特表 2024-500879 双性イオン性脂質ナノ粒子組成物およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-10

(54)【発明の名称】双性イオン性脂質ナノ粒子組成物およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20231227BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20231227BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 35/76 20150101ALN20231227BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7088

A61K9/51

A61K47/34

A61K47/24

A61K31/713

A61K31/7105

A61K47/28

A61K48/00

A61P37/04

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537964

(86)(22)【出願日】2021-12-21

(85)【翻訳文提出日】2023-08-10

(86)【国際出願番号】 US2021064639

(87)【国際公開番号】W WO2022140404

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】63/129,343

(32)【優先日】2020-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508298488

【氏名又は名称】コーネル ユニヴァーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】スージン・ルオジョン

(72)【発明者】

【氏名】ゼファン・ユエン

(72)【発明者】

【氏名】シャオイー・ジァン

(72)【発明者】

【氏名】シャオラン・フー

(72)【発明者】

【氏名】ショーン・ベイリー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA65

4C076AA95

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE17

4C076EE41

4C084AA13

4C084NA13

4C084ZB09

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086NA13

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087NA13

4C087ZB09

(57)【要約】

（ｉ）脂質部分が双性イオン性ポリマーに共有結合している少なくとも１つの双性イオン性ポリマー含有脂質；（ｉｉ）荷電脂質および非荷電脂質から選択されるが、ポリマーに結合していない少なくとも１つの非カチオン性脂質；（ｉｉｉ）少なくとも１つのカチオン性またはイオン化可能脂質；および（ｉｖ）少なくとも１つの治療物質、ならびに場合により（ｖ）コレステロールまたはその誘導体を含む、脂質ナノ粒子組成物。本明細書にはまた、治療物質を対象に送達する方法が記載されており、この方法は、上記の脂質ナノ粒子組成物を対象に投与することを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂質ナノ粒子組成物であって：
（ｉ）脂質部分が双性イオン性ポリマーに共有結合している、少なくとも１つの双性イオン性ポリマー含有脂質；
（ｉｉ）荷電脂質および非荷電脂質から選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質であって、ポリマーに結合していない、非カチオン性脂質；
（ｉｉｉ）第二級、第三級、または第四級アミノ基を含む少なくとも１つのカチオン性またはイオン化可能脂質、および
（ｉｖ）少なくとも１つの治療物質
を含む、脂質ナノ粒子組成物。

【請求項2】

構成要素（ｉ）の前記脂質部分がジアシルグリセリドである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

構成要素（ｉ）がポリアルキレンオキシドセグメントを含まない、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

構成要素（ｉ）の前記双性イオン性ポリマーが、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）、ポリ（ホスホベタイン）、ポリ（ホスファチジルコリン）、グルタミン酸－リジン（ＥＫ）含有ポリペプチド、ポリ（トリメチルアミンＮ－オキシド）ポリマーおよびポリ（双性イオン性ホスファチジルセリン）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

構成要素（ｉ）の前記双性イオン性ポリマーがベタインポリマーである、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記ベタインポリマーがポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルホベタイン）またはポリ（ホスホベタイン）ポリマーである、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

構成要素（ｉｉ）の前記非カチオン性脂質が双性イオン性部分を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記双性イオン性部分が、ホスホベタイン、ホスファチジルコリン、カルボキシベタイン、スルホベタイン、トリメチルアミンＮ－オキシド、グルタミン酸－リジン（ＥＫ）含有ペプチド、または双性イオン性ホスファチジルセリン部分からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチル－ホスホエタノールアミン、１６－Ｏ－ジメチル－ホスホエタノールアミン、１８－１－ｔｒａｎｓ－ホスホエタノールアミン、１－ステアロイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎグリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

構成要素（ｉｉ）がポリアルキレンオキシドセグメントを含まない、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

構成要素（ｉｉ）の前記非カチオン性脂質がリン脂質である、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記リン脂質がホスファチジルセリン脂質である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

構成要素（ｉｉｉ）の前記カチオン性またはイオン化可能脂質が、第二級、第三級または第四級アミノ基を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

構成要素（ｉｉｉ）の前記カチオン性またはイオン化可能脂質が、生理的条件下で負に荷電する官能基と共に、第二級、第三級、または第四級基を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項15】

前記カチオン性またはイオン化可能な脂質が：

【化1】

［式中、
Ｒ_１／Ｒ_２＝Ｈまたはアルキル基であり、前記アルキル基は飽和、不飽和、分枝鎖、および／または非分枝鎖であることができ、限定されるものではないが、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦを含む、１つまたはそれ以上のヘテロ原子をさらに含むことができ；
Ｌは、ＮとＡとの間に共有結合性リンカー基を含み、前記共有結合性リンカー基は、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨ_２ＣＨＣｌＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＯＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＳＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＳＳＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_２－、Ｃ、Ｈのうちの１つまたはそれ以上を含んでいてもよく、限定されるものではないが、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦを含む、１つまたはそれ以上のヘテロ原子をさらに含むことができ；
Ａ－（Ｘ）ｎは、特定のｐＨ条件下で負に荷電する官能基であり、以下を含むことができる：
（ｉ）Ａ（Ｘ）ｎは、カルボン酸基（Ａ＝－ＣＯＯＨおよびｎ＝０）または
（ｉｉ）Ａ（Ｘ）ｎはリン酸基であり、ここでＡ＝

【化2】

およびｎ＝１であり、Ｘ＝Ｈ、または飽和もしくは不飽和、分枝鎖もしくは非分枝鎖、全炭素、または限定されるものではないが、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦ等のヘテロ原子を含むアルキル基であるか、または
（ｉｉｉ）Ａ（Ｘ）ｎは、スルホン酸基であり、ここで、Ａ＝

【化3】

およびｎ＝０であり、
（ｉｖ）Ａ（Ｘ）ｎは、スルホンアミド基であり、ここで、Ａ＝

【化4】

およびｎ＝１であり、Ｘ＝Ｈ、または飽和もしくは不飽和、分枝鎖もしくは非分枝鎖、全炭素および水素、または限定されるものではないが、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦ等のヘテロ原子を含むアルキル基である］
を含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記官能基が、以下：

【化5】

からなる群から選択され、
ｎ＝１～１０である、請求項１４に記載の組成物。

【請求項17】

構成要素（ｉｉｉ）の前記カチオン性またはイオン化可能脂質が、ポリアルキレンオキシドセグメントを含まない、請求項１に記載の組成物。

【請求項18】

前記脂質ナノ粒子組成物が：（ｖ）コレステロールまたはその誘導体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項19】

構成要素（ｉｖ）の前記治療物質が核酸分子である、請求項１に記載の組成物。

【請求項20】

前記核酸分子がＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記ＲＮＡがウイルスｍＲＮＡである、請求項２０に記載の組成物。

【請求項23】

前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、およびその組合せからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。

【請求項24】

前記治療物質がウイルスのスパイクタンパク質である、請求項２０に記載の組成物。

【請求項25】

対象に治療物質を送達する方法であって：
（ｉ）脂質部分が双性イオン性ポリマーに共有結合している少なくとも１つの双性イオン性ポリマー含有脂質；
（ｉｉ）荷電脂質および非荷電脂質から選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質であって、ポリマーに結合していない、非カチオン性脂質；
（ｉｉｉ）第二級、第三級、または第四級アミノ基を含む少なくとも１つのカチオン性またはイオン化可能脂質、および
（ｉｖ）少なくとも１つの治療物質
を含む脂質ナノ粒子組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項26】

前記脂質ナノ粒子組成物が前記対象の細胞に送達される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記治療物質が核酸分子であり、その投与により前記対象の遺伝子治療がもたらされる、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記治療物質が核酸分子であり、その投与が前記対象のワクチン接種をもたらす、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

構成要素（ｉ）の前記脂質部分がジアシルグリセリドである、請求項２５に記載の方法。

【請求項30】

構成要素（ｉ）がポリアルキレンオキシドセグメントを含まない、請求項２５に記載の方法。

【請求項31】

構成要素（ｉ）の前記双性イオン性ポリマーが、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）、ポリ（双性イオン性ホスホベタイン）、グルタミン酸－リジン（ＥＫ）含有ポリペプチド、ポリ（ホスファチジルコリン）、およびポリ（トリメチルアミンＮ－オキシド）ポリマーからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項32】

構成要素（ｉ）の前記双性イオン性ポリマーがベタインポリマーである、請求項２５に記載の方法。

【請求項33】

前記ベタインポリマーがカルボキシベタインポリマーである、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

構成要素（ｉｉ）の前記非カチオン性脂質が双性イオン性部分を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項35】

前記双性イオン性部分が、ホスホベタイン、ホスファチジルコリン、カルボキシベタイン、スルホベタイン、トリメチルアミンＮ－オキシド、グルタミン酸－リジン（ＥＫ）含有ペプチド、または双性イオン性ホスファチジルセリン部分からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチル－ホスホエタノールアミン、１６－Ｏ－ジメチル－ホスホエタノールアミン、１８－１－ｔｒａｎｓ－ホスホエタノールアミン、１－ステアロイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項37】

構成要素（ｉｉ）がポリアルキレンオキシドセグメントを含まない、請求項２５に記載の方法。

【請求項38】

構成要素（ｉｉ）の前記非カチオン性脂質がリン脂質である、請求項２５に記載の方法。

【請求項39】

前記リン脂質がホスファチジルセリン脂質である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記カチオン性またはイオン化可能脂質が第二級、第三級または第四級アミノ基を有する、請求項２５に記載の方法。

【請求項41】

前記カチオン性またはイオン化可能脂質がポリアルキレンオキシドセグメントを含まない、請求項２５に記載の方法。

【請求項42】

前記脂質ナノ粒子組成物が：（ｖ）コレステロールまたはその誘導体をさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項43】

前記治療物質が核酸分子である、請求項２５に記載の方法。

【請求項44】

前記核酸分子がＲＮＡである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ウイルスｍＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、およびその組合せからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

前記治療物質がウイルスのスパイクタンパク質である、請求項２５に記載の方法。

【請求項48】

脂質組成物であって、生理的条件下で負に荷電する官能基と共に、第二級、第三級、または第四級アミン基に結合した脂質部分を含む、脂質組成物。

【請求項49】

請求項１５に記載の脂質部分を含む、脂質組成物。

【請求項50】

請求項１６に記載の脂質部分を含む、脂質組成物。

【請求項51】

対象の二次リンパ系臓器（ＳＬＯ）への治療薬の標的化送達のための方法であって：
ホスホセリン含有脂質（ＰＳ）をさらに含む請求項１～２４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子組成物を得ること；および
有効量の前記脂質ナノ粒子組成物を前記対象に投与すること；を含み、
前記治療薬が、前記対象の前記二次リンパ器官（ＳＬＯ）に標的化されている、方法。

【請求項52】

前記治療剤が核酸分子を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記ホスホセリン含有脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、天然に存在するＰＳ－脂質、Ｌ－α－ホスファチジルセリン、および／または双性イオン性ＰＳ－脂質からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

前記ＳＬＯが脾臓およびリンパ節から選択される、請求項５１に記載の方法。

【請求項55】

前記治療剤の標的化送達が、癌免疫療法、自己免疫疾患免疫療法、ワクチン接種および／または遺伝子編集を実行する、請求項５１に記載の方法。

【請求項56】

対象のマクロファージへの治療剤の標的化送達のための方法であって：
ホスホセリン含有脂質（ＰＳ）をさらに含む請求項１～２４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子組成物を得ること；および
有効量の前記脂質ナノ粒子組成物を前記対象に投与することを含み；
前記治療剤が、前記対象のマクロファージに標的化されている、方法。

【請求項57】

前記治療剤が核酸分子を含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記ホスホセリン含有脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、天然に存在するＰＳ－脂質、Ｌ－α－ホスファチジルセリン、および／または双性イオン性ＰＳ－脂質からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。

【請求項59】

前記治療剤が前記対象のマクロファージに標的化され、それにより前記治療薬が脾臓および／またはリンパ節にさらに標的化されている、請求項５６に記載の方法。

【請求項60】

前記治療剤の前記標的化送達が、癌免疫療法、自己免疫疾患免疫療法、ワクチン接種、および／または遺伝子編集を実行する、請求項５６に記載の方法。

【請求項61】

対象の二次リンパ系器官（ＳＬＯ）への治療薬の標的化送達のための方法であって：
ホスホセリン含有脂質（ＰＳ）をさらに含む脂質ナノ粒子組成物を得ること；および
前記対象に有効量の前記脂質ナノ粒子組成物を投与すること；を含み、
前記治療剤が、前記対象の二次リンパ器官（ＳＬＯ）に標的化されている、方法。

【請求項62】

対象の二次リンパ系器官（ＳＬＯ）への治療剤の標的化送達のための方法であって：
ホスホセリン含有脂質（ＰＳ）をさらに含む請求項４８～５０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子組成物を得ること；および
有効量の前記脂質ナノ粒子組成物を前記対象に投与することを含み；
前記治療剤が、前記対象の二次リンパ器官（ＳＬＯ）に標的化されている、方法。

【請求項63】

対象のマクロファージに治療剤を標的化送達するための方法であって：
ホスホセリン含有脂質（ＰＳ）をさらに含む脂質ナノ粒子組成物を得ること；および
前記対象に有効量の前記脂質ナノ粒子組成物を投与することを含み；
前記治療剤が、対象のマクロファージに標的化されている、方法。

【請求項64】

対象のマクロファージに治療薬を標的化送達するための方法であって：
ホスホセリン含有脂質（ＰＳ）をさらに含む請求項４８～５０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子組成物を得ること；および
有効量の前記脂質ナノ粒子組成物を前記対象に投与することを含み；
前記治療剤が、前記対象のマクロファージに標的化されている、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年１２月２２日に出願された米国仮出願第６３／１２９，３４３号からの優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0002】

政府支援
本発明は、全米科学財団から授与された助成金番号２００２９４０および２１０３２９５の政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

【0003】

本発明は一般的に、核酸等の治療剤の封入および送達のための双性イオン性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤に関する。本発明は、より具体的には、遺伝子治療等により様々な疾患または障害を治療するための治療剤の送達のため、または対象にワクチン接種するための、そのようなＬＮＰ製剤、特にその非ＰＥＧ化バージョンの使用に関する。

【背景技術】

【0004】

ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ等の核酸のｉｎ ｖｉｖｏ送達は、ワクチン接種、酵素補充療法、および遺伝性疾患の治療に革命をもたらす可能性を有する。ウイルスベクターと比較して、脂質ナノ粒子送達プラットフォームは安全性の問題が少ないと考えられている。２０１８年に最初のＬＮＰ－ｓｉＲＮＡ薬剤がＦＤＡに承認されて以来、ますます多くの脂質ナノ粒子が開発され、臨床試験に移行している。ＬＮＰは通常、イオン化可能カチオン性脂質、リン脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質の４つの構成要素からなる。中でもＰＥＧ－脂質は、ＬＮＰ構造を安定化し保護するために一般的に使用されている。

【0005】

当初、ＰＥＧは免疫学的に不活性であると推定されていたが、現在では、脂質またはタンパク質への結合が、ハプテン効果による免疫反応の新たな原因となり、抗ＰＥＧ抗体（Ａｂｓ）を引き起こすことが知られている。症例によっては、抗タンパク質Ａｂではなく抗ＰＥＧ Ａｂが臨床的問題の主な原因であることを強調する臨床報告が増えている。ＰＥＧ化ウリカーゼ製剤であるＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ（Ｋｒｙｓｔｅｘｘａ）の典型的な例では、この薬剤を投与された難治性慢性痛風患者の４０％超が高レベルの抗ＰＥＧ Ａｂ反応に苦しみ、その結果、この治療に対して非応答性になった。

【0006】

抗ＰＥＧ抗体によって、市販されているいくつかのＰＥＧコンジュゲートタンパク質の有効性が損なわれている。誘導された抗ＰＥＧ抗体に加えて、既存の抗ＰＥＧ抗体も全てのＰＥＧ化薬剤にとって重要である。急性冠症候群患者を対象とした臨床試験では、ＰＥＧ化ＲＮＡアプタマーであるペグニバコギンの初回投与後に重篤なアレルギー反応が起こった。ドキソルビシンのＰＥＧ化リポソーム製剤であるＤｏｘｉｌ（登録商標）も、初回の注射時に一部の患者で直ちに過敏反応が見られたことが報告されている。したがって、従来のＬＮＰにおける問題のある構成要素を置換し、改善された機能を有するバイオ医薬品を提供することができる新しい脂質組成物を提供する必要性がまだ満たされていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、核酸等の治療剤を対象に送達するための新規の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物に最も関する。本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、好都合に、低い免疫原性、長い循環能力、および標的化能力を有する。ＬＮＰ組成物はまた、特定の細胞または細胞成分に結合するための標的化剤で機能化される。

【課題を解決するための手段】

【0008】

第１の態様において、本開示は、少なくとも以下の構成要素を含むＬＮＰ組成物に関する：（ｉ）脂質部分が双性イオン性ポリマーに共有結合している少なくとも１つの双性イオン性ポリマー含有脂質；（ｉｉ）ポリマーに結合していない荷電脂質および非荷電脂質から選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質；（ｉｉｉ）第二級、第三級、または第四級アミノ基を有する少なくとも１つのカチオン性またはイオン化可能脂質；および（ｉｖ）少なくとも１つの治療物質。第１の実施形態のセットにおいて、構成要素（ｉ）の脂質部分は、ジアシルグリセロール（ジアシルグリセリド）である。第２の実施形態のセットにおいて、構成要素（ｉ）は、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）セグメントを含まない。第３の実施形態のセットにおいて、構成要素（ｉ）の双性イオン性ポリマーは、ベタインポリマー、またはより具体的には、カルボキシベタインポリマーである。第４の実施形態のセットにおいて、構成要素（ｉｉ）の非カチオン性脂質は、双性イオン部分を含む。第５の実施形態のセットにおいて、構成要素（ｉｉ）は、ポリアルキレンオキシドセグメントを含まない。第６の実施形態のセットにおいて、構成要素（ｉｉ）の非カチオン性脂質は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）脂質等のリン脂質である。第７の実施形態のセットにおいて、カチオン性またはイオン化可能脂質は、第二級、第三級または第四級の基を有する。第８の実施形態のセットにおいて、カチオン性またはイオン化可能脂質は、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）セグメントを含まない。第９の実施形態のセットにおいて、脂質ナノ粒子組成物は：（ｖ）コレステロールまたはその誘導体をさらに含む。第１０の実施形態のセットにおいて、治療物質は、ＲＮＡ、より具体的にはｍＲＮＡ、より具体的にはウイルスｍＲＮＡ、より具体的には直鎖状または環状ｍＲＮＡ等の核酸分子である。注目すべきことに、第１～第１０の実施形態のいずれかを組み合わせて、本発明のＬＮＰ組成物をもたらすことができる。

【0009】

他の態様において、本開示は、上述の第１～第１０の実施形態のいずれかを含む、上述の脂質ナノ粒子組成物のいずれかを対象に投与することによって、治療物質を対象に送達する方法に関する。第１の実施形態のセットでは、脂質ナノ粒子組成物は対象の細胞に送達される。第２の実施形態のセットでは、治療物質は核酸分子であり、その投与により対象の遺伝子治療がもたらされる。第３の実施形態のセットにおいて、治療物質は核酸分子であり、その投与は対象のワクチン接種をもたらす。

【0010】

他の態様において、本開示は、生理的条件下で負に荷電する官能基と共に、第二級、第三級、または第四級アミン基に結合した脂質部分を含む脂質組成物に関する。この脂質部分は

【化1】

であってよく、
式中、
Ｒ１／Ｒ２＝Ｈまたはアルキル基である。アルキルは、飽和または不飽和、分枝鎖または非分枝鎖、全炭素および水素、または限定されるものではないが、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦ等のヘテロ原子を含むことができる。
Ｌは、ＮとＡとの間の共有結合リンカー基である。リンカーは、全炭素および水素であるか、または限定されるものではないがＮ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、ＢｒおよびＦ等のヘテロ原子を含むことができる。Ｌの構造は、限定されるものではないが：－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨ_２ＣＨＣｌＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＯＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＳＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＳＳＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_２－によって例示される。
Ａ－（Ｘ）ｎは、生理的条件下で負に荷電する官能基である。構造は、限定されるものではないが：
（ｉ）Ａ（Ｘ）ｎは、カルボン酸基（Ａ＝－ＣＯＯＨおよびｎ＝０）または

【0011】

（ｉｉ）Ａ（Ｘ）ｎは、リン酸基であり、ここで、Ａ＝

【化2】

およびｎ＝１である。Ｘ＝Ｈ、または飽和もしくは不飽和、分枝鎖もしくは非分枝鎖、全炭素、または限定されるものではないがＮ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ等のヘテロ原子を含むアルキル基であるか、または

【0012】

（ｉｉｉ）Ａ（Ｘ）ｎは、スルホン酸基であり、ここで、Ａ＝

【化3】

およびｎ＝０であり、

【0013】

（ｉｖ）Ａ（Ｘ）ｎは、スルホンアミド基であり、ここで、Ａ＝

【化4】

およびｎ＝１であり、Ｘ＝Ｈ、または飽和もしくは不飽和、分枝鎖もしくは非分枝鎖、全炭素および水素、または限定されるものではないが、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦ等のヘテロ原子を含むアルキル基である。

【0014】

これらのイオン化可能脂質の例示的な構造は

【化5】

であり、ここでｎ＝１～１０である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】本発明の双性イオン性ポリマー含有脂質であるＤＭＧ－ＰＣＢ（またはＰＣＢ脂質）の化学構造および^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図2】ＰＣＢ脂質を含むＬＮＰ（またはＰＣＢ－ＬＮＰ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価。（ａ）代表的なＰＣＢ－ＬＮＰ製剤のＴＥＭ画像。（ｂ）ＨｅｐＧ２細胞株における異なるＰＣＢ－ＬＮＰのルシフェラーゼ発現。

【図3】ＰＣＢ脂質を含むＬＮＰ（またはＰＣＢ－ＬＮＰ）のｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ発現。画像はＡｕｒａ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した。全てのＰＣＢ－ＬＮＰは、肝臓において、それらのＰＥＧ対応物と同等のトランスフェクション効率を示した。

【図4】ＺＷ－Ａ－ＣＢｎ（ｎ＝１、２、３）の合成。

【図5】化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ１の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）スペクトル。

【図6】化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ２の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）スペクトル。

【図7】化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ３の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）スペクトル。

【図8】ＺＷ－Ｂ－ＣＢｎ（ｎ＝１、２、３）の合成。

【図9】３－（（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）プロパン酸（６）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図10】Ｎ－（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）－Ｎ－（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）グリシン（８）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図11】４－（（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）ブタン酸（１０）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図12】ＺＷ－Ａ－スルファミド－３の合成

【図13】化合物ＺＷ－Ａ－スルファミド－３の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）スペクトル。

【図14】Ａ．ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２を異なるモル比で含むＰＣＢ－ＬＮＰの製剤。Ｂ． ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションを、群Ａおよび群ＢについてＨｅｐＧ２細胞で実施した。各系は３つ組で行った。

【図15】ａ）実施例８で実施した注射スキーム。ｂ）実施例８において試験した製剤の組成。ｃ）製剤の３回目の注射後、指示した時点で採取した血清からのＥＰＯ（エリスロポエチン）血清濃度解析：ＣＢ１（左）、ＣＢ２（中央）、およびＭＣ３（右）。正規化されたデータは、２つのコホート間の変化の倍率を表すようにここに示されている。

【図16】Ｃ５７Ｂ６／Ｌマウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）におけるＰＣＢ－ｍＬＮＰ（すなわち、ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２脂質を含むＰＣＢ－ＬＮＰ）（左）およびＰＳ５－ＰＣＢ－ｍＬＮＰ（すなわち、ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２およびＰＳ脂質を含むＰＣＢ－ＬＮＰ）（右）のｉｎ ｖｉｖｏでのルシフェラーゼ発現。画像は静脈内注射の６時間後に撮影した。

【図17】ＬＮＰによって送達されたＦｌｕｃ－ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現。水性緩衝溶液のｐＨ値：ｐＨ＝５（ａ）またはｐＨ＝３（ｂ）。製剤：５０：３８．５：１０：１．５（イオン化可能脂質＋双性イオン性イオン化可能脂質）：コレステロール：ヘルパー脂質（ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）：ＰＥＧ－脂質。横縞：ＭＣ３ ５０％＋双性イオン性脂質０％；縦縞：ＭＣ３ ２５％＋ＺＷ－Ｂ－ＣＢ１ ２５％；チェッカーボード：ＭＣ３ ２５％＋ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２ ２５％；グリッド：ＭＣ３ ２５％＋ＺＷ－Ｂ－ＣＢ３ ２５％。

【図18】ＬＮＰによって送達されたＦｌｕｃ－ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現。水性緩衝溶液のｐＨ値：ｐＨ＝５（左）またはｐＨ＝３（右）。一般的製剤：５０：３８．５：１．５（イオン化可能脂質＋双性イオン性イオン化可能脂質）：コレステロール：ＰＥＧ－脂質。横縞：ＭＣ３ ５０％＋双性イオン性脂質０％；縦縞：ＭＣ３ ２５％＋ＺＷ－Ｂ－ＣＢ１ ２５％；チェッカーボード：ＭＣ３ ２５％＋ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２ ２５％；グリッド：ＭＣ３ ２５％＋ＺＷ－Ｂ－ＣＢ３ ２５％。

【図19】異なる細胞におけるＰＳ５－ＬＮＰおよびＰＳ０－ＬＮＰ（ＰＥＧ製剤）のルシフェラーゼ発現：（ａ）ＨｅｐＧ２、（ｂ）Ｒａｗ２６４．７、（ｃ）初代マウス脾臓細胞。実験は３つ組で行った。（ｄ）ＦｌｕｃをコードするｍＲＮＡをそれぞれ有するＰＳ０－ＬＮＰおよびＰＳ５－ＬＮＰで処理したマウスから単離した臓器のＩＶＩＳ画像および生物発光シグナル解析。図に示す臓器は（上から下へ）、肺、表在性頚部リンパ節（ＳＣＬＮ、唾液腺に付着）、肝臓、腎臓、および脾臓である。

【図20】ＬＮＰ製剤における、ＰＣ部分を有するかまたは有さない、いくつかの例示的な双性イオン性ポリマー含有脂質および非カチオン性脂質の構造。

【図21】異なる種類の脂質部分（例えば、双性イオン性ポリマー修飾脂質、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびコレステロールまたはその誘導体）が化学的に結合された、いくつかの例示的な脂質組成物の構造。

【発明を実施するための形態】

【0016】

一態様において、本開示は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物に関する。当技術分野のいくつかのＬＮＰは、例えば、Ｘ．Ｈｏｕら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，６，１０７８－１０９４，２０２１に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。「脂質ナノ粒子」という用語は、少なくとも一部が脂質分子で構成されたナノ粒子を指す。以下にさらに記載されるように、脂質分子は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の双性イオン性ポリマー含有脂質、ならびに１つまたは複数の非カチオン性脂質、カチオン性またはイオン化可能脂質、および／またはコレステロールを含む。

【0017】

異なる実施形態において、ＬＮＰは、例えば、正確に、およそ、少なくとも、もしくは最大１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、もしくは２５０ミクロンの、または前述の値のうちの任意の２つによって囲まれる範囲内のサイズを有する。

【0018】

ＬＮＰの第１の構成要素は、少なくとも１つの双性イオン性ポリマー含有脂質である。双性イオン性ポリマー含有脂質では、脂質部分は双性イオン性ポリマーに共有結合している（すなわち、連結している）。双性イオン性ポリマーは、一般的に双性イオン性モノマー、ならびに双性イオン性モノマーに変換し得るモノマー、すなわち双性イオン性モノマーの前駆体から誘導される。双性イオン性モノマーは、同数の正電荷および負電荷（例えば、それぞれ１つずつ）を含む電子的に中性のモノマーである。いくつかの実施形態において、双性イオン性ポリマーは、複数の繰り返し単位を含み、各繰り返し単位は、１つの正電荷部分および１つの負電荷部分を含む。双性イオン性ポリマーは、典型的には、少なくとも２個、５個、または１０個以上、最大１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、または１０００個以下の単位を含む。

【0019】

「本明細書で使用される場合、用語「双性イオン性ポリマー」は、重合可能な双性イオン性モノマーを重合することによって製造されるポリマーを指し、これは、１００ｍｏｌ％の双性イオン性部分を有する双性イオン性ポリマーを提供する（すなわち、双性イオン性ポリマーの各繰り返し単位は双性イオン性部分であるか；または重合性双性イオン性モノマーと重合性コモノマーとを共重合することによって製造されるポリマーを指し、これは、１００ｍｏｌ％未満の双性イオン性部分を有する双性イオン性ポリマーを提供する（例えば、重合性双性イオン性モノマーと重合性コモノマーとが重合混合物中に等しい割合で存在する場合、生成物は５０ｍｏｌ％の双性イオン性部分を有する双性イオン性ポリマーである）。

【0020】

用語「双性イオン性ポリマー」はまた、重合混合物中に実質的に等しい割合でそれぞれ存在する、重合性負荷電モノマーおよび重合性正荷電モノマーを共重合することによって製造される、実質的に等しい数の負（アニオン）電荷および正（カチオン）電荷を有するポリマーを指す。このような共重合の生成物は、１００ｍｏｌ％の双性イオン性部分を有する双性イオン性ポリマーであり、各双性イオン性部分は、負電荷を有する繰り返し単位と正電荷を有する繰り返し単位との一対の繰り返し単位として定義される。このような双性イオン性ポリマーは混合荷電コポリマーと呼ばれる。用語「双性イオン性ポリマー」はまた、重合混合物中に実質的に等しい割合でそれぞれ存在する、重合性負荷電モノマー、重合性正荷電モノマー、および重合性コモノマーを共重合することによって製造されるポリマーを指し、これは、１００ｍｏｌ％未満の双性イオン性部分を有する双性イオン性ポリマーを提供する（例えば、重合性負荷電モノマーおよび重合性正荷電モノマーの組合せならびに重合性コモノマーが重合混合物中に等しい割合で存在する場合（すなわち、５０％の重合性負荷電モノマーおよび重合性正荷電モノマーの組合せならびに５０％の重合性コモノマー）、生成物は、５０ｍｏｌ％の双性イオン性部分を有する双性イオン性ポリマーである）」。

【0021】

脂質部分は、１つまたは２つの脂肪酸分子でエステル化されてモノアシルまたはジアシル脂質をもたらすポリオール部分（例えば、ジオール、グリセロール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、またはホスファチジルセリン）で構成され、ここで、用語「アシル」は、ＲＣ（＝Ｏ）基を指し、Ｒは、少なくとも８個、典型的には最大３０個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の炭化水素（脂肪）鎖であり、ここで、炭化水素鎖は、飽和であっても、１つまたはそれ以上の炭素－炭素二重結合を含んでいてもよい。脂質部分は、例えば、ジアシルジオール（例えば、ジアシルエチレングリコール）、ジアシルグリセロール（ジアシルグリセリド）、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、またはジアシルホスファチジルセリン部分であってもよい。脂質は、本願に提供される実施例１～１４のいずれか１つに記載される脂質のいずれかであってもよい。脂質はまた、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１１／０５７２２７号に記載される脂質のいずれかであってもよい。脂肪アシル部分は、公知の脂肪酸のいずれから得られてもよい。脂肪アシル部分のいくつかの例としては、オレオイル、パルミトイル、ラウリル、ミリストイル、ステアロイル、リノレオイル、およびアラキドニルが挙げられる。双性イオン性ポリマーは、脂質部分、例えば上記の脂質部分のいずれかに、典型的にはポリオール上の炭素を介して結合する。双性イオン性ポリマーは、ポリマーの側鎖または骨格（またはその組合せ）中に双性イオン性基を含んでもよい。

【0022】

一実施形態において、ポリマーは、双性イオン性モノマーから製造されたホモポリマーであり、式：

【化6】

を有し、式中、Ｂは、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリアミド、またはポリ炭化水素（例えば、ポリエチレンまたはポリプロピレン）骨格等のポリマー骨格であり、Ｐは、双性イオン部分である。特定の実施形態において、骨格（Ｂ）は、以下の構造のいずれか：

【化7】

を有していてもよく、式中、Ｒは、水素および置換または非置換アルキルからなる群から選択され；Ｅは、置換または非置換のアルキレン、－（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）Ｏ－、および－（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）ＮＲ^２－からなる群から選択され；ｐは、代表的には、０～１２の整数であり；Ｒ^２は、水素および置換または非置換アルキルから選択され；Ｌは、場合により、１つまたはそれ以上の酸素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキレン基である。添え字ｘは、典型的には、少なくとも２、５、または１０以上であり、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００単位以下である。

【0023】

特定の実施形態において、Ｐは、以下の構造：

【化8】

のいずれかから選択され、式中、
Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^６は、独立して、水素および置換または非置換アルキル基からなる群から選択され、Ｒ^５またはＲ_５は、置換または非置換アルキレン基、フェニレン基およびポリエーテル基からなる群から選択され、ｍは、１～７の整数であり；ｘは、２～５００の整数である。

【0024】

いくつかの実施形態において、双性イオン性ポリマーは、ベタインポリマーである。他の実施形態において、双性イオン性ポリマーは、ポリ（ホスファチジルコリン）ポリマー、ポリ（トリメチルアミンＮ－オキシド）ポリマー、ポリ（双性イオン性ホスファチジルセリン）ポリマー、またはグルタミン酸－リジン（ＥＫ）含有ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、双性イオン性ホスファチジルセリンは、ホスホセリンの負電荷と均衡をとるために、隣接する１つの正荷電部分を含む。いくつかの実施形態において、双性イオン性ホスファチジルセリンは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる「Ｄｅ ｎｏｖｏ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ，２０２０年５月２９日，第６巻，第２２号，（ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａｂａ０７５４）に記載されるような化合物を含む。

【0025】

ベタインポリマーのいくつかの例としては、ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルホベタイン）、およびポリ（ホスホベタイン）ポリマーが挙げられる。適切なポリ（カルボキシベタイン）は、例えば、カルボキシベタインアクリレート、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシド、およびその混合物から選択される１つまたはそれ以上のモノマーから製造することができる。一実施形態では、モノマーはカルボキシベタインメタクリレートである。本発明において有用なカルボキシベタインポリマーを作製するための代表的なモノマーとしては、カルボキシベタインメタクリレート、例えば２－カルボキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２’－メタクリロイルオキシエチル）エタンアミニウム内塩；カルボキシベタインアクリレート；カルボキシベタインアクリルアミド；カルボキシベタインビニル化合物；カルボキシベタインエポキシド；およびヒドロキシル基、イソシアネート基、アミノ基、またはカルボン酸基を有する他のカルボキシベタイン化合物が挙げられる。特定の実施形態において、ポリマーは、ポリ（カルボキシベタインメタクリレート）（ポリ（ＣＢＭＡ））である。

【0026】

双性イオン性ポリマーは、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、およびフリーラジカル重合等の任意の適切な重合法によって製造することができる。当技術分野で周知のものを含む、このようなモノマーを重合するための任意の適切なラジカル開始剤を使用することができる。いくつかの実施形態では、双性イオン性ポリマー含有脂質または他のポリマー含有脂質を製造するために、双性イオン性もしくは他のモノマーまたはその前駆体を脂質に結合させ、脂質に結合させた状態でモノマーを重合させる。あるいは、既に産生されたポリマーを、当技術分野で周知の手段によって脂質に結合させてもよい。

【0027】

他の実施形態において、双性イオン性ポリマーは、ポリマー骨格に正電荷を有し、ペンダントカルボン酸基を有するホモポリマーであり、式：

【化9】

を有し、式中、Ｒは、水素および置換または非置換アルキルからなる群から選択され；Ｌ_１およびＬ_２は、独立して、場合により１つまたはそれ以上の酸素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキレン基であり；ｘは、２～５００の整数である。

【0028】

他の実施形態において、双性イオン性ポリマーは混合荷電コポリマーであり、一般式：

【化10】

を有し、式中、Ｂ_１およびＢ_２は、前述のように、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３から独立して選択され；Ｒは、水素および置換または非置換アルキルから選択され；Ｅは、置換または非置換アルキレン、－（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）Ｏ－、および－（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）ＮＲ^２－から選択され、ｐは、０～１２の整数であり；Ｒ^２は、水素および置換または非置換アルキルから選択され；Ｌは、場合により１つまたはそれ以上の酸素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキレン基であり；Ｐ_１は、正に荷電した基であり；Ｐ_２は、カルボン酸基等の負に荷電した基であり；ｍは、１～５００の整数であり；ｎは、１～５００の整数である。いくつかの実施形態において、Ｐ_１は、芳香族環中の窒素またはＮＲ_５Ｒ_６であり、ここで、Ｒ_５およびＲ_６は、独立して、置換または非置換アルキル基である。

【0029】

双性イオン性ポリマーの正荷電単位（Ｐ１含有単位）は、正荷電ペンダント基を有するモノマーから得ることができる。本発明のポリマーにおいて正荷電単位を得るために使用することができる代表的なモノマーとしては、２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド、およびＮ－アセチルグルコサミンが挙げられる。

【0030】

一実施形態において、双性イオン性ポリマーの負荷電単位は、２－カルボキシエチルアクリレート（ＣＡ）から得られ、正荷電単位は、２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭ）から得られる。他の実施形態において、負荷電単位は、２－カルボキシエチルアクリレート（ＣＡ）から得られ、正荷電単位は、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＥ）から得られる。他の実施形態において、負荷電単位は、２－カルボキシエチルアクリレート（ＣＡ）から得られ、正荷電単位は、［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド（ＴＭ）から得られる。他の実施形態において、負荷電単位は、２－カルボキシエチルアクリレート（ＣＡ）から得られ、正荷電単位は、２－アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド（ＮＨ_２）から得られる。

【0031】

いくつかの実施形態において、双性イオン性ポリマーは、ポリアルキレンオキシド（ポリアルキレングリコール）セグメントを含まないか、または双性イオン性ポリマーは、より具体的には、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドセグメントを含まない。いくつかの実施形態において、構成要素（ｉ）は全て、ポリアルキレンオキシドセグメントを含まないか、または構成要素（ｉ）は、より具体的には、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドセグメントを含まない。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は全体としてポリアルキレンオキシドセグメントまたは分子を含まない。

【0032】

用語「脂質」は、脂肪酸のエステルを含むがこれらに限定されない有機化合物を指し、水に不溶性であるが多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする。脂質は通常、少なくとも３つのクラス：（１）脂肪および油ならびにワックスを含む「単純脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；および（３）ステロイド等の「誘導脂質」に分けられる。一実施形態において、脂質はジアシルグリセリドを含む。

【0033】

一実施形態において、双性イオン性ポリマーは「複合脂質」と連結される。そのような脂質のいくつかの例としては、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチル－ホスホエタノールアミン、１６－Ｏ－ジメチル－ホスホエタノールアミン、１８－１－ｔｒａｎｓ－ホスホエタノールアミン、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）が挙げられる。他の実施形態において、双性イオン性ポリマーは、「単純脂質」と連結する。他の実施形態において、双性イオン性ポリマーは、「誘導脂質」と連結する。いくつかの実施形態において、双性イオン性ポリマーは、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１１０５７２２５号Ａ２に開示されるような双性イオン性化合物を含む。

【0034】

ＬＮＰの第２の構成要素は、ポリマーに結合していない荷電脂質および非荷電脂質から選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質である。本明細書で使用する用語「非カチオン性脂質」、正に荷電しておらず、正に荷電した状態にイオン化することができない脂質を指す。しかしながら、非カチオン性脂質は、先に記載した双性イオン性基および部分のいずれかのような双性イオン（ポリマー内の正電荷および負電荷）を含有することによって、中性に荷電していてもよい。

【0035】

いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質は双性イオン性部分を含む。双性イオン性部分は、先に詳述した任意のそのような部分であり得る。双性イオン性部分は、例えば、ホスホベタイン、ホスファチジルコリン、カルボキシベタイン、スルホベタイン、トリメチルアミンＮ－オキシド、グルタミン酸－リジン（ＥＫ）含有、または双性イオン性ホスファチジルセリン（ホスホセリン）部分、またはその組合せであり得る。いくつかの実施形態において、双性イオン性脂質は、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルセリン脂質等のリン脂質である。

【0036】

他の実施形態において、非カチオン性脂質は、双性イオン性ではないが、負に荷電した基（例えば、ホスホセリン）を含むことによって負に荷電している。金属（例えば、アルカリ）またはアンモニウムの対アニオンは、負に荷電した基とイオン的かつ流動的に会合していてもよい。

【0037】

他の実施形態のセットでは、非カチオン性脂質は、荷電基を含まないことによって非荷電性である。非荷電非カチオン性脂質は、例えば、ホスファチジルグリセロール脂質、ホスファチジルエタノールアミン脂質、またはスフィンゴ脂質であり得る。非カチオン性脂質は、いくつかの実施形態において、脂肪、油、および／またはワックス等の単純脂質であってもよい。非カチオン性脂質は、いくつかの実施形態において、リン脂質または糖脂質等の複合脂質であってもよい。非カチオン性脂質は、いくつかの実施形態において、ステロイド、リン脂質、スフィンゴ脂質、および／またはステロール等の誘導脂質であってもよい。いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質は、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、またはセレブロシドから選択される。特定の実施形態において、非カチオン性脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、またはホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のうちの１つまたはそれ以上から選択される。他の特定の実施形態において、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチル－ホスホエタノールアミン、１６－Ｏ－ジメチル－ホスホエタノールアミン、１８－１－ｔｒａｎｓ－ホスホエタノールアミン、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）から選択される。非カチオン性脂質はポリマーに結合していないため、非カチオン性脂質はポリアルキレンオキシド（ポリアルキレングリコール）セグメントを含まない。

【0038】

特定の実施形態において、イオン性部分を含む非カチオン性脂質はリン脂質である。一実施形態において、イオン性部分を含む非カチオン性脂質は、１つまたはそれ以上のカルボキシベタイン基とコンジュゲートした脂質である。一実施形態において、イオン性部分を含む非カチオン性脂質は、１つまたはそれ以上のスルホベタイン基とコンジュゲートした脂質である。一実施形態において、イオン性部分を含む非カチオン性脂質は、１つまたはそれ以上のトリメチルアミンＮ－オキシド基とコンジュゲートした脂質である。

【0039】

ＬＮＰの第３の構成要素は、少なくとも１つのカチオン性またはイオン化可能脂質である。カチオン性またはイオン化可能脂質は、カチオン性基を有するポリマーに結合した脂質を含んでも、または含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、カチオン性またはイオン化可能脂質は、ポリマーに結合していない。本明細書で使用される用語「カチオン性脂質」は、（典型的には、アンモニウム基を有することによって）正に荷電した脂質を指す。カチオン性脂質において、正に荷電した基は、カチオン性脂質内で負電荷と会合していない。したがって、カチオン性脂質は双性イオン性脂質ではない。本明細書で使用される用語「イオン化可能脂質」は、ポリマー中に正電荷をもたらすためにイオン化可能な１つまたはそれ以上の基を含む脂質を指す。イオン化可能脂質は、一般的に、第二級、第三級、または第四級アミノ基、特にアルキル化アミン、より詳細にはモノアルキルアミンまたはジアルキルアミン基を有し、これらのいずれかは、プロトン化またはアルキル化されてアルキル化アンモニウム基をもたらし得る。カチオン性脂質は、トリアルキルアミン基を含有していてもよく、これは、脂質に結合すると必然的に正に荷電する。特定の実施形態において、カチオン性またはイオン化可能脂質は、ジメチルアミノまたはトリメチルアミノ（またはジメチルアンモニウムまたはトリメチルアンモニウム）基を有する。特定の実施形態において、カチオン性またはイオン化可能脂質は、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ）、および［（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル］４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎＭＣ３ＤＭＡ）から選択される。

【0040】

いくつかの実施形態において、イオン化可能脂質は、官能基と共に、第二級、第三級または第四級アミン基に結合した脂質部分を含み、これは生理学的条件下で負に荷電する。この脂質部分は、

【化11】

であってもよく、式中、
Ｒ１／Ｒ２＝Ｈまたはアルキル基である。アルキルは、飽和または不飽和、分枝鎖または非分枝鎖、全炭素および水素、または限定されるものではないが、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦ等のヘテロ原子を含んでいてもよい。
Ｌは、ＮとＡとの間の共有結合リンカー基である。リンカーは、全炭素および水素であるか、または限定されるものではないが、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦ等のヘテロ原子を含んでいてもよい。Ｌの構造は、限定されるものではないが：－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨ_２ＣＨＣｌＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＯＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＳＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＳＳＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_２－によって例示される。
Ａ－（Ｘ）ｎは、特定のｐＨ条件下で負に荷電する官能基である。構造は、以下に例示されるが、これらに限定されない：
（ｖ）Ａ（Ｘ）ｎは、カルボン酸基（Ａ＝－ＣＯＯＨおよびｎ＝０）であるか、または

【0041】

（ｖｉ）Ａ（Ｘ）ｎはリン酸基であり、ここでＡ＝

【化12】

およびｎ＝１である。Ｘ＝Ｈ、または飽和もしくは不飽和、分枝鎖もしくは非分枝鎖、全炭素、または限定されるものではないが、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ等のヘテロ原子を含むアルキル基、または

【0042】

（ｖｉｉ）Ａ（Ｘ）ｎは、スルホン酸基であり、ここで、Ａ＝

【化13】

およびｎ＝０であり、

【0043】

（ｖｉｉｉ）Ａ（Ｘ）ｎは、スルホンアミド基であり、ここで、Ａ＝

【化14】

およびｎ＝１であり、Ｘ＝Ｈ、または飽和もしくは不飽和、分枝鎖もしくは非分枝鎖、全炭素および水素、または限定されるものではないが、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦ等のヘテロ原子を含むがこれらに限定されないアルキル基である。

【0044】

これらのイオン化可能脂質の例示的な構造は

【化15】

であり、ここで、ｎ＝１～１０である。

【0045】

いくつかの実施形態において、カチオン性またはイオン化可能脂質は、ポリアルキレンオキシド（ポリアルキレングリコール）セグメントを除き、またはカチオン性もしくはイオン化可能脂質は、より具体的には、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドセグメントを含まない。いくつかの実施形態において、カチオン性またはイオン化可能脂質は、ポリアルキレンオキシドセグメントを含まないか、またはカチオン性もしくはイオン化可能脂質は、より具体的には、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドセグメントを含まない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子はポリアルキレンオキシドセグメントを含まない。

【0046】

いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、コレステロールまたはその誘導体をさらに含み、これは、本明細書において、ＬＮＰの任意のさらなる構成要素であると考えられる。特定の実施形態において、コレステロール誘導体は、植物ステロール、例えば、β－シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、フコステロール、またはスチグマスタノールである。特定の実施形態において、コレステロール誘導体は、ジヒドロコレステロール、エントコレステロール、エピコレステロール、デスモステロール、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、３β［Ｎ－（Ｎ’Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイルコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２４（Ｓ）－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、２５（Ｒ）－２７－ヒドロキシコレステロール、２２－オキサコレステロール、２３－オキサコレステロール、２４－オキサコレステロール、シクロアルテノール、２２－ケトステロール、２０－ヒドロキシステロール、７－ヒドロキシコレステロール、１９－ヒドロキシコレステロール、２２－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、７－デヒドロコレステロール、５α－コレスト－７－エン－３β－オール、３，６，９－トリオキサオクタン－１－オール－コレステリル－３ｅ－オール、デヒドロエルゴステロール、デヒドロエピアンドロステロン、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、ラノステノール、ルミステロール、シトカルシフェロール、カルシポトリオール、コプロスタノール、コレカルシフェロール、ルペオール、エルゴカルシフェロール、２２－ジヒドロエゴカルシフェロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、コール酸、チェノデオキシコール酸、ジモステロール、ジオスゲニン、フコステロール、フェコステロール、またはフェコステロール、またはその塩もしくはエステル、例えばコール酸ナトリウムである。

【0047】

ＬＰＮは、上記の第１、第２、第３、および／または第４の脂質構成要素の１つまたはそれ以上で構築された自己組織化シェルに組み込まれるか、またはそれによって封入された治療物質をさらに含む。治療物質は、生体、特にヒトまたは動物対象等の哺乳動物に対して治療的価値を有する任意の物質であり得る。治療物質は、例えば、負に荷電した核分子であり得る。核分子は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基、または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。特定の実施形態において、治療物質は、１つまたはそれ以上のそのような核分子を含む。いくつかの実施形態において、治療物質は、ＲＮＡ、より詳細にはｍＲＮＡ、より詳細にはウイルスｍＲＮＡを含む。他の特定の実施形態において、治療物質は、コロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２（ＣＯＶＩＤ－１９）、またはＨＩＶウイルス等のウイルスのスパイクタンパク質である。

【0048】

本発明の脂質ナノ粒子および組成物は、核酸分子、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、および多数の他の治療物質の送達を含む、様々な目的に使用することができる。核酸の例としては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ阻害剤（ａｎｔａｇｏｍｉｒ／ａｎｔｉｍｉｒ）、メッセンジャーＲＮＡ干渉性相補的ＲＮＡ（ｍｉｃＲＮＡ）、多価ＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、オリゴＤＮＡ、および相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が挙げられる。特定の実施形態において、治療分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、およびそのハイブリッドのうちの１つまたはそれ以上を含む。他の実施形態において、治療分子は、プラスミドＤＮＡまたは線状化ＤＮＡの１つまたはそれ以上を含む。他の実施形態において、治療分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、および／または長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）のうちの１つまたはそれ以上を含む。他の実施形態において、治療分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。他の実施形態において、治療分子は、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよび／またはガイドＲＮＡ核酸を含む。ガイドＲＮＡ核酸は、例えば、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。前述の実施形態のいずれかにおいて、治療分子は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２に対するワクチンを含み、特に、ワクチンはｍＲＮＡワクチンであるか、またはｍＲＮＡワクチンはスパイクタンパク質もしくはその一部に対応する。

【0049】

前述の実施形態のいずれかにおいて、ヌクレオチドは、保護ドメインおよび機能的ドメインを含む融合生物学的部分をコードし得る。いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、保護ドメインに直接またはアミノ酸からなるリンカーを介して融合される。さらなる特定の実施形態において、保護ドメインは、以下：複数の負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびその誘導体）；複数の正荷電アミノ酸（例えば、リジン、ヒスチジン、アルギニン、およびその誘導体）；ならびにプロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される複数の付加的なアミノ酸を含んでいてもよく、ここで、正荷電アミノ酸の数と負荷電アミノ酸の数の比は、約１：０．５～約１：２である。いくつかの実施形態において、保護ドメインは、他のアミノ酸ポリマー（例えば、拡張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）、プロリン－アラニン－セリンおよびエラスチン様ポリペプチド）から選択し得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、保護ドメインは、天然の半減期延長ドメイン（例えば、Ｆｃフラグメント）から選択し得る。

【0050】

ＬＮＰはまた、複合機能性を有する脂質構成要素を含み得る。実施形態において、双性イオン性ポリマー含有脂質、非カチオン性脂質、カチオン性脂質、およびコレステロールおよび／またはコレステロール誘導体を含むがこれらに限定されない脂質構成要素はいずれも、異なる脂質構成要素の１つまたはそれ以上の官能性を含むことができる。実施形態において、双性イオン性ポリマー含有脂質は、双性イオン性ポリマー含有脂質およびカチオン性脂質またはイオン化可能脂質の官能性を含む。実施形態において、双性イオン性ポリマー含有脂質、非カチオン性またはイオン化可能脂質、カチオン性脂質、およびコレステロールおよび／またはコレステロール誘導体はいずれかもまた、双性イオン性ポリマー含有脂質、非カチオン性脂質、カチオン性脂質、およびコレステロールおよび／またはコレステロール誘導体のうちの１つまたは複数の官能性を含み得る。実施形態において、脂質構成要素は、他の脂質構成要素の官能性を含むことができ、それにより、その官能性を有する追加の脂質構成要素を必要としない。実施形態において、双性イオン性ポリマー含有脂質は、非カチオン性脂質の官能性を含むことができ、それにより、非カチオン性脂質の必要性が排除または低減される。実施形態において、双性イオン性ポリマー含有脂質は、カチオン性脂質の官能性を含むことができ、それにより、カチオン性脂質の必要性が排除または低減される。実施形態において、双性イオン性ポリマー含有脂質は、コレステロールおよび／またはコレステロール誘導体の官能性を含むことができ、それにより、コレステロールおよび／またはコレステロール誘導体の必要性が排除または低減される。

【0051】

実施形態において、任意の脂質構成要素（双性イオン性ポリマー修飾脂質、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびコレステロールまたはその誘導体）は、任意の他の脂質構成要素と化学的に結合させることができる。実施形態において、双性イオン性ポリマー修飾脂質およびカチオン性脂質は、１つの脂質に化学的に結合される。実施形態において、双性イオン性ポリマー修飾脂質および非カチオン性脂質は、１つの脂質に化学的に結合される。実施形態において、カチオン性脂質および非カチオン性脂質は、１つの脂質に化学的に結合される。実施形態において、双性イオン性ポリマー修飾脂質、カチオン性脂質および非カチオン性脂質は、１つの脂質に化学的に結合される。実施形態において、双性イオン性ポリマー修飾脂質およびコレステロールまたは誘導体は１つの脂質に化学的に結合される。実施形態において、双性イオン性ポリマー修飾脂質、カチオン性脂質、およびコレステロールまたは誘導体は、１つの脂質に化学的に結合される。実施形態において、双性イオン性ポリマー修飾脂質、非カチオン性脂質、およびコレステロールまたは誘導体は、１つの脂質に化学的に結合される。実施形態において、双性イオン性ポリマー修飾脂質、非カチオン性脂質、非カチオン性脂質およびコレステロールまたは誘導体は、１つの脂質に化学的に結合される。他の実施形態では、各脂質構成要素は、分離した別個のものであり、他の脂質成分と組み合わされていない。

【0052】

上述の脂質ナノ粒子の成分のいずれかは、標的化リガンド（例えば、ＦａｂまたはＦｃ）を含むように化学修飾される。特定の実施形態において、双性イオン性ポリマー含有脂質は、治療剤もしくは診断剤またはそれらの両方を充填したＬＮＰを体内の特別な器官内の標的領域に送達するための標的化リガンド、例えば、ペプチド（例えば、ＲＧＤ）、脂質（例えば、ホスホセリン含有脂質）、タンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ｅ）、アプタマー（例えば、抗ＶＥＧＦアプタマー）、糖（例えば、シアル酸）および抗体（例えば、抗ＰＤ１）または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦｃ）を有する。

【0053】

他の態様において、本開示は、上記のＬＮＰ組成物のいずれか１つまたはそれ以上を対象に投与することによって、対象に治療物質を送達する方法に関する。対象は、典型的には哺乳動物であり、より典型的にはヒト対象であるが、イヌ、ネコ、ウシ、またはヒツジ等のペットまたは家畜等の他の種類の哺乳動物であってもよい。いくつかの実施形態において、治療物質を送達する方法は、対象を治療する方法をもたらす。治療方法として、ＬＮＰ組成物は、例えば、タンパク質補充療法、癌免疫療法、癌ワクチン療法、感染症ワクチン、遺伝子編集、自己免疫疾患治療、および／または癌診断の目的で投与し得る。特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集を含む遺伝子治療のため、または細胞外小胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ産生のため、またはコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対するワクチン接種のために投与される。より特定の実施形態において、ＬＮＰは、例えば、Ｃａｓタンパク質等の１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする１つまたはそれ以上の核酸を送達することを含むが、これらに限定されない、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのクラスター化規則的間隔短縮回文反復－Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）遺伝子編集のために使用される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、癌を治療するためにチェックポイント阻害剤（例えば、抗プログラム死リガンド１（抗ＰＤ－Ｌ１）抗体または抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（抗ＣＴＬＡ４））と共に投与される。

【0054】

いくつかの実施形態では、治療方法は、対象の二次リンパ器官（ＳＬＯ）への治療剤の標的化送達を含み、ここで、対象は、ホスホセリン含有脂質と治療剤とを含む脂質ナノ粒子を投与される。ＳＬＯは、例えば、脾臓および／またはリンパ節であり得る。ホスホセリン含有脂質は、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、またはＬ－α－ホスファチジルセリン（脳）等の天然に存在するＰＳ－脂質であってもよい。いくつかの実施形態において、標的化送達は、癌免疫療法、自己免疫疾患免疫療法、または遺伝子編集をもたらす。

【0055】

ＬＮＰ組成物は、典型的には、ＬＮＰを含む医薬組成物の形態で投与される。医薬組成物において、ＬＮＰは、当技術分野で周知のように、液体、半固体（例えば、ゲルまたはワックス）または固体であってよい薬学的に許容される担体に溶解または懸濁させるか、またはそれと混和させることができる。「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、対象への投与に適している化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、対象に対して生理学的に安全であるという意味で「許容される」ものであるべきである。本明細書では、投与様式に応じて、当技術分野で公知の任意の担体が好適であり得る。

【0056】

薬学的に許容される液体担体のいくつかの例としては、哺乳動物への導入に許容されるアルコール（例えばエタノール）、グリコール（例えばプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、ポリオール（例えばグリセロール）、油（例えば、鉱油または植物油）、パラフィン、および非プロトン性極性溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドまたはＮ－メチル－２－ピロリドン）が挙げられ、これらはいずれも、水性構成要素（例えば、少なくとも、１０、２０、３０、４０、または５０ｖｏｌ％またはこれらの値を超える、最大でこれらの値、またはこれらの値未満の水）を含んでいても含まなくてもよい。薬学的に許容されるゲルのいくつかの例としては、長鎖ポリアルキレングリコールおよびそのコポリマー（例えば、ポロキサマー）、セルロース系およびアルキルセルロース系物質（例えば、米国特許第６，４３２，４１５号に記載されている）、およびカルボマーが挙げられる。薬学的に許容されるワックスは、例えば、カルナウバワックス、ホワイトワックス、ミツロウ、モノステアリン酸グリセリン、オレイン酸グリセリン、および／またはパラフィンであっても、またはそれらを含んでいてもよい。

【0057】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＬＮＰと、１つまたはそれ以上の溶媒または担体とのみを含む。他の実施形態において、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の追加構成要素を含む。追加構成要素は、例えば、ｐＨ緩衝剤、単糖または多糖（例えば、ラクトース、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、またはデキストラン）、防腐剤、電解質、界面活性剤、または抗菌剤であり得る。所望により、甘味剤、香味剤、または着色剤を含むことができる。他の適切な賦形剤は、標準的な医薬テキスト、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５に記載されている。

【0058】

ＬＮＰ組成物は、典型的には、ＬＮＰが液体または固体の薬学的に許容される担体と混和またはそこに懸濁された医薬組成物の形態で、任意の適切な経路によって対象に投与することができる。ＬＮＰは、静脈内、経口、筋肉内、皮内、皮下、経鼻、または吸入により投与することができる。特定の実施形態では、ＬＮＰは、対象へ注射によって投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは対象の細胞に送達される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、対象から細胞を除去し、除去した細胞に脂質ナノ粒子を投与し、次いで除去した細胞を対象に再導入することによって送達される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはｉｎ ｖｉｖｏで直接注射され、ｉｎ ｖｉｖｏで宿主細胞に送達される。他の実施形態では、ＬＮＰをｅｘ ｖｉｖｏで宿主細胞にトランスフェクトし、得られた細胞をｉｎ ｖｉｖｏで注入する。

【0059】

実施例は、説明の目的で、本発明の現時点での最良の態様を記載するために以下に記載した。しかしながら、本発明の範囲は、本明細書に記載した実施例によって何ら限定されるものではない。

【実施例】

【0060】

実施例１．双性イオン性ポリマー修飾脂質（ＤＭＧ－ＰＣＢまたはＰＣＢ脂質）の製造および特性
本実施例では、本発明の代表的な双性イオン性ポリマー修飾脂質であるＤＭＧ－ＰＣＢの製造および特性について説明する。ＤＭＧ－ＰＣＢの構造および^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。

【0061】

ＤＭＧ－Ｎ－ＢＯＣ。トリエタノールアミン（１．６ｍＬ、９．３６ｍｍｏｌ、１．２当量）を、窒素雰囲気下で、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－（２，３－ジヒドロキシプロピル）カルバメート（１．５ｇ、７．８ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に添加し、混合物を氷浴中で０℃まで冷却した。この溶液に、塩化ステアロイル（２．８３ｇ、９．３６ｍｍｏｌ、１．２当量）をＤＣＭ ２０ｍＬに溶解し、３０分かけて滴加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液［ａ．ｑ．］）で抽出した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィーでさらに精製し、ＤＭＧ－Ｎ－ＢＯＣ（１．４２ｇ、４０％）を得た。

【0062】

ＤＭＧ－Ｎ。ＤＭＧ－Ｎ－ＢＯＣ（１００ｍｇ）をＤＣＭ ５ｍＬおよびＴＦＡ ５ｍＬに溶解した。反応物を室温で３時間撹拌した。その後、溶媒を真空で除去し、ＤＭＧ－Ｎを白色粉末として得た。

【0063】

ＣＴＡ－ＤＭＧ脂質。ＤＣＭ（５ｍＬ）中のＤＭＧ－Ｎ（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（９２．３４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（２２．３μＬ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で一晩撹拌させた。反応混合物を真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製してＣＴＡ－ＤＭＧ脂質を得た。

【0064】

ＤＭＧ－ＰＣＢ。１０ｋＤａのポリマーを得るための典型的な可逆的付加－開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合反応において、ＣＴＡ－ＤＭＧ脂質（１００ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌ）、およびＣＢＡＡＭ－１－ｔＢｕ（１０３６．３２ｍｇ、２．８４ｍｍｏｌ）２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ、４．６６ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を、撹拌棒を取り付けた２５ｍＬ丸底フラスコ中で無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、５ｍＬ）に溶解した。フラスコをゴム製セプタムで密閉し、窒素で３０分間パージした。反応を６５℃の油浴で一晩撹拌した。得られたポリマーをエチルエステル中に３回沈殿させ、遠心分離してペレットを回収し、真空下で一晩乾燥させ、微黄色粉末を得た。トリチオ炭酸基ポリマー（２５８．６ｍｇ）を除去するために、得られたポリマー（２５８．６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＥＰＨＰ（８９．２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（３．３ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ３ｍＬに溶解した。溶液を３０分間窒素でパージし、１００℃で２時間撹拌した。生成物をジエチルエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、真空下で乾燥して白色固体粉末を得た。最終生成物ＤＭＧ－ＰＣＢは、ｔｅｒｔ－ブチル基をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ポリマー１００ｍｇあたり５ｍＬ）で室温で４時間脱保護し、次いでエチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離を３回行うことで得た。ペレットを真空下で一晩乾燥させ、ＲＮａｓｅフリーの水に溶解し、２日間透析した。分子量（約１２ｋＤａ）は、^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）から決定した。

【0065】

実施例２．双性イオン性ポリマー修飾脂質（ＤＭＧ－ＰＣＢまたはＰＣＢ脂質）を含むＬＮＰの製造およびｉｎ ｖｉｔｒｏ特性
本実施例では、２つの市販のＬＮＰ製剤からのＤＭＧ－ＰＥＧを実施例１からのＤＭＧ－ＰＣＢに置き換えて、ＰＣＢ脂質を含むＬＮＰ（またはＰＣＢ－ＬＮＰ）を形成する。ＰＣＢ－ＬＮＰのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率を図２ｂに示す。図２ａに示すように、ＰＣＢ－ＬＮＰの形態を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。ｍＲＮＡ治療薬を含有するＰＣＢ－ＬＮＰの製造を以下に記載する。

【0066】

ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）は、Ｏｒｇａｎｉｘｉｎｃ ｌｎｃから購入した。１，１‘－（（２－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）は、Ｃｏｒｄｅｎｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．から購入した。その他の構成要素としては、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡ）が挙げられる。異なるポリマー分子量（４ｋＤａまたは７ｋＤａ）を含むＤＭＧ－ＰＣＢは、実施例１から合成した。

【0067】

マイクロ流体混合装置ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｉｇｎｉｔｅ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）において脂質構成要素とｍＲＮＡを混合することによって、ｍＲＮＡのＰＣＢ－ＬＮＰへの封入体を製造した。２つの異なるイオン化可能脂質をベースとしたＬＮＰ製剤をそれぞれ検討した。ＭＣ３ベースのＬＮＰでは、脂質混合物のモル比はＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：Ｘ＝５０：４０：３８．５：１．５であり、ＸはＭＣ３－ＰＥＧではＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、ＭＣ３－ＰＣＢ４ではＤＭＧ－ＰＣＢ４Ｋ、ＭＣ３－ＰＣＢ７ではＤＭＧ－ＰＣＢ７Ｋである。Ｃ１２－２００ベースのＬＮＰでは、脂質混合物のモル比は、Ｃ１２－２００：ＤＯＰＥ：コレステロール：Ｙ＝３５：１６：４６．５：２．５であり、ＹはＣ１２－ＰＥＧではＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、Ｃ１２－ＰＣＢではＤＭＧ－ＰＣＢ４Ｋである。簡単に説明すると、４つの脂質構成要素をエタノールに溶解し、別にホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードするｍＲＮＡを５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝３）に溶解した。その後、マイクロ流体装置内で水相とエタノール相を流速比３：１で混合した。残留有機溶媒を除去するため、得られたＬＮＰを１００ｋＤａ遠心フィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、ＵＳＡ）でＰＢＳで洗浄した。

【0068】

ＬＮＰをＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ－８０６５）にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発現をトランスフェクションの６時間後に解析した。簡単に説明すると、細胞を６０～７０％コンフルエントで播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１ｘペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）を添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションの間、ＲＮＡを図２ｂに示した用量でウェルごとに添加した。トランスフェクションの６時間後、ＬＮＰを含む培養培地を注意深く除去し、細胞をＰＢＳで一度穏やかにすすいだ。ルシフェラーゼ発現は、製造元のプロトコールに従って、ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃：Ｅ１５０１）を用いて測定した。全てのＰＣＢ－ＬＮＰは、対応するＰＥＧ－ＬＮＰと同等のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率を示し、これは、ｍＲＮＡを細胞に送達するためにＤＭＧ－ＰＣＢをＬＮＰに使用できることを示している。

【0069】

実施例３．双性イオン性ポリマー修飾脂質（ＤＭＧ－ＰＣＢまたはＰＣＢ脂質）を含むＬＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ送達
実施例２からのＰＣＢ－ＬＮＰ製剤をマウスに送達して、全身送達後のタンパク質発現の生体分布を試験した。

【0070】

簡単に説明すると、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、０．４ｍｇ／ｋｇの投与量で眼窩後注射によりＦｌｕｃ－ｍＲＮＡを有するＬＮＰを投与した。トランスフェクションの６時間後に生物発光イメージングを行った。マウスにＰＢＳで希釈したＤ－ルシフェリンを１５０ｍｇ／ｋｇを注射した。全ての画像はＡｕｒａ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。図３に示すように、全てのＰＣＢ－ＬＮＰは肝臓で高いｍＲＮＡ発現を促進した。ｍＲＮＡの効率的なｉｎ ｖｉｖｏ発現は、２つの異なるＬＮＰ系：１つはイオン化可能脂質としてＭＣ３を用いた系；もう１つはイオン化可能脂質としてＣ１２－２００を用いた系において裏付けられた。したがって、この超親水性ポリマーコンジュゲート脂質をＬＮＰに組み込むことにより、効率的なｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションが行われ、ＤＭＧ－ＰＥＧの代替物としてＤＭＧ－ＰＣＢが実現可能であることが示された。

【0071】

実施例４．ＺＷ－Ａ－ＣＢｎ（ｎ＝１、２、３）の合成および特性評価。
本実施例では、ＺＷ－Ａ－ＣＢｎ（ｎ＝１、２、３）を合成し、^１Ｈ－ＮＭＲによって特性評価した。ＺＷ－Ａ－ＣＢｎ－の合成方法を図４に示し、以下に説明する。

【0072】

化合物Ｓ１は、Ｊａｙａｒａｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｐｅの条件（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９－８５３３）に従って合成した。Ｍｇ屑を０．１Ｍ ＨＣｌで新たに活性化し、水およびアセトンで洗浄し、高真空下で乾燥させた。マグネチックスターラー、添加漏斗、および還流冷却器を備えた３つ口丸底フラスコにＭｇ（６８０ｍｇ）を添加した。フラスコを脱気し、２．３ｍＬの無水エーテルで満たした。臭化リノレイル（７．５０ｇ）をエーテル１４ｍＬに溶解した後、エーテル溶液２ｍＬを室温でフラスコに一度に添加した。反応混合物を２分間撹拌した後、ヨウ素の小結晶を添加した。ヨウ素による暗褐色は急速に消え、反応混合物は還流し始めた。緩やかな還流下に反応を維持しながら、エーテル中のリノレイル溶液の残りを５～１０分かけて滴加した。添加後、反応混合物を３５℃の水浴中で３時間保持した後、氷浴中で冷却した。ギ酸エチル（０．８ｍＬ、０．７３４ｇ）を０℃で滴加した後、反応物を室温まで加温した。６時間後、ＮＨ_４Ｃｌ溶液を添加して反応をクエンチした。溶液をエーテル（ｘ３）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させ、濃縮して粗混合物を黄色油状物として得た。主な副生成物はＳ１のギ酸エステルであることが確認されたので、粗混合物をエタノール中のＫＯＨの１０ｍＬ飽和溶液に溶解し、一晩撹拌して副生成物を加水分解した。次に、反応混合物をＤＣＭで希釈し、ＮＨ_４Ｃｌで洗浄し、濃縮し、Ｎａ_２ＳＯ_４で用いて乾燥させ、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中１％～１５％酢酸エチル）で精製し、所望の生成物を淡黄色油状物として得た。収量：３．５６ｇ。

【0073】

化合物Ｓ２：窒素下で２つ口丸底フラスコに、Ｓ１（２．００ｇ）、４－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ］ブタン酸（０．８７ｇ）、ＤＭＡＰ（０．０４５ｇ）、およびＤＣＭ２５ｍＬを添加した。溶液を０℃に冷却した後、ＤＣＭ中のＤＣＣの５ｍＬ溶液を滴加した。溶液を濾過し、濃縮し、ヘキサン中０～１０％酢酸エチルを用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製した。無色油状物２．６５８ｇが生成物として生じた。

【0074】

化合物Ｓ３：５０ｍＬの丸底フラスコにＳ２（１．７５８ｇ）およびＤＣＭ中ＴＦＡの５０ｖ／ｖ％溶液５ｍＬを添加した。反応物を室温で１．５時間撹拌した後、濃縮した。粗製物をＤＣＭに溶解し、Ｎａ_２ＣＯ_３溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。黄色油状物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２～１５％ＭｅＯＨ）で精製し、１．０２ｇの微黄色油状物を得た。

【0075】

化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ１：２ｍＬオートサンプラーバイアルに、化合物Ｓ３（１１４ｍｇ）、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（３５．４ｍｇ）、Ｋ_２ＣＯ_３（８０ｍｇ）、ＫＩ（４．３ｍｇ）、および無水アセトニトリル（０．３ｍＬ）とＴＨＦ（０．１ｍＬ）との混合物を添加した。混合物を室温で１５時間撹拌した後、ＤＣＭで希釈し、濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％～１５％ＭｅＣＮ）で精製し、化合物１’を無色油状物として得た。収量：６１ｍｇ。化合物１’（６１ｍｇ）を、ＤＣＭ中ＴＦＡの５０ｖ／ｖ％溶液に溶解し、室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、ＤＣＭ中の５～２０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを介して精製し、化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ１を微黄色油状物として得た。収量：５３ｍｇ。化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ１の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）を図５に示す。

【0076】

化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ２：２ｍＬオートサンプラーバイアルに化合物Ｓ３（１０２ｍｇ）、アクリル酸（３８．４ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．４ｍｇ）およびエタノール０．３ｍＬを添加した。混合物を３７℃で３０時間撹拌した後、ＤＣＭで希釈し、水およびブラインで洗浄した。抽出物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／酢酸エチル１：１中１％～２０％ ＭｅＯＨ）で精製し、化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ２を淡黄色油状物として得た。収量：８６ｍｇ。化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ２の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）を図６に示す。

【0077】

化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ３：２ｍＬオートサンプラーバイアルに、化合物Ｓ３（９９．４ｍｇ）、４－ブロモ酪酸ｔ－ブチル（４６．８ｍｇ）、Ｋ_２ＣＯ_３（８９．６ｍｇ）、ＫＩ（８ｍｇ）、および無水アセトニトリル（０．３ｍＬ）とＴＨＦ（０．１ｍＬ）との混合物を添加した。混合物を４０℃で１８時間撹拌した後、ＤＣＭで希釈し、濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１％～１５％ＭｅＣＮ）で精製し、化合物３’を無色油状物として得た。収量：９５ｍｇ。化合物３’（９０ｍｇ）をＤＣＭ中ＴＦＡの５０ｖ／ｖ％溶液に溶解し、室温で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＤＣＭ中の１－１５％ＭｅＯＨを用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ３をグミ状液体として得た。収量：５４ｍｇ。化合物ＺＷ－Ａ－ＣＢ３の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）を図７に示す。

【0078】

特に断らない限り、市販の試薬をさらに精製することなく使用した。全ての反応は、特に断らない限り、Ｎ_２またはアルゴン雰囲気下で行った。カラムクロマトグラフィーは、ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ ＳｉｌｉａＳｅｐ ＨＰフラッシュカートリッジを用いたＢｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ系で行った。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒまたはＶａｒｉａｎ ４００もしくは５００ＭＨｚスペクトロメーターで記録した。全ての^１Ｈ ＮＭＲ実験は、δ単位、百万分率（ｐｐｍ）で報告され、重水素化溶媒中の残留クロロホルム（７．２６ｐｐｍ）のシグナルに対して相対的に測定された。

【0079】

実施例５ ＺＷ－Ｂ－ＣＢｎ（ｎ＝１～３）の合成および特性評価
本実施例では、ＺＷ－Ｂ－ＣＢｎ（ｎ＝１、２、３）を合成し、^１Ｈ－ＮＭＲで特性評価した。ＺＷ－Ｂ－ＣＢｎの合成方法を図８に示し、以下に説明する。

【0080】

ノナン－２－イル ８－ブロモオクタノエート（１）。１００ｍＬ丸底フラスコに、８－ブロモ酢酸（２．００ｇ）、ノナン－１－オール（２．５９ｇ）、およびジクロロメタン２０ｍＬを装入した。フラスコをＮ_２でパージし、ジクロロメタン２０ｍＬ中の１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミドヒドロクロリド（２．２５ｇ）および４－ジメチルアミノピリジン（０．２２ｇ）を滴加した。混合物をＮ_２下で１８時間撹拌した。水を添加し、粗生成物をジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。生成物をジクロロメタン／ヘキサンを溶離液として使用するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製した。収量は２．３６ｇ（７５％）であった。

【0081】

ヘプタデカン－９－イル ８－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）オクタノエート（２）。１００ｍＬ丸底フラスコに８－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）オクタン酸（１．０４ｇ）およびヘプタデカン－９－オール（１．１３ｇ）をジクロロメタン２０ｍＬと共に装入した。フラスコをＮ_２でパージし、ジクロロメタン２０ｍＬ中の１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミドヒドロクロリド（１．０１ｇ）および４－ジメチルアミノピリジン（０．０５ｇ）を滴加した。混合物をＮ_２下で２０時間撹拌した。水を添加し、粗生成物をジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。生成物を、酢酸エチル／ヘキサンを溶離液として使用するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製した。収量は１．４２ｇ（７２％）であった。

【0082】

ヘプタデカン－９－イル ８－アミノオクタノエート（３）。２０ｍＬバイアルにヘプタデカン－９－イル ８－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）オクタン酸（０．１３ｇ）、ジクロロメタン２ｍＬおよびトリフルオロ酢酸２ｍＬを添加した。混合物を３時間撹拌した。揮発分を真空で除去した後、粗生成物を酢酸エチルに溶解し、１Ｎ ＮａＯＨおよびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。収量は９３．２ｍｇ（９３％）であった。

【0083】

ノニル ８－（（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（４）。火炎乾燥した５０ｍＬシュレンク反応器に、活性化４Åモレキュラーシーブス（５００ｍｇ）、水酸化セシウム一水和物（１８８ｍｇ）、および無水ジメチルホルムアミド６ｍＬを装入した。反応物をＮ_２下で１０分間撹拌した。ヘプタデカン－９－イル ８－アミノオクタノエート（５００ｍｇ）を添加し、混合物をＮ２下でさらに３０分間撹拌した。次いで、ノナン－２－イル ８－ブロモオクタノエート（４８３ｍｇ）を懸濁液に滴加し、反応物をＮ_２下で２４時間撹拌した。混合物を濾過し、１Ｎ ＮａＯＨに注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。メタノール／クロロホルムを溶離液として使用するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで生成物を精製した。収量は７０５ｍｇ（８４％）であった。

【0084】

ヘプタデカン－９－イル ８－（（３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－３－オキソプロピル）（８－（ノナン－２－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（５）。１．５ｍＬバイアルに、メタノール０．５ｍＬ中のノニル８－（（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（５０ｍｇ）およびｔ－ブチルアクリレート（１０．６ｍｇ）を添加した。反応物をＮ_２下で２０時間撹拌した。揮発分を真空中で除去した。収量は５８ｍｇ（９８％）であった。

【0085】

３－（（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）プロパン酸（６）。１．５ｍＬバイアルに、ヘプタデカン－９－イル ８－（（３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－３－オキソプロピル）（８－（ノナン－２－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（５０ｍｇ）、ジクロロメタン０．５ｍＬおよびトリフルオロ酢酸０．５ｍＬを添加した。混合物を３時間撹拌した。揮発分を真空中で除去し、メタノール／ジクロロメタンを溶離液として使用するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで生成物を精製した。収量は４５ｍｇ（９４％）であった。３－（（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）プロパン酸（６）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図９に示す。この化合物はＺＷ－Ｂ－ＣＢ２と命名される。

【0086】

ヘプタデカン－９－イル ８－（（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエチル）（８－（ノナン－２－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（７）。火炎乾燥した１．５ｍＬバイアルに、ノニル８－（（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（１００ｍｇ）、ブロモ酢酸ｔ－ブチル（１１７ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（９７ｍｇ）および無水ジメチルホルムアミド１ｍＬを添加した。反応物をＮ_２下で２４時間撹拌した。混合物を１Ｎ ＮａＯＨに注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。メタノール／ジクロロメタン／アンモニアを溶離液として使用するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで生成物を精製した。収量は９２ｍｇ（７９％）であった。

【0087】

Ｎ－（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）－Ｎ－（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）グリシン（８）。１．５ｍＬバイアルに、ヘプタデカン－９－イル ８－（（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエチル）（８－（ノナン－２－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタンノエート（５０ｍｇ）、ジクロロメタン０．５ｍＬおよびトリフルオロ酢酸０．５ｍＬを添加した。混合物を３時間撹拌した。揮発分を真空中で除去し、メタノール／ジクロロメタンを溶離液として使用するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで生成物を精製した。収量は４２ｍｇ（８８％）であった。Ｎ－（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）－Ｎ－（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）グリシン（８）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１０に示す。この化合物はＺＷ－Ｂ－ＣＢ１と命名される。

【0088】

ヘプタデカン－９－イル ８－（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－４－オキソブチル）（８－（ノナン－２－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（９）。火炎乾燥した１．５ｍＬバイアルに、ノニル８－（（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（１００ｍｇ）、４－ブロモ酪酸ｔ－ブチル（１３４ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（９７ｍｇ）および無水ジメチルホルムアミド１ｍＬを添加した。反応物をＮ_２下で２４時間撹拌した。混合物を１Ｎ ＮａＯＨに注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。メタノール／ジクロロメタン／アンモニアを溶離液として使用するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで生成物を精製した。収量は９８ｍｇ（８１％）であった。

【0089】

４－（（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）ブタン酸（１０）。１．５ｍＬバイアルに、ヘプタデカン－９－イル ８－（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－４－オキソブチル）（８－（ノナン－２－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（５０ｍｇ）、ジクロロメタン０．５ｍＬおよびトリフルオロ酢酸０．５ｍＬを添加した。混合物を３時間撹拌した。揮発分を真空中で除去し、メタノール／ジクロロメタンを溶離液として使用するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで生成物を精製した。収量は４４ｍｇ（９３％）であった。４－（（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）（８－（オクタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）ブタン酸（１０）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１１に示す。この化合物をＺＷ－Ｂ－ＣＢ３と命名する。

【0090】

実施例６．ＺＷ－Ａ－スルホアミド－３の合成および特性評価
本実施例では、ＺＷ－Ａ－スルファミド－３を合成し、^１Ｈ－ＮＭＲによって特徴評価した。ＺＷ－Ａ－スルファミド－３の合成法を図１２に示し、以下に説明する。

【0091】

Ｓ４：５０ｍＬの丸底フラスコに、化合物Ｓ１（６００ｍｇ）、ブロモ酢酸（１７８ｍｇ）、ＤＭＡＰ（６ｍｇ）およびＤＣＭ５ｍＬを添加した。混合物を氷浴で冷却し、ＤＣＣ（１７８ｍｇ）溶液５ｍＬを滴加した。反応物を室温まで加温し、１２時間撹拌した後、濾過し、濃縮し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中５％～３０％ＤＣＭ）で精製した。化合物Ｓ４を無色油状物として得た。収量：０．５９ｇ。

【0092】

Ｓ５：２５ｍＬの丸底フラスコに、４－ヒドロキシベンゼンスルホンアミド（６０．８ｍｇ）、Ｋ_２ＣＯ_３（４３．４ｍｇ）、およびＤＭＦ０．５ｍＬを添加した。混合物を５分間撹拌した後、ＤＭＦ中のＳ４（１２１ｍｇ）の溶液１ｍＬを添加した。反応混合物を３５℃で２０時間以上撹拌した後、ＤＣＭ５ｍＬで希釈し、濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキセン中１０％～４０％酢酸エチル）で精製し、Ｓ５を無色油状物として得た。収量：１０２ｍｇ。

【0093】

ＺＷ－Ａ－スルファミド－３：２０ｍＬバイアルに、Ｓ５（１００ｍｇ）、３－カルボキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルプロパン－１－アミニウムクロリド（４８ｍｇ）、Ｎ’－エチルカルボジイミドヒドロクロリド（７５ｍｇ）、ＤＭＡＰ（３２ｍｇ）、トリエチルアミン（５５μＬ）およびＤＭＦ２ｍＬを添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した後、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％～５０％ＭｅＯＨ）で精製し、表題化合物を淡黄色固体として得た。収量：５５ｍｇ。化合物ＺＷ－Ａ－スルファミド－３の１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）を図１３に示す。

【0094】

実施例７．ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２含有ＰＣＢ－ＬＮＰ（非ＰＥＧ製剤）の製造およびｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価
本実施例において、実施例５から合成されたＺＷ－Ｂ－ＣＢ２は、ＭＣ３を置換するために異なる比率で実施例２に記載されたＰＣＢ－ＬＮＰに組み込んだ。他の構成要素としては、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＣＢ４Ｋが含まれた。各構成要素のモル比を図１４に示す。

【0095】

脂質をエタノールに溶解し、ｍＲＮＡを５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３）に溶解した。激しく撹拌しながら、２相を１：３（エタノール：水、ｖ／ｖ％）の比率で混合することにより、ＬＮＰへのｍＲＮＡの封入体を調製した。製剤を透析カセット中でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して少なくとも１０時間透析し、０．２２μｍフィルターを通過させて濃縮し、使用するまで４℃で保存した。

【0096】

製剤のトランスフェクション効率を評価するために、ＦｌｕｃをコードするｍＲＮＡを封入したＬＮＰのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションを行った。簡単に説明すると、ＬＮＰをＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ－８０６５）にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発現をトランスフェクション６時間後に解析した。細胞培養条件は実施例２に記載した。トランスフェクションの間、ＲＮＡは１ウェルあたり１００ｎｇを３つ組で添加した。トランスフェクションの６時間後、ＬＮＰを含む培養培地を注意深く除去し、細胞をＰＢＳで１回穏やかにすすいだ。ルシフェラーゼ発現を、製造元のプロトコールに従ってルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃：Ｅ１５０１）を用いて測定した。

【0097】

実施例８．ＺＷ－Ｂ－ＣＢｎ（ｎ＝１～３）含有ＰＣＢ－ＬＮＰ（非ＰＥＧ製剤）のｉｎ ｖｉｖｏでの複数全身送達
血液クリアランス促進（ＡＢＣ）効果は、ＬＮＰが複数回注射され、その後の注射でＬＮＰの急速なクリアランスが観察された場合に報告されている。ＡＢＣ効果は、免疫原性であることが報告されているＬＮＰの脂質構成要素に対して生成された抗体によって引き起こされるところが大きい。本実施例では、実施例７からのＺＷ－Ｂ－ＣＢｎ含有ＰＣＢ－ＬＮＰを、ＬＮＰのＡＢＣ効果を試験するために使用した。実施例２からのＭＣ３ベースのＰＥＧ－ＬＮＰを対照として用いた。各製剤の組成を図１５ｂに示す。

【0098】

ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学（ＰＫ）研究のために、３～４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを３群に分け、ｍＲＮＡ－ＬＮＰをｍＲＮＡ ５μｇの用量で静脈内投与した。２つの異なる注射コホートを実施した。（図１５ａ）コホート１では、１用量のｈＥＰＯ－ｍＲＮＡ（ヒトエリスロポエチンｍＲＮＡ）のみを投与した。コホート２では、最初の２回の注射にＦｌｕｃ－ｍＲＮＡ（ハエルシフェラーゼｍＲＮＡ）を投与し、最後の注射にｈＥＰＯ－ｍＲＮＡを投与した。（図１５ａ）コホート２は、最初の２回の注射で誘導された抗ｈＥＰＯ免疫応答を排除するように設計され、それによって３回目の注射におけるｈＥＰＯのＰＫプロファイルは、主にＬＮＰ構成要素によるＡＢＣ効果を示している。ｈＥＰＯのＰＫプロファイルを決定するために、マウス血清を注射後６時間、２４時間に採取し、ＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ、ｈＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ）を用いて解析した。

【0099】

図１５ｃに示すように、ＰＣＢおよびＺＷ－Ｂ－ＣＢ１／ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２を含有するＬＮＰは、ＭＣ３製剤と比較して、注射コホート２においてより少ないＡＢＣ効果を示した。この結果は、ＺＷ－Ｂ－ＣＢｎを有するＰＣＢ－ＬＮＰが、減少したＡＢＣ効果を誘導し、したがって免疫原性が低いことを示す。

【0100】

実施例９．ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２を含有し、ホスホセリン（ＰＳ）脂質を標的化するＰＣＢ－ＬＮＰ（非ＰＥＧ製剤）のｉｎ ｖｉｖｏ全身送達
本実施例では、負に荷電したリン脂質、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）を、実施例７に記載したＰＣＢ－ＬＮＰ製剤に組み込んだ。簡単に説明すると、ＭＣ３：ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＣＢ４ｋ：ＤＯＰＳのモル比は、２０：３０：１０：３８．５：１．５：５に等しい。ＤＯＰＳを含む製剤をＰＳ－ＰＣＢ－ｍＬＮＰ（すなわち、ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２とＰＳ脂質とを含むＰＣＢ－ＬＮＰ）と名付け、ＤＯＰＳを含まないものを対照としてＰＣＢ－ｍＬＮＰ（すなわち、ＺＷ－Ｂ－ＣＢ２脂質を含むＰＣＢ－ＬＮＰ）と名付ける。脂質混合物およびｍＲＮＡ水溶液を、実施例２に記載したようにマイクロ流体チャンネル内で急速に混合した後、ＰＢＳで洗浄して最終生成物を生成した。ＤＯＰＳを、二次リンパ器官（ＳＬＯ）へ標的化するための非カチオン性脂質として使用した。

【0101】

Ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質発現を試験するために、ＦｌｕｃをコードするｍＲＮＡを有するＰＳ－ＰＣＢ－ｍＬＮＰを静脈内注射によりマウスに送達した。上述のようにＩＶＩＳを用いて投与６時間後に生物発光画像を撮影した。図１６に示すように、ＩＶＩＳ画像は、ｍＲＮＡ発現が肝臓から脾臓および表在リンパ節に向かってシフトしていることを示している。対照群では、標的化脂質ＤＯＰＳを含まないＰＣＢ－ｍＬＮＰでは、Ｆｌｕｃ発現はほとんど肝臓で起こった。したがって、ＤＯＰＳを組み込むことにより、脾臓およびリンパ節でより多くのタンパク質発現が可能となり、これらのＳＬＯへの標的化効果が示された。この結果は、ＰＳ－ＰＣＢ－ｍＬＮＰが、免疫療法およびワクチンを含む用途のための、ＳＬＯへのｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ送達のための有望なプラットフォームであることを示している。

【0102】

実施例１０．ＺＷ－Ｂ－ＣＢｎ（ｎ＝１～３）含有ＰＥＧ ＬＮＰ（ＰＥＧ製剤）の製造およびｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価
ＬＮＰ（または、ＰＥＧ脂質がＰＣＢ脂質で置換されたＰＣＢ ＬＮＰと区別するためにＰＥＧ ＬＮＰと表記される）の主要構成要素であるイオン化可能脂質は、免疫原性であることが報告されている。免疫原性を低減するために、イオン化可能脂質を実施例６で得られたＺＷ－Ｂ－ＣＢｎで部分的に置換し、製剤を作製した。簡単に説明すると、異なるヘルパー脂質を変化させた３つの条件：１）ＤＳＰＣ、２）ＤＯＰＥ、および３）ヘルパー脂質なしを試験した。条件１および２では、ＬＮＰは以下の脂質：モル比５０：１０：３８．５：１．５のＭＣ３＋ＺＷ－Ｂ－ＣＢｎ、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋによって構成されていた。条件３では、ＬＮＰは以下の脂質：モル比５０：３８．５：１．５のＭＣ３＋ＺＷ－Ｂ－ＣＢｎ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋによって構成されていた。ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションの結果を図１７および図１８に示す。ＬＮＰの製造およびｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションを以下に記載する。

【0103】

脂質は指されたモル比でエタノールに溶解し、ｍＲＮＡは２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）または２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３）に溶解した。ＬＮＰを生成するために、エタノールおよび水溶液を激しく撹拌しながら１：３（エタノール：水溶液）の比率で急速に混合した。製剤は、透析カセットでＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して少なくとも１０時間透析し、０．２２μｍのフィルターを通して濃縮し、使用するまで４℃で保存した。全ての製剤を、粒子サイズ、およびＲＮＡ封入について試験した。

【0104】

製剤のトランスフェクション効率を評価するために、ＦｌｕｃをコードするｍＲＮＡを封入したＬＮＰのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションを行った。簡単に説明すると、ＬＮＰをＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ－８０６５）にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発現をトランスフェクション６時間後に解析した。細胞培養条件は実施例２に記載した。トランスフェクション時に、ＲＮＡはウェルあたり１００ｎｇを３つ組で添加した。トランスフェクションの６時間後、ＬＮＰを含む培養培地を注意深く除き、細胞をＰＢＳで１回穏やかにすすいだ。ルシフェラーゼ発現を、ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃：Ｅ１５０１）を用いて、製造元のプロトコールに従って測定した。

【0105】

実施例１１．標的化脂質としてＰＳ脂質を含むＰＥＧ ＬＮＰ（ＰＥＧ製剤）の製造およびｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価
本実施例において、負に荷電したリン脂質、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）を、ＰＳ５－ＬＮＰを生成するためにＭＣ３ベースの製剤に組み込んだ。簡単に説明すると、ＰＳ５－ＬＮＰは、実施例２に記載されたマイクロ流路を用いて作製され、これは、ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ、およびＤＯＰＳを５０：１０：３８．５：１．５：５のモル比で含む。ＤＯＰＳを含まないＬＮＰを対照（ＰＳ０－ＬＮＰ）として使用した。

【0106】

ＰＳ５－ＬＮＰおよびＰＳ０－ＬＮＰは共に、ホタルのルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードするｍＲＮＡを封入し、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ－８０６５）およびＲａｗ２６４．７（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ－７１）にトランスフェクションし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスフェクション効率を評価した。細胞培養条件として、ＨｅｐＧ２は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１ｘペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）を添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。同様に、Ｒａｗ２６４．７は、１０％ＦＢＳおよび１ｘ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で同じ培養条件で維持した。ＬＮＰを細胞にトランスフェクションするために、６０～７０％のコンフルエントで播種した９６ウェルプレートに播種した細胞に、異なる量のＲＮＡ（プロットで示す）を添加した。トランスフェクションの６時間後、ＰＳ－ＬＮＰを含有する培養培地を注意深く除き、細胞をＰＢＳで１回静かにすすいだ。Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃：Ｅ１９４１）３０μＬを添加して細胞を溶解し、Ｄ－ルシフェリン基質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃：Ｅ１５０１）１００μＬを各ウェルに添加した。基質を添加した直後に、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ）を用いて、発光強度を白色不透明プレートで測定した。図１９に示すように、ＰＳ５－ＬＮＰは肝細胞株であるＨｅｐＧ２（図１９ａ）と単球／マクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７（図１９ｂ）の両方でトランスフェクション効率を有する。さらに、ＰＳ０－ＬＮＰと比較して、ＰＳ５－ＬＮＰは単球／マクロファージでより高いｍＲＮＡ発現レベルを示すが、肝細胞でははるかに低い。加えて、ＰＳ５－ＬＮＰはマウスの初代脾臓細胞においても高いトランスフェクション効率を示した（図１９ｃ）。これらの細胞におけるタンパク質発現の違いは、ＰＳ５－ＬＮＰが、肝細胞ではなく、免疫細胞に選択的にｍＲＮＡを送達する可能性があることを示している。

【0107】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験からの発見は、ｉｎ ｖｉｖｏでも裏付けられた。ＰＳ５－ＬＮＰとＰＳ０－ＬＮＰの両方にホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードするｍＲＮＡを封入し、眼窩後注射でＣ５７ＢＬ／６マウスに送達した（０．２ｍｇ／ｋｇ）。投与６時間後にマウスを安楽死させ、ｍＲＮＡ発現レベルを解析するために様々な臓器を単離した。ＰＳ５－ＬＮＰでは、頚部リンパ節と脾臓に総生物発光シグナルの４０％が認められた。対照群ＰＳ０－ＬＮＰでは、対照的に９０％超の生物発光シグナルが肝臓に見られたが、リンパ節と脾臓にはほとんど見られなかった（図１９ｄ）。この結果は、ＤＯＰＳを組み込んだ後のＳＬＯへの生体分布シフトを明確に結論付けている。負に荷電した脂質が粒子のトランスフェクション効率を低下させるという他の多くの報告がある一方で、ＰＳの添加は全体的なトランスフェクション効率を犠牲にすることなく、リンパ節および脾臓を標的とすることは注目に値する。

【0108】

実施例１２－予言的実施例。構成要素を減少させたＰＣＢ－ＬＮＰの製造および特性評価
コレステロールの量を減少させたＰＣＢ－ＬＮＰのライブラリーを作製する。表１に示すように、コレステロールの比は０～３８．５ｍｏｌ％の範囲とし、これに対応してＤＭＧ－ＰＣＢは１．５～４０ｍｏｌ％の範囲とする。イオン化可能脂質（５０ｍｏｌ％）およびヘルパー脂質（１０ｍｏｌ％）の量は、実施例２に記載したように変化しない。

【0109】

【表1】

【0110】

各製剤は、実施例２に記載したのと同じ手順に従って製造する。各製剤について、サイズ、ゼータ電位、および封入効率の特性評価を行う。有効性試験のために、各製剤をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションし、トランスフェクション効率を評価する。具体的には、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードするｍＲＮＡを各製剤でそれぞれ封入する。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１１２６８）を培養培地（１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ）１００μＬ中、９６ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩静置する。その後、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ担持ＬＮＰ５μＬを培地に添加し、６時間インキュベートした。各製剤は５つ組であり、陰性対照としてＰＢＳを加える。トランスフェクション後、培養培地を注意深く除き、ルシフェラーゼアッセイシステムを用いてＦｌｕｃの発現を評価する。

【0111】

さらに、最も優れた製剤をマウスに送達し、ｉｎ ｖｉｖｏでの発現および生体内分布を評価する。具体的には、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ担持ＬＮＰ（ｍＲＮＡ １ｍｇ／ｋｇ）を、６～７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに注射する。トランスフェクションの６時間後、マウスにＤ－ルシフェリン（ＰＢＳ中３０ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内注射によって投与する。１０分後、マウスを屠殺し、８つの臓器（肝臓、脾臓、腎臓、肺、および脾臓）を採取する。臓器の発光は、光学イメージングシステムを使用して解析し、適切なソフトウェアを使用して定量化し、各臓器の放射輝度を光子／秒で測定する。

【0112】

実施例１３－予言的実施例。ＰＣ部分を有する、または有さないＬＮＰの製造および特性評価
本実施例では、ＰＣ部分からの免疫原性に対処するために、ＰＣ部分を含まない分子を使用する製剤を生成する。（図２０）ＰＣ部分を含まない１つの製剤において、ＬＮＰの４つの構成要素は、イオン化可能脂質、ＤＭＧ－ＣＢ１、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＣＢを含む。ＤＭＧ－ＣＢ１は実施例１から生成され、ＣＢはＤＭＧ－Ｎに結合し、以前の製剤のヘルパー脂質ＤＳＰＣに取って代わる。ＰＣ部分を有する製剤では、ＬＮＰの４つの構成要素として、イオン化可能脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ－ＰＣＢが含まれる。ＤＳＰＥ－ＰＣＢは、参考文献（Ｚ．Ｃａｏ，Ｌ．ＺｈａｎｇおよびＳ．Ｊｉａｎｇ，Ｓｕｐｅｒｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２８，１１６２５，２０１２）に従って生成される。

【0113】

各製剤は、実施例２に記載したのと同じ手順に従って製造する。各製剤について、サイズ、ゼータ電位および封入効率の特性評価を実施する。有効性試験のために、各製剤をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションし、トランスフェクション効率を評価する。具体的には、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードするｍＲＮＡを各製剤でそれぞれ封入する。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１１２６８）を培養培地（１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ）１００μＬ中、９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩静置する。その後、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ担持ＬＮＰ５μＬを培地に添加し、６時間インキュベートした。各製剤は５つ組であり、陰性対照としてＰＢＳを加える。トランスフェクション後、培養培地を注意深く除き、ルシフェラーゼアッセイシステムを用いてＦｌｕｃの発現を評価する。

【0114】

さらに、最も優れた製剤をマウスに送達し、ｉｎ ｖｉｖｏでの発現および生体内分布を評価する。具体的には、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ担持ＬＮＰ（ｍＲＮＡ １ｍｇ／ｋｇ）を、６～７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに注射する。トランスフェクションの６時間後、マウスにＤ－ルシフェリン（ＰＢＳ中３０ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内注射によって投与する。１０分後、マウスを屠殺し、８つの臓器（肝臓、脾臓、腎臓、肺、および心臓）を採取する。臓器の発光は、光学イメージングシステムを用いて解析し、適切なソフトウェアを用いて定量化し、各臓器の放射輝度を光子／秒で測定する。

【0115】

実施例１４－予言的実施例。脂質構成要素の組合せ
図２１にも示されるように、任意の脂質構成要素（双性イオン性ポリマー修飾脂質、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびコレステロールまたはその誘導体）は、上述の組成物および方法を達成するために、任意の他の構成要素と化学的に組み合わせることができる。

【0116】

本発明の好ましい実施形態と考えられるものを示し、説明してきたが、当技術分野の当業者は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に留まる様々な変更および修正を行うことができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【国際調査報告】