特表 2024-500797 過剰な核酸沈殿を阻害するための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-10

(54)【発明の名称】過剰な核酸沈殿を阻害するための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/14 20060101AFI20231227BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20231227BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20231227BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20231227BHJP

   C07K 1/16 20060101ALI20231227BHJP

【ＦＩ】

C07K1/14

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C07K1/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537314

(86)(22)【出願日】2021-12-17

(85)【翻訳文提出日】2023-08-02

(86)【国際出願番号】 IB2021061943

(87)【国際公開番号】W WO2022137058

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】63/199,368

(32)【優先日】2020-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/263,924

(32)【優先日】2021-11-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

３．ＢＲＩＪ

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(74)【代理人】

【識別番号】100185960

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 理愛

(72)【発明者】

【氏名】ネハ カラ

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム キッシュ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン ライトホルダー

(72)【発明者】

【氏名】ズオ リュー

(72)【発明者】

【氏名】エリック ヴォースト

(72)【発明者】

【氏名】タマラ ゼコビック

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA20

4H045CA01

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA05

4H045GA21

4H045GA22

4H045GA23

4H045GA26

(57)【要約】

本開示は、宿主細胞によって作製された生物由来生成物の精製における使用のための改善された方法について記載する。一部の実施形態では、改善された方法は、界面活性剤等により宿主細胞を溶解して、生物由来生成物を放出させ、ドミフェン臭化物等により宿主細胞ＤＮＡを沈殿させ、次いで、十分な最終濃度となるように塩を添加することにより、生物由来生成物を含有する上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害する１つまたは複数のステップを含む。一部の実施形態では、生物由来生成物は、ワクチン、またはＡＡＶベクターもしくはレンチウイルスベクター等の遺伝子療法のためのウイルスベクターである。
【図１】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

溶解された宿主細胞の試料から宿主細胞ＤＮＡを除去する方法であって、（ｉ）宿主細胞を溶解し、ライセートを産生するステップと、（ｉｉ）ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させ、凝結物および上清を産生するステップと、（ｉｉｉ）凝結物から上清を分離するステップと、（ｉｖ）上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するステップとを含む方法。

【請求項2】

宿主細胞が、生理的に適合性の流体に懸濁され、細胞懸濁液が形成され、細胞溶解を引き起こすのに十分な濃度の界面活性剤を含む溶液を細胞懸濁液に添加することにより溶解される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

細胞懸濁液および界面活性剤溶液を混合するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

生理的に適合性の流体に懸濁される前に、宿主細胞が、基材における接着細胞培養として、または懸濁細胞培養において育成または維持される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

界面活性剤が、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤または双性イオン性界面活性剤である、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

非イオン性界面活性剤が、アルキルフェノールエトキシレート、４－アルキルフェノールエトキシレート、オクチルフェノールエトキシレート、４－オクチルフェノールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、４－ノニルフェノールエトキシレート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｔｗｅｅｎ ２０およびＴｗｅｅｎ ８０からなる界面活性剤化合物の群から選択される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

非イオン性界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

溶解に先立ち、細胞懸濁液における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬである、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

宿主細胞の生細胞密度が、約１０×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬまたは約１５×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及ぶ、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

宿主細胞が、哺乳類細胞または昆虫細胞である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｓｆ９細胞およびＳｆ１細胞からなる細胞の群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

ライセートにおける界面活性剤の最終濃度が、少なくとも０．３％である、請求項２から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ライセートにおける界面活性剤の最終濃度が、約０．３％～０．７％または約０．４％～０．６％の範囲に及ぶ、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

ライセートにおける界面活性剤の最終濃度が、約０．５％である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

ライセートにおける宿主細胞ＤＮＡが、ドミフェンハロゲン化物を含む溶液をライセートに添加することにより沈殿される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

ライセートと、ドミフェンハロゲン化物を含む溶液とを混合するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

ドミフェンハロゲン化物が、ドミフェン臭化物（ＤＢ）である、請求項１５から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

ライセートにおけるＤＢの最終濃度が、少なくとも０．１５％である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ライセートにおけるＤＢの最終濃度が、約０．１５％～０．４５％、約０．２％～０．４％または約０．２％～０．３％の範囲に及ぶ、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ライセートにおけるＤＢの最終濃度が、約０．３％である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるＤＢの最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００９％、０．００８％または０．００７％以上である、請求項１７から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．３％～０．７％または約０．３５％～０．６５％または約０．４％～０．６％の範囲に及び、ライセートにおけるＤＢの最終濃度が、約０．１５％～０．４５％または約０．２％～０．４％または約０．２％～０．３％の範囲に及ぶ、請求項１７から１８および２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．３％～０．７％または約０．３５％～０．６５％または約０．４％～０．６％の範囲に及び、ライセートにおけるＤＢの最終濃度が、約０．１５％～０．４５％または約０．２％～０．４％または約０．２％～０．３％の範囲に及ぶ、請求項１７から１８および２１から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．５％であり、ＤＢの最終濃度が、約０．３％である、請求項１７から１８および２１から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

重力の影響下で沈降させ、沈降した凝結物の下層および上清の上層を形成することにより、上清が、凝結物から分離される、請求項１から１２、１５から１８および２１から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

上清を除去および濾過するステップをさらに含む、請求項１から１２、１５から１８および２１から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿が、宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに十分な濃度の塩を含む溶液を上清に添加することにより阻害される、請求項１から１２、１５から１８および２１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

塩が、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）または塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

上清および塩溶液を混合するステップをさらに含む、請求項２７から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

溶解に先立ち、宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ライセートにおけるＤＢの最終濃度が、少なくとも約０．２％であり、塩が、ＭｇＳＯ_４またはＭｇＣｌ_２であり、上清における添加された塩の最終濃度が、少なくとも約１０ｍＭである、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

溶解に先立ち、宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ライセートにおけるＤＢの最終濃度が、少なくとも約０．２％であり、塩が、ＮａＣｌまたはＫＣｌであり、上清における添加された塩の最終濃度が、少なくとも約１００ｍＭである、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるＤＢの最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％以上である、請求項１７から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、ライセートにおけるＤＢの最終濃度が、約０．２％～０．４％または約０．２％～０．３％の範囲に及び、塩が、ＮａＣｌまたはＫＣｌであり、上清における添加された塩の最終濃度が、少なくとも約１００ｍＭもしくは少なくとも約２００ｍＭであるか、または約２００ｍＭ～約７００ｍＭの範囲に及ぶ、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、ライセートにおけるＤＢの最終濃度が、約０．２％～０．４％または約０．２％～０．３％の範囲に及び、塩が、ＮａＣｌまたはＫＣｌであり、上清における添加された塩の最終濃度が、少なくとも約１００ｍＭもしくは少なくとも約２００ｍＭであるか、または約２００ｍＭ～約７００ｍＭの範囲に及ぶ、請求項２８から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、少なくとも約０．３％であるか、または約０．３％～０．７％もしくは０．３５％～０．６５％もしくは０．４％～０．６％の範囲に及ぶか、または約 ０．５％である、請求項２７から３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．５％であり、ＤＢの最終濃度が、約０．３％である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

上清および塩溶液の混合物を濾過するステップをさらに含む、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

下流精製処理ステップを行うことにより、生物由来生成物を精製するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

上清および塩溶液の混合物が、下流精製処理ステップを行う前に、少なくとも３時間保持される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

生物由来生成物が、異種遺伝子を発現するための組換えウイルスベクターである、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

組換えウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

組換えウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

ＡＡＶベクターが、ＨＳＰＧと比較してシアル酸またはガラクトースにより強く結合するカプシドを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５またはＡＡＶ９カプシドを含む、請求項４２から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

下流精製処理ステップが、クロマトグラフィーを含む、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回またはそれを超えるクロマトグラフィー精製サイクルの後に、少なくとも５０％、６０％または７０％のＡＡＶベクター収率をもたらすのに有効である、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

少なくとも５回のクロマトグラフィー精製サイクルの後に、少なくとも５０％のＡＡＶベクター収率をもたらすのに有効である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィー、偽親和性クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーである、請求項４５から４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

親和性クロマトグラフィーが、免疫親和性クロマトグラフィーである、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

エンドヌクレアーゼが、ライセートに添加されない、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

塩が、凝結物から上清を分離するステップに先立ち添加されない、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

溶解に先立つ細胞懸濁液の体積が、少なくとも１００Ｌである、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法によって産生された生物由来生成物。

【請求項54】

アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターからなる群から選択される、異種遺伝子を発現するための組換えウイルスベクターである、請求項５３に記載の生物由来生成物。

【請求項55】

ＡＡＶベクターである、請求項５４に記載の生物由来生成物。

【請求項56】

請求項５５に記載のＡＡＶベクターを含む組成物。

【請求項57】

前記ＡＡＶベクター組成物におけるカプシドが、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％フルカプシドである、請求項５６に記載の組成物。

【請求項58】

約２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０ｐｇ／１×１０^９ｖｇ以下の宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項５６から５７のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２１日に出願された米国仮出願第６３／１９９，３６８号および２０２１年１１月１１日に出願された米国仮出願第６３／２６３，９２４号の利益を主張するものであり、これら仮出願のそれぞれの内容は、これにより、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

培養において維持された様々な種類の細胞は、所望の生成物を作製するための生物工場として機能することができる。そのような生成物は、改変されていない細胞によって作製された天然起源の化合物を含むが、細胞は、そのような細胞が通常産生できない、単純な分子およびより複雑な分子、さらにはウイルスのような超分子構造を産生するように、遺伝子操作技術を使用して改変することもできる。例として、ヒト成長ホルモンもしくはインスリン等の相対的に単純なタンパク質を発現するように操作されたプラスミドを細菌にトランスフェクトすること、または細胞が、酵素、凝固因子および抗体等のより複雑化されたタンパク質を産生するように導くことができる外来性遺伝物質で、酵母、哺乳類もしくは昆虫細胞等の真核細胞を形質転換することが挙げられる。この技術は、他の仕方では不可能となる、重要な医学的および産業的な用途を有する生物由来生成物の効率的な産生を可能にした。

【0003】

細胞によって作製された一部の生物由来生成物は、周囲の培地へと分泌され、この培地から、生成物を直接的に精製することができ、この際、細胞は典型的に廃棄されるであろう。しかし、他の場合では、所望の生物由来生成物は分泌されず、その代わりに、生細胞内に大部分がまたは完全に保持される。したがって、精製は、様々な仕方で細胞膜を破壊し、細胞の内容物が周囲の培地へとあふれ出すことを可能にすることを要求する。このアプローチは、保持された生物由来生成物を細胞から放出させるのに有効であるが、問題になっている生成物のための純度の一般的な標準に従うために１つまたは複数の下流処理ステップにおいて除去されなければならない、他の全ての細胞内容物も放出するという不利益を有する。例えば、哺乳類細胞は、多くの異なる種類の組換え生物学的製剤の産生に使用されており、米国食品医薬品局は、薬物製品中に存在し得る細胞由来夾雑物の最大量を規定するガイダンスを発行した。これらの厳密な標準に従うということは、生成物収率の観点から非効率的でありかつ実行するのに費用がかかる、複雑な精製スキームを要求し得る。

【0004】

ＦＤＡが限定することを求める細胞由来夾雑物の１つは、ＤＮＡであり、粗細胞ライセートから細胞由来ＤＮＡを除去するために様々なアプローチが開発された。一般的な方法は、下流処理ステップにおいてより容易に除去することができるかまたは依然として存在していたとしても薬物製品中で検出不能となり得る、より小型の断片へと細胞ＤＮＡを消化するように作用する、ベンゾナーゼ（Benzonase）等のエンドヌクレアーゼをライセートに添加することである。エンドヌクレアーゼは、高価な試薬であるが、下流で除去されなければならないライセート中の別の生物由来構成成分を表す。これらの不利益のため、粗ライセートから細胞由来ＤＮＡを除去するための他の戦略が開発された。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

エンドヌクレアーゼに頼らない、ライセートから細胞ＤＮＡを除去するためのアプローチは、ドミフェン臭化物（ＤＢ）等のカチオン性界面活性剤を十分な量で添加して、ＤＮＡを沈殿させることである。溶液から凝結物（flocculant）の塊として沈降させられる場合、沈殿したＤＮＡは、上清から容易に分離され得、これは次いで、１つまたは複数の下流精製ステップにおいてさらに処理され得る。このアプローチは、より少ない費用と共に、いずれかの下流ステップが実行される前の相当量の宿主細胞ＤＮＡの除去（エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを除去するのではなく、これをより小型の断片へと単純に消化する）の利点を享受する。しかし、本発明者らは、部分的に清澄化された上清中の残渣細胞ＤＮＡおよびカチオン性界面活性剤が反応し続け、懸濁液中に残って経時的な濁度の増加として検出することができる小型の凝集物を形成することができることを観察した。沈殿反応が十分な長さで進む場合、懸濁された粒子は、下流精製ステップにおいて使用されるクロマトグラフィーカラムを詰まらせ、生物由来生成物の収率が許容される値を下回る前に、新鮮なカラムが耐え得る実行サイクルの数を低減させる可能性がある。したがって、当技術分野において、界面活性剤による清澄化されたライセートにおける残渣ＤＮＡの望まれない沈殿を防止しつつ、カチオン性界面活性剤を用いた沈殿によって粗細胞ライセートから細胞ＤＮＡを除去するための改善された方法の必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、望ましい生物由来生成物を精製することを意図する下流処理ステップに干渉し得る残渣宿主細胞ＤＮＡのその後の沈殿を阻害しつつ、粗宿主細胞ライセートから宿主細胞ＤＮＡおよび他の夾雑物を除去するための新規方法、組成物およびシステムを提供することにより、当技術分野における必要に取り組む。ある特定の非限定的な実施形態において、そのような生成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。

【0007】

当業者であれば、本明細書に記載されている本開示の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するであろう、または単なるルーチン実験法を使用してこれを確かめることができるであろう。そのような均等物は、次の実施形態（Ｅ）によって包含されることが意図される。
Ｅ１．溶解された宿主細胞の試料から宿主細胞ＤＮＡを除去する方法であって、（ｉ）宿主細胞を溶解し、ライセートを産生するステップと、（ｉｉ）ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させ、凝結物および上清を産生するステップと、（ｉｉｉ）凝結物から上清を分離するステップと、（ｉｖ）上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するステップと、場合により（ｖ）宿主細胞によって産生された生物由来生成物を精製するステップとを含む方法。
Ｅ２．宿主細胞が、機械的に、浸透圧的に、化学的にまたは酵素的に溶解される、Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．宿主細胞が、育成培地等の生理的に適合性の流体に懸濁され、細胞溶解を引き起こすのに十分な濃度の界面活性剤を含む溶液を細胞懸濁液に添加することにより化学的に溶解される、Ｅ１またはＥ２に記載の方法。
Ｅ４．宿主細胞が、基材における接着細胞培養として育成または維持され、細胞溶解を引き起こすのに十分な濃度の界面活性剤を含む溶液と接触させることにより化学的に溶解されるか、または先ず基材から剥離され、生理的に適合性の流体に懸濁され、そこに、界面活性剤溶液が添加される、Ｅ１またはＥ２に記載の方法。
Ｅ５．界面活性剤が、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤または双性イオン性界面活性剤である、Ｅ３またはＥ４に記載の方法。
Ｅ６．非イオン性界面活性剤が、アルキルフェノールエトキシレート、４－アルキルフェノールエトキシレート、オクチルフェノールエトキシレート、４－オクチルフェノールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、４－ノニルフェノールエトキシレート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｔｗｅｅｎ ２０およびＴｗｅｅｎ ８０からなる界面活性剤化合物の群から選択される、Ｅ５に記載の方法。
Ｅ７．溶解に先立ち、生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとももしくは約８×１０^６、９×１０^６、１０×１０^６、１１×１０^６、１２×１０^６、１３×１０^６、１４×１０^６、１５×１０^６、１６×１０^６、１７×１０^６、１８×１０^６、１９×１０^６、２０×１０^６、２１×１０^６、２２×１０^６、２３×１０^６、２４×１０^６、２５×１０^６、２６×１０^６、２７×１０^６、２８×１０^６、２９×１０^６もしくは３０×１０^６個の、１ｍＬ当たりの生細胞数（ｖｃ／ｍＬ）もしくはそれを超える、または約８×１０^６～１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１５×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬもしくは１８×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の範囲である、Ｅ３～Ｅ６に記載の方法。
Ｅ８．宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞もしくはＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞、またはＳｆ９細胞もしくはＳｆ１細胞等の昆虫細胞である、Ｅ１～Ｅ７に記載の方法。
Ｅ９．宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、Ｅ１～Ｅ８に記載の方法。
Ｅ１０．ライセートにおける界面活性剤の最終濃度が、少なくとももしくは約０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％、０．２５％、０．３０％、０．３５％、０．４０％、０．４５％、０．５０％、０．５５％、０．６０％、０．６５％、０．７０％、０．７５％、０．８０％、０．８５％、０．９０％、０．９５％、１．００％、２．００％、３．００％、４．００％もしくは５．００％、または約０．０５％～５．００％、０．１０％～２．５０％、０．２０％～１．２５％、０．２０％～０．７５％、０．２５％～０．７５％、０．２５％～０．６５％、０．２０％～０．７０％、０．３０％～０．７０％、０．３５％～０．６５％、０．４０％～０．６０％もしくは０．４５％～０．５５％等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の濃度の範囲である、Ｅ３～Ｅ９に記載の方法。
Ｅ１１．界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である、Ｅ３～Ｅ１０に記載の方法。
Ｅ１２．溶解に先立ち、生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、少なくとも約０．３０％である、Ｅ１１に記載の方法。
Ｅ１３．溶解に先立ち、生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり少なくとも約０．０１０％である、Ｅ１１に記載の方法。
Ｅ１４．溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０６０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２３％～０．０７０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２４％～０．０４０％、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０２８％～０．０４７％である、Ｅ１１に記載の方法。
Ｅ１５． 溶解時における細胞懸濁液の体積が、少なくとももしくは約２リットル（Ｌ）、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、１５００Ｌ、２０００Ｌもしくはそれを超える、または２Ｌ～１００Ｌ、５０Ｌ～５００Ｌ、５００Ｌ～１０００Ｌ、５００Ｌ～１５００Ｌ、１０００Ｌ～１５００Ｌもしくは５００Ｌ～２０００Ｌ等、前述の値のいずれかを含めたそれらの間の範囲であり、これは、一部の実施形態では、タンク、バッグまたはバイオリアクター等の容器内に封入されている、Ｅ３～Ｅ１４に記載の方法。
Ｅ１６．一部の実施形態では、少なくとももしくは約５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、７５分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１５分間、１２０分間、１５０分間、１８０分間、または前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の時間の範囲にわたり行うことができる、細胞懸濁液および界面活性剤溶液を混合するステップをさらに含む、Ｅ３～Ｅ１５に記載の方法。
Ｅ１７．ライセートにおける宿主細胞ＤＮＡが、宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに十分な濃度でアルキル－ジメチル－（２－フェノキシエチル）アザニウム（azanium）ハロゲン化物を含む溶液をライセートに添加することにより沈殿され、一部の実施形態では、アルキル－ジメチル－（２－フェノキシエチル）アザニウムハロゲン化物が、ドミフェン臭化物、ドミフェン塩化物またはドミフェンヨウ化物等のドミフェンハロゲン化物である、Ｅ３～Ｅ１６に記載の方法。
Ｅ１８．ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、少なくとももしくは約０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％、０．２５％、０．３０％、０．３５％、０．４０％、０．４５％もしくは０．５０％、または０．１０％～０．５０％、０．１０％～０．４０％、０．１０％～０．３０％、０．１０％～０．２０％、０．１５％～０．４５％、０．２０％～０．５０％、０．２０％～０．４０％、０．２０％～０．３０％、０．２５％～０．３５％、０．２５％～０．４５％、０．３０％～０．５０％、０．３０％～０．４０％もしくは０．４０％～０．５０％等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の濃度の範囲である、Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ１９．溶解に先立ち、生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、少なくとも約０．２０％である、Ｅ１７またはＥ１８に記載の方法。
Ｅ２０．溶解に先立ち、生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり少なくとも０．００７％である、Ｅ１７またはＥ１８に記載の方法。
Ｅ２１．溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の範囲に及ぶ、Ｅ１７またはＥ１８に記載の方法。
Ｅ２２．溶解に先立ち、生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、少なくとも約０．３０％であり、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、少なくとも約０．２０％である、Ｅ１７またはＥ１８に記載の方法。
Ｅ２３．溶解に先立ち、生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり、溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり少なくとも約０．０１０％であり、溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり少なくとも０．００７％である、Ｅ１７またはＥ１８に記載の方法。
Ｅ２４．溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００９％、０．００８％または０．００７％以上である、Ｅ１７またはＥ１８に記載の方法。
Ｅ２５．ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．３％～０．７％の範囲に及び、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の濃度に対する比が、約０．１００～０．３３３、０．１５０～０．５００、０．２００～０．６６７、０．２５０～０．８３３、０．３００～１．０００、０．３５０～１．１６７、０．４００～１．３３３、０．４５０～１．５００、０．５００～１．６６７、０．５５０～１．８３３、０．６００～２．０００、０．１００～０．２５０、０．１５０～０．３７５、０．２００～０．５００、０．２５０～０．６２５、０．３００～０．７５０、０．３５０～０．８７５、０．４００～１．０００、０．４５０～１．１２５、０．５００～１．２５０、０．５５０～１．３７５、０．６００～１．５００、０．１００～０．２００、０．１５０～０．３００、０．２００～０．４００、０．２５０～０．５００、０．３００～０．６００、０．３５０～０．７００、０．４００～０．８００、０．４５０～０．９００、０．５００～１．０００、０．５５０～１．１００、０．６００～１．２００、０．１００～０．１６７、０．１５０～０．２５０、０．２００～０．３３３、０．２５０～０．４１７、０．３００～０．５００、０．３５０～０．５８３、０．４００～０．６６７、０．４５０～０．７５０、０．５００～０．８３３、０．５５０～０．９１７、０．６００～１．０００、０．１００～０．１４３、０．１５０～０．２１４、０．２００～０．２８６、０．２５０～０．３５７、０．３００～０．４２９、０．３５０～０．５００、０．４００～０．５７１、０．４５０～０．６４３、０．５００～０．７１４、０．５５０～０．７８６または０．６００～０．８５７の範囲に及ぶ、Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ２６．ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．４％～０．６％の範囲に及び、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の濃度に対する比が、約０．１５０～０．３７５、０．２００～０．５００、０．２５０～０．６２５、０．３００～０．７５０、０．３５０～０．８７５、０．４００～１．０００、０．４５０～１．１２５、０．１５０～０．３００、０．２００～０．４００、０．２５０～０．５００、０．３００～０．６００、０．３５０～０．７００、０．４００～０．８００、０．４５０～０．９００、０．１５０～０．２５０、０．２００～０．３３３、０．２５０～０．４１７、０．３００～０．５００、０．３５０～０．５８３、０．４００～０．６６７または０．４５０～０．７５０の範囲に及ぶ、Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ２７．ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．４％であり、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の濃度に対する比が、約０．１５０～０．３７５、０．２００～０．５００、０．２５０～０．６２５、０．３００～０．７５０、０．３５０～０．８７５、０．４００～１．０００もしくは０．４５０～１．１２５の範囲に及ぶか；またはライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．５％であり、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の濃度に対する比が、約０．１５０～０．３００、０．２００～０．４００、０．２５０～０．５００、０．３００～０．６００、０．３５０～０．７００、０．４００～０．８００もしくは０．４５０～０．９００の範囲に及ぶか；またはライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．６％であり、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の濃度に対する比が、約０．１５０～０．２５０、０．２００～０．３３３、０．２５０～０．４１７、０．３００～０．５００、０．３５０～０．５８３、０．４００～０．６６７もしくは０．４５０～０．７５０の範囲に及ぶ、Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ２８．溶解に先立つ生細胞密度が、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬまたは１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．３５％～０．６５％または０．４％～０．６％の範囲に及び、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、約０．１５％～０．４５％、０．２％～０．３％または０．２％～０．４％の範囲に及ぶ、Ｅ１７、Ｅ１８およびＥ２２に記載の方法。
Ｅ２９．溶解に先立つ生細胞密度が、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．４％～０．６％の範囲に及び、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、約０．２％～０．３％または０．２％～０．４％の範囲に及ぶ、Ｅ１７、Ｅ１８およびＥ２２に記載の方法。
Ｅ３０．溶解に先立つ生細胞密度が、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．５％であり、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、約０．２％～０．３％または０．２％～０．４％の範囲に及ぶ、Ｅ１７、Ｅ１８およびＥ２２に記載の方法。
Ｅ３１．宿主細胞が、ＡＡＶベクターを産生し、上清から精製されたＡＡＶベクターを含む薬物物質における残渣宿主細胞ＤＮＡの量が、１×１０^９ベクターゲノム当たり約１００、９０、８０、７０、６０または５０ピコグラム（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）未満である、Ｅ１～Ｅ３０に記載の方法。
Ｅ３２．アルキル－ジメチル－（２－フェノキシエチル）アザニウムハロゲン化物が、ドミフェン臭化物（ＤＢ）である、Ｅ１７～Ｅ３１に記載の方法。
Ｅ３３．一部の実施形態では、少なくとももしくは約５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、７５分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１５分間、１２０分間、１５０分間、１８０分間、または前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の時間の範囲にわたり行うことができる、ライセートおよびドミフェンハロゲン化物溶液を混合するステップをさらに含む、Ｅ１７～Ｅ３２に記載の方法。
Ｅ３４．凝結物を、ライセートを保持する容器の底に重力の影響下で沈降させることにより、上清が、凝結物から分離され、沈降した凝結物の下層および上清の上層を形成する、Ｅ１～Ｅ３３に記載の方法。
Ｅ３５．凝結物が、少なくとももしくは約０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、または前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の時間の範囲にわたり沈降させられる、Ｅ３４に記載の方法。
Ｅ３６．ライセートを保持する容器を遠心分離することにより、上清が、凝結物から分離され、上清から分離された凝結物のペレットを形成する、Ｅ１～Ｅ３３に記載の方法。
Ｅ３７．ポンピング等により上清が容器から除去され、凝結物を容器内に残す、Ｅ３４～Ｅ３６に記載の方法。
Ｅ３８．上清を除去した後に、一部の実施形態では、約１００μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２５μｍ、２０μｍ、１５μｍ、１０μｍ、５μｍ、２μｍ、１μｍまたは０．５μｍ以下の名目上の保持評定を有するデプスフィルターを使用して行うことができる、深層濾過等により、上清が濾過される、Ｅ３７に記載の方法。
Ｅ３９．ドミフェンハロゲン化物による上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿が、ドミフェンハロゲン化物による宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに十分な濃度の塩を含む溶液を上清に添加することにより阻害される、Ｅ１７～Ｅ３８に記載の方法。
Ｅ４０．塩溶液が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等の界面活性剤をさらに含む、Ｅ３９に記載の方法。
Ｅ４１．塩が、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）または塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）である、Ｅ３９に記載の方法。
Ｅ４２．上清における添加された塩の最終濃度が、少なくともまたは約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、２７５ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭ、７００ｍＭ、７５０ｍＭまたは８００ｍＭである、Ｅ３９～Ｅ４１に記載の方法。
Ｅ４３．溶解に先立ち、生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、少なくとも約０．２０％であり、塩が、ＮａＣｌまたはＫＣｌであり、上清における添加された塩の最終濃度が、少なくとも約１００ｍＭである、Ｅ３９～Ｅ４２に記載の方法。
Ｅ４４．溶解に先立ち、生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、少なくとも約０．２０％であり、塩が、ＭｇＳＯ_４またはＭｇＣｌ_２であり、上清における添加された塩の最終濃度が、少なくとも約１０ｍＭである、Ｅ３９～Ｅ４２に記載の方法。
Ｅ４５．溶解に先立ち、生理的に適合性の流体における宿主細胞の生細胞密度が、少なくとも１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり少なくとも０．００７％であり、（ｉ）塩が、ＮａＣｌもしくはＫＣｌであり、上清における添加された塩の最終濃度が、少なくとも約１００ｍＭであるか、または（ｉｉ）塩が、ＭｇＳＯ_４もしくはＭｇＣｌ_２であり、上清における添加された塩の最終濃度が、少なくとも約１０ｍＭである、Ｅ３９～Ｅ４２に記載の方法。
Ｅ４６．溶解に先立つ生細胞密度に対するライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％以上である、Ｅ４３～Ｅ４５に記載の方法。
Ｅ４７．溶解に先立つ生細胞密度が、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及ぶ、Ｅ４３またはＥ４４に記載の方法。
Ｅ４８．溶解に先立つ生細胞密度が、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及ぶ、Ｅ４３またはＥ４４に記載の方法。
Ｅ４９．ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の最終濃度が、約０．２％～０．５％、０．２％～０．４％または０．２％～０．３％の範囲に及ぶ、Ｅ４３、Ｅ４４、Ｅ４７またはＥ４８に記載の方法。
Ｅ５０．界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、少なくとも約０．３０％である、Ｅ４３またはＥ４４またはＥ４７～Ｅ４９に記載の方法。
Ｅ５１．界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度が、約０．３％～０．７％、０．３５％～０．６５％、０．４％～０．６％の範囲に及ぶか、または約０．５％である、Ｅ４３またはＥ４４またはＥ４７～Ｅ５０に記載の方法。
Ｅ５２．溶解に先立つ生細胞密度が、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、ライセートにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の濃度が、約０．５％であり、ライセートにおけるドミフェンハロゲン化物の濃度が、約０．２％～０．３％または０．２％～０．４％の範囲である、Ｅ４３またはＥ４４またはＥ４７～Ｅ５１に記載の方法。
Ｅ５３．塩が、ＮａＣｌまたはＫＣｌであり、上清における添加された塩の最終濃度が、約１００ｍＭ～３００ｍＭ、１００ｍＭ～３５０ｍＭ、１００ｍＭ～４００ｍＭ、１００ｍＭ～４５０ｍＭ、１００ｍＭ～５００ｍＭ、１００ｍＭ～５５０ｍＭ、１００ｍＭ～６００ｍＭ、１００ｍＭ～６５０ｍＭ、１００ｍＭ～７００ｍＭ、１００ｍＭ～７５０ｍＭ、１００ｍＭ～８００ｍＭ、１５０ｍＭ～３００ｍＭ、１５０ｍＭ～３５０ｍＭ、１５０ｍＭ～４００ｍＭ、１５０ｍＭ～４５０ｍＭ、１５０ｍＭ～５００ｍＭ、１５０ｍＭ～５５０ｍＭ、１５０ｍＭ～６００ｍＭ、１５０ｍＭ～６５０ｍＭ、１５０ｍＭ～７００ｍＭ、１５０ｍＭ～７５０ｍＭ、１５０ｍＭ～８００ｍＭ、２００ｍＭ～３００ｍＭ、２００ｍＭ～３５０ｍＭ、２００ｍＭ～４００ｍＭ、２００ｍＭ～４５０ｍＭ、２００ｍＭ～５００ｍＭ、２００ｍＭ～５５０ｍＭ、２００ｍＭ～６００ｍＭ、２００ｍＭ～６５０ｍＭ、２００ｍＭ～７００ｍＭ、２００ｍＭ～７５０ｍＭ、２００ｍＭ～８００ｍＭ、２５０ｍＭ～３００ｍＭ、２５０ｍＭ～３５０ｍＭ、２５０ｍＭ～４００ｍＭ、２５０ｍＭ～４５０ｍＭ、２５０ｍＭ～５００ｍＭ、２５０ｍＭ～５５０ｍＭ、２５０ｍＭ～６００ｍＭ、２５０ｍＭ～６５０ｍＭ、２５０ｍＭ～７００ｍＭ、３００ｍＭ～４００ｍＭ、３００ｍＭ～４５０ｍＭ、３００ｍＭ～５００ｍＭ、３００ｍＭ～５５０ｍＭ、３００ｍＭ～６００ｍＭ、３００ｍＭ～６５０ｍＭ、３００ｍＭ～７００ｍＭ、３５０ｍＭ～４００ｍＭ、３５０ｍＭ～４５０ｍＭ、３５０ｍＭ～５００ｍＭ、３５０ｍＭ～５５０ｍＭ、３５０ｍＭ～６００ｍＭ、３５０ｍＭ～６５０ｍＭ、３５０ｍＭ～７００ｍＭ、４００～５００ｍＭ、４００～５５０ｍＭ、４００～６００ｍＭ、４００～６５０ｍＭ、４５０～５００ｍＭ、４５０～５５０ｍＭ、４５０～６００ｍＭまたは４５０～６５０ｍＭの範囲である、Ｅ３９～Ｅ５２に記載の方法。
Ｅ５４．一部の実施形態では、少なくとももしくは約５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、７５分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１５分間、１２０分間、１５０分間、１８０分間、または前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の時間の範囲にわたり行うことができる、上清および塩溶液を混合するステップをさらに含む、Ｅ３９～Ｅ５３に記載の方法。
Ｅ５５．上清を分離するステップと、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するために塩溶液を上清に添加するステップの間の期間が、約１２時間、６時間、３時間、２時間、１時間、４５分間、３０分間、１５分間、１０分間、５分間未満、またはそれに満たない、Ｅ３９～Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５６．上清および塩溶液が、バッチにおいて混合される、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５７．上清および塩溶液が、連続的に混合される、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５８．上清および塩溶液の混合物を濾過するステップをさらに含む、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５９．濾過するステップが、約１０μｍ、５μｍ、２μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．２μｍまたは０．１μｍ以下の平均ポアサイズを有する膜フィルターを使用して行われる、Ｅ５８に記載の方法。
Ｅ６０．少なくとも１つの下流処理ステップにおいて、上清および塩溶液の混合物から生物由来生成物を精製するステップをさらに含む、Ｅ５４～Ｅ５９に記載の方法。
Ｅ６１．塩溶液を上清に添加するステップと、生物由来生成物を精製するステップの間の期間が、約７２時間、４８時間、３６時間、２４時間、１２時間、９時間、６時間、３時間、２時間、９０分間、６０分間、４５分間、３０分間、１５分間もしくは１０分間未満、またはそれに満たない、Ｅ６０に記載の方法。
Ｅ６２．宿主細胞によって産生された生物由来生成物が、組換えである、Ｅ１～Ｅ６１に記載の方法。
Ｅ６３．宿主細胞によって産生された生物由来生成物が、ウイルス粒子である、Ｅ１～Ｅ６１に記載の方法。
Ｅ６４．ウイルス粒子が、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、レトロウイルス粒子またはレンチウイルス粒子である、Ｅ６３に記載の方法。
Ｅ６５．ウイルス粒子が、異種遺伝子を発現するように改変され、ウイルスベクターを形成する、Ｅ６３またはＥ６４に記載の方法。
Ｅ６６．ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、Ｅ６５に記載の方法。
Ｅ６７．ＡＡＶベクターが、ＨＳＰＧと比較してシアル酸またはガラクトースにより強く結合するカプシドを含む、Ｅ６６に記載の方法。
Ｅ６８．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５またはＡＡＶ９カプシドを含む、Ｅ６６またはＥ６７に記載の方法。
Ｅ６９．下流処理ステップが、クロマトグラフィーを含む、Ｅ６０またはＥ６１に記載の方法。
Ｅ７０．クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、偽親和性（pseudoaffinity）クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーである、Ｅ６９に記載の方法。
Ｅ７１．生物由来生成物が、ＡＡＶベクターであり、方法が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回またはそれを超えるクロマトグラフィー精製サイクルの後に、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のＡＡＶベクター収率を達成するのに有効である、Ｅ６９またはＥ７０に記載の方法。
Ｅ７２．少なくとも５回のクロマトグラフィー精製サイクルの後に、少なくとも５０％のＡＡＶベクター収率を達成するのに有効である、Ｅ７１に記載の方法。
Ｅ７３．クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィーである、Ｅ７０～Ｅ７２に記載の方法。
Ｅ７４．クロマトグラフィーが、免疫親和性クロマトグラフィーである、Ｅ７３に記載の方法。
Ｅ７５．ＡＡＶベクターが、ＨＳＰＧと比較してシアル酸またはガラクトースにより強く結合するカプシドを含む、Ｅ７１～Ｅ７４に記載の方法。
Ｅ７６．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５またはＡＡＶ９カプシドを含む、Ｅ７１またはＥ７４に記載の方法。
Ｅ７７．Ｅ１～Ｅ７６に記載の方法によって産生された生物由来生成物。
Ｅ７８．ウイルスベクターである、Ｅ７７に記載の生物由来生成物。
Ｅ７９．ＡＡＶベクターである、Ｅ７７に記載の生物由来生成物。
Ｅ８０．Ｅ１～Ｅ７６に記載の方法によって産生された生物由来生成物を含む組成物。
Ｅ８１．前記生物由来生成物が、ウイルスベクターである、Ｅ８０に記載の組成物。
Ｅ８２．前記生物由来生成物が、ＡＡＶベクターである、Ｅ８０に記載の組成物。
Ｅ８３．前記組成物におけるＡＡＶベクターのカプシドが、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％フル（full）である、Ｅ８２に記載の組成物。
Ｅ８４．約２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０ｐｇ／１×１０^９ｖｇ以下の宿主細胞ＤＮＡを含む、Ｅ８２またはＥ８３に記載の組成物。
Ｅ８５．Ｅ３９～Ｅ５９に記載の方法によって産生された上清および塩溶液の混合物であって、混合物の濁度が、約１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０または５以下のネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）である、混合物。
Ｅ８６．Ｅ３９～Ｅ５９のいずれかに記載の方法を行うためのシステムであって、（ｉ）上清を含有するための手段と、（ｉｉ）塩溶液を含有するための手段と、（ｉｉｉ）上清および塩溶液を混合するための手段とを含むシステム。
Ｅ８７．それぞれの容器手段から混合手段への流体連絡のための手段をさらに含む、Ｅ８６に記載のシステム。
Ｅ８８．上清および塩溶液を、これらそれぞれの容器手段から、流体連絡手段を通してポンピングするための手段をさらに含む、Ｅ８７に記載のシステム。
Ｅ８９．前記混合手段が、静的インライン混合手段である、Ｅ８６～Ｅ８８に記載のシステム。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１は、ドミフェン臭化物（ＤＢ）が、ＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされた界面活性剤溶解ＨＥＫ２９３細胞から宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣ－ＤＮＡ）を沈殿させる、濃度依存性を説明する。ライセートにおける最終ＤＢ濃度（％ｗ／ｗ）をｘ軸に示す。１ｍＬ当たりのゲノムにおけるベクタータイターを左のｙ軸に示し、１Ｅ１４ ＶＧ当たりのナノグラム数として正規化された宿主細胞ＤＮＡの濃度を右のｙ軸に示す。宿主細胞ＤＮＡおよびベクターの両方をｑＰＣＲによって定量化した。傾向線を作成するために、個々のデータ点を、ベクタータイターのための多項式、および宿主細胞ＤＮＡ濃度のための指数方程式にフィットさせた。

【図2-1】図２Ａは、ドミフェン臭化物（ＤＢ）が、ＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされた界面活性剤溶解ＨＥＫ２９３細胞から宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣ－ＤＮＡ）を沈殿させる、濃度依存性を説明する。ライセートにおける最終ＤＢ濃度（％ｗ／ｗ）をｘ軸に示す。１ｍＬ当たりのゲノムにおけるベクタータイターを左のｙ軸に示し、ＶＧ当たりのピコグラム数として正規化された宿主細胞ＤＮＡの濃度を右のｙ軸に示す。宿主細胞ＤＮＡおよびベクターの両方をｑＰＣＲによって定量化した。傾向線を作成するために、個々のデータ点を一次方程式にフィットさせた。

【図2-2】図２Ｂは、ＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶解ＨＥＫ２９３細胞が、宿主細胞ＤＮＡおよびベクターをライセートへと放出する、濃度依存性を説明する。ライセートにおける最終Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００濃度（％ｗ／ｗ）をｘ軸に示す。１ｍＬ当たりのゲノムにおけるベクタータイターを左のｙ軸に示し、ＶＧ当たりのピコグラム数として正規化された宿主細胞ＤＮＡの濃度を右のｙ軸に示す。宿主細胞ＤＮＡおよびベクターの両方をｑＰＣＲによって定量化した。傾向線を作成するために、個々のデータ点を一次方程式にフィットさせた。

【図3】図３は、ＮａＣｌが、ＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートにおける、残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる進行中の沈殿を阻害する、時間および濃度依存性を説明する。沈殿は、経時的な濁度の増加として検出し、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表した。

【図4】図４は、ＮａＣｌが、ＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートにおける、残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる進行中の沈殿を阻害する、時間および濃度依存性を説明する。沈殿は、経時的な濁度の増加として検出し、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表した。

【図5-1】図５Ａは、ＮａＣｌが、ＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートにおける、残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる進行中の沈殿を阻害する、時間および濃度依存性を説明する。沈殿は、経時的な濁度の増加として検出し、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表した。

【図5-2】図５Ｂは、ＭｇＳＯ_４、ならびにナトリウムカチオンならびに異なる無機および有機アニオンを含む塩が、ＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートにおける、残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる進行中の沈殿を阻害する、時間および濃度依存性を説明する。沈殿は、経時的な濁度の増加として検出し、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表した。

【図5-3】図５Ｃは、グリシン、ならびに塩化物および異なるカチオン（anion）を含む塩が、ＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートにおける、残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる進行中の沈殿を阻害する、時間および濃度依存性を説明する。沈殿は、経時的な濁度の増加として検出し、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表した。

【図5-4】図５Ｄは、最も強力な塩が、ＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートにおける、残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる進行中の沈殿を阻害する、時間および濃度依存性を説明する。沈殿は、経時的な濁度の増加として検出し、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表した。

【図6-1】図６Ａは、時間およびイオン強度（伝導率によって測定される）の間の関係性、ならびにＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートにおける、残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる進行中の沈殿の阻害を説明する。沈殿は、経時的な濁度の増加として検出し、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表した。複数の塩に関する伝導率、および濁度におけるそれらの効果は、実験０日目（すなわち、初日）に決定した。図６Ｂは、時間およびイオン強度（伝導率によって測定される）の間の関係性、ならびにＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートにおける、残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる進行中の沈殿の阻害を説明する。沈殿は、経時的な濁度の増加として検出し、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表した。複数の塩に関する伝導率、および濁度におけるそれらの効果は、１日目に決定した。

【図6-2】図６Ｃは、時間およびイオン強度（伝導率によって測定される）の間の関係性、ならびにＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートにおける、残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる進行中の沈殿の阻害を説明する。沈殿は、経時的な濁度の増加として検出し、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表した。複数の塩に関する伝導率、および濁度におけるそれらの効果は、２日目に決定した。図６Ｄは、時間およびイオン強度（伝導率によって測定される）の間の関係性、ならびにＡＡＶ９に基づくベクターを産生するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートにおける、残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる進行中の沈殿の阻害を説明する。沈殿は、経時的な濁度の増加として検出し、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表した。複数の塩に関する伝導率、および濁度におけるそれらの効果は、３日目に決定した。

【図7-1】図７Ａは、４Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む溶液として本明細書に例証される沈殿阻害剤を、界面活性剤で溶解され、宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるための薬剤で処理された宿主細胞由来の清澄化されたライセートと連続的に混合するためのシステムを説明する。

【図7-2】図７Ｂは、４Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む溶液として本明細書に例証される沈殿阻害剤を、界面活性剤で溶解され、宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるための薬剤で処理された宿主細胞由来の清澄化されたライセートとバッチ混合するためのシステムを説明する。

【図7-3】図７Ｃは、４Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む溶液として本明細書に例証される沈殿阻害剤を、界面活性剤で溶解され、宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるための薬剤で処理された宿主細胞由来の清澄化されたライセートと連続的に混合するためのシステムを説明する。

【図8】図８は、ドミフェン臭化物による残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するために塩処理されていない、清澄化された細胞ライセートからＡＡＶ９に基づくベクターを精製する、５サイクルにわたる免疫親和性クロマトグラフィーカラムの性能を説明するクロマトグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0009】

ベンゾナーゼ等のエンドヌクレアーゼの使用に頼ることなく、粗宿主細胞ライセートから宿主細胞ＤＮＡを除去するために有用に用いることができる、様々な方法、組成物およびシステムの例示的な非限定的な実施形態を詳細に後述する。これらの実施形態のいくつかは、その例がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、宿主細胞によって作製された所望の生物由来生成物を少なくとも部分的に精製することを意図した下流ステップの効率を低減させることが観察された、清澄化されたライセートにおける残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するさらなる利点を提供する。本明細書に記載されている方法の利点は、外因的に添加されたエンドヌクレアーゼを使用しない、宿主細胞ＤＮＡの有効な除去であるが、そのような酵素の使用は、所望される場合、方法のある特定の実施形態において除外されない。

【0010】

ある特定の実施形態において、本開示は、所望の生物由来生成物を産生した宿主細胞の調製物または試料を溶解し、細胞から放出された宿主細胞ＤＮＡの少なくとも一部分を沈殿させて、凝結物および上清を形成し、凝結した宿主細胞ＤＮＡから上清の少なくとも一部を分離し、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害する方法を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、溶解される前に、所望の生物由来生成物の産生に十分な時間および条件下で、培養において育成または維持される。他の実施形態では、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿が阻害された後に、所望の生物由来生成物は、上清から少なくとも部分的に精製される。

【0011】

宿主細胞
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、所望の生物由来生成物のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に適したまたは適応された細胞を意味する。宿主細胞は、多くの場合、老化が成長を停止する前に複数の世代にわたり分裂することができるクローナル細胞株である、またはさらには不死であってもよい。本開示の方法における使用のため、宿主細胞は、特異的生物由来生成物の宿主細胞における生合成を導くように設計された外因的遺伝情報の導入により、一過的にまたは非一過的に改変することができる。例えば、宿主細胞に、タンパク質または調節性ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ等）をコードする核酸塩基配列を含有する核酸をトランスフェクトすることができる。一部の実施形態では、核酸は、コード配列が、ｍＲＮＡを産生するための細胞の転写およびスプライシング機構が作用し得るプロモーターおよびエンハンサー等の転写調節性エレメントの制御下に置かれた、プラスミド等のＤＮＡである。他の実施形態では、核酸は、タンパク質へと直接的に翻訳され得る、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり得る。

【0012】

ＤＮＡまたはＲＮＡを宿主細胞にトランスフェクトするための様々な仕方が当技術分野で公知である。そのようなものは、リン酸カルシウムまたはカチオン性有機化合物、例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリブレン、シクロデキストリン、カチオン性脂質、および当技術分野で公知のその他を含む、核酸と複合体形成して細胞内に吸収され得る、ある特定の化合物とＤＮＡまたはＲＮＡを混合するステップを限定することなく含む。トランスフェクションは、エレクトロポレーションおよびよりエキゾチックな技術、例えば、微粒子銃による粒子送達により、非化学的に行うこともできる。当技術分野で公知の通り、トランスフェクションは、一過的または安定的であり得る。一過的トランスフェクションにより、トランスフェクトされたＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞内に限られた期間存在し、ＤＮＡの場合、ゲノムに組み込まれない。安定的トランスフェクションにより、細胞に導入されたＤＮＡは、エピソームプラスミドとして、または染色体に組み込まれて、長期間持続することができる。通常、安定的にトランスフェクトされた細胞を産生するために、選択マーカーと共に、所望の生物由来生成物を発現するための遺伝子（単数または複数）を含有するプラスミドが細胞にトランスフェクトされ、次いで細胞を、選択圧下で、すなわち、トランスフェクトされていない細胞、またはその選択マーカーを含む外因的ＤＮＡが何らかの理由で失われたトランスフェクトされた細胞を死滅させる条件下で育成および維持する。例えば、プラスミドは、抗生物質抵抗性遺伝子を含有することができ、トランスフェクトされた細胞は、細胞が育成されている培地に抗生物質を添加することにより選択することができる。一部の実施形態では、安定的にトランスフェクトされた宿主細胞に導入された生物由来生成物を産生するための遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下に置かれ、プロモーターを誘導する、薬物、金属イオンまたは温度増加等の環境因子が、細胞が育成される際に導入されない限り、発現されないか、またはごく低レベルで発現される。

【0013】

他の実施形態では、宿主細胞ゲノムは、所望の生物由来生成物、その構成成分、またはそのような生成物の生合成に必要な他の遺伝子産物を産生するように宿主細胞を導くために、ノックイン等の遺伝子操作方法または遺伝子編集方法を使用して、非一過的かつ標的化された様式で改変することができる。本発明は、宿主細胞が作成される様式によって限定されない。形質導入により所望の生物由来生成物の産生を導く目的で、外来性遺伝子を宿主細胞に導入することもでき、それによると、宿主細胞は、そのような遺伝子を含有する改変されたウイルス（すなわち、ベクター）に感染される。そのような目的に有用なウイルスベクターの例として、アデノウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、バキュロウイルス、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスが挙げられ、その他も可能である。

【0014】

宿主細胞は、所望の生物由来生成物を生合成する目的に有用であることが当技術分野で公知である、いずれかの型の細胞であり得る。宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、または真核細胞、例えば、真菌細胞、例えば、酵母細胞、例えば、植物細胞または例えば、動物細胞、例えば、昆虫細胞またはラット、マウスもしくはヒト細胞を含む哺乳類細胞であり得る。一部の実施形態では、本開示の方法において有用な宿主細胞は、哺乳類宿主細胞であり、その例として、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞（およびＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３ＦＴ細胞等、ＨＥＫ２９３細胞のバリアント）、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＨＴ－１０８０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、Ｃ１２７細胞、ＡＧＥ１．ＨＮ細胞、ＣＡＰ細胞、ＨＫＢ－１１細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞が挙げられ、多くのその他も可能である。一部の実施形態では、本開示の方法において有用な宿主細胞は、昆虫宿主細胞であり、その例として、Ｓｆ９細胞、ＥｘｐｉＳｆ９、Ｓｆ２１細胞、Ｓ２細胞、Ｄ．Ｍｅｌ２細胞、Ｔｎ－３６８細胞またはＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂ１－４細胞が挙げられ、多くのその他も可能である。

【0015】

生物由来生成物を産生する目的で、宿主細胞は、多くの場合、その相対的に高い密度までの成長および所望の生物由来生成物の生合成を促す制御された条件下で培養において育成または維持される。例えば、宿主細胞は、細胞成長および生合成に必要な全ての栄養素を提供する規定された化学組成の液体培地において育成することができる。例示的な培地は、哺乳類宿主細胞のためのＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、およびある特定の昆虫細胞のためのＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ、Ｓｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ、Ｓｆ－９００ ＩＩＩまたはＥｘｐｉＳｆ ＣＤを含む。そのような培地は、抗生物質、成長因子または使用されている特定の型の細胞の成長を刺激することが公知であるサイトカイン（組換えにより産生されるか、またはＦＢＳ等の動物血清中に存在する）、ならびに所望の生物由来生成物の最適な生合成および／または活性に要求され得るが、それ以外の状況では限定的な供給の他の成分を補充することができる。例示的なサプリメントは、必須アミノ酸、グルタミン、ビタミンＫ、インスリン、ＢＳＡまたはトランスフェリンを含む。育成培地に加えて、ｐＨ、温度ならびにＣＯ_２および酸素濃度等、細胞の成長および／または生産性を最適化するための他の培養条件を制御することができる。

【0016】

培養における宿主細胞は、撹拌タンクバイオリアクター、ウェーブ（wave）バッグ、スピナフラスコ、ホローファイバーバイオリアクターまたはローラーボトル等、当技術分野で公知の多くの容器において育成または維持することができ、これら容器のいくつかは、使い捨て（single use）または複数回使用（multiple use）のために設計および構成することができる。問題になっている宿主細胞の特徴に応じて、宿主細胞は、細胞が物理的基材と接触しつつそれに付着して成長する、接着細胞培養において育成することができるか、または単一細胞が自身を支える培地中を自由に浮遊するかもしくは培地中に懸濁されたビーズマイクロキャリアに付着した、懸濁細胞培養において育成することができる。当技術分野で公知の通り、灌流培養等、様々な技術が開発されており、高い細胞密度へと宿主細胞を育成するために使用することができる。

【0017】

当技術分野で公知の通り、宿主細胞の試料は、多くの場合、マスター細胞バンクおよび作業細胞バンク等の凍結細胞バンクにおいて維持され、このことは、宿主細胞による一貫した性能を確実にしつつ、時間と共に多くのバッチにおいて生物由来生成物を産生することを容易にする。生物由来生成物を産生するキャンペーンの前に、細胞バンクから得た宿主細胞の凍結試料は典型的に、解凍され、小さい培養体積で播種され、増加する体積の培養においてこれまでよりも高い密度または数となるように育成されるであろう。宿主細胞が、培養において所望の細胞密度および／または体積に達したら、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションまたはウイルスベクターによる感染等により外因的遺伝物質を導入して、所望の生物由来生成物の産生を始めさせることができる。あるいは、生物由来生成物の遺伝子が誘導性制御下に置かれた、非一過的に改変された宿主細胞を使用する場合、発現の誘導に必要な環境因子を導入することができる。次に、宿主細胞は、所望の量の生物由来生成物を産生するのに十分な時間および条件下で、培養において育成または維持することができる。

【0018】

生物由来生成物
本開示の方法は、宿主細胞によって作製され得るいずれかの生物由来生成物の産生において有用に用いることができ、そのうち相当な部分が、インタクトな細胞膜を備えた宿主細胞内に保持される。非限定的な例として、いずれかの型および特異性のモノクローナル抗体、凝固因子、酵素（治療薬としての使用のためであれ、産業適用における使用のためであれ）、成長因子、ホルモン、サイトカイン、ワクチンとして機能する抗原性タンパク質、ならびに凝固因子とアルブミンまたは免疫グロブリンタンパク質由来のＦｃ領域の融合体等、異種タンパク質領域またはドメインと融合されたバージョンを含む、前述のいずれかのいずれかの天然起源または非天然起源のバージョンまたはバリアントを含む、いずれかの種類の組換えタンパク質が挙げられる。そのようなタンパク質は、炭水化物基、脂質分子および非標準アミノ酸の共有結合による付加等、当業者にとって公知のいずれかの翻訳後修飾を含むことができる。そのようなタンパク質は、共有結合または非共有結合により互いに結合された複数のポリペプチド鎖を含むこともできる。他の実施形態では、生物由来生成物は、ウイルス、またはがん細胞を死滅させるように（腫瘍溶解性ウイルス）もしくは異種遺伝子のベクター、例えば、遺伝子療法において使用されるべきベクターとして機能するように操作された、改変されたウイルス等、超分子アセンブリーであり得る。非限定的な例として、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、またはそのようなウイルスを使用して作製されたベクターが挙げられる。

【0019】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
一部の実施形態において、本開示の方法は、遺伝子療法のためのウイルスベクター（よって、ＡＡＶベクター）として機能するように組換えにより改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生において有用である。そのように改変されると、ＡＡＶベクターは、遺伝子転写の適切な開始および終結のための調節性エレメントを含むことが多い遺伝子カセットを、形質導入により標的化された細胞に送達することができる。このようにして、ＡＡＶベクターは、遺伝子の機能的コピーを、内因的バージョンが欠けているかまたは突然変異している標的細胞に供給することができる。

【0020】

当技術分野で周知の通り、ＡＡＶは、それ自身の複製に必須であるヘルパー因子として公知の遺伝子産物を供給するためにある特定の他のウイルスに依存する、小型のエンベロープを持たない明らかに非病原性のウイルスであり、この依存は、ＡＡＶを組換えベクターとしての機能によく適するものにした生物学上の不思議（quirk）である。例えば、アデノウイルス（ＡｄＶ）は、アデノウイルスおよびＡＡＶに同時感染した細胞において、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ２ＡおよびＥ４ＯＲＦ６タンパク質ならびにＶＡ ＲＮＡ等、ある特定のアデノウイルス因子を提供することにより、ヘルパーウイルスとして機能することができる。ある特定の動物（哺乳類および鳥類等）および種（ヒトおよびアカゲザル等）に感染するその能力が制限されており、種内では他の組織よりもさらにある特定の組織（肝臓または筋肉等）に感染する傾向を有する、多数の型のＡＡＶが発見されており、これは、トロピズムと呼ばれる現象であり、異なる細胞表面受容体への特異的結合に基づく。ＡＡＶ２と呼ばれるヒトに感染するＡＡＶの１つの型が、生物学的に特によく特徴付けされているが、多くの他の型が、遺伝子療法ベクターの創出における有用性を見出した。

【0021】

自然界では、ＡＡＶゲノムは、一本鎖のＤＮＡであり、ＡＡＶ２では約４．７キロベースの長さであり、ｒｅｐおよびｃａｐと呼ばれる２種の遺伝子を含有する。２種のプロモーターからの転写物のオルタナティブスプライシングが原因で、ｒｅｐ遺伝子は、ゲノム複製およびパッケージングならびに遺伝子発現に関与する、Ｒｅｐ（ＡＡＶ２ではＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）と呼ばれる４種の関連する多機能性タンパク質を産生する。ｃａｐ遺伝子を制御する単一のプロモーターからの転写物のオルタナティブスプライシングは、３種の関連する構造タンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を産生し、これらの総計６０個が自己集合して、それぞれおよそ１：１：１０の比でウイルスの正二十面体カプシドを形成する。ＶＰ１は、３種のＶＰタンパク質の中で最も長く、そのアミノ末端領域にＶＰ２には存在しないアミノ酸を含有し、次いでＶＰ２は、ＶＰ３よりも長く、そのアミノ末端領域にＶＰ３には存在しないアミノ酸を含有する。カプシドは、ＡＡＶゲノムを保護し、また、標的細胞の表面における受容体への特異的な結合の原因となる。

【0022】

ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子に加えて、インタクトなＡＡＶゲノムは、逆位末端配列（ＩＴＲ）と呼ばれる、自身の５’および３’端のそれぞれに位置する相対的に短い（ＡＡＶ２では１４５ヌクレオチド）配列エレメントを有する。ＩＴＲは、ワトソン・クリック型の塩基対合により自己アニールして、Ｔ字形またはヘアピン二次構造を形成することができる、入れ子状態のパリンドローム配列を含有する。ＡＡＶ２において、ＩＴＲは、一本鎖ＤＮＡゲノムを遺伝子発現に要求される二本鎖形態に変換することと共に、Ｒｅｐタンパク質によって一本鎖ＡＡＶゲノムをカプシドアセンブリー内にパッケージングすることを含む、ウイルス生活環に要求される重要な機能を有する。

【0023】

ＡＡＶ２ビリオンが、細胞表面におけるその同族受容体に結合した後に、ウイルス粒子は、エンドサイトーシスを介して細胞に侵入する。リソソームの低ｐＨに達したら、カプシドタンパク質は、立体構造変化を起こし、これにより、カプシドがサイトゾルへとエスケープし、次いで核へと輸送されることが可能となる。核内に入ったら、カプシドは解体され、ゲノムを放出し、ゲノムは、自己アニーリング後にプライマーとして機能する３’端のＩＴＲから開始して第２のＤＮＡ鎖を合成するように細胞のＤＮＡポリメラーゼによる作用を受ける。次いで、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の発現を始め、続いて、新たなウイルス粒子を形成することができる。

【0024】

ＡＡＶの構造および生活環の相対的な単純さ、ならびにこれがヒトにおいて病原性があることは知られていないという事実から閃き得て、研究者達は、ＡＡＶを操作し、これをウイルスから遺伝子療法のための組換えベクターに変換した。簡潔に説明すると、これは、両方のＩＴＲを含むＡＡＶ２のゲノム全体をプラスミドにクローニングし、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を別々のプラスミドへと除去し、これらを、異種転写制御領域（プロモーターと、場合により、エンハンサー）および目的の遺伝子（これは時に、導入遺伝子と称される）を含む遺伝子発現カセットに置き換えることにより行われた。よって、ベクターゲノム中に保持される唯一のウイルスゲノム配列はＩＴＲであり、これは、パッケージングおよび遺伝子発現におけるそれらの重大な意味を持つ機能のためであり、これなしでは、標的細胞の形質導入後に、ＡＡＶベクターは、産生されることも、目的の遺伝子を発現するために機能することもできない。最後に、ヘルパーウイルスによる同時感染の必要を回避するために、いわゆるヘルパー因子（ＡｄＶの場合は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡ ＲＮＡヘルパー因子等）の遺伝子を第３のプラスミドにクローニングした。３種のプラスミドが細菌において多数複製され、精製され、ＨＥＫ２９３細胞等の哺乳類細胞に一緒にトランスフェクトされる場合、ＲｅｐおよびＶＰタンパク質ならびにＡｄＶヘルパー因子は、細胞においてそれぞれのプラスミドから発現されて機能して、カプシドをアセンブルし、その中に、その配列が存するプラスミドから複製された一本鎖ベクターゲノムをパッケージングする。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ＩＴＲに挟まれたそれらの通常の前後関係の外側で、異なるプラスミドにトランスで存在するため、ベクターにパッケージングされない。結果的に、ベクターは、標的細胞に結合し、そのゲノム内の発現カセットを細胞内に運ぶことができるが、新たなベクター粒子を複製および創出することはできない。このような理由で、用語「形質導入」は、用語「感染」の代わりに、このプロセスを指すように使用されることが多い。ベクターが、意図される通りに機能する場合、発現カセットは、転写活性があり、目的の遺伝子によってコードされた遺伝子産物を産生するであろう。

【0025】

本開示の方法に関連した使用のため、ＡＡＶベクターは、遺伝子療法における使用等、その意図される使用に適することが当技術分野で公知である、いずれかの配列、構造、機能的サブエレメントの配置、および構成の、ＡＡＶベクターゲノム内におけるいずれかの目的の遺伝子を含むことができる。ＡＡＶベクターが典型的に設計される場合、実験戦略は、パッケージング限界を上回るように開発されたが、遺伝子の長さが、転写調節性領域およびＩＴＲ等、ベクター機能に要求されるゲノムにおける他の全エレメントと組み合わされたときに、ＡＡＶ２の場合はおよそ５キロベースを超えないように、目的の遺伝子の選択は、カプシドのパッケージング容量のみによって限定される。

【0026】

遺伝子療法の目的のため、目的の遺伝子は、その生成物が、いずれかの疾患または状態を防止または処置するが必ずしも治癒しないと理解される、いずれかの遺伝子であり得る。一部の実施形態では、遺伝子療法は、機能喪失型突然変異が原因で生じ得るもの等、天然起源の遺伝子によって産生される生成物の異常に少ない量またはさらには非存在によって特徴付けされた疾患または状態を防止または処置することを意図する。そのような実施形態に関して、目的の遺伝子は、発現されたときに同じまたは同様の遺伝子産物を提供することにより欠損遺伝子を代償することを意図する遺伝子であり得る。非限定的な例は、ネイティブ第ＩＸ因子遺伝子における機能喪失型突然変異によって引き起こされた血友病Ｂの遺伝子療法における使用のための、凝固因子ＩＸの機能的バージョンを発現するように設計されたベクターとなるであろう。しかし、他の実施形態では、目的の遺伝子は、標的化された細胞における有害な機能獲得型突然変異の効果を相殺することを意図する遺伝子であり得る。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、望ましい遺伝子産物を産生する内因的遺伝子の活性を増加させるための転写活性化因子、または逆に、望ましくない遺伝子産物を産生する内因的遺伝子の活性を減少させるための転写リプレッサーをコードすることができる。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、タンパク質、または調節性非コードＲＮＡ分子（例えば、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ、エンハンサーＲＮＡまたは長鎖非コードＲＮＡ）等のコードタンパク質とは別個の機能を有するＲＮＡ分子をコードすることができる。目的の遺伝子におけるタンパク質コード配列は、コドン最適化することができ、翻訳開始部位（例えば、コザック配列）は、翻訳を開始するその傾向を増加または減少させるように改変することができる。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、１個または複数のオープンリーディングフレームを含有することができる。他の実施形態では、ベクターゲノムは、２個以上の目的の遺伝子、それ自身の別々の転写単位の各部分を含むことができる、または異なる生成物を、オルタナティブスプライス部位を含めることによって単一の転写単位から産生することができる。

【0027】

目的の遺伝子とは別に、ＡＡＶベクターゲノムの多くの他の側面は、ベクターの意図される使用に応じた選択および最適化の設計に受け入れられる。限定することなく、転写制御領域は、構成的に活性、組織特異的または誘導性であり得、プロモーターと共に１個または複数のエンハンサーエレメントを含むことができる。転写制御領域は、天然に遺伝子に生じるものと同じヌクレオチド配列を含むことができる、または自然界で見出される配列に対してヌクレオチドを変化、付加もしくは除去することにより、その機能を改善するようにおよび／もしくはその長さを低減させるように改変することができる、または完全に合成であってもよい。他の実施形態では、ベクターゲノムは、遺伝子の５’および／または３’端由来の非翻訳領域、非コードエクソン、イントロン、転写終結シグナル（例えば、ポリＡシグナル配列）、ＲＮＡ転写物を安定化するエレメント、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ｌｏｘ部位、調節性ｍｉＲＮＡのための結合部位、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節性エレメント（ＷＰＲＥ）等のｍＲＮＡの核外輸送を増強するエレメント、ならびに機序が不確かであったとしても目的の遺伝子の発現を改善することが経験的に実証された他のいずれかのエレメントをさらに含むことができる。

【0028】

一部の実施形態では、ベクターゲノムは、標的細胞のゲノムを編集または他の仕方で改変する目的で設計することができる。例えば、ベクターゲノムは、ベクターゲノムおよび標的細胞ゲノムの間の相同組換えを促進することを意図するホモロジーアームに挟まれた目的の遺伝子を含むことができる。別の例では、ベクターゲノムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および／またはｇＲＮＡに結合し、ｇＲＮＡによって標的化されたＤＮＡ配列を切断することができる、Ｃａｓ９もしくはＳａＣａｓ９等の関連するエンドヌクレアーゼ等のエンドヌクレアーゼを発現させることにより、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を実行するように設計することができる。

【0029】

当技術分野で公知の通り、ＡＡＶベクターにおいて典型的に使用されるＩＴＲは、ＡＡＶ２に起源を持つが、他の血清型および天然起源のＡＡＶ単離株もしくはハイブリッドに由来するＩＴＲまたはさらには完全に合成のＩＴＲを使用することもできる。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡゲノムの各端に１個ずつ、２個のインタクトなＩＴＲを含む。しかし、他の実施形態では、従来の一本鎖ＡＡＶゲノムと同様に、第２鎖合成の必要なく直ちに進むための遺伝子発現を可能にする、二本鎖形態へとカプシド脱コートした後に自己アニールすることができる、いわゆる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムに生じるもの等、末端分離（resolution）部位を欠如する第３の突然変異したＩＴＲが、ゲノムの中央に位置することができる。ある１つの型のＡＡＶ由来のＩＴＲを、同じ型のＡＡＶ由来のカプシドに、または時に偽型ベクターとして公知である異なる型のＡＡＶ由来のカプシドに含有されたゲノムにおいて使用することができる。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲを、ＡＡＶ２カプシド、またはＡＡＶ５カプシド（これは時にＡＡＶ２／５と表示）、またはＡＡＶ２とは異なる別のＡＡＶカプシドによってカプシド被包されたゲノムにおいて使用することができる。

【0030】

単に、ベクターゲノムの設計において広い自由度があるため、多くの異なる天然起源のおよび改変されたＡＡＶカプシドを使用してＡＡＶベクターを作製することができる。かつては、生物学的試料から６つの型のみの霊長類ＡＡＶが単離されており（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６）、そのうち最初の５つは、抗体交差反応性実験に基づき異なる血清型として分類されるのに十分なほど構造的に別個のものであった。後に、ＡＡＶ７およびＡＡＶ８と呼ばれる２種の新規ＡＡＶが、以前に発見されたＡＡＶのｃａｐ遺伝子における高度に保存された領域を標的とするプライマーを使用したアカゲザル由来のＤＮＡのＰＣＲ増幅によって発見された。Ｇａｏ、Ｇら、Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９９（１８）：１１８５４～１１８５９（２００２）。その後、同様のアプローチを使用して、ヒトおよび非ヒト霊長類組織から多数の新規ＡＡＶをクローニングし、公知ＡＡＶ ｃａｐタンパク質配列の範囲を大いに拡大した。Ｇａｏ、Ｇら、Ｃｌａｄｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ａｒｅ Ｗｉｄｅｌｙ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅｓ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７８（１２）：６３８１～６３８８（２００４）。多くのＡＡＶ ｃａｐタンパク質配列は、互いに、または以前に同定されたＡＡＶと高度に類似しており、別個のＡＡＶ「血清型」と称されることが多いが、そのようなカプシドの全てが、抗体交差反応性によって検査された場合に免疫学的に識別可能であると必ず予想されるとは限らない。

【0031】

研究は、異なるＡＡＶカプシドが、異なる組織トロピズムと共に、特定の適用についてあるカプシドを別のカプシドよりも好ましくすることができる他の特性を有することを確立した。例えば、いずれの集団が検査されているかに応じて、ヒトは、天然起源のＡＡＶへの曝露の結果として、高い中和抗体タイターを有することができ、これは、標的細胞に形質導入する、同じまたは同様のカプシドを有するＡＡＶベクターの能力に干渉し得る。よって、遺伝子療法のためのベクターの設計において、カプシドの選択は、一部の場合では、カプシドの免疫原性、および／または処置されるべき患者の血清有病率によって導かれ得る。

【0032】

本開示の方法に関連した使用のため、ＡＡＶベクターは、遺伝子療法における使用等、その意図される使用に適することが当技術分野で公知のいずれかのカプシドを含むことができる。そのようなカプシドは、天然起源のＡＡＶ由来のカプシドと共に、改変または操作されたカプシドを含む。例えば、組織トロピズム、免疫原性、安定性または製造可能性等、何らかの仕方でカプシド機能を改善することが意図されるｃａｐタンパク質配列において、ペプチドを挿入することまたはアミノ酸置換を作製することにより、天然起源のカプシドを改変することができる。他の例として、ある公知のカプシドから別のカプシドへとアミノ酸もしくはドメインを取り替えることにより創出された（これは時に、モザイクまたはキメラカプシドとして公知である）、またはＤＮＡシャッフリングおよび定向進化方法を用いて作成および選択された、改善された特性を有する新規カプシドが挙げられる。一部の実施形態では、宿主細胞によって有用に産生され、本開示の方法を用いて精製され得るＡＡＶベクターは、次のカプシド：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２．５およびＡＡＶ２ｉ８のうちいずれかを使用するＡＡＶベクターを含み、多くのその他も可能である。

【0033】

上に記す通り、ビリオンのカプシドが、標的細胞の表面における受容体に特異的に結合すると、ＡＡＶ感染が始まる。次に、ビリオンは、エンドサイトーシスを介して細胞内に取り込まれ、核に輸送され、そこで、カプシドは脱コートして、ゲノムをさらけ出す。異なるカプシドは、異なる細胞受容体に特異的に結合することが示されており、このことは、少なくとも部分的に、異なるＡＡＶ血清型およびバリアントの間で観察された異なる組織トロピズムを説明することができる。細胞へのＡＡＶによる初期付着は、多くの場合では、細胞表面タンパク質に表示されたグリカン部分へのカプシドによる結合が関与すると思われ、他の細胞表面タンパク質は、ウイルス侵入に関与する共受容体としての重要な役割を果たす。例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６はＮ結合型シアル酸に、ＡＡＶ４はＯ結合型シアル酸に、ＡＡＶ９は末端Ｎ結合型ガラクトースに結合することが示された。ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１３およびＡＡＶ－ＤＪを含む、他のカプシドは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に特異的に結合することが示された。ＡＡＶＲとして公知の細胞表面タンパク質は、多数のＡＡＶ血清型による侵入に明らかに要求されるが、カプシド血清型に応じて、ある特定のインテグリンおよびラミニン受容体等の他のタンパク質が関与する場合もある。例えば、Ｈｕａｎｇ、ＬＹ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃａｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２０１４）７：１０８～１１８；Ｚｈａｎｇ、Ｒら、Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＡＡＶＲ、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．（２０１９）１０：３７６０；Ｈａｖｌｉｋ、ＬＰ、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｉｎ Ｎｅｗｌｙ Ｅｖｏｌｖｅｄ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０２１）９５（１９）：ｅ００５８７－２１を参照されたい。

【0034】

一部の実施形態では、いずれか公知のまたは未だ特徴付けされていないカプシドを含むＡＡＶベクターは、本開示の方法を用いて精製することができ、一方、他の実施形態では、本開示の方法を用いて精製することができるＡＡＶベクターは、ＨＳＰＧと比較してシアル酸もしくはガラクトースにより強く結合する、またはＨＳＰＧに特異的に結合しないかもしくはごく弱く結合するカプシドを含む。よって、一部の実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１３およびＡＡＶ－ＤＪ由来のカプシドを含むＡＡＶベクターは、本開示の方法を用いて精製することができ、一方、他の実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９由来のカプシドを含むＡＡＶベクターは、本開示の方法を用いて精製することができる。いずれかの種類の受容体に対するカプシドの特異的結合親和性またはアビディティーは、表面プラズモン共鳴または他の方法等、当業者にとって造詣が深いいずれかの技法を使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示の方法を用いて精製することができるＡＡＶベクターは、少なくともまたは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２５０、５００、１０００倍もしくはそれを超える倍数、または他の何らかの倍数だけ、ＨＳＰＧと比較してシアル酸またはガラクトースにより強く結合するカプシドを含む。

【0035】

当技術分野で公知の通り、多数の仕方で、ラージスケールを含めて、ウイルスベクターを産生することができる。例えば、ＡＡＶベクターは、哺乳類または昆虫細胞において作製し、次いで精製することができる。ヘルパーウイルスによる同時感染に頼らない伝統的なアプローチは、上に記述されている通り、３種のプラスミドの使用が関与する。１つのプラスミドは、ヘルパーウイルス因子の遺伝子を含有し、第２のプラスミドは、二本鎖形態のＡＡＶゲノム配列を含有し、第３のプラスミドは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する。ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドは、多くの場合、ＡＡＶ２由来のｒｅｐ遺伝子を含有するが、これは要件ではなく、ｃａｐ遺伝子配列は、いずれのＡＡＶ ｃａｐタンパク質がカプシドの構成に所望されるかに基づき選択される。実際に、３種のプラスミドは、多くの場合、細菌において別々に複製され、精製され、所定の割合で溶液中にて一緒に混合され、次いで、トランスフェクション剤と混合される。次に、トランスフェクション混合物は、適した哺乳類宿主細胞（接着または懸濁細胞培養における）のトランスフェクトに使用され、細胞は、十分な時間（例えば、４８～７２時間等）にわたり、また、宿主細胞がヘルパー因子ならびにｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現し、ＡＡＶベクターゲノムがそのプラスミドテンプレートから複製されてカプシド中にパッケージングされるのに十分な条件下で、インキュベートされる。一部の実施形態では、ヘルパープラスミドが、ＡｄＶ Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６およびＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含有することのみを必要とするように、宿主細胞は、ＡｄＶヘルパー因子Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞である。自分でＡｄＶまたは他のウイルスヘルパー因子を産生しない他の哺乳類宿主細胞の使用は、欠けているまたは他の理由で要求されるいずれかのヘルパー因子を含有するヘルパープラスミドの使用を必要とするであろう。上に記載されているいわゆる三重トランスフェクション方法が一般的に用いられるが、ヘルパー因子ならびにｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が、別々のプラスミドに提供されることの要件はない。原則的にこれらの遺伝子の全てを１つのプラスミドに収容することができ、例えば、この場合、トランスフェクションにおいて２つのプラスミドを使用することができる。

【0036】

ラージスケールでＡＡＶベクターを産生する、より効率的な方法を求めて、当該細胞株がなければ一過的トランスフェクションによって細胞に導入される必要があるであろう構成成分の全てではなく一部を含有する安定的細胞株が創出された。パッケージング細胞株は、安定的に組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する。パッケージング細胞におけるＡＡＶの産生は、細胞が、ＡＡＶベクターゲノムを含有するプラスミドを一過的にトランスフェクトされ、ヘルパーウイルスに感染されることを要求する。トランスフェクションを用いずに、先ず、細胞をＡｄＶ Ｅ１遺伝子産物を供給するＡｄＶ（野生型の、またはＥ２ｂ遺伝子が欠失された）に感染させ、これにより、細胞におけるｒｅｐおよびｃａｐ発現、ならびにＡＡＶ複製に要求されるヘルパー因子を誘導し、続いて、ＡＡＶベクターゲノムがハイブリッドウイルスのゲノムにおいてＥ１遺伝子に取って代わった複製欠損ハイブリッドＡｄＶに感染させることにより、パッケージング細胞においてＡＡＶベクターを産生することも可能である。産生株細胞株は、安定的に組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を、また、ＡＡＶベクターゲノムを含有する。産生株細胞におけるＡＡＶの産生は、細胞がヘルパーウイルスに感染されることを要求する。パッケージングおよび産生株細胞は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ、Ｊら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：２５３～２６９（２０１３）；Ｇａｏ、ＧＰら、Ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ａ Ｒｅｐ／Ｃａｐ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、９：２３５３～６２（１９９８）；Ｍａｒｔｉｎ、Ｊら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．、２４：２５３～６９（２０１３）；Ｃｌｅｍｅｎｔ、ＮおよびＪＣ Ｇｒｉｅｇｅｒ、Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．＆Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．（２０１６）３、１６００２（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．２）にさらに記載されている。商業的スケールで行うものを含む、哺乳類細胞においてＡＡＶベクターを産生するための他の細胞システムが可能である。

【0037】

バキュロウイルスシステムもまた、ＡＡＶベクターの産生に用いられてきた。このシステムにおいて、Ｓｆ９昆虫細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにＡＡＶゲノムを様々に含有する組換えバキュロウイルスベクターに感染される。外因的遺伝子が発現され、続いて、細胞内でベクター粒子へのゲノムパッケージングが行われる。システムの初期バージョンにおいて、各構成成分であるｒｅｐ、ｃａｐおよびゲノムは、３種の別々のバキュロウイルスによって運搬された。後に、２つの型のバキュロウイルスのみが要求されるように、単一のバキュロウイルスにｒｅｐおよびｃａｐを組み合わせることや、ＡＡＶベクターゲノムを含有する単一の型の組換えバキュロウイルスによる感染のみを要求する、安定的に組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＳｆ９細胞株を産生すること等の改変が為された。ＡＡＶベクターを産生するためのバキュロウイルスシステムの使用は、例えば、Ｕｒａｂｅ、Ｍら、Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ Ｆａｃｔｏｒｙ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１３：１９３５～４３（２００２）；Ｖｉｒａｇ、Ｔら、Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｆｏｓｔｅｒ ｃｅｌｌｓ：Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ－ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０：８０７～１７（２００９）；Ｓｍｉｔｈ、ＲＨら、Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ－ＡＡＶ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ｒＡＡＶ ｓｔｏｃｋｓ ｆｒｏｍ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１７：１８８８～９６（２００９）；Ｍｉｅｔｚｓｃｈ、Ｍら、ＯｎｅＢａｃ：ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｃａｌａｂｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １－１２ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２５（３）：２１２～２２（２０１４）にさらに記載されている。商業的スケールで行なうものを含む、昆虫細胞においてＡＡＶベクターを産生するための他の細胞システムが可能である。

【0038】

宿主細胞の溶解
所望の生物由来生成物を含む宿主細胞は、精製されることを求められる生物由来生成物を変性させることなく、細胞内部の内容物を周囲の培地と接触させることを可能にする、細胞の原形質膜の破壊に有効であることが当技術分野で公知のいずれかの仕方で溶解することができる。宿主細胞の溶解は、溶解の直前に細胞が懸濁されたまたは他の仕方で細胞を囲んだ流体中に分散された、細胞構成成分の中でもとりわけ、宿主細胞ＤＮＡおよび生物由来生成物を含む、粗宿主細胞ライセートを産生する。

【0039】

本開示の一部の実施形態では、宿主細胞溶解は、高圧ホモジナイザーもしくはビーズミルを用いる等、機械的に、または物理的、化学的もしくは生物学的方法を包含し得る、非機械的にもたらすことができる。物理的方法の例として、加熱、凍結融解サイクル、浸透圧ショック、超音波処理またはキャビテーションに細胞を曝露することが挙げられ；化学的方法の例として、アルカリまたは界面活性剤で細胞を処理することが挙げられ；生物学的方法の例として、酵素で細胞を処理することが挙げられる。溶解方法に関するさらなる情報は、Ｉｓｌａｍ、ＭＳら、Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｍａｃｒｏｓｃａｌｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ ８、８３（ｐｐ．１～２７）（２０１７）に見出すことができる。

【0040】

一部の実施形態では、宿主細胞溶解は、細胞の原形質膜の破壊、融解または溶解を引き起こすのに十分な濃度で界面活性剤と宿主細胞を接触させることによりもたらされる。上に記す通り、宿主細胞は、接着細胞培養または懸濁細胞培養において育成および維持することができる。一部の実施形態では、接着細胞培養において育成された宿主細胞の溶解は、いくつかの仕方で簡便に行うことができる。育成培地を除去することができ、次いで、細胞溶解を引き起こすのに十分な最終濃度で界面活性剤および場合によりバッファー等の他の構成成分を含む溶解溶液を、細胞が育成されている容器に添加し、次いで、細胞溶解が生じるまで、細胞と接触させることができる。容器をかき混ぜる、振動させる等して、細胞にわたる溶解溶液の有効な分布、ならびに溶解溶液と溶解した細胞およびその内容物の混合を引き起こすことができる。その代わりに、界面活性剤および場合によりバッファー等の他の構成成分を含む濃縮ストック溶液を調製し、細胞溶解を引き起こすのに十分な所望の最終界面活性剤濃度（例えば、％重量／体積、％重量／重量または容積モル濃度として）となるように、育成培地（またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）その他等、細胞が維持されている他の生理的に適合性の流体）に直接的に添加することができる。次に、培地および溶解溶液を混合し、細胞溶解が生じるまで、容器内の接着細胞と接触させることができる。他の実施形態では、接着細胞培養において育成された宿主細胞は、その基材から化学的にまたは酵素的に剥離することができ、その後、上に記載されている溶解溶液が容器に添加され、細胞溶解が生じるまで、懸濁下の細胞と接触させる。その代わりに、剥離された細胞は、その育成容器から除去し、懸濁下で、上に記載されている通り、溶解が行われることになる新たな容器に移すことができる。

【0041】

一部の実施形態では、懸濁細胞培養において育成または維持された宿主細胞は、細胞溶解を引き起こすのに十分な所望の最終界面活性剤濃度（例えば、％重量／体積、％重量／重量または容積モル濃度として）となるように、界面活性剤および場合によりバッファー等の他の構成成分を含む濃縮ストック溶液を育成培地（またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）その他等、細胞が維持される他の生理的に適合性の流体）に添加することにより溶解することができる。次に、培地および溶解溶液を混合して、培養体積の全体にわたり界面活性剤を均等に分布させ、細胞溶解が生じるまで、細胞を接触させることができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、いずれか所望の体積のバイオリアクターにおいて育成または維持され、そこに、界面活性剤溶解溶液が、１つもしくは複数のボーラスとして、または溶解溶液の所望の体積全体が添加されるまで継続的に添加される。界面活性剤溶解溶液は、当技術分野で公知であるいずれかの仕方で、例えば、宿主細胞が懸濁された流体の上に位置するチューブ経由等、上から、または表面下添加ラインもしくはチューブ経由等、バイオリアクターのいずれか所望の高さでそのような流体の表面より下から、バイオリアクター、またはその中で宿主細胞が溶解されることになるいずれかの容器に添加することができる。細胞が懸濁されている培地および溶解溶液の混合は、細胞が溶解される期間全体にわたって進めることができる、またはより短い期間にわたり進められ、続いて、混合またはかき混ぜなしで細胞が溶解させられるインキュベーション期間となる。混合は、羽根車またはポンプの使用等、当技術分野で公知であるいずれかの仕方で行うことができる。一部の実施形態では、宿主細胞と、それが懸濁培養において育成された培地を、宿主細胞を沈降させること等により分離し、培地を除去し、同じもしくは異なる種類の新鮮培地または何らかの他の生理的に適合性の流体等の異なる流体に置き換えることができ、次いで、そこに界面活性剤溶解溶液が添加され、続いて、混合および細胞溶解が行われる。これは、細胞が育成された同じ容器で、またはいずれか適したサイズの新たな容器で起こり得る。

【0042】

所望の生物由来生成物を損なうことも変性させることもなく、宿主細胞溶解を引き起こすのに有効であることが当技術分野で公知のいずれかの界面活性剤を使用することができるが、他の仕方で変性させる界面活性剤の使用は、その濃度が低い場合または細胞がそれに限られた期間曝露される場合、可能となり得る。本開示の方法における使用のための界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤であり得る。アニオン性界面活性剤の例として、デオキシコール酸ナトリウムおよびアルキル硫酸塩、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムが挙げられ、その他も可能である、カチオン性界面活性剤の多くの例は、当技術分野で公知である。双性イオン性界面活性剤の例として、（３－（（３－コラミドプロピル（cholamidopropyl））ジメチルアンモニオ）－１－プロパンスルホネート）（ＣＨＡＰＳ）および３－（［３－コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）が挙げられ、その他も可能である。非イオン性界面活性剤の例として、ｎ－アルキル－ベータ－Ｄ－マルトピラノシド（アルキル基が、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシルである場合等）、ｎ－アルキル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシド（アルキル基が、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシルである場合等）、ｎ－アルキル－ベータ－Ｄ－チオグルコピラノシド（アルキル基が、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシルである場合等）、ジギトニン、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（例えば、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０））、Ｂｒｉｊ ３５、Ｂｒｉｊ ５８およびアルキルフェノールエトキシレート界面活性剤が挙げられる。

【0043】

一部の実施形態では、宿主細胞を溶解するための本開示の方法において有用である非イオン性界面活性剤は、２－アルキルフェノールエトキシレート、３－アルキルフェノールエトキシレートまたは４－アルキルフェノールエトキシレート界面活性剤等のアルキルフェノールエトキシレート界面活性剤であり、これは、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１－フェニル－Ｏ－［－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－］_ｘ－Ｈ（式中、アルキル基は、直鎖状または分枝状であり得、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または何らかの他の整数であり、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または何らかの他の整数である）によって提供される。

【0044】

一部の実施形態では、宿主細胞を溶解するための本開示の方法において有用である非イオン性界面活性剤は、２－オクチルフェノールエトキシレート、３－オクチルフェノールエトキシレートまたは４－オクチルフェノールエトキシレート界面活性剤等のオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤であり、これは、一般式Ｃ_８Ｈ_１７－フェニル－Ｏ－［－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－］_ｘ－Ｈ（式中、オクチル基は、直鎖状または分枝状であり得、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または何らかの他の整数である）によって提供される。

【0045】

一部の実施形態では、宿主細胞を溶解するための本開示の方法において有用である非イオン性界面活性剤は、次の構造を有する４－オクチルフェノールエトキシレート界面活性剤である：

【0046】

【化1】

（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または何らかの他の整数である）。

【0047】

例示的なオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１５、Ｘ－３５、Ｘ－４５、Ｘ－１００、Ｘ－１６５、Ｘ－３０５、Ｘ－４０５、Ｘ－１０２、Ｘ－１１４またはＸ－７０５等、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘシリーズのそれを含む。例示的なオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤は、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０およびＣＡ－７２０等、Ｉｇｅｐａｌシリーズのそれも含む。一部の実施形態では、本開示の方法における使用のためのオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤は、次の（Ｉ）化学名：４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコール４－ｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル；ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール；ポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル；ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルシクロヘキシルエーテル；（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール；４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール；ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルフェニルエーテル；ポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル；ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルシクロヘキシルエーテル；ポリオキシエチレン（１２）イソオクチルフェニルエーテル；ポリオキシエチレン（１２）オクチルフェニルエーテル、分枝状；（ＩＩ）化学式：ｔ－オクタ－Ｃ_６Ｈ_４－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｘＯＨ、ｘ＝～５；４－（Ｃ_８Ｈ_１７）Ｃ_６Ｈ_１０（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨ、ｎ～１０；ｔ－オクタ－Ｃ_６Ｈ_４－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｘＯＨ、ｘ＝９～１０；（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）ｎ Ｃ_１４Ｈ_２２Ｏ、ｎ＝７もしくは８；または（ＩＩＩ）ＣＡＳ登録番号：９０３６－１９－５、９２０４６－３４－９および９００２－９３－１によって公知である。

【0048】

一部の実施形態では、宿主細胞を溶解するための本開示の方法において有用である非イオン性界面活性剤は、２－ノニルフェノールエトキシレート、３－ノニルフェノールエトキシレートまたは４－ノニルフェノールエトキシレート界面活性剤等のノニルフェノールエトキシレート界面活性剤であり、これは、一般式Ｃ_９Ｈ_１９－フェニル－Ｏ－［－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－］_ｘ－Ｈ（式中、ノニル基は、直鎖状または分枝状であり得、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または何らかの他の整数である）によって提供される。

【0049】

例示的なノニルフェノールエトキシレート界面活性剤は、ＮＰ－４、ＮＰ－６、ＮＰ－７、ＮＰ－８、ＮＰ－９、ＮＰ－９．５、ＮＰ－１０、ＮＰ－１１、ＮＰ－１２、ＮＰ－１３、ＮＰ－１５、ＮＰ－３０、ＮＰ－４０およびＮＰ－５０を含むＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰシリーズのそれを含む。例示的なノニルフェノールエトキシレート界面活性剤は、Ｉｇｅｐａｌ ＣＯ－５２０、ＣＯ－６３０、ＣＯ－７２０およびＣＯ－８９０等、Ｉｇｅｐａｌシリーズのそれも含む。一部の実施形態では、本開示の方法における使用のためのノニルフェノールエトキシレート界面活性剤は、次の（Ｉ）化学名：ポリオキシエチレン（５）ノニルフェニルエーテル、分枝状；ポリオキシエチレン（９）ノニルフェニルエーテル、分枝状；ポリオキシエチレン（１２）ノニルフェニルエーテル、分枝状；ポリオキシエチレン（４０）ノニルフェニルエーテル、分枝状；（ＩＩ）化学式：（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ・Ｃ_１５Ｈ_２４Ｏ、ｎ～５；（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ・Ｃ_１５Ｈ_２４Ｏ ・ ｎ＝９～１０；（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ・Ｃ_１５Ｈ_２４Ｏ、ｎ＝１０．５～１２；（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ・Ｃ_１５Ｈ_２４Ｏ ｎ＝４０；または（ＩＩＩ）ＣＡＳ登録番号：６８４１２－５４－４によって公知である。

【0050】

一部の実施形態では、オクチルフェノールエトキシレートおよびノニルフェノールエトキシレート界面活性剤組成物等、アルキルフェノールエトキシレート界面活性剤組成物は、例えば、あるものは直鎖状であり、またあるものは異なる構成の分枝状である、異なるアルキル鎖構造や、異なる数のエトキシレート（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）単量体を有する親水性（hydrophile）の鎖を有する種の不均一集団を含む。一部の実施形態では、オクチルフェノールエトキシレートおよびノニルフェノールエトキシレート界面活性剤組成物等、アルキルフェノールエトキシレート界面活性剤組成物は、１分子当たりのエトキシレート単量体の平均数、例えば、１分子当たり平均して約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４もしくは５５個のエトキシレート単量体、または１分子当たり１～２、２～３、３～４、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、１１～１２、１２～１３、１３～１４、１４～１５、１５～１６、１６～１７、１７～１８、１８～１９もしくは１９～２０個の間のエトキシレート単量体によって特徴付けることができる。

【0051】

一部の実施形態では、本開示の方法における使用のための界面活性剤組成物は、式（Ｉ）（式中、ｎの平均値は、９～１０の間である）の構造を有するオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤を含む。

【0052】

一部の実施形態では、特に、宿主細胞が、懸濁培養において育成または維持される場合、宿主細胞溶解のステップは、細胞が懸濁されている培地、または他の生理的に適合性の流体の規定された体積における生存宿主細胞の数、例えば、１ミリリットル当たりの生細胞数（ｖｃ／ｍＬ）を意味する、所定の生細胞密度で行うことができる。細胞生存率は、当技術分野で公知のいずれかの技法を使用して決定することができる。例えば、細胞の試料は、細胞が育成または維持されている培養物から引き抜き、トリパンブルー等の生体色素と混合することができ、次いで、色素を排除する細胞の総数を血球計数器で計数し、その結果から、１ｍＬ（または他のいずれかの体積）当たりの生細胞の数を容易に計算することができる。その代わりに、生細胞密度は、誘電率センサー等のセンサーを使用して、リアルタイムでモニターすることができ、それに関するさらなる情報は、例えば、Ｍｅｔｚｅ、Ｓら、Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｎｌｉｎｅ ｂｉｏｍａｓｓ ｗｉｔｈ ａ ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ｓｅｎｓｏｒ ｄｕｒｉｎｇ ｓｃａｌｅ－ｕｐ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｕｓｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓ．Ｅｎｇ．４３：１９３～２０５（２０２０）に見出すことができる。

【0053】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクター等の所望の生物由来生成物を産生する宿主細胞は、ある特定の生細胞密度で溶解（収集）され、そのような生細胞密度は、少なくとももしくは約０．０１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、０．１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、３０×１０^６ｖｃ／ｍＬもしくはそれよりも高く、または約２×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；５×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；５×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×１０^６～２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２０×１０^６～２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２０×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２１×１０^６～２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２０×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２１×１０^６～２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２０×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２１×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２２×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２３×１０^６～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２０×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２１×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２２×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２３×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２４×１０^６～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２０×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２１×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２２×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２３×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２４×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２５×１０^６～２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２０×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２１×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２２×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２３×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２４×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２５×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２６×１０^６～２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２０×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２１×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２２×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２３×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２４×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２５×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２６×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２７×１０^６～２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２０×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２１×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２２×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２３×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２４×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２５×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２６×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２７×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２８×１０^６～２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１０×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１１×
１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１２×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１３×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１４×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１５×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１６×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１７×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１８×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；１９×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２０×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２１×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２２×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２３×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２４×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２５×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２６×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２７×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；２８×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ；もしくは２９×１０^６～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の生細胞密度の範囲、または何らかの他の範囲であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、懸濁培養におけるＨＥＫ２９３細胞である。

【0054】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクター等の所望の生物由来生成物を産生する宿主細胞は、ある体積の生理的に適合性の流体、例えば、細胞が育成された培地、または一部の実施形態では、細胞がトランスフェクトされた培地（これは、細胞が育成された培地と同じ培地であり得る）に懸濁されながら溶解され、そのような体積は、少なくとももしくは約２リットル（Ｌ）、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、５０Ｌ、７５Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌ、７００Ｌ、７５０Ｌ、８００Ｌ、９００Ｌ、１０００Ｌ、１２５０Ｌ、１５００Ｌ、１７５０Ｌ、２０００Ｌ、３０００Ｌ、４０００Ｌ、５０００Ｌもしくはより大きい体積、または２Ｌ～５Ｌ、２Ｌ～１０Ｌ、２Ｌ～５０Ｌ、２Ｌ～１００Ｌ、５Ｌ～１０Ｌ、５Ｌ～５０Ｌ、５Ｌ～１００Ｌ、１０Ｌ～５０Ｌ、１０Ｌ～１００Ｌ、５０Ｌ～２５０Ｌ、５０Ｌ～５００Ｌ、１００Ｌ～２５０Ｌ、１００Ｌ～５００Ｌ、１００Ｌ～１０００Ｌ、２５０Ｌ～５００Ｌ、２５０Ｌ～１０００Ｌ、２５０Ｌ～２０００Ｌ、５００Ｌ～１０００Ｌ、５００Ｌ～２０００Ｌ、５００Ｌ～５０００Ｌ等、前述の体積のいずれかを含めたそれらの間の範囲、または何らかの他の範囲であり得る。一部の実施形態では、体積は、宿主細胞の試料の体積であり、この試料は、例えば、バイオリアクター内の懸濁細胞培養物の体積全体を含むことができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、懸濁培養におけるＨＥＫ２９３細胞である。他の実施形態では、溶解前に、宿主細胞は、細胞が育成された培地の体積と比較して小さい、生理的に適合性の流体の体積へと濃縮することができる。

【0055】

宿主細胞の懸濁液に添加される、またはそれと界面活性剤溶液の混合物における（または接着細胞が基材に付着したまま溶解される場合は、細胞溶解溶液における）界面活性剤の最終濃度は、溶解後に細胞から放出されたＡＡＶベクター等の所望の生物由来生成物を損なうことも変性することもなく、宿主細胞を溶解するのに有効ないずれかの濃度であり得る。濃度は、パーセンテージまたは容積モル濃度を単位として表すことができ、パーセンテージとして表される場合、％重量／体積または％重量／重量として計算することができ、それらの値は、希薄水溶液にでは有意に異ならないであろう。

【0056】

一部の実施形態では、界面活性剤（例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤）の最終濃度は、少なくとももしくは約０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％、０．２５％、０．３０％、０．３５％、０．４０％、０．４５％、０．５０％、０．５５％、０．６０％、０．６５％、０．７０％、０．７５％、０．８０％、０．８５％、０．９０％、０．９５％、１．００％、１．１０％、１．２０％、１．２５％、１．３０％、１．４０％、１．５０％、１．６０％、１．７０％、１．８０％、１．９０％、２．００％、３．００％、４．００％もしくは５．００％、または約０．０５％～５．００％、０．０５％～１．２５％、０．１０％～２．５０％、０．１０％～０．９０％、０．２０％～０．８０％、０．２０％～１．２５％、０．２０％～０．７５％、０．２５％～０．７５％、０．２５％～０．６５％、０．２０％～０．７０％、０．３０％～０．７０％、０．３５％～０．６５％、０．４０％～０．６０％、０．４５％～０．５５％等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の濃度の範囲、または何らかの他の範囲であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞を溶解するのに使用される界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例えば、オクチルフェノールエトキシレート界面活性剤（例えば、４－オクチルフェノールエトキシレート界面活性剤）またはノニルフェノールエトキシレート界面活性剤（例えば、４－ノニルフェノールエトキシレート界面活性剤）等のアルキルフェノールエトキシレート界面活性剤であり、具体的な非限定的な例は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり、これらのいずれかを、少なくとももしくは約０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％、０．２５％、０．３０％、０．３５％、０．４０％、０．４５％、０．５０％、０．５５％、０．６０％、０．６５％、０．７０％、０．７５％、０．８０％、０．８５％、０．９０％、０．９５％、１．００％、１．１０％、１．２０％、１．２５％、１．３０％、１．４０％、１．５０％、１．６０％、１．７０％、１．８０％、１．９０％、２．００％、３．００％、４．００％もしくは５．００％、または約０．０５％～５．００％、０．０５％～１．２５％、０．１０％～２．５０％、０．１０％～０．９０％、０．２０％～０．８０％、０．２０％～１．２５％、０．２０％～０．７５％、０．２５％～０．７５％、０．２５％～０．６５％、０．２０％～０．７０％、０．３０％～０．７０％、０．３０％～０．６０％、０．３５％～０．６５％、０．４０％～０．６０％、０．４５％～０．５５％等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の濃度の範囲、または何らかの他の範囲の最終濃度で、宿主細胞の溶解に使用することができる。

【0057】

一部の実施形態では、懸濁液における宿主細胞の試料は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む溶液を懸濁液に添加することにより溶解され、混合物におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度は、約０．３０％～０．７０％、０．３５％～０．６５％、０．４０％～０．６０％、０．４５％～０．５５％または約０．５％である。一部の実施形態では、宿主細胞は、懸濁培養におけるＨＥＫ２９３細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶベクターを産生する。

【0058】

一部の実施形態では、約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、少なくとももしくは約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、または約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬもしくは１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の生細胞密度の範囲等、溶解（収集）時に高い生細胞密度であっても宿主細胞を溶解させるのに有効である。後者の２つの例示的な範囲において、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度は、それぞれ１ｍＬ当たり１０^６個の生存宿主細胞当たり０．０５％～０．０１７％、または１ｍＬ当たり１０^６個の生存宿主細胞当たり０．０３３％～０．０２％に等しい。これらの因数を使用して、いずれか特定の生細胞密度の宿主細胞を有効に溶解するために使用することができるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度範囲を計算することができる。例えば、一部の実施形態では、約０．１７％～０．５％または約０．２％～０．３３％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度の宿主細胞を溶解させるのに有効であり、約０．３３％～１．０％または約０．４％～０．６７％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、約２０×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度の宿主細胞を溶解させるのに有効であり、約０．５％～１．５％または約０．６％～１％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、約３０×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度の宿主細胞を溶解させるのに有効である。同様の様式で、一部の実施形態では、約１％～３％または約１．２％～２％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、約６０×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度の宿主細胞を溶解させるのに有効である。一部の非限定的な実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶベクターを産生する、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞である。

【0059】

一部の他の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０６０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２３％～０．０７０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２４％～０．０４０％、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０２８％～０．０４７％の最終濃度で、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞等の宿主細胞の試料に添加されるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させ、宿主細胞界面活性剤ライセートを産生するのに有効である。

【0060】

一部の実施形態では、宿主細胞の懸濁液および界面活性剤を含む溶解溶液は、溶解溶液の添加中および／または全ての溶解溶液が添加された後の期間にわたり混合されて、２つの溶液の徹底的な混合をもたらす。一部の実施形態では、そのような混合は、少なくとももしくは約５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、７５分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１５分間、１２０分間、１５０分間、３時間、４時間、５時間、６時間もしくはそれを超える、または１５分間～９０分間等、前述の時間のうちいずれか２つを含めたそれらの間の範囲、または何らかの他の時間の範囲にわたり行うことができる。一部の実施形態では、混合後に、宿主細胞懸濁液および界面活性剤溶解溶液の混合物は、活発な混合を行うことなく、ある期間にわたり保持またはインキュベートされる。一部の実施形態では、保持期間は、少なくとももしくは約５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、７５分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１５分間、１２０分間、１５０分間、３時間、４時間、５時間、６時間もしくはそれを超える、または１５分間～９０分間等、前述の時間のうちいずれか２つを含めたそれらの間の範囲、または何らかの他の時間の範囲であり得る。一部の実施形態では、混合および／または保持は、約室温、例えば、２０～２２℃、または約２℃～８℃、４℃もしくは３７℃等、何らかの他の温度で行われる。

【0061】

宿主細胞ＤＮＡの沈殿
宿主細胞の溶解は、細胞が懸濁されている周囲の流体、例えば、育成培地中に宿主細胞ＤＮＡを放出する。宿主細胞ＤＮＡの相当な割合がゲノムＤＮＡであるが、溶解された宿主細胞から放出されたいずれかのＤＮＡ、例えば、ミトコンドリアＤＮＡおよび／またはプラスミドＤＮＡを含むことができる。本方法の目標は、溶解された宿主細胞の試料における宿主細胞ＤＮＡの量を低減させることであるが、本方法は、一部の実施形態では、ライセートからＲＮＡと共に、クロマチンとして宿主細胞ＤＮＡと複合体形成したヒストン等のタンパク質を少なくとも部分的に除去するのに有効となる可能性もある。宿主細胞ＤＮＡは、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを除去するのに有効であることが当技術分野で公知のいずれかの技法によって、宿主細胞のライセートから除去することができる。本明細書で使用される場合、宿主細胞のライセートからの宿主細胞ＤＮＡの除去は、そのようなＤＮＡ全ての除去を要求しないが、後述でより明らかとなるように、ライセートの一部分における宿主細胞ＤＮＡの量の単なる低減を要求する。

【0062】

一部の実施形態では、カチオン性界面活性剤等のカチオン性有機化合物とＤＮＡを接触させることにより宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることにより、宿主細胞ＤＮＡは、ライセートから除去することができる。そのような接触は、適した容器において、カチオン性界面活性剤（すなわち、ＤＮＡ沈殿溶液）および場合によりバッファー等の他の構成成分を含むストック溶液を宿主細胞ライセートに添加して、宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに十分な、ライセートにおけるカチオン性界面活性剤の最終濃度（例えば、％重量／体積、％重量／重量または容積モル濃度として）を達成し、次いで、ライセート全体にわたりカチオン性界面活性剤を均等に分布させ、ＤＮＡに接触させるように混合することにより、簡便に行うことができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ沈殿が行われる容器は、宿主細胞溶解が行われたバイオリアクター等の同じ容器である。ＤＮＡ沈殿溶液は、宿主細胞ＤＮＡが、当技術分野で公知であるいずれかの仕方で、例えば、宿主細胞が懸濁された流体の上に位置するチューブ経由等、上からまたは表面下添加ラインもしくはチューブ経由等、バイオリアクターのいずれか所望の高さでそのような流体の表面より下から、１つもしくは複数のボーラスとして、またはＤＮＡ沈殿溶液の所望の体積全体が添加されるまで継続的に沈殿されることになるバイオリアクターまたはいずれかの容器に添加することができる。混合は、ＤＮＡ沈殿溶液が添加されている間におよび／またはその後のある期間にわたり起こり、それぞれの場合において、ライセートおよびＤＮＡ沈殿溶液を一緒に徹底的に混合することができる。混合は、羽根車またはポンプの使用等、当技術分野で公知であるいずれかの仕方で行うことができる。

【0063】

理論に制約されることは望まないが、カチオン性界面活性剤における正に荷電した基は、ＤＮＡ骨格における負に荷電したリン酸と静電気的に相互作用することができ、一方、界面活性剤分子内の疎水性の基は、非共有結合的に相互作用して、水を排除し、ＤＮＡおよび界面活性剤分子の複合体を沈殿させると考えられる。初期に、粒子は、非常に小型であり、溶液中で懸濁状態を維持するが、所望であればモニターすることができる濁度の増加を引き起こすことにより検出可能（detectible）となり得る。しかし、沈殿反応が進むにつれて、複合体形成したＤＮＡおよび界面活性剤のこれまでより大型の粒子が合体し、最終的に、重力の影響下で溶液から沈降することができる十分なサイズの凝集物（凝集塊）を形成し、沈殿反応が生じる封じ込め容器（例えば、ボトル、タンクまたは撹拌タンクバイオリアクターその他）の底に凝結物を形成し、その上に、ＡＡＶベクター等の生物由来生成物を含有する部分的に清澄化された上清が形成される。典型的に、凝結物は、低密度であり、容易に撹乱され、そのため、ライセート中にカチオン性界面活性剤を分布させるための混合後に、混合物は、カチオン性界面活性剤およびＤＮＡが相互作用して、溶液から凝結物として沈降する沈殿物を形成することを可能にするために、多くの場合、有意な混合もかき混ぜも行わずに、またはせいぜい穏やかな混合下で保持またはインキュベートされる。

【0064】

一部の実施形態では、カチオン性界面活性剤は、四級アンモニウムカチオンにおける電荷が、臭化物、塩化物またはヨウ化物等のハロゲン化物によってバランスを取られた、アルキル－ジメチル－（２－フェノキシエチル）アザニウムまたはその塩等の四級アンモニウム化合物である。一部の実施形態では、カチオン性界面活性剤は、アルキル置換基がＣ_６～Ｃ_１８またはＣ_８～Ｃ_１６、Ｃ_１０～Ｃ_１４またはＣ_１２であり、ハロゲン化物が臭化物、塩化物またはヨウ化物である、アルキル－ジメチル－（２－フェノキシエチル）アザニウムハロゲン化物である。一部の実施形態では、カチオン性界面活性剤は、ドミフェン（ＣＡＳ登録番号１３９００－１４－６）とも呼ばれるドデシル－ジメチル－（２－フェノキシエチル）アザニウムであり、ハロゲン化物は、臭化物、塩化物またはヨウ化物である。さらに他の実施形態では、カチオン性界面活性剤は、「ＤＢ」と省略される、ドミフェン臭化物（ＣＡＳ登録番号５３８－７１－６）とも呼ばれるドデシル－ジメチル－（２－フェノキシエチル）アザニウム臭化物である。

【0065】

一部の実施形態では、ライセートとの混合物におけるドミフェン臭化物 （ＤＢ）等のドデシル－ジメチル－（２－フェノキシエチル）アザニウムハロゲン化物等のアルキル－ジメチル－（２－フェノキシエチル）アザニウムハロゲン化物等のカチオン性界面活性剤の最終濃度（％重量／体積（ｗ／ｖ）または重量／重量（ｗ／ｗ）。これらは、相対的に希薄な水溶液では同等である）は、少なくとももしくは約０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％、０．２５％、０．３０％、０．３５％、０．４０％、０．４５％もしくは０．５０％、または０．１０％～０．５０％、０．１０％～０．４０％、０．１０％～０．３０％、０．１０％～０．２０％、０．１５％～０．４５％、０．２０％～０．５０％、０．２０％～０．４０％、０．２０％～０．３０％、０．２５％～０．３５％、０．２５％～０．４５％、０．３０％～０．５０％、０．３０％～０．４０％、０．４０％～０．５０％等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の濃度の範囲、または何らかの他の濃度の範囲である。

【0066】

一部の実施形態では、約０．３％の最終濃度におけるＤＢは、少なくとももしくは約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、または約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬもしくは１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の生細胞密度の範囲等、収集時に高い生細胞密度であっても、溶解された宿主細胞の界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。後者の２つの例示的な範囲において、０．３％ＤＢの最終濃度は、それぞれ１ｍＬ当たり１０^６個の生存宿主細胞当たり０．０３％～０．０１％、または１ｍＬ当たり１０^６個の生存宿主細胞当たり０．０２％～０．０１２％に等しい。これらの因数を使用して、いずれか特定の生細胞密度で宿主細胞ＤＮＡを有効に沈殿させるのに使用することができるＤＢの最終濃度範囲を計算することができる。例えば、一部の実施形態では、約０．１％～０．３％または約０．１２％～０．２％の最終濃度におけるＤＢは、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度で宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効であり、約０．２％～０．６％または約０．２４％～０．４％の最終濃度におけるＤＢは、約２０×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度で宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効であり、約０．３％～０．９％または約０．３６％～０．６％の最終濃度におけるＤＢは、約３０×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度で宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。同様の様式で、一部の実施形態では、約０．６％～１．８％または約０．７２％～１．２％の最終濃度におけるＤＢは、約６０×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度で宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００９％、０．００８％または０．００７％以上の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞の界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。前述の実施形態のいずれかに関するさらに他の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶベクターを産生した、懸濁液において育成されたＨＥＫ２９３細胞であり得、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ピコグラム（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）未満であり得、ライセートにおけるＡＡＶベクターの量に対する上清におけるＡＡＶベクターの量（収率）は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。

【0067】

前述の実施形態では、ＤＢの最終濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度に対する比は、約０．６である。他の実施形態では、この比は、ＡＡＶベクター等の生物由来生成物の収率を実質的に低減させることなく、また、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量を実質的に増加させることなく、若干変動し得る。例えば、一部の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度は、約０．３％であり得、ＤＢの最終濃度は、約０．１０％～０．６０％（または、約０．３３～２のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．１５％～０．５５％（または、約０．５～１．８３のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．５０％（または、約０．６７～１．６７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．４５％（または、約０．６７～１．５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．４０％（または、約０．６７～１．３３のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．３５％（または、約０．６７～１．１７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．５０％（または、約０．８３～１．６７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．４５％（または、約０．８３～１．５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．４０％（または、約０．８３～１．３３のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．３５％（または、約０．８３～１．１７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）に変動し得る、約０．３％（または、約１のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）であり得る、または約０．２％（または、約０．６７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）であり得る。前述の実施形態のいずれかでは、収集時の生存宿主細胞の濃度は、少なくとももしくは約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、または約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬもしくは１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の生細胞密度の範囲であり得る。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００９％、０．００８％または０．００７％以上の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞の界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。前述の実施形態のいずれかに関するさらに他の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶベクターを産生した、懸濁液において育成されたＨＥＫ２９３細胞であり得、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ピコグラム未満（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）であり得、ライセートにおけるＡＡＶベクターの量に対する上清におけるＡＡＶベクターの量（収率）は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。

【0068】

一部の他の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度は、約０．３％～０．４％または約０．４％であり得、ＤＢの最終濃度は、約０．１０％～０．６０％（または、約０．２５～１．５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．１５％～０．５５％（または、約０．３８～１．３８のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．５０％（または、約０．５～１．２５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．４５％（または、約０．５～１．１３のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．４０％（または、約０．５～１のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．３５％（または、約０．５～０．８８のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．５０％（または、約０．６３～１．１５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．４５％（または、約０．６３～１．１３のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．４０％（または、約０．６３～１のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．３５％（または、約０．６３～０．８８のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）に変動し得る、約０．３％（または、約０．７５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）であり得る、または約０．２％（または、約０．５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）であり得る。前述の実施形態のいずれかでは、収集時の生存宿主細胞の濃度は、少なくとももしくは約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、または約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬもしくは１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の生細胞密度の範囲であり得る。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００９％、０．００８％または０．００７％以上の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞の界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。前述の実施形態のいずれかに関するさらに他の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶベクターを産生した、懸濁液において育成されたＨＥＫ２９３細胞であり得、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ピコグラム未満（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）であり得、ライセートにおけるＡＡＶベクターの量に対する上清におけるＡＡＶベクターの量（収率）は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。

【0069】

一部の他の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度は、約０．４％～０．５％または約０．５％であり得、ＤＢの最終濃度は、約０．１０％～０．６０％（または、約０．２～１．２のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．１５％～０．５５％（または、約０．３～１．１のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．５０％（または、約０．４～１のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．４５％（または、約０．４～０．９のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．４０％（または、約０．４～０．８のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．３５％（または、約０．４～０．７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．５０％（または、約０．５～１のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．４５％（または、約０．５～０．９のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．４０％（または、約０．５～０．８のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．３５％（または、約０．５～０．７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）に変動し得る、約０．３％（または、約０．６のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）であり得る、または約０．２％（または、約０．４のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）であり得る。前述の実施形態のいずれかでは、収集時の生存宿主細胞の濃度は、少なくとももしくは約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、または約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬもしくは１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の生細胞密度の範囲であり得る。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００９％、０．００８％または０．００７％以上の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞の界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。前述の実施形態のいずれかに関するさらに他の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶベクターを産生した、懸濁液において育成されたＨＥＫ２９３細胞であり得、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ピコグラム未満（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）であり得、ライセートにおけるＡＡＶベクターの量に対する上清におけるＡＡＶベクターの量（収率）は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。

【0070】

一部の他の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度は、約０．５％～０．６％または約０．６％であり得、ＤＢの最終濃度は、約０．１０％～０．６０％（または、約０．１７～１のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．１５％～０．５５％（または、約０．２５～０．９２のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．５０％（または、約０．３３～０．８３のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．４５％（または、約０．３３～０．７５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．４０％（または、約０．３３～０．６７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．３５％（または、約０．３３～０．５８のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．５０％（または、約０．４２～０．８３のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．４５％（または、約０．４２～０．７５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．４０％（または、約０．４２～０．６７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．３５％（または、約０．４２～０．５８のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）に変動し得る、約０．３％（または、約０．５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）であり得る、または約０．２％（または、約０．３３のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）であり得る。前述の実施形態のいずれかでは、収集時の生存宿主細胞の濃度は、少なくとももしくは約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、または約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬもしくは１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の生細胞密度の範囲であり得る。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００９％、０．００８％または０．００７％以上の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞の界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。前述の実施形態のいずれかに関するさらに他の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶベクターを産生した、懸濁液において育成されたＨＥＫ２９３細胞であり得、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ピコグラム未満（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）であり得、ライセートにおけるＡＡＶベクターの量に対する上清におけるＡＡＶベクターの量（収率）は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。

【0071】

一部の他の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度は、約０．６％～０．７％または約０．７％であり得、ＤＢの最終濃度は、約０．１０％～０．６０％（または、約０．１４～０．８６のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．１５％～０．５５％（または、約０．２１～０．７９のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．５０％（または、約０．２９～０．７１のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．４５％（または、約０．２９～０．６４のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．４０％（または、約０．２９～０．５７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２０％～０．３５％（または、約０．２９～０．５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．５０％（または、約０．３６～０．７１のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．４５％（または、約０．３６～０．６４のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．４０％（または、約０．３６～０．５７のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）、０．２５％～０．３５％（または、約０．３６～０．５のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）に変動し得る、約０．３％（または、約０．４３のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）であり得る、または約０．２％（または、約０．２９のＤＢ対Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の比）であり得る。前述の実施形態のいずれかでは、収集時の生存宿主細胞の濃度は、少なくとももしくは約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２１×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２２×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２３×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２６×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２７×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２８×１０^６ｖｃ／ｍＬ、２９×１０^６ｖｃ／ｍＬ、３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、または約９×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～１４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１８×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２４×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬもしくは１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の生細胞密度の範囲であり得る。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００９％、０．００８％または０．００７％以上の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞の界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。前述の実施形態のいずれかに関するさらに他の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶベクターを産生した、懸濁液において育成されたＨＥＫ２９３細胞であり得、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ピコグラム未満（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）であり得、ライセートにおけるＡＡＶベクターの量に対する上清におけるＡＡＶベクターの量（収率）は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。

【0072】

一部の他の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度で、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞等の宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加されたＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１０％～０．０３０％の最終濃度で、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞等の宿主細胞の試料に添加されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させ、宿主細胞界面活性剤ライセートを産生するのに有効であり、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１２％～０．０２０％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させるのに有効であり、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１３％～０．０４０％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させるのに有効であり、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１６％～０．０２７％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させるのに有効であり、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１７％～０．０５０％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させるのに有効であり、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させるのに有効であり、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０２０％～０．０６０％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させるのに有効であり、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０２３％～０．０７０％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させるのに有効であり、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０２４％～０．０４０％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させるのに有効であり、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０２８％～０．０４７％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、宿主細胞を溶解させるのに有効であり、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００４％～０．００７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００７％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．００８％～０．０１３％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１０％～０．０３０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１２％～０．０２０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１３％～０．０４０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１６％～０．０２７％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０１７％～０．０５０％、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり０．０２０％～０．０３３％の最終濃度におけるＤＢは、宿主細胞界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効である。

【0073】

一部の実施形態では、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、細胞は、ＡＡＶベクターを産生し、細胞の溶解に使用されるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度は、約０．３５％～０．６５％または０．４％～０．６％の範囲に及び、宿主細胞ＤＮＡの沈殿に使用されるＤＢの最終濃度は、約０．１５％～０．４５％または０．２％～０．４％の範囲に及び、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ピコグラム（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）未満であり、ライセートにおけるＡＡＶベクターの量に対する上清におけるＡＡＶベクターの量（収率）は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％または５０％である。これらの実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0074】

一部の実施形態では、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、細胞は、ＡＡＶベクターを産生し、細胞の溶解に使用されるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度は、約０．４％～０．６％の範囲に及び、宿主細胞ＤＮＡの沈殿に使用されるＤＢの最終濃度は、約０．２％～０．４％の範囲に及び、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約５０ピコグラム（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）未満であり、ライセートにおけるＡＡＶベクターの量に対する上清におけるＡＡＶベクターの量（収率）は、少なくとも約４０％である。これらの実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0075】

一部の実施形態では、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの範囲に及び、細胞は、ＡＡＶベクターを産生し、細胞の溶解に使用されるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度は、約０．５％であり、宿主細胞ＤＮＡの沈殿に使用されるＤＢの最終濃度は、約０．２％～０．３％の範囲に及び、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約５０ピコグラム（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）未満であり、ライセートにおけるＡＡＶベクターの量に対する上清におけるＡＡＶベクターの量（収率）は、少なくとも約４０％である。これらの実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0076】

一部の実施形態では、宿主細胞ライセート、およびＤＢ等のカチオン性界面活性剤を含むＤＮＡ沈殿溶液は、ＤＮＡ沈殿溶液の添加の最中のおよび／またはＤＮＡ沈殿溶液が全て添加された後の期間にわたり混合されて、２つの溶液の徹底的な混合をもたらす。一部の実施形態では、そのような混合は、少なくとももしくは約５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、７５分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１５分間、１２０分間、１５０分間、１８０分間、または１５分間～６０分間等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の時間の範囲、または何らかの他の時間の範囲にわたり行うことができる。一部の実施形態では、混合後に、宿主細胞ライセート、およびＤＢ等のカチオン性界面活性剤を含むＤＮＡ沈殿溶液の混合物は、凝集塊の沈降を可能にするために、活発な混合を行うことなく、ある期間にわたり保持される。一部の実施形態では、保持期間は、少なくとももしくは約５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、７５分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１５分間、１２０分間、１５０分間、３時間、４時間、５時間、６時間もしくはそれを超える、または３０分間～３時間、１時間～６時間等、前述の時間のうちいずれか２つを含めたそれらの間の範囲、または何らかの他の時間の範囲であり得る。一部の実施形態では、混合および／または保持は、約室温、例えば、約２０℃～２２℃、または約２℃～８℃、４℃もしくは３７℃等、何らかの他の温度で行われる。

【0077】

上清からの凝結した宿主細胞ＤＮＡの分離
凝結した宿主細胞ＤＮＡおよび上清を分離するのに有効であることが当技術分野で公知のいずれかの技法によって、凝結した宿主細胞ＤＮＡを上清から分離することができる。上に記す通り、一部の実施形態では、通常、沈降が生じている間に混合することなく、宿主細胞ライセートおよびＤＮＡ沈殿溶液が混合された容器の底に、ある期間にわたり重力の影響下で凝集塊を沈降させることにより、凝結した宿主細胞ＤＮＡを上清から分離することができる。その代わりに、連続流遠心分離等の遠心分離によって、凝結した宿主細胞ＤＮＡを上清から分離することができる。凝集塊は、１つまたは複数のデプスフィルターを通して混合物から除去することもできる。

【0078】

部分的に清澄化された上清（ライセート）が、凝結した宿主細胞ＤＮＡの層の上に形成されたら、上清または凝結物をポンピングによって除去することができる。例えば、その端が上清に浸漬されているが凝結物層の上に位置する、上から挿入されたチューブを通して、または凝結物の層の上に配置された容器の壁を通って挿入されたポートを通して、上清をポンピングして出すことができる。その代わりに、その端が凝結物に浸漬されている、上から挿入されたチューブを通して、または容器の底にある、もしくは上清の下に配置された容器の壁を通って挿入されたポートを通して、凝結物をポンピングして出すことができる。これらの方法の組合せを使用することもできる。典型的に、凝結した宿主細胞ＤＮＡから除去または分離された後に、上清は、新たな容器に移される。

【0079】

一部の実施形態では、部分的に清澄化された上清は、ポンピング等によって凝結した宿主細胞ＤＮＡから除去または分離された後に、例えば、１つまたは複数のデプスフィルターおよび／または膜フィルターを通した濾過によって、除去プロセス中に運ばれた可能性のあるいかなる凝集塊も除去するように濾過される。部分的に清澄化された上清（ライセート）の濾過は、清澄化された上清（ライセート）をもたらす。一部の実施形態では、フィルターのうち１つまたは複数は、約１００μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２５μｍ、２０μｍ、１５μｍ、１０μｍ、５μｍ、２μｍ、１μｍまたは０．５μｍ以下の名目上の保持評定または平均ポアサイズを有する。

【0080】

残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿の阻害
宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるステップは、多くの場合、粗宿主細胞界面活性剤ライセートから相当な割合のＤＮＡを除去するのに高度に有効となるであろうが、特に、所望の生物由来生成物が、細胞内でかつその溶解の直前に産生されながら、宿主細胞が、高い生細胞密度まで育成または維持された場合、ある程度の残渣および複合体形成しなかった宿主細胞ＤＮＡならびにカチオン性界面活性剤が、前のステップから、部分的に清澄化されたまたは清澄化された上清（ライセート）に残り得ることが予想される。介入がなければ、残渣ＤＮＡおよびＤＢ等の界面活性剤は、複合体形成し続けることができるが、通常これは、それらのより低い濃度が原因で、より遅い速度となり、経時的に増加している濁度として検出されるのに十分なサイズの粒子を徐々に形成する。濁度の増加が僅かな程度のものである場合であっても、この進行中のプロセスは、十分な濃度のそのような粒子を産生して、時に著しく、ＡＡＶベクター等の所望の生物由来生成物をさらに精製することを意図する下流処理ステップの効率を低減させ得る。この問題に取り組むために、一部の実施形態では、本開示の方法は、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するステップをさらに含む。

【0081】

上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効であることが当技術分野で公知のいずれかの技法を使用して、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿は、例えば、ＤＢ等のドミフェンハロゲン化物による宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに十分な、ある量の塩を上清に添加することにより阻害される。一部の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）または塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）である。一部の実施形態では、塩は、固体形態で、または塩（すなわち、塩溶液）および場合により、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等の界面活性剤等の他の成分を含む濃縮ストック溶液において、いずれか所望の最終濃度まで、例えば、約０．５％（ｗ／ｖまたはｗ／ｗ）の上清における最終濃度を達成するのに十分な量で、上清に添加することができる。

【0082】

一部の実施形態では、上清、および塩を含む溶液は、ある期間にわたり混合されて、２つの溶液の徹底的な混合をもたらし、混合物を形成し、次いで場合により、濾過される、および／または混合することなく、貯蔵等において、ある期間にわたり保持（インキュベート）される。一部の実施形態では、混合および／または保持は、約室温、例えば、約２０℃～２２℃、または約２℃～８℃、４℃もしくは３７℃等、何らかの他の温度で行われる。一部の実施形態では、上清、および塩を含む溶液の混合は、少なくとももしくは約５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、７５分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１５分間、１２０分間、１５０分間、１８０分間、または１５分間～６０分間等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の時間の範囲、または何らかの他の時間の範囲にわたり行われる。

【0083】

一部の実施形態では、例えば、ＤＢ等のドミフェンハロゲン化物による上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するステップは、凝結した宿主細胞ＤＮＡから上清を除去または分離し、場合により上清を濾過する、前のステップの直後に行われる。一部の実施形態では、上清を除去し、場合により濾過するステップの終結と、沈殿を阻害するステップの開始との間の遅延は、約１２時間、６時間、３時間、２時間、１時間、４５分間、３０分間、１５分間、１０分間、５分間またはそれに満たない時間未満である。

【0084】

一部の実施形態では、上清における添加された塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４もしくはＭｇＣｌ_２または別の添加された塩の、その添加後の最終濃度は、少なくとももしくは約５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭ、７００ｍＭ、７５０ｍＭもしくは８００ｍＭ、または１０ｍＭ～２００ｍＭ、１０ｍＭ～４００ｍＭ、２００ｍＭ～６００ｍＭ、２００ｍＭ～８００ｍＭ、３００ｍＭ～５００ｍＭ、３００ｍＭ～６００ｍＭ、２５０ｍＭ～６００ｍＭ、２５０ｍＭ～４００ｍＭもしくは４００ｍＭ～６００ｍＭ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の濃度の範囲である。一部の実施形態では、宿主細胞ＤＮＡは、ＤＢ等のドミフェンハロゲン化物により沈殿される。

【0085】

明確にするために、本明細書に記載されている添加された塩の最終濃度が、上清中に先在し得る同じ型の塩の濃度を考慮しない、添加された塩の最終濃度を指すことに留意されたい。例えば、当技術分野で周知の通り、様々な種類の細胞培養培地は、ＮａＣｌおよびＫＣｌ等の塩を既に含み、既に存在するそのような塩の濃度は、他に指示がない限り、添加された塩の最終濃度の値に含まれない。

【0086】

一部の実施形態では、塩は、ＮａＣｌまたはＫＣｌであり、上清における添加された塩の最終濃度は、少なくとももしくは約１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭもしくは６００ｍＭ、または約２００ｍＭ～３００ｍＭ、２００ｍＭ～４００ｍＭ、２００ｍＭ～５００ｍＭ、２００ｍＭ～６００ｍＭ、２００ｍＭ～７００ｍＭ、２００ｍＭ～８００ｍＭ、３００ｍＭ～５００ｍＭ、３００ｍＭ～６００ｍＭ、２５０ｍＭ～６００ｍＭ、２５０ｍＭ～４００ｍＭ、２５０ｍＭ～３５０ｍＭもしくは４００～６００ｍＭ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の濃度の範囲である。一部の実施形態では、塩は、ＭｇＳＯ_４であり、処理された上清における添加された塩の最終濃度は、少なくともまたは約１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭまたは４００ｍＭであり、一方、他の実施形態では、塩は、ＭｇＣｌ_２であり、処理された上清における添加された塩の最終濃度は、少なくともまたは約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭまたは１００ｍＭである。一部の実施形態では、宿主細胞ＤＮＡは、ＤＢ等のドミフェンハロゲン化物により沈殿される。

【0087】

一部の実施形態では、宿主細胞ＤＮＡは、ＤＢ等のドミフェンハロゲン化物により沈殿され、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度におけるＤＢは、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ、少なくとも（least）約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ、少なくとも（least）約２０×１０^６ｖｃ／ｍＬまたは約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬもしくは１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬ等、収集時に高い生細胞密度であっても、溶解された宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加されたときに宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるのに有効であり、少なくとも約２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、または約２００ｍＭ～８００ｍＭの範囲の添加された塩の最終濃度となるような、ＮａＣｌまたはＫＣｌ等、上清への塩のその後の添加は、混合物における残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害またはクエンチするのに有効である。そのようなクエンチは、例えば、免疫親和性クロマトグラフィー等の下流クロマトグラフィーステップ中のカラム詰まりを低減させることにより、ＡＡＶベクター等の生物由来生成物をさらに精製することを意図する下流処理ステップの効率を有用に増強することができる。

【0088】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭまたは約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約７００ｍＭまたは約７００ｍＭ～８００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0089】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約７００ｍＭまたは約７００ｍＭ～８００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0090】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約２０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭまたは約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約２０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約２０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約２０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約２０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、少なくとも約２０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約７００ｍＭまたは約７００ｍＭ～８００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0091】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭまたは約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約７００ｍＭまたは約７００ｍＭ～８００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0092】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭまたは約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％または０．３％等、約０．１％～０．５％または約０．２％～０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約７００ｍＭまたは約７００ｍＭ～８００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0093】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭまたは約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0094】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．３％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭまたは約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．３％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．３％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．３％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．３％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0095】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭまたは約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0096】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭまたは約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．２％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0097】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．３％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭまたは約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．３％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．３％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．３％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．３％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0098】

一部の実施形態では、ＤＢは、約０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約２００ｍＭまたは約２００ｍＭ～３００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約３００ｍＭまたは約３００ｍＭ～４００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約４００ｍＭまたは約４００ｍＭ～５００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ～６００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。一部の実施形態では、ＤＢは、約０．４％の最終濃度となるように、宿主細胞の界面活性剤ライセートに添加して、ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させることができ、この場合、収集時の生細胞密度は、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬであり、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、約６００ｍＭまたは約６００ｍＭ～７００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加して、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害することができる。前述の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、約０．３％～０．７％または０．４％～０．６％の範囲に及ぶまたは約０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて溶解することができ、宿主細胞は、懸濁培養において育成された、ＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞であり得る。

【0099】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを産生する、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞は、細胞を溶解するために少なくともまたは約０．５％の最終濃度となるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加することにより、少なくともまたは約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度で収集され、ＤＢは、界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるために、少なくともまたは約０．２％の最終濃度となるように添加され、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するために、少なくともまたは約２００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを産生する、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞は、細胞を溶解するために少なくともまたは約０．５％の最終濃度となるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加することにより、少なくともまたは約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度で収集され、ＤＢは、界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるために、少なくともまたは約０．２％の最終濃度となるように添加され、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するために、少なくともまたは約２００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを産生する、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞は、細胞を溶解するために少なくともまたは約０．５％の最終濃度となるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加することにより、少なくともまたは約２０×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度で収集され、ＤＢは、界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるために、少なくともまたは約０．２％の最終濃度となるように添加され、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するために、少なくともまたは約２００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを産生する、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞は、細胞を溶解するために少なくともまたは約０．５％の最終濃度となるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加することにより、約１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ～３０ｖｃ／ｍＬの生細胞密度で収集され、ＤＢは、界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させために、少なくともまたは約０．２％の最終濃度となるように添加され、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するために、少なくともまたは約２００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを産生する、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞は、細胞を溶解するために少なくともまたは約０．５％の最終濃度となるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加することにより、約１５×１０^６ｖｃ／ｍＬ～２５×１０^６ｖｃ／ｍＬの生細胞密度で収集され、ＤＢは、界面活性剤ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるために、少なくともまたは約０．２％の最終濃度となるように添加され、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するために、少なくともまたは約２００ｍＭの最終添加塩濃度となるように、上清に添加される。前述の実施形態のいずれかに関するさらに他の実施形態では、上清における残渣宿主細胞ＤＮＡの量は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約５０ピコグラム（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）未満であり得、ライセートにおけるＡＡＶベクターの量に対する上清におけるＡＡＶベクターの量（すなわち、収率）は、少なくとも約４０％であり得る。

【0100】

一部の実施形態では、ＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、粗ライセートにＤＢを添加することにより宿主細胞ＤＮＡが沈殿された界面活性剤溶解された宿主細胞（例えば、懸濁培養において育成されたＨＥＫ２９３細胞）から調製された上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの濃度は、それが溶解された時点における、宿主細胞の生細胞密度（例えば、細胞が懸濁された流体１ミリリットル当たりの生細胞の数（ｖｃ／ｍＬ））に対する添加された塩の量を単位として表すことができる。よって、例えば、一部の実施形態では、ＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００３％～０．０１０％の最終濃度で粗ライセートに添加されたＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００４％～０．００７％の最終濃度で粗ライセートに添加されたＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００７％～０．０２０％の最終濃度で粗ライセートに添加されたＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．００８％～０．０１３％の最終濃度で粗ライセートに添加されたＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１０％～０．０３０％の最終濃度で粗ライセートに添加されたＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１２％～０．０２０％の最終濃度で粗ライセートに添加されたＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１３％～０．０４０％の最終濃度で粗ライセートに添加されたＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。

【0101】

一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１６％～０．０２７％の最終濃度で粗ライセートに添加されたＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０１７％～０．０５０％の最終濃度で粗ライセートに添加されたＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。一部の実施形態では、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約０．０２０％～０．０３３％の最終濃度で粗ライセートに添加されたＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である、上清に添加されるＮａＣｌまたはＫＣｌの最終濃度は、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約６．７ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり８．０ｍＭ～１３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１０．０ｍＭ～３０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１２．０ｍＭ～２０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１３．３ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．０ｍＭ～２６．７ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり１６．７ｍＭ～５０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～３３．３ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２０．０ｍＭ～６０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２３．３ｍＭ～７０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２４．０ｍＭ～４０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２６．７ｍＭ～８０．０ｍＭ、１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり２８．０ｍＭ～４６．７ｍＭ、または１×１０^６ｖｃ／ｍＬ当たり約３２．０ｍＭ～５３．３ｍＭである。

【0102】

一部の実施形態では、％ｗ／ｖまたは％ｗ／ｗとして表される粗宿主細胞ライセートから宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるために添加されたＤＢ等のドミフェンハロゲン化物の最終濃度に対する、１リットル当たりのモル数（Ｍ）で表される上清における添加された塩の最終濃度の比は、少なくともまたは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．３３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９もしくは３．０、または約３．０～０．１、２．９～０．２、２．８～０．２、２．８～０．３、２．７～０．２、２．７～０．３、２．７～０．４、２．６～０．２、２．６～０．３、２．６～０．４、２．６～０．５、２．５～０．２、２．５～０．３、２．５～０．４、２．５～０．５、２．５～０．６、２．５～０．７、２．５～０．８、２．５～０．９、２．５～１．０、２．５～１．１、２．５～１．２、２．５～１．３、２．５～１．４、２．５～１．５、２．５～１．６、２．５～１．７、２．５～１．８、２．５～１．９、２．５～２．０、２．５～２．１、２．５～２．２、２．５～２．３、２．５～２．４、２．４～０．２、２．４～０．３、２．４～０．４、２．４～０．５、２．４～０．６、２．４～０．７、２．４～０．８、２．４～０．９、２．４～１．０、２．４～１．１、２．４～１．２、２．４～１．３、２．４～１．４、２．４～１．５、２．４～１．６、２．４～１．７、２．４～１．８、２．４～１．９、２．４～２．０、２．４～２．１、２．４～２．２、２．４～２．３、２．３～０．２、２．３～０．３、２．３～０．４、２．３～０．５、２．３～０．６、２．３～０．７、２．３～０．８、２．３～０．９、２．３～１．０、２．３～１．１、２．３～１．２、２．３～１．３、２．３～１．４、２．３～１．５、２．３～１．６、２．３～１．７、２．３～１．８、２．３～１．９、２．３～２．０、２．３～２．１、２．３～２．２、２．２～０．２、２．２～０．３、２．２～０．４、２．２～０．５、２．２～０．６、２．２～０．７、２．２～０．８、２．２～０．９、２．２～１．０、２．２～１．１、２．２～１．２、２．２～１．３、２．２～１．４、２．２～１．５、２．２～１．６、２．２～１．７、２．２～１．８、２．２～１．９、２．２～２．０、２．２～２．１、２．１～０．２、２．１～０．３、２．１～０．４、２．１～０．５、２．１～０．６、２．１～０．７、２．１～０．８、２．１～０．９、２．１～１．０、２．１～１．１、２．１～１．２、２．１～１．３、２．１～１．４、２．１～１．５、２．１～１．６、２．１～１．７、２．１～１．８、２．１～１．９、２．１～２．０、２．０～０．２、２．０～０．３、２．０～０．４、２．０～０．５、２．０～０．６、２．０～０．７、２．０～０．８、２．０～０．９、２．０～１．０、２．０～１．１、２．０～１．２、２．０～１．３、２．０～１．４、２．０～１．５、２．０～１．６、２．０～１．７、２．０～１．８、２．０～１．９、１．９～０．２、１．９～０．３、１．９～０．４、１．９～０．５、１．９～０．６、１．９～０．７、１．９～０．８、１．９～０．９、１．９～１．０、１．９～１．１、１．９～１．２、１．９～１．３、１．９～１．４、１．９～１．５、１．９～１．６、１．９～１．７、１．９～１．８、１．８～０．２、１．８～０．３、１．８～０．４、１．８～０．５、１．８～０．６、１．８～０．７、１．８～０．８、１．８～０．９、１．８～１．０、１．８～１．１、１．８～１．２、１．８～１．３、１．８～１．４、１．８～１．５、１．８～１．６、１．８～１．７、１．７～０．２、１．７～０．３、１．７～０．４、１．７～０．５、１．７～０．６、１．７～０．７、１．７～０．８、１．７～０．９、１．７～１．０、１．７～１．１、１．７～１．２、１．７～１．３、１．７～１．４、１．７～１．５、１．７～１．６、１．６～０．２、１．６～０．３、１．６～０．４、１．６～０．５、１．６～０．６、１．６～０．７、１．６～０．８、１．６～０．９、１．６～１．０、１．６～１．１、１．６～１．２、１．６～１．３、１．６～１．４、１．６～１．５、１．５～０．２、１．５～０．３、１．５～０．４、１．５～０．５、１．５～０．６、１．５～０．７、１．５～０．８、１．５～０．９、１．５～１．０、１．５～１．１、１．５～１．２、１．５～１．３、１．５～１．４、１．４～０．２、１．４～０．３、１．４～０．４、１．４～０．５、１．４～０．６、１．４～０．７、１．４～０．８、１．４～０．９、１．４～１．０、１．４～１．１、１．４～１．２、１．４～１．３、１．３～０．２、１．３～０．３、１．３～０．４、１．３～０．５、１．３～０．６、１．３～０．７、１．３～０．８、１．３～０．９、１．３～１．０、１．３～１．１、１．３～１．２、１．２～０．２、１．２～０．３、１．２～０．４、１．２～０．５、１．２～０．６、１．２～０．７、１．２～０．８、１．２～０．９、１．２～１．０、１．２～１．１、１．１～０．２、１．１～０．３、１．１～０．４、１．１～０．５、１．１～０．６、１．１～０．７、１．１～０．８、１．１～０．９、１．１～１．０、１．０～０．２、１．０～０．３、１．０～０．４、１．０～０．５、１．０～０．６、１．０～０．７、１．０～０．８、１．０～０．９、０．９～０．２、０．９～０．３、０．９～０．４、０．９～０．５、０．９～０．６、０．９～０．７、０．９～０．８、０．８～０．２、０．８～０．３、０．８～０．４、０．８～０．５、０．８～０．６、０．８～０．７、０．７～０．２、０．７～０．３、０．７～０．４、０．７～０．５、０．７～０．６、０．６～０．２、０．６～０．３、０．６～０．４、０．６～０．５、０．５～０．２、０．５～０．３、０．５～０．４、０．４～０．２、０．４～０．３もしくは０．３～０．２等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の範囲である。

【0103】

上清への塩の添加は、上清のイオン強度を高め、イオン強度は、その使用が当業者の知識範囲内である伝導率プローブおよびメーターを使用して測定することができ、１センチメートル当たりのミリシーメンス（ｍＳ／ｃｍ）等の適した単位で表すことができる、溶液の伝導率の増加等の様々な仕方で表すことができる。一部の実施形態では、上清への塩の添加は、上清の伝導率を、塩の添加前のその伝導率と比べて、少なくとももしくは約５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、２０ｍＳ／ｃｍ、２５ｍＳ／ｃｍ、３０ｍＳ／ｃｍ、３５ｍＳ／ｃｍ、４０ｍＳ／ｃｍ、４５ｍＳ／ｃｍ、５０ｍＳ／ｃｍ、５５ｍＳ／ｃｍ、６０ｍＳ／ｃｍ、６５ｍＳ／ｃｍ、７０ｍＳ／ｃｍ、７５ｍＳ／ｃｍ、８０ｍＳ／ｃｍ、８５ｍＳ／ｃｍ、９０ｍＳ／ｃｍ、９５ｍＳ／ｃｍもしくは１００ｍＳ／ｃｍ、または５ｍＳ／ｃｍ～６０ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ～６０ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ～６０ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ～５５ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ～５０ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ～４５ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ～４０ｍＳ／ｃｍもしくは１５ｍＳ／ｃｍ～３５ｍＳ／ｃｍ等、前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の伝導率の範囲、または何らかの他の範囲だけ増加させる。

【0104】

一部の実施形態では、混合後に、上清および塩溶液の混合物は、例えば、深層濾過、限外濾過、ナノ濾過または透析濾過によって濾過することができる。一部の実施形態では、濾過は、約１０μｍ、５μｍ、２μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．２μｍまたは０．１μｍ以下の平均ポアサイズを有する膜フィルター等の１つまたは複数の膜フィルターを使用して行われる。

【0105】

一部の実施形態では、混合および場合により濾過後に、上清および塩溶液の混合物は、混合物における宿主細胞の生物由来生成物を精製することを意図する少なくとも１つの追加の下流処理ステップを行う前に、活発に混合することなく、ある期間にわたり、バッグ、ブレイク（break）タンクもしくは使い捨てミキサー、または当技術分野で公知の他の容器等、何らかの種類の適した容器内の貯蔵等において、保持（インキュベート）することができる。一部の実施形態では、保持期間は、約９６時間、７２時間、４８時間、３６時間、２４時間、１２時間、９時間、６時間、３時間、２時間、９０分間、６０分間、４５分間、３０分間、１５分間または１０分間以下である。一部の実施形態では、混合物は、約室温、例えば、約２０℃～２２℃、または約２℃～８℃、４℃もしくは３７℃等、何らかの他の温度で保持される。

【0106】

実施例セクションに記載されている通り、ＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿が原因の濁度は、経時的に増加することができ、その結果生じる沈殿物は、親和性クロマトグラフィー等の下流処理ステップの効率を劇的に低減させることができ、ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはその他等の塩の添加は、濃度依存的様式で、この進行中の沈殿を阻害することができる。さらに、より高い塩濃度の阻害効果は、沈殿が生じ得る、より長い期間にわたり最も明らかである。結果的に、一部の実施形態では、保持時間が相対的に短い場合、残渣宿主細胞ＤＮＡの進行中の沈殿を阻害するために、より低い最終濃度の添加された塩を使用し、逆に、保持時間が比較的に長い場合、進行中の沈殿を阻害するために、より高い最終濃度の添加された塩を使用することが可能となり得る。例えば、一部の実施形態では、塩添加と、クロマトグラフィー等のその後の精製ステップとの間の保持時間が、約２４時間またはそれに満たない時間である場合、ＮａＣｌまたはＫＣｌ等の塩は、約１００ｍＭ、または約１００ｍＭ～２００ｍＭ、１００ｍＭ～３００ｍＭ、１００ｍＭ～４００ｍＭ、１００ｍＭ～５００ｍＭ、１００ｍＭ～６００ｍＭの最終濃度となるように、上清に添加することができる。他の実施形態では、塩添加と、クロマトグラフィー等のその後の精製ステップとの間の保持時間が、約３６時間またはそれに満たない時間である場合、ＮａＣｌまたはＫＣｌ等の塩は、約２００ｍＭ、または約２００ｍＭ～３００ｍＭ、２００ｍＭ～４００ｍＭ、２００ｍＭ～５００ｍＭ、２００ｍＭ～６００ｍＭ、または約３００ｍＭ、または約３００ｍＭ～４００ｍＭ、３００ｍＭ～５００ｍＭもしくは３００ｍＭ～６００ｍＭ、または約４００ｍＭ、または約４００ｍＭ～５００ｍＭもしくは４００ｍＭ～６００ｍＭの最終濃度となるように、上清に添加することができる。一部の他の実施形態では、塩添加と、クロマトグラフィー等のその後の精製ステップとの間の保持時間が、約４８時間またはそれに満たない時間である場合、ＮａＣｌまたはＫＣｌ等の塩は、約３００ｍＭ、または約３００ｍＭ～４００ｍＭ、３００ｍＭ～５００ｍＭもしくは３００ｍＭ～６００ｍＭ、または約４００ｍＭ、または約４００ｍＭ～５００ｍＭもしくは４００ｍＭ～６００ｍＭの最終濃度となるように、上清に添加することができる。また、さらに他の実施形態では、塩添加と、クロマトグラフィー等のその後の精製ステップとの間の保持時間が、約７２時間またはそれに満たない時間である場合、ＮａＣｌまたはＫＣｌ等の塩は、約４００ｍＭ、または約４００ｍＭ～５００ｍＭもしくは４００ｍＭ～６００ｍＭ、または約５００ｍＭ、または約５００ｍＭ～６００ｍＭ、または約６００ｍＭの最終濃度となるように、上清に添加することができる。

【0107】

上に記載されている実施形態のいずれかにおいて、残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿によって引き起こされた上清（すなわち、清澄化された宿主細胞ライセート）の濁度は、塩溶液の添加およびそれとの混合ならびに場合によりその後の濾過の前またはその直後等、いずれかの簡便なステージまたは時点で、ならびに上清の保持または貯蔵の期間中だが、一部の実施形態では、ＡＡＶベクター等の所望の生物由来生成物をさらに精製することを対象にする１つまたは複数の追加のステップに従ってこれが処理される前等、１つまたは複数のその後の時点でモニターすることができる。濁度は、電子濁度メーター（濁度計）、ネフェロメーター、分光光度計その他を使用すること等により、当技術分野で公知であるいずれかの仕方で検出および定量化することができ、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）またはＪａｃｋｓｏｎ濁度単位（ＪＴＬＪ）等、いずれか簡便な単位で表すことができる。例えば、Ｚｈｕ、Ｙら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｕｓｉｎｇ Ｔｗｏ ＮＩＲ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｃａｍｅｒａｓ、ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ５：５４２１～８（２０２０）；Ｂｉｎ Ｏｍａｒ、ＦＡおよびＭＺ Ｂｉｎ ＭａｔＪａｆｒｉ、Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｉｂｅｒ Ｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｗａｔｅｒ Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ、Ｓｅｎｓｏｒｓ ９：８３１１～３５（２００９）を参照されたい。

【0108】

一部の実施形態では、界面活性剤溶解された宿主細胞から調製された上清への塩の添加は、上清の濁度が、約１００ＮＴＵ、５０ＮＴＵ、４０ＮＴＵ、３０ＮＴＵ、２０ＮＴＵ、１５ＮＴＵ、１４ＮＴＵ、１３ＮＴＵ、１２ＮＴＵ、１１ＮＴＵ、１０ＮＴＵ、９ＮＴＵ、８ＮＴＵ、７ＮＴＵ、６ＮＴＵ、５ＮＴＵ、４ＮＴＵ、３ＮＴＵ、２ＮＴＵ、１ＮＴＵもしくはそれ未満またはそれに満たない、または前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の範囲となるように、ＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するのに有効である。一部の実施形態では、濁度は、１時間もしくはそれに満たない時間以内、または約９６時間、７２時間、４８時間、３６時間、２４時間、１２時間、９時間、６時間、３時間、２時間、９０分間、６０分間、４５分間、３０分間、１５分間もしくは１０分間以下の保持期間の最中もしくはその後等、塩添加後の何らかの期間、または前述の値のうちいずれか２つを含めたそれらの間の何らかの時間の範囲等、塩溶液の添加およびそれとの混合ならびに場合によりその後の濾過の直後に測定される。

【0109】

方法を行うためのシステム
一部の実施形態では、塩溶液は、１つまたは複数のボーラスとしてバッチにおいて上清に添加され、塩溶液の添加中におよび／またはその後に上清と混合される。そのような混合は、ボトル、タンク、撹拌タンクバイオリアクターその他等、いずれか適したサイズおよび構成の封じ込め容器において行うことができる。この様式において、上清および塩溶液の体積全体は、１つまたは複数の別々のステップの経過にわたり、互いに組み合わされる。そのような実施形態では、混合は、羽根車またはポンピングの使用による等、溶液の混合に有効であることが当技術分野で公知のいずれかの仕方で行うことができる。

【0110】

他の実施形態では、上清および塩溶液の容積は、連続的プロセスにおいて一緒に混合されながら、別々に維持することができる。一部の実施形態では、上清および塩溶液を別々に含有する１個または複数の容器手段と、混合手段と、別々の溶液のそれぞれの容器手段から混合手段への流体連絡のための手段とを含むシステムを使用して、連続的混合プロセスをもたらすことができる。一部の実施形態では、システムは、混合手段から、混合物を様々に貯蔵するため、混合物を濾過するためおよび／または混合物から生物由来生成物をさらに精製するための下流の手段への流体連絡のための手段をさらに含む。一部の実施形態では、システムは、ポンプ手段、例えば、蠕動ポンプその他等、いくつかの封じ込め手段から混合手段へと流体を活発に動かすための手段をさらに含む。本開示のシステムは、単一のポンプ手段または複数のそれを含むことができる。一部の実施形態では、本開示のシステムは、塩溶液と混合される前に上清を濾過するための、ならびに／または混合後に上清および塩溶液の混合物を濾過するための手段をさらに含む。

【0111】

一部の実施形態では、容器手段は、生物由来生成物を含む溶液の保持に適することが当技術分野で公知のいずれかの型の容器であり得、その例は、ボトル、タンク、カーボイ、プラスチックバッグまたはバイオリアクターである。封じ込め手段および下流の混合手段の間の流体連絡は、ある場所から別の場所へと溶液を連続的に運ぶための当技術分野で公知のいずれかの仕方でもたらすことができ、その例は、パイプまたはチューブである。そのような流体連絡手段は、容器手段における開口部を通して溶液と一時的に接触させられた（その上部における開口部からタンク内に配置されたチューブ等）、または封じ込め手段の付着ポイントに何らかの様式で永久的にもしくは半永久的に取り付けられた（例えば、締め付け、接着によってまたは摩擦接合により）、別々のワークピースであり得る、または封じ込め手段と一体的であり得る（例えば、溶接によって）。混合手段は、様々な構成の羽根車、撹拌子、回転子／固定子組合せまたは静的インラインミキサー等、その少なくとも１種が生物由来生成物を含有する溶液を一緒に混合するのに有効であることが当技術分野で公知のいずれかのデバイスまたは機序であり得る。封じ込め手段、流体連絡手段および混合手段はそれぞれ、ステンレススチール、ガラスおよびポリエチレン等のプラスチック、またはそのような材料の組合せ等、生物由来生成物と適合性であることが当技術分野で公知のいずれかの材料から作られていてよい。流体連絡手段は、流体連絡をもたらすための単一の手段または複数の手段を含むことができる。例えば、本開示のシステムは、容器手段、濾過手段および混合手段等のシステムの他の構成成分に付属しており、これを流体的に接続する複数のチューブを含むことができる。

【0112】

本開示の方法を行うためのシステムの非限定的な例は、図７Ａに説明されている。本システムにおいて、上清は、使い捨てバイオリアクター（ＳＵＢ）において一時的に保持され、塩（この場合、ＮａＣｌ）を含む濃縮溶液は、別々の容器において保持される。チューブは、ＳＵＢおよび塩溶液のための容器から伸びて、流体が各々から出ることを可能にする。同じであっても異なっていてもよい規定された速度で各溶液をそれぞれの容器からポンピングすることができるように、各チューブは、蠕動ポンプにロードされる。次に、チューブは、中空ＴコネクタまたはＹコネクタで交わり、そこで、２種の溶液が一緒に混ざり、次いで混合物として下流に進むことができる。描写されている通り、上清のポンプの下流かつ中空コネクタの上流に深層濾過装置を位置させること等により、混合前に上清を濾過することができ、出口チューブを経て混合のための中空コネクタに進行する前に、上清は、この装置を通過して濾過され得る。同様に描写されている通り、混合後に、他の管によってそこに接続された、１つまたは複数の膜フィルターを中空コネクタの下流に位置させること等により、混合物を濾過することができる。

【0113】

本開示の方法を行うためのシステムの別の非限定的な例は、図７Ｂに説明されている。本システムにおいて、上清および塩溶液は、第１のシステムの場合と同様に、一時的に保持、ポンピングおよび濾過されるが、中空コネクタで組み合わせて混合することの代わりに、Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ ＸＤＵＯ ＳＵＭ（Ｃｙｔｉｖａ）等の使い捨てミキサー（ＳＵＭ）へとポンピングされ、そこで、上清および塩溶液が一緒に混合される。その後、蠕動ポンプは、ＳＵＭから、場合により膜フィルターを通して、接続管を経て、混合物をポンピングする。本システムは、バッチ式で操作することができ、これは、上清および塩溶液の容積をそれらの容器からＳＵＭへとポンピングし、そこで混合し、その後、下流の処理のためにＳＵＭからポンピングすることができることを意味する。その代わりに、本システムは、連続的に操作することができ、これは、上清および塩溶液を混合のためにそこにポンピングするのと同時に、ＳＵＭにおいて形成された混合物を下流の処理のためにそこからポンピングすることができることを意味する。

【0114】

本開示の方法を行うためのシステムのさらに別の非限定的な例は、図７Ｃに説明されている。本システムにおいて、上清および塩溶液は、第１のシステムの場合と同様に、一時的に保持、ポンピングおよび濾過されるが、上清および塩溶液が初期に組み合わされる中空ＴまたはＹコネクタの下流に位置する、多数の構成が可能な静的インライン混合エレメントにより２種の溶液をポンピングすることにより、混合効率が増強される。そのような静的インライン混合エレメントの使用は、上清および塩溶液が、有意に異なる粘稠性を有する（塩溶液が高濃度の塩を含有して、その粘稠性がより高くなる場合に生じ得る）場合等、様々な状況下での混合を改善することができる。システムは、デプスフィルターの下流かつミキサーの上流に位置する、所望であれば上清のより高速のポンピング（例えば、有効なデプスフィルタリングに十分な圧力を維持するために）を可能にする、ここではＳＵＭとして描写されているブレイクタンクと共に、ブレイクタンクからミキサーへと上清をポンピングするための追加のポンプをさらに含むことができる。同様に描写されている通り、混合後に、他の管によってそこに接続された、１つまたは複数の膜フィルターをミキサーの下流に位置させること等により、混合物を濾過することができる。

【0115】

上に記す通り、上清および塩溶液のポンピング流速は、混合物における所望の最終塩濃度を達成するために上清と混合されるべき塩溶液の相対量を制御する目的で、同じであっても異なっていてもよい。例えば、混合物における添加された塩の所望の最終濃度が、約４００ｍＭとなるべきである場合、４Ｍ塩を含むストック溶液を調製することができる。その後、所望の最終塩濃度を達成するために、１０：１の相対的比率で上清および濃縮塩溶液をポンピングすることができる。一部の実施形態では、コンダクタンスを許容される範囲内に戻すために、相対的ポンプ比率の調整に使用されるフィードバック制御を用いて、混合物のコンダクタンスをリアルタイムでモニターすることができる。混合物における塩の所望の最終濃度およびストック溶液におけるその濃度を考慮して、いずれか適した相対的ポンプ比率が可能である。

【0116】

下流精製ステップ
本明細書で使用される場合、用語「精製する」、「精製された」、「精製」その他は、生物由来生成物またはその試料もしくは調製物に関連して使用される場合、生物由来生成物が得られる出発材料および／または生物由来生成物の精製を意図する逐次精製ステップの一部のスキームにおける前の中間精製ステップと比較した、純度の相対的な増加または改善を示し、他に指定がなければ、特定の定性的または定量的な程度の純度を要求するものではない。

【0117】

一部の実施形態では、上清および塩溶液の混合、ならびに場合により混合物の濾過および／または保持の後に、混合物における生物由来生成物を、そのような生物由来生成物を精製するのに有効であることが当技術分野で公知の少なくとも１つの下流処理ステップにおいてさらに精製することができる。例えば、生成物がモノクローナル抗体である場合、カラムを満たすために使用されるレジンまたはマトリックスがプロテインＡを含有する、親和性クロマトグラフィーカラムを通して混合物をポンピングすることにより、生成物を精製することができる。他の実施形態では、生物由来生成物の性質に応じて、下流処理ステップは、硫酸アンモニウム等のリオトロピック塩における沈殿を含むことができる。他の実施形態では、下流処理ステップは、少なくとも１つの型のクロマトグラフィーを行うステップを含むことができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）；抗体もしくはその抗原結合性断片、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはグリカン等、生物由来生成物に特異的結合することができる、クロマトグラフィーレジンまたはマトリックスに付着されたいずれかの親和性リガンドを使用した親和性クロマトグラフィー；固定化金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）；チオフィリック（thiophilic）吸着クロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；マルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）；偽親和性クロマトグラフィー；およびアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）またはカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）等のイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸまたはＩＥＣ）を限定することなく含む、本開示の方法において有用である多くの型のクロマトグラフィーが当技術分野で公知である。他の実施形態では、下流処理ステップは、例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用した、生物由来生成物の脱塩またはバッファー交換、限外濾過、ナノ濾過および／または透析濾過等の濾過、または濃縮を含むことができる。２つ以上の下流処理ステップの使用が可能であり、複数の下流処理ステップを、当業者の知識に従っていずれかの順序で行うことができる。

【0118】

一部の実施形態では、生物由来生成物は、ＡＡＶベクターであり、ベクターをさらに精製するのに有用な下流ステップは、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを行うステップを限定することなく含むことができる。一部の実施形態では、クロマトグラフィーステップは、抗体に基づく親和性リガンド精製を含み、それによると、抗体またはその抗体断片は、クロマトグラフィーカラムに充填された固定相マトリックスまたはレジンに付着され、次いでこれは、適したバッファーで平衡化され、続いてカラムを通したベクターを含有する上清および塩溶液混合物のポンピング、次いでリガンドに特異的に結合したベクターの溶出が行われる。一部の実施形態では、固相に結合された抗体は、ＩｇＧもしくはその断片、または単鎖ラクダ類抗体（重鎖可変領域ラクダ類抗体等）であり得る。そのようなレジンの非限定的な例として、セファロースＡＶＢ、ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ、ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ８およびＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９が挙げられる。例えば、Ｔｅｒｏｖａ、Ｏら、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ、ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｌ． ｅＢｏｏｋ ｐｐ．２７～３５（２０１７）；Ｍｉｅｔｚｓｃｈ、Ｍら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄｓ： Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．＆Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．、１９：３６２～７３（２０２０）；Ｒｉｅｓｅｒ、Ｒら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｂａｓｅｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １３、７４８（２０２１）（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ１３０５０７４８）を参照されたい。

【0119】

他の実施形態では、クロマトグラフィーステップは、シアル酸（例えば、Ｏ結合型またはＮ結合型シアル酸）、ガラクトース、ヘパリンもしくはヘパラン硫酸等のグリカン、またはヘパランもしくはヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）等のプロテオグリカン等、ある特定のＡＡＶ血清型が細胞への結合において使用する、同じ型のリガンドが結合された固定相の使用を含む。例えば、シアル酸残基を含有する親和性マトリックスは、シアル酸に特異的に結合するカプシドを有するＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５またはＡＡＶ６）の精製に使用することができ；ガラクトースを含有する親和性マトリックスは、ガラクトースに特異的に結合するカプシドを有するＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９）の精製に使用することができ；ヘパリン、ヘパランまたはＨＳＰＧを含有する親和性マトリックスは、ＨＳＰＧに特異的に結合するカプシドを有するＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６またはＡＡＶ１３）の精製に使用することができる。さらに他の例示的な非限定的な実施形態では、カプシド表面の電荷等、ベクターの物理化学的特徴に応じて、ＡＡＶベクターは、アニオン交換、カチオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うことにより、さらに精製することができる。当技術分野で公知のＡＡＶベクターを精製するのに有用な他のいずれかの下流プロセスステップを使用することもできる。

【0120】

一部の実施形態では、本開示の方法は、少なくとも１つの下流処理ステップの性能を改善するのに有効である。一部の実施形態では、下流処理ステップは、親和性クロマトグラフィーであり、改善された性能は、生物由来生成物、例えば、ＡＡＶベクターの収率が、８０％、７０％、６０％または５０％未満等のある特定の閾値を下回る前の、多数の精製サイクルとして測定される。当技術分野で公知の通り、クロマトグラフィーは典型的に、いずれか適したサイズのクロマトグラフィーカラムに、親和性レジン等、行われているクロマトグラフィーの型に適した新鮮な未使用の固定相レジンまたはマトリックスを詰め、次いで、カラムに精製されるべき試料をロードするのに備えて、適した平衡化溶液（複数可）でレジンを洗浄および／または平衡化することにより行われる。その結果、カラムは、精製されるべき生物由来生成物を含有する液体試料がカラムにロードされ、それを通ってポンピングされる、第１の精製サイクルの準備ができている。試料全体がポンピングされて通り過ぎたら、カラムをいずれか適した非変性洗浄溶液（複数可）で洗浄して、生物由来生成物を通常非共有結合により固定相に保持しつつ、夾雑物を除去することができる。その後、カラムを通していずれか適した溶出溶液をポンピングし、溶出液を収集することによって、生成物を溶出することができ、溶出液は、溶出画分において収集することができ、溶出画分はその後に検査して、各々における生物由来生成物の量を決定し、その後に、相当量の生物由来生成物を含有する画分をプールすることができる。一部の実施形態では、溶出後に、固定相は、酸、塩基またはカオトロピック塩等の化学物質を含有するいずれか適した定置洗浄溶液（複数可）で定置洗浄して、いかなる残渣生成物も夾雑物も除去し、次いで、その後の精製サイクルに備えて、平衡化溶液で再平衡化することができる。よって、本明細書で使用される場合、精製サイクルは、クロマトグラフィーカラムを通して試料を泳動し、次いで、固定相に保持されたＡＡＶベクター等の所望の生物由来生成物を溶出するステップを含む。

【0121】

クロマトグラフィーが関与する下流プロセスステップの文脈において、生物由来生成物の「収率」は、クロマトグラフィーステップの前の試料における生成物の総量のパーセンテージとして表される、溶出液プールにおける生成物の総量を意味する。生物由来生成物の量は、当技術分野で公知のいずれかの方法を使用して決定することができる。例えば、生成物がＡＡＶベクターである場合、ベクターの量は、ＩＴＲまたは導入遺伝子もしくは発現カセットの他の部分における配列に対するプライマーを使用した定量的ＰＣＲ（ｐＰＣＲ）を使用して、またはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して、定量化することができ、ミリリットル等の単位体積当たりのベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）を単位としたタイターとして表すことができる。例えば、Ｄｏｂｎｉｋ、Ｄら、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１０、Ａｒｔ．１５７０、ｐｐ．１～１３（２０１９）；Ｗａｎｇ、Ｙら、Ａ ｑＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｉｔｅｒ ｗｉｔｈ ｄｄＰＣＲ－Ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎ． Ｄｅｖｅｌ．、１９：３４１～６（２０２０）；Ｗｅｒｌｉｎｇ、ＮＪら、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．２６：８２～９２（２０１５）を参照されたい。

【0122】

一部の実施形態では、本開示の方法は、親和性クロマトグラフィーを行うことにより、ＡＡＶベクターを精製するのに有効であり、ＡＡＶベクターの収率が、８０％、７０％、６０％または５０％を下回る前に行うことができる親和性クロマトグラフィー精製サイクルの数は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回またはそれを超えるサイクルである。これらの実施形態の一部では、クロマトグラフィーは、免疫親和性クロマトグラフィーであり、ベクターは、ＨＳＰＧよりも強く、シアル酸またはガラクトースに結合する、またはＨＳＰＧに特異的に結合しないかもしくはごく弱く結合するカプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５またはＡＡＶ９を含有する。他の実施形態では、本開示の方法は、親和性クロマトグラフィーを行うことにより、ＡＡＶベクターを精製するのに有効であり、ＡＡＶベクターの収率が５０％を下回る前に行うことができる、親和性クロマトグラフィー精製サイクルの数は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回またはそれを超えるサイクルである。これらの実施形態の一部では、クロマトグラフィーは、免疫親和性クロマトグラフィーであり、ベクターは、ＨＳＰＧよりも強く、シアル酸またはガラクトースに結合するカプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９を含有する。他の実施形態では、本開示の方法は、親和性クロマトグラフィーを行うことにより、ＡＡＶベクターを精製するのに有効であり、ＡＡＶベクターの収率が６０％を下回る前に行うことができる、親和性クロマトグラフィー精製サイクルの数は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回またはそれを超えるサイクルである。これらの実施形態の一部では、クロマトグラフィーは、免疫親和性クロマトグラフィーであり、ベクターは、ＨＳＰＧよりも強く、シアル酸またはガラクトースに結合する、またはＨＳＰＧに特異的に結合しないかもしくは弱く結合するカプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５またはＡＡＶ９を含有する。他の実施形態では、本開示の方法は、親和性クロマトグラフィーを行うことにより、ＡＡＶベクターを精製するのに有効であり、ＡＡＶベクターの収率が７０％を下回る前に行うことができる、親和性クロマトグラフィー精製サイクルの数は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回またはそれを超えるサイクルである。これらの実施形態の一部では、クロマトグラフィーは、免疫親和性クロマトグラフィーであり、ベクターは、ＨＳＰＧよりも強く、シアル酸またはガラクトースに結合する、またはＨＳＰＧに特異的に結合しないかもしくは弱く結合するカプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５またはＡＡＶ９を含有する。

【0123】

一部の実施形態では、本開示の方法は、薬物物質または薬物製品におけるＡＡＶベクター等の所望の生物由来生成物等の活性成分の高い収率および／または純度を達成するのに有効である。この文脈で使用される場合、「収率」は、活性成分の合成または産生において使用される出発材料における同じ化合物もしくは物質またはその前駆物質の量と比較した、薬物物質における活性成分の量を意味する。本明細書で使用される場合、「薬物物質」は、活性成分を精製することを意図する完全なプロセスに起因する実質的に精製された活性成分を含む調製物を意味し、実際に設計または使用された場合に、夾雑物を除去するまたは活性成分をさらに精製することを意図するいかなるさらなるステップを含むこともこれを要求することもない場合、このプロセスは完全である。明確にするために、そのようなさらなるステップは、薬物物質から薬物製品を調製することを単に意図する、バッファー交換、体積低減、または賦形剤の添加その他を含まず、「薬物製品」は、患者への投与のために販売または使用されることになるため、活性成分の完了された剤形である。本明細書で使用される場合、「活性成分」は、疾患の診断、治癒、軽減、処置もしくは予防における薬理学的活性もしくは他の直接的効果を提供すること、または人体の構造もしくはいずれかの機能に影響を与えることを意図する、生物由来物質を含むいずれかの化合物または物質である。活性成分の非限定的な例として、ウイルス、ワクチンおよびウイルス由来のベクター、例えば、ＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクターその他が挙げられる。

【0124】

そのようなベクターの試料または調製物におけるＡＡＶベクターの純度は、当技術分野で公知の種々の仕方で決定し、当技術分野で公知の種々の仕方で表すことができる。例えば、ベクター調製物は、変性ポリアクリルアミドゲルにおいて解析し、銀染色して、混入細胞タンパク質に対する、異なるウイルスタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の割合を検出することができる。異なる技法を使用して、空カプシドと比較したフルの割合を検出することもでき、より大きいパーセンテージのフルカプシドは、より高い純度を示す。本明細書で使用される場合、「フルカプシド」は、ベクターゲノムを含有すると結論付けられるカプシドであり、「空カプシド」は、核酸を全く含有しないかまたはほとんど含有しないと結論付けられるカプシドである。例えば、ベクター調製物におけるカプシドは、ｃｒｙｏＥＭを含む透過型電子顕微鏡を使用して可視化することができ、フルおよび空カプシドの数は、手作業で、またはコンピュータ処理された画像認識アルゴリズムを使用して計数することができる。さらにより高い分解能は、フル、部分的にフルおよび空カプシドの間を識別することができる解析的超遠心分離を使用して達成することができる。混入空カプシドの量の観点からＡＡＶベクター純度を推定するための簡便な方法は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるベクター調製物のＵＶ光の吸光度を測定して、Ａ２６０／Ａ２８０比を得ることである。特定のベクターのカプシドおよびゲノムの理論的消衰係数を計算することにより、調製物におけるそのカプシドおよびゲノムの相対濃度をＡ２６０／Ａ２８０比から計算することができ、より高いＡ２６０／Ａ２８０値は、より高い割合のフルカプシドを示す。ベクター純度を検査するための方法に関する追加の情報は、Ｂｕｒｎｈａｍ Ｂら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．、２６（６）：２２８～２４２（２０１５）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｓら、Ｆｉｌｌｉｎｇ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄｓ： Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｓｕｃｃｅｓｓ ｂｙ Ｃｒｙｏ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３０（１２）：１４４９～６０（２０１９）；ＭｃＩｎｔｏｓｈ、ＮＬら、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ ａｎｄ ｍｕｌｔｉ ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、１１：３０１２、ｐｐ．１～１２（２０２１）；Ｓｏｍｍｅｒ、ＪＭら、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｅｍｐｔｙ Ｃａｐｓｉｄｓ ｂｙ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７（１）：１２２～８（２００３）；Ｗｕ、Ｄら、Ｒａｐｉｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ、ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２１．０２．１８．４３１９１６（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０２．１８．４３１９１６）に記載されている。

【0125】

一部の実施形態では、本開示の方法は、宿主細胞によって産生されたＡＡＶベクター等の所望の生物由来生成物を含有する薬物物質または薬物製品における、宿主細胞ＤＮＡの許容できる程度に低い負荷を達成するのに有効である。ＡＡＶベクター等、そのような細胞の界面活性剤ライセートまたはそのような細胞から精製された生物由来生成物を含む組成物（薬物物質または薬物製品等）等の試料または調製物における宿主細胞ＤＮＡの量は、当技術分野で公知のいずれかの仕方で決定することができる。例えば、ヒトゲノムに特有の反復配列エレメント（例えば、Ａｌｕ反復）、およびその宿主細胞が製造において一般的に使用される他の種のエレメントを特異的に検出するように設計された、高感度ｑＰＣＲアッセイが開発された。例えば、Ｚｈａｎｇ、Ｗら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｑ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ＤＮＡ ｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｓａｍｐｌｅｓ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ １００：１４５～９（２０１４）；Ｗａｎｇ、Ｙら、Ａ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ ＤＮＡ ｉｎ ｒＡＡＶ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：５２６～３１（２０１９）を参照されたい。宿主細胞ＤＮＡの量を定量化し、ミリリットルまたは用量等の他の単位等の体積におけるピコグラム（ｐｇ）またはナノグラム（ｎｇ）等の単位の質量等、絶対量として表すことができる。宿主細胞ＤＮＡの量は、試料におけるＡＡＶベクターの量等、別の変数に対して正規化することもでき、これは、一部の実施形態では、定量化し、ミリリットル、用量当たりのベクターゲノムの数等として表すこともできる。

【0126】

薬物物質または薬物製品における宿主細胞ＤＮＡの許容できる程度に低い負荷を構成するものは、当業者には明らかとなるであろうが、問題になっている生物由来生成物の型、ならびに産業、患者および／またはＵＳ ＦＤＡもしくはＥＭＡ等の規制当局の期待に依存することができ、これらは、経時的に変化し得る。例えば、Ｇｏｍｂｏｌｄ、Ｊら、Ｌｏｔ Ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｖｅ－Ｖｉｒｕｓ－Ｂａｓｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐａｒｔ ２、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｌ． ４：４６～５６（２００６）；Ｗｒｉｇｈｔ、ＪＦ、Ｐｒｏｄｕｃｔ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ－Ｇｒａｄｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｉｓｋ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ２（１）：８０～９７（２０１４）；Ｗａｎｇ、Ｘら、Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ １０９（２）：３０７～１７（２０１２）を参照されたい。

【0127】

一部の実施形態では、本開示の方法は、ＡＡＶベクターの高い収率および／または純度、ならびに薬物物質または薬物製品における宿主細胞ＤＮＡの許容できる程度に低い負荷を達成するのに有効である。一部の実施形態では、本開示の方法（一部の実施形態では、追加の下流精製ステップを同様に含む）を使用して産生されたＡＡＶベクターの収率は、少なくとももしくは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％もしくは８０％もしくはそれを超える、または前述の値のいずれかの間のそれらを含めたいずれかのパーセンテージ収率であり得る。一部の実施形態では、本開示の方法（一部の実施形態では、追加の下流精製ステップを同様に含む）を使用して産生されたＡＡＶベクターの純度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで測定されたＵＶ吸光度の比（すなわち、Ａ_２６０／Ａ_２８０）として表すことができ、これは、一部の実施形態では、少なくとももしくは約０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７もしくは１．８もしくはそれを超える、または前述の値のいずれかの間のそれらを含めたＡ_２６０／Ａ_２８０であり得る。一部の実施形態では、本開示の方法（一部の実施形態では、追加の下流精製ステップを同様に含む）を使用して産生されたＡＡＶベクターの純度は、ベクター調製物におけるフルカプシドのパーセンテージとして表すことができ、これは、一部の実施形態では、少なくとももしくは約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、または前述の値のいずれかの間のそれらを含めたフルカプシドのいずれかのパーセンテージであり得る。

【0128】

一部の実施形態では、薬物物質または薬物製品における宿主細胞ＤＮＡの許容できる程度に低い負荷は、用量当たり約１００ｎｇ、９０ｎｇ、８０ｎｇ、７０ｎｇ、６０ｎｇ、５０ｎｇ、４０ｎｇ、３０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、２ｎｇもしくは１ｎｇもしくはそれ未満の、もしくはそれに満たない、または前述の値のいずれかの間のそれらを含めたいずれかの値の負荷である。他の実施形態では、薬物物質または薬物製品における宿主細胞ＤＮＡの許容できる程度に低い負荷は、薬物物質もしくは薬物製品１ミリリットル当たり約５０ｎｇ、４０ｎｇ、３０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、２ｎｇ、１ｎｇ、０．９ｎｇ、０．８ｎｇ、０．７ｎｇ、０．６ｎｇ、０．５ｎｇ、０．４ｎｇ、０．３ｎｇ、０．２ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０９ｎｇ、０．０８ｎｇ、０．０７ｎｇ、０．０６ｎｇ、０．０５ｎｇ、０．０４ｎｇ、０．０３ｎｇ、０．０２ｎｇ、０．０１ｎｇ、０．００９ｎｇ、０．００８ｎｇ、０．００７ｎｇ、０．００６ｎｇ、０．００５ｎｇ、０．００４ｎｇ、０．００３ｎｇ、０．００２ｎｇ、０．００１ｎｇもしくはそれ未満の、もしくはそれに満たない、または前述の値のいずれかの間のそれらを含めたいずれかの値の負荷である。さらに他の実施形態では、ＡＡＶベクターを含有する薬物物質または薬物製品における宿主細胞ＤＮＡの許容できる程度に低い負荷は、１×１０^９ベクターゲノム当たり約１０００、５００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、２もしくは１ピコグラム（ｐｇ／１×１０^９ｖｇ）もしくはそれ未満の、もしくはそれに満たない、または前述の値のいずれかの間のそれらを含めたいずれかの値の負荷である。

【0129】

本発明の他の目的、特色および利点は、前述の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変化、改変および均等物が、詳細な説明および実施例から当業者にとって明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に収まるため、詳細な説明と後述する具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示すが、単なる説明として提示されていることを理解されたい。

【0130】

他に指示がない限り、一式の実施形態の１つまたは複数の要素を参照した用語「または」の使用は、意味が「および／または」と等しく、互いに相互排他的であることを要求しない。他に指示がない限り、複数の明確に列挙されている数的範囲はまた、その下限が、明確に列挙されている範囲のいずれか１つの下限または上限に由来し、その上限が、明確に列挙されている範囲のいずれか他の１つの下限または上限に由来する範囲を表す。よって、例えば、一連の明確に列挙されている範囲「１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、１００～１５０、２００～２５０、２７５～３００」はまた、範囲１０～５０、５０～１００、１００～２００および１５０～２５０を、他にも多数あるが表す。他に指示がない限り、一連の数値または範囲の前にある用語「約」の使用は、その直後に現れる値または範囲のみならず、同じ一連においてその後に現れるありとあらゆる値または範囲も改変することを意図する。よって、例えば、語句「約１、２または３」は、「約１、約２または約３」に等しい。

【0131】

本明細書に引用されている、論文、抄録、特許、特許出願（公開されているか公開されていないかに関わりなく）および生物学的配列（具体的なデータベース参照番号によって同定された配列を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない、あらゆる刊行物および参考文献は、あたかも個々の刊行物または参考文献のそれぞれが、そのように参照により本明細書に組み込まれていると特にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、あらゆる目的で、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願が直接的にまたは間接的に優先権を主張するいかなる特許出願もまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0132】

他に指示がない限り、後述する実施例は、当業者にとって周知かつルーチンである標準技法を使用して行われたまたは行われている実験について記載する。実施例は、説明を目的とするが、本発明を限定するものではない。

【実施例】

【0133】

（実施例１）
ドミフェン臭化物による宿主細胞ＤＮＡの濃度依存的沈殿
第１のシリーズの実験は、界面活性剤溶解された宿主細胞からの宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣ－ＤＮＡ）および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の沈殿ならびに細胞によって産生されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの回収における、ドミフェン臭化物（ＤＢ）濃度の効果を決定した。

【0134】

ＨＥＫ２９３細胞を、４．９×１０^６個の細胞／ｍＬの生細胞密度となるまで、５０Ｌ使い捨てバイオリアクター（ＳＵＢ）における懸濁培養において育成し、次いで、ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子、アデノウイルスヘルパー機能、ならびにＡＡＶ２ ＩＴＲで挟まれたミニジストロフィンタンパク質を産生するための発現カセット（この例示的なベクターは、ＷＯ２０１７／２２１１４５にさらに記載されている）をそれぞれ含有する３種のプラスミドをトランスフェクトした。ＡＡＶベクター産生のための７２時間のインキュベーション後に（この時点までに、細胞は、約７．７×１０^６個の細胞／ｍＬの生細胞密度に達した）、バイオリアクターから細胞懸濁液の１０００ｍＬ試料を除去し、０．５％（ｖ／ｖ）の最終Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００濃度となるように１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ストック溶液（ｗ／ｖ）を添加し、続いて３０分間室温でかき混ぜることにより溶解した。次に、０．０５％～０．２０％（ｖ／ｖ）に及ぶ範囲の最終ＤＢ濃度となるように１０％ＤＢストック溶液（ｗ／ｖ）をライセート試料に添加し、３０分間室温でかき混ぜて、ＨＣ－ＤＮＡを沈殿させ、これを３０分間、同様に室温で溶液から沈降させた。次に、ＤＢ処理ライセート試料を４０００ＲＰＭで１５分間遠心分離して、ＤＮＡをペレットにし、その後、上清（すなわち、部分的に清澄化されたライセート）を除去して確保した。ＤＢによる残渣ＨＣ－ＤＮＡの沈殿を防止するために（すなわち、沈殿をクエンチするために）、０．２５Ｍの最終ＮａＣｌ濃度となるように５Ｍ ＮａＣｌストック溶液を添加した。クエンチされた上清を、１つまたは複数の０．２μｍフィルター（ＥＫＶ （Ｐａｌｌ））を通して濾過して、最終清澄化されたライセートを産生した。次に、ベクターにおけるＡＡＶ９カプシドに特異的な免疫親和性クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０システムを使用した１ｃｍ（ｄ）×１０ｃｍ（ｈ）カラムにおける８ｍＬのＰｏｒｏｓ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９）によって、試料からＡＡＶベクターを精製した。

【0135】

最終清澄化されたライセート（出発材料）および精製されたベクター（クロマトグラフィーカラム溶出）の試料におけるＡＡＶベクターのタイターならびにＨＣＰおよびＨＣ－ＤＮＡの量を検査した。ＡＡＶベクタータイターは、ベクターにおける導入遺伝子に対するプライマーを使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって決定し、１ミリリットル当たりのベクターゲノム（ＶＧ／ｍＬ））として表し；ＨＣＰの量は、ＥＬＩＳＡによって決定し、１ｍＬ当たりのナノグラム（ｎｇ／ｍＬ）として表し；ＨＣ－ＤＮＡの量は、ｑＰＣＲによって決定し、１ｍＬ当たりのピコグラム（ｐｇ／ｍＬ）として表した。試料体積可変性を制御するために、ＨＣＰおよびＨＣ－ＤＮＡの量を、ベクターの量に対して正規化した。表１に示す通り、出発材料におけるベクタータイターならびにＨＣＰおよびＨＣ－ＤＮＡの量は、検査した全てのＤＢ濃度にわたって相対的に一貫していた一方で、ライセートにおける０．１％ＤＢ最終濃度から開始して、ＨＣ－ＤＮＡの濃度依存的低減が見られ、ＤＢが、宿主細胞界面活性剤ライセートからＨＣ－ＤＮＡを沈殿させることができる有効性を実証する。

【0136】

【表1】

【0137】

第２のシリーズの実験は、界面活性剤溶解された宿主細胞からのＨＣ－ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質ＨＣＰの沈殿ならびに細胞によって産生されたＡＡＶベクターの回収における、より高いＤＢ濃度の効果を決定した。

【0138】

上に記載されているものと同様に、３．６Ｌ体積の２個のバイオリアクターにおいて、ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養において育成し、トランスフェクトして、ＡＡＶベクターを産生した。細胞が、それぞれ約１．４×１０^７個の細胞／ｍＬおよび１．７×１０^７個の細胞／ｍＬの生細胞密度に達したら、培養物を組み合わせ、１つの３５００ｍＬ、４つの２００ｍＬを含む、試料を採取した。各試料に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加して（０．５％最終濃度）細胞を溶解し、その後に、ＤＢを添加してＨＣ－ＤＮＡを沈殿させた。３５００ｍＬ試料における最終ＤＢ濃度は、０．２％であり、一方、４つの２００ｍＬ試料における最終ＤＢ濃度は、０．１％～０．４％の範囲に及んだ。ＤＮＡ沈殿後に、全ての試料を、１μｍデプスフィルター（Ｊ７００（Ｐａｌｌ））および０．４μｍデプスフィルター（Ｂｉｏ２０（Ｐａｌｌ））を通して濾過した。次に、濃縮ＮａＣｌの溶液を、２５０ｍＭ～５００ｍＭに及ぶ範囲の異なる最終濃度となるように濾過試料に添加し、続いて、３０分間室温で混合した。塩を添加し、混合した後に、試料を、０．２μｍおよび０．１μｍ膜フィルター（それぞれＥＡＶおよびＥＤＴ（Ｐａｌｌ））を通して濾過した。同日（０日目）に、試料を解析して、上に記載されている通り、ＡＡＶベクタータイターならびにＨＣ－ＤＮＡおよびＨＣＰの量を定量化した。表２に示す通り、清澄化されたライセートにおけるベクタータイターならびにＨＣＰおよびＨＣ－ＤＮＡの量は、検査した全てのＤＢ濃度にわたって同等であり、一方、ＨＣ－ＤＮＡの濃度依存的低減が見られ、ＤＢが、本実施例に記載されている第１の実験において研究されたものと比較して、より高い生細胞密度で宿主細胞界面活性剤ライセートにおけるＨＣ－ＤＮＡを沈殿させることができる有効性を実証した。

【0139】

【表2-1】

【0140】

【表2-2】

【0141】

清澄化されたＨＥＫ２９３細胞ライセートにおけるベクタータイターおよびＨＣ－ＤＮＡ濃度におけるＤＢ沈殿の濃度依存性は、第１の膜濾過ステップの後に行われた測定から得たデータに基づき、図１に説明されている。グラフにおいて、ベクタータイター曲線は、多項式にフィットされ、ＨＣ－ＤＮＡ濃度は、指数方程式にフィットされる。結果は、研究された条件下で、０．１％を超えるＤＢ濃度が、宿主細胞ＤＮＡを有効に沈殿させるのに要求され、０．３％～０．４％を上回るＤＢ濃度が、おそらく、沈殿された材料中にベクターを隔絶することにより、ベクター収率の低減を開始できることを示す。

【0142】

濁度計を使用して、０日目および２～４日目に、濾過されたライセートにおける濁度も測定し、結果をネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表す。表３に示す通り、検査した全てのＤＢおよびＮａＣｌ濃度において、濁度は、０日目および４日目の間でごくわずかに増加した。

【0143】

【表3】

【0144】

第３のシリーズの実験は、ＤＮＡ沈殿後の清澄化されたライセートにおけるＡＡＶベクター収率およびＨＣ－ＤＮＡの量における、宿主細胞の溶解に使用されるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および宿主細胞ＤＮＡの沈殿に使用されるＤＢの濃度を変動させることの効果を試験した。

【0145】

上に記載されているものと同様に、ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養において育成し、トランスフェクトして、ＡＡＶベクターを産生した。約２×１０^７個の細胞／ｍＬの生細胞密度に達した後に、４０ｍＬ試料を引き抜き、細胞を溶解するためのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、粗ライセートにおける宿主細胞ＤＮＡを沈殿させるためのＤＢ、および部分的に清澄化されたライセートにおける残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる沈殿を阻害するためのＮａＣｌの最終濃度のマトリックスに従って処理した。細胞ライセートを産生するためのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００添加後に、細胞を３０分間混合し、そこにＤＢを添加し、３０分間混合して、ＨＣ－ＤＮＡを沈殿させ、続いて、遠心分離して、沈殿されたＨＣ－ＤＮＡをペレットにした。処理された試料由来の上清を確保し、続いて、塩添加および２日間の貯蔵を行った。細胞懸濁液におけるおよび処理された試料由来のベクタータイターおよびＨＣ－ＤＮＡを０日目に定量化し、出発細胞懸濁液と比べた試料におけるベクター収率および残渣宿主細胞ＤＮＡの量の計算に使用した。０日目に、および再び４７時間後に、清澄化されたライセートの濁度を測定して、清澄化されたライセートにおける残渣宿主細胞ＤＮＡのＤＢによる沈殿を測定した。処理された試料におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＤＢおよびＮａＣｌの最終濃度、ベクタータイターおよび収率、ならびに濃度およびベクタータイターに対する正規化の両方として表されるＨＣ－ＤＮＡの量を含む実験条件および結果は、表４に記載されている。

【0146】

【表4】

【0147】

表４における結果に基づき、図２Ａは、ＨＣ－ＤＮＡの沈殿に使用されたＤＢの濃度、ならびにＨＥＫ２９３細胞の清澄化されたライセートの試料におけるベクターおよびＨＣ－ＤＮＡの両方の含量の間の関係性を説明する。検査した範囲内で、ＤＢ濃度の増加は、清澄化されたライセートにおけるベクターおよびＨＣ－ＤＮＡの量の両方を低減させたが、個々のデータ点にフィットされた線形傾向線によって示される通り、ＨＣ－ＤＮＡが低減された率は、より大きかった。同様に、図２Ｂは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の濃度、ならびに同じ試料におけるベクターおよびＨＣ－ＤＮＡの含量の間の関係性を説明する。検査した範囲内で、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００濃度の増加は、ベクタータイターに有意に影響を与えずに、清澄化されたライセートにおけるＨＣ－ＤＮＡの量を増加させる。

【0148】

（実施例２）
塩化ナトリウムは、ドミフェン臭化物による残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害する
ＤＢによる宿主細胞ＤＮＡの沈殿は、溶解された細胞から放出されたＤＮＡの実質的な部分を除去するのに有効であるが、清澄化されたライセートは、反応し続ける十分な残渣ＨＣ－ＤＮＡおよびＤＢを含有し、経時的に増加する濁度を生じる。制御されなければ、この効果は、ＡＡＶベクターを精製するために下流プロセスにおいて一般的に用いられるクロマトグラフィーカラムの詰まりをもたらし得る。追加の実験を実行して、いかなる濃度の塩化ナトリウムが、清澄化された細胞ライセートにおけるＤＢによる残渣宿主細胞ＤＮＡの望まれない沈殿を阻害またはクエンチするのに最も有効であるか決定した。

【0149】

実施例１に記載されているものと同様に、３．６Ｌ体積の２個のバイオリアクターにおいて、ＨＥＫ２９３細胞を育成し、トランスフェクトして、ＡＡＶベクターを産生した。細胞が、それぞれ約１．８×１０^７個の細胞／ｍＬおよび２．１×１０^７個の細胞／ｍＬの生細胞密度に達したら、培養物を組み合わせ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加して（０．５％最終濃度）細胞を溶解し、ＤＢを添加して（０．２％最終濃度）ＨＣ－ＤＮＡを沈殿させ、続いて、１μｍデプスフィルター（Ｊ７００（Ｐａｌｌ））および０．４μｍデプスフィルター（Ｂｉｏ２０（Ｐａｌｌ））を通した濾過を行った。次に、１つの２０００ｍＬおよび４つの３００ｍＬを含む、濾液の試料を採取した。次に、濃縮ＮａＣｌの溶液を、２５０ｍＭ～５００ｍＭに及ぶ範囲の異なる最終濃度となるように濾過試料に添加し、続いて、３０分間室温で混合した。塩を添加し、混合した後に、試料を、０．２μｍおよび０．１μｍ膜フィルター（それぞれＥＡＶおよびＥＤＴ（Ｐａｌｌ））を通して濾過した。ＮａＣｌが添加されなかった試料を同様に処理し、対照とした。同日（０日目）に、試料を解析して、ＡＡＶベクタータイターならびにＨＣ－ＤＮＡおよびＨＣＰの量を定量化した。ベクタータイターは、ｑＰＣＲを使用して決定し、ＶＧ／ｍＬとして表し；ＨＣＰレベルは、ＥＬＩＳＡによって決定し、ｎｇ／ｍＬとして表すと共に、ベクタータイターに対して正規化し、ｎｇ／ＶＧとして表し；ＨＣ－ＤＮＡレベルは、ｑＰＣＲによって決定し、ｐｇ／ｍＬとして表すと共に、ベクタータイターに対して正規化し、ｐｇ／ＶＧとして表した。実施例１とは異なり、試料は、クロマトグラフィーによってさらに精製されなかった。結果は、表５に報告されている。他の実験の場合と同様に、０．２％の最終濃度におけるＤＢは、ＨＣ－ＤＮＡを沈殿させるのに有効であった。２０００ｍＬ試料による実験において、膜濾過後の清澄化されたライセートにおけるＨＣ－ＤＮＡの量は、処理されていないライセートにおける量の１００分の１よりも少なかった。

【0150】

【表5】

【0151】

濁度計を使用して、０、１および２日目に濁度も測定し、結果をネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表す。結果は、表６に報告され、図３に説明されている。図３に示す通り、塩がライセートに添加されなかった場合（０Ｍ ＮａＣｌ）、濁度は、２日間の実験の経過にわたりほぼ４０倍増加しており、このことは、ＤＢによる残渣ＨＣ－ＤＮＡの沈殿が進行中のプロセスであることを示した。対照的に、０．２５Ｍ～０．５０Ｍに及ぶ範囲の最終濃度となるようなＮａＣｌの添加は、同じ時間にわたり本質的に未変化の濁度レベルをもたらし、これらの濃度の塩の添加が、ＤＢによる残渣ＨＣ－ＤＮＡの進行中の沈殿を阻害するのに有効であることを示す。表５に示す通り、ＡＡＶベクタータイターは、宿主細胞タンパク質の量と同様に、検査した全ての塩濃度（塩なし対照を含む）にわたって同等であった。

【0152】

【表6】

【0153】

別のシリーズの実験において、上に記載されている他の実験と同様に、ＨＥＫ２９３細胞を育成し、ＡＡＶベクター産生のためにトランスフェクトし、収集した。細胞を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（３０分間室温で）により溶解し、宿主細胞ＤＮＡを０．３％ＤＢ（３０分間室温で）により沈殿させ、次いで、本明細書に記載されている通り、Ｊ７００、Ｂｉｏ２０、ＥＡＶおよびＥＤＴフィルターを通して濾過した。次に、濃縮塩溶液を試料に添加して、２００ｍＭ～８００ｍＭに及ぶ範囲の最終ＮａＣｌ濃度と、塩なし対照を達成した。次に、処理された試料の部分を７日間保持し、１、２、３、４および７日目に濁度を測定し、他の部分を免疫親和性カラムクロマトグラフィーによって精製して、ＡＡＶベクターを精製した。濁度測定の結果は、表７に報告されており、これは、図４にさらに説明されている通り、２００ｍＭを超えるＮａＣｌ濃度が、７日後であっても、濁度の有意な増加を防止するのに有効であったことを実証する。

【0154】

【表7】

【0155】

免疫親和性カラムクロマトグラフィーによって異なる塩処理された試料からＡＡＶベクターを単離した後に、精製された調製物を解析して、ｑＰＣＲによってベクタータイターを決定し、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を測定してＡ２６０／Ａ２８０比を計算することによりフルカプシドの割合を決定し、ＨＣ－ＤＮＡおよびＨＣＰの量を定量化した。結果は、表８に報告されており、これは、精製されたベクター調製物におけるベクタータイターおよび純度にまたはＨＣ－ＤＮＡもしくはＨＣＰの量に有意差がないことを実証する。

【0156】

【表8】

【0157】

（実施例３）
ドミフェン臭化物による残渣宿主細胞ＤＮＡ沈殿の阻害におけるアニオンおよびカチオン交換の効果
理論に制約されることは望まないが、ＤＢによるＨＣ－ＤＮＡ沈殿における塩化ナトリウムの効果についての可能な説明は、塩化物アニオンが、正に荷電したドミフェン部分と静電気的に相互作用し、これを遮蔽し、それと負に荷電したＤＮＡとの相互作用を低減させることである。この潜在的な機序をさらに調査するために、ＨＣ－ＤＮＡの沈殿およびＡＡＶベクター産生における異なる塩の効果を検査した一連の実験を実行した。検査条件は、実施例２において検査されたものよりも広い範囲のＮａＣｌ濃度、ナトリウムが異なる無機および有機アニオンと対形成した塩の使用、塩化物が異なる無機カチオンと対形成した塩の使用、ならびにナトリウムも塩化物も存在しない塩（ＭｇＳＯ_４）の使用を含んだ。

【0158】

以前の実施例の場合と同様に、ＨＥＫ２９３細胞を育成し、ＡＡＶベクター産生のためにトランスフェクトした。細胞が、約１．４×１０^７個の細胞／ｍＬの生細胞密度に達したら、細胞を、０．５％の最終濃度におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００により３０分間溶解した。溶解後に、３０分間混合しつつ、０．３％の最終濃度となるようにＤＢを添加して、ＨＣ－ＤＮＡを沈殿させた。凝結されたＨＣ－ＤＮＡを沈降させ、その後、バイオリアクターから上清をポンピングして出し、１９μｍおよび０．４μｍデプスフィルターを通した濾過によって清澄化した。清澄化されたライセートの３００ｍＬ試料に、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および塩を含有するストック溶液を表９に記載されている通りに添加し、混合し、０．２２μｍおよび０．１μｍフィルターを通して濾過して、最終清澄化されたライセートを産生し、次いでこれを貯蔵ボトルに分注し、室温で４日間保持した。０日目に、試料を解析して、ｐＨ、伝導率、ＡＡＶベクタータイター、ならびにＨＣ－ＤＮＡおよびＨＣＰの濃度を測定し、一方、濁度は、０．２μｍおよび０．１μｍフィルターを通した濾過の前および後に、０～４日目にＨａｃｈ ２１００ Ｑ濁度計により測定した。

【0159】

表１０は、異なる塩の存在下での経時的なネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）（３回の測定の平均）で報告された濁度測定の結果を報告し、これは、図５Ａ～図５Ｄのグラフにおいても説明されている。表９は、ライセート伝導率の０日目における測定の結果を報告し、一方、表１１は、ライセート試料におけるＡＡＶベクタータイターならびにＨＣＰおよびＨＣ－ＤＮＡの正規化された濃度の同日における測定の結果を報告する。

【0160】

【表9】

【0161】

【表10】

【0162】

図５Ａと、表１０の追加の詳細に示す通り、清澄化されたライセートは、１日後に増加する濁度を実証し、これは、より高い濃度のＮａＣｌが添加されるにつれて、濃度依存的様式で阻害された。これらの実験において、０．６Ｍ ＮａＣｌは、残渣ＨＣ－ＤＮＡのさらなるＤＢ沈殿をほぼ完全に阻害すると思われた。

【0163】

興味深いことに、図５Ｂに示す通り、ナトリウムおよび塩化物以外のアニオンを含む塩は、漸進的濁度増加の防止において、同じ濃度（０．４Ｍ）で検査した場合、ＮａＣｌよりも優れた成績にはならなかった。さらに、検査した塩のうち２種であるＮａＩおよびクエン酸ナトリウムは、時間と共に驚くべき仕方で濁度に影響を与えると思われた。塩ＮａＩは、初期に濁度を劇的に加速するが、後にこれを阻害すると思われ、一方、クエン酸ナトリウムは、初期に濁度を加速し、続いて阻害し、阻害は後の時点で徐々に縮小すると思われた。塩化物は、濁度の阻害において有効性が低いアニオンよりも高い電荷密度を有し、電荷密度が、正に荷電したドミフェンとの相互作用に影響を与える重要な変数となり得ることを示唆する。注目すべきことに、図５Ｂにも示す通り、ＭｇＳＯ_４は、濁度の阻害について、同じ濃度のＮａＣｌよりも有効であった。塩化物は、硫酸塩よりも高い電荷密度を有するため、観察された差は、ＤＢとＤＮＡとの相互作用に干渉し得る、負に荷電したＤＮＡとＭｇ^２＋イオンとの強い静電気的相互作用に起因し得る。

【0164】

図５Ｃに示す通り、塩化物およびナトリウム以外のカチオンを含む検査した２種の塩は、濁度の阻害について、ＮａＣｌよりも優れた成績にはならなかった。濁度を阻害すると初期に思われた後に、０．２Ｍ ＣａＣｌ_２は、後の時点で濁度を急速に増加させ、一方、ＫＣｌは、有効であったが、同じ濃度のＮａＣｌと比較してわずかに劣る。対照的に、塩化物が、Ｍｇ^２＋対イオンと対形成した場合、濁度の阻害は、半分の濃度（０．２Ｍ）であっても、ＮａＣｌよりも有効であった。この効果は、ＤＮＡとの強いＭｇ^２＋相互作用と組み合わせた、塩化物の高い電荷密度（おそらく、ドミフェンとのより有効な相互作用に寄与する）に起因し得る。双性イオンとして挙動し得るアミノ酸グリシンも検査したが、いかなる認識できる程度にも、濁度を阻害することができなかった。図５Ｄは、濁度形成の最も強力な阻害剤の比較有効性に関する追加の詳細を提供する。

【0165】

異なる量の同じ塩または同様の量の異なる塩が、可変的な程度でイオン強度に寄与し得るため、濁度形成の阻害が、様々なイオンの化学的性質ならびにそれらとＤＢおよび／またはＤＮＡとの相互作用の代わりに、イオン強度によるものであり得る可能性があった。図６Ａ～図６Ｄに示す通り、伝導率（表９に報告される通り０日目における）の関数としての、検査期間（表１０に報告される通り、０～３日目）にわたる濁度の回帰プロットは、しかし、イオン強度が、初期時点において不十分に予測的であり、後の時点において多くても弱く予測的であることを示す。３日目においてのみ、回帰解析は、より高いイオン強度が、濁度形成の低減と正に相関し得ることを示唆する。まとめると、本データは、検査した塩におけるイオンの化学的特性が、イオン強度よりも有意な濁度阻害の寄与因子であることを示唆する。

【0166】

表１１に要約される通り、大部分の沈殿阻害剤の添加は、１００％を超えた阻害％ＶＧ収率値において反映される通り、ＡＡＶベクタータイターに有意に影響を与えなかった。対照的に、０．４Ｍ ＭｇＳＯ_４、０．２Ｍ ＭｇＣｌ_２および０．２Ｍ ＣａＣｌ_２の添加は、濾過後阻害％ＶＧ収率の低減を引き起こした。表１１におけるデータは、ＤＢが、溶解された細胞からのＨＣ－ＤＮＡの除去において高度に有効であることも実証する（ＤＢ添加前の７７０．９ｐｇ／１×１０^９ＶＧから、添加後の５０．６ｐｇ／１×１０^９ＶＧ）。阻害剤の添加と、それに続く０．２μｍおよび０．１μｍ濾過は、ＨＣ－ＤＮＡレベルを有意に変更しなかった。

【0167】

【表11】

【0168】

（実施例４）
ラージスケールでのドミフェン臭化物による残渣宿主細胞ＤＮＡ沈殿の阻害
ＨＣ－ＤＮＡのＤＢ沈殿、および上に記載されているある特定の塩の添加によるその阻害の研究を相対的にスモールスケールで実行し、これは、清澄化された細胞ライセートを塩溶液と組み合わせるバッチ混合技法に頼った。しかし、バッチ混合は、臨床的または商業的スケールでベクター製造に適用される場合、非効率的となるであろうことから、実験を実行して、ＤＢ処理細胞ライセートを濃縮塩溶液と混合し、これを同じスケールのバッチシステムと比較するための半連続的システムの有効性を検査した。バッチシステムは、図７Ｂに説明されており、連続的システムは、図７Ｃに説明されている。連続的混合のための代替システムは、図７Ａに説明されている。

【0169】

バッチまたは連続的プロセスシステムのいずれかを用いた実験を行った。本質的に上の実施例に記載されている通りに、２５０Ｌ使い捨てバイオリアクター（ＳＵＢ）内で懸濁培養においてＨＥＫ２９３細胞を育成し、ＡＡＶベクター産生のためにプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの約６８時間後に、この時点で生細胞密度は、約２．０×１０^７個の細胞／ｍＬに達しており、１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を、０．５％の最終濃度となるようにＳＵＢに添加し、続いて３０分間混合した。ＨＣ－ＤＮＡを沈殿させるために、１０％ドミフェン臭化物を、０．３％の最終濃度となるようにＳＵＢに添加し、続いて３０分間混合した。ＳＵＢ羽根車を止め、凝結されたＨＣ－ＤＮＡをＳＵＢの底に沈降させた。

【0170】

バッチシステムにおいてＤＢによる残渣ＨＣ－ＤＮＡの沈殿をクエンチするために、ＤＢ沈殿ＨＣ－ＤＮＡの層を覆う（overly）部分的に清澄化されたライセートをポンピングしてＳＵＢから出し、１．０μｍおよび０．４μｍデプスフィルター（それぞれＴ３５００およびＢｉｏ ２０ Ｓｔａｘ）を通して、使い捨てミキサー（ＳＵＭ）に入れた。次に、４Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する濃縮塩溶液をポンピングしてＳＵＭに入れ、続いて濾液と混合して、塩に、さらなるＨＣ－ＤＮＡ沈殿を阻害させた。次に、クエンチされた混合物をポンピングしてＳＵＭから出し、追加のフィルターを通過させた。連続的混合システムにおいて、部分的に清澄化されたライセートをポンピングしてＳＵＢから出し、上述の通りに濾過し、次いで、この設計ではブレイクタンクとして機能するＳＵＭに一時的に貯蔵した。十分な体積の濾過された上清をＳＵＭに添加した後に、別々のタンクに貯蔵された上清、ならびに４Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する溶液を、蠕動ポンプによってポンピングしてそれぞれの容器から出し、Ｙ－コネクタで交わる別々のチューブを通した。これらの実験において、混合物において０．４Ｍ ＮａＣｌの最終濃度を達成することが所望された。したがって、濾液および濃縮ＮａＣｌ溶液の相対的ポンプ比率は、約１０：１であった。Ｙ－コネクタの下流は、濾液および塩溶液の徹底的な混合を確実にするための静的インライン混合エレメントを含有する単一のチューブであり、その後に、混合物は、追加のフィルターを通過された。

【0171】

実際には、上清および塩溶液混合物は、さらなる下流精製ステップ（例えば、クロマトグラフィー）に供されるであろうが、これらの実験においては、経時的な濁度変化をモニターするために室温で貯蔵された。ＡＡＶベクタータイターを０日目に決定し、Ｈａｃｈ ２１００ Ｑ濁度計を使用して濁度を０～４日目に測定した。実験システムの側面は、表１２に要約されており、結果は、表１３に要約されている。バッチシステムを使用して調製された１種の検査試料、ならびに異なるポンプ流速、管直径および静的ミキサーで構成された連続的システムを使用して調製された３種の検査試料と同様に、沈殿阻害剤が添加されなかった対照試料が含まれた。上に記述されている結果と一致して、ＮａＣｌが添加されなかった対照は、経時的に増加する濁度を示した。対照的に、ＮａＣｌが、バッチまたは連続的システムのいずれかを使用して清澄化されたライセートに添加された場合、実験の最終日までに濁度レベルの有意な増加は観察されなかった。ＡＡＶタイターレベルも、異なる実験にわたって一貫していた。本データは、貯蔵の前に、および／またはＡＡＶベクターをさらに精製するための下流プロセスにおける使用の前に、清澄化されたライセートを塩溶液と混合して、ＤＢによる残渣ＨＣ－ＤＮＡの沈殿を阻害するために、連続的混合システムが、バッチシステムと同じ程度に有効であることを示唆する。

【0172】

【表12】

【0173】

【表13】

【0174】

（実施例５）
免疫親和性カラムクロマトグラフィー効率におけるドミフェン臭化物ＤＮＡ沈殿の阻害の効果
以前の実施例に記載されているものと同様の方法および試薬を使用して、懸濁培養におけるＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトすることにより、ＡＡＶ９カプシドを有するＡＡＶベクターの別々の調製物を２５０Ｌスケールで産生した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で細胞を溶解し、次いで、０．２％の最終濃度のドミフェン臭化物で宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣ－ＤＮＡ）を沈殿させることにより、ベクターを収集した。凝結されたＨＣ－ＤＮＡを沈降させ、その後に、ベクターを含有する部分的に清澄化された細胞ライセートを除去し、深層濾過して、清澄化されたライセートを産生した。残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿を阻害するために塩を添加しなかった。次に、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９親和性レジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を詰めたカラムを使用した免疫親和性クロマトグラフィーによって、ベクターを精製した。複数のベクター調製物由来の清澄化されたライセートを、同じカラムを通して泳動して、カラム性能が望ましくないほど低いレベルに劣化する前に可能となる精製サイクルの数を評価した。ｑＰＣＲによって、各調製物からの精製の前および後のベクターの量を決定し、組み合わせた溶出プールにおけるベクターの量をクロマトグラフィー前の清澄化されたライセートにおけるベクターの量で割ることによって、収率を計算した。

【0175】

結果は、表１４に示されており、これは、ほんの４回の精製サイクルの後に、３０％ベクター収率へのカラム性能の急速劣化を実証する。異なる量のベクターをそれぞれ含有する異なるベクター調製物が精製されていたため、各精製サイクルからの精製されたベクターの総量は変動する。第５の精製サイクルの前に、免疫親和性レジンをカラムから除去し、洗浄し、再充填して、この操作が、レジン性能を改善することができるか検査したが、収率に僅かな改善しか観察されなかった。

【0176】

【表14】

【0177】

カラム性能はまた、免疫親和性クロマトグラフィー精製の溶出相における系列溶出画分におけるベクターの量を定量化することによって評価した。表１４に記載されている精製サイクルのうち３つの結果が、図８のクロマトグラムに示されている。第１のサイクル（サイクル＃１）は、免疫親和性レジンによるベクターの有効な分離を示す、単一の鋭い溶出プロファイルピークを示す。しかし、第４のサイクル（サイクル＃４）によって、溶出ピークは、カラム性能の劣化を示す、幅広くかつ二峰性であった。レジンの洗浄および再充填は、ベクターを分離するレジンの能力を回復するのに有効であったが、収率は低減した（サイクル＃５）。

【0178】

免疫親和性クロマトグラフィー性能における清澄化されたライセートへの塩の添加の効果も評価した。他の実施例に記載されている通り、懸濁培養におけるＨＥＫ２９３細胞においてＡＡＶ９カプシドを有するＡＡＶベクターを産生し、その後に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で細胞を溶解し、ドミフェン臭化物で宿主細胞ＤＮＡを沈殿させた。深層濾過後に、０．４Ｍ（既に存在していた可能性があるＮａＣｌを説明しない）の最終濃度となるように、ＮａＣｌを清澄化されたライセートに添加した。次に、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９親和性レジンを詰めたカラムを使用して、１０サイクルの試料ローディング、洗浄、ベクター溶出およびレジンの定置洗浄を経て、ライセートからベクターを精製した。上述の通りにベクター収率を決定し、非変性逆相ＨＰＬＣによってベクター純度を決定し、一定の流速の維持に要求されるカラム圧力もモニターした。結果は、表１５に示されている。塩処理により、カラム性能は、ベクター収率および純度の観点から一貫して高かったが、カラム圧力は、１０回の精製サイクルの経過にわたり増加した（最大デルタ圧力がおよそ倍加）。表１４におけるデータと比較して、これらの実験のために新たな定置洗浄プロトコールを実行し、これは、性能改善に寄与した可能性もある。

【0179】

【表15】

【0180】

まとめると、表１４、図８および表１５に示す結果は、塩添加による、清澄化された宿主細胞ライセートにおけるドミフェン臭化物による残渣宿主細胞ＤＮＡの沈殿の阻害が、性能が望ましくないレベルを下回る前に、クロマトグラフィーカラムが耐えることができる、ＡＡＶベクター精製サイクルの数を増加させるのに有効であることを示唆する。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8】

【国際調査報告】