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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-10
(54)【発明の名称】特異的結合分子の迅速なヒト化
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231227BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231227BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231227BHJP
C40B 40/10 20060101ALI20231227BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20231227BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231227BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231227BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231227BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231227BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20231227BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231227BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20231227BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20231227BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20231227BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231227BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/62 Z
C40B40/10
C07K16/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61P43/00 111
A61P29/00
A61P35/00
A61P19/02
A61P17/00
A61P13/12
A61P29/00 101
A61P1/04
A61P25/00
A61P9/10 101
A61K39/395 N
A61K39/395 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023536953
(86)(22)【出願日】2021-12-17
(85)【翻訳文提出日】2023-08-15
(86)【国際出願番号】 EP2021086492
(87)【国際公開番号】W WO2022129524
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】2020152.1
(32)【優先日】2020-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520102808
【氏名又は名称】エラスモーゲン リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】バレル，キャロライン ジェーン
(72)【発明者】
【氏名】コバレバ，マリナ
(72)【発明者】
【氏名】ファーグソン，ローラ アン
(72)【発明者】
【氏名】ウバー，オビナ チュクエメカ
(72)【発明者】
【氏名】ポーター，アンドリュー ジャスティン ラドクリフ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AD12
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA03
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA16
4C085CC05
4C085CC21
4C085DD23
4C085DD31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA52
4H045DA76
4H045EA20
(57)【要約】
本発明は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーに由来するヒト化された抗原特異的結合分子の合成ライブラリー、これを生成するためのプロセス、および前記ライブラリーから単離された特異的抗原特異的結合分子に関する。本発明はまた、ヒト化されたＩｇ様新規抗原受容体可変ドメイン（ＶＮＡＲ）を含むマルチドメイン特異的結合分子にも関する。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）に結合する特異的結合ドメインもまた提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の式（Ｉ）：ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するための方法であって、
（１）ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の２つ以上の連続するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成すること、ここで前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ライゲートされると、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む；
（２）２つ以上の連続するペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成すること；
（３）（２）で得られたライゲートされたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングすること；および
（４）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成すること、を含む方法。
【請求項2】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の少なくとも１つが、それぞれ、ＦＷ２が、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った１つまたは複数の配列を含むこと；
ＦＷ３ａが、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った１つまたは複数の配列を含むこと；
ＦＷ３ｂが、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った１つまたは複数の配列を含むこと；および
ＦＷ４が、Ｄ／Ｙ／Ｆ Ｇ Ａ／Ｇ／Ｑ Ｇ Ｔ Ｋ／Ｖ Ｖ／Ｌ Ｅ／Ｔ Ｉ／Ｖ Ｋ／Ｎ（配列番号５）に従った１つまたは複数の配列を含むこと
からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のうちの２つが、ヒト化配列を含み、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のうちの残りの２つが、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の少なくとも１つに対応する配列を含む、または、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーの各配列について、（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、および／または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のうち３つが、ヒト化配列を含み、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のうちの残りの１つが、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の少なくとも１つに対応する配列を含む、または、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーの各配列について、（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、および／または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＦＷ４が、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４についての配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ＦＷ３ａが、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ３ａについての配列を含む、またはＦＷ３ｂが、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ３ｂについての配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の組み合わせ配列の少なくとも３つのアミノ酸残基がヒト化されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＦＷ１についての１つまたは複数のヒト化配列が、Ａ／Ｔ Ｓ／Ｒ Ｖ Ｎ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号６）；
Ｄ Ｉ Ｑ Ｍ Ｔ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号７）；および
ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）
からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ＦＷ２についての１つまたは複数の配列が、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ Ｋ Ｎ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号９）；
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｙ／Ｆ Ｑ Ｑ Ｋ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号１０）；および
ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）
からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＦＷ３ａについての１つまたは複数の配列が、ＧＲＹＶＥＳＶＮ（配列番号１２）；
ＧＲＦＳＧＳＧＳ（配列番号１３）；
ＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）；および
ＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）
からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ＦＷ３ｂについての１つまたは複数の配列が、Ｆ Ｓ Ｌ Ｒ Ｉ Ｋ Ｄ Ｌ Ｔ Ｖ Ａ Ｄ Ｓ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１６）；
Ｆ Ｔ Ｌ Ｔ Ｉ Ｓ Ｓ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｄ Ｆ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１７）；
ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）；および
ＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）
からなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ＦＷ４についての１つまたは複数の配列が、Ｄ／Ｙ Ｇ Ａ／Ｇ／Ｑ Ｇ Ｔ Ｋ Ｖ／Ｌ Ｅ Ｉ Ｋ（配列番号２０）；および
ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）
からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の少なくとも１つが、ＦＷ２が、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２２）に従った１つまたは複数の配列を含むこと；
ＦＷ３ａが、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号２３）に従った１つまたは複数の配列を含むこと；
ＦＷ３ｂが、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号２４）に従った１つまたは複数の配列を含むこと；および
ＦＷ４が、Ｄ／Ｙ Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｋ Ｖ Ｅ Ｉ Ｋ（配列番号２５）に従った１つまたは複数の配列を含むこと
からなる群から選択される１つまたは複数の配列をそれぞれ含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ＣＤＲ１が、６アミノ酸の領域であり、ＨＶ２が、９アミノ酸の領域であり、
ＨＶ４が、５アミノ酸の領域であり、および／または
ＣＤＲ３が、８から３６アミノ酸の領域である、
請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４、およびＣＤＲ３の少なくとも１つが、ＣＤＲ１が、Ｙ／Ｔ／Ｒ／Ｉ／Ｋ／Ｎ／Ｓ Ｃ／Ｙ Ｐ／Ｓ／Ａ／Ｇ Ｗ／Ｌ Ｈ／Ｓ／Ｙ Ｎ／Ｒ／Ｇ／Ｓ（配列番号２６）に従った１つまたは複数の配列を含むこと、ここでＣＤＲ１がシステイン残基を含んでいれば、ＣＤＲ３もまたシステイン残基を含む；
ＨＶ２が、Ｓ／Ｔ／Ｐ Ｎ／Ｄ Ｑ／Ｗ Ｅ Ｒ Ｉ／Ｍ Ｓ Ｉ Ｇ／Ｓ（配列番号２７）に従った１つまたは複数の配列を含むこと；
ＨＶ４が、Ｋ Ｇ／Ｒ Ｔ／Ｐ／Ｓ Ｋ／Ｍ Ｓ（配列番号２８）に従った１つまたは複数の配列を含むこと；ならびに
ＣＤＲ３が、以下の式（ＩＩ）：
Ｊ－Ｊ－［Ｘａａ］ｎ－Ｏ－Ｕ－Ｕ’
に従った１つまたは複数の配列を含むこと、
ここで、Ｊが、システイン以外の任意の天然に生じるアミノ酸であり、
Ｘａａが、任意の天然に生じるアミノ酸であり、
ｎが、３から３１であり、
Ｏが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、リジン、アスパラギン、セリン、バリン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｕが、システイン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、トリプトファン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｕ’が、チロシン、ロイシン、バリン、およびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＣＤＲ３が、１つのシステイン残基を含むまたはシステイン残基を含まず、ＣＤＲ３がシステイン残基を含んでいれば、ＣＤＲ１もまたシステイン残基を含んでいる
からなる群から選択される１つまたは複数の配列をそれぞれ含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４、およびＣＤＲ３のうちの１つまたは複数の配列を、制御された突然変異生成にかけること、ならびに所望のＣＤＲ１配列、ＨＶ２配列、ＨＶ４配列、および／またはＣＤＲ３配列を、標的分子に対する親和性成熟によって選択すること
をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ヒト化された抗原特異的抗原結合分子を生成するための方法であって、（１）請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法に従って準備されたライブラリーから所望のクローンを選択すること；
（２）これらのクローンから、ヒト化された抗原特異的抗原結合分子を単離および精製すること；
（３）前記ヒト化された抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングすること；ならびに
（４）宿主を形質転換して前記発現ベクターを発現させること、を含む、方法。
【請求項18】
以下の式（Ｉ）：ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子を生成するための方法であって、
（１）ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の２つ以上の連続するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成すること、ここで、前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ライゲートされると、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む；
（２）２つ以上の連続するペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成すること；
（３）（１）で得られた増幅されたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングすること；および
（４）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成すること；
（５）ライブラリーから所望のクローンを選択すること；
（６）クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製すること；
（７）前記抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングすること；ならびに
（８）宿主を形質転換して前記発現ベクターを発現させること、を含む、方法。
【請求項19】
前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ＦＷ１、ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３、およびＣＤＲ３－ＦＷ４である、請求項１～１７または請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
２つ以上のＶＮＡＲドメインを含むマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子であって、 各ＶＮＡＲドメインが、以下の式（Ｉ）：ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するアミノ酸配列を含み、
ここで、少なくとも１つのＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従ったヒト化配列を含み、
少なくとも１つのＶＮＡＲドメインのＦＷ４が、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列、または
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、もしくは
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含む、マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項21】
ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の少なくとも１つが、それぞれ、ＦＷ１が、
ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）、
Ａ／Ｔ Ｓ／Ｒ Ｖ Ｎ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号６）、および
Ｄ Ｉ Ｑ Ｍ Ｔ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号７）
からなる群から選択される配列を含むこと；
ＦＷ２が、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った配列を含むこと；
ＦＷ３ａが、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った配列を含むこと；
ＦＷ３ｂが、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った配列を含むこと；ならびに
ＦＷ４が、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）に従った配列、または
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、もしくは
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含むこと
からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項２０に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項22】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、およびＦＷ３ｂの組み合わせ配列の少なくとも３つのアミノ酸残基がヒト化されている、請求項２０または２１に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項23】
ＦＷ２についての１つまたは複数の配列が、ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）；
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ Ｋ Ｎ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号９）；および
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｙ／Ｆ Ｑ Ｑ Ｋ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号１０）
からなる群から選択される、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項24】
ＦＷ３ａについての１つまたは複数の配列が、ＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）；
ＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）；
ＧＲＹＶＥＳＶＮ（配列番号１２）；および
ＧＲＦＳＧＳＧＳ（配列番号１３）
からなる群から選択される、請求項２０～２３のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項25】
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ａがＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）を含み、第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ａがＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）を含む、請求項２４に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項26】
ＦＷ３ｂについての１つまたは複数の配列が、ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）；
ＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）；
Ｆ Ｓ Ｌ Ｒ Ｉ Ｋ Ｄ Ｌ Ｔ Ｖ Ａ Ｄ Ｓ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１６）；および
Ｆ Ｔ Ｌ Ｔ Ｉ Ｓ Ｓ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｄ Ｆ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１７）
からなる群から選択される、請求項２０～２５のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項27】
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ｂがＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）を含み、第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ｂがＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）を含む、請求項２６に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項28】
ＦＷ４についての１つまたは複数の配列がＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含む、請求項２０～２７のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項29】
ＦＷ１についての１つまたは複数の配列がＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含む、請求項２０～２８のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項30】
第１のＶＮＡＲドメインおよび第２のＶＮＡＲドメインを含む、請求項２０～２９のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子であって、前記第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ１が、ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含み；
前記第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ２が、ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）を含み；
前記第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ａが、ＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）を含み；
前記第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ｂが、ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）を含み；
前記第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ４が、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含み；
前記第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ１が、ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含み；
前記第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ２が、ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）を含み；
前記第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ａが、ＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）を含み；
前記第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ｂが、ＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）を含み；
前記第２のＶＮＡＲドメインＦＷ４が、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含む、マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項31】
前記ＶＮＡＲドメイン間のスペーサー配列をさらに含む、請求項２０～３０のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項32】
前記スペーサー配列が、免疫グロブリンＦｃ領域に由来する、請求項２０～３１のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項33】
前記スペーサー配列が、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域に由来する、請求項２０～３２のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項34】
前記ＶＮＡＲドメインの１つまたは複数が、以下のＣＤＲおよび超可変領域（ＨＶ）を含むＴＮＦ－アルファ特異的ＶＮＡＲ結合ドメインである、請求項２０～３２のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子：ＣＤＲ１：ＨＣＡＴＳＳ（配列番号２９）またはＮＣＧＬＳＳ（配列番号３０）またはＮＣＡＬＳＳ（配列番号３１）
ＨＶ２：ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ（配列番号３２）
ＨＶ４：ＳＧＳＫＳ（配列番号３３）またはＥＧＳＫＳ（配列番号３４）
ＣＤＲ３：ＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶ（配列番号３５）またはＳＷＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶ（配列番号３６）またはＹＩＰＣＩＤＥＬＶＹＭＩＳＧＧＴＳＧＰＩＨＤＶ（配列番号３７）。
【請求項35】
第１のＶＮＡＲドメインおよび第２のＶＮＡＲドメインを含む、請求項３４に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子であって、前記第１のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ１が、ＨＣＡＴＳＳ（配列番号２９）を含み；
前記第１のＶＮＡＲドメインのＨＶ２が、ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ（配列番号３２）を含み；
前記第１のＶＮＡＲドメインのＨＶ４が、ＳＧＳＫＳ（配列番号３３）を含み；
前記第１のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ３が、ＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶ（配列番号３５）を含み；
前記第２のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ１が、ＮＣＧＬＳＳ（配列番号３０）を含み；
前記第２のＶＮＡＲドメインのＨＶ２が、ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ（配列番号３２）を含み；
前記第２のＶＮＡＲドメインのＨＶ４が、ＥＧＳＫＳ（配列番号３４）を含み；
前記第２のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ３が、ＳＷＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶ（配列番号３６）を含む、マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項36】
前記第１のＶＮＡＲドメインが、配列ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳＨＣＡＴＳＳＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号３８）を含み、前記第２のＶＮＡＲドメインが、配列ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳＮＣＧＬＳＳＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＩＮＥＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬＳＷＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号３９）を含む、請求項３５に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項37】
ヒトに投与される場合に潜在的免疫原性を低減させるために、１つまたは複数のアミノ酸配列位置で修飾されている、請求項２０～３６のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子。
【請求項38】
請求項２０～３７のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項39】
マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子を準備するための方法であって、請求項３８に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記宿主細胞が前記マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子を生成するような条件下で培養または維持することを含み、前記マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子を単離することをさらに含んでもよい、方法。
【請求項40】
請求項２０～３７のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的結合分子および場合によって少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項41】
治療において使用するための、請求項２０～３７のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗原特異的結合分子。
【請求項42】
それを必要とする患者における疾患を処置するための医薬品の製造における、請求項２０～３７のいずれか一項に記載の特異的抗原結合分子の使用。
【請求項43】
処置を必要とする患者への、治療有効投与量の、請求項４０に記載の医薬組成物の投与を含む、前記患者における疾患を処置する方法。
【請求項44】
治療有効量の、ＴＮＦαに特異的に結合するマルチドメイン抗原特異的結合分子を含む請求項４０に記載の組成物の投与を含む、ＴＮＦαが媒介する状態を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーに由来するヒト化された抗原特異的結合分子の合成ライブラリー、これを生成するためのプロセス、および前記ライブラリーから単離された特異的抗原特異的結合分子に関する。本発明はまた、ヒト化されたＩｇ様の新規抗原受容体可変ドメイン（ＶＮＡＲ）を含むマルチドメイン特異的結合分子に関する。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）に結合する特異的結合ドメインもまた提供される。
【0002】
本発明は全体として、ヒト化された抗原特異的抗原結合分子のライブラリーに関する。ライブラリーは、ＣＤＲ領域およびフレームワーク領域の両方において多様性を生じさせること、ならびに少なくとも１つのフレームワーク領域の配列をヒト化することによって生じる、ドメインおよび／またはその断片を含む複数の異なるヒト化された抗原特異的抗原結合分子を含む。特に、ＣＤＲ領域における多様性は、本発明の抗原特異的抗原結合分子のＶＮＡＲ配列およびドメインの構造的混乱を最小にしながら多様性を最大化するように設計されている。
【0003】
このようなライブラリーは、例えば、結合親和性およびアビディティーなどの所望の活性を有する合成ＶＮＡＲクローンの選択および／またはスクリーニングに有用な、コンビナトリアルライブラリーを提供する。これらのライブラリーは、広範な標的抗原のいずれとも相互作用し得る配列の同定に有用である。例えば、ファージ上に提示されている、本発明の、多様化されたＶＮＡＲポリペプチドを含むライブラリーは、目的の抗原結合分子の選択および／またはスクリーニングの、ハイスループットで、効率的で自動化可能なシステムに特に有用であり、また、当該システムを提供する。本発明の方法は、由来源分子または鋳型分子に対する変化を最小にして、標的抗原に対する高親和性バインダーを提供するように、および抗体または抗原結合断片を細胞培養で生成する場合に良好な生成収量をもたらすように、設計されている。
【背景技術】
【0004】
ＷＯ２０１４／１７３９５９は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種から単離されたＲＮＡに由来する抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するための方法を記載している。このようなライブラリーは、任意の所与の標的のための潜在的ＶＮＡＲ治療薬を効果的に供給するために有用である。このようなライブラリーの有用性は、同一種内の異なるアイソタイプおよび異なるＥｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ種の異なるアイソタイプに由来する２つ以上の天然に生じるＶＮＡＲ配列から生成されたライブラリーから単離されたＶＮＡＲの、予想外の多様性、親和性、特異性、および有効性に基づく。本発明者らは今回、２つ以上の天然に生じるＶＮＡＲ配列を使用する利点に依拠するＷＯ２０１４／１７３９５９の教示とは対照的に、少なくとも１つのフレームワーク領域についてのヒト化配列を組み込んでいるライブラリーを生成した。潜在的ＶＮＡＲ治療薬は既にヒト化されているため、本発明のライブラリーは、任意の所与の標的のための改善された潜在的ＶＮＡＲ治療薬を供給することを可能にする。このことによって、任意の所与の標的のためのヒト化された潜在的ＶＮＡＲ治療薬の、早期の、効率的でハイスループットな試験が可能となり、この試験データの妥当性が潜在的ＶＮＡＲ治療薬の後のヒト化（および再試験）の必要性によって損なわれることがないことは確実である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らはまた、１つのフレームワーク領域はヒト化されているが、別のフレームワーク領域は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのフレームワーク領域に対応する配列を保持している、有利な特性を有するマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子を同定した。驚くべきことに、本発明者らは、当該有利な特性が、特定のフレームワーク領域（ＦＷ１）が板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのフレームワーク領域に対応する配列を保持しており、別の特定のフレームワーク領域（ＦＷ４）がヒト化されている場合には消えるが、逆に、ＦＷ１がヒト化されており、ＦＷ４が板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのフレームワーク領域に対応する配列を保持している場合には維持されることを示している。
【課題を解決するための手段】
【0006】
第１の態様に従うと、本発明は、以下の式（Ｉ）：
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するための方法であって、
（１）ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の２つ以上の連続するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成するステップであって、前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ライゲートされると、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、式中、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む、ステップ、
（２）２つ以上の連続するペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成するステップ、
（３）（２）で得られたライゲートされたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングするステップ、および
（４）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するステップ
を含む方法を提供する。
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するための方法であって、
（１）ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の２つ以上の連続するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成するステップであって、前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ライゲートされると、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、式中、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む、ステップ、
（２）２つ以上の連続するペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成するステップ、
（３）（２）で得られたライゲートされたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングするステップ、および
（４）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するステップ
を含む方法を提供する。
【0007】
本発明の第２の態様に従うと、ヒト化された抗原特異的抗原結合分子を生成するためのプロセスであって、
（１）前記請求項のいずれかに記載の方法に従って準備されたライブラリーから所望のクローンを選択するステップ、
（２）これらのクローンから、ヒト化された抗原特異的抗原結合分子を単離および精製するステップ、
（３）ヒト化された抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングするステップ、ならびに
（４）宿主を形質転換して発現ベクターを発現させるステップ
を含むプロセスが提供される。
（１）前記請求項のいずれかに記載の方法に従って準備されたライブラリーから所望のクローンを選択するステップ、
（２）これらのクローンから、ヒト化された抗原特異的抗原結合分子を単離および精製するステップ、
（３）ヒト化された抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングするステップ、ならびに
（４）宿主を形質転換して発現ベクターを発現させるステップ
を含むプロセスが提供される。
【0008】
本発明の第３の態様に従うと、以下の式（Ｉ）：
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子を生成するための方法であって、
（１）ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の２つ以上の連続するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成するステップであって、前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ライゲートされると、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、式中、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む、ステップ、
（２）２つ以上の連続するペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成するステップ、
（３）（２）で得られたライゲートされたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングするステップ、ならびに
（４）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するステップ、
（５）ライブラリーから所望のクローンを選択するステップ、
（６）クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製するステップ、
（７）抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングするステップ、ならびに
（８）宿主を形質転換して発現ベクターを発現させるステップ
を含む方法が提供される。
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子を生成するための方法であって、
（１）ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の２つ以上の連続するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成するステップであって、前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ライゲートされると、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、式中、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む、ステップ、
（２）２つ以上の連続するペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成するステップ、
（３）（２）で得られたライゲートされたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングするステップ、ならびに
（４）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するステップ、
（５）ライブラリーから所望のクローンを選択するステップ、
（６）クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製するステップ、
（７）抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングするステップ、ならびに
（８）宿主を形質転換して発現ベクターを発現させるステップ
を含む方法が提供される。
【0009】
本発明の第４の態様に従うと、２つ以上のＶＮＡＲドメインを含むマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子であって、各ＶＮＡＲドメインが、以下の式（Ｉ）：
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するアミノ酸配列を含み、
式中、少なくとも１つのＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従ったヒト化配列を含み、
少なくとも１つのＶＮＡＲドメインのＦＷ４が、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列、あるいは
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含む、
マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子が提供される。
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するアミノ酸配列を含み、
式中、少なくとも１つのＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従ったヒト化配列を含み、
少なくとも１つのＶＮＡＲドメインのＦＷ４が、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列、あるいは
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含む、
マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子が提供される。
【0010】
本発明の第５の態様に従うと、本発明の第４の態様に従ったマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。
【0011】
本発明の第６の態様に従うと、本発明の第５の態様のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記宿主細胞がマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子を生成するような条件下で培養または維持するステップを含み、マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子を単離するステップを場合によってさらに含む、マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子を準備するための方法が提供される。
【0012】
本発明の第７の態様に従うと、本発明の第４の態様のマルチドメイン抗原特異的結合分子および場合によって少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物が提供される。
【0013】
本発明のさらなる態様に従うと、医薬において使用するための、前述の態様の医薬組成物が提供される。このような使用には、治療有効用量の上記で定義した本発明の医薬組成物の投与を介する、本発明の結合ドメインの標的抗原とそのリガンドパートナーとの間の相互作用に関連する疾患を処置するための方法が含まれる。組成物は、少なくとも１つの本発明のマルチドメイン特異的結合分子、またはこのような分子の組み合わせを含み得る。
【0014】
本発明のこの態様に従うと、本発明の結合ドメインの標的抗原とそのリガンドパートナーとの間の相互作用に関連する疾患を処置するための医薬品の製造において使用するための組成物が提供される。
【0015】
このような組成物は、示されているような、さらなる薬学的に活性な薬剤を含み得る。さらなる薬剤は、治療用化合物、例えば、抗炎症薬、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、または抗生物質であり得る。このようなさらなる薬剤は、それを必要とする患者への投与に適切な形態で存在し得、このような投与は、同時、個別、または連続的であり得る。構成要素は、必要に応じて指示を含み得るキットの形態で準備され得る。
【0016】
本発明に従うと、医薬において使用するための本発明のマルチドメイン特異的結合分子が提供される。本発明のこの態様は、したがって、それを必要とする患者における疾患を処置するための医薬品の製造における、このような本発明のマルチドメイン結合分子の使用に及ぶ。このような使用はまた、患者への、治療有効投与量の、本発明のマルチドメイン結合分子を含む本明細書において定義される医薬組成物の投与を含む、処置を必要とする患者における疾患を処置する方法も包含する。
【0017】
さらなる態様において、本発明は、ＴＮＦαが媒介する状態を処置するための方法であって、治療有効量の、ＴＮＦαに特異的に結合する本発明の組成物の投与を含む方法を提供する。
【0018】
以下の多くの図面を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】ヒト抗体軽鎖であるＤＰＫ９を鋳型として使用して、ヒト残基を抗ＴＮＦ ＶＮＡＲドメイン（Ｄ１およびＣ４）に組み込むことによって説明されるヒト化を示す図である。
【図2】ＶＮＡＲのＦＷ１またはＦＷ４が修復された、修飾されたＤ１－ｈｕＦｃ－Ｃ４ ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ構築物のアラインメントを示す図である。
【図3】還元ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－ＸバリアントのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。ＳｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ ＶＮＡＲ ＦＷ１は、ＨＥＫ２９３細胞における発現を示さなかったが、ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ ＶＮＡＲ ＦＷ４は、有意なタンパク質発現を示した。したがって、このフォーマットを、ネイティブなＶＮＡＲ Ｑｕａｄ－Ｘ（ＷＴ Ｑｕａｄ－Ｘとも呼ばれる）との比較におけるさらなる特徴付けおよび機能的評価のために次へ進めた。
【図4】ネイティブなＱｕａｄ－Ｘと比較した、ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ（ＶＮＡＲ ＦＷ４）の結合ＥＬＩＳＡを示す図である。この１対１の標的結合比較において、ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ（ＶＮＡＲ ＦＷ４）およびネイティブなＱｕａｄ－Ｘの両方が、ＴＮＦαを認識し（図４Ａ）、ヒト血清アルブミンは認識しない（図４Ｂ）、同等の機能性を示した。
【図5】ＳＥＣのトレースを個々のピークおよび重複画像として示している、ｓｏｌｏＭＥＲ（ｓｏｌｏＭＥＲ ＶＮＡＲ ＦＷ４）およびネイティブなＱｕａｄ－Ｘドメインの分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を示す図である。ＳＥＣのデータは、ドメインの生化学的挙動の単量体性および類似性を裏付けており、凝集の形跡も不安定性の形跡もない。
【図6】Ｌ９２９細胞における、０．３ｎｇ／ｍＬ（ＬＤ８０）のｈＴＮＦ－アルファによって誘発される細胞傷害性の中和を示す図である。インビトロでのヒトＴＮＦ－アルファ中和アッセイ。ネイティブなＷＴ Ｑｕａｄ－Ｘ（Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ ＶＮＡＲ）およびｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ（ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ ＶＮＡＲ ＦＷ４としても知られている）の両方が、マウス線維肉腫細胞系（Ｌ９２９細胞）に対するヒトＴＮＦ－アルファの細胞傷害効果を中和する同一の能力を示すことが実証された。ネイティブおよびｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ ＶＮＡＲ ＦＷ４で達成されたＮＤ５０値は、それぞれ０．００２ｎＭおよび０．００１７ｎＭである。
【図7】抗ＲＯＲ１ ＶＮＡＲ Ｐ３Ａ１のいくつかのヒト化バリアント（Ｖ１からＶ６）を設計し、二量体（短鎖ペプチドリンカーと連結され、ＨｉｓＭｙｃ検出タグを有する、２×Ｐ３Ａ１ ＶＮＡＲバリアント）として合成したことを示す図である。配列が正確であることを確認し、これを適切な細菌発現ベクターにクローニングした。表４も参照されたい。構築物を、ＨｉｓＭｙｃタグを有する二量体として、またインテイン融合体として発現させた。
【図8】ＶＮＡＲ Ｅ４および７８のヒト化バリアントを示す配列アラインメントを示す図である。ヒト化に利用したヒトＩｇファミリーＤＰＫ９配列鋳型が、ネイティブな（ＷＴ）抗ＤＬＬ４ ＶＮＡＲ配列の上に示されている。アラインメントは、ヒト生殖細胞系Ｖｋ１配列由来のヒト残基、ヒト化で利用されたＤＰＫ９、およびｓｏｌｏＭＥＲ－Ｖ１からＶ５からのヒト残基グラフティングの増大のパーセンテージの程度を示している。
【図9】Ｅ４クローンの還元ｓｏｌｏＭＥＲバリアントのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。Ｍは、マルチカラータンパク質マーカーを表している。
【図10】１μｇ／ｍＬのｈＤＬＬ４－ＦｃでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに対する、発現し精製されたｓｏｌｏＭＥＲ Ｅ４バリアントおよび７８バリアントの結合ＥＬＩＳＡを示す図である。フレームワークのそれぞれは、ある程度のレベルの機能的結合を、特に７８クローンバリアントでは示したが、ｓｏｌｏＭＥＲ Ｅ４および７８バリアントのこれらの最初の機能的特徴付けから同定された最良のバリアントは、Ｅ４－Ｖ２および７８－Ｖ２および７８－Ｖ４であった。
【図11】Ｅ４－Ｖ２を示す図である。ライブラリーのクローニングの後、各ライブラリーからの９６の配列（Ｅ４および７８の親配列）を分析すると、両ライブラリーが９０％を超える正確性を示し、これは、全配列および互いに異なる配列である。ライブラリーの総サイズ（固有のクローン）は、およそ１×１０９個のクローンであると推定された。
【図12】各パンニングラウンドで使用したＤＬＬ４抗原の濃度および洗浄ステップ（ｔｗｅｅｎを有するまたは有さないリン酸緩衝生理食塩水）を示す、Ｅ４－Ｖ２ヒト化ライブラリーのパンニング戦略を示す図である。
【図13】抗ＤＬＬ４ファージ陽性のＥ４Ｖ２ライブラリーを示す図である。異なるクローンの結合を、Ｗｔ ＤＬＬ４ ＶＮＡＲおよびＶ２のヒト化親フレームワークと比較し、特異性を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への結合の欠如によって確認した。
【図14】選択後のライブラリーに由来する抗ＤＬＬ４ファージバインダーの配列分析を示す図である。
【図15】Ｄ３のいくつかのヒト化バリアントを合成し（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４、Ｖ５）、配列を正確であると確認し、適切な細菌発現ベクターにクローニングしたことを示す図である。
【図16】ＣＤＲ１、ＨＶ２、およびＨＶ４における制御された突然変異生成、ならびにヒトＲＯＲ１（ｈＲＯＲ１）タンパク質に対するインビトロでの親和性成熟を示す図である。Ｄ３Ｖ２の配列およびループライブラリーの設計：ＣＤＲ１の多様性によって４８８の組み合わせが生じ、ＨＶ２の多様性によって７６８の組み合わせが生じ、そしてＨＶ４の多様性によって２４の組み合わせが生じる。
【図17】抗原特異的ＶＮＡＲ配列についてのｓｏｌｏＭＥＲライブラリーのスクリーニングを示す図である。選択の戦略。組換えヒトＲＯＲ１タンパク質を、Ｄ３Ｖ２ ｓｏｌｏＭＥＲライブラリーの選択およびスクリーニングに使用した。ＲＯＲ１特異的ｓｏｌｏＭＥＲを単離するために、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズをビオチン化抗原で事前に装飾し、低ストリンジェンシーでの３ラウンドのパンニングを行った（パンニングラウンド３では２００ｎＭの抗原を５０ｎＭまで低減させた）。抗原特異的ファージをファージモノクローナルのＥＬＩＳＡによって検出し、抗原特異的ファージのパーセンテージは、ＰＡＮ１（１１％）からＰＡＮ３（８８％）まで上昇した。
【図18】４つの最も良く結合するヒト化抗ＲＯＲ１ ｓｏｌｏＭＥＲクローンのヒト化配列を示す図である。表６も参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明の方法および組成物は、治療的にまたは試薬として使用され得る新規な抗原特異的抗原結合分子の同定に有用である。
【0021】
第１の態様に従うと、本発明は、以下の式（Ｉ）：
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するための方法であって、
（１）ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の２つ以上の連続するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成するステップであって、前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ライゲートされると、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、式中、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む、ステップ、
（２）２つ以上の連続するペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成するステップ、
（３）（２）で得られたライゲートされたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングするステップ、および
（４）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するステップ
を含む方法を提供する。
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するための方法であって、
（１）ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の２つ以上の連続するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成するステップであって、前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ライゲートされると、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、式中、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む、ステップ、
（２）２つ以上の連続するペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成するステップ、
（３）（２）で得られたライゲートされたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングするステップ、および
（４）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するステップ
を含む方法を提供する。
【0022】
本発明の抗原特異的抗原結合分子は、したがって、基本構造（本明細書において定義される）：
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
に従って本明細書において開示されている様々な領域のアミノ酸配列のいずれかから構築することができ、式中、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＨＶ２、ＦＷ３ａ、ＨＶ４、ＦＷ３ｂ、ＣＤＲ３、およびＦＷ４のそれぞれはペプチド配列を表し、「ＦＷ」は「フレームワーク」領域であり、「ＣＤＲ１」は「相補性決定領域１」であり、「ＨＶ」は「超可変」領域であり、そして「ＣＤＲ３」は「相補性決定領域３」である。適切なペプチドドメイン配列の例は、本明細書において記載されている。
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
に従って本明細書において開示されている様々な領域のアミノ酸配列のいずれかから構築することができ、式中、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＨＶ２、ＦＷ３ａ、ＨＶ４、ＦＷ３ｂ、ＣＤＲ３、およびＦＷ４のそれぞれはペプチド配列を表し、「ＦＷ」は「フレームワーク」領域であり、「ＣＤＲ１」は「相補性決定領域１」であり、「ＨＶ」は「超可変」領域であり、そして「ＣＤＲ３」は「相補性決定領域３」である。適切なペプチドドメイン配列の例は、本明細書において記載されている。
【0023】
以下の式（Ｉ）によって表されるペプチドドメイン構造を有する抗原特異的抗原結合分子は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＮＡＲ）と呼ぶことができる。新規なまたは新たな抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）は、軟骨魚類の血清で見られる、およそ１６０ｋＤａのホモ二量体タンパク質である。各分子は、単一のＮ末端可変ドメイン（ＶＮＡＲ）および５つの定常ドメイン（ＣＮＡＲ）から構成される。ＩｇＮＡＲドメインは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＶＮＡＲは、免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体の可変ドメインに対するならびに細胞接着分子に対する構造的類似性および一部の配列類似性を有する、堅くフォールディングしたドメインであり、従来の免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体の可変Ｎ末端ドメインに類似していることから、ＶＮＡＲと呼ばれる。ＶＮＡＲは、免疫グロブリンと限られた配列相同性を共有しており、例えば、ＶＮＡＲとヒト軽鎖配列との間では２５～３０％の類似性である（Ｄｏｏｌｅｙ，Ｈ．およびＦｌａｊｎｉｋ，Ｍ．Ｆ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００５．３５（３）：９３６～９４５頁）。
【0024】
参照によって本明細書に組み込まれる、Ｋｏｖａｌｅｖａ Ｍ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１４．１４（１０）：１５２７～１５３９頁、およびＺｉｅｌｏｎｋａ Ｓ．ら、ｍＡｂｓ ２０１５．７（１）：１５～２５頁は、ＶＮＡＲの構造的特徴付けおよび生成の概要を記載している。
【0025】
ＶＮＡＲ結合表面は、他の天然の免疫グロブリンにおける可変ドメインとは異なり、介在するフレームワーク配列によって以下の順に連結されているＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４、およびＣＤＲ３という４つの多様な領域に由来する：ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４。天然の軽鎖パートナーの欠如およびＣＤＲ２の欠如の組み合わせによって、ＶＮＡＲは、脊椎動物界で最も小さい天然に生じる結合ドメインとなっている。
【0026】
本発明の特異的抗原結合分子は、Ｌｉｕら（Ｌｉｕら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４、１７７５～１７８３（２００７）、およびＬｉｕら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７（７８）ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－７－７８（２００７））に従ったＶＮＡＲの命名法の一般構造に従って分類され得る。
【0027】
本発明の一実施形態において、ステップ（１）におけるＤＮＡの増幅は、システインを除いた任意のアミノ酸の配列をコードするオリゴマーの存在下で行われる。言い換えると、増幅されたＤＮＡによってコードされる、得られたＣＤＲ領域は、システインを含まない。しかし、他の実施形態においては、システインはＣＤＲ領域内に存在し得る。
【0028】
全てのＶＮＡＲは、ＦＷ１およびＦＷ３において２つの標準的なｃｙｓ残基を有し、これが、従来の免疫グロブリン（Ｉｇ）のフォールディングを生じさせる。加えて、ＶＮＡＲは、以下のような、ＣＤＲおよびＦＷにおける追加のシステイン（ｃｙｓ）残基の付加を特徴としている。
【0029】
Ｉ型：ＣＤＲ３における２つの追加のｃｙｓに加えて、ＦＷ２およびＦＷ４における非標準的なｃｙｓ残基 － ＦＷ－ＣＤＲ３の対合が、緊密に制約されたＣＤＲ３構造を形成している。
【0030】
ＩＩ型：ＣＤＲ３を突き出た位置にあるようにするジスルフィド架橋を生じさせる、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３における非標準的なｃｙｓ残基。
【0031】
ＩＩＩ型：ＩＩ型と同様の非標準的なｃｙｓ残基であるが、これらは、ＣＤＲ１において保存されたＷを有している。
【0032】
上記の全ては、オオテンジクザメ（ｎｕｒｓｅ ｓｈａｒｋ）命名法に基づいている。本発明において、他の新たなアイソタイプが単離されており、これらは、以下のような「ｂ型」バリアントとして記載されている。
【0033】
ＩＩｂ型：ＣＤＲ１およびＣＤＲ３に非標準的なｃｙｓ残基は存在しない － その結果、非常に柔軟性のあるＣＤＲ３が生じる（２Ｖは、ＩＩｂ型バリアントの一例である）。
【0034】
ＩＩＩｂ型：ＣＤＲ１およびＣＤＲ３に非標準的なｃｙｓ残基は存在しないが、ＣＤＲ１に不変のＷを有する（５Ｖは、ＩＩＩｂ型バリアントの一例である）。
【0035】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ３に非標準的なシステイン（Ｃ）残基が存在しないことを確実にすることが望ましい場合があり、これによって、さらに柔軟性のあるＣＤＲ３領域が提供され得る。このような構造は、Ｌｉｕら（Ｌｉｕら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４、１７７５～１７８３（２００７）、およびＬｉｕら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７（７８）ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－７－７８（２００７））に従った、ＶＮＡＲについてのオオテンジクザメ命名法の一般構造に従って、「ＩＩｂ型」アイソタイプと呼ぶことができる。
【0036】
代替的な実施形態において、非標準的なシステイン（Ｃ）残基がＣＤＲ１およびＣＤＲ３に存在しないことを確実にすることだけではなく、不変のトリプトファン（Ｗ）をＣＤＲ１に有することも望ましい場合がある。このような構造は、Ｌｉｕら（上記で引用の）に従った、ＶＮＡＲについてのオオテンジクザメ命名法の一般構造に従って、「ＩＩＩｂ型」アイソタイプと呼ぶことができる。
【0037】
本発明の一実施形態において、抗原特異的抗原結合分子は、領域ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＨＶ２、ＦＷ３ａ、ＨＶ４、ＦＷ３ｂ、ＣＤＲ３、および／またはＦＷ４の融合体であってもよく、これは、ＩＩｂ型およびＩＩＩｂ型のＶＮＡＲ由来である。融合したＩＩｂ部分およびＩＩＩｂ部分は、必要に応じていずれかの順序で結合されて、ＶＮＡＲ構造を形成し得る。
【0038】
本発明の一実施形態において、ＤＮＡ配列は、ドメインＦＷ３ｂにＣＫＡまたはＣＲＡという最後の３つのアミノ酸残基と、ＹまたはＤおよびＧＡというＦＷ４の最初の３つのアミノ酸残基を有し得る。他のＦＷ３ｂ配列は、ＣＡＮ、ＣＲＧ、ＣＫＶ、ＣＫＴ、および／またはＣＨＴなどの変型体を含み得る。したがって、ＦＷ３ｂの最後の３つのアミノ酸残基は、ＣＫＡ、ＣＲＡ、ＣＡＮ、ＣＲＧ、ＣＫＶ、ＣＫＴ、およびＣＨＴ（好ましくは、ＣＫＡおよびＣＲＡ）からなる群から選択され得、かつ／または、ＦＷ４の最初の３つのアミノ酸残基は、ＤＧＡもしくはＹＧＡであり得る。
【0039】
アイソタイプの他の代替的な融合体もまた、本発明に従って作製され得る。例えば、Ｉ型ＶＮＡＲの領域をＩＩＩ型ＶＮＡＲと融合することができるか、またはＩ型ＶＮＡＲの領域をＩＩ型ＶＮＡＲと融合することができる。本発明において記載されているような、アイソタイプ領域Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型の変型体であるＩｂ型、ＩＩｂ型、およびＩＩＩｂ型もまた含まれる。融合体には、ＶＮＡＲファミリー全体にわたる任意のアイソタイプ融合体、すなわち、Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉの任意の種から単離されたアイソタイプ領域も含まれ得る。例えば、ツノザメ（ｄｏｇｆｉｓｈ）のＩＩ型領域と融合したオオテンジクザメのＩＩ型領域、またはツノザメのＩＩＩｂ型と融合したテンジクザメ（Ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ）のＩＩｂ型。
【0040】
本明細書において開示されている配列において、「／」は「または」を意味し、本発明者らが示した残基が特定した通りに変化し得ることを示している。この文脈において、「－」は、ギャップ、またはアミノ酸の不存在を意味する。Ｘは、任意のアミノ酸である。例えば、「Ｖ／Ｍ」は、ＶまたはＭのいずれかであり得る残基を意味する。同様に、「－／Ｄ」は、不存在またはＤのいずれかであり得る残基を意味する。同様に、「Ａ／Ｉ／Ｔ」は、Ａ、Ｉ、またはＴであり得る残基を意味する。配列同一性の値が特定される場合には、配列同一性は、「／」によって隔てられた残基のいずれか１つから出発して計算され得る。
【0041】
一実施形態において、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の少なくとも１つは、それぞれ、以下からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ４は、Ｄ／Ｙ／Ｆ Ｇ Ａ／Ｇ／Ｑ Ｇ Ｔ Ｋ／Ｖ Ｖ／Ｌ Ｅ／Ｔ Ｉ／Ｖ Ｋ／Ｎ（配列番号５）に従った１つまたは複数の配列を含む。
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ４は、Ｄ／Ｙ／Ｆ Ｇ Ａ／Ｇ／Ｑ Ｇ Ｔ Ｋ／Ｖ Ｖ／Ｌ Ｅ／Ｔ Ｉ／Ｖ Ｋ／Ｎ（配列番号５）に従った１つまたは複数の配列を含む。
【0042】
ＦＷ１は、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む。しかし、代替的な態様においては、ＦＷ１の配列は定義されておらず、ライブラリーは、その代わり、以下の１つまたは複数によって特徴付けされる：
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ４は、Ｄ／Ｙ／Ｆ Ｇ Ａ／Ｇ／Ｑ Ｇ Ｔ Ｋ／Ｖ Ｖ／Ｌ Ｅ／Ｔ Ｉ／Ｖ Ｋ／Ｎ（配列番号５）に従った１つまたは複数の配列を含む。
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ４は、Ｄ／Ｙ／Ｆ Ｇ Ａ／Ｇ／Ｑ Ｇ Ｔ Ｋ／Ｖ Ｖ／Ｌ Ｅ／Ｔ Ｉ／Ｖ Ｋ／Ｎ（配列番号５）に従った１つまたは複数の配列を含む。
【0043】
この代替的な態様では、典型的には、ＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、ＦＷ３ｂ配列、およびＦＷ４配列の１つまたは複数がヒト化される。ヒト化されたＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、ＦＷ３ｂ配列、および／またはＦＷ４配列は、任意のヒト化されたＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、ＦＷ３ｂ配列、およびＦＷ４配列、または本明細書において開示されている配列であり得る。
【0044】
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った１つまたは複数の配列を含み得る。
【0045】
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った１つまたは複数の配列を含み得る。
【0046】
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った１つまたは複数の配列を含み得る。
【0047】
ＦＷ４は、Ｄ／Ｙ／Ｆ Ｇ Ａ／Ｇ／Ｑ Ｇ Ｔ Ｋ／Ｖ Ｖ／Ｌ Ｅ／Ｔ Ｉ／Ｖ Ｋ／Ｎ（配列番号５）に従った１つまたは複数の配列を含み得る。
【0048】
一実施形態において、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のうちの２つはヒト化配列を含み、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のうちの残りの２つは、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のうちの対応する少なくとも１つについての配列を含むか、あるいは、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーの各配列について、
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、および／または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
を有するアミノ酸配列を含む。
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、および／または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
を有するアミノ酸配列を含む。
【0049】
一実施形態において、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のうちの３つはヒト化配列を含み、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のうちの残りの１つは、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のうちの対応する少なくとも１つについての配列を含むか、あるいは、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーの各配列について、
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、および／または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
を有するアミノ酸配列を含む。
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、および／または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
を有するアミノ酸配列を含む。
【0050】
ＥｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉはＣｈｏｎｄｒｉｃｈｔｈｙｅｓ綱の亜綱であり、これとしては、軟骨魚類、サメ、エイ、およびガンギエイが含まれる。この亜綱のメンバーは、Ｃａｒｃｈａｒｉｎｉｆｏｒｍｅｓ、Ｈｅｔｅｒｏｄｏｎｔｉｆｏｒｍｅｓ、Ｈｅｘａｎｃｈｉｆｏｒｍｅｓ、Ｌａｍｎｉｆｏｒｍｅｓ、Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｉｆｏｒｍｅｓ、Ｐｒｉｓｔｉｆｏｒｍｅｓ、Ｒａｊｉｆｏｒｍｅｓ、Ｓｑｕａｌｉｆｏｒｍｅｓ、Ｓｑｕａｔｉｎｉｆｏｒｍｅｓ、Ｔｏｒｐｅｄｉｎｉｆｏｒｍｅｓという１１の目にさらに分類することができる。それぞれの目は、次いで、多くの科にさらに分類することができる。例えば、ＦＷ４配列は、Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｆｏｒｍｅｓ目のＧｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ科のＧｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ ｃｉｒｒａｔｕｍ、および／またはＳｑｕａｌｉｆｏｒｍｅｓ目のＳｑｕａｌｉｄａｅ科のＳｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｉａｓに由来し得る。
【0051】
アミノ酸配列は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、およびまたさらに好ましくは９５％（またさらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性を有し得る。
【0052】
アミノ酸配列は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーの配列に対する３つの、好ましくは２つの、またはさらに好ましくは１つのアミノ酸置換を有し得る。１つまたは複数の置換は、保存的なアミノ酸置換であり得る。
【0053】
配列同一性および／またはアミノ酸置換は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における任意の種の任意のＦＷ４配列に対するものであり得る。例えば、配列同一性および／またはアミノ酸置換は、Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｆｏｒｍｅｓ目のＧｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ科のＧｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ ｃｉｒｒａｔｕｍ、および／またはＳｑｕａｌｉｆｏｒｍｅｓ目のＳｑｕａｌｉｄａｅ科のＳｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｉａｓのＦＷ４配列に対するものであり得る。配列同一性および／またはアミノ酸置換は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）に対するものであり得る。
【0054】
ＦＷ４は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）に従った配列、あるいは
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含み得る。
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含み得る。
【0055】
ＦＷ４は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４についての配列を含み得る。
【0056】
ＦＷ４は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）に従った配列を含み得る。
【0057】
ＦＷ３ａは、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ３ａについての配列を含み得るか、またはＦＷ３ｂは、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ３ｂについての配列を含み得る。
【0058】
ＦＷ３ａは、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ３ａについての配列を含み得る。
【0059】
ＦＷ３ｂは、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ３ｂについての配列を含み得る。
【0060】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の組み合わせ配列の少なくとも３つのアミノ酸残基がヒト化され得る。したがって、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の組み合わせ配列から出発して、少なくとも３つのアミノ酸残基が、ＤＰＫ－９由来の対応する残基に置換され得る。ＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、ＦＷ３ｂ配列、およびＦＷ４配列は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種の同一のメンバー、または板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種の２つ以上の異なるメンバー、例えば同一種の異なる個体に由来し得る。あるいは、ＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、ＦＷ３ｂ配列、およびＦＷ４配列は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における２つ以上の異なる種に由来し得る。
【0061】
少なくとも３つのヒト化残基は、本明細書において開示されている任意のＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、ＦＷ３ｂ配列、および／またはＦＷ４配列における任意の３つのヒト化残基から選択され得る。例えば、少なくとも３つのヒト化残基は、図１で示されている任意の３つのヒト化残基から選択され得る。
【0062】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の組み合わせ配列の少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のアミノ酸残基がヒト化され得る。
【0063】
ＦＷ１についての１つまたは複数のヒト化配列は、
Ａ／Ｔ Ｓ／Ｒ Ｖ Ｎ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号６）、
Ｄ Ｉ Ｑ Ｍ Ｔ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号７）、および
ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）
からなる群から選択され得る。
Ａ／Ｔ Ｓ／Ｒ Ｖ Ｎ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号６）、
Ｄ Ｉ Ｑ Ｍ Ｔ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号７）、および
ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）
からなる群から選択され得る。
【0064】
ＦＷ２についての１つまたは複数の配列は、
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ Ｋ Ｎ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号９）、
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｙ／Ｆ Ｑ Ｑ Ｋ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号１０）、および
ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）
からなる群から選択され得る。
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ Ｋ Ｎ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号９）、
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｙ／Ｆ Ｑ Ｑ Ｋ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号１０）、および
ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）
からなる群から選択され得る。
【0065】
ＦＷ３ａについての１つまたは複数の配列は、
ＧＲＹＶＥＳＶＮ（配列番号１２）、
ＧＲＦＳＧＳＧＳ（配列番号１３）、
ＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）、および
ＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）
からなる群から選択され得る。
ＧＲＹＶＥＳＶＮ（配列番号１２）、
ＧＲＦＳＧＳＧＳ（配列番号１３）、
ＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）、および
ＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）
からなる群から選択され得る。
【0066】
ＦＷ３ｂについての１つまたは複数の配列は、
Ｆ Ｓ Ｌ Ｒ Ｉ Ｋ Ｄ Ｌ Ｔ Ｖ Ａ Ｄ Ｓ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１６）、
Ｆ Ｔ Ｌ Ｔ Ｉ Ｓ Ｓ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｄ Ｆ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１７）、
ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）、および
ＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）
からなる群から選択され得る。
Ｆ Ｓ Ｌ Ｒ Ｉ Ｋ Ｄ Ｌ Ｔ Ｖ Ａ Ｄ Ｓ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１６）、
Ｆ Ｔ Ｌ Ｔ Ｉ Ｓ Ｓ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｄ Ｆ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１７）、
ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）、および
ＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）
からなる群から選択され得る。
【0067】
ＦＷ４についての１つまたは複数の配列は、
Ｄ／Ｙ／Ｆ Ｇ Ａ／Ｇ／Ｑ Ｇ Ｔ Ｋ Ｖ／Ｌ Ｅ Ｉ Ｋ（配列番号２０）、および
ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）
からなる群から選択され得る。
Ｄ／Ｙ／Ｆ Ｇ Ａ／Ｇ／Ｑ Ｇ Ｔ Ｋ Ｖ／Ｌ Ｅ Ｉ Ｋ（配列番号２０）、および
ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）
からなる群から選択され得る。
【0068】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される１つまたは複数の配列をそれぞれ含んでいてもよく、
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２２）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号２３）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号２４）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ４は、Ｄ／Ｙ Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｋ Ｖ Ｅ Ｉ Ｋ（配列番号２５）に従った１つまたは複数の配列を含む。
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２２）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号２３）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号２４）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ４は、Ｄ／Ｙ Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｋ Ｖ Ｅ Ｉ Ｋ（配列番号２５）に従った１つまたは複数の配列を含む。
【0069】
本方法は、上記の配列の任意の組み合わせによって規定され得る。例えば、本方法は、上記の配列の１つまたは複数をそれぞれが含むＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の少なくとも２つ、上記の配列の１つまたは複数をそれぞれが含むＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の少なくとも３つ、または、上記の配列の１つまたは複数をそれぞれが含むＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の４つ全てによって規定され得る。好ましくは、
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２２）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号２３）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号２４）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ４は、Ｄ／Ｙ Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｋ Ｖ Ｅ Ｉ Ｋ（配列番号２５）に従った１つまたは複数の配列を含む。
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２２）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号２３）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号２４）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ４は、Ｄ／Ｙ Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｋ Ｖ Ｅ Ｉ Ｋ（配列番号２５）に従った１つまたは複数の配列を含む。
【0070】
ヒト化された抗原特異的抗原結合分子は、ある特定の長さのＣＤＲおよび超可変領域（ＨＶ）を含み得る。一実施形態において、
ＣＤＲ１は、６アミノ酸からなる領域であり、
ＨＶ２は、９アミノ酸からなる領域であり、
ＨＶ４は、５アミノ酸からなる領域であり、かつ／または
ＣＤＲ３は、８から３６アミノ酸からなる領域である。
ＣＤＲ１は、６アミノ酸からなる領域であり、
ＨＶ２は、９アミノ酸からなる領域であり、
ＨＶ４は、５アミノ酸からなる領域であり、かつ／または
ＣＤＲ３は、８から３６アミノ酸からなる領域である。
【0071】
ライブラリーは、多様なＣＤＲ配列およびＨＶ配列を含み得る。一実施形態において、ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４、およびＣＤＲ３の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される１つまたは複数の配列をそれぞれ含み、
ＣＤＲ１は、Ｙ／Ｔ／Ｒ／Ｉ／Ｋ／Ｎ／Ｓ Ｃ／Ｙ Ｐ／Ｓ／Ａ／Ｇ Ｗ／Ｌ Ｈ／Ｓ／Ｙ Ｎ／Ｒ／Ｇ／Ｓ（配列番号２６）に従った１つまたは複数の配列を含み、配列中、ＣＤＲ１がシステイン残基を含んでいれば、ＣＤＲ３もまたシステイン残基を含み、
ＨＶ２は、Ｓ／Ｔ／Ｐ Ｎ／Ｄ Ｑ／Ｗ Ｅ Ｒ Ｉ／Ｍ Ｓ Ｉ Ｇ／Ｓ（配列番号２７）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＨＶ４は、Ｋ Ｇ／Ｒ Ｔ／Ｐ／Ｓ Ｋ／Ｍ Ｓ（配列番号２８）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＣＤＲ３は、以下の式（ＩＩ）：
Ｊ－Ｊ－［Ｘａａ］ｎ－Ｏ－Ｕ－Ｕ’
に従った１つまたは複数の配列を含み、式中、
Ｊは、システイン以外の任意の天然に生じるアミノ酸であり、
Ｘａａは、任意の天然に生じるアミノ酸であり、
ｎは、３から３１であり、
Ｏは、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、リジン、アスパラギン、セリン、バリン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｕは、システイン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、トリプトファン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｕ’は、チロシン、ロイシン、バリン、およびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＣＤＲ３は、１つのシステイン残基を含むかまたはシステイン残基を含まず、ＣＤＲ３がシステイン残基を含んでいれば、ＣＤＲ１もまたシステイン残基を含んでいる。
ＣＤＲ１は、Ｙ／Ｔ／Ｒ／Ｉ／Ｋ／Ｎ／Ｓ Ｃ／Ｙ Ｐ／Ｓ／Ａ／Ｇ Ｗ／Ｌ Ｈ／Ｓ／Ｙ Ｎ／Ｒ／Ｇ／Ｓ（配列番号２６）に従った１つまたは複数の配列を含み、配列中、ＣＤＲ１がシステイン残基を含んでいれば、ＣＤＲ３もまたシステイン残基を含み、
ＨＶ２は、Ｓ／Ｔ／Ｐ Ｎ／Ｄ Ｑ／Ｗ Ｅ Ｒ Ｉ／Ｍ Ｓ Ｉ Ｇ／Ｓ（配列番号２７）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＨＶ４は、Ｋ Ｇ／Ｒ Ｔ／Ｐ／Ｓ Ｋ／Ｍ Ｓ（配列番号２８）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＣＤＲ３は、以下の式（ＩＩ）：
Ｊ－Ｊ－［Ｘａａ］ｎ－Ｏ－Ｕ－Ｕ’
に従った１つまたは複数の配列を含み、式中、
Ｊは、システイン以外の任意の天然に生じるアミノ酸であり、
Ｘａａは、任意の天然に生じるアミノ酸であり、
ｎは、３から３１であり、
Ｏは、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、リジン、アスパラギン、セリン、バリン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｕは、システイン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、トリプトファン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｕ’は、チロシン、ロイシン、バリン、およびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＣＤＲ３は、１つのシステイン残基を含むかまたはシステイン残基を含まず、ＣＤＲ３がシステイン残基を含んでいれば、ＣＤＲ１もまたシステイン残基を含んでいる。
【0072】
ＣＤＲ領域のそれぞれへのシステイン（Ｃｙｓ）残基の組み込みは、従来のＩＩ型ＶＮＡＲドメインで見られるようなＣＤＲ１からＣＤＲ３へのジスルフィド架橋の可能性を生み出すことによって、ライブラリーの多様性を増大させる。
【0073】
一部の実施形態において、ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４、およびＣＤＲ３にシステイン残基は存在しない。
【0074】
各ＣＤＲおよびＨＶ領域の各位置についての考えられる組み合わせの数は、図１６で示されている。
【0075】
ライブラリーのクローンは、未処理のレパートリーと等しいレベルの多様性および／またはアミノ酸組成を有し得る。
【0076】
本発明に従ったＣＤＲ配列およびＨＶ配列の多様性は、累積的に、ライブラリー内のクローン配列の非常に広範な多様性を可能にする。これはひいては、ライブラリーを極めて多用途にし、所与の目標へのヒト化前の抗原特異的抗原結合分子の的中率の改善をもたらす可能性が高いという効果を有する。
【0077】
一部の実施形態において、ライブラリーは、クローンの集団を含み得、当該クローンの少なくとも９０％は、他のクローンの９０％のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、および／またはＦＷ４それぞれのアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の同一性を有する、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、および／またはＦＷ４のアミノ酸配列を含む。このライブラリーは、「サブライブラリー」と呼ぶことができる。サブライブラリーは、他のクローンの９０％のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、および／またはＦＷ４それぞれのアミノ酸配列と同一でない最大３つ、最大２つ、または最大１つのアミノ酸を有するＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、および／またはＦＷ４のアミノ酸配列をそれぞれが含むクローンの集団を含み得る。サブライブラリーは、他のクローンの９０％のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、および／またはＦＷ４それぞれのアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列を有するＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、および／またはＦＷ４のアミノ酸配列をそれぞれが含むクローンの集団を含み得る。サブライブラリーは、他のクローンのＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４それぞれのアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列を有するＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４のアミノ酸配列をそれぞれが含むクローンの集団を含み得る。本方法は、したがって、サブライブラリーを作製するための方法であり得、場合によって、本発明において、サブライブラリーは、ＣＤＲ１領域、ＨＶ２領域、ＨＶ４領域、およびＣＤＲ３領域において多様性を有しているが、ＦＷ１領域、ＦＷ２領域、ＦＷ３ａ領域、ＦＷ３ｂ領域、および／またはＦＷ４領域においては有していない。このようなサブライブラリーは、ユーザーが、必要なヒト化のレベルが分かっている所与の抗原に対するヒト化された抗原特異的抗原結合分子を迅速に準備することを望む場合に、有用であり得る。本発明の方法は、サブライブラリーのスーパーライブラリーを生成するための方法として並行して行うことができ、この場合、各サブライブラリーは、ＣＤＲ１領域、ＨＶ２領域、ＨＶ４領域、およびＣＤＲ３領域において多様性を有するが、ＦＷ１領域、ＦＷ２領域、ＦＷ３ａ領域、ＦＷ３ｂ領域、および／またはＦＷ４領域においては有さず、また、ＦＷ１領域、ＦＷ２領域、ＦＷ３ａ領域、ＦＷ３ｂ領域、および／またはＦＷ４領域のヒト化のレベルは、サブライブラリーの間で異なっている。本方法は、したがって、本発明の第１の態様の方法が、各サブライブラリーで異なるＦＷ１配列、ＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、ＦＷ３ｂ配列、および／またはＦＷ４配列を使用して反復される、ヒト化された抗原特異的抗原結合分子のサブライブラリーのスーパーライブラリーを生成するための方法であり得る。
【0078】
本方法は、さらに、
ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４、およびＣＤＲ３のうちの１つまたは複数の配列を、制御された突然変異生成にかけるステップ、ならびに
所望のＣＤＲ１配列、ＨＶ２配列、ＨＶ４配列、および／またはＣＤＲ３配列を、標的分子に対する親和性成熟によって選択するステップ
を含み得る。
ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４、およびＣＤＲ３のうちの１つまたは複数の配列を、制御された突然変異生成にかけるステップ、ならびに
所望のＣＤＲ１配列、ＨＶ２配列、ＨＶ４配列、および／またはＣＤＲ３配列を、標的分子に対する親和性成熟によって選択するステップ
を含み得る。
【0079】
制御された突然変異生成の方法、例えばオーバーラップＰＣＲが、当業者に公知である。同様に、標的分子に対する親和性成熟の方法、例えば、表面パンニングおよび溶液選別が、当業者に公知である。
【0080】
特許請求の範囲において規定されている本発明の第１の態様に対する同等物は、第１の態様の代替的な記述であり、これにおいて、本方法は、
（ｉ）以下の式（Ｉ）によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子をそれぞれがコードしているＤＮＡ配列の集団を合成するステップであって、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含むステップ、
（ｉｉ）ＤＮＡ配列の集団を増幅するステップ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた増幅されたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングするステップ、および
（ｉｖ）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するステップ
を含む。
（ｉ）以下の式（Ｉ）によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子をそれぞれがコードしているＤＮＡ配列の集団を合成するステップであって、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含むステップ、
（ｉｉ）ＤＮＡ配列の集団を増幅するステップ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた増幅されたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングするステップ、および
（ｉｖ）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するステップ
を含む。
【0081】
当業者には、必要な変更を加えた、この同等物のステップ（ｉ）から（ｉｖ）で、特許請求の範囲に記載のアプローチのステップ（１）から（４）を置き換えることができることが理解されよう。特許請求の範囲において規定されている本発明の第１の態様の任意のさらなる特徴を、第１の態様の上記の代替的な記述と組み合わせることができる。例えば、本明細書において開示されているＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、および／またはＦＷ４の任意の配列を、第１の態様の上記の代替的な記述と組み合わせることができる。特許請求の範囲に記載のアプローチまたはこの同等物のアプローチのいずれかを、本発明に従ったライブラリーを作製するために使用することができる。ライブラリーの構築について記載する場合、ライブラリーＤＮＡの集団がまず合成され、その後、当該集団が、記載／設計された位置での全ての必要な変型を伴って、クローニングのために増幅される。これは、単一の連続配列集団として、または増幅プロセスを介して繋ぐことができる連続配列として、行うことができる。共通の特徴は、最終ライブラリーにおけるアミノ酸のバリエーションおよびクローンの違いをもたらすために、本発明者らがどのようにライブラリー（またはライブラリーの部分）を設計するかである。典型的には、多様性が大きいほど、ライブラリーがより良くなる。
【0082】
本方法は、ステップ（１）の前に、以下のステップをさらに含み得る：
（１ａ）板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーからＲＮＡを単離するステップ、
（２ａ）（１ａ）で得られたＲＮＡから、抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列のデータベースを作製するステップ、
（３ａ）（２ａ）で準備したデータベースからＤＮＡ配列を選択するステップ。
（１ａ）板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーからＲＮＡを単離するステップ、
（２ａ）（１ａ）で得られたＲＮＡから、抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列のデータベースを作製するステップ、
（３ａ）（２ａ）で準備したデータベースからＤＮＡ配列を選択するステップ。
【0083】
本方法がステップ（１ａ）、（２ａ）、および（３ａ）をさらに含む場合、（１）の前記２つ以上の連続するペプチドドメインは、（３ａ）で選択された少なくとも２つの異種ＤＮＡ配列に由来し得る。ＲＮＡは、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種の１つのメンバーまたはいくつかの異なるメンバーから単離され得る。板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のあるメンバーへの言及には、したがって、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種の１つまたは複数の異なるメンバーへの言及も含まれる。ステップ（１ａ）は、したがって、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種の１つまたは複数のメンバーからＲＮＡを単離することを含み得る。
【0084】
ＥｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉはＣｈｏｎｄｒｉｃｈｔｈｙｅｓ綱の亜綱であり、これとしては、軟骨魚類、サメ、エイ、およびガンギエイが含まれる。この亜綱のメンバーは、Ｃａｒｃｈａｒｉｎｉｆｏｒｍｅｓ、Ｈｅｔｅｒｏｄｏｎｔｉｆｏｒｍｅｓ、Ｈｅｘａｎｃｈｉｆｏｒｍｅｓ、Ｌａｍｎｉｆｏｒｍｅｓ、Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｉｆｏｒｍｅｓ、Ｐｒｉｓｔｉｆｏｒｍｅｓ、Ｒａｊｉｆｏｒｍｅｓ、Ｓｑｕａｌｉｆｏｒｍｅｓ、Ｓｑｕａｔｉｎｉｆｏｒｍｅｓ、Ｔｏｒｐｅｄｉｎｉｆｏｒｍｅｓという１１の目にさらに分類することができる。それぞれの目は、次いで、多くの科にさらに分類することができる。例えば、本発明の方法は、Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｆｏｒｍｅｓ目のＧｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ科のＧｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ ｃｉｒｒａｔｕｍ、および／またはＳｑｕａｌｉｆｏｒｍｅｓ目のＳｑｕａｌｉｄａｅ科のＳｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｉａｓに関するものであり得る。
【0085】
したがって、ライゲートされるとＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４によって表される式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのペプチドドメインを使用することが可能である。
【0086】
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の前記２つ以上の連続するペプチドドメインは、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＨＶ２、ＦＷ３ａ、ＨＶ４、ＦＷ３、ＣＤＲ３、およびＦＷ４、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。２つ、３つ、４つ、または５つのこのようなペプチドドメインが存在し得る。
【0087】
ライゲートされると式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードするＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の連続するペプチドドメインの潜在的組み合わせは、式（ＩＩＩ）：
Ｐ－Ｑ－Ｒ
によって規定され得、
ここで、Ｐ－Ｑ－Ｒは、ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４であり、Ｐ、Ｑ、およびＲのそれぞれは、連続するペプチドドメインを表し、場合によって、ＱまたはＲは不存在である。ライゲートされると式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子を共にコードする連続するペプチドドメインの一部の非限定的な例を、以下の表１に示した。
Ｐ－Ｑ－Ｒ
によって規定され得、
ここで、Ｐ－Ｑ－Ｒは、ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４であり、Ｐ、Ｑ、およびＲのそれぞれは、連続するペプチドドメインを表し、場合によって、ＱまたはＲは不存在である。ライゲートされると式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子を共にコードする連続するペプチドドメインの一部の非限定的な例を、以下の表１に示した。
【0088】
【表1】
【0089】
ライゲートされると式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子を共にコードする連続するペプチドドメインの他の断片は、式（Ｉ）によって規定されるペプチドドメイン配列を都合に合わせた代替的な様式で分割することによって準備することができる。
【0090】
各フレームワーク（ＦＷ）領域が別々の断片内にある場合、次いで潜在的に４つまたは５つのペプチドドメインが準備され得る。このケースでは、式（ＩＩＩ）は、
Ｐ－Ｑ－Ｒ－Ｓ
によって表され、式中、４つの別々のペプチドドメインが存在し、Ｐ－Ｑ－Ｒ－Ｓは、ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４であり、Ｐ、Ｑ、Ｒ、およびＳの各々は、連続するペプチドドメインを表し、または
Ｐ－Ｑ－Ｒ－Ｓ－Ｔ
によって表され、式中、５つの別々のペプチドドメインが存在し、Ｐ－Ｑ－Ｒ－Ｓ－Ｔは、ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４であり、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴの各々は、連続するペプチドドメインを表す。
Ｐ－Ｑ－Ｒ－Ｓ
によって表され、式中、４つの別々のペプチドドメインが存在し、Ｐ－Ｑ－Ｒ－Ｓは、ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４であり、Ｐ、Ｑ、Ｒ、およびＳの各々は、連続するペプチドドメインを表し、または
Ｐ－Ｑ－Ｒ－Ｓ－Ｔ
によって表され、式中、５つの別々のペプチドドメインが存在し、Ｐ－Ｑ－Ｒ－Ｓ－Ｔは、ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４であり、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴの各々は、連続するペプチドドメインを表す。
【0091】
これらの代替的な実施形態に従った連続するペプチドドメインの例を、以下の表２に示す。
【0092】
【表2】
【0093】
本発明のこの態様の一実施形態において、２つ以上の連続するペプチドドメインは、ＦＷ１、ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ、およびＣＤＲ３－ＦＷ４である、ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４によって表される３つのドメインである。
【0094】
本発明のこの実施形態において、ステップ（１）は、（３ａ）で選択された少なくとも２つの異種ＤＮＡ配列に由来するペプチドドメインＦＷ１、ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３、およびＣＤＲ３－ＦＷ４をコードするＤＮＡ配列を、（３ａ）で選択された配列内のＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、ペプチドドメインＦＷ１、ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３、およびＣＤＲ３－ＦＷ４をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成するステップであると規定され得る。結果として、本発明のこの実施形態に従ったステップ（２）は、ペプチドドメインＦＷ１、ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３、およびＣＤＲ３－ＦＷ４をコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成するステップであると規定され得る。
【0095】
本発明の一実施形態において、異なる背景にある、鋳型由来のＨＶ２ループおよびＨＶ４ループは、鋳型由来のＨＶ２およびＨＶ４の組み合わせとそれぞれに由来するＦＷ１ならびにＣＤＲ１断片およびＣＤＲ３断片とをコードするＰＣＲ断片を選択的スプライシングすることを介して得ることができる。
【0096】
本発明の第１の態様の方法のステップ（３ａ）に従った、ステップ（２ａ）において準備されたデータベースからのＤＮＡ配列の選択は、準備されたＤＮＡ配列についての発現したアミノ酸配列の分析に従って行うことができる。翻訳されたＤＮＡ配列は、ＣＤＲ３の長さの分布に加えて、分析対象の集団全体にわたるアミノ酸（ＡＡ）組成、相対的位置の保存、および頻度に関して調べることができる。
【0097】
ライブラリーからの発現した配列と比較した、天然の配列のデータベースにおける発現したＤＮＡ配列の分析から、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３のいずれかにおける天然組成の程度、ならびにまた、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３に存在する相対的多様性に基づいて、ＤＮＡ配列を選択することが可能である。
【0098】
天然の配列組成は、対応する天然に発現したＶＮＡＲ配列と比較して少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％、例えば、約８０％から約９５％、または約８５％から約９０％の配列同一性として定義される。高いレベルの多様性は、約６０％から約７５％、適切には約６５％から約７０％の配列同一性として定義され、この場合、対応する天然に発現したＶＮＡＲ配列と比較して約６０％から約６５％の多様性が適切であり得る。
【0099】
例えば、天然型のＣＤＲ１と、ＣＤＲ３での高レベルの多様性とを有することが望ましい場合がある。システイン残基の付加は、ＤＮＡ増幅プロセスにおいてＴＲＭオリゴヌクレオチドを使用することによって行うことができる。
【0100】
本発明の第２の態様に従うと、ヒト化された抗原特異的抗原結合分子を生成するためのプロセスであって、
（１）前記請求項のいずれかに記載の方法に従って準備されたライブラリーから所望のクローンを選択するステップ、
（２）これらのクローンから、ヒト化された抗原特異的抗原結合分子を単離および精製するステップ、
（３）ヒト化された抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングするステップ、ならびに
（４）宿主を形質転換して発現ベクターを発現させるステップ
を含むプロセスが提供される。
（１）前記請求項のいずれかに記載の方法に従って準備されたライブラリーから所望のクローンを選択するステップ、
（２）これらのクローンから、ヒト化された抗原特異的抗原結合分子を単離および精製するステップ、
（３）ヒト化された抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングするステップ、ならびに
（４）宿主を形質転換して発現ベクターを発現させるステップ
を含むプロセスが提供される。
【0101】
本発明の第３の態様に従うと、以下の式（Ｉ）：
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子を生成するための方法であって、
（１）ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の２つ以上の連続するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成するステップであって、前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ライゲートされると、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、式中、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む、ステップ、
（２）２つ以上の連続するペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成するステップ、
（３）（２）で得られたライゲートされたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングするステップ、ならびに
（４）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するステップ、
（５）ライブラリーから所望のクローンを選択するステップ、
（６）クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製するステップ、
（７）抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングするステップ、ならびに
（８）宿主を形質転換して発現ベクターを発現させるステップ
を含む方法が提供される。
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するヒト化された抗原特異的抗原結合分子を生成するための方法であって、
（１）ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の２つ以上の連続するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＤＲ１ドメインまたはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成するステップであって、前記２つ以上の連続するペプチドドメインが、ライゲートされると、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、式中、ＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む、ステップ、
（２）２つ以上の連続するペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を共にライゲートして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成するステップ、
（３）（２）で得られたライゲートされたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングするステップ、ならびに
（４）宿主を前記ディスプレイベクターで形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを生成するステップ、
（５）ライブラリーから所望のクローンを選択するステップ、
（６）クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製するステップ、
（７）抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングするステップ、ならびに
（８）宿主を形質転換して発現ベクターを発現させるステップ
を含む方法が提供される。
【0102】
本発明の一実施形態において、ステップ（１）におけるＤＮＡの増幅は、システインを除いた任意のアミノ酸の配列をコードするオリゴマーの存在下で行われる。言い換えると、増幅されたＤＮＡによってコードされる得られたＣＤＲ領域は、システインを含まない。しかし、他の実施形態においては、システインはＣＤＲ領域内に存在し得る。
【0103】
定義
本発明の抗原特異的抗原結合分子は、本発明の方法に従って準備されたＶＮＡＲ分子の合成ライブラリーに由来し得るアミノ酸配列を含む。ＶＮＡＲ、ＩｇＮＡＲ、およびＮＡＲという用語もまた、区別せずに使用され得る。
本発明の抗原特異的抗原結合分子は、本発明の方法に従って準備されたＶＮＡＲ分子の合成ライブラリーに由来し得るアミノ酸配列を含む。ＶＮＡＲ、ＩｇＮＡＲ、およびＮＡＲという用語もまた、区別せずに使用され得る。
【0104】
アミノ酸は、本明細書において、一文字コードで、または３文字コードで、またはその両方で表されている。
【0105】
「アフィニティー精製」という用語は、分子を、パートナー部分に結合した状態または引き付けられた状態のままにしながら不純物から分離することを可能にする、組み合わせまたは複合体を形成するための、化学的パートナーまたは結合パートナーへの分子の特異的な引力または結合に基づく、分子の精製を意味する。
【0106】
「相補性決定領域」またはＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３）という用語は、その存在が抗原結合に必要である、ＶＮＡＲドメインのアミノ酸残基を指す。各ＶＮＡＲは、典型的には、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、「相補性決定領域」のアミノ酸残基および／または「超可変ループ」（ＨＶ）のアミノ酸残基を含み得る。一部の場合において、相補性決定領域は、ＣＤＲ領域のアミノ酸と超可変ループのアミノ酸との両方を含み得る。ＶＮＡＲ分子についての一般に認められている命名法に従うと、ＣＤＲ２領域は存在していない。本明細書において使用される場合、ＣＤＲまたはＨＶが配列を「含む」と言われる場合は常に、この用語には、同一の配列「からなる」ＣＤＲまたはＨＶも含まれる。
【0107】
「フレームワーク領域」（ＦＷ）は、ＣＤＲ残基以外のＶＮＡＲ残基の領域である。各ＶＮＡＲは、典型的には、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４と同定される５つのフレームワーク領域を有する。本明細書において使用される場合、ＦＷが配列を「含む」と言われる場合は常に、この用語には、同一の配列「からなる」ＦＷも含まれる。
【0108】
「コドンセット」は、所望のバリアントアミノ酸をコードするために使用される異なるヌクレオチドトリプレット配列のセットを指す。オリゴヌクレオチドのセットは、例えば固相合成によって合成することができ、これは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの全ての考えられる組み合わせを表し、所望のアミノ酸群をコードする、配列を含む。コドン指定の標準的な形態は、ＩＵＢコードの形態であり、これは、当技術分野において公知であり、本明細書において記載されている。
【0109】
コドンセットは、典型的には、イタリック体の３つの大文字、例えば、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなどによって表される。「ランダムでないコドンセット」は、したがって、本明細書において記載されるアミノ酸選択の基準を部分的に、好ましくは完全に満たす選択アミノ酸をコードするコドンセットを指す。ある特定の位置での選択されたヌクレオチド「縮重」を伴うオリゴヌクレオチドの合成が当技術分野において周知であり、例えば、ＴＲＩＭアプローチ（Ｋｎａｐｐｅｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）、２９６、５７～８６）；ＧａｒｒａｒｄおよびＨｅｎｎｅｒ、Ｇｅｎｅ（１９９３）、１２８、１０３）である。ある特定のコドンセットを有するこのようなオリゴヌクレオチドセットは、市販の核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスター・シティ、ＣＡから入手可能である）を使用して合成することができるか、または、商業的に（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロックビル、ＭＤから）入手することができる。特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを典型的に含み、配列のその違いは、配列全体内のコドンセットによって生じている。本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、ＶＮＡＲ核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、都合の良い場合には、制限酵素部位を含み得る。
【0110】
「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」は、区別せずに使用され（文脈により別段の指示がない限り）、このような指定には、細胞または細胞系の全ての子孫が含まれる。したがって、例えば、「形質転換体」および「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞、および、移入の数に関わらずこれから派生した培養物が含まれる。全ての子孫は、意図的なまたは意図しない突然変異に起因して、ＤＮＡ組成が正確に同一ではない場合があることも理解されたい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同一の機能または生物学的活性を有している突然変異子孫が含まれる。
【0111】
「制御配列」は、発現に関する場合、特定の宿主生物における作動可能に連結しているコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列としては、例えば、プロモーター、場合によってオペレーター配列、リボソーム結合部位などが含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーなどの制御配列を使用する。
【0112】
「外被タンパク質」という用語は、その少なくとも一部がウイルス粒子の表面に存在するタンパク質を意味する。機能的観点から、外被タンパク質は、宿主細胞におけるウイルスのアセンブリプロセスの際にウイルス粒子と結び付き、ウイルスが別の宿主細胞に感染するまで、アセンブリしたウイルスと結び付いたままでいる、あらゆるタンパク質である。
【0113】
特定のアッセイにおける化学的実体の「検出限界」は、そのアッセイのバックグラウンドレベルを上回って検出され得る、当該実体の最小濃度である。例えば、ファージＥＬＩＳＡでは、特定の抗原結合断片を提示している特定のファージの「検出限界」は、抗原結合断片を提示していないコントロールファージによって生成されるシグナルを上回るＥＬＩＳＡシグナルを当該特定のファージが生成するファージ濃度である。
【0114】
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、共に共有結合している２つの部分を有するポリペプチドを指し、前記部分の各々は、異なる特性を有するポリペプチドである。特性は、生物学的特性、例えば、インビトロまたはインビボでの活性であり得る。特性はまた、単純な化学的または物理的特性、例えば、標的抗原への結合、反応の触媒などであり得る。２つの部分は、単一のペプチド結合によって直接連結されていても、または、１つもしくは複数のアミノ酸残基を有するペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。一般に、２つの部分およびリンカーは、互いにリーディングフレーム内に存在する。好ましくは、ポリペプチドの２つの部分は、異種のまたは異なるポリペプチドから得られる。本発明のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子は、２つ以上のＶＮＡＲドメインを含むため、融合タンパク質の一例である。
【0115】
この明細書における「融合タンパク質」という用語は、一般的には、水素結合もしくは塩架橋を含む化学的手段によって、またはタンパク質合成を介するペプチド結合によって、またはこれらの両方によって共に繋がった、１つまたは複数のタンパク質を意味する。
【0116】
「異種ＤＮＡ」は、宿主細胞に導入されているあらゆるＤＮＡである。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびこれらの融合体または組み合わせを含む、様々な由来源に由来し得る。ＤＮＡは、宿主細胞もしくはレシピエント細胞と同一の細胞もしくは細胞型に由来するＤＮＡ、または、異なる細胞型に由来する、例えば同種異系のもしくは異種の由来源に由来するＤＮＡを含み得る。ＤＮＡは、場合によって、マーカーまたは選択遺伝子、例えば、抗生物質耐性遺伝子、温度耐性遺伝子などを含み得る。
【0117】
「多様性の高い位置」は、公知のおよび／または天然に生じる抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列を比較すると、ある位置で表される多くの異なるアミノ酸を有する軽鎖および重鎖の可変領域内にある、当該アミノ酸位置を指す。多様性の高い位置は、典型的には、ＣＤＲ領域内にある。
【0118】
「同一性」は、配列の比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を指す。同一性はまた、場合に応じて、このような配列鎖の間のマッチによって決定される、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の間の配列関係性（相同性）の程度を意味する。２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の間の同一性を測定するための多くの方法が存在しているが、同一性を決定するために一般に利用される方法は、コンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列の間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムとしては、限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２、３８７（１９８４）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５、４０３））が含まれる。
【0119】
好ましくは、タンパク質のアミノ酸配列は、ＨＧＭＰ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ）によって提供されているＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Ａｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５、４０３～４１０）のデフォルトパラメータを使用して、アミノ酸レベルで、本明細書において開示されているアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有している。
【0120】
さらに好ましくは、タンパク質配列は、核酸またはアミノ酸レベルで、本明細書において示されているアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、およびまたさらに好ましくは９５％（またさらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性を有し得る。
【0121】
タンパク質はまた、ＨＧＭＰによって提供されているＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを使用して、本明細書において開示されている配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【0122】
「ライブラリー」は、複数のＶＮＡＲもしくはＶＮＡＲ断片配列（例えば、本発明のポリペプチド）、またはこれらの配列をコードする核酸を指し、これらの配列は、本発明の方法に従ってこれらの配列内に導入されているバリアントアミノ酸の組み合わせが異なっている。
【0123】
「ライゲーション」は、２つの核酸断片の間のリン酸ジエステル結合を形成するプロセスである。２つの断片のライゲーションでは、断片の末端は、互いに適合していなければならない。一部のケースにおいて、末端は、エンドヌクレアーゼ消化の後、すぐに適合する。しかし、エンドヌクレアーゼ消化の後に一般に生じる付着末端を平滑末端に変換して当該末端をライゲーションに適合させることが、まず必要である場合がある。末端を平滑化するために、ＤＮＡを、適切な緩衝液中で、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で、約１０単位の、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片またはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで、１５℃で少なくとも１５分間処理する。ＤＮＡを次いで、フェノール－クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって、またはシリカ精製によって精製する。共にライゲートされるＤＮＡ断片を、およそ等しいモル量で溶液中に入れる。溶液はまた、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、およびリガーゼ、例えば、ＤＮＡ０．５μｇ当たり約１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含有する。ＤＮＡがベクターにライゲートされる場合、ベクターは、適切な制限エンドヌクレアーゼでの消化によってまず線状化される。線状化された断片は次いで、ライゲーションステップの間のセルフライゲーションを防ぐために、細菌アルカリホスファターゼまたは仔牛小腸由来のホスファターゼで処理される。
【0124】
「突然変異」は、野生型配列などの参照ヌクレオチド配列に対する、ヌクレオチドの欠失、挿入、または置換である。
【0125】
「天然の」または「天然に生じる」ＶＮＡＲは、非合成由来源、例えばエクスビボで得られた組織由来源から同定された、または板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）の動物の血清から同定された、ＶＮＡＲを指す。これらのＶＮＡＲには、天然のまたはそれ以外の様式で誘導される、あらゆるタイプの免疫応答で生じるＶＮＡＲが含まれ得る。天然のＶＮＡＲとしては、アミノ酸配列、およびこれらの抗体を構成するまたはコードするヌクレオチド配列が含まれる。本明細書において使用される場合、天然のＶＮＡＲは、「合成ＶＮＡＲ」とは異なるものであり、合成ＶＮＡＲは、例えば、ある特定の位置の１つのアミノ酸または２つ以上のアミノ酸の、由来源抗体配列と異なる抗体配列を提供する異なるアミノ酸での置換、欠失、または付加によって、由来源配列または鋳型配列から変化している、ＶＮＡＲ配列を指す。
【0126】
「核酸構築物」という用語は、一般に、任意の長さの、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ、例えば、クローニングによって得られたまたは化学合成によって生成されたｍＲＮＡであり得る、核酸を指す。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡは、コードしているセンス鎖であり得るか、または非コード鎖もしくはアンチセンス鎖であり得る。治療的使用では、核酸構築物は、好ましくは、処置対象において発現し得る形態である。
【0127】
「作動可能に連結している」は、核酸に言及している場合、核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれていることを意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現していれば、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結しており、プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合には、コード配列に作動可能に連結しており、または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置していれば、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結している」は、連結されるＤＮＡ配列が連続的であることを意味し、分泌リーダーのケースでは、偶発的でありリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続的である必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって行われる。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣例に従って使用される。
【0128】
「ファージディスプレイ」は、バリアントポリペプチドを、ファージ、例えば繊維状ファージの粒子の表面上の外被タンパク質の少なくとも一部への融合タンパク質として提示するための技術である。ファージディスプレイ技術によって、高い親和性で標的抗原に結合する配列について迅速であり効率的に選別され得る、ランダム化されたタンパク質バリアントの大きなライブラリーを準備することが可能となる。ファージ上でのペプチドライブラリーおよびタンパク質ライブラリーの提示は、特異的結合特性を有するポリペプチドについて数百万のポリペプチドをスクリーニングするために使用することができる。多価ファージディスプレイ方法が、繊維状ファージの外被タンパク質ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、またはｐＩＸをコードする遺伝子への融合を介する、低分子ランダムペプチドおよび低分子タンパク質の提示に使用されている。
【0129】
「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏｌＥｌと、バクテリオファージの遺伝子間領域のコピーとを有する、プラスミドベクターである。ファージミドは、糸状バクテリオファージおよびラムダ様バクテリオファージを含むあらゆる公知のバクテリオファージで使用され得る。プラスミドはまた、抗生物質耐性についての選択マーカーを一般に有する。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増幅させることができる。これらのベクターを有する細胞に、ファージ粒子の生成に必要な全ての遺伝子が供給されると、プラスミドの複製態様はローリングサークル複製に変化して、プラスミドＤＮＡの一本鎖のコピーが生成され、ファージ粒子がパッケージングされる。ファージミドは、感染性または非感染性のファージ粒子を形成し得る。この用語には、異種ポリペプチド遺伝子に連結しているファージ外被タンパク質遺伝子またはその断片を遺伝子融合体として有しており、その結果、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面に提示されている、ファージミドが含まれる。ファージミドディスプレイベクターの一例は、ｐＷＲＩＬ－１である。
【0130】
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を有し、複製が可能な、バクテリオファージの二本鎖複製形態を意味する。ファージベクターは、ファージの複製およびファージ粒子の形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは、好ましくは、糸状バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３ファージ、ｆｌファージ、ｆｄファージ、Ｐｆ３ファージ、もしくはこれらの誘導体、または、ラムダ様ファージ、例えば、ラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、もしくはこれらの誘導体である。
【0131】
「タンパク質」という用語は、一般的には、ペプチド結合によって共に繋がった複数のアミノ酸残基を意味する。これは、区別せずに使用され、ペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー、またはポリペプチドと同一の意味であり、そして、糖タンパク質およびその誘導体を含む。「タンパク質」という用語はまた、タンパク質の断片、類似体、バリアント、および誘導体も含むものであり、ここで、断片、類似体、バリアント、または誘導体は、参照タンパク質と本質的に同一の生物学的活性または機能を保持している。タンパク質の類似体および誘導体の例としては、ペプチド核酸、およびＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）が含まれる。
【0132】
タンパク質の断片、類似体、バリアント、または誘導体は、それが由来した元である起源タンパク質配列の長さに応じて、少なくとも２５の、好ましくは３０もしくは４０の、または最大５０もしくは１００の、または６０から１２０のアミノ酸長であり得る。９０から１２０、１００から１１０アミノ酸長が、一部の場合において都合が良い場合がある。
【0133】
タンパク質の断片、誘導体、バリアント、または類似体は、（ｉ）アミノ酸残基の１つもしくは複数が、保存されたもしくは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）で置換されており、このような置換されたアミノ酸残基が、遺伝子コードによってコードされているアミノ酸残基であってもなくてもよい、断片、誘導体、バリアント、もしくは類似体、または（ｉｉ）アミノ酸残基の１つもしくは複数が置換基を含む、断片、誘導体、バリアント、もしくは類似体、または（ｉｉｉ）さらなるアミノ酸が、成熟ポリペプチド、例えば、ポリペプチドの精製に利用されるリーダー配列もしくは補助配列に融合している、断片、誘導体、バリアント、もしくは類似体であり得る。このような断片、誘導体、バリアント、および類似体は、本明細書における教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
【0134】
「オリゴヌクレオチド」は、公知の方法（固相技術を使用する、リン酸トリエステル化学、ホスファイト化学、またはホスホロアミダイト化学など）によって化学的に合成される、長さの短い、一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。さらなる方法としては、遺伝子の核酸配列全体が分かっている場合、またはコード鎖に相補的な核酸の配列が利用可能な場合に使用される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。あるいは、標的アミノ酸配列が分かっている場合には、各アミノ酸残基についての公知のおよび好ましいコード残基を使用して、考えられる核酸配列を推定することができる。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルもしくは分子サイジングカラムで、または沈殿によって精製することができる。ＤＮＡは、ＤＮＡが非核酸不純物（これは、極性、非極性、イオン性などであり得る）から分離されている場合、「精製」されている。
【0135】
「由来源」ＶＮＡＲまたは「鋳型」ＶＮＡＲ」は、本明細書において使用される場合、本明細書において記載される基準に従った多様化が行われる際に、その抗原結合配列が鋳型配列として機能する、ＶＮＡＲまたはＶＮＡＲ抗原結合断片を指す。抗原結合配列は、一般に、ＶＮＡＲ内に好ましくは少なくとも１つのＣＤＲを含み、好ましくはフレームワーク領域を含む。
【0136】
「転写調節エレメント」は、以下の構成要素：エンハンサーエレメント、プロモーター、オペレーター配列、リプレッサー遺伝子、および転写終結配列の１つまたは複数を有する。
【0137】
「形質転換」は、細胞がＤＮＡを取り込み、「形質転換体」となるプロセスを意味する。ＤＮＡの取り込みは、永続的または一時的であり得る。「形質転換体」は、ＤＮＡを取り込み、維持している細胞であり、これは、当該ＤＮＡに関連する表現型（例えば、当該ＤＮＡによってコードされているタンパク質によって付与された抗生物質耐性）の発現によって確認される。
【0138】
融合タンパク質（ポリペプチド）または異種ポリペプチド（ファージに対して異種の）などの、出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド（例えば、由来源ＶＮＡＲまたはそのＣＤＲ）の「バリアント」または「突然変異体」は、（１）出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、および（２）天然のまたは人工の突然変異生成を介して出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチドから派生した、ポリペプチドである。このようなバリアントは例えば、目的のポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または当該残基への挿入、および／または当該残基の置換を含む。例えば、バリアントアミノ酸（由来源ＶＮＡＲまたは抗原結合断片における対応する位置で見られるアミノ酸に対する）を有する配列をコードする非ランダムなコドンセットを含むオリゴヌクレオチドを使用して生成された本発明の融合ポリペプチドは、由来源ＶＮＡＲまたは抗原結合断片に対するバリアントポリペプチドとなる。したがって、バリアントＣＤＲは、出発ポリペプチド配列または参照ポリペプチド配列（由来源ＶＮＡＲまたは抗原結合断片のポリペプチド配列など）に対するバリアント配列を含むＣＤＲを指す。バリアントアミノ酸は、この文脈において、出発ポリペプチド配列または参照ポリペプチド配列（由来源ＶＮＡＲまたは抗原結合断片のポリペプチド配列など）における対応する位置にあるアミノ酸と異なるアミノ酸を指す。最終構築物が所望の機能的特徴を有するという条件で、欠失、挿入、および置換のあらゆる組み合わせが、最終バリアントまたは突然変異構築物を得るために行われ得る。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数または位置の変更などの、ポリペプチドの翻訳後プロセスを改変し得る。
【0139】
「野生型」もしくは「参照」配列、または、「野生型」もしくは「参照」タンパク質／ポリペプチドの、例えば外被タンパク質もしくは由来源ＶＮＡＲのＣＤＲの配列は、突然変異の導入を介してバリアントポリペプチドがそこから派生する参照配列であり得る。通常、所与のタンパク質の「野生型」配列は、自然界で最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、自然界で最も一般的に見られる、当該遺伝子の配列である。突然変異は、天然のプロセスを介してまたは人為的な手段を介して、「野生型」遺伝子（およびひいては、それがコードするタンパク質）に導入することができる。このようなプロセスの生成物は、起源の「野生型」タンパク質または遺伝子の「バリアント」または「突然変異」形態である。
【0140】
「ヒト化された」抗原特異的抗原結合分子は、特異的抗原上の特異的エピトープに対する機能的結合活性を保持しながら、インビボでの免疫原性の可能性を低減させるために、１つまたは複数のアミノ酸配列位置で修飾され得る。
【0141】
抗体可変ドメインのヒト化は、ヒト以外の種において作られている、治療上有用な標的に対する抗体を修飾し、その結果、ヒト化形態が、ヒト対象に投与された時の望ましくない免疫学的反応を避け得るようにするための、当技術分野において周知の技術である。ヒト化に関連する方法は、Ａｌｍａｇｒｏ Ｊ．ＣおよびＷｉｌｌｉａｍ Ｓｔｒｏｈｌ Ｗ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ．Ａｎ Ｊ．編、２００９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ、ならびに、Ｓｔｒｏｈｌ Ｗ．Ｒ．およびＳｔｒｏｈｌ Ｌ．Ｍ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０１２において概説されている。
【0142】
ＩｇＮＡＲは、免疫グロブリンと比較して起源が異なり、免疫グロブリン可変ドメインと比較して非常にわずかな配列相同性しか有さないが、免疫グロブリンの可変ドメインとＩｇＮＡＲの可変ドメインとの間にはある程度の構造的類似性が存在し、そのため、類似のプロセスをＶＮＡＲドメインに適用することができる。例えば、参照によって組み込まれるＷＯ２０１３／１６７８８３は、ＶＮＡＲのヒト化についての記載を提供しており、Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ Ｏ．Ｖ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３．２８８（２４）：１７４０８～１９頁もまた参照されたい。
【0143】
ヒト化された抗原特異的結合分子は、１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基をＤＰＫ－９の対応するフレームワークアミノ酸残基で置換することによって、野生型抗原特異的結合分子と異なるものになり得る。ＤＰＫ－９は、可変カッパサブグループ１（Ｖκ１）のメンバーであるヒト生殖細胞系ＶＬ足場である。ＤＰＫ－９は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＮＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
（配列番号４０）
に従った配列を有する。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＮＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
（配列番号４０）
に従った配列を有する。
【0144】
ＶＮＡＲおよびＤＰＫ－９の配列は、（図１）で示されている通りにアラインされ得る。
【0145】
ライブラリーの多様性
ＣＤＲ１およびＣＤＲ３というＣＤＲ領域におけるアミノ酸位置は、各位置で一般に生じるアミノ酸をコードするランダムでないコドンセットを使用して、それぞれ突然変異させることができる。一部の実施形態において、ＣＤＲ領域内の１つの位置が突然変異される場合、その位置のアミノ酸の好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、好ましくは全てをコードするコドンセットが選択される。一部の実施形態において、ＣＤＲ領域内の１つの位置が突然変異される場合、その位置の全てのアミノ酸の好ましくは約５０％から約１００％、好ましくは約６０％から約９５％、好ましくは少なくとも約７０％から約９０％、好ましくは約７５％から約９０％をコードするコドンセットが選択される。
ＣＤＲ１およびＣＤＲ３というＣＤＲ領域におけるアミノ酸位置は、各位置で一般に生じるアミノ酸をコードするランダムでないコドンセットを使用して、それぞれ突然変異させることができる。一部の実施形態において、ＣＤＲ領域内の１つの位置が突然変異される場合、その位置のアミノ酸の好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、好ましくは全てをコードするコドンセットが選択される。一部の実施形態において、ＣＤＲ領域内の１つの位置が突然変異される場合、その位置の全てのアミノ酸の好ましくは約５０％から約１００％、好ましくは約６０％から約９５％、好ましくは少なくとも約７０％から約９０％、好ましくは約７５％から約９０％をコードするコドンセットが選択される。
【0146】
ＶＮＡＲのライブラリーの多様性は、ＶＮＡＲの構造的混乱を最小化しながら多様性を最大化して、親和性が高い抗原特異的抗原結合分子を単離する能力を増大させ、また細胞培養において高収量で生成され得るこのような分子を提供するように、設計される。ＶＮＡＲ可変ドメインにおける突然変異位置の数は最小化されており、各位置のバリアントアミノ酸は、一般には生じないアミノ酸および停止コドンを適切に（可能である場合）排除しながら、システインを除いた各位置の一般に生じるアミノ酸を含むように、設計されている。
【0147】
ライブラリーにおける多様性は、少なくとも１つのＣＤＲにおける位置を非ランダムなコドンセットを使用して突然変異させることによって設計されている。非ランダムなコドンセットは、システインおよび停止コドンなどの非標的配列を最小化しながら、これらの位置にある一般に生じるアミノ酸の少なくとも１つのサブセットを好ましくはコードする。
【0148】
各位置の非ランダムなコドンセットは、少なくとも２つのアミノ酸を好ましくはコードし、システインはコードしない。各位置の非標的アミノ酸は最小化されており、システインおよび停止コドンは、構造に悪影響を与え得るため、一般におよび好ましくは排除される。
【0149】
上述したように、バリアントアミノ酸は、非ランダムなコドンセットによってコードされている。コドンセットは、所望のアミノ酸群をコードするために使用されるオリゴヌクレオチドのセットを形成するために使用され得る異なるヌクレオチドトリプレット配列のセットである。オリゴヌクレオチドのセットは、例えば固相合成によって合成することができ、これは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの全ての考えられる組み合わせに相当し、所望のアミノ酸群をコードする、配列を有する。ある特定の位置での選択されたヌクレオチドの「縮重」を伴うオリゴヌクレオチドの合成は、標準的な手順である。
【0150】
ある特定のコドンセットを有するこのようなヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスター・シティ、ＣＡから入手可能である）を使用して合成することができるか、または商業的に（例えば、Ｇｅｎｅ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ、ホーソーン、ＮＹ、もしくはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロックビル、ＭＤから）入手することができる。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドのセットは、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを典型的に含み、配列のその違いは、配列全体内のコドンセットによって生じている。本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸の鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングを目的とした制限酵素部位を含み得る。
【0151】
一実施形態において、バリアントＣＤＲ１およびＣＤＲ３またはこれらの混合物を有するポリペプチドが形成され、これにおいて、少なくとも１つのバリアントＣＤＲは、少なくとも１つのアミノ酸位置にバリアントアミノ酸を含み、バリアントアミノ酸は、非ランダムなコドンセットによってコードされ、非ランダムなコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は、公知の可変ドメイン配列におけるその位置での標的アミノ酸である。
【0152】
選択されたアミノ酸を鋳型核酸内に置換する方法は、当技術分野において良く確立されており、これらの方法の一部は、本明細書において記載されている。例えば、ライブラリーは、Ｋｕｎｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５４、３６７～３８２）を使用して、少なくとも１つのＣＤＲ領域におけるアミノ酸位置を、バリアントアミノ酸でのアミノ酸置換のために標的化することによって、生成することができる。
【0153】
コドンセットは、所望のバリアントアミノ酸をコードするために使用される異なるヌクレオチドトリプレット配列のセットである。コドンセットは、ＩＵＢコードに従った、以下に示すような、特定のヌクレオチドまたは等モルのヌクレオチド混合物を指定するための記号を使用して表すことができる。典型的には、コドンセットは、３つの大文字、例えば、ＲＲＫ、ＧＳＴ、ＴＫＧ、ＴＷＣ、ＫＣＣ、ＫＣＴ、およびＴＲＭによって表される。
ＩＵＢコード
Ｇ グアニン
Ａ アデニン
Ｔ チミン
Ｃ シトシン
Ｒ（ＡまたはＧ）
Ｙ（ＣまたはＴ）
Ｍ（ＡまたはＣ）
Ｋ（ＧまたはＴ）
Ｓ（ＣまたはＧ）
Ｗ（ＡまたはＴ）
Ｈ（ＡまたはＣまたはＴ）
Ｂ（ＣまたはＧまたはＴ）
Ｖ（ＡまたはＣまたはＧ）
Ｄ（ＡまたはＧまたはＴ）
Ｎ（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）。
ＩＵＢコード
Ｇ グアニン
Ａ アデニン
Ｔ チミン
Ｃ シトシン
Ｒ（ＡまたはＧ）
Ｙ（ＣまたはＴ）
Ｍ（ＡまたはＣ）
Ｋ（ＧまたはＴ）
Ｓ（ＣまたはＧ）
Ｗ（ＡまたはＴ）
Ｈ（ＡまたはＣまたはＴ）
Ｂ（ＣまたはＧまたはＴ）
Ｖ（ＡまたはＣまたはＧ）
Ｄ（ＡまたはＧまたはＴ）
Ｎ（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）。
【0154】
オリゴヌクレオチドセットまたはプライマーセットは、標準的な方法を使用して合成することができる。オリゴヌクレオチドのセットは、例えば固相合成によって合成することができ、これは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの全ての考えられる組み合わせを表し、所望のアミノ酸群をコードする、配列を含む。
【0155】
ある特定の位置での選択されたヌクレオチド「縮重」を伴うオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野において周知である。ある特定のコドンセットを有するこのようなオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスター・シティ、ＣＡから入手可能である）を使用して合成することができるか、または、商業的に（例えば、Ｇｅｎｅ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ、ハーソーン、ＮＹ、もしくはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロックビル、ＭＤから）入手することができる。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを典型的に含み、配列のその違いは、配列全体内のコドンセットによって生じている。本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸の鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングを目的とした制限酵素部位を含み得る。
【0156】
１つの方法において、バリアントアミノ酸をコードする核酸配列は、本明細書において開示されているＶＮＡＲ配列のＤ１もしくはＣ４などの由来源ポリペプチドまたは鋳型ポリペプチドをコードする核酸配列のオリゴヌクレオチド介在性の突然変異生成によって、生成することができる。この技術は、Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８７）１０、６４８７～６５０４（１９８７）によって記載されているように、当技術分野において周知である。簡潔に述べると、バリアントアミノ酸をコードする核酸配列は、所望のコドンセットをコードするオリゴヌクレオチドセットをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズすることによって生成され、ここで、鋳型は、可変領域核酸の鋳型配列を有する一本鎖形態のプラスミドである。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して鋳型の第２の相補鎖の全体を合成し、当該相補鎖はこうして、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、オリゴヌクレオチドセットによって提供されるコドンセットを有することになる。
【0157】
他の由来源分子または鋳型分子をコードする核酸は公知であるか、または容易に決定することができる。一般に、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードするヌクレオチドのいずれか側にある鋳型に対して完全に相補的な１２から１５のヌクレオチドを有する。これによって、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に適切にハイブリダイズすることが確実となる。オリゴヌクレオチドは、Ｃｒｅａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）７５：５７６５によって記載されているような当技術分野において公知の技術を使用して容易に合成される。
【0158】
ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販されているＭ１３ｍｐｌ８ベクターおよびＭ１３ｍｐｌ９ベクターが適切である）に由来するベクター、または、Ｖｉｅｒａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５３、３によって記載されている一本鎖ファージ複製起点を有するベクターによって生成され得る。したがって、一本鎖鋳型を生成するために、突然変異させようとしているＤＮＡを、これらのベクターの１つに挿入することができる。
【0159】
ネイティブなＤＮＡ配列を改変するために、オリゴヌクレオチドは、適切なハイブリダイゼーション条件下で、一本鎖の鋳型にハイブリダイズされる。ＤＮＡポリマー化酵素、通常はＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片が次いで、オリゴヌクレオチドを合成のためのプライマーとして使用して鋳型の相補鎖を合成するために添加される。ヘテロ二本鎖分子がこうして形成され、その結果、ＤＮＡの一方の鎖は突然変異形態のコード配列１をコードし、他方の鎖（元の鋳型）は、コード配列１のネイティブな改変されていない配列をコードする。このヘテロ二本鎖分子は次いで、適切な宿主細胞、通常は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１などの原核生物に形質転換される。細胞を増殖させた後、これらの細胞をアガロースプレートに播種し、３２リン酸で放射性標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してスクリーニングして、突然変異したＤＮＡを有する細菌コロニーを同定する。
【0160】
今記載した方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異を有するホモ二本鎖分子が生成されるように修正されてもよい。修正は以下の通りである：一本鎖オリゴヌクレオチドを、上記のような一本鎖鋳型にアニーリングする。デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）、およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）という３つのデオキシリボヌクレオチドの混合物を、ｄＣＴＰ－（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオデオキシリボシトシン（これは、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手することができる）と組み合わせる。この混合物を、鋳型－オリゴヌクレオチド複合体に添加する。ＤＮＡポリメラーゼをこの混合物に添加すると、突然変異した塩基以外が鋳型に同一のＤＮＡ鎖が生成する。加えて、この新たなＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ－（ａＳ）を有し、これは、制限エンドヌクレアーゼ消化から鎖を保護するために役立つ。二本鎖ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に、適切な制限酵素でニックを入れた後、当該鋳型鎖を、突然変異を生成しようとする部位を有する領域を過ぎたところで、ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは別の適切なヌクレアーゼで消化することができる。反応を次いで停止させて、部分的にのみ一本鎖である分子を残す。完全な二本鎖ＤＮＡのホモ二本鎖を次いで、４つ全てのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを使用して形成する。このホモ二本鎖分子を次いで、適切な宿主細胞に形質転換させることができる。
【0161】
これまでに示されているように、オリゴヌクレオチドセットの配列は、鋳型核酸にハイブリダイズするために十分な長さであり、また、必ずしもそうではないが、制限部位を有し得る。ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクターに由来するベクター、またはＶｉｅｒａら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）、１５３、３）によって記載されている一本鎖ファージ複製起点を有するベクターによって生成され得る。したがって、一本鎖鋳型を生成するために、突然変異させようとしているＤＮＡは、これらのベクターの１つに挿入されなければならない。
【0162】
オリゴヌクレオチドセットは、核酸鋳型配列を鋳型として使用して核酸カセットを生成するポリメラーゼ連鎖反応において使用することができる。核酸鋳型配列は、ＶＮＡＲ分子（すなわち、置換のために標的化されたアミノ酸をコードする核酸配列）の任意の部分であり得る。核酸鋳型配列は、第１の核酸鎖および相補的な第２の核酸鎖を有する二本鎖ＤＮＡ分子の一部である。核酸鋳型配列は、ＶＮＡＲドメインの少なくとも一部を有し、また、少なくとも１つのＣＤＲを有する。一部のケースにおいて、核酸鋳型配列は、２つ以上のＣＤＲを有する。核酸鋳型配列の上流部分および下流部分は、上流のオリゴヌクレオチドセットおよび下流のオリゴヌクレオチドセットのメンバーとのハイブリダイゼーションのために標的化することができる。
【0163】
上流のプライマーセットの第１のオリゴヌクレオチドは第１の核酸鎖にハイブリダイズし得、下流のプライマーセットの第２のオリゴヌクレオチドは第２の核酸鎖にハイブリダイズし得る。オリゴヌクレオチドプライマーは、１つまたは複数のコドンセットを含み得、核酸鋳型配列の一部にハイブリダイズするように設計され得る。これらのオリゴヌクレオチドを使用することで、ＰＣＲ後にＰＣＲ産物（すなわち、核酸カセット）内に２つ以上のコドンセットを導入することができる。ＶＮＡＲドメインをコードする核酸配列の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、アミノ酸置換のために標的化されたＣＤＲ残基をコードする部分を含む。
【0164】
上流および下流のオリゴヌクレオチドセットはまた、オリゴヌクレオチド配列内に制限部位を含むように合成することができる。これらの制限部位は、追加のＶＮＡＲ配列を有する発現ベクター内への核酸カセット（すなわち、ＰＣＲの反応生成物）の挿入を促進し得る。
【0165】
タンパク質発現
本発明の抗原特異的抗原結合分子をコードする核酸配列は、核酸構築物内に存在し得る。このような核酸構築物は、ベクター、例えば発現ベクターの形態であり得、またこれら構築物としては、とりわけ、染色体ベクター、エピソーム性ベクター、およびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミドに由来するベクター、バクテリオファージに由来するベクター、トランスポゾンに由来するベクター、酵母エピソームに由来するベクター、挿入エレメントに由来するベクター、酵母染色体エレメントに由来するベクター、ウイルスに由来するベクター、例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスに由来するベクター、ならびに、これらの組み合わせに由来するベクター、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来する、例えばコスミドおよびファージミドに由来するベクターが含まれ得る。一般に、宿主内で核酸を維持するか、増幅させるか、または発現させてポリペプチドを発現させるために適切なあらゆるベクターを、この点に関する発現に使用することができる。
本発明の抗原特異的抗原結合分子をコードする核酸配列は、核酸構築物内に存在し得る。このような核酸構築物は、ベクター、例えば発現ベクターの形態であり得、またこれら構築物としては、とりわけ、染色体ベクター、エピソーム性ベクター、およびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミドに由来するベクター、バクテリオファージに由来するベクター、トランスポゾンに由来するベクター、酵母エピソームに由来するベクター、挿入エレメントに由来するベクター、酵母染色体エレメントに由来するベクター、ウイルスに由来するベクター、例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスに由来するベクター、ならびに、これらの組み合わせに由来するベクター、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来する、例えばコスミドおよびファージミドに由来するベクターが含まれ得る。一般に、宿主内で核酸を維持するか、増幅させるか、または発現させてポリペプチドを発現させるために適切なあらゆるベクターを、この点に関する発現に使用することができる。
【0166】
核酸構築物は、核酸の発現を制御するプロモーターまたは他の調節配列を適切に含み得る。核酸の発現を制御するプロモーターおよび他の調節配列は同定されており、当技術分野において公知である。当業者であれば、プロモーターまたは他の調節配列全体を必ずしも利用する必要はないであろうことが分かるであろう。最小の必須の調節エレメントのみが必要であり得、実際、このようなエレメントが、キメラ配列または他のプロモーターを構築するために使用され得る。必須の要件は、当然のことながら、組織特異性および／または時間的特異性を保持することである。プロモーターは、任意の適切な公知のプロモーター、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、またはレトロウイルスのＬＴＲのプロモーター、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲのプロモーター、ならびにメタロチオネインプロモーター、例えば、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターであり得る。プロモーターは、プロモーター活性のために含まれる最小単位（エンハンサーエレメントを場合によって有さないＴＡＴＡエレメントなど）、例えば、ＣＭＶプロモーターの最小配列を含み得る。好ましくは、プロモーターは、核酸配列に隣接している。
【0167】
本明細書において記載されているように、核酸構築物は、ベクターの形態であり得る。ベクターは、ベクターでトランスフェクトされた（または形質転換された）細胞の選択を可能にする、および好ましくは、異種ＤＮＡを組み込むベクターを含有している細胞の選択を可能にする、１つまたは複数の発現マーカーを含むことが多い。適切な開始シグナルおよび停止シグナルが、一般に存在する。
【0168】
ベクターは、ｐＥＴなどの任意の適切な発現ベクターであり得る。ベクターは、このような追加の制御配列、例えば、開始配列および終結配列を含む、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性、蛍光など）、転写制御配列、およびプロモーターを必要に応じて含み得る
プロモーターは、本発明の核酸配列によってコードされるタンパク質の発現を生じさせるための任意の適切なプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターであり得る。
プロモーターは、本発明の核酸配列によってコードされるタンパク質の発現を生じさせるための任意の適切なプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターであり得る。
【0169】
このようなベクターは、宿主細胞内に存在し得る。本発明の核酸構築物の発現のための適切な宿主細胞の代表的な例としては、ウイルスベクター内への核酸のカプセル化を可能にするウイルスパッケージング細胞；細菌細胞、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、大腸菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；単細胞、例えば酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＰＨＫ．２９３、およびボウズ・メラノーマ（Ｂｏｗｅｓ Ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞、および他の適切なヒト細胞；ならびに植物細胞、例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａが含まれる。適切には、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞などの真核細胞である。
【0170】
宿主細胞への発現ベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ・ローディング、バリスティック導入、感染、または他の方法によって行うことができる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）などの、多くの標準的な実験マニュアルにおいて記載されている。
【0171】
成熟タンパク質は、ＣＨＯ細胞、酵母、細菌、または他の細胞などの哺乳動物細胞を含む宿主細胞において、適切なプロモーターの制御下で発現させることができる。本発明の第３の態様の核酸構築物に由来するＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を生成するために、無細胞翻訳システムを利用することができる。原核生物宿主および真核生物宿主と共に使用するための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）によって記載されている。
【0172】
本発明はまた、本明細書において記載される本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供する。本発明に従うと、本発明の抗原特異的抗原結合分子をコードする核酸配列を、本明細書において定義される適切な宿主細胞において発現させるステップを含む、前記分子を生成するためのプロセスが提供される。
【0173】
タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンおよび／またはヘパリンクロマトグラフィーを含む標準的な方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。治療のためには、例えば組換えベクターの形態の核酸構築物は、当技術分野において公知の技術によって、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）において記載されているようなカラムクロマトグラフィーによって、精製することができる。
【0174】
本発明はまた、本明細書において定義される抗原特異的抗原結合分子を含む融合タンパク質にも及ぶ。抗原特異的抗原結合分子は、生物学的に活性なタンパク質に融合される。本発明はまた、本明細書において開示されている抗原特異的抗原結合分子コードする核酸またはその融合タンパク質にも及ぶ。
【0175】
本発明のこの態様は、したがって、宿主細胞における発現による組換えによる融合タンパク質の生成と、ペプチド結合、水素結合もしくは塩結合、または化学的架橋による発現した融合タンパク質の精製とを含む、本発明の融合タンパク質を準備するためのプロセスに及ぶ。本発明のこの態様の一部の実施形態において、融合タンパク質は、水素結合または塩結合を使用して準備することができ、ここで、ペプチドは、多量体化、例えば二量体化または三量体化することができる。
【0176】
ライブラリーとしてのタンパク質発現
別の態様において、本発明は、本発明の複数のベクターを含むライブラリーであって、前記複数のベクターが複数のポリペプチドをコードする、ライブラリーを提供する。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをその表面に提示しているウイルスまたはウイルス粒子（ファージまたはファージミド粒子など）を提供する。本発明はまた、本発明の複数のウイルスまたはウイルス粒子を含むライブラリーであって、各ウイルスまたはウイルス粒子が本発明のポリペプチドを提示しているライブラリーも提供する。本発明のライブラリーは、任意の数の異なるポリペプチド（配列）、少なくとも約１×１０８個の、少なくとも約１×１０９個の、少なくとも約１×１０１０個の異なる配列、より適切には少なくとも約９×１０１０個の配列を含み得る。
別の態様において、本発明は、本発明の複数のベクターを含むライブラリーであって、前記複数のベクターが複数のポリペプチドをコードする、ライブラリーを提供する。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをその表面に提示しているウイルスまたはウイルス粒子（ファージまたはファージミド粒子など）を提供する。本発明はまた、本発明の複数のウイルスまたはウイルス粒子を含むライブラリーであって、各ウイルスまたはウイルス粒子が本発明のポリペプチドを提示しているライブラリーも提供する。本発明のライブラリーは、任意の数の異なるポリペプチド（配列）、少なくとも約１×１０８個の、少なくとも約１×１０９個の、少なくとも約１×１０１０個の異なる配列、より適切には少なくとも約９×１０１０個の配列を含み得る。
【0177】
本発明はまた、複数のポリペプチドを含有するライブラリーであって、それぞれのタイプのポリペプチドが、本明細書において記載される本発明のポリペプチドである、ライブラリーも提供する。
【0178】
核酸カセットは、生成した標的化されたアミノ酸置換を有しているＶＮＡＲの一部または全体を発現するための任意の適切なベクターにクローニングすることができる。核酸カセットは、ウイルス外被タンパク質の全てまたは一部に融合しているＶＮＡＲ鎖配列の一部または全体の生成（すなわち、融合タンパク質の生成）を可能にするベクターにクローニングされ得、粒子または細胞の表面に提示され得る。いくつかのタイプのベクターが利用可能であり、本発明を実施するために使用され得るが、ファージミドベクターが、比較的容易に構築され得、容易に増幅され得るため、本明細書における使用に好ましいベクターである。ファージミドベクターは、一般に、プロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点部位、および他の必要な構成要素を含む、様々な構成要素を有する。
【0179】
別の実施形態において、特定のバリアントアミノ酸の組み合わせを発現させようとする場合、核酸カセットは、ＶＮＡＲ配列の全てまたは一部をコードし得る、およびバリアントアミノ酸の組み合わせをコードし得る配列を有する。ライブラリーにおけるように、これらのバリアントアミノ酸またはバリアントアミノ酸の組み合わせを有する抗原特異的抗原結合分子を生成するために、核酸カセットを、追加のＶＮＡＲ配列、例えば、様々なＣＤＲ、フレームワーク、および／または超可変領域の全てまたは部分を有する発現ベクターに挿入することができる。これらの追加の配列はまた、他の核酸配列、例えば、ウイルス外被タンパク質の構成要素をコードする、ひいては、融合タンパク質の生成を可能にする配列に融合され得る。
【0180】
本発明の一態様は、遺伝子融合体をコードする核酸配列を含む複製可能な発現ベクターであって、前記遺伝子融合体が、ウイルス外被タンパク質の全てまたは一部に融合している１つのＶＮＡＲ配列および第２のＶＮＡＲ配列を含む融合タンパク質をコードする、発現ベクターを含む。また、上記のように多様な配列で生成された複数のＶＮＡＲ配列を含む複数の異なる融合タンパク質をコードする複数の遺伝子融合体を含む多様な複製可能な発現ベクターのライブラリーも含まれる。ベクターは様々な構成要素を含み得、好ましくは、異なるベクター間でのＶＮＡＲ配列の移動を可能にするように、および／または異なるフォーマットでの融合タンパク質の提示をもたらすように、構築される。
【0181】
ベクターの例には、ファージベクターが含まれる。ファージベクターは、ファージの複製およびファージ粒子の形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは、好ましくは、糸状バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ３ファージ、もしくはこれらの誘導体、または、ラムダ様ファージ、例えば、ラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４など、もしくはこれらの誘導体である。
【0182】
ウイルス外被タンパク質の例としては、感染性タンパク質ＰＩＩＩ、主要外被タンパク質ＰＶＩＩＩ、ｐ３、Ｓｏｃ（Ｔ４）、Ｈｏｃ（Ｔ４）、ｇｐＤ（バクテリオファージラムダの）、微量バクテリオファージ外被タンパク質６（ｐＶＩ）（繊維状ファージ；Ｈｕｆｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（１９９９）、２３１（１～２）：３９～５１）、Ｍ１３バクテリオファージ主要外被タンパク質（Ｐ８）のバリアント（Ｗｅｉｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ（２０００）９（４）：６４７～５４）が含まれる。融合タンパク質はファージの表面に提示され得、適切なファージシステムとしては、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３－ＶＣＳ、およびＰｈｉ Ｘ １７４、ｐＪｕＦｏファージシステム（Ｐｅｒｅｂｏｅｖら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（２００１）、７５（１５）：７１０７～１３）、ならびにハイパーファージ（Ｒｏｎｄｏｔら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）、１９（１）：７５～８）が含まれる。好ましいヘルパーファージはＭ１３Ｋ０７であり、好ましい外被タンパク質はＭ１３ファージ遺伝子ＩＩＩ外被タンパク質である。好ましい宿主は、大腸菌、および大腸菌のプロテアーゼ欠損株である。ｆｔｈｌベクター（Ｅｎｓｈｅｌｌ－Ｓｅｉｊｆｆｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）；２９（１０）：Ｅ５０－０）などのベクターは、融合タンパク質の発現に有用であり得る。
【0183】
発現ベクターはまた、各ＶＮＡＲまたはその断片をコードするＤＮＡに融合した分泌シグナル配列を有し得る。この配列は、典型的には、融合タンパク質をコードする遺伝子のすぐ５’側に位置し、したがって、融合タンパク質のアミノ末端で転写される。しかし、ある特定のケースにおいて、シグナル配列は、分泌されるタンパク質をコードする遺伝子の５’側以外の位置にあることが示されている。この配列は、細菌細胞の内膜全体にわたってそれが付着しているタンパク質を標的化している。シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有するタンパク質をコードするあらゆる遺伝子から、制限エンドヌクレアーゼ断片として得ることができる。適切な原核生物シグナル配列は、例えば、ＬａｍＢまたはＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ（１９８３）６８、１９３１）、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡをコードする遺伝子、および他の遺伝子から得ることができる。
【0184】
本発明を実施するための好ましい原核生物シグナル配列は、Ｃｈａｎｇら（Ｇｅｎｅ ５５．１８９（１９８７））によって記載されている大腸菌の熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列、およびｍａｌＥである。
【0185】
ベクターはまた、典型的には、融合タンパク質の発現を進めるためのプロモーターも含む。原核生物ベクターにおいて最も一般的に使用されるプロモーターには、ｌａｃＺプロモーターシステム、アルカリホスファターゼｐｈｏＡプロモーター（Ａｐ）、バクテリオファージＸＰＬプロモーター（温度感受性プロモーター）、ｔａｃプロモーター（ｌａｃリプレッサーによって調節されるハイブリッドｔｒｐ－ｌａｃプロモーター）、トリプトファンプロモーター、およびバクテリオファージＴ７プロモーターが含まれる。プロモーターの一般的な説明については、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらの第１７節を参照されたい。これらが最も一般的に使用されるプロモーターではあるが、他の適切な微生物プロモーターも同様に使用することができる。
【0186】
ベクターはまた、他の核酸配列、例えば、ファージのまたは細胞の表面に発現した融合タンパク質の検出または精製に有用であり得るｇＤタグ、ｃ－Ｍｙｃエピトープ、ポリヒスチジンタグ、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）、またはベータガラクトシダーゼタンパク質をコードする配列も含み得る。
【0187】
例えばｇＤタグをコードする核酸配列もまた、融合タンパク質を発現している細胞またはウイルスの正または負の選択のために提供される。一部の実施形態において、ｇＤタグは、ウイルス外被タンパク質の構成要素に融合していないＶＮＡＲ配列に好ましくは融合している。例えばポリヒスチジンタグをコードする核酸配列は、特異的抗原に結合しているＶＮＡＲ配列を含む融合タンパク質を、免疫組織化学を使用して同定するために有用である。抗原結合の検出に有用なタグは、ウイルス外被タンパク質の構成要素に融合していないＶＮＡＲ配列またはウイルス外被タンパク質の構成要素に融合しているＶＮＡＲ配列のいずれかに融合していてよい。
【0188】
本発明を実施するために使用されるベクターの別の有用な構成要素は、表現型選択遺伝子である。典型的な表現型選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子である。説明として、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）およびテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔｒ）が、この目的のために手軽に利用される。
【0189】
ベクターはまた、固有の制限部位および抑制性の停止コドンを有する核酸配列も含み得る。固有の制限部位は、異なるベクターおよび発現系の間でＶＮＡＲ配列を移動させるために有用である。抑制性の停止コドンは、融合タンパク質の発現レベルを制御するため、および可溶性ＶＮＡＲ断片の精製を容易にするために有用である。例えば、アンバー停止コドンは、ｓｕｐＥ宿主においてはＧｌｎと読まれてファージディスプレイを可能にし得るが、一方、非ｓｕｐＥ宿主では、これは停止コドンと読まれて、ファージ外被タンパク質への融合を伴わずに可溶性ＶＮＡＲ断片を生成する。これらの合成配列は、ベクター内で１つまたは複数のＶＮＡＲ配列に融合され得る。
【0190】
目的の配列、例えばバリアントアミノ酸を有するＣＤＲをコードする核酸をベクターシステムから容易に除去し、別のベクターシステムに置くことを可能にする、ベクターシステムを使用することが、都合が良い場合がある。例えば、適切な制限部位は、ベクターシステムにおいて、ＶＮＡＲをコードする核酸配列の除去を促進するように操作することができる。制限配列は、効率的な切除および新たなベクターへのライゲーションを促進するために、ベクター内で固有となるように通常選択される。ＶＮＡＲ配列は次いで、ウイルス外被タンパク質または他の配列タグなどの外来の融合配列を有さないベクターから発現され得る。
【0191】
ＶＮＡＲ配列をコードする核酸（遺伝子１）とウイルス外被タンパク質の構成要素をコードする核酸（遺伝子２）との間に、終結コドンまたは停止コドンをコードするＤＮＡが挿入され得、このような終結コドンには、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、およびＵＧＡ（オペル）が含まれる。（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓら、Ｈａｒｐｅｒ ＆ Ｒｏｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０；２３７、２４５～４７、および３７４頁）。野生型宿主細胞において発現している終結コドンまたは停止コドンは、遺伝子２のタンパク質が付随していない遺伝子１のタンパク質産物を合成させる。しかし、サプレッサー宿主細胞の増殖は、検出可能な量の融合タンパク質の合成をもたらす。大腸菌サプレッサー株などのこのようなサプレッサー宿主細胞は周知であり、記載されている（Ｂｕｌｌｏｃｋら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５：３７６～３７９（１９８７））。あらゆる許容可能な方法を、融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ内にこのような終結コドンを置くために使用することができる。
【0192】
抑制性のコドンは、ＶＮＡＲ配列をコードする第１の遺伝子と、ファージ外被タンパク質の少なくとも一部をコードする第２の遺伝子との間に挿入することができる。あるいは、抑制性の終結コドンは、ＶＮＡＲ配列内の最後のアミノ酸トリプレットまたはファージ外被タンパク質内の最初のアミノ酸を置き換えることによって、融合部位の隣に挿入することができる。抑制性の終結コドンは、二量体化ドメインのＣ末端に、または当該Ｃ末端の後ろに、位置し得る。抑制性のコドンを有するプラスミドをサプレッサー宿主細胞内で増幅させる場合、これは、ポリペプチドおよび外被タンパク質を有する融合ポリペプチドの検出可能な産生をもたらす。プラスミドを非サプレッサー宿主細胞内で増幅させる場合、ＶＮＡＲ配列は、挿入された抑制性のトリプレットＵＡＧ、ＵＡＡ、またはＵＧＡでの終結に起因して、ファージ外被タンパク質への融合をほとんど伴わずに合成される。非サプレッサー細胞では、他の場合には宿主の膜に固定されている融合したファージ外被タンパク質が存在していないため、抗体可変ドメインが宿主細胞から合成および分泌される。
【0193】
一部の実施形態において、多様化されている（ランダム化されている）ＣＤＲは、鋳型配列に、操作された停止コドン（本明細書において「停止鋳型」と呼ばれる）を有し得る。この特徴は、目的のバリアントアミノ酸の配列を含むオリゴヌクレオチドの組み込みに起因して、鋳型配列における停止コドンの成功裏の修復に基づいて成功裏に多様化された配列の検出および選択を提供する。
本発明のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子
さらなる態様において、本発明は、２つ以上のＶＮＡＲドメインを含むマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子であって、各ＶＮＡＲドメインが、以下の式（Ｉ）：
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するアミノ酸配列を含み、
式中、少なくとも１つのＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従ったヒト化配列を含み、
少なくとも１つのＶＮＡＲドメインのＦＷ４が、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列、あるいは
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含む、
マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子を提供する。
本発明のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子
さらなる態様において、本発明は、２つ以上のＶＮＡＲドメインを含むマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子であって、各ＶＮＡＲドメインが、以下の式（Ｉ）：
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するアミノ酸配列を含み、
式中、少なくとも１つのＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ１が、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従ったヒト化配列を含み、
少なくとも１つのＶＮＡＲドメインのＦＷ４が、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列、あるいは
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含む、
マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子を提供する。
【0194】
ヒト化ＦＷ１配列を採用しながら、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列に由来する、または当該配列に関する（上記で定義したように）ＦＷ４配列を維持する効果は、ＦＷ４もヒト化されている対応するマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子と比較して同等であり得るかまたはわずかに増大し得る中和力である。この効果は、ＦＷ４がヒト化されている分子の中和力が高い（およそ０．００２ｎＭ）場合であっても見られる。本発明者らは、驚くべきことに、この効果が、ＦＷ４をヒト化せずにＦＷ１をヒト化することに予想外に関連しているが、しかし、ＦＷ１をヒト化せずにＦＷ４をヒト化することには関連していないことを同定した。ＦＷ１をヒト化せずにＦＷ４をヒト化すると、中和力が著しく損なわれる場合がある。
【0195】
本発明の第１の態様、第２の態様、および第３の態様の方法に関連して開示されている本発明の特徴は、本発明の第４の態様のマルチドメイン抗原特異的抗原結合分子に関連して開示されている発明の規定において使用され得、また逆の場合も同様である。
【0196】
２つ以上のＶＮＡＲドメインは、同一であっても異なっていてもよい。典型的には、マルチドメイン抗原特異的結合分子は、少なくとも２つの異なるＶＮＡＲドメインを含む。２つの異なるＶＮＡＲドメインは、ある程度の配列同一性、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を共有し得る。２つの異なるＶＮＡＲドメインは、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＨＶ２、ＦＷ３ａ、ＨＶ４、ＦＷ３ｂ、ＣＤＲ３、およびＦＷ４からなる群から選択される１つまたは複数のドメインについて同一の配列を共有し得る。典型的には、２つの異なるＶＮＡＲドメインは、少なくともＦＷ１およびＦＷ４について同一の配列を共有する。２つの異なるＶＮＡＲドメインは、ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４、およびＣＤＲ３について同一の配列を共有し得る。２つの異なるＶＮＡＲドメインは、ＦＷ１、ＦＷ２、ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４、およびＣＤＲ３について同一の配列を共有し得る。
【0197】
典型的には、２つ以上のＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ１はそれぞれ、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従ったヒト化配列を含む。
【0198】
典型的には、２つ以上のＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ４はそれぞれ、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列、あるいは
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含む。
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含む。
【0199】
一実施形態において、マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子は、２つ以上のＶＮＡＲドメインを含み、各ＶＮＡＲドメインは、以下の式（Ｉ）：
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するアミノ酸配列を含み、
式中、少なくとも１つのＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ１は、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従ったヒト化配列を含み、
少なくとも１つのＶＮＡＲドメインのＦＷ４は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列を含む。
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するアミノ酸配列を含み、
式中、少なくとも１つのＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ１は、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従ったヒト化配列を含み、
少なくとも１つのＶＮＡＲドメインのＦＷ４は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列を含む。
【0200】
一実施形態において、マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子は、２つ以上のＶＮＡＲドメインを含み、各ＶＮＡＲドメインは、以下の式（Ｉ）：
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するアミノ酸配列を含み、
式中、少なくとも２つのＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ１は、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従ったヒト化配列を含み、
少なくとも２つのＶＮＡＲドメインのＦＷ４は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列を含む。
ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４
によって表されるペプチドドメイン構造を有するアミノ酸配列を含み、
式中、少なくとも２つのＶＮＡＲ結合ドメインのＦＷ１は、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従ったヒト化配列を含み、
少なくとも２つのＶＮＡＲドメインのＦＷ４は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４に対応する配列を含む。
【0201】
一実施形態において、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ、およびＦＷ４の少なくとも１つは、それぞれ、以下からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ１は、
ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）、
Ａ／Ｔ Ｓ／Ｒ Ｖ Ｎ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号６）、および
Ｄ Ｉ Ｑ Ｍ Ｔ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号７）
からなる群から選択される配列を含み、
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った配列を含み、
ＦＷ４は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）に従った配列、あるいは
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含む。
ＦＷ１は、
ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）、
Ａ／Ｔ Ｓ／Ｒ Ｖ Ｎ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号６）、および
Ｄ Ｉ Ｑ Ｍ Ｔ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号７）
からなる群から選択される配列を含み、
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った配列を含み、
ＦＷ４は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）に従った配列、あるいは
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含む。
【0202】
ＦＷ１は、
ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）、
Ａ／Ｔ Ｓ／Ｒ Ｖ Ｎ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号６）、および
Ｄ Ｉ Ｑ Ｍ Ｔ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号７）
からなる群から選択される配列を含み得る。
ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）、
Ａ／Ｔ Ｓ／Ｒ Ｖ Ｎ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号６）、および
Ｄ Ｉ Ｑ Ｍ Ｔ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ（配列番号７）
からなる群から選択される配列を含み得る。
【0203】
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った配列を含み得る。
【0204】
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った配列を含み得る。
【0205】
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った配列を含み得る。
【0206】
アミノ酸配列は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、およびまたさらに好ましくは９５％（またさらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性を有し得る。
【0207】
アミノ酸配列は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ４配列に対する３つの、好ましくは２つの、またはさらに好ましくは１つのアミノ酸置換を有し得る。１つまたは複数の置換は、保存的なアミノ酸置換であり得る。
【0208】
配列同一性および／またはアミノ酸置換は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における任意の種の任意のＦＷ４配列に対するものであり得る。例えば、配列同一性および／またはアミノ酸置換は、Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｆｏｒｍｅｓ目のＧｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ科のＧｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ ｃｉｒｒａｔｕｍおよび／またはＳｑｕａｌｉｆｏｒｍｅｓ目のＳｑｕａｌｉｄａｅ科のＳｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｉａｓのＦＷ４配列に対するものであり得る。配列同一性および／またはアミノ酸置換は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）に対するものであり得る。
【0209】
ＦＷ４は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）に従った配列、あるいは、
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含み得る。
（ｉ）それに対して少なくとも７０％の同一性、または
（ｉｉ）それに対する１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換
のいずれかを有するアミノ酸配列を含み得る。
【0210】
ＦＷ４は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）に従った配列を含み得る。
【0211】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、およびＦＷ３ｂの組み合わせ配列の少なくとも３つのアミノ酸残基は、ヒト化され得る。したがって、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種のメンバーのＦＷ２、ＦＷ３ａ、およびＦＷ３ｂの組み合わせ配列から出発して、少なくとも３つのアミノ酸残基が、ＤＰＫ－９由来の対応する残基に置換され得る。ＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、およびＦＷ３ｂ配列は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種の同一のメンバーに、または板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における種の２つ以上の異なるメンバーに、例えば同一種の異なる個体に由来し得る。あるいは、ＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、およびＦＷ３ｂ配列は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ ｓｕｂｃｌａｓｓ）における２つ以上の異なる種に由来し得る。
【0212】
少なくとも３つのヒト化残基は、本明細書において開示されている任意のＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、および／またはＦＷ３ｂ配列における任意の３つのヒト化残基から選択され得る。例えば、少なくとも３つのヒト化残基は、図１で示されている任意の３つのヒト化残基から選択され得る。
【0213】
ＦＷ２、ＦＷ３ａ、およびＦＷ３ｂの組み合わせ配列の少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のアミノ酸残基が、ヒト化され得る。
【0214】
ＦＷ２についての１つまたは複数の配列は、
ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）、
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ Ｋ Ｎ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号９）、および
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｙ／Ｆ Ｑ Ｑ Ｋ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号１０）
からなる群から選択され得る。
ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）、
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ Ｋ Ｎ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号９）、および
Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｙ／Ｆ Ｑ Ｑ Ｋ Ｐ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号１０）
からなる群から選択され得る。
【0215】
ＦＷ３ａについての１つまたは複数の配列は、
ＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）、
ＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）、
ＧＲＹＶＥＳＶＮ（配列番号１２）、および
ＧＲＦＳＧＳＧＳ（配列番号１３）
からなる群から選択され得る。
ＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）、
ＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）、
ＧＲＹＶＥＳＶＮ（配列番号１２）、および
ＧＲＦＳＧＳＧＳ（配列番号１３）
からなる群から選択され得る。
【0216】
一実施形態において、第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ａはＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）を含み、第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ａはＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）を含む。
【0217】
ＦＷ３ｂについての１つまたは複数の配列は、
ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）、
ＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）、
Ｆ Ｓ Ｌ Ｒ Ｉ Ｋ Ｄ Ｌ Ｔ Ｖ Ａ Ｄ Ｓ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１６）、および
Ｆ Ｔ Ｌ Ｔ Ｉ Ｓ Ｓ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｄ Ｆ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１７）
からなる群から選択され得る。
ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）、
ＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）、
Ｆ Ｓ Ｌ Ｒ Ｉ Ｋ Ｄ Ｌ Ｔ Ｖ Ａ Ｄ Ｓ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１６）、および
Ｆ Ｔ Ｌ Ｔ Ｉ Ｓ Ｓ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｄ Ｆ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ Ａ（配列番号１７）
からなる群から選択され得る。
【0218】
一実施形態において、第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ｂはＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）を含み、第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ｂはＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）を含む。
【0219】
ＦＷ４についての１つまたは複数の配列は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含み得る。
【0220】
ＦＷ１についての１つまたは複数の配列は、ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含み得る。
【0221】
一実施形態において、ＦＷ４についての１つまたは複数の配列はＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含み、ＦＷ１についての１つまたは複数の配列はＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含む。
【0222】
一実施形態において、マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子は、
ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含む、ＦＷ４についての配列、および
ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含む、ＦＷ１についての配列
をそれぞれが含む、少なくとも２つのＶＮＡＲドメインを含む。
ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含む、ＦＷ４についての配列、および
ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含む、ＦＷ１についての配列
をそれぞれが含む、少なくとも２つのＶＮＡＲドメインを含む。
【0223】
マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子は、第１のＶＮＡＲドメインおよび第２のＶＮＡＲドメインを含み得、ここで、
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ１は、ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ｂは、ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ４は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ１は、ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ｂは、ＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインＦＷ４は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含む。
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ１は、ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＴＶＮ（配列番号１４）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ｂは、ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳ（配列番号１８）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＦＷ４は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ１は、ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳ（配列番号８）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳ（配列番号１１）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＴＩＮ（配列番号１５）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＦＷ３ｂは、ＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬ（配列番号１９）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインＦＷ４は、ＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号２１）を含む。
【0224】
本発明のこの態様に従うと、ＦＷ１は、－／Ｄ Ａ／Ｉ／Ｔ Ｓ／Ｑ／Ｒ Ｖ／Ｍ Ｎ／Ｔ／Ｄ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｖ Ｌ／Ｖ Ｔ／Ｒ Ｄ／Ｇ Ｔ／Ａ／Ｓ（配列番号１）に従った１つまたは複数のヒト化配列を含む。しかし、代替的な態様において、ＦＷ１の配列は規定されておらず、ライブラリーは、あるいは、以下の１つまたは複数によって特徴付けされる：
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った１つまたは複数の配列を含む。
ＦＷ２は、Ｔ Ｓ／Ｙ Ｗ Ｆ／Ｙ Ｒ／Ｑ Ｋ／Ｑ Ｎ／Ｋ Ｐ／Ｓ Ｇ Ｔ／Ｓ（配列番号２）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ａは、Ｇ Ｒ Ｙ／Ｆ Ｖ／Ｓ Ｅ／Ｇ Ｓ／Ｔ Ｖ／Ｇ／Ｉ Ｎ／Ｓ（配列番号３）に従った１つまたは複数の配列を含み、
ＦＷ３ｂは、Ｆ Ｓ／Ｔ Ｌ Ｒ／Ｔ Ｉ Ｋ／Ｓ／Ｎ Ｄ／Ｓ Ｌ Ｔ／Ｑ Ｖ／Ｐ Ａ／Ｅ Ｄ Ｓ／Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ｙ Ｙ／Ｒ／Ｉ Ｃ Ｋ／Ｒ／Ａ Ａ／Ｓ／Ｌ（配列番号４）に従った１つまたは複数の配列を含む。
【0225】
この代替的な態様では、典型的には、ＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、およびＦＷ３ｂ配列の１つまたは複数がヒト化されている。ヒト化されたＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、およびＦＷ３ｂ配列は、任意のヒト化されたＦＷ２配列、ＦＷ３ａ配列、ＦＷ３ｂ配列、およびＦＷ４配列、または本明細書において開示されている配列であり得る。
【0226】
本発明は、多価のまたは多重特異的な実体に組み合わせられる能力を有するＶＮＡＲドメイン配列に関するものであり、このマルチドメイン実体において、各ドメインは結合機能を保持している。マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子は、二価または多価のＶＮＡＲであり得る。
【0227】
マルチドメイン特異的結合分子は、１つまたは複数の特異的抗原の同一のまたは異なるエピトープに結合する２つ以上のＶＮＡＲドメインを含み得る。
【0228】
ある特定の好ましい実施形態において、本発明の第１の態様のマルチドメイン特異的結合分子におけるＶＮＡＲは、特異的抗原上の同一の抗原を結合する。
【0229】
さらに好ましい実施形態において、マルチドメイン特異的結合分子のＶＮＡＲは、特異的抗原上の異なるエピトープを結合する。これらの実施形態に従ったマルチドメイン特異的結合分子は、本明細書においてさらに記載されるように、バイパラトピック分子と呼ぶことができる。
【0230】
一実施形態において、特異的ＶＮＡＲ結合ドメイン配列は、多価のまたは多重特異的な実体に組み合わされ、このマルチドメイン実体において、各ドメインは結合機能を保持しており、ここで、結合ドメインは、単一抗原上の異なるエピトープを認識する。
【0231】
一実施形態において、マルチドメイン特異的結合分子内のＶＮＡＲドメインの少なくとも１つは、その標的に対して、単量体ＶＮＡＲよりも高い結合親和性を示す。
【0232】
一実施形態において、少なくとも２つのＶＮＡＲドメインは、１つの特異的抗原の同一のまたは異なるエピトープに結合する。
【0233】
一実施形態において、少なくとも２つのＶＮＡＲドメインは、１つの特異的抗原の異なるエピトープに結合する。
【0234】
一実施形態において、少なくとも２つのＶＮＡＲドメインはそれぞれ、異なる特異的抗原に結合する。
【0235】
本発明の好ましい実施形態は、２つの（またはそれを超える）異なるＶＮＡＲドメインを含む二重特異的または多重特異的な結合分子であり、当該分子において、結合特異性は、単一の特異的抗原上の異なるエピトープに対するものであり、得られた実体は、個々のＶＮＡＲ結合ドメインよりも改善した特性を示す。改善した特性の例としては、単量体ＶＮＡＲと比較して増大したアゴニスト性またはアンタゴニスト性の影響が含まれる。
【0236】
好ましくは、本発明のマルチドメイン特異的結合分子のＶＮＡＲドメインは、スペーサー配列によって離されている。さらに好ましくは、スペーサー配列は独立した機能性を有しており、当該機能性は結合分子において示される。一実施形態において、スペーサー配列は、ＶＮＡＲドメインまたはその機能的断片である。具体的な例において、スペーサー配列は、限定されないがヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含む、免疫グロブリンのＦｃ部分であり得る。改善した特性は、部分的にまたは完全に、スペーサーの特性に由来し得、これは例えば、ＶＮＡＲドメインを受動的に空間的に離すこと、または得られた実体のインビボでの半減期を延ばし得る血清アルブミン結合などのスペーサーの固有の特性、またはＩＣＯＳＬなどの第２の治療的自己免疫標的の認識、または免疫グロブリンＦｃ領域のケースでは、細胞と契合するための免疫系もしくは補体の能力の導入による。
【0237】
スペーサー配列によって離された２つ以上のＶＮＡＲドメインを含む、本発明のマルチドメイン特異的結合分子の実施形態は、本明細書において、Ｑｕａｄ－Ｘフォーマットと呼ばれ得る。好ましくは、マルチドメイン特異的結合分子は、免疫グロブリンＦｃ領域に由来する、スペーサー配列によって離された２つ以上のＶＮＡＲドメインを含む。
【0238】
他の実施形態において、マルチドメイン特異的結合分子は、１つまたは複数の非ＶＮＡＲドメインをさらに含み得る。１つまたは複数の非ＶＮＡＲドメインは、ＶＮＡＲドメインに対する任意の位置に置くことができる。典型的には、および好ましい実施形態において、非ＶＮＡＲドメインは、ＶＮＡＲドメインのＣ末端側またはＮ末端側となる。
【0239】
ＶＮＡＲドメインのＣ末端側またはＮ末端側にある２つ以上のＶＮＡＲドメインおよび１つの非ＶＮＡＲドメインを含む本発明のマルチドメイン特異的結合分子の実施形態は、本明細書において、Ｑｕａｄ－Ｙフォーマットと呼ばれ得る。
【0240】
典型的な非ＶＮＡＲドメインとしては、限定されないが、ＴＮＦ Ｒ１および免疫グロブリンＦｃが含まれる。
【0241】
特異的抗原は、サイトカイン、増殖因子、酵素、細胞表面結合分子、細胞表面膜構成要素、細胞内分子、細胞外マトリクス構成要素、間質抗原、血清タンパク質、骨格抗原、微生物抗原、または通常は免疫特権のある位置に由来する抗原を含む群に由来し得る。
【0242】
本発明のさらなる態様は、サイトカインを認識するＶＮＡＲ結合ドメインの特異的組み合わせである。
【0243】
また、ヒトＴＮＦを認識し、疾患を処置するために現在使用されている全ての他の良く特徴付けされた抗ＴＮＦ抗体およびＶＨＨバインダーと異なるエピトープに結合する、特異的ドメインも、本発明によって提供される。
【0244】
一実施形態において、ＶＮＡＲドメインの１つまたは複数は、以下のＣＤＲおよび超可変領域（ＨＶ）を含むＴＮＦ－アルファ特異的ＶＮＡＲ結合ドメインである：
ＣＤＲ１：ＨＣＡＴＳＳ（配列番号２９）またはＮＣＧＬＳＳ（配列番号３０）またはＮＣＡＬＳＳ（配列番号３１）
ＨＶ２：ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ（配列番号３２）
ＨＶ４：ＳＧＳＫＳ（配列番号３３）またはＥＧＳＫＳ（配列番号３４）
ＣＤＲ３：ＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶ（配列番号３５）またはＳＷＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶ（配列番号３６）またはＹＩＰＣＩＤＥＬＶＹＭＩＳＧＧＴＳＧＰＩＨＤＶ（配列番号３７）。
ＣＤＲ１：ＨＣＡＴＳＳ（配列番号２９）またはＮＣＧＬＳＳ（配列番号３０）またはＮＣＡＬＳＳ（配列番号３１）
ＨＶ２：ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ（配列番号３２）
ＨＶ４：ＳＧＳＫＳ（配列番号３３）またはＥＧＳＫＳ（配列番号３４）
ＣＤＲ３：ＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶ（配列番号３５）またはＳＷＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶ（配列番号３６）またはＹＩＰＣＩＤＥＬＶＹＭＩＳＧＧＴＳＧＰＩＨＤＶ（配列番号３７）。
【0245】
マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子は、第１のＶＮＡＲドメインおよび第２のＶＮＡＲドメインを含み得、ここで、
第１のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ１は、ＨＣＡＴＳＳ（配列番号２９）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＨＶ２は、ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ（配列番号３２）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＨＶ４は、ＳＧＳＫＳ（配列番号３３）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ３は、ＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶ（配列番号３５）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ１は、ＮＣＧＬＳＳ（配列番号３０）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＨＶ２は、ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ（配列番号３２）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＨＶ４は、ＥＧＳＫＳ（配列番号３４）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ３は、ＳＷＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶ（配列番号３６）を含む。
第１のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ１は、ＨＣＡＴＳＳ（配列番号２９）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＨＶ２は、ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ（配列番号３２）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＨＶ４は、ＳＧＳＫＳ（配列番号３３）を含み、
第１のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ３は、ＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶ（配列番号３５）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ１は、ＮＣＧＬＳＳ（配列番号３０）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＨＶ２は、ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ（配列番号３２）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＨＶ４は、ＥＧＳＫＳ（配列番号３４）を含み、
第２のＶＮＡＲドメインのＣＤＲ３は、ＳＷＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶ（配列番号３６）を含む。
【0246】
一実施形態において、第１のＶＮＡＲドメインは、配列ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳＨＣＡＴＳＳＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号３８）を含み、第２のＶＮＡＲドメインは、配列ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳＮＣＧＬＳＳＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＩＮＥＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬＳＷＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号３９）を含む。
【0247】
一実施形態において、マルチドメイン抗原特異的抗原結合分子は、配列：ＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳＨＣＡＴＳＳＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＳＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＲＤＳＮＣＧＬＳＳＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＩＮＥＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＳＧＴＹＲＣＫＬＳＷＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶＹＧＧＧＴＶＶＴＶＮ（配列番号５９）を含み得る。
【0248】
好ましい実施形態において、本発明のＴＮＦ－アルファ特異的ＶＮＡＲドメインは、特異的抗原上の特異的エピトープに対する機能的結合活性を保持しながら、インビボでの免疫原性の可能性を低減させるために、例えば、ヒト化、脱免疫化、または類似の技術によって、１つまたは複数のアミノ酸配列位置で修飾されている。
【0249】
本明細書において記載されるＴＮＦ－アルファ特異的ＶＮＡＲ結合ドメインは、本発明のマルチドメイン特異的結合分子において一方または両方のＶＮＡＲドメインとして使用され得る。
【0250】
抗原特異的抗原結合分子は、本明細書において記載される分子を生成するためのプロセスの際に精製および／または単離を促進し得る、使用の前に切断される追加のＮ末端配列またはＣ末端配列を含み得る。例えば、（Ａｌａ）３（Ｈｉｓ）６が分子のＣ末端にある。
【0251】
いくつかの、例えば５から１０個の、または１から５個の、または１から３、２、１、もしくは０個のアミノ酸残基が任意の組み合わせで置換されているか、欠失しているか、または付加されているタンパク質のアミノ酸配列を有する、バリアント、類似体、誘導体、および断片もまた、本発明に含まれる。これらの間で特に好ましいものは、本発明のタンパク質の特性および活性を改変しない、サイレントな置換、付加、および欠失である。これに関連して同様に特に好ましいものは、本発明のタンパク質の特性が元の形態と比較してバリアント形態で保存される、保存的な置換である。バリアントにはまた、本発明に従った抗原特異的抗原結合分子を含む融合タンパク質も含まれる。
【0252】
上述したように、本発明のバリアントの例には、１つまたは複数のアミノ酸が１つまたは複数の他のアミノ酸で置換されているタンパク質が含まれる。当業者であれば、様々なアミノ酸が類似の特性を有していることを認識している。物質の１つまたは複数のこのようなアミノ酸は、その物質の所望の活性に干渉することも当該活性を排除することもなく、１つまたは複数の他のこのようなアミノ酸によって置換され得ることが多い。このような置換は、「非保存的な」アミノ酸置換と呼ぶことができる。
【0253】
したがって、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、しばしば互いに置換され得る（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの考えられる置換のうち、グリシンおよびアラニンが互いの置換に使用されること（これらは比較的短い側鎖を有するため）、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが互いの置換に使用されること（これらは、疎水性の、より大きな脂肪族側鎖を有するため）が好ましい。しばしば互いに置換され得る他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびにシステインおよびメチオニン（硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸）が含まれる。この性質の置換は、「保存的な」または「半保存的な」アミノ酸置換と呼ばれることが多い。
【0254】
アミノ酸の欠失または挿入はまた、上記で言及した融合タンパク質のアミノ酸配列に対して行うことができる。したがって、例えば、ポリペプチドの活性にあまり影響しない、またはこのような活性を少なくとも排除しないアミノ酸を、欠失させることができる。このような欠失は、活性を依然として保持しながらポリペプチドの全体的な長さおよび分子量を低減させ得るため、有利であり得る。これは、特定の目的に必要なポリペプチドの量を低減させることを可能にし得、例えば、投与量レベルを低減させることができる。
【0255】
上記の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸の挿入もまた行うことができる。これは、本発明の物質の特性を改変するため（例えば、融合タンパク質に関して上記で説明したように、同定、精製、または発現を促進するため）に行うことができる。
【0256】
本発明の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸の変化は、任意の適切な技術を使用して、例えば、部位特異的突然変異生成を使用することによって、行うことができる。
【0257】
本発明の範囲内のアミノ酸の置換または挿入が天然に生じるまたは非天然のアミノ酸を使用して行われ得ることが理解される。天然アミノ酸または合成アミノ酸が使用されているかどうかに関わらず、Ｌ－アミノ酸のみが存在していることが好ましい。
【0258】
本発明に従ったタンパク質は、追加のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸配列を有し得る。このような配列は、様々な理由で、例えばグリコシル化のために提供され得る。
【0259】
融合タンパク質は、融合タンパク質に構造要素を提供する異種のペプチド配列またはタンパク質配列に融合している本発明の抗原特異的抗原結合分子を含み得る。他の実施形態において、融合タンパク質は、生物学的活性を有する分子、すなわち、薬理学的に有用な活性を有する治療用タンパク質に融合している本発明の抗原特異的抗原結合分子を含み得る。当該分子は、ペプチド配列もしくはタンパク質配列、または別の生物学的に活性な分子であり得る。
【0260】
例えば、抗原特異的抗原結合分子は、ポリアミノ酸配列、例えば、複数のヒスチジン残基もしくは複数のリジン残基（適切には、２、３、４、５、もしくは６残基）、または免疫グロブリンドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）であり得る、異種ペプチド配列に融合していてよい。
【0261】
異種ペプチド配列への言及には、マウスおよびヒトなどの他の哺乳動物種に由来する配列、ならびに他のＶＮＡＲドメインに由来する任意の異種ペプチド配列が含まれる。
【0262】
融合タンパク質が、生物学的活性を有する分子と融合している本発明の抗原特異的抗原結合分子を含む場合、生物学的に活性な部分は、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質、例えば、酵素、免疫グロブリン、サイトカイン、またはこれらの断片であり得る。あるいは、生物学的に活性な分子は、抗生物質、抗がん剤、ＮＳＡＩＤ、ステロイド、鎮痛剤、毒素、または他の薬学的に活性な薬剤であり得る。抗がん剤には、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤が含まれ得る。
【0263】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、別の免疫グロブリン可変領域もしくは定常領域または本発明の別の抗原特異的抗原結合分子に融合している、本発明の抗原特異的抗原結合分子を含み得る。言い換えると、本発明の抗原特異的抗原結合分子の融合体は、可変の長さのもの、例えば、二量体、三量体、四量体、または高次多量体（すなわち、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体、またはそれを超えるもの）であり得る。具体的な実施形態において、これは、単量体ＶＮＡＲサブユニットの多量体となり得る。
【0264】
例えば、ＶＮＡＲ ＣＤＲが追加のペプチド配列に融合している場合、当該追加のペプチド配列は、ウイルス粒子または細胞の表面上の１つまたは複数の融合ポリペプチドの相互作用をもたらし得る。これらのペプチド配列は、したがって、「二量体化ドメイン」と呼ぶことができる。二量体化ドメインは、二量体化配列の少なくとも１つもしくは複数、またはシステイン残基を含む少なくとも１つの配列、あるいはこれらの両方を含み得る。適切な二量体化配列としては、疎水性の残基が規則的な間隔を有しており、各タンパク質の疎水性残基の相互作用による二量体の形成を可能にする、両親媒性のアルファヘリックスを有するタンパク質の二量体化配列が含まれる。このようなタンパク質およびタンパク質の部分としては、例えば、ロイシンジッパー領域が含まれる。
【0265】
二量体化ドメインはまた、１つまたは複数のシステイン残基（例えば、二量体化ドメインに抗体ヒンジ配列を含めることによってもたらされる）も含み得る。システイン残基は、１つまたは複数のジスルフィド結合の形成による二量体化をもたらし得る。停止コドンが二量体化ドメインの後ろに存在する一実施形態において、二量体化ドメインは、少なくとも１つのシステイン残基を含む。二量体化ドメインは、好ましくは、抗体可変ドメインまたは定常ドメインとウイルス外被タンパク質の構成要素との間に位置する。
【0266】
本発明の融合タンパク質において、抗原特異的抗原結合分子は、リンカー部分を介して融合タンパク質の他のエレメントに直接的に融合または連結していてよい。リンカーは、ペプチド、ペプチド核酸、またはポリアミド結合であり得る。適切なペプチドリンカーとしては、複数のアミノ酸残基、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個のアミノ酸、例えば、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ、（Ｇｌｙ）４（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）４、またはこれらの組み合わせもしくはこれらの多量体（例えば、二量体、三量体、もしくは四量体、もしくはそれを超えるもの）が含まれ得る。例えば、適切なリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３であり得る。代替的なリンカーとしては、（Ａｌａ）３（Ｈｉｓ）６またはその多量体が含まれる。ＨＧＭＰによって提供されているＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを使用して、それに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列も含まれる。
【0267】
一部のケースでは、ベクターは、外被タンパク質に融合した単一のＶＮＡＲ－ファージポリペプチドをコードする。これらのケースでは、ベクターは、ある特定のプロモーターの制御下で１つの転写産物を発現する「モノシストロン性」であると考えられる。
【0268】
このようなベクターの例示的な例は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、またはＶＮＡＲ領域をコードするモノシストロン性配列の発現を進めるためのＴａｃプロモーターと、ドメイン間のリンカーペプチドとを利用する。シストロン性配列は、その５’末端で、大腸菌のｍａｌＥまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に接続していてよく、また、その３’末端で、ウイルス外被タンパク質の全てまたは一部（例えば、ｐＩＩＩタンパク質）に接続していてよい。ベクターは、その３’末端で、第２の可変ドメイン配列とウイルス外被タンパク質配列との間に、二量体化ドメイン（ロイシンジッパーなど）をコードする配列をさらに含み得る。二量体化ドメインを含む融合ポリペプチドは、二量体化して、２つのポリペプチドの複合体を形成することができる。
【0269】
他のケースでは、ＶＮＡＲ配列（複数のＶＮＡＲ配列または断片）は、別々のポリペプチドとして発現され得、ベクターは、したがって、「２シストロン性」であり得、別々の転写産物の発現を可能にする。これらのベクターにおいて、ＰｔａｃプロモーターまたはＰｈｏＡプロモーターなどの適切なプロモーターを、２シストロン性のメッセージの発現を行わせるために使用することができる。例えば第１のＶＮＡＲ配列をコードする第１のシストロンは、５’末端で、大腸菌のｍａｌＥまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に接続していてよく、また、３’末端で、ｇＤタグをコードする核酸配列に接続していてよい。例えば第２のＶＮＡＲ配列をコードする第２のシストロンは、その５’末端で、大腸菌のｍａｌＥまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に接続していてよく、また、３’末端で、ウイルス外被タンパク質の全てまたは一部に接続していてよい。
【0270】
例となるベクターは、適切なプロモーター、例えば、５’末端で大腸菌のｍａｌＥまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に作動可能に連結しており、また３’末端で、ｇＤタグをコードする核酸配列に作動可能に連結している、ＶＮＡＲ配列をコードする第１のシストロンの発現を進める、ＰｔａｃプロモーターまたはＰｈｏＡ（ＡＰ）プロモーターを含み得る。第２のシストロンは、例えば、５’末端で大腸菌のｍａｌＥまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に作動可能に連結しており、また、３’末端で、ＩｇＧヒンジ配列およびロイシンジッパー配列を含む二量体化ドメインと、それに続く、ウイルス外被タンパク質の少なくとも一部とを有している、別のＶＮＡＲ配列をコードする。
【0271】
ＶＮＡＲ配列の融合ポリペプチドは、細胞、ウイルス、またはファージミド粒子の表面上で、様々なフォーマットで提示され得る。これらのフォーマットには、一本鎖断片およびこれらの断片の多価形態が含まれる。多価形態は、二量体、またはそれを超える多量体であり得る。提示の多価形態は、これら形態が２つ以上の抗原結合部位を有し、これによって、親和性が低いクローンが一般に同定され、また、選択プロセスの際に、稀なクローンのより効率的な選別が可能となるため、都合が良い場合がある。
【0272】
本発明に従って記載されているように構築されたベクターは、増幅および／または発現のために宿主細胞に導入される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、およびこれらに類するものを含む標準的な形質転換方法を使用して宿主細胞に導入することができる。ベクターがウイルスなどの感染性粒子である場合、ベクター自体が、宿主細胞内への進入のための備えを有している。遺伝子融合体をコードする複製可能な発現ベクターを有する宿主細胞のトランスフェクション、および標準的な手順に従ったファージ粒子の生成は、融合タンパク質がファージ粒子の表面に提示されているファージ粒子を生じさせる。
【0273】
複製可能な発現ベクターは、様々な方法を使用して宿主細胞に導入される。一実施形態において、ベクターは、使用して細胞に導入され得る。細胞は、標準的な培養液中における培養で、場合によって約３７℃で約６～４８時間（またはＯＤ６００＝０．６～０．８になるまで）培養され増殖し、次いで、培養液が遠心分離され、上清が除去される（例えば、デカンテーションされる）。最初の精製は、好ましくは、緩衝溶液（例えば、１．０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中での細胞ペレットの再懸濁と、その後の再遠心分離、および上清の除去によって行われる。得られた細胞ペレットは、希釈されたグリセロール（例えば、５～２０％ｖ／ｖ）中に再懸濁され、細胞ペレットを形成するために再び再遠心分離され、そして上清が除去される。最終細胞濃度は、細胞ペレットを水または希釈されたグリセロール中に所望の濃度まで再懸濁することによって得られる。
【0274】
エレクトロポレーションの際の、より高いＤＮＡ濃度の使用は、形質転換効率を増大させ（約１０倍）、宿主細胞に形質転換されるＤＮＡの量を増大させる。高い細胞濃度の使用はまた、効率も増大させる（約１０倍）。移入されるＤＮＡの量が多いほど、より大きな多様性を有し、より多くの数の固有のコンビナトリアルライブラリーメンバーを表す、より大きなライブラリーが得られる。形質転換された細胞は、抗生物質を含有する培地での増殖によって一般に選択される。
【0275】
方法論におけるその様々な順列およびバリエーションを伴う、標的抗原バインダーを同定するためのファージディスプレイの使用は、当技術分野において良く確立されている。１つのアプローチは、融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合体に作動可能に連結している転写調節エレメントを有する複製可能なバリアントベクターのファミリーを構築すること、適切な宿主細胞を形質転換すること、形質転換された細胞を培養して、表面上に融合ポリペプチドを提示しているファージ粒子を形成すること、その後の、組換えファージ粒子を標的抗原と接触させて、粒子集団の少なくとも一部を標的に結合させる、選択プロセスにおいて結合しない粒子のサブセットよりも結合する粒子のサブセットを増大させ、豊富にするという目的を有する選択または選別を伴うプロセスを伴う。選択されたプールは、異なるまたは同一のストリンジェンシーを用いる同一の標的での別の選別ラウンドのために宿主細胞を感染させることによって増幅することができる。得られたバリアントプールは次いで、標的抗原に対してスクリーニングされて、新規な高い親和性の結合タンパク質が同定される。
【0276】
これらの新規な高い親和性の結合タンパク質は、アンタゴニストもしくはアゴニストとしての治療剤として、ならびに／または診断試薬および研究試薬として有用であり得る。
【0277】
バリアントアミノ酸を含む抗体可変ドメインなどの融合ポリペプチドは、ファージ、ファージミド粒子、または細胞の表面上に発現させることができ、次いで、融合ポリペプチド群のメンバーの、典型的には目的の抗原である標的抗原を結合する能力について、選択および／またはスクリーニングすることができる。
【0278】
このような融合タンパク質は、宿主細胞または無細胞システムにおける発現による組換え技術を含む任意の適切な経路によって、ならびに化学的合成経路によって、準備することができる。
【0279】
ライブラリーメンバーの選択
標的へのバインダーを選択するプロセスにはまた、ファージ上に提示されている抗体または抗体断片に結合するプロテインＬまたはタグ特異的抗体などの、抗体可変ドメインに対する親和性を有する一般的タンパク質の選別が含まれ得、これは、正しくフォールディングした抗体断片（融合ポリペプチド）を提示するライブラリーメンバーを豊富にするために使用することができる。
標的へのバインダーを選択するプロセスにはまた、ファージ上に提示されている抗体または抗体断片に結合するプロテインＬまたはタグ特異的抗体などの、抗体可変ドメインに対する親和性を有する一般的タンパク質の選別が含まれ得、これは、正しくフォールディングした抗体断片（融合ポリペプチド）を提示するライブラリーメンバーを豊富にするために使用することができる。
【0280】
受容体などの標的タンパク質は、天然の由来源から単離することができるか、または当技術分野において公知の手順による組換え方法によって準備することができる。標的抗原には、治療上興味深い多くの分子が含まれ得る。
【0281】
考えられる、親和性について選択（選別）するための２つの主要な戦略は、（ｉ）固体担体方法またはプレート選別または固定標的選別、および（ｉｉ）溶液結合方法である。
【0282】
固体担体方法では、標的タンパク質は、当技術分野において公知の適切な固体または半固体マトリクス、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリルコポリマー、ヒドロキシアルキルメタクリレートゲル、ポリアクリルコポリマーおよびポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性担体およびイオン性担体などに付着させてもよい。
【0283】
標的抗原をマトリクスに付着させた後、固定された標的を、ファージ粒子集団の少なくとも一小集団と固定された標的抗原との結合に適した条件下で、融合ポリペプチドを発現しているライブラリーと接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度、およびこれらに類するものを含む条件は、生理学的状態を模倣する。固定された標的に結合した粒子（「バインダー」）を、洗浄によって、標的に結合していない粒子から分離する。洗浄条件は、高い親和性のバインダー以外の全てが除去されるように調整することができる。バインダーは、様々な方法によって、固定された標的から解離することができる。これらの方法としては、野生型リガンド（例えば、過剰な標的抗原）を使用する競合的解離、ｐＨおよび／またはイオン強度の変更、ならびに当技術分野において公知の方法が含まれる。バインダーの選択は、典型的には、０．１ＭのＨＣｌのような酸またはリガンドなどの適切な溶出材料を用いる、親和性マトリクスからの溶出を伴う。増大濃度のリガンドでの溶出は、親和性が増大している提示された結合分子を溶出することができる。
【0284】
バインダーを単離し、次いで、バインダーであるウイルス粒子（および、必要に応じて、例えば、ウイルス粒子がファージミド粒子である場合には、ヘルパーファージ）を細胞に感染させることによって、適切な宿主細胞において再増幅させることができ、そして、宿主細胞を、所望の融合ポリペプチドを提示する粒子の増幅に適した条件下で培養する。ファージ粒子を次いで回収し、選択プロセスを、標的抗原のバインダーがある程度豊富になるまで、１回または複数回反復する。任意のラウンド数の選択または選別を利用することができる。選択手順または選別手順の１つは、プロテインＬなどの一般的親和性タンパク質に結合するバインダー、または提示されているポリペプチドに存在しているポリペプチドタグに対する抗体、例えば、ｇＤタンパク質もしくはポリヒスチジンタグに対する抗体の単離を伴い得る。
【0285】
別の選択方法は「溶液結合方法」であり、これは、従来の溶液選別方法よりも向上した効率での溶液相の選別を可能にする。溶液結合方法は、ランダムライブラリーからオリジナルバインダーを見出すため、または特定の結合クローンもしくはクローン群の親和性を向上させるために指定されたライブラリーから、改善されたバインダーを見出すために使用されている。この方法は、複数のポリペプチド、例えばファージまたはファージミド粒子（ライブラリー）上に提示されている複数のポリペプチドを、タグ分子で標識されたまたはタグ分子と融合している標的抗原と接触させるステップを含む。タグは、それに対して特異的バインダーが利用可能である、ビオチンまたは他の部分であり得る。溶液相のストリンジェンシーは、第１の溶液結合相における標識された標的抗原の濃度の低下を使用することによって、変化させることができる。
【0286】
ストリンジェンシーをさらに増大させるために、第１の溶液結合相の次に第２の溶液相が続いてよく、この第２の溶液相は、第１の溶液相における標識された標的との最初の結合の後の、高濃度の未標識標的抗原を有している。通常、標識された標的の１００から１０００倍の未標識標的が、第２の相（含まれる場合）において使用される。第１の溶液相のインキュベーション時間の長さは、平衡に達するまで、数分間から１～２時間、またはそれを超える時間で変化し得る。この第１の相において、より短い結合時間を使用すると、会合速度の速いバインダーに偏り得るか、または当該バインダーが選択され得る。第２の相におけるインキュベーションの時間の長さおよび温度は、ストリンジェンシーを増大させるように変化させることができる。これによって、標的から離れる速度（解離速度）が遅いバインダーに対する選択バイアスが生じる。
【0287】
複数のポリペプチド（ファージ／ファージミド粒子上に提示されている）を標的抗原と接触させた後、標識された標的に結合しているファージまたはファージミド粒子を、結合していないファージから分離する。結合の溶液相から得た粒子－標的混合物を、標識された標的部分と接触させ、標識された標的部分を結合する分子に前記混合物を短時間（例えば、２～５分間）にわたり結合させることによって、前記混合物を単離する。標識された標的抗原の最初の濃度は、約０．１ｎＭから約１０００ｎＭの範囲であり得る。結合した粒子を溶出し、次の選別ラウンドのために増殖させてもよい。各選別ラウンドでより低い濃度の標識された標的抗原を使用する、複数の選別ラウンドが好ましい。
【0288】
例えば、約１００から２５０ｎＭの標識された標的抗原を使用する最初の選別または選択は、広範な親和性を捕捉するために十分であるべきだが、この因子は、経験的におよび／または医師の希望に沿うように決定することができる。第２の選択ラウンドにおいて、約２５から１００ｎＭの標識された標的抗原が使用され得る。第３の選択ラウンドにおいて、約０．１から２５ｎＭの標識された標的抗原が使用され得る。例えば、１００ｎＭのバインダーの親和性を向上させるために、２０ｎＭで開始し、次いで５および１ｎＭの標識された標的に進み、次いでその後に、約０．１ｎＭなどのさらに低い濃度の標識された標的抗原とすることが望ましい場合がある。
【0289】
本明細書において記載されるように、固体担体方法および溶液選別方法の組み合わせが、所望の特徴を有するバインダーを単離するために有利に使用され得る。数ラウンドにわたり標的抗原を選択／選別した後、選択されたプールに由来する個々のクローンのスクリーニングが、所望の特性／特徴を有する特異的バインダーを同定するために一般に行われる。好ましくは、スクリーニングプロセスは、ライブラリー候補のハイスループットスクリーニングを可能にする自動システムによって行われる。
【0290】
２つの主要なスクリーニング方法が以下に記載される。しかし、他の方法もまた使用可能である。第１のスクリーニング方法は、固定された標的抗原を用いるファージＥＬＩＳＡアッセイを含み、これは、非結合クローンからの特異的結合クローンの同定をもたらす。特異性は、標的でコーティングされたウェルおよびＢＳＡまたは他の非標的タンパク質でコーティングされたウェルでのクローンの同時のアッセイによって決定することができる。このアッセイは、ハイスループットスクリーニングのために自動化可能である。
【0291】
一実施形態は、複数のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製するステップ、ライブラリーを、結合に適した条件下で、標的抗原および少なくとも１つの非標的抗原と接触させるステップ、ライブラリー内のポリペプチドバインダーを非バインダーから分離するステップ、標的抗原に結合し、非標的抗原には結合しないバインダーを同定するステップ、標的抗原からバインダーを溶出するステップ、ならびに特異的抗原に結合するポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅するステップによる、特異的標的抗原に結合する抗体可変ドメインを抗体可変ドメインのライブラリーから選択する方法を提供する。
【0292】
第２のスクリーニングアッセイは、本願において具現化されている発明であり、これは、ハイスループットな様式で、低い親和性を有するクローンからの高い親和性を有するクローンのスクリーニングを提供する、親和性スクリーニングアッセイである。このアッセイにおいて、各クローンは、ある特定の濃度の標的抗原との一定時間にわたる（例えば３０～６０分間にわたる）第１のインキュベーションを伴っておよび伴わずにアッセイされ、その後、標的でコーティングされたウェルに短時間（例えば５～１５分間）アプライされる。次いで、結合したファージは、通常のファージＥＬＩＳＡ方法によって、例えば、抗Ｍ１３ ＨＲＰコンジュゲートを使用して測定される。一方のウェルは標的とプレインキュベートされており、他方のウェルは標的抗原とプレインキュベートされていない、２つのウェルの結合シグナルの比率は、親和性の指標である。第１のインキュベーションでの標的の濃度の選択は、目的の親和性範囲に応じる。例えば、１０ｎＭより高い親和性を有するバインダーが望ましい場合、第１のインキュベーションにおいて１０００ｎＭの標的が使用されることが多い。バインダーが特定の選別（選択）ラウンドから見出されると、これらのクローンを、より高い親和性を有するバインダーを同定するために、親和性スクリーニングアッセイでスクリーニングすることができる。
【0293】
上記の選別／選択方法のうちのいずれかの組み合わせを、スクリーニング方法と組み合わせることができる。例えば、一実施形態において、ポリペプチドバインダーは、固定された標的抗原への結合について最初に選択される。
【0294】
固定された標的抗原に結合するポリペプチドバインダーを次いで増幅し、標的抗原への結合についておよび非標的抗原への結合の欠如についてスクリーニングすることができる。標的抗原に特異的に結合しているポリペプチドバインダーが増幅される。これらのポリペプチドバインダーを次いで、ある濃度の標識された標的抗原と接触させて複合体を形成することによって、より高い親和性について選択することができ、ここで、標識された標的抗原の濃度範囲は約０．１ｎＭから約１０００ｎＭであり、複合体は、標的抗原上の標識に結合する薬剤と接触させることによって単離される。ポリペプチドバインダーを次いで、標識された標的抗原から溶出し、場合によって、選択ラウンドを反復し、毎回、より低い濃度の標識された標的抗原が使用される。この選択方法を使用して単離された高い親和性のポリペプチドバインダーを、次いで、例えば溶液相ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、高い親和性についてスクリーニングすることができる。
【0295】
バインダーが標的抗原への結合によって同定された後、核酸を抽出することができる。抽出されたＤＮＡを次いで、大腸菌宿主細胞を形質転換するために直接使用することができるか、またはあるいは、適切なプライマーを用いるＰＣＲを例えば使用してコード配列を増幅し、典型的なシーケンシング方法によってシーケンシングすることができる。バインダーの可変ドメインＤＮＡを制限酵素消化し、その後、タンパク質発現のためにベクターに挿入することができる。
【0296】
一部の実施形態において、本発明のポリペプチドを含むライブラリーは複数の選別ラウンドにかけられ、ここで、各選別ラウンドは、前のラウンドで得られたバインダーを前のラウンドの標的抗原とは異なる標的抗原と接触させるステップを含む。
【0297】
本発明の別の態様は、特異的標的抗原、例えば、成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、インスリン様増殖因子、ｎ－メチオニルヒト成長ホルモンを含むヒト成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、アミリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、造血成長因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子、ミュラー管阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ポリペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、神経増殖因子、例えばＮＧＦベータ、インスリン様増殖因子－ＩおよびＩＩ、エリスロポエチン、骨誘導因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、骨形成タンパク質、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＦＬＴ－３リガンド、ならびにｋｉｔリガンドに対する高い親和性のバインダーを選択するための方法を提供する。
【0298】
本発明の方法は、１つまたは複数の多様化されたＣＤＲ領域を有するポリペプチド（例えば、抗原特異的抗原結合分子）のライブラリーを提供する。これらのライブラリーは、標的抗原に対する高い親和性のバインダーを同定するために選別（選択）および／またはスクリーニングされる。一態様において、ライブラリー由来のポリペプチドバインダーは、標的抗原への結合について、および親和性について選択される。これらの選択戦略の１つまたは複数を使用して選択されたポリペプチドバインダーは次いで、親和性についておよび／または特異性（標的抗原にのみ結合し、非標的抗原には結合しない）についてスクリーニングされ得る。
【0299】
一方法は、１つまたは複数の多様化されたＣＤＲ領域を有する複数のポリペプチドを生成するステップ、当該複数のポリペプチドを、結合に適した条件下で標的抗原と接触させることによって、当該複数のポリペプチドを標的抗原へのバインダーのために選別するステップ、標的抗原へのバインダーを、結合していないバインダーから分離するステップ、バインダーを単離するステップ、および高い親和性のバインダーを同定するステップを含む。標的抗原に結合するバインダーの親和性は、本明細書において記載されるものなどの競合ＥＬＩＳＡを使用して決定することができる。場合によって、ポリペプチドは、標的抗原の選別と組み合わせてバインダーを選別するために使用され得る、ｇＤ、ポリｈｉｓ、またはＦＬＡＧなどのポリペプチドタグに融合されていてよい。
【0300】
別の実施形態は、ａ）複数の本発明のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製するステップ、ｂ）ライブラリーと、固定された標的抗原とを、結合に適した条件下で接触させることによって、標的抗原へのポリペプチドバインダーをライブラリーから単離するステップ、ｃ）ライブラリー内のポリペプチドバインダーを非バインダーから分離し、標的抗原からバインダーを溶出するステップ、ｄ）ポリペプチドバインダーを有する複製可能な発現ベクターを増幅するステップ、およびｅ）場合によって、ステップａ～ｄを少なくとも２回反復するステップを含む、標的抗原に結合する抗原特異的抗原結合分子をＶＮＡＲのライブラリーから選択する方法を提供する。
【0301】
本方法は、ｆ）ポリペプチドバインダーを含む増幅された複製可能な発現ベクターを、結合に適した条件下で、０．１ｎＭから１０００ｎＭの範囲の濃度の標識された標的抗原とインキュベートして、混合物を形成するステップ、ｇ）混合物を、標的抗原上の標識に結合する固定された薬剤と接触させるステップ、ｈ）標識された標的抗原に結合したポリペプチドバインダーを分離し、標識された標的抗原からポリペプチドバインダーを溶出するステップ、ｉ）ポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅するステップ、およびｊ）場合によって、毎回、より低い濃度の標識された標的抗原を使用して、ステップｆ）からｉ）を少なくとも２回反復するステップをさらに含み得る。場合によって、本方法は、過剰な未標識標的抗原を混合物に添加するステップ、および標識された標的抗原から親和性の低いバインダーを溶出するために十分な時間にわたりインキュベートするステップを含み得る。
【0302】
別の実施形態は、ａ）複数の本発明のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製するステップ、ｂ）ライブラリーを少なくとも約０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の標的抗原と接触させて、標的抗原へのポリペプチドバインダーを単離するステップ、ｃ）標的抗原からポリペプチドバインダーを分離し、ポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅するステップ、ｄ）場合によって、毎回、低濃度の標的抗原を用いて、ステップａ～ｃを少なくとも２回反復して、最低濃度の標的抗原に結合するポリペプチドバインダーを単離するステップ、ｅ）ポリペプチドバインダーをいくつかの異なる希釈の標的抗原とインキュベートすることによって、最低濃度の標的抗原に結合するポリペプチドバインダーを高い親和性について選択し、ポリペプチドバインダーのＩＣ５０を決定するステップ、およびｆ）約０．１ｎＭから２００ｎＭの標的抗原への親和性を有するポリペプチドバインダーを同定するステップを含む、複製可能な発現ベクターのライブラリーから標的抗原に対する高い親和性のバインダーを単離または選択する方法を提供する。
【0303】
別の実施形態は、ａ）ライブラリーを、結合に適した条件下で、０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度範囲の濃度の標識された標的抗原と接触させて、ポリペプチドバインダーと標識された標的抗原との複合体を形成するステップ、ｂ）複合体を単離し、標識された標的抗原からポリペプチドバインダーを分離するステップ、ｃ）ポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅するステップ、ｄ）場合によって、毎回、より低い濃度の標的抗原を使用して、ステップａ～ｃを少なくとも２回反復するステップを含む、複数の本発明のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーからポリペプチドバインダーを選択するためのアッセイを提供する。
【0304】
場合によって、本方法は、過剰な未標識標的抗原をポリペプチドバインダーと標的抗原との複合体に添加するステップをさらに含み得る。好ましい実施形態において、本方法のステップは２回反復され、第１の選択ラウンドにおける標的の濃度は約１００ｎＭから２５０ｎＭであり、第２の選択ラウンドにおいては約２５ｎＭから１００ｎＭであり、そして第３の選択ラウンドにおいては約０．１ｎＭから２５ｎＭである。
【0305】
本発明はまた、ａ）ライブラリーの第１の試料を、標的抗原へのポリペプチドの結合に適した条件下で、ある濃度の標的抗原とまずインキュベートするステップ、ｂ）ライブラリーの第２の試料を標的抗原なしでインキュベートするステップ、ｃ）第１の試料および第２の試料の各々を、固定された標的抗原へのポリペプチドの結合に適した条件下で、固定された標的抗原と接触させるステップ、ｄ）各試料について、固定された標的抗原に結合したポリペプチドの量を検出するステップ、ｅ）第２の試料から得られた結合したポリペプチドの量に対する第１の試料から得られた結合したポリペプチドの量の比率を計算することによって、標的抗原に対するポリペプチドの親和性を決定するステップを含む、複数の本発明のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーをスクリーニングする方法も含む。
【0306】
本明細書において記載されるように作製されたライブラリーはまた、特異的標的への結合についておよび非標的抗原への結合の欠如についてスクリーニングすることができる。一態様において、別の実施形態は、ａ）複数の本発明のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製するステップ、ｂ）ライブラリーを、結合に適した条件下で、標的抗原および少なくとも１つの非標的抗原と接触させるステップ、ｃ）ライブラリー内のポリペプチドバインダーを非バインダーから分離するステップ、ｄ）標的抗原に結合し、非標的抗原には結合しないバインダーを同定するステップ、ｅ）標的抗原からバインダーを溶出するステップ、ならびにｆ）特異的抗原に結合するポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅するステップを含む、特異的標的抗原に結合する抗体可変ドメインをＶＮＡＲのライブラリーからスクリーニングする方法を提供する。
【0307】
上記の選別／選択方法のうちのいずれかの組み合わせは、スクリーニング方法と組み合わせることができる。例えば、一実施形態において、ポリペプチドバインダーは、固定された標的抗原への結合について最初に選択される。
【0308】
固定された標的抗原に結合するポリペプチドバインダーは次いで増幅し、標的抗原への結合についておよび非標的抗原への結合の欠如についてスクリーニングすることができる。標的抗原に特異的に結合しているポリペプチドバインダーが増幅される。これらのポリペプチドバインダーを次いで、ある濃度の標識された標的抗原と接触させて複合体を形成することによって、より高い親和性について選択することができ、ここで、標識された標的抗原の濃度範囲は約０．１ｎＭから約１０００ｎＭであり、複合体は、標的抗原上の標識に結合する薬剤と接触させることによって単離される。ポリペプチドバインダーを次いで、標識された標的抗原から溶出し、場合によって、選択ラウンドを反復し、毎回、より低い濃度の標識された標的抗原が使用される。この選択方法を使用して単離された高い親和性のポリペプチドバインダーを、次いで、例えば溶液相ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、高い親和性についてスクリーニングすることができる。
【0309】
ＶＮＡＲの単離
ＶＮＡＲドメインは、標的で免疫化されたサメの組織を使用して構築されたファージディスプレイされたライブラリーから得ることができ（Ｄｏｏｌｅｙ，Ｈ．ら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００３．４０（１）：２５～３３頁；Ｎｕｔｔａｌｌ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２００４．５５（１）：１８７～９７頁；およびＤｏｏｌｅｙ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００６．１０３（６）：１８４６～５１頁）、参照によって組み込まれるＷＯ２００３／０１４１６１は、サメを免疫化し、結合ドメインを得るための有用な方法を記載している。
ＶＮＡＲドメインは、標的で免疫化されたサメの組織を使用して構築されたファージディスプレイされたライブラリーから得ることができ（Ｄｏｏｌｅｙ，Ｈ．ら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００３．４０（１）：２５～３３頁；Ｎｕｔｔａｌｌ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２００４．５５（１）：１８７～９７頁；およびＤｏｏｌｅｙ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００６．１０３（６）：１８４６～５１頁）、参照によって組み込まれるＷＯ２００３／０１４１６１は、サメを免疫化し、結合ドメインを得るための有用な方法を記載している。
【0310】
ＶＮＡＲ結合ドメインはまた、ＶＮＡＲ配列を含む合成ライブラリーからも得ることができる。参照によって組み込まれるＷＯ２０１４／１７３９５９は、ＶＮＡＲライブラリーを開発し、結合ドメインを得るための有用な方法を記載している。
【0311】
加えて、ＣＤＲ３に対して標的化された合成多様性を有するライブラリーが、ＶＮＡＲ構造に基づいて結合ドメインを得るために使用され得ることが示されている（Ｎｕｔｔａｌｌ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００１．３８（４）：３１３～２６頁；Ｎｕｔｔａｌｌ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００３．２７０（１７）：３５４３～５４頁；Ｓｈａｏ，Ｃ．Ｙ．ら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７．４４（４）：６５６～６５頁；およびＬｉｕ、Ｊ．Ｌ．ら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００７．７：７８頁；ＷＯ２００５／１１８６２９）。
【0312】
本発明のＶＮＡＲは、本明細書において記載されているように、人に投与される（ヒト化）場合に潜在的免疫原性を低減させるために、さらに適用され得る。
【0313】
本発明はまた、本明細書において記載される任意の態様または実施形態に従った結合分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。さらに、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記宿主細胞が結合分子を生成する条件下で培養または維持するステップを含み、場合によって、結合分子を単離するステップをさらに含む、本発明に従った結合分子を準備するための方法が本明細書において提供される。
医薬組成物および使用
本発明に従うと、本発明のマルチドメイン特異的結合分子を含む医薬組成物が提供される。このような組成物には、前記抗原特異的抗原結合分子を含む融合タンパク質が含まれる。
医薬組成物および使用
本発明に従うと、本発明のマルチドメイン特異的結合分子を含む医薬組成物が提供される。このような組成物には、前記抗原特異的抗原結合分子を含む融合タンパク質が含まれる。
【0314】
医薬組成物はまた、治療用タンパク質に融合した本発明の抗原特異的抗原結合分子またはその断片を含み得る。治療用タンパク質は、ホルモン、増殖因子（例えば、ＴＧＦβ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、胎盤増殖因子）；分化因子；血液凝固因子（例えば、因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、フォン・ヴィレブランド因子、もしくはプロテインＣ）、または血液凝固カスケード由来の別のタンパク質（例えば、抗トロンビン）；サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、もしくはＩＬ－３３）、またはインターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、およびＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＦＮ－γ誘導因子（ＩＧＩＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ－１、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－８、ＢＭＰ－９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ－１１、ＢＭＰ－１２、ＢＭＰ－１３）；インターロイキン受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－１ＲＩＩ）；ケモカイン（例えば、ＭＩＰ（マクロファージ炎症性タンパク質）、例えば、ＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１β；ＭＣＰ（単球走化性タンパク質）、例えば、ＭＣＰ１、２、または３；ＲＡＮＴＥＳ（発現し分泌された正常Ｔ細胞の活性化で調節される））；栄養因子；サイトカイン阻害剤；サイトカイン受容体；酵素、例えば、フリーラジカル捕捉酵素、例えばスーパーオキシドジスムターゼもしくはカタラーゼ、またはプロドラッグ変換酵素（例えば、アンギオテンシン変換酵素、デアミナーゼ、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、キナーゼ、およびホスファターゼ）；ペプチド模倣体；プロテアーゼ阻害剤；メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ、例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、もしくはＴＩＭＰ４）またはセルピン（セリンプロテアーゼの阻害剤）であり得る。
【0315】
本発明の他の実施形態において、融合タンパク質中の治療用タンパク質は、抗体、または、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）２（化学的に結合したＦ（ａｂ’）２鎖を含む）、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ（その多量体形態、すなわち、ジｓｃＦｖ、またはトリｓｃＦｖを含む）、ｓｄＡｂ、もしくはＢｉＴＥ（二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー）を含む、操作されたその断片であり得る。抗体断片としてはまた、可変ドメインおよびその断片、ならびに他のＶＮＡＲタイプの断片（ＩｇＮＡＲ分子）も含まれる。
【0316】
医薬組成物は、治療用タンパク質に融合した多くの本発明の抗原特異的抗原結合分子、例えば二量体、三量体、または高次多量体、すなわち２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、または８量体から構成され得る。
【0317】
治療用タンパク質への本発明の抗原特異的抗原結合分子の融合は、タンパク質の任意の都合の良い部位で起こり得、また、Ｎ－、Ｃ－、および／またはＮ／Ｃ末端での融合であり得る。本発明の一実施形態において、本発明の抗原特異的抗原結合分子の融合は、治療用タンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に対するものである。
【0318】
本発明の医薬組成物は、任意の適切なおよび薬学的に許容可能な担体、希釈剤、アジュバント、または緩衝溶液を含み得る。組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤を含み得る。このような担体としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれ得る。
【0319】
このような組成物は、示されているような、さらなる薬学的に活性な薬剤を含み得る。さらなる薬剤は、治療用化合物、例えば、抗炎症薬、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、または抗生物質であり得る。このようなさらなる薬剤は、それを必要とする患者への投与に適切な形態で存在し得、このような投与は、同時、個別、または連続的であり得る。構成要素は、必要に応じて指示を含み得るキットの形態で準備され得る。
【0320】
医薬組成物は、とりわけ経口経路、局所経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、または皮内経路による投与を例えば含む、患者の疾患の処置に効果的なあらゆる効果的な都合の良い様式で投与され得る。治療において、または予防として、活性な薬剤は、注射可能な組成物として、例えば、好ましくは等張の、無菌の水性分散液として、個体に投与され得る。
【0321】
哺乳動物、特にヒトへの投与では、活性な薬剤の１日投薬量が体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ、典型的にはおよそ１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、または最大４ｍｇ／ｋｇとなることが予想される。いずれの事象でも、医師が、個体にとって最も適切となる実際の投薬量を決定し、当該投薬量は、個体の年齢、体重、性別、および応答を含む因子に応じる。上記の投薬量は、平均的なケースの典型例である。当然のことながら、より多くのまたは少ない投薬量が適当である場合が存在し得、これらは、本発明の範囲内である。
【0322】
本発明に従うと、医薬において使用するための本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子が提供される。本発明のこの態様は、したがって、それを必要とする患者における疾患を処置するための医薬品の製造における、本発明のこのような抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子の使用に及ぶ。本発明の抗原特異的抗原結合分子はまた、本発明の医薬組成物に関連して上記で定義したこのような特異的結合分子を含む融合タンパク質を準備するためにも使用され得る。
【0323】
このような使用はまた、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子を含む、治療有効投薬量の本明細書において定義される医薬組成物を患者に投与するステップを含む、処置を必要とする患者における疾患を処置する方法も包含する。
【0324】
本明細書において使用される場合、用語「処置」には、ヒトまたは非ヒト動物に有利であり得るあらゆるレジメが含まれる。動物用医薬における「非ヒト動物」の処置は、ウマおよびコンパニオンアニマル（例えば、ネコおよびイヌ）、ならびにヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、およびウマの科のメンバーを含む家畜／農業用動物を含む、家畜の処置に及ぶ。処置は、あらゆる既存の状態もしくは障害に関する治療的処置であり得るか、または予防的（防止処置）であり得る。処置は、遺伝的なまたは後天的な疾患の処置であり得る。処置は、急性または慢性的な状態の処置であり得る。処置は、炎症および／またはがんに関連する状態／障害の処置であり得る。本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子は、限定されないが、変形性関節症、強皮症、腎臓病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、またはあらゆる炎症性疾患を含む障害の処置において使用することができる。
【0325】
本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子はまた、患者における疾患状態の性質を調べるためにも使用することができる。抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子は、Ｘ線、ガンマ線、もしくはＰＥＴスキャン、またはこれらに類するものなどの画像化技術を使用して対象の身体における疾患の部位の画像を準備するために使用することができる。本発明は、したがって、適切に検出可能に標識された抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子を対象に投与すること、および対象の身体をその後にスキャンすることを含む、対象における疾患の部位を画像化する方法に及び得る。あるいは、対象への前記分子の投与は、分子を投与した後の対象から得られた試料を分析することによって、試験結果を提供し得る。このような実施形態には、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子の投与を含む、対象における疾患または医学的状態を診断する方法が含まれ得る。本発明のマルチドメイン特異的結合分子は、特に、同一の抗原上の異なるエピトープを標的化する複数のＶＮＡＲを使用する場合に、診断の感度に関して特に有用であり得る。
【0326】
さらなる態様において、本発明は、治療有効量の、ＴＮＦαに特異的に結合する本発明の組成物を投与するステップを含む、ＴＮＦαが媒介する状態を処置するための方法を提供する。
【0327】
結合の測定
標的へのＶＮＡＲの結合の検出および測定は、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴を含む、当技術分野において周知の多くの方法で測定することができる。
標的へのＶＮＡＲの結合の検出および測定は、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴を含む、当技術分野において周知の多くの方法で測定することができる。
【0328】
機能的活性
本発明のＶＮＡＲは、サイトカインなどの分子に結合させ、当該分子の生物学的影響を中和すること、受容体に結合させてリガンドの結合を防ぐかまたは結合後の生物学的影響を生じさせることを含む、多くの様式で機能し得る。
本発明のＶＮＡＲは、サイトカインなどの分子に結合させ、当該分子の生物学的影響を中和すること、受容体に結合させてリガンドの結合を防ぐかまたは結合後の生物学的影響を生じさせることを含む、多くの様式で機能し得る。
【0329】
結合ドメインの機能的活性を測定する方法は、当技術分野において公知である。第２のおよびそれに続く本発明の態様の好ましい特徴は、本発明の第１の態様に必要な変更を加えたものである。
【実施例】
【0330】
本発明をここで、以下の実施例および添付の図面を参照することによって記載するが、当該実施例および図面は、説明のみを目的として存在しており、本発明を限定するものとしては解釈されない。
【0331】
実施例１－迅速なヒト化：抗ＴＮＦα ｓｏｌｏＭＥＲにおける機能を回復させるための、ｓｏｌｏＭＥＲドメイン上のＤＰＫ９相同性フレームワークの修飾
この実施例全体を通して、ヒト化されたＶＮＡＲ配列は、ｓｏｌｏＭＥＲとも呼ぶことができる。ヒト化のための第１のステップは、十分であるが有害ではないヒト残基を、ヒト抗体配列ＤＰＫ９相同性モデルを使用して、リード抗ＴＮＦ ＶＮＡＲドメイン（Ｄ１およびＣ４）に組み込むことを伴うものであった（図１を参照されたい）。
この実施例全体を通して、ヒト化されたＶＮＡＲ配列は、ｓｏｌｏＭＥＲとも呼ぶことができる。ヒト化のための第１のステップは、十分であるが有害ではないヒト残基を、ヒト抗体配列ＤＰＫ９相同性モデルを使用して、リード抗ＴＮＦ ＶＮＡＲドメイン（Ｄ１およびＣ４）に組み込むことを伴うものであった（図１を参照されたい）。
【0332】
ヒト化されたＱｕａｄ Ｘバインダーを作るために（図２を参照されたい）、Ｄ１－Ｖ２およびＣ４－Ｖ１を、言及されている場所を除いて維持し、フレームワーク１またはフレームワーク４を未処理のＶＮＡＲ配列に回復させ、これによって、ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ ＶＮＡＲ ＦＷ１回復済またはｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ ＶＮＡＲ ＦＷ４回復済という名称とした。ＨＥＫ２９３宿主細胞におけるポリエチレンイミン媒介トランスフェクションおよび一過性発現を、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。タンパク質の一過性発現を５～７日間継続させ、その後、培地上清を採取した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを利用して、Ｆｃに融合したｓｏｌｏＭＥＲの精製を行った。最大１５０ｍｇ／ｌの発現レベル（ＦｃベースのｓｏｌｏＭＥＲ構築物）が、これらの哺乳動物システムにおいて達成された。
【0333】
ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ ＶＮＡＲ ＦＷ１はＨＥＫ２９３細胞において発現を示さなかったが、ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ ＶＮＡＲ ＦＷ４は顕著なタンパク質発現を示した（図３を参照されたい）。したがって、このフォーマットを、さらなる特徴付け、およびネイティブなＶＮＡＲ Ｑｕａｄ－Ｘ（ＷＴ Ｑｕａｄ－Ｘとも呼ばれる）との比較における機能的評価のために次へ進めた。
【0334】
この１対１の標的結合比較において、ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ（ＶＮＡＲ ＦＷ４）およびネイティブなＱｕａｄ－Ｘの両方が、ＴＮＦαを認識し（図４Ａ）ヒト血清アルブミンは認識しない（図４Ｂ）、同等の機能性を示した。これはまた、それらの結合動態およびヒトＴＮＦ－アルファに対する親和性によっても示されている（表３を参照されたい）。
【0335】
ＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲｉ（表面プラズモン共鳴イメージング）機器を利用して、ｓｏｌｏＭＥＲおよびネイティブなＶＮＡＲ Ｑｕａｄ－Ｘタンパク質の試料の結合動態を決定した。抗ＴＮＦドメインを、連続フローマイクロスポッター（ＣＦＭ）を使用して、センサー（アレイチップ）にアミン結合し、その後、固定されたｓｏｌｏＭＥＲまたはネイティブなＶＮＡＲ Ｑｕａｄ－Ｘに抗原（ヒトＴＮＦ－アルファ）を通した。
【0336】
【表3】
【0337】
図５におけるＳＥＣのデータは、単量体性およびドメインの生化学的挙動の類似性を裏付け、凝集の形跡も不安定性の形跡もない。
【0338】
上記のインビトロでのヒトＴＮＦ－アルファ中和アッセイ（図６を参照されたい）において、ネイティブなＷＴ Ｑｕａｄ－Ｘ（Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ ＶＮＡＲ）およびｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ（ｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ ＶＮＡＲ ＦＷ４としても知られている）の両方が、マウス線維肉腫細胞系（Ｌ９２９細胞）に対するヒトＴＮＦ－アルファの細胞傷害効果を中和する同一の能力を示すことが実証された。ネイティブおよびｓｏｌｏＭＥＲ Ｑｕａｄ－Ｘ ＶＮＡＲ ＦＷ４で達成されたＮＤ５０値は、それぞれ０．００２ｎＭおよび０．００１７ｎＭである。
【0339】
実施例２－クローンＰ３Ａ１は、ＲＯＲ１と呼ばれるヒトタンパク質を認識する。クローンＰ３Ａ１のヒト化を、抗ＴＮＦ ＶＮＡＲクローンと類似の方法で行った（図１を参照されたい）。
【0340】
Ｐ３Ａ１のいくつかのヒト化バリアント（Ｖ１からＶ６）を設計し（図７）、二量体（短鎖ペプチドリンカーと結び付き、ＨｉｓＭｙｃ検出タグを有している、２×Ｐ３Ａ１バリアント）として合成し、配列が正確であることを確認し、これを適切な細菌発現ベクターにクローニングした。これらのバリアントのうち、Ｖ１およびＶ４だけが、何らかのタンパク質を産生した（表４）。Ｐ３Ａ１ Ｖ１は機能的結合を示し、これは、親ＷＴクローンＰ３Ａ１よりも優れていた（より高い親和性であった）（表４）。Ｖ４の発現レベルは低く、精製の間に沈殿した。Ｖ１はまた、そのｈＲＯＲ１標的タンパク質に対する良好な特異性を保持していたが、それは、Ｖ１が、ＷＴ非ヒト化Ｐ３Ａ１クローンの特異性を模倣する、関係性の近いｈＲＯＲ２タンパク質に結合できなかったことによる（表４）。
【0341】
【表4】
【0342】
実施例３－様々なヒト化レベルを有する５つのヒト化ＶＮＡＲバリアント
ＶＮＡＲクローンＥ４および７８は、ヒトタンパク質ＤＬＬ４を認識する。抗ＴＮＦプログラムおよび抗ＲＯＲ１（クローンＰ３Ａ１）プログラムについて記載されているように、抗ＤＬＬ４ ＶＮＡＲドメインＥ４および７８を、ＤＰＫ９をヒトＩｇ相同性鋳型として使用してヒト化し、様々な程度のＤＰＫ９残基（ヒト化のレベル）を有する５つのヒト化ＶＮＡＲバリアントを得た。
ＶＮＡＲクローンＥ４および７８は、ヒトタンパク質ＤＬＬ４を認識する。抗ＴＮＦプログラムおよび抗ＲＯＲ１（クローンＰ３Ａ１）プログラムについて記載されているように、抗ＤＬＬ４ ＶＮＡＲドメインＥ４および７８を、ＤＰＫ９をヒトＩｇ相同性鋳型として使用してヒト化し、様々な程度のＤＰＫ９残基（ヒト化のレベル）を有する５つのヒト化ＶＮＡＲバリアントを得た。
【0343】
図８で示されているアラインメントは、ヒト生殖細胞系Ｖｋ１配列のヒト残基、ヒト化で利用されたＤＰＫ９、およびｓｏｌｏＭＥＲ－Ｖ１からＶ５からのヒト残基グラフティングの増大のパーセンテージの程度を示している。
【0344】
ヒト化ＶＮＡＲ Ｅ４および７８バリアント（ｓｏｌｏＭＥＲ）を、パイロット小規模非最適化システム（大腸菌）における発現について評価した。
【0345】
可溶性ＶＮＡＲタンパク質を、原核生物（大腸菌）において発現させた。大腸菌ＴＧ１細胞における発現を１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、可溶性ＶＮＡＲタンパク質をペリプラズム（大腸菌ＴＧ１細胞）から抽出した。全てのＶＮＡＲ構築物を、ｐＩＭＳ１００発現ベクターを使用して、ＩＰＴＧで誘導した大腸菌ＴＧ１細胞において細胞質タンパク質として発現させた。細胞質ＶＮＡＲタンパク質の抽出は、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）タンパク質抽出試薬とＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）とを使用して行った。
【0346】
全てのＶＮＡＲ構築物を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用して、ポリヒスチジンタグを介して精製した。精製されたタンパク質試料の電気泳動を、ＭＥＳ緩衝液システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上で行った。タンパク質試料を還元し、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ＋β－メルカプトエタノールを使用して変性させ、そして１００℃で３～５分間沸騰させた。
【0347】
直接的な結合ＥＬＩＳＡ技術を使用するｓｏｌｏＭＥＲドメインの結合活性の評価
９６ウェル平底Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｏプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１μｇ／ｍＬのｈＤＬＬ４で、４℃で一晩コーティングした。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ［０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を有するＰＢＳ］で３回洗浄し、その後、ウェル当たり２００μｌの４％の乳（ｗ／ｖ）ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）でブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。ブロックしたプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、未定量のｓｏｌｏＭＥＲ／ＶＮＡＲタンパク質溶液を添加し、これを次いで、プレートに流したＰＢＳで１：２で希釈し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌの１：１０００希釈の抗ポリヒスチジン－ＨＲＰ（ヒスチジンタグ付けされたタンパク質）をプレートに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を添加することによって顕色し、そして５０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して中和した。
９６ウェル平底Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｏプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１μｇ／ｍＬのｈＤＬＬ４で、４℃で一晩コーティングした。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ［０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を有するＰＢＳ］で３回洗浄し、その後、ウェル当たり２００μｌの４％の乳（ｗ／ｖ）ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）でブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。ブロックしたプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、未定量のｓｏｌｏＭＥＲ／ＶＮＡＲタンパク質溶液を添加し、これを次いで、プレートに流したＰＢＳで１：２で希釈し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌの１：１０００希釈の抗ポリヒスチジン－ＨＲＰ（ヒスチジンタグ付けされたタンパク質）をプレートに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を添加することによって顕色し、そして５０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して中和した。
【0348】
ｓｏｌｏＭＥＲ Ｅ４および７８バリアントのこれらの最初の機能的特徴付けから同定された最良のバリアントは、Ｅ４－Ｖ２および７８－Ｖ２および７８－Ｖ４であったが、フレームワークのそれぞれは、ある程度のレベルの機能的結合を、特に７８クローンバリアントで示した（図１０）。
【0349】
親和性成熟のためのＥ４－Ｖ２および７８－Ｖ２ヒト化ライブラリー
図１１に示すように、抗ＤＬＬ４ ｓｏｌｏＭＥＲライブラリーを、個別調整された多様性がＣＤＲ１領域、ＨＶ２領域、およびＨＶ４領域に導入されたＥ４－Ｖ２フレームワークに基づいて設計した。Ｓｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｕｓ由来のＶＮＡＲ配列のデータベースを分析して、所望の領域が有し得る予測される多様性のレベルを決定した。
図１１に示すように、抗ＤＬＬ４ ｓｏｌｏＭＥＲライブラリーを、個別調整された多様性がＣＤＲ１領域、ＨＶ２領域、およびＨＶ４領域に導入されたＥ４－Ｖ２フレームワークに基づいて設計した。Ｓｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｕｓ由来のＶＮＡＲ配列のデータベースを分析して、所望の領域が有し得る予測される多様性のレベルを決定した。
【0350】
ライブラリーのクローニングの後、各ライブラリーからの９６の配列（Ｅ４および７８親配列）を分析すると、両ライブラリーが９０％を超える正確性を示し、これは、全配列および互いに異なる配列である。ライブラリーの総サイズ（固有のクローン）は、およそ１×１０９個のクローンであると推定された。
ヒト化ライブラリーのＤＬＬ４に対するモノクローナルファージ結合ＥＬＩＳＡ。
ヒト化ライブラリーのＤＬＬ４に対するモノクローナルファージ結合ＥＬＩＳＡ。
【0351】
ファージのアウトプットを、モノクローナルファージＥＬＩＳＡによって、ヒトＤＬＬ４への結合についてスクリーニングした。パンニングされていないライブラリーを、図１２で概説されている戦略に従ったバイオパンニングの後に、ラウンド１～３でスクリーニングした。Ｅ４－Ｖ２親フレームワークと比較して結合が向上している多くのバインダーが、Ｅ４－Ｖ２ライブラリー（パンニングされていないおよびパンニングされている）から同定され、結合親和性は、ヒト化前の親クローンＥ４ ＷＴの結合親和性にほぼ等しく、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への結合は有さずに、標的抗原であるヒトＤＬＬ４に対する特異性を保持していた（図１３）。これらのクローンの配列は図１４において報告されている。
【0352】
実施例４－Ｄ３Ｖ２ ｓｏｌｏＭＥＲライブラリーの作製
ライブラリーの設計
クローンＤ３は、ヒトタンパク質のＲＯＲ１を認識する。Ｄ３のいくつかのヒト化バリアントを合成し、配列が正確であることを確認し（図１５）、そして適切な発現ベクターにクローニングした。これらのバリアントのうち、Ｄ３Ｖ２を、表５におけるデータに基づくさらなる最適化のために選択した。
ライブラリーの設計
クローンＤ３は、ヒトタンパク質のＲＯＲ１を認識する。Ｄ３のいくつかのヒト化バリアントを合成し、配列が正確であることを確認し（図１５）、そして適切な発現ベクターにクローニングした。これらのバリアントのうち、Ｄ３Ｖ２を、表５におけるデータに基づくさらなる最適化のために選択した。
【0353】
【表5】
【0354】
Ｖ１およびＶ２は、ＷＴ Ｄ３と比較して、ＫＤ親和性の変化はほとんど示していない。Ｖ２はＶ１よりも向上したＴｍを示し、したがって、Ｄ３ Ｖ２誘導体を、Ｖ２フレームワーク内のいかなる変化も伴わない、ＣＤＲ１領域、ＨＶ２領域、およびＨＶ４領域のランダム化を介してヒト化Ｄ３Ｖ２バリアント（ｓｏｌｏＭＥＲ）の結合親和性を向上させるように設計されたＤ３Ｖ２ヒト化ライブラリーの作製、およびこれからの選択のために選択した。超可変領域（ＣＤＲ１、ＨＶ２、およびＨＶ４）におけるアミノ酸の変化および可能性の選択は、Ｓｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｕｓ由来のＶＮＡＲ配列のデータ分析に基づいて設計した。Ｄ３Ｖ２の配列およびライブラリーの設計を図１６に示す。
【0355】
ライブラリーを、ＣＤＲ１、ＨＶ２、およびＨＶ４の制御された突然変異生成によって合成した。ＣＤＲ１ループ、ＨＶ２ループ、およびＨＶ４ループ内にそれぞれ位置する残基２６～３３、４４～５２、および６１～６５を、図１６で特定した通りの選択されたアミノ酸に変え、８．２×１０６の組み合わせの、ライブラリーの総多様性を得た。
【0356】
ライブラリーの構築
Ｄ３Ｖ２ ＳｏｌｏＭＥＲライブラリーのＤＮＡを、ｐＨＥＮファージミドベクターへのクローニングのために、ＮｃｏＩ制限部位およびＮｏｔＩ制限部位を導入するための特異的プライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した。ベクターにライゲートされたライブラリーＤＮＡを、エレクトロコンピテントＴＧ１大腸菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換した。ライブラリーサイズを、１．５×１０７の固有のクローンであると計算した（配列および完全長インサートによって）。
Ｄ３Ｖ２ ＳｏｌｏＭＥＲライブラリーのＤＮＡを、ｐＨＥＮファージミドベクターへのクローニングのために、ＮｃｏＩ制限部位およびＮｏｔＩ制限部位を導入するための特異的プライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した。ベクターにライゲートされたライブラリーＤＮＡを、エレクトロコンピテントＴＧ１大腸菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換した。ライブラリーサイズを、１．５×１０７の固有のクローンであると計算した（配列および完全長インサートによって）。
【0357】
抗原特異的ＶＮＡＲ配列についてのＳｏｌｏＭＥＲライブラリーのスクリーニング
組換えヒトＲＯＲ１タンパク質を、Ｄ３Ｖ２ ｓｏｌｏＭＥＲライブラリーの選択およびスクリーニングに使用した。ＲＯＲ１特異的ｓｏｌｏＭＥＲを単離するために、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズをビオチン化抗原で事前に装飾し、低ストリンジェンシーの３ラウンドのパンニング（選択戦略の詳細については図１７を参照されたい）を行った。抗原特異的ファージをファージモノクローナルのＥＬＩＳＡによって検出し、抗原特異的ファージのパーセンテージを、ＰＡＮ１（１１％）からＰＡＮ３（８８％）まで上昇させた。
組換えヒトＲＯＲ１タンパク質を、Ｄ３Ｖ２ ｓｏｌｏＭＥＲライブラリーの選択およびスクリーニングに使用した。ＲＯＲ１特異的ｓｏｌｏＭＥＲを単離するために、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズをビオチン化抗原で事前に装飾し、低ストリンジェンシーの３ラウンドのパンニング（選択戦略の詳細については図１７を参照されたい）を行った。抗原特異的ファージをファージモノクローナルのＥＬＩＳＡによって検出し、抗原特異的ファージのパーセンテージを、ＰＡＮ１（１１％）からＰＡＮ３（８８％）まで上昇させた。
【0358】
ＰＡＮ３のＤ３Ｖ２ ｓｏｌｏＭＥＲライブラリーのアウトプットを、可溶性ｓｏｌｏＭＥＲの発現のために、ｐＩＭＳ１４７－ｃカッパベクターにサブクローニングした。ライブラリーＤＮＡを、ＮｏｔＩ／ＮｃｏＩ制限部位を介してｐＩＭＳ１４７－ｃカッパにライゲートし、エレクトロコンピテントＴＧ１大腸菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換した。ライブラリーサイズを３．８×１０８であると計算した。
【0359】
単一のクローンを培養し、ペリプラズム可溶性タンパク質の発現を誘導し、そして、８３％の、ｈｕＲＯＲ１に対する正のバインダーを得た。
【0360】
モノクローナルファージＥＬＩＳＡおよびペリプラズム－ｐｒｅｐ ＥＬＩＳＡにおける、ｈｕＲＯＲ１に対する正のバインダー（ｃｋドメインを介して検出される）をアラインし、９つの固有の配列を同定した。
【0361】
【表6】
【0362】
さらなる分析の後、４つのヒットを、それらの発現可能性および抗原への結合に基づいて次へ進めた。クローンＦ１１、Ｅ０８、Ｆ０１、およびＧ０２（表６）は全て、ヒト化Ｄ３ Ｖ２バリアントおよび親クローンＤ３ ＷＴの双方よりも向上した発現レベルを示した。さらに、全てのクローンが、Ｄ３ Ｖ２クローンと少なくとも同等の、ｈＲＯＲ１抗原に対する親和性を示し、密接な関係があるｈＲＯＲ２タンパク質には結合しなかった（結果は示されていない）。クローンＥ０８はＤ３ Ｖ２クローンよりも増大した親和性を示し、親Ｄ３ ＷＴクローンに対する親和性は同様であった。結果は、ライブラリーの選択が、同等の親和性および特異性を有するがバイオプロセシング特徴が向上しているＤ３ ＷＴのヒト化バリアント（クローンＥ０８）の生成において非常にうまくいったことを示している。４つの最も良く結合するクローンのヒト化配列を図１８に示す。
【0363】
ライブラリーの合成
ＣＤＲループライブラリーおよび個々のクローンを、設計が示されている図面において概説されている設計に従って、ＧｅｎｅＡｒｔ遺伝子合成によって合成した。
ＣＤＲループライブラリーおよび個々のクローンを、設計が示されている図面において概説されている設計に従って、ＧｅｎｅＡｒｔ遺伝子合成によって合成した。
【0364】
ｐＨＥＮへのライブラリーのサブクローニング
合成ライブラリーのＰＣＲ増幅を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、および以下のプライマー：Ｄ３＿ＦＯＲ＿ＮｃｏＩ ＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣ（配列番号４１）、Ｄ３＿ＲＥＶ＿ＮｏｔＩ ＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧ（配列番号４２）を使用して行った。
合成ライブラリーのＰＣＲ増幅を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、および以下のプライマー：Ｄ３＿ＦＯＲ＿ＮｃｏＩ ＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣ（配列番号４１）、Ｄ３＿ＲＥＶ＿ＮｏｔＩ ＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧ（配列番号４２）を使用して行った。
【0365】
アンプリコンをＰｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ精製キットで精製し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして同一の制限酵素で開裂したｐＨＥＮベクターにライゲートした。ライゲーションは１：１の比率で行った。
【0366】
ライブラリーの選択
１．選択のためにライブラリーファージを守るために、ライブラリーグリセロールストックからの培養物を、ＯＤ６００が０．５となるまで、２×ＴＹ、１％（ｗ／ｖ）のグルコース、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン中で、３７℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。
１．選択のためにライブラリーファージを守るために、ライブラリーグリセロールストックからの培養物を、ＯＤ６００が０．５となるまで、２×ＴＹ、１％（ｗ／ｖ）のグルコース、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン中で、３７℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。
【0367】
２．細胞を約１×１０９のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）で重感染させ、次いで、２×ＴＹ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン中で、２５℃および２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。
【0368】
３．ファージを細菌培養物から２回ＰＥＧ沈殿させ（２０％のＰＥＧ／２．５ＭのＮａＣｌ）、得られたファージペレットを１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。
【0369】
４．３％（ｗ／ｖ）のＭＰＢＳでプレブロックした２００マイクロリットルのダイナビーズＭ－２８０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１２０５Ｄ）を、２０ｒｐｍで回転させながら、室温で１時間、ビオチン化されたヒトＲＯＲ１でコーティングした。
【0370】
５．ライブラリーファージを、室温で回転させながらダイナビーズと１時間インキュベーションすることによって、選択から外し、次いで、抗原でコーティングしたビーズに添加した。
【0371】
６．ビーズをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、４００μｌの１００ｍＭ ＴＥＡ中で８分間回転させることによって溶出し、そして２００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５を添加することによって中和した。
【0372】
７．大腸菌ＴＧ１細胞（１０ｍｌ）を、３００μｌの溶出されたファージで、３７℃で３０分間感染させ、１％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＹＥ寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた。
【0373】
８．３回のさらなる選択ラウンドを実施し、アウトプットを、モノクローナルファージおよびライブラリー設計（限定されないが、ヒトＤＬＬ４（ｈＤＬＬ４）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒトＲＯＲ１（ｈＲＯＲ１）、およびヒトＲＯＲ２（ｈＲＯＲ２）を含む）に応じた広範な異なる抗原に対するペリプラズム抽出ＥＬＩＳＡによって抗原特異的結合についてスクリーニングした。ファージバインダーを、ＨＲＰにコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体を使用して検出し、ペリプラズムタンパク質を、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、またはヒトＣカッパ抗体を使用して検出した。
【0374】
ｓｏｌｏＭＥＲライブラリーのスクリーニング：９６ウェルフォーマットでの単一クローンのペリプラズム発現および結合ＥＬＩＳＡ
１．１ｍｌの２×ＴＹ／０．１％（ｗ／ｖ）のグルコース／１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを含有するＧｒｅｉｎｅｒ ９６ディープウェルプレートに接種する。わずかに濁るまで、インキュベーションチャンバ内で、３７℃で５時間、１８０ｒｐｍで増殖させる。
１．１ｍｌの２×ＴＹ／０．１％（ｗ／ｖ）のグルコース／１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを含有するＧｒｅｉｎｅｒ ９６ディープウェルプレートに接種する。わずかに濁るまで、インキュベーションチャンバ内で、３７℃で５時間、１８０ｒｐｍで増殖させる。
【0375】
２．２×ＴＹ／Ａｍｐ中の１１０μｌ／ウェルの１ｍＭ ＩＰＴＧ（ＩＰＴＧ最終濃度＝１００μＭ）で誘導する。２８℃で一晩、同一の振とう速度。
【0376】
３．培養物を４℃および３５００ｒｐｍで１５分間スピンさせる。上清をデカンテーションし、ペーパータオルで叩いて乾燥させる。
【0377】
４．２５０μｌ／ウェルの氷冷したＴＥＳ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０／１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０／２０％（ｗ／ｖ）のショ糖）をペレットに添加する。ボルテックスする。
【0378】
５．水中で１：５希釈した２５０μｌのＴＥＳ緩衝液（氷冷した）を添加する。氷上で（またはリッジ内で）３０分間維持する。上記のようにスピンさせる。使用する直前まで上清を氷上で維持する。
【0379】
ＥＬＩＳＡ
１．１μｇ／ｍｌのｈＲＯＲ１－Ｆｃ、ｈＲＯＲ２－Ｆｃ、またはＨＳＡ、またはｈＤＬＬ４で９６ウェルプレートをコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。
１．１μｇ／ｍｌのｈＲＯＲ１－Ｆｃ、ｈＲＯＲ２－Ｆｃ、またはＨＳＡ、またはｈＤＬＬ４で９６ウェルプレートをコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。
【0380】
２．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
【0381】
３．コーティングされたプレートを２００μｌ／ウェルの４％のＭ－ＰＢＳでブロックする。室温で１時間インキュベートする。
【0382】
４．ＰＢＳＴで３回洗浄する。
【0383】
５．プレートを、１００μｌ／ウェルのペリプラズム調製物と室温で１時間インキュベートする。
【0384】
６．１００μｌの抗Ｈｉｓ－ＨＲＰまたはヒトＣカッパ－ＨＲＰ（ＰＢＳＴ中で１：１０００）を添加し、室温で１時間インキュベートする。
【0385】
７．ＰＢＳＴで２回、およびＰＢＳで２回洗浄する。
【0386】
８．１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を添加する。５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させる。
【0387】
ＲＯＲ１ ＶＮＡＲバインダーの大規模発現および精製
１．グリセロールストックから得たクローンを２０ｍｌの２×ＴＹ／１％（ｗ／ｖ）のグルコース／１００μｇ／ｍｌのＡｍｐに接種する。２５０ｒｐｍで振とうしながら、インキュベーションチャンバ内で、３７℃で一晩増殖させる。
１．グリセロールストックから得たクローンを２０ｍｌの２×ＴＹ／１％（ｗ／ｖ）のグルコース／１００μｇ／ｍｌのＡｍｐに接種する。２５０ｒｐｍで振とうしながら、インキュベーションチャンバ内で、３７℃で一晩増殖させる。
【0388】
２．一晩の培養物を、ＴＢ＋リン酸塩＋１％（ｗ／ｖ）のグルコース＋１００μｇ／ｍｌ Ａｍｐ培地（５００ｍｌの培地に１０ｍｌのｏ／ｎ培養物；４５０ｍｌのＴＢ＋５０ｍｌのリン酸塩）中で１：５０で希釈し、強力に振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で終日、またはできるだけ長くインキュベートする。
【0389】
３．２０℃で、４０００×ｇで２０分間遠心分離することによって、細胞をペレット化する。
【0390】
４．細胞を同一の容積のＴＢ＋リン酸塩＋１％（ｗ／ｖ）のグルコース＋１００μｇ／ｍｌ Ａｍｐ培地中に再懸濁し、振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３０℃で一晩インキュベートする。
【0391】
５．２０℃で、４０００×ｇで２０分間遠心分離することによって細胞をペレット化し、細胞を同一の容積のＴＢ＋リン酸塩＋１００μｇ／ｍｌ Ａｍｐ培地（グルコースなし）中に再懸濁する。ＩＰＴＧを添加して、ＩＰＴＧの最終濃度１ｍＭとする。振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３０℃で４～５時間インキュベートする。
【0392】
６．４５００×ｇで３０分間遠心分離することによって細胞を回収する［ペレットはこの時点で－２０℃で凍結され得る］。
【0393】
７．ペレットを１０％の培養容積の氷冷したＴＥＳ緩衝液（５００ｍｌの培養物に対して５０ｍｌ）中で再懸濁し、氷上で１５分間、穏やかに振とうする。
【0394】
８．等容積の氷冷した５ｍＭのＭｇＳＯ４を添加し（２．５ｍＭ最終濃度のＭｇＳＯ４まで）、さらに１５分間、氷上で穏やかに振とうを続ける。
【0395】
９．４℃で、８０００×ｇで３０分間遠心分離することによって懸濁液をペレット化する。上清は、放出されたペリプラズムタンパク質を含有している。
【0396】
１０．１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）［最終濃度１×ＰＢＳ］をペリプラズム調製物抽出物に添加し、その後、ＩＭＡＣ精製する。
【0397】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製
１．２～３ｍｌのニッケル樹脂（Ｈｉｓ Ｐｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃８８２２２）を１００ｍｌの浸透圧衝撃溶液（ペリプラズム抽出物）に添加し、ローラー上で、室温で１時間インキュベートする。
１．２～３ｍｌのニッケル樹脂（Ｈｉｓ Ｐｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃８８２２２）を１００ｍｌの浸透圧衝撃溶液（ペリプラズム抽出物）に添加し、ローラー上で、室温で１時間インキュベートする。
【0398】
２．ペリプラズム抽出物をカラム（ポリプレップクロマトグラフィーカラム１０ｍｌ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃７３２１０１０）に通す。
【0399】
３．５０～１００ｍｌのＰＢＳで樹脂を洗浄する。
【0400】
４．５×１ｍｌの５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）でタンパク質を溶出した。
【0401】
５．透析カセット（Ｓｌｉｄｅ Ａ Ｌｙｚｅｒ透析カセット７．０００ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃６６７０７）内で、撹拌しながら、溶出液を３×５リットルのＰＢＳ中で透析する。
【0402】
６．タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】