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特表2024-500686クチナーゼによる、酵素を使用した再生ポリエチレンテレフタレートリサイクル
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-10
(54)【発明の名称】クチナーゼによる、酵素を使用した再生ポリエチレンテレフタレートリサイクル
(51)【国際特許分類】
C08J 11/10 20060101AFI20231227BHJP
C12N 9/16 20060101ALN20231227BHJP
【ＦＩ】
C08J11/10 ZAB
C12N9/16 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023535866
(86)(22)【出願日】2021-12-13
(85)【翻訳文提出日】2023-06-13
(86)【国際出願番号】 EP2021085364
(87)【国際公開番号】W WO2022135985
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】20217177.3
(32)【優先日】2020-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】590002013
【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100140453
【弁理士】
【氏名又は名称】戸津 洋介
(72)【発明者】
【氏名】ベルナー， ティム
(72)【発明者】
【氏名】ルートハンス， ニーナ， クリスティーナ， マリア
【テーマコード（参考）】
4F401
【Ｆターム（参考）】
4F401AA09
4F401AA22
4F401AA26
4F401AC10
4F401AD01
4F401BA13
4F401CA14
4F401CA49
4F401CA76
4F401CB14
4F401FA01Z
4F401FA06Z
4F401FA07Z
4F401FA08Z
4F401FA20Z
(57)【要約】
本発明は、全般的に、再生ポリエチレンテレフタレート（ｒＰＥＴ）の、例えば、多層包装におけるｒＰＥＴ層の分解の分野に関する。例えば、本発明は、ｒＰＥＴを少なくとも１種のクチナーゼに供する工程を含む、ｒＰＥＴを分解する方法に関する。ｒＰＥＴは、包装に含まれる多層包装構造における、ｒＰＥＴを主原料とする層であってもよい。注目すべきことに、本発明の主題により、多層包装材料中のｒＰＥＴ含有層の選択的分解が可能になる。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
再生ポリエチレンテレフタレート（ｒＰＥＴ）を分解する方法であって、前記ｒＰＥＴを少なくとも１種のクチナーゼに供する工程を含む、方法。
【請求項2】
前記少なくとも１種のクチナーゼが、Ｔｈｆ＿Ｃｕｔ、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ１、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ２、ＢＣ－ＣＵＴ－０１３、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記少なくとも１種のクチナーゼが、粗抽出物として使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１種のクチナーゼが、ポリマー１ｍｇ当たり少なくとも０．６５μｇのタンパク質、又はポリマー１ｍｇ当たり６μｇのタンパク質、又はポリマー１ｍｇ当たり５０μｇのタンパク質の酵素添加量で使用される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ｒＰＥＴが、２０～５０℃、例えば３０～４０℃の範囲の温度で、前記少なくとも１種のクチナーゼに供される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ｒＰＥＴが、約６～９の範囲、例えば約６．５～８の範囲のｐＨで、前記少なくとも１種のクチナーゼに供される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ｒＰＥＴが、少なくとも２日間、少なくとも７日間、又は少なくとも１５日間、前記少なくとも１種のクチナーゼに供される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ｒＰＥＴが包装中に存在する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記包装が、少なくとも２層のポリマー層を備える多層包装構造を備え、前記ポリマー層が、ｒＰＥＴを主原料とする層と、ポリウレタン（ＰＵ）を主原料とする層、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を主原料とする層、ポリエチレン（ＰＥ）を主原料とする層、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１層とを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
多層包装における少なくとも１層のｒＰＥＴを主原料とする層を選択的に剥離するために使用される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ｒＰＥＴが、多層包装構造を備える包装中に存在し、前記多層包装構造が、リサイクル可能なベース層、例えばＰＥを主原料とする層と、少なくとも１層のｒＰＥＴ層とを備え、前記方法が、前記少なくとも１層のｒＰＥＴを主原料とする層を分解すること及び前記ベース層をリサイクルの流れに供することによって、前記多層包装材料をリサイクルするために使用される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記方法が、前記ｒＰＥＴ及び／又は前記ｒＰＥＴ含有材料を少なくとも１種のクチナーゼに供する前又は供する間に、前記ｒＰＥＴ及び／又は前記ｒＰＥＴ含有材料例えば前記ｒＰＥＴ含有包装の粒子径を小さくする工程を更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
機械的処理によって前記粒子径を小さくし、平均直径が約５ｍｍ未満、約１ｍｍ未満、又は約０．５ｍｍ未満の直径の粒子にする、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記方法が密閉容器中で実施される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、全般的に、再生ポリエチレンテレフタレート（ｒＰＥＴ）、例えば多層包装におけるｒＰＥＴ層の分解の分野に関する。例えば、本発明は、ｒＰＥＴを少なくとも１種のクチナーゼに供する工程を含む、ｒＰＥＴを分解する方法に関する。ｒＰＥＴは、包装に含まれる多層包装構造における、ｒＰＥＴを主原料とする層であってもよい。注目すべきことに、本発明の主題により、多層包装材料中のｒＰＥＴ含有層の選択的分解が可能になる。
【背景技術】
【0002】
プラスチックの生産量は、過去６０年間にわたって増加し続けており、２０１７年には３億４８００万トンに達している（Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｅｕｒｏｐｅ，２０１８）。包装は、プラスチックを使用する主要部門であり、市場需要のほぼ４０％を占めている（Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｅｕｒｏｐｅ，２０１８）。その大部分は使い捨てプラスチックからなり、寿命が短く、消費者が入手して程なくして廃棄物となる。プラスチックの蓄積は、不適切な廃棄、又は廃棄物の埋め立て地での堆積と併せて、プラスチックの高い分解耐性に起因する、現代の主要な環境問題であることは常識である。過去数年にわたり、埋め立て地でのプラスチック堆積を避けるための努力がなされている（Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｅｕｒｏｐｅ、２０１８年）。それでもなお、大量の包装用プラスチックが廃棄物となるため、排出される廃棄物の量と、プラスチックを生産するための資源消費とを同時に最小化する効率的なリサイクル技術が必要とされている。
【0003】
包装に使用されるポリマーは、炭素－炭素骨格を有するもの［例：ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）］、及びヘテロ原子骨格を有するもの［例：ポリエステル、ポリウレタン（ＰＵ）］の２種類に大別することができる。Ｃ－Ｃ結合を切断するのに高いエネルギーが必要とされるため、炭化水素は、分解に対して非常に耐性が高い（Ｍｉｃｒｏｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０（６），１３０８－１３２２）。一方、ポリエステル及びポリウレタンは加水分解可能なポリエステル結合を有するため、非生物的分解及び生物的分解に対して耐性が低い。
最も一般的なポリエステルは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）である（Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｅｕｒｏｐｅ，２０１８）。その使用量の多さから、ＰＥＴをリサイクルする能力は産業の重要な焦点である。Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｒｅｃｙｃｌｅｒ Ｅｕｒｏｐｅによる最近の評価では、欧州のＰＥＴリサイクル能力は２０１７年に２１０万トンであった。バージンＰＥＴの使用量の低減を目的として、リサイクルＰＥＴ（ｒＰＥＴ）の使用が、包装材料中の唯一のＰＥＴ源とすること、並びにバージンＰＥＴと組み合わせてバージンＰＥＴとｒＰＥＴの複合材料とすること、の両方により産業界において増加している。最近、例えばｒＰＥＴのみから製造されたボトルが市販されている。結果として、例えば米国におけるＩＨＳ Ｍａｒｋｉｔ分析によれば、ｒＰＥＴは、毎年生産及び消費されるＰＥＴ包装樹脂の約１２～１４パーセントを構成する。
最も一般的なポリエステルは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）である（Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｅｕｒｏｐｅ，２０１８）。その使用量の多さから、ＰＥＴをリサイクルする能力は産業の重要な焦点である。Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｒｅｃｙｃｌｅｒ Ｅｕｒｏｐｅによる最近の評価では、欧州のＰＥＴリサイクル能力は２０１７年に２１０万トンであった。バージンＰＥＴの使用量の低減を目的として、リサイクルＰＥＴ（ｒＰＥＴ）の使用が、包装材料中の唯一のＰＥＴ源とすること、並びにバージンＰＥＴと組み合わせてバージンＰＥＴとｒＰＥＴの複合材料とすること、の両方により産業界において増加している。最近、例えばｒＰＥＴのみから製造されたボトルが市販されている。結果として、例えば米国におけるＩＨＳ Ｍａｒｋｉｔ分析によれば、ｒＰＥＴは、毎年生産及び消費されるＰＥＴ包装樹脂の約１２～１４パーセントを構成する。
【0004】
プラスチック包装は、通常、単一のポリマーで構成されていない。むしろ多くの場合、プラスチックの特定の用途に関連する一定の特性（弾性、親水性、耐久性又は水バリア性及びガスバリア性）を得るためには、異なるポリマーのブレンド又は異なるポリマーからなる多層が必要である（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５９，５８－６４）。また、包装材料は、一般に、接着剤、コーティング、並びに可塑剤、安定剤及び着色剤などの添加剤を含有する（Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ，３６４（１５２６），２１１５－２１２６）。これにより、一部の包装材料のリサイクルは非常に困難である。
【0005】
現在のプラスチック廃棄物リサイクル技術は、主に熱機械的プロセスからなり、ケミカルリサイクルは産業化の初期段階にある。メカニカルリサイクルには清浄な廃棄物ストリームの投入が必要であるが、この投入は、汚染された複雑な包装構造物の場合、それぞれ事前の洗浄工程及び分離工程を経ることで達成され得る。したがって、現在の多層包装リサイクル率は非常に低い。むしろ、多層包装は、ほとんど焼却されるか、埋め立て処分されている。更にメカニカルリサイクルプロセスでは、多くの場合、特性が低下し、及び食品用としての品質が限定された劣化したプラスチックが得られるため、本来の価値や用途が失われる。そのため、これらの材料は、通常、より価値の低い二次製品に使用される。一方、ケミカルリサイクルプロセスでは、ポリマーのビルディングブロックを回収し、プラスチックの再製造に使用することができるよう、開発が進められている。しかしながら、このプロセスは経済的コスト及びエネルギーコストが高く、通常、極端な条件及び刺激の強い化学物質を必要とする。したがって、これらの技術は、複雑な多層プラスチック材料には理想的ではない（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１７），５９，５８－６４）。
【0006】
多層プラスチック包装の各構成要素を選択的に取り外し、リサイクルすることができる技術があれば、元の包装を再製造し、リサイクルを混合プラスチック包装廃棄物や材料へ拡大できる可能性がある。
【0007】
酵素は基質に対する選択性が高いため、リサイクルプロセスへ応用できる可能性が高い。酵素により、各層を選択的に分解して、その後の新しいプラスチック製造に使用することができる出発ビルディングブロック、又は付加価値のある化学物質にすることが可能になる。難分解性プラスチックの酵素分解及び微生物分解は、過去数年にわたり、特にＰＥＴを中心に研究が進んでいる（Ｍｉｃｒｏｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０（６），１３０２－１３０７）。プラスチックの酵素分解は困難であるが、プラスチック包装の製造に使用されるポリエステルを分解することができる酵素が存在する。しかしながら、酵素の分解効率は、様々なクラス及び種類の酵素によって異なり、実験を実施した条件が、分解の程度に大きく影響を与える。加えて、ポリマーの特性、例えば結晶化度及び組成も、分解速度に強い影響を与える。
【0008】
ポリマーの酵素分解の効率を上げる努力がなされてきたが、ほとんどの研究は純粋な材料に対して行われたものである。これらの研究により、プラスチックの酵素分解に関する良好な初期知見が提供されるが、これらのプラスチックは、ポリマーが単離されておらず、添加剤が存在し得る実際の包装材料を代表するものではない。更に、実験条件、酵素の特性、ポリマーの特性が分解プロセスに及ぼす影響についての深い理解が欠けている。
したがって、多層包装の選択的リサイクルプロセスを考案することは、非常に重要である。
したがって、多層包装の選択的リサイクルプロセスを考案することは、非常に重要である。
【0009】
したがって、費用効率がよく、高品質の材料をもたらし、過酷な処理条件を必要としない、多層包装におけるｒＰＥＴベースの層を選択的に分解（剥離）するために使用することができる利用可能なプロセスを有することが望ましい。
【0010】
ＰＥＴはクチナーゼによって分解され得ることが知られているが（Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１９）９：１６０３８）、従来技術は、発明者の知る限り、リサイクルＰＥＴ（ｒＰＥＴ）の酵素的加水分解に関する情報を欠いている。典型的には、機械的リサイクル中の熱加水分解による分子量の減少によって引き起こされる、バージンＰＥＴと比較したｒＰＥＴの質の低下を補うために、鎖延長剤が一般的に使用される（Ｄ．Ｓ．Ａｃｈｉｌｉａｓ（Ｅｄ．），Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｃｙｃｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，ＩｎＴｅｃｈ，Ｒｉｊｅｋａ，Ｃｒｏａｔｉａ（２０１２），ｐｐ．８５－１１４）。このような化学的修飾は、分子量を増加させ、部分的な架橋をもたらし、ＰＥＴと比較してｒＰＥＴの全体的な化学的性質を変化させる（Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００１，７９（１０），１８１６－１８２４を参照されたい）。したがって、ｒＰＥＴ及びＰＥＴの組成及び特性が異なることが知られている。例えば、Ｐａｃｋａｇ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｓｃｉ．２０２０；３３：３５９－３７１は、これらの差異のいくつかを掲載している。１つの結果として、例えば、ｒＰＥＴは、典型的にはＰＥＴよりも高い結晶化度を有する（Ｔｈｅｒｍｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌｕｍｅ ６８３，Ｊａｎｕａｒｙ ２０２０，１７８４７２）。より高い結晶化度は、酵素による加水分解効率に悪影響を及ぼす可能性がある。さらに、延長剤による化学修飾は、例えば、酵素的加水分解に影響を与える。すなわち、クチナーゼはＰＥＴを分解することができることが知られているからといって、クチナーゼをｒＰＥＴの分解にも使用できると結論付けることはできない。
【0011】
しかしながら、ｒＰＥＴ、例えばｒＰＥＴボトルなどのｒＰＥＴ食品包装を酵素により加水分解し、多層包装中に存在する１層以上のｒＰＥＴ層を剥離するためのプロセスであって、バージン再生ＰＥＴ（ｒＰＥＴ）を再生成するためのモノマーを生成することを可能にし、ひいては、例えば食品包装用途又は他の高価値用途のために再生ｒＰＥＴを再使用することを可能にする、プロセスを利用可能にすることが望ましい。
【0012】
重要なことに、純粋なＰＥＴの結晶化度は、溶融及び冷却（急冷）によって、例えば押出によって変化させることができることが知られているが、この手法では分離することができず、したがって、例えば押出プロセスを適用不可能にする異なるポリマー特性のために、多層構造体には不可能である。したがって、ｒＰＥＴ／ＰＥＴ含有多層包装のための効率的な酵素的解重合及び層間剥離プロセスが切に必要とされている。
【0013】
本明細書における先行技術文献のいかなる参照も、かかる先行技術が周知であること、又は当分野で共通の全般的な認識の一部を形成していることを認めるものとみなされるべきではない。
【0014】
［発明の概要］
したがって、本発明の目的は、現在の技術水準を向上又は改善することであり、特に、当技術分野において、ｒＰＥＴ、例えば、多層包装中に適用されたｒＰＥＴを分解する方法であって、層の事前分離を必要とせず、刺激の強い化学物質及び／若しくは過酷な条件を必要とせず、経済的及び環境的利点をもたらす、方法を提供すること、又は少なくとも当技術分野で利用できる解決策の有用な代替手段を提供することであった。
したがって、本発明の目的は、現在の技術水準を向上又は改善することであり、特に、当技術分野において、ｒＰＥＴ、例えば、多層包装中に適用されたｒＰＥＴを分解する方法であって、層の事前分離を必要とせず、刺激の強い化学物質及び／若しくは過酷な条件を必要とせず、経済的及び環境的利点をもたらす、方法を提供すること、又は少なくとも当技術分野で利用できる解決策の有用な代替手段を提供することであった。
【0015】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の目的が独立請求項の主題によって達成され得ることを見出した。従属請求項は、本発明の着想を更に展開させるものである。
【0016】
したがって、本発明は、ｒＰＥＴを少なくとも１種のクチナーゼに供する工程を含む、ｒＰＥＴを層間剥離（及び分解）する方法を提供する。
【0017】
本明細書で使用される場合、「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる／備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語、及び類似の単語は、排他的又は網羅的な意味で解釈されるべきではない。換言すれば、これらは「含むが、これらに限定されない」ことを意味することを意図している。
【0018】
本発明者らは、クチナーゼを使用することで、ｒＰＥＴを効率的に分解することができることを示した。本発明者らは、クチナーゼＴｈｆ＿Ｃｕｔ、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ１、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ２、及びクチナーゼ様酵素ＢＣ－ＣＵＴ－０１３について、特に有望な結果を得た。注目すべきことに、ｒＰＥＴ／ＰＥＴ複合材料においても、全てのクチナーゼ酵素を効率的に使用してｒＰＥＴを分解することができた。それらはまた、多層包装におけるｒＰＥＴ含有層を選択的に分解するために使用することができる。例えば、ｒＰＥＴを主原料とする層を備えるＰＥ系多層包装構造の場合、クチナーゼを使用することにより、ｒＰＥＴを主原料とする層を選択的に分解することができ、これにより、ｒＰＥＴモノマーを回収し、多層包装構造のＰＥベースの骨格を遊離させ、ＰＥリサイクルに供することができた。得られたＰＥが清浄な状態であるため、リサイクルされたＰＥを価値の高い用途にリサイクルすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
本発明の追加の特徴及び利点は、図面を参照して以下に記載の現在好ましい実施形態の説明において記載されており、この説明から明らかになる。
【図1】異なる４種類のクチナーゼ及びクチナーゼ様酵素をそれぞれ使用した、３０％のリサイクルＰＥＴ含量を有するポストコンシューマＰＥＴから放出された総加水分解産物（ｍＭ）の増加を示す：Ｔｈｆ＿Ｃｕｔ（菱形、白ダイヤモンド）、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ２（三角、白三角）、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ１（丸、白丸）及びＢＣ－ＣＵＴ－０１３（四角、白四角）。実験には、ｐＨ７の０．１Ｍ ＰＢＳからなる陰性対照（黒丸、黒丸）も含めた。０．２～０．５ｍｍに粉砕した２０～２５ｍｇのｒＰＥＴ基質を用いて、３７℃及びｐＨ７で７日間反応を行った。各記号は、デュプリケートで行った反応の平均を表す。生成物濃度（ＴＰＡ、ＢＨＥＴ、ＭＨＥＴ）をＨＰＬＣにより決定した。酵素添加量は、典型的にはポリマー１ｍｇ当たり６μｇのタンパク質に調整した。
【図2A】３０％のリサイクルＰＥＴ含有量を有するポストコンシューマＰＥＴを使用して、異なる４種類の酵素による２日の反応時間後に放出された各加水分解生成物の個々の量を示す。０．２～０．５ｍｍに粉砕した２０～２５ｍｇのｒＰＥＴ基質を用いて、３７℃及びｐＨ７で、それぞれ２日間反応を行った。生成物バー中の異なる色のフラクションは、ＨＰＬＣによって決定された反応混合物の加水分解生成物ＴＰＡ（白色）、ＭＨＥＴ（灰色）及びＢＨＥＴ（黒色）の濃度を示す。各バーは、それぞれの最大値及び最小値を有するデュプリケートで行った反応の全生成物の平均濃度を表す。典型的に使用する酵素添加量は、反応ごとにポリマー１ｍｇ当たり６μｇのタンパク質に設定した。
【図2B】３０％のリサイクルＰＥＴ含有量を有するポストコンシューマＰＥＴを使用して、異なる４種類の酵素による７日の反応時間後に放出された各加水分解生成物の個々の量を示す。０．２～０．５ｍｍに粉砕した２０～２５ｍｇのｒＰＥＴ基質を用いて、３７℃及びｐＨ７で、それぞれ７日間反応を行った。生成物バー中の異なる色のフラクションは、ＨＰＬＣによって決定された反応混合物の加水分解生成物ＴＰＡ（白色）、ＭＨＥＴ（灰色）及びＢＨＥＴ（黒色）の濃度を示す。各バーは、それぞれの最大値及び最小値を有するデュプリケートで行った反応の全生成物の平均濃度を表す。典型的に使用する酵素添加量は、反応ごとにポリマー１ｍｇ当たり６μｇのタンパク質に設定した。
【図3】７５％のリサイクル含量を有するポストコンシューマＰＥＴの、ｐＨ７．５（黒色）、ｐＨ８（灰色）、及びｐＨ８．２（白色）で７日間の酵素加水分解後の総生成物濃度（ＢＨＥＴ＋ＭＨＥＴ＋ＴＰＡ）を示す。陰性対照は、０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝液中のｒＰＥＴのみを用いて行った。反応は、０．２～０．５ｍｍに粉砕した２０～２５ｍｇのｒＰＥＴ基質を用いて３７℃で４ｍＬのガラスバイアル中で行った。各バーは、それぞれの最大値及び最小値を有するデュプリケートで行った反応の全生成物の平均濃度を表す。典型的な酵素添加量を、ポリマー１ｍｇ当たり５．６～７μｇのタンパク質に設定した。
【図4A】酵素Ｔｈｆ＿ｃｕｔについて、７０％の再生ＰＥＴ含有量を有するポストコンシューマＰＥＴの酵素加水分解の反応プロファイルを示す。０．２～０．５ｍｍに粉砕した２０～２５ｍｇの基質を用いて、３７℃及びｐＨ７．５（四角）、ｐＨ８（三角）及びｐＨ８．２（菱形）で２日間反応を行った。加水分解生成物をＨＰＬＣにより測定した。各バーは、それぞれの最大値及び最小値を有するデュプリケートで行った反応の全生成物の平均濃度を表す。典型的な酵素添加量を、反応の大部分においてポリマー１ｍｇ当たり５．６～７μｇのタンパク質に調整した。
【図4B】酵素Ｔｈｃ＿ｃｕｔ２について、７０％の再生ＰＥＴ含有量を有するポストコンシューマＰＥＴの酵素加水分解の反応プロファイルを示す。０．２～０．５ｍｍに粉砕した２０～２５ｍｇの基質を用いて、３７℃及びｐＨ７．５（四角）、ｐＨ８（三角）及びｐＨ８．２（菱形）で２日間反応を行った。加水分解生成物をＨＰＬＣにより測定した。各バーは、それぞれの最大値及び最小値を有するデュプリケートで行った反応の全生成物の平均濃度を表す。典型的な酵素添加量を、反応の大部分においてポリマー１ｍｇ当たり５．６～７μｇのタンパク質に調整した。
【図4C】酵素Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ１（Ｃ）及について、７０％の再生ＰＥＴ含有量を有するポストコンシューマＰＥＴの酵素加水分解の反応プロファイルを示す。０．２～０．５ｍｍに粉砕した２０～２５ｍｇの基質を用いて、３７℃及びｐＨ７．５（四角）、ｐＨ８（三角）及びｐＨ８．２（菱形）で２日間反応を行った。加水分解生成物をＨＰＬＣにより測定した。各バーは、それぞれの最大値及び最小値を有するデュプリケートで行った反応の全生成物の平均濃度を表す。典型的な酵素添加量を、反応の大部分においてポリマー１ｍｇ当たり５．６～７μｇのタンパク質に調整した。
【図4D】酵素ＢＣ－ＣＵＴ－０１３について、７０％の再生ＰＥＴ含有量を有するポストコンシューマＰＥＴの酵素加水分解の反応プロファイルを示す。０．２～０．５ｍｍに粉砕した２０～２５ｍｇの基質を用いて、３７℃及びｐＨ７．５（四角）、ｐＨ８（三角）及びｐＨ８．２（菱形）で２日間反応を行った。加水分解生成物をＨＰＬＣにより測定した。各バーは、それぞれの最大値及び最小値を有するデュプリケートで行った反応の全生成物の平均濃度を表す。典型的な酵素添加量を、反応の大部分においてポリマー１ｍｇ当たり５．６～７μｇのタンパク質に調整した。
【発明を実施するための形態】
【0020】
したがって、本発明は、部分的には、ポリエチレンテレフタレート（ｒＰＥＴ）を少なくとも１種のクチナーゼに供する工程を含む、再生ｒＰＥＴを分解する方法に関する。
【0021】
ｒＰＥＴは、単一材料として、又は例えばｒＰＥＴを含む複合材料若しくは多層材料として提供されてもよい。
【0022】
本発明者らは、例えば、ｒＰＥＴを含む材料が３０％又は７５％のリサイクルＰＥＴを含む複合ＰＥＴ材料である場合に、非常に良好な結果を得た。
【0023】
本発明によれば、ｒＰＥＴは、少なくとも１種のクチナーゼによって分解される。用語「分解」は解重合を含み、解重合はポリマーをその最終モノマーに変換するプロセスを指す。用語「分解」は、より一般的には、ポリマー鎖が酵素のうちの少なくとも１つによって切断され、モノマーには限らないが、より短いポリマー鎖が得られることを表す。このようなポリマー断片化は、例えば、エンド型酵素の活性によって、又はエキソ型酵素の不完全な活性によって達成することができる。本発明の一実施形態において、本発明の方法は、ｒＰＥＴ、例えば、包装中の少なくとも１層のｒＰＥＴを主原料とする層を解重合する方法であってもよい。
【0024】
クチナーゼは、クチンと水との反応を触媒して、クチンモノマーを生成する。クチナーゼは、セリンエステラーゼであり、通常セリンヒドロラーゼのＳｅｒ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ三つ組み残基を含有する。
【0025】
少なくとも１種類のクチナーゼは、真菌材料又は微生物材料由来のクチナーゼであってもよい。真菌材料又は微生物材料由来の酵素を使用することは、それらが天然に産生され得るという利点を有する。特に、酵素が真菌又は微生物によって分泌される酵素である場合、真菌又は微生物自体を、包装材料中の少なくとも１層のポリマー層を分解するために使用することができる。
【0026】
少なくとも１種のクチナーゼは、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）、サーモビフィダ・セルロシリティカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ）又はサーモビフィダ・アルバ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ａｌｂａ）由来のクチナーゼであってもよい。
【0027】
サーモビフィダ属の生物は、土壌中に生息する好熱性生物であり、コンポストヒープ、腐葉土、堆肥の山又はキノコ生育培地などの加熱後有機物における植物細胞壁の主要な分解者である。サーモビフィダ属の生物の細胞外酵素は、耐熱性、広いｐＨ範囲、及び高活性を有するため、研究されてきた。
【0028】
本発明者らは、少なくとも１種のクチナーゼがＴｈｆ＿Ｃｕｔ、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ１、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ２、ＢＣ－ＣＵＴ－０１３、又はそれらの組み合わせからなる群から選択された場合に、特に有望な結果を得た。
【0029】
Ｔｈｆ＿Ｃｕｔ（Ｔ．フスカ）、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ１（Ｔ．セルロシリティカ）及びＴｈｃ＿Ｃｕｔ２（Ｔ．セルロシリティカ）並びに３つのメタゲノムクチナーゼＢＣ－ＣＵＴ－０１３は、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ Ｌｔｄ．ＵＫから購入した。
【0030】
酵素は純粋な形態で使用してもよい。しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、酵素が粗抽出物として、例えば真菌材料及び／又は微生物材料からの粗抽出物としても使用することができることを見出した。粗抽出物を使用すると、コストのかかる酵素精製が不要になるという利点がある。したがって、本発明によれば、少なくとも１種類のクチナーゼは、粗抽出物として使用してもよい。有利には、少なくとも１種類のクチナーゼは、水溶性粗抽出物として使用してもよい。
【0031】
使用される酵素の量は、本発明の方法における分解工程の成功において重要ではない。しかしながら、使用される酵素の量は、分解速度において重要である。本発明者らは、ポリマー１ｍｇあたり少なくともタンパク質約０．６５μｇ、ポリマー１ｍｇあたり少なくともタンパク質約６μｇ、又はポリマー１ｍｇあたり少なくともタンパク質約５０μｇの酵素添加量で分解が実施された場合に、良好な結果を得た。
【0032】
特に、本発明の枠組みにおいて使用されるクチナーゼが好熱性生物から得られる場合、クチナーゼは一定の熱安定性も示す。したがって、分解は、高温で、例えば３０～４０℃、３５～４５℃又は４０～５０℃の範囲の温度で行うことができる。高温での分解は、著しく速く進行する。予想される反応速度の増加は、アレニウスの式に従って推定することができる。
【0033】
しかしながら、反応温度を上昇させることにより、例えば、エネルギー使用量増加のためのコストが必要となる。したがって、分解を周囲温度で行うことが好ましい場合がある。これは特に、必要な反応時間が重要でない場合に当てはまる。周囲温度は、例えば、地理的な位置や季節によって異なる場合がある。周囲温度は、例えば、約０～３０℃、例えば約５～２５℃の範囲の温度を意味し得る。
【0034】
したがって、例えば、本発明の枠組みにおいて、ｒＰＥＴは、２０～５０℃、例えば３０～４０℃の範囲の温度で、少なくとも１種のクチナーゼに供され得る。本発明者らは、約３７℃の温度で非常に良好な結果を得た。
【0035】
本発明者らは、異なるｐＨ値での反応を更に試験した。本発明の方法は、分解を中性から弱アルカリ性の条件で実施した場合に、最も効果的であることが判明した。６～９の範囲のｐＨで良好な結果が得られた。例えば、ｒＰＥＴは、約６～９の範囲、例えば約６．５～８の範囲のｐＨで、少なくとも１種のクチナーゼに供され得る。
【0036】
したがって、約７～９の範囲のｐＨ、好ましくは約７．５～８．５の範囲のｐＨ、例えば約８．２のｐＨで分解が実施されることが好ましい場合がある。
【0037】
本発明者らは、ｒＰＥＴを少なくとも２日間、少なくとも７日間、又は少なくとも１５日間、少なくとも１種のクチナーゼに供した場合に、良好な結果を得た。
【0038】
本発明の方法を用いると、ｒＰＥＴの部分的な分解又は完全な分解さえも可能であると思われる。本発明者らは、対応するモノマー及びモノマー混合物の放出（ＴＰＡ、ＢＨＥＴ、ＭＨＥＴ）からこれを結論付ける。例えば、本発明の方法を用いると、ｒＰＥＴを少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４５重量％、少なくとも５０重量％、又は少なくとも５５重量％分解することが可能であると思われる。この分解は、一部分において、モノマー又はモノマー混合物の生成をもたらした。したがって、本発明の方法を用いると、少なくとも１層のポリマー層の分解は、分解されたポリマーの少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４５重量％、少なくとも５０重量％、又は少なくとも５５重量％のモノマー、又はモノマー混合物の生成をもたらす。
【0039】
本発明の方法は、特に包装リサイクルへの適用に適している。したがって、本発明の枠組みにおいて、ｒＰＥＴは、包装、例えば、ボトル、トレイ、可撓性若しくは多層可撓性パッキングなどの剛性若しくは可撓性食品包装、又はパウチなどのペットフード包装に存在し得る。本発明の目的に関し、「食品」という用語は、国際食品規格（Ｃｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）に従って、加工、半加工、又は未加工に関わらず、ヒトによる消費を意図した任意の物質であり、飲料、チューインガム、及び「食品」の製造、調製又は処理で使用されている任意の物質を含むが、化粧品若しくはタバコ、又は薬物としてのみ使用される物質を含まないものとして理解される。
【0040】
多層包装構造は、現在の産業、例えば食品産業において頻繁に使用されている。ここで、多層包装は多くの場合、食品アイテムに一定のバリア特性、強度及び保存安定性を有する軽量包装を与えるために使用される。このような多層包装材料は、例えば、積層又は共押出によって製造することができる。更に、ナノテクノロジー、ＵＶ処理、及びプラズマ処理に基づく技術が、多層包装の性能を向上させるために使用される。Ｃｏｍｐｒ Ｒｅｖ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ｓａｆ．２０２０；１９：１１５６－１１８６は、食品用途のための多層包装における最近の進歩を概説している。
【0041】
包装が多層包装材料を含む場合、この多層包装材料は、少なくとも２層のポリマー層を備えてもよい。
【0042】
ポリマー層は、ｒＰＥＴを主原料とする層と、ｒＰＥＴを主原料とする更なる層、ポリウレタン（ＰＵ）を主原料とする層、ポリエチレン（ＰＥ）を主原料とする層、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１層とを含んでもよい。
【0043】
層は、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、又は少なくとも約９９重量％のＰＵ、ＰＥ、又はｒＰＥＴをそれぞれ含有する場合、ＰＵ、ＰＥ、又はｒＰＥＴを主成分とすると考えられる。
【0044】
ポリマー層は、ｒＰＥＴ層と、ｒＰＥＴを主原料とする更なる層、ポリウレタン（ＰＵ）を主原料とする層、ポリエチレン（ＰＥ）を主原料とする層、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１層とを含んでもよい。
【0045】
ＰＵ層はまた、食品包装において頻繁に使用される。ＰＵ層は、通常、高い伸びを有し、本質的に強く、柔軟で、可塑剤を含まず、時間の経過と共に脆くならない柔軟なフィルムである。ＰＵ層は脂肪及び加水分解に対して耐性である。ＰＵ層は高温に耐えることができ、微生物からの攻撃に対して優れた耐性を示す。
【0046】
ＰＥＴ層も、食品包装において頻繁に使用される。ＰＥＴ層は透明であり、非常に良好な寸法安定性及び引張強度を有し、広い温度範囲にわたって安定である。ＰＥＴ層は、低い水吸着挙動を示し、顕著にＵＶ耐性であり、良好なガスバリアを提供する。更に、ＰＥＴへの高品質な印刷が容易である。しかしながら、ＰＥＴフィルムの水分バリア性は中程度にすぎない。持続可能性の理由から、ｒＰＥＴは、バージンＰＥＴを部分的又は完全に置き換えるためにますます使用されるようになっている。
【0047】
ポリエチレン（ＰＥ）は、プラスチックポリマーであり、現在では比較的容易に機械的にリサイクルすることができる。ＰＥ熱可塑性樹脂は、興味深いことに、それらの融点で液体になり、高温下で分解し始めない。そのため、かかる熱可塑性プラスチックは、融点まで加熱し、冷却し、再度加熱しても、大きく劣化しない。ＰＥは、熱によって液化すると、押出成形や射出成形が可能となり、したがって、リサイクルして新たな用途に使用することができる。しかしながら、例えば、多層包装材料において、ＰＥ層が他のプラスチック層と組み合わされている場合、ＰＥをリサイクルするには問題がある。
【0048】
本発明に記載される方法の１つの利点は、ＰＥ層からｒＰＥＴ層を選択的に剥離するために使用できることである。したがって、本発明の方法は、多層包装における少なくとも１層のｒＰＥＴを主原料とする層を選択的に剥離するために使用され得る。
【0049】
本発明者らは、本発明の枠組みにおいて使用される酵素でｒＰＥＴを主原料とする層を分解し得ることを示すことができた。例えば、本発明者らは、市販のｒＰＥＴ含有材料を、本発明の枠組みにおいて使用されるクチナーゼで分解することができることを示した。
【0050】
本発明の方法において、ｒＰＥＴは、多層包装構造を備える包装中に存在してもよく、多層包装構造は、リサイクル可能なベース層、例えばＰＥを主原料とする層と、少なくとも１層のｒＰＥＴを主原料とする層とを備え、本方法は、少なくとも１層のｒＰＥＴを主原料とする層を分解すること及びベース層をリサイクルの流れに供することによって、多層包装構造をリサイクルするために使用される。得られたＰＥＴモノマーも、同様に回収してリサイクルすることができる。
【0051】
本発明者らは更に、包装、例えば多層包装構造の表面積対体積比が増加した場合、分解速度及び／又は完全性を著しく増加させることができることを提案する。例えば、包装を酵素に供する前に、包装を機械的に処理し、粒子径を小さくして平均直径が約５ｍｍ未満、約１ｍｍ未満、又は約０．５ｍｍ未満の直径の粒子にしてもよい。通常、機械的処理は、例えば細断であってもよい。したがって、本発明の方法は、ｒＰＥＴ及び／又はｒＰＥＴ含有材料を少なくとも１種のクチナーゼに供する前又は供する間に、ｒＰＥＴ及び／又はｒＰＥＴ含有材料例えばｒＰＥＴ含有包装の粒子径を小さくする工程を更に含んでもよい。機械的処理によって粒子径を小さくし、平均直径が約５ｍｍ未満、約１ｍｍ未満、又は約０．５ｍｍ未満の直径の粒子にしてもよい。
【0052】
本発明の方法による１つの利点は、制御された条件下、例えばバイオリアクターなどの密閉容器中で実施することができることである。分解プロセスの条件が比較的穏やかであるため、極端な条件に耐えることができるバイオリアクターは必要なく、このことは本発明の方法の安全性及び費用対効果に寄与する。密閉容器を使用することは、例えば温度及び撹拌などの反応及びプロセスのパラメータを正確に制御することができるという利点を有する。
【0053】
当業者は、本明細書に開示される本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができることを理解するであろう。特に、本発明の方法について説明した特徴は、組み合わせてもよい。更に、本発明の異なる実施形態について記載された特徴を組み合わせてもよい。
【0054】
本発明を実施例によって説明してきたが、特許請求の範囲で定義された本発明の範囲から逸脱することなく、変更及び改変を加えることができることが理解されるべきである。
【0055】
更に、既知の均等物が特定の特徴に対して存在する場合、かかる均等物は、本明細書で具体的に言及されているかのように組み込まれる。本発明の更なる利点及び特徴は、図及び非限定的な実施例から明らかである。
【0056】
実施例１：４種類のクチナーゼによる３０％リサイクルＰＥＴの酵素分解
材料及び化学物質
酵素アッセイに使用したポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）は、リサイクルＰＥＴ（ｒＰＥＴ）３０％又は７５％を含む、３３ｃＬのＨｅｎｎｉｅｚスティルウォーターボトルのポストコンシューマＰＥＴであった。グリセロール、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＯＨ及び酢酸エチル、塩酸、ギ酸、塩酸及びメタノールは全てＳｉｇｍａから購入した。テレフタル酸（ＴＰＡ）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はＦｌｕｋａから購入した。
材料及び化学物質
酵素アッセイに使用したポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）は、リサイクルＰＥＴ（ｒＰＥＴ）３０％又は７５％を含む、３３ｃＬのＨｅｎｎｉｅｚスティルウォーターボトルのポストコンシューマＰＥＴであった。グリセロール、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＯＨ及び酢酸エチル、塩酸、ギ酸、塩酸及びメタノールは全てＳｉｇｍａから購入した。テレフタル酸（ＴＰＡ）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はＦｌｕｋａから購入した。
【0057】
Ｔｈｆ＿Ｃｕｔ１（Ｔ．フスカ）、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ２（Ｔ．セルロシルティカ）及びＴｈｃＣｕｔ１（Ｔ．セルロシリティカ）並びにメタゲノムクチナーゼＢＣ－ＣＵＴ－０１３は、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔから購入した。
【0058】
【表1】
【0059】
実験中の取り扱いを容易にするために、全ての酵素を、４０％（ｗ／ｖ）グリセロールによりタンパク質１ｍｇ／ｍＬのストック溶液に希釈した。最終酵素添加量は、ポリマー１ｍｇあたり５．６～７μｇに相当した。
【0060】
再生ＰＥＴ（ｒＰＥＴ）を含むポストコンシューマポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の酵素加水分解
３０％又は７５％の再生ＰＥＴ含有量（ｒＰＥＴ）を有するポストコンシューマ水ボトルを、酵素処理に供する前に前処理した。ｒＰＥＴを１～２ｃｍの四角形に切断し、エタノールで洗浄し（約３０分間）、３７℃で乾燥させた。続いて、ＳＰＥＸ（登録商標）ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ製の６８７０Ｄ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ（登録商標）Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒを使用して、ｒＰＥＴを細断した。細断したｒＰＥＴ粒子をふるいにかけ、小片を、０．２ｍｍ未満、０．２～０．５ｍｍ、０．５～１ｍｍ、及び１ｍｍ超の４つのサイズカテゴリーに分別した。
３０％又は７５％の再生ＰＥＴ含有量（ｒＰＥＴ）を有するポストコンシューマ水ボトルを、酵素処理に供する前に前処理した。ｒＰＥＴを１～２ｃｍの四角形に切断し、エタノールで洗浄し（約３０分間）、３７℃で乾燥させた。続いて、ＳＰＥＸ（登録商標）ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ製の６８７０Ｄ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ（登録商標）Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒを使用して、ｒＰＥＴを細断した。細断したｒＰＥＴ粒子をふるいにかけ、小片を、０．２ｍｍ未満、０．２～０．５ｍｍ、０．５～１ｍｍ、及び１ｍｍ超の４つのサイズカテゴリーに分別した。
【0061】
前処理したポストコンシューマｒＰＥＴ粉末約２０～２５ｍｇを、ＰＴＦＥ／シリコーン／ＰＴＦＥセプタムを有する、２ｍＬエッペンドルフチューブ又は４ｍＬガラスバイアルに入れた。反応は、ｐＨ７の１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液で新たに調製した酵素溶液１．５ｍＬ中、３７℃で実施した。
【0062】
２ｍＬチューブについては、反応をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社製のＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）５４３７において１１００ｒｐｍで行い、一方、ガラスバイアルでは、Ｋｕｈｎｅｒ Ｓｈａｋｅｒ社製のＩＳＦ１－Ｘインキュベーターシェーカーにおいて１００ｒｐｍで水平に置き、ｒＰＥＴ粒子を懸濁状態に保った。対照反応は、酵素溶液の代わりに緩衝液を用いて行った。生成物分析用のサンプルを定期的に採取した。
【0063】
ＨＰＬＣによるｒＰＥＴ加水分解生成物の分析
ｒＰＥＴの酵素加水分解生成物を、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって定量した。サンプル５０μＬを反応混合物から定期的に採取し、２５ｍＭ ＨＣｌ ２０５μＬをＨＰＬＣ移動相（３０％ＭｅＯＨ中０．１％ギ酸）中に含有する氷上のチューブに移して反応を停止させ、酵素を沈殿させた。次いでサンプルを、０℃、１６０００ｇで１５分間遠心分離した。上清約２００μＬをＨＰＬＣガラスバイアルに移した。Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ １．８μｍ ２．１×５０ｍｍカラム及びダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズシステムを使用して、サンプルを逆相クロマトグラフィによって分析し、２４１ｎｍで検出した。５μＬ又は１０μＬの量のサンプルをシステムに注入した。流量は０．２ｍＬ／ｍｉｎであり、カラムは５０℃で操作し、ランタイムは８分であった。テレフタル酸（ＴＰＡ）、モノ（２－ヒドロキシエチルテレフタレート）（ＭＨＥＴ）及びビス（２－ヒドロキシエチルテレフタレート）（ＢＨＥＴ）の検量線は、サンプルと同じ方法で、０．００５～１ｍＭの範囲の濃度で作製したものである。全ての化合物の１０ｍＭストック溶液をＤＭＳＯで調製した。
ｒＰＥＴの酵素加水分解生成物を、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって定量した。サンプル５０μＬを反応混合物から定期的に採取し、２５ｍＭ ＨＣｌ ２０５μＬをＨＰＬＣ移動相（３０％ＭｅＯＨ中０．１％ギ酸）中に含有する氷上のチューブに移して反応を停止させ、酵素を沈殿させた。次いでサンプルを、０℃、１６０００ｇで１５分間遠心分離した。上清約２００μＬをＨＰＬＣガラスバイアルに移した。Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ １．８μｍ ２．１×５０ｍｍカラム及びダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズシステムを使用して、サンプルを逆相クロマトグラフィによって分析し、２４１ｎｍで検出した。５μＬ又は１０μＬの量のサンプルをシステムに注入した。流量は０．２ｍＬ／ｍｉｎであり、カラムは５０℃で操作し、ランタイムは８分であった。テレフタル酸（ＴＰＡ）、モノ（２－ヒドロキシエチルテレフタレート）（ＭＨＥＴ）及びビス（２－ヒドロキシエチルテレフタレート）（ＢＨＥＴ）の検量線は、サンプルと同じ方法で、０．００５～１ｍＭの範囲の濃度で作製したものである。全ての化合物の１０ｍＭストック溶液をＤＭＳＯで調製した。
【0064】
結果及び考察
ｐＨ７及び３７℃の周囲温度で７日間のｒＰＥＴ分解に関し、試験した全ての酵素のうち最も高い総生成物形成は、生体触媒由来の新規クチナーゼであるＢＣ－ＣＵＴ－０１３について検出された（図１及び図２を参照）。ＢＣ－ＣＵＴ－０１３は、広く報告されている３種のＰＥＴ分解酵素Ｔｈｆ＿ｃｕｔ、Ｔｈｃ＿ｃｕｔ２及びＴｈｃ＿Ｃｕｔ１を、７日後に０．７６ｍＭで３倍上回った（図１及び図２Ｂ参照）。本発明者の知る限り、これは、再生ＰＥＴ（ｒＰＥＴ）の酵素加水分解に関する最初の報告である。これまでのところ、ポストコンシューマＰＥＴの使用のみが、クチナーゼ及び酵素一般の基質として報告されている（Ｗｅｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．２０１９，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６（１４）：１９００４９１及びＭｕｌｌｅｒ，Ｒ．－Ｊ．，ｅｔ ａｌ．２００５，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６（１７），１４００－１４０５を参照されたい）。Ｗｅｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．２０１９による研究は、未使用のＰＥＴフィルムと比較して、ポストコンシューマＰＥＴに対するクチナーゼの効率が約４倍低いことを実証し、著者らは、その挙動を結晶化度の差に関連するものとした。しかしながら、リサイクルされた内容物について利用可能な情報は存在しない。本発明において、生体触媒由来のＢＣ－ＣＵＴ－００１３酵素は、ｒＰＥＴを分解することができるだけでなく、リサイクル含量（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｃｏｎｔｅｎｔ）による影響を最も受けないことが見出された。表１に示すように、リサイクル含量を３０％から７５％に増加させた場合、２１％までの加水分解効率の低下が観察されたが、他のクチナーゼ（Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ）は、３０％までのさらに高い加水分解の低下を示した。ＰＥＴのリサイクル含有量の増加に伴う加水分解効率の低下は、変性ＰＥＴのより高い含有量及び結晶化度に関連している可能性が高い。典型的には、機械的リサイクル中の熱加水分解による分子量の減少によって引き起こされる、バージンＰＥＴと比較したｒＰＥＴの質の低下を補うために、鎖延長剤が一般的に使用される（Ｄ．Ｓ．Ａｃｈｉｌｉａｓ（Ｅｄ．），Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｃｙｃｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，ＩｎＴｅｃｈ，Ｒｉｊｅｋａ，Ｃｒｏａｔｉａ（２０１２），ｐｐ．８５－１１４）。このような化学的修飾は、分子量を増加させ、ｒＰＥＴの全体的な物理化学特性を変化させて、バージンＰＥＴと同様の機械的特性を回復させる（Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００１，７９（１０），１８１６－１８２４を参照）。また、リサイクル含量が高いほど、架橋されたＰＥＴ鎖が高くなり、これは、ＰＥＴ鎖への酵素（クチナーゼ）の作用性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）に影響を及ぼし得る。注目すべきことに、文献における反応は、はるかに高い温度で行われたが、本発明は、周囲温度で反応を行い、このことは、多層中のｒＰＥＴをリサイクルするための解決策を提供するだけでなく、従来技術によって記載された反応と比較してエネルギー節約をもたらすであろうより低い温度でリサイクルするための解決策も提供するため、結果の独自性及び重要性をさらに強調する。
ｐＨ７及び３７℃の周囲温度で７日間のｒＰＥＴ分解に関し、試験した全ての酵素のうち最も高い総生成物形成は、生体触媒由来の新規クチナーゼであるＢＣ－ＣＵＴ－０１３について検出された（図１及び図２を参照）。ＢＣ－ＣＵＴ－０１３は、広く報告されている３種のＰＥＴ分解酵素Ｔｈｆ＿ｃｕｔ、Ｔｈｃ＿ｃｕｔ２及びＴｈｃ＿Ｃｕｔ１を、７日後に０．７６ｍＭで３倍上回った（図１及び図２Ｂ参照）。本発明者の知る限り、これは、再生ＰＥＴ（ｒＰＥＴ）の酵素加水分解に関する最初の報告である。これまでのところ、ポストコンシューマＰＥＴの使用のみが、クチナーゼ及び酵素一般の基質として報告されている（Ｗｅｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．２０１９，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６（１４）：１９００４９１及びＭｕｌｌｅｒ，Ｒ．－Ｊ．，ｅｔ ａｌ．２００５，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６（１７），１４００－１４０５を参照されたい）。Ｗｅｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．２０１９による研究は、未使用のＰＥＴフィルムと比較して、ポストコンシューマＰＥＴに対するクチナーゼの効率が約４倍低いことを実証し、著者らは、その挙動を結晶化度の差に関連するものとした。しかしながら、リサイクルされた内容物について利用可能な情報は存在しない。本発明において、生体触媒由来のＢＣ－ＣＵＴ－００１３酵素は、ｒＰＥＴを分解することができるだけでなく、リサイクル含量（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｃｏｎｔｅｎｔ）による影響を最も受けないことが見出された。表１に示すように、リサイクル含量を３０％から７５％に増加させた場合、２１％までの加水分解効率の低下が観察されたが、他のクチナーゼ（Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ）は、３０％までのさらに高い加水分解の低下を示した。ＰＥＴのリサイクル含有量の増加に伴う加水分解効率の低下は、変性ＰＥＴのより高い含有量及び結晶化度に関連している可能性が高い。典型的には、機械的リサイクル中の熱加水分解による分子量の減少によって引き起こされる、バージンＰＥＴと比較したｒＰＥＴの質の低下を補うために、鎖延長剤が一般的に使用される（Ｄ．Ｓ．Ａｃｈｉｌｉａｓ（Ｅｄ．），Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｃｙｃｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，ＩｎＴｅｃｈ，Ｒｉｊｅｋａ，Ｃｒｏａｔｉａ（２０１２），ｐｐ．８５－１１４）。このような化学的修飾は、分子量を増加させ、ｒＰＥＴの全体的な物理化学特性を変化させて、バージンＰＥＴと同様の機械的特性を回復させる（Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００１，７９（１０），１８１６－１８２４を参照）。また、リサイクル含量が高いほど、架橋されたＰＥＴ鎖が高くなり、これは、ＰＥＴ鎖への酵素（クチナーゼ）の作用性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）に影響を及ぼし得る。注目すべきことに、文献における反応は、はるかに高い温度で行われたが、本発明は、周囲温度で反応を行い、このことは、多層中のｒＰＥＴをリサイクルするための解決策を提供するだけでなく、従来技術によって記載された反応と比較してエネルギー節約をもたらすであろうより低い温度でリサイクルするための解決策も提供するため、結果の独自性及び重要性をさらに強調する。
【0065】
表１は、ＢＣ－ＣＵＴ－０１３及びＴｈｆ＿Ｃｕｔ加水分解効率における、ポストコンシューマＰＥＴ包装中７５％の含有量を有するリサイクルＰＥＴの効果を示す。反応は、０．２～０．５ｍｍに粉砕したｒＰＥＴを２０～２５ｍｇ使用して、ガラスバイアル中、３７℃及びｐＨ７で２４時間行った。典型的な酵素添加量は、ポリマー１ｍｇ当たり７μｇのタンパク質に設定した。加水分解生成物をＨＰＬＣによって定量した。
【0066】
【表2】
【0067】
実施例２：７５％リサイクルＰＥＴの酵素分解反応に対するｐＨの影響
材料及び方法
材料及び化学物質
酵素アッセイに使用したポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）は、リサイクルＰＥＴ（ｒＰＥＴ）３０％を含む、３３ｃＬのＨｅｎｎｉｅｚスティルウォーターボトルのポストコンシューマＰＥＴであった。グリセロール、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＯＨ及び酢酸エチル、ギ酸、塩酸、及びメタノールは全てＳｉｇｍａから購入した。テレフタル酸（ＴＰＡ）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はＦｌｕｋａから購入した。
材料及び方法
材料及び化学物質
酵素アッセイに使用したポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）は、リサイクルＰＥＴ（ｒＰＥＴ）３０％を含む、３３ｃＬのＨｅｎｎｉｅｚスティルウォーターボトルのポストコンシューマＰＥＴであった。グリセロール、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＯＨ及び酢酸エチル、ギ酸、塩酸、及びメタノールは全てＳｉｇｍａから購入した。テレフタル酸（ＴＰＡ）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はＦｌｕｋａから購入した。
【0068】
Ｔｈｆ＿Ｃｕｔ１（Ｔ．フスカ）、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ２（Ｔ．セルロシリティカ）、Ｅｓｔ１１９（Ｔ．アルバ）及びＴｈｃＣｕｔ１（Ｔ．セルロシリティカ）並びにメタゲノムクチナーゼＢＣ－ＣＵＴ－０１３は、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔから購入した（表２を参照）。
【0069】
【表3】
【0070】
より高い純度により、０．１ｍｇタンパク質／ｍＬに希釈したシュードモナス・セパシアリパーゼ以外は、実験中のより容易な取り扱いのために４０％（ｗ／ｖ）グリセロール中１ｍｇ／ｍＬのタンパク質ストック溶液に希釈された。
【0071】
ポストコンシューマポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の酵素加水分解
７５％の再生含有量を有するポストコンシューマＰＥＴボトルを、酵素処理に供する前に前処理した。ＰＥＴを１～２ｃｍの四角形に切断し、エタノールで洗浄し（約３０分間）、３７℃で乾燥させた。続いて、ＳＰＥＸ（登録商標）ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ製の６８７０Ｄ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ（登録商標）Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒを使用して、ＰＥＴを細断した。細断したＰＥＴをふるいにかけ、小片を、０．２ｍｍ未満、０．２～０．５ｍｍ、０．５～１ｍｍ、及び１ｍｍ超の４つのサイズカテゴリーに分けた。
７５％の再生含有量を有するポストコンシューマＰＥＴボトルを、酵素処理に供する前に前処理した。ＰＥＴを１～２ｃｍの四角形に切断し、エタノールで洗浄し（約３０分間）、３７℃で乾燥させた。続いて、ＳＰＥＸ（登録商標）ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ製の６８７０Ｄ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ（登録商標）Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒを使用して、ＰＥＴを細断した。細断したＰＥＴをふるいにかけ、小片を、０．２ｍｍ未満、０．２～０．５ｍｍ、０．５～１ｍｍ、及び１ｍｍ超の４つのサイズカテゴリーに分けた。
【0072】
前処理したポストコンシューマｒＰＥＴ粉末約２０～２５ｍｇを、ＰＴＦＥ／シリコーン／ＰＴＦＥセプタムを有する、２ｍＬエッペンドルフチューブ又は４ｍＬガラスバイアルに入れた。反応は、ｐＨ７．５、ｐＨ８、ｐＨ８．２の１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液で新たに調製した酵素溶液１．５ｍＬ中、３７℃で実施した。最終酵素投入量は、ポリマー１ｍｇあたり５．６～７μｇに相当した。
【0073】
２ｍＬチューブについては、反応をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社製のＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）５４３７において１１００ｒｐｍで行い、一方、ガラスバイアルでは、Ｋｕｈｎｅｒ Ｓｈａｋｅｒ社製のＩＳＦ１－Ｘインキュベーターシェーカーにおいて１００ｒｐｍで水平に置き、ＰＥＴ粒子を懸濁状態に保った。対照反応は、酵素溶液の代わりに緩衝液を用いて行った。２４時間毎にサンプルを採取した。
【0074】
反応終了後、ＰＥＴをＭｉｌｌｉＱで２回、エタノールで１回洗浄し、室温で乾燥させ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いる更なる分析のために保存した。
【0075】
ＨＰＬＣによる加水分解生成物の分析
ｒＰＥＴの酵素加水分解生成物を、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって定量した。サンプル５０μＬを採取し、２５ｍＭ ＨＣｌ ２０５μＬをＨＰＬＣ移動相（３０％ＭｅＯＨ中０．１％ギ酸）中に含有する氷上のチューブに移して、反応を停止させ、酵素を沈殿させた。次いでサンプルを、０℃、１６０００ｇで１５分間遠心分離した。上清約２００μＬをＨＰＬＣガラスバイアルに移した。Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ １．８μｍ ２．１×５０ｍｍカラム及びダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズシステムを使用して、サンプルを逆相クロマトグラフィによって分析し、２４１ｎｍで検出した。５μＬ又は１０μＬの量のサンプルをシステムに注入した。流量は０．２ｍＬ／ｍｉｎであり、カラムは５０℃で操作し、ランタイムは８分であった。テレフタル酸（ＴＰＡ）、モノ（２－ヒドロキシエチルテレフタレート）（ＭＨＥＴ）及びビス（２－ヒドロキシエチルテレフタレート）（ＢＨＥＴ）の検量線は、サンプルと同じ方法で、０．００５～１ｍＭの範囲の濃度で作製したものである。全ての化合物の１０ｍＭストック溶液をＤＭＳＯで調製した。
ｒＰＥＴの酵素加水分解生成物を、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって定量した。サンプル５０μＬを採取し、２５ｍＭ ＨＣｌ ２０５μＬをＨＰＬＣ移動相（３０％ＭｅＯＨ中０．１％ギ酸）中に含有する氷上のチューブに移して、反応を停止させ、酵素を沈殿させた。次いでサンプルを、０℃、１６０００ｇで１５分間遠心分離した。上清約２００μＬをＨＰＬＣガラスバイアルに移した。Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ １．８μｍ ２．１×５０ｍｍカラム及びダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズシステムを使用して、サンプルを逆相クロマトグラフィによって分析し、２４１ｎｍで検出した。５μＬ又は１０μＬの量のサンプルをシステムに注入した。流量は０．２ｍＬ／ｍｉｎであり、カラムは５０℃で操作し、ランタイムは８分であった。テレフタル酸（ＴＰＡ）、モノ（２－ヒドロキシエチルテレフタレート）（ＭＨＥＴ）及びビス（２－ヒドロキシエチルテレフタレート）（ＢＨＥＴ）の検量線は、サンプルと同じ方法で、０．００５～１ｍＭの範囲の濃度で作製したものである。全ての化合物の１０ｍＭストック溶液をＤＭＳＯで調製した。
【0076】
結果及び考察
７５％ｒＰＥＴに対する活性について、異なるクチナーゼのｐＨ依存性を評価し、本発明者らは、反応ｐＨを７．５から８．２に変化させた場合、ＢＣ－ＣＵＴ－０１３の活性がほぼ２倍増加し得ることを見出した（図３参照）。酵素を含まない対照反応は加水分解産物を示さなかったことに留意されたい（図３）。他のクチナーゼは、反応ｐＨを変化させた場合に加水分解速度の変化をほとんど示さなかった（図３参照）。したがって、広いｐＨ範囲を有するにもかかわらず（表３を参照されたい）、これらのクチナーゼ（Ｔｈｆ＿Ｃｕｔ、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ２、Ｔｈｃ＿Ｃｕ１）は、ＢＣ－ＣＵＴ－０１３と比較して、ｒＰＥＴに対する加水分解活性が全体的にはるかに低いことを特徴とする。このことは、ｐＨを８．２に上昇させると、この特定の酵素（ＢＣ－ＣＵＴ－０１３）によるＰＥＴの加水分解反応を有意に改善することができ、したがって、ｒＰＥＴ加水分解の最適化のための重要なパラメータとして役立つことを意味する。
７５％ｒＰＥＴに対する活性について、異なるクチナーゼのｐＨ依存性を評価し、本発明者らは、反応ｐＨを７．５から８．２に変化させた場合、ＢＣ－ＣＵＴ－０１３の活性がほぼ２倍増加し得ることを見出した（図３参照）。酵素を含まない対照反応は加水分解産物を示さなかったことに留意されたい（図３）。他のクチナーゼは、反応ｐＨを変化させた場合に加水分解速度の変化をほとんど示さなかった（図３参照）。したがって、広いｐＨ範囲を有するにもかかわらず（表３を参照されたい）、これらのクチナーゼ（Ｔｈｆ＿Ｃｕｔ、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ２、Ｔｈｃ＿Ｃｕ１）は、ＢＣ－ＣＵＴ－０１３と比較して、ｒＰＥＴに対する加水分解活性が全体的にはるかに低いことを特徴とする。このことは、ｐＨを８．２に上昇させると、この特定の酵素（ＢＣ－ＣＵＴ－０１３）によるＰＥＴの加水分解反応を有意に改善することができ、したがって、ｒＰＥＴ加水分解の最適化のための重要なパラメータとして役立つことを意味する。
【0077】
以下の表３は、４種類のクチナーゼ（Ｔｈｆ＿Ｃｕｔ、Ｔｈｆ＿Ｃｕｔ２、Ｔｈｃ＿Ｃｕｔ１及びＢＣ－ＣＵＴ０１３）の、ポストコンシューマ７５％リサイクルＰＥＴの酵素分解の最適ｐＨ範囲を要約する。反応ｐＨは、０．２～０．５ｍｍに粉砕したｒＰＥＴを２０～２５ｍｇ含む４ｍＬガラスバイアル中、３７℃で４８時間で、それぞれｐＨ７．５、ｐＨ８及びｐＨ８．２に設定した。
【0078】
【表4】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【国際調査報告】