特表 2024-500768 凝集抑制のためのＡβ変異体の伝達

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-10

(54)【発明の名称】凝集抑制のためのＡβ変異体の伝達

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20231227BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231227BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20231227BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20231227BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 31/445 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 31/27 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 31/55 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 31/13 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20231227BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

C12N15/12 ZNA

C12N15/86 Z

C12N15/85 Z

C12N15/864 100Z

A61P25/00

A61P25/28

A61P25/16

A61K9/127

A61K9/51

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K39/395 N

A61K31/445

A61K31/27

A61K31/55

A61K31/13

A61K38/16

A61K35/761

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537058

(86)(22)【出願日】2021-12-15

(85)【翻訳文提出日】2023-08-16

(86)【国際出願番号】 US2021072944

(87)【国際公開番号】W WO2022133461

(87)【国際公開日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】63/127,815

(32)【優先日】2020-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】391058060

【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】パク，キュン‐ウォン

(72)【発明者】

【氏名】ジャンコウスキー，ジョアンナ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA65

4C076AA95

4C076BB13

4C076CC01

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA19

4C084MA24

4C084MA38

4C084MA66

4C084NA13

4C084ZA02

4C084ZA16

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB11

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG02

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC21

4C086CB22

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA24

4C086MA38

4C086MA66

4C086NA13

4C086ZA02

4C086ZA16

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA24

4C087MA38

4C087MA66

4C087NA13

4C087ZA02

4C087ZA16

4C087ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA29

4C206HA24

4C206MA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA44

4C206MA58

4C206MA86

4C206NA13

4C206ZA02

4C206ZA16

4C206ZC75

(57)【要約】

本開示内容の局面は、神経退行性障害、疾患または病態を有する対象体を治療するための組成物および方法に関するものである。特定の局面は、Ａβペプチド変異体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を用いる治療に関するものである。更なる局面は、少なくとも一つの生体内の内因性Ａβペプチドを、Ａβペプチド変異体をコードするベクターから治療学的有効量の発現されたＡβペプチド変異体と接触させる（前記ベクターは組成物に存在する）ことで生体内の内因性Ａβペプチドの凝集を抑制する方法に関するものである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド変異体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を対象体に投与する段階を含む、対象体から神経退行性疾患、障害または病態を治療または予防する方法であって、前記Ａβペプチド変異体は、次と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。

、またはその断片または機能的誘導体。

【請求項2】

タンパク質ミスフォールディング、内因性Ａβペプチドの凝集、アミロイドプラークの形成、神経炎症、神経退行性、ニューロン損失またはシナプス損失を予防または減少させ；タウのレベル（ｔａｕ ｌｅｖｅｌ）、タウのリン酸化またはリン酸化されたタウのレベルを減少させ；タウのシーディングまたは内因性Ａβペプチドのシーディングを鈍化させ／鈍化させるか、または認知改善を促進する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

内因性Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルまたはプラークの形成を予防または減少させる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

内因性Ａβペプチド凝集体の細胞毒性を予防または減少させる、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

少なくとも一つの生体内の内因性Ａβペプチドを、Ａβペプチド変異体をコードするベクターから治療学的有効量の発現されたＡβペプチド変異体と接触させる段階を含む、生体内の内因性Ａβペプチドの凝集を抑制する方法であって、前記ベクターは、組成物に存在し、Ａβペプチド変異体は、次と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。

、またはその断片または機能的誘導体。

【請求項6】

内因性Ａβペプチドの凝集を抑制することは、対象体から神経退行性疾患、障害または病態を治療または予防する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

内因性Ａβペプチドの凝集を抑制することは、Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルまたはプラークの形成を予防または減少させる、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

内因性Ａβペプチドの凝集を抑制することは、内因性Ａβペプチド凝集体の細胞毒性を予防または減少させる、請求項５乃至７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

神経退行性疾患、障害または病態がある対象体を診断する段階と、
神経退行性疾患、障害または病態の症状を有すると対象体を診断する段階と、または
神経退行性疾患、障害または病態を有する危険がある対象体を診断する段階とをさらに含む、請求項１、２、３、４、６、７または８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

神経退行性疾患、障害または病態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病認知症、血管性認知症、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、慢性外傷性脳症、ダウン症候群、および／または病的老化である、請求項１、２、３、４、６、７、８または９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

神経退行性疾患、障害または病態がアルツハイマー病である、請求項１、２、３、４、６、７、８、９または１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

Ａβペプチド変異体が配列番号：３、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

Ａβペプチド変異体が配列番号：３、またはその断片または機能的誘導体を含む、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

配列番号：３と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：３を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

配列番号：３と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：３を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む、請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

配列番号：３の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＤＦＡＥ（配列番号：１０）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２乃至１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

Ａβペプチド変異体が配列番号：４、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

Ａβペプチド変異体が配列番号：４を含む、請求項１、２、３、４、５、６、７または１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

配列番号：４と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：４を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む、請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

配列番号：４と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：４を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む、請求項１９乃至２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

配列番号：４の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＦＰＡＥ（配列番号：１１）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９乃至２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

Ａβペプチド変異体が配列番号：５、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

Ａβペプチド変異体が配列番号：５を含む、請求項１、２、３、４、５、６、７または２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

配列番号：５と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：５を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む、請求項２６または２７に記載の方法。

【請求項29】

Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

配列番号：５と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：５を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む、請求項２６乃至２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

配列番号：５の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＤＦＡＥ（配列番号：１０）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６乃至３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

Ａβペプチド変異体が配列番号：６、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

Ａβペプチド変異体が配列番号：６を含む、請求項１、２、３、４、５、６、７または３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

配列番号：６と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：６を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む、請求項３３または３４に記載の方法。

【請求項36】

Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

配列番号：６と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：６を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む、請求項３３乃至３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

配列番号：６の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＰＦＡＥ（配列番号：１２）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３乃至３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

ベクターが、Ａβペプチド変異体をコードするミニ遺伝子をコードする、請求項１乃至３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

Ａβペプチド変異体をコードするミニ遺伝子は、アミロイド前駆体タンパク質の切断されたベータ－カルボキシル－末端断片（β－ＣＴＦ）を含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列をコードする、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

切断されたβ－ＣＴＦが信号ペプチド配列に融合される、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

信号ペプチド配列がガウシアルシフェラーゼ信号ペプチドを含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列、またはマウス免疫グロブリン重鎖信号ペプチドを含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

切断されたβ－ＣＴＦがＡβペプチド変異体配列、膜貫通ドメイン配列および細胞質配列を含む、請求項４１乃至４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

膜貫通ドメイン配列が、配列番号：９、配列番号：１８、配列番号：８６または配列番号：８７を含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

細胞質配列が膜固定（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）、ガンマ－セクレターゼ切断の促進、および／またはＡβペプチド変異体の細胞外放出のためのアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む、請求項４１乃至４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

細胞質配列が２つのリジン残基を含むアミノ酸配列に相応する、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

細胞質配列が３つのリジン残基を含むアミノ酸配列に相応する、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

細胞質配列は、５’から３’方向にアルギニン残基に引き続き、２つのリジン残基を含むアミノ酸配列に相応する、請求項４６に記載の方法。

【請求項50】

ミニ遺伝子は、配列番号：８、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７または配列番号：３８と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４０乃至４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

ミニ遺伝子は、配列番号：８、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７または配列番号：３８を含む、請求項４０乃至５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

ミニ遺伝子が配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４０乃至４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

ミニ遺伝子は、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０を含む、請求項４０乃至５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

ミニ遺伝子が配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４または配列番号：７５と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４０乃至４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

ミニ遺伝子は、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４または配列番号：７５を含む、請求項４０乃至５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

ミニ遺伝子が配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９または配列番号：８０と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４０乃至４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

ミニ遺伝子は、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９または配列番号：８０を含む、請求項４０乃至５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

ミニ遺伝子の発現が構成的なプロモーターによって調節される、請求項４０乃至５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

ミニ遺伝子の発現が組織－特異的または細胞－特異的プロモーターによって調節される、請求項４０乃至５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

細胞－特異的プロモーターがニューロン－特異的プロモーターである、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

ニューロン－特異的プロモーターがヒトシナプシンＩプロモーターである、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

組織－特異的プロモーターが脈絡叢－特異的プロモーターである、請求項５９に記載の方法。

【請求項63】

組織－特異的プロモーターがＰｒｌｒ、Ｓｐｉｎｔ２、またはＦ５である、請求項５９に記載の方法。

【請求項64】

ベクターがウイルスベクターまたは非－ウイルスベクターである、請求項１乃至６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

ベクターがアデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノ－関連ウイルスベクターである、請求項１乃至６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

ベクターがＡＡＶベクターである、請求項１乃至６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、ＡＡｖＤＪ、ＡＡＶｒｈｌＯ．ＸＸ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３７またはＰＨＰ．ｅＢ ＡＡＶである、請求項１乃至６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

ベクターがＡＡＶ９、ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、またはＡＡＶｒｈ．４３である、請求項１乃至６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

対象体の体重１ｋｇ当たり１×１０^８乃至１×１０^１８ベクターゲノムの用量が対象体に投与される、請求項１乃至６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

対象体の体重１ｋｇ当たり１×１０^１１乃至１×１０^１４ベクターゲノムの用量が対象体に投与される、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

対象体の体重１ｋｇ当たり１×１０^１２乃至１×１０^１５ベクターゲノムの用量が対象体に投与される、請求項６９に記載の方法。

【請求項72】

ベクターが対象体の細胞を形質導入し、対象体の細胞がミニ遺伝子を発現する、請求項１乃至７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

組成物が薬剤学的に許容される担体をさらに含む、請求項１乃至７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

薬剤学的に許容される担体がリポソーム、重合体ミセル、マイクロスフェアまたはナノ粒子を含む、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

組成物が全身的にまたは局所的へ伝達される、請求項１乃至７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

組成物が末梢注入を通じて全身的に中枢神経系へ伝達される、請求項１乃至７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

末梢注入は静脈注入である、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

組成物が脳脊髄液（ＣＳＦ）へ伝達される、請求項１乃至７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

組成物が非外科的な注入によって脳脊髄液（ＣＳＦ）へ伝達される、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

脳脊髄液（ＣＳＦ）への非外科的な注入は、非外科的脊髄腔内の注入を含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

組成物が非外科的な注入によって脳脊髄液（ＣＳＦ）へ伝達される、請求項７８に記載の方法。

【請求項82】

脳脊髄液（ＣＳＦ）への神経外科的な注入が大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ）への神経外科的な注入を含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

組成物が心室系へ伝達される、請求項１乃至７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

組成物が神経外科的な注入によって心室系へ伝達される、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

組成物が血液－脳関門（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）を通過する、請求項１乃至８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

組成物が対象体に１回伝達される、請求項１乃至８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

組成物がＡβペプチドオリゴマー、プロトフィブリルまたはフィブリル形成の開始前に伝達される、請求項１乃至８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

組成物がＡβペプチドオリゴマー、プロトフィブリルまたはフィブリル形成の開始後に伝達される、請求項１乃至８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

組成物がアミロイドプラーク形成の開始前に伝達される、請求項１乃至８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

組成物がアミロイドプラーク形成の開始後に伝達される、請求項１乃至８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

対象体が神経退行性疾患、障害または病態に対する一つ以上の追加療法の有効量を提供される、請求項１乃至９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

一つ以上の追加療法がアルツハイマー病薬物を含む、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

アルツハイマー病薬物がアデュカヌマブ、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンまたはタクリンを含む、請求項９２に記載の方法

【請求項94】

Ａβペプチド変異体をコードするベクターを含む薬剤学的組成物であって、Ａβペプチド変異体は、下記と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、薬剤学的組成物。

、またはその断片または機能的誘導体。

【請求項95】

Ａβペプチド変異体が配列番号：３と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載の組成物。

【請求項96】

Ａβペプチド変異体が配列番号：３、またはその断片または機能的誘導体を含む、請求項９４または９５に記載の組成物。

【請求項97】

配列番号：３と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：３を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む、請求項９５または９６に記載の組成物。

【請求項98】

Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む、請求項９７に記載の組成物。

【請求項99】

配列番号：３と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：３を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む、請求項９５乃至９８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項100】

Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む、請求項９９に記載の組成物。

【請求項101】

配列番号：３の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＤＦＡＥ（配列番号：１０）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９５乃至１００のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項102】

Ａβペプチド変異体が配列番号：４と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載の組成物。

【請求項103】

Ａβペプチド変異体が配列番号：４、またはその断片または機能的誘導体を含む、請求項９４または１０２に記載の組成物。

【請求項104】

配列番号：４と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：４を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む、請求項１０２または１０３に記載の組成物。

【請求項105】

Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項106】

配列番号：４と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：４を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む、請求項１０２乃至１０５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項107】

Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む、請求項１０６に記載の組成物。

【請求項108】

配列番号：４の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＦＰＡＥ（配列番号：１１）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０２乃至１０７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項109】

Ａβペプチド変異体が配列番号：５と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載の組成物。

【請求項110】

Ａβペプチド変異体が配列番号：５、またはその断片または機能的誘導体を含む、請求項９４または１０９に記載の組成物。

【請求項111】

配列番号：５と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：５を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む、請求項１０９または１１０に記載の組成物。

【請求項112】

Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む、請求項１１１に記載の組成物。

【請求項113】

配列番号：５と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：５を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む、請求項１０９乃至１１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項114】

Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む、請求項１１３に記載の組成物。

【請求項115】

配列番号：５の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＤＦＡＥ（配列番号：１０）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０９乃至１１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項116】

Ａβペプチド変異体が配列番号：６と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載の組成物。

【請求項117】

Ａβペプチド変異体が配列番号：６、またはその断片または機能的誘導体を含む、請求項９４または１１６に記載の組成物。

【請求項118】

配列番号：６と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：６を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む、請求項１１６または１１７に記載の組成物。

【請求項119】

Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む、請求項１１８に記載の組成物。

【請求項120】

配列番号：６と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：６を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む、請求項１１６乃至１１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項121】

Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む、請求項１２０に記載の組成物。

【請求項122】

配列番号：６の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＰＦＡＥ（配列番号：１２）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１６乃至１２１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項123】

ベクターがＡβペプチド変異体をコードするミニ遺伝子をコードする、請求項９４乃至１２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項124】

Ａβペプチド変異体をコードするミニ遺伝子は、アミロイド前駆体タンパク質の切断されたベータ－カルボキシル－末端断片（β－ＣＴＦ）を含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列をコードする、請求項１２３に記載の組成物。

【請求項125】

切断されたβ－ＣＴＦが信号ペプチド配列に融合される、請求項１２４に記載の組成物。

【請求項126】

信号ペプチド配列がガウシアルシフェラーゼ信号ペプチドを含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列またはマウス免疫グロブリン重鎖信号ペプチドを含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む、請求項１２５に記載の組成物。

【請求項127】

切断されたβ－ＣＴＦがＡβペプチド変異体配列、膜貫通ドメイン配列および細胞質配列を含む、請求項１２４乃至１２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項128】

膜貫通ドメイン配列が配列番号：９、配列番号：１８、配列番号：８６または配列番号：８７を含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む、請求項１２７に記載の組成物。

【請求項129】

細胞質配列が膜固定（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）、ガンマ－セクレターゼ切断の促進、および／またはＡβペプチド変異体の細胞外放出のためのアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む、請求項１２４乃至１２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項130】

細胞質配列が２つのリジン残基を含むアミノ酸配列に相応する、請求項１２９に記載の組成物。

【請求項131】

細胞質配列が３つのリジン残基を含むアミノ酸配列に相応する、請求項１２９に記載の組成物。

【請求項132】

細胞質配列は５’から３’方向にアルギニン残基に引き続き、２つのリジン残基を含むアミノ酸配列に相応する、請求項１２９に記載の組成物。

【請求項133】

ミニ遺伝子が配列番号：８、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７または配列番号：３８と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２３乃至１３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項134】

ミニ遺伝子は、配列番号：８、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７または配列番号：３８を含む、請求項１２３乃至１３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項135】

ミニ遺伝子が配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、または配列番号：７０と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２３乃至１３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項136】

ミニ遺伝子は、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０を含む、請求項１２３乃至１３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項137】

ミニ遺伝子が配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、または配列番号：７５と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２３乃至１３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項138】

ミニ遺伝子は、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４または配列番号：７５を含む、請求項１２３乃至１３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項139】

ミニ遺伝子が配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９または配列番号：８０と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２３乃至１３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項140】

ミニ遺伝子は、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９または配列番号：８０を含む、請求項１２３乃至１３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項141】

ミニ遺伝子の発現が構成的なプロモーターによって調節される、請求項１２３乃至１４０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項142】

ミニ遺伝子の発現が組織－特異的または細胞－特異的プロモーターによって調節される、請求項１２３乃至１４１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項143】

細胞－特異的プロモーターがニューロン－特異的プロモーターである、請求項１４２に記載の組成物。

【請求項144】

ニューロン－特異的プロモーターがヒトシナプシンＩプロモーターである、請求項１４３に記載の組成物。

【請求項145】

組織－特異的プロモーターが脈絡叢－特異的プロモーターである、請求項１４２に記載の組成物。

【請求項146】

組織－特異的プロモーターがＰｒｌｒ、Ｓｐｉｎｔ２、またはＦ５である、請求項１４２に記載の組成物。

【請求項147】

ベクターがウイルスベクターまたは非－ウイルスベクターである、請求項９４乃至１４６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項148】

ベクターがアデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノ－関連ウイルスベクターである、請求項９４乃至１４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項149】

ベクターがＡＡＶベクターである、請求項９４乃至１４８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項150】

ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、ＡＡｖＤＪ、ＡＡＶｒｈｌＯ．ＸＸ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３７、またはＰＨＰ．ｅＢ ＡＡＶである、請求項９４乃至１４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項151】

ベクターが、ＡＡＶ９、ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、またはＡＡＶｒｈ．４３である、請求項９４乃至１５０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項152】

薬剤学的に許容される担体をさらに含む、請求項９４乃至１５１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項153】

薬剤学的に許容される担体がリポソーム、重合体ミセル、マイクロスフェアまたはナノ粒子を含む、請求項１５２に記載の組成物。

【請求項154】

神経退行性疾患、障害または病態に対する一つ以上の追加療法をさらに含む、請求項９４乃至１５３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項155】

一つ以上の追加療法がアルツハイマー病薬物を含む、請求項１５４に記載の組成物。

【請求項156】

アルツハイマー病薬物が、アデュカヌマブ、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンまたはタクリンを含む、請求項１５５に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２０年１２月１８日に出願された米国仮特許出願一連番号第６３／１２７，８１５号に対する優先権を主張し、その開示内容は、全文が本願に参照として含まれる。

【0002】

本発明は、米国国立予防衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）が授与したＮＳ０９２６１５、ＡＧ０５４１６０、ＡＧ０５６０２８およびＡＧ０５８１８８による政府支援により行われた。政府は、本発明に対する特定権利を有する。

【0003】

本開示内容の局面は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、タンパク質生物学、神経生物学および医学分野に関する。

【背景技術】

【0004】

アルツハイマー病（ＡＤ）は致命的な神経退行性障害であり、認知症の最もありがちな原因である。アルツハイマー病の病理学的な特徴は、患者の脳に神経線維のもつれ（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ）とアミロイド沈殿物が存在するということである。ベータ－アミロイドペプチド（Ａβ）およびその凝集形態はアミロイドプラークの主な構成成分である。Ａβ１－４２は特に凝集しやすく、オリゴマー、プロトフィブリル、不溶性フィブリルおよびプラークを形成する。操作された抗体療法はＡβ凝集を下げるのに効果的である；しかし、副作用プロファイルおよび繰り返し静脈伝達の要件は、アルツハイマー病のような神経退行性疾患の治療のための操作された抗体の広範囲な使用に障害を引き起こす。従って、Ａβペプチドのオリゴマー化および凝集を防止することができる高い特異性、低い毒性および延長された生体内の半減期を有する新規の治療アプローチが当業界に要求される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本開示内容の局面は、神経退行性疾患、障害または病態（例えば、アルツハイマー病）を有する対象体を治療するための方法および組成物を提供することによって、当業界の要求を扱っている。従って、一部の局面において、Ａβペプチド変異体、またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を投与する段階を含む、神経退行性疾患、障害または病態を有する対象体を治療し／治療するか、生体内でアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの凝集を抑制するか、または分解を促進するための方法および組成物が本発明に提供される。一部の実施様態において、開示されている方法は、神経退行性疾患、障害または病態を有する対象体を診断する段階と、神経退行性疾患、障害または病態の症状を有する対象体を診断する段階と、または神経退行性疾患、障害または病態を有する危険がある対象体を診断する段階とをまた含む。一部の実施様態において、神経退行性疾患、障害または病態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病認知症、血管性認知症、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、慢性外傷性脳症、ダウン症候群、および／または病的老化である。一部の実施様態において、神経退行性疾患、障害または病態はアルツハイマー病である。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示内容の実施様態は、神経退行性疾患、障害または病態を有する対象体を治療するための、および／または生体内のＡβペプチドの凝集を抑制するための方法および組成物を含む。本開示内容の方法は、下記段階のうち１、２、３、４、５個以上を含んでもよい：対象体にＡβペプチド変異体を提供する段階と、神経退行性疾患、障害または病態に対する一つ以上の追加療法を対象体に提供する段階と、神経退行性疾患、障害または病態がある対象体を診断する段階と、神経退行性疾患、障害または病態の症状を有すると対象体を診断する段階と、および神経退行性疾患、障害または病態を有する危険がある対象体を診断する段階。本開示内容の特定の実施様態は、先行要素および／または段階のうち一つ以上を除外してもよい。

【0007】

一部の局面において、Ａβペプチド変異体、またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を対象体に投与する段階を含む、対象体から神経退行性疾患、障害または病態を治療または予防する方法が本願に開示される。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを投与する段階は、タンパク質ミスフォールディング、内因性Ａβペプチド凝集、アミロイドプラークの形成、神経炎症、神経退行性、ニューロン損失またはシナプス損失を防止または減少させ；タウのレベル、タウのリン酸化またはリン酸化されたタウのレベルを減少させ；タウのシーディングまたは内因性Ａβペプチドのシーディングを鈍化させ／鈍化させるか、または認知改善を促進する。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体をコードするベクターを投与する段階は、内因性Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルまたはプラークの形成を防止または減少させる。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体をコードするベクターを投与する段階は、内因性Ａβペプチド集合体の細胞毒性を予防または減少させる。

【0008】

一部の局面において、少なくとも一つの生体内の内因性Ａβペプチドを、Ａβペプチド変異体をコードするベクターから治療学的有効量の発現されたＡβペプチド変異体と接触させる段階（前記ベクターは組成物に存在する）を含む生体内の内因性Ａβペプチドの凝集を抑制する方法が本願に記載されている。一部の実施様態において、内因性Ａβペプチドの凝集を抑制する方法は、対象体から神経退行性疾患、障害または病態を治療または予防する。一部の実施様態において、内因性Ａβペプチドの凝集を抑制する方法は、内因性Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルまたはプラークの形成を防止または減少させる。一部の実施様態において、内因性Ａβペプチドの凝集を抑制する方法は、内因性Ａβペプチド凝集体の細胞毒性を防止または減少させる。

【0009】

一部の実施様態において、前記方法は、神経退行性疾患、障害または病態を有する対象体を診断する段階と、神経退行性疾患、障害または病態の症状を有する対象体を診断する段階と、および神経退行性疾病、障害または病態を有する危険がある対象体を診断する段階とをさらに含む。一部の実施様態において、神経退行性疾患、障害または病態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病認知症、血管性認知症、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、慢性外傷性脳症、ダウン症候群、および／または病的老化である。一部の実施様態において、神経退行性疾患、障害または病態はアルツハイマー病である。

【0010】

一部の局面において、Ａβペプチド変異体をコードするベクターを含む薬剤学的組成物が本願に開示される。

【0011】

本願に開示されている方法および組成物の一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、または配列番号：６、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６、またはその断片または機能的誘導体を含む。

【0012】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体が配列番号：３、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、配列番号：３、またはその断片または機能的誘導体を含む。一部の実施様態において、配列番号：３と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：３を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、配列番号：３と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：３を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、配列番号：３の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＤＦＡＥ（配列番号：１０）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0013】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体が配列番号：４、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、配列番号：４、またはその断片または機能的誘導体を含む。一部の実施様態において、配列番号：４と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：４を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、配列番号：４と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：４を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、配列番号：４の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＦＰＡＥ（配列番号：１１）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0014】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体が配列番号：５、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、配列番号：５、またはその断片または機能的誘導体を含む。一部の実施様態において、配列番号：５と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：５を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、配列番号：５と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：５を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、配列番号：５の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＤＦＡＥ（配列番号：１０）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0015】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体が配列番号：６、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、配列番号：６、またはその断片または機能的誘導体を含む。一部の実施様態において、配列番号：６と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：６を含むＡβペプチド変異体がＮ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、配列番号：６と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するか、または配列番号：６を含むＡβペプチド変異体がＣ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、配列番号：６の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＰＦＡＥ（配列番号：１２）と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0016】

本願に開示されている方法および組成物の一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、Ａβペプチド変異体をコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。一部の実施様態において、ベクターは、Ａβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドをコードする。

【0017】

一部の実施様態において、ベクターまたはベクターによってコードされたポリヌクレオチドは、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードする。一部の実施様態において、ベクターまたはベクターによってコードされたポリヌクレオチドは、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするミニ遺伝子をコードする。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体をコードするミニ遺伝子は、アミロイド前駆体タンパク質の切断されたベータ－カルボキシル－末端断片（β－ＣＴＦ）を含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列をコードする。一部の実施様態において、切断されたβ－ＣＴＦは信号ペプチド配列に融合される。一部の実施様態において、信号ペプチド配列は、ガウシアルシフェラーゼ信号ペプチドを含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列またはマウス免疫グロブリン重鎖信号ペプチドを含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む。一部の実施様態において、切断されたβ－ＣＴＦは、Ａβペプチド変異体配列、膜貫通ドメイン配列および細胞質配列を含む。一部の実施様態において、膜貫通ドメイン配列が配列番号：９、配列番号：１８、配列番号：８６または配列番号：８７を含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む。一部の実施様態において、細胞質配列は、膜固定（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）、ガンマ－セクレターゼ切断の促進、および／またはＡβペプチドの細胞外放出のためのアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む。一部の実施様態において、細胞質配列は２つのリジン残基を含むアミノ酸配列に相応する。一部の実施様態において、細胞質配列は３つのリジン残基を含むアミノ酸配列に相応する。一部の実施様態において、細胞質配列は５’から３’方向にアルギニン残基に引き続き、２つのリジン残基を含むアミノ酸配列に相応する。

【0018】

一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：８、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、または配列番号：３８と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：８、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７または配列番号：３８を含む。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、または配列番号：７０と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９または配列番号：７０を含む。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、または配列番号：７５と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４または配列番号：７５を含む。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、または配列番号：８０と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９または配列番号：８０を含む。

【0019】

一部の実施様態において、ミニ遺伝子の発現は、構成的なプロモーターによって調節される。一部の実施様態において、ミニ遺伝子の発現は、組織－特異的または細胞－特異的プロモーターによって調節される。一部の実施様態において、細胞－特異的プロモーターは、ニューロン－特異的プロモーターである。一部の実施様態において、ニューロン－特異的プロモーターはシナプシンプロモーターである。一部の実施様態において、組織－特異的プロモーターは、脈絡叢（ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ）－特異的プロモーターである。一部の実施様態において、組織－特異的プロモーターはＰｒｌｒ、Ｓｐｉｎｔ２、またはＦ５である。

【0020】

一部の実施様態において、Ａβペプチドまたはその断片または機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドはベクターに含まれる。一部の実施様態において、ベクターはウイルスベクターまたは非－ウイルスベクターである。一部の実施様態において、ベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノ－関連ウイルスベクターである。特定の実施様態において、ベクターはＡＡＶベクターである。一部の実施様態において、ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶｒｈｌＯ．ＸＸ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３７、またはＰＨＰ．ｅＢ ＡＡＶである。一部の実施様態において、ベクターは、ＡＡＶ９、ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、またはＡＡＶｒｈ．４３である。

【0021】

一部の実施様態において、対象体の体重１ｋｇ当たり１×１０^８乃至１×１０^１８ベクターゲノムの用量が対象体に投与される。一部の実施様態において、対象体の体重１ｋｇ当たり約１×１０^１１乃至約１×１０^１４ベクターゲノムの用量が対象体に投与される。一部の実施様態において、対象体の体重１ｋｇ当たり約１×１０^１２乃至約１×１０^１５ベクターゲノムの用量が対象体に投与される。一部の実施様態において、ベクターは対象体の細胞を形質導入し、対象体の細胞はミニ遺伝子を発現する。

【0022】

本願に開示されている方法および組成物の一部の実施様態において、組成物は薬剤学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施様態において、薬剤学的に許容される担体は、リポソーム、重合体ミセル、マイクロスフェアまたはナノ粒子を含む。

【0023】

一部の実施様態において、組成物が全身的にまたは局所的に伝達される。一部の実施様態において、組成物が末梢注入を通じて全身的に中枢神経系へ伝達される。一部の実施様態において、末梢注入は静脈注入である。一部の実施様態において、組成物が脳脊髄液（ＣＳＦ）へ伝達される。一部の実施様態において、組成物は非外科的な注入によって脳脊髄液（ＣＳＦ）へ伝達される。一部の実施様態において、脳脊髄液（ＣＳＦ）への非外科的な注入は非外科的脊髄腔内注入を含む。一部の実施様態において、組成物は、神経外科的な注入によって脳脊髄液（ＣＳＦ）へ伝達される。一部の実施様態において、脳脊髄液への神経外科的な注入は、大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ）への神経外科的な注入を含む。一部の実施様態において、組成物は心室系に伝達される。一部の実施様態において、組成物は、神経外科的な注入によって心室系に伝達される。一部の実施様態において、組成物は血液－脳関門（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）を通過する。

【0024】

一部の実施様態において、組成物が対象体に１回伝達される。一部の実施様態において、組成物がＡβペプチドオリゴマー、プロトフィブリルまたはフィブリル形成の開始前に伝達される。一部の実施様態において、組成物がＡβペプチドオリゴマー、プロトフィブリルまたはフィブリル形成の開始後に伝達される。一部の実施様態において、組成物がアミロイドプラーク形成の開始前に伝達される。一部の実施様態において、組成物がアミロイドプラーク形成の開始後に伝達される。

【0025】

一部の実施様態において、対象体は、神経退行性疾患、障害または病態に対する一つ以上の追加療法の有効量が提供される。一部の実施様態において、一つ以上の追加療法はアルツハイマー病薬物を含む。一部の実施様態において、アルツハイマー病薬物は、アデュカヌマブ、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンまたはタクリンを含む。

【0026】

「個体」、「対象体」および「患者」は相互交換的に用いられ、ヒトまたは非ヒトを指称してもよい。

【0027】

本出願の全体にわたって、用語「およそ」は、値が測定または定量化方法に対する固有の誤差範囲を含むことを示すのに用いられる。

【0028】

用語「含む」を組み合わせて用いる場合、単語「一つ」または「一つの」の使用は「一つ」を意味してもよいが、「一つ以上」、「少なくとも一つ」および「一つまたは一つ以上」の意味とも一致する。

【0029】

文句「および／または」は「および」または「または」を意味する。例えば、Ａ、Ｂおよび／またはＣは、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢの組み合わせ、ＡおよびＣの組み合わせ、ＢおよびＣの組み合わせ、またはＡ、ＢおよびＣの組み合わせを含む。すなわち、「および／または」は包括または包括しないものと機能する。

【0030】

単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（およびすべての「含む」および「を含む」のような含む形態）、「有している」（およびすべての「有する」および「有している」のような有する形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（およびすべての「含む」および「を含む」のような含みの形態）または「含有する」（およびすべての「含有する」および「を含有する」のような含有の形態）は、包括的であるか、または制限がなく、さらに言及されない要素または方法の段階を排除しない。

【0031】

使用のための組成物および方法は、明細書の全般にわたって開示されている任意の成分または段階を「含み」、「本質的に構成」または「構成」することができる。開示されている任意の成分または段階で「本質的に構成された」組成物および方法は、請求された発明の基本的で新規の特徴に実質的に影響を及ぼすことのない特定材料または段階に請求の範囲を制限する。

【0032】

治療、診断または生理学的目的または効果と関連して、任意の方法は記載されている治療学的、診断学的または生理学的な目的または効果を達成または具現するために本願において議論された任意の化合物、組成物または製剤の「用途」のような「用途」の請求用語として記載されてもよい。

【0033】

本明細書において議論された任意の実施様態は、本発明の任意の方法または組成物と関連して具現されてもよく、その反対も可能であるということが考慮される。また、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために用いられてもよい。

【0034】

本発明の別の目的、特徴および長所は、次の詳細な説明から明らかになるだろう。しかし、詳細な説明および特定例は、本発明の具体的な実施様態を示すが、単に例示として与えられるということを理解しなければならず、これは、本発明の思想および範囲内における多様な変化および修正が詳細な説明から当業者に明白であるためである。

【0035】

次の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定局面をさらに立証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示されている特定実施例の詳細な説明とともにこれらの図面のうち一つ以上を参照することでさらによく理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】図１Ａ～１Ｅは、変異体Ａβペプチドが野生型Ａβのフィブリル化および細胞毒性を減少させることを示す。図１Ａは、野生型（ＷＴ）Ａβ４２と比べて変異体ペプチドの自己－凝集に対するチオフラビン－Ｔ（ＴｈＴ）検定を示す。５種類の変異体のうちいずれも反応中に自己凝集を示しておらず；比較のためにＷＴ Ａβ４２（緑色）は１時間以内にＴｈＴ結合停滞期に到達した。図１Ｂは、ＷＴ Ａβ４２凝集の抑制を試験する競争検定を示す。各変異体をＷＴ Ａβ４２と１：１で混合してＴｈＴとともにインキュベーションした。Ｖ１８ＰはＷＴペプチドの凝集を悪化させ；他の４個の変異体はフィブリル化を減少させた。Ｆ２０Ｐ（赤色）およびＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ（青色）は凝集を防止して追加の研究のために選択された。図１Ｃは、Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐに対するフィブリルの分解検定を示す。ＷＴ Ａβ４２フィブリルを多様な濃度の単量体Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐペプチドに露出させた。フィブリル単独と比べてＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐとのインキュベーションは、Ａβフィブリルの分解と一致するＴｈＴ蛍光の濃度－依存的な減少を生成した。図１Ｄは、Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐについて記述されているように、Ｆ２０Ｐに対するフィブリルの分解を示す。Ｆ２０ＰはまたＴｈＴ蛍光を濃度－依存的に減少させたが、Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐよりかなり効果的でなかった。図１Ｅは、野生型Ａβ４２オリゴマー（緑色）と異なり、Ｆ２０Ｐ（赤色）またはＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ（青色）がＮ２ａ細胞自体の毒性を誘発することなく、二つの変異体のすべてが非処理された対照群（黒色）と類似していることをみせるＭＴＳ分析を示す。対照的に、オリゴマーＡβを形成する間、任意の変異体とＷＴ Ａβの等モル共インキュベーションは、後続Ｎ２ａ細胞毒性を減少させた。Ｘ軸値は、試験のためにＮ２ａ培地に追加された１００μＬのオリゴマーＡβ反応の体積（μｌ）を示す。これは、０．１または１０μＭの単量体ＷＴ Ａβ４２出発物質および同一の量の変異体ペプチド（表示された場合）に相当する。ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ ＷＴ Ａβ４２単独との比較のためのボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）事後検定。すべてのデータは、平均±ＳＥＭで表示される。

【図2】図２Ａ～２Ｄは、変異体Ａβの効率的な分泌のために最適化された発現構築物を示す。図２Ａは、γ－セクレターゼ切断に十分な最も短いＣＴＦ断片を確認するために用いられる順次的欠失ストラテジーを示す。構築物をＮ２ａ細胞によりトランスフェクトさせて培地からＡβを回収して分泌を測定した。最適の構築物は、全体膜貫通ドメインと２つの細胞内リジン（ＫＫ）を含んだ。このミニ遺伝子は、全長ＣＴＦと同等なＡβ分泌を達成した（左側ブロット、矢印は末端残基で表示された各構築物に対する分泌されたＡβ対比切断されていないＡβ＋残存膜貫通（ＴＭ）ドメインを示す）。‘ＫＫ’最小構築物を用いた野生型Ａβ４２の分泌は、β－セクレターゼ抑制剤ＬＹ４１１５７５によって用量依存的方式で遮断された（右側ブロット、矢印は再び分泌されたＡβ対比切断されていないＡβ＋ＴＭドメイン、ｎＭ単位のＧＳＩ濃度を示す）。図２Ｂは、生体内の変異体Ａβペプチドの伝達のためのＡＡＶベクターの設計をみせる。発現カセットは、ＡβのＮ－末端にガウシアルシフェラーゼ信号ペプチドに引き続き、Ａβ４２変異体および最小ＡＰＰ Ｃ－末端膜貫通配列を含み、いずれもＣＡＧプロモーターによって制御される。図２Ｃは、免疫沈殿されたＡβの質量分光分析を用いた全長変異体Ａβの細胞外放出を示す。Ａβ Ｆ２０Ｐを発現するＮ２ａ細胞を用いて６Ｅ１０免疫沈殿によって培地から分泌されたペプチドを分離した。溶出されたペプチドのＭＳ１スペクトルは、Ａβ４０ Ｆ２０ＰおよびＡβ４２ Ｆ２０Ｐに対する予想質量を表示する（データは図示していない）。＋５電荷状態のｍ／ｚ＝８５６．４４４１における完全なＡβ４０ Ｆ２０Ｐのピークは、４，２７７．１８４１ Ｄａの単一同位元素質量を示す一方、最も豊富な同位元素は、４，２７９．１８５１ Ｄａの質量を示し、予想質量の１０ｐｐｍ誤差内にある。図２Ｄは、Ａβ４０ Ｆ２０Ｐの質量と一致するペプチドのＭＳ２断片化をみせ、２０ｐｐｍ未満の断片イオン許容誤差により配列同一性を確認する。

【図3】図３Ａ～３Ｇは、新生児ＡＡＶ注入が変異体Ａβの神経発現を生成することを立証する。Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４ＰまたはＦ２０Ｐ ＡβをコードするＡＡＶを野生型新生児マウスの側脳室に注入した。３週間または７ヶ月後、免疫染色および／またはＥＬＩＳＡ分析のためにマウスを回収した。図３Ａは、ＡＡＶ－Ｆ２０ＰのＰ０注入３週間後に回収された抗－ヒトＡβ免疫染色（６Ｅ１０、緑色）が矢状切片の皮質で広範囲なウイルスの発現を立証することをみせる。図３Ｂは、ウイルス－伝達変異体Ａβ（（Ｆ２０Ｐ；６Ｅ１０、緑色）および内因性マウスＡＰＰ（Ｙ１８８、赤色）に対する共染色が優れた一致性を立証することをみせ、これは、皮質ニューロンで変異体ペプチドの膜伝達を示唆する。図３Ｃは、生体内全長変異体Ａβの生成を確認するための免疫沈殿されたＡβの質量分光分析法をみせる。Ａβ Ｆ２０Ｐを発現するマウスを用いて６Ｅ１０免疫沈殿によって脳ホモジナイズ液からペプチドを分離した。溶出されたペプチドのＭＳ１スペクトルは、Ａβ４２ Ｆ２０Ｐ（表示される）およびＡβ４０ Ｆ２０Ｐに対する予想質量を表示する。＋５電荷状態（ｄ＝０．２）を有するｍ／ｚ＝８９３．２６７５における完全なＡβ４２ Ｆ２０Ｐのピークは、４，４６１．３０１１ Ｄａの単一同位元素質量を示すのに対し、最も豊富な同位元素の構成は、４，４６３．３１３６ Ｄａであり、予想質量の１５ｐｐｍ誤差内にある。図３Ｄは、Ａβ４２ Ｆ２０Ｐの配列同一性を確認するためのペプチドのＭＳ２断片化をみせ、断片イオン許容誤差は２０ｐｐｍである。図３Ｅは、３週齢に安楽死させた野生型マウスからの前頭葉ホモジネートの可溶性分画でＥＬＩＳＡによって検出されたヒトＡβを示す。二つの変異体はすべてヒトＡβ４２を生成し、Ａβ４０はＦ２０Ｐで形質導入されたマウスでのみ検出された。Ｆ２０Ｐは注入されていないマウスに比べて高いレベルのＡβ４０を生成したのに対し、Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐは無視できるレベルでＡβ４０の生成を示し、変異体ペプチド（グラフでＦ１９Ｄと略称される）の不良な検出のためであると推測される。Ａβ４２の生成は野生型γ－セクレターゼ部位をコードする構築物について予想されるようにＡβ４０よりも低かった。図３Ｆで変異体ヒトＡβの発現はＰ０ウイルス注入の後７．５ヶ月後にも依然としてＥＬＩＳＡによって検出され得ることを示す。図面内の値は非－トランスジェニック動物の前頭葉ホモジネートの溶解性分画に関するものである。パネルＣとＤの絶対値は他の製造ロットのキットを用いて別の時間に検定を行ったため、直接比較することはできない。図３Ｇにおいて、各変異体によって生成されたＡβ４０：４２の割合は３週間（上部パネル）と７．５ヶ月（下部パネル）との間に一定に維持される。ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データは、平均±ＳＥＭで表示される。ｎ＝２－１０／処理。

【図4】図４Ａ～４Ｃは、変異体Ａβの生涯にわたる発現がＡＰＰ／ＰＳ１マウスでプラーク負荷およびＡβ蓄積を減少させることを立証する。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにＡβ Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４ＰまたはＦ２０ＰをコードするＡＡＶをＰ０に注入し、７．５ヶ月後に回収した。図４Ａは、Ａβ免疫染色が変異体Ａβペプチドで処理されたマウスで減少されたプラーク蓄積を示すことをみせる。図４Ｂは、％Ａβ面積で測定された皮質プラーク負荷が非処理されたマウスよりＦ２０Ｐマウスがさらに少ないアミロイドを有することを確認することをみせる。ｎ＝５未注入、ｎ＝４ Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ、ｎ＝８ Ｆ２０Ｐ。図４Ｃは、皮質組織のグアニジン抽出物でヒトＡβペプチドに対するＭＳＤ ＥＬＩＳＡがプラーク組織学を反映することをみせる。Ａβ４０のレベルは二つの変異体のすべてで減少したのに対し、Ｆ２０ＰはＡβ４２のレベルも減少した。Ａβの減少はＦ２０Ｐで有意味なレベルに至り、Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐで傾向を示した。ｎ＝８未注入、ｎ＝５ Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ、ｎ＝１２ Ｆ２０Ｐ。ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データは、平均±ＳＥＭで表示される。

【図5】図５Ａ～５Ｂは、転移遺伝子発現の空間的分布およびタイミングを制御するためのウイルス血清型の使用を立証する。図５Ａは、末梢注入後のＣＮＳの発現を立証するために用いられた赤色蛍光タンパク質をコードするＰＨＰ．ｅＢウイルスを示す。ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏをコードするＰＨＰ．ｅＢの１．６×１０^１１粒子を生後３ヶ月になったマウスの後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）へ注入し；２週間後にマウスを回収した。図５Ｂは、図３において用いられたＡＡＶ８と異なり、低力価ＡＡＶ１は新生児マウスの側脳室に注入されるとき、上衣細胞を優先的に形質導入することを示す。第４脳室にウイルスが拡散されることに注目する。図面内の挿入物はさらに高い倍率で側脳室（ボックス型）を示す。ＡＡＶ４またはＡＡＶ５のような代替血清型は側脳室に注入されるとき、上衣細胞に対する特異性を提供するために用いられてもよい。

【図6】図６Ａ－６Ｄは、変異体Ａβペプチドがプラーク負荷に相応する反応性神経膠症を減少させるということをみせる。ＡＰＰ／ＰＳ１および野生型（非－トランスジェニック、ＮＴＧ）マウスのすべてはＦ２０Ｐ変異体Ａβを伝達するためにｉｃｖ Ｐ０ウイルス注入の後、７．５ヶ月に回収された。非注入されたシブリング（ｓｉｂｌｉｎｇ）が比較のために用いられた。図６Ａ、６Ｂは、星状細胞の検出に用いられるＧＦＡＰ免疫染色；ミクログリア細胞を検出するＩｂａ１を示す。最も下の行に表示された蛍光免疫染色はアミロイドプラークを検出するためにチオフラビン－Ｓで対照染色された。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスでＦ２０Ｐ処理によって神経グリア病巣のサイズと周辺細胞の数が注入されていない動物（上段および下段の列）に比べて全て減少した。対照的に、ウイルスの注入は、ＮＴＧマウスでミクログリア細胞の形態または密度に影響を及ぼしていないが、脳梁（真ん中の列）に沿ってＧＦＡＰ＋細胞の数を増加させた。図６Ｃは、ＧＦＡＰおよびＩｂａ１に対する比色免疫染色の定量化を見せるものであって、Ｆ２０Ｐの処理がＡＰＰ／ＰＳ１マウスで相応するグリア細胞染色領域を減少させたが、注入されていない対照群と比べてＮＴＧマウスでＧＦＡＰのレベルを上昇させたという定性的発見を確認させてくれる。図６Ｄは、ヒトＡβのウイルス発現は前脳星状細胞の下位集合で検出された。Ｆ２０Ｐを注入したＮＴＧマウスでヒトＡβ（６Ｅ１０、緑色）およびＧＦＡＰ（赤色）に対する共免疫蛍光は希薄な共標識細胞（矢印）を検出した。ＡＰＰ／ＰＳ１ ｎ＝５未注入、ｎ＝７－８ Ｆ２０Ｐ；ＮＴＧ ｎ＝５－６未注入、ｎ＝５ Ｆ２０Ｐ。抗ヒトＡβ抗体６Ｅ１０（緑色）で共標識されたＧＦＡＰ＋星状細胞（赤色）の小さな部分は、ＡＡＶ注入によってＰ０で形質導入されたことを示唆する。両方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データは、平均±ＳＥＭで表示される。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本発明は、少なくとも部分的に一部のアミロイドベータ（Ａβ）ペプチド変異体、変異体をコードするベクター、または変異体Ａβペプチドのタンパク質の発現を可能にするミニ遺伝子をコードするベクターは、内因性Ａβペプチドの凝集を抑制できるという驚くべき発見に基づく。また、前記変異体をコードするベクターまたは変異体Ａβペプチドのタンパク質の発現を可能にするミニ遺伝子をコードするベクターを投与することは、驚くべきことに内因性Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルまたはプラークの形成および内因性Ａβペプチド凝集体の内因性形成の細胞毒性を防止または減少させるものと明かにされた。本願に開示されているように、Ａβペプチド変異体をコードするベクターまたは変異体Ａβペプチドのタンパク質の発現を可能にするミニ遺伝子をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物の投与は、タンパク質ミスフォールディング、内因性Ａβペプチドの凝集、アミロイドプラークの形成、神経炎症、神経退行性、ニューロン損失またはシナプス損失を予防または減少させることができ；タウのレベル（ｔａｕ ｌｅｖｅｌ）、タウのリン酸化またはリン酸化されたタウのレベルを減少させることができ；タウのシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）または内因性Ａβペプチドのシーディングを鈍化させることができ／できるか、または認知改善を促進することができる。

【0038】

従って、一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体をコードするベクターまたは変異体Ａβペプチドのタンパク質の発現を可能にするミニ遺伝子をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を投与する段階を含む、対象体から神経退行性疾患、障害または病態を治療または予防するか、または生体内で内因性Ａβペプチドの凝集を抑制するための方法および組成物が開示される。一部の実施様態において、神経退行性疾患、障害または病態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病認知症、血管性認知症、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、慢性外傷性脳症、ダウン症候群、および／または病的老化である。一部の実施様態において、神経退行性疾患、障害または病態はアルツハイマー病である。一部の実施様態において、対象体は、神経退行性疾患、障害または病態、神経退行性疾患、障害または病態の症状で先立って診断されたか、または神経退行性疾患、障害または病態を有する危険がある。

【0039】

Ｉ．神経退行性疾患、障害および病態
一部の実施様態において、神経退行性疾患を治療する方法が開示される。本願において用いられる用語「神経退行性疾患、障害または病態」または「神経退行性疾患」は、主にヒトの脳のニューロンに影響を及ぼしてニューロンの構造または機能の漸進的な損失（ニューロンの死滅を含む）をもたらす状態を指称する。神経退行性疾患は具体的に下記の類型であってもよいが、これに制限されることはない：アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病認知症、血管性認知症、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、慢性外傷性脳症、ダウン症候群、および／または病的老化。一部の実施様態において、神経退行性疾患はアルツハイマー病である。

【0040】

神経退行性疾患は、脳または末梢神経系の神経細胞の進行性変性および／または死滅をもたらす不治の衰弱状態である。これは動きまたは精神機能（認知症という）に問題を引き起こす。認知症は日常生活と活動に支障を与える程度に認知機能、例えば、思考、記憶、推論および行動能力の喪失である。認知症はヒトの機能に影響を及ぼし始めたばかりの最も軽微な段階から日常生活の基本活動を他人に完全に依存しなければならない最も深刻な段階まで重症度の範囲が広い。

【0041】

認知症の原因は、発生し得る脳の変化の類型に応じて多様であり得る。認知症は神経退行性疾患の最も大きい負担を担当し、アルツハイマー病は認知症事例の約６０～７０％を示す。２０１６年には、約５４０万人のアメリカ人がアルツハイマー病を病んでいた。他の認知症としては、レビー小体型認知症、前側頭葉障害、および血管性認知症を含む。一部の場合には、患者が二つ以上の類型の認知症が結合された混合型認知症を有する場合がある。例えば、一部の患者はアルツハイマー病と血管性認知症を全て有している。

【0042】

アルツハイマー病（ＡＤ）は大脳皮質および特定皮質の下部構造でニューロンおよびシナプスの損失をもたらす慢性神経退行性疾患であって、側頭葉、頭頂葉、前頭葉皮質および帯状回（ｃｉｎｇｕｌａｔｅ ｇｙｒｕｓ）の一部が総体的に委縮し、退行（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）される。退行は青斑のような脳幹核にも存在する可能性がある。ＭＲＩとＰＥＴを用いた研究では、アルツハイマー病患者が軽微な認知障害からアルツハイマー病へ進行することによって健康な老人の類似したイメージと比較してアルツハイマー患者の特定の脳領域の大きさが減少したことを記録した。アルツハイマー病病理学は、主に正常な脳機能と化学作用を妨害し、神経伝達物質の相当な欠乏をもたらして脳機能の漸進的な損失をもたらす老人性プラークおよび神経線維のもつれの存在を特徴とする。非正常的な量のベータ－アミロイドとタウタンパク質が脳で形成され、脳細胞を蚕食し始めてプラークと神経線維のもつれを形成する。アミロイドプラークと神経線維のもつれは両方ともアルツハイマー病にかかった脳、特に海馬で顕微鏡にて明確に見られる。多数の高齢人から老化の結果で一部のプラークともつれが発生するが、アルツハイマー病患者の脳は側頭葉のような特定脳領域にさらに多い量のプラークともつれを有する。

【0043】

最もありがちな初期症状としては、最近の出来事を記憶するのに経験する困難である。アルツハイマー病が進行するにつれて、症状は、言語問題、方向感覚の喪失、気分の変化、動機喪失、セルフケアの誤った管理および行動問題を含み得る。さらに深刻なアルツハイマー病患者はたびたび家族と社会から退く。漸次的に、身体機能を喪失し、究極的に死亡に至ることになる。進行速度は多様であり得るが、アルツハイマー病診断の後、一般的な期待寿命は３年から９年である。

【0044】

Ａ．アルツハイマー病の過程
疾患の過程は、認知および機能障害の漸進的なパターンとともに明らかな段階に分けられる。前臨床アルツハイマー病はＰＥＴまたはＣＳＦ検査によって検出されたアミロイドのようなアルツハイマー病に対するバイオマーカーの存在を特徴とする。軽度認知障害（ＭＣＩ）はアルツハイマー病症状の発病を特徴とする。これはたびたび正常な老化と認知症との間の過渡期段階であると明らかにされた。ＭＣＩは多様な症状を示すことができ、記憶喪失が主な症状である場合、「記憶喪失性ＭＣＩ」とし、アルツハイマー病の前駆段階として頻繁に見なされる。最初の症状はたびたび老化やストレスに起因すると誤って思うが、詳細な神経心理学的検査を通じて、アルツハイマー病の診断のための臨床的基準が満たされる最大８年前に軽微な認知障害が現れることがある。最も著しい欠点は短期記憶喪失であって、最近学んだ事実を記憶するのに困難であり、新たな情報を習得できないものと現れる。注意力、計画、柔軟性および抽象的思考のような実行機能の微妙な問題または意味論的記憶、意味記憶および概念関係の損傷も初期アルツハイマー病の症状であり得る。無関心も観察されることがあり、疾患が進められる間、最も持続的な神経精神科的症状として残る。抑うつ症状、過敏性、微妙な記憶力障害に対する認識減少もよくみられる。

【0045】

アルツハイマー病患者における学習および記憶障害の増加は、結局のところ、最終的な診断に繋がる。少数割合の患者において、言語、実行機能、知覚（認知不能症）または動作実行（運動不能症）の困難性が記憶力の問題よりさらに顕著である。アルツハイマー病はすべてのメモリー容量に同様に影響を与えるものではない。個体の人生に関する古い記憶（エピソード的記憶）、学習された事実（意味論的記憶）および暗示的記憶（物事を行う方法に対する身体の記憶）は、新たな事実や記憶より影響を受けない。言語問題は、主に語彙減少と単語流暢性の減少に特徴づけられ、口頭および書面言語の全般的な欠陥に繋がる。この段階においては、一般的に基本思考は適切に伝えることができる。微細な運動作業を行う間、特定動きの調整および計画の困難性または運動不能症が示されることがあるが、目立たない可能性がある。アルツハイマー病が進められることにつれて患者は多くの作業を独立的に行い続けることができるが、認知的に最も要求される活動には助けや監督が必要である場合がある。

【0046】

漸進的な悪化は、結局のところ、患者が日常生活の最も一般的な活動を遂行できなくなり、独立性を妨害する。語彙を記憶することができないことから言語障害が明らかになることがあり、これは、頻繁な誤った単語代替または意訳に繋がる。読み取りおよび書き能力は漸進的に喪失される場合がある。アルツハイマー病が進められることにつれて複雑な運動配列は不十分に調整される可能性があるので、転倒の危険が増加する。記憶力問題が悪化し、長期記憶力が損傷される可能性がある。行動および神経精神科的な変化がさらに広く広がり得、彷徨、過敏、泣きに繋がる不安定な影響、計画されていない攻撃性爆発または介護への抵抗が含まれ得る。日没症候群（Ｓｕｎｄｏｗｎｉｎｇ）が示されることもある。アルツハイマー病患者の約３０％は錯視誤認およびその他の妄想症状をみせる。患者はまた疾病不覚症（ａｎｏｓｏｇｎｏｓｉａ）と知られた疾患過程と限界に対する洞察力を喪失することもある。

【0047】

アルツハイマー病の最終の段階で、患者は介護人に全面的に依存することがある。言語は単なる句や一の単語にまで減少する場合があり、結局、言葉を完全に失うことになる。極度の無関心と脱力と同様に、攻撃性は依然として存在する可能性がある。筋肉量と運動性は患者が寝たきりになり、自分で食事をすることができない時点まで悪化する場合がある。死亡原因は一般的に疾患自体よりは感染や肺炎のような外部要因である。

【0048】

Ｂ．アルツハイマー病の原因
双子および家族研究の検討に基づいたアルツハイマー病の遺伝的遺伝性の範囲は４９％乃至７９％に至る。事例の約０．１％は早期発病家族性アルツハイマー病と知られた６５歳以前に発病する、家族形態の常染色体優性遺伝である。大部分の常染色体優性家族性アルツハイマー病の事例は、三種類の遺伝子：アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）とプレセニリン１および２をコードする遺伝子のうちの一つの突然変異に起因してもよい。ＡＰＰおよびプレセニリン遺伝子の大部分の突然変異は、老人性プラークの主成分であるベータ－アミロイドタンパク質（Ａ－ベータタンパク質またはＡβタンパク質）の生成を増加させるか、またはＡβ４２タンパク質（４２つのアミノ酸で構成される）対Ａβ４０タンパク質（４０個のアミノ酸で構成される）の割合を増加させる。一部の突然変異は、総Ａβレベルを増加させることなくＡβ４２およびＡβ４０のような他の主な形態のアミロイドベータタンパク質との間の割合を改造する。

【0049】

大部分のアルツハイマー病の事例は常染色体優性遺伝を示さず、環境および遺伝的差異が危険要因として作用する可能性がある散発性アルツハイマー病と言う。最もよく知られた遺伝的危険因子は、アポ脂質タンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ；ＡＰＯＥ）のε４対立遺伝子の遺伝である。アルツハイマー病患者の４０乃至８０％は少なくとも一つのＡＰＯＥε４対立遺伝子を有している。ＡＰＯＥε４対立遺伝子は異形接合体で３倍、同型接合体で１５倍まで疾患の危険を増加させる。ゲノム－全体関連研究（Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ；ＧＷＡＳ）は、アルツハイマー病の危険に影響を及ぼすものと見られる追加遺伝子で３０個以上の領域を発見した。これら遺伝子は、ＡＢＣＡ７、ＳＯＲＬ１、ＣＡＳＳ４、ＣＥＬＦ１、ＦＥＲＭＴ２、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＭＥ８、ＰＴＫ２Ｂ、ＳＯＲＬ１、ＺＣＷＰＷ１、ＳＬＣ２４Ａ４、ＣＬＵ、ＰＩＣＡＬＭ、ＣＲ１、ＢＩＮ１、ＭＳ４Ａ、ＡＢＣＡ７、ＥＰＨＡ１およびＣＤ２ＡＰを含むが、これに制限されるものではない。アルツハイマー病の危険にかかる追加遺伝子は、全文が本願に参照として含まれた文献［参照：ＢＷ Ｋｕｎｋｌｅの他．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５１、４１４～４３０（２０１９）］から見つけることができる。ＴＲＥＭ２遺伝子の対立遺伝子はまたアルツハイマー発病の危険が３乃至５倍さらに高いものと関連している。一部のＴＲＥＭ２変異体における脳のミクログリア細胞は、存在するベータ－アミロイドの量をこれ以上調節することができない。Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅなどの２０１８年の研究（遺伝子データおよび認知的に定義された後期発病アルツハイマー病の下位グループ。Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（２０１８）、具体的に、本明細書に全文が参照として含まれ、アルツハイマー病を記憶、言語、時空間および実行機能を含む６種類の範疇に区分して３０個のＳＮＰを追加する）によると、多くの単一塩基多形成（ＳＮＰ）がアルツハイマー病と関連している。

【0050】

日本血統の家族性アルツハイマー病は大阪突然変異として知られたＡＰＰのコドン６９３の欠失突然変異と関連しているものと明らかにされた。この突然変異を有した同型接合体はアルツハイマー病を発病させる。突然変異はＡβオリゴマー化を加速化するが、タンパク質はアミロイドフィブリルを形成しない。この突然変異を発現するマウスは、大阪突然変異によるアルツハイマー病のすべての一般的な病理を有している。

【0051】

ＡＰＰ遺伝子のコドン６７３におけるアラニンからバリンへの置換突然変異は、おそらくＡβの形成を促進することにより、アミロイドフィブリルの発達とともに同型接合体キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）でアルツハイマー病の危険を増加させるのに対し、Ａ６７３Ｖの異形接合体キャリアは、アルツハイマー病から保護され得る。この置換は、ベータ－セクレターゼ切断部位に隣接し、アミロイド生成経路を通じてベータ－セクレターゼによるＡＰＰ切断の増加をもたらす可能性がある。対照的に、６７３番の位置で同一のアラニンをスレオニン（Ａ６７３Ｔ）に置換すれば、アルツハイマー病を予防することができる。この置換は、ベータ－セクレターゼ切断部位に隣接し、試験管内でアミロイドベータの形成を４０％減少させることができる。

【0052】

また、細胞外Ａβ沈殿物がアルツハイマー病の根本原因であるという理論も提示された。この理論を裏付けるのは、２１番染色体にあるＡＰＰ遺伝子の位置だけでなく、追加の遺伝子コピーを有した多数の２１番三染色体性（ダウン症候群）患者が４０歳までＡＤの最も初期症状をみせるという事実である。また、ＡＰＯＥ４は、アルツハイマー病の主な遺伝的危険因子である（文献参照：例えば、Ｍ．Ｓａｆｉｅｈの他、ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７：６４（２０１９）、およびＣ．Ｇ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚの他、Ｆｒｏｎｔ．Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１：１４（２０１９）、具体的に、これらの文献は、全文が本明細書に参照として含まれる）。ヒトＡＰＰ遺伝子の突然変異形態を発現する形質転換マウスは、原線維性アミロイドプラークと空間学習欠陥があるアルツハイマー病－類似脳の病理を発病させる。

【0053】

Ａβ沈殿物はＡβ（Ａ－ベータペプチドまたはベータ－アミロイドと指称する）から形成され、長さは一般的に３９乃至４３個のアミノ酸である。Ａβペプチドは細胞膜を貫通する膜貫通タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるさらに大きいタンパク質の断片である。ＡＰＰは正常なニューロンの成長、生存および損傷後、復旧で役割をするものと見られる。アルツハイマー病で、ガンマ－セクレターゼとベータ－セクレターゼは、タンパク質の分解過程でともに作用してＡＰＰをさらに小さな断片に分けさせる。これらの断片は、老人性プラークまたはアミロイドプラークとして知られた稠密な細胞外沈殿物に自己組み立てすることができるベータ－アミロイドフィブリルを生成する。プラークは、ベータ－アミロイドペプチドとニューロンの外部および周辺の細胞物質からなった稠密かつ大部分不溶性の沈殿物である。実験的なワクチンは、初期ヒト実験でアミロイドプラークを除去するものと明らかになったが、認知症に対して有意な影響を与えてはおらず、これは、非－プラークＡβオリゴマーがＡβの主な病原性形態であることを示すことができる。アミロイド－由来拡散性リガンドともするこれらの毒性オリゴマーは、ニューロンの表面受容体に結合してシナプスの構造を変化させることで神経通信を妨害する。

【0054】

他の研究においては、タウタンパク質異常がアルツハイマー病カスケード（ＡＤ ｃａｓｃａｄｅ）を開始すると提案している。すべてのニューロンには、部分的に微細小管で構成された細胞骨格がある。タウタンパク質はリン酸化されるとき、微細小管を安定化させる。アルツハイマー病モデルにおけるタウは化学的変化を経て過リン酸化される。過リン酸化されたタウはタウの他の糸と対をなし始める。結局、神経細胞体の内部に神経線維のもつれを形成する。もつれ（神経原線維のもつれ）は過リン酸化されて細胞内部に蓄積される微細小管－関連タンパク質タウの集合体である。もつれが発生すれば、微細小管が分解され、細胞の細胞骨格構造が破壊し、ニューロンの輸送システムを崩壊する。最初には、ニューロンの間の生化学的通信の誤作動を引き起こし、後には細胞の死滅を引き起こすことができる。病原性タウはまた転位因子調節障害を通じてニューロン死滅を誘発することがある。

【0055】

年齢はアルツハイマー病の重要な危険要素である。脳の年齢－関連変化は、ニューロンに害を及ぼして他の類型の脳細胞に影響を及ぼし、アルツハイマー損傷に寄与することがある。年齢－関連変化は、脳の特定部分の委縮（収縮）、炎症、血管損傷、自由ラジカルとする不安定な分子生成、およびミトコンドリア機能障害（細胞内エネルギー生産の崩壊）を含む。従って、高齢（６０歳以上）はアルツハイマー病の危険因子である。

【0056】

アルツハイマー病の原因を説明するために提示されたいくつかの追加理論がある。例えば、炎症性仮説は、アルツハイマー病が神経退行性で絶頂に達する脳で自体的に持続する進行性炎症によって誘発されるということである。一部のモデルにおいては、感染性ウイルスおよび微生物作用剤がＡβとともに作用して神経炎症に対する陽性フィードバックメカニズムを生成するものと思われる。文献参照［Ａ．Ｌ．Ｋｏｍａｒｏｆｆ、ＪＡＭＡ ３２４（３）：２３９～２４０（２０２０）］。血液－脳関門（ＢＢＢ）の機能低下が関わり得るという神経血管仮説も提案されている。イオン性銅、鉄および亜鉛のような生体金属の細胞恒常性はアルツハイマー病においても破壊され；これらのイオンは、タウ、ＡＰＰおよびＡＰＯＥに影響を及ぼし、またこれらの影響を受け、これらの調節障害は病理学に寄与できる酸化ストレスを誘発し得る。また他の仮説は、老化の間、希突起グリア細胞および関連ミエリンの機能障害が軸索損傷に寄与して副作用としてアミロイドの生成およびタウの過リン酸化を誘発するということである。

【0057】

Ｃ．アルツハイマー病の診断
アルツハイマー病は、一般的に患者の病歴、親戚の病歴および行動観察に基づいて診断される。特徴的な神経学的および神経心理学的特徴の存在および代替条件の不在がこれを支持する。コンピュータ断層撮影または磁気共鳴映像および単一－光子放出コンピュータ断層撮影または陽電子放出断層撮影を用いた高度医療映像を用いて、他の脳の病理または認知症の下位類型を排除することができる。また、軽微な認知障害と代表される前駆段階でアルツハイマー病への転換を予測することができる。

【0058】

アルツハイマー病を診断するために米国国立老化研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｎ Ａｇｉｎｇ）およびアルツハイマー協会（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）ワークグループの研究フレームワークは、現在のところ、主なアルツハイマー病バイオマーカーを、病理学的変化類型に基づいて三種類の範疇であるβ－アミロイド（Ａ）、病理学的タウ（Ｔ）および神経退行性（Ｎ）に分けるバイオマーカー分類体系を用いる。ＡＴＮ命名法は、去る１０年間、アミロイド、タウおよび神経退行性マーカーとの間の関係に対する経験的な観察に基づく概念的なフレームワークを示す。「Ａ」はアミロイドプラークのアミロイド陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）映像によって、またはＡβ４２またはＡβ４２対Ａβ４０の割合として脳脊髄液（ＣＳＦ）で測定されたアミロイドβ（Ａβ）を指称する。「Ｔ」は、実質神経線維のもつれのＣＳＦリン酸化されたタウまたはタウＰＥＴ映像化によって測定されたタウ病理学を指称する。「Ｎ」は、例えば、海馬体積または皮質体積または厚さによって測定される神経退行性または神経損傷および機能障害を指称する。「Ａ」＋「Ｔ」は、アルツハイマー病に対する診断的特異性を有するものと見なされるのに対し、「Ｎ」は、アルツハイマー病の他に任意の数の病因を反映することができるので、アルツハイマー病の診断に特異的ではない。ＡＴＮシステムは、文献（ＤＳ Ｋｎｏｐｍａｎの他．、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ＆Ｄｅｍｅｎｔ．１４（４）：５６３～５７５（２０１８）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）に詳細に記載されている。

【0059】

記憶力検査を含む知的機能の評価は疾患の状態をさらに特性化することができる。医療機関は診断プロセスを標準化するために診断基準を構築した。１９８４年国立神経およびコミュニケーション障害および脳卒中研究所（ＮＩＮＣＤＳ）とアルツハイマー病および関連障害協会（ＡＤＲＤＡ、現在、アルツハイマー協会と知られている）は、最も一般的に用いられるＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡアルツハイマーの基準を確立し、認知障害および疑われる認知症症候群は、可能であるまたは蓋然性のあるアルツハイマー病の臨床的診断のための神経心理学的検査により確認されることを要求する。記憶力、言語、知覚能力、注意力、運動能力、方向性、問題解決および実行機能能力のような８種類の知的ドメインがアルツハイマー病において最も一般的に損傷される。これらのドメインは、米国精神科協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）で発行した精神障害診断および統計マニュアル（ＤＳＭ－ＩＶ－ＴＲ）に並べられたＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡアルツハイマーの基準と同一である。診断の基準と明確な組織病理学的な確認との間に優れた統計的信頼性と妥当性が示された。

【0060】

２０１１年米国国立老化研究所／アルツハイマー協会は、診断および治療に関する研究を進めるための高度なガイドラインを提供するために臨床医と科学者のためのアップデートされたアプローチを発表した。２０１１年のガイドラインはいくつかの重要な点において１９８４年の診断基準と異なる。これらの団体は、アルツハイマー病が３段階、すなわち無症状の初期前臨床段階；軽度認知障害の中間段階；および認知症症状が現れる最終段階のスペクトルに進行されるという点を認識する。１９８４年の基準は、認知症の最終段階である疾患の一段階のみを扱い；最初のまたは唯一の主な症状である記憶喪失を超えてアルツハイマー認知症の基準を拡張する。これらの団体は、単語探し能力や判断力のような認知の別の局面が先に損傷され得ることを認識する。１９８４年の基準は、アルツハイマー認知症の核心的な特徴として記憶喪失に焦点を置き；アルツハイマー認知症と非アルツハイマー認知症の間だけでなく、アルツハイマーと血管疾患のような発病に影響を及ぼす可能性がある障害の間の相違点と関連性に関するさらなる理解を反映する。１９８４年にはこのような関係がよく認識または理解されておらず、アルツハイマー疾患を診断するために根本的な脳疾患の指標であるバイオマーカーの潜在的使用を認識する。しかし、ガイドラインには、バイオマーカーが臨床設定よりは研究にのみほぼ独占的に用いられると明示されている。これらのバイオマーカーは、１９８４年に元々の基準が開発されたときに存在しておらず、一般的に、死亡後の剖検を通じて診断を確認した。

【0061】

ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）のような神経心理学的検査は、診断に必要な認知障害を評価するのに広く用いられる。初期のアルツハイマー病における神経学的検査は、認知症の別の原因を含めて別の疾患過程の結果と変わらない可能性がある明白な認知障害を除いては、一般的に正常な結果を提供する。追加の神経学的検査はアルツハイマー病およびその他の疾患の鑑別診断に重要である。家族構成員とのインタビューも疾患の評価に活用される。介護人は日常生活能力だけでなく、時間経過による患者の精神機能低下に関する重要な情報を提供することができる。介護者の観点は特に重要である場合があり、アルツハイマー病患者は、一般的に自分の欠陥を認識できないためである。

【0062】

補充検査は疾患の特徴に関する追加の情報を提供するか、または他の診断を排除するのに用いることができる。血液検査はアルツハイマー病ではない認知症の別の原因を識別することができる。また、甲状腺機能検査遂行、Ｂ１２評価、梅毒排除、代謝性問題排除（腎機能、電解質レベルおよび糖尿病検査を含む）、重金属（例えば、鉛、水銀）レベルおよび貧血評価が一般的である。抑うつ症はアルツハイマー病、認知障害の初期兆候と同時に、またはその上、原因である場合もあるため、抑うつ症に関する審理検査も用いることができる。

【0063】

ＩＩ．Ａβペプチド変異体
一部の実施様態において、開示されている組成物は少なくとも一つのタンパク質性分子を含む。一部の実施様態において、タンパク質性分子は、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドまたはその変異体を含む。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体を含むタンパク質性分子はポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施様態において、ポリヌクレオチドはベクターによってコードされる。一部の実施様態において、ポリヌクレオチドは、Ａβペプチドのタンパク質の発現を可能にするミニ遺伝子をコードするベクターによってコードされる。従って、一部の実施様態において、野生型または変異体Ａβペプチドまたはその断片または機能的誘導体は、ベクターによってコードされる。一部の実施様態において、Ａβペプチドまたはその断片または機能的誘導体は、Ａβペプチドのタンパク質の発現を可能にするミニ遺伝子をコードするベクターによってコードされる。

【0064】

Ａβペプチドはニューロンの膜を通じて透過する膜貫通タンパク質（ＡＰＰ）というさらに大きいタンパク質の断片である。代表的なｍＲＮＡ ＡＰＰ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿０００４８４で見出すことができ、次のアミノ酸配列を含む。

【0065】

ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡＬＥＶＰＴＤＧＮＡＧＬＬＡＥＰＱＩＡＭＦＣＧＲＬＮＭＨＭＮＶＱＮＧＫＷＤＳＤＰＳＧＴＫＴＣＩＤＴＫＥＧＩＬＱＹＣＱＥＶＹＰＥＬＱＩＴＮＶＶＥＡＮＱＰＶＴＩＱＮＷＣＫＲＧＲＫＱＣＫＴＨＰＨＦＶＩＰＹＲＣＬＶＧＥＦＶＳＤＡＬＬＶＰＤＫＣＫＦＬＨＱＥＲＭＤＶＣＥＴＨＬＨＷＨＴＶＡＫＥＴＣＳＥＫＳＴＮＬＨＤＹＧＭＬＬＰＣＧＩＤＫＦＲＧＶＥＦＶＣＣＰＬＡＥＥＳＤＮＶＤＳＡＤＡＥＥＤＤＳＤＶＷＷＧＧＡＤＴＤＹＡＤＧＳＥＤＫＶＶＥＶＡＥＥＥＥＶＡＥＶＥＥＥＥＡＤＤＤＥＤＤＥＤＧＤＥＶＥＥＥＡＥＥＰＹＥＥＡＴＥＲＴＴＳＩＡＴＴＴＴＴＴＴＥＳＶＥＥＶＶＲＥＶＣＳＥＱＡＥＴＧＰＣＲＡＭＩＳＲＷＹＦＤＶＴＥＧＫＣＡＰＦＦＹＧＧＣＧＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＭＡＶＣＧＳＡＭＳＱＳＬＬＫＴＴＱＥＰＬＡＲＤＰＶＫＬＰＴＴＡＡＳＴＰＤＡＶＤＫＹＬＥＴＰＧＤＥＮＥＨＡＨＦＱＫＡＫＥＲＬＥＡＫＨＲＥＲＭＳＱＶＭＲＥＷＥＥＡＥＲＱＡＫＮＬＰＫＡＤＫＫＡＶＩＱＨＦＱＥＫＶＥＳＬＥＱＥＡＡＮＥＲＱＱＬＶＥＴＨＭＡＲＶＥＡＭＬＮＤＲＲＲＬＡＬＥＮＹＩＴＡＬＱＡＶＰＰＲＰＲＨＶＦＮＭＬＫＫＹＶＲＡＥＱＫＤＲＱＨＴＬＫＨＦＥＨＶＲＭＶＤＰＫＫＡＡＱＩＲＳＱＶＭＴＨＬＲＶＩＹＥＲＭＮＱＳＬＳＬＬＹＮＶＰＡＶＡＥＥＩＱＤＥＶＤＥＬＬＱＫＥＱＮＹＳＤＤＶＬＡＮＭＩＳＥＰＲＩＳＹＧＮＤＡＬＭＰＳＬＴＥＴＫＴＴＶＥＬＬＰＶＮＧＥＦＳＬＤＤＬＱＰＷＨＳＦＧＡＤＳＶＰＡＮＴＥＮＥＶＥＰＶＤＡＲＰＡＡＤＲＧＬＴＴＲＰＧＳＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬＫＫＫＱＹＴＳＩＨＨＧＶＶＥＶＤＡＡＶＴＰＥＥＲＨＬＳＫＭＱＱＮＧＹＥＮＰＴＹＫＦＦＥＱＭＱＮ（配列番号：１）

【0066】

ガンマ－セクレターゼとベータ－セクレターゼはタンパク質の分解過程においてともに作用してＡＰＰがＡβ（アミロイドベータまたはＡ－ベータ）ペプチドと知られたさらに小さいアミノ酸断片に分けるようにする。ＡβペプチドのＣ－末端を生成するガンマ－セクレターゼは、ＡＰＰの膜貫通領域内で切断し、長さが３０乃至５１個のアミノ酸残基の多数のＣ－末端断片同型を生成することができる。これらのＣ－末端断片とは別途に、配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号：２）を含む４２つのアミノ酸Ａβペプチド断片もＡＰＰの切断によって生成される。これらの断片はプラークとして知られた稠密な細胞外沈着物で自己組み立てることができるベータ－アミロイドフィブリルを生成する。Ａβ４２はさらに疎水性であるため、最もアミロイド生成形態のペプチドである。しかし、中央アミノ酸配列ＫＬＶＦＦＡＥ（配列番号：３９）は、それ自体でアミロイドを形成するものと知られており、アミロイドフィブリルのコアを形成することができる。

【0067】

従って、本開示内容の一部の実施様態において、開示されている組成物は、野生型Ａβペプチドを含む。本開示内容の一部の実施様態において、開示されている組成物は、野生型Ａβペプチドの変異体を含む。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体は、内因性Ａβペプチドの凝集を促進する。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体は、オリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルまたはプラークで自己組み立てされる。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、内因性Ａβペプチドの凝集を防止する。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、オリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルまたはプラークで自己組み立てされない。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は残っているＡβペプチド凝集体の細胞毒性を減少させる。一部の実施様態において、本願に開示されている全長Ａβの変異体は、Ａβに対する親和度および特異性を増加させるために多重凝集ドメインの標的化を同時に許容する。

【0068】

一部の実施様態において、野生型Ａβペプチドは、ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号：２）、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、本開示内容の野生型Ａβペプチドは、配列番号：２、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：２の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＦＦＡＥ（配列番号：３９）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。

【0069】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含み、ここで太字の残基は、野生型Ａβペプチドからの置換を示す。一部の実施様態において、本開示内容のＡβペプチド変異体は、配列番号：３、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：３の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＤＦＡＥ（配列番号：１０）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。

【0070】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含み、ここで太字の残基は、野生型Ａβペプチドからの置換を示す。一部の実施様態において、本開示内容のＡβペプチド変異体は、配列番号：４、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：４の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＦＰＡＥ（配列番号：１１）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。

【0071】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含み、ここで太字の残基は、野生型Ａβペプチドからの置換を示す。一部の実施様態において、本開示内容のＡβペプチド変異体は、配列番号：５、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：５の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＤＦＡＥ（配列番号：１０）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。

【0072】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含み、ここで太字の残基は、野生型Ａβペプチドからの置換を示す。一部の実施様態において、本開示内容のＡβペプチド変異体は、配列番号：６、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：６の断片または機能的誘導体はＫＬＶＰＦＡＥ（配列番号：１２）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。

【0073】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含み、ここで太字の残基は、野生型Ａβペプチドからの置換を示す。一部の実施様態において、本開示内容のＡβペプチド変異体は、配列番号：７、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：７の断片または機能的誘導体は、ＫＬＰＦＦＡＥ（配列番号：６５）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、配列番号：７を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成されない。

【0074】

一部の実施様態において、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体はＮ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は１乃至２２つのアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む。

【0075】

一部の実施様態において、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体はＣ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｃ－末端切断は１乃至２７個のアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む。

【0076】

一部の実施様態において、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体はＮ－末端切断およびＣ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は１乃至２２つのアミノ酸切断を含み、Ｃ－末端切断は１乃至２７個のアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含み、Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む。

【0077】

一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体はポリペプチドを含む。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体は、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施様態において、ベクターは、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドをコードする。一部の実施様態において、ベクターまたはベクターによってコードされるポリヌクレオチドは、信号ペプチドに融合された野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードする。一部の実施様態において、ベクターまたはベクターによってコードされるポリヌクレオチドは、全体ＡＰＰベータ－カルボキシル－末端断片（β－ＣＴＦ）をコードし、β－ＣＴＦのＮ－末端で信号ペプチドに融合された野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体アミノ酸配列を含むアミロイド前駆体タンパク質の９９ Ｃ－末端アミノ酸を含む。

【0078】

一部の実施様態において、ベクターまたはベクターによってコードされるポリヌクレオチドは、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするミニ遺伝子をコードする。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、β－ＣＴＦのＮ－末端で信号ペプチドに融合された切断されたβ－ＣＴＦを含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列をコードする。一部の実施様態において、切断されたβ－ＣＴＦは、細胞外および膜貫通アミノ酸のすべてが、膜貫通ドメインアミノ酸配列、および細胞質アミノ酸配列を含む野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体アミノ酸配列（またはその断片または機能的誘導体）を含む。

【0079】

従って、一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、本願に開示されている任意の信号ペプチド、本願に開示されている野生型Ａβペプチドまたは任意のＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体、本願に開示されている任意の膜貫通ドメインアミノ酸配列、および本願に開示されている任意の細胞質アミノ酸配列をコードすることができる。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、本願に開示されている信号ペプチド、本願に開示されている野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体、本願に開示されている膜貫通ドメインアミノ酸配列、および本願に開示されている細胞質アミノ酸配列を５’から３’方向にコードする。

【0080】

一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含み、ここで太字は、Ａβペプチド変異体アミノ酸配列に該当し、下線を引いたテキストは、膜貫通ドメインアミノ酸配列に該当し、変形されていないテキストは、細胞質アミノ酸配列に該当する。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：８、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、または配列番号：３８のアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。

【0081】

一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含み、ここで太字は、Ａβペプチド変異体アミノ酸配列に該当し、下線を引いたテキストは、膜貫通ドメインアミノ酸配列に該当し、変形されていないテキストは、細胞質アミノ酸配列に該当する。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６9、または配列番号：７０のアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。

【0082】

一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含み、ここで太字は、Ａβペプチド変異体アミノ酸配列に該当し、下線を引いたテキストは、膜貫通ドメインアミノ酸配列に該当し、変形されていないテキストは、細胞質アミノ酸配列に該当する。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、または配列番号：７５のアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。

【0083】

一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含み、ここで太字は、Ａβペプチド変異体アミノ酸配列に該当し、下線を引いたテキストは、膜貫通ドメインアミノ酸配列に該当し、変形されていないテキストは、細胞質アミノ酸配列に該当する。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、または配列番号：８０のアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。

【0084】

一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含み、ここで太字は、Ａβペプチド変異体アミノ酸配列に該当し、下線を引いたテキストは、膜貫通ドメインアミノ酸配列に該当し、変形されていないテキストは、細胞質アミノ酸配列に該当する。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３、配列番号：８４、または配列番号：８５のアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。

【0085】

一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含み、ここで太字は、野生型Ａβ４２ペプチドアミノ酸配列に該当し、下線を引いたテキストは、膜貫通ドメインアミノ酸配列に該当し、変形されていないテキストは、細胞質アミノ酸配列に該当する。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、または配列番号：１７のアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。

【0086】

一部の実施様態において、膜貫通ドメインは、Ａβペプチド変異体の１３個のＣ－末端アミノ酸および追加１０個のアミノ酸に相応するヌクレオチド配列を含む。従って、当業者は、Ａβペプチド変異体のアミノ酸配列が膜貫通ドメインのアミノ酸配列の一部を含むかまたは重複することを認知するだろう。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体をコードするミニ遺伝子の膜貫通部分のアミノ酸配列は、

を含み、ここで太字は、Ａβペプチド変異体のアミノ酸配列と重なる膜貫通ドメインアミノ酸配列の一部を示す。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：９、配列番号：１８、配列番号：８６、または配列番号：８７のうちの一つと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列に相応する膜貫通配列を含む。

【0087】

一部の実施様態において、細胞質配列は、膜固定（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）、ガンマ－セクレターゼ切断の促進、および／またはＡβペプチドの細胞外放出のためのアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む。一部の実施様態において、細胞質配列は、２つのリジン残基（例えば、ＫＫ）を含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む。一部の実施様態において、細胞質配列は、３つのリジン残基（例えば、ＫＫＫ）を含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含む。細胞質アミノ酸配列が３つのリジン残基を含む一部の実施様態において、一番目または５’リジンはアルギニン残基（例えば、ＲＫＫ）に置換されてもよい。一部の実施様態において、信号ペプチド配列は、文献［参照：Ｌ．Ｋｏｂｅｒの他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１０（４）：１１６４～１１７３（２０１３）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる］に記載されているアミノ酸配列を含む。細胞表面へのＡβ－含有プロペプチドのトラフィッキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を保障するのに十分な任意の信号配列は、内因性プロテアーゼによって切断されてＡβペプチドＮ－末端を露出させることがあり、本開示内容のポリヌクレオチド構築物で用いるために考慮される。

【0088】

非制限的な例として、一部の実施様態において、信号ペプチド配列は、ガウシアルシフェラーゼ信号ペプチド（Ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含み、ここで、ガウシアルシフェラーゼ信号ペプチドは、文献［参照：Ｂ．Ａ．Ｔａｎｎｏｕｓの他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（３）：４３５～４４３（２００５）、およびＳ．Ｋｎａｐｐｓｋｏｇの他．、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２８：７０５～７１５（２００７）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる］に記載されているように哺乳動物遺伝子発現のためにコドン－最適化され得る。一部の実施様態において、ガウシアルシフェラーゼ信号ペプチドのアミノ酸配列は、ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡ（配列番号：１９）を含む。配列番号：１９のガウシアルシペラジェ信号ペプチドをコードする、相応するヌクレオチド配列は、ＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＡＧＧＣＡ（配列番号：２０）を含んでもよい。

【0089】

第２の非制限的な例として、一部の実施様態において、信号ペプチド配列は、マウス免疫グロブリン重鎖（ＭｏＩｇＨ）信号ペプチドを含むアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含み、ここで、ＭｏＩｇＨ信号ペプチドは、文献［参照：Ｂ．Ａ．Ｔａｎｎｏｕｓの他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（３）：４３５～４４３（２００５）、およびＳ．Ｋｎａｐｐｓｋｏｇの他、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２８：７０５～７１５（２００７）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる］に記載されているように哺乳動物遺伝子発現のためにコドン－最適化され得る。一部の実施様態において、ＭｏＩｇＨ信号ペプチドのアミノ酸配列は、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号：２１）を含む。配列番号：２１のＭｏＩｇＨ信号ペプチドをコードする、相応するヌクレオチド配列は、

を含んでもよく、ここで、配列番号：２２の太字の部分は、ＭｏＩｇＨ信号ペプチドのイントロン非コード配列に相当する。

【0090】

一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：１９または配列番号：２１のうちの一つと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列に相応する信号ペプチド配列を含む。

【0091】

一部の実施様態において、ポリヌクレオチドはベクターに含まれる。一部の実施様態において、ベクターはＡβペプチドの細胞外空間への放出が内因性γ－セクレターゼによって調節される細胞膜で野生型または変異体Ａβペプチド、またはその断片または機能的誘導体を安定的に発現する。

【0092】

Ａ．タンパク質性組成物
本願に用いられた「タンパク質性分子」、「タンパク質性組成物」、「タンパク質性化合物」、「タンパク質性鎖」または「タンパク質性物質」は、一般的に、約２００個以上のアミノ酸または遺伝子から翻訳された全長内因性配列以上のタンパク質；約１００個以上のアミノ酸のポリペプチド；および／または約３乃至約１００個のアミノ酸のペプチドを指称するが、これに制限されるものではない。前記に記載されているすべての「タンパク質性」という用語は、本願において相互交換的に用いられてもよい。

【0093】

本願において用いられる「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、少なくとも３個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。本願において用いられる用語「内因性」は、生物体で自然的に発生する分子のバージョンを意味する。一部の実施様態において、内因性ペプチドは野生型ペプチドを含む。一部の実施様態において、内因性ペプチドは野生型ペプチドからのアミノ酸改造を含む。一部の実施様態において、タンパク質またはペプチドの野生型バージョンが用いられるが、本開示内容の多くの実施様態において、変形されたタンパク質またはペプチドが用いられる。前記用語は相互交換的に用いることができる。「変形されたタンパク質」または「変形されたポリペプチド」または「変異体」は、化学的構造、特にそのアミノ酸配列が野生型タンパク質またはペプチドに対して改造されたタンパク質またはペプチドを指称する。一部の実施様態において、変形された／変異体タンパク質またはペプチドは、少なくとも一つの変形された活性または機能を有する（タンパク質またはポリペプチドが多重活性または機能を有し得ることを認識する）。変形された／変異体タンパク質またはペプチドは一つの活性または機能に関して改造され得るが、別の局面においては、野生型活性または機能を保有し得るということが具体的に考慮される。

【0094】

タンパク質が本明細書において具体的に言及される場合、一般的に、天然（内因性）または組換え（変形または変異体）タンパク質またはペプチドに対する参照である。タンパク質は固有の生物体から直接分離されるか、組換えＤＮＡ／外因性発現方法によって生産されるか、固体相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）またはその他の試験管内の方法によって生産され得る。多様な自動合成機が商業的に利用可能であり、公知になっているプロトコルに従って用いられてもよい。例えば、それぞれの全文が本願に具体的に参照として含まれる文献［参照：Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、（１９８４）；Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．、（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、（１９８６）；およびＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９）］を参照する。代案的に、ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適合する条件下でインキュベーションされる組換えＤＮＡ技術が用いられてもよい。特定の実施様態において、ペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸セグメントおよび組換えベクターがある。「組換え」という用語は、ペプチドまたは特定ペプチドの名とともに用いられてもよく、これは、一般的に、試験管内で操作された核酸分子から生成されたペプチドまたはこのような分子の複製産物を意味する。

【0095】

特定の実施様態において、少なくとも一つのタンパク質性分子の大きさは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５個、約１０００個、約１１００個、約１２００個、約１３００個、約１４００個、約１５００個、約１７５０個、約２０００個、約２２５０個、約２５００個以上のアミノ分子残基、およびこれらの範囲内の誘導可能な任意の範囲、または本願に記載または参照された、相応するアミノ 酸配列の誘導体を含んでもよいが、これに制限されるものではない。

【0096】

本願に記載されているペプチドは、少なくとも、最大、または正確に５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、３００、４００、５００、５５０、１０００個以上のアミノ酸（またはこれらの範囲内の任意の誘導可能な範囲）の固定長さであってもよい。

【0097】

特定の実施様態において、タンパク質性組成物は少なくとも一つのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。本明細書に記載されている事実上任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド含有成分が本願に開示されている組成物および方法に用いられ得ることが考慮される。追加の実施様態において、タンパク質性組成物は、生体適合性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。本願において用いられる用語「生体適合性」は、本願に記載されている方法および量に応じて与えられた生物体に適用または投与されるとき、有意味な副作用を引き起こさない物質を指称する。このような不適切且つ好ましくない効果は、重大な毒性または不利な免疫学的反応と同様である。好ましい実施様態において、生体適合性タンパク質－、ポリペプチド－、またはペプチド－含有組成物は、一般的に、毒素、病原体および有害な免疫原がそれぞれ本質的にない哺乳動物タンパク質またはペプチドまたは合成タンパク質またはペプチドであるだろう。

【0098】

タンパク質性組成物は、標準分子生物学的技術を通じたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現、天然供給源からタンパク質性化合物の分離、またはタンパク質性物質の化学的合成を含む当業者に公知になっている任意の技術によって製造されてもよい。多様な遺伝子に対するヌクレオチドおよびタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列は以前に開示されており、当業者に公知になっている電算化されたデータベースで見つけることができる。データベースのうち一つは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）である。これらの公知になっている遺伝子に対するコーディング領域は、本明細書に開示されている技術を用いるか、または当業者に公知になっているように増幅および／または発現されてもよい。代案的に、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの多様な市販用製剤が当業者に公知になっている。

【0099】

特定の実施様態において、タンパク質性化合物は精製されてもよい。一般的に、「精製された」とは、多様な他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを除去するために分画化された特定またはタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド組成物を指称するものであって、ここで組成物は、その活性を実質的に維持するものと評価（例えば、特定または目的とするタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドについて当業者に公知になっているようにタンパク質検定によって評価される）されてもよい。

【0100】

本発明に用いるのに適合するタンパク質およびペプチドは自己タンパク質またはペプチドであってもよいが、本発明は、このような自己タンパク質の使用を明確に制限しない。本願において用いられる用語「自己タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド」は、生物体から由来するかまたは得られるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを意味する。用いられてもよい生物体は、ウシ、爬虫類、両生類、魚類、げっ歯類、鳥類、イヌ、ネコ、菌類、植物または原核生物を含むが、これに制限されるものではなく、選ばれた動物またはヒト対象体が好まれる。「自己タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド」は選ばれた動物またはヒト対象体に適用するための組成物の成分として用いられてもよい。

【0101】

本開示内容の組成物が神経退行性疾患を治療または予防するのに用いるのに特に適しているという点において、野生型または変異体Ａβペプチドを含む好ましいタンパク質が考慮される。

【0102】

本開示内容の方法および組成物に用いるための他のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを選択するために、当業者は、好ましくは、下記特性のうち一つ以上を保有するタンパク質性物質を選択するだろう：高い百分率の可溶化されたタンパク質性物質を有した溶液を形成し；高い粘度（すなわち、約４０乃至約１００ポアズ）を有し；非共有混合物（すなわち、陰イオン性タンパク質と陽イオン性染料、または陽イオン性タンパク質と陰イオン性染料）である場合、染料に結合する正しい分子電荷を有し；共有架橋結合を形成するために存在する正しいアミノ酸を有し（すなわち、一つ以上のチロシン、ヒスチジン、トリプトファンおよび／またはメチオニン）；および／または生体適合性である（すなわち、哺乳動物の場合、哺乳動物起源、好ましくは、ヒトの場合、ヒト起源、イヌの場合、イヌ起源など；自己由来であり、非アレルギー性および／または非免疫原性である）。

【0103】

本開示内容の組成物において、１ｍｌ当たり約０．００１ｍｇ乃至約１０ｍｇの全体ポリペプチド、ペプチドおよび／またはタンパク質が存在するものと考慮される。組成物のうちタンパク質の濃度は、約、少なくとも約、または最大約０．００１、０．０１０、０．０５０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０ｍｇ／ｍｌまたは以上（またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の範囲）であってもよい。

【0104】

Ｂ．生物学的機能性等価物
本発明によるポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質の構造に変形および／または変化が行われてもよく、類似または改善された特性を有する分子を得つつ、このような生物学的機能性等価物も本発明に含まれる。

【0105】

１．変形されたポリヌクレオチドおよびペプチド
生物学的機能性等価物は「野生型」または標準タンパク質またはペプチドまたは「変異体」タンパク質またはペプチドをコードする能力を維持しつつ、同時に別個の配列を含むように操作されたポリヌクレオチドを含んでもよい。これは、遺伝子コードの退化、すなわち同一のアミノ酸をコードする多重コドンの存在により達成され得る。用語「機能的に同等なコドン」は、アルギニンに対する６個の異なるコドンのように同一のアミノ酸をコードするコドンを指称するために本願において用いられる。また、生物学的に同等なアミノ酸をコードするコドンまたはコドンの変化を示す「中立置換」または「中立突然変異」が考慮される。一つの例において、当業者は、ポリヌクレオチドがタンパク質をコードする能力を妨害しないつつ、制限酵素認識配列をポリヌクレオチドに取り入れることを望む場合がある。

【0106】

機能性等価物と関連して、熟練した技術者は「生物学的機能性等価物」タンパク質および／またはポリヌクレオチドの定義に内在されている、許容可能なレベルの同等な生物学的活性を有した分子を維持しつつ、分子の定義された部分内で作られ得る変化の数に制限があるという概念であることをよく理解する。従って、生物学的機能性等価物は、内因性Ａβペプチド凝集を妨害し／妨害するか、または内因性Ａβペプチドフィブリルまたは他の内因性Ａβペプチド多量体構造の分解を促進する能力を維持する、選ばれたアミノ酸（またはコドン）に置換または突然変異があるタンパク質（およびポリヌクレオチド）および／または自己－凝集しないことから、例えば、内因性Ａβペプチドの毒性および／または凝集が減少するようになる選ばれたアミノ酸（またはコドン）に置換または突然変異があるその他の内因性Ａβペプチド多量体構造および／またはタンパク質（およびポリヌクレオチド）と本願において定義される。生物学的機能性等価物はまた内因性Ａβペプチドの凝集および／または内因性Ａβペプチドフィブリルまたは他の内因性Ａβペプチドの多量体構造および／またはタンパク質（およびポリヌクレオチド）の凝集を促進する能力を維持する選ばれたアミノ酸（またはコドン）に置換または突然変異があるタンパク質（およびポリヌクレオチド）および／または、例えば、自己－凝集する選択されたアミノ酸（またはコドン）で置換または突然変異を有するタンパク質（およびポリヌクレオチド）を含んでもよい。

【0107】

一般的に、分子の長さが短いほど、機能を維持しながら分子内で作ることができる変化が少ない。さらに長いドメインには中間程度の変化があり得る。全長タンパク質はさらに多い程度の変化に対して最も大きい耐性に有するだろう。しかし、構造に大きく依存する特定分子またはドメインは、変形がほぼないかまたは全く許容されない可能性があることを理解しなければならない。

【0108】

一つの例において、ポリヌクレオチドはさらに重要な変化を有する生物学的機能性等価物（およびコード化）であってもよい。特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原－結合領域、基質分子上の結合部位、受容体などのような構造との相互作用結合能力の相当な損失なく、タンパク質構造で他のアミノ酸を代替することができる。

【0109】

置換変異体は、典型的にタンパク質内の一つ以上の部位で一つのアミノ酸を他のアミノ酸に交換することを含み、他の機能または特性の損失とともにまたは損失なくポリペプチドの一つ以上の特性を調節するように設計されてもよい。置換は保存的であってもよく、すなわち、一つのアミノ酸が類似した形状と電荷を有した一つに代替される。保存的置換は当業界によく知られており、例えば、アラニンからセリン；アルギニンからリジン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リジンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；バリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化を含む。いわゆる「保存的」変化は、タンパク質の生物学的活性を妨害することはなく、これは構造的変化が設計された機能を行うタンパク質の能力に影響を与えるものではないためである。従って、本発明の目的を依然として満たしつつ、本願に開示されている遺伝子およびタンパク質の配列に多様な変化が行われ得ることが本発明者によって考慮される。代案的に、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように非－保存的であってもよい。非－保存的変化は、典型的に一つの残基を非極性または非荷電アミノ酸を極性または電荷を帯びたアミノ酸に、またはその反対のように、化学的に他の残基に代替することを含む。非－保存的置換は、アミノ酸クラスのうち一つのメンバーを他のクラスのメンバーに交換することを含んでもよい。

【0110】

他の実施様態において、ポリペプチド機能の改造は一つ以上の置換を取り入れることで意図される。例えば、特定のアミノ酸は相互作用結合能力の相当な損失なくタンパク質構造で他のアミノ酸を代替することができる。例えば、酵素触媒ドメインまたは相互作用成分のような構造は、このような機能を維持するために置換されたアミノ酸を有してもよい。タンパク質の生物学的機能的活性を定義することは、タンパク質の相互作用能力と特性であるため、特定のアミノ酸置換がタンパク質配列と基本ＤＮＡコーディング配列で行われてもよく、それにもかかわらず類似した特性を有したタンパク質を生成することができる。従って、本発明者は、生物学的有用性または活性の相当な損失なく遺伝子のＤＮＡ配列に多様な変化が行われてもよいと思う。

【0111】

欠失変異体は典型的に天然または野生型タンパク質の一つ以上の残基が欠如されている。個別残基が欠失されるか、または多数の隣接アミノ酸が欠失される場合がある。停止コドンは切断されたタンパク質を生成するためにコード化核酸配列に導入（置換または挿入により）されてもよい。例えば、ペプチドは多数の隣接アミノ酸の切断または欠失によって突然変異されて相応する内因性形態よりもさらに短くすることができることが考慮される。

【0112】

挿入突然変異は、一般的に、ポリペプチドの非－末端地点にアミノ酸残基を追加することを含む。これは、一つ以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。末端の追加がまた生成されてもよく、本願に記述されているか、または参照されている一つ以上のペプチドまたはポリペプチドの多量体または連鎖体（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）である融合タンパク質を含んでもよい。例えば、特定機能（例えば、標的化または局所化のために、強化された活性のために、精製目的のためになど）を有する異種タンパク質またはポリペプチド配列を融合または接合することでペプチドが改造され得ることが考慮される。

【0113】

さらに、本発明のポリペプチドは化学的に変形されてもよい。ポリペプチドのグリコシル化は、例えば、抗原に対するポリペプチドの親和度を増加させるために、ポリペプチド配列内の一つ以上のグリコシル化部位を変形することで改造されてもよい（米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号）。

【0114】

また、アミノ酸および核酸配列は、それぞれ追加のＮ－またはＣ－末端アミノ酸、または５’または３’配列のような追加的な残基を含んでもよく、配列がタンパク質の発現にかかる生物学的タンパク質活性の維持を含めて上記に提示されている基準を満たす限り、依然として本質的に本願に開示されている配列のうち一つに記載されたとおりである。末端配列の追加は、特に、例えば、コーディング領域の５’または３’部分の側面に位置した多様な非－コーディング配列を含んでもよい核酸配列に適用される。

【0115】

本開示内容のアミノ酸配列変異体は、例えば、置換、挿入または欠失変異体であってもよい。本開示内容のポリペプチドの領域または断片は、配列番号：１乃至９、配列番号：２１、２３乃至３９および６５乃至８７に対し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００個またはそれ以上のアミノ酸置換、隣接アミノ酸添加または隣接アミノ酸欠失を有するか、少なくとも有するか、または最大で有するアミノ酸配列を有してもよいと考慮される。代案的に、本開示内容のポリペプチドの領域または断片は、任意の配列番号：１乃至１９、配列番号：２１、２３乃至３９および６５乃至８７と５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％（またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値）同一であるか、少なくとも同一であるか、または最大で同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれにより構成されたアミノ酸配列を有してもよい。

【0116】

また、一部の実施様態において、領域または断片は、任意の配列番号：１乃至１９、配列番号：２１、２３乃至３９および６５乃至８７（ここで、位置１は配列番号のＮ－末端にある）で位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００で始まる４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００個以上の隣接アミノ酸からなるアミノ酸領域を含む。

【0117】

本開示内容のポリペプチドは、任意の配列番号：１乃至１９、配列番号：２１、２３乃至３９および６５乃至８７の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個以上の変異体アミノ酸を含んでもよいか、または少なくともまたは最大３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、３００、４００、５００、５５０、６００個以上（またはこれらの範囲内の任意の誘導可能な範囲）の隣接アミノ酸と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％類似、同一または相同であってもよい。

【0118】

本開示内容のポリペプチドは、少なくとも、最大または正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４または６１５個の置換（またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の範囲）を含んでもよい。

【0119】

置換は、任意の配列番号：１乃至１９、配列番号：２１、２３乃至３９および６５乃至８７（またはこれらの範囲内の誘導可能な範囲）のアミノ酸位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４または６５０で行われてもよい。

【0120】

アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換体の相対的な類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状および／または類型に対する分析は、アルギニン、リジンおよび／またはヒスチジンがすべて陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンおよび／またはセリンはいずれも類似した大きさであり；および／またはフェニルアラニン、トリプトファンおよび／またはチロシンはいずれも一般的に類似した形状を有することを示す。従って、このような考慮事項に応じて、アルギニン、リジンおよび／またはヒスチジン；アラニン、グリシンおよび／またはセリン；および／またはフェニルアラニン、トリプトファンおよび／またはチロシンは、本願において生物学的に機能的な等価物と定義される。

【0121】

生物学的に機能的な等価物を生産するためにこのような変化を加えるとき、アミノ酸の疎水性指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ）が考慮されてもよい。タンパク質の疎水性プロファイルは、各アミノ酸に数字値（「疎水性指数」）を割り当てた後、繰り返しペプチド鎖に沿ってこれらの値を平均して計算する。各アミノ酸は疎水性および電荷特性を基準として値を指定した。これらのアミノ酸は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）である。タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を付与するにあたり、疎水性アミノ酸指数の重要性は一般的に当業界において理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水性特性が生成されたタンパク質の２次構造に寄与するものと受け入れられ、これは、順にタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義する。また、特定のアミノ酸は、類似した疎水性指数または点数を有する他のアミノ酸に代替されてもよく、依然として類似した生物学的活性を維持できるものと知られている。疎水性指数に基づいた変化を加えるとき、特定の実施様態において、疎水性指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。本開示内容の一部の局面において、±１以内である疎水性指数が含まれ、本開示内容の別の局面において、±０．５以内である疎水性指数が含まれる。

【0122】

類似アミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的に行われ得るということも当業界において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号は、全文が本願に参考として含まれており、隣接アミノ酸の親水性によって決定されるタンパク質の最大局所平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関関係があると記述している。特定の実施様態において、隣接したアミノ酸の親水性によって決定されるタンパク質の最大局所平均親水性は、タンパク質の生物学的特性と相関関係がある。次の親水性値がこれらのアミノ酸残基：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；およびトリプトファン（－３．４）に割り当てられた。類似した親水性値に基づいた変化を加えるとき、特定の実施様態において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、他の実施様態においては±１以内である親水性値が含まれ、また他の実施様態においては±０．５が含まれる。一部の場合には、親水性に基づいて１次アミノ酸配列からエピトープを識別することもできる。アミノ酸は類似した親水性値を有する他のアミノ酸に代替されてもよく、依然として生物学的に同等且つ免疫学的に同等なタンパク質を生産できることが理解される。

【0123】

さらに、当業者は、活性または構造に重要な、類似したポリペプチドまたはタンパク質の残基を確認する構造－機能の研究を検討することができる。このような比較の観点において、類似したタンパク質の活性や構造に重要なアミノ酸残基に該当するタンパク質のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基に対して化学的に類似したアミノ酸置換を選択することができる。

【0124】

当業者はまた類似したタンパク質またはポリペプチドから３次元構造およびこの構造にかかるアミノ酸配列を分析することができる。このような情報の観点において、当業者は、３次元構造に対するアミノ酸残基の整列を予測することができる。当業者は、タンパク質表面にあると予想されるアミノ酸残基を変更しないように選択することができるが、その理由は、このような残基が他の分子との重要な相互作用に関与できるからである。さらに、当業者は、それぞれの目的とするアミノ酸残基で単一アミノ酸置換を含む試験変異体を生成することができる。その後、これらの変異体は結合および／または活性に対する標準検定を用いてスクリーニングすることができ、従って、このような日常的な実験から収集された情報を得ることができ、これは、当業者が追加置換を単独または別の突然変異と組み合わせて避けなければならないアミノ酸位置を決定できるようにする。２次構造を決定するのに用いてもよい多様な道具は、ワールドワイドウェブ（ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ／ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）で見つけることができる。

【0125】

本開示内容の一部の実施様態において、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体の形成のための結合親和性を改造し、（４）リガンド結合親和性を改造し、および／または（５）このようなポリペプチドに他の物理化学的または機能的特性を付与または変形して行われる。例えば、単一または多重アミノ酸置換（特定の実施様態において、保存的アミノ酸置換）は、自然発生配列で行われてもよい。分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）の外部にあるタンパク質部分で置換が行われてもよい。このような実施様態において、タンパク質またはポリペプチドの構造的特徴を実質的に変化させない保存的なアミノ酸置換（例えば、天然タンパク質を特徴づける１次、２次または３次構造を破壊しない一つ以上の代替アミノ酸）が用いられてもよい。

【0126】

上記したように、アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換体の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。前述の多様な特性を考慮した例示的な置換はよく知られており、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；およびバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。

【0127】

２．改造されたアミノ酸
本願に用いられた「アミノ分子」は、当業者に公知になっている任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣体を指称する。特定の実施様態において、タンパク質性分子の残基は、アミノ分子残基の配列を妨害する任意の非－アミノ分子なく順次的である。他の実施様態において、配列は一つ以上の非－アミノ分子モイアティを含んでもよい。特定の実施様態において、タンパク質性分子の残基の配列は一つ以上の非－アミノ分子モイアティによって中断されてもよい。ペプチドおよびポリペプチドは２０個の「天然」アミノ酸およびこの翻訳－後の変形を含む。しかし、試験管内のペプチド合成は、変形されたおよび／または特異なアミノ酸の使用を許容する。

【0128】

従って、用語「タンパク質性組成物」は自然的に合成されたタンパク質から２０個の共通アミノ酸のうち少なくとも一つ、または少なくとも一つの変形されたまたは特異なアミノ酸を含むアミノ分子配列を含み、下記の表に示したものを含むが、これに制限されるものではない。

【0129】

【0130】

３．模倣体（Ｍｉｍｅｔｉｃ）
前記議論された生物学的機能性等価物に加えて、本発明者らはまた、構造的に類似した化合物が本発明のペプチドまたはポリペプチドの核心部分を模倣するように剤形化できることを考慮する。ペプチドミメティックス（模倣ペプチド：ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）と言える前記化合物は、本発明のペプチドと同一の方式で用いられてもよいので、機能性等価物でもある。

【0131】

タンパク質２次および３次構造の要素を模倣する特定模倣体は、文献［参照：Ｊｏｈｎｓｏｎの他（１９９３）］に記載されている。ペプチド模倣体を用いる根本的な根拠は、タンパク質のペプチド骨格が主に抗体および／または抗原のような分子相互作用を促進する方式でアミノ酸側鎖を配向するために存在するということである。従って、ペプチド模倣体は天然分子と類似した分子相互作用を許容するように設計される。

【0132】

ペプチド模倣概念の一部の成功的な適用は、抗原性の高いものと知られたタンパク質内でβ－ターンの模倣に焦点を置いている。ポリペプチド内の類似β－ターンの構造は、本明細書において議論されたようにコンピュータ－基盤アルゴリズムによって予測され得る。前記ターンの成分アミノ酸が決定されると、アミノ酸側鎖の必須要素の類似した空間方向を達成するために模倣体を構成することができる。

【0133】

他のアプローチは、大きなタンパク質の結合部位を模倣する生物学的活性形態を生成するための魅力的な構造テンプレートとして、小さな多重二硫化物－含有タンパク質を用いるのに焦点を置く。文献参照：Ｖｉｔａの他．（１９９８）。特定毒素で進化的に保存されているものと思われる構造的モチーフは、小さく（３０～４０個のアミノ酸）、安定しており、突然変異に対して高い許容性を有する。このモチーフは３個の二硫化物によって内部コアで連結されたベータシートとアルファ螺旋で構成される。

【0134】

ベータＩＩターンはサイクリックＬ－ペンタペプチドとＤ－アミノ酸を有するものを用いて成功的に模倣された。Ｗｅｉｓｓｈｏｆｆの他（１９９９）。また、文献［Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎの他．（１９９９）］は、リバースターン誘導特性を有しているバイサイクリックトリペプチドについて報告する。

【0135】

特定構造を生成する方法は当業界に開示されている。例えば、アルファ－螺旋模倣体は、米国特許第５，４４６，１２８号；第５，７１０，２４５号；第５，８４０，８３３号；および第５，８５９，１８４号に記載されている。これらの構造は、ペプチドまたはタンパク質を熱的にさらに安定にし、タンパク質分解に対する抵抗性を増加させる。６員、７員、１１員、１２員、１３員および１４員の環構造が開示されている。

【0136】

構造的に制限されたベータ－ターンおよびベータ膨張（ｂｅｔａ ｂｕｌｇｅ）を生成する方法は、例えば、米国特許第５，４４０，０１３号；第５，６１８，９１４号；および第５，６７０，１５５号に記載されている。ベータ－ターンは相応する骨格形態の変化なしに変更された側面置換体を許容し、標準合成手順によってペプチドに統合するための適切な末端を有する。他の類型の模倣ターンには、リバースターンおよびガンマターンが含まれる。リバースターン模倣体は、米国特許第５，４７５，０８５号および第５，９２９，２３７号に開示されており、ガンマターン模倣体は、米国特許第５，６７２，６８１号および第５，６７４，９７６号に記述されている。

【0137】

Ｃ．ペプチドの外因性伝達
特定の実施様態において、ペプチドの細胞への外因性伝達を改善するために、本願に開示されているタンパク質性組成物およびペプチド変異体に変形が行われてもよい。

【0138】

特定の実施様態において、ベクターは、細胞が本願に開示されているタンパク質性組成物およびペプチド変異体を発現させる外因性核酸配列を含むように構成されてもよい。これらのベクターの成分および伝達方法に関する詳細事項は、下記に開示されている。

【0139】

一部の実施様態において、本願に開示されている組成物を投与して細胞が細胞の遺伝子工学による一つ以上の遺伝的改造を含むようにすることができる。外因性核酸またはポリヌクレオチドが任意の適切な人工操作手段によって細胞内に伝達される場合、または細胞がポリヌクレオチドを受け継いだ元の変形された細胞の子孫である場合、細胞は「遺伝的に改造された」、「遺伝的に変形された」または「トランスジェニック」とする。

【0140】

多様な実施様態において、本願に開示されている野生型または変異体Ａβペプチドまたはその断片または機能的誘導体のペプチド配列をコードするＤＮＡ構築物またはベクターが提供される。遺伝的変形はまた細胞に導入されてもよい。このような変形は、例えば、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片、または機能的誘導体をコードするベクターで細胞を形質導入して野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片、または機能的誘導体を発現する細胞を生成することを含む。本願に開示されている野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体のペプチド配列をコードするウイルスベクターは、連続的な遺伝子発現およびＡβペプチド放出を可能にする。

【0141】

本開示内容による細胞は、本願に開示されているタンパク質性組成物およびペプチド変異体および／または細胞が本願に開示されているタンパク質性組成物およびペプチド変異体を発現するように外因性核酸配列を含むように作製されたＤＮＡ構築物、またはベクターが本願に記載されているように導入および発現できる任意の細胞を含む。本明細書に記述されている本発明の基本概念は、細胞類型によって制限されないことを理解しなければならない。本開示内容による細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞などを含む。また、細胞には機能的タンパク質の生産を調節するのに有益または好ましいすべてが細胞が含まれる。

【0142】

１．外因性伝達を改善するためのペプチドの変形
一部の実施様態において、本願に開示されている野生型または変異体Ａβペプチドは、細胞によるペプチドの摂取（ｕｐｔａｋｅ）または吸収を向上させるために変形されてもよい。例えば、一部の実施様態において、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、野生型または変異体Ａβペプチドに付着してＡβオリゴマーおよびフィブリルの形成の細胞透過性および／または脳透過性抑制剤を生成する。ＣＰＰはナノサイズの粒子から小さな化合物乃至大きなＤＮＡ片に至る分子の細胞摂取および吸収を促進する短いペプチドである。カーゴ（ｃａｒｇｏ）は共有結合を通じた化学的連結または非共有相互作用を通じてペプチドと連結される。ＣＰＰは、一般的に、リジンまたはアルギニンのような陽電荷を帯びたアミノ酸を相対的に多く含むか、または極性、荷電性アミノ酸および非極性、疎水性アミノ酸の交代パターンを含む配列を有するアミノ酸組成を有する。これら二つの類型の構造は、それぞれ多価陽イオン性または両親媒性と言う。三つ目の部類のＣＰＰは疎水性ペプチドであって、純電荷の低い無極性残基または細胞摂取に重要な疎水性アミノ酸グループのみを含む。

【0143】

一部の実施様態において、細胞－透過ペプチドは、逆転バージョン（ｒｅｔｒｏ－ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）のＨＩＶタンパク質伝達ドメイン「ＴＡＴ」；ポリ－アルギニン（例えば、Ｒ８－Ｒ１２）；ポリアミン；ＭＡＰ；ＭＴＳ；ＭＰＧ；ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）；Ｐｅｐ－１；トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）；またはＶＰ２２である。一部の実施様態において、細胞－透過ペプチドは、逆転バージョンのＨＩＶタンパク質伝達ドメイン「ＴＡＴ」である。一部の実施様態において、細胞－透過ペプチドはポリ－アルギニンである。一部の実施様態において、細胞－透過ペプチドはポリアミンである。一部の実施様態において、野生型または変異体Ａβペプチドに細胞－透過ペプチドを付着させることは、野生型または変異体Ａβペプチドがベクター化することなく細胞透過性になるようにする。

【0144】

ヒト免疫欠乏ウイルス１（ＨＩＶ－１）のトランス活性化転写活性剤（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ＴＡＴ）は、細胞膜の不浸透性リン脂質二重層に浸透して生物学的障壁を通過可能にする。文献［参照：Ｍ．Ｇｒｅｅｎの他、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４１４：１２７～１３９（１９９８）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）］を参照する。ＨＩＶ－感染された細胞で分泌された後、ＴＡＴは、隣接した細胞に移動して遺伝子転写を変形させて疾患を広める。Ｔａｔ－由来ペプチドが大きなタンパク質を他の細胞類型と哺乳類器官へ伝達できることを立証した最初の報告書は１９９４年に発表され、これは、キメラとしてβ－ガラクトシダーゼを生きている細胞内に摂取することを促進できるＨＩＶ－１の３６個のアミノ酸領域の化学的架橋および識別を立証した。文献［参照：Ｓ．Ｆａｗｅｌｌの他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：６６４～６６８（１９９４）］を参照する。このＨＩＶ ＴＡＴタンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）は、塩基性アミノ酸残基のクラスターとα－螺旋構成を採択するものと推定される配列を含む。ＴＡＴペプチドのさらに短いドメインが細胞内在化に十分であるか否かを記述することを数多くの研究で目標とした。転座に必要な主な決定要因は塩基性アミノ酸のクラスターと確認されており、α－螺旋領域のあるペプチドがさらに効率的に細胞に入ることができるが、推定されるα－螺旋ドメインは不要であるものと示された。ＲＮＡ結合および核局所化信号（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ：ＮＬＳ）モチーフを含む切断された多重陽イオン性ペプチドＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲは、細胞および組織への効果的な転座に適したものと確認されており、ＴＡＴに含まれる。文献［参照：Ｅ．Ｖｉｖｅｓ Ｅの他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１６０１０～１６０１７（１９９７）］を参照する。従って、一部の実施様態において、野生型または変異体ＡβペプチドはＴＡＴ配列に付着される。ＴＡＴ配列は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２４）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号：２５）を含むアミノ酸配列を有するペプチドを含んでもよく、アミノ酸配列は、任意の配列番号：２３乃至２５、またはその断片または誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有する。

【0145】

オリゴ－およびポリ－アルギニンは、構造的に、Ａｒｇが唯一のビルディングブロックである最も単純なＣＰＰであり、容易に製造することができる。ポリ－アルギニンは、水溶液でまたは強い側鎖電荷反発と疎水性または両親媒性構造の欠如により、リン脂質膜と結合されるとき、無作為コイル形態を採択し、膜透過性は主にグアニジニウム電荷グループにより媒介される脂質膜との静電気的相互作用に依存する。従って、一部の実施様態において、野生型または変異体Ａβペプチドはポリ－アルギニンに付着される。一部の実施様態において、ポリ－アルギニンは６個以上のアルギニンアミノ酸を含むＬ－またはＤ－アルギニンの重合体を含む。一部の実施様態において、ポリ－アルギニンはＲＲＲＲＲＲＲＲ－ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号：２６）を含むアミノ酸配列に相応するＲ８－Ｒ１２を含む（参照文献：Ｇ．Ｔｕｎｎｅｍａｎｎの他、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．１４：４６９～４７６（２００８）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）。

【0146】

ポリアミン、例えば、プトレシン、スペルミジンおよびスペルミンは、血液－神経および血液－脳関門でタンパク質の透過性を増加させるものと示された。ポリアミン輸送体は、ポリアミン－変形タンパク質の輸送を担当してもよい。例えば、文献［参照：Ｊ．Ｆ．Ｐｏｄｕｓｌｏ＆Ｇ．Ｌ．Ｃｕｒｒａｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６６：５７０５～５７０９（１９９６）；Ｊ．Ｆ．Ｐｏｄｕｓｌｏ＆Ｇ．Ｌ．Ｃｕｒｒａｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６７：７３４～７４１（１９９６）；ａｎｄ Ｊ．Ｆ．Ｐｏｄｕｓｌｏの他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏ ３９（３）：３７１～８２（１９９９）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる］を参照する。従って、ポリアミン－変形野生型または変異体Ａβペプチドの全身投与は、アルツハイマー病を含む多様な神経系疾患の治療のためにこれらの治療剤をＣＮＳに伝達するための効率的なアプローチであり得、一部の実施様態において、野生型または変異体Ａβペプチドはポリアミンに共有結合される。一部の実施様態において、ポリアミンはプトレシンである。一部の実施様態において、ポリアミンはスペルミジンである。一部の実施様態において、ポリアミンはスペルミンである。

【0147】

本願に開示されている野生型または変異体Ａβペプチドへの付着のために考慮される他の細胞－透過ペプチドは、次の細胞－透過ペプチドを含むが、これに制限されるものではない：ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号：２７）を含むアミノ酸配列に相応するＭＡＰ（参照文献Ｊ．Ｏｅｈｌｋｅの他、Ｃｅｌｌ ５８：２１５～２２３（１９８９）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）；ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号：２８）を含むアミノ酸配列に相応するＭＴＳ（参照文献Ｍ．Ｒｏｊａｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：３７０～３７５（１９９８）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）；ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：２９）を含むアミノ酸配列に相応するＭＰＧ（参照文献Ｍ．Ｃ．Ｍｏｒｒｉｓの他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２７３０～２７３６（１９９７）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）；ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号：３０）を含むアミノ酸配列に相応するペネトラチン（参照文献Ｄ．Ｄｅｒｏｓｓｉの他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４～１０４５０（１９９４）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）；ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＲＫＶ（配列番号：３１）を含むアミノ酸配列に相応するＰｅｐ－１（参照文献Ｍ．Ｃ．Ｍｏｒｒｉｓの他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１７３～１１７６（２００１）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列に相応するトランスポータン（参照文献Ｍ．Ｐｏｏｇａの他、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１２：６７～７７（１９９８）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）；またはＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＱＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＱ（配列番号：３３）を含むアミノ酸配列に相応するＶＰ２２（参照文献Ｇ．Ｅｌｌｉｏｔｔの他、Ｃｅｌｌ ８８：２２３～２３３（１９９７）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）。本願に開示されている野生型または変異体Ａβペプチドへの付着のために考慮される追加の細胞－透過ペプチドは、例えば、文献［Ａ．Ｂｏｒｒｅｌｌｉの他、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２３：２９５～３１８（２０１８）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる］に記載されている。

【0148】

一部の実施様態において、細胞－透過および／または脳－透過Ａβペプチド変異体は、Ａβペプチド変異体の自然発生Ｌ－アミノ酸がアミノ酸のＤ－鏡像異性質体に代替されたＡβペプチド変異体を含む。文献［Ｊ．Ｆ．Ｐｏｄｕｓｌｏの他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏ ３９（３）：３７１～８２（１９９９）］を参照する。Ｄ－残基を含むペプチドは、タンパク質分解に対する抵抗性がさらに大きい。文献［Ｒｏｂｓｏｎ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８９３～８９５（１９９６）、ａｎｄ Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒの他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１８５４～１８５７（１９９６）］を参照する。また、このような変形は、Ａβペプチド変異体を低い免疫原性にすることができ、これは、Ｌ－アミノ酸ペプチドがＴヘルパー細胞への主な組織適合性複合体クラスＩＩ－に制限された提示のために効率的に処理され、従って、薬物の生体活性を損傷させる活発な体液性免疫反応を生成するのに対し、Ｄ－残基ペプチドは抗原性がはるかに少ない。文献［参照Ｈｅｒｖｅの他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：１５７～１６３（１９９７）］を参照する。従って、一部の実施様態において、本願に開示されているＡβペプチド変異体の自然発生Ｌ－アミノ酸は、Ａβペプチド変異体の細胞透過性および／または脳透過性を改善するためにアミノ酸のＤ－鏡像異性質体に代替される。

【0149】

２．ベクター
一部の実施様態において、本願に開示されている野生型または変異体Ａβペプチドは、野生型または変異体Ａβペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、細胞によって吸収されて発現される発現ベクターに構築物を混入することで達成される。ベクターは、複製、場合によって真核生物内の統合に適合する可能性がある。典型的なクローニングベクターは、目的とする核酸配列の発現調節に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミド（ｃｏｓｍｉｄ）を含むが、これに制限されないベクターにクローニングされてもよい。特に、関心のあるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよびシークエンシングベクターが含まれる。一般的に、適合するベクターは、少なくとも一つの生物体で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および一つ以上の選別マーカーを含む（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；および米国特許第６，３２６，１９３号）。一部の実施様態において、適合するベクターは、血液－脳関門を通過することができる。

【0150】

特定の実施様態において、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞へ提供されてもよい。ウイルスベクター技術は当業界によく知られており、例えば、文献［参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋの他．、（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）］およびその他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。

【0151】

哺乳類細胞への遺伝子伝達のために多数のウイルス基盤システムが開発されてきた。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルス（自己不活性化レンチウイルスベクターを含む）を含むが、これに制限されるものではない。例えば、アデノウイルスは遺伝子伝達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当業界に公知になっている技術を用いてベクターへ挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）されてもよい。この後、組換えウイルスは分離されて生体内または生体外対象体の細胞に伝達されてもよい。従って、一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体をコードする核酸は、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ガンマ－レトロウイルス、アデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスを含むウイルスベクターのような組換えベクターを用いて細胞内に導入される。

【0152】

特定の実施様態において、ベクターはＡＡＶベクターである。「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶｒｈｌＯ．ＸＸ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３７、ＰＨＰ．ｅＢ ＡＡＶ、およびその他のようなアデノ－関連ウイルス血清型から由来した組換えベクターを意味する。ＡＡＶベクターは一つまたはすべての野生型ＡＡＶ遺伝子が欠失されてもよいが、依然として機能的逆末端繰り返し（ＩＴＲ）核酸配列を含む。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、構造およびパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は野生型配列または実質的に同一の配列であってもよく、または、例えば、機能を維持する限り、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失または置換によって改造されてもよい。このようなＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現する宿主細胞に存在するとき、複製され、感染性ウイルス粒子でパッケージングされてもよい。

【0153】

ＡＡＶのゲノムは長さが約５，０００個のヌクレオチド（ｎｔ）未満である線形単一鎖ＤＮＡ分子である。逆末端繰り返し（ＩＴＲ）は、非構造的複製（Ｒｅｐ）タンパク質と構造的（ＶＰ）タンパク質に対する固有のコーディングヌクレオチド配列の側面に位置する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、－２および－３）はカプシドを形成する。末端１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内デュプレックスが形成され得るように構成される。このようなヘアピン構造は、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーの役割をするウイルスＤＮＡ複製の起点の役割をする。哺乳動物細胞で野生型ＡＡＶ感染の後、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２）は、それぞれＰ５プロモーターおよびＰ１９プロモーターから発現され、二つのＲｅｐタンパク質はいずれもウイルスゲノムの複製機能を有する。Ｒｅｐ ＯＲＦにおけるスプライシングイベント（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｖｅｎｔ）は実際に４個のＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の発現を引き起こす。しかし、哺乳類細胞においてＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質をコードする非接合されたｍＲＮＡがＡＡＶベクターの生産に十分であるということが明かにされた。また、昆虫細胞でＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質はＡＡＶベクターの生産に十分である。

【0154】

ＡＡＶ ＶＰタンパク質はＡＡＶビリオンの細胞親和性を決定するものと知られている。ＶＰタンパク質－コード配列は、別のＡＡＶ血清型の中でＲｅｐタンパク質および遺伝子よりはるかに不十分に保存される。他の血清型の相応する配列を交差補完するＲｅｐおよびＩＴＲ配列の能力は一つの血清型（例：ＡＡＶ５）のカプシドタンパク質およびまた他のＡＡＶ血清型（例：ＡＡＶ２）のＲｅｐおよび／またはＩＴＲ配列を含む類似型ＡＡＶ粒子の生産を可能にする。本明細書において、類似型ＡＡＶ粒子は「ｘ／ｙ」類型と言及されてもよく、ここで「ｘ」はＩＴＲの根源（ｓｏｕｒｃｅ）を示し、「ｙ」はカプシドの血清型を示し、例えば、２／５ ＡＡＶ粒子はＡＡＶ２のＩＴＲとＡＡＶ５のカプシドを有する。

【0155】

ＡＡＶベクターは少なくとも一つのＡＡＶ ＩＴＲが側面に位置した一つ以上の関心ポリヌクレオチド配列（一つ以上のトランスジーン）を含んでもよい。従って、一つの局面において、本開示内容は、本願に開示されている一つ以上の野生型または変異体Ａβペプチドのペプチド配列をコードする一つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸ベクター構築物に関するものであり、ここで核酸ベクター構築物は組換えＡＡＶベクターであり、これにより、一つ以上の野生型または変異体Ａβペプチドのペプチド配列をコードする一つ以上のヌクレオチド配列に側面に位置した少なくとも一つのＡＡＶ ＩＴＲを含む。核酸ベクター構築物の一部の実施様態において、一つ以上の野生型または変異体Ａβペプチドのペプチド配列をコードする一つ以上のヌクレオチド配列はいずれか一方にＡＡＶ ＩＴＲが側面に位置する。

【0156】

ＡＡＶの任意の適合する血清型がベクターとして用いられてもよく、ベクターは一つ以上の関心ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。一部の実施様態において、一つ以上の関心ポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、ＡＡｖＤＪ、ＡＡＶｒｈｌＯ．ＸＸ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３７、またはＰＨＰ．ｅＢ ＡＡＶベクターである。一部の実施様態において、ベクターは、血液－脳関門を通過することができる。一部の実施様態において、血液－脳関門を通過することができるベクターは、ＡＡＶ９、ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０またはＡＡＶｒｈ．４３を含む。一部の実施様態において、血脳関門を通過することができるベクターは、例えば、静脈内、脳内および／または心室内に伝達され、大人ＣＮＳでニューロンを効率的且つ広範囲に形質導入することができる。一部の実施様態において、アデノウイルスベクターは、宿主反応を減少させるために変形される。文献［参照：例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３～２６０４（２０００）；米国特許公開番号第２００８／０００８６９０号；およびＺａｌｄｕｍｂｉｄｅの他．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５（４）：２３９～４６（２００８）；これらの文献は、具体的に、本願に全文が参照として含まれる］を参照する。

【0157】

当業者は標準組換え技術（例えば、全文が本願に参照として具体的に含まれる文献Ｍａｎｉａｔｉｓの他．、１９８８およびＡｕｓｕｂｅｌの他．、１９９４）を通じて少なくとも一つのＡＡＶ ＩＴＲが側面に位置した一つ以上の関心ポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターを作製することができるだろう。

【0158】

ベクターはまた遺伝子伝達および／または遺伝子発現をさらに調節するか、または標的細胞に有益な特性を提供する他の構成成分または機能を含んでもよい。このような他の構成成分には、例えば、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす構成成分（細胞類型または組織－特異結合を仲裁する構成成分を含む）；細胞によるベクター核酸の摂取に影響を及ぼす構成成分；摂取後に細胞内のポリヌクレオチドの局所化に影響を及ぼす構成成分（例えば、核局所化を媒介する作用剤）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす構成成分を含む。

【0159】

このような構成成分はまたベクターによって伝達された核酸を吸収して発現する細胞を検出するかまたは選別するのに用いられてもよい検出可能な、および／または選別マーカーのようなマーカーを含んでもよい。このような構成成分は、ベクターの自然的な特徴（例えば、結合および摂取を媒介する構成成分または機能を有する特定ウイルスベクターの使用）として提供されるか、またはベクターがこのような機能を提供するように変形されてもよい。非常に多様なこのようなベクターは当業界に公知になっており、一般的に利用可能である。ベクターが宿主細胞で維持される場合、ベクターは自律的構造として有糸分裂中に細胞によって安定して複製されるか、宿主細胞のゲノム内に統合されるか、または宿主細胞の核または細胞質で維持されてもよい。

【0160】

ベクターに含まれた真核発現カセットは、特に、タンパク質－コーディング配列に作動可能に連結された真核転写プロモーター、介在配列を含むスプライス信号、転写終結／ポリアデニル化配列、転写後調節エレメントおよび複製起点を含む（５’から３’方向）調節エレメントを含む。

【0161】

ａ．プロモーター／エンハンサー
「プロモーター」は開始および転写速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。プロモーターは核酸配列の特定の転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼおよびその他の転写因子のように調節タンパク質および分子が結合できる遺伝エレメントを含んでもよい。文具：「作動可能に位置された」、「作動可能に連結された」、「制御下に」および「転写制御下に」は、プロモーターが、核酸配列と関して正しい機能的位置および／または方向にあり、該当配列の転写開始および／または発現を制御するということを意味する。

【0162】

プロモーターは、一般的に、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置させる機能をする配列を含む。これについて最もよく知られた例はＴＡＴＡボックスであり、ＴＡＴＡボックスのない一部のプロモーター、例えば、哺乳類末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子に対するプロモーター、およびＳＶ４０後期遺伝子に対するプロモーターで開始部位の上にある個別エレメント自体は、開始位置を固定するのに役立つ。追加プロモーターエレメントは転写開始頻度を調節する。一般的に、追加プロモーターエレメントは、開始部位の３０ １１０ ｂｐアップストリーム領域に位置し、多くのプロモーターが開始部位のダウンストリームにも機能エレメントを含むものと示された。コーディング配列をプロモーター「の制御下に」もたらすため、選択されたプロモーターの転写読み取りフレーム「ダウンストリーム」（すなわち、３’）の転写開始部位の５’末端を位置させる。「アップストリーム」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。

【0163】

プロモーターエレメントとの間の間隔は多くの場合柔軟であるため、エレメントが反転されるか、または互いに相対的に移動するとき、プロモーターの機能が保存される。例えば、チミジンキナーゼプロモーターで、プロモーターエレメントとの間の間隔は、活性が減少し始める前に５０ｂｐ間隔に増加されてもよい。プロモーターによって個別エレメントが協力的にまたは独立的に機能して転写を活性化できるものと思われる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス－作用調節配列を意味する「エンハンサー」とともに用いられるか、または用いられない場合もある。

【0164】

コーディングセグメントおよび／またはエキソンのアップストリームに位置した５’非コーディング配列を分離することで得られるように核酸配列と自然的に関連したものであり得る。これらのプロモーターは、「内因性」と指摘されてもよい。類似に、エンハンサーは、該当配列のダウンストリームまたはアップストリームに位置した核酸配列と自然的に関連したものであり得る。代案的に、コーディング核酸セグメントを組換えまたは異種プロモーターの制御下に位置させることで特定利点を得ることができ、これは自然環境で核酸配列と正常に関連しないプロモーターを意味する。組換えまたは異種エンハンサーは、自然環境で核酸配列と正常に関連しないエンハンサーを意味する場合もある。このようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他のウイルス、または原核または真核細胞から分離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「自然発生」ではない、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントを含むプロモーターまたはエンハンサー、および／または発現を改造する突然変異を含んでもよい。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生成すること以外にも、本願に開示されている組成物と関連して、ＰＣＲ^ＴＭを含む組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を用いて配列を生成することができる（それぞれ米国特許第４，６８３，２０２号および第５，９２８，９０６号を参照、全文が本明細書に具体的に参照として含まれる）。また、ミトコンドリアなどのような非－核小器官内配列の転写および／または発現を指示する制御配列も用いられてもよいものと考慮される。

【0165】

当然、発現のために選択された小器官、細胞類型、組織、器官または生物体でＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを用いることが重要である。分子生物学分野の熟練家は、一般的に、タンパク質の発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞類型の組み合わせの使用を分かっている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋの他．１９８９、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）。用いられたプロモーターは、導入されたＤＮＡセグメントの高いレベルの発現を指示する適切な条件下で構成的、細胞特異的、組織特異的、誘導的および／または有用であり得、例えば、組換えタンパク質および／またはペプチドの大掛かりの生産に有利である。プロモーターは異種性または内因性であってもよい。

【0166】

さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ［例えば、ワールドワイドウェブ（ｅｐｄ．ｉｓｂ－ｓｉｂ．ｃｈ／）を通じたＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ（ＥＰＤＢ）］も発現を駆動するのに用いられてもよい。その他の潜在的なプロモーターの非制限的な例は、初期または後期ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えば、ベータ－アクチンプロモーター（Ｎｇ、１９８９；Ｑｕｉｔｓｃｈｅの他、１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒの他、１９８８、Ｅｒｃｏｌａｎｉの他、１９８８）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎの他、１９８９；Ｒｉｃｈａｒｄｓの他、１９８４）；および最小ＴＡＴＡボックス付近のサイクリックＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）および応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ）のような連結された応答エレメントプロモーターを含む。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されているヒト成長ホルモン最小プロモーター、受託番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３－３４１）またはマウス乳腺腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣより入手可能、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＴＣＣ ４５００７）を用いることがまた可能である。特定の例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターであってもよい。

【0167】

一部の実施様態において、ポリヌクレオチドの発現は、構成的なプロモーターによって調節される。一部の実施様態において、構成的なプロモーターは、ＣＡＧ（ＣＡＧＧＳまたはＣＢＡとも知られている）、ＥＦ－１ＡＬＰＨＡ、ユビキチンまたはＣＭＶである。

【0168】

一部の実施様態において、ポリヌクレオチドの発現は、細胞－特異的プロモーターによって調節される。一部の実施様態において、細胞－特異的プロモーターはニューロン－特異的プロモーターである。一部の実施様態において、ニューロン－特異的プロモーターは、ヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ）プロモーター、マウスカルシウム／カルモジュリン－依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、ラットチューブリンアルファＩ（Ｔａ１）、ラットニューロン－特異的なエノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、ヒト血小板－由来成長因子－ベータ鎖（ＰＤＧＦ）プロモーター、またはＴＨＹ１（ＣＤ９０）プロモーターを含む。一部の実施様態において、細胞－特異的プロモーターはヒトシナプシンＩである。

【0169】

一部の実施様態において、ポリヌクレオチドの発現は組織－特異的プロモーターによって調節される。一部の実施様態において、組織－特異的プロモーターは、脈絡叢（ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ）－特異的プロモーターである。一部の実施様態において、脈絡叢－特異的プロモーターは、Ｐｒｌｒプロモーター、Ｓｐｉｎｔ２プロモーターまたはＦ５プロモーターを含む。一部の実施様態において、組織－特異的プロモーターは、肝－特異的プロモーターである。肝－特異的プロモーターは、例えば、文献［参照：ＬＭ Ｋａｔｔｅｎｈｏｒｎの他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７（１２）：９４７～９６１（２０１６）、具体的に、全文が本願に参照として含まれる］に記載されている。

【0170】

ｂ．プロテアーゼの切断部位／自己－切断ペプチドおよび内部リボソームの結合部位
適合したプロテアーゼの切断部位および自己－切断ペプチドは、当業者に公知になっている（例えば、Ｒｙａｎの他、１９９７；Ｓｃｙｍｃｚａｋの他、２００４を参照）。プロテアーゼの切断部位の例は、フリンプロテアーゼ、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）Ｎｌａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ－２－エンコーディングプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球形ウイルス）３Ｃ－類似プロテアーゼ、ＰＹＦＶ（パースニップ黄色斑点ウイルス）３Ｃ－類似プロテアーゼ、トロンビン、因子Ｘａおよびエンテロキナーゼの切断部位である。高い切断ストリンジェンシーにより、タバコエッチ病ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ：ＴＥＶ）プロテアーゼの切断部位を用いることができる。一部の実施様態において、プロテアーゼの切断部位はフリンプロテアーゼの切断部位である。

【0171】

例示的な自己－切断ペプチド（「シス－作用加水分解エレメント」ともいう、ＣＨＹＳＥＬ；ｄｅＦｅｌｉｐｅ（２００２）を参照）は、ポティウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチドに由来する。特定の自己－切断ペプチドは、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａ（ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ Ａ）ウイルス、ＴａＶ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ ｖｉｒｕｓ）およびブタテスコウイルスから２Ａペプチドから選択されてもよい。

【0172】

特定の開始信号はまた、ポリシストロンメッセージでコーディング配列の効率的な翻訳のために用いられてもよい。これらの信号はＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。例えば、開始信号は、ＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧＧ（配列番号：３４）を含むアミノ酸配列を有するＫｏｚａｋコンセンサス配列を含んでもよい。文献［Ｋｏｚａｋ、１９８７；Ｈａｒｔｅの他、２０１２］を参照する。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御信号が提供される必要がある場合がある。当業者はこれを容易に決定し、必要な信号を提供することができるだろう。全体挿入物の翻訳を保障するために、開始コドンが目的とするコーディング配列の読み取りフレームと「フレーム内」でなければならないということはよく知られている。外因性翻訳制御信号および開始コドンは天然または合成であってもよい。発現の効率性は適切な転写エンハンサーエレメントを含むことで向上され得る。

【0173】

特定の実施様態において、内部リボソームの進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子またはポリシストロンメッセージを生成するのに用いられる。ＩＲＥＳエレメントは５’メチル化キャップ依存翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回することができ、内部部位で翻訳を始めることができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピコルナウイルス系列の二つのメンバー（小児麻痺および脳心筋炎）のＩＲＥＳエレメントが記載されており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）、哺乳類メッセージのＩＲＥＳエレメントも記載されている（Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ、１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは異種オープンリーディングフレームに連結されてもよい。多重オープンリーディングフレームをともに転写することができ、それぞれは、ＩＲＥＳにより分離されてポリシストロンメッセージを生成する。ＩＲＥＳエレメントのおかげでそれぞれのオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセスしてもよい。多重遺伝子は単一メッセージを転写するために、単一プロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現されてもよい（米国特許第５，９２５，５６５号および第５，９３５，８１９号を参照、それぞれ本願に参照として含まれる）。

【0174】

ｃ．マルチクローニング部位
ベクターは、ベクターを分解するために標準組換え技術とともに用いられてもよい多重制限酵素部位を含む核酸領域であるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含んでもよい（例えば、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌｉの他、１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎの他、１９９８、およびＣｏｃｅａ、１９９７、特に、全文が本願に参照として含まれる）。「制限酵素切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）」は核酸分子の特定位置でのみ機能する酵素で核酸分子を触媒切断することを意味する。このような制限酵素のうちの多数は商業的に利用可能である。このような酵素の使用は当業者によって広く理解される。頻繁に、ベクターは外因性配列がベクターにライゲーションできるようにＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いて線形化または断片化される。「ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）」は互いに隣接していても、隣接していなくてもよい２個の核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成する過程を意味する。制限酵素およびライゲーション反応を伴う技術は、組換え技術分野の熟練家によく知られている。

【0175】

ｄ．スプライシング部位
大部分の転写された真核ＲＮＡ分子は、ＲＮＡスプライシングを経て１次転写体でイントロンを除去する。ゲノム真核配列を含むベクターは、タンパク質の発現のための転写体の適切なプロセッシングを保障するためにドナーおよび／またはアプセプタースプライシング部位を必要とする場合がある（例えば、本願に参照として含まれたＣｈａｎｄｌｅｒの他、１９９７を参照）。

【0176】

ｅ．終結信号
ベクターまたは構築物は少なくとも一つの終結信号を含んでもよい。「終結信号」または「ターミネーター」はＲＮＡ重合酵素によるＲＮＡ転写物の特定終結に関与するＤＮＡ配列で構成される。従って、特定の実施様態において、ＲＮＡ転写体の生成を終了させる終結信号が考慮される。ターミネーターは目的とするメッセージレベルを達成するために生体内で必要な場合がある。

【0177】

真核システムにおいて、終結領域はまたポリアデニル化部位を露出させるために新たな転写体の部位－特異的切断を許容する特定ＤＮＡ配列を含んでもよい。これは、転写体の３’末端に約２００Ａ残基（ｐｏｌｙＡ）のストレッチを追加するように専門化された内因性重合酵素に信号を送る。このｐｏｌｙＡテイルで変形されたＲＮＡ分子はより安定していると思われ、さらに効率的に翻訳される。従って、真核生物を含む他の実施様態において、ターミネーターは、ＲＮＡ切断のための信号を含み、終結信号はメッセージのポリアデニル化を促進する。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位のエレメントはメッセージのレベルを向上させ、カセットで他の配列への読み取りを最小化する役割をすることができる。

【0178】

考慮されるターミネーターは、例えば、ウシ成長ホルモンのターミネーターのような遺伝子の終結配列、または、例えば、ＳＶ４０のようなウイルス終結配列を含むが、これに制限されない、本願に記述されているか、または当業者に公知になっている任意の公知になっている転写ターミネーターを含む。特定の実施様態において、終結信号は、例えば、配列切断による転写可能または翻訳可能配列の欠如であり得る。

【0179】

ｆ．ポリアデニル化信号
発現、特に真核生物の発現において、一般的に転写体の適切なポリアデニル化を行うためのポリアデニル化信号を含むだろう。ポリアデニル化信号の特性は成功的な実習に決定的であるものと思われず、任意のすべての配列が用いられてもよい。例示的な実施様態は、便利且つ多様な標的細胞でよく機能するものと知られたＳＶ４０ポリアデニル化信号またはウシ成長ホルモンのポリアデニル化信号を含む。ポリアデニル化は転写体の安定性を増加させるか、または細胞質輸送を促進することができる。

【0180】

ｇ．転写後調節エレメント
本開示内容において用いるためのベクターはまた一つ以上の転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含んでもよい。ＰＲＥの例は、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ、およびヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子のイントロンＡを含む。追加の例示および詳細事項について文献［参照：Ｓｕｎの他、２００９およびＭａｒｉａｔｉの他、２０１０］を参照して下さい。特定の実施様態において、ＰＲＥはＷＰＲＥである。ＷＰＲＥは転写されるとき、ウイルスベクターによって伝達される遺伝子の発現を向上させるために３次構造を生成するＤＮＡ配列である。

【0181】

ｈ．複製の起源
宿主細胞でベクターを増殖させるために、ベクターは、一つ以上の複製部位起源（種々「ｏｒｉ」と指称される）、例えば、前記記載されているようなＥＢＶのｏｒｉＰまたは遺伝的に操作されたｏｒｉＰに相応する核酸配列（複製が始まる特定核酸配列である分化プログラミングで類似または向上した機能を有する）を含んでもよい。代案的に、前述のような他の染色体－外複製ウイルスの複製起源、または自律複製配列（ＡＲＳ）が用いられてもよい。

【0182】

３．ベクター伝達
遺伝的変形または外因性核酸の細胞への導入は、本願に記載されているように、または当業者に公知になっているように細胞の形質転換のための核酸伝達のための任意の適合した方法を用いてもよい。遺伝子を細胞へ導入し、発現させる方法は当業界に公知になっている。発現ベクターと関連して、ベクターは、当業界の任意の方法によって宿主細胞、例えば、哺乳動物、バクテリア、酵母または昆虫細胞内へ容易に導入されてもよい。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞へ伝達されてもよい。

【0183】

これらの方法は、ＤＮＡの直接伝達、例えば、生体外トランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎの他、１９８９、Ｎａｂｅｌの他、１９８９）；形質導入；ウイルス性形質導入；微細注入（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５、米国特許第５，７８９，２１５号（本願に参照として含まれる）を含む注入（米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号、それぞれが本願に参照として含まれる）；エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号、本願に参照として含まれる；Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａの他．、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒの他．、１９８４）；リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅの他、１９９０）；ＤＥＡＥデキストランに続いてポリエチレングリコールを使用（Ｇｏｐａｌ、１９８５）；直接的な音波負荷（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒの他、１９８７）；ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）；リポフェクションまたはリポソーム媒介トランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙの他、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕの他、１９８７；Ｗｏｎｇの他．、１９８０；Ｋａｎｅｄａの他．、１９８９；Ｋａｔｏの他、１９９１）および収容体－媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）；マクロインジェクションまたはナノパーティクル・ガン（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／０９６９９および９５／０６１２８；米国特許第５，６１０，０４２号；第５，３２２，７８３号、第５，５６３，０５５号、第５，５５０，３１８号、第５，５３８，８７７号および第５，５３８，８８０号、それぞれ本願に参照として含まれる）；シリコンカーバイド繊維との撹拌（Ｋａｅｐｐｌｅｒの他、１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号および第５，４６４，７６５号、それぞれ本願に参照として含まれる）；アグロバクテリウム－媒介形質転換（米国特許第５，５９１，６１６号および第５，５６３，０５５号、それぞれ本願に参照として含まれる）；原形質体のＰＥＧ－媒介形質転換（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈの他、１９９３；米国特許第４，６８４，６１１号および第４，９５２，５００号、それぞれ本願に参照として含まれる）；乾燥／抑制－媒介ＤＮＡの吸収（Ｐｏｔｒｙｋｕｓの他、１９８５）；熱衝撃（Ｆｒｏｇｅｒ ａｎｄ Ｈａｌｌ、２００７）；およびこれらの方法の組み合わせを含むが、これに制限されるものではない。このような技術を適用して小器官（単数または複数）、細胞（単数または複数）、組織（単数または複数）または生物体（単数または複数）が安定にまたは一時的に変形されてもよい。

【0184】

ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための物理的な方法は、リン酸カルシウム沈澱法、リポフェクション法、パーティクル・ガン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などを含む。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を生産する方法は当業界によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋの他．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。

【0185】

関心のあるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的な方法は、関心のあるポリヌクレオチドまたはトランスジーンが挿入できるＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含んでもよい。ウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く用いられる方法となった。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ－関連ウイルスなどから誘導され得る（例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および第５，５８５，３６２号などを参照）。

【0186】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質－基盤システムのようなコロイド分散システムを含む。また、ナノ粒子が考慮される。試験管内および生体内の伝達ビヒクルとして用いるための例示的なコロイドシステムはリポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

【0187】

遺伝子の治療方法および、例えば、アデノ－関連ウイルスを用いて対象体に遺伝子を伝達する方法は、特許文献ＵＳ６，９６７，０１８、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＵＳ２００８／０１７５８４５、ＵＳ２０１４／０１００２６５、ＥＰ２４３２４９０、ＥＰ２３５２８２３、ＥＰ２３８４２００、ＷＯ２０１４／１２７１９８、ＷＯ２００５／１２２７２３、ＷＯ２００８／１３７４９０、ＷＯ２０１３／１４２１ １４、ＷＯ２００６／１２８１９０、ＷＯ２００９／１３４６８１、ＥＰ２３４１０６８、ＷＯ２００８／０２７０８４、ＷＯ２００９／０５４９９４、ＷＯ２０１４０５９０３１、ＵＳ７，９７７，０４９およびＷＯ２０１４／０５９０２９（これらのそれぞれは、全文が本願に参照として含まれる）に記載されている。

【0188】

ａ．リポソーム－媒介トランスフェクション
一つの例示的な伝達ビヒクルは脂質および／またはリポソームである。脂質製剤の使用は、核酸を宿主細胞に導入するたに考慮される（試験管内、生体外または生体内）。また他の局面において、核酸は脂質と会合されてもよい。脂質と会合された核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化されてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在されており、リポソームとオリゴヌクレオチドのすべてと関連する連結分子を通じてリポソームに付着、リポソームに捕獲、リポソームと複合化、脂質を含む溶液に分散、脂質と混合、脂質と結合、脂質に懸濁液として含有、ミセルに含有または複合化、またはそうでなければ脂質と会合されてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連の組成物は、溶液中の任意の特定構造に制限されない。例えば、二重層構造、ミセルまたは「崩壊した」構造で存在してもよい。これらはまた単に溶液に散在され、大きさや形状が均一でない凝集体を形成することが可能である。脂質は自然発生または合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質には、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含む化合物の種類だけでなく、細胞質で自然的に発生する脂肪滴が含まれる。

【0189】

特定の実施様態において、核酸は、例えば、リポソームのような脂質複合体に捕獲されてもよい。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部の水性媒質を特徴とする多孔質構造である。多層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソームは、水性媒質により分離された様々な脂質層を有している。脂質層はリン脂質が過量の水溶液に懸濁されるとき、自発的に形成される。脂質成分は－閉じられた構造が形成される前に自己再配列を経て、脂質二重層の間に水と溶解された溶質を捕獲する（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。用いられるリポソームの量は、用いられる細胞だけでなくリポソームの特性によって変化し得、例えば、１００万乃至１０００万細胞当たり約５乃至約２０μｇベクターＤＮＡが考慮されてもよい。

【0190】

リポソーム－媒介核酸伝達および外来ＤＮＡの試験管内の発現は、非常に成功的であった（文献参照：Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙの他、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕの他、１９８７）。培養されたニワトリ胚、ＨｅＬａおよび肝癌細胞におけるリポソーム－媒介伝達および外来ＤＮＡ発現可能性も立証された（Ｗｏｎｇの他、１９８０）。

【0191】

特定の実施様態において、リポソームは赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成してもよい。これは、細胞膜との融合を促進し、リポソーム－カプセル化ＤＮＡの細胞進入を促進するものと示された（Ｋａｎｅｄａの他、１９８９）。他の実施様態において、リポソームは、核非－ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ－１）とともに複合化されるか、または用いられてもよい（Ｋａｔｏの他、１９９１）。また他の実施様態において、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ１のすべてとともに複合化されるか、または用いられてもよい。他の実施様態において、伝達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含んでもよい。

【0192】

多様な実施様態において用いるのに適合した脂質は、商業的な供給源から得られる。例えば、リポフェクタミンは、米国マサチューセッツ州・ウォルサム素材のＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手することができ；ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、米国ミズーリ州・セントルイス素材のＳｉｇｍａから入手することができ；ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、米国ニューヨーク州・プレーンビュー素材のＫ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手することができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇで得ることができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）およびその他の脂質は、米国アラバマ州・バーミンガム素材のＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．、から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノールのうち脂質原液は約－２０℃で保管してもよい。クロロホルムはメタノールより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として用いてもよい。「リポソーム」は取り囲まれた脂質二重層または凝集体の生成によって形成された多様な単一および多層脂質ビヒクルを包括する一般的な用語である。リポソームはリン脂質二重層膜および内部水性媒質を有する多孔質構造を有するものと特徴付けられてもよい。多層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソームは、水性媒質により分離された多くの脂質層を有している。脂質層は、リン脂質が過量の水溶液に懸濁されるとき、自発的に形成される。脂質成分は、閉じられた構造が形成される前に自己再配列を経て、脂質二重層の間に水と溶解された溶質を捕獲する（Ｇｈｏｓｈの他（１９９１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５～５１０）。しかし、溶液で正常な多孔質構造とは異なる構造を有する組成物も含まれる。例えば、脂質は、ミセル構造を仮定するか、または単に脂質分子の不均一な凝集体で存在してもよい。リポフェクタミン－核酸複合体も考慮される。

【0193】

ｂ．エレクトロポレーション法
特定の実施様態において、核酸はエレクトロポレーション法を通じて細胞内に導入される。エレクトロポレーション法は、細胞懸濁液とＤＮＡを高電圧電気放電に露出させることを含む。レシピエント細胞は、機械的傷によるトランスフォーメーションにさらに敏感にさせることができる。また、用いられるベクターの量は、用いられる細胞の特性によって変化し得、例えば、１００万乃至１０００万個の細胞当たり約５乃至約２０μｇのベクターＤＮＡが考慮されてもよい。

【0194】

エレクトロポレーション法を利用した真核細胞のトランスフェクションはかなり成功的であった。マウスのプレ－Ｂリンパ球はヒトカッパー－免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒの他、１９８４）、ラット肝細胞はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａの他、１９８６）。

【0195】

ｃ．リン酸カルシウム法
他の実施様態において、核酸は、リン酸カルシウム沈殿を用いて細胞に導入される。ヒトＫＢ細胞は、この技術を用いてアデノウイルス５ＤＮＡ（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３）でトランスフェクトされた。また、このような方式でマウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ－１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞にネオマイシンマーカー遺伝子をトランスフェクトさせ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ、１９８７）、ラット肝細胞に多様なマーカー遺伝子をトランスフェクトさせた（Ｒｉｐｐｅの他、１９９０）。

【0196】

ｄ．ＤＥＡＥ－デキストラン法
他の実施様態において、核酸は、ＤＥＡＥ－デキストランに続いてポリエチレングリコールを用いて細胞内に伝達される。このような方式でレポータープラスミドをマウス骨髄腫および赤白血病細胞に導入した（Ｇｏｐａｌ、１９８５）。

【0197】

４．選択可能であるか、またはスクリーニング可能なマーカー
外因性核酸を宿主細胞に導入する方法、または本発明の抑制剤に細胞を露出させる方法とは関係なく、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために多様な検定を行うことができる。このような検定は、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者によく知られた「分子生物学的」検定と、特定ペプチドの存在または不在検出のような「生化学的」検定、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）または本開示内容の範囲内に属する作用剤を確認するための本願に記載されている検定とを含む。

【0198】

特定の実施様態において、外因性核酸を含む細胞は、発現ベクターまたは外因性核酸にマーカーを含むことで、試験管内または生体内で識別され得る。このようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞を容易に識別することができるように、細胞に識別可能な変化を付与するだろう。一般的に、選択マーカーは、選択を許容する属性を付与するものであってもよい。ポジティブ選択マーカーは、マーカーの存在が選択を許容するマーカーであるのに対し、ネガティブ選択マーカーは、その存在が選択を妨害するマーカーである。陽性選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。

【0199】

条件の具現に基づいて形質転換体の区別を可能にする表現型を付与するマーカーの他に、比色分析を基本とするＧＦＰのようなスクリーニング可能なマーカーを含む他の類型のマーカーも考慮される。代案的に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような陰性選別マーカーとして、スクリーニング可能な酵素を用いてもよい。当業者はまた、可能にはＦＡＣＳ分析とともに免疫学的マーカーを用いる方法を認知するだろう。用いられたマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現できる限り、重要でないものと思われる。選別およびスクリーニング可能なマーカーの追加の例は、当業者によく知られている。

【0200】

選別可能なマーカーは、外来ＤＮＡを細胞に導入するためのトランスフェクションまたはその他の操作の成功を示すために実験室の微生物学、分子生物学および遺伝工学において用いられるレポーター遺伝子類型を含んでもよい。選別可能なマーカーは、たびたび抗生剤耐性遺伝子であり；外部ＤＮＡを導入する操作を経た細胞は抗生剤を含んだ培地で成長し、成長できる細胞は、導入された遺伝物質を成功的に吸収して発現した。選別可能なマーカーの例は、ジェネテシンに対する抗生剤耐性を付与するＴｎ５のＡｂｉｃｒ遺伝子またはＮｅｏ遺伝子を含む。

【0201】

スクリーニング可能なマーカーは、研究者が所望する細胞と所望しない細胞を区別できるようにするレポーター遺伝子を含んでもよい。本発明の特定の実施様態は、特定の細胞系統を示すためにレポーター遺伝子を利用する。例えば、レポーター遺伝子は、同時発現のための心室－または心房－選択的遺伝子のコーディング領域と、一般的に関連した心室－または心房－選択的調節エレメントの制御下に発現エレメント内に位置してもよい。レポーターは、特定血統の細胞を薬物またはその他の選択圧力に置くか、または細胞生存可能性を危険に落ち込むことなく分離することができる。

【0202】

このようなレポーターの例は、細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ４、ＨＡエピトープ）、蛍光タンパク質、抗原決定基および酵素（例えば、β－ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子を含む。ベクター含有細胞は、例えば、細胞表面のタンパク質に対する蛍光－タグされた抗体またはベクターによりコードされた酵素によって蛍光生成物に転換され得る基質を用いてＦＡＣＳによって分離されてもよい。

【0203】

特定の実施様態において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質である。ほぼ全体可視光線スペクトルにわたった蛍光放出スペクトルプロフィルを特徴とする広範囲な蛍光タンパク質遺伝変異体が開発された（非制限的な例は、表１を参照）。元々Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａクラゲ緑色蛍光タンパク質に対する突然変異誘発努力により青色から黄色まで多様な色相の新たな蛍光プローブが作られており、これは、生物学的研究において最も広く用いられる生体内のレポーター分子中の一部である。オレンジ色と赤色スペクトル領域で放出するさらに長い波長の蛍光タンパク質は、海洋イソギンチャク、ディスコソマ線条体（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａ）および珊瑚虫（Ａｎｔｈｏｚｏａ）の種類に属する暗礁珊瑚から開発された。青緑色、緑色、黄色、オレンジ色および濃い赤色蛍光放出を有する類似したタンパク質を生産するためにまた別の種が採掘された。蛍光タンパク質の明るさと安定性を改善して全般的な有用性を向上させるための開発研究努力が進行中である。

【0204】

【0205】

ＩＩＩ．神経退行性疾患の治療
本開示内容の局面は、神経退行性疾患、障害または病態を病んでいる対象体を治療または予防するためにこのような組成物を用いる組成物および方法に関するものである。一部の実施様態において、神経退行性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病認知症、血管性認知症、大脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、慢性外傷性脳症、ダウン症候群、および／または病的老化である。一部の実施様態において、神経退行性疾患はアルツハイマー病である。

【0206】

特定の実施様態において、開示されている方法は、神経退行性疾患、障害または病態と診断された対象体を治療する段階をさらに含む。特定の実施様態において、開示されている方法は、神経退行性疾病、障害または病態の症状を有すると診断された対象体を治療する方法をさらに含む。特定の実施様態において、開示されている方法は、神経退行性疾患、障害または病態を有する危険があると確認された対象体を治療する段階をさらに含む。当業界に公知になり、本願に記述された試験および診断方法を用いて、対象体は神経退行性疾患、障害または病態と診断されるか、または症状を有すると診断され得るか、または有する危険があると識別され得る。

【0207】

一部の実施様態において、前記方法は、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を含む、治療が必要な対象体を決定する段階をさらに含む。一部の実施様態において、Ａβペプチドをコードするベクターは、Ａβペプチドのタンパク質の発現を可能にするミニ遺伝子をコードすることができ、一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：８、配列番号：１３乃至１７、配列番号：３５乃至３８、または配列番号：６６乃至８５のうちの任意の配列番号と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含んでもよい。一部の実施様態において、前記方法は、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を含む治療を対象体に必要であると判断される場合、対象体に提供する段階をさらに含む。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を含む治療を必要とする対象体を決定する段階は、対象体を神経退行性疾患、障害または病態と診断する段階を含む。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を含む治療を必要とする対象体を決定する段階は、対象体が神経退行性疾患、障害または病態の症状を有すると診断する段階を含む。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を含む治療を必要とする対象体を決定する段階は、神経退行性疾患、障害または病態を有する危険がある対象体を識別する段階を含む。

【0208】

一部の実施様態において、開示されている方法は、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物を神経退行性疾患、障害または病態を病んでいる対象体に投与する段階を含む。本願に開示されているように、神経退行性疾患は、Ａβペプチドの凝集またはオリゴマー化と関連する可能性があり、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターの投与は、驚くべきことに内因性Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルまたはプラークの形成を防止または減少させるものと期せずして明らかにされた。また、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを投与すると、驚くべきことに内因性Ａβペプチド凝集体の細胞毒性を予防または減少させることができる。従って、一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む治療学的有効量の組成物で神経退行性疾患、障害または病態を病んでいる対象体を治療するための組成物、および相応する方法が開示される。追加の実施様態において、少なくとも一つの生体内の内因性Ａβペプチドを、Ａβペプチド変異体をコードするベクターから治療学的有効量の発現されたＡβペプチド変異体と接触させる段階を含む、生体内で内因性Ａβペプチドの凝集を抑制する方法が開示されており、ここで、ベクターは任意で組成物に含まれる。追加の実施様態において、少なくとも一つの生体内の内因性Ａβペプチドを、野生型－Ａβ型ペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするベクターから治療学的有効量の発現された野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体と接触させる段階を含む、生体内の内因性Ａβペプチドの凝集を促進する方法が開示され、ここで、ベクターは任意で組成物に含まれる。一部の実施様態において、神経退行性疾患、障害または病態は、内因性Ａβペプチドの非正常的な凝集を特徴とするものである。一部の実施様態において、神経退行性疾患、障害または病態はアルツハイマー病である。

【0209】

対象体は、例えば、Ａβペプチドの異常凝集を症状および／または機序として有する病態を有し得る。本開示内容の実施様態は、Ａβペプチド凝集の調節が有益である任意の医学的病態の治療または予防を含む。特定の実施様態において、個体におけるＡβペプチド凝集の弱化、または個体におけるＡβペプチド凝集の遅延または逆転のために、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む一つ以上の組成物の治療学的有効量を提供する。特定の実施様態において、個体にＡβペプチド凝集の促進のための野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む一つ以上の組成物の治療学的有効量を提供する。特定の実施様態において、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物で治療または予防される医学的病態は、Ａβペプチドの凝集を特徴とする神経退行性疾患、障害または病態を含む。特定の実施様態において、Ａβペプチドの凝集は、本開示内容の組成物で処理されない。一部の場合に、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は、例えば、Ａβペプチドの凝集を改善、抑制、遅延または逆転させることで、個体の医学的病態を治療または予防する。一部の場合に、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は、例えば、Ａβペプチドの凝集を促進することで、個体の医学的病態を治療または予防する。一部の実施様態において、Ａβペプチド凝集の改善、抑制、遅延または逆転は、タウタンパク質シーディングを弱化させることができる。

【0210】

対象体は、例えば、非正常的アミロイドプラークの形成、タンパク質ミスフォールディング、タウタンパク質のレベルおよび／またはリン酸化されたタウタンパク質のレベルの増加、タウタンパク質および／またはＡβペプチドシーディングの増加、神経炎症、認知減退、神経退行性、ニューロン損失、および／またはシナプス損失を症状および／または機序として有する病態を有し得る。本開示内容の実施様態は、アミロイドプラークの形成、タンパク質ミスフォールディング、タウタンパク質のレベル、タウタンパク質のリン酸化、タウタンパク質および／またはＡβペプチドのシーディングのシーディング速度、神経炎症、認知低下、神経退行性、ニューロン損失および／またはシナプス損失の調節が有益である任意の医学的病態の治療または予防を含む。特定の実施様態において、個体内のアミロイドプラークの形成、タンパク質ミスフォールディング、タウタンパク質のレベル、タウタンパク質のリン酸化、タウタンパク質および／またはＡβペプチドのシーディング速度、神経炎症、認知低下、神経退行性、ニューロン損失および／またはシナプス損失の弱化のための野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む一つ以上の組成物の治療学的有効量が個体に提供される。特定の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物で治療または予防される医学的病態は、神経退行性疾患、障害またはタンパク質ミスフォールディング、内因性Ａβペプチドの凝集、アミロイドプラークの形成、神経炎症、神経退行性、ニューロン損失またはシナプス損失に繋がり得る病態；非正常的なタウのレベル、タウのリン酸化、またはリン酸化されたタウのレベル；タウのシーディングまたは内因性Ａβペプチドのシーディング；および／または認知低下を含む。特定の実施様態において、タンパク質ミスフォールディング、内因性Ａβペプチドの凝集、アミロイドプラークの形成、神経炎症、神経退行性、ニューロン損失またはシナプス損失；非正常的なタウのレベル、タウのリン酸化、またはリン酸化されたタウのレベル；タウのシーディングまたは内因性Ａβペプチドのシーディング；および／または認知減退は、本発明の組成物で治療されない。一部の場合に、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は、例えば、タンパク質ミスフォールディング、内因性Ａβペプチドの凝集、アミロイドプラークの形成、神経炎症、神経退行性、ニューロン損失またはシナプス損失；非正常的なタウのレベル、タウのリン酸化、またはリン酸化されたタウのレベル；タウのシーディングまたは内因性Ａβペプチドのシーディング；および／または認知低下を改善するか、または抑制することで個体の医学的病態を治療または予防する。

【0211】

本開示内容の実施様態は、タンパク質ミスフォールディング、内因性Ａβペプチドの凝集、アミロイドプラークの形成、神経炎症、神経退行性、ニューロン損失またはシナプス損失；非正常的なタウのレベル、タウのリン酸化、またはリン酸化されたタウのレベル；タウのシーディングまたは内因性Ａβペプチドのシーディング；および／または神経退行性障害の結果として認知減退を治療または予防する組成物および方法を含む。特定の場合に、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物を個体に伝達すれば、内因性Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルの形成または内因性Ａβペプチド凝集体のプラークまたは細胞毒性を防止または減少させる。特定の場合に、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物を個体に伝達すれば、内因性Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルまたは内因性Ａβペプチド凝集体のプラークの形成を促進する。

【0212】

一部の実施様態において、野生型Ａβペプチドをコードするベクターは、ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号：２）、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、本開示内容の野生型Ａβペプチドは、配列番号：２、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：２の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＦＦＡＥ（配列番号：３９）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。

【0213】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターは、野生型Ａβペプチドアミノ酸配列に相応する配列番号：２の変異体を含む。

【0214】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、本開示内容のＡβペプチド変異体は、配列番号：３、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：３の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＤＦＡＥ（配列番号：１０）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。

【0215】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、本開示内容のＡβペプチド変異体は、配列番号：４、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：４の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＦＰＡＥ（配列番号：１１）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。

【0216】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、本開示内容のＡβペプチド変異体は、配列番号：５、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：５の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＤＦＡＥ（配列番号：１０）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。

【0217】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、本開示内容のＡβペプチド変異体は、配列番号：６、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：６の断片または機能的誘導体は、ＫＬＶＰＦＡＥ（配列番号：１２）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。

【0218】

一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、

、またはその断片または機能的誘導体と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、本開示内容のＡβペプチド変異体は、配列番号：７、またはその断片または機能的誘導体を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される。一部の実施様態において、配列番号：７の断片または機能的誘導体は、ＫＬＰＦＦＡＥ（配列番号：６５）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体は、配列番号：７を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成されない。

【0219】

一部の実施様態において、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体はＮ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は、１乃至２２つのアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含む。

【0220】

一部の実施様態において、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体はＣ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｃ－末端切断は、１乃至２７個のアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む。

【0221】

一部の実施様態において、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７を含むか、またはこれにより構成されるか、本質的に構成される野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体は、Ｎ－末端切断およびＣ－末端切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は、１乃至２２つのアミノ酸切断を含み、Ｃ－末端切断は、１乃至２７個のアミノ酸切断を含む。一部の実施様態において、Ｎ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２つのアミノ酸切断を含み、Ｃ－末端切断は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のアミノ酸切断を含む。

【0222】

野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体は、Ａβペプチドのタンパク質の発現を可能にするミニ遺伝子をコードするベクターによってコードされてもよい。一部の実施様態において、ミニ遺伝子は、配列番号：８、配列番号：１３乃至１７、配列番号：３５乃至３８、または配列番号：６６乃至８５のうちの任意の配列番号と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値を有するアミノ酸配列に相応するヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0223】

また、一部の実施様態においては、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む薬剤学的組成物が開示される。一部の場合に、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物が個体のための単独療法で提供されるが、他の場合、個体は、タンパク質ミスフォールディング、内因性Ａβペプチドの凝集、アミロイドプラークの形成、神経炎症、神経退行性、ニューロン損失またはシナプス損失の治療または予防；非正常的なタウのレベル、タウのリン酸化、またはリン酸化されたタウのレベル；タウのシーディングまたは内因性Ａβペプチドのシーディング；および／または認知低下のための一つ以上の追加療法を提供されるか；または他の場合にＡβペプチドの凝集、アミロイドプラークの形成および／またはフィブリルの形成を促進するための一つ以上の追加療法が個体に提供される。

【0224】

一つ以上の追加療法は任意の種類であってもよいが、特定の場合に、一つ以上の追加療法は、一つ以上の追加神経退行性疾患治療剤、例えば、アルツハイマー病薬物である。一部の実施様態において、アルツハイマー病薬物は、アデュカヌマブ、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンまたはタクリンを含む。一部の実施様態において、アルツハイマー病薬物はＡβレベルを減少させるか、または凝集を防止する追加および／または代替薬物および生物製剤（すなわち、セクレターゼ抑制剤／調節剤、抗－Ａβ手動免疫化、抗－Ａβ能動免疫化または金属キレート剤）；タウのレベルを下げるか、またはタウの凝集を防止するか、またはタウの病的リン酸化を減少させる薬物および製剤（すなわち、キナーゼ抑制剤、抗－タウ手動免疫化、抗－タウ能動免疫化、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）；微細小管を安定化する薬物および製剤；神経退化を減少する薬物および製剤；炎症反応を遮断または変形する薬物および製剤；神経精神病症状を減少する薬物および製剤；認知を向上する薬物および製剤（すなわち、神経伝達物質抑制剤、調節剤、活性剤）；血管機能を保存または改善する薬物および製剤；または細胞代謝を変更する薬物および製剤を含んでもよい（例えば、文献Ｋ．Ｇ．Ｙｉａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ＆Ｓ．Ｇ．Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ、Ｊ．Ｃｅｎｔ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．Ｄｉｓ．１２：１１７９５７３５２０９０７３９７（２０２０）、ａｎｄ Ｊ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓの他、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｅｍｅｎｔ．（Ｎ．Ｙ．）５：２７２～２９３（２０１９）を参照）。

【0225】

一部の実施様態において、一つ以上の追加療法は、老化の障害または同伴疾患、例えば、心血管疾患、糖尿病、粥状動脈硬化症、肥満、癌、感染および神経障害を治療するための一つ以上の療法を含む。老化の進行に対するよく－確立された全ての指標を用いることができる。一部の実施様態において、老化の障害または同伴疾患を治療するための一つ以上の療法は、ガン発病率の減少、粥状動脈硬化症のような心血管疾患の遅延または緩和；骨粗鬆症の遅延および／または緩和；ブドウ糖耐性の改善または糖尿病および肥満のような関連疾患の発病率の減少；記憶機能およびその他の認知機能の低下の改善または減少；衰退する神経筋協応改善または減少；および免疫機能低下を改善または減少させる効果を有する。年齢－関連障害の改善は、影響を受けた対象体の症状減少または治療されていない集団と比べて、集団の疾病または障害発病率の減少の結果でもあり得る。一つ以上の療法は、特定のマーカーおよび老化障害によって評価されるように、多様な年齢－関連病態および疾患を治療および／または予防する効果を有する。従って、追加の局面において、本発明は、少なくとも心血管機能の減少、骨粗鬆症、関節炎、ブドウ糖不耐性、インシュリン抵抗性、記憶力減少、神経筋協応喪失、心血管疾患増加、心臓、循環系または肺機能の減少および寿命減少、またはこれらの組み合わせのグループから選ばれる障害または老化マーカーの対象体における治療または予防に関するものである。

【0226】

ＩＶ．治療学的組成物の投与
特定の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は、治療的投与のための薬剤学的組成物として剤形化される。一部の実施様態において、開示されている方法は、対象体または患者に神経退行性疾患療法を投与する段階を含む。本開示内容の組成物は、生体内、試験管内または生体外投与のために用いられてもよい。
一部の実施様態において、神経退行性疾患療法は、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異療法であってもよいタンパク質－基盤療法を含む。一部の実施様態において、神経退行性疾患療法は、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む療法であってもよいポリヌクレオチド－基盤の療法を含む。一部の実施様態において、神経退行性疾患療法は一つ以上の神経退行性疾患の薬物を含む。これらの神経退行性疾患療法はいずれも除外されてもよい。これらの療法の組み合わせもまた投与されてもよい。

【0227】

本願において提供される療法は、第１の神経退行性疾患療法（例えば、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体または野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチド）および一つ以上の追加神経退行性疾患療法（例えば、神経退行性疾患薬物）のような治療学的組成物の組み合わせの投与を含んでもよい。療法は当業界に公知になっている任意の適合した方式で投与されてもよい。例えば、第１および一つ以上の追加の神経退行性疾患療法は、順次に（異なる時間に）または同時に（同時にまたはほぼ同時に；また「同時に」または「実質的に同時に」）投与されてもよい。一部の実施様態において、第１および一つ以上の追加の神経退行性疾患治療療法は、別途の組成物で投与されてもよい。一部の実施様態において、第１および一つ以上の追加の神経退行性疾患治療療法は同一の組成物にあり得る。異なる療法は、一つの組成物または２つの組成物、３つの組成物または４つの組成物のような一つ超過の組成物で投与され得る。製剤の多様な組み合わせが用いられてもよい。

【0228】

一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物（単数または複数）、および一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物は実質的に同時に投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターおよび一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物を含む組成物（単数または複数）は順次に投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物（単数または複数）は、一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物を投与する前に投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物（単数または複数）は、一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物を投与した後に投与される。

【0229】

一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物（単数または複数）は対象体に１回伝達される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は、対象体に、例えば、１日１回、１日１回以上、１週間に１回、１週間に１回以上、１ヶ月に１回、１ヶ月に１回以上、１年に１回または１年に１回以上に数回伝達される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体が対象体に数回投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするベクターまたはポリヌクレオチドは対象体に１回投与される。多重治療は同一の製剤および／または投与経路を有してもよく、または有さなくてもよい。

【0230】

一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は、Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリルまたはフィブリル形成の開始後に伝達される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は、アミロイドプラーク形成の開始後に伝達される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は、Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリルまたはフィブリル形成の開始前に伝達される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物はアミロイドプラーク形成の開始前に伝達される。

【0231】

Ａ．担体
一部の実施様態において、本開示内容の薬剤学的組成物は、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体または薬剤学的に許容される担体に溶解または分散された変異体をコードするポリヌクレオチドを含む有効量の一つ以上の組成物を含む。「薬剤学的」および「薬理学的に許容される」という文具は、本明細書において相互交換的に用いられ、例えば、ヒトのような対象体に適切に投与されるとき、副作用、アレルギーまたはその他の好ましくない反応を引き起こすことなく、本開示内容の治療方法を妨害しない分子実体および組成物を意味する。Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体または追加の活性成分をコードする少なくとも一つのベクターを含む薬剤学的組成物の製造は、文献［参照：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５、具体的に、全文が本願に参照として含まれる］に例示されるように、本開示内容に照らして当業者に公知になるだろう。また、対象体に投与するための製剤は、ＦＤＡ生物標準事務局（ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）で要求する無菌性、発熱性、一般安全性および純度標準を満たさなければならないことを理解するだろう。

【0232】

本願において用いられる用語「薬剤学的に許容される担体」は、当業者に公知になったような（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０、ｐｐ．１２８９～１３２９、具体的に、全文が本願に参照として含まれる）、任意のおよびすべての溶媒、分散媒質、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料、類似物質およびこれらの組み合わせを含む。任意の通常の担体が活性成分と両立できない場合を除き、薬剤学的組成物におけるその使用が考慮される。野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはこれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、固体、液体またはエアロゾル形態で投与されるか否か、および注入のような投与経路に対して滅菌が必要であるか否かによって異なる類型の担体を含んでもよい。

【0233】

さらに、本開示内容によると、投与に適合した本開示内容の組成物は、不活性希釈剤とともにまたは不活性希釈剤なく製薬上許容される担体に提供されてもよい。担体は同化可能であるべきであり、液体、半固体、すなわちペーストまたは固体担体を含む。任意の通常の媒質、作用剤、希釈剤または担体がレシピエントまたは内部に含有された組成物の治療効果に有害な場合を除き、本開示内容の方法を実施するのに担体の使用が適切である。担体または希釈剤の例は、脂肪、オイル、水、塩水溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤、アルコールなど、またはこれらの組み合わせを含む。組成物はまた一つ以上の成分の酸化を遅滞させるために多様な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物作用の予防は、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）またはこれらの組み合わせを含むが、これに制限されない多様な抗菌剤および抗真菌剤のような防腐剤によって引き起こされてもよい。

【0234】

本開示内容によると、組成物は、任意の便利で実質的な方式、すなわち、溶液、懸濁液、乳化、混合、カプセル化、吸収などによって担体と組み合わされる。このような操作は当業者にとって日常的である。野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはこれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物は凍結乾燥されてもよい。

【0235】

本開示内容の特定の実施様態において、組成物は、半固体または固体担体と完全に組み合わされるか、または混合される。混合は、グラインディング（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）のような任意の便利な方式で行われてもよい。治療活性の損失、すなわち、胃腸での変性から組成物を保護するために安定化剤がまた混合過程で添加されてもよい。組成物に用いられる安定化剤の例は、緩衝剤、グリシンおよびリジンのようなアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、果糖、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどのような炭水化物を含む。

【0236】

更なる実施様態において、本開示内容は、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはこのような一つ以上の脂質をコードするポリヌクレオチド、および水性溶媒を含む組成物を含む薬剤学的脂質ビヒクル組成物の使用を含んでもよい。本願において用いられる用語「脂質」は、特徴的に水に不溶性であり、かつ有機溶媒で抽出することができる広範囲な物質のうち任意のものを含むと定義されるだろう。このような広範囲な部類の化合物は、当業者によく知られており、「脂質」という用語が本願において用いられることによって任意の特定構造に制限されない。脂質の例は、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含む化合物を含む。脂質は天然発生または合成（すなわち、ヒトによって設計または生産される）であってもよい。しかし、脂質は、一般的に生物学的物質である。生物学的脂質は当業界によく知られており、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、グリコスフィンゴ脂質、糖脂質、スルファチド（ｓｕｌｐｈａｔｉｄｅ）、エーテルおよびエステル－結合された脂肪酸を有する脂質および重合性脂質、およびこれらの組み合わせを含む。もちろん、当業者が脂質と理解する本願に具体的に記載されている脂質以外の化合物も本開示内容の組成物および方法に含まれる。

【0237】

当業者は組成物を脂質ビヒクルに分散させるために用いられてもよい技術の範囲をよく知っているはずである。例えば、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはこれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物（単数または複数）は、脂質を含む溶液に分散され、脂質と溶解され、脂質と油化され、脂質と混合され、脂質に共有結合され、脂質に懸濁液で含有され、ミセルまたはリポソームに含有または複合化されるか、または当業者に公知になっている任意の手段によって脂質または脂質構造と会合されてもよい。分散液はリポソームを形成してもよく、または形成しなくてもよい。

【0238】

野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物（単数または複数）は、遊離塩基、中性または塩形態の組成物に剤形化されてもよい。薬剤学的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成された塩、または、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸のような有機酸と形成された塩を含む。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄のような無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインのような有機塩基から由来してもよい。製剤化の際、溶液は、投与製剤と互換される方式で、そして治療学的に効果的な量で投与されるだろう。前記剤形は、肺へ伝達するための注入液またはエアロゾルのような非経口投与のために剤形化されるか、または薬物放出カプセルなどのような消化投与のために剤形化される形態のような多様な投与形態で容易に投与される。

【0239】

Ｂ．投与経路
本発明の治療剤は同一の投与経路または異なる投与経路によって投与されてもよい。組成物の投与経路は、例えば、静脈内、脳内、頭蓋内、筋肉内、皮下、局所、経口、粘膜内、皮内、経皮、腹腔内、動脈内、眼窩内、移植によって、膣内、直腸内、脊髄腔内、関節内、脳室内、潤滑膜内または鼻腔内；吸入、注入、投入、連続投入、カテーテルを介して、洗浄を通じて標的細胞を直接な局所的灌流入浴；クリームまたは脂質組成物（例えば、リポソーム）；他の方法または当業者に公知になっている前述の方法の任意の組み合わせであってもよい（例えば、文献Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０を参照、具体的に全文が本願に参照として含まれる）。

【0240】

一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物（単数または複数）は全身的にまたは局所的に伝達される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は、眼窩－後方注入を通じて中枢神経系へ伝達される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は、末梢注入を通じて全身的に中枢神経系へ伝達される。一部の実施様態において、末梢注入は静脈注入である。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は脳脊髄液（ＣＳＦ）へ伝達される。一部の実施様態において、組成物は非外科的な注入によって脳脊髄液へ伝達される。一部の実施様態において、脳脊髄液への非外科的な注入は非外科的脊髄腔内の注入を含む。一部の実施様態において、組成物は神経外科的な注入によって脳脊髄液へ伝達される。一部の実施様態において、脳脊髄液への神経外科的な注入は大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ）への神経外科的な注入を含む。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物は心室系へ伝達される。一部の実施様態において、組成物は神経外科的な注入によって心室系へ伝達される。脳脊髄液および／または心室系への組成物の伝達は、例えば、本願に全文が参照として含まれた文献［Ｗ．Ａ．Ｌｉｇｕｏｒｅの他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２７（１１）：２０１８～２０３７］に記述されている。一部の実施様態において、中枢神経系、ＣＳＦおよび／または心室系へ伝達される組成物は血液脳関門を通過する。

【0241】

一部の実施様態において、本願に開示されている野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体を含む組成物は、文献［Ａ．Ｌ．Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｊ．Ｒｉｃｈａｒｄ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ６（２）：１４９～１６３（２０１５）、具体的に、本願に全文が参照として含まれる）］に説明されているように、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体の生体内の安定性および／または細胞による野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体の摂取または吸収を向上させるために剤形化されてもよい。例えば、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体は、細胞による野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体の吸収を増加させるために吸収増強剤、例えば、アシルカルニチン、オクタン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ＳＮＡＣ、ＳＮＡＤ、５－ＣＮＡＣとともに剤形化されてもよい。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体の生体内の安定性および／または細胞による野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体の吸収または吸収を向上させるための剤形は、組成物の投与経路、例えば、経口または注入に左右されるだろう。

【0242】

１．非経口経路
従って、一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物（単数または複数）は非経口経路を通じて投与されてもよい。本願において用いられる用語「非経口」は、消化管を迂回する経路を含む。具体的に、本願に開示されている薬剤学的組成物は、例えば、眼窩－後方、脳内、頭蓋内、静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、脊髄腔内、皮下または腹腔内に投与されてもよいが、これに制限されるものではない（米国特許第６，７５３７，５１４号、第６，６１３，３０８号、第５，４６６，４６８号、第５，５４３，１５８号；第５，６４１，５１５号；および第５，３９９，３６３号（それぞれ全文が参照として本明細書に具体的に含まれる）。

【0243】

遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水で製造されてもよい。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物およびオイルで製造されてもよい。一般的な保管および使用条件において、これらの製剤は、微生物の成長を防止する防腐剤を含む。注入可能な用途に適合した薬剤学的形態は、殺菌された注入可能な溶液または分散液の即席製造のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号、具体的に全文が本願に参照として含まれる）。すべての場合に、形態は無菌状態でなければならず、注入が容易である程度に流動的でなければならない。製造および保管条件で安定的でなければならず、バクテリアおよびカビのような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（すなわち、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適合した混合物および／または植物性オイルを含む溶媒または分散媒質であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散の場合必要である粒子の大きさの維持および界面活性剤の使用によって維持されてもよい。微生物作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって引き起こされてもよい。多くの場合に、例えば、糖または塩化ナトリウムのような等張化剤を含むことが好ましいだろう。注入用組成物は吸収を遅延させる製剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物に用いることで長時間吸収されてもよい。

【0244】

例えば、水溶液における非経口投与のために、溶液は、必要である場合に適切に緩衝されなければならず、液体希釈剤は、先ず十分な食塩水またはブドウ糖で等張性にさせるべきである。これらの特定水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適合している。これと関連して、用いられてもよい滅菌水性媒質は、本開示内容に照らして当業者に公知になるだろう。例えば、一つの投与量を等張性ＮａＣｌ溶液に溶解させて提案された投入部位に注入することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１０３５～１０３８頁および１５７０～１５８０頁を参照）。投与量の一部の変動は、治療対象体の状態に応じて必然的に発生するだろう。投与責任者はどのような場合でも個別対象体に適切な用量を決定する。また、ヒト投与の場合、製剤は、ＦＤＡ生物標準事務局において要求する無菌性、発熱性、一般安全性および純度標準を満たさなければならない。

【0245】

滅菌注入用溶液は必要な量の活性化合物を適切な溶媒に前記列挙された多様なその他の成分とともに混入させた後、必要である場合、例えば、ろ過滅菌することで製造することができる。一般的に、分散液は、基本分散媒質および上記に列挙されたもののうち、必要なその他の成分を含む滅菌ビヒクルに多様な滅菌活性成分を混入して製造される。滅菌注入溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、以前に滅菌濾過された溶液から活性成分の粉末と任意の追加の所望の成分を生成する真空乾燥および凍結乾燥技術である。粉末化組成物は安定化剤とともにまたは安定化剤なく、例えば、水または食塩水のような液体担体と組み合わされる。

【0246】

２．消化経路
本開示内容の特定の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物（単数または複数）は、消化経路を通じて投与されるように剤形化される。消化経路は組成物が消化管と直接接触するすべての可能な投与経路を含む。具体的に、本願に開示されている薬剤学的組成物は、経口、頬側、直腸または舌下で投与されてもよい。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤または同化可能な食用担体とともに剤形化されてもよいか、硬質－または軟質－シェルのゼラチンカプセルに同封されてもよいか、錠剤で圧縮されてもよいか、または献立の食べ物と直接統合されてもよい。

【0247】

特定の実施様態において、活性化合物は賦形剤とともに混入されてもよく、摂取可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ）、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハなどの形態で用いられてもよい（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚの他、１９９７；Ｈｗａｎｇの他、１９９８、米国特許第５，６４１，５１５号、第５，５８０，５７９号および第５，７９２，４５１号（それぞれ全文が本願に参考として含まれる）。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた次を含んでもよい：例えば、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチンまたはそれらの組み合わせのような結合剤；例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはこれらの組み合わせのような賦形剤；例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸またはこれらの組み合わせのような崩壊剤；例えば、マグネシウムステアレートのような潤滑剤；例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはこれらの組み合わせのような甘味剤；例えば、ペパーミント、ウインターグリーンオイル、チェリー香料、オレンジ香料などのような香味剤。投与単位の形態がカプセルである場合、前記類型の物質に加えて液体担体を含んでもよい。多様なその他の物質がコーティング剤で存在することができるか、そうでなければ投与単位の物理的形態を変形することができる。例えば、錠剤、丸薬またはカプセルはシェラック（ｓｈｅｌｌａｃ）、砂糖または両方ともでコーティングされてもよい。投与形態がカプセルである場合、前記類型の物質に加えて液体担体のような担体を含んでもよい。ゼラチンカプセル、錠剤または丸薬は腸溶コーティングされてもよい。腸溶コーティングはｐＨが酸性である胃または上部腸で組成物の変性を防止する。例えば、米国特許第５，６２９，００１号を参照する。小腸に到達すれば、内部塩基性ｐＨはコーティングを溶解させ、組成物が放出されて、特化された細胞、例えば上皮腸細胞およびＰｅｙｅｒ’ｓ ｐａｔｃｈ Ｍ細胞により吸収されるようにする。エリキシルシロップは活性化合物であるスクロースのような甘味料、メチルおよびプロピルパラベンのような防腐剤、染料および香味剤（例えば、チェリーまたはオレンジ香）を含んでもよい。もちろん、任意の投与単位形態を製造するのに用いられる任意の物質は薬剤学的に純粋であり、用いられる量で実質的に無毒性でなければならない。また、活性化合物は持続放出製剤および剤形に含まれてもよい。

【0248】

経口投与のために、本開示内容の野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物（単数または複数）は、代案的に口腔洗浄剤、歯磨き粉、頬側錠剤、経口スプレーまたは舌下経口－投与剤形の形態で一つ以上の賦形剤とともに混入されてもよい。例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ’ｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）のような適切な溶媒に必要な量の活性成分を含んで口腔清潔剤を製造することができる。代案的に、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む溶液のような経口溶液に混入されるか、歯磨剤（ｄｅｎｔｉｆｒｉｃｅ）に分散されるか、または水、結合剤、研磨剤、香味剤、発布剤および湿潤剤を含んでもよい組成物に治療学的有効量で加えることができる。代案的に、組成物は舌の下に置くか、口中で溶解され得る錠剤または溶液の形態で作られてもよい。

【0249】

他の消化管の投与方式に適合した追加の剤形は座薬を含む。座薬は多様な重さと形状の固形剤形であって、一般的に直腸に挿入するために薬用で用いられる。挿入後の座薬は共同流体で軟化されるか溶けるか、または溶解される。一般的に、座薬の場合、伝統的な担体は、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはこれらの組み合わせを含んでもよい。特定の実施様態において、座薬は、例えば、約０．５％乃至約１０％（重量）、好ましくは約１％乃至約２％（重量）の範囲の活性成分を含む混合物から形成されてもよい。

【0250】

３．その他の経路
本開示内容の他の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む組成物（単数または複数）は、多様なその他の経路、例えば、局所（すなわち、経皮）投与、粘膜投与（鼻腔、膣など）および／または吸入を通じた投与のために剤形化されてもよい。

【0251】

局所投与用製薬組成物は、軟膏、ペースト、クリームまたは粉末のような医薬適用のために剤形化された活性化合物を含んでもよい。軟膏は局所適用のためのすべての維持性、吸着性、エマルジョンおよび水溶性基盤組成物を含むのに対し、クリームおよびローションはエマルジョン基盤のみを含む組成物である。局所的に投与される薬物には肌を通じた活性成分の吸着を促進するための浸透促進剤が含有されてもよい。適合した浸透促進剤は、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドンおよびラウロカプラムを含む。局所適用のための組成物の可能なベースは、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリームおよびワセリンだけでなく、任意の他の適合した吸収性、エマルジョンまたは水溶性軟膏ベースを含む。局所製剤はまた活性成分を保存し、均質にした混合物を提供するために必要に応じて乳化剤、ゲル化剤および抗微生物保存剤を含んでもよい。本開示内容の経皮投与はまた「パッチ」の使用を含んでもよい。例えば、パッチは一つ以上の活性物質を予め決定された速度で固定された期間の中、連続的な方式で供給することができる。

【0252】

特定の実施様態において、Ａβペプチド変異体またはその断片または機能的誘導体をコードするベクターを含む製薬組成物（単数または複数）は、点眼液、鼻腔内スプレー、吸入および／またはその他のエアロゾル伝達ビヒクルによって伝達されてもよい。鼻腔エアロゾルスプレーを通じて組成物を肺に直接伝達する方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および第５，８０４，２１２号（それぞれ全文が参照として本明細書に含まれる）に記載されている。類似に、鼻腔内微細粒子樹脂（例えば、Ｔａｋｅｎａｇａの他、１９９８を参照）およびリソホスファチジル－グリセロール化合物（例えば、米国特許第５，７２５，８７１号を参照、全文が本願に参考として含まれる）を用いる薬物の伝達が薬学分野においてもよく知られている。類似に、ポリテトラフルオロエチレン支持体マトリックス形態の経粘膜薬物伝達は、例えば、米国特許第５，７８０，０４５号（全文が本明細書に具体的に参照として含まれる）に記載されている。

【0253】

エアロゾルという用語は、液化または加圧ガス推進剤に分散された液体粒子の微細に分割された固体のコロイドシステムを意味する。吸入のための本開示内容の典型的なエアロゾルは、液体推進剤または液体推進剤と適合した溶媒の混合物のうち活性成分の懸濁液で構成されるだろう。適合した推進剤は、炭化水素および炭化水素エーテルを含む。適切な容器は推進剤の圧力要件によって変わる。エアロゾルの投与は、対象の年齢、体重および症状の重症度および反応によって変わる。

【0254】

Ｃ．投薬
対象体に投与される本開示内容の組成物（単数または複数）の適切な投与量は、体重、重症度および状態経過、治療される疾患の類型、個体の臨床的状態、以前または同時治療介入、個体の臨床病歴および治療に対する反応、対象の特発性、投与経路および主治医の裁量のような物理的および生理学的要因によって決定され得る。投与量および投与経路によって、好ましい投与量および／または有効量の投与回数は、対象体の反応に応じて変ってもよい。投与を担当する専門医はどのような場合にも組成物内の活性成分（単数または複数）の濃度および個別対象体に対する適切な用量（単数または複数）を決定するだろう。

【0255】

特定の実施様態において、薬学組成物は、例えば、最大または少なくとも約０．０００００１乃至最大または少なくとも約１０％（重量）の活性化合物を含んでもよい。他の実施様態において、活性化合物は単位重量の約０．００１％乃至約１％、または、例えば、約０．０１％乃至約０．１％、およびこれらの範囲内の誘導可能な任意の範囲を含んでもよい。当然、それぞれの治療的に有用な組成物における活性化合物（単数または複数）の量は適切な投与量が化合物の任意の与えられた単位用量で得られる方式で製造されてもよい。溶解度、生体利用率、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間のような因子だけでなく、その他の薬理学的考慮事項は、このような薬剤学的製剤を製造する技術分野の熟練家によって考慮されるはずであり、従って、多様な投与量および治療療法が好ましい場合がある。

【0256】

治療には多様な「単位用量」が含まれてもよい。単位用量は所定量の治療用組成物を含むものと定義される。投与する量、特定経路および剤形は臨床分野の技術従事者の決定技術内にある。単位用量は単一注入で投与する必要はないが、一定期間にわたる連続投入を含んでもよい。一部の実施様態において、単位用量は単一投与可能な用量を含む。

【0257】

治療回数と単位用量に応じて投与する量は目的とする治療効果に左右される。有効用量は特定効果を達成するのに必要な量を意味するものと理解される。また、このような用量は一日中および／または数日、数週または数ケ月の間多回投与されてもよい。

【0258】

一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体の単一用量が投与される。一部の実施様態において、Ａβペプチド変異体の多重用量が投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体の単一用量が投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体は、少なくても、最大、または約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、および２００、３００、４００、５００、１０００μｇ／ｋｇ、ｍｇ／ｋｇ、μｇ／日、またはｍｇ／日またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の範囲または値の用量で投与される。特定の実施様態において、Ａβペプチド変異体の有効用量は、約、少なくとも約または最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００μＭまたはこれらの範囲内の誘導可能な任意の範囲の血液レべルを提供することができる用量である。特定の実施様態において、対象体に投与される野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体は代謝治療剤として体内で代謝され、この場合、血液レベルは、その製剤の量を示すことができる。代案的に、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体が対象体によって代謝されない限り、本願において議論された血液レベルは、代謝されない野生型または変異体Ａβペプチドを指称することができる。

【0259】

一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドの単一用量が投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドの多重用量が投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドの有効用量が投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドは、対象体の体重（ｋｇ）当たり、少なくても、最大、または約１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７または１×１０^１８ポリヌクレオチドのコピー数、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値または範囲の用量で投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドは対象体の体重（ｋｇ）当たり１×１０^８乃至１×１０^１８ポリヌクレオチドのコピー数の用量で投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドは対象体の体重（ｋｇ）当たり１×１０^１１乃至１×１０^１４ポリヌクレオチドのコピー数の用量で投与される。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドは、対象体の体重（ｋｇ）当たり１×１０^１２乃至１×１０^１５ポリヌクレオチドのコピー数の用量で投与される。

【0260】

一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドはベクターに含まれる。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドは変異体Ａβペプチドのタンパク質の発現を可能にするミニ遺伝子をコードするベクターに含まれる。一部の実施様態において、野生型ＡβペプチドまたはＡβペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターの有効用量が投与される。一部の実施様態において、ベクターは、対象体の体重（ｋｇ）当たり、少なくても、最大、または約１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７または１×１０^１８ベクターゲノム、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の範囲または値の用量で投与される。一部の実施様態において、ベクターは、対象体の体重（ｋｇ）当たり１×１０^８乃至１×１０^１８のベクターゲノムの用量で投与される。一部の実施様態において、ベクターは、対象体の体重（ｋｇ）当たり１×１０^１１乃至１×１０^１４のベクターゲノムの用量で投与される。一部の実施様態において、ベクターは、対象体の体重（ｋｇ）当たり１×１０^１２乃至１×１０^１５のベクターゲノムの用量で投与される。

【0261】

一部の実施様態において、一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物の単一用量が投与される。一部の実施様態において、一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物の多重用量が投与される。一部の実施様態において、一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物の有効用量が投与される。一部の実施様態において、一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物は、少なくても、最大、または約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５および２００、３００、４００、５００、１０００μｇ／ｋｇ、ｍｇ／ｋｇ、μｇ／日、またはｍｇ／日またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の範囲または値の用量で投与される。特定の実施様態において、一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物の有効用量は、約、少なくとも約または最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００μＭまたはこれらの範囲内の誘導可能な任意の範囲の血液レベルを提供できる用量である。特定の実施様態において、対象体に投与される一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物は、体内で代謝される代謝治療剤として提供され、この場合、血液レベルは該当製剤の量を示すことができる。代案的に、一つ以上の追加の神経退行性疾患薬物が対象体によって代謝されない限り、本願において議論された血液レベルは、代謝されない野生型または変異体Ａβペプチドを示すことができる。

【0262】

治療学的組成物の正確な量は専門医の判断に左右され、各個体ごとに異なる。投与量に影響を及ぼす要因には患者の身体的および臨床的状態、投与経路、意図された治療目標（症状緩和対比治療）、特定治療物質または対象体が受けることができる他の療法の効能、安定性および毒性が含まれる。

【0263】

当業者は体重のμｇ／ｋｇまたはｍｇ／ｋｇの投与単位がμｇ／ｍｌまたはｍＭ（血中濃度）の類似した濃度単位に転換されて表現され得ることを理解し、認知するだろう。摂取は種および器官／組織依存的であるということも理解される。吸収および濃度測定と関連して適用可能な換算係数および生理学的仮定はよく知られており、当業者が一つの濃度測定を他の濃度測定に変換し、本願に記載されている用量、効能および結果に関する合理的な比較および結論を下すことができるようにする。

【0264】

Ｖ．キット
本開示内容の特定の局面はまた、開示内容の組成物または開示内容の方法を具現するための組成物を含むキットに関するものである。一部の実施様態において、キットは、一つ以上のバイオマーカー（例えば、Ａβペプチドオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリル、プラーク、ミスフォールディングタンパク質、タウタンパク質、リン酸化されたタウタンパク質）、シーディングされたタウタンパク質および／またはシーディングされたＡβペプチド、神経炎症マーカー、認知減退のマーカー、神経退行性マーカー、ニューロン損失のマーカー、および／またはシナプス損失のマーカー）を評価するのに用いてもよい。特定の実施様態において、キットを用いて試験管内または生体内でＡβペプチドまたは他のタンパク質の発現を測定してもよい。特定の実施様態において、キットは、少なくともまたは最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、５００、１，０００個以上のプローブ、プライマーまたはプライマーセット、合成分子または抑制剤、またはこれらの範囲内の誘導可能な任意の値または範囲および組み合わせを含む。一部の実施様態において、細胞でバイオマーカーの活性を評価するためのキットがある。

【0265】

キットは、チューブ、瓶、バイアル、シリンジまたはその他の適合した容器手段のような容器に個別的に包装されるか、または配置され得る構成要素を含んでもよい。

【0266】

個別構成要素は濃縮された量でキットに提供されてもよく；一部の実施様態において、構成要素は他の構成要素とともに溶液にあるときと同一の濃度で個別的に提供される。成分の濃度は、１×、２×、５×、１０×または２０×以上に提供されてもよい。

【0267】

予後または診断適用のための本開示内容のプローブ、合成核酸、非合成核酸、合成ペプチド、非合成ペプチドおよび／または抑制剤を用いるためのキットが本開示内容の一部として含まれる。バイオマーカーの非コーディング配列だけでなく、バイオマーカーのコーディング配列を含んでもよいバイオマーカーの全部または一部と同一であるか、または相補的な核酸プライマー／プライマーセットおよびプローブを含む、本願で確認された任意のバイオマーカーに該当する任意のこのような分子が具体的に考慮される。

【0268】

特定の局面において、陰性および／または陽性対照群核酸、プローブおよび抑制剤が一部キットの実施様態に含まれる。また、キットは一つ以上のバイオマーカーのメチル化に対する陰性または陽性対照群である試料を含んでもよい。

【0269】

命じて特定バイオマーカーを含む開示内容の任意の実施形態は、特定核酸の成熟した配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の同一の配列であるバイオマーカーを含む実施様態を含むものとまた考慮される。

【0270】

本明細書に記載されている任意の方法または組成物が本明細書に記載されている任意の他の方法または組成物に対して具現でき、異なる実施様態を組み合わせてもよいことと見なされる。本来提出された請求項は、任意の提出された請求項または提出された請求項の組み合わせに多重従属された請求項を含むものと考慮される。

【実施例】

【0271】

下記の実施例は、本発明の実施形態を説明するために含まれる。当業者は下記の実施例に開示されている技術が本発明の実施でよく機能するものであって、発明者によって発見された技術を示すということを理解しなければならない。しかし、当業者は、本開示内容に照らして開示されている特定実施例において多くの変更が行われてもよく、依然として本発明の思想および範囲から外れることなく類似（ｌｉｋｅ）または類似した（ｓｉｍｉｌａｒ）結果が得られることを認識しなければならない。

【0272】

実施例１－アミロイド減少のためのＡβ変異体を利用した遺伝子治療
４つの治療基準を満たすペプチド抑制剤が試験管内で確認されており、上位２つのペプチド候補がＡβアミロイド症の動物モデルで生体内で調べられた。ミニ遺伝子ベクターは、細胞外空間への放出が内因性プロテアーゼによって調節される細胞膜で変異体Ａβペプチドを発現するために生成された。この後、ＡＡＶを用いてアルツハイマー病（ＡＤ）のＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルでＡβ減少に対する効能を試験する広範囲な生涯神経発現のために新生児マウス脳へベクターを伝達した。本研究は、病原性Ａβと単に１個または２つのアミノ酸が異なるペプチドがＡβフィブリル化を効果的に減少させ、既存のフィブリルを不安定にし、試験管内の短い期間の間、オリゴマーの毒性を下げる一方、生体内で慢性的に用いられるとき、アミロイドの凝集および神経炎症を減少させるという直観に反する結果をもたらした。

【0273】

また、本研究は、ベンチから脳へペプチドＡβ抑制剤を発展させるのに当たり過去の限界を克服するために、ウイルス－媒介遺伝子療法を適用する最初の段階を行う。本研究のより大きい影響は、ペプチド治療が現在の発現工学およびウイルスを通じて克服できる技術的な理由により忌避された神経退行性を誘発する毒性種でミスフォールディングタンパク質の凝集を含む他のタンパク質ミスフォールディング疾患にこのストラテジーを適用できる可能性にある。

【0274】

Ａ．Ｆ２０ＰおよびＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ変異体は野生型Ａβ４２の凝集を抑制する。
Ａβの中央疎水性領域（１７Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ａｌａ２１）は単量体の組み立て速度を制御し、成熟したフィブリルでβ－シートヘアピンを形成する。フィブリルの形成における重要性を考慮するとき、一部の実施様態において、この領域で標的化されたアミノ酸置換は、野生型Ａβ４２ペプチドの凝集を防止することができるペプチドを生成する。このドメインに関する過去の研究に基づいてＶ１８Ｐ、Ｆ１９Ｄ、Ｆ１９Ｐ、Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４ＰおよびＦ２０Ｐの５種類の他のＡβ４２変異体ペプチドを検査した。５つの変異体のうちいずれもフィブリルで自体凝集されないということがチオフラビン（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ）－Ｔ分析を用いて初めて確認された（図１Ａ）。次に、二つのペプチドがフィブリル化反応を始める前に等モル比で混合されたとき、５つのペプチドのうち任意のものが野生型Ａβ４２のフィブリル化を競争的に抑制することができるか否かを試験した（図１Ｂ）。５種類の変異体ペプチドのうち４種類が野生型Ａβのフィブリル化を減少させたのに対し、１種類（Ｖ１８Ｐ）は凝集を悪化させた。追加の研究のために選ばれた２つのペプチド変異体、Ｆ２０ＰおよびＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐは凝集を完全に防止するものと示された。これらの２つのペプチドをフィブリルの形成後に添加するとき、野生型Ａ４２を分解する可能性について試験した。二つの変異体はいずれも濃度－依存方式で野生型フィブリルを分解したが、Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４ＰはＦ２０Ｐよりフィブリルの分解でよりさらに効果的であって、試験された最高濃度で＞８０％のＴｈＴ信号損失を達成した（図１Ｃ、１Ｄ）。

【0275】

最後に、変異体Ａβペプチドが野生型Ａβオリゴマーによって誘発される細胞毒性を弱化させる可能性を調査した。この実験のために、野生型Ａβ４２を単独で用いるか、またはオリゴマーの組み立て前に変異体ペプチドと等モル比で混合した。２４時間後、ネズミ科の神経芽細胞腫２ａ細胞株（Ｎ２ａ）の細胞培養培地にペプチド溶液を添加した。野生型Ａβ４２から組み立てられたオリゴマーは、オリゴマー化緩衝液単独で処理された培養物と比べてほぼ５０％の細胞損失を引き起こした（図１Ｅ）。対照的に、Ｆ２０ＰやＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐはそれ自体で細胞生存力を大して変化させなかった。特に、細胞生存率は、野生型Ａβ４２単独で対照群の５０％からオリゴマー組み立ての間、野生型ペプチドが変異体と共培養されたとき、約７０％に増加した。従って、一部の実施様態において、Ｆ２０ＰおよびＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ変異体は、候補凝集抑制剤に対する最小の試験管内の基準を満たす。

【0276】

Ｂ．哺乳類細胞でＡβ変異体を分泌するベクターの設計
次に、Ａβペプチド変異体は治療学的に有効であるだけ十分に高いレベルで脳で試験された。細胞外空間への放出が内因性γ－セクレターゼによって調節される細胞膜で変異体Ａβを安定的に発現するように発現ストラテジーを設計した。以前の研究は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の信号ペプチドをＡＰＰ Ｃ－末端断片（β－ＣＴＦ）に融合してこの目標を達成したが、この構築物は、細胞外Ａβを生成するのに対し、β－ＣＴＦの過発現によりＡβ－独立的リソソーム－自己貪食病理を期せずして引き起こした。従って、本発明者は、γ－セクレターゼ切断に必要な最も小さいβ－ＣＴＦ断片を用いることで潜在的なリソソーム合併症を避けようとした。ガウシアルシフェラーゼ信号ペプチド（Ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ信号ペプチド）を用いて細胞膜を標的にし、この信号ペプチドを一連のβ－ＣＴＦ断片に融合した。最も長い断片は、長さが５４個のアミノ酸であって、Ａβ４２および全体ＡＰＰ膜貫通ドメインと２つの細胞内リジン残基を含有した（図２Ａ）。４つの追加構築物は、それぞれ２つのアミノ酸によって膜貫通ドメインにより切断され；最も短い構築物は、単に４５個の残基を含有した（Ａβ４２＋３追加）。

【0277】

異なる構築物をＮ２ａ細胞でトランスフェクトさせ、免疫沈澱法に引き続き免疫ブロットを用いて調整された細胞培養培地で測定され、分泌されたＡβを測定した。完全なＡＰＰ膜貫通ドメイン＋２つの細胞内リジンは、全長ＣＴＦをコードする構築物を用いて観察されたものと同等なレベルでＡβ分泌を達成するのに必要であり、十分であると明かにされた（図２Ａ）。γ－セクレターゼ抑制剤ＬＹ４１１５７５の添加は、濃度－依存的方式でＡβ変異体の培地への放出を遮断してＡβ分泌がγ－セクレターゼの活性に依存するということを確認した（図２Ａ）。

【0278】

この最小発現構築物は、ユビキタスＣＡＧプロモーターの制御下に以降の生体内の発現のためにＡＡＶ伝達ベクターでクローニングした（図２Ｂ）。ウッドチャックポリオウイルスの反応要素は、ｍＲＮＡを安定化するために３’末端に含まれ、ウシの成長ホルモンポリＡ配列が続いた。最後に、質量分光分析法を用いてこのベクターが細胞で発現されるとき、真にＡβ４０／４２を生産するかを確認した。Ｎ２ａ細胞をウイルスＡβ Ｆ２０Ｐベクターでトランスフェクトさせた後、ヒトＡβをＷＴペプチドに対して培地から免疫沈殿させた。液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を酵素消化なく行い、全長ペプチドが作られたか否かを確認した。この分析を通じてＡβ４０ Ｆ２０Ｐ（図２Ｃ）およびＡβ４２ Ｆ２０Ｐ（データは提示されていない）に対して適切な質量を有するペプチドの存在をそれぞれのペプチドに対する正確な配列とともに（図２Ｄ）確認した。

【0279】

Ｃ．ＡＡＶを用いて生体内Ａβ変異体の発現
野生型マウスに注入してペプチドが生体内で発現および分泌されるかを確認した。Ａβ Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４ＰおよびＦ２０Ｐ発現構築物すべてをＡＡＶ８にパッケージングし、新生児（Ｐ０）マウスの側脳室に注入した。発現レベルおよびウイルスの分布を調査するために、注入してから３週間乃至４週間後にマウスを安楽死させた。変異体Ａβを検出するために、ヒト－特異的ＡＰＰ抗体（６Ｅ１０）を用いた免疫染色によってウイルスの拡散を評価した。ウイルスの発現は前頭葉皮質に偏向されており、後続分析は、この領域に焦点を合わせた（図３Ａ）。変異体Ａβ検出のための６Ｅ１０と内因性マウスＡＰＰの検出のためのＹ１８８の共免疫染色でウイルス－伝達された前駆体ペプチドが内因性ＡＰＰのとなりにある細胞膜に位置することを確認した（図３Ｂ）。

【0280】

全長ペプチドの生体内の発現を試験するために、Ａβ Ｆ２０Ｐで形質導入されたＷＴマウスからのホモジネートに対してＩＰに引き続きＭＳを用いた。脳ホモジネートのＡβ４０およびＡβ－４２ Ｆ２０Ｐはいずれも細胞培地から分離されたＡβと同一の溶出時間を示しており；二つのペプチドはいずれも予想質量で再度確認され、配列が確認された（図３Ｃ、３Ｄ；Ａβ４２ Ｆ２０Ｐに関するデータが提示される）。特に、６Ｅ１０で免疫沈殿されてもよい部分的な切断生成物（例えば、信号ペプチドがない完全なＴＭドメインまたは信号ペプチドに依然として付着されているγ－セクレターゼ－切断されたＡβ）はスペクトルに示されていない。

【0281】

また、各変異体Ａβペプチドの生体内の生産をＥＬＩＳＡにより測定した。本検定のヒト－特異的な捕獲抗体および末端－特異的な検出抗体は、測定されたペプチドが１）ヒト、従って、ウイルス－伝達された変異体Ａβおよび２）γ－セクレターゼ切断が行われた成熟したＡβであることを保障した。Ｆ２０Ｐは生体内でよく発現された。天然ＡＰＰと類似に、この構築物は、Ａβｘ－４２よりさらに何倍は大きいレベルでＡβｘ－４０ペプチドを生産した（図３Ｅ）。対照的に、Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐは高いレベルのＡβｘ－４２を生成したが、検出可能なＡβｘ－４０は生成しておらず、これは、一部の実施様態において、Ｌ３４Ｐ置換が末端－特異的なＡβ４０抗体結合を破壊することを示す。これらの結果は、一部の実施様態において、最小発現ベクターを用いたウイルス形質導入が細胞膜の局所化およびγ－セクレターゼ切断を達成して変異体Ａβペプチドを脳へ放出することを示唆する。

【0282】

Ｄ．ウイルス－伝達された変異体ペプチドがＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスでＡβ負荷を減少させてもよい
Ａβ Ｆ２０ＰまたはＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐをコードするウイルスを新生児（Ｐ０）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよび非－トランスジェニック（形質転換されていない）同腹仔（ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）に注入した。このモデルからアミロイド沈着が始まった直後である生後７．５ヶ月に動物を回収した。非－トランスジェニックシブリング（ｓｉｂｌｉｎｇ）の皮質組織を用いてウイルスで発現されたＡβがこの年齢にも依然として生産されるということを確認した（図３Ｆ）。ＡＡＶ－注入された非－トランスジェニックマウスは、３週目と同一の相対レベルのＡβ４０：４２を示しており、二つの変異体の両方でｘ－４２は増加し、増加されたｘ－４０はＦ２０Ｐでのみ検出された（図３Ｇ）。

【0283】

ＡＰＰ／ＰＳ１動物において、一方の半球の前頭葉皮質でＡβ免疫染色によって、そして他の半球でＡβ ＥＬＩＳＡによってプラーク負荷を評価した。注入されていないＡＰＰ／ＰＳ１対照群マウスと比較して、Ｆ２０Ｐで処理されたマウスは、Ａβ沈着がほぼ７５％減少したと示された（図４Ａ、４Ｂ）。免疫染色と一致するように、Ｆ２０Ｐで処理されたマウスで不溶性Ａβｘ－４０およびＡβｘ－４２のレベルも顕著に減少した（図４Ｃ）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスでＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ発現の効果は、Ｆ２０Ｐよりもさらに可変的であった。不溶性Ａβｘ－４０レベルは、Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐを発現するＡＰＰ／ＰＳ１マウスで有意に減少されたが、Ａβｘ－４２もプラーク負荷も有意に減少することはなかった（図４Ｂ、４Ｃ）。従って、Ｆ２０ＰおよびＦ１９Ｄ／Ｌ３４ＰはいずれもＡβの総蓄積をかなり減少させたが、Ｆ２０ＰはＡＰＰ／ＰＳ１マウスで凝集を抑制するのにさらに効果的であった。Ｆ２０Ｐ－またはＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ－処理された非－トランスジェニック動物は、発現７．５ヶ月の間ヒトＡβの検出可能なレベルを蓄積していない（データは提示されていない；総Ａβ４０＋４２、可溶性＋不溶性、非注入１００．７±４５．５（ｎ＝６）；Ｆ１９Ｄ／３４Ｐ ７２．３±２３．６（ｎ＝１１）；Ｆ２０Ｐ １５８．２±３５．２ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝１０）；ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、２４）＝２．０２、ｐ＝０．１５）。

【0284】

生物理学的分析において、変異体のうちの少なくともひとつであるＦ１９Ｄ／Ｌ３４ＰがＡβの組み立てを防止できるだけでなく、試験管内で既存のＡβフィブリルの分解を促進できることを示唆したため（図１Ｃ）、変異体がアミロイドの開始後に投与される場合、プラーク除去を支援できるか否かを試験した。ＰＨＰ．ｅＢのような新たに進化されたＡＡＶ血清型を用いて大人の脳でウイルスの伝達および発現を達成し、末梢注入を通じたＣＮＳの伝達を可能にした。ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢの注入は形質導入効率および脳全体の空間分布に対する読み取り値として蛍光タンパク質を用いて最適化された（図５Ａ）。ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ血清型は拡散と一致し、新生児ＡＡＶ８注入によって達成された密度に近づくことが明らかにされ、これは、生体内で用いるのに十分なレベルで変異体Ａβを伝達することを示唆する。ウイルス性形質導入はまた臨床的に用いられてもよい代替投与経路がニューロン形質導入の効能と一致するか否かを試験することができるようにした。脈絡叢のウイルス性形質導入は、リソソーム蓄積病、ＡＤおよびＡＬＳのマウスモデルにおける遺伝子治療に用いられた。本発明者は、脈絡膜神経叢の上衣細胞がＡＡＶ１によって容易に形質導入され得ることを見出し、これは、本願において変異体ＡβのＣＳＦの伝達可能性を試験するために用いられる（図５Ｂ）。

【0285】

Ｅ．変異体Ａβの発現は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスから全般的な神経炎症を減少させるが、軽微な星状細胞症を誘発する可能性がある
アミロイドプラークは肥大性星状細胞とミクログリア細胞がコア沈着物を取り囲むように移動するか、または分裂する明白な神経免疫反応を誘導する。大部分の条件で神経膠誘導の程度はアミロイド負荷の程度と類似している。一般的に言えば、プラーク蓄積を遅らせる治療は、神経膠の形態および局所化におけるこれらの変化も緩和させる。従って、変異体Ａβで処理されたマウスにおいて、一般的にコアＡβ沈着物の範囲を決める肥大性星状細胞およびミクログリア細胞のクラスタリングがプラーク負荷とともに減少するか否かを調査した。Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐよりプラーク負荷にさらに顕著な影響を及ぼすため、Ｆ２０Ｐ変異体に焦点を合わせて分析した。神経膠原線維タンパク質（ＧＦＡＰ）－陽性星状細胞およびＩｂａ１－陽性ミクログリア細胞は両方とも未処理のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの皮質におけるアミロイドプラークの輪郭を顕著に示す（図５Ａ、５Ｂ）。実際に、ＧＦＡＰおよびＩｂａ１の両方の表面積は未処理のトランスジェニックマウスにおけるＡβ免疫染色の表面積を超えている（図５Ｃ）。ウイルス－伝達されたＡβＦ２０Ｐを用いた生涯治療は、これらのマーカーのすべてに対する染色を有意に減少させ、これは、一部の実施様態において、神経炎症がアミロイド負荷とともに減少することを示唆する。

【0286】

皮質ＧＦＡＰ染色の増加は、未注入の対照群と比較してウイルス－注入された非－トランスジェニックマウスにおいても観察された（図５Ａ、５Ｃ）。ＧＦＡＰ－陽性星状細胞は主に脳梁に隣接したバンドに制限されており、その効果は、星状細胞に対して特異的であった：非－トランスジェニックマウスにおけるＩｂａ１のレベルはウイルス露出によって変わらなかった（図５Ｂ、５Ｃ）。同一のパターンの脳梁周囲ＧＦＡＰ染色がＦ２０Ｐ－処理されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスで識別され得るが、この領域はまた定量化を混同させるプラーク－関連星状細胞症を含有した（図５Ａ）。

【0287】

ヒトＡβ（６Ｅ１０）およびＧＦＡＰに対する共免疫染色を７．５ヶ月のＮＴＧマウスで行った。ヒトＡβを発現するいくつかの星状細胞が検出されたが、これらの共標識された細胞は、ＧＦＡＰ＋集団の小さな断片のみを含んだ。これらのデータは、一部の実施様態において、変異体Ａβペプチドのウイルスの発現がそれ自体で軽微な星状グリア細胞症を誘発することがあるが、アミロイド症モデルの純効果はプラーク負荷の減少に相応する慢性神経炎症の重症度を減少させることを示唆する。

【0288】

実施例２－変異体と野生型Ａβペプチドとの間の相互作用に対する生物理学的メカニズムの解読
分離および野生型Ａβの存在のいずれもにおいて溶液内の変異体ペプチドによって採択された形態は、これらの特性が生体内の使用に適合であることを保障するために決定される。

【0289】

Ａ．長期間の試験管内のインキュベーション時にＡβペプチドによって採択された構造の分析
各変異体ペプチドによって形成された構造は、円型二色性（ＣＤ）分光法、大きさ－排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、Ａ１１／ＯＣドットブロット分析、および透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）の４種類の主な分析を用いて評価される。初期実験は、分離されたＦ２０ＰおよびＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐペプチドによって形成された２次および３次構造が、多様なインキュベーション条件下で経時的にどのように変化するか、そして二つのうち一つが凝集を示す４次構造で組み立てられるか否かを決定する。各ペプチドの２次構造は遠赤外線ＣＤ分光法で、３次／４次構造は近紫外線分光法でモニタリングし、多様なタンパク質濃度と溶媒条件でスペクトルおよび熱スキャンを用いる。動力学ＣＤ分光法の測定は、ペプチドフォールディングおよびアンフォールディングの時間的進化を評価するために平衡分析を補完することになる。ＣＤ分光法で収集したデータを用いて各ペプチドに対する誘導期、代数増殖期および安定期のタイミングを案内し、ＳＥＣのために試料を除去して単量体ペプチドが小さなオリゴマーおよびさらに大きい構造に転換されるか否かを確認する。Ａ１１／ＯＣドットブロットのために別途の時間超過試料を除去して、非－原線維型および前－原線維型オリゴマー状態の形成を試験する。試料の最終セットは、１）構造化フィブリルの存在または不在および適切な場合、周期性および幅、２）オリゴマーまたはプロトフィブリルを暗示するさらに小さな規則的な構造の外見、または３）以前にアミロイド生成ペプチドのプロリン置換変異体において観察された無定形の凝集を暗示する不規則な構造を確認するために陰性染色ＴＥＭイメージングのための安定期反応（＞２４時間）で収集される。

【0290】

Ｂ．野生型Ａβ単量体とＡβ変異体の共インキュベーション時に生成された構造の分析
ＣＤ分光法、ＳＥＣ、Ａ１１／ＯＣドットブロットおよびＴＥＭを用いて、Ｆ２０ＰまたはＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐと野生型Ａβの共インキュベーションによって形成された構造を評価する。

【0291】

Ｃ．野生型Ａβ４２の凝集を防止するのに必要な変異体ペプチドの割合および事前－形成されたフィブリルを分解するのに必要な最小濃度
一部の実施様態において、変異体Ａβペプチドの等モル混合物は、野生型Ａβ４２の凝集を防止するが、変異体：野生型の割合がさらに低いと十分である。大部分のペプチド抑制剤は、野生型Ａβの凝集を防止するために化学量論以上の濃度を要求するが、いくつかの候補は、抑制剤：野生型の割合が１：５０の程度と低い効能をみせる。ＴｈＴ検定は、Ｆ２０ＰまたはＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐが１：５０の変異体：野生型まで亜化学量論的濃度で野生型Ａβ４２のフィブリル化を減少させるか、または防止できるか否かを決定するのに用いられる。並列実験を通じて事前－形成されたＡβ４２フィブリルの分解に必要な変異体ペプチドの最小濃度を確認することができる。一部の実施様態において、５μＭのＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ程度の少ない量でも１０μＭ ＷＴ Ａβ出発物質から作られたフィブリルのＴｈＴ蛍光を下げるのに相当十分であり；一部の実施様態において、さらに低い濃度のＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐは同一の効果を達成し、Ｆ２０Ｐはフィブリルの分解に同等に効率的である可能性がある。

【0292】

Ｄ．変異体Ａβペプチドによる野生型Ａβフィブリルの分解で現れる構造の分析
一部の実施様態において、野生型ＡβフィブリルはＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐペプチドの添加時、時間の経過に応じてＴｈＴ蛍光を喪失し、これは、一部の実施様態において、この変異体がフィブリルの分解を促進することを示唆する。野生型Ａβフィブリルの分解により発生する構造は、変異体ペプチドの存在下に決定される。野生型Ａβ４２フィブリルが生成され、本願に記述されているように、ＣＤ分光法、ＳＥＣ、ドットブロットおよびＴＥＭによる分析のために１０μＭ Ｆ２０ＰまたはＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐに露出される。上記の分解検定においてＴｈＴ蛍光をかなり下げることができるＦ２０ＰまたはＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐの最も低い濃度を用いて並列実験を行う。

【0293】

Ｅ．変異体ペプチドと野生型Ａβの共インキュベーションが細胞毒性に及ぼす影響
Ｆ２０ＰおよびＦ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ変異体によって形成された構造は、野生型Ａβ４２凝集体の細胞毒性を減少させることができる。一部の実施様態において、オリゴマー形成の間、野生型Ａβ４２と一つの変異体の共インキュベーションはＮ２ａ培養における後続細胞の死滅を減少させる。細胞株および１次ニューロン培養で研究が行われ、Ａβ変異体ペプチドによるＡβフィブリルの分解生成物が二つの細胞システムの両方で試験される。Ａβ４２の組み立ておよび分解のための反応生成物は、各変異体に対して０．１乃至１０μＭの等モルおよび最小有効ペプチドの割合で試験され、細胞生存力はＭＴＴ検定により測定される。

【0294】

議論
これらの実験は、変異体ペプチドが野生型Ａβの凝集を防止する方法と、事前－形成されたフィブリルの分解を促進する方法に関する生物理学的理解を提供する。互いに異なる温度、濃度および溶媒条件で平衡および動力学反応のすべてについてＣＤスペクトルを評価することで、野生型および変異体ペプチドの相互作用で現れる物理的構造を識別することができる。一部の実施様態において、野生型Ａβと比較して、単離された変異体は優勢な無作為コイル状態で残っており、野生型との共インキュベーションは、構造化されたオリゴマーおよびフィブリル形態の出現を減少させる。一部の実施様態において、ＳＥＣ分析は、単離されたＡβ変異体に対して、および野生型Ａβとの共インキュベーションの両方に対してオリゴマーまたはフィブリル状態対比単量体ペプチドの優勢を確認する。一部の実施様態において、末期インキュベーションのＴＥＭ分析により野生型Ａβ４２からのみフィブリルが検出され、変異体単独または野生型Ａβ４２との共インキュベーションにおいてはフィブリルが検出されない。

【0295】

代案的に、一部の実施様態において、ＳＥＣの分析は、単量体の減少とともにオリゴマー種の出現を示すが、さらに大きな種の実質的な増加はなく、ＣＤスペクトルの移動を伴って時間の経過によってさらに大きい割合のβ－シート構造を示し、フィブリルの形成時観察された程度まではない。一部の実施様態において、Ａ１１／ＯＣとも反応し得る環状または小さな原線維構造がＴＥＭで観察される。一部の実施様態において、このような中間体はまたあらかじめ形成されたフィブリルの分解後に発生する。一部の実施様態において、これらの中間体は、野生型Ａβによって形成されたものよりも毒性が低い。

【0296】

実施例３－変異体Ａβ投与の投与量、時期および経路が生体内の効能に及ぼす影響の決定

【0297】

Ａ．ＡＰＰマウスにおける生涯変異体Ａβ発現の分析
一部の実施様態において、変異体Ａβペプチドの生涯にわたる発現は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるプラークの発達に相当な影響を及ぼす。ＡＡＶコード化スクランブルＡβペプチドで処理されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスグループが追加される。この追加制御は、変異体Ａβを用いた治療で見られる効果がウイルス形質導入の副作用ではないペプチドによるものであることを保障する。変異体Ａβの発現がＡＰＰの発現に影響を及ぼすか、または生体内のプロセッシングに影響を及ぼすか否かもまた決定される。一部の実施様態において、変異体Ａβのアミロイド－低下メカニズムは、細胞から放出された後、野生型Ａβの結合により発生し、ウエスタンブロットによる全長ＡＰＰ、ｓＡＰＰおよびＣＴＦを測定し、これが事実であるかを保障する。最後に、一部の実施様態において、第２のＡＰＰモデルであるＡＰＰ^ＮＬ－Ｆノック－イン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）マウスラインは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスからの発見を確認する。ＫＩマウスはＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりも後にプラークを発生させるため、ＫＩ動物は、内因性ペプチドよりも高いレベルで変異体Ａβの長期間発現が病理学または神経生存に予想せぬ影響を及ぼすか否かを試験できる機会を提供する。ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ^ＮＬ－Ｆ ＫＩマウスの両方、Ｐ０で変異体またはスクランブルＡＡＶを脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ：ＩＣＶ）注入し、分析のために、それぞれ７．５ヶ月または１５ヶ月に回収する。本実験および後続実験に対する結果の測定は、組織学的プラーク負荷（Ａβおよびチオフラビン－Ｓ）、ヒトＡβ ＥＬＩＳＡおよびヒトオリゴマーＡβ ＥＬＩＳＡ（ＩＢＬ、８２Ｅ１１）である。

【0298】

Ｂ．効果に必要な野生型Ａβに対する変異体Ａβの割合（投与量）
一部の実施様態において、変異体と野生型Ａβの等モル混合物は、野生型ペプチドの凝集を阻止するのに十分である（図１Ｂ）。従って、一部の実施様態において、変異体Ａβに対する生体内の有効用量はかなり低い。変異体Ａβの生産と総Ａβの蓄積との間の生体内の用量－反応関係を試験した。生体内のウイルスの発現は、事実上、すべての細胞が形質導入されていないモザイクであるが、ペプチドが分泌されるため、広い領域に変異体ペプチドを露出させるためには細胞の一部のみを形質導入すればよい。一部の実施様態において、マウス脳におけるウイルスの発現密度は、注入されたウイルスの力価を制御することで容易に調整される。ここで、生体内でプラークの形成を遅らせるのに必要な変異体Ａβの閾値レベルがあるか否かを決定する。ＥＬＩＳＡは処理されていない幼いＡＰＰ／ＰＳ１マウスで測定された野生型ヒトＡβのレベルと比較するために、非－トランスジェニックマウスの各力価で変異体Ａβのレベルを用いてＦ２０Ｐ変異体：野生型Ａβの割合を経験的に測定するのに用いられる。本実験から決定された用量－反応関係はＡＰＰ／ＰＳ１モデルに適用されるが、一部の実施様態において、効果のために必要な変異体Ａβの相対的な露出に関する貴重な情報を提供したりもする。ＡＰＰ／ＰＳ１および非－トランスジェニックマウスは、Ｐ０でＦ２０Ｐ ＡＡＶを脳室内に注入し、７．５ヶ月後に分析のために回収する。ウイルスの希釈は以前の試験管研究によって知られ、以前に用いられた力価の約０．０５から１×の範囲である。

【0299】

Ｃ．心室投与は実質伝達（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）効果を表現する
一部の実施様態において、変異体Ａβは細胞外空間で野生型Ａβの凝集を抑制するためにニューロンによって発現される必要がない。一部の実施様態において、間質液に接近することができる任意の細胞類型における発現は、変異体Ａβを脳全体に広範囲に伝達するのに十分である。一部の実施様態において、側脳室の脳室膜ライニングは分泌タンパク質をＣＳＦを通じて脳に伝達するのに理想的である。ニューロン分泌で観察されるように、皮質を通じたＡβの凝集を減少させるための変異体ＡβのＣＳＦへの伝達の十分性を試験する。ＡＰＰ／ＰＳ１および非－トランスジェニック動物にＡＡＶ１コード化Ｆ２０ＰまたはスクランブルＡβを注入して脈絡叢を形質導入する。脳室膜－脳関門が成熟した後のＰ３とＰ７の間に注入が行われる。ニューロン形質導入によって達成されたものと比較するために、非－トランスジェニック動物を用いて、上衣形質導入の後に皮質に到達する変異体Ａβの濃度を測定する。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは分析のために７．５ヶ月に回収される。

【0300】

Ｄ．変異体Ａβはプラーク発病後に導入された場合、利点を維持する
試験管内の研究を通じて、一部の実施様態において、変異体Ａβがフィブリルの形成後に導入される場合、分解を促進することが示される。変異体Ａβが脳で既存の凝集体を除去する可能性を調べる。この実験は、ＡＡＶ血清型ＰＨＰ．ｅＢを活用して大人脳の細胞へ広範囲に形質導入させる。ＡＰＰ／ＰＳ１および非－トランスジェニックシブリングは、７．５ヶ月齢にＦ２０Ｐ変異体Ａβまたはスクランブルペプチドを運ぶＰＨＰ．ｅＢウイルスを眼窩－後方に注入する。ヒトシナプシンプロモーターは、ニューロンの特異的な発現に用いられ；注入のためのウイルス力価は１×１０^１１乃至１×１０^１２ｇｃ／マウスの掲示された範囲内で各製造に対して経験的に一致する。非－トランスジェニック動物は、Ｐ０で治療によって達成されたものと比較するために大人に注入した後、皮質で変異体Ａβの濃度を測定するのに用いられる。動物を処理した後、分析３ヶ月および６ヶ月に回収し、７．５ヶ月齢に処理せずに回収したマウスと比較した。

【0301】

議論
本実験は、投与量、時期および投与経路が変異体Ａβの生体内の効能にどのような影響を及ぼすかを試験する。一部の実施様態において、Ｆ２０Ｐの発現およびさらに少ない程度であり、Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐの発現は、非注入ＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよびスクランブルＡβペプチドを発現する新たに追加された対照群のすべてと比較してＡＰＰ／ＰＳ１マウスの拡張されたコホートにおけるプラーク負荷およびＡβ負荷を減少させる。一部の実施様態において、同一の効果がＡＰＰ^ＮＬ－Ｆで観察されるが、これらの後期開始は、回収前のさらに長い時間の間、変異体Ａβを過発現し、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりも非－トランスジェニックに比べてさらに多くの変異体を生産することを意味する。

【0302】

一部の実施様態において、生体内でプラークの形成を遅らせるのに必要な変異体対野生型Ａβの最小割合があり、これは、試験管内の効果に必要な最小割合とほぼ類似している。この割合以上に、一部の実施様態において、試験管内よりも不十分に定義された用量－反応関係があるにもかかわらず、段階的な程度のプラークの減少が観察される。非－トランスジェニック動物を用いてＣＳＦを通じて皮質に到達する変異体Ａβの濃度をニューロンの発現によって達成される濃度と比較して、ＣＳＦの伝達がニューロンの発現のための最小有効投与量と同じであるか、または超える変異体Ａβの皮質レベルを達成するか否かを決定する。そうではない場合、心室発現のための代替血清型（すなわち、ＡＡＶ４）または脈絡叢で活性である代替プロモーター（すなわち、Ｐｒｌｒ、Ｓｐｉｎｔ２、Ｆ５）を用いて伝達を改善する。

【0303】

これらの実験は、後続研究で認知検査、シナプス分析および電気生理学に発展され、変異体ペプチドに対する露出からＡβ種に対する基本的な理解が確立されると、生体内でＡβ蓄積を緩和するか、または逆転させるための最適の治療療法の識別および意図しない神経炎症が生理的測定を妨害できるか否かを決定することになる。

【0304】

実施例４－プラークの減少に寄与することができる変異体Ａβに対する神経免疫反応の調査（Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｖａｒｉａｎｔ Ａβ ａｓ ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ａｃｃｏｍｐｌｉｃｅ ｔｏ ｐｌａｑｕｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）
一部の実施様態において、新生児ウイルス形質導入は脳で軽微で細胞－特異的な神経免疫反応を誘導するが、分析は形態学的マーカーに制限されており、根本的な分子変化を全く示していない。ＲＮＡプロファイリングは、アミロイド病理学の脈絡でまたはウイルス発現単独による改造に対し、広範囲な神経免疫マーカーを評価するのに用いられる。年齢による神経免疫プロファイルの進化を試験し、大人脳の形質導入が新生児として注入されたマウスで初めて観察されたことよりもさらに顕著な反応を誘導するか否かを決定する。星状細胞およびミクログリア細胞の組織学的分析を完了し、プラーク負荷、ウイルスの露出および細胞反応が疾患の様々な段階で介入後の変異体Ａβを処理した後、相互作用する方式を決定する。一部の実施様態における効果は、星状細胞反応性に起因するのに対し、他の実施様態における効果は、野生型ペプチドに対する変異体Ａβの生物理学的効果に起因する。一部の実施様態において、生物理学的効果は、星状細胞の反応を乗り越える。アルツハイマー病やその他のタンパク質凝集疾患における自己抑制のためのプラットフォームとしての遺伝子療法の有用性を確立するために経験的な検査が行われる。

【0305】

Ａ．変異体Ａβのウイルス伝達に対する神経炎症の転写マーカーの上向調節およびウイルス伝達年齢が反応に及ぼす影響
この実験においては、非－天然タンパク質を発現するＡＡＶの導入が脳で神経炎症反応を誘導するか否かを扱う。最初はＡＰＰ／ＰＳ１動物におけるプラーク－関連神経膠腫の交絡効果を避けるために、非－形質転換動物に焦点を合わせる。本実験および後続実験のための動物は実施例３のように生成される：全体ＲＮＡ抽出のために各動物の一方の半球から前頭葉皮質の小さな部分（約２０～４０ｍｇ）を収集し、残りの皮質は、実施例３のＥＬＩＳＡおよびウエスタン研究のために残しておく。反対側の半球は組織学的研究のために固定される。ここで、非－トランスジェニック対照群マウスの転写プロファイルは、Ｐ０または７．５ヶ月にＡＡＶ－Ｆ２０Ｐまたはスクランブルペプチドで処理されたシブリングと比較される。Ｐ０に注入され、１５ヶ月に回収された非－トランスジェニック動物も含まれ、神経炎症反応への延長されたウイルス発現の影響を評価する。転写は広範囲な潜在的な神経免疫反応にわたった７５６個の遺伝子を扱うマウス用ナノストリングＮカウンター（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ）神経炎症パネルを用いてプロファイリングされる。ＲＮＡシークエンシングとは異なり、このプラットフォームは、テンプレートの増幅なしに線形定量化のためにｍＲＮＡ分子を直接デジタルで測定する。ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェアを用いて発現データを分析し、処理／回収年齢の各組み合わせに対してＦ２０Ｐまたはスクランブルペプチドで処理された動物と、注入されていない対照群の遺伝子発現を比較する。２次階層の分析は、ベイラー医科大学の多重オミクスデータ分析コア（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｍｕｌｔｉ－Ｏｍｉｃｓ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｅ）から経路および遺伝子集合の強化のために修得する。ＲＮＡシークエンシングも利用可能であり、潜在的な変化に対するより広い読み取り値を提供する。

【0306】

Ｂ．ウイルス－伝達されたＡβ変異体が神経炎症反応に及ぼす影響
ＡＡＶとその非－天然ペプチドカーゴの導入がアミロイド沈殿物に対する神経炎症反応を変化させるか否かを扱う。Ｐ０または７．５ヶ月にＦ２０ＰまたはスクランブルＡβを注入したＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ^ＮＬ－Ｆマウスの皮質転写プロファイルを各実験で注入していないＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ^ＮＬ－Ｆシブリングと比較する。ナノストリングＮカウンター神経炎症パネルは、ＡＰＰモデルにおける神経免疫反応の発現プロファイリングに用いられる。

【0307】

Ｃ．変異体Ａβのウイルス発現時の神経炎症細胞の多様な形態および分布
変異体Ａβのウイルス伝達に対する神経免疫反応の細胞プロファイルを検査する。免疫蛍光は非－トランスジェニック、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ^ＮＬ－Ｆマウスでミクログリア細胞（汎－小膠細胞マーカーとしてのＩｂａ１、恒常性ミクログリア細胞の場合、Ｐ２ＲＹ１２、食細胞ミクログリア細胞の場合、ＣＤ６８、および炎症性ミクログリア細胞の場合、ＭＨＣＩＩ）および星状細胞（汎－星状細胞マーカーとしてのＡｌｄｈ１ｌ１、反応性星状細胞に優先的なＧＦＡＰ）を検出するのに用いられる。注入されていないマウスと比較するために、Ｐ０または７．５ヶ月にＦ２０Ｐまたはスクランブルペプチドを注入した後、マウスを回収した。結果の測定には、非－トランスジェニック動物でまたはＡＰＰモデルで、アミロイドプラークと関連して単位面積当たりの皮質神経免疫細胞の定性的形態および定量的細胞数および空間分布が含まれる。

【0308】

論議
この作業は、転写および細胞マーカーによる非－天然タンパク質のウイルス伝達に対する神経炎症の反応を調査する。これらの実験はまたパイロット研究で観察されたアミロイドの減少が、治療に対する神経炎症反応によって役に立てるか否かを調べる。一部の実施様態において、軽い星状細胞症は、非－トランスジェニックマウスでウイルス伝達を伴ってもよいが、星状細胞症およびミクログリア細胞症の両方はいずれもＦ２０Ｐ－処理されたＡＰＰ／ＰＳ１動物でプラーク負荷に比例して減少される。一部の実施様態において、これらの分子および組織学的実験は、このような不一致の解決を許容し、神経炎症性食細胞作用よりはＡβ立体抑制に基づいたメカニズムを裏付ける。

【0309】

一部の実施様態において、ｍＲＮＡまたは組織学的プロファイルが変異体Ａβで処理された動物で上昇された炎症を提案する場合、ニューロンの形質導入を通じて処理されたマウスのプロファイルをＣＳＦを通じて処理されたマウスのプロファイルと比較する。ＣＳＦ伝達はウイルス露出を制限するが、変異体Ａβの拡散は制限することなく、神経発現との比較は、ウイルスまたはペプチドが原因であるかを正確に指摘しなければならない。試験管内の代替研究は、精製された１次細胞培養および組換えタンパク質を用いて変異体Ａβペプチドに対するミクログリア細胞／星状細胞反応を直接試験する。プラークの減少における神経炎症の役割を排除するために、星状細胞／小膠細胞の存在および不在での治療効能も比較される。

【0310】

最後に、一部の実施様態において、ｍＲＮＡパネルは循環する大食細胞、Ｔ－またはＢ－細胞のような追加的な細胞類型が任意の神経炎症反応に関与し、脳組織のＦＡＣＳ分類が細胞の構成成分および神経侵入の程度を識別するのに用いられるということを示す。伝達経路（すなわち、ニューロンよりは心室）またはカプシド（臨床的に用いられるＡＡＶ９対実験的に用いられるＡＡＶ８／ＰＨＰ．ｅＢ）は、任意の治療－関連神経炎症を緩和するための今後の研究のために変更される。

【0311】

一部の実施様態において、ｍＲＮＡマーカーパネルまたは組織学的染色がウイルス処理された動物で増加された反応を確認する場合、必要に応じて、Ｐ０または大人のウイルス伝達後の神経炎症変化の時間経過をマッピングするために追加の実験を行う。

【0312】

実施例５－変異体ＡβはＡＤ凝集のシーディングを鈍化させる。
変異体Ａβを用いた遺伝子治療が、病原性タンパク質シードが生体内で疾患の進行を加速化する可能性を減少させることができるか否かを試験した。これらの実験は、変異体Ａβがモノマーからシードの形成を防止するのに制限されるかまたは既存のシードの成長も抑制できるか否かを試験することができる機会を提供する。さらに、この実験は、ヒトアルツハイマー病組織の病原性シードを試験し、これは、遺伝子モデル単独よりもさらに多様で現実的な挑戦を示す。最初の実験は、変異体Ａβの予防的発現がＡβシードが豊富なヒトアルツハイマー病抽出物で接種して発生するプラークの形成を鈍化させ得るか否かを調べる。最終の実験は、アミロイド－含有マウスにおけるタウの２次シーディングを弱化させるＡβ減少の可能性を試験する。

【0313】

Ａ．事前－沈着マウスにおけるアミロイドシーディングの速度および程度に対する変異体Ａβの効果のメカニズム
変異体Ａβの生涯にわたる発現が外因性アルツハイマー病の脳抽出物への接種によって誘発され、加速化されたアミロイド症を緩和することができるか否かを試験する。病理学的に確認された２人のアルツハイマー病被験者と年齢が一致する健康な対照群１人から生体内のシーディングのためのＡβ抽出物を製造する。冷凍前頭葉皮質試料を修得する。注入用タンパク質抽出物はＰＢＳでホモジナイズされ、超音波処理されて清澄化される。抽出物は、オリゴマーＡβに対するＡ１１／ＯＣドットブロット、総Ａβ濃度に対するＥＬＩＳＡ、およびシーディング量に対するタンパク質ミスフォールディング循環増幅（ＰＭＣＡ）の検定を特徴とする。出生時、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにＦ２０Ｐ変異体またはスクランブルＡβをコードするＡＡＶを投与し、１ヶ月後にアルツハイマー病または健康な対照群の脳抽出物を海馬および上部皮質に両側注入した。Ｆ２０Ｐ対スクランブルを発現する動物におけるＡβ凝集の重症度および広がりを評価するためのＡβ免疫組織化学およびＥＬＩＳＡのために、このモデルでプラークの正常の開始前の３乃至５ヶ月後に動物を回収する。

【0314】

Ｂ．変異体Ａβはアミロイド－含有マウスでシードされたタウ病理学に影響を与える。
最終の実験は、変異体Ａβの存在が、アミロイド－含有マウスにおけるタウ神経病理学の形成を予防または鈍化できるか否かを試験する。注入用タウ抽出物は、元々Ｌｅｅグループが説明したとおり、サルコシル－不溶性脳ホモジネートの分画遠心分離によって皮質灰白質から製造される。抽出物は総タウ濃度に対するＰＨＦ１ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにより特徴付けられ、タウＲＤ ＦＲＥＴバイオセンサー細胞（ＡＴＣＣから入手可能）を用いてシーディングの可能性について試験した。アルツハイマー病－タウ抽出物が試験管内で予想どおり行われると、Ｆ２０ＰをコードするＡＡＶまたはスクランブルＡβを新生児ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに投与して生体内実験を行う。１２ヶ月後、十分なアミロイド負荷を保障するために、アルツハイマー病（ＡＤ）－タウ抽出物を海馬と上部皮質に両側注入する。３または６ヶ月後にタウ免疫組織化学（ＡＴ８、ＡＴ１８０、ＭＣ１）およびアミロイド免疫染色および組織学（チオフラビン－Ｓ）のために動物を回収してＦ２０Ｐ対スクランブルを発現する動物におけるアミロイド負荷に対するホスホ－タウ免疫染色の広がりおよび総面積を測定する。

【0315】

議論
一部の実施様態において、変異体Ａβの生涯にわたる発現はＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイドの形成を減少させ、アルツハイマー病抽出物によるプラークおよびホスホ－タウ神経突起のシーディングを減少させる可能性がある。一部の実施様態において、変異体Ａβは新たに生成されたシーディングと同様に注入されたＡＤ－Ａβシードの拡張を制限する。類似に、一部の実施様態において、変異体Ａβがタウの２次シーディングを促進するのに必要なアミロイドプラークの形成を弱化させることによってホスホ－タウ神経突起の出現が減少する。代案的に、一部の実施様態において、変異体Ａβは、外因性凝集体によるシーディングを弱化させることができず、これは、一部の実施様態において、変異体ＡβがＡＰＰマウスにおけるシードの形成を鈍化させるのに十分であるが、一旦存在すれば、種子の成長を防止するか、またはＡＤ抽出物に存在するシードと相互作用し得ないことを示唆し；これは、出発物質にかかわらず発生しなければならないフィブリル拡張中の、立体障害の予測されたメカニズムにより可能性が低い。

【0316】

このような実験は接種に関する治療時期が効能を制御する方法を試験する今後の研究のための重要な土台を提供する。変異体Ａβがプラーク発病後に提供される場合、シーディングを妨害することができるか否かを決定するために試験を行う。時間外にも投与量と投与経路がアミロイドからタウへの進行に及ぼす影響を調べる。

【0317】

実施例６－例示的な方法
ＷＴ Ａβ４２または変異体ペプチドストックの製造。合成Ａβ４２ ＷＴまたは変異体ペプチドは、Ｂｉｏｍａｔｉｋ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）で購入した。凝集体のないＡβ４２ ＷＴまたは変異体ペプチドの原液を製造するために粉末型ペプチドを５０％アセトニトリルに溶解して、凍結し、一晩凍結乾燥して残留トリフルオロ酢酸を除去した。凍結乾燥されたＡβ４２ペプチドをＨＦＩＰ（＃１０５２２８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に溶解させた。Ａβ－ＨＦＩＰ溶液を室温（ＲＴ）で３０分間インキュベーションした後、分取量に分けた。ＨＦＩＰをヒュームフードで一晩蒸発させた後、１時間の間ＳｐｅｅｄＶａｃに移動させ、残っているＨＦＩＰの痕跡を除去した。ペプチドフィルムを含むチューブは、用いるまで－２０℃で乾燥剤の上に保管した。実験に用いる直前に凍結乾燥されたペプチドをＤＭＳＯに最終濃度が５ｍＭとなるように溶解させ、水槽超音波処理器で１０分間超音波処理した。

【0318】

オリゴマーおよび原線維型ＷＴ Ａβの製造。Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地（＃３０６１１０４０－１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でペプチドを最終濃度１００μｍ ＷＴ Ａβ４２ペプチドまたは１００μＭ ＷＴ＋１００μＭ変異体で溶解した後、振盪せずに４℃で２４時間の間インキュベーションし、オリゴマーＡβを生成した。原線維型ＡβはＷＴペプチドをＰＢＳに最終濃度１００μｍで溶解させ、振盪せずに３７℃で２４時間の間インキュベーションして生成された。

【0319】

Ａβ自己－凝集、ＷＴペプチドとの競争およびフィブリルの分解の動力学を試験するためのＴｈＴ検定。Ａβ４２ ＷＴまたは変異体単量体の自己－凝集は５μＭチオフラビンＴ（ＴｈＴ）を含むＰＢＳで１０μＭの開始濃度で試験した。ＴｈＴ蛍光は４４０ｎｍの励起波長および４８５ｎｍの放出波長でＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定された。反応物を３７℃で振盪せずにインキュベーションした後、蛍光を読み取る前に５秒間振盪した。変異体とＷＴ Ａβとの間の競争は類似に行われ、ＷＴ単独を除いて混合物（１：１、ＷＴ：変異体）の各ペプチドに対して１０μＭの開始濃度を用いて最終濃度１０μＭで試験した。５μＭ ＴｈＴを含むＰＢＳで１０μｌのＷＴ Ａβ４２フィブリル（上記で説明した）を５、１０または２０μＭ単量体Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４ＰまたはＦ２０Ｐペプチドと１：１の割合で混合してフィブリルの分解を評価した。３７℃で４８時間の間振盪せずに２４時間ごとに蛍光を測定した。

【0320】

オリゴマーＡβ毒性検定。Ｎ２ａ細胞は１×１０^４Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（＃１５１４０－１２２、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および１０％胎児ウシ血清（＃ＭＴ３５０１０ＣＶ、Ｆｉｓｈｅｒ）が補充されたＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ、＃１１２－０１８－１０１、ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）培地で、３７℃で５％のＣＯ_２に成長させた。融合性（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）細胞をトリプシン化し、細胞成長を最小化するために、１％のＮ_２補充剤を含むＥＭＥＭに希釈した後、透明平面－床９６－ウェルプレート（＃０７－２００－８９、Ｆｉｓｈｅｒ）に、１ウェル当たり５，０００個の細胞をプレーティングした。１０μｌのそれぞれのオリゴマー製剤（ＷＴ Ａβ単独またはＷＴ＋変異体、上記に記載されている）または１０μｌの１：１０希釈液を９０μｌの培養培地に添加した。製造社の指示に応じてＭＴＳ検定（＃Ｇ３５８２、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて処理２４時間後に細胞生存力を測定した。簡略に、２０μｌのＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを培養ウェルに直接添加し、３７℃、５％のＣＯ_２雰囲気で２時間の間培養した後、Ｅｐｏｃｈ ２分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いて４９０ｎｍで吸光度を記録して検定を行った。

【0321】

プラスミド構築物。Ａβ－ＣＴＦのＮ末端にガウシアルシペラジェ信号ペプチド（ＧＬＳＰ、アミノ酸ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡ、配列番号：２０に該当）を添加するためにＰＣＲを用いた。先ず、オリゴＧＬＳＰ－１ ５’ＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡ ３’（配列番号：４０）およびオリゴＧＬＳＰ－２ ５’ＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＧＧＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴＴＣＡＣＧＣＣＣＡＴ ３’（配列番号：４１）を用いて部分的なＡβ配列を有したＧＬＳＰ用合成ＤＮＡを製造した。このオリゴヌクレオチドは９５℃の２分間で開始した後、漸次的に２５℃に冷却されるようにプログラミングされたサーマルサイクラーでインキュベーションしてアニーリングされた。第二に、ヒトＡＰＰ野生型配列（ｐＢＳ－ｈＡＰＰｗｔ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）を含むプラスミドをフォワードプライマー５’ＧＴＣＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＡＴＧＡＣ ３’（配列番号：４２）およびリバースプライマー５’ＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＣＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧ ３’（配列番号：４３）に増幅して部分的なＧＬＳＰ配列を有するＡβ－ＣＴＦを生成した。その後、ＧＬＳＰ－Ａβ－ＣＴＦは、二つのテンプレートからＫｏｚａｋ配列５′ＧＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＴ ３′（配列番号：４４）を追加するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマー５′ ＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＣＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧ ３′（配列番号：４５）を用いてＧＬＳＰ＋部分ＡβにＡβ－ＣＴＦ＋部分ＧＬＳＰに結合するキブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）アセンブリーによって生成された。生成されたＧＬＳＰ－Ａβ－ＣＴＦ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断し、ＣＡＧプロモーターおよびＷＰＲＥを含むｐＡＡＶでサブクローニングしてｐＡＡＶ－ＧＬＳＰ－Ａβ－ＣＴＦを生成した。

【0322】

ＧＬＳＰ－Ａβ－ＣＴＦ欠失シリーズは、多様なＧＬＳＰ－Ａβ－ＣＴＦ欠失をｐＡＡＶでクローニングして作製された。ＧＬＳＰ－Ａβ－ＣＴＦ欠失シリーズは、一連のリバースプライマーと共通のフォワードプライマーを用いて全長ｐＡＡＶ－ＧＬＳＰ－Ａβ－ＣＴＦからＰＣＲによって増幅された後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断し、ｐＡＡＶにライゲーションさせた。

【0323】

フォワードプライマー：
Ａβ－ＧＬＳＰ－Ｆ（ＫＯＺＡＫ）：５′ ＧＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＴ ３′（配列番号：４６）。

【0324】

リバースプライマー：
Ａβ－Ｒ（ＫＫ）：５′ ＧＣＧＣＧｇａｔａｔｃＴＴＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧ ３′（配列番号：４７）；
Ａβ－Ｒ（ＭＬ）：５′ ＧＣＧＣＧｇａｔａｔｃＴＴＡＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡ ３′（配列番号：４８）；
Ａβ－Ｒ（ＬＶ）：５′ ＧＣＧＣＧｇａｔａｔｃＴＴＡＣＴＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡ ３′（配列番号：４９）；
Ａβ－Ｒ（ＩＴ）：５′ ＧＣＧＣＧｇａｔａｔｃＴＴＡＣＴＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧＴＣＧ ３′（配列番号：５０）；
Ａβ－Ｒ（ＩＶ）：５′ ＧＣＧＣＧｇａｔａｔｃＴＴＡＣＴＡＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＡ ３′（配列番号：５１）；
Ａβ－Ｒ（ＩＡ）：５′ ＧＣＧＣＧｇａｔａｔｃＴＴＡＣＴＡＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＡ ３′（配列番号：５２）；

【0325】

Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ置換を含むｐＡＡＶ－ＧＬＳＰ－Ａβ（Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ）－ＫＫを構築するために２つのＰＣＲ反応を行った。ＧＬＳＰ－Ａβ（Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ）－ＫＫの断片は、フォワードプライマー５′ ＧＣＧＣＧａａｇｃｔｔＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＴ ３′（配列番号：５３）およびリバースプライマー５′ ＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＣＡＡＴＧＡＴＴＧＣＡＣＣＴＴＴＧＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＡ ３′（配列番号：５４）を用いてｐＡＡＶ－ＧＬＳＰ－Ａβ－ＫＫから増幅された。ＧＬＳＰ－Ａβ（Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ）－ＫＫの第２の断片は、フォワードプライマー５′ ＴＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＧＴＧＣＡＡＴＣＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡＴＧＧＴ ３‘（配列番号：５５）およびリバースプライマー５′ ＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧ ３′（配列番号：５６）を用いて増幅された。生成された断片をフォワードプライマー５′ ＧＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＴ ３′（配列番号：５７）およびリバースプライマー５′ ＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧ ３′（配列番号：５８）を用いてギブスンアセンブリーによって結合した。生成された挿入物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断し、ｐＡＡＶにサブクローニングしてｐＡＡＶ－ＧＬＳＰ－Ａβ（Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ）－ＫＫを生成した。

【0326】

Ｆ２０Ｐ置換を含むｐＡＡＶ－ＧＬＳＰ－Ａβ（Ｆ２０Ｐ）－ＫＫに対し、２つのＰＣＲ反応を行った。ＧＬＳＰ－Ａβ（Ｆ２０Ｐ）－ＫＫの断片は、フォワードプライマー５′ ＧＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＴ ３′（配列番号：５９）およびリバースプライマー５′ ＴＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＧ ３′（配列番号：６０）を用いてｐＡＡＶ－ＧＬＳＰ－Ａβ－ＫＫから増幅された。ＧＬＳＰ－Ａβ（Ｆ２０Ｐ）－ＫＫの第２の断片は、フォワードプライマー５′ ＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡ ３′（配列番号：６１）およびリバースプライマー５′ ＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧ ３′（配列番号：６２）を用いて増幅された。生成された断片をフォワードプライマー５′ ＧＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＴ ３′（配列番号：６３）およびリバースプライマー５′ ＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧ ３′（配列番号：６４）を用いてギブスンアセンブリーによって結合した。生成された挿入物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断してｐＡＡＶにサブクローニングしてｐＡＡＶ－ＧＬＳＰ－Ａβ（Ｆ２０Ｐ）－ＫＫを生成した。全ての制限酵素はニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）で購入した。

【0327】

Ｎ２ａ調節培地でＡβペプチドの収集。Ｎ２ａ細胞は１×１０^４Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％胎児ウシ血清が補充されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、＃１２－６０４Ｆ、ＶＷＲ）培地を用いておよそ９０％融合されるまで６ウェルプレートで成長させた。引き続き、リポフェクタミンＬＴＸ（＃１５３３８０３０、Ｆｉｓｈｅｒ）または１４μｇ／皿（１０ｃｍ）のｐＡＡＶ－ＧＬＳＰ－Ａβ（Ｆ２０Ｐ）－ＫＫを用いて順次に欠失されたＡＰＰ－ＣＴＦ配列（例えば、ｐＡＡＶ－ＧＬＳＰ－Ａβｗｔ－ＫＫ）の２．５μｇ／ウェルで細胞をトランスフェクトさせた。２４時間後、細胞を１× Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭおよび０．２％の胎児ウシ血清で構成された血清－減少培地を添加した後、細胞を３７℃で５％のＣＯ_２に回復させた。調節培地を２４時間後に回収し、４℃で５分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した（ＩＰ反応当たり２ｍｌ／ウェル×３ウェル）。γ－セクレターゼ活性に対するＡβ放出の依存性を試験するために、細胞を上記のようにトランスフェクトさせ、０．１または１ｎＭのＬＹ４１１５７５（＃ＳＭＬ０５０６、Ｓｉｇｍａ）を含む後続培地を入れ替った。上澄み液を収集し、プロテアーゼ抑制剤（＃５８９２９７０００１、Ｓｉｇｍａ）および０．０１％のＮａＮ_３（＃Ｓ２００２、Ｓｉｇｍａ）で補充してタンパク質分解を防止した。

【0328】

免疫ブロットのための調節培地のＡβ ＩＰ．タンパク質Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（５０μｌ、＃１０００３Ｄ、Ｆｉｓｈｅｒ）に室温で１時間の間マウス抗－Ａβ抗体６Ｅ１０（１μｇ、＃ＳＩＧ－３９３２０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をローディングした。トランスフェクトされたＮ２ａ細胞（６ｍｌ）の調節培地を４℃で一晩回転器で５０μｌのＤｙｎａｂｅａｄ－６Ｅ１０複合体とともに培養した。翌日、磁気分離を用いてビーズを収集し、上澄み液を除去した。ビーズを０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。免疫沈殿された複合体を５０ｍＭグリシンｐＨ２．８で溶出させた。この後、試料を７０℃で１０分間同一の体積の２× Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファーで変性させ、１６．５％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅゲル（＃３４５００６３、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で電気泳動した。トランス－ブロットターボトランスファーシステム（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、＃１７０－４１５９、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてタンパク質をニトロセルロースに移した。メンブレンを０．１％のＴｗｅｅｎ－２０および５％無脂肪粉乳を含むＰＢＳで室温で１時間の間ブロッキングし、ブロッキング溶液に１：５０００で希釈された６Ｅ１０を用いて４℃で一晩探針した。抗体結合はブロックで１：２０，０００で希釈されたＩＲＤｙｅと接合されたマウス抗－ＩｇＧ ２次抗体（＃２６－３２２１０、ＬＩ－ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を用いて検出された。オデッセイＦｃイメージャ（Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｆｃ Ｉｍａｇｅｒ）でブロットをイメージ化し、イメージスタジオ（Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ）ソフトウェア（ＬＩ－ＣＯＲ）で分析した。

【0329】

ＭＳ用調節培地のＡβ ＩＰ．Ａβ Ｆ２０Ｐを含む約６０ｍＬのＮ２ａ調節培地を１０μｇマウス抗－Ａβ抗体６Ｅ１０（＃ＳＩＧ－３９３２０；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともにインキュベーションし、それぞれ３０ｍＬずつ二つのバッチに分け、回転器で４℃で一晩インキュベーションした。翌日Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１００μＬ；＃１０００３Ｄ；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培地に添加し、４℃で２時間インキュベーションした。上澄み液を除去するために、磁気分離によりビーズを収集した後、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、洗剤なしにＰＢＳで２回洗浄した。最後に、ＭＳ分析のために免疫沈殿された複合体を１０％のギ酸溶液８０μＬで溶出した。

【0330】

ＭＳ．脳ホモジネートおよびＡβ Ｆ２０Ｐを発現する培養培地で溶出された免疫沈殿物をＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥し、５０μＬの２０％のギ酸に再懸濁させた。１μＬのＩＰ反応物を１０ｃｍ、１００μｍ内径Ｃ３コラム（ＺＯＲＢＡＸ ３００ＳＢ－Ｃ３；３００Å ５μｍ）にローディングし、溶融シリカに自体パッキングし、引き寄せてナノ電気噴霧放出器を形成した。オンライン高性能ＬＣ（ＨＰＬＣ）はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｕ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ ＰｒｏＦｌｏｗシステムで行われた。緩衝液Ａ：２％のアセトニトリル、０．１％のギ酸および緩衝液Ｂ：９８％のアセトニトリルおよび０．１％のギ酸を用いて０％の緩衝液Ｂから３５％の緩衝液Ｂまで５０分線形勾配した。コラム溶離液はナノ電子噴霧イオン化によってＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓに導入された。２，２００Ｖの静的噴霧電圧と３２０℃のイオン伝達チューブの温度が供給源に対して設定された。

【0331】

ＭＳ１は４重極子分離（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）があるポジティブモードで６０ｋの解像度設定でオービトラップ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）によって行われた。最大注入時間が２００ｍｓである５．０ｅ６の自動利得制御（ＡＧＣ）標的、２つのマイクロスキャンおよび３５０乃至２，０００質量対電荷割合（ｍ／ｚ）のスキャン範囲が用いられた。ＭＳ２断片化のために選択された標的前駆体ｍ／ｚは、＋４、＋５および＋６ Ａβ Ｆ２０Ｐ ３８、４０および４２アミノ酸変形されていないイオンに対する単一同位元素および最も豊富な質量を含んだ。正規化された衝突エネルギーが４５％である高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）断片化が用いられた。ＭＳ２収集は１５ｋの解像度設定、ＡＧＣ標的１ｅ６、最大注入時間１００ｍｓ、スキャン範囲１５０－２，０００ｍ／ｚおよび３つのマイクロスキャンを用いてオービトラップを用いて行われた。次に、α－セクレターゼにより切断されたＡβ １－１６の質量は、ＭＳ分析のために切断されずに部分的に切断された前駆体（信号ペプチドおよび残存ＴＭドメインがあるかまたはない）とともに特異的に標的化され、これらの標的に対する敏感度を向上させた。媒介変数はこのような代案的に切断されたペプチドを含む標的質量リストで複製された。

【0332】

データ処理は、上記において説明したように、カスタム分析スイートによって行われた。切断されずに部分的に切断された前駆体ペプチド（信号ペプチドおよび残留ＴＭドメインがあるかまたはない）とともにＡβ Ｆ２０Ｐ ３８、４０および４２つのペプチド、α－セクレターゼ－切断されたＡβ １－１６は検索のための鋳型配列で用いられた。変形されていないＡβ Ｆ２０Ｐに対する代表的なスペクトルが図示される。

【0333】

ウイルス性パッケージング。すべてのＡＡＶは以前に説明したのと類似した方法を用いてベイラー医科大学の遺伝子ベクターコア（Ｇｅｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ）で製造した。ＨＥＫ２９３Ｔサブクローン１Ｆ１１細胞を１０％のＦＢＳ（＃９７０６８－０８５、ＶＷＲ）および１×抗生剤／抗真菌剤（＃ＣＡ００２－０１０、ＧｅｎＤＥＰＯＴ）が補充されたＤＭＥＭ（＃ＣＭ００２－０５０、ＧｅｎＤＥＰＯＴ Ｃｏｒｐ．、Ｂａｒｋｅｒ、ＴＸ）で成長させた。血清型８ＡＡＶはｉＭＦｅｃｔｉｎ Ｐｏｌｙ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（＃Ｉ７２００－１０１、ＧｅｎＤＥＰＯＴ）２４μＬ／プレートを用いて３つのプラスミド（発現ベクター（１．１４μｇ／１５ｃｍプレート）、ｐ５Ｅ１８－ＶＤ２／８ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド（４．５７μｇ／プレート）およびｐＡｄＤＦ６ヘルパープラスミド（２．２９μｇ／プレート）の同時トランスフェクションによって製造された。ＡＡＶ精製は、Ａｙｕｓｏの他に基づいたプロトコルを用い、０．７５ Ｍ ＮａＣｌを含む１５％のイオジキサノールで行った。トランスフェクションの３日後、後続ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿のために培地を維持する間、細胞を収集した。細胞ペレットをプレート当たり１ｍｌの５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および０．１５ Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に再懸濁し、室温で３０分間０．１体積の５％のデオキシコール酸ナトリウムを添加して溶解させた後、３７℃で１時間の間１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ ＩおよびＲＮａｓｅ Ａで培養した。細胞溶解物を４℃で１０分間、５，０００× ｇで遠心分離して浄化した。培養培地を１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ ＩおよびＲＮａｓｅ Ａとともに３７℃で１時間の間培養した後、４℃で８％のＰＥＧ（ストック４０％のＰＥＧ ８０００＋２．５ Ｍ ＮａＣｌ）で一晩培養した。この混合物から２，５００× ｇで３０分間遠心分離によってＡＡＶを収集した。ＡＡＶを含むペレットを最小体積のＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％のサルコシルおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に再懸濁させた。イオジキサノール密度遠心分離のために細胞－関連の、および分泌されたＡＡＶ製剤を組み合わせた。生成されたＡＡＶ粒子をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルター（１００，０００ ｋＤａ公称限界、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を用いてＭｇおよびＣａがないＰＢＳに対して透析し、力価をリアルタイムＰＣＲで決定した。

【0334】

マウス。ベイラー医科大学の比較医学センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で購入した野生型ＩＣＲ動物は、Ｐ０ウイルス注入のための子孫生成に用いられた。これらの同腹仔の野生型仔は、下述のように、Ｐ０でウイルスの注入されており、１ヶ月齢で新皮質ウイルス発現を評価するために回収された。男性ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９ ｂｉｇｅｎｉｃマウスは、ジャクソン研究所のＭｕｔａｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（製品 ＃３４８３２－ＪＡＸ、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ、ＰＳＥＮ１ｄＥ９）８５Ｄｂｏ／Ｍｍｊａｘ）で入手した。これらは野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配して逆交配コロニーを構築するか、またはＦＶＢ／ＮＪ雌と交配して研究用Ｆ１子孫を生成した。雄および雌、非－トランスジェニック（野生型）およびＡＰＰ／ＰＳ１－陽性子孫の両方にＰ０ウイルス注入して７．５ヶ月齢で変異体Ａβの発現を評価した。すべての動物実験はベイラー医科大学機関動物管理および使用委員会で検討して承認し、関連規制標準を遵守する。

【0335】

Ｐ０脳室内注入。新生児マウス仔の側脳室にＡＡＶを上述したように定位注入した。生まれた後６時間以内に新生児をケージから収集して冷凍麻酔で注入する準備をする。運動を中断した後、０．０５％のトリパンブルーを含む滅菌ＰＢＳに希釈された４×１０^６ＴＵ／μｌのウイルス溶液を３２ゲージ針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、＃７８０３－０４、ＲＮ ６ＰＫ ＰＴ４）が装着された１０μＬのシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ、＃７６５３－０１）を用いて側脳室に注入した。新生児定位装置（Ｘ、Ｙ、Ｚ）＝（±０．８、±１．５、－１．５ｍｍ）および（±１．３５、±２．０、－１．７ｍｍ）を用いてラムダから半球当たり２つの部位に部位当たり１μＬのウイルス溶液を注入した。注入された仔をケアのために生物学的な母親に戻す前に、正常の色と動きを取り戻すために温熱パッドの上に置いた。

【0336】

組織の回収。野生型ＩＣＲマウスを３週齢にウイルス拡散および発現について研究した；トランスジェニックＡＰＰ／ＰＳ１動物およびこれらの非－トランスジェニックシブリングを７．５ヶ月齢でＡβレベル、プラークの負荷および神経膠症について研究した。ペントバルビタールナトリウムの過多服用によりマウスを死滅し、ＰＢＳとヘパリンを心臓を通じて灌流した。脳を除去して正中線に沿って解剖した。左側皮質の口側半分は生化学のためにドライアイスで急速凍結させた。右側半球は４℃で４８時間の間４％のパラホルムアルデヒドに浸漬固定されており、４℃で３０％のスクロースで凍結保護されており、組織学のために３５ｍｍで分割した。

【0337】

組織ホモジナイズ。凍結された前頭葉皮質を５ｍＭ ＥＤＴＡ、１×プロテアーゼ抑制剤（＃０５８９２９７０００１、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および１× ＰｈｏｓＳＴＯＰ（＃０４９０６８４５００１、Ｒｏｃｈｅ）を含むＰＢＳで超音波処理し、４℃で３０分間１００，０００× ｇで遠心分離した。ペレットを１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＰＢＳ－Ｘ）を含む同一体積のＰＢＳに再懸濁し、４℃で３０分間柔らかい回転にて混合した。試料を４℃で３０分間１００，０００× ｇで遠心分離し、上澄み液をＰＢＳ－Ｘ可溶性分画で貯蔵した。ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８のうち同量の５Ｍグアニジンハイドロクロライドに再懸濁し、室温で一晩柔らかく回転して混合した。試料を室温で３０分間１６，０００× ｇで遠心分離し、上澄み液をグアニジン可溶性分画で貯蔵した。

【0338】

ＭＳ用脳抽出物のＡβ ＩＰ．ＡＡＶ－Ｆ２０Ｐを注入し、３週目に回収したＷＴ ＩＣＲマウスの脳抽出物をＩＰ－ＭＳに用いた。５００μＬのＰＢＳ－Ｘ溶解性抽出物を５００μＬのＲＩＰＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％のＩｇｅｐａｌ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．２％のＳＤＳおよびプロテアーゼ抑制剤を含むＰＢＳ）と混合した後、回転プラットフォームで５μｇマウス抗Ａβ－抗体６Ｅ１０とともに４℃で一晩インキュベーションした。翌日Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（５０μＬ）をホモジネートに添加し、４℃で２時間インキュベーションした。ビーズを磁気分離により収集して上清液を除去した後、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、洗剤なしにＰＢＳで２回洗浄した後、免疫沈殿された複合体をＭＳ用１０％のギ酸溶液４０μＬで溶出した。

【0339】

中間規模ディスカバリーの検定（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｓｓａｙ）。ＰＢＳ－Ｘ（生後３週）またはグアニジン（生後７．５ヶ月）で製造された前頭葉皮質抽出物でヒトＡβｘ－４０および－４２の濃度は、マルチプレックスＡβペプチドパネル１（＃Ｋ１５２００Ｅ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて測定された。捕獲のために提供された６Ｅ１０抗体（ヒトＡβ １－１６）、および検出のために提供された末端－特異的４０／４２抗体を用いて、基本的に製造業社の指示に応じて検定を行った。試料はＰＢＳ－Ｘの場合、１：１、グアニジンの場合、１：２５０の希釈を要求する検定の線形範囲内にあるように希釈した。ＰＢＳ－Ｘおよびグアニジン分画の初期希釈は、１％のプロテアーゼのないＢＳＡ（＃８２０４５１、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）を含むＰＢＳで行われた。キットに含まれたＤｉｌｕｅｎｔ ３５を用いて最終作業希釈液を製造するが；Ａβ遮断試薬を用いなかった。ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００で試料を読み取り、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて濃度を計算した。

【0340】

免疫蛍光。１／１２シリーズ切片をＴＢＳでリンスさせ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および１０％の正常ヤギ血清を含むＴＢＳで室温で１時間の間ブロッキングした後、それぞれがブロッキング溶液のうち１：５００希釈されたマウス抗－ＧＦＡＰ（＃Ｇ３８９３、Ｓｉｇｍａ）、ウサギ抗－Ｉｂａ１（＃０１９－１９７４１、Ｗａｃｏ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）、またはマウス抗－Ａβ抗体６Ｅ１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）＋ウサギ抗－Ａβ抗体Ｙ１８８（＃ａｂ３２１３６、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）で４℃で一晩インキュベーションした。ＴＢＳで数回洗浄した後、切片を１：５００ブロックで希釈させたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－５６８ヤギ－抗ウサギおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８ヤギ－抗マウス２次抗体（＃Ａ－１１０３６および＃Ａ－２１１２１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに室温で２時間インキュベーションした。ＧＦＡＰ／Ｉｂａ１切片をＴＢＳで洗浄した後、ＴＢＳで希釈した０．００２％のチオフラビン－Ｓで室温で８分間対比染色した。チオフラビン－染色された切片を５０％のエタノールで二回洗浄した後、装着する前にＴＢＳで数回洗浄した。すべての切片をスーパーフロストプラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ）スライド（＃１２－５５０－１５、Ｆｉｓｈｅｒ）に装着し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ装着媒体（＃Ｈ１４００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でカバースリップした。

【0341】

免疫組織化学。アミロイド－ベータプラークを標識するために、自由－浮動切片をＴＢＳを利用して凍結保護剤で洗浄し、８８％のギ酸で１分間インキュベーションした後、ＴＢＳでリンスさせた。内因性ペルオキシダーゼを室温で３０分間ＴＢＳ＋０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＴＢＳ－Ｔ）のうち０．９％のＨ_２０_２で急冷（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）した。ＴＢＳで洗浄した後、切片を室温で１時間の間ＴＢＳ－Ｔで５％の正常ヤギ血清でブロッキングした。切片をブロッキング緩衝液に希釈された１次抗体（１：５００、Ｒｂ抗－Ａβ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｚｙｍｅｄ、７１－５８００）とともに一晩４℃でインキュベーションした。翌日、切片をＴＢＳで洗浄して室温で２時間の間、２次抗体とともにインキュベーションした（１：５００、ビオチニル化されたＧｔ抗－Ｒｂ、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、ＰＫ－６１０１）。使用の３０分前にＴＢＳ ５ｍｌに各溶液５０μＬを用いてＡ＋Ｂ試薬を製造した。切片をＴＢＳで数回洗浄した後、Ａ＋Ｂ試薬で９０分間室温でインキュベーションした。切片を再度ＴＢＳで洗浄した後、濾過されたＤＡＢ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｄ４２９３）で現像させ、ＴＢＳ洗浄して急冷させた。切片をスーパーフロストプラススライド（Ｆｉｓｈｅｒ、１２－５５０－１５）に装着させて一晩乾燥させた。スライドをＰｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ、ＳＰ１５－１００）でカバースリップする前にエタノールシリーズ（７０％、９５％、１００％、キシレン）を通じて処理した。

【0342】

星状細胞およびミクログリア細胞標識のために切片を次のように変形して上記のように処理した。内因性ペルオキシダーゼを室温で３０分間ＴＢＳ＋０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳ－ＴＴ）のうち０．９％のＨ_２０_２を用いて急冷した。ブロッキング溶液はＴＢＳ－ＴＴのうち５％のＮＧＳで構成された。１次抗体をＴＢＳ－ＴＴ（１：１，０００、Ｒｂ抗－ＧＦＡＰ、ＤＡＫＯ Ｚ０３３４または１：１，０００、Ｒｂ抗－Ｉｂａ１、Ｗａｋｏ ０１９－１９７４１）に希釈した。

【0343】

Ａβ、ＧＦＡＰおよびＩｂａ１表面積の定量化。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１を１０×倍率で用いてタイルイメージを獲得した（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。露出時間とランプ強度はすべての切片で一定であった。ブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）で０．２４ｍｍから２．０４ｍｍの間の二つの矢状切片が定量化のために無作為に選ばれた。Ｆｉｊｉ １．５１Ｗ（ＮＩＨ、ＵＳＡ）を用いて分析のために海馬前方前頭葉皮質をＲＯＩで表示した。イメージを８ビットで変換し、ＲＯＩを基準としてＹｅｎ（円）アルゴリズムを用いて臨界値を適用した。ＲＯＩがある臨界値上の面積百分率を定量化に用いた。

【0344】

統計。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ｈを用いて統計の比較およびグラフ作成を行った。二つのグループの比較は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔで行った；３つ以上のグループの比較は、一元または両方向ＡＮＯＶＡに引き続き、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後試験で行われた。Ｇｒｕｂｂの試験は異常値データポイントを識別するのに用いられた（ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／ｑｕｉｃｋｃａｌｃｓ／Ｇｒｕｂｂｓ１．ｃｆｍ）；これによって図３Ｅで１つのデータポイント（Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ Ａβ４２）を、図３Ｆで２つのデータポイント（Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ Ａβ４０およびＦ２０Ｐ Ａβ４２）を、図３Ｆで１つのデータポイント（７．５ヶ月Ｆ１９Ｄ／Ｌ３４Ｐ）を、そして図４Ｂから１つのデータポイント（Ｆ２０Ｐ）を除去した。グラフはグループ平均±ＳＥＭを表示する。
＊＊＊

【0345】

本明細書に開示されて請求されたすべての方法は、本開示内容を考慮して過度な実験なしに行われ、実行されてもよい。本発明の組成物および方法が特定の実施様態の観点で記述されているが、本明細書に記述された方法および段階または段階の順序は、本発明の概念、思想および範囲から外れることなく、変形され得ることが当業者に明白であるだろう。より具体的に、同一または類似の結果が達成される間、化学的および生理学的に両方とも関わった特定製剤が本明細書に記載されている製剤を代替することができることが明白であるだろう。当業者に明白なすべての類似した代替物および修正物は、添付の請求の範囲によって定義された本発明の思想、範囲および概念内にあるものと見なされる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【配列表】

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【国際調査報告】