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▶ リカージョン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-10
(54)【発明の名称】ハイスループット遺伝子編集系及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20231227BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20231227BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231227BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231227BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231227BHJP
C12N 5/04 20060101ALN20231227BHJP
C12N 5/07 20100101ALN20231227BHJP
C12N 9/22 20060101ALN20231227BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231227BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z
C12N15/09 110
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
C12N5/04
C12N5/07
C12N9/22
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023531629
(86)(22)【出願日】2021-11-23
(85)【翻訳文提出日】2023-07-24
(86)【国際出願番号】 US2021060486
(87)【国際公開番号】W WO2022109449
(87)【国際公開日】2022-05-27
(31)【優先権主張番号】17/101,545
(32)【優先日】2020-11-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517307681
【氏名又は名称】リカージョン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】クーパー、ジェイコブ
(72)【発明者】
【氏名】イェンセン、ジェームズ
(72)【発明者】
【氏名】ダーレム、ティモシー
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA05
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
本開示は、アドレス可能なウェルプレートのウェル内の細胞内に変異遺伝子を作製するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の標的細胞を遺伝子改変する方法であって、（ａ）第１のウェルプレートの複数のウェルのそれぞれにおいて、（１）ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、ここで、前記ｃｒＲＮＡ部分は、標的遺伝子に相補的な固有のスペーサーを含む、（２）前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（３）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（４）標的細胞を組み合わせること、並びに
（ｂ）前記複数のウェル内で前記複数の標的細胞をインキュベートすること、ここで、前記ｃｒＲＮＡ部分及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、前記ガイドＲＮＡを形成し、前記Ｃａｓ酵素及び前記ガイドＲＮＡは、前記標的細胞の前記標的遺伝子と共局在複合体を形成し、前記Ｃａｓ酵素は、前記標的遺伝子を切断し、前記標的遺伝子を変異させる、
を含み、
それぞれのウェル内の前記ｃｒＲＮＡ部分の前記固有のスペーサー配列は、異なる標的遺伝子に相補的であり、それぞれのウェル内のそれぞれの固有のスペーサー配列の前記第１のウェルプレート内における位置が既知であり、それぞれのウェル内の前記標的細胞は、異なる標的遺伝子が変異している、
前記方法。
【請求項2】
ステップ（ａ）において、異なる標的遺伝子に相補的な固有のスペーサーをそれぞれ有する、ガイドＲＮＡの少なくとも２つ以上のｃｒＲＮＡ部分が、リポソーム内に別個に提供され、ステップ（ｂ）において、少なくとも２つ以上の異なる標的遺伝子が、各標的細胞内でノックアウトされる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記複数のウェルが、５００個以上のウェルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記複数のウェルが、１０００個以上のウェルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記複数のウェルが、１５３６個以上のウェルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記複数のウェルが、３０００個以上のウェルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記第１のウェルプレートがエッジウェルを含み、前記エッジウェルが空いている、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記複数の標的細胞のうちのそれぞれの標的細胞が、同じ細胞型である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記複数の標的細胞のうちのそれぞれの標的細胞が、異なる細胞型である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記標的細胞が前記ウェルに提供される前に、ガイドＲＮＡの前記ｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、及び前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又は前記Ｃａｓ酵素を含む前記リポソームが前記ウェルに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
ガイドＲＮＡの前記ｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、及び前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又は前記Ｃａｓ酵素を含む前記リポソームが前記ウェルに提供される前に、前記標的細胞が前記ウェルに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
ガイドＲＮＡの前記ｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソームが前記ウェルに提供される前に、前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又は前記Ｃａｓ酵素を含む前記リポソーム、及び前記標的細胞が前記ウェルに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又は前記Ｃａｓ酵素を含む前記リポソーム、及び前記標的細胞が前記ウェルに提供される前に、ガイドＲＮＡの前記ｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソームが前記ウェルに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又は前記Ｃａｓ酵素を含む前記リポソーム、及び前記標的細胞が前記ウェルに提供された後に、ガイドＲＮＡの前記ｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソームが前記ウェルに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、及び前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又は前記Ｃａｓ酵素を含む前記リポソームが、混合物として前記ウェルに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又は前記Ｃａｓ酵素を含む前記リポソーム、及び前記標的細胞が、混合物として前記ウェルに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又は前記Ｃａｓ酵素を含む前記リポソーム、及び前記標的細胞が、混合物として前記ウェルに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記標的細胞が前記ウェルに提供される前に、前記Ｃａｓ酵素をコードする前記核酸が前記細胞にトランスフェクトされる、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
（１）ガイドＲＮＡの前記ｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、（２）前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソームと、前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又は前記Ｃａｓ酵素を含む前記リポソームとの混合物、及び（３）前記標的細胞が、前記ウェルに別個に提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
ステップ（ａ）及び（ｂ）が、第２のウェルプレートについて繰り返され、ここで、前記第１のウェルプレートの前記ウェルに提供されるそれぞれの固有のスペーサー配列が、前記第２のウェルプレート内において前記第１のウェルプレートとは異なる位置に提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
ステップ（ａ）及び（ｂ）が、複数のウェルプレートについて繰り返され、ここで、前記第１のウェルプレートの前記ウェルに提供されるそれぞれの固有のスペーサー配列が、前記複数のウェルプレート及び前記第１のウェルプレートのそれぞれにおいて異なる位置に提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記複数のウェルプレートが、１０００個超のウェルプレートである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
各ウェルに１つ以下の細胞が存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
ステップ（ａ）では、ガイドＲＮＡの前記ｃｒＲＮＡ部分と前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分とが連結され、リポソーム内で単一のガイドＲＮＡとして提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
ガイドＲＮＡのウェル濃度が、１０ｎＭ～１μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
ガイドＲＮＡのウェル濃度が、２５ｐｍｏｌ～１２５ｐｍｏｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項27】
ガイドＲＮＡのウェル濃度が、７５ｐｍｏｌ～１２５ｐｍｏｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項28】
Ｃａｓ酵素のウェル濃度が、１ｎＭ～１５０ｎＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項29】
Ｃａｓ酵素のウェル濃度が、６０ｎＭ～８０ｎＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項30】
ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む前記リポソーム、Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含む前記リポソーム、及び前記標的細胞が、音波を使用した、供給源容器から前記ウェルへの液滴移送によって前記ウェルに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項31】
前記Ｃａｓ酵素が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓ酵素である、請求項１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一般に、ＣＲＩＳＰＲ試薬、リポフェクション、及びアドレス可能なアレイマルチウェルプレートを使用して細胞内に遺伝子変異を作製するハイスループット法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子変異を作製するためにＣＲＩＳＰＲ試薬を使用する方法は公知である。国際公開第２０１８／０５７８３７号、米国特許第２０１９／０２３３８２０号、国際公開第２０１９／０２５９８４号、国際公開第２０１５／０８９４６５号、米国特許第２０１９／０１５３４１２号、及び国際公開第２０１５／０８９４７３号を参照されたい。しかし、細胞への導入を改善し、ハイスループットプラットフォーム上でのＣＲＩＳＰＲ活性を増加させるためにＣＲＩＳＰＲ試薬を取り扱う方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本開示の態様は、ウェルプレート内の複数のウェルのそれぞれに存在する標的細胞内の標的遺伝子を編集するための、当技術分野で公知のＣａｓ酵素及びガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する、多重遺伝子編集の組成物及び方法に関する。それぞれのウェルは、標的細胞の異なる標的遺伝子に対するガイドＲＮＡを含む。したがって、それぞれのウェルは、変異について単一の遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含有する。それぞれのウェル内の変異の標的とされる異なる単一の遺伝子座のそれぞれを考慮すると、前記方法では全体として標的細胞の複数の遺伝子が編集されることになるため、標的細胞のゲノムは、並行して効率的に多重遺伝子編集が行われる。このように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用して、アドレス可能又はインデックス可能なマルチウェルプレートのそれぞれのウェル内に単一の変異遺伝子を作製するハイスループットスクリーニング法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【0004】
ある態様によれば、前記系は、（１）ガイドＲＮＡを含むリポソーム、ここで、前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子に相補的な固有のスペーサーを含む（２）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（３）標的細胞を含む。ガイドＲＮＡは、デュアルガイドＲＮＡ（dual guide RNA）、すなわち、当技術分野で知られているように、共にハイブリダイズする別個のｃｒＲＮＡ分子及び別個のｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含むデュアルイドＲＮＡであってもよく、又はガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（single guide RNA）、すなわち、当技術分野で知られているように、リンカー（例えば、核酸配列）によって互いに連結された、すなわち、互いに共有結合したｃｒＲＮＡ部分及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分を有する単一分子であってよい。ＧＡＡＡなどのリンカーは、当業者に公知である。一般的な態様では、（１）ガイドＲＮＡを含むリポソーム、（２）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（３）標的細胞は、ウェルプレートのウェル内に存在する。Ｃａｓ酵素及びガイドＲＮＡは、標的細胞の標的遺伝子と共局在複合体を形成し、Ｃａｓ酵素は、標的遺伝子に二本鎖切断を生成し、これにより、二本鎖切断が細胞によって修復される際に、遺伝子に１つ又は複数の変異が誘導される。
【0005】
ある態様によれば、前記系は、（１）ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、ここで、前記ｃｒＲＮＡ部分は、標的遺伝子に相補的な固有のスペーサー、及びｔｒａｃｒＲＮＡのセグメントに相補的なセグメントを含む、（２）前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、ここで、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は前記ｃｒＲＮＡ部分にハイブリダイズする、（３）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（４）標的細胞（所与のウェル内の複数の同じ細胞型であってもよい）を含む。一般的な態様では、（１）ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（２）ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（３）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（４）標的細胞は、ウェルプレートのウェル内に存在する。ｃｒＲＮＡ部分及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ハイブリダイズしてガイドＲＮＡを形成する。Ｃａｓ酵素及びガイドＲＮＡは、標的細胞の標的遺伝子と共局在複合体を形成し、Ｃａｓ酵素は、標的遺伝子に二本鎖切断を生成し、これにより、二本鎖切断が細胞によって修復される際に、遺伝子に１つ又は複数の変異が誘導される。
【0006】
ある態様によれば、本明細書に記載の方法は、ウェルプレート内の複数のウェル内で行われ、それぞれのウェル内のガイドＲＮＡは、異なる標的遺伝子を標的とする。ある態様によれば、この方法は、ウェルプレート内の複数のウェル内で同時に行われ、それぞれのウェル内のガイドＲＮＡは、異なる標的遺伝子を標的とする。
【0007】
ある態様によれば、（１）ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（２）前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（３）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（４）標的細胞は、ウェルに同時に導入されてもよい。ある態様によれば、（１）ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（２）前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（３）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（４）標的細胞は、ウェルに順次に導入されてもよく、又は（１）、（２）、（３）、若しくは（４）のうちの１つ又は複数、２つ以上、若しくは３つ以上の組み合せが、ウェルに同時に導入されてもよい。例えば、（４）標的細胞がウェルに導入されてもよく、次いで、（１）ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（２）前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、及び（３）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、の混合物が細胞に導入されてもよい。例えば、（４）標的細胞、（２）ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、及び（３）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、の混合物が細胞に導入されてもよく、次いで、（１）前記ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソームが細胞に導入されてもよい。（１）ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（２）前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（３）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（４）標的細胞を導入する他の実施形態が想定され、本明細書にさらに記載される。さらに、（１）ガイドＲＮＡを含むリポソーム、（２）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（３）標的細胞を同時に若しくは別個に導入する実施形態、又は（１）と（２）の混合物、（２）と（３）の混合物、若しくは（１）と（３）の混合物として導入する実施形態が想定される。
【0008】
別の態様によれば、本開示は、Ｃａｓ酵素をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素をコードする核酸は、ベクター内、例えば、操作されたＤＮＡプラスミドベクター内又はウイルスベクター内に存在する。核酸は、標的細胞内でのＣａｓ酵素の発現のためのプロモーターを含む。ある態様によれば、Ｃａｓ酵素は、標的細胞へのプラスミドの導入及びＣａｓ酵素の発現によって、標的細胞に提供される。ある態様によれば、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ酵素の標的細胞の核への進入を促進するための１つ又は複数、又は２つ以上の核局在化シグナルを有し得る。
【0009】
ある態様によれば、ウェルプレートのウェル内の標的細胞（例えば、標的細胞は同じ種型である）は、リポソーム内のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系構成成分と組み合わされ、これにより、標的細胞へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成成分（すなわち、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ酵素）の進入が促進されて、遺伝子が切断され変異遺伝子が生じる。次いで、変異遺伝子を有する細胞が分析される。ある態様によれば、標的細胞は、真核細胞、例えば、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、又はヒト細胞である。ある態様によれば、細胞は原核細胞である。ある態様によれば、ウェルプレートは、アレイ内のそれぞれのウェル内での（例えば、固有のスペーサー配列を有する）ガイドＲＮＡの同一性及び位置が既知である限り、アドレス可能、インデックス可能、又は同定可能なアレイである。したがって、スペーサー配列の同一性に基づいて変異される標的遺伝子の同一性及び位置は、アレイ内で既知である。前記プロセスは、後続のアドレス可能なアレイウェルプレート内で繰り返されてもよく、ここで、それぞれのガイドＲＮＡは、前のウェルプレートのウェル位置とは異なるウェル位置に提供される。前記方法は、アドレス可能なアレイウェルプレートにおいて複数回繰り返すことができ、ガイドＲＮＡは、アドレス可能なアレイウェルプレートの異なる位置に提供される。
【0010】
本発明の特定の実施形態のさらなる特徴及び利点は、実施形態及びその図面の以下の説明において、並びに特許請求の範囲からさらに完全に明らかになるであろう。
【0011】
特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開の写しは、請求、及び必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供される。本実施形態の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面と併せて、例示的な実施形態の以下の詳細な説明からさらに完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本開示の一実施形態を概略的に示す。
【図2】本開示の代替の実施形態を概略的に示す。
【図3】本開示の代替の実施形態を概略的に示す。
【図4】本開示の代替の実施形態を概略的に示す。
【図5】細胞ゲノムＤＮＡのサンガーシーケンシングを使用した遺伝子編集率の測定を示す。
【図6】ＭＦＮ２遺伝子又はＯＰＡ１遺伝子のノックアウトの結果を示す。
【図7】ＰＬＫ１遺伝子のノックアウトの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本開示の態様によれば、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン、及びガイドＲＮＡと相互作用してエンドヌクレアーゼを切断のための特異的ヌクレオチド配列に標的化する少なくとも１つのドメインを含む、ＣＲＩＳＰＲタンパク質エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）が提供される。ＣＲＩＳＰＲタンパク質エンドヌクレアーゼをコードする核酸、及びＣＲＩＳＰＲタンパク質エンドヌクレアーゼを使用して、真核細胞又は胚の細胞などの細胞の染色体配列を改変する方法も提供される。ＣＲＩＳＰＲタンパク質エンドヌクレアーゼは特定のガイドＲＮＡと相互作用し、特定のガイドＲＮＡのそれぞれはエンドヌクレアーゼを特定の標的部位に誘導し、その部位で、ＣＲＩＳＰＲタンパク質エンドヌクレアーゼは二本鎖切断を導入し、二本鎖切断は染色体配列が改変又は変異されるようにＤＮＡ修復プロセスによって修復され得る。特異性はガイドＲＮＡ（又はｃｒＲＮＡ）によってもたらされるため、ＣＲＩＳＰＲタンパク質エンドヌクレアーゼは、普遍的であり、様々なゲノム配列を標的とするために様々なガイドＲＮＡとともに使用され得る。本明細書に開示される方法は、細胞のゲノムにおける標的位置で特定の染色体配列を標的とし、改変するために使用され得る。
【0014】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用する本明細書に記載の方法は、細胞の高効率ゲノム編集のためのプラットフォームを提供する。細胞及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系構成成分は、マルチウェルプレートのウェルに送達され、ここで、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系構成成分は、例えば、リポソーム媒介性トランスフェクションを使用して細胞に送達され、細胞のゲノム中の標的核酸を切断するために使用される。マルチウェルプレート及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系構成成分の使用により、ハイスループットの多重ゲノムワイド細胞編集がもたらされる。
【0015】
本開示の態様は、アドレス可能なアレイウェルプレートのウェルにおいて標的細胞内の標的遺伝子を変異させる方法に関する。複数の標的細胞が、アドレス可能なアレイウェルプレート内に含まれる。複数の細胞が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と接触させられ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の構成成分は、標的細胞に進入するための１つ又は複数のリポソーム内に存在する。例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ９）を含み、当業者に公知であり、市販されている。ガイドＲＮＡのスペーサー配列は、標的遺伝子を標的とするために、当技術分野で一般的に知られているように設計することができる。設計されたスペーサー配列を有するガイドＲＮＡは市販されている。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系構成成分は細胞に進入し、標的遺伝子は複数の標的細胞内で変異される。ガイドＲＮＡスペーサー配列の同一性、したがって、標的遺伝子の同一性がウェルプレート内において既知の位置にある限り、ウェルプレートはアドレス可能である。ある態様によれば、複数の細胞のそれぞれの細胞は、同じ種型である。ある態様によれば、複数の細胞のそれぞれの細胞は、異なる変異遺伝子を含む。これにより、標的細胞の複数の遺伝子が変異される。まとめると、複数の変異遺伝子は、標的細胞の多重変異を表し、その分析は、ハイスループットスクリーニング法を提供する。ある態様によれば、本開示は、マルチウェルプレートの使用、及びそのようなプレートを使用するハイスループット法を含み、ここで、異なるウェルがＣａｓ９タンパク質及びトランスフェクション試薬を含有する。さらに、異なるウェルは、異なるｇＲＮＡ分子を含有する。そのようなプレートは、細胞内の複数の遺伝子部位を変化させるためのハイスループット法に使用され得る。
【0016】
ある態様によれば、本開示は、使用準備済の試薬を提供する。例えば、使用準備済の試薬は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸又はＣａｓタンパク質と、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分をコードする核酸又はガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分との混合物を含んでいてもよい。次いで、混合物は、細胞、及びｃｒＲＮＡをコードする核酸又はｃｒＲＮＡと組み合わされてもよく、ＣＲＩＳＰＲ活性をもたらされる。
【0017】
ＣＲＩＳＰＲ系
本開示の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースとした系に関し、その構成成分は、標的細胞への進入を促進するためにリポソーム内にあってもよい。ＣＲＩＳＰＲ系、すなわち、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ酵素及びガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系は、当業者に公知である。そのようなＣａｓ酵素には、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓ酵素、すなわち、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の一部として機能するＣａｓ酵素が含まれる。そのようなＣａｓ酵素としては、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系における天然若しくは野生型のＣａｓ酵素、又はその変異体若しくは改変体が挙げられる。Ｃａｓ９は、例示的なＣａｓ酵素である。Ｃａｓ酵素は、本明細書に記載されるように市販されており、Ｃａｓ９内の例示的な単一点変異Ｒ６９１Ａを記載する、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるVakulskas et al., Nature Medicine, vol.24, August 2018, pp.1216-1224に記載されるように、それらの野生型バージョンから改変されてもよい。例えば、本明細書で使用されるＣａｓ９は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（米国、アイオワ州、コーラルビル）から市販されている。１つ又は複数の点変異を含む例示的なＣａｓ酵素ニッカーゼは、当技術分野で公知である。Ｃａｓ９タンパク質及びＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、当技術分野では文書により十分に裏付けられている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、全補足情報を含むMakarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol.9, June 2011, pp.467-477を参照されたい。市販のＣａｓ９などの有用なＣａｓ酵素には、Vakulskas et al., Nature Medicine, vol.24, August 2018, pp.1216-1224など、当技術分野で記載される野生型Ｃａｓ酵素（Ｃａｓ９など）に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、７５％以上、又は７０％以上の配列同一性又は相同性を有するが、標的核酸中に二本鎖切断を作製する酵素機能を保持しているものが含まれる。配列同一性を決定する方法は、当業者に公知である。ある態様によれば、Ｃａｓ酵素は、リポソーム内に提供され得る。
本開示の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースとした系に関し、その構成成分は、標的細胞への進入を促進するためにリポソーム内にあってもよい。ＣＲＩＳＰＲ系、すなわち、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ酵素及びガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系は、当業者に公知である。そのようなＣａｓ酵素には、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓ酵素、すなわち、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の一部として機能するＣａｓ酵素が含まれる。そのようなＣａｓ酵素としては、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系における天然若しくは野生型のＣａｓ酵素、又はその変異体若しくは改変体が挙げられる。Ｃａｓ９は、例示的なＣａｓ酵素である。Ｃａｓ酵素は、本明細書に記載されるように市販されており、Ｃａｓ９内の例示的な単一点変異Ｒ６９１Ａを記載する、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるVakulskas et al., Nature Medicine, vol.24, August 2018, pp.1216-1224に記載されるように、それらの野生型バージョンから改変されてもよい。例えば、本明細書で使用されるＣａｓ９は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（米国、アイオワ州、コーラルビル）から市販されている。１つ又は複数の点変異を含む例示的なＣａｓ酵素ニッカーゼは、当技術分野で公知である。Ｃａｓ９タンパク質及びＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、当技術分野では文書により十分に裏付けられている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、全補足情報を含むMakarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol.9, June 2011, pp.467-477を参照されたい。市販のＣａｓ９などの有用なＣａｓ酵素には、Vakulskas et al., Nature Medicine, vol.24, August 2018, pp.1216-1224など、当技術分野で記載される野生型Ｃａｓ酵素（Ｃａｓ９など）に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、７５％以上、又は７０％以上の配列同一性又は相同性を有するが、標的核酸中に二本鎖切断を作製する酵素機能を保持しているものが含まれる。配列同一性を決定する方法は、当業者に公知である。ある態様によれば、Ｃａｓ酵素は、リポソーム内に提供され得る。
【0018】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ活性」は、ＣＲＩＳＰＲ系に関連する活性を指す。そのような活性の例としては、標的核酸の切断又はニッキングが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ系」は、組み合わされた場合、少なくともＣＲＩＳＰＲ関連活性（例えば、二本鎖ＤＮＡの標的遺伝子座特異的な二本鎖切断）をもたらす、ＣＲＩＳＰＲタンパク質と核酸との集合体を指す。本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ複合体」は、互いに会合して機能的活性を有する凝集物を形成するＣＲＩＳＰＲタンパク質及び核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）を指す。ＣＲＩＳＰＲタンパク質としては、野生型又はその改変体若しくは変異体が挙げられ、野生型又は改変体若しくは変異体のいずれかの形態で市販されているものであってもよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体の例は、標的遺伝子座に特異的なガイドＲＮＡに結合するＣａｓ９（Ｃｓｎ１と呼ばれることもある）タンパク質である。多くの場合、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、それらが核に輸送されることを可能にする核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有することになる。本明細書で使用される場合、用語「標的遺伝子座」は、ＣＲＩＳＰＲ系相互作用（例えば、結合及び切断）のための核酸分子内における部位を指す。単一のＣＲＩＳＰＲ複合体が二本鎖核酸を切断するように設計される場合、標的遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される切断部位及び周囲領域である。２つのＣＲＩＳＰＲ複合体が近接した二本鎖核酸にニックを入れて二本鎖切断を作製するように設計されている場合、切断点を取り囲み、切断点を含む領域は標的遺伝子座と呼ばれる。
【0019】
一般に、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、核酸配列を標的とするためにＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡに依存する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を細胞に導入する方法の説明については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第２０１８／０１９５０８９号明細書を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ系は、特定の配列を標的とするためにカスタマイズされたタンパク質の生成を必要とせず、むしろ、標的に対する配列相補性を有する短いＲＮＡ分子によって標的ヌクレオチド配列（標的遺伝子座）に導かれ得る単一のＣａｓ酵素を必要とする。
【0020】
一般に、３つのクラスのＣＲＩＳＰＲ系が一般に知られており、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型と呼ばれる。ある態様によれば、ｄｓＤＮＡを切断するための本開示による特に有用な酵素は、ＩＩ型に共通の単一エフェクター酵素Ｃａｓ９である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるK. S. Makarova et al., Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature reviews. Microbiology 9,467(Jun,2011)を参照されたい。ある態様によれば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ二本鎖をほどき、切断するためにｃｒＲＮＡと一致する配列を検索する。標的認識は、標的ＤＮＡ内の「プロトスペーサー」配列とｃｒＲＮＡ内の残りのスペーサー配列との間の相補性の検出時に起こる。正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も３’末端に存在する場合にのみ、Ｃａｓ９はＤＮＡを切断する。特定の態様によれば、異なるプロトスペーサー隣接モチーフが利用され得る。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ系はＮＧＧ配列を必要とし、ここでＮは何らかのヌクレオチドであり得る。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＩＩ型系は、ＮＧＧＮＧ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるP. Horvath, R. Barrangou, CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science 327,167(Jan 8,2010)を参照及びＮＮＡＧＡＡＷ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるH. Deveau et al., Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of bacteriology 190,1390(Feb,2008)を参照）をそれぞれ必要とするが、異なるＳ．ｍｕｔａｎｓ系は、ＮＧＧ又はＮＡＡＲを許容する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるJ.R.van der Ploeg, Analysis of CRISPR in Streptococcus mutans suggests frequent occurrence of acquired immunity against infection by M102-like bacteriophages. Microbiology 155,1966(Jun,2009)を参照。バイオインフォマティクス分析により、追加の有用なＰＡＭを同定し、ＣＲＩＳＰＲ標的化可能な配列のセットを拡大するのに役立ち得る、様々な細菌のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の広範囲なデータベースが生成されている（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれるM.Rho,Y. W. Wu, H. Tang, T. G. Doak, Y.Ye, Diverse CRISPRs evolving in human microbiomes. PloS genetics 8, e1002441(2012)及びD. T. Pride et al., Analysis of streptococcal CRISPRs from human saliva reveals substantial sequence diversity within and between subjects over time. Genome research 21, 126(Jan,2011)を参照。
【0021】
好適なＣＲＩＳＰＲタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１ Ｏｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６が挙げられる。Ｃａｓ９タンパク質は、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol.9, June 2011, pp.467-477の補足情報で同定されているように、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ Ｃ７；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ ＹＳ－３１４；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２ Ｋｉｔａｓａｔｏ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２ Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ ＤＳＭ ４４３８５；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ＡＴＣＣ １９９７７；Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ ＩＦＭ１０１５２；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＰＲ４；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ ＲＨＡ１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ Ｂ４ ｕｉｄ３６５７３；Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ １１Ｂ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ Ａ６；Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ ｆｌａｖｉｄａ ＤＳＭ １７８３６ ｕｉｄ４３４６５；Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｒｖａｔａ ＤＳＭ ４３１８３；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ Ｂｄ１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＤＪＯ１０Ａ；Ｓｌａｃｋｉａ ｈｅｌｉｏｔｒｉｎｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＤＳＭ ２０４７６；Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ ＥＸ Ｈ１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＮＣＴＣ ９４３４；Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ ＤＳＭ ７２７１；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＪＩＰ０２ ８６；Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ ＢＡＡ ８３５；Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ ＤＳＭ １３９４１；Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ＲＳ１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＰＣＣ６８０３；Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ Ｐｅｉ１９１；ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｔｅｒｍｉｔｅ ｇｒｏｕｐ １ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ Ｒｓ Ｄ１７；Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ Ｓ８５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １０９８７；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＵＣＣ１１８；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ Ａ９０９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ＮＥＭ３１６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ２６０３；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ ＧＧＳ １２４；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＭＧＣＳ１０５６５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ＵＣＮ３４ ｕｉｄ４６０６１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ Ｃｈａｌｌｉｓ ｓｕｂｓｔ ＣＨ１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＮＮ２０２５ ｕｉｄ４６３５３；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｍ１ ＧＡＳ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ５００５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ２０９６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ９４２９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ１０２７０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ６１８０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ３１５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＳＳＩ－１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ１０７５０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＮＺ１３１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ ＣＮＲＺ１０６６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ ＬＭＤ－９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ ＬＭＧ １８３１１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ３ Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂ Ｅｋｌｕｎｄ １７Ｂ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂａ４ ６５７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｆ Ｌａｎｇｅｌａｎｄ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｈ１０；Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ＡＴＣＣ ２９３２８；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ ＡＴＣＣ ３３６５６；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ １６３Ｋ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ ５３；Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １２１１２；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＢＴＡｉ１；Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ Ｘ１４；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＢｉｓＢ１８；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＢｉｓＢ５；Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ ＤＳ－１；Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ ＤＦＬ １２；Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ Ｐａｌ ５ ＦＡＰＥＲＪ；Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ Ｐａｌ ５ ＪＧＩ；Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ Ｂ５１０ ｕｉｄ４６０８５；Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＡＴＣＣ １１１７０；Ｄｉａｐｈｏｒｏｂａｃｔｅｒ ＴＰＳＹ ｕｉｄ２９９７５；Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ ＥＦ０１－２；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ ０５３４４２；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ ａｌｐｈａ１４；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｚ２４９１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ ＤＳＭ ２６３８；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｄｏｙｌｅｉ ２６９ ９７；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ８１１１６；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ ＲＭ２１００；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ；Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ；Ｔｏｌｕｍｏｎａｓ ａｕｅｎｓｉｓ ＤＳＭ ９１８７；Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ Ｔ６ｃ；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｅａｌｅａｎａ ＡＴＣＣ ７００３４５；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｐａｒｉｓ；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ １３０Ｚ；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＦＳＣ １９８；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＷＹ９６－３４１８；及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ＡＴＣＣ ３５４０５を含む多くのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に存在することが知られている。Ｃａｓ９タンパク質は、文献内では当業者によってＣｓｎ１と称されている場合がある。例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるDeltcheva et al.,Nature 471,602-607(2011)に提供されている。
【0022】
本開示において有用なＣＲＩＳＰＲ系、及び細胞への送達方法はまた、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０５７８３７号、米国特許第２０１９／０２３３８２０号、国際公開第２０１９／２５９８４号、国際公開第２０１５／０８９４６５号、米国特許第２０１９／０１５３４１２号、国際公開第２０１５／０８９４７３号、国際公開第２０１８／０９４３５６号、及び米国特許第２０１９／０３９０２２９号に記載されている。
【0023】
ある態様によれば、２つ以上のヌクレアーゼドメインを有するＣＲＩＳＰＲタンパク質は、１つを除くすべてのヌクレアーゼドメインを不活性化するように改変又は変化されてもよい。そのような改変又は変化されたＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを切断するか、又はそれにニックを入れる限り、ニッカーゼと呼ばれる。例示的なＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、改変Ｃａｓ９、Ｃａｓ９のホモログ、又はＣａｓ９の変異体である。例示的なＣａｓ９タンパク質ニッカーゼは当技術分野で公知である。Jinek et al.,Science 337,816-821(2012)を参照されたい。ある態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質又はＣａｓ９タンパク質ニッカーゼは、ＤＮＡに結合し、ＲＮＡによって誘導される前記タンパク質の能力を保持するそのホモログ及びオルソログを含む。ある態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、又はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の天然に存在するＣａｓ９について記載される配列、及びそれに対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の相同性を有するタンパク質配列を含む。
【0024】
例示的なＣＲＩＳＰＲ系としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳＴ１ Ｃａｓ９、Ｓａ Ｃａｓ９）が挙げられる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるEsvelt KM, et al., Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing, Nature Methods.,(2013)を参照）。例示的なＣＲＩＳＰＲ系としては、極めて高い親和性の（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるSternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M.,Greene, E. C. & Doudna, J.A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature 507,62-67(2014)を参照）、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連系から単離されたプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGarneau, J. E. et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.Nature 468, 67-71(2010)及びJinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821(2012)を参照）であるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｓｐ．Ｃａｓ９）が挙げられる。ある態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質は、酵素的に活性なＣａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質野生型タンパク質、又はＣａｓ９タンパク質ニッカーゼである。
【0025】
特定の態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、細胞に導入されてもよく、又は細胞内で産生されてもよい。さらに、Ｃａｓ９タンパク質が細胞内に取り込まれるか又は細胞内で産生される期間、及び細胞内に存在する量は、制御又は調節され得る。一例として、染色体に組み込まれたＣａｓ９タンパク質コード配列は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結されてもよい。さらに、細胞に導入される、Ｃａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡの量は調節されてもよい。
【0026】
ガイドＲＮＡ
本開示の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用に関し、特に、スペーサー配列、ｔｒａｃｒメイト配列、及びｔｒａｃｒ配列のうちの１つ又は複数を含み得るガイドＲＮＡの使用に関する。ガイドＲＮＡは、リポソーム内に提供されてもよい。スペーサー配列という用語は、当業者によって理解されており、標的核酸配列とハイブリダイズし、標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くのに十分な、標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。ガイドＲＮＡ分子は、標的遺伝子座に対して少なくとも１０（例えば、約１０～約５０、約１０～約４０、約１０～約３５、約１０～約３０、約１０～約２５、約１５～約２５、約１７～約２２、約２０）ヌクレオチドの配列相補性領域（当技術分野ではスペーサーとして知られている）を有していてもよい。多くの場合、標的遺伝子座は、真核細胞内の天然に存在する染色体遺伝子座である。細胞のゲノム内の核酸配列を標的とするために、例えば、バイオインフォマティクスデータを使用することによって、スペーサー配列を設計することができる。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒメイト配列（ｃｒＲＮＡと呼ばれ得る）及び別個のｔｒａｃｒ配列に共有結合したスペーサー配列から形成されてもよく、ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒ配列の一部にハイブリダイズする。特定の態様によれば、ｔｒａｃｒメイト配列及びｔｒａｃｒ配列は、リンカー配列による共有結合などによって接続又は連結され、この構築物は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列との融合物と呼ばれ得る。したがって、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分と前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、連結され、リポソーム内で単一のガイドＲＮＡとして提供される。本明細書で言及されるリンカー配列とは、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列を接続する、本明細書で核酸配列と呼ばれるヌクレオチド配列である。したがって、ガイドＲＮＡは、二成分の種（すなわち、互いにハイブリダイズする別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡ）又は単分子の種（すなわち、多くの場合ｓｇＲＮＡと呼ばれるｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒ ＲＮＡ融合物）であり得る。ガイドＲＮＡが二成分の種である場合、標的部位特異的ｃｒＲＮＡ分子／セグメントに接続された単一のｔｒａｃｒＲＮＡ分子／セグメントを使用して、異なる標的部位に対する特異性を有するガイドＲＮＡ分子を生成することができる。例えば、ゲノム内の異なる核酸を標的とする異なるｃｒＲＮＡ分子／セグメントを設計することができ、単一のｔｒａｃｒＲＮＡ分子／セグメントを異なるｃｒＲＮＡ分子／セグメントのそれぞれにハイブリダイズさせて、ゲノム内の異なる核酸を標的とする機能的ガイドＲＮＡを形成することができる。この態様によれば、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子を、例えば、混合物として、細胞及びＣａｓタンパク質とともにそれぞれのウェルに導入することができる。次いで、異なる標的特異的ｃｒＲＮＡをそれぞれのウェルに添加し、それによって、それぞれのウェル内に細胞ゲノムの異なる遺伝子変異を作製することができる。
本開示の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用に関し、特に、スペーサー配列、ｔｒａｃｒメイト配列、及びｔｒａｃｒ配列のうちの１つ又は複数を含み得るガイドＲＮＡの使用に関する。ガイドＲＮＡは、リポソーム内に提供されてもよい。スペーサー配列という用語は、当業者によって理解されており、標的核酸配列とハイブリダイズし、標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くのに十分な、標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。ガイドＲＮＡ分子は、標的遺伝子座に対して少なくとも１０（例えば、約１０～約５０、約１０～約４０、約１０～約３５、約１０～約３０、約１０～約２５、約１５～約２５、約１７～約２２、約２０）ヌクレオチドの配列相補性領域（当技術分野ではスペーサーとして知られている）を有していてもよい。多くの場合、標的遺伝子座は、真核細胞内の天然に存在する染色体遺伝子座である。細胞のゲノム内の核酸配列を標的とするために、例えば、バイオインフォマティクスデータを使用することによって、スペーサー配列を設計することができる。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒメイト配列（ｃｒＲＮＡと呼ばれ得る）及び別個のｔｒａｃｒ配列に共有結合したスペーサー配列から形成されてもよく、ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒ配列の一部にハイブリダイズする。特定の態様によれば、ｔｒａｃｒメイト配列及びｔｒａｃｒ配列は、リンカー配列による共有結合などによって接続又は連結され、この構築物は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列との融合物と呼ばれ得る。したがって、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分と前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、連結され、リポソーム内で単一のガイドＲＮＡとして提供される。本明細書で言及されるリンカー配列とは、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列を接続する、本明細書で核酸配列と呼ばれるヌクレオチド配列である。したがって、ガイドＲＮＡは、二成分の種（すなわち、互いにハイブリダイズする別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡ）又は単分子の種（すなわち、多くの場合ｓｇＲＮＡと呼ばれるｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒ ＲＮＡ融合物）であり得る。ガイドＲＮＡが二成分の種である場合、標的部位特異的ｃｒＲＮＡ分子／セグメントに接続された単一のｔｒａｃｒＲＮＡ分子／セグメントを使用して、異なる標的部位に対する特異性を有するガイドＲＮＡ分子を生成することができる。例えば、ゲノム内の異なる核酸を標的とする異なるｃｒＲＮＡ分子／セグメントを設計することができ、単一のｔｒａｃｒＲＮＡ分子／セグメントを異なるｃｒＲＮＡ分子／セグメントのそれぞれにハイブリダイズさせて、ゲノム内の異なる核酸を標的とする機能的ガイドＲＮＡを形成することができる。この態様によれば、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子を、例えば、混合物として、細胞及びＣａｓタンパク質とともにそれぞれのウェルに導入することができる。次いで、異なる標的特異的ｃｒＲＮＡをそれぞれのウェルに添加し、それによって、それぞれのウェル内に細胞ゲノムの異なる遺伝子変異を作製することができる。
【0027】
ガイドＲＮＡ分子は、当業者に公知の方法を使用して、設計及び合成され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ編集に適した標的核酸配列（プロトスペーサー配列として知られている）は、細胞のゲノムにおいて同定されてもよい。相補配列（スペーサー配列として知られている）が合成され得る。スペーサー配列は、Ｃａｓタンパク質に結合させるために、当業者に公知の足場配列に接続され得る。このように、ｃｒＲＮＡセグメント及びｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含む機能的ガイドＲＮＡが作製され得る。一例として、スペーサー配列（約１５～３０ヌクレオチド）は、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズする部分（約１０～３０ヌクレオチド）を含む、ｃｒＲＮＡの標的遺伝子座認識配列である。ｔｒａｃｒＲＮＡ（１０～５０ヌクレオチドを含む）は、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズして、ガイドＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡは、リンカー核酸セグメントを介して、ｔｒａｃｒＲＮＡに連結されてもよい。
【0028】
ある態様によれば、個々の標的部位に対する特異性を有する、ｃｒＲＮＡ分子の集合体が提供される。例えば、特定の種類の細胞（例えば、ヒト細胞）内の標的部位に対する特異性を有する、ｃｒＲＮＡ分子の集合体が提供される。細胞のそのような集合体のメンバーは、これらの特定の種類の細胞の配列情報に基づいて生成されてもよい。一例として、特定の種類の細胞の完全なゲノム配列を使用して、１つのそのような集合体を生成することができる。ゲノム配列データを使用して、ヒトゲノム内のそれぞれの遺伝子のコード領域に対する特異性を有する、ｃｒＲＮＡ分子のライブラリーを生成することができる。そのようなライブラリーを生成するために使用され得るパラメーターとしては、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位の位置、オフターゲット効果（例えば、標的領域に固有の配列）、及び遺伝子「ノックアウト」が所望される場合、遺伝子発現産物を完全に又は部分的に非機能性にする可能性が高いコード領域内の位置（例えば、活性部位コード領域、イントロン／エクソン接合部など）が挙げられ得る。ｃｒＲＮＡ分子の集合体又はライブラリーは、約５～約１００，０００、例えば、約５０～約１００，０００、約２００～約１００，０００、約５００～約１００，０００、約８００～約１００，０００、約１，０００～約１００，０００、約２，０００～約１００，０００、約４，０００～約１００，０００、約５，０００～約１００，０００、約５０～約５０，０００、約１００～約５０，０００、約５００～約５０，０００、約１，０００～約５０，０００、約２，０００～約５０，０００、約４，０００～約５０，０００、約５０～約１０，０００、約１００～約１０，０００、約２００～約１０，０００、約５００～約１０，０００、約１，０００～約１０，０００、約２，０００～約１０，０００、約４，０００～約１０，０００、約５０～約５，０００、約１００～約５，０００、約５００～約５，０００、約１，０００～約５，０００、約５０～約２，０００、約１００～約２，０００、約５００～約２，０００などの多種多様な個々の分子を含み得る。ｃｒＲＮＡ分子の数は、所与の標的細胞の所与のゲノムについて変異させる遺伝子の数によって決定されてもよい。
【0029】
特定の態様によれば、ガイドＲＮＡは、注入若しくはリポフェクションを含む、当業者に公知の方法によって天然種として、又はその同族ＤＮＡから転写されるように、細胞に直接送達されてもよく、同族ＤＮＡは、エレクトロポレーション、一過性かつ安定なトランスフェクション（リポフェクションを含む）、及びウイルス形質導入によって細胞に導入される。例示的な実施形態では、ガイドＲＮＡコード配列は、リポソームにパッケージングされ、細胞に送達される。ある態様によれば、それぞれのウェル内で異なるゲノム変異を作製するために、複数のウェルのそれぞれのウェルに異なるｃｒＲＮＡが送達される。
【0030】
細胞
本開示による細胞としては、開示される核酸を本明細書に記載されるように導入し発現させることができる任意の細胞が挙げられる。本明細書に記載の本開示の基本概念は、細胞型によって限定されないことを理解されたい。本発明を実施する際に使用され得る代表的な細胞としては、限定されるものではないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、及び動物細胞（哺乳動物細胞及びヒト細胞など）が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は胚に由来する。細胞は、幹細胞、接合体、又は生殖系列細胞であり得る。細胞が幹細胞である実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞又は多能性幹細胞である。他の実施形態では、細胞は体細胞である。細胞が体細胞である実施形態では、体細胞は、真核細胞又は原核細胞である。真核細胞は、ブタ細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、イヌ細胞、ウマ細胞、ウシ細胞、非ヒト霊長類細胞、又はヒト細胞などに由来する、動物細胞であり得る。
本開示による細胞としては、開示される核酸を本明細書に記載されるように導入し発現させることができる任意の細胞が挙げられる。本明細書に記載の本開示の基本概念は、細胞型によって限定されないことを理解されたい。本発明を実施する際に使用され得る代表的な細胞としては、限定されるものではないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、及び動物細胞（哺乳動物細胞及びヒト細胞など）が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は胚に由来する。細胞は、幹細胞、接合体、又は生殖系列細胞であり得る。細胞が幹細胞である実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞又は多能性幹細胞である。他の実施形態では、細胞は体細胞である。細胞が体細胞である実施形態では、体細胞は、真核細胞又は原核細胞である。真核細胞は、ブタ細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、イヌ細胞、ウマ細胞、ウシ細胞、非ヒト霊長類細胞、又はヒト細胞などに由来する、動物細胞であり得る。
【0031】
本発明はさらに、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ系構成成分を含有する細胞、及び本明細書に記載される方法によって作製される細胞を含む。例えば、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ複合体が導入された細胞（例えば、（１）Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡをコードするプラスミド、（２）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡなどを含有する細胞）を含む。本発明はさらに、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ系構成成分を含有するか又は含有しない、本発明の方法によって改変されたもの（例えば、切断部位に挿入を有するか又は有しない、細胞ＤＮＡの切断及び排除を経た細胞）を含む。
【0032】
ベクター
本明細書に記載の方法及び構築物と共に使用するためのベクターが企図される。用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を含む。本明細書に記載の細胞に核酸を送達するために使用されるベクターとしては、当業者に公知であり、そのような目的のために使用されるベクターが挙げられる。特定の例示的なベクターは、当業者に公知のプラスミド、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスであってもよい。ベクターとしては、限定されないが、一本鎖核酸分子、二本鎖核酸分子、又は部分的に二本鎖の核酸分子；１つ又は複数の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方を含む核酸分子；及び当技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドが含まれる。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、「プラスミド」は、標準的な分子クローニング技術などによって、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター内に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって担持されるポリヌクレオチドを含む。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術では有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。組換え発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むことができ、これは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つ又は複数の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞内で）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節エレメントに連結されていることを意味することが意図される。
本明細書に記載の方法及び構築物と共に使用するためのベクターが企図される。用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を含む。本明細書に記載の細胞に核酸を送達するために使用されるベクターとしては、当業者に公知であり、そのような目的のために使用されるベクターが挙げられる。特定の例示的なベクターは、当業者に公知のプラスミド、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスであってもよい。ベクターとしては、限定されないが、一本鎖核酸分子、二本鎖核酸分子、又は部分的に二本鎖の核酸分子；１つ又は複数の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方を含む核酸分子；及び当技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドが含まれる。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、「プラスミド」は、標準的な分子クローニング技術などによって、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター内に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって担持されるポリヌクレオチドを含む。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術では有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。組換え発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むことができ、これは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つ又は複数の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞内で）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節エレメントに連結されていることを意味することが意図される。
【0033】
核酸、又は天然ＤＮＡ結合タンパク質、天然ガイドＲＮＡ、若しくは他の天然種の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、微粒子銃法、ビロソーム法、リポソーム法、イムノリポソーム法、ポリカチオン法、又は脂質：核酸複合体法、ネイキッドＤＮＡ法、人工ビリオン法、及び薬剤により強化されたＤＮＡの取込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号、及び米国特許第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号；国際公開第９１／１６０２４号のものが含まれる。送達は、細胞（例えば、インビトロ投与又はエクスビボ投与）又は標的組織（例えばインビボ投与）に対するものであり得る。天然という用語は、タンパク質種、酵素種、又はガイドＲＮＡ種自体を含み、その種をコードする核酸を含まない。
【0034】
調節エレメント、ターミネーター、及びタグ
本明細書に記載の方法及び構築物と共に使用するための調節エレメントが企図される。用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むことが意図される。そのような調節エレメントは、例えば、Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)に記載される。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を導く調節エレメント、及び特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を導く調節エレメント（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主に、目的の所望の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えばリンパ球）において発現を導いてもよい。調節エレメントはまた、時間依存的に、例えば、細胞周期依存的に又は発達段階依存的に発現を導いてもよく、これは、組織特異的若しくは細胞型特異的であってよく、又はそうでなくてもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ又は複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ又は複数のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ又は複数のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、又はそれらの組み合せを含んでいてもよい。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、限定されないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、限定されないが、（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、（任意にＣＭＶエンハンサーを有する）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、Boshart et al,Cell,41:521-530(1985)を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーター、並びに本明細書に記載されるＰｏｌ ＩＩプロモーターが挙げられる。用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント（Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p.466-472, 1988）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ－グロビンのエクソン２とエクソン３との間のイントロン配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.78(3), p.1527-31, 1981）などのエンハンサーエレメントも包含される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者には理解されるであろう。ベクターを宿主細胞に導入して、それによって、本明細書に記載の核酸によってコードされる、転写物、タンパク質、又は融合タンパク質若しくは融合ペプチドを含むペプチド（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）の転写物、タンパク質、酵素、その変異体形態、その融合タンパク質など）を産生することができる。
本明細書に記載の方法及び構築物と共に使用するための調節エレメントが企図される。用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むことが意図される。そのような調節エレメントは、例えば、Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)に記載される。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を導く調節エレメント、及び特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を導く調節エレメント（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主に、目的の所望の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えばリンパ球）において発現を導いてもよい。調節エレメントはまた、時間依存的に、例えば、細胞周期依存的に又は発達段階依存的に発現を導いてもよく、これは、組織特異的若しくは細胞型特異的であってよく、又はそうでなくてもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ又は複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ又は複数のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ又は複数のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、又はそれらの組み合せを含んでいてもよい。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、限定されないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、限定されないが、（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、（任意にＣＭＶエンハンサーを有する）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、Boshart et al,Cell,41:521-530(1985)を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーター、並びに本明細書に記載されるＰｏｌ ＩＩプロモーターが挙げられる。用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント（Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p.466-472, 1988）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ－グロビンのエクソン２とエクソン３との間のイントロン配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.78(3), p.1527-31, 1981）などのエンハンサーエレメントも包含される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者には理解されるであろう。ベクターを宿主細胞に導入して、それによって、本明細書に記載の核酸によってコードされる、転写物、タンパク質、又は融合タンパク質若しくは融合ペプチドを含むペプチド（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）の転写物、タンパク質、酵素、その変異体形態、その融合タンパク質など）を産生することができる。
【0035】
本明細書に記載される方法の態様は、ターミネーター配列を利用し得る。ターミネーター配列は、転写中にゲノムＤＮＡ内の遺伝子又はオペロンの末端をマークする、核酸配列の部分を含む。この配列は、転写複合体からｍＲＮＡを放出するプロセスを引き起こすシグナルを、新たに合成されたｍＲＮＡに提供することによって、転写終結を媒介する。これらのプロセスは、ｍＲＮＡ二次構造と複合体との直接相互作用、及び／又は動員された終結因子の間接的活性を含む。転写複合体の放出は、ＲＮＡポリメラーゼ及び関連する転写機構を解放して、新しいｍＲＮＡの転写を開始させる。ターミネーター配列には、当技術分野で公知であり、本明細書で同定及び記載されるものが含まれる。
【0036】
本明細書に記載される方法の態様は、エピトープタグ及びレポーター遺伝子配列を利用し得る。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。
【0037】
ウェルプレート
本明細書に記載の方法に有用なウェルプレートは、当技術分野で公知の複数のウェルを含む。ウェルプレートは、一般に、試薬が配置される複数の「ウェル」を有する平らなプレートである。ウェルは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してゲノム編集を行うための試験管又は格納容器として機能する。ウェルプレートは、アドレス可能なアレイであってもよいアレイを形成する長方形マトリックスに配置された、６個、１２個、２４個、４８個、９６個、３８４個、１５３６個、３４５６個、又は９６００個のウェルを有していてもよい。それぞれのウェルは、数十ナノリットル～数ミリリットルの液体を保持していてもよい。ウェルの形状は、円形から正方形まで様々であってもよい。本開示において有用なウェルプレートは市販されている。
本明細書に記載の方法に有用なウェルプレートは、当技術分野で公知の複数のウェルを含む。ウェルプレートは、一般に、試薬が配置される複数の「ウェル」を有する平らなプレートである。ウェルは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してゲノム編集を行うための試験管又は格納容器として機能する。ウェルプレートは、アドレス可能なアレイであってもよいアレイを形成する長方形マトリックスに配置された、６個、１２個、２４個、４８個、９６個、３８４個、１５３６個、３４５６個、又は９６００個のウェルを有していてもよい。それぞれのウェルは、数十ナノリットル～数ミリリットルの液体を保持していてもよい。ウェルの形状は、円形から正方形まで様々であってもよい。本開示において有用なウェルプレートは市販されている。
【0038】
特定の態様によれば、マルチウェルプレートは、５００個以上のウェル、１０００個以上のウェル、３０００個以上のウェルを含む。ある態様によれば、ウェルプレートはエッジウェル（ｅｄｇｅ ｗｅｌｌ）を含み、エッジウェルは、空であるか、又は本明細書に記載のハイスループット法の最中に使用されない。
【0039】
細胞へのＣＲＩＳＰＲ系の導入
特定の態様によれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分をコードする核酸、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分をコードする核酸を含むベクターは、当業者に公知の方法によって細胞に送達され得る。多くの標準的な実験室マニュアル、例えば、Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)及びSambrook et al., MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour.N.Y.(1989)に記載されているものを含む、細胞にＣＲＩＳＰＲ系構成成分を導入するための組成物及び方法が提供されており、これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、形質導入、スクレイプローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）、ヌクレオポレーション、流体力学的衝撃（hydrodynamic shock）、及び感染が含まれる。
特定の態様によれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分をコードする核酸、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分をコードする核酸を含むベクターは、当業者に公知の方法によって細胞に送達され得る。多くの標準的な実験室マニュアル、例えば、Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)及びSambrook et al., MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour.N.Y.(1989)に記載されているものを含む、細胞にＣＲＩＳＰＲ系構成成分を導入するための組成物及び方法が提供されており、これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、形質導入、スクレイプローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）、ヌクレオポレーション、流体力学的衝撃（hydrodynamic shock）、及び感染が含まれる。
【0040】
本発明と共に使用するのに適したトランスフェクション剤としては、細胞へのＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質の導入を促進するトランスフェクション剤が挙げられる。例示的なトランスフェクション試薬としては、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ Ｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ、ＦＵＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ－１０（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ－２０．（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ－５０（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ １（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ２（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ３（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ４（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、及びＥＳＣＯＲＴ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）が挙げられる。
【0041】
ある態様によれば、リポフェクションとは、カチオン性脂質を細胞に導入される材料と混合して、細胞膜と融合し、材料を細胞の内部に沈着させるリポソームを生成する、脂質ベースのトランスフェクション技術である。リポフェクションのためのリポソームを作製するための試薬は市販されており、それらには、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されているＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＲＮＡＩＭＡＸ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＣＲＩＳＰＲＭＡＸが挙げられる。
【0042】
条件は、通常、細胞への所望のレベルのＣＲＩＳＰＲ系構成成分の導入のために、例えば、細胞型ごとに調整される。細胞へのＣＲＩＳＰＲ系構成成分の導入を増強するために、任意の数の条件を変化させてもよい。例示的なインキュベーション条件には、ｐＨ、イオン強度、細胞型、細胞のエネルギー電荷、存在する特定のＣＲＩＳＰＲ系構成成分、ＣＲＩＳＰＲ系構成成分の比（複数のＣＲＩＳＰＲ系構成成分が存在する場合）、ＣＲＩＳＰＲ系構成成分／細胞比、細胞及びＣＲＩＳＰＲ系構成成分の濃度、インキュベーション時間などがある。
【0043】
ある態様によれば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ構成成分は、細胞を含有するウェルに提供され、次いで、一定期間（例えば、約２分～約８時間、約１０分～約８時間、約２０分～約８時間、約３０分～約８時間、約６０分～約８時間、約２０分～約６時間、約２０分～約３時間、約２０分～約２時間、約４５分～約３時間など）にわたってインキュベート又は培養され、次いで、細胞内のＣＲＩＳＰＲ活性、例えば、標的核酸の切断が、当業者に公知の方法を使用して測定される。例えば、核酸全体が、ＣＲＩＳＰＲ系活性について試験される細胞から単離され、次いで、例えば、核酸の標的遺伝子座での切断の代理として変異誘導を測定することによって、標的遺伝子座でそのようであった核酸の量について分析され得る。
【0044】
ウェルプレートのウェルへの系構成成分の送達
ある態様によれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つ又は複数の細胞又は構成成分は、当業者に公知の方法を使用してウェルプレートのウェルに送達される。ある態様によれば、複数のウェルのそれぞれのウェルについて、細胞がウェルに移送され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つ又は複数の構成成分がウェルに移送されるように、１つ又は複数の試薬を含む１つ又は複数のリザーバーに接続された１つ又は複数の導管が設けられているマイクロフルイディクスシステムが使用される。マルチウェルプレートのウェルへの流体の輸送のためのシステム、例えば、マルチドロップディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が市販されている。細胞及びＣＲＩＳＰＲ構成成分が複数のウェルに移送されると、複数のウェルは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分が細胞に提供され、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ酵素、及び標的核酸の間に共局在複合体が形成され、Ｃａｓ酵素が標的核酸を切断し、変異遺伝子が生じる条件下でインキュベートされるか又は他の方法で配置される。
ある態様によれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つ又は複数の細胞又は構成成分は、当業者に公知の方法を使用してウェルプレートのウェルに送達される。ある態様によれば、複数のウェルのそれぞれのウェルについて、細胞がウェルに移送され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つ又は複数の構成成分がウェルに移送されるように、１つ又は複数の試薬を含む１つ又は複数のリザーバーに接続された１つ又は複数の導管が設けられているマイクロフルイディクスシステムが使用される。マルチウェルプレートのウェルへの流体の輸送のためのシステム、例えば、マルチドロップディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が市販されている。細胞及びＣＲＩＳＰＲ構成成分が複数のウェルに移送されると、複数のウェルは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分が細胞に提供され、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ酵素、及び標的核酸の間に共局在複合体が形成され、Ｃａｓ酵素が標的核酸を切断し、変異遺伝子が生じる条件下でインキュベートされるか又は他の方法で配置される。
【0045】
ある態様によれば、細胞、及び／又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分は、ウェルプレートの下に配置された供給源プレートから供給源プレートの上に配置されたウェルプレートのウェルへの試薬の音響液滴射出を使用して、ウェルプレートのウェルに送達される。音波は、供給源から、供給源の上に吊るされたウェルに、正確なサイズの液滴を射出する。例示的な送達システムはＬＡＢＣＹＴＥから市販されており、それらとしては、ＥＣＨＯ液体処理技術（ECHO liquid handling technology）が挙げられる。ある態様によれば、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び標的細胞のうちの１つ若しくは複数又は全部は、音波を使用した、供給源容器からウェルへの液滴移送によってウェルに提供される。
【実施例】
【0046】
以下の実施例は、本開示を代表するものとして記載される。これらの実施例は、これら及び他の同等の実施形態が本開示、図面、及び添付の特許請求の範囲を考慮して明らかになるため、本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【0047】
実施例Ｉ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬のための一般的なトランスフェクションプロトコル
図１に示す概略図を参照して、以下のように細胞をトランスフェクトする。Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及び標的核酸に相補的なガイドＲＮＡをリポフェクション試薬と組み合わせて、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを含むリポソームの混合物（「試薬混合物」）を作製する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、混合物に添加される別個の試薬として別個のリポソームに含めることができる。好適なリポフェクション試薬としては、ＲＮＡＭＡＸ、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ、又はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００などが挙げられる。次いで、音響液滴射出を使用して、試薬混合物をマルチウェルプレートのウェルに送達する。この方法によれば、試薬（又は細胞）を含む流体源が、音響発生器に作動可能に接続される。マルチウェルプレートを、ウェルが流体源に面するように反転位置で流体源の上に配置する。音波を発生させ、液滴を流体源からマルチウェルプレートのウェルの上及び中に射出させ、マルチウェルプレートでは、マルチウェルプレートが反転されているにもかかわらず液滴が保持される。複数のウェルに試薬が同時に提供されるように、複数の流体源をマルチウェルプレートの下に配置してもよい。あるいは、異なる流体源を特定のウェルの下に配置して、例えば、標的細胞の特定の遺伝子を標的とするための固有のｃｒＲＮＡ配列など、特定の試薬をウェルに送達することができる。このように、複数のウェルのそれぞれのウェルは、異なる固有のｃｒＲＮＡを含有してもよい。さらに、異なる流体源を特定のウェルの下に配置して、例えば、標的細胞の異なる遺伝子を標的とするための２つ以上の固有のｃｒＲＮＡ配列など、２つ以上の特定の試薬をウェルに送達することができる。加えて、異なる流体源を特定のウェルの下に配置して、例えば、混合物中の２つ以上の固有のｃｒＲＮＡ配列など、標的細胞の２つ以上の特定の遺伝子を標的とするための２つ以上の特定の試薬を特定のウェルに送達することができる。したがって、本開示は、単一の固有のｃｒＲＮＡを特定のウェルに送達することだけでなく、複数の固有のｃｒＲＮＡを特定のウェルに送達して、単一のウェル内の単数又は複数の細胞内の複数の遺伝子を標的とすることも企図する。ガイドＲＮＡのウェル濃度は、１０ｎｍ～１μｍｏｌ、例えば、２５ｐｍｏｌ～１２５ｐｍｏｌであってもよい。Ｃａｓ酵素のウェル濃度は、１ｎＭ～１５０ｎＭ、例えば、６０ｎＭ～８０ｎＭである。次いで、音響液滴射出システム又はマルチドロップディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかを使用して、試薬混合物を含むそれぞれのウェルに細胞を添加する。細胞を試薬混合物と２４時間インキュベートする。次いで、培地を交換し、細胞をさらに９６時間インキュベートする。次いで、細胞をウェルから取り除き、固定し、染色し、画像化する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬のための一般的なトランスフェクションプロトコル
図１に示す概略図を参照して、以下のように細胞をトランスフェクトする。Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及び標的核酸に相補的なガイドＲＮＡをリポフェクション試薬と組み合わせて、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを含むリポソームの混合物（「試薬混合物」）を作製する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、混合物に添加される別個の試薬として別個のリポソームに含めることができる。好適なリポフェクション試薬としては、ＲＮＡＭＡＸ、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ、又はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００などが挙げられる。次いで、音響液滴射出を使用して、試薬混合物をマルチウェルプレートのウェルに送達する。この方法によれば、試薬（又は細胞）を含む流体源が、音響発生器に作動可能に接続される。マルチウェルプレートを、ウェルが流体源に面するように反転位置で流体源の上に配置する。音波を発生させ、液滴を流体源からマルチウェルプレートのウェルの上及び中に射出させ、マルチウェルプレートでは、マルチウェルプレートが反転されているにもかかわらず液滴が保持される。複数のウェルに試薬が同時に提供されるように、複数の流体源をマルチウェルプレートの下に配置してもよい。あるいは、異なる流体源を特定のウェルの下に配置して、例えば、標的細胞の特定の遺伝子を標的とするための固有のｃｒＲＮＡ配列など、特定の試薬をウェルに送達することができる。このように、複数のウェルのそれぞれのウェルは、異なる固有のｃｒＲＮＡを含有してもよい。さらに、異なる流体源を特定のウェルの下に配置して、例えば、標的細胞の異なる遺伝子を標的とするための２つ以上の固有のｃｒＲＮＡ配列など、２つ以上の特定の試薬をウェルに送達することができる。加えて、異なる流体源を特定のウェルの下に配置して、例えば、混合物中の２つ以上の固有のｃｒＲＮＡ配列など、標的細胞の２つ以上の特定の遺伝子を標的とするための２つ以上の特定の試薬を特定のウェルに送達することができる。したがって、本開示は、単一の固有のｃｒＲＮＡを特定のウェルに送達することだけでなく、複数の固有のｃｒＲＮＡを特定のウェルに送達して、単一のウェル内の単数又は複数の細胞内の複数の遺伝子を標的とすることも企図する。ガイドＲＮＡのウェル濃度は、１０ｎｍ～１μｍｏｌ、例えば、２５ｐｍｏｌ～１２５ｐｍｏｌであってもよい。Ｃａｓ酵素のウェル濃度は、１ｎＭ～１５０ｎＭ、例えば、６０ｎＭ～８０ｎＭである。次いで、音響液滴射出システム又はマルチドロップディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかを使用して、試薬混合物を含むそれぞれのウェルに細胞を添加する。細胞を試薬混合物と２４時間インキュベートする。次いで、培地を交換し、細胞をさらに９６時間インキュベートする。次いで、細胞をウェルから取り除き、固定し、染色し、画像化する。
【0048】
実施例ＩＩ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬のための一般的なトランスフェクションプロトコル（Ｃａｓ９の事前処理）
図２を参照すると、細胞をガイドＲＮＡと接触させる前に、細胞をリポフェクション試薬中でＣａｓ９ｍＲＮＡと組み合わせて、Ｃａｓ９を細胞に添加する。次いで、Ｃａｓ９を含むようにトランスフェクトされた細胞をリポフェクション試薬中でガイドＲＮＡと混合し、マルチドロップディスペンサー又は音響液滴射出のいずれかを使用して混合物をマルチウェルプレートのウェルに添加する。あるいは、Ｃａｓ９を含むようにトランスフェクトされた細胞をウェルに添加してもよく、次いで、ガイドＲＮＡを含有するリポソームを作製するためにリポフェクション試薬を用いて処理されたガイドＲＮＡ試薬を、ウェルに添加してもよい。好適なリポフェクション試薬としては、ＲＮＡＭＡＸ、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ、又はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００が挙げられる。ガイドＲＮＡのウェル濃度は、１０ｎｍ～１μｍｏｌ、例えば、２５ｐｍｏｌ～１２５ｐｍｏｌであってもよい。細胞を試薬混合物と２４時間インキュベートする。次いで、培地を交換し、細胞をさらに９６時間インキュベートする。次いで、細胞をウェルから取り除き、固定し、染色し、画像化する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬のための一般的なトランスフェクションプロトコル（Ｃａｓ９の事前処理）
図２を参照すると、細胞をガイドＲＮＡと接触させる前に、細胞をリポフェクション試薬中でＣａｓ９ｍＲＮＡと組み合わせて、Ｃａｓ９を細胞に添加する。次いで、Ｃａｓ９を含むようにトランスフェクトされた細胞をリポフェクション試薬中でガイドＲＮＡと混合し、マルチドロップディスペンサー又は音響液滴射出のいずれかを使用して混合物をマルチウェルプレートのウェルに添加する。あるいは、Ｃａｓ９を含むようにトランスフェクトされた細胞をウェルに添加してもよく、次いで、ガイドＲＮＡを含有するリポソームを作製するためにリポフェクション試薬を用いて処理されたガイドＲＮＡ試薬を、ウェルに添加してもよい。好適なリポフェクション試薬としては、ＲＮＡＭＡＸ、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ、又はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００が挙げられる。ガイドＲＮＡのウェル濃度は、１０ｎｍ～１μｍｏｌ、例えば、２５ｐｍｏｌ～１２５ｐｍｏｌであってもよい。細胞を試薬混合物と２４時間インキュベートする。次いで、培地を交換し、細胞をさらに９６時間インキュベートする。次いで、細胞をウェルから取り除き、固定し、染色し、画像化する。
【0049】
実施例ＩＩＩ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬のための一般的なトランスフェクションプロトコル（ウェルごとに異なるｇＲＮＡ）
図３に示す概略図を参照して、以下のように細胞をトランスフェクトする。例えば、マルチドロップディスペンサーを使用して、又は音響液滴射出を使用して、１５３６マルチウェルプレートのウェルに細胞を送達する。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをリポフェクション試薬と組み合わせて、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含むリポソームを作製し、次いで、これを、例えば、マルチドロップディスペンサーを使用して、又は音響液滴射出を使用してウェルに添加する。それぞれの異なるガイドＲＮＡをリポフェクション試薬と組み合わせてガイドＲＮＡを含むリポソームを作製することによって、標的核酸に相補的な異なるガイドＲＮＡをそれぞれ含む試薬を作製する。好適なリポフェクション試薬としては、ＲＮＡＭＡＸ、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ、又はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００が挙げられる。それぞれの異なるガイドＲＮＡ試薬を、マルチドロップディスペンサーを使用して、又は音響液滴射出を使用して、異なるウェルに添加する。ガイドＲＮＡのウェル濃度は、１０ｎｍ～１μｍｏｌ、例えば、２５ｐｍｏｌ～１２５ｐｍｏｌであってもよい。Ｃａｓ酵素のウェル濃度は、１ｎＭ～１５０ｎＭ、例えば、６０ｎＭ～８０ｎＭである。細胞を試薬混合物と２４時間インキュベートする。次いで、培地を交換し、細胞をさらに９６時間インキュベートする。次いで、細胞をウェルから取り除き、固定し、染色し、画像化する。それぞれのウェルは、異なるゲノム改変を有する細胞を含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬のための一般的なトランスフェクションプロトコル（ウェルごとに異なるｇＲＮＡ）
図３に示す概略図を参照して、以下のように細胞をトランスフェクトする。例えば、マルチドロップディスペンサーを使用して、又は音響液滴射出を使用して、１５３６マルチウェルプレートのウェルに細胞を送達する。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをリポフェクション試薬と組み合わせて、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含むリポソームを作製し、次いで、これを、例えば、マルチドロップディスペンサーを使用して、又は音響液滴射出を使用してウェルに添加する。それぞれの異なるガイドＲＮＡをリポフェクション試薬と組み合わせてガイドＲＮＡを含むリポソームを作製することによって、標的核酸に相補的な異なるガイドＲＮＡをそれぞれ含む試薬を作製する。好適なリポフェクション試薬としては、ＲＮＡＭＡＸ、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ、又はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００が挙げられる。それぞれの異なるガイドＲＮＡ試薬を、マルチドロップディスペンサーを使用して、又は音響液滴射出を使用して、異なるウェルに添加する。ガイドＲＮＡのウェル濃度は、１０ｎｍ～１μｍｏｌ、例えば、２５ｐｍｏｌ～１２５ｐｍｏｌであってもよい。Ｃａｓ酵素のウェル濃度は、１ｎＭ～１５０ｎＭ、例えば、６０ｎＭ～８０ｎＭである。細胞を試薬混合物と２４時間インキュベートする。次いで、培地を交換し、細胞をさらに９６時間インキュベートする。次いで、細胞をウェルから取り除き、固定し、染色し、画像化する。それぞれのウェルは、異なるゲノム改変を有する細胞を含む。
【0050】
ガイドＲＮＡが標的とする代表的な遺伝子としては、図３に示すものが挙げられる。
【0051】
実施例ＩＶ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬のための一般的なトランスフェクションプロトコル（試薬の組み合せ）
本開示の態様によれば、例えば、マルチドロップディスペンサーを使用して、又は音響液滴射出を使用して、様々な試薬を様々な時間及び様々な順序で添加することができる。一般に、図４を参照して、本明細書に記載される、複数の標的細胞を遺伝子改変するための方法は、（ａ）第１のウェルプレートの複数のウェルのそれぞれにおいて、（１）ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、ここで、ｃｒＲＮＡ部分は、標的遺伝子に相補的な固有のスペーサーを含む、（２）前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（３）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（４）標的細胞を組み合わせるステップ、並びに（ｂ）前記複数のウェル内で前記複数の標的細胞をインキュベートするステップ、ここで、前記ｃｒＲＮＡ部分及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、前記ガイドＲＮＡを形成し、前記Ｃａｓ酵素及び前記ガイドＲＮＡは、前記標的細胞の前記標的遺伝子と共局在複合体を形成し、前記Ｃａｓ酵素は、前記標的遺伝子を切断し、前記標的遺伝子を変異させる、を含み、それぞれのウェル内の前記ｃｒＲＮＡ部分の前記固有のスペーサー配列は、異なる標的遺伝子に相補的であり、それぞれのウェル内のそれぞれの固有のスペーサー配列の前記第１のウェルプレート内における位置は既知であり、それぞれのウェル内の前記標的細胞は、異なる標的遺伝子が変異している。前記プロセスは所与のセットのｃｒＲＮＡについて繰り返されるが異なるウェル位置にｃｒＲＮＡを提供してもよく、又は前記プロセスはゲノムの一部若しくはゲノム全体に対応する異なるセットのｃｒＲＮＡについて行われてもよい。このように、ＣＲＩＳＰＲ試薬を使用するハイスループット法が、アドレス可能なアレイ、及びゲノム規模でのウェル当たりの単一ノックアウト変異を使用して提供される。細胞は、例えば、細胞ペインティング及び高次元分析を使用して分析されてもよい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬のための一般的なトランスフェクションプロトコル（試薬の組み合せ）
本開示の態様によれば、例えば、マルチドロップディスペンサーを使用して、又は音響液滴射出を使用して、様々な試薬を様々な時間及び様々な順序で添加することができる。一般に、図４を参照して、本明細書に記載される、複数の標的細胞を遺伝子改変するための方法は、（ａ）第１のウェルプレートの複数のウェルのそれぞれにおいて、（１）ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、ここで、ｃｒＲＮＡ部分は、標的遺伝子に相補的な固有のスペーサーを含む、（２）前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（３）Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び（４）標的細胞を組み合わせるステップ、並びに（ｂ）前記複数のウェル内で前記複数の標的細胞をインキュベートするステップ、ここで、前記ｃｒＲＮＡ部分及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、前記ガイドＲＮＡを形成し、前記Ｃａｓ酵素及び前記ガイドＲＮＡは、前記標的細胞の前記標的遺伝子と共局在複合体を形成し、前記Ｃａｓ酵素は、前記標的遺伝子を切断し、前記標的遺伝子を変異させる、を含み、それぞれのウェル内の前記ｃｒＲＮＡ部分の前記固有のスペーサー配列は、異なる標的遺伝子に相補的であり、それぞれのウェル内のそれぞれの固有のスペーサー配列の前記第１のウェルプレート内における位置は既知であり、それぞれのウェル内の前記標的細胞は、異なる標的遺伝子が変異している。前記プロセスは所与のセットのｃｒＲＮＡについて繰り返されるが異なるウェル位置にｃｒＲＮＡを提供してもよく、又は前記プロセスはゲノムの一部若しくはゲノム全体に対応する異なるセットのｃｒＲＮＡについて行われてもよい。このように、ＣＲＩＳＰＲ試薬を使用するハイスループット法が、アドレス可能なアレイ、及びゲノム規模でのウェル当たりの単一ノックアウト変異を使用して提供される。細胞は、例えば、細胞ペインティング及び高次元分析を使用して分析されてもよい。
【0052】
ある態様によれば、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、及びＣａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソームは、標的細胞がウェルに提供される前にウェルに提供される。ある態様によれば、標的細胞は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、及びＣａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソームとがウェルに提供される前にウェルに提供される。ある態様によれば、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び標的細胞は、前記ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソームがウェルに提供される前にウェルに提供される。ある態様によれば、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソームは、前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び標的細胞がウェルに提供される前にウェルに提供される。ある態様によれば、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソームは、前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び標的細胞がウェルに提供された後にウェルに提供される。ある態様によれば、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、及びＣａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソームは、混合物としてウェルに提供される。ある態様によれば、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び標的細胞は、混合物としてウェルに提供される。ある態様によれば、Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソーム、及び標的細胞は、混合物としてウェルに提供される。ある態様によれば、細胞は、標的細胞がウェルに提供される前に、Ｃａｓ酵素をコードする核酸によってトランスフェクトされる。ある態様によれば、（１）ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を含むリポソーム、（２）前記ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むリポソームと、Ｃａｓ酵素をコードする核酸配列又はＣａｓ酵素を含むリポソームとの混合物、及び（３）標的細胞は、ウェルに別個に提供される。ある態様によれば、一般的な方法のための上記のステップ（ａ）及び（ｂ）は、第２のウェルプレートについて繰り返され、ここで、第１のウェルプレートのウェルに提供されるそれぞれの固有のスペーサー配列は、第２のウェルプレート内において第１のウェルプレートとは異なる位置に提供される。ある態様によれば、一般的な方法のための上記のステップ（ａ）及び（ｂ）は、複数のウェルプレートについて繰り返され、ここで、第１のウェルプレートのウェルに提供されるそれぞれの固有のスペーサー配列は、前記複数のウェルプレート及び第１のウェルプレートのそれぞれにおいて異なる位置に提供される。
【0053】
ある態様によれば、ゲノム全体のそれぞれの遺伝子に関するＣＲＩＳＰＲ活性は、それぞれの遺伝子のハイスループット遺伝子変異を使用して、アッセイ又は分析され得る。ｃｒＲＮＡは、それぞれの遺伝子について設計される。それぞれのｃｒＲＮＡを単一のウェルに導き、本明細書に記載されるように１５３６マルチウェルプレートを使用して、標的細胞のゲノム全体が、約１２００個の１５３６マルチウェルプレートを使用してＣＲＩＳＰＲ活性についてアッセイされ得る。このような全ゲノムアッセイは、約４００プレート／週を処理する場合、約３週間で行われ得る。
【0054】
ある態様によれば、本明細書に提供され、上記で説明された方法により、様々なウェル位置から得られるが特定の遺伝子の切断に関するデータを生成することによって、ＣＲＩＳＰＲ活性のランダム化が可能になる。このように、ウェル位置によって生成される任意の影響又はアーチファクトを最小限に抑えることができる。
【0055】
実施例Ｖ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬のための特異的トランスフェクションプロトコル
細胞のリポフェクションを準備するために、試薬を１５３６ウェルプレートに反復的に添加する。まず、Ｅｃｈｏ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｅｒを使用して、ｃｒＲＮＡをプレートに分注する。１０ｕＬの１種類又は複数種類のｃｒＲＮＡを２００ｕＭの濃度でそれぞれのウェルに分注する。分注後、これらのプレートを密封し、４℃で保存する。これらのプレートを４℃で１ヶ月間以内、保存すべきである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬のための特異的トランスフェクションプロトコル
細胞のリポフェクションを準備するために、試薬を１５３６ウェルプレートに反復的に添加する。まず、Ｅｃｈｏ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｅｒを使用して、ｃｒＲＮＡをプレートに分注する。１０ｕＬの１種類又は複数種類のｃｒＲＮＡを２００ｕＭの濃度でそれぞれのウェルに分注する。分注後、これらのプレートを密封し、４℃で保存する。これらのプレートを４℃で１ヶ月間以内、保存すべきである。
【0056】
本明細書に記載の方法に従って、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を調製する。１５３６ウェルプレートのそれぞれは、３．２ｍＬのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を必要とする。以下の表１及び表２は、１ｍＬに対する量を示す。当業者であれば、所望の実験のサイズに基づいて量を調整又は増大することができる。２本の１５ｍＬコニカルチューブを「Ａ」及び「Ｂ」と標識する。表１に列挙した試薬をそれらが列挙されている順序で組み合わせ、ｔｒａｃｒＲＮＡと、必要であれば、所望により、細胞へのＣａｓ９トランスフェクションを補助する構成成分、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販されているＣａｓ９ ＰＬＵＳとを添加した後にボルテックスを確実に行うことによって、チューブＡを準備する。チューブを室温で５分間静置した後、次のステップで使用する。
【0057】
【表1】
【0058】
表２に列挙された順序で試薬を組み合わせることによって、チューブＢを準備する。
【0059】
【表2】
【0060】
このチューブを室温で５分間静置した後、次のステップで使用する。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物の調製を完了するために、チューブＡの内容物をチューブＢに注ぐ。混合物が組み合わされるまで、それらを一緒に穏やかに旋回させる。
【0061】
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物の準備ができたら、それを１５３６ウェルプレートに添加する。自動液体ハンドラーを使用して、ウェル当たり２ｕＬの混合物を分注する。これに続いて、自動液体ハンドラーを使用して、それぞれのウェルに１２５，０００細胞／ｍＬで８ｕＬの細胞を分注する。１時間後、プレートをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及び細胞とともに３７℃のインキュベーターに移す。２４時間後、プレート上の培地を交換して、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を除去する。この培地交換では、当該の細胞型に適した培地が使用される必要がある。追加の４８時間の後（又は実験に入って７２時間後）に、２回目の培地交換を行う。９６時間後、試料は下流分析の準備が整う。
【0062】
上記の手順について、遺伝子ノックアウトを検証した。本明細書に記載の方法を使用した細胞の編集の成功を確認するために、特定の遺伝子ノックアウトを標的とした細胞の蛍光画像を分析した。第１の例では、細胞ゲノムＤＮＡのサンガーシーケンシングを使用して、遺伝子編集率を測定した。この方法は、それぞれの試料中の未編集細胞に対する、ＣＲＩＳＰＲを使用して編集された細胞の割合を検出することができる。図５の第１のパネルは、編集された細胞を生成するために遺伝子ＭＦＮ２に対して６つの異なるＣＲＩＳＰＲ試薬を使用した結果を詳述しており、前記方法が約５０％の編集率をもたらすことができることを実証している。図５の第２のパネルは、同じ手順であるが、遺伝子ＰＬＫ１及びＯＰＡ１について行われた結果を含む。両パネルは、細胞の観察可能な編集を実証している。
【0063】
遺伝子編集をさらに確認するために、ＭＦＮ２遺伝子及びＯＰＡ１遺伝子をノックアウトの標的とし、細胞を蛍光色素によって染色して、ミトコンドリア形態のパターンを観察した。これらの遺伝子はともに、細胞内のミトコンドリアの安定性を調節するために必要であり、これらの遺伝子を除去するとミトコンドリアが断片化される。これにより、ミトコンドリアは、図６の第１のパネルに例示されるように、糸状のスパゲティ様の形態から、点状の分散した形態になる。ＭＦＮ２、ＯＰＡ１、又は非標的化対照試薬を用いて処理した細胞から得られた画像の切片を分析することにより、ＭＦＮ２又はＯＰＡ１のノックアウトを標的とするウェルは、断片化されたミトコンドリア表現型を含有する。
【0064】
第２の例では、細胞周期に関与するタンパク質であるＰＬＫ１の欠失について細胞を標的とした。ＰＬＫ１のノックアウトは、細胞死又は多核細胞のいずれかをもたらす。図７の第１のパネルは、ＰＬＫ１遺伝子を標的とする様々な試薬を用いて細胞を処理した場合の１５３６ウェルプレートに観察された細胞数の分布を示す。対照と比較して、６つのＰＬＫ１標的化試薬のうちの４つは、観察される細胞数を有意に減少させ、これは、ＰＬＫ１ノックアウトの予測される効果である。さらに、細胞数減少ＰＬＫ１試薬によって標的とされるウェルでは、多核細胞も観察される。この一例が図７に示されており、多核細胞は赤色で囲まれている。この表現型は、未編集細胞の同様の試料では観察されない。
【0065】
上記の実験は、培養細胞に、予測可能な可視的表現型がもたらされることを実証している。
【0066】
本明細書に引用されるすべての特許、公開出願、及び参考文献の教示は、参照によりその全体が組み込まれる。
【0067】
本発明をその例示的な実施形態を参照して特に示し説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更を行うことができることが当業者には理解されるであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】