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特表2024-500945ＦｃガンマＲＩＩｂに対する親和性を有する修飾免疫グロブリン及びその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-10
(54)【発明の名称】ＦｃガンマＲＩＩｂに対する親和性を有する修飾免疫グロブリン及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20231227BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20231227BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231227BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20231227BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20231227BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231227BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20231227BHJP
C07K 16/46 20060101ALN20231227BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20231227BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P37/08
A61P37/02
A61P29/00
A61P31/04
A61P31/12
A61K39/395 V
A61P25/00
C07K16/00 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023538766
(86)(22)【出願日】2021-12-22
(85)【翻訳文提出日】2023-08-01
(86)【国際出願番号】 AU2021051548
(87)【国際公開番号】W WO2022133543
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】2020904823
(32)【優先日】2020-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510332958
【氏名又は名称】マクファーレン バーネット インスティテュート フォー メディカル リサーチ アンド パブリック ヘルス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＣＦＡＲＬＡＮＥ ＢＵＲＮＥＴ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＰＵＢＬＩＣ ＨＥＡＬＴＨ ＬＴＤ
(71)【出願人】
【識別番号】517240322
【氏名又は名称】ジェンマブ エー／エス
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＭＡＢ Ａ／Ｓ
【住所又は居所原語表記】Ｋａｌｖｅｂｏｄ Ｂｒｙｇｇｅ ４３ １５６０ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｖ Ｄｅｎｍａｒｋ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ホガース，フィリップ マーク
(72)【発明者】
【氏名】ウィネス，ブルース デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】トリスト，ハリナ マリー
(72)【発明者】
【氏名】エスパロン，サンドラ エリザベス
(72)【発明者】
【氏名】チェノウェス，アリシア ミシェル
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA21
(57)【要約】
ＩｇＧ２抗体に由来する少なくとも１つの重鎖ポリペプチドを含む免疫療法用タンパク質が開示されており、重鎖ポリペプチドは、少なくとも定常重ドメイン２及び３（ＣＨ２及びＣＨ３）と、下部ヒンジと、を含み、下部ヒンジの配列は、免疫療法用タンパク質がＦｃγＲＩＩｂに結合するかつ／又はＦｃγＲＩＩｂを活性化させることを可能にする変異を含む。免疫療法用タンパク質は、例えば、ＦｃγＲＩＩｂの活性化（すなわち、ＦｃγＲＩＩｂの阻害機能の動員のため）が有益である疾患又は状態、例えばアレルギー性疾患の治療方法における使用に好適である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における疾患又は状態を治療する方法であって、ＦｃγＲＩＩｂへの結合及び／又はＦｃγＲＩＩｂの活性化が、前記疾患又は状態の前記治療又は予防に有益であり、前記方法が、ＩｇＧ２抗体に由来する少なくとも１つの重鎖ポリペプチドを含む有効量の免疫療法用タンパク質を前記対象に投与することを含み、前記重鎖ポリペプチドが、少なくとも定常重ドメイン２及び３（ＣＨ２及びＣＨ３）と、下部ヒンジと、を含み、前記下部ヒンジの配列が、前記免疫療法用タンパク質がＦｃγＲＩＩｂに結合するかつ／又はＦｃγＲＩＩｂを活性化させることを可能にする変異を含む、方法。
【請求項2】
前記重鎖ポリペプチドが、Ｆｃ断片の重鎖成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記免疫療法用タンパク質が、変異型ＩｇＧ２抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記変異が、２３３～２３６位（ＥＵ番号付け）での、前記下部ヒンジ配列の置換、又は前記下部ヒンジ配列内の１つ以上のアミノ酸の置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記下部ヒンジ配列が、以下のアミノ酸配列を含み、Ｘ１Ｘ２Ｘ３－Ｇ－Ｘ５又は
式中、
Ｘ１が、プロリン（Ｐ）及びグルタミン酸（Ｅ）から選択され、
Ｘ２が、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、及びフェニルアラニン（Ｆ）から選択され、
Ｘ３が、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、及びグルタミン酸（Ｅ）から選択され、Ｘ５が、グリシン（Ｇ）及びプロリン（Ｐ）から選択されるか、又は存在せず、
ただし、前記下部ヒンジが野生型ＩｇＧ２下部ヒンジ配列からなるものではない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
前記下部ヒンジ配列が、ＥＬＬＧＧ、ＥＦＬＧＧ、ＥＦＬＧＰ、及びＥＦＥＧＧからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記免疫療法用タンパク質が、ＦｃγＲＩＩｂに結合し、かつＦｃγＲＩＩｂを活性化させて、ＦｃγＲＩＩｂ阻害機能を動員する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記免疫療法用タンパク質が、ＦｃγＲＩＩｂに結合して、ＦｃγＲＩＩｂ媒介性エンドサイトーシス／内在化（「スイーピング」）を誘導する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記免疫療法用タンパク質が、ＦｃγＲＩＩｂに結合して、ＦｃγＲＩＩｂ媒介性足場形成を誘導する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記免疫療法用タンパク質が、前記重鎖ポリペプチドのうちの前記少なくとも１つのＣＨ２領域内のＳ２６７Ｅ及び／又はＬ３２８Ｆアミノ酸置換（ＥＵ番号付け）を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記下部ヒンジ配列が、前記アミノ酸配列ＥＦＬＧＧを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記下部ヒンジ配列が、前記アミノ酸配列ＥＦＥＧＧを含み、前記免疫療法用タンパク質が、前記少なくとも１つの重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ２領域内のＳ２６７Ｅ及び／又はＬ３２８Ｆアミノ酸置換（ＥＵ番号付け）を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記免疫療法用タンパク質が、前記重鎖ポリペプチドの定常重領域内に更なる変異を含まない、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記対象が、ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１に対してホモ接合性である、請求項１０又は１２に記載の方法。
【請求項15】
前記免疫療法用タンパク質が、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
治療される前記疾患又は状態が、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び状態、他の炎症性疾患、感染性疾患、並びに増殖性疾患から選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記治療される疾患又は状態が、アレルギー性疾患であり、前記免疫療法用タンパク質が、アレルゲンに特異的に結合する抗原結合領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記免疫療法用タンパク質が、ＩｇＥによるアレルギー性好塩基球活性化のＦｃγＲＩＩｂ依存性阻害を媒介する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記治療される疾患又は状態が、自己免疫疾患であり、前記免疫療法用タンパク質が、自己抗原に特異的に結合する抗原結合領域を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記治療される疾患又は状態が、がんであり、前記免疫療法用タンパク質が、がん抗原に特異的に結合する抗原結合領域を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記免疫療法用タンパク質が、（ａ）抗原、
（ｂ）活性化受容体に結合した抗体、
（ｃ）活性化受容体の抗体（リガンド）結合ドメイン、
（ｄ）活性化受容体のサブユニット、
（ｅ）ＢＣＲ複合体の免疫グロブリン成分に結合した抗原、又は
（ｆ）ＢＣＲ複合体のサブユニット若しくは関連するＩｇ－α若しくはβ鎖、に特異的に結合する抗原結合領域を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
ＦｃγＲＩＩｂへの結合及び／又はＦｃγＲＩＩｂの活性化が有益である疾患又は状態を治療するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の免疫療法用タンパク質の使用。
【請求項24】
ＦｃγＲＩＩｂへの結合及び／又はＦｃγＲＩＩｂの活性化が有益である疾患又は状態を治療するための医薬品の製造における、請求項１～２２のいずれか一項に記載の免疫療法用タンパク質の使用。
【請求項25】
請求項１～２２のいずれか一項に記載の免疫療法用タンパク質と、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と、を含む、薬学的組成物又は医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、疾患又は状態を治療する方法において使用するための修飾免疫グロブリン分子（すなわち、抗体）を含む免疫療法用タンパク質に関する。より具体的には、本開示は、ヒト阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂに対して改善された結合特異性及び親和性を示す変異型ＩｇＧ２抗体を記載する。これらの抗体は、例えば、ＦｃγＲＩＩｂの活性化が有益である疾患、例えばアレルギー性疾患を治療するために使用され得る。
【0002】
優先権書類
本出願は、「修飾免疫グロブリン及びその使用方法（１）」と題され、２０２０年１２月２３日に出願されたオーストラリア特許出願第２０２０／９０４８２３号からの優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、「修飾免疫グロブリン及びその使用方法（１）」と題され、２０２０年１２月２３日に出願されたオーストラリア特許出願第２０２０／９０４８２３号からの優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、がん及び自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療に革命をもたらす、最も重要かつ成功したタイプの療法のうちの１つになっている。ＩｇＧ抗体クラスの骨格上で操作された多くのｍＡｂは、それらの可変Ｆａｂドメインを介して標的抗原と、定常Ｆｃ断片を含むそれらの重鎖を介してＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）の両方に係合することによって、免疫系の強力なエフェクター機能を特異的に利用する。炎症性疾患において、操作されたｍＡｂは、炎症性メディエーターを中和することによって、それらの受容体を中和することによって、又は免疫調節受容体に係合することによって、潜在的に作用し得る。本発明との関連で特に関心のある１つの事項は、アレルギー反応における炎症誘発性応答を中和する可能性であり、その主要なメディエーターは、その高い親和性受容体であるＦｃεＲＩのアレルゲン特異的ＩｇＥ活性化である。
【0004】
アレルギー性疾患の治療における使用について承認された、操作されたｍＡｂの例は、ＩｇＧ１ベースのｍＡｂであるオマリズマブである。このｍＡｂは、ＩｇＥとＦｃεＲＩとの相互作用を中和することによって、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩ経路を標的とし、それによって、ＩｇＥ依存性アレルギー反応における重要な炎症細胞である好塩基球の活性化を防止する（Ｇｅｒｉｃｋｅ Ｊ ｅｔ ａｌ．，ＪＥＡＤＶ ２９（９）：１８３２－１８３６，２０１４）。ヒト好塩基球は、ＦｃεＲＩ並びにその調節因子である阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂの両方を発現する（Ｋｅｐｌｅｙ ＣＬ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０６（２）：３３７－３４８，２０００）。ＦｃγＲＩＩｂは、抗体依存性炎症細胞活性化を調節する強力なチェックポイントである。ＦｃγＲＩＩｂは、ＦｃεＲＩの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）依存性シグナル伝達経路、並びに活性化型ＩｇＧ及びＩｇＡ Ｆｃ受容体、すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃαＲＩを調節する免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を介して作用する。ＦｃγＲＩＩｂはまた、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）によるＢ細胞活性化を調節する。ＦｃγＲＩＩｂなどの免疫チェックポイントの標的化は、疾患における白血球応答を調節するための戦略として浮上している（Ｋａｐｌｏｎ Ｈ ａｎｄ ＪＭ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｍａｂｓ １１（２）：２１９－２３８，２０１９、Ｃｈｅｎｏｗｅｔｈ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９８（４）：２８７－３０４，２０２０）。しかしながら、Ｔ細胞機能のチェックポイント（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１）のｍＡｂ標的化とは異なり、ＦｃγＲＩＩｂは、ｍＡｂ治療薬のＦｃ断片に対するその特異性のために、ｍＡｂ治療薬との関連で特異的であり、その阻害作用を発揮するために、ＦｃγＲＩＩｂは、ＩＴＡＭ含有活性化受容体、例えば、活性化型ＦｃＲ複合体、又はＢ細胞抗原受容体若しくはＢＣＲとしても知られるＢ細胞の抗原受容体複合体との共架橋を必要とするので（Ｇｅｔａｈｕｎ Ａ ａｎｄ ＪＣ Ｃａｍｂｉｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２６８（１）：６６－７３，２０１５、Ｃｈｅｎｏｗｅｔｈ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，２０２０（前掲））、アレルギー反応において（ＦｃεＲＩと共凝集するか、又はＢ細胞抗原受容体ＢＣＲと共凝集しつつ）ＦｃγＲＩＩｂの正常な生理学的阻害の役割を利用できる特定の免疫抑制抗体を使用する戦略は、高親和性ＩｇＥ受容体、ＦｃεＲＩ、若しくはＢＣＲなどの活性化受容体を標的とする潜在的に有用な方法を提供する。
【0005】
本開示に至る研究において、本発明者らは、ＩｇＧ２抗体が低親和性活性化型ＦｃγＲＩＩａの１つの対立遺伝子形態（すなわち、「Ｈｉｓ１３１形態」、ＦｃγＲＩＩａ－Ｈｉｓ１３１；Ｂｒｅｄｉｕｓ ＲＧＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１：１４６３－１４７２，１９９３）にのみ結合する非常に制限されたＦｃγＲ特異性を有し、エフェクター機能を制限し、かつ補体を固定できないことを鑑みて、「ＩｇＧ２骨格」は「機能的に不活性」であると考えられており、これは、操作されたＩｇＧ２抗体（すなわち、変異型ＩｇＧ２抗体）が、炎症細胞からのＦｃγＲ依存性サイトカイン放出、キラー細胞からの細胞毒性、又は潜在的に「サイトカインストーム」として知られている生命を脅かす炎症応答（例えば、ＩｇＧ４ベースの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体であるＴＧＮ１４１２で観察されているように；Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５５（１０）：１０１８－１０２８，２００６）などの望ましくない炎症誘発性エフェクター応答を含む望ましくない活動（すなわち「副作用」）を引き起こす傾向が低い可能性があることを意味することから、アレルギー反応の治療又は予防のためのＩｇＧ２ベースの免疫グロブリン分子の使用を調査することを選択した。しかしながら、ＩｇＧ２抗体は、上記のＦｃγＲＩＩａの１つの対立遺伝子形態を除いて、ＦｃγＲＩＩｂ又は他のＦｃγＲに結合しないことが知られているが（Ｂｒｕｈｎｓ Ｐ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ １１３（１６）：３７１６－３７２５，２００９、及び以下の図１Ａ）、それにもかかわらず、本発明者らは、驚くべきことに、ＦｃγＲＩＩｂ特異性、親和性、及び阻害効力を向上させるようにＩｇＧ２骨格を操作することができた。採用されたアプローチは、新規の強力な抗炎症療法用ｍＡｂ及び分子を含む免疫療法用タンパク質の生成に対してより広い意味を有すると考えられる。
【発明の概要】
【0006】
したがって、第１の態様では、本開示は、対象における疾患又は状態を治療する方法であって、ＦｃγＲＩＩｂへの結合及び／又はＦｃγＲＩＩｂの活性化が、当該疾患又は状態の治療又は予防に有益であり、当該方法が、ＩｇＧ２抗体に由来する少なくとも１つの重鎖ポリペプチドを含む有効量の免疫療法用タンパク質を当該対象に投与することを含み、当該重鎖ポリペプチドが、少なくとも定常重ドメイン２及び３（すなわち、ＣＨ２及びＣＨ３）と、下部ヒンジと、を含み、下部ヒンジの配列が、免疫療法用タンパク質がＦｃγＲＩＩｂに結合するかつ／又はＦｃγＲＩＩｂを活性化させることを可能にする変異を含む、方法を提供する。
【0007】
いくつかの特定の好ましい実施形態では、免疫療法用タンパク質の下部ヒンジ配列は、ＥＬＬＧＧ（配列番号１）、ＥＦＬＧＧ（配列番号２）及びＥＦＥＧＧ（配列番号３）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0008】
第２の態様では、本開示は、例えば、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び状態、感染性疾患、並びに増殖性疾患を含む、ＦｃγＲＩＩｂへの結合及び／又はＦｃγＲＩＩｂの活性化が有益である疾患又は状態を治療するための、第１の態様で定義される免疫療法用タンパク質の使用を提供する。
【0009】
第３の態様では、本開示は、例えば、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び状態、他の炎症性疾患、感染性疾患、並びに増殖性疾患を含む、ＦｃγＲＩＩｂへの結合及び／又はＦｃγＲＩＩｂの活性化が有益である疾患又は状態を治療するための医薬品の製造における、第１の態様で定義される免疫療法用タンパク質の使用を提供する。
【0010】
第４の態様では、本開示は、第１の態様で定義される免疫療法用タンパク質と、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と、を含む、薬学的組成物又は医薬品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、及び変異型ＩｇＧ４抗体と比較した、本開示による変異型ＩｇＧ２抗体のヒトＦｃγＲとの結合プロファイルを示す。
【図2】本開示による変異型ＩｇＧ２抗体を使用するアレルギー患者からの、生理学的レベルのＩｇＧを欠く、洗浄した血液中の蜂毒Ａｐｉ ｍ １アレルゲン依存性好塩基球活性化の阻害を示す。
【図3】本開示による変異型ＩｇＧ２抗体を使用した好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）アッセイの結果を提供し、アレルギー患者からの生理学的レベルのＩｇＧを含有する全血中の蜂毒Ａｐｉ ｍ １アレルゲン依存性好塩基球活性化の阻害を示す。
【図4】ＳＥＬＦ変異を含む変異型ＩｇＧ２抗体がＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１に対する結合親和性の向上を示すかどうかを判定するために実施したアッセイの結果を示す：（Ａ）ＴＮＰ－ＢＳＡ上で捕捉されたｒｓＦｃγＲＩＩｂの単量体抗ＴＮＰ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及び示された変異体又はＩｇＧ２への結合のＢＬＩ分析（平均±ＳＥＭ）、（Ｂ）ＴＮＰ－ＢＳＡ上で捕捉されたｒｓＦｃγＲＩＩＩａ－Ｒ１３１の単量体抗ＴＮＰ ＩｇＧ１－ＳＥＬＦ、ＩｇＧ２－ＳＥＬＦ、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦ及びＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦへの結合のＢＬＩ分析（平均±ＳＤ）。
【図5】本開示による変異型ＩｇＧ２抗体が、ヒトＦｃγＲ結合プロファイルを変更したことを実証する結果を提供する。ヒトＦｃγＲを発現する細胞を使用して、複合化ＩｇＧの低親和性ヒトＦｃγＲへの結合力又は非複合化単量体ＩｇＧのＦｃγＲＩへの親和性を、フローサイトメトリーによって決定した：（Ａ）ＦｃγＲＩＩｂ、（Ｂ）ＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１、（Ｃ）ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１、（Ｄ）ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆ１５８、（Ｅ）ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８、及び（Ｆ）ＦｃγＲＩ。ＩｇＧ変異体と関連するＩｇＧ ＷＴ骨格との間で統計的比較を行った。＊（ｐ＜０．５）、＊＊（ｐ＜０．１）、＊＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）、ｎ．ｓ（有意でない）。
【図6】本開示による変異型ＩｇＧ２抗体の単量体のＦｃγＲ結合特異性の結果を示す。変異型ＩｇＧ２抗体の一部は、ＳＥＬＦ変異を含んでいた。
【図7】本開示による変異型ＩｇＧ２抗体（ＳＥＬＦ変異を有するものもある）を使用したＢＡＴアッセイの結果を提供し、健康なドナーからの全血におけるＩｇＧ変異体による（ＩｇＥ依存性刺激として抗ＩｇＥ－ＴＮＰを使用する）抗ＩｇＥ依存性好塩基球活性化の阻害を示す。
【図8】ＦｃγＲＩＩｂ発現及びＦｃγＲＩＩｂ特異的ＦｃεＲＩ活性化の阻害を評価する実験の結果を提供する：（Ａ）緩衝液バックグラウンド（Ｂｋｇ）と比較した、ＦｃγＲＩＩｂ特異的ｍＡｂであるＨ２Ｂ６のＦ（ａｂ’）２断片を使用したＩｇＥ陽性好塩基球上のＦｃγＲＩＩｂのフローサイトメトリー検出、（Ｂ）ＦｃγＲＩＩｂのＨ２Ｂ６ Ｆ（ａｂ’）２遮断は、全血ＢＡＴ中のＩｇＧ２－ＦＬＧＧ（７．５μｇ／ｍｌ）による好塩基球活性化の阻害を防止する、（Ｃ）ＦｃεＲＩ（αβγ）複合体及び阻害性ＦｃγＲＩＩｂを共発現するＩＩＡ１．６細胞におけるＩｇＥ／ＦｃεＲＩ依存性誘導カルシウム動員のｍＡｂ抑制。細胞をＩｇＥで一晩前処理し、ＴＮＰコンジュゲートＦ（ａｂ’）２抗ｈＩｇＥと予め複合化された抗ＴＮＰ抗体で刺激した。細胞を抗ＩｇＥ－ＴＮＰ（Ｆ（ａｂ’）２）（２０μｇ／ｍｌ）及びｍＡｂ（３５μｇ／ｍｌ）で刺激した。カルシウムフラックス（３４０／３８０ｎｍ）を経時的に測定し、変異型ＩｇＧ２抗体によるカルシウムフラックスの阻害を、ＦｃγＲＩＩｂに結合しない親の野生型ＩｇＧ２と比較した。非刺激ベースライン対照は、緩衝液単独である（ｎ＝３）。
【図9】Ｂ細胞抗原受容体複合体を検出するＩｇＧ ｍＡｂによるＢ細胞の抗原刺激の抑制を示す実験の結果を提供する。ＩｇＧ４骨格又はＩｇＧ２骨格を有するオマリズマブの可変ドメインを有する抗ＩｇＥ ｍＡｂは、ヒトＦｃγＲＩＩｂ１を共発現するＢ細胞におけるＮＩＰ特異的ｈｕ－ＩｇＥ ＢＣＲ誘発カルシウムフラックスのＮＩＰ（２２）ＢＳＡ刺激を抑制する。ＩｇＥ ＢＣＲの調節は、これらのＩｇＧフォーマットのＦｃγＲＩＩｂ結合活性のランクと相関するＩｇＧ１（オマリズマブ）～ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の階層を有した。
【図10】Ｂ細胞抗原受容体複合体に結合する（本開示による）ＩｇＧ２変異型ｍＡｂによるＢ細胞の抗原刺激の抑制を示す実験の結果を提供する。本開示によるＩｇＧ２変異型抗体として提供されるオマリズマブの可変ドメインを有する抗ＩｇＥ ｍＡｂは、ヒトＦｃγＲＩＩｂ１を共発現するＢ細胞におけるＮＰ特異的ｈｕ－ＩｇＥ ＢＣＲ誘発カルシウムフラックスの抗原（すなわち、ＮＩＰ（２２）ＢＳＡ）刺激を抑制する。ＩｇＧ２変異型ｍＡｂによるＩｇＥ ＢＣＲの調節に対する変異の影響は、ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦ＞ＦＬＧＧ～ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦ＞ＦＥＧＧ＞ＩｇＧ２の階層を有し、これは、ＩｇＧ２フォーマットにおけるこれらの変異のＦｃγＲＩＩｂ結合活性のランクと広く相関していた。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明者らは、機能的に不活性なＩｇＧ２骨格を、下部ヒンジ配列の変異（例えば、下部ヒンジをＩｇＧ４の下部ヒンジ配列に効果的に置き換える）及び他の変異を組み込むための足場として使用して、ヒト阻害性受容体であるＦｃγＲＩＩｂ（当業者に周知のｍＲＮＡスプライスバリアントのうちのいずれか又は全て、すなわち、ＦｃγＲＩＩｂ１、ＦｃγＲＩＩｂ２及びＦｃγＲＩＩｂ３を含む、に対する結合特異性及び親和性を改善し得ることを見出した（Ｇｅｔａｈｕｎ Ａ ａｎｄ ＪＣ Ｃａｍｂｉｅｒ，２０１５（前掲）、及びＣｈｅｎｏｗｅｔｈ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，２０２０（前掲）、Ａｎａｎｉａ ＪＣ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：１８０９，２０１８）。得られる変異型ＩｇＧ２抗体は、例えば、治療効果のためにＦｃγＲの「足場形成」が必要とされるｍＡｂの増強されたアゴニスト機能を潜在的に提供することができる。これらはまた、ＦｃγＲＩＩｂの正常な生理学的阻害機能、又はＦｃγＲＩＩｂによって媒介される抗原若しくは免疫複合体クリアランス（例えば、エンドサイトーシス／内在化又は「スイーピング」によって）を利用することが望ましい状況において、非アゴニスト療法用抗体の開発に有用であり得る。
【0013】
したがって、第１の態様では、本開示は、対象における疾患又は状態を治療する方法であって、ＦｃγＲＩＩｂへの結合及び／又はＦｃγＲＩＩｂの活性化が、当該疾患又は状態の治療又は予防に有益であり、当該方法が、ＩｇＧ２抗体に由来する少なくとも１つの重鎖ポリペプチドを含む有効量の免疫療法用タンパク質を当該対象に投与することを含み、当該重鎖ポリペプチドが、少なくとも定常重ドメイン２及び３（すなわち、ＣＨ２及びＣＨ３）と、下部ヒンジと、を含み、下部ヒンジの配列が、免疫療法用タンパク質がＦｃγＲＩＩｂに結合するかつ／又はＦｃγＲＩＩｂを活性化させることを可能にする変異を含む、方法を提供する。
【0014】
免疫療法用タンパク質の少なくとも１つの重鎖ポリペプチドは、例えば、重鎖ポリペプチドのＣＨ２及びＣＨ３ドメインが、野生型（ＷＴ）ＩｇＧ２抗体のＣＨ２／ＣＨ３ドメインの配列、又はより好ましくは、Ｗｉｎｅｓ ＢＤ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９７（４）：１５０７－１５１６，２０１６及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＨ００５２７３．２）によって提供されるもののようなＷＴヒトＩｇＧ２抗体のＣＨ２／ＣＨ３ドメインの配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を示すアミノ酸配列を含むという理由により、当業者がＩｇＧ２抗体に由来すると認識する任意の重鎖ポリペプチドであってもよい。
【0015】
当業者は、ＩｇＧ２抗体に由来する重鎖ポリペプチドが、例えば、完全長重鎖ポリペプチド（すなわち、定常重領域（ＣＨ）及び可変重（ＶＨ）領域を含む）を含み得るか、又は少なくともＣＨ２、ＣＨ３及び下部ヒンジを含むその断片を含み得ることを容易に理解するであろう。このような断片の１つの好ましい例は、抗体のパパイン消化（上部ヒンジ配列内のポリペプチドを切断して、各々がＣＨ２、ＣＨ３並びに下部及びコアヒンジ配列を含む２つの重鎖架橋断片を含むＦｃ断片を生成する）によって生成される断片の重鎖成分のうちの１つに対応するＦｃ断片である。同様の重鎖ポリペプチドは、「Ｆｃ断片」を生成するものとしても当業者に知られている、プラスミン及びヒト好中球エラスターゼ（ＮＨＥ）を用いた抗体の消化によって調製されてもよく、そのような重鎖ポリペプチドは、第１の態様の方法の免疫療法用タンパク質を好適に含んでもよい。好適な重鎖ポリペプチドの更なる例は、ＣＨ２、ＣＨ３及び下部ヒンジに加えて、ＩｇＧ２抗体の定常重ドメイン１（ＣＨ１）の全て若しくは一部、並びに／又はコアヒンジ及び／若しくは上部ヒンジ配列を含み得る。
【0016】
いくつかの実施形態では、免疫療法用タンパク質は、融合タンパク質又はタンパク質コンジュゲートの形態で提供される重鎖ポリペプチドを含んでもよい。当業者であれば、融合タンパク質では、重鎖ポリペプチドが、融合パートナーのＮ末端又はＣ末端のペプチド結合又は短いペプチドリンカー配列を介して、ポリペプチド又はペプチドパートナー（すなわち、融合パートナー）に共有結合（すなわち、「融合」）されることを理解し、一方、タンパク質コンジュゲートでは、重鎖ポリペプチドが、ジスルフィド結合などの化学連結、又はスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）（例えば、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）（ＢＳ３）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）若しくは酒石酸ジスクシンイミジル（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｔａｒｔｒａｔｅ、ＤＳＴ）などのホモ二官能性架橋剤などの架橋剤化合物を介して、コンジュゲートパートナー（ポリペプチド、ペプチド、又は他の化学物質であり得る）に共有結合又は非共有結合されて、アミン基、又はｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＤＳ）及びＮ－（ε－マレイミドカプロロキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）などのヘテロ二官能性架橋剤を連結するか、あるいは水素結合などの他の非共有結合によってコンジュゲートパートナーに共有結合又は非共有結合されることを理解すべきである。コンジュゲートパートナーがポリペプチドである場合、タンパク質コンジュゲートは、そうでなければ、架橋タンパク質とみなされ得る。コンジュゲートパートナーは、Ｎ末端又はＣ末端の重鎖ポリペプチドにコンジュゲートされてもよいが、そうでなければ、重鎖ポリペプチド上の任意の他の好適な部位（例えば、重鎖ポリペプチドに含まれる場合、ＣＨ１又は上部ヒンジ配列内）でコンジュゲートされてもよい。当業者は、融合パートナー又はコンジュゲートパートナーが１つ以上の有用な活性又は機能を提供し得ることを認識するであろう。例えば、融合パートナーは、タンパク質回収又は発現（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ））を改善し、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）若しくはＦＬＡＧタグなどの様々な親和性タグ、又は目的の抗原に結合する更なる能力を提供し得る。融合パートナー又はコンジュゲートパートナーの他の例としては、受容体（例えば、インターロイキンの受容体（例えば、ＩＬ－１受容体）若しくはＴＧＦ－βスーパーファミリーのサイトカインの受容体などのサイトカイン受容体）、又は細胞表面分子及び免疫チェックポイント（例えば、ＣＴＬＡ４又はＰＤ１）が挙げられる。
【0017】
いくつかの他の実施形態では、免疫療法用タンパク質は、二量体又は多量体形態で提供される少なくとも１つの重鎖ポリペプチドを含んでもよい。例えば、重鎖ポリペプチドは、特にヒンジ配列（特にコアヒンジ配列）内に位置する場合に、１つ以上のシステイン（Ｃ）残基を通して共有結合二量体を形成する天然の傾向を有し得る（Ｙｏｏ ＥＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：３１３４－３１３８，２００３）。多量体形態の重鎖ポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチドの３つ、４つ、５つ、６つなどのコピーを含む）を産生するのに好適な技術が記載されており、当業者に周知である（例えば、ヒトＩｇＧ２又はイソロイシンジッパー（ＩＬＺ）のヒンジ領域からマウスＩｇＧ２ａのＮ末端又はＣ末端までの連結した多量体化ドメイン（ＭＤ）配列を含むＦｃ多量体形態（ｓｔｒａｄｏｍｅｒｓ（商標））；Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１，ａｒｔｉｃｌｅ ４９６，２０２０）。重鎖ポリペプチドのそのような二量体又は多量体形態は、好ましくは可溶性である（すなわち、生理食塩水に）。
【0018】
更にいくつかの他の実施形態では、免疫療法用タンパク質は、２つの軽鎖ポリペプチドを有する２つの完全長重鎖ポリペプチドを含むＩｇＧ２抗体、特に、２つの重鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、ＩｇＧ２抗体がＦｃγＲＩＩｂに結合するかつ／又はＦｃγＲＩＩｂを活性化させることを可能にする変異を下部ヒンジ配列内に含む変異型ＩｇＧ２抗体を含む。
【0019】
野生型（ＷＴ）ヒトＩｇＧ２抗体は、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を示さないか、又は事実上検出できない（図１Ａを参照）。対照的に、本開示の方法は、ＩｇＧ２抗体がＦｃγＲＩＩｂに結合するかつ／又はＦｃγＲＩＩｂを活性化させることを可能にする変異型ヒトＩｇＧ２抗体（すなわち、少なくとも１つの重鎖ポリペプチドの下部ヒンジ配列における変異を含むＩｇＧ２抗体）を利用し得る。ＩｇＧ２下部ヒンジ配列における変異は、配列の置換、又は配列内の１つ以上のアミノ酸の置換を２３３～２３６位（ＥＵ番号付けシステム、Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ６３：７８－８５，１９６９及びＫａｂａｔ ＥＡ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，ＤＩＡＮＥ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ，１９９１；しかし、疑義を避けるために、本明細書で言及されるＩｇＧ２下部ヒンジ配列は、ＩｇＧ１の下部ヒンジ配列のアミノ酸と同等の位置にアミノ酸を含む）に含み得、この配列は、ヒトＩｇＧ２抗体におけるＰＶＡＧ（配列番号１４）である。ＩｇＧ２下部ヒンジ配列における変異は、アミノ酸の挿入又は付加を更に含み得、例えば、変異したヒトＩｇＧ２下部ヒンジ（ＰＶＡＧ：配列番号１４）配列は、変異型ＩｇＧ２抗体における５個のアミノ酸配列であってもよい。
【0020】
好ましくは、免疫療法用タンパク質において、下部ヒンジ配列は、以下のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３－Ｇ－Ｘ５（配列番号４）
式中、
Ｘ１は、プロリン（Ｐ）及びグルタミン酸（Ｅ）から選択され、
Ｘ２は、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、及びフェニルアラニン（Ｆ）から選択され、
Ｘ３は、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、及びグルタミン酸（Ｅ）から選択され、
Ｘ５は、グリシン（Ｇ）及びプロリン（Ｐ）から選択されるか、又は存在せず（すなわち、配列がＸ１Ｘ２Ｘ３－Ｇ：配列番号３１であるように）、
ただし、下部ヒンジは野生型ＩｇＧ２下部ヒンジ配列（例えば、ヒトＩｇＧ２抗体のＰＶＡＧ（配列番号１４））からなるものではない。
Ｘ１Ｘ２Ｘ３－Ｇ－Ｘ５（配列番号４）
式中、
Ｘ１は、プロリン（Ｐ）及びグルタミン酸（Ｅ）から選択され、
Ｘ２は、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、及びフェニルアラニン（Ｆ）から選択され、
Ｘ３は、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、及びグルタミン酸（Ｅ）から選択され、
Ｘ５は、グリシン（Ｇ）及びプロリン（Ｐ）から選択されるか、又は存在せず（すなわち、配列がＸ１Ｘ２Ｘ３－Ｇ：配列番号３１であるように）、
ただし、下部ヒンジは野生型ＩｇＧ２下部ヒンジ配列（例えば、ヒトＩｇＧ２抗体のＰＶＡＧ（配列番号１４））からなるものではない。
【0021】
いくつかの特定の好ましい実施形態では、変異型ＩｇＧ２抗体の下部ヒンジ配列は、ＥＬＬＧＧ（ヒトＩｇＧ１に由来、配列番号１）、ＥＦＬＧＧ（ヒトＩｇＧ４に由来、配列番号２）、ＥＦＬＧＰ（配列番号５）及びＥＦＥＧＧ（配列番号３）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0022】
上述のように、本開示の免疫療法用タンパク質（例えば、変異型ＩｇＧ２抗体）は、ＦｃγＲＩＩｂに結合し得るかつ／又はＦｃγＲＩＩｂを活性化させ得る。免疫療法用タンパク質がＦｃγＲＩＩｂに結合し、かつＦｃγＲＩＩｂを活性化させる場合、免疫療法用タンパク質は、ＦｃγＲＩＩｂ阻害機能を誘発するように作用し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ＦｃγＲＩＩｂの阻害効果が有益である疾患又は状態の治療又は予防に特に適している。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本開示の方法は、特に、例えば、アレルギー性疾患の治療又は予防を対象とし、免疫療法用タンパク質によるＦｃγＲＩＩｂの結合及び活性化は、ＩｇＥによるアレルギー性好塩基球活性化のＦｃγＲＩＩｂ依存性阻害を媒介する。
【0023】
本開示の方法は、アレルギー反応の治療又は予防のために実施され、免疫療法用タンパク質は、好ましくは、変異型下部ヒンジ配列ＥＦＬＧＧ（配列番号２）又はＥＬＬＧＧ（配列番号１）を含むタンパク質であり、以下に記載される実施例において、「ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ（配列番号６）」ｍＡｂ及び「ＩｇＧ２－ＬＬＧＧ（配列番号７）」ｍＡｂとして示される変異型ＩｇＧ２抗体は、ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性が比較的低いにもかかわらず、試験された変異型ＩｇＧ２抗体のＩｇＥ／ＦｃεＲＩ塩基親和性活性化の最も強力な阻害剤である（注：それらは免疫複合体としてのみ結合した）ことが見出された。
【0024】
いくつかの好ましい実施形態では、免疫療法用タンパク質は、重鎖ポリペプチド内（又は少なくとも、重鎖ポリペプチドの定常重領域内）に更なる変異を含まないが、いくつかの他の実施形態では、少なくとも１つの重鎖ポリペプチドのうちの１つ以上の更なる変異を更に含むことが有利であり得る。例えば、免疫療法用タンパク質（例えば、変異型ＩｇＧ２抗体）は、重鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つ、及びより好ましくはその両方、のＣＨ２ドメインにおける２６７位及び／又は３２８位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換、例えば、それぞれいわゆる「ＳＥＬＦ」変異と呼ばれるＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ置換を更に含み得る。以下に説明する実施例では、ＥＦＥＧＧ（配列番号３）変異型下部ヒンジ配列及びＳＥＬＦ変異を有する変異型ＩｇＧ２抗体（例えば、「ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ（配列番号８）－ＳＥＬＦ」ｍＡｂ）が、試験された変異型ＩｇＧ２抗体の最も特異的な方法でＦｃγＲＩＩｂに結合し、阻害効力を保持したことが見出された。
【0025】
しかしながら、ＳＥＬＦ変異は、変異型ＩｇＧ２抗体とＦｃγＲＩＩｂとの相互作用を増強したが、インビボでは、対象におけるそのような変異型ＩｇＧ２抗体の特異性は、ＦｃγＲＩＩａの高／低レスポンダ多型の存在によって決定されてもよく、その理由は、ＳＥＬＦ変異を含む抗体は、ＦｃγＲＩＩｂ及び活性化受容体型ＦｃγＲＩＩａ（「Ａｒｇ１３１形態」のみであって、「Ｈｉｓ１３１形態」ではない）との高い親和性相互作用を有することが見出されているからである。したがって、本方法がＳＥＬＦ変異を含む変異型ＩｇＧ２抗体の投与を伴ういくつかの実施形態では、本方法は、好ましくは、ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１に対してホモ接合性の対象（注：ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１に対してホモ接合性の対象は、集団の約３０％に相当する；ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌ ＷＬ ａｎｄ Ｊ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４８：２２２－２３２，１９９８）とともに使用することを意図され得る。そのような実施形態では、本方法は、ＦｃγＲＩＩａの高／低レスポンダ多型について遺伝子型決定することによって対象を選択するステップを更に含み得る。すなわち、いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１に対してホモ接合性であると判定された対象は、ＳＥＬＦ変異を含む変異型ＩｇＧ２抗体を投与することによる治療のために選択されてもよい。
【0026】
免疫療法用タンパク質が変異型ＩｇＧ２抗体を含む場合、変異型ＩｇＧ２抗体は典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含み、好ましくはヒトｍＡｂ又はヒト化ｍＡｂである。そのような抗体は、当業者に既知の標準的な方法論のうちのいずれかに従って産生され得る。例えば、当業者は、標準的な分子生物学技術を使用して構築物を生成することによって、本開示の方法において使用するのに好適な変異型ＩｇＧ２抗体を容易に調製することができ、この構築物は、好適な抗体（例えば、目的の抗原に結合する抗原結合領域を含むもの）の可変重（ＶＨ）及び軽（ＶＬ）領域配列並びにＩｇＧ２抗体（例えば、Ｗｉｎｅｓ ＢＤ ｅｔ ａｌ．，２０１６（前掲）に記載されているような）からの定常重（ＣＨ）領域をコードするポリヌクレオチド配列を含み、部位特異的変異誘発などの標準的な分子生物学技術、上記の下部ヒンジ配列変異（及び所望する場合にはＳＥＬＦ変異）をコードするポリヌクレオチド配列変化によって、ＣＨ領域をコードするポリヌクレオチド配列に組み込まれる。構築物は、好適な宿主細胞（例えば、ヒト腎臓（ＨＥＫ）宿主細胞）に導入され、標準的な培養プロトコルに従って培養され、発現された変異型ＩｇＧ２抗体は、例えば精製のための既知の好適な方法論（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）のうちのいずれかを使用して培養上清から精製される。
【0027】
ＦｃγＲＩＩｂの活性化による疾患の治療
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、対象における疾患又は状態を治療するために使用されてもよく、ＦｃγＲＩＩｂの活性化（すなわち、阻害作用の動員のため）は、当該疾患又は状態の治療又は予防に有益である。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、対象における疾患又は状態を治療するために使用されてもよく、ＦｃγＲＩＩｂの活性化（すなわち、阻害作用の動員のため）は、当該疾患又は状態の治療又は予防に有益である。
【0028】
そのような実施形態のいくつかの例では、免疫療法用タンパク質は、例えば、（ａ）抗原（例えば、受容体に結合したＩｇＧ、ＩｇＥ若しくはＩｇＡなどの抗体に結合したアレルゲン又は自己抗原）、（ｂ）活性化受容体に結合した抗体、（ｃ）活性化受容体の抗体（リガンド）結合ドメイン、又は（ｄ）活性化受容体のサブユニット（例えば、Ｆｃ受容体共通γ鎖）などの潜在的なシグナル伝達複合体の成分を認識する抗原結合領域（例えば、Ｆａｂ領域）などの結合ドメインを含むことによって、ＩＴＡＭシグナル伝達受容体複合体を標的としてもよく、一方、他の例では、免疫療法用タンパク質は、例えば、（ａ）ＢＣＲ複合体の免疫グロブリン成分に結合した抗原（例えば、アレルゲン、自己抗原、細菌若しくはウイルス病原体の抗原などの感染性因子の抗原、又は移植された組織若しくは臓器からの抗原）、又は（ｂ）ＢＣＲ複合体のサブユニット（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、若しくはＩｇＡなどのＢＣＲ複合体の膜免疫グロブリン）若しくは関連するＩｇ－α若しくはβ鎖（例えば、ＣＤ７９ａ若しくはＣＤ７９ｂ、又はＣＤ１９、ＣＤ２１若しくはＣＤ８１）を含むＢ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）複合体の成分を標的としてもよい。
【0029】
そのような実施例の全てにおいて、免疫療法用タンパク質は、ＩＴＡＭ含有活性化受容体と阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂとの必要な共架橋をもたらし、ＦｃγＲＩＩｂの阻害作用を動員し、上記の考察から理解されるように、これは、免疫療法用タンパク質の標的がかなり変化するいくつかの異なる方法で達成され得、したがって、幅広い範囲の異なる疾患又は状態の治療又は予防のためのそれらの潜在的な使用を可能にする。
【0030】
より具体的には、免疫療法用タンパク質が、ＦｃγＲＩＩｂへの結合及びＦｃγＲＩＩｂの活性化による疾患又は状態の治療又は予防のために使用されることが意図されるいくつかの例では、免疫療法用タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分を介してＦｃεＲＩに結合した免疫複合体（すなわち、抗原がＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＡと複合化されている）、又は活性化型ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、及びＦｃγＲＩＩＩａ若しくはＦｃγＲＩＩＩｂ、それぞれ別名ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ、及びＣＤ１６ｂとして知られている）、又は活性化型受容体ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）中に存在する目的の抗原に標的化された抗原結合領域などの結合ドメインを含んでもよい。したがって、目的の抗原は、例えば、アレルギー性疾患の治療又は予防のための免疫療法用タンパク質の使用のためのアレルゲン（例えば、蜂毒）、自己免疫疾患の治療又は予防のための免疫療法用タンパク質の使用のための自己抗原（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は多発性硬化症（ＭＳ）に関連する自己抗原）、免疫複合体血管炎などの他の炎症性疾患に関連する抗原、抗体媒介性移植拒絶の治療又は予防のための免疫療法用タンパク質の使用を可能にする、移植された組織又は器官からの抗原、及び細菌又はウイルス病原体の抗原（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はデングウイルスの抗原）などの感染性因子の抗原から選択され得る。
【0031】
あるいは、免疫療法用タンパク質が、ＦｃγＲＩＩｂへの結合及びＦｃγＲＩＩｂの活性化による疾患又は状態の治療又は予防のために使用されることが意図されるいくつかの例では、免疫療法用タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分を介してＦｃεＲＩに結合した免疫複合体、又は活性化型ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、及びＦｃγＲＩＩＩａ若しくはＦｃγＲＩＩＩｂ）、又は活性化型受容体ＦｃαＲＩ中に存在する免疫グロブリンを標的とする抗原結合領域などの結合ドメインを含んでもよい。すなわち、抗原がＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＡと複合化される場合、免疫療法用タンパク質は、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＡの重鎖又は軽鎖に標的化されて、ＦｃγＲＩＩｂと活性化Ｆｃ受容体との共架橋をもたらし得る。したがって、このように標的化された免疫療法用タンパク質はまた、アレルギー性疾患（例えば、アレルゲンが標的化された免疫グロブリンと複合化されている場合）、ＳＬＥ及びＭＳなどの自己免疫疾患（例えば、自己抗原が免疫療法用タンパク質によって標的化された免疫グロブリンと複合化されている場合）、免疫複合体血管炎などの他の炎症性疾患（例えば、関連する抗原が標的化された免疫グロブリンと複合化されている場合）、抗体媒介性移植拒絶（例えば、移植された組織又は器官からの抗原が標的化された免疫グロブリンと複合化されている場合）、並びに感染性疾患（例えば、感染性因子の抗原が標的化された免疫グロブリンと複合化されている場合）、更には増殖性疾患（例えば、がん抗原が、療法用タンパク質によって標的化された免疫グロブリンと複合化されている場合）の治療又は予防のためにも使用することができる。
【0032】
更に、免疫療法用タンパク質がＦｃγＲＩＩｂへの結合及びＦｃγＲＩＩｂの活性化による疾患又は状態の治療又は予防のために使用されることが意図されるいくつかの例では、免疫療法用タンパク質は、免疫複合体が活性化Ｆｃ受容体（又は１つ以上のサブユニット）に結合しているかどうかにかかわらず、免疫グロブリンＦｃ結合サブユニット又は発現及び／若しくはシグナル伝達に必要な関連サブユニットなどの活性化Ｆｃ受容体又はその１つ以上のサブユニットに標的化された抗原結合領域などの結合ドメインを含んでもよい（例えば、結合ドメインは、リガンド結合鎖ＦｃεＲＩαサブユニット、並びに関連するＦｃεＲＩβ及びγサブユニットから構成されるＦｃεＲＩのサブユニットのうちのいずれかに標的化され得る）。したがって、このように標的化された免疫療法用タンパク質は、アレルギー性疾患（例えば、アレルゲンを含む免疫複合体が活性化ＦｃＲに結合している場合）、ＳＬＥ及びＭＳなどの自己免疫疾患（例えば、自己抗原を含む免疫複合体が活性化ＦｃＲに結合している場合）、免疫複合体血管炎などの他の炎症性疾患（例えば、関連する抗原を含む免疫複合体が活性化ＦｃＲに結合している場合）、抗体媒介性移植拒絶（例えば、移植された組織又は器官からの抗原を含む免疫複合体が活性化ＦｃＲに結合している場合）、並びに感染症（例えば、感染性因子の抗原を含む免疫複合体が活性化ＦｃＲに結合している場合）の治療又は予防のためにも使用することができる。
【0033】
更に、免疫療法用タンパク質が、ＦｃγＲＩＩｂへの結合及びＦｃγＲＩＩｂの活性化による疾患又は状態の治療又は予防のために使用されることが意図されるいくつかの例では、免疫療法用タンパク質は、Ｂ細胞受容体複合体（ＢＣＲ）（すなわち、抗原がＢ細胞の表面上の膜ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＡに結合している）に結合している目的の抗原に標的化された抗原結合領域などの結合ドメインを含んでもよい。したがって、このように標的化された免疫療法用タンパク質は、結合した抗原を含むＢＣＲへのＦｃγＲＩＩｂの共架橋がＦｃγＲＩＩｂの活性化をもたらし、それによって、抗体産生（及び／又はＢ細胞増殖）を停止するＦｃγＲＩＩｂ阻害作用を動員するように、アレルギー性疾患（例えば、免疫療法用タンパク質がＢＣＲの膜免疫グロブリンに結合した抗原に結合する場合）の治療又は予防のために使用することができる。同様に、そのような免疫療法用タンパク質は、ＳＬＥ及びＭＳなどの自己免疫疾患、免疫複合体血管炎などの他の炎症性疾患、抗体媒介性移植拒絶、及び感染性疾患の治療又は予防のために使用することができる。
【0034】
更に、免疫療法用タンパク質が、ＦｃγＲＩＩｂへの結合及びＦｃγＲＩＩｂの活性化による疾患又は状態の治療又は予防のために使用されることが意図されるいくつかの例では、免疫療法用タンパク質は、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）複合体などのＦｃ受容体以外の活性化受容体に標的化される抗原結合領域などの結合ドメインを含んでもよい。例えば、免疫療法用タンパク質は、例えば、膜免疫グロブリンの可変ドメイン（例えば、免疫療法用タンパク質は、抗イディオタイプＩｇＧ２抗体であり得る）を標的とすることによって、ＢＣＲ複合体の膜免疫グロブリン（例えば、Ｂ細胞の表面上の膜ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＡ）に標的化されてもよい。標的化ＢＣＲの膜免疫グロブリンは、結合抗原を含んでも、含まなくてもよい。したがって、このように標的化された免疫療法用タンパク質は、ＦｃγＲＩＩｂのＢＣＲへの共架橋がＦｃγＲＩＩｂの活性化をもたらし、それによって抗体産生（及び／又はＢ細胞増殖）を停止するＦｃγＲＩＩｂ阻害作用を動員するように、アレルギー性疾患（例えば、免疫療法用タンパク質が結合アレルゲンの有無にかかわらず、ＢＣＲ複合体の膜免疫グロブリンに結合する場合）の治療又は予防のために使用することができる。同様に、そのような免疫療法用タンパク質は、ＳＬＥ及びＭＳなどの自己免疫疾患、免疫複合体血管炎などの他の炎症性疾患、抗体媒介性移植拒絶、及び感染性疾患の治療又は予防のために使用することができる。加えて、ＢＣＲなどの非Ｆｃ型活性化受容体に標的化される免疫療法用タンパク質は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞リンパ腫）、及びＸ連鎖性増殖性疾患などの増殖性疾患、特にリンパ増殖性疾患（ＬＰＤ）の治療又は予防のためにも使用することができ、ＦｃγＲＩＩｂのＢＣＲへの共架橋をもたらす免疫療法用タンパク質の能力は、次に、ＦｃγＲＩＩｂの活性化を引き起こし、それによって、ＦｃγＲＩＩｂ阻害作用を動員して、がん性細胞の増殖を停止させることができる。
【0035】
更に、免疫療法用タンパク質がＦｃγＲＩＩｂへの結合及びＦｃγＲＩＩｂの活性化による疾患又は状態の治療又は予防のために使用されることが意図されるいくつかの例では、免疫療法用タンパク質は、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）複合体又はその１つ以上のサブユニット、例えば、発現及び／又はシグナル伝達に必要な膜免疫グロブリン又は関連サブユニットに標的化された抗原結合領域などの結合ドメインを含んでもよい（例えば、結合ドメインは、抗原結合膜免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ若しくはＩｇＡ）、並びに関連するＩｇ－α若しくはβ鎖（例えば、ＣＤ７９ａ若しくはＣＤ７９ｂ）又は他の関連タンパク質（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２１若しくはＣＤ８１）から構成されるＢＣＲ複合体のサブユニットのうちのいずれかに標的化され得る。標的化ＢＣＲの膜免疫グロブリンは、結合抗原を含んでも、含まなくてもよい。したがって、このように標的化された免疫療法用タンパク質はまた、アレルギー性疾患（例えば、アレルゲンがＢＣＲ複合体に結合していても、していなくてもよい場合）、ＳＬＥ及びＭＳなどの自己免疫疾患（例えば、自己抗原がＢＣＲ複合体に結合している場合）、免疫複合体血管炎等の他の炎症性疾患（例えば、関連抗原がＢＣＲ複合体に結合している場合）、抗体媒介性移植拒絶（例えば、移植された組織又は器官からの関連抗原がＢＣＲ複合体に結合している場合）、及び感染性疾患（例えば、感染性因子の関連抗原がＢＣＲ複合体に結合している場合）の治療又は予防のために使用することができる。
【0036】
アレルギー性疾患
肥満細胞及び好塩基球は、アレルギー性疾患の病因における２つの重要なエフェクター細胞であり、いずれも高親和性ＩｇＥ受容体であるＦｃεＲＩを発現する。しかしながら、それらは、ＩｇＧ受容体ＦｃγＲ、ＦｃεＲＩのシグナル伝達を阻害し、好塩基球の活性化を減少させることができる、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂを発現する好塩基球の発現プロファイルの点で異なる。変異型ＩｇＧ２抗体などの本開示の免疫療法用タンパク質は、（好塩基球表面上の活性化ＦｃＲに結合した免疫複合体内で）アレルゲンに結合し、ＦｃγＲＩＩｂにも結合して活性化ＦｃＲへの共架橋をもたらし、それによってＦｃγＲＩＩｂを活性化させる（すなわち、ＦｃγＲＩＩｂ阻害機能を動員する、より具体的には、変異型ＩｇＧ２抗体のＦｃγＲＩＩｂへの結合が、ＩｇＥによるアレルギー性好塩基球活性化のＦｃγＲＩＩｂ依存性阻害を媒介する）ように標的化され得るため、本開示の方法は、重度の花粉症、アトピー性皮膚炎、ピーナッツアレルギーなどの食物アレルギー、及び毒素（例えば、蜂毒）に対するアレルギーのようなアレルギー性疾患及び状態の治療又は予防を可能にする。ＦｃγＲＩＩｂを発現するヒト肥満細胞のサブセットはまた、ヒト肥満細胞細胞のサブセット上でのその発現を介して（Ｂｕｒｔｏｎ ＯＴ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：１２４４． ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｉｍｍｕ ２０１８）、アレルギー性疾患及び状態を調節するように作用し得る（例えば、ｆｏｏｄ ａｌｌｅｒｇｙ，Ｂｕｒｔｏｎ ＯＴ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４１（１）：１８９－２０１．ｅ３，２０１８）。したがって、変異型ＩｇＧ２抗体などの本開示の免疫療法用タンパク質は、肥満細胞上でＦｃγＲＩＩｂ阻害機能を動員し得る。望ましくは、変異型ＩｇＧ２抗体はまた、望ましくない肥満細胞活性化を回避するために、ＦｃγＲＩ（強力な肥満細胞活性化を誘導することができる）への結合能を示さない、又はわずかに示し得る。
肥満細胞及び好塩基球は、アレルギー性疾患の病因における２つの重要なエフェクター細胞であり、いずれも高親和性ＩｇＥ受容体であるＦｃεＲＩを発現する。しかしながら、それらは、ＩｇＧ受容体ＦｃγＲ、ＦｃεＲＩのシグナル伝達を阻害し、好塩基球の活性化を減少させることができる、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂを発現する好塩基球の発現プロファイルの点で異なる。変異型ＩｇＧ２抗体などの本開示の免疫療法用タンパク質は、（好塩基球表面上の活性化ＦｃＲに結合した免疫複合体内で）アレルゲンに結合し、ＦｃγＲＩＩｂにも結合して活性化ＦｃＲへの共架橋をもたらし、それによってＦｃγＲＩＩｂを活性化させる（すなわち、ＦｃγＲＩＩｂ阻害機能を動員する、より具体的には、変異型ＩｇＧ２抗体のＦｃγＲＩＩｂへの結合が、ＩｇＥによるアレルギー性好塩基球活性化のＦｃγＲＩＩｂ依存性阻害を媒介する）ように標的化され得るため、本開示の方法は、重度の花粉症、アトピー性皮膚炎、ピーナッツアレルギーなどの食物アレルギー、及び毒素（例えば、蜂毒）に対するアレルギーのようなアレルギー性疾患及び状態の治療又は予防を可能にする。ＦｃγＲＩＩｂを発現するヒト肥満細胞のサブセットはまた、ヒト肥満細胞細胞のサブセット上でのその発現を介して（Ｂｕｒｔｏｎ ＯＴ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：１２４４． ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｉｍｍｕ ２０１８）、アレルギー性疾患及び状態を調節するように作用し得る（例えば、ｆｏｏｄ ａｌｌｅｒｇｙ，Ｂｕｒｔｏｎ ＯＴ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４１（１）：１８９－２０１．ｅ３，２０１８）。したがって、変異型ＩｇＧ２抗体などの本開示の免疫療法用タンパク質は、肥満細胞上でＦｃγＲＩＩｂ阻害機能を動員し得る。望ましくは、変異型ＩｇＧ２抗体はまた、望ましくない肥満細胞活性化を回避するために、ＦｃγＲＩ（強力な肥満細胞活性化を誘導することができる）への結合能を示さない、又はわずかに示し得る。
【0037】
自己免疫疾患及び状態
例えば、自己抗原を含む結合免疫複合体を介してＦｃγＲＩＩｂを活性化型ＦｃＲに共架橋することによって、罹患した対象内に存在するＦｃγＲＩＩｂ受容体の活性化を促進することによって、本開示の方法は、上記のようなものなどの自己免疫疾患及び状態の有益な治療及び／又は予防を可能にする。しかしながら、対象におけるＦｃγＲＩＩｂの発現及び／又はシグナル伝達活性の低下（例えば、受容体発現及びシグナル伝達に影響を及ぼすＦｃγＲＩＩｂのプロモーター及び膜貫通ドメインにおける多型に起因する）は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）及び関節リウマチ（ＲＡ）を含む自己免疫疾患及び状態に対する感受性の増加と関連している（Ｆｌｏｔｏ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １１：１０５６－１０５８，２００５、Ｌｉ Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：３２４２－３２５２，２００３、及びＲａｄｓｔａｋｅ ＴＲ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５４：３８２８－３８３７，２００６）。したがって、本開示の方法が自己免疫疾患又は状態に罹患しているか、又はその傾向がある対象との使用を意図されているいくつかの実施形態では、本方法は、ＦｃγＲＩＩｂのプロモーター及び膜貫通ドメインにおける関連する多型（例えば、ＦＣＧＲ２Ｂのプロモーター領域における多型（Ｓｕ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：７１８６－７１９１，２００４、及びＢｌａｎｋ ＭＣ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １１７：２２０－２２７，２００５）、及びＦｃγＲＩＩｂの膜貫通ドメインにおけるＩ２３２Ｔ多型（Ｋｙｏｇｏｋｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４６：１２４２－１２５４，２００２））について遺伝子型決定することによって対象を選択するステップを更に含み得る。
例えば、自己抗原を含む結合免疫複合体を介してＦｃγＲＩＩｂを活性化型ＦｃＲに共架橋することによって、罹患した対象内に存在するＦｃγＲＩＩｂ受容体の活性化を促進することによって、本開示の方法は、上記のようなものなどの自己免疫疾患及び状態の有益な治療及び／又は予防を可能にする。しかしながら、対象におけるＦｃγＲＩＩｂの発現及び／又はシグナル伝達活性の低下（例えば、受容体発現及びシグナル伝達に影響を及ぼすＦｃγＲＩＩｂのプロモーター及び膜貫通ドメインにおける多型に起因する）は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）及び関節リウマチ（ＲＡ）を含む自己免疫疾患及び状態に対する感受性の増加と関連している（Ｆｌｏｔｏ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １１：１０５６－１０５８，２００５、Ｌｉ Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：３２４２－３２５２，２００３、及びＲａｄｓｔａｋｅ ＴＲ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５４：３８２８－３８３７，２００６）。したがって、本開示の方法が自己免疫疾患又は状態に罹患しているか、又はその傾向がある対象との使用を意図されているいくつかの実施形態では、本方法は、ＦｃγＲＩＩｂのプロモーター及び膜貫通ドメインにおける関連する多型（例えば、ＦＣＧＲ２Ｂのプロモーター領域における多型（Ｓｕ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：７１８６－７１９１，２００４、及びＢｌａｎｋ ＭＣ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １１７：２２０－２２７，２００５）、及びＦｃγＲＩＩｂの膜貫通ドメインにおけるＩ２３２Ｔ多型（Ｋｙｏｇｏｋｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４６：１２４２－１２５４，２００２））について遺伝子型決定することによって対象を選択するステップを更に含み得る。
【0038】
感染性疾患
本開示による変異型ＩｇＧ２抗体などの免疫療法用タンパク質を使用して、例えば、Ｂリンパ球上のＢＣＲのＩＴＡＭ受容体ベースのシグナル伝達の調節（すなわち、ＦｃγＲＩＩｂ（ＩＴＩＭ受容体）を共発現する細胞上のＩＴＡＭ受容体を標的とすることによる）を標的とすることができる。すなわち、Ｂ細胞において、ＢＣＲのＦｃγＲＩＩｂ阻害は、抗体産生を調節するための重要な免疫チェックポイントであり（Ｌｅｈｍａｎｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：２４３－２５４，２０１２）、おそらくは体細胞過剰変異中の自己反応性Ｂ細胞のアポトーシスによる除去によって（Ｐｅａｒｓｅ ＲＮ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：７５３－７６０，１９９９）、体液性免疫系の選択的抗原特異性を制限し、Ｂ細胞の産生を適切な抗体レパートリーに向ける。これは、もちろん、細菌病原体（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（「黄金ブドウ球菌（Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｔａｐｈ）」））又はウイルス（例えば、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、及びヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１））による感染と「戦う」上で有益であり得る。
本開示による変異型ＩｇＧ２抗体などの免疫療法用タンパク質を使用して、例えば、Ｂリンパ球上のＢＣＲのＩＴＡＭ受容体ベースのシグナル伝達の調節（すなわち、ＦｃγＲＩＩｂ（ＩＴＩＭ受容体）を共発現する細胞上のＩＴＡＭ受容体を標的とすることによる）を標的とすることができる。すなわち、Ｂ細胞において、ＢＣＲのＦｃγＲＩＩｂ阻害は、抗体産生を調節するための重要な免疫チェックポイントであり（Ｌｅｈｍａｎｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：２４３－２５４，２０１２）、おそらくは体細胞過剰変異中の自己反応性Ｂ細胞のアポトーシスによる除去によって（Ｐｅａｒｓｅ ＲＮ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：７５３－７６０，１９９９）、体液性免疫系の選択的抗原特異性を制限し、Ｂ細胞の産生を適切な抗体レパートリーに向ける。これは、もちろん、細菌病原体（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（「黄金ブドウ球菌（Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｔａｐｈ）」））又はウイルス（例えば、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、及びヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１））による感染と「戦う」上で有益であり得る。
【0039】
増殖性疾患
Ｂリンパ球のＢＣＲは、様々なＢ細胞由来のリンパ系がんの発病に関与することが示されており、ますます多くの証拠によって、ＢＣＲの抗原非依存的な自己会合が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、重鎖疾患（ＨＣＤ）、及び活性化Ｂ細胞様亜型びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ ＤＬＢＣＬ）などの多くのＢ細胞腫瘍型における重要な特徴であることが示唆されている（Ｄｕｈｒｅｎ－ｖｏｎ Ｍｉｎｄｅｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６３（７４１５）：３０９－３１２，２０１２、Ｃｏｒｃｏｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（１０）：１１４０－１１４８，１９９５、及びＤａｖｉｓ ＲＥ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６３（７２７７）：８８－９２，２０１０）。したがって、本開示の方法はまた、増殖性疾患、特にＢ細胞由来のリンパ系がんの予防及び／又は治療に適用されてもよく、変異型ＩｇＧ２抗体を使用して、例えば、ＢＣＲ又はＢＣＲのサブユニットに複合化された（すなわち、変異型ＩｇＧ２抗体によって標的化された）関連抗原を介してＦｃγＲＩＩｂをＢＣＲに共架橋することによって、Ｂ細胞上のＦｃγＲＩＩｂを活性化させて、ＢＣＲシグナル伝達の阻害をもたらすことができる。
Ｂリンパ球のＢＣＲは、様々なＢ細胞由来のリンパ系がんの発病に関与することが示されており、ますます多くの証拠によって、ＢＣＲの抗原非依存的な自己会合が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、重鎖疾患（ＨＣＤ）、及び活性化Ｂ細胞様亜型びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ ＤＬＢＣＬ）などの多くのＢ細胞腫瘍型における重要な特徴であることが示唆されている（Ｄｕｈｒｅｎ－ｖｏｎ Ｍｉｎｄｅｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６３（７４１５）：３０９－３１２，２０１２、Ｃｏｒｃｏｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（１０）：１１４０－１１４８，１９９５、及びＤａｖｉｓ ＲＥ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６３（７２７７）：８８－９２，２０１０）。したがって、本開示の方法はまた、増殖性疾患、特にＢ細胞由来のリンパ系がんの予防及び／又は治療に適用されてもよく、変異型ＩｇＧ２抗体を使用して、例えば、ＢＣＲ又はＢＣＲのサブユニットに複合化された（すなわち、変異型ＩｇＧ２抗体によって標的化された）関連抗原を介してＦｃγＲＩＩｂをＢＣＲに共架橋することによって、Ｂ細胞上のＦｃγＲＩＩｂを活性化させて、ＢＣＲシグナル伝達の阻害をもたらすことができる。
【0040】
ＦｃγＲＩＩｂ媒介性エンドサイトーシス／内在化（「スイーピング」）による疾患の治療
いくつかの他の実施形態では、本開示の方法は、対象における疾患又は状態の治療のために使用されてもよく、白血球及びいくつかの他の非造血細胞型（例えば、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ））の表面上に存在するＦｃγＲＩＩｂによる循環からの免疫複合体（例えば、オプソナイズドウイルス、タンパク質（例えば、サイトカイン）及び毒素を含む「小さな」可溶性複合体；Ｉｗａｙａｎａｇｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９５：３１９８－３２０５，２０１５、及びＭａｔｅｓ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：３５，２０１７）のクリアランスは、当該疾患又は状態の治療又は予防に有益である。Ｆｃ受容体型及び貪食細胞（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）を活性化させることによって実行され、例えば、細菌、寄生虫及びがん性細胞などの大きなものを含む大きな免疫複合体を除去する貪食とは機構的に異なり、この現象を中心とした新しい治療薬の開発にはかなりの関心がある（例えば、Ｉｗａｙａｎａｇｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５（前掲）、及びＣｈｅｎｏｗｅｔｈ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，２０２０（前掲）を参照されたい）。したがって、そのような実施形態のいくつかの例では、変異型ＩｇＧ２抗体などの免疫療法用タンパク質は、例えば、抗原（例えば、ウイルス抗原）、又は免疫グロブリン、ホルモン、代謝物、サイトカイン若しくは毒素などの他のタンパク質若しくは化学物質に標的化されて、小さな可溶性免疫複合体の形成を可能にし得る。次に、ＬＳＥＣのＦｃγＲＩＩｂ受容体への免疫療法用タンパク質の結合は、循環からの免疫複合体のスイーピングクリアランスを媒介し得る。したがって、そのような免疫療法用タンパク質は、例えば、感染性疾患（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症などのウイルス感染症、又は内毒素などの毒素の産生を特徴とする感染症）、及びクッシング症候群などの内分泌障害（Ｂｕｌｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｌｉｆｅ ９：１２－１８，２０１６）、並びに、例えばサイトカインの過剰発現を特徴とする炎症性疾患（疾患の再燃中の循環単球からのＩＬ－１βの過剰発現を特徴とするＴＮＦ受容体関連周期症候群（ＴＲＡＰＳ）（Ｂａｃｈｅｔｔｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ７２：１０４４－１０５２，２０１３）、ＩＬ－１７又はＩＬ－２３の産生を特徴とする乾癬、ＴＮＦ又はＩＬ－１βなどのサイトカインの産生を特徴とする関節リウマチ、自己抗体の産生を特徴とする自己免疫疾患、及びＩｇＥの産生を特徴とするアレルギー疾患など）の治療又は予防のために使用することができる。
いくつかの他の実施形態では、本開示の方法は、対象における疾患又は状態の治療のために使用されてもよく、白血球及びいくつかの他の非造血細胞型（例えば、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ））の表面上に存在するＦｃγＲＩＩｂによる循環からの免疫複合体（例えば、オプソナイズドウイルス、タンパク質（例えば、サイトカイン）及び毒素を含む「小さな」可溶性複合体；Ｉｗａｙａｎａｇｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９５：３１９８－３２０５，２０１５、及びＭａｔｅｓ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：３５，２０１７）のクリアランスは、当該疾患又は状態の治療又は予防に有益である。Ｆｃ受容体型及び貪食細胞（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）を活性化させることによって実行され、例えば、細菌、寄生虫及びがん性細胞などの大きなものを含む大きな免疫複合体を除去する貪食とは機構的に異なり、この現象を中心とした新しい治療薬の開発にはかなりの関心がある（例えば、Ｉｗａｙａｎａｇｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５（前掲）、及びＣｈｅｎｏｗｅｔｈ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，２０２０（前掲）を参照されたい）。したがって、そのような実施形態のいくつかの例では、変異型ＩｇＧ２抗体などの免疫療法用タンパク質は、例えば、抗原（例えば、ウイルス抗原）、又は免疫グロブリン、ホルモン、代謝物、サイトカイン若しくは毒素などの他のタンパク質若しくは化学物質に標的化されて、小さな可溶性免疫複合体の形成を可能にし得る。次に、ＬＳＥＣのＦｃγＲＩＩｂ受容体への免疫療法用タンパク質の結合は、循環からの免疫複合体のスイーピングクリアランスを媒介し得る。したがって、そのような免疫療法用タンパク質は、例えば、感染性疾患（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症などのウイルス感染症、又は内毒素などの毒素の産生を特徴とする感染症）、及びクッシング症候群などの内分泌障害（Ｂｕｌｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｌｉｆｅ ９：１２－１８，２０１６）、並びに、例えばサイトカインの過剰発現を特徴とする炎症性疾患（疾患の再燃中の循環単球からのＩＬ－１βの過剰発現を特徴とするＴＮＦ受容体関連周期症候群（ＴＲＡＰＳ）（Ｂａｃｈｅｔｔｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ７２：１０４４－１０５２，２０１３）、ＩＬ－１７又はＩＬ－２３の産生を特徴とする乾癬、ＴＮＦ又はＩＬ－１βなどのサイトカインの産生を特徴とする関節リウマチ、自己抗体の産生を特徴とする自己免疫疾患、及びＩｇＥの産生を特徴とするアレルギー疾患など）の治療又は予防のために使用することができる。
【0041】
ＦｃγＲＩＩｂ媒介性足場形成による疾患の治療
いくつかの他の実施形態では、本開示の方法は、対象における疾患又は状態を治療するために使用され得、免疫療法用タンパク質の増強されたアゴニスト機能は、ＦｃγＲＩＩｂ「足場形成」によって達成され得、エフェクター細胞内ではシグナルは生成されないが、１つの細胞上のＦｃγＲＩＩｂによるオプソナイジング抗体（例えば、本開示の変異型ＩｇＧ２抗体）の「超架橋」が、例えば、細胞のアゴニスト的増殖におけるアポトーシス若しくは活性化の誘導及び／又はそれらのサイトカイン分泌などの有益な治療効果をもたらし得るコンジュゲート標的細胞内でシグナルを生成する（Ｃｈｅｎｏｗｅｔｈ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，２０２０（前掲））。したがって、そのような実施形態のいくつかの例では、変異型ＩｇＧ２抗体等の免疫療法用タンパク質は、例えば、がん性細胞（例えば、ＣＤ２０）の表面上に存在するがん抗原、又は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）上に存在する細胞表面抗原（例えば、ＣＴＬＡ４）に標的化されてもよい。したがって、そのような免疫療法用タンパク質は、例えば、増殖性疾患及び自己免疫疾患の治療又は予防のために使用できる。
いくつかの他の実施形態では、本開示の方法は、対象における疾患又は状態を治療するために使用され得、免疫療法用タンパク質の増強されたアゴニスト機能は、ＦｃγＲＩＩｂ「足場形成」によって達成され得、エフェクター細胞内ではシグナルは生成されないが、１つの細胞上のＦｃγＲＩＩｂによるオプソナイジング抗体（例えば、本開示の変異型ＩｇＧ２抗体）の「超架橋」が、例えば、細胞のアゴニスト的増殖におけるアポトーシス若しくは活性化の誘導及び／又はそれらのサイトカイン分泌などの有益な治療効果をもたらし得るコンジュゲート標的細胞内でシグナルを生成する（Ｃｈｅｎｏｗｅｔｈ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，２０２０（前掲））。したがって、そのような実施形態のいくつかの例では、変異型ＩｇＧ２抗体等の免疫療法用タンパク質は、例えば、がん性細胞（例えば、ＣＤ２０）の表面上に存在するがん抗原、又は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）上に存在する細胞表面抗原（例えば、ＣＴＬＡ４）に標的化されてもよい。したがって、そのような免疫療法用タンパク質は、例えば、増殖性疾患及び自己免疫疾患の治療又は予防のために使用できる。
【0042】
上記から、本開示の免疫療法用タンパク質、好ましくは変異型ＩｇＧ２抗体は、典型的には、目的の抗原などの標的又は活性化Ｆｃ受容体、ＢＣＲ複合体の免疫グロブリン、又は活性化Ｆｃ受容体複合体若しくはＢＣＲ複合体のサブユニットなどに結合した抗体などの免疫グロブリンに特異的に結合する抗原結合領域を含むことが明らかとなるであろう。したがって、例えば、本開示の方法がアレルギー性疾患に罹患している対象との使用を意図されている場合、本開示による変異型ＩｇＧ２抗体の抗原結合領域は、アレルゲンである抗原（例えば、蜂毒アレルゲンＡｐｉ ｍ １、並びにピーナッツアレルゲンＡｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３及びＡｒａ ｈ ６）に特異的に結合し得る。同様に、自己免疫疾患又は状態に罹患しているか、又はその傾向がある対象とともに使用することを意図された本開示の方法との関連において、変異型ＩｇＧ２抗体の抗原結合領域は、自己抗原である抗原（例えば、ＳＬＥの一般的な抗Ｓｍ／ＲＮＰ、抗Ｒｏ／Ｌａ、及び抗ｄｓＤＮＡ自己抗原のうちの１つ）に特異的に結合し得る。更に、本方法が感染性疾患の治療での使用を意図されている場合、変異型ＩｇＧ２抗体の抗原結合領域は、病原性抗原（例えば、ＢＣＲ複合体内に結合した）に特異的に結合し得るか、又はそうでなければ、病原性抗原を含むＢＣＲ複合体の膜免疫グロブリンに特異的に結合し得る。同様に、増殖性疾患の治療での使用を意図された変異型ＩｇＧ２抗体の抗原結合領域は、ＢＣＲ複合体に結合したがん抗原に特異的に結合し得るか、又は代替的に、ＦｃγＲＩＩｂ媒介性足場形成を含む方法において、変異型ＩｇＧ２抗体の抗原結合領域は、がん性細胞の表面上に存在するがん性抗原（例えば、ＣＬＬ細胞の表面上に見出されるＣＤ２０及びＣＤ５２抗原、並びに一部の乳がん及び膵臓がんにおいて過剰発現されるムチン（例えばＭＵＣ－１）などのがん細胞に差次的に発現される及び／又は存在する細胞表面抗原、に特異的に結合して、がん性細胞のアポトーシスをもたらし得る。
【0043】
いくつかの実施形態では、本開示の方法での使用に好適な変異型ＩｇＧ２抗体は、免疫コンジュゲートとして提供されてもよく、この抗体は、例えば、目的の抗原に結合する追加の能力を提供する分子（例えば、第１の結合特異性を有する抗原結合領域を含み、第２の結合特異性を有する別の分子に連結されている二重特異性ＩｇＧ２抗体）又は他の機能性を提供する分子（例えば、染料などの検出可能な分子又は相補性薬物分子などの治療上重要な分子）などの別の分子にコンジュゲートされる。
【0044】
いくつかの他の実施形態では、本開示の方法での使用に好適な変異型ＩｇＧ２抗体は、二量体又は多量体形態（例えば、変異型ＩｇＧ２抗体の３つ、４つ、５つ、６つ（六量体）などのコピー）で提供され得る。二量体及び多量体形態の抗体（例えば、ｓｔｒａｄｏｍｅｒｓ（商標）、又は隣接する抗体分子のＦｃ領域の自己会合による）を産生するための標準的な方法論は、当業者に周知である（例えば、Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ ＣＡ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３（６１７６）：１２６０－１２６３，２０１４を参照されたい）。
【0045】
本開示の方法は、典型的には、ヒト対象における疾患又は状態の治療に適用されるであろう。しかしながら、対象はまた、例えば、家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ及びヤギ）、同伴動物（例えば、イヌ及びネコ）、及びエキゾチック動物（例えば、非ヒト霊長類、トラ、ゾウなど）から選択され得る。
【0046】
第２の態様では、本開示は、例えば、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び状態、感染性疾患、並びに増殖性疾患を含む、ＦｃγＲＩＩｂへの結合及び／又はＦｃγＲＩＩｂの活性化が有益である疾患又は状態を治療するための、第１の態様で定義される免疫療法用タンパク質の使用を提供する。
【0047】
第３の態様では、本開示は、例えば、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び状態、他の炎症性疾患、感染性疾患、並びに増殖性疾患を含む、ＦｃγＲＩＩｂの活性化が有益である疾患又は状態を治療するための医薬品の製造における、第１の態様で定義される免疫療法用タンパク質の使用を提供する。
【0048】
第４の態様では、本開示は、第１の態様で定義される免疫療法用タンパク質と、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と、を含む、薬学的組成物又は医薬品を提供する。
【0049】
本明細書では、当業者によく知られているいくつかの用語が用いられる。それにもかかわらず、明確にするために、これらの用語のいくつかを以下に定義する。
【0050】
本明細書で使用する場合、「ＩｇＧ２抗体」という用語は、ＩｇＧ２定常重（ＣＨ）領域（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ２ ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインであり、各ドメインが、独立して、例えば、Ｗｉｎｅｓ ＢＤ ｅｔ ａｌ．，２０１６（前掲）において以前に詳細に記載されている野生型ヒト配列としての野生型配列と同一であるか、又は野生型配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を示すアミノ酸配列を含む）を含む任意の重鎖ポリペプチドであって、抗体が、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む「ＩｇＧ２骨格」を含み、例えば、可変重鎖（ＶＨ）領域がＩｇＧ２ ＣＨ領域と同じ種に由来しても、しなくてもよい別の免疫グロブリンクラス又はサブクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１など）の抗体に由来するキメラ重鎖ポリペプチドを含む抗体を含むような、任意の重鎖ポリペプチドを指す（例えば、ＩｇＧ２抗体は、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ領域及びマウスＩｇＥ ＶＨ領域を含む重鎖ポリペプチドを含み得る）。更に、「ＩｇＧ２抗体」は、ＩｇＧ２又は任意の他の免疫グロブリンクラス若しくはサブクラスに由来する定常軽（ＣＬ）領域及び／又は可変軽（ＶＬ）領域を含む軽鎖ポリペプチドを含んでもよく、又は軽鎖ポリペプチドがキメラであり、当該領域の一方は、１つの免疫グロブリンクラス又はサブクラスからの抗体に由来し、当該領域の他方は、別の免疫グロブリンクラス又はサブクラスからの抗体に由来することが理解されるべきである（例えば、ＩｇＧ２抗体は、ヒトＩｇΚ ＣＬ領域と、ＩｇＥ由来のＶＬ領域と、を含む軽鎖ポリペプチドを含み得る）。
【0051】
「標的」という用語、並びに「標的化された（ｔａｒｇｅｔｅｄ）」及び「標的とする（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」などのその派生語は、用語が使用される文脈により当業者によって十分に理解されるであろう。例えば、「標的」は、作用又はプロセスが対象とする何かを指すものとして理解されるであろう。例えば、抗体の特徴／活性の文脈で本明細書で使用される場合、「標的抗原」は、その抗体が結合する抗原を指すものとして理解され、同様に、何かを「標的とする」ことは、抗体（又は他の免疫療法用分子）が、その何か（例えば、抗原、免疫チェックポイント、受容体など）に結合するように調製されることであることが理解されるであろう。
【0052】
本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列間の「％同一性」という用語は、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ ａｎｄ ＳＦ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８７：２２６４－２２６８，１９９０に記載され、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ ａｎｄ ＳＦ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９０：５８７３－５８７７，１９９３におけるように修正されたようなものなどの数学的アルゴリズムを使用して計算されたと理解される配列同一性パーセンテージを指す。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－４１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、デフォルトパラメータを使用してＸＢＬＡＳＴプログラムで実行できる（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照されたい）。２つのアミノ酸配列間の配列同一性パーセンテージを決定するために、数学的アルゴリズムは、最適な比較目的のために配列をアラインメントし、配列が共有する同一位置の数の関数として、配列間のパーセント同一性を計算し得る（すなわち、パーセント同一性＝同一位置の数／位置（例えば、重複位置）の総数×１００）。
【0053】
本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患又は状態の確立された症状の予防及び緩和を含む。したがって、疾患又は状態を「治療する」という行為は、（１）疾患又は状態に罹患しているか、又はその傾向がある対象において発症する疾患又は状態の臨床症状の出現を予防するか、又は遅延させること、（２）疾患又は状態を阻害すること（すなわち、維持治療の場合には疾患若しくは状態又はその再発、又は少なくとも１つのその臨床的若しくは無臨床的症状の発症を阻止するか、低減するか、又は遅延させること）、並びに（３）疾患又は状態を軽減又は減弱させること（すなわち、疾患若しくは状態又はその臨床的若しくは無臨床的症状のうちの少なくとも１つの退行を引き起こすこと）を含む。
【0054】
本明細書で使用される場合、「医薬品の製造」という語句は、第１の態様で直接医薬品として定義されるような、又は第１の態様で定義されるような１つ以上の免疫療法用タンパク質を含む医薬品の製造の任意の段階での、１つ以上の免疫療法用タンパク質の使用を含む。
【0055】
「有効量」という用語は、有益な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。典型的には、有効量は、疾患若しくは状態を治療するのに十分であるか、又はそうでなければ、疾患若しくは状態を緩和するか、改善するか、安定化させるか、逆転させるか、遅延させるか、又はその進行を遅らせるのに十分である。例としてのみ、変異型ＩｇＧ２抗体などの免疫療法用タンパク質の有効量は、１日当たり約０．１～約２５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１日当たり約０．１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、更により好ましくは１日当たり約０．１～約２５ｍｇ／ｋｇ体重を含み得る。しかしながら、上記にかかわらず、有効量は変化し得、治療される対象の年齢、体重、性別、及び／又は健康、特定のタンパク質の活性、特定のタンパク質の代謝安定性及び作用時間、特定のタンパク質の投与経路及び時間、特定のタンパク質の排泄速度、並びに例えば、治療される疾患又は状態の重症度を含む、様々な要因に依存してもよいことが、当業者によって理解されるであろう。
【0056】
免疫療法用タンパク質は、治療される特定の疾患又は状態の治療のための１つ以上の追加の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、免疫療法用タンパク質は、アレルギー性疾患を治療するための他の薬剤（例えば、抗ヒスタミン薬（静脈内に（ｉｖ）投与されるもの、コルチゾン及び／又はアルブテロールなどのベータ－アゴニスト薬を含む））と併用されてもよく、又は増殖性疾患の治療との関連では、免疫療法用タンパク質は、がんを治療するための他の薬剤（例えば、シスプラチン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、エピルビシン、タキソールを含むタキソイド、エトポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤、タモキシフェンなどの細胞増殖抑制剤、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール）、及び成長因子機能の阻害剤（例えば、抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））などの抗体）などの抗腫瘍性薬を含む）と併用されてもよい。
【0057】
他の薬剤と併用される場合、免疫療法用タンパク質は、同じ薬学的組成物で、又は別個の薬学的組成物で投与され得る。別個の薬学的組成物で投与される場合、免疫療法用タンパク質及び他の薬剤は、同時に、又は任意の順序で連続的に（例えば、数秒以内、又は数分以内、又は数時間（例えば、２～４８時間）以内）投与されてもよい。
【0058】
免疫療法用タンパク質は、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤とともに、薬学的組成物に製剤化され得る。好適な担体及び希釈剤の例は、当業者には周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。本明細書に記載の様々な異なる形態の薬学的組成物に好適な賦形剤の例は、ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９４），Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａ Ｗａｄｅ ａｎｄ ＰＪ Ｗｅｌｌｅｒに見出され得る。好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。担体、希釈剤、及び／又は賦形剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な医薬的慣習に関して行われ得る。
【0059】
第１の態様で定義される免疫療法用タンパク質を含む薬学的組成物は、任意の好適な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、及び可溶化剤を更に含んでもよい。好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、グルコース等の天然糖、無水ラクトース、遊離ラクトース、ベータ－ラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ガム、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールが挙げられる。好適な潤滑剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。防腐剤、安定剤、及び更には染料を薬学的組成物中に提供してもよい。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤及び懸濁剤も使用してもよい。
【0060】
第１の態様で定義される免疫療法用タンパク質を含む薬学的組成物は、典型的には、静脈内又は皮下投与に適合される。したがって、薬学的組成物は、対象に注入してもよく、滅菌又は滅菌可能な溶液から調製される溶液又はエマルションを含み得る。薬学的組成物は、単位投薬形態（すなわち、単位用量、又は単位用量の複数ユニット若しくはサブユニットを含む別個の部分の形態）で製剤化され得る。
【0061】
本開示の方法、使用、及び薬学的組成物は、以下の非限定的な例を参照して、以下で更に説明される。
【実施例】
【0062】
実施例１
方法及び材料
抗体及び試薬
ウサギ抗ヒトＩｇＥ（Ｄａｋｏ Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ＜Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）のＦ（ａｂ’）２断片を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｄｒｅｗ ＳＭ ａｎｄ ＪＡ Ｔｉｔｕｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｕｎｉｔ ２．８，２００１に記載されているように、ペプシン消化物によって産生した。簡単に述べると、ウサギ抗体を消化緩衝液（０．２Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０）に対して透析し、次に、消化緩衝液中の等容量のペプシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を添加して３７℃で一晩インキュベートした。２ＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ８．０）１０％（ｖ／ｖ）を添加することによって消化を停止し、次に消化物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ８．０）に対して透析した。ハプテン２，４，６－トリニトロフェニル（ＴＮＰ）を、水中１０％２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とともにインキュベートすることによって、ウサギ抗ヒトＩｇＥ（抗ＩｇＥ－ＴＮＰ）、蜂毒アレルゲン（Ａｐｉ ｍ １－ＴＮＰ）のＦ（ａｂ’）２断片に、又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ－ＴＮＰ）にコンジュゲートし、室温で９０分間０．１Ｍホウ酸塩（ｐＨ７．０）で１／２０に希釈し、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して透析した。
方法及び材料
抗体及び試薬
ウサギ抗ヒトＩｇＥ（Ｄａｋｏ Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ＜Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）のＦ（ａｂ’）２断片を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｄｒｅｗ ＳＭ ａｎｄ ＪＡ Ｔｉｔｕｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｕｎｉｔ ２．８，２００１に記載されているように、ペプシン消化物によって産生した。簡単に述べると、ウサギ抗体を消化緩衝液（０．２Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０）に対して透析し、次に、消化緩衝液中の等容量のペプシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を添加して３７℃で一晩インキュベートした。２ＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ８．０）１０％（ｖ／ｖ）を添加することによって消化を停止し、次に消化物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ８．０）に対して透析した。ハプテン２，４，６－トリニトロフェニル（ＴＮＰ）を、水中１０％２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とともにインキュベートすることによって、ウサギ抗ヒトＩｇＥ（抗ＩｇＥ－ＴＮＰ）、蜂毒アレルゲン（Ａｐｉ ｍ １－ＴＮＰ）のＦ（ａｂ’）２断片に、又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ－ＴＮＰ）にコンジュゲートし、室温で９０分間０．１Ｍホウ酸塩（ｐＨ７．０）で１／２０に希釈し、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して透析した。
【0063】
ヒトドナー
健康なドナー及びアレルギー患者を動員し、血液試料を採取した。蜜蜂毒アレルギーを呈した患者を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（Ｐｈａｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって関連するアレルゲンに対するＩｇＥ反応性について試験した。
健康なドナー及びアレルギー患者を動員し、血液試料を採取した。蜜蜂毒アレルギーを呈した患者を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（Ｐｈａｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって関連するアレルゲンに対するＩｇＥ反応性について試験した。
【0064】
細胞表面ＦｃγＲの発現
ヒトＦｃγＲを、内因性マウスＦｃ受容体を欠くマウスＢ細胞株ＩＩＡ１．６中で発現させた。ヒトＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１及びＦｃγＲＩＩｂを発現する細胞は、以前に記載されている（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ＭＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６（１２）：７４８９－７４９４，２００６、Ｒａｍｓｌａｎｄ ＰＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８７（６）：３２０８－３２１７，２０１１、及びＴｒｉｓｔ ＨＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９２（２）：７９２－８０３，２０１４）。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＧｅｎＢａｎｋ：受託ＮＰ＿００１１２１０６５）対立遺伝子形態Ｖ１５８及びＦ１５８並びにヒトＦｃγＲＩ（Ａｌｌｅｎ ＪＭ ａｎｄ Ｂ Ｓｅｅｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３（４８８９）：３７８－３８１，１９８９）を発現する細胞株を、ＦｃγＲＩＩａについて記載されるように生成した（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６（前掲））。簡潔に述べると、受容体ｃＤＮＡを、標準的な分子生物学技術を使用してＧａｔｅｗａｙエントリープラスミドｐＥＮＴＲ１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に別々にクローニングし、続いてＧａｔｅｗａｙ ＬＲをネオマイシン耐性カセットを含有するＧａｔｅｗａｙ適合ｐＭＸＩ発現ベクターにクローニングした（Ｗｉｎｅｓ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９（２５）：２６３３９－２６３４５，２００４）。レトロウイルスをＰｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞株（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６（前掲））を使用して生成し、ＩＩＡ１．６細胞株を形質導入してＦｃγＲＩＩＩａ又はＦｃγＲＩの発現するために使用した。次いで、ヒトＦｃＲγ鎖を既に発現しているＩＩＡ１．６細胞（Ｗｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４（前掲））をＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩレトロウイルスのいずれかで形質導入して、ＦｃＲγ／ＦｃγＲＩ又はＦｃＲγ／ＦｃγＲＩＩＩを共発現する細胞株を作製した。形質導入細胞集団上での受容体の発現を、受容体特異的抗体のビオチン化Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片及びストレプトアビジン－ＡＰＣ（１／５００）を使用して評価した。使用された抗Ｆｃ受容体抗体は、ＦｃγＲＩＩａ（ＩＶ－３ Ｆａｂ－ビオチン断片）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｈ２Ｂ６ Ｆ（ａｂ’）２－ビオチン）、ＦｃγＲＩ（３２．２ Ｆ（ａｂ’）２－ビオチン）、ＦｃγＲＩＩＩａ（３Ｇ８ Ｆ（ａｂ’）２－ビオチン）、及びＦｃＲγ－ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）であり、ＦＩＴＣチャネル内で検出した。
ヒトＦｃγＲを、内因性マウスＦｃ受容体を欠くマウスＢ細胞株ＩＩＡ１．６中で発現させた。ヒトＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１及びＦｃγＲＩＩｂを発現する細胞は、以前に記載されている（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ＭＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６（１２）：７４８９－７４９４，２００６、Ｒａｍｓｌａｎｄ ＰＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８７（６）：３２０８－３２１７，２０１１、及びＴｒｉｓｔ ＨＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９２（２）：７９２－８０３，２０１４）。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＧｅｎＢａｎｋ：受託ＮＰ＿００１１２１０６５）対立遺伝子形態Ｖ１５８及びＦ１５８並びにヒトＦｃγＲＩ（Ａｌｌｅｎ ＪＭ ａｎｄ Ｂ Ｓｅｅｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３（４８８９）：３７８－３８１，１９８９）を発現する細胞株を、ＦｃγＲＩＩａについて記載されるように生成した（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６（前掲））。簡潔に述べると、受容体ｃＤＮＡを、標準的な分子生物学技術を使用してＧａｔｅｗａｙエントリープラスミドｐＥＮＴＲ１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に別々にクローニングし、続いてＧａｔｅｗａｙ ＬＲをネオマイシン耐性カセットを含有するＧａｔｅｗａｙ適合ｐＭＸＩ発現ベクターにクローニングした（Ｗｉｎｅｓ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９（２５）：２６３３９－２６３４５，２００４）。レトロウイルスをＰｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞株（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６（前掲））を使用して生成し、ＩＩＡ１．６細胞株を形質導入してＦｃγＲＩＩＩａ又はＦｃγＲＩの発現するために使用した。次いで、ヒトＦｃＲγ鎖を既に発現しているＩＩＡ１．６細胞（Ｗｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４（前掲））をＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩレトロウイルスのいずれかで形質導入して、ＦｃＲγ／ＦｃγＲＩ又はＦｃＲγ／ＦｃγＲＩＩＩを共発現する細胞株を作製した。形質導入細胞集団上での受容体の発現を、受容体特異的抗体のビオチン化Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片及びストレプトアビジン－ＡＰＣ（１／５００）を使用して評価した。使用された抗Ｆｃ受容体抗体は、ＦｃγＲＩＩａ（ＩＶ－３ Ｆａｂ－ビオチン断片）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｈ２Ｂ６ Ｆ（ａｂ’）２－ビオチン）、ＦｃγＲＩ（３２．２ Ｆ（ａｂ’）２－ビオチン）、ＦｃγＲＩＩＩａ（３Ｇ８ Ｆ（ａｂ’）２－ビオチン）、及びＦｃＲγ－ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）であり、ＦＩＴＣチャネル内で検出した。
【0065】
抗ＴＮＰヒトＩｇＧ及び変異型抗ＴＮＰヒトＩｇＧプラスミド構築物の産生 マウス抗トリニトロフェニル（抗ＴＮＰ）抗体ＴＩＢ１４２の可変重（ＶＨ）及び軽（ＶＬ）領域配列と、ヒトＩｇＧサブクラスからの定常重（ＣＨ）領域からの配列と、からなるキメラ抗ＴＮＰヒトＩｇＧ抗体構築物については、以前に詳細に説明されている－ＩｇＧ１（Ｐａｔｅｌ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８４（１１）：６２８３－６２９２，２０１０）、ｈＩｇＧ２及びｈＩｇＧ４（Ｗｉｎｅｓ ＢＤ ｅｔ ａｌ．，２０１６（前掲））。これには、正常なＩｇＧ４のＣＰＳＣ配列をＣＰＰＣに変換することによる、ＩｇＧ４ベースの変異体のコアヒンジの安定化が含まれ、これは、半分子交換を防止する。全てのキメラ抗体配列をｐＣＲ３ベクターにサブクローニングした。変異を、標準的な分子生物学技術を使用して、ＩｇＧ定常重鎖（ＣＨ）ｃＤＮＡ配列内に作製し、表１に列挙した。
【表1】
【0066】
ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦ及びＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦについてのＩｇＧ重鎖ポリペプチド（ＣＨ）の定常領域をコードするｃＤＮＡ配列を表２に提供し、これらは、可変重（ＶＨ）領域についてのｃＤＮＡ配列にライゲーションして示している。マウス（抗ＴＮＰ）抗体の可変軽（ＶＬ）領域についてのｃＤＮＡ配列も提供される。
【表2】
【0067】
抗ヒトＩｇＥ及び変異型抗ヒトＩｇＥプラスミド構築物の産生
抗ヒトＩｇＥ抗体構築物は、療法用ｍＡｂであるオマリズマブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）の可変重（ＶＨ）領域及び軽鎖領域配列をコードする合成ＤＮＡを含んでいた。Ｈ鎖構築物は、ＩｇＧ４及びＩｇＧ２バリアントについてのＶＨ ｃＤＮＡ配列及び定常ドメイン配列を含んでいた。ＩｇＧ重鎖及び軽鎖についてのＤＮＡを、発現ベクターｐＣＲ３又はｐｃＤＮＡ３．４にサブクローニングした。結合に影響を及ぼすＩｇＧ２定常重鎖（ＣＨ）ｃＤＮＡ配列の変異を表１に列挙した。
抗ヒトＩｇＥ抗体構築物は、療法用ｍＡｂであるオマリズマブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）の可変重（ＶＨ）領域及び軽鎖領域配列をコードする合成ＤＮＡを含んでいた。Ｈ鎖構築物は、ＩｇＧ４及びＩｇＧ２バリアントについてのＶＨ ｃＤＮＡ配列及び定常ドメイン配列を含んでいた。ＩｇＧ重鎖及び軽鎖についてのＤＮＡを、発現ベクターｐＣＲ３又はｐｃＤＮＡ３．４にサブクローニングした。結合に影響を及ぼすＩｇＧ２定常重鎖（ＣＨ）ｃＤＮＡ配列の変異を表１に列挙した。
【0068】
ＩｇＧ重鎖ポリペプチド（ＣＨ）又は抗ＩｇＥ軽鎖（ＣＬ）の定常領域、ＩｇＧ４、並びにＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦ及びＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦをコードするｃＤＮＡ配列を表３に提供し、これらは、可変重（ＶＨ）領域についてのｃＤＮＡ配列にライゲーションして示している。抗ＩｇＥ抗体軽鎖についてのｃＤＮＡ配列も提供する。
【表3】
【0069】
Ｅｘｐｉ２９３細胞によるヒトＩｇＧ及び変異型ＩｇＧタンパク質の発現及び産生
ヒトＩｇＧ及び変異型ヒトＩｇＧを、前述のように、Ｅｘｐｉ２９３ヒト胚性腎細胞において産生した（Ｗｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６（前掲））。簡潔に述べると、Ｅｘｐｉ２９３細胞を、細胞成長及びタンパク質産生の両方のためにＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）中に維持した。細胞を、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ還元血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中で希釈したＩｇＧ重鎖プラスミド（１５ｕｇ）及び軽鎖プラスミド（１５μｇ）と同時にトランスフェクションし、次いで４日間培養した。培養上清を遠心分離によって清澄化し、０．２μｍフィルターを通して濾過し、その後、ＩｇＧをＨｉ－Ｔｒａｐ ＨＰタンパク質Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ３．５）で溶出し、続いて１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に対する透析を行った。任意の凝集体を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で後続のゲル濾過によって除去し、単量体ＩｇＧピーク画分を収集した。記載されるように、全ての抗体調製物の抗原結合活性を、ＥＬＩＳＡによってＢＳＡ－ＴＮＰ上で試験した（Ｗｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ，２０１６（前掲））。
ヒトＩｇＧ及び変異型ヒトＩｇＧを、前述のように、Ｅｘｐｉ２９３ヒト胚性腎細胞において産生した（Ｗｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６（前掲））。簡潔に述べると、Ｅｘｐｉ２９３細胞を、細胞成長及びタンパク質産生の両方のためにＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）中に維持した。細胞を、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ還元血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中で希釈したＩｇＧ重鎖プラスミド（１５ｕｇ）及び軽鎖プラスミド（１５μｇ）と同時にトランスフェクションし、次いで４日間培養した。培養上清を遠心分離によって清澄化し、０．２μｍフィルターを通して濾過し、その後、ＩｇＧをＨｉ－Ｔｒａｐ ＨＰタンパク質Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ３．５）で溶出し、続いて１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に対する透析を行った。任意の凝集体を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で後続のゲル濾過によって除去し、単量体ＩｇＧピーク画分を収集した。記載されるように、全ての抗体調製物の抗原結合活性を、ＥＬＩＳＡによってＢＳＡ－ＴＮＰ上で試験した（Ｗｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ，２０１６（前掲））。
【0070】
細胞表面ＦｃγＲへのＩｇＧ結合のフローサイトメトリー測定
抗体ＦｃγＲ結合を、免疫複合体又は単量体ＩｇＧのいずれかを使用して測定した。免疫複合体は、抗ＴＮＰ抗体（親又は変異型抗ＴＮＰ ＩｇＧ）をＴＮＰ－ＢＳＡと２：１の比（４０μｇ／ｍｌ：２０μｇ／ｍｌ）で３７℃で３０分間、次いで４℃で１０分間インキュベートすることによって生成した。フローサイトメトリー結合分析において、複合体又は単量体ＩｇＧを、示された濃度で、ＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液中の２５μｌのＦｃγＲ発現細胞（５×１０６／ｍｌ）に添加し、氷上で１時間インキュベートし、２回洗浄し、氷上で１時間、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２特異的ヤギ抗血清のＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片５０ｕｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）（緩衝液で１／４００希釈）に再懸濁した。細胞を２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ及び１０，０００個の生細胞に再懸濁し、少なくとも３つの実験で分析した。単量体ＩｇＧ結合（ＭＦＩ）を単一結合部位モデルに適合させて、結合親和性（ＫＡ）を測定した。同様に、免疫複合体結合は、みかけの親和性（ＫＡ ａｐｐ）として報告される。
抗体ＦｃγＲ結合を、免疫複合体又は単量体ＩｇＧのいずれかを使用して測定した。免疫複合体は、抗ＴＮＰ抗体（親又は変異型抗ＴＮＰ ＩｇＧ）をＴＮＰ－ＢＳＡと２：１の比（４０μｇ／ｍｌ：２０μｇ／ｍｌ）で３７℃で３０分間、次いで４℃で１０分間インキュベートすることによって生成した。フローサイトメトリー結合分析において、複合体又は単量体ＩｇＧを、示された濃度で、ＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液中の２５μｌのＦｃγＲ発現細胞（５×１０６／ｍｌ）に添加し、氷上で１時間インキュベートし、２回洗浄し、氷上で１時間、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２特異的ヤギ抗血清のＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片５０ｕｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）（緩衝液で１／４００希釈）に再懸濁した。細胞を２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ及び１０，０００個の生細胞に再懸濁し、少なくとも３つの実験で分析した。単量体ＩｇＧ結合（ＭＦＩ）を単一結合部位モデルに適合させて、結合親和性（ＫＡ）を測定した。同様に、免疫複合体結合は、みかけの親和性（ＫＡ ａｐｐ）として報告される。
【0071】
Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＯＣＴＥＴ）を使用したＩｇＧ：ＦｃＲ相互作用の親和性測定
ＴＮＰ－ＢＳＡを、製造業者の指示に従ってＥＺ－ｌｉｎｋ（商標）ビオチン化試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させた。得られたＴＮＰ－ＢＳＡ－ビオチン（５μｇ／ｍｌ、３０秒）を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＬＬＣ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を使用してストレプトアビジンＢＬＩプローブ上で約０．８ｎｍまで捕捉し、次いで、抗ＴＮＰ ＩｇＧ（４μｇ／ｍｌ、７５秒）を充填した。ベースラインを確立し（６０秒）、続いて、ｒｓＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１又はｒｓＦｃγＲＩＩｂの濃度系列（１５ｎＭ～２０μＭ）の会合及び解離を行った（９０秒）。各初期反応ＴＮＰ－ＢＳＡ－ビオチン捕捉後の再生及びその後の結合サイクルには、１０ｍＭのＨＣｌを使用した。センソグラム（Ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を１：１のラングミュア結合モデルに充填するか、又は会合サイクルの終了時の結合応答を定常状態親和性に適合させた。
ＴＮＰ－ＢＳＡを、製造業者の指示に従ってＥＺ－ｌｉｎｋ（商標）ビオチン化試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させた。得られたＴＮＰ－ＢＳＡ－ビオチン（５μｇ／ｍｌ、３０秒）を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＬＬＣ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を使用してストレプトアビジンＢＬＩプローブ上で約０．８ｎｍまで捕捉し、次いで、抗ＴＮＰ ＩｇＧ（４μｇ／ｍｌ、７５秒）を充填した。ベースラインを確立し（６０秒）、続いて、ｒｓＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１又はｒｓＦｃγＲＩＩｂの濃度系列（１５ｎＭ～２０μＭ）の会合及び解離を行った（９０秒）。各初期反応ＴＮＰ－ＢＳＡ－ビオチン捕捉後の再生及びその後の結合サイクルには、１０ｍＭのＨＣｌを使用した。センソグラム（Ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を１：１のラングミュア結合モデルに充填するか、又は会合サイクルの終了時の結合応答を定常状態親和性に適合させた。
【0072】
蜜蜂毒アレルゲンの製造及び精製：Ａｐｉ ｍ １
蜜蜂（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）毒からの主要なアレルゲン：ホスホリパーゼＡ２（Ａｐｉ ｍ １）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ１６７０９、アレルゲン名：Ａｐｉ ｍ １）を製造業者の指示（Ｇｉｂｃｏ）に従って、懸濁液適合昆虫細胞株Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ２１で製造した。簡潔に述べると、Ｓｆ２１細胞を、成長、ウイルス産生及びタンパク質産生のために、Ｓｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地中で２７℃で維持した。３’ヘキサ－Ｈｉｓタグを有する完全長Ａｐｉ ｍ １をコードするｃＤＮＡをドナープラスミドｐＦａｓｔＢａｃにクローニングし、次いでＤＨ１０Ｂａｃ Ｅ．ｃｏｌｉにトランスフェクトした。得られたバクミドＤＮＡをＤＨ１０Ｂａｃ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から精製し、Ｓｆ２１細胞にトランスフェクトした。次いで、組換えバキュロウイルスを使用してＳｆ２１細胞に感染させ、分泌したＡｐｉ ｍ １を、Ｔａｌｏｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙクロマトグラフィー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）によって細胞培養上清から精製した。
蜜蜂（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）毒からの主要なアレルゲン：ホスホリパーゼＡ２（Ａｐｉ ｍ １）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ１６７０９、アレルゲン名：Ａｐｉ ｍ １）を製造業者の指示（Ｇｉｂｃｏ）に従って、懸濁液適合昆虫細胞株Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ２１で製造した。簡潔に述べると、Ｓｆ２１細胞を、成長、ウイルス産生及びタンパク質産生のために、Ｓｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地中で２７℃で維持した。３’ヘキサ－Ｈｉｓタグを有する完全長Ａｐｉ ｍ １をコードするｃＤＮＡをドナープラスミドｐＦａｓｔＢａｃにクローニングし、次いでＤＨ１０Ｂａｃ Ｅ．ｃｏｌｉにトランスフェクトした。得られたバクミドＤＮＡをＤＨ１０Ｂａｃ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から精製し、Ｓｆ２１細胞にトランスフェクトした。次いで、組換えバキュロウイルスを使用してＳｆ２１細胞に感染させ、分泌したＡｐｉ ｍ １を、Ｔａｌｏｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙクロマトグラフィー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）によって細胞培養上清から精製した。
【0073】
好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）
ＢＡＴアッセイを、２つの細胞源のいずれか、すなわち、全（未加工）血又はＤＭＥＭ／０．１％ ＢＳＡで２回洗浄した血液を使用して、前述のように（Ｄｒｅｗ ＡＣ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３（９）：５８７２－５８７９，２００４）実行した。好塩基球を、ＩｇＧ ｍＡｂの存在下又は非存在下で、ハプテン化（ＴＮＰ）ウサギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＥ（抗ＩｇＥ－ＴＮＰ）又はハプテン化蜂毒アレルゲン（Ａｐｉ ｍ １－ＴＮＰ）を使用して刺激した。簡潔に述べると、健康なドナー又はアレルギー患者のいずれかからの１００μｌのヘパリン化ヒト全血を、２０μｌの刺激緩衝液（１３３ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、７ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２０μｌ／ｍｌのヘパリン、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ３、ｐＨ７．４）とともに３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、試料を、抗ＴＮＰ ｈＩｇＧと予め複合化されていた（３７℃で３０分間）１００μｌの抗ｈＩｇＥ－ＴＮＰ（２０μｇ／ｍｌ）又はＡｐｉ ｍ １－ＴＮＰ（４μｇ／ｍｌ）のいずれかを添加することによって、３７℃で２０分間刺激した。バックグラウンド刺激を、１００μｌの刺激緩衝液単独を添加することによって判定した。刺激のための陽性対照としては、Ｎ－ホルミル－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ、９ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又は無傷のウサギ抗ヒトＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｄａｋｏ Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）のいずれかを利用した。アッセイを氷上で５分間インキュベーションすることによって終了させ、次いで正常なヤギ血清を添加した（１０μｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。刺激応答をフローサイトメトリーによって定量した。したがって、刺激後、細胞を、マウス抗ヒトＣＤ６３－ＰＥ（２ｕｌ／試験）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、マウス抗ヒトＩｇＥ－ＦＩＴＣ（３ｕｌ／試験）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）及びマウス抗ヒトＣＤ２０３ｃ－ＡＰＣ（５ｕｌ／試験）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を添加することによって、氷上で４０分間染色した。染色後、２ｍｌの溶解溶液（１５４ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ２、０．８ｍＭのＥＤＴＡ）とともに室温で１０分間２回インキュベートし、遠心分離（２５０×ｇ、５分）を行うことによって、赤血球（ＲＢＣ）を溶解した。細胞ペレットを３ｍｌの洗浄緩衝液（１３３ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＫＣｌ、０．２７ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）で洗浄し、７－アミノアクチノマイシンＤ（２μｌ／試験）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する２００μｌの洗浄緩衝液中にフローサイトメトリー分析のために再懸濁して、非生細胞を除外した。
ＢＡＴアッセイを、２つの細胞源のいずれか、すなわち、全（未加工）血又はＤＭＥＭ／０．１％ ＢＳＡで２回洗浄した血液を使用して、前述のように（Ｄｒｅｗ ＡＣ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３（９）：５８７２－５８７９，２００４）実行した。好塩基球を、ＩｇＧ ｍＡｂの存在下又は非存在下で、ハプテン化（ＴＮＰ）ウサギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＥ（抗ＩｇＥ－ＴＮＰ）又はハプテン化蜂毒アレルゲン（Ａｐｉ ｍ １－ＴＮＰ）を使用して刺激した。簡潔に述べると、健康なドナー又はアレルギー患者のいずれかからの１００μｌのヘパリン化ヒト全血を、２０μｌの刺激緩衝液（１３３ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、７ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２０μｌ／ｍｌのヘパリン、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ３、ｐＨ７．４）とともに３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、試料を、抗ＴＮＰ ｈＩｇＧと予め複合化されていた（３７℃で３０分間）１００μｌの抗ｈＩｇＥ－ＴＮＰ（２０μｇ／ｍｌ）又はＡｐｉ ｍ １－ＴＮＰ（４μｇ／ｍｌ）のいずれかを添加することによって、３７℃で２０分間刺激した。バックグラウンド刺激を、１００μｌの刺激緩衝液単独を添加することによって判定した。刺激のための陽性対照としては、Ｎ－ホルミル－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ、９ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又は無傷のウサギ抗ヒトＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｄａｋｏ Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）のいずれかを利用した。アッセイを氷上で５分間インキュベーションすることによって終了させ、次いで正常なヤギ血清を添加した（１０μｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。刺激応答をフローサイトメトリーによって定量した。したがって、刺激後、細胞を、マウス抗ヒトＣＤ６３－ＰＥ（２ｕｌ／試験）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、マウス抗ヒトＩｇＥ－ＦＩＴＣ（３ｕｌ／試験）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）及びマウス抗ヒトＣＤ２０３ｃ－ＡＰＣ（５ｕｌ／試験）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を添加することによって、氷上で４０分間染色した。染色後、２ｍｌの溶解溶液（１５４ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ２、０．８ｍＭのＥＤＴＡ）とともに室温で１０分間２回インキュベートし、遠心分離（２５０×ｇ、５分）を行うことによって、赤血球（ＲＢＣ）を溶解した。細胞ペレットを３ｍｌの洗浄緩衝液（１３３ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＫＣｌ、０．２７ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）で洗浄し、７－アミノアクチノマイシンＤ（２μｌ／試験）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する２００μｌの洗浄緩衝液中にフローサイトメトリー分析のために再懸濁して、非生細胞を除外した。
【0074】
ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩサイトメーター上で細胞を解析し、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃ解析ソフトウェアを使用して蛍光データを解析した。使用されたゲーティング戦略は以下の通りである。洗浄した血液又は全血細胞を、好塩基球集団を含むように前方散乱及び側方散乱でゲーティングし、続いて、７ＡＡＤ陽性細胞の除外に基づいて生細胞ゲーティングを行った。好塩基球を、高ＩｇＥ発現（ＦＩＴＣ高）及びＣＤ２０３ｃ（ＡＰＣ陽性）細胞として同定し、次いで、ＣＤ６３陰性ゲート（刺激緩衝液単独）及びＣＤ６３陽性ゲート（抗ヒトＩｇＥ又はｆＭＬＰで刺激）を設定するために使用した。活性化された好塩基球は、ＣＤ６３陽性ゲート内の細胞として同定した。好塩基球活性化の阻害％は、Ａｐｉ ｍ １－ＴＮＰ又は抗ＩｇＥ－ＴＮＰ刺激単独と比較した、Ａｐｉ ｍ １－ＴＮＰ又は抗ＩｇＥ－ＴＮＰ：ＩｇＧ複合体によって誘導されるＣＤ６３陽性細胞の％減少として計算した。
【0075】
好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）におけるＦｃγＲＩＩｂ阻害作用の遮断
ＦｃγＲＩＩｂとＢＡＴ中の抗ＩｇＥ－ＴＮＰ：ＩｇＧ複合体との相互作用は、上記のようにＢＡＴ中の抗ＩｇＥ－ＴＮＰ：ＩｇＧを添加する前に、ＦｃγＲＩＩｂ特異的遮断ｍＡｂであるＨ２Ｂ６のＦ（ａｂ’）２断片との細胞のインキュベーションによって遮断された。簡潔に述べると、１０μｌの抗Ｈ２Ｂ６ Ｆ（ａｂ’）２（最終濃度７．５μｇ／ｍｌ）又は刺激緩衝液単独を９０μｌの洗浄した血液に添加し、氷上で３０分間インキュベートした後、抗ＩｇＥ－ＴＮＰ又は抗ＩｇＥ－ＴＮＰ：ＩｇＧ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を使用してＢＡＴを実行し、％好塩基球活性化を測定した。
ＦｃγＲＩＩｂとＢＡＴ中の抗ＩｇＥ－ＴＮＰ：ＩｇＧ複合体との相互作用は、上記のようにＢＡＴ中の抗ＩｇＥ－ＴＮＰ：ＩｇＧを添加する前に、ＦｃγＲＩＩｂ特異的遮断ｍＡｂであるＨ２Ｂ６のＦ（ａｂ’）２断片との細胞のインキュベーションによって遮断された。簡潔に述べると、１０μｌの抗Ｈ２Ｂ６ Ｆ（ａｂ’）２（最終濃度７．５μｇ／ｍｌ）又は刺激緩衝液単独を９０μｌの洗浄した血液に添加し、氷上で３０分間インキュベートした後、抗ＩｇＥ－ＴＮＰ又は抗ＩｇＥ－ＴＮＰ：ＩｇＧ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を使用してＢＡＴを実行し、％好塩基球活性化を測定した。
【0076】
ヒト高親和性ＦｃεＲＩ複合体と阻害性ｈＦｃγＲＩＩｂとの細胞表面共発現 阻害性ＦｃγＲＩＩｂとともにＦｃεＲＩ複合体（ＦｃεＲＩα、β、γ）を発現する細胞を、介在するピコルナウイルスリボソームスキッピング２Ａペプチドによって中断された各ＦｃＲ又はサブユニットをコードするコドン最適化ｃＤＮＡによるＩＩＡ１．６細胞の形質導入によって生成した（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２（５）：５８９－５９４，２００４）。配列は、ＦｃεＲＩα－Ｐ２Ａ－ＦｃεＲＩβ－Ｔ２Ａ－ＦｃεＲＩγ－Ｆ２Ａ－ＦｃγＲＩＩｂ－翻訳停止の順序であった。これを、配列検証済みの２８６３ｂｐ合成ＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）として、隣接するゲートウェイａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２部位を用いて合成した。合成ＤＮＡをゲートウェイ適合マウス白血病ウイルス発現ベクターｐＭＸＩ－ｎｅｏにサブクローニングした。Ｐｈｏｅｎｉｘパッケージング株の一過性トランスフェクション及びＦｃＲ欠損マウスＩＩＡ１．６細胞株の感染を、前述のように実行した（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６（前掲））。
【0077】
ＩｇＥ誘導性カルシウム動員
阻害性ｈＦｃγＲＩＩｂとｈＦｃεＲＩ（α、β、γ）複合体とを共発現するＩＩＡ１．６細胞を、０．５μｇ／ｍｌのＩｇＥ（ＪＷ８／５／１３マウス／ヒトキメラ抗ＮＰ ＩｇＥ）（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Μ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６：１３５１－１３６１，１９８７）とともに一晩インキュベーションすることによってＩｇＥで感作した。翌日、細胞を２０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＥ－Ｔ単独で刺激したか、又は抗ＴＮＰ ＩｇＧ ｍＡｂ（最終濃度、３５μｇ／ｍｌ）と複合化し、カルシウム動員を測定した（Ａｎａｎｉａ ＪＣ ｅｔ ａｌ．，２０１８（前掲））。
阻害性ｈＦｃγＲＩＩｂとｈＦｃεＲＩ（α、β、γ）複合体とを共発現するＩＩＡ１．６細胞を、０．５μｇ／ｍｌのＩｇＥ（ＪＷ８／５／１３マウス／ヒトキメラ抗ＮＰ ＩｇＥ）（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Μ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６：１３５１－１３６１，１９８７）とともに一晩インキュベーションすることによってＩｇＥで感作した。翌日、細胞を２０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＥ－Ｔ単独で刺激したか、又は抗ＴＮＰ ＩｇＧ ｍＡｂ（最終濃度、３５μｇ／ｍｌ）と複合化し、カルシウム動員を測定した（Ａｎａｎｉａ ＪＣ ｅｔ ａｌ．，２０１８（前掲））。
【0078】
キメラ抗ＮＰ ＩｇＥ ＢＣＲと阻害性ｈＦｃγＲＩＩｂとの細胞表面共発現
マウスＶドメイン（並びに膜貫通及び細胞質ドメインを含むヒト細胞表面ＩｇＥ重鎖）と、軽鎖と、を含むＪＷ８／５／１３マウス／ヒトキメラ抗ＮＰ（４－ヒドロキシ－３－ニトロフェニルアセチル）ＩｇＥ ＢＣＲを発現し、かつ阻害性ＦｃγＲＩＩｂを共発現するレポーター細胞を、ピコルナウイルスリボソームスキッピングＰ２Ａ及びＦ２Ａペプチドによって分離された軽鎖、ＩｇＥ重鎖及びＦｃγＲＩＩｂ１を含む単一のポリタンパク質をコードするコドン最適化ｃＤＮＡによるＩＩＡ１．６細胞の形質導入によって生成した（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２（５）：５８９－５９４，２００４）。したがって、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、抗ＮＰ ＩｇＥ軽鎖ｃＤＮＡ、次いでＰ２Ａペプチド、次いでＩｇＥ重鎖、次いでＦ２Ａペプチド、次いでＦｃγＲＩＩｂ１、及び次いで翻訳停止で構成した。マウス／ヒトキメラ抗ＮＰ重鎖配列は、適切に接合されたＪＷ８／５／１３抗ＮＰ ＩｇＥ ＤＮＡ配列（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Μ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６：１３５１－１３６１，１９８７）と、配列受託番号Ｘ６３６９３．１（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ生殖細胞系選択的スプライシングＩｇＥ重鎖ＤＮＡ）と、を含んでいた。これを、配列検証済みの合成ＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧｅｎｅＡｒｔ）として、隣接するゲートウェイａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２部位を用いて合成した。合成ＤＮＡをＧａｔｅｗａｙ適合マウス白血病ウイルス発現ベクターｐＭＸＩ－ｎｅｏにサブクローニングした。Ｐｈｏｅｎｉｘパッケージング株の一過性トランスフェクション及びＦｃＲ欠損マウスＩＩＡ１．６ Ｂ細胞株の感染を、前述のように実行した（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６（前掲））。
マウスＶドメイン（並びに膜貫通及び細胞質ドメインを含むヒト細胞表面ＩｇＥ重鎖）と、軽鎖と、を含むＪＷ８／５／１３マウス／ヒトキメラ抗ＮＰ（４－ヒドロキシ－３－ニトロフェニルアセチル）ＩｇＥ ＢＣＲを発現し、かつ阻害性ＦｃγＲＩＩｂを共発現するレポーター細胞を、ピコルナウイルスリボソームスキッピングＰ２Ａ及びＦ２Ａペプチドによって分離された軽鎖、ＩｇＥ重鎖及びＦｃγＲＩＩｂ１を含む単一のポリタンパク質をコードするコドン最適化ｃＤＮＡによるＩＩＡ１．６細胞の形質導入によって生成した（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２（５）：５８９－５９４，２００４）。したがって、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、抗ＮＰ ＩｇＥ軽鎖ｃＤＮＡ、次いでＰ２Ａペプチド、次いでＩｇＥ重鎖、次いでＦ２Ａペプチド、次いでＦｃγＲＩＩｂ１、及び次いで翻訳停止で構成した。マウス／ヒトキメラ抗ＮＰ重鎖配列は、適切に接合されたＪＷ８／５／１３抗ＮＰ ＩｇＥ ＤＮＡ配列（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Μ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６：１３５１－１３６１，１９８７）と、配列受託番号Ｘ６３６９３．１（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ生殖細胞系選択的スプライシングＩｇＥ重鎖ＤＮＡ）と、を含んでいた。これを、配列検証済みの合成ＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧｅｎｅＡｒｔ）として、隣接するゲートウェイａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２部位を用いて合成した。合成ＤＮＡをＧａｔｅｗａｙ適合マウス白血病ウイルス発現ベクターｐＭＸＩ－ｎｅｏにサブクローニングした。Ｐｈｏｅｎｉｘパッケージング株の一過性トランスフェクション及びＦｃＲ欠損マウスＩＩＡ１．６ Ｂ細胞株の感染を、前述のように実行した（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６（前掲））。
【0079】
ＩｇＥ Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）誘導性カルシウム動員
抗ＮＰ表面ＩｇＥ及び阻害性ｈＦｃγＲＩＩｂを共発現するＩＩＡ１．６細胞にカルシウムインジケータＦｕｒａ－２を充填し、ＩｇＥ特異的療法用ｍＡｂであるオマリズマブ又は変異体、すなわち、ＩｇＧ４として、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ、ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－Ｓ２６７Ｅ－Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－Ｓ２６７Ｅ－Ｌ３２８Ｆ－としてフォーマットされたオマリズマブ（１μｇ／ｍｌ）、続いてＮＰ関連抗原であるＮＩＰ（２２）ＢＳＡ（ＢＳＡ分子１個当たり平均２２個の４－ヒドロキシ－３－ヨード－５－ニトロフェニルアセチル基で誘導体化されたウシ血清アルブミン）とともにインキュベートした。カルシウム動員を測定した（Ａｎａｎｉａ ＪＣ ｅｔ ａｌ．，２０１８（前掲））。
抗ＮＰ表面ＩｇＥ及び阻害性ｈＦｃγＲＩＩｂを共発現するＩＩＡ１．６細胞にカルシウムインジケータＦｕｒａ－２を充填し、ＩｇＥ特異的療法用ｍＡｂであるオマリズマブ又は変異体、すなわち、ＩｇＧ４として、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ、ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－Ｓ２６７Ｅ－Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－Ｓ２６７Ｅ－Ｌ３２８Ｆ－としてフォーマットされたオマリズマブ（１μｇ／ｍｌ）、続いてＮＰ関連抗原であるＮＩＰ（２２）ＢＳＡ（ＢＳＡ分子１個当たり平均２２個の４－ヒドロキシ－３－ヨード－５－ニトロフェニルアセチル基で誘導体化されたウシ血清アルブミン）とともにインキュベートした。カルシウム動員を測定した（Ａｎａｎｉａ ＪＣ ｅｔ ａｌ．，２０１８（前掲））。
【0080】
結果
修飾Ｆｃを有する変異型ＩｇＧ２抗体は、強力な特異的好塩基球阻害剤を生成する。
ＩｇＧ４及びＩｇＧ１（表１）からの配列エレメント用の足場としてＩｇＧ２を使用して、ＩｇＧサブクラス間で異なり、ＦｃγＲとの重要な接触部である下部ヒンジ領域に焦点を当てて、一連の阻害性ｍＡｂを開発した。特に、ＩｇＧ２下部ヒンジのＶＡＧを、ＩｇＧ４からのＦＬＧＧ（ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ）又はＩｇＧ１からのＬＬＧＧ（ＩｇＧ２－ＬＬＧＧ）のいずれかで置き換えた。変異型ＩｇＧ２ ｍＡｂを、細胞表面上で発現される異なるヒトＦｃγＲに対するそれらのＦｃγＲ結合特異性について評価した。結果を図１に示す。
修飾Ｆｃを有する変異型ＩｇＧ２抗体は、強力な特異的好塩基球阻害剤を生成する。
ＩｇＧ４及びＩｇＧ１（表１）からの配列エレメント用の足場としてＩｇＧ２を使用して、ＩｇＧサブクラス間で異なり、ＦｃγＲとの重要な接触部である下部ヒンジ領域に焦点を当てて、一連の阻害性ｍＡｂを開発した。特に、ＩｇＧ２下部ヒンジのＶＡＧを、ＩｇＧ４からのＦＬＧＧ（ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ）又はＩｇＧ１からのＬＬＧＧ（ＩｇＧ２－ＬＬＧＧ）のいずれかで置き換えた。変異型ＩｇＧ２ ｍＡｂを、細胞表面上で発現される異なるヒトＦｃγＲに対するそれらのＦｃγＲ結合特異性について評価した。結果を図１に示す。
【0081】
細胞表面上のヒトＦｃγＲと変異型ＩｇＧの相互作用をフローサイトメトリーによって評価し、親ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の結合、並びに全てのヒトＦｃγＲの「普遍的な」リガンドであるＩｇＧ１と比較した。低親和性ヒトＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩ）への結合を、免疫複合体を使用して実行した（図１Ａ～Ｅ）。高親和性ＦｃγＲＩへの結合を、単量体ＩｇＧを使用して測定した（図１Ｆ）。親ＩｇＧ分子の各々は、期待される特異性を示した（すなわち、全ての受容体に結合した複合化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２は、阻害性ＦｃγＲＩＩｂのみに結合したＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１及びＩｇＧ４複合体を除いて、任意のＦｃγＲに結合することができなかった）。ＩｇＧ２ではなく、複合化されていない単量体ＩｇＧ１及びＩｇＧ４が、高親和性ＦｃγＲＩに結合した。
【0082】
ＩｇＧ２－ＬＬＧＧ又はＩｇＧ２－ＦＬＧＧ ｍＡｂ ＦｃγＲ結合プロファイルは、ＩｇＧ２とはかなり異なり、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧの場合にはＩｇＧ４とも異なることが見出された（図１Ａ～Ｅ）。ＩｇＧ２－ＬＬＧＧ ｍＡｂは、親ＩｇＧ１と同等の特異性プロファイルを示した（図１Ａ～Ｅ）。
したがって、ＩｇＧ２中の下部ヒンジのみの置き換えは、阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの結合を含むＩｇＧ１様結合を付与するのに十分であった。更に、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧの受容体結合プロファイルは、両方の親ＩｇＧとは異なっている（図１）。特に、この変異型ｍＡｂは、阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの有意に増強された結合、並びにＩｇＧ４と比較してより広い特異性を示し、ＩｇＧ２にもＩｇＧ４にも結合しないＦｃγＲＩＩＩａ対立遺伝子形態の両方、並びに通常、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の貧弱な結合剤でもあるＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１にも貪欲に結合した。ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１への結合は、おそらくＩｇＧ２骨格からの寄与である。しかしながら、単量体ＩｇＧ４と同様に、単量体ＩｇＧ２－ＦＬＧＧは、ＩｇＧ２に結合しない高親和性ＦｃγＲＩに結合した（図１Ｆ）。
したがって、ＩｇＧ２中の下部ヒンジのみの置き換えは、阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの結合を含むＩｇＧ１様結合を付与するのに十分であった。更に、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧの受容体結合プロファイルは、両方の親ＩｇＧとは異なっている（図１）。特に、この変異型ｍＡｂは、阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの有意に増強された結合、並びにＩｇＧ４と比較してより広い特異性を示し、ＩｇＧ２にもＩｇＧ４にも結合しないＦｃγＲＩＩＩａ対立遺伝子形態の両方、並びに通常、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の貧弱な結合剤でもあるＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１にも貪欲に結合した。ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１への結合は、おそらくＩｇＧ２骨格からの寄与である。しかしながら、単量体ＩｇＧ４と同様に、単量体ＩｇＧ２－ＦＬＧＧは、ＩｇＧ２に結合しない高親和性ＦｃγＲＩに結合した（図１Ｆ）。
【0083】
変異型ＩｇＧ２抗体は、Ａｐｉ ｍ １アレルゲン誘導性好塩基球活性化を阻害する
また、変異型ＩｇＧ２ ｍＡｂを、ＩｇＥによるアレルギー性好塩基球活性化のＦｃγＲＩＩｂ依存性阻害を媒介する能力について評価した。特に、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ、ＩｇＧ４－ＬＬＧＧ及びＩｇＧ２－ＬＬＧＧ抗体を、ＩｇＥ＋アトピー性個体（蜜蜂毒アレルギー患者）からの好塩基球のＦｃεＲＩ活性化を調節するそれらの能力について、親ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ１と比較した。洗浄した血液中の好塩基球を、抗ＴＮＰ ＩｇＧ２又はＩｇＧ４ ｍＡｂの存在下で、主要な蜜蜂毒アレルゲンであるホスホリパーゼＡ２（Ａｐｉ ｍ １－ＴＮＰ）で刺激した。結果を図２に示す。
また、変異型ＩｇＧ２ ｍＡｂを、ＩｇＥによるアレルギー性好塩基球活性化のＦｃγＲＩＩｂ依存性阻害を媒介する能力について評価した。特に、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ、ＩｇＧ４－ＬＬＧＧ及びＩｇＧ２－ＬＬＧＧ抗体を、ＩｇＥ＋アトピー性個体（蜜蜂毒アレルギー患者）からの好塩基球のＦｃεＲＩ活性化を調節するそれらの能力について、親ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ１と比較した。洗浄した血液中の好塩基球を、抗ＴＮＰ ＩｇＧ２又はＩｇＧ４ ｍＡｂの存在下で、主要な蜜蜂毒アレルゲンであるホスホリパーゼＡ２（Ａｐｉ ｍ １－ＴＮＰ）で刺激した。結果を図２に示す。
【0084】
最も驚くべきことに、Ａｐｉ ｍ １誘導性好塩基球活性化のほぼ完全な阻害は、ＩｇＧ２－ＬＬＧＧ及びＩｇＧ２－ＦＬＧＧによって媒介された（それぞれ８１％及び８５％阻害）が、予想通り、ＦｃγＲＩＩｂに結合しない親ＩｇＧ２は、Ａｐｉ ｍ １応答を阻害しなかった。驚くべきことに、いずれもＦｃγＲＩＩｂに貪欲に結合する親ＩｇＧ４及びＩｇＧ１は、使用される最高濃度（２μｇ／ｍｌ）でそれぞれ４２％及び４５％の阻害しか達成しない比較的弱い阻害を示した。
【0085】
下部ヒンジの変異は、ＦｃγＲＩＩｂに対するｍＡｂ特異性を改善する
ＦｃγＲＩＩｂ相互作用に対する特異性は、下部ヒンジの更なる変異によって更に改良され（図１）、洗浄した血液（すなわち、血漿を含まない）又は全血（すなわち、生理学的レベルのＩｇＧを含有する）を使用して、ＢＡＴアッセイにおける効力について評価した。その結果を図２、３、及び７に示す。
ＦｃγＲＩＩｂ相互作用に対する特異性は、下部ヒンジの更なる変異によって更に改良され（図１）、洗浄した血液（すなわち、血漿を含まない）又は全血（すなわち、生理学的レベルのＩｇＧを含有する）を使用して、ＢＡＴアッセイにおける効力について評価した。その結果を図２、３、及び７に示す。
【0086】
まず、Ｌ２３５Ｅの点変異を親ＩｇＧ４－ＷＴとＩｇＧ２－ＦＬＧＧ ｍＡｂの下部ヒンジ配列のＦＬＧＧに導入し、それぞれＩｇＧ４－ＦＥＧＧとＩｇＧ２－ＦＥＧＧを作製した。この変異は、一般にＦｃγＲ結合を除去すると記載されており（Ａｌｅｇｒｅ ＭＬ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８（１１）：３４６１－３４６８，１９９２）、いくつかの抗体におけるＦｃγＲ結合の不活性化のために使用されている（Ｒｅｄｄｙ ＭＰ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４（４）：１９２５－１９３３，２０００）。しかしながら、ここでは、ＦｃγＲＩＩｂへの結合が保持されることが見出された。
【0087】
ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ及びＩｇＧ４－ＦＥＧＧにおけるＬ２３５Ｅ変異は、元の修飾されていないＩｇＧ２－ＦＬＧＧ及びＩｇＧ４－ＷＴのＦｃγＲＩへの結合を、親ＩｇＧ２－ＷＴのほぼベースラインレベルまで除去した（図１Ｆ）。他の骨格依存性の違いも明らかであった。ＩｇＧ２骨格上で、ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ及びＩｇＧ２－ＦＬＧＧ変異体は、ＦｃγＲＩＩｂだけでなく、ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１及びＲ１３１対立遺伝子にも容易に結合する能力を含む類似の低親和性ＦｃγＲ結合プロファイルを示し（図１Ａ～Ｅ）、ＦｃγＲＩＩＩａの両方の対立遺伝子へのＩｇＧ２－ＦＥＧＧの結合は、比較的わずかしか低下しなかった（図１Ｄ、Ｅ）。しかしながら、このことは、ＩｇＧ４－ＦＥＧＧ ｍＡｂにおけるＩｇＧ４骨格に対する同じ変異の影響とは著しく対照的であり（図１）、ＳＥＬＦ変異との関連では結合が大幅に減少した（図５Ｆ）。
【0088】
次に、変異体を洗浄した血液ＢＡＴ（図２）で評価した。ここで、ＦｃγＲＩＩｂへの明らかな優先的かつ改善された結合にもかかわらず（図１Ａを参照）、ＩｇＧ４－ＦＥＧＧは、好塩基球活性化の抑制レベルが驚くほど弱い（４２％）ことを示し、これはＩｇＧ４－ＷＴ（４５％）と実質的に同等であった。対照的に、ＩｇＧ２骨格上の同等の配列であるＩｇＧ２－ＦＥＧＧ抗体は、元のＩｇＧ２－ＦＬＧＧ変異体及びＩｇＧ２－ＬＬＧＧでも見られるより強力な阻害を保持した（図２）。
【0089】
改善されたｍＡｂ親和性及び阻害効力のためのＣＨ２の修飾
ＦｃγＲＩＩｂ特異性を更に改善するために、ＦｃドメインのＣＨ２中の２つの残基を追加的に修飾した（表１を参照）。特に、ＩｇＧ１骨格で使用されている２つの変異Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ（ＳＥＬＦ）（Ｃｈｕ ＳＹ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５（１５）：３９２６－３９３３，２００８）を、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４ベースのｍＡｂ、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ、ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ及びＩｇＧ４－ＦＥＧＧ、並びに親ＩｇＧ４抗体に導入した。次いで、抗体を、アレルゲン特異的（図３）及び抗ＩｇＥ ＢＡＴ（図７）において特異性（図４～６を参照されたい）及び阻害効力について試験した。いくつかの効果が明らかになった。すなわち、ＳＥＬＦ変異の導入により、単量体ＩｇＧ（図６）及び複合化ＩｇＧ（図５）の両方の結合の親和性が有意な増加（７０倍超の増加）し、特異性が変化した。単量体ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦ及びＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦは、それぞれ、細胞表面（ＫＡ８９及び３２×１０６ Ｍ－１）上で発現されるＦｃγＲＩＩｂへの高い親和性結合を示し（図６Ａ）、ＢＬＩ分析（ＫＡ１０３及び２９×１０６ Ｍ－１）（図４及び表４）により、これらは、ＳＥＬＦ変異を伴わない同等のｍＡｂと比較して７０～１２０倍増加した親和性である（図４及び表４）。ＩｇＧ１－ＳＥＬＦ変異体は、以前に報告されたように高い親和性結合を示した（Ｃｈｕ ＳＹ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３９２６－３９３３，２００８）。特に、ＳＥＬＦ変異を有するこれらの抗体は、細胞上の阻害性ＦｃγＲＩＩｂに対するよりも、ＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１に対してより高い結合親和性（４～６倍）を示した（図６Ａ、Ｂ、並びに図４及び表４に示されるように、ＢＬＩ分析によって確認される）。
ＦｃγＲＩＩｂ特異性を更に改善するために、ＦｃドメインのＣＨ２中の２つの残基を追加的に修飾した（表１を参照）。特に、ＩｇＧ１骨格で使用されている２つの変異Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ（ＳＥＬＦ）（Ｃｈｕ ＳＹ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５（１５）：３９２６－３９３３，２００８）を、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４ベースのｍＡｂ、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ、ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ及びＩｇＧ４－ＦＥＧＧ、並びに親ＩｇＧ４抗体に導入した。次いで、抗体を、アレルゲン特異的（図３）及び抗ＩｇＥ ＢＡＴ（図７）において特異性（図４～６を参照されたい）及び阻害効力について試験した。いくつかの効果が明らかになった。すなわち、ＳＥＬＦ変異の導入により、単量体ＩｇＧ（図６）及び複合化ＩｇＧ（図５）の両方の結合の親和性が有意な増加（７０倍超の増加）し、特異性が変化した。単量体ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦ及びＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦは、それぞれ、細胞表面（ＫＡ８９及び３２×１０６ Ｍ－１）上で発現されるＦｃγＲＩＩｂへの高い親和性結合を示し（図６Ａ）、ＢＬＩ分析（ＫＡ１０３及び２９×１０６ Ｍ－１）（図４及び表４）により、これらは、ＳＥＬＦ変異を伴わない同等のｍＡｂと比較して７０～１２０倍増加した親和性である（図４及び表４）。ＩｇＧ１－ＳＥＬＦ変異体は、以前に報告されたように高い親和性結合を示した（Ｃｈｕ ＳＹ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３９２６－３９３３，２００８）。特に、ＳＥＬＦ変異を有するこれらの抗体は、細胞上の阻害性ＦｃγＲＩＩｂに対するよりも、ＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１に対してより高い結合親和性（４～６倍）を示した（図６Ａ、Ｂ、並びに図４及び表４に示されるように、ＢＬＩ分析によって確認される）。
【0090】
この新たに獲得した高い親和性結合は、免疫複合体の結合力の大幅な増加にも反映された（図５）。加えて、元のＩｇＧ２－ＦＬＧＧ及びＩｇＧ２－ＦＥＧＧ ｍＡｂのＦｃγＲＩＩＩ形態への予期せぬ免疫複合体結合（図１Ｄ、Ｅ）を、ＳＥＬＦ変異によって除去した（図５）。ＩｇＧ２骨格上にＳＥＬＦ変異を含めることの影響は、同等のＩｇＧ４ ｍＡｂでも明らかであり（図５）、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１に対する結合の増加は同様に示されたが、ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１に対する結合の増加は示されなかった。
【0091】
ＳＥＬＦ変異によって誘導される低親和性ＦｃγＲとの相互作用の親和性及び特異性に対する大きな変化にもかかわらず、ＦｃγＲＩとの相互作用は影響を受けず、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦは、ＩｇＧ１－ＳＥＬＦ変異型抗体と同一の結合を示した（図６Ｆ及び７Ｄ）。更に、重要なことに、ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦ及びＩｇＧ４－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦにおけるＳＥＬＦ変異によって、元のＩｇＧ２－ＦＥＧＧ又はＩｇ４－ＦＥＧＧにおいて観察されたＬ２３５Ｅ変異によるＦｃγＲＩ結合の除去が無効にならなかったことが見出された（図１Ｆ）。したがって、この抗体変異の組み合わせは、より限定された特異性だけでなく、阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの強固な結合ももたらした。
【表4】
【0092】
アレルギー患者及び健康なドナーからの全血における好塩基球活性化の阻害 変異型ＩｇＧ２ ｍＡｂも、全血におけるそれらの阻害効力について評価した。すなわち、２つの別個のＩｇＥ依存性刺激であるアレルゲンＡｐｉ ｍ １－Ｔ（図３）又は抗ＩｇＥ－ＴＮＰ（図７）のいずれかを使用して、ＩｇＧの生理学的レベルの存在下で評価した。対応するＩｇＧ４変異体と比較して、ＩｇＧ２ベースのｍＡｂ（図７Ａ）は、ＩｇＧ４－ｍＡｂ（図７Ｂ）よりもアレルゲン誘導性活性化のより強力な阻害剤であった。実際、洗浄した血液における活性化を阻害したＩｇＧ４、ＩｇＧ４－ＦＥＧＧ、及びＩｇＧ４－ＬＬＧＧ（図２）は、全血における非常に低い阻害を示した（それぞれ８％、８％、１３％の阻害）。対照的に、生理学的ＩｇＧの存在にもかかわらず、ＩｇＧ４の下部ヒンジを含有し、低親和性でＦｃγＲＩＩｂに結合するＩｇＧ２－ＦＬＧＧは、実質的な阻害を保持した（５４％、ＩＣ５０＝１．６μｇ／ｍｌ）。加えて、結果は、ＩｇＧ２ ｍＡｂの効力が、ＣＨ２領域のＳＥＬＦ変異の包含によって大幅に増加したことを示した。例えば、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦ及びＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦの結合は、それぞれＩＣ５０＝０．２４μｇ／ｍｌ及び０．３８μｇ／ｍｌに少なくとも６倍改善された。興味深いことに、ＳＥＬＦ変異を有する変異型ＩｇＧ２ ｍＡｂは、それらのＩｇＧ４下部ヒンジ当量よりも実質的に強力であった（例えば、ＩｇＧ４－ＳＥＬＦ ＩＣ５０＝１．１μｇ／ｍｌと比較して、ＩｇＧ４下部ヒンジを有するＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦ（ＩＣ５０＝０．２４μｇ／ｍｌ）、これは、ＩｇＧ骨格の性質が、これらの操作された抗体における阻害効力を決定する重要な要因であることを示している）。
【0093】
また、効力がアレルゲン系に固有のものでないことを確認するために、変異型ＩｇＧ２ ｍＡｂを第２のＩｇＥ／ＦｃεＲＩ依存系において試験した。すなわち、抗ＩｇＥ－ＴＮＰで刺激した全血中の好塩基球についてアッセイを行い、その結果、抗体によって媒介される阻害の相対的効力は、Ａｐｉ ｍ １－Ｔアレルゲン刺激を用いて見られるもの、すなわち、
、及びＩｇＧ４骨格ｍＡｂについては、
と同じであることが示された。したがって、含有する特定の変異型ｍＡｂが好塩基球の活性化を阻害する能力と、使用した他の抗体と比較したそのランキングは、好塩基球が抗ｈＩｇＥ－ＴＮＰ断片又はＡｐｉ ｍ １－ＴＮＰのどちらを介して活性化されたとしても同等であった。
【数1】
、及びＩｇＧ４骨格ｍＡｂについては、
【数2】
と同じであることが示された。したがって、含有する特定の変異型ｍＡｂが好塩基球の活性化を阻害する能力と、使用した他の抗体と比較したそのランキングは、好塩基球が抗ｈＩｇＥ－ＴＮＰ断片又はＡｐｉ ｍ １－ＴＮＰのどちらを介して活性化されたとしても同等であった。
【0094】
変異型ＩｇＧ２抗体の阻害機能は、ＦｃγＲＩＩｂ遮断によって損なわれる。
血中好塩基球に対する阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体の予想される発現（Ｋｅｐｌｅｙ ＣＬ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０６：３３７－３４８，２０００）をフローサイトメトリーによって確認した（図８Ａを参照されたい）。ＩｇＧ ｍＡｂによるＩｇＥ／ＦｃεＲＩ好塩基球活性化の阻害のＦｃγＲＩＩｂ依存性を、ＦｃγＲＩＩｂ特異的ｍＡｂであるＨ２Ｂ６を使用して好塩基球上で発現されるＦｃγＲＩＩｂの遮断によって評価した（図８Ｂ）。ＩｇＧ２－ＦＬＧＧの存在下での抗ＩｇＥ－ＴＮＰによる刺激前のＨ２Ｂ６ Ｆ（ａｂ’）２断片による全血の前処理により、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧの効力が有意に低下した（図８Ｂ）。
血中好塩基球に対する阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体の予想される発現（Ｋｅｐｌｅｙ ＣＬ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０６：３３７－３４８，２０００）をフローサイトメトリーによって確認した（図８Ａを参照されたい）。ＩｇＧ ｍＡｂによるＩｇＥ／ＦｃεＲＩ好塩基球活性化の阻害のＦｃγＲＩＩｂ依存性を、ＦｃγＲＩＩｂ特異的ｍＡｂであるＨ２Ｂ６を使用して好塩基球上で発現されるＦｃγＲＩＩｂの遮断によって評価した（図８Ｂ）。ＩｇＧ２－ＦＬＧＧの存在下での抗ＩｇＥ－ＴＮＰによる刺激前のＨ２Ｂ６ Ｆ（ａｂ’）２断片による全血の前処理により、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧの効力が有意に低下した（図８Ｂ）。
【0095】
ＦｃεＲＩ誘導性カルシウム動員の阻害
変異型ＩｇＧ２抗体を、ＩｇＥ：ＦｃεＲＩ誘導性カルシウム動員のＦｃγＲＩＩｂ依存性調節についても試験した（図８Ｃ）。ＦｃγＲＩＩｂとＦｃεＲＩ（αβγ２）複合体とを共発現する細胞を、親抗ＴＮＰ ＩｇＧ２又はＩｇＧ２ベースの抗ＴＮＰ変異型ｍＡｂの存在下で、ＩｇＥで感作し、抗ＩｇＥ－ＴＮＰで刺激した（図８Ｃ）。ｍＡｂによるＩｇＥ／ＦｃεＲＩカルシウム動員の阻害は、ＦｃγＲＩＩｂに対するそれらの親和性と、好塩基球のアレルゲン又は抗ＩｇＥ誘導活性化の両方におけるそれらの阻害の効力と相関していた（図３及び８）。ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦ及びＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦ抗体は、カルシウム動員の最大の阻害を示し、応答の大きさ及び動態の同様の低下を引き起こした。興味深いことに、ＳＥＬＦ変異を含有しなかったＩｇＧ２－ＦＬＧＧ抗体は、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩ Ｃａ２＋応答の実質的な低下を依然として示し（図８Ｃ）、これは全血における好塩基球活性化のその阻害とも一致する（図３）。
変異型ＩｇＧ２抗体を、ＩｇＥ：ＦｃεＲＩ誘導性カルシウム動員のＦｃγＲＩＩｂ依存性調節についても試験した（図８Ｃ）。ＦｃγＲＩＩｂとＦｃεＲＩ（αβγ２）複合体とを共発現する細胞を、親抗ＴＮＰ ＩｇＧ２又はＩｇＧ２ベースの抗ＴＮＰ変異型ｍＡｂの存在下で、ＩｇＥで感作し、抗ＩｇＥ－ＴＮＰで刺激した（図８Ｃ）。ｍＡｂによるＩｇＥ／ＦｃεＲＩカルシウム動員の阻害は、ＦｃγＲＩＩｂに対するそれらの親和性と、好塩基球のアレルゲン又は抗ＩｇＥ誘導活性化の両方におけるそれらの阻害の効力と相関していた（図３及び８）。ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦ及びＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦ抗体は、カルシウム動員の最大の阻害を示し、応答の大きさ及び動態の同様の低下を引き起こした。興味深いことに、ＳＥＬＦ変異を含有しなかったＩｇＧ２－ＦＬＧＧ抗体は、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩ Ｃａ２＋応答の実質的な低下を依然として示し（図８Ｃ）、これは全血における好塩基球活性化のその阻害とも一致する（図３）。
【0096】
表面ＩｇＥ、Ｂ細胞抗原受容体誘導性カルシウム動員の阻害
療法用ｍＡｂオマリズマブをＩｇＧ４及びＩｇＧ２抗体として再フォーマットし、これらを、抗原（ＮＩＰ２２ＢＳＡ）誘導性カルシウム動員のＦｃγＲＩＩｂ依存性調節について試験した（図９及び図１０）。
療法用ｍＡｂオマリズマブをＩｇＧ４及びＩｇＧ２抗体として再フォーマットし、これらを、抗原（ＮＩＰ２２ＢＳＡ）誘導性カルシウム動員のＦｃγＲＩＩｂ依存性調節について試験した（図９及び図１０）。
【0097】
ＦｃγＲＩＩｂとＮＰ特異的細胞表面ＩｇＥ ＢＣＲとを共発現するＩＩＡ１．６ Ｂ細胞を、療法用ｍＡｂオマリズマブ（ＩｇＧ１ ｍＡｂ）又はオマリズマブ変異型ｍＡｂ（ＩｇＧ４骨格を備えるか、又は本開示による変異型ＩｇＧ２抗体として提供される）で処理し、その後、ＢＣＲをＮＰ関連抗原ＮＩＰ（２２）ＢＳＡ抗原で刺激した。ＩｇＧ１オマリズマブ処理は、抗原（２回目の注射、ＮＩＰ（２２）ＢＳＡ、図９Ａ）による後続のカルシウム動員を強く抑制した。ＩｇＧ２変異型抗ＩｇＥ処理は、ＮＩＰ（２２）ＢＳＡ抗原（２回目の注射、図９Ｂ）による後続のカルシウム動員を部分的にしか抑制しなかった。オマリズマブと同様であるが、ＩｇＧ２対応物とは異なり、ＩｇＧ４フォーマットされた抗ＩｇＥは、抗原刺激カルシウム動員を強く抑制した（図９Ｃ）。これらの抑制活性は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４が阻害性ＦｃγＲＩＩｂ１に係合する能力と相関するが、ＩｇＧ２は、ＦｃγＲＩＩｂ１に結合することができない。
【0098】
ＢＣＲを標的とするｍＡｂの抗原刺激に対する効果を、ＩｇＧ２骨格を備えるオマリズマブの可変ドメインを含む抗ＩｇＥ ｍＡｂを使用して、ＦｃγＲＩＩｂ１を共発現するＩＩＡ１．６ Ｂ細胞について評価した（図１０）。ＩｇＥ ＢＣＲ及びヒトＦｃγＲＩＩｂ１をＩｇＧ２形態のオマリズマブと共発現するＢ細胞の処理は、緩衝液対照（２回目の注射、ＮＩＰ（２２）ＢＳＡ、図１０Ａ）と比較して、抗原（ＮＩＰ）特異的ｈｕ－ＩｇＥ ＢＣＲ誘発カルシウムフラックスの部分的な抑制をもたらした。この部分的な抑制は、ＩｇＧ２がＦｃγＲＩＩｂに結合しないため、ＦｃγＲＩＩｂ１とは無関係である。しかしながら、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ抗体として提供されるオマリズマブによる処理は、抗原特異的ｈｕ－ＩｇＥ ＢＣＲ誘発カルシウムフラックス（２回目の注射、図１０Ｂ）を大幅に抑制した。また、ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ ｍＡｂとして提供されるオマリズマブは、抗原誘発カルシウムフラックス（２回目の注射、図１０Ｃ）も抑制したが、ＩｇＧ２－ＦＬＧＧフォーマットされたｍＡｂよりも強力ではなかった。ＩｇＧ２－ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦ ｍＡｂとして提供されるオマリズマブの形態は、抗原刺激応答（２回目の注射、図１０Ｄ）も抑制したが、ＩｇＧ２－ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦ形態による抑制（図１０Ｅ）は、ＩｇＧ－ＦＬＧＧ ｍＡｂのものと同等であった。全体として、ＩｇＥ ＢＣＲの調節は、ＦＬＧＧ－ＳＥＬＦ＞ＦＬＧＧ～ＦＥＧＧ－ＳＥＬＦ＞ＦＥＧＧ＞ＩｇＧ２の階層を有し、これは、このＩｇＧ２フォーマットにおけるこれらの変異のＦｃγＲＩＩｂ結合活性のランク順序と広く相関していた。
【0099】
考察
免疫チェックポイントの標的化は、疾患における白血球応答を調節するための重要な戦略として浮上している。ＦｃγＲＩＩｂは、記載された最も初期の免疫チェックポイントのうちの１つである（Ｈｉｂｂｓ ＭＬ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８３：６９８０－６９８４，１９８６）。ＦｃεＲＩ、他の活性化型ＦｃＲ、及びＢ細胞抗原受容体によって利用されるＩＴＡＭ依存性シグナル伝達経路のその調節は、自然免疫及び適応免疫における抗体依存性白血球機能を調節する。これには、ＩｇＥ依存性好塩基球活性化の阻害（Ｃａｄｙ ＣＴ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ １３０（１－２）：５７－６５，２０１０）及びＢ細胞抗原受容体（Ａｍｉｇｏｒｅｎａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１８０８－１８１２，１９９２）が含まれる。本実施例で説明される研究では、下部ヒンジ配列を変異させることによってＦｃγＲＩＩｂの阻害効力を利用するように修飾されたＦｃγＲ特異性／親和性を有するｍＡｂを開発するための足場として「機能的に不活性な」ヒトＩｇＧ２を使用できることが見出された。実際、このようにして、活性化型受容体ＦｃεＲＩを調節し、それによってヒト好塩基球のＩｇＥ／ＦｃεＲＩアレルゲン又は抗ＩｇＥ活性化を阻害するように、ＦｃγＲＩＩｂの阻害効力を利用することが可能であることが見出された。更に、そのような変異型ＩｇＧ２抗体としての抗ＩｇＥ ｍＡｂを提供することは、表面ＩｇＥ Ｂ細胞受容体の抗原刺激の阻害に有効であった。
したがって、そのような変異型ＩｇＧ２抗体は、アレルギー反応を治療又は予防するための新規のｍＡｂ治療薬の基礎としてかなりの期待を提供する。
免疫チェックポイントの標的化は、疾患における白血球応答を調節するための重要な戦略として浮上している。ＦｃγＲＩＩｂは、記載された最も初期の免疫チェックポイントのうちの１つである（Ｈｉｂｂｓ ＭＬ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８３：６９８０－６９８４，１９８６）。ＦｃεＲＩ、他の活性化型ＦｃＲ、及びＢ細胞抗原受容体によって利用されるＩＴＡＭ依存性シグナル伝達経路のその調節は、自然免疫及び適応免疫における抗体依存性白血球機能を調節する。これには、ＩｇＥ依存性好塩基球活性化の阻害（Ｃａｄｙ ＣＴ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ １３０（１－２）：５７－６５，２０１０）及びＢ細胞抗原受容体（Ａｍｉｇｏｒｅｎａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１８０８－１８１２，１９９２）が含まれる。本実施例で説明される研究では、下部ヒンジ配列を変異させることによってＦｃγＲＩＩｂの阻害効力を利用するように修飾されたＦｃγＲ特異性／親和性を有するｍＡｂを開発するための足場として「機能的に不活性な」ヒトＩｇＧ２を使用できることが見出された。実際、このようにして、活性化型受容体ＦｃεＲＩを調節し、それによってヒト好塩基球のＩｇＥ／ＦｃεＲＩアレルゲン又は抗ＩｇＥ活性化を阻害するように、ＦｃγＲＩＩｂの阻害効力を利用することが可能であることが見出された。更に、そのような変異型ＩｇＧ２抗体としての抗ＩｇＥ ｍＡｂを提供することは、表面ＩｇＥ Ｂ細胞受容体の抗原刺激の阻害に有効であった。
したがって、そのような変異型ＩｇＧ２抗体は、アレルギー反応を治療又は予防するための新規のｍＡｂ治療薬の基礎としてかなりの期待を提供する。
【0100】
本明細書及び以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈が別段の定めがない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変化形は、記載された整数又は整数群の包含を意味するが、任意の他の整数又は整数群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。
【0101】
本明細書における任意の先行技術への言及は、そのような先行技術が共通の一般知識の一部を形成するという何らかの形の示唆を承認するものではなく、また承認するものとして解釈されるべきではない。
【0102】
本明細書に開示される免疫療法用タンパク質（例えば、変異型ＩｇＧ２抗体）及び組成物の方法及び使用は、記載される特定の出願によって制限されないことが、当業者には理解されるであろう。方法、使用、及び組成物は、本明細書に記載又は描写される特定の要素及び／又は特徴に関して、それらの好ましい実施形態においては制限されない。また、本明細書に開示される免疫療法用タンパク質及び組成物の方法及び使用は、開示される１つ以上の実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲によって記載及び定義される本開示の範囲から逸脱することなく、多数の再構成、変形及び置換が可能であることも理解されるであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】