▶ セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-10
(54)【発明の名称】ウイルス起源の各感染症の治療のためのペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20231227BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20231227BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231227BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20231227BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20231227BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20231227BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20231227BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231227BHJP
C12N 7/06 20060101ALN20231227BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08
A61P31/12 ZNA
A61P31/14
A61P31/16
A61P31/20
A61K38/10
A61P43/00 121
A61P31/22
A61K45/00
C12N7/06
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023536568
(86)(22)【出願日】2021-12-21
(85)【翻訳文提出日】2023-08-15
(86)【国際出願番号】 CU2021050015
(87)【国際公開番号】W WO2022135622
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】2020-0110
(32)【優先日】2020-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】304012895
【氏名又は名称】セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フェルナンデス オルテガ、セリア ベルタ
(72)【発明者】
【氏名】ラミレス スアレス、アンナ、カリディス
(72)【発明者】
【氏名】カシージャス カサノバ、ディオンネ
(72)【発明者】
【氏名】デュアルテ カノ、カルロス、アントニオ
(72)【発明者】
【氏名】ウビエタ ゴメス、レイモンド
(72)【発明者】
【氏名】ギレン ニエト、ヘラルド、エンリケ
(72)【発明者】
【氏名】カブラレス リコ、アニア
(72)【発明者】
【氏名】アルバレス ペレス、カレン
(72)【発明者】
【氏名】ペレラ ゴンザレス、カルメン ラウラ
(72)【発明者】
【氏名】ファルコン カマ、ビビアン
(72)【発明者】
【氏名】ペレア ロドリゲス、シルビオ、エルネスト
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゲス モルト、マリア、ピラール
(72)【発明者】
【氏名】ガライ ペレス、ヒルダ、エリサ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065BB19
4B065BB37
4B065CA44
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA19
4C084AA22
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA23
4C084CA59
4C084MA02
4C084MA55
4C084MA56
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC751
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA01
4H045BA17
4H045BA72
4H045EA29
4H045FA33
(57)【要約】
配列番号２～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つペプチド、並びに当該ペプチドを含む医薬組成物。配列番号１として特定されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症の治療又は予防のための医薬組成物。本発明は、哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症の治療又は予防のための医薬品を製造するための、配列番号１～配列番号２０として特定されるアミノ酸配列を有するペプチドの使用を含む。配列番号１～配列番号２０として特定されるアミノ酸配列の少なくとも１つのペプチドと、抗ウイルス医薬との組合せも開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、ペプチド。
【請求項2】
配列番号２～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項3】
配列番号１として特定されるアミノ酸配列を有するペプチドをさらに含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
非経口経路又は粘膜経路による投与のために製剤化される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項5】
配列番号１として特定されるアミノ酸配列を有するペプチドと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための、医薬組成物。
【請求項6】
非経口経路又は粘膜経路による投与のために製剤化される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記感染症が、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、並びにアデノウイルス科のウイルスによって引き起こされる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記感染症が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び豚熱ウイルスからなる群からのウイルスによって引き起こされる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項9】
哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための医薬品を製造するための、配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの使用。
【請求項10】
前記感染症が、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、並びにアデノウイルス科のウイルスによって引き起こされる、請求項９に記載の使用。
【請求項11】
前記感染症が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び豚熱ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項９に記載の使用。
【請求項12】
前記医薬品が、配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２つ以上のペプチドを含む、請求項９に記載の使用。
【請求項13】
哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための方法であって、治療有効量の、配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを、それを必要とする個体に投与することを特徴とする、方法。
【請求項14】
前記感染症が、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、並びにアデノウイルス科のウイルスによって引き起こされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記感染症が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び豚熱ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
抗ウイルス薬が前記個体にさらに投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
前記ペプチド及び前記抗ウイルス薬を、同時に又は順次投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記抗ウイルス薬が、リバビリン、イベルメクチン、ペンシクロビル、ニタゾキサニド、ナファモスタット、レムデシビル、ファビピラビル、配列番号２３として特定されるペプチド、アルファインターフェロン（ＩＦＮ）、ガンマＩＦＮ、又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ２つ以上のペプチドを含むことを特徴とする、組合せ医薬。
【請求項20】
前記ペプチドが、同じ治療の過程で同時に又は順次投与される、請求項１９に記載の組合せ医薬。
【請求項21】
哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための組合せ医薬であって、ａ）配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、ｂ）抗ウイルス薬とを含むことを特徴とする、組合せ医薬。
【請求項22】
前記抗ウイルス薬が、リバビリン、イベルメクチン、ペンシクロビル、ニタゾキサニド、ナファモスタット、レムデシビル、ファビピラビル、配列番号２３として特定されるペプチド、アルファインターフェロン（ＩＦＮ）、ガンマＩＦＮ、又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の組合せ医薬。
【請求項23】
前記ペプチド及び前記抗ウイルス薬が、同じ治療の過程で同時に又は順次投与される、請求項２１に記載の組合せ医薬。
【請求項24】
前記感染症が、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、並びにアデノウイルス科のウイルスによって引き起こされる、請求項２１に記載の組合せ医薬。
【請求項25】
前記感染症が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び豚熱ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項２１に記載の組合せ医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウイルス学及び製薬産業の分野に関する。特に、本発明は、呼吸器系の上皮細胞に感染する広範囲のウイルスの感染に対して抗ウイルス活性を有する相互に関連する配列を有する合成ペプチドの群、並びに当該ペプチドと他の抗ウイルス剤との相乗的組合せを開示する。
【背景技術】
【0002】
急性呼吸器疾患は、全ての年齢層において最も頻度の高い疾患である。これらの疾患の重要な部分は、ヒト及び動物の両方において、呼吸器系への初期又はその後のゲートウェイのいずれかとして、呼吸器系の上皮細胞に特異的に感染するウイルスによって引き起こされる。気道上皮は、それを上皮の残りの部分と区別する形態学的及び生理学的な特徴を有する。そもそも、ほとんどの気道の上皮は、単層の細胞で構成されているにもかかわらず、核が整列していないため、擬似層状化されていることによって区別される。一方、その他の上皮細胞とは異なり、大部分は線毛細胞からなる。粘液分泌杯細胞は、この上皮に存在し、他の上皮には存在しない別の細胞型である。気道の管腔に向かう繊毛の存在、並びに杯細胞の作用は、管の湿度を維持し、粒子が肺に入るのを防ぐ。呼吸器上皮細胞の別の特徴的な性質は、いわゆるＰＡＭＰ（病原体関連分子パターン：Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ）を認識することができる多数のパターン認識受容体（ＰＲＲ：ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の存在であり、その機能は病原体の存在下で自然免疫応答を直ちに活性化することである。気道上皮には１０種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ１～ＴＬＲ１０）が発現されている。特に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９は、気道に感染するウイルスの検出に特化したＴＬＲファミリーを構成する。防御機能に関連するこれらの細胞の別の特性は、とりわけ、インターフェロン、デフェンシン及び一酸化窒素（ＮＯ）等の抗ウイルス活性を有する分子を産生する能力である。さらに、それらは、サイトカイン及びケモカインを活性化する適応免疫応答を分泌することができる（Ｖａｒｅｉｌｌｅ Ｍ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ， Ｖｏｌｕｍｅ ２４． Ｎｏ． １， ｐ． ２１０-２２９）。
【0003】
気道を通って侵入するウイルスの中には、インフルエンザウイルスを含むオルトミクソウイルス科のウイルス；パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、及びヒトメタニューモウイルスを含むパラミクソウイルス科；ライノウイルス及びコクサッキーウイルスを含むピコルナウイルス科；アデノウイルスを含むアデノウイルス科；コロナウイルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ ＧＷ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ， Ｖｏｌｕｍｅ ２１， Ｎｏ． ２． ｐ． ２７４－２９０； Ｄｅ Ｃｌｅｒｋ ａｎｄ Ｌｉ． ２０１６， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ， Ｖｏｌｕｍｅ ２９， ｐ． ６９５-７４７）によって代表される、コロナウイルス科のウイルスがある。
【0004】
言及された全てのウイルスは、ヒト及び動物において疾患を引き起こす。それらのいくつか、例えば季節性インフルエンザは、それらの高い罹患率のために毎年大きな経済的損失を引き起こすが、死亡率は低い。しかしながら、動物に感染するウイルスからの変化によって生成されたいくつかのインフルエンザ変異体は、１９１８年のスペインインフルエンザＨ１Ｎ１（死亡数４０００万～１億人）、１９５７年のアジアインフルエンザＨ２Ｎ２（死亡数１１０万人）、又は１９５８年の香港Ｈ３Ｎ２インフルエンザ（死亡数５００，０００人）等、非常に致死的なアウトブレイクの原因となっている。近年では、１９９６年に中国で初めて検出されたＨ５Ｎ１鳥インフルエンザが、５０％の死亡率でアジア及び北アフリカでのアウトブレイクを引き起こしている。呼吸器多核体ウイルスは、５歳未満の小児の間では毎年３２０万人が入院し、５９，６００人が死亡し、また１１８，２００人が死亡すると推定されている（Ｓｈｉ Ｔ ｅｔ ａｌ． ２０１７． Ｌａｎｃｅｔ， Ｖｏｌｕｍｅ ３９０， ｐ． ９４６-５８）。
【0005】
一方、他の経路を介して宿主に感染し、他の組織で最初に複製するウイルスがあるが、感染の過程で気道に感染して深刻な損傷を引き起こす可能性もある。この第２の群の中にはデングウイルスがあり、これは蚊の刺咬傷を介して血流に入るが、上皮肺細胞に感染することができ、疾患の悪化を引き起こす（Ｃｈｅｎｇ ＮＭ ｅｔ ａｌ． ２０１７． ＰＬＯＳ Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００５５２０； Ｌｅｅ ＹＲ ｅｔ ａｌ． ２００７， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １２６， Ｎｏ． １， ｐ． ２１６－２５）。
【0006】
デングウイルスは、世界中で毎年約３億９０００万人に感染している。これらのうち、５００，０００人が重症疾患又は出血性デング熱を発症し、毎年２５，０００人が死亡している。実際、デングの重症の症例の多くは、これらの呼吸障害に関連している。これらの肺合併症のいくつかには、肺浸潤、胸水、非心原性肺水腫、及び呼吸不全が含まれる（Ｃｈｅｅｐｓａｔｔａｙａｋｏｒｎ Ａ ａｎｄ Ｃｈｅｅｐｓａｔｔａｙａｋｏｒｎ Ｒ． ２０１４， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｄｏｉ： １０．５１７１／２０１４．１６２２４５； Ｍａｒｃｈｉｏｒｉ Ｅ ｅｔ ａｌ． ２００９， Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ４， Ｎｏ． ８）。これらの特徴を示す他のウイルスは、ヘルペスウイルス科のウイルスである単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）である。ＨＳＶは院内ウイルス性肺炎、気管支肺炎、及び急性呼吸器症候群を引き起こす（Ｌｕｙｔ ＣＥ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄ， Ｖｏｌｕｍｅ ４０， ｐ． Ｅ５６１-ｅ５６８）。
【0007】
相対的な治療有効性を示すこれらのウイルスのいくつかについて抗ウイルス薬が開発されている。例えば、ヒトにおける使用が承認されている抗ウイルス薬の中には、ヘルペスウイルスに対するドクスウリジン、トリフルリジン及びブリブジン、インフルエンザに対するオセルタミビル、ザナミビル及びバロキサビルマルボキシル、並びに呼吸器多核体ウイルスに対するパリビズマブ及びトコザノールがある。それにもかかわらず、新たな作用機序、低コスト及び既存のものより少ない有害作用を有する新しくより効果的な抗ウイルス薬の継続的な開発が必要とされており、したがって、既存のものとは異なる機構を介して作用する新たな抗ウイルス剤の開発は、世界では健康上の優先事項である。
【0008】
デングウイルス及びコロナウイルス等の他のウイルスの場合、適切な有効な治療法はない（Ｄｅ Ｃｌｅｒｋ ａｎｄ Ｌｉ， ２０１６， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ， Ｖｏｌｕｍｅ ２９， ｐ． ６９５-７４７）。特に、コロナウイルス科のメンバーは、動物及びヒトにおける広範囲の疾患の原因である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、流行及び重篤な呼吸器感染症を引き起こす。２００３年における人畜共通感染症ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス）（Ｄｒｏｓｔｅｎ Ｃ ｅｔ ａｌ． ２００３， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ３４８， ｐｐ． １９６７-１９７６）のアウトブレイク、及び１０年後のＭＥＲＳ－ＣｏＶ（中東呼吸器症候群コロナウイルス）（Ｃｕｉ Ｊ ｅｔ ａｌ． ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １７． ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５７９－０１８－０１１８－９）の出現は、ヒトにおいてこのタイプのウイルスによって引き起こされる大きな損傷の最初の証拠となった。どちらのコロナウイルスも重度の呼吸器疾患を引き起こし、制御される前に１０，０００人近くに感染している。
【0009】
今年、新たなコロナウイルスが報告され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）のアウトブレイクを引き起こし（Ｚｈｏｕ Ｐ ｅｔ ａｌ． ２０２０， Ｎａｔｕｒｅ， ５７９， ２７０-２７３， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２０１２－７）、これは、後に世界保健機関によってＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックと宣言された。ＣＯＶＩＤ－１９として知られるこのウイルスによって引き起こされる疾患は、患者の約３％において致死的であり得る急性呼吸器症候群を特徴とする。このパンデミックは世界中に急速に拡散しており、２０２０年１１月現在、７０００万人を超える症例が確認され、１５０万人を超える人が死亡している。
【0010】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む、ヒトにおける任意のコロナウイルスに対する任意の薬物の安全性及び有効性を実証する臨床的証拠はほとんどない（Ｋａｌｉｌ ＡＣ ｅｔ ａｌ． ２０２０， ＪＡＭＡ， Ｖｏｌｕｍｅ ３２３， Ｎｏ． １９， ｐ． １８９７-１８９８）。１４日間を超えて持続する持続性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する患者において抗ウイルス効果を示す薬物の臨床的実証もない。臨床試験においてある程度の治療効果を示している抗ウイルス化合物はレムデシビル（Ｗａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ． ２０２０， Ｌａｎｃｅｔ， Ｖｏｌｕｍｅ ３９５， Ｎｏ． １０２３６， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２０）３１０２２－９）であるが、その範囲は狭いスペクトルの患者に限定され、その治療効果は必要とされるほど強力ではない。十分な科学的証拠によって支持される治療の欠如は、異なる治療レジメンの使用及びプロトコルの迅速な変更をもたらした。証明された治療法の欠如及び証拠に基づく治療ガイドラインを確立するための臨床試験の必要性が強調されている（Ｄiａｚ Ｅ ｅｔ ａｌ． ２０２０， Ｍｅｄ Ｉｎｔｅｎｓｉｖａ， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｅｄｉｎ．２０２０．０６．０１７）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療には依然として満たされていない医学的必要性がある。コロナウイルス感染症、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のための新たな抗ウイルス治療選択肢の探索は、世界中でヒトの健康に対する緊急の必要性を構成している。コロナウイルス、インフルエンザ又は他の呼吸器ウイルスによって引き起こされる新たなパンデミックの脅威は、ウイルス感染症を制御することができる新規な抗ウイルス薬の必要性を強いる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0011】
発明の説明
本発明は、配列番号２～配列番号２０によって構成される群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、並びにそれらのペプチドの少なくとも１つと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物を提供することによって上記で提起された課題を解決する。本発明の一実施形態では、当該医薬組成物は、非経口経路又は粘膜経路による投与のために製剤化される。本発明はまた、配列番号１として特定されるアミノ酸配列を有するペプチドと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための、医薬組成物を提供する。配列表において配列番号１～配列番号２０として特定される合成ペプチドの群は、それらの一次構造によって互いに関連している。
本発明は、配列番号２～配列番号２０によって構成される群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、並びにそれらのペプチドの少なくとも１つと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物を提供することによって上記で提起された課題を解決する。本発明の一実施形態では、当該医薬組成物は、非経口経路又は粘膜経路による投与のために製剤化される。本発明はまた、配列番号１として特定されるアミノ酸配列を有するペプチドと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための、医薬組成物を提供する。配列表において配列番号１～配列番号２０として特定される合成ペプチドの群は、それらの一次構造によって互いに関連している。
【0012】
特に、本発明は、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、並びにアデノウイルス科のウイルス等の呼吸器系の上皮細胞に直接感染するウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の阻害に関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、及びアデノウイルス、とりわけ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）、インフルエンザＡ、パラインフルエンザ３型、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、アデノウイルスＡｄ７、ボカウイルスＨＢｏＶ－１等に関する。本発明はまた、デングウイルス及びジカウイルス、単純ヘルペスウイルス及びサイトメガロウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の治療に関し、これらのウイルスが気道、主に肺のレベルで引き起こし得る深刻な損傷を回避又は治療する。豚熱ウイルス等、主に動物に影響を及ぼすウイルスも含まれる。
【0013】
配列番号１として特定されるペプチドは、細胞骨格の中間径フィラメントがビメンチンによって形成される細胞において、ビメンチン細胞骨格において誘導されるウイルス複製を防止する修飾を介する、ＨＩＶ複製の阻害剤として以前に報告されている（Ｆｅｒｎaｎｄｅｚ－Ｏｒｔｅｇａ Ｃ ｅｔ ａｌ． ２０１６， Ｖｉｒｕｓｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ８， Ｎｏ， ６， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｖ８０６００９８）。一方、技術水準は、ビメンチンが、このタンパク質によって形成された細胞骨格中間径フィラメントを有する細胞におけるウイルス阻害の重要な標的であることを示した。２０１５年、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ビメンチン遺伝子サイレンシングがＴＧＥＶ豚コロナウイルスのウイルス複製に影響を及ぼすことを報告した（Ｚｈａｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ． ２０１５， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｕｓｒｅｓ．２０１４．１２．０１３）。
【0014】
より最近になって、ビメンチンリン酸化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞において調節されることが報告された（Ｂｏｕｈａｄｄｏｕ Ｍ ｅｔ ａｌ． ２０２０， Ｃｅｌｌ， ｖｏｌｕｍｅ １８２， ｐ． ６８５-７１２． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０６．０３４）。しかしながら、本発明では、配列番号１として配列表において特定されるペプチドは、ビメンチン細胞骨格を提示しないウイルス感染の主要標的細胞において、コロナウイルスに対して強い抗ウイルス活性を示すことが見出された。さらに、本発明で言及されるウイルス感染症の治療に有用なこのペプチドの抗ウイルス作用は、ビメンチン細胞骨格とは無関係であることが実証された。より具体的には、本発明者らは、驚くべきことに、このペプチドが、当業者が何らの効果も期待していない細胞に感染するウイルスによって引き起こされる疾患の治療において使用され得ることを示す。本発明には、呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスに対して強い抗ウイルス活性を有する、説明されていないペプチドも含まれる。
【0015】
本発明の第１及び第２の例は、細胞骨格の一部としてビメンチンの中間径フィラメントを提示する細胞株における、ＢＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する、配列番号１として特定されるペプチド及びそれに関連する他のペプチドの抗ウイルス活性を実証する。驚くべきことに、これらのペプチドは、これらの細胞におけるビメンチン細胞骨格の再構成に影響を及ぼさない。これらの細胞株は上皮起源であるが、それらはｉｎ ｖｉｔｒｏでビメンチン細胞骨格を発生させた。技術水準によれば、ペプチドの作用によるその改変が予想されるはずであるが、これは起こらない。これらの細胞がビメンチンフィラメントを有するという事実にもかかわらず、本発明のペプチドは、これらの細胞骨格フィラメントを改変することなく、ウイルス細胞変性効果に対する阻害活性を示す。さらにより驚くべきことは、配列番号１～配列番号２０として特定されるペプチドが、細胞骨格の一部としてビメンチン中間径フィラメントを提示しない呼吸器系の上皮細胞の初代培養物におけるコロナウイルス及び他のウイルスによる感染を阻害することができることの実証である。
【0016】
一方、以前の研究では、ウイルス侵入中のビメンチンとＳＡＲＳ－ＣｏＶのスパイク（Ｓ）タンパク質との間の直接的な相互作用が報告された。さらに、ビメンチンは、その細胞受容体へのＳＡＲＳ－ＣｏＶの結合及び細胞へのウイルス侵入において役割を果たすことが知られている（Ｙｕ ｅｔ ａｌ． ２０１６， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌｕｍｅ ２３， ｎｕｍｂｅｒ １４． ｄｏｉ １０．１１８６／ｓ１２９２９－０１６－０２３４－７）。驚くべきことに、本発明のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質とも、そのＡＣＥ２受容体とも相互作用しないが、上記ウイルスのＮタンパク質と相互作用する。
【0017】
本発明の別の予想外の結果は、配列番号１～２０として配列表において特定されるペプチドによって引き起こされるウイルス阻害が、全ての上皮細胞において達成されなかったことである。ＨＳＶ－１ウイルスの場合、その複製は、記載されるペプチドによって鼻粘膜の初代細胞において効率的に阻害される。しかしながら、本発明の例では、呼吸器系以外の上皮細胞ではウイルス複製の阻害が達成されなかったことが示されている。まとめると、これらの結果は全て、非常に驚くべきことに、これらのペプチドが、呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスに対して抗ウイルス活性を有することを実証している。この所見は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＢＣｏＶ、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１、パラインフルエンザ３型、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルスＡｄ７、ボカウイルスＨＢｏＶ－１、デングウイルス２、単純ヘルペスＨＳＶ－１及び豚熱ウイルスの複製の阻害を指すが、これらに限定されない。
【0018】
したがって、本発明のペプチドの抗ウイルス作用は、中間径ビメンチンフィラメントの変化も標的細胞膜上のその受容体へのウイルス結合の遮断も伴わない機構によって発揮される。この知見は、本発明のペプチドが、技術水準では報告されていない新規な機構を介してそれらの抗ウイルス活性を発現することを確認する。驚くべきことに、それらは、呼吸器系の上皮細胞におけるウイルス感染を阻害することができる。
【0019】
本発明の一実施形態では、配列番号１～配列番号２０として配列表において特定されるペプチドを含む医薬組成物は、非経口経路又は粘膜経路によって投与されるように製剤化される。本発明の一実施形態では、配列番号１～配列番号２０のペプチドで治療される感染症は、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、並びにアデノウイルス科のウイルスによって引き起こされる。特定の実施形態では、配列番号１～配列番号２０のペプチドを含む医薬組成物は、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス及び豚熱ウイルスによって引き起こされる感染症の治療又は予防に有用である。
【0020】
本発明の別の目的は、哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための薬物を製造するための、配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの使用である。特定の実施形態では、当該薬物は、配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２つ以上のペプチドを含む。
【0021】
したがって、本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９、並びに呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる他の感染症の治療における配列番号１のペプチドの使用を含む。本発明はまた、これらの感染症の治療のための配列番号１のペプチドに構造的に関連する新たなペプチドを提供し、その侵入の初期標的が呼吸器系の細胞ではないが、この系の細胞により深刻な臨床結果をもたらし得るウイルスによって引き起こされるものを含む。これらのウイルスには、ヘルペスウイルス、デングウイルス、及びサイトメガロウイルスが含まれる。
【0022】
別の態様では、本発明は、哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための方法であって、治療有効量の、配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを、それを必要とする個体に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明の方法の特定の実施形態において、感染症は、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、並びにアデノウイルス科のウイルスによって引き起こされる。本発明の方法の好ましい実施形態において、感染症は、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び豚熱ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。
【0023】
本発明の一実施形態において、治療又は予防の方法の一部として、抗ウイルス薬が個体にさらに投与される。配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド及び抗ウイルス薬は、同じ治療スケジュールで同時に又は順次投与され得る。本発明の一実施形態において、抗ウイルス医薬は、リバビリン、イベルメクチン、ペンシクロビル、ニタゾキサニド、ナファモスタット、レムデシビル、ファビピラビル、配列番号２３として特定されるペプチド、インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ、ＩＦＮガンマ、又はそれらの組合せからなる群から選択される。
【0024】
本発明の別の目的は、配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２つ以上のペプチドを含むことを特徴とする組合せ医薬である。本発明の一実施形態では、組合せ医薬において、ペプチドは、同じ治療の過程で同時に又は順次投与される。
【0025】
さらに、本発明は、ａ）配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、ｂ）抗ウイルス薬とを含むことを特徴とする、哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染を治療又は予防するための組合せ医薬を想定する。特定の実施形態では、組合せ医薬中の抗ウイルス薬は、リバビリン、イベルメクチン、ペンシクロビル、ニタゾキサニド、ナファモスタット、レムデシビル、ファビピラビル、配列番号２３として特定されるペプチド、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮガンマ、又はそれらの組合せによって形成される群から選択される。そのような組合せ医薬では、ペプチド及び抗ウイルス薬は、同じ治療の過程で同時に又は順次投与される。
【0026】
本発明では、配列番号１～配列番号２０のペプチドと他の抗ウイルス化合物との組合せがそれらの阻害活性を増強し、相乗的な抗ウイルス活性をもたらすことが実証される。抗ウイルス薬は、リバビリン、イベルメクチン、ペンシクロビル、ニタゾキサニド、ナファモスタット、レムデシビル、ファビピラビル、配列番号２３として特定されるペプチド、インターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、又はそれらの組合せによって形成される群から選択されるが、本発明の範囲はこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】配列番号１として配列表において特定されるペプチドによるウシコロナウイルスのＭｅｂｕｓ株の複製の阻害。（Ａ）：細胞変性効果の阻害、（Ｂ）：ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルスリボ核酸（ＲＮＡ）のコピー数の減少。
【図2】細胞株におけるビメンチン中間径フィラメントの免疫検出。ＭＤＢＫ細胞（パネルＡ）及びＶｅｒｏＥ６細胞（パネルＢ）を、配列表において配列番号１として特定されるペプチドにより１００μＭで２４時間処理した。処理細胞と未処理細胞との間でビメンチンフィラメントの構造に差は観察されなかった。ＣＣ：未処理細胞；標的：ビメンチン細胞骨格；４０倍。
【図3】配列番号１として配列表において特定されるペプチドとの異なる分子の相互作用アッセイに対応するセンサーグラム。（Ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質Ｎ、（Ｂ）デング２ウイルスカプシドタンパク質、（Ｃ）ＨＩＶ ｐ２４タンパク質、（Ｄ）ポリクローナル抗配列番号１。全ての分析物を１０ｎＭ～２００ｎＭの濃度範囲で測定し、相互作用の特徴的なパラメータを推定するために、試料あたり少なくとも５つの曲線を考慮に入れた。
【図4】配列表において配列番号１として特定されるペプチドによる豚熱ウイルスの阻害。Ａ．ＰＫ－１５細胞におけるウイルス複製の阻害効果。Ｂ．３－（４．５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾール（ＭＴＴ）ブロミドアッセイによって評価したＰＫ１５細胞におけるペプチドの細胞毒性。
【図5】配列番号１として配列表において特定されるペプチド及びインターフェロンアルファ２ｂの併用処理の抗ウイルス効果の決定。ＭＤＢＫ細胞を２４時間前に処理した。上記ペプチド、インターフェロン、又は両方の組合せをウシコロナウイルスのＭｅｂｕｓ株に感染させた。抗ウイルス効果の評価は、感染７２時間後の培養上清中に存在するウイルスの感染能力を決定することによって行った。
【発明を実施するための形態】
【0028】
例
例１．配列番号１として特定されるペプチドによるウシコロナウイルス複製の阻害。
固相合成法を用いた化学合成により、配列表において配列番号１として特定されるペプチドを得た。このペプチドの抗ウイルス効果を評価するために、ＭＤＢＫとして既知のウシ腎臓細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培養培地中、２４ウェルプレートにウェルあたり２８０，０００細胞で播種した。プレートを３７℃及び５％ＣＯ２の湿潤環境でインキュベートした。１８～２４時間後、配列番号１として特定されるペプチドを異なる濃度で添加し、同一条件で１時間又は２４時間インキュベートした。この処理時間が経過すると、培養培地を除去し、３７℃及び５％ＣＯ２の湿潤環境において、２００μＬの無血清ＤＭＥＭ培地中、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で、細胞をウシコロナウイルスのＭｅｂｕｓ株に１時間感染させた。その後、各ウェルの体積を、ペプチドの存在下で無血清ＤＭＥＭ培地を用いて１ｍＬにした。１２０時間のインキュベーションを行い、ＭＴＴの代謝低下の方法により細胞培養物のバイアビリティを評価した。これを行うため、培養培地を除去した。２００マイクロリットルのＭＴＴを各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２及び湿度９５％で２～４時間インキュベートした。その後、３００μＬのイソブチルアルコールを添加し、プレートを１時間振盪した。ＭＴＴ法の代替法として、細胞をクリスタルバイオレット（０．１％）で染色した。最後に、プレートリーダー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）において各ウェルの吸光度を５７０ｎｍで測定した。抗ウイルス効果を、細胞変性効果（ＣＰＥ）の阻害（図１Ａ）、及びＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルスＲＮＡの阻害（図１Ｂ）のパーセントとして表した。結果は、配列番号１として特定されるペプチドがウシコロナウイルス感染に対して抗ウイルス効果を発揮することを実証している。
例１．配列番号１として特定されるペプチドによるウシコロナウイルス複製の阻害。
固相合成法を用いた化学合成により、配列表において配列番号１として特定されるペプチドを得た。このペプチドの抗ウイルス効果を評価するために、ＭＤＢＫとして既知のウシ腎臓細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培養培地中、２４ウェルプレートにウェルあたり２８０，０００細胞で播種した。プレートを３７℃及び５％ＣＯ２の湿潤環境でインキュベートした。１８～２４時間後、配列番号１として特定されるペプチドを異なる濃度で添加し、同一条件で１時間又は２４時間インキュベートした。この処理時間が経過すると、培養培地を除去し、３７℃及び５％ＣＯ２の湿潤環境において、２００μＬの無血清ＤＭＥＭ培地中、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で、細胞をウシコロナウイルスのＭｅｂｕｓ株に１時間感染させた。その後、各ウェルの体積を、ペプチドの存在下で無血清ＤＭＥＭ培地を用いて１ｍＬにした。１２０時間のインキュベーションを行い、ＭＴＴの代謝低下の方法により細胞培養物のバイアビリティを評価した。これを行うため、培養培地を除去した。２００マイクロリットルのＭＴＴを各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２及び湿度９５％で２～４時間インキュベートした。その後、３００μＬのイソブチルアルコールを添加し、プレートを１時間振盪した。ＭＴＴ法の代替法として、細胞をクリスタルバイオレット（０．１％）で染色した。最後に、プレートリーダー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）において各ウェルの吸光度を５７０ｎｍで測定した。抗ウイルス効果を、細胞変性効果（ＣＰＥ）の阻害（図１Ａ）、及びＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルスＲＮＡの阻害（図１Ｂ）のパーセントとして表した。結果は、配列番号１として特定されるペプチドがウシコロナウイルス感染に対して抗ウイルス効果を発揮することを実証している。
【0029】
例２．配列番号１～配列番号２２として特定されるペプチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する抗ウイルス効果の評価。
配列表の配列番号２～配列番号２２として特定されるペプチドを、固相合成法を用いた化学合成により得た。配列番号１～配列番号２２として特定されるペプチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する抗ウイルス効果を評価するため、ＶｅｒｏＥ６細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）を、９６ウェルプレートに、ウェルあたり２０，０００細胞で、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培養培地に播種し、３７℃及び５％ＣＯ２の湿潤環境でインキュベートした。およそ２４時間が経過した後、評価したペプチドを０．０１μＭ～１００μＭの濃度範囲で添加し、同じ条件下で１時間又は２４時間インキュベートした。続いて、培養培地を除去し、１００μＬの２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地中で、３７℃及び５％ＣＯ２の湿潤環境において０．０１のＭＯＩで、細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに１時間感染させた。その後、各ウェルの体積を、ペプチドの存在下で２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地を用いて２００μＬにした。９６時間インキュベートし、ニュートラルレッド染色法により培養物中の細胞生存率を評価した。このために、培地を除去し、１００μＬの色素を添加し、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度で１時間インキュベートし、吸光度をプレートリーダーにおいて５８０ｎｍで測定した。抗ウイルス効果をＣＰＥの阻害率として表した。結果は、配列番号１として特定されるペプチド及びいくつかの関連ペプチドが、表１に観察されるように、ウシコロナウイルス感染に対して抗ウイルス効果を発揮することを実証している。
配列表の配列番号２～配列番号２２として特定されるペプチドを、固相合成法を用いた化学合成により得た。配列番号１～配列番号２２として特定されるペプチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する抗ウイルス効果を評価するため、ＶｅｒｏＥ６細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）を、９６ウェルプレートに、ウェルあたり２０，０００細胞で、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培養培地に播種し、３７℃及び５％ＣＯ２の湿潤環境でインキュベートした。およそ２４時間が経過した後、評価したペプチドを０．０１μＭ～１００μＭの濃度範囲で添加し、同じ条件下で１時間又は２４時間インキュベートした。続いて、培養培地を除去し、１００μＬの２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地中で、３７℃及び５％ＣＯ２の湿潤環境において０．０１のＭＯＩで、細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに１時間感染させた。その後、各ウェルの体積を、ペプチドの存在下で２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地を用いて２００μＬにした。９６時間インキュベートし、ニュートラルレッド染色法により培養物中の細胞生存率を評価した。このために、培地を除去し、１００μＬの色素を添加し、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度で１時間インキュベートし、吸光度をプレートリーダーにおいて５８０ｎｍで測定した。抗ウイルス効果をＣＰＥの阻害率として表した。結果は、配列番号１として特定されるペプチド及びいくつかの関連ペプチドが、表１に観察されるように、ウシコロナウイルス感染に対して抗ウイルス効果を発揮することを実証している。
【表1】
【0030】
例３．ＭＤＢＫ細胞及びＶｅｒｏＥ６細胞におけるビメンチン中間径フィラメントに対する配列番号１として同定されたペプチドの効果の評価。
配列番号１として同定されるペプチドのビメンチン中間径フィラメントに対する効果を評価するため、ＭＤＢＫ細胞及びＶｅｒｏ Ｅ６細胞を１００μＭのペプチドで３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間処理した。次いで、それらを固定し、アセトン：メタノール（１：１ Ｖ／Ｖ）の溶液中で－２０℃にて１０分間透過処理して、リン酸緩衝生理食塩水中の１％ウシ血清アルブミンで３７℃にて３０分間ブロックした。マウス抗ビメンチンＩｇＧ１モノクローナル抗体（４．５μｇ／ｍＬ）、続いてフルオレセインイソチオシアネートにコンジュゲートした抗マウス抗体（１／２００）を使用して、ビメンチン中間径フィラメントを検出した。ビメンチン中間径フィラメントＦＩ）は、細胞の核周囲領域から一方又は両方の極に向かって細胞質全体に分布していることが観察された。評価条件下で処理細胞と未処理細胞との間で超分子構造に差は観察されなかった。処理後、細胞の完全性に対する損傷は観察されなかった。ビメンチン細胞骨格は、ＭＤＢＫ細胞（図２Ａ）又はＶｅｒｏＥ６細胞（図２Ｂ）において配列番号１として特定されるペプチドによって改変されていない。配列番号２～２２のペプチドを用いて行った同様の実験では、中間径フィラメントの構造にも改変は観察されなかった。
配列番号１として同定されるペプチドのビメンチン中間径フィラメントに対する効果を評価するため、ＭＤＢＫ細胞及びＶｅｒｏ Ｅ６細胞を１００μＭのペプチドで３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間処理した。次いで、それらを固定し、アセトン：メタノール（１：１ Ｖ／Ｖ）の溶液中で－２０℃にて１０分間透過処理して、リン酸緩衝生理食塩水中の１％ウシ血清アルブミンで３７℃にて３０分間ブロックした。マウス抗ビメンチンＩｇＧ１モノクローナル抗体（４．５μｇ／ｍＬ）、続いてフルオレセインイソチオシアネートにコンジュゲートした抗マウス抗体（１／２００）を使用して、ビメンチン中間径フィラメントを検出した。ビメンチン中間径フィラメントＦＩ）は、細胞の核周囲領域から一方又は両方の極に向かって細胞質全体に分布していることが観察された。評価条件下で処理細胞と未処理細胞との間で超分子構造に差は観察されなかった。処理後、細胞の完全性に対する損傷は観察されなかった。ビメンチン細胞骨格は、ＭＤＢＫ細胞（図２Ａ）又はＶｅｒｏＥ６細胞（図２Ｂ）において配列番号１として特定されるペプチドによって改変されていない。配列番号２～２２のペプチドを用いて行った同様の実験では、中間径フィラメントの構造にも改変は観察されなかった。
【0031】
例４．呼吸器系の上皮細胞の初代培養において種々のペプチドによって示される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性
気道から得られた初代上皮細胞を使用して、研究中のペプチドがビメンチン細胞骨格を有しない細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製を阻害するかどうかを調べた。これらの細胞は、ビメンチン中間径フィラメントを有しないことが知られている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ－Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｈａｎ Ａ ２００６．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，ｖｏｌ，４．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍ．Ａ．Ｈａｙａｔ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．５３７－４７）。配列番号１～２２として配列表において特定されるペプチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する抗ウイルス活性を、Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００３， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ． １０７， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ： Ｊ． Ｐｉｃｏｔ (c) Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）に従って、鼻生検若しくは気管支生検、又は臓器ドナーから得られたヒト気道上皮（ＨＡＥ）において評価した。初代細胞を、個人の同意を得て取得した。
気道から得られた初代上皮細胞を使用して、研究中のペプチドがビメンチン細胞骨格を有しない細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製を阻害するかどうかを調べた。これらの細胞は、ビメンチン中間径フィラメントを有しないことが知られている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ－Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｈａｎ Ａ ２００６．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，ｖｏｌ，４．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍ．Ａ．Ｈａｙａｔ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．５３７－４７）。配列番号１～２２として配列表において特定されるペプチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する抗ウイルス活性を、Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００３， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ． １０７， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄ： Ｊ． Ｐｉｃｏｔ (c) Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）に従って、鼻生検若しくは気管支生検、又は臓器ドナーから得られたヒト気道上皮（ＨＡＥ）において評価した。初代細胞を、個人の同意を得て取得した。
【0032】
ヒト気道上皮の初代培養物をＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート中の気液界面で維持し、３７℃及び５％ＣＯ２で１時間、ＭＯＩ １でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。培養物をウイルスチャレンジの前に０．０１μＭ～１００μＭの濃度で１時間又は２４時間処理した。ウイルスチャレンジ後、ペプチドを２４時間毎に培養物中で置換した。７２時間後、アピカル（ａｐｉｃａｌ）洗浄及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。驚くべきことに、ペプチドは、中間径ビメンチンフィラメントを提示しない細胞においてこのウイルスの複製を阻害し、これは、このタンパク質の独立した抗ウイルス機構を示す（表２）。
【表2】
【0033】
配列表において配列番号１～配列番号２２として特定される残りのペプチドもまた、記載されているような系において評価したところ、それらは、２０％を超える阻害率に達しなかった配列番号２１及び２２のペプチドを除いて、６０～７０％の間の阻害範囲で、表２と同様に、ヒト気道上皮の初代培養物においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害した。
【0034】
例５．ペプチドとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質Ｎ及び他のウイルスタンパク質との相互作用
これらのペプチドの阻害効果が細胞骨格を介して起こらないことを示す、得られた予想外の結果から、可能な作用経路を検討した。特に、ペプチドとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質、並びにウイルスのヒト宿主細胞への侵入に関与するいくつかのタンパク質（中でも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）、ＡＣＥ２受容体の細胞外ドメイン及びウイルスＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）との相互作用を検討した。同様に、以下に記載されるように、ペプチドと他のウイルス由来のタンパク質との相互作用を検討した。この研究では、表面プラズモン共鳴と呼ばれる光学原理に基づいて２つの分子間の相互作用を特徴付けることを可能にするＢＩＡＣＯＲＥ型センサを使用した。必要な測定を行うために、配列番号１として特定されるビオチン化ペプチド（中密度条件下）をストレプトアビジン（ＳＡ）官能化チップ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ． ＵＳＡ）の両チャネルに固定化した。再生プロセス後、表面上の固定化分子の完全性を確認するため、ｆｃ１チャネルを試料チャネルとして使用し、ｆｃ２チャネルを参照として使用した。
これらのペプチドの阻害効果が細胞骨格を介して起こらないことを示す、得られた予想外の結果から、可能な作用経路を検討した。特に、ペプチドとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質、並びにウイルスのヒト宿主細胞への侵入に関与するいくつかのタンパク質（中でも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）、ＡＣＥ２受容体の細胞外ドメイン及びウイルスＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）との相互作用を検討した。同様に、以下に記載されるように、ペプチドと他のウイルス由来のタンパク質との相互作用を検討した。この研究では、表面プラズモン共鳴と呼ばれる光学原理に基づいて２つの分子間の相互作用を特徴付けることを可能にするＢＩＡＣＯＲＥ型センサを使用した。必要な測定を行うために、配列番号１として特定されるビオチン化ペプチド（中密度条件下）をストレプトアビジン（ＳＡ）官能化チップ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ． ＵＳＡ）の両チャネルに固定化した。再生プロセス後、表面上の固定化分子の完全性を確認するため、ｆｃ１チャネルを試料チャネルとして使用し、ｆｃ２チャネルを参照として使用した。
【0035】
固定化ペプチドの反応性を評価するため、配列番号１として特定されるペプチドに対して、１／３０００の力価でウサギにおいて得られた特異的ポリクローナル抗体を使用した。ポリクローナル抗体の適用は、シグナル（ＲＵ）の増加を引き起こし、これはチップ表面への固定化後のその完全性と相関し得る分子認識の証拠である（図３Ｄ、表３）。
【0036】
配列番号１として特定されるペプチドと異なるタンパク質との相互作用の分析により、ＲＢＤもＡＣＥ２ペプチドも配列番号１として特定されるペプチドと相互作用しないことが明らかになった。タンパク質Ｎは、検討された濃度範囲（１０～２００ｎＭ）で固定化された、配列番号１として特定されるペプチドと相互作用することにより、シグナル（ＲＵ）の有意な増加を示した（図３Ａ）。この相互作用について推定されたＫＤは３．５８×１０－９Ｍの値を有し、これは両方の相互作用物質間の（ナノモル範囲の）相互作用の高い親和性を前提としている。
【0037】
図３Ｂは、配列番号１として特定されるペプチドとデング２ウイルスカプシドタンパク質との相互作用の研究から得られたセンサーグラムを示し、タンパク質の濃度依存的相互作用を観察することができる。一方、配列番号１として特定されるペプチドとＨＩＶ－１ ｐ２４タンパク質との相互作用のセンサーグラム（図３Ｃ）は、相互作用がないことを示す。ジカウイルスのエンベロープタンパク質（ＺＩＫＶ Ｅ）、デングウイルス２の非構造タンパク質１（ＮＳ１－Ｄ２）、及びインフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスのカプシドタンパク質等の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質Ｎと同様の特徴を有する他のウイルスタンパク質は、配列番号１、２、１４及び１５として特定されるペプチドとの相互作用を示した。このペプチドと種々のウイルスタンパク質との相互作用を特徴付ける最も重要なパラメータを表３及び表４に示す。
【0038】
ＨＩＶ－１ ｐ２４タンパク質の場合、評価したペプチドとの相互作用はなかった（図３Ｃ）。この結果は、配列番号１として特定される既知のペプチドによるＨＩＶ－１感染の阻害が、呼吸器系の上皮細胞では満たされない特定の条件下でのこのペプチドの異なる作用機序によって引き起こされることを確認する。
【表3】
【0039】
驚くべきことに、これらの結果は全て、本発明のペプチドの抗ウイルス活性が、宿主細胞の細胞骨格とは無関係に、ウイルスとの相互作用の直接的な機構によって引き起こされるという事実を指し示している。
【表4】
【0040】
配列番号１～配列番号２０として配列表において特定される残りのペプチドを評価したところ、同様の結果であった。配列番号２１及び配列番号２２として特定されるペプチドは、評価したタンパク質と相互作用しなかった。
【0041】
例６．配列表において配列番号１として特定されるペプチドによる豚熱（ＣＳＦ）ウイルスの阻害。
配列表において配列番号１として特定されるペプチドの抗ウイルス効果を評価するため、９６ウェルプレート中の５０μＬのＤＭＥＭ培地に８５００個／ウェルのＰＫ１５細胞を播種し、５０μＬのＤＭＥＭを加えるか、又はＤＭＥＭで希釈したペプチドを加えた。８０μＭから開始して、ペプチドの二倍連続希釈液を作製した。各点を３連で評価し、３つのウイルス不含細胞対照を含めた。プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＣＳＦウイルスＭａｒｇａｒｉｔａ株のうち、ウェルあたり１００ ＴＣＩＤ５０を添加した（ＭＯＩ ０．０１）。プレートを７２時間インキュベートし、培地を廃棄し、細胞を８０℃で１時間固定した。次いで、それらをＰＢＳ中の１００μＬの２％ミルクで３７℃にて１時間ブロッキングした。それらをＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたＥ２ウイルスタンパク質に対するモノクローナル抗体の１：３０００希釈液１００μＬを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄し、基質を添加した（５ｍｇのオルトフェニレンジアミン＋５μＬのＨ２Ｏ２を含む１０ｍＬのクエン酸緩衝液ｐＨ５．０）。室温で１０分間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を決定した。
配列表において配列番号１として特定されるペプチドの抗ウイルス効果を評価するため、９６ウェルプレート中の５０μＬのＤＭＥＭ培地に８５００個／ウェルのＰＫ１５細胞を播種し、５０μＬのＤＭＥＭを加えるか、又はＤＭＥＭで希釈したペプチドを加えた。８０μＭから開始して、ペプチドの二倍連続希釈液を作製した。各点を３連で評価し、３つのウイルス不含細胞対照を含めた。プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＣＳＦウイルスＭａｒｇａｒｉｔａ株のうち、ウェルあたり１００ ＴＣＩＤ５０を添加した（ＭＯＩ ０．０１）。プレートを７２時間インキュベートし、培地を廃棄し、細胞を８０℃で１時間固定した。次いで、それらをＰＢＳ中の１００μＬの２％ミルクで３７℃にて１時間ブロッキングした。それらをＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたＥ２ウイルスタンパク質に対するモノクローナル抗体の１：３０００希釈液１００μＬを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄し、基質を添加した（５ｍｇのオルトフェニレンジアミン＋５μＬのＨ２Ｏ２を含む１０ｍＬのクエン酸緩衝液ｐＨ５．０）。室温で１０分間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を決定した。
【0042】
阻害濃度５０（ＩＣ５０）値を得るため、対応する用量反応曲線を作成し（図４）、これらの値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍａソフトウェアを使用して推定した。並行して、ＰＫ１５細胞に対するペプチドの細胞傷害効果を、ＭＴＴアッセイによって１μＭ～４００μＭの濃度範囲で試験した。このため、ペプチドとのインキュベーションを９６時間延長し、次いで、ＭＴＴによる処理によって発色を行った。
【0043】
得られた結果は、配列番号１として特定されるペプチドが、細胞生存率に影響がない用量範囲で（図４Ｂ）、ＣＳＦウイルスの複製に濃度依存的阻害効果を及ぼすことができることを実証している（図４Ａ）。抗ウイルスＩＣ５０（３００ｎＭ）は、細胞傷害性濃度５０（ＣＣ５０＞４００μＭ）よりもはるかに高く、１３３３よりも高い非常に好ましい安全指数（ＳＩ）を与えることも示された。配列番号２～配列番号２０として配列表において特定される残りのペプチドも、記載の系で評価したところ、同様の結果であった。
【0044】
例７．気道に感染する種々のウイルスに対するペプチドの抗ウイルス効果の実証。
Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１０７，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄ：Ｊ．Ｐｉｃｏｔ（ｃ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に従って、臓器ドナーの鼻腔、気管、気管支及び／又は肺からＨＡＥの初代培養物を得た。異なる呼吸器ウイルスを用いて行われた阻害試験には、初期の実証を容易にするために、本発明のペプチドの異なる群を使用した。
Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１０７，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄ：Ｊ．Ｐｉｃｏｔ（ｃ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に従って、臓器ドナーの鼻腔、気管、気管支及び／又は肺からＨＡＥの初代培養物を得た。異なる呼吸器ウイルスを用いて行われた阻害試験には、初期の実証を容易にするために、本発明のペプチドの異なる群を使用した。
【0045】
配列番号１、２、３、７、９、１４及び１９として特定されるペプチドのインフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスに対する抗ウイルス活性を評価するため、気管－気管支組織由来のＨＡＥを１２又は２４ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート（Ｃｏｓｔａｒ）で培養し、ウイルスチャレンジ前に、０．０１～１００μＭの濃度で、２時間又は２４時間ペプチドで前処理した。培養物を１００ＰＦＵ（プラーク形成単位）でインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１に４℃で１時間感染させ、ＰＢＳで洗浄し、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで、ＭＤＣＫ細胞におけるウイルス性能を評価するために収集したＰＢＳを用いてアピカル洗浄を行った。これを行うため、ＭＤＣＫ細胞を９６ウェルプレートに播種し、それらがコンフルエンスに達したとき、連続１０倍希釈のアピカル洗浄液に細胞を感染させ、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。次に、それらをＰＢＳで洗浄し、２×ＤＭＥＭ（１：１）中の寒天層を添加し、固化させた。続いて、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートし、ＰＦＵ数を決定するためクリスタルバイオレットで染色した。ペプチドは、６７～９３のパーセンテージ範囲でウイルス複製を阻害した（表５）。
【0046】
配列番号１、２、８、１３、１５及び２０として特定されるペプチドのパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ３）に対する抗ウイルス活性を評価するため、インフルエンザＨ１Ｎ１について記載されるようにアッセイを行ったが、感染は４０００ＰＦＵを用いて３７℃で９０分間行った。ＰＢＳで洗浄した後、培養物をペプチドの存在下で３日間インキュベートした。後に、前述のように、ＰＢＳによるアピカル洗浄を実施し、収集して、ＭＤＣＫ細胞におけるウイルス性能を評価した。結果は、評価した濃度のペプチドの存在下での７３～９０の間のウイルス阻害の割合を示す（表５）。
【0047】
配列番号１、２、３、１３、１５及び２０として特定されるペプチドの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に対する抗ウイルス活性を、インフルエンザＨ１Ｎ１について記載されるとおりであるが、２×１０６ＰＦＵでの感染を３７℃で２時間行って、気管支から得られたＨＡＥにおいて評価した。ＰＢＳで洗浄した後、培養物を１０日間インキュベートし、培地及びペプチドを２日毎に回復させた。ウイルスを、ＲＴ－ｑＰＣＲによってＲＳＶ核タンパク質ＲＮＡを検出することによって評価した。ウイルス阻害値は７５％超（７５～９１％）に達した（表５）。
【0048】
配列番号１、３、７、９、１３及び１５として特定されるペプチドのアデノウイルス７型に対する効果を評価するため、本発明者らは、インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスについて記載されるとおりであるが、ＡｄＶ７ Ｇｏｍｅｎ株を、ＭＯＩ １で３７℃にて１時間、気管支から得られたＨＡＥ培養物に感染させて行った。培養物をＰＢＳで洗浄し、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳを用いてアピカル洗浄を行い、これを収集してｑＰＣＲによってウイルスを検出した。ペプチドの存在下でのウイルスの阻害値は、６８％超（６８～８２％）に達した（表５）。
【0049】
配列番号３、８、９、１９及び２０として特定されるペプチドのヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）に対する効果を達成し、Ｈ１Ｎ１について記載されるとおりであるが、気管由来のＨＡＥを用いて、培養物を３７℃で２時間、１のＭＯＩで感染させて測定した。その後、培地を除去し、培養物を７２時間維持してアピカル洗浄を行い、ｑＰＣＲによってＮＳ１領域におけるウイルスの存在を定量した。ペプチドの存在下で得られたウイルス阻害値は、６７～８７％の間であった（表５）。
【0050】
デングウイルス複製に対する配列番号１、２、７、８、１４及び１９として特定されるペプチドの阻害を評価するため、肺癌患者から得られ、３０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養培地で維持された肺細胞の初代培養を行った。ウイルスチャレンジの前に、０．０１μＭ～１００μＭの濃度のペプチドで培養物を２時間又は２４時間処理した。培地を廃棄し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で２時間、１０のＭＯＩでデング２ウイルスに感染させた。ウイルスを除去し、次いで洗浄を行い、培養物をＤＭＥＭ培地中のペプチドで再度処理し、３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。その後、培養物を収集して、ＶｅｒｏＥ６細胞に対するウイルス性能を評価した。このために、細胞を２４ウェルプレートに播種し、細胞がコンフルエンスに達すると、上清の連続１０倍希釈液に感染させ、３７℃及び５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。次に、ＰＢＳで洗浄し、２×ＤＭＥＭ（１：１）中の寒天層を添加した。層を固化させ、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。プレートをクリスタルバイオレットで染色して、ＰＦＵの数を決定した。ペプチドは、６８～８８％のウイルス複製を阻害した（表５）。
【0051】
Ｇｌｏｒｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（Ｇｌｏｒｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ． ２０１１， ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ６（７）： ｅ２２１６０， ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２２１６０）に従って、ヒト鼻粘膜の一次外植片において単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）の複製を行った。外植片を２４ウェルプレートで培養し、配列番号１、３、１３、１５及び２０として特定されるペプチドで２時間、０．０１～１００μＭの濃度で処理し、その後、無血清培地中１０７ ＴＣＩＤ５０ ＨＳＶ－１／ｍＬに３７℃及び５％ＣＯ２で１時間感染させた。その後、培養物を洗浄し、培養培地中のペプチドの存在下、３７℃及び５％ＣＯ２で３６時間維持した。培養物を回収し、ＨＳＶ－１をｑＰＣＲによって定量した。ウイルス阻害の割合は、ペプチドの存在下で７０～９２％の範囲であった（表５）。
【0052】
配列番号１～２０として配列表において特定される全てのペプチドを、言及されたウイルスのそれぞれに対してその後の実験で評価し、表５に示す阻害範囲と同様の阻害範囲であった。
【表5】
【0053】
例８．呼吸器系由来の上皮細胞以外の上皮細胞に対するペプチドの効果。
本発明のペプチドが呼吸器系由来のもの以外の初代上皮細胞におけるウイルス感染を阻害するかどうかを見出すため、ＨＳＶ－１感染をヒト角膜上皮細胞の初代培養物において試験した。細胞を８０～９０％コンフルエンスに達するまで４８ウェルプレートに播種し、それらを配列番号１、１３及び２０として特定されるペプチドで異なる濃度で２時間処理し、無血清培地中１０７ ＴＣＩＤ５０のＨＳＶ－１／ｍＬに３７℃及び５％ＣＯ２で１時間感染させた。細胞を洗浄し、ペプチドで再度処理し、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間維持した。培養物中のＨＳＶ－１の存在をｑＰＣＲによって決定した。例７で実証されるように、これらのペプチドが初代呼吸細胞においてこのウイルスを阻害することができたという事実にもかかわらず、ペプチドの存在下で得られたウイルス阻害の割合は２５％未満であった。
本発明のペプチドが呼吸器系由来のもの以外の初代上皮細胞におけるウイルス感染を阻害するかどうかを見出すため、ＨＳＶ－１感染をヒト角膜上皮細胞の初代培養物において試験した。細胞を８０～９０％コンフルエンスに達するまで４８ウェルプレートに播種し、それらを配列番号１、１３及び２０として特定されるペプチドで異なる濃度で２時間処理し、無血清培地中１０７ ＴＣＩＤ５０のＨＳＶ－１／ｍＬに３７℃及び５％ＣＯ２で１時間感染させた。細胞を洗浄し、ペプチドで再度処理し、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間維持した。培養物中のＨＳＶ－１の存在をｑＰＣＲによって決定した。例７で実証されるように、これらのペプチドが初代呼吸細胞においてこのウイルスを阻害することができたという事実にもかかわらず、ペプチドの存在下で得られたウイルス阻害の割合は２５％未満であった。
【0054】
例９．ウシコロナウイルス複製の阻害における配列番号１として特定されるペプチドとアルファインターフェロンとの相乗効果。
組換えアルファ２ｂインターフェロン（Ｈｅｂｅｒｏｎ（商標）Ａｌｆａ Ｒ、キューバ）と組み合わせた配列番号１として特定されるペプチドの抗ウイルス効果を、９６ウェルプレートを使用して、ＭＤＢＫ細胞におけるウシコロナウイルスのＭｅｂｕｓ株の感染系によって評価した。ペプチド処理を１０μＭで２４時間行い、インターフェロンとのインキュベーションを２０μｇ／ｍＬで２４時間行った。結果を図５に示す。図から分かるように、両方の分子の組合せは、ペプチド単独と比較してウイルス感染をおよそ５０倍減少させ、インターフェロンと比較して１００倍減少させた。試験結果は、インターフェロンとの同時処理による上記ペプチドの抗ウイルス効果の増強を実証している。配列番号２～配列番号２０として配列表において特定されるペプチドでも同様の結果が得られた。
組換えアルファ２ｂインターフェロン（Ｈｅｂｅｒｏｎ（商標）Ａｌｆａ Ｒ、キューバ）と組み合わせた配列番号１として特定されるペプチドの抗ウイルス効果を、９６ウェルプレートを使用して、ＭＤＢＫ細胞におけるウシコロナウイルスのＭｅｂｕｓ株の感染系によって評価した。ペプチド処理を１０μＭで２４時間行い、インターフェロンとのインキュベーションを２０μｇ／ｍＬで２４時間行った。結果を図５に示す。図から分かるように、両方の分子の組合せは、ペプチド単独と比較してウイルス感染をおよそ５０倍減少させ、インターフェロンと比較して１００倍減少させた。試験結果は、インターフェロンとの同時処理による上記ペプチドの抗ウイルス効果の増強を実証している。配列番号２～配列番号２０として配列表において特定されるペプチドでも同様の結果が得られた。
【0055】
例１０．抗ウイルス活性を有する異なる化合物と組み合わせたペプチドの効果。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は他のウイルスに対して抗ウイルス活性を有する化合物と組み合わせた配列番号１として特定されるペプチドの効果を評価するために、例２に記載されているように、ＶｅｒｏＥ６細胞に対してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジアッセイを実施した。単層のＶｅｒｏＥ６細胞を、配列番号１として特定されるペプチドと共に、１０μＭで１時間又は２４時間、単独で、又は各抗ウイルス化合物と共に３７℃、５％ＣＯ２で、０．１μＭ～１００μＭの濃度でインキュベートした。抗ウイルス効果をＣＰＥ阻害率として表し、ペプチドの有無による各化合物の阻害濃度５０（ＩＣ５０）を算出した。表６において、配列番号１、２及び３として特定されるペプチドの存在下で評価された化合物は、抗ウイルス活性に対する増強効果を示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は他のウイルスに対して抗ウイルス活性を有する化合物と組み合わせた配列番号１として特定されるペプチドの効果を評価するために、例２に記載されているように、ＶｅｒｏＥ６細胞に対してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジアッセイを実施した。単層のＶｅｒｏＥ６細胞を、配列番号１として特定されるペプチドと共に、１０μＭで１時間又は２４時間、単独で、又は各抗ウイルス化合物と共に３７℃、５％ＣＯ２で、０．１μＭ～１００μＭの濃度でインキュベートした。抗ウイルス効果をＣＰＥ阻害率として表し、ペプチドの有無による各化合物の阻害濃度５０（ＩＣ５０）を算出した。表６において、配列番号１、２及び３として特定されるペプチドの存在下で評価された化合物は、抗ウイルス活性に対する増強効果を示す。
【表6】
【0056】
配列番号２～配列番号２０として配列表において特定される残りのペプチドも、表６に記載の化合物の活性を増強した。
【0057】
例１１．配列番号１～２０として配列表において特定されるペプチドのうち１つ以上を含む医薬組成物。
呼吸器系の上皮細胞に影響を及ぼすウイルスによって引き起こされる感染症の予防又は治療のための医薬組成物を得るため、１．０～２０．０ｍｇ／ｍＬの濃度の配列番号１～２０として配列表において特定されるペプチドの少なくとも１つと、１０．０～２０．０ｍｇ／ｍｌの間の濃度のスクロースと、０．１～６μｇ／ｍｌの濃度の酢酸を含む製剤を開発した。組成物はさらに、水酸化ナトリウム及び注射用水を適量（十分な濃度で）含んでいた。製剤を加速安定性試験に供し、結果は、それらが９５％を超える純度及び０．０１ｃｆｕ／ｍｇ（コロニー形成単位／ｍｇ）以下の微生物限界を有する均一な白色凍結乾燥物として残っており、発熱物質を含まず、１０％以下の湿度パーセンテージ、６０％以上のペプチド含量及び２～６の間のｐＨを有することを示した。
呼吸器系の上皮細胞に影響を及ぼすウイルスによって引き起こされる感染症の予防又は治療のための医薬組成物を得るため、１．０～２０．０ｍｇ／ｍＬの濃度の配列番号１～２０として配列表において特定されるペプチドの少なくとも１つと、１０．０～２０．０ｍｇ／ｍｌの間の濃度のスクロースと、０．１～６μｇ／ｍｌの濃度の酢酸を含む製剤を開発した。組成物はさらに、水酸化ナトリウム及び注射用水を適量（十分な濃度で）含んでいた。製剤を加速安定性試験に供し、結果は、それらが９５％を超える純度及び０．０１ｃｆｕ／ｍｇ（コロニー形成単位／ｍｇ）以下の微生物限界を有する均一な白色凍結乾燥物として残っており、発熱物質を含まず、１０％以下の湿度パーセンテージ、６０％以上のペプチド含量及び２～６の間のｐＨを有することを示した。
【0058】
例１２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している患者における配列番号１として特定されるペプチドの抗ウイルス効果。
ヘルシンキ宣言に従ってヒト研究を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者群を、ヒトにおける臨床使用に適合され品質で得られた配列番号１として特定されるペプチドで治療した。ペプチドを皮下投与した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの存在を、１５日間にわたり４８時間又は９６時間毎に患者の鼻咽頭スワブにおいてＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）によって決定した。いずれも疾患の初期段階にあり、同様の特徴を有する２０人の患者をそれぞれ含む４つの群を形成した。群１の患者は、カレトラ（ロピナビル／リトナビル）、クロロキン、及びＨｅｂｅｒｏｎ（商標）Ａｌｐｈａ Ｒ（ＩＦＮα２ｂ）に基づくＣＯＶＩＤ－１９療法において最も頻繁に使用される治療を受けた。群２は、この治療に加えて、配列表において配列番号１として特定されるペプチドを受けた。後者を２ｍｇ／ｋｇ体重で５日間皮下投与した。群３の患者は、カレトラ、クロロキン、並びに筋肉内ＩＦＮα２ｂ（３００万国際ユニット、ＭＩＵ）及びＩＦＮγ（０．５ＭＩＵ）の複合製剤に基づく治療を受けた。群４の患者は、群３と同じ治療に加えて、配列表において配列番号１として特定されるペプチド（２ｍｇ／ｋｇ体重）を５日間にわたって皮下に受けた。
ヘルシンキ宣言に従ってヒト研究を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者群を、ヒトにおける臨床使用に適合され品質で得られた配列番号１として特定されるペプチドで治療した。ペプチドを皮下投与した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの存在を、１５日間にわたり４８時間又は９６時間毎に患者の鼻咽頭スワブにおいてＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）によって決定した。いずれも疾患の初期段階にあり、同様の特徴を有する２０人の患者をそれぞれ含む４つの群を形成した。群１の患者は、カレトラ（ロピナビル／リトナビル）、クロロキン、及びＨｅｂｅｒｏｎ（商標）Ａｌｐｈａ Ｒ（ＩＦＮα２ｂ）に基づくＣＯＶＩＤ－１９療法において最も頻繁に使用される治療を受けた。群２は、この治療に加えて、配列表において配列番号１として特定されるペプチドを受けた。後者を２ｍｇ／ｋｇ体重で５日間皮下投与した。群３の患者は、カレトラ、クロロキン、並びに筋肉内ＩＦＮα２ｂ（３００万国際ユニット、ＭＩＵ）及びＩＦＮγ（０．５ＭＩＵ）の複合製剤に基づく治療を受けた。群４の患者は、群３と同じ治療に加えて、配列表において配列番号１として特定されるペプチド（２ｍｇ／ｋｇ体重）を５日間にわたって皮下に受けた。
【0059】
結果は、ペプチドで治療した患者が、ペプチドの非存在下で同様の治療を行った患者と比較して、より短時間でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性になることを示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陰性と検査された患者の数は、ペプチド抗ウイルス治療を受けた群でより高かった（表７）。治療開始後４日目に、ペプチドで治療した患者の８０％及び８５％（それぞれ２群及び４群）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性であり、ペプチドなしで治療を受けた群が到達した割合（群１及び群３）よりも高い割合であった。治療開始後６日目に、群２及び４の患者の１００％がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性であったが、ペプチドで処置しなかった患者は１４日目に１００％に達した（表７）。
【表7】
【0060】
例１３．ＣＯＶＩＤ－１９患者と接触している健康な個体における配列番号１として配列表配列表において特定されるペプチドの効果。
健康な個体（ＣＯＶＩＤ－１９患者の接触者）をこの試験に含めた。同様のリスクの感染病原体に曝露された２５人の健常個体の２つの群（群Ｉ及び群ＩＩ）を分析した。群ＩＩを、配列表において配列番号１として特定されるペプチドを１４μｇ／ｍＬの濃度で鼻腔内液滴として６日間毎日治療した。ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出のために鼻咽頭スワブ試料を収集した。サンプリングを、試験の開始時及び開始から７日後に行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２決定の結果は、試験した２５名のうち１２名（４８％）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していた未治療群とは対照的に、配列番号１として配列表において特定されるペプチドで治療した個体がウイルス感染から防御され、試験した２５名の個体のうち１個体のみが感染したことを示した（３．９％）（表８）。
健康な個体（ＣＯＶＩＤ－１９患者の接触者）をこの試験に含めた。同様のリスクの感染病原体に曝露された２５人の健常個体の２つの群（群Ｉ及び群ＩＩ）を分析した。群ＩＩを、配列表において配列番号１として特定されるペプチドを１４μｇ／ｍＬの濃度で鼻腔内液滴として６日間毎日治療した。ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出のために鼻咽頭スワブ試料を収集した。サンプリングを、試験の開始時及び開始から７日後に行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２決定の結果は、試験した２５名のうち１２名（４８％）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していた未治療群とは対照的に、配列番号１として配列表において特定されるペプチドで治療した個体がウイルス感染から防御され、試験した２５名の個体のうち１個体のみが感染したことを示した（３．９％）（表８）。
【表8】
【配列表フリーテキスト】
【0061】
配列表１ ＜２２３＞人工配列の説明：合成ペプチド
配列表２ ＜２２３＞人工配列の説明：合成ペプチド
配列表２＜２２３＞アセチル化
配列表３ ＜２２３＞人工配列の説明：アセチル化されており、Ｎ６がＤアミノ酸である合成ペプチド
配列表３ ＜２２３＞アセチル化
配列表４ ＜２２３＞人工配列の説明：アセチル化されており、Ｎ８がＤアミノ酸である合成ペプチド
配列表４ ＜２２３＞アセチル化
配列表５ ＜２２３＞人工配列の説明：アセチル化されており、Ｎ９がＤアミノ酸である合成ペプチド
配列表５＜２２３＞アセチル化
配列表６～配列表１８ ＜２２３＞人工配列の説明：合成ペプチド
配列表１９ ＜２２３＞人工配列の説明：Ｎ６がＤアミノ酸である合成ペプチド
配列表２０ ＜２２３＞人工配列の説明：Ｎ８がＤアミノ酸である合成ペプチド
配列表２１～配列表２２ ＜２２３＞人工配列の説明：合成ペプチド
配列表２３ ＜２２３＞人工配列の説明：Ｃ１５とＣ２５との間にジスルフィド結合を有する抗ウイルス合成ペプチド
配列表２ ＜２２３＞人工配列の説明：合成ペプチド
配列表２＜２２３＞アセチル化
配列表３ ＜２２３＞人工配列の説明：アセチル化されており、Ｎ６がＤアミノ酸である合成ペプチド
配列表３ ＜２２３＞アセチル化
配列表４ ＜２２３＞人工配列の説明：アセチル化されており、Ｎ８がＤアミノ酸である合成ペプチド
配列表４ ＜２２３＞アセチル化
配列表５ ＜２２３＞人工配列の説明：アセチル化されており、Ｎ９がＤアミノ酸である合成ペプチド
配列表５＜２２３＞アセチル化
配列表６～配列表１８ ＜２２３＞人工配列の説明：合成ペプチド
配列表１９ ＜２２３＞人工配列の説明：Ｎ６がＤアミノ酸である合成ペプチド
配列表２０ ＜２２３＞人工配列の説明：Ｎ８がＤアミノ酸である合成ペプチド
配列表２１～配列表２２ ＜２２３＞人工配列の説明：合成ペプチド
配列表２３ ＜２２３＞人工配列の説明：Ｃ１５とＣ２５との間にジスルフィド結合を有する抗ウイルス合成ペプチド
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、ペプチド。
【請求項2】
配列番号２～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項3】
配列番号１として特定されるアミノ酸配列を有するペプチドをさらに含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
非経口経路又は粘膜経路による投与のために製剤化される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項5】
配列番号１として特定されるアミノ酸配列を有するペプチドと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための、医薬組成物。
【請求項6】
非経口経路又は粘膜経路による投与のために製剤化される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記感染症が、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、又はアデノウイルス科のウイルスによって引き起こされる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記感染症が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び豚熱ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項9】
哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための医薬品を製造するための、配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの使用。
【請求項10】
前記感染症が、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、又はアデノウイルス科のウイルスによって引き起こされる、請求項９に記載の使用。
【請求項11】
前記感染症が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び豚熱ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項９に記載の使用。
【請求項12】
前記医薬品が、配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２つ以上のペプチドを含む、請求項９に記載の使用。
【請求項13】
哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための医薬組成物であって、治療有効量の、配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを含み、それを必要とする個体に投与されることを特徴とする、上記医薬組成物。
【請求項14】
前記感染症が、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、又はアデノウイルス科のウイルスによって引き起こされる、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記感染症が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び豚熱ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項16】
抗ウイルス薬が前記個体にさらに投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記医薬組成物及び前記抗ウイルス薬が、同時に又は順次投与される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記抗ウイルス薬が、リバビリン、イベルメクチン、ペンシクロビル、ニタゾキサニド、ナファモスタット、レムデシビル、ファビピラビル、配列番号２３として特定されるペプチド、アルファインターフェロン（ＩＦＮ）、ガンマＩＦＮ、又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項19】
配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ２つ以上のペプチドを含むことを特徴とする、組合せ医薬。
【請求項20】
前記ペプチドが、同じ治療の過程で同時に又は順次投与される、請求項１９に記載の組合せ医薬。
【請求項21】
哺乳動物呼吸器系の上皮細胞に感染するウイルスによって引き起こされる感染症を治療又は予防するための組合せ医薬であって、ａ）配列番号１～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、ｂ）抗ウイルス薬とを含むことを特徴とする、組合せ医薬。
【請求項22】
前記抗ウイルス薬が、リバビリン、イベルメクチン、ペンシクロビル、ニタゾキサニド、ナファモスタット、レムデシビル、ファビピラビル、配列番号２３として特定されるペプチド、アルファインターフェロン（ＩＦＮ）、ガンマＩＦＮ、又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の組合せ医薬。
【請求項23】
前記ペプチド及び前記抗ウイルス薬が、同じ治療の過程で同時に又は順次投与される、請求項２１に記載の組合せ医薬。
【請求項24】
前記感染症が、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科及びパラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、又はアデノウイルス科のウイルスによって引き起こされる、請求項２１に記載の組合せ医薬。
【請求項25】
前記感染症が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び豚熱ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項２１に記載の組合せ医薬。【国際調査報告】