特表 2024-500867 高品質の幹細胞選別用マーカー、およびこれを用いた高品質の幹細胞の選別方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-10

(54)【発明の名称】高品質の幹細胞選別用マーカー、およびこれを用いた高品質の幹細胞の選別方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20231227BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20231227BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20231227BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20231227BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20231227BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231227BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/09 200

C12Q1/02

C12N5/0775

A61K35/28

A61P37/02

A61P37/06

A61P11/06

A61P17/00

A61P37/08

A61P11/00

A61P29/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537899

(86)(22)【出願日】2021-12-22

(85)【翻訳文提出日】2023-06-28

(86)【国際出願番号】 KR2021019582

(87)【国際公開番号】W WO2022139442

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】10-2020-0180455

(32)【優先日】2020-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522225583

【氏名又は名称】セル２イン，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100205659

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 拓也

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(74)【代理人】

【識別番号】100185269

【弁理士】

【氏名又は名称】小菅 一弘

(72)【発明者】

【氏名】カン フンス

(72)【発明者】

【氏名】シン ジ ウン

(72)【発明者】

【氏名】カン ヒェウォン

(72)【発明者】

【氏名】キム ヒェ ミ

(72)【発明者】

【氏名】イ キベク

(72)【発明者】

【氏名】ジョン ハットニム

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ08

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS33

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AC20

4B065BA25

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087NA20

4C087ZA59

4C087ZA89

4C087ZB07

4C087ZB08

4C087ZB11

4C087ZB13

(57)【要約】

本発明は、幹細胞の品質評価用組成物、キットおよび幹細胞の製造方法に関し、細胞治療剤および免疫関連疾患の予防または治療用組成物を提供することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

分化クラスター７１（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ７１；ＣＤ７１）タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルを測定する製剤を含む、幹細胞の品質評価用組成物。

【請求項2】

前記ＣＤ７１タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルが対照群に比べて減少した場合、前記幹細胞の品質が高いと判別される、請求項１に記載の幹細胞の品質評価用組成物。

【請求項3】

前記幹細胞は、中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）である、請求項１に記載の幹細胞の品質評価用組成物。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか１項に記載の幹細胞の品質評価用組成物を含む、幹細胞の品質評価用キット。

【請求項5】

幹細胞を得るステップと、
前記幹細胞における分化クラスター７１（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ７１；ＣＤ７１）タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルを測定するステップとを含む、活性化された幹細胞の選別方法。

【請求項6】

前記幹細胞の前記ＣＤ７１タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルが対照群に比べて減少した場合、前記幹細胞の品質が高いと判別される、請求項５に記載の活性化された幹細胞の選別方法。

【請求項7】

品質が高いと判別された活性化された幹細胞の表現型は、ＣＤ７１^ｌｏｗ幹細胞である、請求項６に記載の活性化された幹細胞の選別方法。

【請求項8】

前記幹細胞の酸化ストレスを測定するステップをさらに含む、請求項５に記載の活性化された幹細胞の選別方法。

【請求項9】

前記酸化ストレスを測定するステップは、細胞内のグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ；ＧＳＨ）レベルを測定して行われるものである、請求項８に記載の活性化された幹細胞の選別方法。

【請求項10】

前記幹細胞は、中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）である、請求項５に記載の活性化された幹細胞の選別方法。

【請求項11】

選別された幹細胞は、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）の発現レベルが対照群に比べて増加したものである、請求項５に記載の活性化された幹細胞の選別方法。

【請求項12】

選別された幹細胞は、インターロイキン６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６；ＩＬ－６）、インターロイキン８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ８；ＩＬ－８）、およびヘム酸化酵素１（ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ１；ＨＭＯＸ１）の少なくとも１つの発現レベルが対照群に比べて減少したものである、請求項５に記載の活性化された幹細胞の選別方法。

【請求項13】

ＣＤ７１^ｌｏｗ表現型を示す幹細胞を有効成分として含む細胞治療剤。

【請求項14】

ＣＤ７１^ｌｏｗ表現型を示す幹細胞を有効成分として含む免疫関連疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項15】

前記免疫関連疾患は、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶反応、喘息、アトピー、特発性肺線維化症、急性炎症、および慢性炎症から構成された群より選択される１種以上である、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高品質の幹細胞選別用細胞表面マーカータンパク質、および前記マーカータンパク質を用いた高品質の幹細胞の選別方法に関する。

【背景技術】

【0002】

幹細胞は未分化細胞であって、自己再生および人体の多様な細胞への分化能を有していて、治療剤として適用する場合、抗炎症効果の提供、損傷した組織に対する原点復帰、組織成長に必要な内皮前駆細胞のような細胞収集、傷痕形成による組織再形成補助、細胞死滅抑制、組織への分化、の５つの主要メカニズムにより回復を仲介すると考えられる。

【0003】

また、幹細胞は、表面で発現する比較的少ない数のＭＨＣ分子によって低い免疫原性を有することが知られている。さらに、免疫反応を回避させ、新しい組織の耐性を促進するケモカインを分泌することが明らかになった。これは大きな免疫拒絶反応の危険なしに同種異系の治療を行えるようにする。一部の幹細胞の効能が伝達方法により影響を受けることがある。

【0004】

幹細胞には、ヒトの胚を用いて作ることができる胚幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と、血球細胞を絶え間なく作る骨髄細胞のような成体幹細胞（Ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とがある。胚幹細胞は人体をなすすべての細胞と組織に分化できるが、倫理的な理由から使用が制限されているのに対し、成体幹細胞は臍帯血や完全に育った成人の骨髄と血液などから抽出したもので、中間葉幹細胞と造血幹細胞として存在する。

【0005】

なかでも、中間葉幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）は、脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞のような様々な細胞系統に分化できる、骨髄を含む全身に存在する幹細胞である。中間葉幹細胞は、アレクサンドル・マクシモフ（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ａ．Ｍａｘｉｍｏｗ、１８７４－１９２８）によって、中間葉に血液細胞へ分化できる前駆細胞があることが究明された後、１９７６年、アレクサンドル・フリーデンスタイン（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ．Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ、１９２４－１９９８）によって、骨髄の基質から最初に分離され、線維芽細胞の前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｆｏｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）と名付けられた。１９９０年代に多くの研究者によって軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、筋細胞、脂肪細胞、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）などに分化する能力があることが究明され、中間葉幹細胞という用語が使われ始めた。以降、中間葉幹細胞は、ヒト、マウス、ネズミ、イヌ、ヤギ、ウサギおよびネコを含む多数の種から分離された。

【0006】

中間葉幹細胞を用いた細胞治療技術は、高純度、高品質の細胞のみを用いて適用することが重要であり、このような治療技術は多様な炎症性疾患のような難治性疾患の治療を試みている。したがって、中間葉幹細胞治療剤に適用するための中間葉幹細胞の性能を評価するためのマーカーの必要性が台頭しているのが現状である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の一目的は、幹細胞の品質評価用組成物およびキットを提供することである。

【0008】

本発明の他の目的は、細胞治療剤として使用できる、活性化された幹細胞の選別方法を提供することである。

【0009】

本発明のさらに他の目的は、本発明の方法で選別された幹細胞を用いた細胞治療剤および免疫関連疾患の予防または治療用組成物を提供することである。

【0010】

しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は以上に言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0011】

以下、本願に記載された多様な実施形態が図面を参照して記載される。下記の説明において、本発明の完全な理解のために、多様な特異的詳細事項、例えば、特異的形態、組成物および工程などが記載されている。しかし、特定の実施形態は、これらの特異的詳細事項の１つ以上なしに、または他の公知の方法および形態とともに実行されてもよい。他の例において、公知の工程および製造技術は、本発明を不必要にあいまいにさせないために、特定の詳細事項として記載されない。「一つの実施形態」または「実施形態」に対する本明細書全体にわたる参照は、実施形態と結びつけて記載された特別な特徴、形態、組成または特性が本発明の一つ以上の実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる多様な位置で表現された「一つの実施形態において」または「実施形態」の状況は、必ずしも本発明の同一の実施形態を示さない。追加的に、特別な特徴、形態、組成、または特性は一つ以上の実施形態において何らかの適した方法で組み合わされる。本発明内に特別な定義がなければ、本明細書に使われたすべての科学的および技術的な用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。

【0012】

本発明の一実施形態によれば、分化クラスター７１（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ７１；ＣＤ７１）タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルを測定する製剤を含む、幹細胞の品質評価用組成物を提供する。

【0013】

本発明において、前記「ＣＤ７１タンパク質」は、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＦＲＣ）ともいい、前記ＣＤ７１タンパク質は、細胞血流に乗って流れる鉄分と結合するトランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）タンパク質と相互作用をして、受容体媒介トランスフェリンエンドサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）という過程を経て、細胞内に鉄分を供給する役割をする。前記ＣＤ７１タンパク質は、配列番号１で表されるものであってもよい。前記ＣＤ７１タンパク質をコードする遺伝子は、ヒトの場合に３番染色体、マウスの場合に１６番染色体に位置する。

【0014】

本発明において、前記ＣＤ７１タンパク質の発現レベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）からなる群より選択された１種以上を含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0015】

本発明の前記「抗体」は、抗原と特異的に結合して抗原－抗体反応を起こす物質を指す。本発明の目的上、抗体は、前記ＣＤ７１タンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味する。

【0016】

本発明の前記抗体は、多クローン抗体、単クローン抗体および組換え抗体をすべて含む。前記抗体は、当業界にて広く公知の技術を利用して容易に製造できる。例えば、多クローン抗体は、前記タンパク質の抗原を動物に注射し、動物から採血して抗体を含む血清を得る過程を含む、当業界にて広く公知の方法により生産できる。このような多クローン抗体は、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌなどの任意の動物から製造できる。また、単クローン抗体は、当業界にて広く公知のハイブリドーマ方法（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｍｅｔｈｏｄ；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６：５１１－５１９参照）、またはファージ抗体ライブラリー技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８，１９９１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１－５９７，１９９１参照）を用いて製造できる。前記方法で製造された抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどの方法を用いて分離、精製できる。また、本発明の抗体は、２個の全長の軽鎖および２個の全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。

【0017】

本発明の前記「ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）」は、人工的に合成された、ＤＮＡまたはＲＮＡに類似の重合体を指し、１９９１年、デンマークコペンハーゲン大学のＮｉｅｌｓｅｎ、Ｅｇｈｏｌｍ、ＢｅｒｇとＢｕｃｈａｒｄｔ教授によって初めて紹介された。ＤＮＡは、リン酸－リボース糖骨格を有するのに対し、ＰＮＡは、ペプチド結合によって連結された繰り返しのＮ－（２－アミノエチル）－グリシン骨格を有し、これによってＤＮＡまたはＲＮＡに対する結合力と安定性が大きく増加して、分子生物学、診断分析およびアンチセンス治療法に使用されている。ＰＮＡは、文献［Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＥ，Ｅｇｈｏｌｍ Ｍ，Ｂｅｒｇ ＲＨ，Ｂｕｃｈａｒｄｔ Ｏ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１９９１）。「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｙｍｉｎｅ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ」。Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４（５０３７）：１４９７－１５００］に詳しく開示されている。

【0018】

本発明において、前記「アプタマー」は、オリゴ核酸またはペプチド分子であり、アプタマーの一般的な内容は、文献［Ｂｏｃｋ ＬＣ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５５（６３６０）：５６４６（１９９２）；Ｈｏｐｐｅ－Ｓｅｙｌｅｒ Ｆ，Ｂｕｔｚ Ｋ「Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｐｔａｍｅｒｓ：ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ」。Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７８（８）：４２６３０（２０００）；Ｃｏｈｅｎ ＢＡ，Ｃｏｌａｓ Ｐ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ．「Ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｅｌｌ－ｃｙｃｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ」。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５（２４）：１４２７２７（１９９８）］に詳しく開示されている。

【0019】

本発明において、前記ＣＤ７１をコードする遺伝子の発現レベルを測定する製剤は、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブおよびアンチセンスヌクレオチドからなる群より選択された１種以上を含むことができる。

【0020】

本発明において、前記「プライマー」は、標的遺伝子配列を認知する断片であって、正方向および逆方向のプライマー対を含むが、好ましくは、特異性および敏感性を有する分析結果を提供するプライマー対である。プライマーの核酸配列が試料内に存在する非－標的配列と不一致の配列であるので、相補的なプライマー結合部位を含む標的遺伝子配列のみ増幅し、非特異的増幅を誘発しないプライマーの時、高い特異性が付与できる。

【0021】

本発明において、前記「プローブ」とは、試料内の検出しようとする標的物質と特異的に結合できる物質を意味し、前記結合により特異的に試料内の標的物質の存在を確認できる物質を意味する。プローブの種類は、当業界にて通常使用される物質として制限はないが、好ましくは、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよいし、最も好ましくは、ＰＮＡである。より具体的には、前記プローブは、バイオ物質として、生物に由来するか、これに類似のものまたは生体外で製造されたものを含むもので、例えば、酵素、タンパク質、抗体、微生物、動植物細胞および器官、神経細胞、ＤＮＡ、およびＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含み、ＲＮＡは、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドを含み、タンパク質の例としては、抗体、抗原、酵素、ペプチドなどを含むことができる。

【0022】

本発明において、前記「ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）」とは、２’－Ｏ、４’－Ｃメチレンブリッジを含む核酸アナログを意味する［Ｊ Ｗｅｉｌｅｒ，Ｊ Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｊ Ｈａｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）１３，４９６．５０２］。ＬＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡとＲＮＡの一般的な核酸塩基を含み、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対規則に従って塩基対を形成することができる。しかし、メチレンブリッジによる分子の「ｌｏｃｋｉｎｇ」によって、ＬＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ結合において理想的な形状を形成できなくなる。ＬＮＡがＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドに含まれると、ＬＮＡは、より速く相補的ヌクレオチド鎖と対をなして二重螺旋の安定性を高めることができる。本発明において、前記「アンチセンス」は、アンチセンスオリゴマーがワトソン・クリック塩基対の形成によってＲＮＡ内の標的配列と混成化されて、標的配列内で典型的にｍＲＮＡとＲＮＡ：オリゴマーのヘテロ二重体の形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間のバックボーンを有するオリゴマーを意味する。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列の相補性または近似相補性を有することができる。

【0023】

本発明による前記ＣＤ７１タンパク質の配列情報はすでに知られているので、当業者であれば、これに基づいて前記ＣＤ７１タンパク質をコードする遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを容易にデザインすることができるであろう。

【0024】

本発明において、前記幹細胞のＣＤ７１タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルが対照群に比べて減少した場合、前記幹細胞の品質が高いと判別される。ここで、前記対照群は、任意の幹細胞におけるＣＤ７１タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルであってもよく、あるいは幹細胞で発現するＣＤ７１タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルの平均値であってもよいが、これに限定されるものではない。本発明において、前記「幹細胞」は、自己複製能力を有しかつ２つ以上の新しい細胞に分化する能力を有する細胞を意味し、分化能によって、万能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、全分化能幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）および単分化能幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に分類することができ、幹細胞の由来組織によって、成体幹細胞、胚幹細胞および逆分化幹細胞に分類することができる。前記万能性乃至全分化能幹細胞は、生体を構成するすべての組織や細胞に分化できる能力を有する細胞を意味する。また、多能性幹細胞は、すべての種類ではないが、複数種の組織や細胞に分化できる能力を有する細胞を意味する。単分化能幹細胞は、特定の組織や細胞に分化できる能力を有する細胞を意味する。万能性幹細胞としては、胚幹細胞（ＥＳ Ｃｅｌｌ）、未分化生殖腺細胞（ＥＧ Ｃｅｌｌ）、逆分化幹細胞（ｉＰＳ ｃｅｌｌ）などが挙げられる。多能性幹細胞としては、肝葉系幹細胞（脂肪由来、骨髄由来、臍帯血またはへその緒由来など）、造血系幹細胞（骨髄または末梢血液などに由来）、神経系幹細胞、生殖幹細胞などの成体幹細胞などが挙げられる。また、単分化能幹細胞としては、平常時は分裂能が低い状態で存在し、活性化後に盛んな分裂により分化能なしにひたすら自己複製のみをする幹細胞（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）などが挙げられる。成体幹細胞は、身体の各組織に少量存在する細胞で、特定の組織を構成する細胞であり、体が常に健康な状態に維持されるのに必要な細胞を提供し、また、損傷が発生した時、損傷した部位に移動した、他の臓器にあった幹細胞と共に損傷した組織に分化して復旧する。本発明の属する分野における通常の技術者に一般的に幹細胞のサイズが小さく、細胞内顆粒（ｇｒａｎｕｌｅ）が少ないほど「高品質幹細胞」と認められる（Ｌｅｎｇｅｆｅｌｄ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｓｉｚｅ ｉｓ ａ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｕｒｉｎｇ ａｇｉｎｇ．Ｓｃｉ Ａｄｖ．２０２１ Ｎｏｖ１２；７（４６）：Ｅｐｕｂ ２０２１ Ｎｏｖ１２．）。また、コロニー形成能力（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）に優れるほど「高品質幹細胞」と認められる（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｆｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｇｉｎｇ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅ４０，Ｉｓｓｕｅ１２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００５、Ｐａｇｅｓ９２６－９３０）。

【0025】

前記の「高品質」とは、幹細胞は効率が高く、細胞治療剤としての効果が大きい細胞という意味である。したがって、前記高品質幹細胞を選別する基準は、１）細胞サイズおよび顆粒；で区分するか、２）コロニー形成能力；で区分するか、または３）細胞のタンパク質発現マーカー；で区分することが可能である。前記の発現マーカーは、高品質幹細胞集団において一般幹細胞の診断に比べて３０％以上発現が増加するタンパク質（陽性マーカー）、または高品質幹細胞集団において一般幹細胞の診断に比べて３０％以上発現が減少するタンパク質（陰性マーカー）に区分することができる。例えば、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）は、若くて健康な細胞で発現が増加することが知られている。この場合に、前記ＶＥＧＦを高品質幹細胞の陽性マーカーと定義することができる。あるいは、ＩＬ－６またはＩＬ－８は、細胞が老化するほど発現が増加することが知られている（Ｊｉｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，０５Ｍａｙ ２０２０）。この場合に、前記ＩＬ－６またはＩＬ－８は、発現が減少するほど若くて健康な細胞ということができ、高品質幹細胞の陰性マーカーと定義することができる。

【0026】

本発明において、前記幹細胞は、中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）であってもよいが、これに限定されない。

【0027】

本発明において、用語「中間葉幹細胞」は、幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）と自己再生能（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）を維持し、多様な肝葉組織に分化できる能力（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）があり、本発明の組成物で品質を測定して選別された幹細胞は、効率が高く、細胞治療剤としての効果が大きい細胞である。

【0028】

本発明において、前記中間葉幹細胞は、ヒト胚幹細胞由来中間葉幹細胞（Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａ ｃｅｌｌ；ｈＥＳ－ＭＳＣ）、臍帯由来中間葉幹細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＵＣ－ＭＳＣ）、臍帯血由来中間葉幹細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＵＣＢ－ＭＳＣ）、骨髄由来中間葉幹細胞（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＢＭ－ＭＳＣ）、脂肪由来中間葉幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＡＤＭＳＣ）、筋肉由来中間葉幹細胞、神経由来中間葉幹細胞、皮膚由来中間葉幹細胞、羊膜由来中間葉幹細胞および胎盤由来中間葉幹細胞からなる群より選択されるいずれか１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0029】

本発明において、前記中間葉幹細胞は、生物学的試料、好ましくは、ヒトの生物学的試料、例えば、骨髄、支柱骨、骨膜、歯髄、腱、脂肪組織、血液、へその緒、胎盤、胎児の卵黄嚢および皮膚（真皮）に由来するものであってもよいが、これに限定されない。

【0030】

本発明において、用語「生物学的試料」、「サンプル」または「生物学的サンプル」は、生物学的供給源、例えば、動物またはヒト対象のような有機体、細胞培養物、組織サンプルなどから得られる任意の物質、組織または細胞を意味することができる。動物またはヒト対象の生物学的試料は、１種以上の組織タイプおよび１種以上の組織タイプの細胞を含むことができる。動物またはヒト対象の生物学的試料の収得方法は、当業界の任意の方法により分離された任意の幹細胞であってもよく、好ましくは、前記幹細胞は、中間葉幹細胞であってもよい。

【0031】

本発明において、前記中間葉幹細胞は、中間葉系統、典型的に２以上の中間葉系統、より典型的には３以上の中間葉系統、例えば、骨軟骨芽細胞（骨および軟骨）、骨芽細胞（骨）、軟骨芽細胞（軟骨）、筋細胞（筋肉）、腱細胞（筋）、線維芽細胞（結合組織）、脂肪細胞（脂肪）および間質（骨髄基質）系統の細胞を生成することができる。

【0032】

本発明において、「幹細胞品質（ｑｕａｌｉｔｙ）」とは、幹細胞試料内の多様な幹細胞の状態であれば制限なく含まれるが、好ましくは、幹細胞試料の幹細胞の臨床適用（例、細胞治療剤）が可能な状態なのか否かに関する。

【0033】

本発明において、前記幹細胞品質は、前記幹細胞の分化程度（例、未分化または骨細胞分化）、成長因子、サイトカインおよびその他のタンパク質の発現量乃至発現レベルを意味するものであってもよいが、幹細胞を実質的に細胞治療剤として使用するのに適した要件に関するものであれば、これに限定されない。

【0034】

本発明において、「評価」乃至「判別」とは、定量および／または定性分析を含むもので、存在、不存在の検出、発現量および濃度測定を含むもので、このような方法は当業界にて公知であり、当業者であれば本願の実施のために適切な方法を選択することができるであろう。

【0035】

本発明の他の実施形態によれば、本発明の幹細胞の品質評価用組成物を含む幹細胞の品質評価用キットに関する。前記幹細胞の品質評価用キットを用いて幹細胞の品質を測定することができる。

【0036】

本発明において、前記幹細胞、前記幹細胞の品質および前記測定に関する記載は、先に記載されたものと重複し、明細書の過度の複雑性を避けるために、以下、その詳しい記載を省略する。

【0037】

本発明において、前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲキット、ＤＮＡチップキット、ＥＬＩＳＡキット、タンパク質チップキット、ラピッド（ｒａｐｉｄ）キットであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0038】

本発明の前記幹細胞の品質評価用キットは、分析方法に適した１種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置をさらに含むことができる。

【0039】

例えば、本発明において、前記幹細胞の品質評価用キットは、逆転写重合酵素反応を行うために必要な必須要素をさらに含むことができる。逆転写重合酵素反応キットは、マーカータンパク質をコードする遺伝子に対して特異的なプライマー対を含む。プライマーは、前記遺伝子の核酸配列に特異的な配列を有するヌクレオチドであって、約７ｂｐ～５０ｂｐの長さ、より好ましくは約１０ｂｐ～３０ｂｐの長さを有することができる。また、対照群遺伝子の核酸配列に特異的なプライマーを含むことができる。その他の逆転写重合酵素反応キットは、テストチューブまたは他の適切な容器、反応緩衝液（ｐＨおよびマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ－ポリメラーゼおよび逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ－水（ＤＥＰＣ－ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含むことができる。

【0040】

また、本発明の幹細胞の品質評価用キットは、ＤＮＡチップを行うために必要な必須要素を含むことができる。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に相当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が付着している基板、および蛍光標識プローブを作製するための試薬、製剤、酵素などを含むことができる。さらに、基板は、対照群遺伝子またはその断片に相当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを含むことができる。

【0041】

また、本発明において、幹細胞の品質評価用キットは、ＥＬＩＳＡを行うために必要な必須要素を含むことができる。ＥＬＩＳＡキットは、前記タンパク質に対して特異的な抗体を含む。抗体は、マーカータンパク質に対する特異性および親和性が高く、他のタンパク質に対する交差反応性がほとんどない抗体で、単クローン抗体、多クローン抗体または組換え抗体である。さらに、ＥＬＩＳＡキットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。その他のＥＬＩＳＡキットは、結合した抗体を検出できる試薬、例えば、標識された二次抗体、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ）、酵素（例：抗体とコンジュゲートされる）およびその基質または抗体と結合できる他の物質などを含むことができる。

【0042】

本発明の幹細胞の品質評価用キットにおいて、抗原－抗体結合反応のための固定体としては、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）樹脂またはポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート（Ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）、ガラスからなるスライドガラスなどが使用できるが、これに限定されるものではない。

【0043】

また、本発明の幹細胞の品質評価用キットにおいて、二次抗体の標識体は、発色反応をする通常の発色剤が好ましく、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、塩基性脱リン酸化酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ（ポリＬ－リジン－フルオレセインイソチオシアネート）、ＲＩＴＣ（ローダミン－Ｂ－イソチオシアネート）などの蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）および色素（ｄｙｅ）などの標識体が使用できるが、これに限定されるものではない。

【0044】

また、本発明の幹細胞の品質評価用キットにおいて、発色を誘導するための発色基質は、発色反応をする標識体に応じて使用することが好ましく、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）、ＡＢＴＳ［２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）］、ＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン）などを使用することができる。この時、発色基質は、緩衝溶液（０．１Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５．５）に溶解した状態で提供されることがさらに好ましい。ＴＭＢのような発色基質は、二次抗体接合体の標識体として使用されたＨＲＰによって分解されて発色浸漬体を生成し、この発色浸漬体の浸漬程度を肉眼で確認することにより、前記マーカータンパク質の存在の有無を検出する。

【0045】

本発明の幹細胞の品質評価用キットにおいて、洗浄液は、リン酸塩緩衝溶液、ＮａＣｌおよびツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むことが好ましく、０．０２Ｍリン酸塩緩衝溶液、０．１３Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％ツイーン２０から構成された緩衝溶液（ＰＢＳＴ）がさらに好ましい。洗浄液は、抗原－抗体結合反応後、抗原－抗体結合体に二次抗体を反応させた後、適量を固定体に添加して３～６回洗浄する。反応停止溶液は、硫酸溶液（Ｈ_２ＳＯ_４）が好ましく使用できる。

【0046】

本発明のさらに他の実施形態によれば、幹細胞を得るステップと、前記幹細胞における分化クラスター７１（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ７１；ＣＤ７１）タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルを測定するステップとを含む、活性化された幹細胞の選別方法に関する。

【0047】

本発明において、前記幹細胞を得るステップは、個体から分離された生物学的試料から前記幹細胞を単離して行われる。

【0048】

本発明において、前記「個体」とは、幹細胞を有する個体であって、幹細胞治療が必要な個体および単純に幹細胞を供与する個体を含み、哺乳動物および非－哺乳動物をすべて含むことができる。ここで、前記哺乳動物の例としては、ヒト、非－ヒト霊長類、例えば、チンパンジー、他の類人猿またはサル種；畜産動物、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；飼育動物、例えば、ウサギ、イヌまたはネコ；実験動物、例えば、齧歯類、例えば、ラット、マウスまたはモルモットなどを含むことができるが、これに限定されるものではない。また、本発明において、前記非－哺乳動物の例としては、鳥類または魚類などを含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0049】

本発明において、用語「生物学的試料」、「サンプル」または「生物学的サンプル」は、生物学的供給源、例えば、動物またはヒト対象のような有機体、細胞培養物、組織サンプルなどから得られる任意の物質、組織または細胞を意味することができる。動物またはヒト対象の生物学的試料は、１種以上の組織タイプおよび１種以上の組織タイプの細胞を含むことができる。動物またはヒト対象の生物学的試料の収得方法は、当業界の任意の方法により分離された任意の幹細胞であってもよく、好ましくは、前記幹細胞は、中間葉幹細胞であってもよい。

【0050】

本発明において、前記生物学的試料は、骨髄、支柱骨、骨膜、歯髄、腱、脂肪組織、血液、へその緒、胎盤、胎児の卵黄嚢および皮膚（真皮）に由来するものであってもよいが、これに限定されない。

【0051】

本発明において、前記「単離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）」は、生物学的試料から幹細胞を分離する工程で、例えば、手動方法を用いて脂肪組織から幹細胞を単離する方法がある。この方法は、３７℃で３０分間、０．０７５％コラゲナーゼタイプＩ溶液で脂質吸引物（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）の処置後に、８００ｇで生成された懸濁液の遠心分離に基づく。遠心分離後、細胞懸濁液は、上部上澄液層（ｕｐｐｅｒ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｌａｙｅｒ）の脂肪細胞、および沈殿物で血液細胞汚染を有する溶液の２つの分画に分けられる。

【0052】

本発明において、前記ＣＤ７１タンパク質の発現レベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）からなる群より選択された１種以上を含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0053】

本発明において、前記ＣＤ７１タンパク質の発現レベルの測定は、タンパク質チップ分析、免疫測定法、リガンドバインディングアッセイ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ（Ｓｕｌｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、補体固定分析法、２次元電気泳動分析、液相クロマトグラフィー－質量分析（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＬＣ－ＭＳ）、ウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）からなる群より選択された１種以上によって行われるが、これに限定されるものではない。

【0054】

本発明において、前記ＣＤ７１タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する製剤は、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブおよびアンチセンスヌクレオチドからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0055】

本発明において、前記ＣＤ７１タンパク質をコードする遺伝子の存在の有無と発現程度を確認する過程でｍＲＮＡの量を測定する分析方法としては、逆転写重合酵素反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップなどがあるが、これに限定されるものではない。

【0056】

本発明において、前記幹細胞のＣＤ７１タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルが対照群に比べて減少した場合、前記幹細胞の品質が高いと判別される。ここで、前記対照群は、任意の幹細胞におけるＣＤ７１タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルであってもよく、あるいは幹細胞で発現するＣＤ７１タンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現レベルの平均値であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0057】

本発明において、選別された幹細胞の表現型は、ＣＤ７１^ｌｏｗ幹細胞であってもよい。

【0058】

本発明において、前記幹細胞の表現型は、ＣＤ７１タンパク質の発現レベルとの相関関係に基づいて、細胞表面分子の発現パターンを、陰性；発現レベルが底い（ｌｏｗ）；および発現レベルが高い（ｈｉｇｈ）；の３つの群に分類することができ、一例としては、前記細胞表面分子の発現レベルに基づいて、上位３０％を高い（ｈｉｇｈ）、下位３０％を底い（ｌｏｗ）群集（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と定義することができるが、これに限定されない。

【0059】

本発明の選別方法は、前記幹細胞の酸化ストレスを測定するステップをさらに含むことにより、細胞治療剤として使用されるのに適した、活性化された幹細胞選別の正確度を高めることができる。

【0060】

本発明において、前記酸化ストレスは、活性酸素（活性酸素種、ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）の生成と分解の不均衡によって活性酸素種が過度に集積された状態に細胞が露出した状況をいう。活性酸素は、非選択的に細胞構成物質であるタンパク質、脂質、ＤＮＡを攻撃して不可逆的な損傷をきたすので、酸化ストレスを追加的に測定する場合、前記幹細胞の品質を測定することができる。

【0061】

本発明において、前記酸化ストレスを測定するステップは、細胞内のグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ；ＧＳＨ）レベルを測定して行われる。

【0062】

本発明において、前記グルタチオンは、生体内の酸化還元反応に重要な役割をする抗酸化物質である。細胞内のグルタチオン含有量が高ければ、前記細胞を若くて（ｙｏｕｎｇ ａｇｅ）健康で、治療効果が高い細胞と定義することができる。前記細胞内のグルタチオンレベルを測定することは、グルタチオンと結合する時の波長とグルタチオンと結合しない時の波長が変化するプローブを用いて行われ、例えば、前記プローブは、細胞と細胞小器官内に入りやすく、グルタチオンのチオール（－ＳＨ）基と結合できる小さい分子プローブ（ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ）であってもよい。ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅがグルタチオンに結合すれば、５１０ｎｍ（Ｆ５１０）の波長帯の蛍光を示し、グルタチオンと結合しなければ、５８０ｎｍ（Ｆ５８０）の波長帯の蛍光を示す。このように測定されたＦ５１０／Ｆ５８０の蛍光値で細胞内のグルタチオン量を測定することができ、前記Ｆ５１０／Ｆ５８０をＦＲ（ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ Ｒａｔｉｏ）で表す。ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒとＧＳＨとの間の反応は可逆的で、測定するのに細胞内のＧＳＨを消費しない。本発明において、前記幹細胞は、中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）であってもよい。

【0063】

本発明において、前記中間葉幹細胞は、ヒト胚幹細胞由来中間葉幹細胞（Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａ ｃｅｌｌ；ｈＥＳ－ＭＳＣ）、臍帯由来中間葉幹細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＵＣ－ＭＳＣ）、臍帯血由来中間葉幹細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＵＣＢ－ＭＳＣ）、骨髄由来中間葉幹細胞（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＢＭ－ＭＳＣ）、脂肪由来中間葉幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＡＤＭＳＣ）、筋肉由来中間葉幹細胞、神経由来中間葉幹細胞、皮膚由来中間葉幹細胞、羊膜由来中間葉幹細胞および胎盤由来中間葉幹細胞からなる群より選択されるいずれか１つ以上であってもよいが、これに限定されない。

【0064】

本発明において、前記のように選別された幹細胞では、成長因子の発現レベルが対照群に比べて増加したものであってもよく、前記成長因子は、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）であってもよいが、これに限定されるものではない。ここで、前記対照群は、任意の幹細胞におけるＶＥＧＦの発現レベルであるか、ＣＤ７１^ｌｏｗ表現型を示す幹細胞におけるＶＥＧＦの発現レベルであるか、あるいは幹細胞で発現するＶＥＧＦの発現レベルの平均値であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0065】

本発明において、前記ＶＥＧＦは、新しい血管の成長を促進するシグナルタンパク質で、血液循環が損傷して低酸素化された場合、血管生成および血管新生により細胞と組織に血液供給を回復させるメカニズムの一部である。通常、若くて（ｙｏｕｎｇ ａｇｅ）健康な幹細胞においてＶＥＧＦ発現が増加することが知られている。

【0066】

本発明において、前記のように選別された幹細胞は、インターロイキン６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６；ＩＬ－６）、インターロイキン８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ８；ＩＬ－８）、およびヘム酸化酵素１（ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ１；ＨＭＯＸ１）の少なくとも１つの発現レベルが対照群に比べて減少したものであってもよい。ここで、前記対照群は、任意の幹細胞においてＩＬ－６、ＩＬ－８、またはＨＭＯＸ１の発現レベルであるか、ＣＤ７１^ｈｉｇｈ表現型を示す幹細胞におけるＩＬ－６、ＩＬ－８、またはＨＭＯＸ１の発現レベルであるか、あるいは幹細胞で発現するＩＬ－６、ＩＬ－８、またはＨＭＯＸ１の発現レベルの平均値であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0067】

本発明において、前記ＩＬ－６は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、大食細胞、線維芽細胞など様々な細胞で生産され、抗炎症性（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインで、ＩＬ－６は、細胞周期を停止させ、骨髄細胞株で分化を誘導するだけでなく、神経系を含む主要生理システムにおいて多くの重要な役割を果たすことができる。前記ＩＬ－８は、急性炎症反応時、好中球の遊走活性化に関与する本質的な因子である。前記ＨＭＯＸ１は、ＩＬ－６およびＩＬ－８のような抗炎症性因子であって、抗酸化機能がある。ＨＭＯＸ１は、炎症性細胞で発現が増加するので、長い時間、免疫学者によって慢性炎症および自己免疫疾患を治療するためのターゲットとして見なされてきた（Ｎｉｃｏｌｅ Ｋ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｈａｅｍ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ１．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ２１，ｐａｇｅｓ４１１－４２５．２０２１）。

【0068】

本発明において、前記幹細胞および前記生物学的試料に関する記載は、先に記載されたものと重複し、明細書の過度の複雑性を避けるために、以下、その詳しい記載を省略する。

【0069】

本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明の選別方法で選別された幹細胞で、ＣＤ７１^ｌｏｗ発現パターンを示す幹細胞を有効成分として含む細胞治療剤に関する。

【0070】

本発明において、前記細胞治療剤とは、細胞と組織の機能を復元させるために、生きている自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞を体外で増殖または選別したり、その他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為により治療、診断および予防の目的で使用される医薬品をいう。米国は１９９３年から、韓国は２００２年から細胞治療剤を医薬品として管理している。前記細胞治療剤は、組織再生あるいは臓器機能回復のためのものであってもよい。

【0071】

本発明の細胞治療剤の投与経路は、目的組織に到達できる限り、何らかの一般的な経路を通して投与可能である。非経口投与、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与できるが、これに限定されない。

【0072】

本発明の細胞治療剤は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、ベータ細胞、血管細胞または肺細胞の再生または保護に用いられる。また、本発明の細胞治療剤は、肺疾患治療；肺疾患による炎症抑制または治療；肺組織再生；および肺組織線維症抑制からなる群より選択されたいずれか１つに有用であることを特徴とし、肺疾患による炎症反応および線維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を抑制したり好転させることができる。さらに、本発明の細胞治療剤は、心血管疾患の治療または軟骨再生用に使用可能である。これとともに、本発明の細胞治療剤は、免疫調節機能を増加させたり、免疫誘発性、免疫細胞侵入または免疫原性のうちの１つを低下させることができ、炎症反応を抑制させることができる。

【0073】

本発明の前記細胞治療剤は、標的細胞に移動できるようにする任意の装置によって投与されてもよい。

【0074】

本発明の細胞治療剤は、疾患の治療のための有効量で含まれる。前記治療のための有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）は、研究者、獣医師、医師またはその他の臨床によって考えられる組織系、動物またはヒトで生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量を意味するもので、これは治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量を含む。

【0075】

本発明の組成物に含まれる細胞治療剤は、所望の効果によって変化できることは当業者に自明である。そのため、最適な細胞治療剤の含有量は当業者によって容易に決定可能であり、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された他の成分の含有量、剤形の種類、および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物を含めた多様な因子によって調節可能である。前記要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を含むことができる。

【0076】

本発明において、前記幹細胞に関する記載は、先に記載されたものと重複し、明細書の過度の複雑性を避けるために、以下、その詳しい記載を省略する。

【0077】

本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明の選別方法で選別された幹細胞で、ＣＤ７１^ｌｏｗ発現パターンを示す幹細胞を有効成分として含む、免疫関連疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。

【0078】

本発明の前記幹細胞は、対照群に比べてＶＥＧＦ、またはＧＳＨの発現レベルが増加し、ＣＤ７１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、またはＨＭＯＸ１の発現レベルが減少する特徴によって免疫寛容性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を調節することができ、よって、免疫関連疾患を効果的に予防、改善または治療することができる（Ｊｉｓｕｎ Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉａ ＣＲＥＢ１－ＮＲＦ２ ｐａｔｈｗａｙ．Ｓｃｉ Ａｄｖ．２０２０ Ａｐｒ１５；６（１６）：ｅａｂａ１３３４．）（Ｅｕｉ Ｍａｎ Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｌｅｖｅｌｓ Ａｒｅ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ Ｍａｉｎｔａｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１８ Ｆｅｂ１３；１０（２）：６００－６１４．）。

【0079】

前記対照群の定義は、先に記載されたものと重複し、明細書の過度の複雑性を避けるために、以下、その詳しい記載を省略する。

【0080】

本発明において、前記「免疫関連疾患」は、多様な免疫細胞および炎症細胞の過度化された活性化および発現によって誘導される疾患で、例えば、自己免疫疾患；移植片対宿主疾患；臓器移植拒絶反応；喘息；アトピー；特発性肺線維化症；および急性または慢性の炎症疾患から構成された群より選択される１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0081】

また、本発明において、前記「自己免疫疾患」は、リウマチ性関節炎、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、アトピー皮膚炎、乾癬、円形脱毛症、喘息、クローン病、ベーチェット病、シェーグレン症侯群、ギラン・バレー症侯群、慢性甲状腺炎、多発性硬化症、多発性筋炎、強直性脊椎炎、線維組織炎および結節性多発性動脈炎から構成された群より選択される１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0082】

一方、本発明において、「予防」は、本発明の薬学的組成物を用いて疾患の症状を遮断したり、その症状を抑制または遅延させるすべての行為であれば制限なく含むことができる。

【0083】

また、本発明において、「治療」は、本発明の薬学的組成物を用いて疾患の症状が好転したり有利になるすべての行為であれば制限なく含むことができる。

【0084】

本発明において、前記薬学的組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学的組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とする。

【0085】

本発明の薬学的組成物はこれらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。本発明の薬学的組成物は、薬剤的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述のような薬学的に許容される担体と混合して多様に製造可能である。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。

【0086】

一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含むことができる。

【0087】

本発明による薬学的組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれるが、経口または非経口投下が好ましい。

【0088】

本発明において、「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学的組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与可能である。

【0089】

本発明の薬学的組成物は、使用された特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含んだ様々な要因によって多様に変化可能であり、前記薬学的組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、１日０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明による医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化可能である。

【0090】

本発明において、前記幹細胞に関する記載は、先に記載されたものと重複し、明細書の過度の複雑性を避けるために、以下、その詳しい記載を省略する。

【発明の効果】

【0091】

本発明では、細胞治療剤として使用されるのに適した高品質の幹細胞で、例えば、ＶＥＧＦ、またはＧＳＨ遺伝子の発現レベルが増加し、ＣＤ７１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、またはＨＭＯＸ１遺伝子の発現レベルが減少した幹細胞を選別できる方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0092】

【図1】実験例１で中間葉幹細胞に酸化ストレスを与える場合、ＣＤ７１が反応することを示す図である。

【図2】実験例２でＣＤ７１が低く発現する中間葉幹細胞とＣＤ７１が高く発現する中間葉幹細胞の細胞サイズ、および顆粒の様子を比較したことを示す図である。

【図3】実験例３でＣＤ７１が低く発現する中間葉幹細胞とＣＤ７１が高く発現する中間葉幹細胞のＶＥＧＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＨＭＯＸ１遺伝子の発現量を比較したことを示す図である。

【図4】実験例４でＣＤ７１が低く発現する中間葉幹細胞とＣＤ７１が高く発現する中間葉幹細胞のコロニー形成能力を比較したことを示す図である。

【0093】

【図5】実験例５でＹｏｕｎｇ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ４）、Ｍｉｄｄｌｅ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ８）、およびＯｌｄ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ１４）に対して老化程度によって細胞の活性が異なることを確認した図である。

【図6】実験例５でＹｏｕｎｇ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ４）およびＯｌｄ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ１４）に対してＣＤ７１遺伝子の発現量を比較したことを示す図である。

【図7】実験例６でＣＤ７１を低く発現し、ＧＳＨを高く発現する幹細胞（ＣＤ７１^ＬＯＷＭＳＣ）の特発性肺線維化症の治療効果を示す図である。

【図8】実験例６でＣＤ７１を低く発現し、ＧＳＨを高く発現する幹細胞（ＣＤ７１^ＬＯＷＭＳＣ）の抗線維化および抗炎症効果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0094】

細胞に酸化ストレスを与えた後、フローサイトメトリー分析を実施した結果、ＧＳＨレベル（ＦＲ）とＣＤ７１の発現レベル（Ｃｏｍｐ Ｒ１－Ａ）によって２つの細胞群集に分けられるが、ＣＤ７１の発現レベルが低い場合、ＧＳＨレベルが高いことから、ＭＳＣのＣＤ７１の発現レベルが低い場合、高品質のＭＳＣ治療剤として判断できることが分かった。

【実施例】

【0095】

以下、本発明を下記の実施例によって詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。

【0096】

実施例
［実験例１］中間葉幹細胞の品質確認のためのフローサイトメトリー分析
中間葉幹細胞（ＭＳＣ）の品質を確認するために、細胞に酸化ストレスを与えて反応するマーカー候補群を同定した。具体的には、ＭＳＣに酸化ストレスを誘発できる試薬を処理し、ミトコンドリアにおけるＧＳＨレベルを測定できるｍｉｔｏＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを用いて染色させた。以後、染色された細胞を引き離した後、マーカー候補群のうちＣＤ７１マーカーを染色させた後、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施して、ＧＳＨレベルおよび各マーカーの発現レベルを確認した（ＢＤ Ｌｙｏｐｌａｔｅ^ＴＭ、ｃａｔ．＃５６０７４７）。その結果を図１に示した。

【0097】

図１に示すように、細胞に酸化ストレスを与えた後、フローサイトメトリー分析を実施した結果、ＧＳＨレベル（ＦＲ）とＣＤ７１の発現レベル（Ｃｏｍｐ Ｒ１－Ａ）によって２つの細胞群集に分けられるが、ＣＤ７１の発現レベルが低い場合、ＧＳＨレベルが高いことから、ＭＳＣのＣＤ７１の発現レベルが低い場合、高品質のＭＳＣ治療剤として判断できることが分かった。

【0098】

［実験例２］ＣＤ７１の発現量が低い細胞における細胞サイズ、および顆粒の様子分析
本発明の属する分野における通常の技術者に一般的に幹細胞のサイズが小さく、細胞内顆粒（ｇｒａｎｕｌｅ）が少ないほど「高品質幹細胞」と認められる。前記の「高品質」とは、幹細胞は効率が高く、細胞治療剤としての効果が大きい細胞という意味である。したがって、ＣＤ７１の発現レベルが低いＭＳＣと細胞のサイズ、および細胞顆粒間の関連性があるかを確認した。このために、ＭＳＣを対象にＣＤ７１の発現様相を分析して、フローサイトメトリー分析の対象になる細胞のうちＣＤ７１が高く発現する上位３０％（ＣＤ７１＿ｈｉｇｈ）中間葉幹細胞とＣＤ７１が低く発現する下位３０％（ＣＤ７１＿ｌｏｗ）中間葉幹細胞とを区分し、２つの集団における細胞のサイズ、および細胞顆粒の程度を比較して、その結果を図２に示した。

【0099】

図２に示すように、フローサイトメトリー分析の対象になる細胞のうちＣＤ７１が高く発現する上位３０％（ＣＤ７１＿ｈｉｇｈ）中間葉幹細胞に比べて、ＣＤ７１が低く発現する下位３０％（ＣＤ７１＿ｌｏｗ）中間葉幹細胞において平均細胞サイズが小さく、細胞内顆粒が少ないことを確認することができた。

【0100】

これにより、ＣＤ７１が低く発現する中間葉幹細胞の場合、細胞サイズが小さく、細胞内顆粒が少ないことを確認して、幹細胞の品質が高いと判別することができた。

【0101】

［実験例３］ＣＤ７１の発現量が低い細胞の主要タンパク質マーカー発現量の変化分析
ＣＤ７１が低く発現する中間葉幹細胞の品質を確認するために、前記実験例１でのフローサイトメトリー分析の結果を定量的に分析した。具体的には、フローサイトメトリー分析の対象になる細胞のうちＣＤ７１が高く発現する上位３０％（ＣＤ７１＿ｈｉｇｈ）中間葉幹細胞とＣＤ７１が低く発現する下位３０％（ＣＤ７１＿ｌｏｗ）中間葉幹細胞とを区分し、２つの集団においてＶＥＧＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＨＭＯＸ１の発現量を比較して、その結果を図３に示した。

【0102】

図３に示すように、フローサイトメトリー分析の対象になる細胞のうちＣＤ７１が高く発現する上位３０％（ＣＤ７１＿ｈｉｇｈ）中間葉幹細胞に比べて、ＣＤ７１が低く発現する下位３０％（ＣＤ７１＿ｌｏｗ）中間葉幹細胞でＶＥＧＦの発現量は有意に増加し、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＨＭＯＸ１の発現量は有意に減少することを確認することができた。

【0103】

本発明の属する分野における通常の技術者に、一般的に、ＶＥＧＦは、若くて健康な細胞で発現が増加することが知られており、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＨＭＯＸ１は、細胞が老化するほど発現が増加することが知られている。

【0104】

したがって、これにより、ＣＤ７１が低く発現する中間葉幹細胞の場合、ＶＥＧＦの発現が増加し、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＨＭＯＸ１の発現が減少したことを確認して、幹細胞の品質が高いと判別することができた。

【0105】

［実験例４］ＣＤ７１の発現量が低い細胞のコロニー形成能分析
幹細胞固有の自己複製能力がよく保存された若くて健康な幹細胞の場合、コロニー形成能力（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）に優れていることが知られている。したがって、ＣＤ７１が低く発現する中間葉幹細胞の品質を確認するために、ＣＤ７１が低く発現する中間葉幹細胞（ＣＤ７１＿ｌｏｗ）と高く発現する中間葉幹細胞（ＣＤ７１＿ｈｉｇｈ）のコロニー形成能を比較して、その結果を図４に示した。

【0106】

図４に示すように、フローサイトメトリー分析の対象になる細胞のうちＣＤ７１が高く発現する上位３０％（ＣＤ７１＿ｈｉｇｈ）中間葉幹細胞に比べて、ＣＤ７１が低く発現する下位３０％（ＣＤ７１＿ｌｏｗ）中間葉幹細胞でコロニー形成能が約２倍増加したことが分かり、これによって、これら幹細胞の品質が高いと判別することができた。

【0107】

［実験例５］細胞の老化程度によるＣＤ７１の発現量分析
幹細胞が老化するほど細胞の幹細胞能および治療効能が減少するので、ＭＳＣ継代（ｐａｓｓａｇｅ）回数に応じてＹｏｕｎｇ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ４）、Ｍｉｄｄｌｅ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ８）、およびＯｌｄ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ１４）に区分した。区分された細胞に対して細胞老化時に蓄積されると知られたＬｉｐｏｆｕｓｃｉｎ（ＦＩＴＣ＿ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅ）の測定により、老化程度によって細胞の活性が異なることを確認した。その結果を図５に示した。

【0108】

前記Ｙｏｕｎｇ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ４）およびＯｌｄ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ１４）に対してＣＤ７１マーカータンパク質の発現量を分析して、その結果を図６に示した。

【0109】

図６に示すように、ＣＤ７１は、Ｙｏｕｎｇ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ４）に比べて、Ｏｌｄ ｐａｓｓａｇｅ幹細胞（Ｐ１４）で著しく発現が増加した。これによって、ＣＤ７１マーカーが若くて健康な高品質の幹細胞を選別するためのマーカーになることを確認した。

【0110】

［実験例６］ＣＤ７１の発現量分析
前記実験例１でＣＤ７１の発現レベルが低い場合、ＧＳＨレベルが高いことを確認したことから、ＣＤ７１を低く発現し、ＧＳＨを高く発現する幹細胞（ＣＤ７１^ＬＯＷＭＳＣ）を用いて特発性肺線維化症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）での治療効果を確認した結果を図７と図８に示した。

【0111】

図７に示すように、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ誘導後に生じた病変組織に比べて、ＢｌｅｏｍｙｃｉｎとＣＤ７１^ＬＯＷＭＳＣを一緒に処理した時、組織の炎症細胞浸潤が著しく減少したことが分かった。

【0112】

また、図８に示すように、肺組織のｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ分析の結果、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ誘導後に生じた病変組織に比べて、ＢｌｅｏｍｙｃｉｎとＣＤ７１^ＬＯＷＭＳＣを一緒に処理した時、線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）マーカーであるａＳＭＡ、およびｃｏｌ１ａ１と炎症サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であるＩＬ－６、およびＩＬ－８の発現が著しく減少し、抗炎症サイトカイン（ａｎｔｉ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であるＩＬ－１０の発現量は増加した。これにより、ＣＤ７１の発現レベルが低いＣＤ７１^ＬＯＷＭＳＣ細胞の抗線維化および抗炎症効果を確認することができた。

【0113】

上記のように、本発明により幹細胞の品質を評価して、ＣＤ７１が低く発現する中間葉幹細胞は、高く発現する中間葉幹細胞より幹細胞の品質が高いと判別可能で、ＣＤ７１が低く発現する中間葉幹細胞を選別して治療に用いる場合、さらに向上した幹細胞の治療効果があることを確認することができた。

【産業上の利用可能性】

【0114】

中間葉幹細胞を用いた細胞治療技術は、高純度、高品質の細胞のみを用いて適用することが重要であり、このような治療技術は、多様な炎症性疾患のような難治性疾患の治療を試みている。したがって、中間葉幹細胞治療剤に適用するための中間葉幹細胞の性能を評価するためのマーカーの必要性が台頭しているのが現状である。

【0115】

本発明の高品質の幹細胞選別用細胞表面マーカータンパク質、および前記マーカータンパク質を用いた高品質の幹細胞の選別方法は、高品質の細胞のみを効果的に選別可能なため、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶反応、喘息、アトピー、特発性肺線維化症、急性炎症、および慢性炎症など免疫関連疾患の予防または治療のために活発に利用可能になると期待される。

【0116】

配列リストフリーテキスト
配列リスト１：ＣＤ７１（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ７１）タンパク質。

【0117】

ＭＭＤＱＡＲＳＡＦＳ ＮＬＦＧＧＥＰＬＳＹ ＴＲＦＳＬＡＲＱＶＤ ＧＤＮＳＨＶＥＭＫＬ ＡＶＤＥＥＥＮＡＤＮ ＮＴＫＡＮＶＴＫＰＫ ＲＣＳＧＳＩＣＹＧＴ ＩＡＶＩＶＦＦＬＩＧ ＦＭＩＧＹＬＧＹＣＫ ＧＶＥＰＫＴＥＣＥＲ ＬＡＧＴＥＳＰＶＲＥ ＥＰＧＥＤＦＰＡＡＲ ＲＬＹＷＤＤＬＫＲＫ ＬＳＥＫＬＤＳＴＤＦ ＴＧＴＩＫＬＬＮＥＮ ＳＹＶＰＲＥＡＧＳＱ ＫＤＥＮＬＡＬＹＶＥ ＮＱＦＲＥＦＫＬＳＫ ＶＷＲＤＱＨＦＶＫＩ ＱＶＫＤＳＡＱＮＳＶ ＩＩＶＤＫＮＧＲＬＶ ＹＬＶＥＮＰＧＧＹＶ ＡＹＳＫＡＡＴＶＴＧ ＫＬＶＨＡＮＦＧＴＫ ＫＤＦＥＤＬＹＴＰＶ ＮＧＳＩＶＩＶＲＡＧ ＫＩＴＦＡＥＫＶＡＮ ＡＥＳＬＮＡＩＧＶＬ ＩＹＭＤＱＴＫＦＰＩ ＶＮＡＥＬＳＦＦＧＨ ＡＨＬＧＴＧＤＰＹＴ ＰＧＦＰＳＦＮＨＴＱ ＦＰＰＳＲＳＳＧＬＰ ＮＩＰＶＱＴＩＳＲＡ ＡＡＥＫＬＦＧＮＭＥ ＧＤＣＰＳＤＷＫＴＤ ＳＴＣＲＭＶＴＳＥＳ ＫＮＶＫＬＴＶＳＮＶ ＬＫＥＩＫＩＬＮＩＦ ＧＶＩＫＧＦＶＥＰＤ ＨＹＶＶＶＧＡＱＲＤ ＡＷＧＰＧＡＡＫＳＧ ＶＧＴＡＬＬＬＫＬＡ ＱＭＦＳＤＭＶＬＫＤ ＧＦＱＰＳＲＳＩＩＦ ＡＳＷＳＡＧＤＦＧＳ ＶＧＡＴＥＷＬＥＧＹ ＬＳＳＬＨＬＫＡＦＴ ＹＩＮＬＤＫＡＶＬＧ ＴＳＮＦＫＶＳＡＳＰ ＬＬＹＴＬＩＥＫＴＭ ＱＮＶＫＨＰＶＴＧＱ ＦＬＹＱＤＳＮＷＡＳ ＫＶＥＫＬＴＬＤＮＡ ＡＦＰＦＬＡＹＳＧＩ ＰＡＶＳＦＣＦＣＥＤ ＴＤＹＰＹＬＧＴＴＭ ＤＴＹＫＥＬＩＥＲＩ ＰＥＬＮＫＶＡＲＡＡ ＡＥＶＡＧＱＦＶＩＫ ＬＴＨＤＶＥＬＮＬＤ ＹＥＲＹＮＳＱＬＬＳ ＦＶＲＤＬＮＱＹＲＡ ＤＩＫＥＭＧＬＳＬＱ ＷＬＹＳＡＲＧＤＦＦ ＲＡＴＳＲＬＴＴＤＦ ＧＮＡＥＫＴＤＲＦＶ ＭＫＫＬＮＤＲＶＭＲ ＶＥＹＨＦＬＳＰＹＶ ＳＰＫＥＳＰＦＲＨＶ ＦＷＧＳＧＳＨＴＬＰ ＡＬＬＥＮＬＫＬＲＫ ＱＮＮＧＡＦＮＥＴＬ ＦＲＮＱＬＡＬＡＴＷ ＴＩＱＧＡＡＮＡＬＳ ＧＤＶＷＤＩＤＮＥＦ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】