特表 2024-500848 無細胞製造システムにおけるグリセロールからのゲラニルピロリン酸の無細胞生成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-10

(54)【発明の名称】無細胞製造システムにおけるグリセロールからのゲラニルピロリン酸の無細胞生成

(51)【国際特許分類】

   C12P 9/00 20060101AFI20231227BHJP

   C12N 11/02 20060101ALI20231227BHJP

【ＦＩ】

C12P9/00 ZNA

C12N11/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537593

(86)(22)【出願日】2021-12-17

(85)【翻訳文提出日】2023-08-14

(86)【国際出願番号】 US2021064034

(87)【国際公開番号】W WO2022133213

(87)【国際公開日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】63/127,836

(32)【優先日】2020-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/127,758

(32)【優先日】2020-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523228060

【氏名又は名称】デビュー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ブリトン， ジョシュア

(72)【発明者】

【氏名】ブリドー， ニコラス

【テーマコード（参考）】

4B033

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B033NA23

4B033NA25

4B033NA35

4B033ND02

4B033NG09

4B033NH09

4B064AE63

4B064CA21

4B064CA31

4B064CD10

(57)【要約】

ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）は、数千もの天然産物のバイオプロダクションにおける重要な中間体分子である。現在、天然産物は、植物から培養されるか、複雑な化学合成戦略によって合成されるか、または細胞ベースの工場（バイオファウンドリとしても知られる）を通じて合成されるかのいずれかである。しかし、無細胞環境においてそのプロセスを複製するためには、多数の酵素および補因子が利用されなければならず、このことが、このアプローチを高価で実行不能にする。このプロセスを実行可能にするために、より少ない酵素および補因子しか使用しない新規なアプローチが、必要であった。本明細書におぃて記載されるとおり、本発明は、細胞の外側での短く簡潔な生合成経路を通じてグリセロールからＧＰＰを生成することが可能であることを、示す。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

グリセロールをゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）および追加の二次代謝産物へと変換する方法であって、
ａ）グリセロールを反応混合物に添加する工程；
ｂ）複数の酵素を工程（ａ）からの反応混合物に添加する工程であって、該酵素は、アルジトールオキシダーゼ（Ａｌｄｏ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙＯｘ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＰｈａＡ）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼＡ１１０Ｇ（ＨＭＧＳ）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸キナーゼ（ＭＤＣ）、イソペンチル－ＰＰイソメラーゼ（ＩＤＩ）、およびファルネシル－ＰＰシンターゼＳ８２Ｆ（ＦＰＰＳ）からなる群より選択される、工程；
ｃ）工程（ｂ）からの反応混合物から上清を除去する工程；ならびに
ｄ）ＧＰＰを単離する工程；
を含む、方法。

【請求項2】

少なくとも２種の酵素が前記反応混合物に添加される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

少なくとも５種の酵素が前記反応混合物に添加される、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

少なくとも１０種の酵素が前記反応混合物に添加される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ＮｐｈＢ酵素を工程（ｂ）に添加してＧＰＰを（カンナビゲロール酸）ＣＢＧＡへと変換する工程
をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

ＧＰＰからＣＢＧＡへの変換を使用して、前記方法から生成されるＧＰＰの量を決定する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記反応混合物が補因子を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記補因子が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ^＋）、またはそれらの組合せである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記補因子がリサイクルされる、請求項７または請求項８に記載の方法。

【請求項10】

グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、およびポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）を前記反応混合物に添加して前記補因子がリサイクルされる、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記酵素のうちの１種または複数種が固定されている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記複数の酵素が固定されている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記酵素のうちの１種または複数種が固定されていない、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記複数の酵素が固定されていない、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

グリセロールをゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）および追加の二次代謝産物へと変換する方法であって、
ａ）グリセロールおよびアルジトールオキシダーゼ（Ａｌｄｏ）を反応混合物に添加する工程；
ｂ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）を工程（ａ）からの反応混合物に添加する工程；
ｃ）工程（ｂ）からの反応混合物の上清を除去する工程；
ｄ）ピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙＯｘ）を工程（ｃ）からの反応混合物の上清に添加する工程；
ｅ）工程（ｄ）からの反応混合物の上清を除去する工程；
ｆ）リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＰｈａＡ）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼＡ１１０Ｇ（ＨＭＧＳ）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸キナーゼ（ＭＤＣ）、イソペンチル－ＰＰイソメラーゼ（ＩＤＩ）、およびファルネシル－ＰＰシンターゼＳ８２Ｆ（ＦＰＰＳ）からなる群より選択される少なくとも２種の酵素を、工程（ｅ）からの反応混合物の上清に添加する工程；
ｇ）工程（ｆ）からの反応混合物から上清を除去する工程；ならびに
ｈ）ＧＰＰを単離する工程；
を含む、方法。

【請求項16】

ＮｐｈＢ酵素を工程（ｆ）に添加してＧＰＰを（カンナビゲロール酸）ＣＢＧＡへと変換する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

ＧＰＰからＣＢＧＡへの変換を使用して、前記方法から生成されるＧＰＰの量を決定する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記反応混合物が補因子を含む、請求項１５～請求項１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記補因子が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ^＋）、またはそれらの組合せである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記補因子がリサイクルされる、請求項１７または請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、およびポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）を前記反応混合物に添加して前記補因子がリサイクルされる、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記酵素のうちの１種または複数種が固定されている、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記酵素すべてが固定されている、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記酵素のうちの１種または複数種が固定されていない、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記酵素すべてが固定されていない、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年１２月１８日に出願された米国仮出願番号６３／１２７，８３６および２０２０年１２月１８日に出願された米国仮出願番号６３／１２７，７５８の利益を主張し、これらの明細書は、本明細書において参照によりその全体が援用される。

【0002】

（配列表に対する言及）
本出願人は、規則１３の３．１（ａ）の下で提出した「ＤＥＢＵＴ＿２０＿０３＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という題のＡｎｎｅｘ Ｃ／ＳＴ．２５テキストファイルの形式で記録された情報が、出願した国際出願の部分を形成する情報と同一であることを断言する。この配列表の内容は、本明細書において参照によりその全体が援用される。

【0003】

（発明の分野）
本発明は、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）をグリセロールから生成する方法を特徴とし、特に、本発明は、無細胞生成方法を特徴とする。

【背景技術】

【0004】

（発明の背景）
ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）は、数千もの天然産物のバイオプロダクションにおける重要な中間体分子である。ここで、天然産物とは、植物、動物、および細菌などの生物において多段階酵素経路を通じて形成される分子である。現在、天然産物は、植物から培養されるか、複雑な化学合成戦略によって合成されるか、または細胞ベースの工場（バイオファウンドリとしても知られる）を通じて合成されるかのいずれかである。

【0005】

以前に、Ｖａｌｌｉｅｒｅら（２０１９）が、グルコースを出発物質として使用して、無細胞環境においてＧＰＰを製造した。天然酵素系のこの完全なレプリカは、２２種の酵素を使用し、４０補因子当量（１２個のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１２個のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、４個のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ^＋）、２個のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、６個のアセチルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）、および４個のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を含む）を必要とする。この文献に記載されたプロセスによって必要とされる補因子の数は、このアプローチが常に高価で実行不能であることを意味する（図１Ｂ）。このプロセスを実行可能にするために、より少ない酵素および補因子しか使用せず信頼性を改善する、新規なアプローチが必要である。本明細書において記載されるとおり、本発明は、細胞の外側での短く簡潔な生合成経路（無細胞生合成として知られる）を通じてＧＰＰを生成することが可能であることを実証する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

（発明の簡単な概要）
独立請求項において明示されるとおり、無細胞生合成プラットフォームによって、グリセロールから出発してゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）および追加の二次代謝産物を生成する生産を可能にする、無細胞方法を提供することが、本発明の一目的である。本発明の実施形態は、従属請求項において提供される。本発明の実施形態は、それらが相互排他的ではない場合には、互いに自由に組み合わされ得る。

【0007】

培養によるか、化学合成によるか、または細胞における天然産物の製造は、高価値化学生産の商業的実行性を制限する多くの問題に悩まされる。第一に、培養は、しばしば経済的に実行不能であり、大量の土地／エネルギー／水を必要とし、植物が、高価値物質を少量でしか生成できない。次に、化学合成は、しばしば複雑過ぎて実験室では生成できない天然産物を生成するために、広大で、精巧で、高価で、毒性があり、非効率的な多段階化学反応を必要とする。最後に、バイオファウンドリ（細胞全体の使用）は、産物の毒性、炭素フラックスの向け直し（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）、細胞壁を通る拡散の問題、および毒性副産物の産生に悩まされる。これらの上記の問題を回避するために、無細胞製造が、実行可能な選択肢として現れる。

【0008】

無細胞系において、細胞の重要成分、すなわち、補因子および酵素が、細胞を伴わない化学反応において使用される。植物、動物、および細菌において見出される同じ酵素が、インビボで（代表的には、細菌などの宿主におけるタンパク質過剰発現を通じて）生成され、クロマトグラフィーによって単離され、その後、基質（出発物質）を含むバイオリアクター中に添加される。その酵素は、植物、動物、および細菌において生じるのと同じ様式でその基質を変換するが、生物の複雑性は伴わない。この様式では、天然産物は、植物も、細胞も、または化学合成も用いずに生成され始め得る。

【0009】

本発明は、グリセロールをＧＰＰへと変換するための、より短く値段が手頃でより簡単なプロセスを可能にするために、（グルコースをピルビン酸にする）解糖系を除去する酵素経路（図１Ａ）を作製する。本願プロセスは、１２個の酵素工程を使用し、２４補因子当量および１０種の酵素を排除する（図１Ｂ）。さらに、酵素固定を使用して、酵素の沈殿、不活化、および非固定系の信頼性の無さを回避することによって、ＧＰＰへの変換を改善した。本発明はまた、酵素固定を用いない場合に、酵素の沈殿およびその酵素経路の破壊が観察されることを示す、証拠を提供する。最後に、このプロセスは、グルコースではなく、グリセロールから出発する。グリセロールは、ＧＰＰの生産において使用されていない豊富な天然物質である。本発明は、この天然の産業廃棄物が、グルコースの実行可能な代替品として利用されることを可能にする。

【0010】

一部の実施形態において、これは、グリセロールをゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）および追加の二次代謝産物へと変換する方法を特徴とする。一部の実施形態において、その方法は、グリセロールを反応混合物に添加する工程を含む。一部の実施形態において、その方法は、複数の酵素を上記反応混合物に添加する工程を含む。一部の実施形態において、それらの酵素は、アルジトールオキシダーゼ（Ａｌｄｏ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙＯｘ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＰｈａＡ）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼＡ１１０Ｇ（ＨＭＧＳ）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸キナーゼ（ＭＤＣ）、イソペンチル－ＰＰイソメラーゼ（ＩＤＩ）、およびファルネシル－ＰＰシンターゼＳ８２Ｆ（ＦＰＰＳ）からなる群より選択される。一部の実施形態において、その方法は、上清を上記反応混合物から除去する工程を含む。一部の実施形態において、その方法は、ＧＰＰを単離または生成する工程を含む。一部の実施形態において、その酵素は、その反応混合物に非同期的に添加され得る。他の実施形態において、その酵素は、その反応混合物に同時に添加され得る。

【0011】

他の実施形態において、本発明は、グリセロールをゲラニルリン酸（ＧＰＰ）および追加の二次代謝産物へと変換する方法を特徴とする。一部の実施形態において、その方法は、グリセロールおよびアルジトールオキシダーゼ（Ａｌｄｏ）を反応混合物に添加する工程を含む。一部の実施形態において、その方法は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）をその反応混合物に添加する工程をさらに含む。一部の実施形態において、その方法は、上記反応混合物の上清を除去する工程、およびピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙＯｘ）をその反応混合物の上清に添加する工程を含む。一部の実施形態において、その方法は、上記反応混合物の上清を除去する工程、ならびにその反応混合物の上清へ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＰｈａＡ）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼＡ１１０Ｇ（ＨＭＧＳ）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸キナーゼ（ＭＤＣ）、イソペンチル－ＰＰイソメラーゼ（ＩＤＩ）、およびファルネシル－ＰＰシンターゼＳ８２Ｆ（ＦＰＰＳ）からなる群より選択される少なくとも２種の酵素を添加する工程を含む。一部の実施形態において、その方法は、上記反応混合物から上清を除去する工程、およびＧＰＰを生成する工程を含む。一部の実施形態において、その酵素は、その反応混合物に非同期的に添加され得る。他の実施形態において、その酵素は、その反応混合物に同時に添加され得る。

【0012】

本発明の独特で進歩的な技術特徴の１つは、グリセロールから出発するゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）および追加の二次代謝産物の生成のための無細胞系の使用である。本発明をいかなる理論にも機構にも限定することは望まないが、本発明の技術的特徴は、有利なことに、より高い反応濃度、生成物および基質の拡散のために戦うべき細胞壁がないこと、炭素フラックスおよび副産物形成について細胞中での競合がないこと、毒性化合物の形成が原因である細胞死がないこと（細胞が存在しない）、および多数の化合物を生成するためのプラットフォーム溶液として、毎回再プログラム化されなければならない細胞と比較して増加した柔軟性を提供すると、考えられる。このアプローチにおいて、経路中の酵素を単に変えるだけで、新規化学実体を生成し得る。

【0013】

さらに、先行文献は、本発明から遠ざかることを教示している。例えば、Ｖａｌｌｉｅｒｅら（２０１９）は、グルコースからのカンナビジオール（ＣＢＤ）の生成における中間体としてＧＰＰを生成するために、より複雑な無細胞系を使用した。本発明の経路は、高価な補因子のうちの６０％、１０種の酵素、および精巧なパージバルブを排除し、代替的出発物質を使用する。本発明は、Ｖａｌｌｉｅｒｅらのアプローチとは１０種の酵素を共有するが、本発明は、１０種の酵素すべてを固定し最適化することによって、酵素の活性、寿命および信頼性を顕著に改善した。注目すべきことに、Ｖａｌｌｉｅｒｅらは、反応混合物中でのすべての酵素のインキュベーション後に酵素の沈殿を示すデータを含む。これらの酵素の沈殿はまた、反応混合物中で合わせたほんの１６時間程度後に作業を反復する場合にも観察され、上記研究を厳しく制限した。重要な成功は、１２種の酵素の各々を固定して、沈殿を排除することによって、それらの酵素が反応混合物中で長期間活性のままでいることを可能にしたことであった。

【0014】

さらに、本発明の進歩的な技術的特徴は、驚くべき結果に寄与した。本発明の経路中の第１モジュールは、Ｇａｏら（２０１５）において報告されたとおりアルジトールオキシダーゼ（ＡＬＤＯ）の活性とジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）の活性を組み合わせることによって、グリセロールをピルビン酸へと変換する。驚くべきことに、本発明は、ピルビン酸をグリセロールから首尾良く生成するためには、この公開された研究に対していくつかの改変を行わなければならなかった。第一に、マルトース結合タンパク質をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのＡＬＤＯのＮ末端に添加して、その酵素（配列番号１）の活性を維持しながら溶解度および安定性を補助した。第二に、ＭＢＰ－ＡＬＤＯは、最適な活性のためには酸素化を必要としたことが、見出された。第三に、Ｇａｏら（２０１５）において報告されたＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのＤＨＡＤは、機能しなかった。多くのＤＨＡＤオルソログをスクリーニングし、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｖｕｌｃａｎｕｓのＤＨＡＤ（配列番号２）が最も活性であることが、見出された。第四に、ＤＨＡＤは、最適な活性のためには脱酸素化および非常に特異的なｐＨ範囲を必要としたことが、見出された。

【0015】

本明細書において記載されるあらゆる特徴または特徴の組合せは、文脈、本明細書および当業者の知識から明らかであるとおり、任意のそのような組合せに含まれる特徴が相互に矛盾しない限りは、本発明の範囲内に含まれる。本発明のさらなる利点および局面が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲において明らかである。

【0016】

（図面のいくつかの図の簡単な説明）
本発明の特徴および利点は、提示される以下の詳細な説明を添付の図面と組み合わせて考慮することから明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１Ａおよび図１Ｂは、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）の生成のために使用される経路（左、図１Ａ）を、グルコースからＧＰＰへの以前の試み（右、図１Ｂ）と対比して示す。示されるとおり、左（図１Ａ）の経路は、７０％少ない補因子および１０個少ない酵素を有する。

【0018】

【図2】図２Ａおよび図２Ｂは、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）のＨＰＬＣトレースを、ＣＢＧＡ標準物質（上、図２Ａ）および固定した酵素バッチ反応（下、図２Ｂ）の両方について示す。２２８ｎｍにて３．６８分の保持時間が、両方の反応について認められる。

【発明を実施するための形態】

【0019】

（発明の詳細な説明）
本化合物、組成物および方法が開示され記載される前に、具体的な合成方法または具体的な組成物は当然変化し得るので、本発明はそれらに限定されないことが、理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載することだけを目的とし、限定することは意図されないこともまた、理解されるべきである。

【0020】

さらに、本開示の実施形態が詳細に記載されてきたが、本明細書において記載される特徴および利点すべてを提供するわけではない実施形態を含む特定の変化形および改変が、当業者にとって明らかになる。本開示は、具体的に開示された実施形態を越えて、他の代替的もしくは追加の実施形態および／または使用ならびにそれらの自明な改変および等価物にまで及ぶことが、当業者によって理解される。さらに、多くの変化形が種々の詳細さで示され記載されてきたが、本開示の範囲内にある他の改変が、本開示に基づいて当業者にとって容易に明らかになる。それらの実施形態の具体的な特徴および局面の種々の組合せまたは部分的組合せが行われ得、依然として本開示の範囲内にあることもまた、企図される。したがって、開示される実施形態の種々の特徴および局面は、本開示の種々の形態を形成するために互いに組み合わされてもよく、または互いに置換されてもよいことが、理解されるべきである。したがって、本明細書において開示される開示の範囲は、本明細書において記載される特定の開示された実施形態によって限定されるべきではないことが、意図される。

【0021】

本明細書において使用される場合、文脈によって明確に違うと示されない限りは、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形もまた含むことが意図される。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（有する）（ｗｉｔｈ）」またはそれらの変化形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される限り、そのような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様の様式で包括的であることが意図される。

【0022】

本明細書において使用される場合、「反応溶液」とは、酵素ベースの化学変換に必要なすべての成分を指し得る。これは、代表的には、緩衝化剤、塩、補因子、および基質（すなわち、出発物質）であるが、それらに限定はされない。

【0023】

本明細書において使用される場合、「反応混合物」とは、「反応溶液」からのすべての成分と、それに加えて酵素および／または反応生成物を指し得る。一部の実施形態において、「反応混合物」とは、いかなる酵素も反応生成物も含まない、反応溶液のみを指し得る。

【0024】

一部の実施形態において、「反応溶液」と「反応混合物」とは、交換可能に使用され得る。

【0025】

本明細書において使用される場合、「緩衝化剤」とは、酸－塩基共役成分の作用によってｐＨ変化に抵抗する水ベースの溶液に添加された化学物質を指し得る。

【0026】

本明細書において使用される場合、「上清」とは、サンプルの可溶性液体画分を指し得る。

【0027】

本明細書において使用される場合、「バッチ反応」とは、閉鎖系（発酵槽または典型的反応フラスコなど）において実施される化学反応または生化学反応を指し得る。

【0028】

本明細書において使用される場合、「補因子」とは、タンパク質に結合し、生物学的な化学反応を支援し得る、非タンパク質化合物を指し得る。補因子は、金属イオン、有機化合物、または他の化学物質であり得る。補因子の非限定的例としては、ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨが挙げられ得るが、それらに限定はされない。

【0029】

本明細書において使用される場合、「補因子リサイクリング」とは、酵素触媒反応に関与可能な機能的補因子の再生を指し得る。この再生の非限定的例は、一次酵素反応によって生成される変化した補因子に作用する別個の反応（ＡＤＰをＡＴＰに戻す酵素変換など）である。

【0030】

ここで図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、および図２Ｂを参照すると、本発明は、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）および追加の二次代謝産物をグリセロールから生成する方法を特徴とする。

【0031】

これは、グリセロールをゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）および追加の二次代謝産物へと変換する方法を特徴とする。一部の実施形態において、その方法は、グリセロールを反応混合物に添加する工程を含む。一部の実施形態において、その方法は、複数の酵素を上記反応混合物に添加する工程を含む。一部の実施形態において、それらの酵素は、アルジトールオキシダーゼ（Ａｌｄｏ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙＯｘ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＰｈａＡ）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼＡ１１０Ｇ（ＨＭＧＳ）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸キナーゼ（ＭＤＣ）、イソペンチル－ＰＰイソメラーゼ（ＩＤＩ）、およびファルネシル－ＰＰシンターゼＳ８２Ｆ（ＦＰＰＳ）からなる群より選択される。一部の実施形態において、その方法は、上清を上記反応混合物から除去する工程を含む。一部の実施形態において、その方法は、ＧＰＰを単離または生成する工程を含む。

【0032】

本発明はまた、グリセロールをゲラニルリン酸（ＧＰＰ）および追加の二次代謝産物へと変換する方法も特徴とする。一部の実施形態において、その方法は、グリセロールおよびアルジトールオキシダーゼ（Ａｌｄｏ）を反応混合物に添加する工程を含む。一部の実施形態において、その方法は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）をその反応混合物に添加する工程をさらに含む。一部の実施形態において、その方法は、上記反応混合物の上清を除去する工程、およびピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙＯｘ）をその反応混合物の上清に添加する工程を含む。一部の実施形態において、その方法は、上記反応混合物の上清を除去する工程、ならびにその反応混合物の上清へ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＰｈａＡ）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼＡ１１０Ｇ（ＨＭＧＳ）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸キナーゼ（ＭＤＣ）、イソペンチル－ＰＰイソメラーゼ（ＩＤＩ）、およびファルネシル－ＰＰシンターゼＳ８２Ｆ（ＦＰＰＳ）からなる群より選択される少なくとも２種の酵素を添加する工程を含む。一部の実施形態において、その方法は、上記反応混合物から上清を除去する工程、およびＧＰＰを生成または単離する工程を含む。

【0033】

一部の実施形態において、少なくとも１種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも２種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも３種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも４種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも５種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも６種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも７種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも８種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも９種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも１０種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも１１種の酵素が、その反応混合物に添加される。一部の実施形態において、少なくとも１２種の酵素が、その反応混合物に添加される。

【0034】

一部の実施形態において、その酵素は、その反応混合物に非同期的に添加され得る。他の実施形態において、その酵素は、その反応混合物に同時に添加され得る。

【0035】

一部の実施形態において、その方法は、その反応混合物からの上清の最終的除去の前にＮｐｈＢ酵素を添加してＧＰＰをカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）に変換する工程をさらに含む。一部の実施形態において、ＣＢＧＡが使用されて、上記方法において生成されるＧＰＰの量が決定される。一部の実施形態において、ＣＢＧＡの生成が、分析ツールとして使用される。一部の実施形態において、ＮｐｈＢによるＧＰＰからのＣＢＧＡの生成が、検出方法として使用される。一部の実施形態において、ＮｐｈＢによるＣＢＧＡの生成が使用されて、ＧＰＰの量が検出される。一部の実施形態において、ＣＢＧＡがＮｐｈＢ酵素によるＧＰＰの変換から生成される量は、１：１である。

【0036】

一部の実施形態において、本明細書において記載される反応混合物は、補因子を含む。一部の実施形態において、その補因子は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ^＋）、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態において、本明細書において記載される方法は、補因子リサイクリングを利用した。一部の実施形態において、その補因子は、リサイクルされる。一部の実施形態において、その方法は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、およびポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）をその反応混合物に添加する工程をさらに含む。一部の実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、およびポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）がその反応混合物に添加されて、補因子がリサイクルされる。

【0037】

一部の実施形態において、反応の温度は、約２２℃～約５０℃の範囲であり得る。一部の実施形態において、反応の温度は、約２０℃である。一部の実施形態において、反応の温度は、約２５℃である。一部の実施形態において、反応の温度は、約３０℃である。一部の実施形態において、反応の温度は、約３５℃である。一部の実施形態において、反応の温度は、約４０℃である。一部の実施形態において、反応の温度は、約４５℃である。一部の実施形態において、反応の温度は、約５０℃である。一部の実施形態において、反応の温度は、約５５℃である。

【0038】

一部の実施形態において、反応のｐＨは、約６．５～約９．０の範囲であり得る．一部の実施形態において、反応のｐＨは、約５．０である。一部の実施形態において、反応のｐＨは、約５．５である。一部の実施形態において、反応のｐＨは、約６．０である。一部の実施形態において、反応のｐＨは、約６．５である。一部の実施形態において、反応のｐＨは、約７．０である。一部の実施形態において、反応のｐＨは、約８．５である。一部の実施形態において、反応のｐＨは、約９．０である。一部の実施形態において、反応のｐＨは、約９．５である。一部の実施形態において、反応のｐＨは、約１０．０である。

【0039】

一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約２時間～約３２時間の範囲であり得る。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約０．５時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約１時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約２時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約５時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約１０時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約１５時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約２０時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約２５時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約３０時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約３５時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約４０時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、約４５時間である。一部の実施形態において、反応を実行する時間は、４５時間よりも長い。

【0040】

一部の実施形態において、酵素は、固定されている。一部の実施形態において、固定された酵素が、固体支持体に固定されている。固体支持体の非限定的な例としては、エポキシメタクリレート、アミノＣ_６メタクリレート、または微孔質ポリメタクリレートが挙げられ得るが、それらに限定はされない。さらなる実施形態において、種々の界面化学が、その固定した酵素を固体表面に連結するために使用され得、それには、共有結合、吸着、イオン性、親和性、カプセル封入、または捕捉が挙げられるが、それらに限定はされない。他の実施形態において、酵素は、固定されていない．

【0041】

一部の実施形態において、それらの酵素のうちの１種または複数種が、固定されている。他の実施形態において、それらの酵素すべてが、固定されている。一部の実施形態において、それらの酵素のうちの１種または複数種が、固定されていない。他の実施形態において、それらの酵素すべてが、固定されていない。一部の実施形態において、複数の酵素が、固定されている。他の実施形態において、複数の酵素が、固定されていない。

【0042】

一部の実施形態において、種々の反応条件が、機能的酵素を確実にするために変更され得、それには、反応時間、酸素化／脱酸素化、ｐＨ、緩衝化剤、および反応温度が挙げられるが、それらに限定はされない。

【0043】

一部の実施形態において、本明細書において記載される方法は、以前に記載された方法から遠ざかることを教示する。その理由は、本願方法は、ＧＰＰを生成するために、より少ない酵素および補因子しか利用しなかったからである。特定の実施形態において、本明細書において記載される方法は、Ｖａｌｌｉｅｒｅらによって使用された２４補因子当量（または６０％の補因子）を使用しない。特定の実施形態において、Ｖａｌｌｉｅｒｅらによって教示された酵素のうちの１０種しか、本願方法において使用されない。

【実施例】

【0044】

（実施例）

【0045】

以下は、本発明の非限定的な実施例である。この実施例は本発明をいかなる様式でも限定することは意図されないことが、理解されるべきである。等価物または置換物は、本発明の範囲にある。

【0046】

（酵素の発現および精製）：すべての遺伝子を合成し、発現プラスミド中にクローン化し、その後、発現のためにＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。細胞を、５０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシンを補充したＴＢ培地において３７℃および２００ｒｐｍにてＡ_６００＝０．６まで増殖させた。細胞を１８℃に冷却し、発現を誘導し、さらに１８時間増殖させた。細胞ペレットを遠心分離によって収集し、凍結させ、その後、細胞ペースト１ｇ当たり５ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に再懸濁した。細胞溶解物を超音波処理によって調製し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。清澄になった溶解物を、ＩＭＡＣ－ニッケル樹脂を含むＧＥ ＸＫシリーズのカラムにロードした。タンパク質を、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）から７０％緩衝液Ｂ（２Ｍイミダゾール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）への１５ＣＶ勾配を使用して溶出させた。目的のタンパク質を含む画分をプールし、ＧＥ ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラムを用いて緩衝液Ａ（上記）中に移行させ、ただしＭＢＰ－Ａｌｄｏは例外とし、これを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００中に保存した。

【0047】

（１．０ 固定していない無細胞経路によるＧＰＰの生成）：本明細書におぃて記載されるとおり、この経路は、まず、アルジトールオキシダーゼ（Ａｌｄｏ、ＥＣ １．１．３．４１）を使用してグリセロールをグリセリン酸へと変換し、その後、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ、ＥＣ ４．２．１．９、図１Ａ）を使用してピルビン酸へと変換した。最初の２種の酵素を記載したが、いくつかの顕著な進歩が、この経路を機能させるためには必要であった。その理由は、以前に報告された研究は再現できなかったからである。

【0048】

機能的酵素を確実にするために、時限式反応酸素化、脱酸素化、ｐＨ変化、特定の緩衝液、および反応温度などの特定の反応条件を、見出す必要があった。第一に、報告されたＡｌｄｏは、不安定で不活性である。これを克服するために、溶液中での溶解度および安定性を改善するために融合マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを含む、改変型Ａｌｄｏ（配列番号１）を作製した。このＭＢＰ融合型Ａｌｄｏは、グリセロールをグリセリン酸へと変換した（１００％、１．７５ｇ／Ｌ）。第二に、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのＤＨＡＤを用いた公開された反応もまた、再現可能ではなかった。これを克服するために、多くのＤＨＡＤ酵素オルソログをスクリーニングし、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｖｕｌｃａｎｕｓ由来のＤＨＡＤが１００％のグリセリン酸をピルビン酸（１．３２ｇ／Ｌ）へ変換したことを。見出した。

【0049】

これらの新規な酵素を用いて、Ａｌｄｏ（１１μＭ）およびＤＨＡＤ（１６μＭ）の両方を含むワンポット反応が、グリセロールをピルビン酸へと変換した（１００％変換、収量１．２３ｇ／Ｌ）。グルコースから出発する以前の研究と比較して、本改良システムは、１４ｍＭのピルビン酸を２４時間で提供し、補因子を使用することがなく、９種少ない酵素は、顕著な改善を提供した。グルコースからの以前の試みは、多くのさらなる酵素、補因子、および反応製造複雑化（タンパク質沈殿など）を必要とすることもまた、留意されるべきである。これらの制約を除去することは、安価な炭素源からＧＰＰへの商業的に実行可能なアプローチを可能にする。

【0050】

ＡｌｄｏおよびＤＨＡＤの最適化の後、ピルビン酸をゲラニルピロリン酸に変換する、経路中の残りの酵素を、生成し最適化しなければならなかった（ＧＰＰ、図１Ａおよび図１Ｂ）。個々の酵素の最適化の後、ＧＰＰを得た（１２０時間で４３ｍｇ／Ｌ）。この結果は、ＧＰＰ製造のためにはるかに少ない補因子しか用いない、このより短い改良型経路を検証したが、数日後にタンパク質沈殿が観察され、このことは、このアプローチが商業生産には適しないだろうことを意味した。この制限を克服するために、この経路中の各酵素を固体支持体に固定して、タンパク質が活性で使用可能なままであることを確実にした。これは、個々の酵素－固体支持体複合体を作製するために広範な最適化および理解を必要とした。

【0051】

（２．０ タンパク質の固定および最適化）：安定性、寿命、および触媒作用を増加させるために、その経路中の精製酵素各々を、固体支持体に固定した。種々の市販の支持体物質を、生成物および基質の保持、酵素の保持、および固定した酵素の活性について、通常通りにスクリーニングした。その支持体コレクションは、以下の型の連結のための種々の界面化学を含んだ：共有結合、吸着、イオン性、親和性、カプセル封入、および捕捉。代表的には、５０ｍｇの樹脂を４．０ｍｇの酵素と脱塩緩衝液中で１６時間～２４時間、室温にて混合した。ＢＣＡアッセイまたはＢｒａｄｆｏｒｄアッセイのいずれかによって固定前および固定後の溶液中のタンパク質濃度を測定することによって、固定した酵素の量を定量した。固定した酵素すべてを、樹脂の型、基質濃度（５ｍＭ～２５０ｍＭ）、ｐＨ（５．０～９．０）、温度（２０℃～５０℃）、緩衝化剤（Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＰＯ_４）、および時間（１時間～３６時間）について最適値についてスクリーニングした。各酵素について最適な反応条件および結果は、以下のとおりである（表１Ａ）。

【0052】

【表1A】

【0053】

上記の表中の収率パーセントは、例示目的のために提示される。一部の実施形態において、ＧＰＰバイオ製造プロセスの各工程は、９９％まで、９９．５％まで、９９．９％まで、または１００％までの収率パーセントを有し得る。一部の実施形態において、ＧＰＰバイオ製造プロセスの各工程における収率パーセントは、以下の表（表１Ｂ）中の範囲内にある値を有し得る。

【0054】

【表1B】

【0055】

（２．１ アルジトールオキシダーゼ（Ａｌｄｏ）の最適化）：ＭＢＰ－Ａｌｄｏを、活性化アミノＣ_６メタクリレート樹脂に固定した。その固定した酵素を使用して、グリセロールをグリセリン酸へと変換した。その反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭグリセロール）を、５０μＭの固定した酵素と３７℃にて２１時間混合した。固定したＭＢＰ－Ａｌｄｏは、１００％の２０ｍＭグリセロールを変換して２０ｍＭ（１．７５ｇ／Ｌ）のグリセリン酸を生じた。サンプリングのために、その反応混合物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。このＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、マイクロガードカチオンＨリフィルカートリッジを備えた３０ｃｍ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラムを取り付けた。このカラムを５５℃に加熱し、サンプルブロックを２５℃にて維持した。各サンプルについて、１μＬを注入し、１００％硫酸（１０ｍＭ）で構成される移動相を使用した。サンプル時間は合計４５分であり、グリセリン酸が１７．２分で溶出し、グリセロールが２１．０分で溶出した。２時間の平衡期間により安定なベースラインを生じた後に、Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＲＩＤ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した。

【0056】

（２．２ ジヒドロキシデヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）の最適化）：ＤＨＡＤを活性化アミノＣ_６メタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してグリセリン酸をピルビン酸へと変換した。その反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭグリセリン酸）を５０μＭの固定した酵素と４５℃にて１６時間混合した。固定したＤＨＡＤは、収量１５ｍＭ（１．３２ｇ／Ｌ、７５％）のピルビン酸のために９９％の２０ｍＭグリセリン酸を変換可能であった。サンプリングのために、その反応混合物をＨＰＬＣシステムにて検査して、グリセロールおよびグリセリン酸の量を調べた。このＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、マイクロガードカチオンＨリフィルカートリッジを備えた３０ｃｍ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラムを取り付けた。このカラムを５５℃に加熱し、サンプルブロックを２５℃にて維持した。各サンプルについて、１μＬを注入し、１００％硫酸（１０ｍＭ）で構成されるアイソクラティック勾配を移動相として使用した。サンプル時間は合計４５分であり、ピルビン酸が１６．０分で溶出し、グリセリン酸が１７．２分で溶出した。２時間の平衡期間により安定なベースラインを生じた後に、Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した。

【0057】

（２．３ ピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙＯｘ）の最適化）：ＰｙＯｘを活性化アミノＣ_６メタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用して、ピルビン酸をアセチルリン酸へと変換した。その反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、５０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ６．５、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭピルビン酸、２０ｍＭチアミンピロリン酸）を３．８５μＭの固定した酵素と３７℃にて１６時間混合した。固定したＰｙＯｘは、収量４．５５ｍＭ（８３７ｍｇ／Ｌ）のアセチルリン酸のために９１％の５ｍＭピルビン酸を変換可能であった。サンプリングのために、その反応液をＨＰＬＣシステムにて検査して、ピルビン酸およびアセチルリン酸の量を調べた。このＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、マイクロガードカチオンＨリフィルカートリッジを備えた３０ｃｍ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラムを取り付けた。このカラムを５５℃に加熱し、サンプルブロックを２５℃にて維持した。このＨＰＬＣ方法は５μｌサンプル注入体積で構成され、１００％硫酸（１０ｍＭ）で構成されるアイソクラティック勾配を移動相として使用した。実行時間は合計２５分であり、アセチルリン酸が２３．６分で溶出し、ピルビン酸が１６．０分で溶出した。２時間の平衡期間により安定なベースラインを生じた後に、Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した。

【0058】

（２．４ リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ）の最適化）：ＰＴＡをエポキシメタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してアセチルリン酸をアセチルコエンザイムＡ（アセチルＣｏＡ）へと変換した。その反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、５０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ ８．０、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３．２ｍＭアセチルリン酸、３．２ｍＭ ＣｏＡ）をその固定した酵素と３２℃にて８時間混合した。固定したＰＴＡ（３８．４μＭ）は、収量１．９２ｍＭ（１．７ｇ／Ｌ）のアセチルＣｏＡのために６０％の３．２ｍＭアセチルリン酸を変換可能であった。サンプリングのために、その反応液をＨＰＬＣシステムにて検査して、アセチルリン酸およびアセチルＣｏＡの量を調べた。このＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、ＢｅｔａＳｉｌ Ｃ１８ ２０ｍｍ×２．１ｍｍガードカラムを備えたＨＹＰＥＲＳＩＬ ＯＤＳ ＣＯＬＵＭＮ １５０ｍｍ×３ｍｍを取り付けた。このカラムを２５℃に加熱し、サンプルブロックを４℃にて維持した。ＨＰＬＣ方法は５μｌサンプル注入体積で構成され、アイソクラティック移動相が、７５ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＮａ（酢酸ナトリウム）および１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（リン酸二水素ナトリウム）をアセトニトリル（ＡＣＮ）と比率９４：６で混合して構成された。実行時間は合計１２分であり、アセチルＣｏＡが８．５分で溶出し、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）が３．９分で溶出した。ダイオードアレイ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、２５９ｎｍでの目的分子の検出のために使用した。

【0059】

（２．５ アセチルコエンザイムＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰｈａＡ）の最適化）：ＰｈａＡをエポキシメタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡへと変換した。その反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、５０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ８．０、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭアセチルＣｏＡ）をその固定した酵素と３２℃にて８時間混合した。固定したＰｈａＡ（２０μＭ）は、収量１．１ｍＭ（１．１ｇ／Ｌ）のアセトアセチルＣｏＡのために４４％の２．５ｍＭアセチルＣｏＡを変換可能であった。ＡｃＣｏＡおよびアセトアセチルＣｏＡの保持時間は一致している。したがって、ＰｈａＡ活性を、この反応において生成されたＣｏＡの量に基づいて測定した。その理由は、ＣｏＡとアセトアセチルＣｏＡとは等モル量で生成されるからである。サンプリングのために、その反応液をＨＰＬＣシステムにて検査して、ＡｃＣｏＡおよびＣｏＡの量を調べた。このＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、ＢｅｔａＳｉｌ Ｃ１８ ２０ｍｍ×２．１ｍｍガードカラムを備えたＨＹＰＥＲＳＩＬ ＯＤＳ ＣＯＬＵＭＮ １５０ｍｍ×３ｍｍを取り付けた。このカラムを２５℃に加熱し、サンプルブロックを４℃にて維持した。ＨＰＬＣ方法は５μｌサンプル注入体積で構成され、アイソクラティック移動相が、７５ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＮａおよび１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４をＡＣＮと比率９４：６で混合して構成された。実行時間は合計１２分であり、アセチルＣｏＡが８．５分で溶出し、コエンザイムＡが３．９分で溶出した。ダイオードアレイ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、２５９ｎｍでの目的分子の検出のために使用した。

【0060】

（２．６ ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）の最適化）：ＨＭＧＳをエポキシメタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してアセトアセチルＣｏＡをＨＭＧ－ＣｏＡへと変換した。その反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．５、５ｍＭアセトアセチルＣｏＡ）を０．５μＭの固定した酵素と３２℃にて２時間混合した。２時間後、その反応溶液を２０．７μＭのＨＭＧＲおよび５ｍＭのＮＡＤＰＨとともにインキュベートした。ＨＭＧＲを使用してＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋へと変換する。したがって、反応成績を３４０ｎｍにてモニターし得る。この共役反応は、５４％の出発物質をメバロン酸（２．７ｍＭまたは４１６ｍｇ／Ｌ）へと変換可能であった。ＨＭＧＲの活性を、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの損失を分光光度計を使用してモニターすることによって測定した。

【0061】

（２．７ ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）の最適化）：ＨＭＧＲをエポキシメタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋へと変換した。その反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７、０、５ｍＭ ＮＡＤＰＨ）を０．４μＭの固定した酵素と３２℃にて２時間混合した。固定したＨＭＧＲは、収量４．９ｍＭ ＮＡＤＰ＋のために９８％の５ｍＭ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を変換可能であった。この収量は、この反応において生成されるメバロン酸（４．９ｍＭまたは７５５ｍｇ／Ｌ）と等モルである。ＨＭＧＲの活性を、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの損失を分光光度計を使用してモニターすることによって測定した。

【0062】

（２．８ メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）の最適化）：ＭＶＫをマクロ孔質ポリメタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してメバロン酸をメバロン酸－５－リン酸へと変換した。反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ８、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭメバロン酸）を１３３μＭの固定した酵素と３７℃にて８時間混合した。固定したＭＶＫは、収量３．１６ｍＭ（１．６８ｇ／Ｌ）のＡＤＰのために７９％の４ｍＭ ＡＴＰを変換可能であった。サンプリングのために、その反応混合物をＨＰＬＣシステムにて検査して、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の量を調べた。そのＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、ＢｅｔａＳｉｌ Ｃ１８ ２０ｍｍ×２．１ｍｍガードカラムを備えたＨＹＰＥＲＳＩＬ ＯＤＳ ＣＯＬＵＭＮ １５０ｍｍ×３ｍｍを取り付けた。このカラムを２５℃に加熱し、サンプルブロックを４℃にて維持した。ＨＰＬＣ方法は、５μｌサンプル注入体積で構成され、アイソクラティック移動相が、１００ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４（リン酸二水素カリウム）、８ｍＭのＴＢＡＨＳ（硫酸水素テトラブチルアンモニウム）、ｐＨ６．０、２０％のメタノール（体積／体積）で構成された。実行時間は合計１０分であり、ＡＴＰが５．７分で溶出し、ＡＤＰが４．６分で溶出した。ダイオードアレイ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、２５４ｎｍでの目的分子の検出のために使用した。

【0063】

（２．９ ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）の最適化）：ＰＭＶＫをアミノＣ_６メタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してメバロン酸－５－リン酸をメバロン酸－５－ピロリン酸へと変換した。その反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ８、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭメバロン酸－５－リン酸）を１６０μＭの固定した酵素と３７℃にて３２時間混合した。固定したＭＶＫは、収量３．８４ｍＭ（１．７９ｇ／Ｌ）のＡＤＰのために９６％の４ｍＭ ＡＴＰを変換可能であった。サンプリングのために、その反応液をＨＰＬＣシステムにて検査して、ＡＴＰおよびＡＤＰの量を調べた。そのＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、ＢｅｔａＳｉｌ Ｃ１８ ２０ｍｍ×２．１ｍｍガードカラムを備えたＨＹＰＥＲＳＩＬ ＯＤＳ ＣＯＬＵＭＮ １５０ｍｍ×３ｍｍを取り付けた。このカラムを２５℃に加熱し、サンプルブロックを４℃にて維持した。ＨＰＬＣ方法は、５μｌサンプル注入体積で構成され、アイソクラティック移動相が、１００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８ｍＭ ＴＢＡＨＳ、ｐＨ６．０、２０％のメタノール（体積／体積）で構成された。実行時間は合計１０分であり、ＡＴＰが５．７分で溶出し、ＡＤＰが４．６分で溶出した。ダイオードアレイ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、２５４ｎｍでの目的分子の検出のために使用した。

【0064】

（２．１０ ジホスホメバロン酸キナーゼ（ＭＤＣ）の最適化）：ＭＤＣをエポキシメタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してメバロン酸－５－ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換した。反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ８、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭメバロン酸－５－ピロリン酸）を、１６０μＭの固定した酵素と３７℃にて３２時間混合した。固定したＭＶＫは、収量１．８ｍＭ（８３９ｍｇ／Ｌ）のＡＤＰのために９４％の２ｍＭ ＡＴＰを変換可能であった。サンプリングのために、その反応液をＨＰＬＣシステムにて検査して、ＡＴＰおよびＡＤＰの量を調べた。そのＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、ＢｅｔａＳｉｌ Ｃ１８ ２０ｍｍ×２．１ｍｍガードカラムを備えたＨＹＰＥＲＳＩＬ ＯＤＳ ＣＯＬＵＭＮ １５０ｍｍ×３ｍｍを取り付けた。このカラムを２５℃に加熱し、サンプルブロックを４℃にて維持した。ＨＰＬＣ方法は、５μｌサンプル注入体積で構成され、アイソクラティック移動相が、１００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８ｍＭ ＴＢＡＨＳ、ｐＨ６．０、２０％のメタノール（体積／体積）で構成された。実行時間は合計１０分であり、ＡＴＰが５．７分で溶出し、ＡＤＰが４．６分で溶出した。ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を、２５４ｎｍでの目的分子の検出のために使用した。

【0065】

（２．１１ イソペンテニル二リン酸Δイソメラーゼ（ＩＤＩ）の最適化）：ＩＤＩをマクロ孔質ポリメタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）へと変換した。その反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２４ｍＭ ＩＰＰ）を８６μＭの固定した酵素と２５℃にて２時間混合した。その後、その反応混合物を、０．２４ｍＭのオリベトール酸、８５μＭ ＮｐｈＢ、および２９．７μＭ ＦＰＰＳとともに２時間インキュベートした。完了した反応物を酢酸エチルで３回抽出し、蒸発させ、その後で、反応混合物中に存在するＣＢＧＡの量を調べるためのＨＰＬＣシステムでの分析のためにメタノール中に再懸濁した。この共役反応は、２８％の出発物質を２１．３ｍｇ/Ｌの生成物へと変換可能であった。そのＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、ガードカラムを備えた２５０ｍｍ×４．６ｍｍの５μｍ ｌｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ８カラムを取り付けた。このカラムを３０℃に加熱し、サンプルブロックを２５℃にて維持した。ＨＰＬＣ方法は、５μｌサンプル注入体積で構成され、アイソクラティック移動相が、２５％の緩衝液Ａ（水、０．１％ギ酸、５ｍＭギ酸アンモニウム）および７５％の緩衝液Ｂ（アセトニトリル、０．１％ギ酸、５ｍＭギ酸アンモニウム）で構成された。この反応で生成されたＣＢＧＡを、２２８ｎｍにてＤＡＤを使用して測定した。実行時間は合計１０分であり、ＣＢＧＡが３．６８分で溶出した。

【0066】

（２．１２ ポリプレニルシンテターゼファミリータンパク質（ＦＰＰＳ）の最適化）：ＦＰＰＳをマクロ孔質ポリメタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）をゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）へと変換した。その反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２４ｍＭ ＩＰＰ、０．２４ｍＭ ＤＭＡＰＰ、０．２４ｍＭオリベトール酸（ＯＡ））および１２０μＭのＮｐｈＢタンパク質を、８６μＭの固定した酵素と２５℃にて４時間混合した。固定したＦＰＰＳは、収量１９５μＭのＧＰＰのために８１％の２４０μＭ ＩＰＰおよび２４０μＭ ＤＭＡＰＰを変換可能であった。ＧＰＰ生成の分析は、ＧＰＰとオリベトール酸とを合わせてＣＢＧＡを生成するプレニルトランスフェラーゼ（ＮｐｈＢ）の活性に結びついている。完了した反応物を酢酸エチルで３回抽出し、蒸発させ、反応混合物中に存在するＣＢＧＡの量を調べるためのＨＰＬＣシステムでの分析のためにメタノール中に再懸濁した。そのＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、ガードカラムを備えた２５０ｍｍ×４．６ｍｍの５μｍ ｌｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ８カラムを取り付けた。このカラムを３０℃に加熱し、サンプルブロックを２５℃にて維持した。ＨＰＬＣ方法は、５μｌサンプル注入体積で構成され、アイソクラティック移動相が、２５％の緩衝液Ａ（水、０．１％ギ酸、５ｍＭギ酸アンモニウム）および７５％の緩衝液Ｂ（アセトニトリル、０．１％ギ酸、５ｍＭギ酸アンモニウム）で構成された。この共役反応は、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を１２９．６μＭまたは４１ｍｇ／Ｌで生じた。この反応において生成されたＣＢＧＡを、２２８ｎｍにてＤＡＤを使用して測定した。実行時間は合計１０分であり、ＣＢＧＡが３．６８分で溶出した。

【0067】

（２．１３ ポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）の最適化）：ＰＰＫ２をエポキシメタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してＡＤＰをＡＴＰへと変換してこの補因子をリサイクルした。反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５．０ｍＭポリリン酸（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５．０ｍＭ ＡＤＰ）を、９５μＭの固定した酵素と３７℃にて１時間混合した。固定したＰＰＫ２は、収量５．０ｍＭのＡＴＰ（１００％、２．５ｇ／Ｌ）のために５．０ｍＭのＡＤＰを変換可能であった。サンプリングのために、その反応液をＨＰＬＣシステムにて検査して、その反応混合物中に存在するＡＴＰおよびＡＤＰの量を調べた。そのＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、ＢｅｔａＳｉｌ Ｃ１８ ２０ｍｍ×２．１ｍｍガードカラムを備えたＨＹＰＥＲＳＩＬ ＯＤＳ Ｃｏｌｕｍｎ １５０ｍｍ×３ｍｍを取り付けた。このカラムを２５℃に加熱し、サンプルブロックを４℃にて維持した。各サンプルについて、５μｌを注入し、アイソクラティック移動相が、１００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８ｍＭ ＴＢＡＨＳ、ｐＨ６．０、２０％のメタノールで構成された。実行時間は合計１０分であり、ＡＴＰが５．７分で溶出し、ＡＤＰが４．６分で溶出した。ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を、２５４ｎｍでの目的分子の検出のために使用した。

【0068】

（２．１４ グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の最適化）：ＧＤＨをエポキシメタクリレート樹脂と混合し、その固定した酵素を使用してＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨへと変換してこの必須の補因子をリサイクルした。その反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）、２０ｍＭグルコース、５．０ｍＭ ＮＡＤＰ＋）を、２００μＭの固定した酵素と２２℃にて１５分間混合した。固定したＧＤＨは、５．０ｍＭのＮＡＤＰＨ（１００％、３．７ｇ／Ｌ）を生じるように５．０ｍＭのＮＡＤＰ＋を変換可能であった。ＧＤＨの活性を、この反応溶液のＮＡＤＰＨ濃度を３４０ｎｍにてプレートリーダーで測定することによって検出した。

【0069】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

＊注記：ピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙＯｘ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）は、ＡＧ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（製品Ｐ－１６００）から購入した。

【0070】

（３．０ グリセロールからＧＰＰを生成するためのすべて固定した酵素の使用）：遊離酵素を用いたグリセロールからのＧＰＰの生成を示し、必要な個別の酵素のすべてが固定された場合に活性であることもまた示した後で、次の目標は、固定した酵素を使用してグリセロールからＧＰＰを生成することであった。各酵素を、表３において列挙した１０ｍｇの樹脂に固定した。精製した酵素を樹脂と２１℃にて１８時間混合し、固定した酵素を単一チューブにプールした。

【0071】

【表3】

【0072】

この多段階反応のために、最初の３種の酵素（Ａｌｄｏ、ＤＨＡＤ、およびＰｙＯＸ）を、最初にバッチリアクターに順次添加した。最初に、固定したＭＢＰ－Ａｌｄｏを、反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭグリセロール）に３７℃にて１８時間添加した。次に、固定したＤＨＡＤをその反応溶液に添加し、４５℃にて１８時間インキュベートした。その上清を、その固定した酵素から除去し、その反応溶液を調整して５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのチアミンピロリン酸を含むようにし、最後に、その反応溶液のｐＨをｐＨ６．０に調整した。その後、固定したＰｙＯｘを、その反応溶液に３７℃にて１６時間添加した。その後、その上清を、固定した酵素から除去し、その反応溶液を調整して５０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのリン酸カリウム、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮＡＤＰＨ、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＣｏＡ、４ｍＭのオリベトール酸、およびｐＨ８．０を最終体積１．０ｍＬについて含むようにした。この経路中の残りの１０種の固定した酵素を、この反応混合物に添加した。この反応を３７℃にて５日間実行した後、酢酸エチル（２×２００μＬ）で抽出し、減圧下で蒸発させ、この反応混合物中に存在するＣＢＧＡの量を調べるためのＨＰＬＣシステムでの分析のためにメタノール（１ｍＬ）中に再懸濁した。そのＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、ガードカラムを備えた２５０ｍｍ×４．６ｍｍの５μｍ ｌｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ８カラムを取り付けた。このカラムを３０℃に加熱し、サンプルブロックを２５℃にて維持した。ＨＰＬＣ方法は、５μｌサンプル注入体積で構成され、２５％の緩衝液Ａ（水、０．１％ギ酸、５ｍＭギ酸アンモニウム）および７５％の緩衝液Ｂ（アセトニトリル、０．１％ギ酸、５ｍＭギ酸アンモニウム）で構成されたアイソクラティック勾配を、移動相として使用した。この反応は、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を１５５μＭまたは４９ｍｇ／Ｌで生じた（図２Ａおよび図２Ｂ）。この反応で生成されたＣＢＧＡを、２２８ｎｍにてＤＡＤを使用して測定した。実行時間は合計１０分であり、ＣＢＧＡが３．６８分で溶出した。

【0073】

（４．０ 補因子（ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨのリサイクリング）を用いてグリセロールからＧＰＰを生成するための固定した酵素の使用）：固定したグリセロールからＧＰＰへの経路の成功を示すことに加えて、その反応における２種の共通する補因子（ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨ）のリサイクリングを達成した。表４において示される固定した酵素の組成を、その反応において使用した。

【0074】

【表4】

【0075】

この多段階反応のために、最初の３種の酵素（Ａｌｄｏ、ＤＨＡＤ、およびＰｙＯＸ）を、最初にバッチリアクターに順次添加した。最初に、固定したＭＢＰ－Ａｌｄｏを、反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭグリセロール）に３７℃にて１８時間添加した。次に、固定したＤＨＡＤをその反応溶液に添加し、４５℃にて１８時間インキュベートした。その上清を、その固定した酵素から除去し、その反応溶液を調整して５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのチアミンピロリン酸を含むようにし、最後に、その反応溶液のｐＨをｐＨ６．０に調整した。その後、固定したＰｙＯｘを、その反応溶液に３７℃にて１６時間添加した。その後、その上清を、固定した酵素から除去し、その反応溶液を調整して５０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのリン酸カリウム、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮＡＤＰＨ、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＣｏＡ、４ｍＭのオリベトール酸、およびｐＨ８．０を最終体積１．０ｍＬについて含むようにした。残りの１２種の酵素（表４に示されるとおり）を、最終体積１．０ｍＬ中で５０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのリン酸カリウム、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭのＮａＣｌ、３．３ｍＭのＮＡＤＰＨ、３．３ｍＭのＡＴＰ、５．０ｍＭのポリリン酸、５．０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＣｏＡ、４ｍＭのオリベトール酸およびｐＨ８．０の反応溶液に添加した。バッチ反応を３７℃にて５日間継続させ、その後、酢酸エチル（３×２００μＬ）で抽出し、減圧下で蒸発させ、この反応混合物中に存在するＣＢＧＡの量を調べるためのＨＰＬＣシステムでの分析のためにメタノール（１ｍＬ）中に再懸濁した。そのＨＰＬＣ方法は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣに、ガードカラムを備えた２５０ｍｍ×４．６ｍｍの５μｍ ｌｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ８カラムを取り付けた。このカラムを３０℃に加熱し、サンプルブロックを２５℃にて維持した。このＨＰＬＣ方法は、５μｌサンプル注入体積で構成され、移動相が、２５％の緩衝液Ａ（水、０．１％ギ酸、５ｍＭギ酸アンモニウム）および７５％の緩衝液Ｂ（アセトニトリル、０．１％ギ酸、５ｍＭギ酸アンモニウム）で構成された。この反応は、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を１１４μＭまたは３６ｍｇ／Ｌで生じた。この反応で生成されたＣＢＧＡを、２２８ｎｍにてＤＡＤを使用して測定した。実行時間は合計１０分であり、ＣＢＧＡが３．６８分で溶出した。

【0076】

本明細書において使用される場合、用語「約」とは、言及された数±１０％を指す。

【0077】

本発明の好ましい実施形態が示され記載されてきたが、添付の特許請求の範囲を越えない改変がそれらの本発明の好ましい実施形態に対して行われ得ることが、当業者にとって容易に明らかである。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。一部の実施形態において、本出願において提示される図面は、角度、寸法比などを含んで正確な縮尺である。一部の実施形態において、図面は例示的なものに過ぎず、特許請求の範囲は、図面の寸法によっては限定されない。一部の実施形態において、句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用して本明細書において記載された発明の記載は、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」として記載され得た実施形態を含み、したがって、句「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を使用して本発明の１つまたは複数の実施形態を特許請求することに関する記載要件は、満たされている。

【図1】

【図2】

【配列表】

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【国際調査報告】