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▶ ティーエムイー セラピューティクス カンパニー，リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-10
(54)【発明の名称】成長因子に結合するタンパク質基板
(51)【国際特許分類】
C07K 14/78 20060101AFI20231227BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20231227BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20231227BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20231227BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231227BHJP
【ＦＩ】
C07K14/78 ZNA
C07K14/435
C12N5/071
C12N5/09
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537578
(86)(22)【出願日】2021-12-16
(85)【翻訳文提出日】2023-07-07
(86)【国際出願番号】 KR2021019159
(87)【国際公開番号】W WO2022131809
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】63/126,245
(32)【優先日】2020-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523227535
【氏名又は名称】ティーエムイー セラピューティクス カンパニー，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002620
【氏名又は名称】弁理士法人大谷特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リ サンゼ
(72)【発明者】
【氏名】ホン ボンジン
(72)【発明者】
【氏名】パク ミンチョル
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045CA50
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
成長因子受容体及びインテグリン全てに同時に又は選択的に結合するかこれを活性化させることができるインテグリン結合モチーフ及び成長因子（ＧＦ）結合ペプチドモチーフを含むタンパク質基板が提供される。前記基板のタンパク質は、イガイ接着タンパク質の形態であってよく、ここで、インテグリン結合ペプチドモチーフから由来される細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質及びＧＦ結合ペプチドモチーフが前記イガイ接着タンパク質内に組換え的に統合される。また、生物工程、傷治癒、組織工学、及び治療適用分野において必須的な工程である細胞付着、移動、又は増殖を含む細胞の挙動を調節するためのタンパク質基板の用途が提供される。他の具現例において、本発明は、プロテアーゼ消化又は細胞内への内在化（又は細胞摂取）から成長因子を安定化及び保護して成長因子の継続的かつ持続的な機能を維持するための方法及び組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インテグリン結合モチーフ及び成長因子に結合するかこれを隔離することができるヘパリン結合モチーフに遺伝的に機能化された組換え接着タンパク質を含む、タンパク質基板。
【請求項2】
前記ヘパリン結合モチーフは、コラーゲン、ビトロネクチン、及び骨シアロタンパク質のフィブロネクチンドメインＩＩＩ、ラミニン球状ドメイン、及びヘパリン結合ドメインよりなる群から由来される、請求項１に記載のタンパク質基板。
【請求項3】
フィブロネクチンドメインＩＩＩから由来される前記ヘパリン結合モチーフは、ＫＹＩＬＲＷＲＰＫＮＳ（配列番号７）、ＹＲＶＲＶＴＰＫＥＫＴＧＰＭＫＥ（配列番号８）、ＳＰＰＲＲＡＲＶＴ（配列番号９）、ＡＴＥＴＴＩＴＩＳ（配列番号１０）、ＶＳＰＰＲＲＡＲＶＴＤＡＴＥＴＴＩＴＩＳＷＲＴＫＴＥＴＩＴＧＦＧ（配列番号１１）、ＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号１２）、ＫＰＤＶＲＳＹＴＩＴＧ（配列番号１３）、ＰＲＡＲＩＴＧＹＩＩＫＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶ（配列番号１４）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号１５）、ＷＱＰＰＲＡＲＩＴＧＹＩＩＫＹＥＫＰＧ（配列番号１６）、ＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰ（配列番号１７）、及びＫＮＮＱＫＳＥＰＬＩＧＲＫＫＴ（配列番号１８）よりなる群から選択される、請求項２に記載のタンパク質基板。
【請求項4】
ラミニン球状ドメインから由来される前記ヘパリン結合モチーフは、ＧＬＩＹＹＶＡＨＱＮＱＭ（配列番号１９）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２０）、ＧＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨＡ（配列番号２１）、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号２２）、ＶＶＲＤＩＴＲＲＧＫＰＧ（配列番号２３）、ＲＡＹＦＮＧＱＳＦＩＡＳ（配列番号２４）、ＧＥＫＳＱＦＳＩＲＬＫＴ（配列番号２５）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭＦＮＶＧＨＫＫＬ（配列番号２６）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭ（配列番号２７）、ＬＶＦＭＦＮＶＧＨＫＫＬ（配列番号２８）、ＧＡＡＷＫＩＫＧＰＩＹＬ（配列番号２９）、ＶＩＲＤＳＮＶＶＱＬＤＶ（配列番号３０）、ＧＫＮＴＧＤＨＦＶＬＹＭ（配列番号３１）、ＲＬＶＳＹＳＧＶＬＦＦＬＫ（配列番号３２）、ＧＰＬＰＳＹＬＱＦＶＧＩ（配列番号３３）、ＲＮＲＬＨＬＳＭＬＶＲＰ（配列番号３４）、ＬＶＬＦＬＮＨＧＨＦＶＡ（配列番号３５）、ＡＧＱＷＨＲＶＳＶＲＷＧ（配列番号３６）、ＫＭＰＹＶＳＬＥＬＥＭＲ（配列番号３７）、ＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３８）、ＶＲＷＧＭＱＱＩＱＬＶＶ（配列番号３９）、ＴＶＦＳＶＤＱＤＮＭＬＥ（配列番号４０）、ＡＰＭＳＧＲＳＰＳＬＶＬＫ（配列番号４１）、ＶＬＶＲＶＥＲＡＴＶＦＳ（配列番号４２）、ＰＧＲＷＨＫＶＳＶＲＷＥ（配列番号７６）及びＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号４３）よりなる群から選択される、請求項２に記載のタンパク質基板。
【請求項5】
前記コラーゲンのヘパリン結合ドメインから由来される前記ヘパリン結合モチーフは、ＫＧＨＲＧＦ（配列番号４４）、ＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号４５）、及びＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号４６）よりなる群から選択される、請求項２に記載のタンパク質基板。
【請求項6】
ビトロネクチンのヘパリン結合ドメインから由来される前記ヘパリン結合モチーフは、ＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱ（配列番号４７）である、請求項２に記載のタンパク質基板。
【請求項7】
骨シアロタンパク質のヘパリン結合ドメインから由来される前記ヘパリン結合モチーフは、ＫＲＳＲ（配列番号４８）、又はＫＲＲＡ（配列番号４９）である、請求項２に記載のタンパク質基板。
【請求項8】
前記ヘパリン結合モチーフは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、転換成長因子β（ＴＧＦ－β）、又は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合することができる、請求項１に記載のタンパク質基板。
【請求項9】
前記インテグリン結合モチーフは、αｖβ３－、αｖβ６－、αｖβ８－、α５β１－、α９β１結合ペプチドから選択される、請求項１に記載のタンパク質基板。
【請求項10】
前記インテグリン結合モチーフは、インテグリンαｖβ６を活性化させることができ、前記ヘパリン結合モチーフは、ＴＧＦ－βに結合することができる、請求項１に記載のタンパク質基板。
【請求項11】
前記インテグリン結合モチーフは、インテグリンα５β１又はα９β１を活性化させることができ、前記ヘパリン結合モチーフは、ｂＦＧＦに結合することができる、請求項１に記載のタンパク質基板。
【請求項12】
前記組換え接着タンパク質は、組換えイガイ接着タンパク質から由来される、請求項１に記載のタンパク質基板。
【請求項13】
前記組換えイガイ接着タンパク質は、配列番号１－６、及び６０－７４よりなる群から選択されるペプチドを含む、請求項１に記載のタンパク質基板。
【請求項14】
前記インテグリン結合モチーフ及び／又はヘパリン結合モチーフは、前記組換え接着タンパク質のＮ－末端及び／又はＣ－末端に結合される、請求項１に記載のタンパク質基板。
【請求項15】
前記インテグリン結合モチーフ及びヘパリン結合モチーフは、いずれも前記組換え接着タンパク質のＮ－末端又はＣ－末端に結合される、請求項１に記載のタンパク質基板。
【請求項16】
前記インテグリン結合モチーフ及びヘパリン結合モチーフは、スペーサーリンカーペプチドを介して連結される、請求項１５に記載のタンパク質基板。
【請求項17】
前記スペーサーリンカーペプチドは、配列番号７５のペプチドである、請求項１６に記載のタンパク質基板。
【請求項18】
細胞の可塑性を調節するための細胞外微細環境表面であって、前記微細環境表面は、インテグリン及び成長因子受容体を同時に活性化させることにより組合的信号伝達を誘導することができる、請求項１から１７のいずれか一項に記載のタンパク質基板を含む、細胞外微細環境表面。
【請求項19】
前記細胞の可塑性は、上皮－間葉移行である細胞である、請求項１８に記載の外微細環境表面。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）結合ペプチドモチーフ（ｍｏｔｉｆ）及び成長因子／サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）結合ペプチドモチーフのいずれも有するタンパク質基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を含むＥＣＭ模倣体及び成長因子複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）に関する。特定の具現例において、本発明は、直接的に、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、及びＶＥＧＦ結合ペプチドモチーフのうち１つ、及びフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、及びテナシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）から由来されるインテグリンαｖ、α２、α４、α５、及びα９結合モチーフのうち１つを含むタンパク質基板に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞付着受容体、インテグリン、及び成長因子受容体は、発生及び／又は病理学的工程の間に信号伝達に対する特異性を提供する上で重要な分子的決定子である。インテグリン及び成長因子受容体は独立して細胞内信号を伝えることができるが、細胞外基質（ＥＣＭ）及び成長因子（ＧＦ）により提供される信号のシナジー（ｓｙｎｅｒｇｙ）が胚形成の間の血管発生、傷治癒だけでなく、腫瘍成長／転移を含む複合的な工程を調節するものとみられる。
【0003】
ＧＦは、多様な細胞工程の調節に関与し、典型的に細胞間の信号伝達分子として作用する。ＧＦは、細胞増殖、分化及び成熟を促進し、これらは成長因子において多様である。大部分の成長因子は、拡散可能な方式で作用し、一般的に組織環境においては不安定である。このような延長された維持は、細胞又はその環境において成長因子の活性を維持し、生物工程（ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ）、再生医学適用分野において有利なものと見なされる。
【0004】
したがって、成長因子の性能（例えば、その活性期間及び安全性）を改善するための多くの試みがなされてきた。その環境において成長因子の維持を延長させるための最も一般的な戦略は、成長因子を化学的結合により固体基板上に固定することであり、前記基板は、傷治癒、組織工学などを含む多くの医学的及び生物学的適用分野のために用いられ得る（Ｍｉｒｈａｍｅｄ Ｈａｊｉｍｉｒｉ，ｅｔ ａｌ，Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ １０３，Ｉｓｓｕｅ ２．２０１５ ｐ８１９－８３８）。併せて、人工臓器のために用いられる生体物質に細胞機能の調節のような生体機能性を付加することが非常に重要である。細胞又はスキャフォルド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）生体物質に対する固定化又は高親和性結合のために成長因子を変形することは、多様な研究者により行われてきた（Ｓｅｉｉｃｈｉ Ｔａｄａ，ｅｔ ａｌ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１２；１３（５）：６０５３－６０７２参照）。しかし、これらの大部分はその効果が制限的であるが、これは主にキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）と連関時に成長因子活性が喪失され、成長因子が非効率的に放出制御され、タンパク質分解及び／又は分解からよく保護されないからである。
【0005】
細胞外基質は、多くの構成成分、例えば、成長因子に結合して多数のその活性を調節するための接着分子、ノッチ（ｎｏｔｃｈ）信号伝達分子、牽引可能（ｔｒａｃｔｉｏｎ－ｅｎａｂｌｉｎｇ）付着分子及びプロテオグリカン分子を含有する（Ｃａｏ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｖｉａ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｗｉｔｈ ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３０，４０８５－４０９３；Ｄｉｓｃｈｅｒ Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．２００５ Ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌｓ ｆｅｅｌ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０，１１３９－１１４３； Ｒａｍｉｒｅｚ Ｆ．＆ Ｒｉｆｋｉｎ Ｄ．Ｂ．，２００３ Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ：ａ ｖｉｅｗ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ．Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．２２，１０１－１０７）。
【0006】
多くのＥＣＭタンパク質は、成長因子が局所的に放出されてその細胞表面受容体に結合させる、成長因子及び細胞付着の全てのための結合部位を有する。よって、前記ＥＣＭは共同因子として機能し、細胞表面受容体に対する成長因子を提供する。また、ＥＣＭ結合による成長因子の局所化は、可溶性ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）及び成長因子モルフォゲン（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ）の濃度勾配の確立に寄与し、これは発生工程で核心的役割を担う。成長因子はまた、局所化貯蔵所として機能することになるＥＣＭに隔離されてよい。その後、ＥＣＭが分解されると、可溶性活性リガンドに転換される固体非活性成長因子を放出するはずである（Ｋｉｍ，Ｓ．－Ｈ．，ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ，ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２０９（２），ｐ１３９－５１；Ｈｙｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｒｉｓｏｍｅ－ａｎ ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，２００９；Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ：ｎｏｔ ｊｕｓｔ ｐｒｅｔｔｙ ｆｉｂｒｉｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），３２６（５９５７），ｐｐ．１２１６－９）。一部の成長因子は拡散しない方式で作用するものと知られており、このような成長因子はＨＢ－ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ、及びＣＳＦであり、大部分の成長因子は拡散可能な方式で作用する（Ｓｅｉｉｃｈｉ Ｔａｄａ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１２；１３（５）：６０５３－６０７２．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ）。
【0007】
本発明の目的は、ＥＣＭ由来ＧＦ結合ペプチドモチーフ及びインテグリン結合モチーフを用いることにより、長期間持続する安全性及び機能性で成長因子を固定化するためのより単純かつ信頼可能なタンパク質基板を提供することにある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、インテグリン結合モチーフ及び成長因子と結合するかこれを隔離することができるヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）結合モチーフに遺伝的に機能化された組換え接着タンパク質を含むタンパク質基板を提供することにある。
【0009】
本発明の他の目的は、細胞の可塑性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を調節するための細胞外微細環境表面を提供することにあり、ここで、前記微細環境表面は、インテグリン及び成長因子受容体を同時に活性化させることにより組合的信号伝達を誘導することができる請求項１から１７のいずれか一項に記載のタンパク質基板を含む。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を達成するために、一側面において、本発明は、インテグリン結合モチーフ及び成長因子と結合するかこれを隔離することができるヘパリン結合モチーフに遺伝的に機能化された組換え接着タンパク質を含むタンパク質基板を提供する。
【0011】
本発明の一具現例において、前記ヘパリン結合モチーフは、コラーゲン、ビトロネクチン、又は骨シアロタンパク質（ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）のフィブロネクチンドメイン（ｄｏｍａｉｎ）ＩＩＩ、ラミニン球状（ｇｌｏｂｕｌａｒ）ドメイン、ヘパリン結合ドメインから由来され得る。
【0012】
本発明の好ましい具現例において、フィブロネクチンドメインＩＩＩから由来される前記ヘパリン結合モチーフは、ＫＹＩＬＲＷＲＰＫＮＳ（配列番号７）、ＹＲＶＲＶＴＰＫＥＫＴＧＰＭＫＥ（配列番号８）、ＳＰＰＲＲＡＲＶＴ（配列番号９）、ＡＴＥＴＴＩＴＩＳ（配列番号１０）、ＶＳＰＰＲＲＡＲＶＴＤＡＴＥＴＴＩＴＩＳＷＲＴＫＴＥＴＩＴＧＦＧ（配列番号１１）、ＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号１２）、ＫＰＤＶＲＳＹＴＩＴＧ（配列番号１３）、ＰＲＡＲＩＴＧＹＩＩＫＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶ（配列番号１４）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号１５）、ＷＱＰＰＲＡＲＩＴＧＹＩＩＫＹＥＫＰＧ（配列番号１６）、ＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰ（配列番号１７）、又はＫＮＮＱＫＳＥＰＬＩＧＲＫＫＴ（配列番号１８）のペプチドであってよい。本発明の他の好ましい具現例において、ラミニン球状ドメインから由来される前記ヘパリン結合モチーフは、ＧＬＩＹＹＶＡＨＱＮＱＭ（配列番号１９）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２０）、ＧＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨＡ（配列番号２１）、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号２２）、ＶＶＲＤＩＴＲＲＧＫＰＧ（配列番号２３）、ＲＡＹＦＮＧＱＳＦＩＡＳ（配列番号２４）、ＧＥＫＳＱＦＳＩＲＬＫＴ（配列番号２５）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭＦＮＶＧＨＫＫＬ（配列番号２６）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭ（配列番号２７）、ＬＶＦＭＦＮＶＧＨＫＫＬ（配列番号２８）、ＧＡＡＷＫＩＫＧＰＩＹＬ（配列番号２９）、ＶＩＲＤＳＮＶＶＱＬＤＶ（配列番号３０）、ＧＫＮＴＧＤＨＦＶＬＹＭ（配列番号３１）、ＲＬＶＳＹＳＧＶＬＦＦＬＫ（配列番号３２）、ＧＰＬＰＳＹＬＱＦＶＧＩ（配列番号３３）、ＲＮＲＬＨＬＳＭＬＶＲＰ（配列番号３４）、ＬＶＬＦＬＮＨＧＨＦＶＡ（配列番号３５）、ＡＧＱＷＨＲＶＳＶＲＷＧ（配列番号３６）、ＫＭＰＹＶＳＬＥＬＥＭＲ（配列番号３７）、ＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３８）、ＶＲＷＧＭＱＱＩＱＬＶＶ（配列番号３９）、ＴＶＦＳＶＤＱＤＮＭＬＥ（配列番号４０）、ＡＰＭＳＧＲＳＰＳＬＶＬＫ（配列番号４１）、ＶＬＶＲＶＥＲＡＴＶＦＳ（配列番号４２）、又はＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号４３）のペプチドであってよい。本発明の他の好ましい具現例において、コラーゲンのヘパリン結合ドメインから由来される前記ヘパリン結合モチーフは、ＫＧＨＲＧＦ（配列番号４４）、ＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号４５）、又はＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号４６）のペプチドであってよい。本発明の他の好ましい具現例において、ビトロネクチンのヘパリン結合ドメインから由来される前記ヘパリン結合モチーフは、ＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱ（配列番号４７）のペプチドであってよい。本発明の他の好ましい具現例において、骨シアロタンパク質のヘパリン結合ドメインから由来される前記ヘパリン結合モチーフは、ＫＲＳＲ（配列番号４８）、又はＫＲＲＡ（配列番号４９）のペプチドであってよい。
【0013】
本発明の一具現例において、前記ヘパリン結合モチーフは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、転換成長因子β（ＴＧＦ－β）、又は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合することができる。
【0014】
本発明の他の具現例において、前記インテグリン結合モチーフは、αｖβ３－、αｖβ６－、αｖβ８－、α５β１－、又はα９β１結合ペプチドであってよい。本発明の好ましい具現例において、前記インテグリン結合モチーフはインテグリンαｖβ６を活性化させることができ、前記ヘパリン結合モチーフはＴＧＦ－βに結合することができる。本発明の他の好ましい具現例において、前記インテグリン結合モチーフはインテグリンα５β１又はα９β１を活性化させることができ、前記ヘパリン結合モチーフはｂＦＧＦに結合することができる。
【0015】
本発明の一具現例において、前記組換え接着タンパク質は、組換えイガイ接着タンパク質から由来され得る。本発明の好ましい具現例において、前記組換えイガイ接着タンパク質は、配列番号１－６、及び６０－７４のペプチド配列を含むか、これにより本質的になされるか、これからなされ得る。本発明の他の好ましい具現例において、前記インテグリン結合モチーフ及び／又はヘパリン結合モチーフは、前記組換え接着タンパク質のＮ－末端及び／又はＣ－末端に結合されてよい。本発明の他の好ましい具現例において、前記インテグリン結合モチーフ及びヘパリン結合モチーフは、いずれも前記組換え接着タンパク質のＮ－末端又はＣ－末端に結合されてよい。
【0016】
本発明の一具現例において、前記インテグリン結合モチーフ及びヘパリン結合モチーフは、スペーサーリンカーペプチドを介して連結されてよい。本発明の好ましい具現例において、前記スペーサーリンカーペプチドは、配列番号７５のペプチドであってよい。
【0017】
他の側面において、本発明は、細胞の可塑性を調節するための細胞外微細環境表面を提供する。
【0018】
本発明の一具現例において、前記微細環境表面は、インテグリン及び成長因子受容体を同時に活性化させることにより組合的信号伝達を誘導することができる本発明のタンパク質基板を含むことができる。本発明の好ましい具現例において、前記細胞の可塑性は、上皮－間葉移行（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）であってよい。
【0019】
タンパク質基板は、ＧＦ結合ペプチドモチーフ及びインテグリン結合ペプチドモチーフを含む組換え接着タンパク質の形態で提供される。前記タンパク質基板は、成長因子受容体又はインテグリンを同時に又は順次活性化させることにより、細胞付着、移動、成長、及び生存を含む広い範囲の細胞挙動を誘導又は操作する。
【0020】
一側面において、本発明は、次の３個のドメインを含む組換え接着タンパク質の形態でタンパク質基板を提供する：
１）細胞、組織、又は任意の基板、例えば、プラスチック及びガラスの表面に付着するイガイ接着タンパク質ドメイン；
２）同族（ｃｏｇｎａｔｅ）成長因子受容体を活性化又は抑制するために成長因子を固定化又は隔離することができる成長因子結合ドメイン；及び
３）インテグリンを活性化させることができるインテグリン結合ドメイン。
１）細胞、組織、又は任意の基板、例えば、プラスチック及びガラスの表面に付着するイガイ接着タンパク質ドメイン；
２）同族（ｃｏｇｎａｔｅ）成長因子受容体を活性化又は抑制するために成長因子を固定化又は隔離することができる成長因子結合ドメイン；及び
３）インテグリンを活性化させることができるインテグリン結合ドメイン。
【0021】
本発明によると、任意の組換えイガイ接着タンパク質が本発明の目的のために用いられ得る。本発明の一具現例において、前記組換えイガイ接着タンパク質は、配列番号１－６、及び６０－７４のペプチドを含むか、これにより本質的になされるか、これからなされ得る。本発明の好ましい具現例において、前記組換えイガイ接着タンパク質は、足糸タンパク質（ｆｏｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）１デカペプチド繰り返し体（配列番号１）、足糸タンパク質３（配列番号２）、足糸タンパク質５（配列番号３－４）又はその組み合わせから選択されてよい。好ましくは、足糸タンパク質１デカペプチド繰り返し体及び足糸タンパク質３、足糸タンパク質１デカペプチド繰り返し体及び足糸タンパク質５、又は足糸タンパク質１、足糸タンパク質３及び足糸タンパク質５のハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）である。好ましくは、ムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）の足糸タンパク質５（配列番号３）又はムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）の足糸タンパク質５（配列番号４）のＮ－及びＣ－末端に足糸タンパク質１デカペプチドの６個繰り返し体からなるハイブリッドタンパク質（配列番号５及び配列番号６）が本発明のために用いられる。
【0022】
本発明において、前記ＧＦ結合ドメインは、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）、テナシン、又は骨シアロタンパク質を含むＥＣＭタンパク質から由来されるヘパリン結合又はシンデカン（ｓｙｎｄｅｃａｎ）結合ペプチドモチーフであってよい。ヘパリン結合又はシンデカン結合モチーフにより結合又は隔離される成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、及び血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）を含み、ヘパリン又はシンデカン結合モチーフにより結合又は隔離されるサイトカインは、転換成長因子β（ＴＧＦ－β）、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－２、及びインターロイキン－６である。
【0023】
他の側面において、本発明は、ＥＣＭ由来インテグリン結合ペプチド及び外因性成長因子を固定するための１つ以上のＧＦ結合モチーフを含む価値のある細胞を培養するための合成細胞外微細環境を生成するためのタンパク質基板を提供する。ヘパリン又はシンデカン結合モチーフに結合される外因性成長因子は、本発明によるタンパク質基板内に維持される。
【0024】
他の側面において、本発明は、生物工程又は組織工学適用分野のための徐放性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）成長因子の運搬のためのタンパク質基板を提供する。
【0025】
他の側面において、本発明は、第１側面のタンパク質基板及び薬学的に許容可能な担体を含む細胞治療法、傷治癒又は組織工学のための組成物を提供する。
【0026】
他の側面において、本発明は、成長因子又はサイトカインを維持する合成細胞外基質としてタンパク質基板を提供する。
【0027】
他の側面において、本発明は、成長因子受容体及びインテグリンのいずれにも結合するタンパク質基板を用いる段階を含む細胞移動を促進する方法を提供する。
【0028】
本発明は、細胞、組織、又は器官に運搬するために成長因子又はサイトカインを固定するための基板を提供する。本発明の具現例だけでなく、特徴及び利点は、本明細書の追加的な記述から明確であろう。
【発明の効果】
【0029】
本発明のタンパク質基板は、細胞培養関連適用分野、例えば、幹細胞拡張、組織工学のための成長因子の運搬、又は治療的適用分野のための生物工程のための表面コーティング用として用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1a】図１ａは、インテグリン結合モチーフ及び多様な成長因子を活性化させるかこれに結合することができるヘパリン結合モチーフを提供するタンパク質基板の２種の基本的方式を示す図である。方式Ａは、Ｃ－末端及びＮ－末端にインテグリン結合及びＧＦ結合ペプチドモチーフを有するタンパク質基板であり、方式Ｂでは、結合ペプチドモチーフがいずれもタンパク質基板のＣ－末端に統合されている。
【図1b】図１ｂは、本発明のタンパク質基板の作用メカニズムを示す図である。特異性のために、コーティングされた表面がコーティングされたタンパク質基板は、図１ｂに示したように、結合モチーフ及び成長因子受容体又はインテグリン間の特異的相互作用を許容する島と類似の地形を形成する。
【図2a】図２ａは、ＧＦに高い親和度を有する任意のペプチドモチーフをスクリーニングするためのヘパリン結合ペプチドモチーフ配列のレイアウト（ｌａｙｏｕｔ）を示す図である。図２ａは、フィブロネクチン、コラーゲン、及びラミニン由来のヘパリン又はシンデカン結合ペプチドモチーフのレイアウトである。
【図2b】図２ｂは、ＧＦに高い親和度を有する任意のペプチドモチーフをスクリーニングするためのヘパリン結合ペプチドモチーフ配列のレイアウト（ｌａｙｏｕｔ）を示す図である。図２ｂは、ラミニンＬＧドメイン由来のヘパリン又はシンデカン結合ペプチドのレイアウトである。
【図5a】図５ａは、ＴＧＦ－βに高い親和度を有するタンパク質基板に結合されたＴＧＦ－βの徐放性放出を示す図である。図５ａは、ＴＧＦ－βに高い親和度を有するＴＧＦ－β結合ペプチドモチーフのレイアウトである。
【図5b】図５ｂは、ＴＧＦ－βに高い親和度を有するタンパク質基板に結合されたＴＧＦ－βの徐放性放出を示す図である。図５ｂは、ＴＧＦ－βの長期間の徐放性放出を示すＴＧＦ－βに対して高い親和度を有するＧＦ結合モチーフの吸収プロフィールを示す。
【図6b】図６ｂは、ＥＭＴ誘導可能なインテグリン結合モチーフがコーティングされた表面で培養された乳房上皮細胞であるＭＣＦ－１０Ａのウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）結果を示す図である。図６ｂにおいて、フィブロネクチン発現は、タンパク質基板に結合されたＴＧＦ－β誘導ＥＭＴマーカーとして示す。ＴＧＦ－βに対して高い親和度を有するＧＦ結合モチーフ（ＹＥＫ ＆ ＡＮＧ）を有するタンパク質基板は、フィブロネクチンの高い発現を誘導したが、ＴＧＦ－βに対して低い親和度を有するＧＦ結合モチーフ（ＷＱ）を有するタンパク質基板は、フィブロネクチン発現を誘導しなかった。
【図7】図７は、ウエスタンブロットにより分析されたトリプシン－媒介ＴＧＦ－β切断を示す図である。タンパク質基板に結合されたＴＧＦ－βは、低いレベルのトリプシン消化を有するが、タンパク質基板がないＴＧＦ－βはトリプシンで処理されるときに大部分消化された。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明は、細胞挙動を調節するためにインテグリン及び成長因子／サイトカイン受容体により同時に又は選択的に媒介された信号伝達を誘導するタンパク質基板に関する。タンパク質基板は、次の３個のドメインを含む組換え接着タンパク質の形態で提供され得る：
１）細胞、組織、又は任意の基板の表面、例えば、プラスチック又はガラスに付着する組換えイガイ接着タンパク質ドメイン；
２）同族成長因子受容体又はサイトカイン受容体を活性化又は抑制するために成長因子又はサイトカインを固定化又は隔離することができる成長因子結合ドメイン；及び
３）インテグリン受容体を活性化させることができるインテグリン結合ドメイン。
１）細胞、組織、又は任意の基板の表面、例えば、プラスチック又はガラスに付着する組換えイガイ接着タンパク質ドメイン；
２）同族成長因子受容体又はサイトカイン受容体を活性化又は抑制するために成長因子又はサイトカインを固定化又は隔離することができる成長因子結合ドメイン；及び
３）インテグリン受容体を活性化させることができるインテグリン結合ドメイン。
【0032】
本明細書で用いられるとき、用語「基板」は、他の物質が適用される物質を意味する。生物学において、有機体、例えば、植物、真菌、又は動物が生きていく表面は基板と称することができる。前記表面は、いずれも生物的、又は非生物的構成成分を含むことができる。
【0033】
本明細書で用いられるとき、組換えイガイ接着タンパク質は、イガイ足糸タンパク質ＦＰ－５及びイガイ足糸タンパク質ＦＰ－１デカペプチドを含む融合タンパク質を示す。一具現例において、本明細書で提供されるタンパク質基板は、配列番号５－６よりなる群から選択されるイガイ足糸タンパク質を含む。
【0034】
本明細書で用いられるとき、用語「ＧＦ結合ペプチドモチーフ」は、例えば、フィブロネクチンドメインＩＩＩ、ラミニンＬＧドメイン、コラーゲンヘパリン結合ドメイン、ビトロネクチンヘパリン結合ドメイン、又はフィブリノーゲンを非制限的に含む細胞外基質タンパク質のヘパリン結合又はシンデカン結合ドメインから由来される短いペプチドを示す。一具現例において、前記ＧＦ結合ペプチドモチーフは、５－４０個のアミノ酸又はその組み合わせを含む。多様な具現例において、前記ＧＦ結合ペプチドモチーフは、フィブロネクチン由来のＫＹＩＬＲＷＲＰＫＮＳ（配列番号７）、ＹＲＶＲＶＴＰＫＥＫＴＧＰＭＫＥ（配列番号８）、ＳＰＰＲＲＡＲＶＴ（配列番号９）、ＡＴＥＴＴＩＴＩＳ（配列番号１０）、ＶＳＰＰＲＲＡＲＶＴＤＡＴＥＴＴＩＴＩＳＷＲＴＫＴＥＴＩＴＧＦＧ（配列番号１１）、ＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号１２）、ＫＰＤＶＲＳＹＴＩＴＧ（配列番号１３）、ＰＲＡＲＩＴＧＹＩＩＫＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶ（配列番号１４）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号１５）、ＷＱＰＰＲＡＲＩＴＧＹＩＩＫＹＥＫＰＧ（配列番号１６）、ＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰ（配列番号１７）、ＫＮＮＱＫＳＥＰＬＩＧＲＫＫＴ（配列番号１８）、又はラミニン由来のＧＬＩＹＹＶＡＨＱＮＱＭ（配列番号１９）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２０）、ＧＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨＡ（配列番号２１）、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号２２）、ＶＶＲＤＩＴＲＲＧＫＰＧ（配列番号２３）、ＲＡＹＦＮＧＱＳＦＩＡＳ（配列番号２４）、ＧＥＫＳＱＦＳＩＲＬＫＴ（配列番号２５）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭＦＮＶＧＨＫＫＬ（配列番号２６）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭ（配列番号２７）、ＬＶＦＭＦＮＶＧＨＫＫＬ（配列番号２８）、ＧＡＡＷＫＩＫＧＰＩＹＬ（配列番号２９）、ＶＩＲＤＳＮＶＶＱＬＤＶ（配列番号３０）、ＧＫＮＴＧＤＨＦＶＬＹＭ（配列番号３１）、ＲＬＶＳＹＳＧＶＬＦＦＬＫ（配列番号３２）、ＧＰＬＰＳＹＬＱＦＶＧＩ（配列番号３３）、ＲＮＲＬＨＬＳＭＬＶＲＰ（配列番号３４）、ＬＶＬＦＬＮＨＧＨＦＶＡ（配列番号３５）、ＡＧＱＷＨＲＶＳＶＲＷＧ（配列番号３６）、ＫＭＰＹＶＳＬＥＬＥＭＲ（配列番号３７）、ＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３８）、ＶＲＷＧＭＱＱＩＱＬＶＶ（配列番号３９）、ＴＶＦＳＶＤＱＤＮＭＬＥ（配列番号４０）、ＡＰＭＳＧＲＳＰＳＬＶＬＫ（配列番号４１）、ＶＬＶＲＶＥＲＡＴＶＦＳ（配列番号４２）、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号４３）、ＰＧＲＷＨＫＶＳＶＲＷＥ（配列番号７６）、又はコラーゲン由来のＫＧＨＲＧＦ（配列番号４４）、ＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号４５）、ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号４６）、又はビトロネクチン由来のＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱ（配列番号４７）、又は骨シアロタンパク質由来のＫＲＳＲ（配列番号４８）、ＫＲＲＡ（配列番号４９）からなるヘパリン結合又はシンデカン結合ペプチドの群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0035】
本明細書で用いられるとき、用語「インテグリン結合モチーフ」は、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、又はテナシンを非制限的に含む細胞外基質タンパク質から由来される短いペプチドを示す。前記インテグリン結合モチーフは、インテグリンαｖ、α５、α８又はα９に結合し、これを活性化させて細胞付着を支持し、ヘパリン結合モチーフに結合された成長因子とともに形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導することができる。多様な具現例において、前記ヘパリン結合ペプチドは、インテグリンαｖ結合のＲＧＤ（配列番号５０）、ＲＧＤＶ（配列番号５１）、ＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（配列番号５２）、又はインテグリンα５結合のＧＲＧＤＳＰ（配列番号５３）、ＰＨＳＲＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号５４）、又はインテグリンα９結合のＥＤＧＩＨＥＬ（配列番号５５）、ＶＡＥＩＤＧＩＥＬ（配列番号５６）、又はインテグリンα８結合のＶＦＤＮＦＶＬＫ（配列番号５７）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0036】
一具現例において、本発明は、成長因子を同時に又は選択的に隔離するか、これに結合するＧＦ結合ペプチドモチーフを提供するタンパク質基板を開示する。任意の好適なＧＦ結合ペプチドモチーフは、前記ヘパリン結合モチーフの用語の定義で詳細に記述されているように、フィブロネクチンドメインＩＩＩ、ラミニンＬＧドメイン、コラーゲンヘパリンドメイン、ビトロネクチンヘパリンドメイン、又は骨シアロタンパク質から由来されるヘパリン結合又はシンデカン結合モチーフよりなる群から選択されてよい。
【0037】
一具現例において、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を隔離するかこれに結合するためのタンパク質基板が開示される。一般的に、前記ＧＦ結合ペプチドモチーフは、ｂＦＧＦ結合のためのフィブロネクチン、ラミニン及びコラーゲンのヘパリン／シンデカン結合ドメインから選択されてよい。好ましくは、フィブロネクチン由来ペプチドのＰＲＡＲＩＴＧＹＩＩＫＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶ（配列番号１４）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号１５）、ラミニン由来ペプチドのＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３８）、ＶＲＷＧＭＱＱＩＱＬＶＶ（配列番号３９）、ＶＬＶＲＶＥＲＡＴＶＦＳ（配列番号４２）、又はコラーゲン由来のＫＧＨＲＧＦ（配列番号４４）がｂＦＧＦを隔離するかこれに結合するために選択されてよい。
【0038】
他の具現例において、本発明は、転換成長因子β（ＴＧＦ－β）を隔離するかこれに結合するためのＧＦ結合ペプチドモチーフを提供するためのタンパク質基板を開示する。前記ＧＦ結合ペプチドモチーフは、ＴＧＦ－β結合のためのフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、又は骨シアロタンパク質のヘパリン／シンデカン結合ドメインから選択されてよい。好ましくは、フィブロネクチン由来モチーフのＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号１２）、ＫＰＤＶＲＳＹＴＩＴＧ（配列番号１３）、ＰＲＡＲＩＴＧＹＩＩＫＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶ（配列番号１４）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号１５）、ＷＱＰＰＲＡＲＩＴＧＹＩＩＫＹＥＫＰＧ（配列番号１６）、ＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰ（配列番号１７）、又はラミニン由来ペプチドのＧＬＩＹＹＶＡＨＱＮＱＭ（配列番号１９）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２０）、ＧＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨＡ（配列番号２１）、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号２２）、ＶＶＲＤＩＴＲＲＧＫＰＧ（配列番号２３）、ＲＡＹＦＮＧＱＳＦＩＡＳ（配列番号２４）、ＧＥＫＳＱＦＳＩＲＬＫＴ（配列番号２５）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭＦＮＶＧＨＫＫＬ（配列番号２６）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭ（配列番号２７）、ＬＶＦＭＦＮＶＧＨＫＫＬ（配列番号２８）、ＧＡＡＷＫＩＫＧＰＩＹＬ（配列番号２９）、ＶＩＲＤＳＮＶＶＱＬＤＶ（配列番号３０）、ＧＫＮＴＧＤＨＦＶＬＹＭ（配列番号３１）、ＲＬＶＳＹＳＧＶＬＦＦＬＫ（配列番号３２）、ＧＰＬＰＳＹＬＱＦＶＧＩ（配列番号３３）、ＲＮＲＬＨＬＳＭＬＶＲＰ（配列番号３４）、ＬＶＬＦＬＮＨＧＨＦＶＡ（配列番号３５）、ＡＧＱＷＨＲＶＳＶＲＷＧ（配列番号３６）、ＫＭＰＹＶＳＬＥＬＥＭＲ（配列番号３７）、ＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３８）、ＶＲＷＧＭＱＱＩＱＬＶＶ（配列番号３９）、ＴＶＦＳＶＤＱＤＮＭＬＥ（配列番号４０）、ＡＰＭＳＧＲＳＰＳＬＶＬＫ（配列番号４１）、ＶＬＶＲＶＥＲＡＴＶＦＳ（配列番号４２）、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号４３）、又はコラーゲン由来のＫＧＨＲＧＦ（配列番号４４）、ＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号４５）、ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号４６）、又はビトロネクチン由来のＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱ（配列番号４７）、又は骨シアロタンパク質由来のＫＲＳＲ（配列番号４８）、ＫＲＲＡ（配列番号４９）がＴＧＦ－βに結合するかこれを隔離するために選択されてよい。より好ましくは、前記ヘパリン結合モチーフは、フィブロネクチン由来のＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号１２）、ＫＰＤＶＲＳＹＴＩＴＧ（配列番号１３）、ＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰ（配列番号１７）、又はラミニン由来のＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号２２）、ＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３８）、ＧＫＮＴＧＤＨＦＶＬＹＭ（配列番号３１）、ＲＬＶＳＹＳＧＶＬＦＦＬＫ（配列番号３２）、ＶＬＶＲＶＥＲＡＴＶＦＳ（配列番号４２）、又はビトロネクチン由来のＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱ（配列番号４７）、又は骨シアロタンパク質由来のＫＲＳＲ（配列番号４８）、ＫＲＲＡ（配列番号４９）から選択されてよい。
【0039】
他の具現例において、本発明は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を隔離するかこれに結合するためのＧＦ結合ペプチドモチーフを提供するためのタンパク質基板を開示する。前記ＰＤＧＦ結合モチーフは、ラミニン由来モチーフのＧＬＩＹＹＶＡＨＱＮＱＭ（配列番号１９）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２０）、ＧＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨＡ（配列番号２１）、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号２２）、ＶＶＲＤＩＴＲＲＧＫＰＧ（配列番号２３）、ＲＡＹＦＮＧＱＳＦＩＡＳ（配列番号２４）、ＧＥＫＳＱＦＳＩＲＬＫＴ（配列番号２５）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭＦＮＶＧＨＫＫＬ（配列番号２６）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭ（配列番号２７）、ＬＶＦＭＦＮＶＧＨＫＫＬ（配列番号２８）、ＧＡＡＷＫＩＫＧＰＩＹＬ（配列番号２９）、ＶＩＲＤＳＮＶＶＱＬＤＶ（配列番号３０）、ＧＫＮＴＧＤＨＦＶＬＹＭ（配列番号３１）、ＲＬＶＳＹＳＧＶＬＦＦＬＫ（配列番号３２）、ＧＰＬＰＳＹＬＱＦＶＧＩ（配列番号３３）、ＲＮＲＬＨＬＳＭＬＶＲＰ（配列番号３４）、ＬＶＬＦＬＮＨＧＨＦＶＡ（配列番号３５）、ＡＧＱＷＨＲＶＳＶＲＷＧ（配列番号３６）、ＫＭＰＹＶＳＬＥＬＥＭＲ（配列番号３７）、ＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３８）、ＶＲＷＧＭＱＱＩＱＬＶＶ（配列番号３９）、ＴＶＦＳＶＤＱＤＮＭＬＥ（配列番号４０）、ＡＰＭＳＧＲＳＰＳＬＶＬＫ（配列番号４１）、ＶＬＶＲＶＥＲＡＴＶＦＳ（配列番号４２）、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号４３）、ＰＧＲＷＨＫＶＳＶＲＷＥ（配列番号７６）、又はビトロネクチン由来のＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱ（配列番号４７）、又は骨シアロタンパク質由来のＫＲＳＲ（配列番号４８）、ＫＲＲＡ（配列番号４９）から選択されてよい。より好ましくは、前記ＰＤＧＦ結合モチーフは、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２０）、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号２２）、ＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３８）、ＧＫＮＴＧＤＨＦＶＬＹＭ（配列番号３１）、ＶＬＶＲＶＥＲＡＴＶＦＳ（配列番号４２）、又はビトロネクチン由来のＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱ（配列番号４７）、又は骨シアロタンパク質由来のＫＲＳＲ（配列番号４８）から選択されてよい。
【0040】
本発明はさらに、生理的条件で成長因子の徐放性放出のためのタンパク質基板を開示する。
【0041】
細胞外基質に存在するヘパリンサルフェートとの相互作用は、組織の恒常性においてＦＧＦのような成長因子の拡散（Ｄｕｃｈｅｓｎｅ Ｌ，ｅｔ ａｌ，ｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２０１２；１０（７）：ｅ１００１３６１．，Ｄｏｗｄ ＣＪ，ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｍｅｄｉａｔｅｓｂＦＧＦ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｙ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒａｐｉｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ １９；２７４（８）：５２３６－４４）だけではなく、ＦＧＦの貯蔵及び放出を直接的に調節することがよく知られている（Ｂａｓｈｋｉｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，ａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｓｕｂｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｂｙ ｈｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８９ ２１；２８（４）：１７３７－４３）。
【0042】
一具現例において、本発明は、生理学的条件において数日の期間にわたり機能の損失がないＴＧＦ－βの徐放性放出システムとしてタンパク質基板を提供する。前記タンパク質基板は、生理的条件において、ＴＧＦ－βの徐放性放出のために、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号２２）、ＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３８）、ＧＫＮＴＧＤＨＦＶＬＹＭ（配列番号３１）、ＲＬＶＳＹＳＧＶＬＦＦＬＫ（配列番号３２）、ＶＬＶＲＶＥＲＡＴＶＦＳ（配列番号４２）から選択されるＴＧＦ－β結合モチーフを提供する。
【0043】
本発明はまた、インテグリン結合ペプチドモチーフ及びＧＦ結合ペプチドモチーフを同時に提供するためのタンパク質基板を開示する。インテグリン結合モチーフは、組換え接着タンパク質のＮ－末端内に統合されてよく、成長因子又はサイトカイン結合モチーフは、前記接着タンパク質のＣ－末端内に統合されてよく、その反対であってもよい。
【0044】
インテグリン及び成長因子受容体間のクロストーク（ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）はよく知られている。例えば、腸などは、ＦＧＦ２－ＦＮＩＩＩ９－１０融合タンパク質がＦＮＩＩＩ９－１０単独と比較してＭＧ６３細胞の細胞付着及び増殖の顕著な増加を示し（Ｊｕｎ－Ｈｙｅｏｇ Ｊａｎｇ ＆ Ｃｈｏｎｇ－Ｐｙｏｕｎｇ Ｃｈｕｎｇ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－２ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ｖｏｌｕｍｅ ２６，ｐ１８３７－１８４０（２００４）），ＦＮＩＩＩ９－１０－媒介付着がＰＣ１２細胞の神経突起成長物（ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）に対するＦＧＦ１の効果を促進することを報告した（Ｃｈｏｕｎｇ ＰＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｉｔｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００２，２９５：８９８－９０２）。
【0045】
一具現例において、本発明は、ＲＧＤＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号５８）を有するフィブロネクチンドメインＩＩＩを模倣するタンパク質基板を開示する。
【0046】
他の具現例において、本発明は、フィブロネクチンドメインＩＩＩ（配列番号５９）を模倣するタンパク質基板を開示し、ここで、インテグリン結合モチーフのＲＧＤ（配列番号５０）は接着タンパク質のＣ－末端に統合され、成長因子又はサイトカイン、例えば、ＴＧＦ－β結合モチーフのＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号１２）は接着タンパク質のＮ－末端に統合される。
【0047】
本発明はまた、傷治癒、血管形成又は発病、例えば、線維症又は腫瘍の転移と直接的に連関される表現型可塑性を制御するためにインテグリン及び成長因子受容体を同時に活性化させる微細環境表面を提供する。
【0048】
一具現例において、本発明は、上皮細胞で上皮－間葉移行（ＥＭＴ）を誘導するために、前記タンパク質基板を含む合成腫瘍微細環境表面を提供する。
【0049】
ＥＭＴは、上皮細胞がＥ－カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）を含む上皮タンパク質を失い、Ｎ－カドヘリン、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）及びフィブロネクチンのような間葉マーカーを獲得する工程である。ＥＭＴは、胚芽又は癌の発生及び／又は進行（Ｋａｌｌｕｒｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｂａｓｉｃｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９；１１９：１４２０－８． Ｊｏｒｄａｎ ＮＶ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．２０１；１０：２８６５－７３）、傷治癒及び組織復旧、及び細胞移動を含む多くの工程と連関される（Ｈｏｓａｋａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｉｃｙｔｅ－ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１６；１１３：Ｅ５６１８－２７．Ｙａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｓｎａｉｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｔｏ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒｒｅｓｔｉｎｇ Ｇ２／Ｍ ｐｈａｓｅ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；５０：１２５１－６０）。ＥＭＴ事件は、発生及び傷復旧のために必須的ではあるが、これはまた、線維性疾患及び癌に対する寄与因子として認識されてきた。ＴＧＦ－β及びＥＣＭタンパク質を含む多くの可溶性及び不溶性因子がＥＭＴ事件の程度及び期間を決める。具体的に、サイトカイン、例えば、ＴＧＦ－β、ＴＮＦα、及びＩＬ６及び低酸素症は、多様な腫瘍でＥＭＴを誘導し得る。
【0050】
コラーゲン－Ｉ、フィブロネクチン、及びヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）を含む幾つかの細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質、及び細胞外リシルオキシダーゼ（ｌｙｓｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ）によるＥＣＭリモデリングがまたＥＭＴの調節に影響を及ぼす（Ｈａｅ－Ｙｕｎ Ｊｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；２１（５） Ｍａｒｃｈ １、２０１５．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｗａｙｓ：Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｔｏ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）。幾つかのインテグリンは、ＥＭＴを媒介するものと知られている。例えば、ＥＭＴは、ＴＧＦ－β１－Ｓｍａｄ２／３の信号伝達経路の活性化を介してインテグリンαｖβ６により調節される（Ｗａｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ｂｅｔａ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｌｖｅｏｌａｒ ｅｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｖｉａ αｖβ６ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＴＧＦ－ｂｅｔａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３６：２１９８－２２１６）。フィブロネクチンに結合するα５β１、及びコラーゲンＩと相互作用するインテグリンα１β１及びα２β１を含む幾つかのインテグリン複合体の発現がまたＥＭＴの間に上向き調節され、Ｅ－カドヘリン複合体の破壊を媒介するものと表われた。ＥＣＭと細胞の相互作用は、ＥＣＭ連関タンパク質、例えば、コラーゲン及びα２β１の相互作用を促進するための糖タンパク質であるＳＰＡＲＣにより調整されるものと表われた。
【0051】
一具現例において、本発明は、乳癌細胞株であるＭＣＦ－１０ＡでＥＭＴを誘導するために、インテグリンα５β１、α９β１、又はαｖβ３結合モチーフから選択されるインテグリン結合モチーフ、及びＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号１２）、ＫＰＤＶＲＳＹＴＩＴＧ（配列番号１３）又はＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰ（配列番号１７）から選択されるサイトカイン結合モチーフを含むタンパク質基板を提供する。
【0052】
本発明はまた、細胞培養培地又はバッファー溶液、例えば、ＰＢＳバッファーで成長因子又はサイトカイン結合モチーフを含むタンパク質基板を成長因子又はサイトカインと混合することにより、細胞培養条件で長期間の間生物学的活性の損失に対して成長因子又はサイトカインを安定化させるための方法を提供する。
【0053】
一具現例において、サイトカイン結合モチーフのＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号１２）及び成長因子結合モチーフのＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰ（配列番号１７）を提供するタンパク質基板を含む組成物は、ＤＭＥＭのような細胞培養培地又はＰＢＳのようなバッファー溶液に溶解される。前記組成物は、乳房上皮細胞株であるＭＣＦ－１０ＡでのＥＭＴ促進テストで実証されるように、その生物学的活性の損失なく少なくとも１週間保管され得る。
【0054】
以下、本発明は、製造例、実施例、及びその実験例を参照しつつ詳細に記述される。
【0055】
しかし、次の製造例、実施例、及び実験例は、本発明を例示するための目的で提供されるだけであり、本発明の範囲を制限するための意図ではないことが理解されなければならない。
【0056】
実施例
実施例１．インテグリン結合モチーフ及びヘパリン結合モチーフを提供するタンパク質基板の製造
イガイ足糸タンパク質１及び足糸タンパク質５の融合タンパク質を含む多様なイガイ接着タンパク質を効率的な方式で生産するための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）基盤のタンパク質発現システムが商業化されており（ＵＳ２０２０／００６２８０９Ａ１及びＷＯ２０１１／１１５４２０Ａ２参照）、前記イガイ接着タンパク質は、Ｋｏｌｌｏｄｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社により市販されるブランドＭＡＰＴｒｉｘ（登録商標）下に商業的に利用可能である。イガイ接着タンパク質を製造するための方法は、本明細書に完全に開示されているように、全ての目的のために引用により本明細書に統合されるＵＳ２０２００／０６２８０９Ａ１及びＷＯ２０１１／１１５４２０Ａ２に完全に記述されている。
実施例１．インテグリン結合モチーフ及びヘパリン結合モチーフを提供するタンパク質基板の製造
イガイ足糸タンパク質１及び足糸タンパク質５の融合タンパク質を含む多様なイガイ接着タンパク質を効率的な方式で生産するための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）基盤のタンパク質発現システムが商業化されており（ＵＳ２０２０／００６２８０９Ａ１及びＷＯ２０１１／１１５４２０Ａ２参照）、前記イガイ接着タンパク質は、Ｋｏｌｌｏｄｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社により市販されるブランドＭＡＰＴｒｉｘ（登録商標）下に商業的に利用可能である。イガイ接着タンパク質を製造するための方法は、本明細書に完全に開示されているように、全ての目的のために引用により本明細書に統合されるＵＳ２０２００／０６２８０９Ａ１及びＷＯ２０１１／１１５４２０Ａ２に完全に記述されている。
【0057】
タンパク質基板の基本的な方式は、図１ａに例示されている。図１ａに示したように、２個のペプチドモチーフは、それぞれイガイ接着タンパク質のＮ－末端及びＣ－末端内に統合され得る（方式Ａ）。代案的に、図１ｂに示したように、両方のモチーフは、Ｃ－末端又はＮ－末端内に統合されてよく（方式Ｂ）、ここで、ＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧのようなスペーサーリンカーペプチドは、相乗効果のために２個のペプチドを効果的に分離する。
【0058】
配列番号５８（以下、「ＭＡＰ－ＲＧＤ－ＧＦ」と記す）及び配列番号５９（以下、「ＧＦ－ＭＡＰ－ＲＧＤ」と記す）を有する２タイプのタンパク質基板をＵＳ２０２０／００６２８０９Ａ１及びＷＯ２０１１／１１５４２０Ａ２に開示されているように組換え的にデザインし、大腸菌発現システムで発現及び精製した。ＧＦ結合モチーフを有する多数のタンパク質基板を同一の手順で生産した。全てのタンパク質基板を凍結乾燥し、さらなる実験のために冷蔵庫に保管した。
【0059】
実施例２．成長因子結合分析法
成長因子又はサイトカイン結合分析法のための複数の配列は、図２ａ及び図２ｂに示したように、９６ウェルフォーマットに整列された多数のヘパリン結合ペプチドモチーフで構成されている。図２ａは、フィブロネクチン、コラーゲン、及びラミニン由来ＧＦ結合モチーフの配列レイアウトであり、図２ｂは、ラミニン球状ドメイン由来ＧＦ結合モチーフの配列レイアウトである。
成長因子又はサイトカイン結合分析法のための複数の配列は、図２ａ及び図２ｂに示したように、９６ウェルフォーマットに整列された多数のヘパリン結合ペプチドモチーフで構成されている。図２ａは、フィブロネクチン、コラーゲン、及びラミニン由来ＧＦ結合モチーフの配列レイアウトであり、図２ｂは、ラミニン球状ドメイン由来ＧＦ結合モチーフの配列レイアウトである。
【0060】
成長因子又はサイトカインに対するペプチドモチーフの特異的結合のために、低い細胞付着又は超疎水性表面を基板タンパク質でコーティングし、ここで、前記基板タンパク質は粒子として形成された。よって、前記表面は、図１ｂに示したように、粒子島のように見える。前記コーティング方法は最新技術であり、詳細な手順は、本発明者達により開発され、参照として本明細書に完全に統合される米国特許出願ＵＳ１６／５４６，９６６に記述されている。前記表面は、ＧＦのような生体分子又は標的細胞が表面に提供されるペプチドモチーフに特異的に結合させる。非標的生体分子又は細胞は、懸濁するように強制され、結局、洗浄されてしまう。
【0061】
組換え塩基性ＦＧＦ、ＴＧＦ－β、ＰＤＧＦ－ＢＢは、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）から購入し、超低（Ｕｌｔｒａｌｏｗ）細胞付着９６ウェルプレートは、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）から購入した。脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）から購入し、ウシ胎児血清は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。
【0062】
組換え成長因子の任意の非特異的結合を除去するか最小化するために、基板タンパク質でコーティングされた９６ウェルプレート表面をＰＢＳＴバッファー（４ｍＭのフォスフェート及び１５５ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５ｗｔ％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）中の２ｗｔ％のＢＳＡを用いて、前記プレートを室温で１時間撹拌することにより遮断した。その後、ＰＢＳＴに溶解された個別の組換え成長因子（５０ｎＭ）を、ヘパリン結合モチーフを含む遮断されたウェルプレートに添加し、前記プレートを４℃で一晩中撹拌した。前記ウェルプレートにコーティングされたタンパク質基板に対する成長因子の結合は、免疫親和度分析法により確認した。簡単に、前記ウェルプレートを前記成長因子に対する１次抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された２次抗体で順次処理した。最後に、ＴＭＢ（３，３’、５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基板をＨＲＰにより化学的に交換し、４５０ｎｍにおける吸光度の値を用いてそれぞれの結合モチーフに対する成長因子の結合を分析した。図３は、成長因子結合に対応するＴＭＢ吸光度の値を示す。前記値に成長因子がないブランクサンプルの吸光度の値が引かれた。０．１を超過する吸光度の判読値は、意味のある相互作用として見なした。
【0063】
図４ａ及び図４ｂに示したように、本発明者達は、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ－β、及びＰＤＧＦ－ＢＢに特異的に結合するフィブロネクチン由来ＧＦ結合モチーフを確認した。それぞれの成長因子に対して高い親和度を有するＧＦ結合モチーフは、次の表１に要約されている。
【0064】
【表1】
【0065】
図４ｃに示したように、大部分のラミニン由来ＧＦ結合ペプチドモチーフは、ＴＧＦ－β及びＰＤＧＦに対してより高い親和度を示したが、フィブロネクチンＧＦ結合モチーフの場合と似てｂＦＧＦに対しては相対的に低い親和度を示した。
【0066】
実施例３．タンパク質基板に結合された成長因子の徐放性放出
ＥＣＭタンパク質内のヘパリン結合ドメインは、生理学的条件において成長を安定化させるものと表われた。前記ＧＦ結合ペプチドモチーフが成長因子に対する任意の保護効果を付与するのか否かを決定するために、実施例２で確認されたＧＦ結合ペプチドモチーフの存在又は不在下にＴＧＦ－βをＰＢＳバッファー又は細胞培養培地であるＤＭＥＭを用いて条件化した。ｂＦＧＦ（０．５μｇ）を前記タンパク質基板コーティング表面に添加し、３７℃で２、４、及び７日間インキュベーションした。本発明者達は、酵素－結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）を用いて３７℃で時間に応じたＴＧＦ－βの安全性を評価し、タンパク質基板から徐々に放出されることとその半減期が４日であることを明らかにした。図５ｂに示したように、ＴＧＦ－βに対して高い親和度を有するＧＦ結合モチーフ（ＡＮＧ－ＭＡＰ－ＲＧＤ－ＩＤＡＰ）は、細胞培養条件でＴＧＦ－βの長期間の徐放性放出を示す。
ＥＣＭタンパク質内のヘパリン結合ドメインは、生理学的条件において成長を安定化させるものと表われた。前記ＧＦ結合ペプチドモチーフが成長因子に対する任意の保護効果を付与するのか否かを決定するために、実施例２で確認されたＧＦ結合ペプチドモチーフの存在又は不在下にＴＧＦ－βをＰＢＳバッファー又は細胞培養培地であるＤＭＥＭを用いて条件化した。ｂＦＧＦ（０．５μｇ）を前記タンパク質基板コーティング表面に添加し、３７℃で２、４、及び７日間インキュベーションした。本発明者達は、酵素－結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）を用いて３７℃で時間に応じたＴＧＦ－βの安全性を評価し、タンパク質基板から徐々に放出されることとその半減期が４日であることを明らかにした。図５ｂに示したように、ＴＧＦ－βに対して高い親和度を有するＧＦ結合モチーフ（ＡＮＧ－ＭＡＰ－ＲＧＤ－ＩＤＡＰ）は、細胞培養条件でＴＧＦ－βの長期間の徐放性放出を示す。
【0067】
実施例４．上皮細胞の間葉細胞への分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を誘導するための合成微細環境
実施例２及び実施例３で確認されたＴＧＦ－β結合モチーフを６ウェルプレートに配列した。実施例２に開示されたように、ＴＧＦ－β（５ｎｇ）を処理した後、前記６ウェルプレートを所定の時間の間（例えば、それぞれ２、４及び７日）３７℃のＣＯ２インキュベーターに保管した。乳房上皮細胞であるＭＣＦ－１０Ａを接種し、ＴＧＦ－β結合ペプチドモチーフがコーティングされたウェルプレートで培養した。図６ｂに示したように、ＴＧＦ－βに対する高い親和度を有する２個のモチーフは、ＭＣＦ－１０ＡがＥＭＴを経験することを誘導することができたが、低いＴＧＦ－β結合親和度モチーフであるＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号１５）は、フィブロネクチン上向き調節がないことにより立証されるようにＥＭＴを誘導することができなかった。
実施例２及び実施例３で確認されたＴＧＦ－β結合モチーフを６ウェルプレートに配列した。実施例２に開示されたように、ＴＧＦ－β（５ｎｇ）を処理した後、前記６ウェルプレートを所定の時間の間（例えば、それぞれ２、４及び７日）３７℃のＣＯ２インキュベーターに保管した。乳房上皮細胞であるＭＣＦ－１０Ａを接種し、ＴＧＦ－β結合ペプチドモチーフがコーティングされたウェルプレートで培養した。図６ｂに示したように、ＴＧＦ－βに対する高い親和度を有する２個のモチーフは、ＭＣＦ－１０ＡがＥＭＴを経験することを誘導することができたが、低いＴＧＦ－β結合親和度モチーフであるＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号１５）は、フィブロネクチン上向き調節がないことにより立証されるようにＥＭＴを誘導することができなかった。
【0068】
実施例５．トリプシン活性からのＧＦ保護
実施例２及び実施例３で確認されたＴＧＦ－β結合ペプチドモチーフを３０℃で１５分間ＴＧＦ－β（２μｇ）及びトリプシン（０．３μｇ）とともにインキュベーションした。トリプシン化した後、サンプルのタンパク質をサイズ依存的方式で１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを２時間クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）溶液で染色した。脱染色後、クマシーブルー溶液により染色したバンドの強度を分析した。図７に示したように、ＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号１２）、ＡＮＧ－Ｍ－ＲＧＤ（配列番号５９）、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号２２）、ＫＲＳＲ（配列番号４８）、及びＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２０）モチーフは、ＭＡＰ－融合モチーフがない場合と比較してＴＧＦ－βのトリプシン化を抑制した。
実施例２及び実施例３で確認されたＴＧＦ－β結合ペプチドモチーフを３０℃で１５分間ＴＧＦ－β（２μｇ）及びトリプシン（０．３μｇ）とともにインキュベーションした。トリプシン化した後、サンプルのタンパク質をサイズ依存的方式で１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを２時間クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）溶液で染色した。脱染色後、クマシーブルー溶液により染色したバンドの強度を分析した。図７に示したように、ＡＮＧＱＴＰＩＱＲＹＩＫ（配列番号１２）、ＡＮＧ－Ｍ－ＲＧＤ（配列番号５９）、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号２２）、ＫＲＳＲ（配列番号４８）、及びＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２０）モチーフは、ＭＡＰ－融合モチーフがない場合と比較してＴＧＦ－βのトリプシン化を抑制した。
【0069】
実施例６．細胞成長のための成長因子結合タンパク質基板
総９６－ウェルのプレート（非組織培養処理される、ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を酢酸ナトリウムバッファーで室温で１時間、ＧＦ結合ペプチドモチーフを有するタンパク質基板を用いて５０μｇ／ｍｌでコーティングした。０．５％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中の２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及びＰＤＧＦ－ＢＢ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を個別ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１時間インキュベーションした。０．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充されたＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でヒト包皮線維芽細胞（Ｈｓ６８、ＡＴＣＣ）を用いて細胞成長分析法を行った。細胞をＧＦ結合基板が事前にコーティングされたプレート上に１，５００細胞／ウェルで接種し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で４８時間インキュベーションした。その後、ＣＣＫ－８分析法を行って細胞成長を決定した。Ｈｓ６８細胞に対してマイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染をチェックした後、５から１０の継代培養に用いた。ＧＦ結合ペプチドモチーフ及びヘパリンがないタンパク質基板をそれぞれ陰性及び陽性対照群として用いた。
総９６－ウェルのプレート（非組織培養処理される、ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を酢酸ナトリウムバッファーで室温で１時間、ＧＦ結合ペプチドモチーフを有するタンパク質基板を用いて５０μｇ／ｍｌでコーティングした。０．５％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中の２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及びＰＤＧＦ－ＢＢ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を個別ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１時間インキュベーションした。０．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充されたＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でヒト包皮線維芽細胞（Ｈｓ６８、ＡＴＣＣ）を用いて細胞成長分析法を行った。細胞をＧＦ結合基板が事前にコーティングされたプレート上に１，５００細胞／ウェルで接種し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で４８時間インキュベーションした。その後、ＣＣＫ－８分析法を行って細胞成長を決定した。Ｈｓ６８細胞に対してマイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染をチェックした後、５から１０の継代培養に用いた。ＧＦ結合ペプチドモチーフ及びヘパリンがないタンパク質基板をそれぞれ陰性及び陽性対照群として用いた。
【0070】
図８ａ及び図８ｂに示したように、ＧＦ結合タンパク質基板は、細胞の成長及び増殖を裏付けた。タンパク質基板に結合されたＧＦは、ヘパリン結合ＧＦと比較するとき低い血清条件（０．５％ＦＢＳ）でヒト包皮線維芽細胞の成長及び増殖を強く裏付けた。
【0071】
前記技術から、本開示された主題に対して多様な用法及び条件に採用されるための変更及び変形が行われ得ることが自明であろう。このような具現例はまた、次の特許請求の範囲内に属する。
【0072】
本明細書に開示された変数の任意の定義において要素の目録を引用することは、任意の単一要素又は列挙された要素の組み合わせ（又は下位組み合わせ）のような当該変数の定義を含む。本明細書において具現例を引用することは、任意の単一具現例又は任意の他の具現例又はその一部との組み合わせとしての当該具現例を含む。
【0073】
本明細書に引用された全ての特許及び公開文献は、それぞれの独立的な特許又は公開文献が具体的に及び個別的に引用により統合されることを示唆するのと同じ程度に引用によって本明細書に統合される。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【配列表】
【国際調査報告】