特表 2024-500973 臍帯由来間葉系幹細胞培養液を有効成分として含む皮膚改善用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-10

(54)【発明の名称】臍帯由来間葉系幹細胞培養液を有効成分として含む皮膚改善用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/96 20060101AFI20231227BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20231227BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20231227BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20231227BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20231227BHJP

   A61K 35/51 20150101ALI20231227BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20231227BHJP

【ＦＩ】

A61K8/96

C12N5/0775 ZNA

A61Q19/00

A61Q19/08

A61K8/64

A61P17/00

A61P17/02

A61K35/51

C12N15/09 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023538914

(86)(22)【出願日】2021-11-05

(85)【翻訳文提出日】2023-06-21

(86)【国際出願番号】 KR2021016007

(87)【国際公開番号】W WO2022139166

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】10-2020-0180918

(32)【優先日】2020-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520221512

【氏名又は名称】ハンス ファーマ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮＳ ＰＨＡＲＭＡ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】イ、ナウン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ジョンテ

(72)【発明者】

【氏名】キム、グニョン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジンヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ドンウク

(72)【発明者】

【氏名】イ、ミンジ

(72)【発明者】

【氏名】イ、ロウン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C083

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AC20

4B065BB19

4B065CA44

4C083AA071

4C083AA072

4C083AD411

4C083EE12

4C083EE13

4C083FF01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB59

4C087BB64

4C087MA63

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA89

4C087ZB11

(57)【要約】

本発明は、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を有効成分として含む皮膚改善用組成物及び炎症性皮膚疾患予防又は治療用医薬組成物に関するものであり、傷の緩和、シワの改善、再生、弾力の増加、保湿、障壁の強化、抗炎症又は抗酸化効果を示すので、皮膚改善用化粧料組成物又は炎症性皮膚疾患予防又は治療用医薬組成物として有用に使用されるであろう。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

臍帯由来間葉系幹細胞培養液を有効成分として含む皮膚改善用化粧料組成物。

【請求項2】

前記皮膚改善は、傷の緩和、シワの改善、再生、弾力の増加、保湿、障壁の強化、抗炎症又は抗酸化である、請求項１に記載の化粧料組成物。

【請求項3】

前記臍帯由来間葉系幹細胞培養液は、６Ｃｋｉｎｅ、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、アンジオゲニン、ＡＮＧＰＴ－１、ＡＮＧＰＴ－２、ＡＮＧＰＴＬ－１、ＡＮＧＰＴＬ－２、アンジオスタチン、ＡＰＲＩＬ、アルテミン、ＢＤ－１、ＢＡＸ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰＲ－ＩＡ／ＡＬＫ－３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ１５４、Ｃｓｋ、ＣＬＣ、ＣＲＴＨ－２、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７、ＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ、ＣＸＣＲ２／ＩＬ－８ ＲＢ、ＣＸＣＲ５／ＢＬＲ－１、ＥＤＡ－Ａ２、ＥＤＧ－１、ＥＧ－ＶＥＧＦ／ＰＫ１、エンドスタチン、ＥｒｂＢ４、Ｆａｓリガンド、ＦＧＦ Ｂａｓｉｃ、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０／ＫＧＦ－２、ＦＧＦ－１１、ＩＬ－１３ １Ｂ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ－１５、ＧＲＯ－ａ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＨＣＲ（ＣＲＡＭ－Ａ／Ｂ）、ＨＲＧ１－α／ＮＲＧ１－α、ＩＧＦＢＰ－３、ＩＧＦＢＰ－６、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ－７、リンホトキシン－β／ＴＮＦＳＦ３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＤＣ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ ２、ＮＡＰ－２、ＰＦ４／ＣＸＣＬ４、ＰＬＵＮＣ、トロンボスポンジン－１、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２、ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１及びＴＲＡＤＤからなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む、請求項１に記載の皮膚改善用化粧料組成物。

【請求項4】

前記臍帯由来間葉系幹細胞培養液は、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、ＡＮＧＰＴ－１、ＡＮＧＰＴ－２、アンジオスタチン、ＡＰＲＩＬ、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＲＴＨ－２、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７、ＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ、ＦＧＦ－９、ＧＤＦ－１５、ＨＢ－ＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ－７、ＭＩＰ－１ａ及びＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む、請求項１に記載の皮膚改善用化粧料組成物。

【請求項5】

前記臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＮＧＰＴ－２、ＡＮＧＰＴＬ－１、ＡＮＧＰＴＬ－２、アンジオスタチン、ＡＰＲＩＬ、アルテミン、ＢＤ－１、ＢＡＸ、ＢＭＰ－３、ＢＭＰＲ－ＩＡ／ＡＬＫ－３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ１５４、Ｃｓｋ、ＣＬＣ、ＣＲＴＨ－２、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７、ＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ、 ＣＸＣＲ２／ＩＬ－８ ＲＢ、ＣＸＣＲ５／ＢＬＲ－１、ＥＤＡ－Ａ２、ＥＤＧ－１、ＥＧ－ＶＥＧＦ／ＰＫ１、ＥｒｂＢ４、Ｆａｓリガンド、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０／ＫＧＦ－２、ＦＧＦ－１１、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ９、ＧＲＯ－ａ、ＨＣＲ（ＣＲＡＭ－Ａ／Ｂ）、ＨＲＧ１－α／ＮＲＧ１－α、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ－７、リンホトキシン－β／ＴＮＦＳＦ３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＤＣ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ ２、ＮＡＰ－２、ＰＦ４／ＣＸＣＬ４、ＰＬＵＮＣ、ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１及びＴＲＡＤＤからなる群から選択される１つ以上のタンパク質、及び
６Ｃｋｉｎｅ、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、アンジオゲニン、ＡＮＧＰＴ－１、ＡＮＧＰＴ－２、ＡＮＧＰＴＬ－１、ＡＮＧＰＴＬ－２、アンジオスタチン、ＡＰＲＩＬ、アルテミン、ＢＤ－１、ＢＡＸ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰＲ－ＩＡ／ＡＬＫ－３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ１５４、Ｃｓｋ、ＣＬＣ、ＣＲＴＨ－２、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７、ＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ、ＣＸＣＲ２／ＩＬ－８ ＲＢ、ＣＸＣＲ５／ＢＬＲ－１、ＥＤＧ－１、ＥＧ－ＶＥＧＦ／ＰＫ１、ＥｒｂＢ４、Ｆａｓリガンド、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０／ＫＧＦ－２、ＦＧＦ－１１、ＩＬ－１３ １Ｂ、ＧＤＦ１１、ＨＣＲ（ＣＲＡＭ－Ａ／Ｂ）、ＨＲＧ１－α／ＮＲＧ１－α、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ－７、リンホトキシン－β／ＴＮＦＳＦ３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＤＣ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ ２、ＮＡＰ－２、ＰＦ４／ＣＸＣＬ４、ＰＬＵＮＣ、ＴＩＭＰ－２、ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１及びＴＲＡＤＤからなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む、請求項１に記載の皮膚改善用化粧料組成物。

【請求項6】

皮膚細胞のコラーゲン合成を促進する、請求項１に記載の化粧料組成物。

【請求項7】

アクアポリン又はヒアルロン酸の合成を促進する、請求項１に記載の化粧料組成物。

【請求項8】

皮膚細胞の活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）の産生を抑制する、請求項１に記載の化粧料組成物。

【請求項9】

皮膚細胞の炎症性サイトカインの産生を抑制する、請求項１に記載の化粧料組成物。

【請求項10】

前記炎症性サイトカインはＴＮＦ－αである、請求項９に記載の化粧料組成物。

【請求項11】

前記臍帯由来間葉系幹細胞は、
ｉ）ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＣＤ９０からなる群から選択される１つ以上の表面抗原に対して陽性を示し、
ｉｉ）ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ４５及びＣＤ３４からなる群から選択される１つ以上の表面抗原に対して陰性を示す、請求項１に記載の化粧料組成物。

【請求項12】

前記臍帯由来間葉系幹細胞培養液は、以下のステップを含む方法により製造される、請求項１に記載の化粧料組成物：
ａ）血管を除去した臍帯から間葉系幹細胞を分離するステップ、
ｂ）前記分離された間葉系幹細胞を無血清細胞培養培地で１回～１０回継代培養するステップ、及び
ｃ）前記継代培養の過程で培養液を得た後、濾過するステップ。

【請求項13】

臍帯由来間葉系幹細胞の培養液を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防又は治療用医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を有効成分として含む皮膚改善用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

幹細胞は、人体内での血管新生促進、抗炎症作用、免疫調節作用など、損傷組織の微小環境（ｍｉｃｒｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）調節による生体作用に関与することが知られている。これらの生体作用は、損傷組織の保護及び再生を促進する様々な増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）、及び抗酸化タンパク質が間葉系幹細胞から分泌されて生じる。これをパラクライン効果（ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔ）と呼ぶ。

【0003】

間葉系幹細胞から分泌された成分は、幹細胞培養液にも多く含まれる可能性があるため、化粧品及び医薬業界では、これらの幹細胞培養液因子を用いた化粧品及び医薬品の開発に努力を傾けている。

【0004】

一方、大韓民国公開特許公報第１０－２００９－０１１６６５９号には臍帯血由来の成体幹細胞培養液を含む美白化粧料組成物について開示されているが、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の傷の緩和、シワの改善、再生、弾力の増加、保湿、障壁の強化、抗炎症又は抗酸化による皮膚改善効果については知られていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、傷の緩和、シワの改善、再生、弾力の増加、保湿、障壁の強化、抗炎症又は抗酸化による皮膚改善効果を示す皮膚改善用化粧料組成物を提供することにある。

【0006】

他の目的は、炎症性皮膚疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一態様は、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を有効成分として含む皮膚改善用化粧料組成物を提供する。

【0008】

前記皮膚の改善は、傷の緩和、しわの改善、再生、弾力の増加、保湿、障壁の強化、抗炎症又は抗酸化であり得る。

【0009】

本明細書において、「臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ）」という用語は、哺乳類の胎児が胎盤で成長するように母体と胚をつなぐ緒を意味してもよく、一般にワルトンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ'ｓ ｊｅｌｌｙ）によって囲まれた３つの血管、すなわち、２つのへそ動脈と１つのへそ静脈からなる組織を意味してもよい、本明細書では臍帯と呼ばれるものである。

【0010】

本明細書において、「間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」という用語は、受精卵が分裂して生じた中胚葉から分化した軟骨、骨組織、脂肪組織、骨髄の間質（ｓｔｒｏｍａ）などに存在する幹細胞を意味し得る。間葉系幹細胞は、幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）と自己複製能（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）を保持し、軟骨細胞、骨芽細胞、筋肉細胞、脂肪細胞を含む様々な細胞に分化する能力を有し、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）、脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、海綿骨（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）、筋肉、膝蓋下脂肪体（ｉｎｆｒａｐａｔｅｌｌａｒ ｆａｔ ｐａｄ）などから抽出することができる。間葉系幹細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球の活性、増殖を抑制し、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＮＫ ｃｅｌｌ）の活性を抑制し、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）とマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の機能を調節する免疫調節能力を有するので、同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）と異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）が可能な細胞である。

【0011】

したがって、本明細書において「臍帯由来間葉系幹細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」とは、臍帯又は臍帯のワルトンゼリー組織から由来し、様々な組織細胞に分化することができる能力を有する細胞を意味し得る。

【0012】

前記臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は、６Ｃｋｉｎｅ、アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）／Ａｃｒｐ３０、アンジオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）－１（ＡＮＧＰＴ－１）、ＡＮＧＰＴ－２、アンジオポエチン様１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ １）（ＡＮＧＰＴＬ－１）、ＡＮＧＰＴＬ－２、アンジオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＡＰＲＩＬ、アルテミン（Ａｒｔｅｍｉｎ）、ＢＤ－１、ＢＡＸ、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、骨形成タンパク質受容体（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＢＭＰＲ－ＩＡ）／ＡＬＫ（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ；未分化リンパ腫キナーゼ）－３、ＣＣＲ（Ｃ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＣケモカイン受容体）１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ３０リガンド（Ｌｉｇａｎｄ）／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ１５４、Ｃｓｋ、ＣＬＣ、ＣＲＴＨ－２、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７（Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ２７；ＣＣモチーフケモカインリガンド２７）、ＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ；インターロイキン８受容体アルファ）、ＣＸＣＲ２／ＩＬ－８ ＲＢ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ；インターロイキン８受容体ベータ）、ＣＸＣＲ５／ＢＬＲ－１、ＥＤＡ－Ａ２、ＥＤＧ－１、ＥＧ－ＶＥＧＦ（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ－ｇｌａｎｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；内分泌腺由来血管内皮細胞増殖因子）／ＰＫ１、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＥｒｂＢ４、Ｆａｓリガンド、ＦＧＦ Ｂａｓｉｃ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０／ＫＧＦ－２、ＦＧＦ－１１、ＩＬ－１３ １Ｂ、ＧＤＦ（Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ；増殖分化因子）３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ－１５、ＧＲＯ－ａ、ＨＢ－ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ；ヘパリン結合性ＥＧＦ）、ＨＣＲ（ｈｅｍｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ；ヘム制御リプレッサー）（ＣＲＡＭ－Ａ／Ｂ）、ＨＲＧ１－α／ＮＲＧ１－α、ＩＧＦＢＰ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；インスリン様増殖因子結合タンパク質）－３、ＩＧＦＢＰ－６、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ（ＩＧＦＢＰ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＩＧＦＢＰ－関連タンパク質）１／ＩＧＦＢＰ－７、リンホトキシン（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）－β／ＴＮＦＳＦ３、Ｍ－ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ；マクロファージコロニー刺激因子）、ＭＤＣ、ＭＩＰ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；マクロファージ炎症性タンパク質）－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ２、ＮＡＰ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；好中球活性化タンパク質）－２、ＰＦ４／ＣＸＣＬ４、ＰＬＵＮＣ（Ｐａｌａｔｅ、ｌｕｎｇ ａｎｄ ｎａｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃｌｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ；口蓋、肺及び鼻咽頭上皮のクローンタンパク質）、トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）－１、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２、ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１、ＴＲＡＤＤ（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ １－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＤＥＡＴＨ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ；腫瘍壊死因子受容体タイプ１－関連デスドメインタンパク質）、又はそれらの組み合わせのタンパク質を含み得る。例えば、前記臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は、前記７１種のタンパク質のうち、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、又は全てのタンパク質を含むことができる。

【0013】

一実施形態では、前記臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の成分をｉＢｒｉｇｈｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて測定した結果、下記表１に記載のような信号強度を有し得る。

【0014】

【表1】

前記臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、ＡＮＧＰＴ－１、ＡＮＧＰＴ－２、アンジオスタチン、ＡＰＲＩＬ、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＲＴＨ－２、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７、ＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ、ＦＧＦ－９、ＧＤＦ－１５、ＨＢ－ＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ－７、ＭＩＰ－１ａ及びＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含み得る。

【0015】

前記臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は、カンステムバイオテック（ソウル、大韓民国）の臍帯血由来間葉系幹細胞培養液に含まれていない、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＮＧＰＴ－２、ＡＮＧＰＴＬ－１、ＡＮＧＰＴＬ－２、アンジオスタチン、ＡＰＲＩＬ、アルテミン、ＢＤ－１、ＢＡＸ、ＢＭＰ－３、ＢＭＰＲ－ＩＡ／ＡＬＫ－３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ１５４、Ｃｓｋ、ＣＬＣ、ＣＲＴＨ－２、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７、ＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ、ＣＸＣＲ２／ＩＬ－８ ＲＢ、ＣＸＣＲ５／ＢＬＲ－１、ＥＤＡ－Ａ２、ＥＤＧ－１、ＥＧ－ＶＥＧＦ／ＰＫ１、ＥｒｂＢ４、Ｆａｓリガンド、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０／ＫＧＦ－２、ＦＧＦ－１１、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ９、ＧＲＯ－ａ、ＨＣＲ（ＣＲＡＭ－Ａ／Ｂ）、ＨＲＧ１－α／ＮＲＧ１－α、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ－７、リンホトキシン－β／ＴＮＦＳＦ３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＤＣ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ ２、ＮＡＰ－２、ＰＦ４／ＣＸＣＬ４、ＰＬＵＮＣ、ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１及びＴＲＡＤＤからなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含み得る。

【0016】

前記臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は、大韓民国登録特許第１０－２１７２３４４号に開示された方法で製造した神経幹細胞培養液に含まれない、６Ｃｋｉｎｅ、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、アンジオゲニン、ＡＮＧＰＴ－１、ＡＮＧＰＴ－２、ＡＮＧＰＴＬ－１、ＡＮＧＰＴＬ－２、アンジオスタチン、ＡＰＲＩＬ、アルテミン、ＢＤ－１、ＢＡＸ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰＲ－ＩＡ／ＡＬＫ－３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ１５４、Ｃｓｋ、ＣＬＣ、ＣＲＴＨ－２、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７、ＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ、ＣＸＣＲ２／ＩＬ－８ ＲＢ、ＣＸＣＲ５／ＢＬＲ－１、ＥＤＧ－１、ＥＧ－ＶＥＧＦ／ＰＫ１、ＥｒｂＢ４、Ｆａｓリガンド、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０／ＫＧＦ－２、ＦＧＦ－１１、ＩＬ－１３ １Ｂ、ＧＤＦ１１、ＨＣＲ（ＣＲＡＭ－Ａ／Ｂ）、ＨＲＧ１－α／ＮＲＧ１－α、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ－７、リンホトキシン－β／ＴＮＦＳＦ３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＤＣ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ ２、ＮＡＰ－２、ＰＦ４／ＣＸＣＬ４、ＰＬＵＮＣ、ＴＩＭＰ－２、ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１及びＴＲＡＤＤからなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含み得る。

【0017】

前記臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＮＧＰＴ－２、ＡＮＧＰＴＬ－１、ＡＮＧＰＴＬ－２、アンジオスタチン、ＡＰＲＩＬ、アルテミン、ＢＤ－１、ＢＡＸ、ＢＭＰ－３、ＢＭＰＲ－ＩＡ／ＡＬＫ－３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ１５４、Ｃｓｋ、ＣＬＣ、ＣＲＴＨ－２、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７、ＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ、ＣＸＣＲ２／ＩＬ－８ ＲＢ、ＣＸＣＲ５／ＢＬＲ－１、ＥＤＡ－Ａ２、ＥＤＧ－１、ＥＧ－ＶＥＧＦ／ＰＫ１、ＥｒｂＢ４、Ｆａｓリガンド、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０／ＫＧＦ－２、ＦＧＦ－１１、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ９、ＧＲＯ－ａ、ＨＣＲ（ＣＲＡＭ－Ａ／Ｂ）、ＨＲＧ１－α／ＮＲＧ１－α、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ－７、リンホトキシン－β／ＴＮＦＳＦ３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＤＣ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ ２、ＮＡＰ－２、ＰＦ４／ＣＸＣＬ４、ＰＬＵＮＣ、ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１及びＴＲＡＤＤからなる群から選択される１つ以上のタンパク質、及び６Ｃｋｉｎｅ、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、アンジオゲニン、ＡＮＧＰＴ－１、ＡＮＧＰＴ－２、ＡＮＧＰＴＬ－１、ＡＮＧＰＴＬ－２、アンジオスタチン、ＡＰＲＩＬ、アルテミン、ＢＤ－１、ＢＡＸ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰＲ－ＩＡ／ＡＬＫ－３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ１５４、Ｃｓｋ、ＣＬＣ、ＣＲＴＨ－２、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７、ＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ、ＣＸＣＲ２／ＩＬ－８ ＲＢ、ＣＸＣＲ５／ＢＬＲ－１、ＥＤＧ－１、ＥＧ－ＶＥＧＦ／ＰＫ１、ＥｒｂＢ４、Ｆａｓリガンド、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０／ＫＧＦ－２、ＦＧＦ－１１、ＩＬ－１３ １Ｂ、ＧＤＦ１１、ＨＣＲ（ＣＲＡＭ－Ａ／Ｂ）、ＨＲＧ１－α／ＮＲＧ１－α、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ－７、リンホトキシン－β／ＴＮＦＳＦ３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＤＣ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ２、ＮＡＰ－２、ＰＦ４／ＣＸＣＬ４、ＰＬＵＮＣ、ＴＩＭＰ－２、ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１及びＴＲＡＤＤからなる群から選択される１つ以上のタンパク質とを含み得る。

【0018】

前記化粧料組成物は、皮膚細胞の傷を回復することによって傷跡をケアすることができる。

【0019】

前記化粧料組成物は、皮膚細胞のコラーゲン合成を促進することによって、皮膚のシワの改善、再生又は弾力の増加の効果を示すことができる。

【0020】

前記化粧料組成物は、アクアポリン又はヒアルロン酸の合成を促進することによって皮膚保湿又は障壁の強化の効果を示すことができる。

【0021】

本明細書において、「アクアポリン（ａｑｕａｐｏｒｉｎ；ＡＱＰ）」という用語は、細胞膜内にチャネルを形成して水分子の受動輸送を誘導する内在性膜タンパク質であり、他の物質の移動は制限しながら水分子のみを選択的に通過させるタンパク質を意味する。

【0022】

本明細書において、「ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＨＡ）」という用語は、Ｎ－アセチルグルコサミンとグルクロン酸からなる高分子化合物として皮膚の保湿に役立つ因子を意味する。

【0023】

前記化粧料組成物は、皮膚細胞の活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）の生成を抑制することによって抗酸化効果を示すことができる。

【0024】

前記化粧料組成物は、皮膚細胞の炎症性サイトカインの産生を抑制することによって抗炎症効果を示すことができる。

【0025】

前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６又はＩＬ－１２であり得るが、これらに限定されない。具体的には、前記炎症性サイトカインはＴＮＦ－αであり得る。

【0026】

前記臍帯由来間葉系幹細胞は、ｉ）ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＣＤ９０からなる群から選択される１つ以上の表面抗原に対して陽性を示し、ｉｉ）ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ４５及びＣＤ３４からなる群から選択される１つ以上表面抗原に対して陰性を示すことができる。

【0027】

本明細書において、「陽性」という用語は、幹細胞表面マーカーに関して、その表面マーカーが基準となる他の非幹細胞と比較した場合、より多い量又はより高い濃度で存在することを意味し得る。すなわち、細胞は、ある表面マーカーが細胞表面に存在するため、そのマーカーを用いてその細胞を１つ以上の他の細胞タイプと区別することができれば、そのマーカーに対して陽性となる。また、細胞がバックグラウンド値よりも大きい値で信号、例えば細胞分析装置が測定できるだけの信号の量でそのマーカーを発現していることを意味し得る。例えば、細胞を幹細胞特異的表面抗原であるＣＤ４４に特異的な抗体で検出可能であり、この抗体からの信号が対照群（例えば、バックグラウンド値）よりも検出可能に大きい場合、その細胞は「ＣＤ４４^＋」である。

【0028】

本明細書において、「陰性」という用語は、特定の細胞表面マーカーに特異的な抗体を使用しても、バックグラウンド値と比較してそのマーカーを検出できないことを意味する。例えば、ＣＤ１４に特異的な抗体で細胞を検出可能に標識できない場合、その細胞は「ＣＤ１４^－」である。

【0029】

前記免疫学的特性は、本発明が属する技術分野で知られている通常の方法によって決定することができる。例えば、フローサイトメトリー、免疫細胞化学染色、又はＲＴ－ＰＣＲなどの様々な方法が用いられることができる。

【0030】

前記臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は、ａ）血管を除去した臍帯から間葉系幹細胞を分離するステップ、ｂ）前記単離された間葉系幹細胞を無血清の細胞培養培地で１～１０回継代培養するステップ、及びｃ）前記継代培養の過程で培養液を得た後、濾過するステップを含む方法によって製造することができる。

【0031】

前記臍帯は、健康な産婦（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ陰性の妊婦）から出産後に分離された胎盤を使用することができる。すなわち、前記「分離された臍帯」とは、産婦の母体から出産後に分離される臍帯を意味し得る。前記分離された臍帯は、分離された後に迅速に滅菌された容器及び氷に入れて保管することができる。

【0032】

前記臍帯を胎盤から分離して得る方法は、例えば、分離された胎盤から臍帯を分離するステップ、前記分離された臍帯の外部の血液を除去するステップ、前記血液が除去された臍帯の動脈と静脈を除去するステップ、及び／又は前記動脈と静脈が除去された 臍帯（へその緒） を一定のサイズ（例えば、１～２０ｍｍ）に細切するステップを含み得る。前記血液の除去は、例えば、Ｃａ／Ｍｇ ｆｒｅｅ ＤＰＢＳ、又はゲンタマイシン含有Ｃａ／Ｍｇ ｆｒｅｅ ＤＰＢＳを用いることができる。

【0033】

次に、分離酵素を処理して、細断された臍帯（例えば単離された臍帯）から間葉系幹細胞を分離することができる。前記分離酵素は、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）、及び／又はディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ）を含むことができる。

【0034】

次に、前記分離された臍帯由来間葉系幹細胞をＰ０として１回～１０回継代培養するステップを含むことができる。具体的には、３回又は４回継代培養してもよい。

【0035】

前記継代培養の過程で培養液を得た後、濾過するステップを通じて、本発明による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を得ることができる。

【0036】

前記化粧料組成物は、必要に応じて、当業界における通常の製造される化粧料剤形に製剤化することができる。

【0037】

前記化粧料組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化されることができるが、これに限定されない。具体的には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー又はパウダーの剤形に製剤化することができる。また、前記化粧料組成物の剤形がペースト、クリーム又はゲルである場合には、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛及びそれらの混合物からなる群から選択される担体成分を含むことができる。

【0038】

また、前記化粧料組成物の剤形が溶液又は乳濁液である場合には、溶媒、溶媒和剤、乳濁化剤及びそれらの混合物からなる群から選択される担体成分を含むことができる。その例としては、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル及びそれらの混合物などが挙げられる。

【0039】

また、前記化粧料組成物の剤形が懸濁液である場合には、水、エタノール、又はプロピレングリコール等の液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル等の懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガ、トラガカント及びそれらの混合物からなる群から選択される担体成分を含み得る。

【0040】

前記担体成分は、化粧料組成物の総重量に基準にして約１～約９９．９９重量％、好ましくは約８０重量％～約９０重量％で含んでもよい。

【0041】

本発明の他の態様は、臍帯由来間葉系幹細胞の培養液を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。

【0042】

前記臍帯由来間葉系幹細胞の培養液については上記の通りである。

【0043】

前記炎症性皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、接触性皮膚炎、ニキビ、脂漏性皮膚炎、汗疹、蕁麻疹、乾癬、皮膚硬化症、湿疹、白斑症、ループス、及び円形脱毛症からなる群から選択される１つ以上の疾患であり得るが、これに限定されるものではない。

【0044】

前記医薬組成物は、有効成分として、前記臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を組成物の総重量を基準にして約０．１重量％～約９０重量％、具体的には約０．５重量％～約７５重量％、より具体的には、約１重量％～約５０重量％で含有してもよい。

【0045】

前記医薬組成物は、通常の方法に従って製剤に配合される通常の非毒性の薬学的に許容可能な添加剤を含み得る。例えば、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含み得る。

【0046】

前記医薬組成物は皮膚に塗布してもよい。前記医薬組成物の剤形は皮膚外用剤の剤形であり得る。前記皮膚外用剤は特にこれに限定されないが、例えば軟膏剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、クリーム剤、散剤、懸濁剤、湿布剤（しめふざい）又はゲル剤の形態で製造して使用することができる。

【0047】

重複する内容は、本明細書の複雑さを考慮して省略され、本明細書で他に定義されていない用語は、本発明が属する技術分野で通常使用される意味を有するものである。

【0048】

【発明の効果】

【0049】

本発明の一態様による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を含む化粧料組成物は、傷の緩和、シワの改善、再生、弾力の増加、保湿、障壁の強化、抗炎症又は抗酸化効果を示すため、皮膚改善用化粧料組成物に有用に使用し得る。

【0050】

他の態様による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を有効成分として含む医薬組成物は、炎症性サイトカインの産生を抑制する効果があるため、炎症性皮膚疾患の予防又は治療用組成物として広く活用されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞のＸ４０倍率顕微鏡の写真である。

【図2】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞のＸ１００倍率顕微鏡の写真である。

【図3】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の骨細胞への分化能を確認した結果である。

【図4】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を確認した結果である。

【図5】フローサイトメトリーであるＦＡＣＳ分析により、一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の幹細胞特異的表面マーカー発現の有無を確認した結果である。

【図6】免疫細胞蛍光染色法により、一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の幹細胞特異的表面マーカー発現の有無を確認した結果である。

【図7】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液に含まれるタンパク質成分を分析した結果である。

【図8】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液から分泌されるタンパク質の発現強度を測定したグラフである。

【図9】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の処理濃度によるヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）の細胞生存率を測定した結果である。

【図10】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の処理濃度によるヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）の細胞生存率を測定した結果である。

【図11】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液及び脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞培養液の処理によるヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）の細胞形態を観察した結果である。ここで、ＡＤは脂肪を、ＢＭは骨髄を、ＵＣは臍帯を意味する。

【図12】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液及び脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞培養液の処理によるヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）の細胞生存率を測定した結果である。ここで、ＡＤは脂肪を、ＢＭは骨髄を、ＵＣは臍帯を意味する。

【図13】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の処理濃度によるヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）で傷跡回復効果を示す顕微鏡写真及び傷跡回復率を測定した結果である。

【図14】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の処理濃度によるヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）で傷跡回復効果を示す顕微鏡写真及び傷跡回復率を測定した結果である。

【図15】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液（ＵＣ－ＭＳＣ）と脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ－ＭＳＣ）、骨髄由来間葉系幹細胞培養液（ＢＭ－ＭＳＣ）の処理によるヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）の傷跡回復を示す顕微鏡写真及び傷跡回復率を測定した結果である。

【図16】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の濃度を異にしてヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）に処理した後、ＣＯＬ１Ａ１の発現の有無を確認した電気泳動写真とＣＯＬ１Ａ１の発現量とを比較したグラフである。

【図17】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の濃度を異にしてヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）に処理した後、ＣＯＬ３Ａ１の発現の有無を確認した電気泳動写真とＣＯＬ３Ａ１の発現量とを比較したグラフである。

【図18】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の処理濃度によるヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）におけるＰＩＣＰ発現量を比較したグラフである。

【図19】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の処理濃度によるヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）におけるＡＱＰ３、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３の発現の有無を確認した電気泳動写真とそれぞれの発現量とを比較したグラフである。

【図20】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液（ＵＣ）と脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ）、骨髄由来間葉系幹細胞培養液（ＢＭ）の処理によるヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）におけるＡＱＰ３、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３の発現の有無を確認した電気泳動写真とそれぞれの発現量とを比較したグラフである。

【図21】マウスマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）にリポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）を処理して炎症反応を誘導し、一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の濃度を異にして処理した後、ＴＮＦ－αの発現の有無を示す電気泳動写真とＴＮＦ－αの発現量とを比較したグラフである。

【図22】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の処理濃度によるヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）におけるＴｒｏｌｏｘ当量抗酸化能力を比較した結果（左）及び臍帯（へその緒）由来中間葉系幹細胞培養液（ＵＣ）、脂肪由来間葉系幹細胞培養液（ＡＤ）、骨髄由来間葉系幹細胞培養液（ＢＭ）の処理によるヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）におけるＴｒｏｌｏｘ当量の抗酸化能力を比較した結果（右）である。

【図23】一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の処理濃度によるヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）における細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の濃度変化を測定した結果及びＤＣＦ－ＤＡ蛍光値を比較したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0052】

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0053】

製造例１．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞及び臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の製造
健康な妊婦の分娩過程で供与された臍帯を、クリーンベンチ（Ｃｌｅａｎ Ｂｅｎｃｈ）又はバイオハザード対策用キャビネット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｃａｂｉｎｅｔ；ＢＳＣ）の氷上に細胞培養皿を置き、リン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で洗浄した。滅菌したハサミで臍帯の血管を先に除去し、３ｍｍ～５ｍｍ程度の大きさに細切した。細切した臍帯組織を細胞培養フラスコに移した後、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）酵素を処理し、３０分間３７℃で反応させ、５％ＨＰＬ（Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｌｙｓａｔｅ；ヒト血小板溶解物、Ｈｅｌｉｏｓ ＵｌｔｒａＧＲＯ）、１％Ｐ／Ｓ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；ペニシリン／ストレプトマイシン、ＧＩＢＣＯ）を含むＭＥＭ－ａｌｐｈａ（ＧＩＢＣＯ）培地を添加して３７℃のインキュベーターで培養して、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞を得た。

【0054】

得られた間葉系幹細胞を３回又は４回継代培養した後に細胞の培養密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が７０～８０％になると、培養培地を５％ ＨＰＬ及び１％ Ｐ／Ｓを含むｐｈｅｎｏｌ－ｒｅｄ ｆｒｅｅ ＭＥＭ－ａｌｐｈａと交換して４８時間培養する過程で培養液を分離した。分離した培養液を０．２２μｍフィルターで濾過して臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を得た。

【0055】

比較例１．脂肪由来間葉系幹細胞培養液及び骨髄由来間葉系幹細胞培養液の製造
Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌから購入した脂肪由来間葉系幹細胞（Ｃａｔ＃Ｃ－１２９７８）及びＬｏｎＺａから購入した骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃａｔ＃ＰＴ－２５０１）を３回又は４回継代培養した後、５％ＨＰＬ及び１％Ｐ／Ｓを含むＭＥＭ－アルファ培地を添加してさらに培養した。細胞の培養密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が７０～８０％になると、培養培地をｐｈｅｎｏｌ－ｒｅｄ ｆｒｅｅ ＭＥＭ－ａｌｐｈａと交換して４８時間培養する過程で脂肪由来間葉系幹細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞培養液を得た。

【0056】

実験例１．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の特性解析

【0057】

実験例１．１．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の細胞形態観察
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の形態を顕微鏡で観察した。図１は、Ｘ４０倍率顕微鏡で観察した写真であり、図２は、Ｘ１００倍率顕微鏡で観察した写真である。

【0058】

実験例１．２．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の分化能解析
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の骨細胞及び脂肪細胞への分化能を解析するために、以下の実験を行った。

【0059】

まず、骨細胞への分化能を解析するために、６ウェルプレートに臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞をウェルあたり２．５×１０^５細胞に分注（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、低グルコースＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）及び１％Ｐ／Ｓを含む）で２４時間培養した。次いで、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａ Ｄ４９０２）、１０μＭのβ－グリセロールリン酸（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ Ｇ９８９１）及び０．２５ｍＭのアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ；ＡＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａ４５４４）を含む完全な分化培地に交換後２１日間培養した。培養終了後、アリザリンレッドＳ染色（Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ Ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行い、骨細胞形成の有無を確認した。その結果、ほとんどの細胞が赤色に染色されたことにより、臍帯（へその緒）由来幹細胞が骨細胞に分化したことを確認した（図３）。

【0060】

次に、脂肪細胞への分化能を解析するために、６ウェルプレートに臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞をウェルあたり１×１０^５に分注した後、低グルコースＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ及び１％ＡＡを含む）で２４時間培養した。次いで、０．５ｍＭ ３－イソブチル－１－メチルキサンチン（３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ；ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ Ｉ７０１８）、１μＭヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、Ｓｉｇｍａ Ｈ０８８８）及び０．１ｍＭインドメタシン（Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、Ｓｉｇｍａ Ｉ７３７８）を完全な分化培地に交換後、２１日間培養し、培地を２～３日ごとに交換した。培養が完了した後、オイルレッドＯ（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ、Ｓｉｇｍａ）染色を行い、脂質液滴の形成を確認した。その結果、水滴のように見える大小の物質（脂肪）が赤色に染色されたことにより、臍帯（へその緒）由来幹細胞が脂肪細胞に分化したことを確認した（図４）。

【0061】

これにより、本発明の一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞が骨細胞及び脂肪細胞への分化能を有していることが分かった。

【0062】

実験例１．３．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の表面マーカー発現分析
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞が幹細胞表面マーカーに対する発現の有無を解析するために、以下の実験を行った。

【0063】

実験例１．３．１．フローサイトメトリーによる解析
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の培養密度が８０～９０％になったとき、培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、トリプシンを添加して細胞を解離した後、ＰＢＳでさらに洗浄した。細胞数を数え、蛍光励起セルソーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）を添加して１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなした後、細胞に陽性マーカー（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ）であるＣＤ４４（ＰＥ）、ＣＤ７３（ＦＩＴＣ）、ＣＤ１０５（ＡＰＣ）、ＣＤ９０（ＰＥ－Ｃｙ７）と陰性マーカー（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ）であるＣＤ１４（ＰＥ）、ＣＤ１９（ＦＩＴＣ）、ＣＤ４５（ＡＰＣ）、ＣＤ３４（ＰＥ－ｃｙ７）抗体を反応させた後ＦＡＣＳを用いて臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞の特異的発現マーカーを確認した。その結果、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０に対して選択的に陽性を示し、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ３４に対して選択的に陰性を示す細胞であることを確認した（図５）。

【0064】

実験例１．３．２．免疫細胞化学染色による解析
４ウェルチャンバースライド（ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅ）に保持していた製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞を４％ｐ－ホルムアルデヒドを用いて３７℃で２０分間固定した後、カルシウムイオン過マグネシウムイオンを含むＰＢＳで２回洗浄した。次いで、ＰＢＳに界面活性剤であるＴｏｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を０．１％に希釈して１０分間処理した後、ＰＢＳで再び洗浄した。非特異的抗体が付着して検出されるのを防ぐために、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳで５％に希釈した後、添加する試料に１時間反応させた。

【0065】

抗体は細胞によって付着する抗体の種類が異なり、タンパク質による標的抗体及び希釈率を下記表２に示す。希釈した抗体溶液と共に４℃のシェーカー（ｓｈａｋｅｒ）で１６時間反応させた。さらに、ＤＡＰＩ（ａｂｃａｍ、ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ１０４１３９、１，０００倍希釈）を用いて核を染色した。染色が完了した試料は蛍光顕微鏡を用いて画像を得た。その結果、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞は、幹細胞の表面陽性マーカーであるＣＤ４４（緑色）を発現し、表面陰性マーカーであるＣＤ３４（赤色）は発現しないことを確認した（図６）。

【0066】

【表2】

これにより、本発明の一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞が幹細胞特異的特性を示すことが分かった。

【0067】

実験例２．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液のセクレトーム解析
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液のセクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）を解析するために、ＲａｙＢｉｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ， Ｎｏｎｃｒｏｓｓ， ＧＡ， ＵＳＡ）を用いて血清がない状態での臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の成分を確認した。

【0068】

アレイ膜（Ａｒｒａｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を室温で３０分間ブロッキングバッファでインキュベーションした後、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液２ｍｌを１時間処理した。膜を５回洗浄した後、ビオチン結合（ｂｉｏｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体を室温で１～２時間処理し、基質であるＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）２ｍｌを添加した。２時間経過後、検出バッファ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を２分間処理し、ｉＢｒｉｇｈｔ（ＣＬ１０００ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の成分を確認し、その信号強度をｉＢｒｉｇｈｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて測定し、下記表３に示す。

【0069】

【表3】

その結果、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液が様々な増殖因子、サイトカインなどを多数含んでいることを確認した（図７及び図８）。具体的には、皮膚再生及び皮膚老化防止に関与するタンパク質であるアディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）／Ａｃｒｐ３０、血管新生誘導因子（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）－１、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ １、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ２、アンジオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰＲ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）－ＩＡ／ＡＬＫ（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ）－３、Ｃｓｋ、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７（Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ２７）、ＣＸＣＲ２／ＩＬ－８ ＲＢ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ｂｅｔａ）、ＥＤＡ－Ａ２、ＥＤＧ－１、ＥＧ－ＶＥＧＦ（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ－ｇｌａｎｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）／ＰＫ１、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＥｒｂＢ４、ＦＧＦ Ｂａｓｉｃ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０／ＫＧＦ－２、ＦＧＦ－１１、ＧＤＦ（Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＲＯ－ａ、ＨＢ－ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子）、トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）－１、ＴＩＭＰ（チオイノシンモノホスフェート）－１、ＴＩＭＰ－２及びＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ－１を含有していることを確認した。

【0070】

さらに、抗炎症効果及び自己免疫疾患の予防に必要なタンパク質であるＣＸＣＲ１／ＩＬ－８ ＲＡ、ＣＸＣＲ５（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ５）／ＢＬＲ－１、ＥＤＧ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ）－１、Ｆａｓ Ｌｉｇａｎｄ、ＩＬ－１３ １Ｂ、ＨＣＲ（ｈｅｍｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）（ＣＲＡＭ－Ａ／Ｂ）、Ｍ－ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＭＤＣ、ＭＩＰ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ－２、ＮＡＰ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）－２、ＰＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ）４／ＣＸＣＬ４、ＰＬＵＮＣ（Ｐａｌａｔｅ， ｌｕｎｇ， ａｎｄ ｎａｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃｌｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＲＡＤＤ（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ １－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＤＥＡＴＨ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）等を含有していることを確認した。

【0071】

実験例３．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の細胞毒性及び細胞増殖効果の評価
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の細胞毒性及び細胞増殖効果を評価するために、ヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）及びヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）を用いて以下の実験を行った。

【0072】

９６ウェルプレートにＨａＣａＴ及びＨＳ６８をそれぞれウェルあたり１×１０^３ｃｅｌｌｓ／１００μｌずつ分注して２４時間培養した後、陰性対照群（ＮＣ；無処理群）及び実験群として濃度５％、１０％、２５％、５０％、１００％の臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液をそれぞれ処理した。各濃度の培養液処理後、３日間毎日同じ時間にＣＣＫ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、ＣＫ０４－１３）試薬を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定することにより細胞活性の変化を観察した。その結果、処理した臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液に濃度依存的にＨａＣａＴ（図９）及びＨＳ６８（図１０）の生存率が増加することを確認した。

【0073】

また、９６ウェルプレートにＨａＣａＴをそれぞれウェルあたり１×１０^３ｃｅｌｌｓ／１００μｌで分注して２４時間培養した後、陰性対照群（ＮＣ）、比較対照群として比較例１で得られた脂肪由来間葉系幹細胞培養液及び骨髄由来間葉系幹細胞、実験群として臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を１００％濃度でそれぞれ処理し、３日後に、細胞の形態を顕微鏡で観察し（図１１）、ＣＣＫ－８試薬を用いて細胞活性の変化を観察した。その結果、脂肪由来間葉系幹細胞培養液及び骨髄由来間葉系幹細胞培養液を処理した細胞と比較して臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を処理した細胞で生存率が著しく増加したことを確認した（図１２）。

【0074】

これにより、本発明の一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は細胞毒性がなく、細胞増殖を誘導することが分かった。

【0075】

実験例４．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の皮膚傷跡回復効果の確認
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の細胞毒性及び細胞増殖効果を評価するために、ヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）及びヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）を用いて以下の実験を行った。

【0076】

２４ウェルプレートにＨａＣａＴを１ウェルあたり３×１０^５ｃｅｌｌｓ、ＨＳ６８を１ウェルあたり２×１０^５ｃｅｌｌｓに分注し、培養密度１００％となるように培養した。１０００Ｐ ｗｈｉｔｅ ｔｉｐを用いてウェルの真ん中を掻き、細胞に傷（ｗｏｕｎｄ）をつけた後、陰性対照群（ＮＣ）及び実験群として濃度５％、１０％、２５％、５０％、１００％の臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液をそれぞれ処理した。ＨａＣａＴ及びＨＳ６８それぞれに対して培養液処理直後及び２４時間経過後、傷の面積を測定して修復率を確認した。この時点で培養液を処理し、２４時間経過後に細胞をクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）試薬で染色し、顕微鏡で観察した。その結果、ＨａＣａＴ（図１３）及びＨＳ６８（図１４）に濃度１０％以上の臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を処理した場合に傷修復率が統計的に有意に増加することを確認した。

【0077】

また、２４ウェルプレートにＨａＣａＴをウェルあたり３×１０^５ｃｅｌｌｓで分注して培養密度１００％となるように培養し、前記の方法と同様に傷をつけた後、陰性対照群（ＮＣ；無処理群）、比較対照群として比較例１で得られた脂肪由来間葉系幹細胞培養液及び骨髄由来間葉系幹細胞、実験群として臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を１００％濃度でそれぞれ処理した。培養液処理直後及び２４時間経過後、傷の面積を測定して修復率を確認し、細胞をクリスタルバイオレット試薬で染色し、顕微鏡で観察した。その結果、脂肪由来間葉系幹細胞培養液及び骨髄由来間葉系幹細胞培養液を処理した細胞と比較して臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を処理した細胞の生存率が著しく増加したことを確認した（図１５）。

【0078】

これにより、本発明の一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は細胞の傷修復効果があることが分かった。

【0079】

実験例５．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液のコラーゲン合成効果の確認
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液のコラーゲン合成効果を評価するために、ヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）及びヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）を用いて以下の実験を行った。

【0080】

実験例５．１．ＲＴ－ＰＣＲを用いたコラーゲン遺伝子の発現量解析
６ウェルプレートに１ウェルあたりＨＳ６８を１．０×１０^５ｃｅｌｌｓで分注し、２４時間培養した。陰性対照群（ＮＣ）及び実験群として濃度５％、１０％、２５％、５０％、１００％の臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液をそれぞれ処理し、２４時間培養した後、コラーゲン合成遺伝子発現量を解析するために、以下のようにリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＰＣＲ）を用いた。

【0081】

具体的には、フェノール／クロロホルムを用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの発現の程度は、Ａｐｐｌｉｄｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）上でｑＰＣＲを用い解析した。このとき、使用したプライマーは下記表４に記載の通りである。

【0082】

【表4】

ｑＰＣＲは、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、及び５６℃で１分のサイクルで、２５回繰り返した。ｍＲＮＡレベルをβ－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）レベルで正規化して比較した。その結果、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を処理した場合、陰性対照群を処理した場合と比較して、コラーゲン遺伝子ＣＯＬ１Ａ１（図１６）及びＣＯＬ３Ａ１（図１７）の発現量が大きく増加したことを確認した。

【0083】

実験例５．２．ＥＬＩＳＡを用いたコラーゲン合成促進能の評価
６ウェルプレートに１ウェルあたりＨＳ６８を１．０×１０^５ｃｅｌｌｓで分注し、２４時間培養した。陰性対照群（ＮＣ）、陽性対照群として１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β及び実験群として濃度５％、１０％、２５％、５０％、１００％の臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液をそれぞれ処理し、２４時間培養した後、培養した培地を遠心分離して上清を得た。Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＩＣＰ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ， Ｃａｔ．＃ＭＫ１０１）を用いてプロコラーゲン合成の程度を解析することにより、コラーゲン合成促進能を確認した。その結果、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞を処理した場合にＰＩＣＰ発現量が著しく増加し、既存にコラーゲン合成促進能があることが知られているＴＧＦ－βと比較してもＰＩＣＰ発現量が類似又は増加したことを確認した（図１８）。

【0084】

これにより、本発明の一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液が皮膚シワの改善及び皮膚弾力の増加に効果があることが分かった。

【0085】

実験例６．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の皮膚保湿及び障壁強化効果の確認
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の皮膚保湿及び障壁強化効果を評価するために、ヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ）を用いて以下の実験を行った。

【0086】

６ウェルプレートに１ウェルあたりＨａＣａＴをそれぞれ１．０×１０^６ｃｅｌｌｓで分注して培養した後、血清を含まない培地に交換した。２４時間経過後、陰性対照群（ＮＣ）、陽性対照群として１ｍＭのレチノール酸（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＲＡ、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒ２６２５）及び実験群として濃度５％、１０％、２５％、５０％、１００％の臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液をそれぞれ処理した。２４時間後、細胞からＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成し、実験例５．１に記載した方法と同様の方法でｑＲＴ－ＰＣＲを行い保湿因子であるＡＱＰ３（ａｑｕａｐｏｒｉｎ３）、ヒアルロン酸合成酵素（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＨＡＳ）－２、ＨＡＳ－３の発現量を解析した。このとき、使用したプライマーは下記表５に記載の通りである。

【0087】

【表5】

その結果、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を処理した場合に、ＡＱＰ３、ＨＡＳ－２、ＨＡＳ－３の発現量が増加することを確認した（図１９）。さらに、６ウェルプレートに１ウェルあたりＨａＣａＴをそれぞれ１．０×１０^６ｃｅｌｌｓｓで分注して培養した後、血清を含まない培地に交換した。２４時間経過後、陰性対照群（ＮＣ）、比較対照群として比較例１で得られた脂肪由来間葉系幹細胞培養液及び骨髄由来間葉系幹細胞、実験群として臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を１００％濃度でそれぞれ処理して２４時間後、細胞からＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成し、前記の方法と同様の方法でｑＲＴ－ＰＣＲを行い、保湿因子であるＡＱＰ３、ＨＡＳ－２及びＨＡＳ－３の発現量を解析した。その結果、脂肪由来間葉系幹細胞培養液及び骨髄由来間葉系幹細胞培養液を処理した細胞と比較して臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を処理した場合に、ＡＱＰ３、ＨＡＳ－２、ＨＡＳ－３の発現量が増加することを確認した（図２０）。

【0088】

皮膚は、ヒアルロン酸などの様々な保湿因子によって障壁機能を果たし、ヒアルロン酸は主にケラチン形成細胞及び線維芽細胞のＨＡＳによって合成され、細胞外マトリックスに蓄積する。

【0089】

これにより、本発明の一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は、皮膚保湿効果及びこれを介した皮膚障壁強化効果があることが分かった。

【0090】

実験例７．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の抗炎症効果の確認
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の抗炎症効果を確認するために、マウスマクロファージ（Ｒａｗ ２６４．７、ＡＴＣＣ（登録商標）、ＴＩＢ－７１（商品名））を用いて以下の実験を行った。

【0091】

６ウェルプレートに１ウェルあたりＲａｗ ２６４．７を２．５×１０^５ｃｅｌｌｓで分注して培養密度が８０％になるように培養した後、血清を含まない培地に交換した。２４時間経過後、炎症反応を引き起こすために、２０μｇ／ｍＬのリポ多糖体（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）を処理し、陰性対照群（ＮＣ）及び実験群として濃度５％、１０％、２５％、５０％、１００％の臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液をそれぞれ処理した。

【0092】

２４時間後、細胞からＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成し、実験例５．１に記載した方法と同様の方法でｑＲＴ－ＰＣＲを行い、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－αの発現量を解析した。このとき、使用したプライマーは下記表６に記載の通りである。

【0093】

【表6】

その結果、炎症反応が誘発された細胞に臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を処理した場合に濃度依存的にＴＮＦ－α発現量が減少することを確認した（図２１）。これにより、本発明の一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は皮膚炎症反応を抑制する効果があることが分かった。

【0094】

実験例８．臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の抗酸化効果の確認

【0095】

実験例８．１。総抗酸化効果の測定
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液の総抗酸化能（Ｔｏｔａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｔａｔｕｓ）を測定するために陰性対照群（ＮＣ）、比較対照群として比較例１で取得した１００％濃度の脂肪由来間葉系幹細胞培養液及び１００％濃度の骨髄由来間葉系幹細胞培養液、実験群として濃度５％、１０％、２５％、５０％、１００％の臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液に対して以下のように、Ｔｒｏｌｏｘ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ法を実施してＴＡＣを測定した。

【0096】

抗酸化剤には、酵素系（ＧＳＨ還元酵素、カタラーゼ、ペルオキシダーゼなど）、低分子（アスコルベート、尿酸、ＧＳＨ、ビタミンＥなど）及びタンパク質（アルブミン、トランスフェリンなど）の３種類がある。Ｔｒｏｌｏｘは酸化防止剤を標準化するために使用され、他のすべての酸化防止剤はＴｒｏｌｏｘ等価物として測定される。低分子抗酸化剤とタンパク質又は低分子単独の組み合わせを測定することができるＴｏｔａｌ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定し、Ｃｕ^２＋イオンは低分子及びタンパク質の両方によってＣｕ^＋に変換される。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｓｋは、タンパク質によるＣｕ^２＋の減少を防ぎ、低分子抗酸化剤のみを解析することができる。還元されたＣｕ^＋イオンは比色プローブ（ｐｒｏｂｅ）であり、キレート化されて全酸化防止剤の容量に比例して約５７０ｎｍの広い吸光ピークを提供する。酸性ｐＨで無色の還元型２，２′アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（２，２′－ａｚｉｎｏｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏ－ｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎａｔｅ；ＡＢＴＳ））は過酸化水素によってターコイズ色のＡＢＴＳに酸化される。試料中に抗酸化物質が存在する場合、これらの濃度に比例してＡＢＴＳは脱色され、この色変化反応の結果は５７０ｎｍでの吸光度で照射して測定される。試料の物質のＴＡＣ測定のために、Ｔｒｏｌｏｘを標準試薬として使用して標準曲線を作成した。Ｔｒｏｌｏｘは総抗酸化能測定に広く使用されている典型的な標準試薬であり、ＴＡＣ活性はＴｒｏｌｏｘ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔと表記した。

【0097】

９６ウェルプレートにＣｕ^２＋ Ｒｅａｇｅｎｔ、試料及びＰｒｏｔｅｉｎ ｍａｓｋを混ぜて２００μｌになるように入れ、９０分間暗条件でオービタルシェーカー（Ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）で反応させた後、５７０ｎｍで吸光度で照射して測定した。

【0098】

その結果、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を処理した場合に濃度依存的にＡＢＴＳラジカル（ｒａｄｉｃａｌ）の消去活性が増加し、脂肪由来間葉系幹細胞培養液及び骨髄由来間葉系幹細胞培養液を処理した細胞と比較して著しく抗酸化物質が増加したことを確認した（図２２）。

【0099】

実験例８．２．細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）消去効果
製造例１で得られた臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液が細胞内活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）産生に及ぼす効果を調べるために、カルボキシ－Ｈ２ＤＣＦＤＡを含むＲＯＳ検出キット（Ａｂｃａｍ）を使用して以下のように実験した。

【0100】

ＤＣＦＨ－ＤＡ（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）は容易に細胞膜を貫通し、細胞内に拡散して細胞内のエステラーゼによって蛍光を失ったＤＣＦＨに加水分解され、その後ＲＯＳが存在する環境で高い蛍光を発するＤＣＦに速やかに酸化される。したがって、ＤＣＦの蛍光強度は細胞内のＲＯＳの量に比例する。

【0101】

ヒト真皮線維芽細胞（ＨＳ６８）を２４ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり２．５×１０^４ｃｅｌｌｓに分注し、１０％のＦＢＳを含む培地及び３７℃、５％のＣＯ_２条件のインキュベーターで２４時間培養した。次いで、陰性対照群（ＮＣ）、陽性対照群として２５０μＭのアスコルビン酸（Ｖｉｔ．Ｃ）、比較対照群として過酸化水素及び実験群として濃度５％、１０％、２５％、５０％、１００％の臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液をそれぞれ添加し、２４時間培養した。

【0102】

２４時間後、２５μＭのＤＣＦＨ－ＤＡを同時に添加し、３７℃で４５分間反応させた後、５０μＭ ＴＢＨＰ（Ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ）溶液を処理し、３７℃で１分～５分間反応させた。１×ＰＢＳで１回洗浄した後、各ウェルに１×ＰＢＳを１００μｌで添加し、蛍光顕微鏡写真を撮影し、蛍光プレートリーダーを用いて励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）波長４８５ｎｍ及び発光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）波長５２８ｎｍで蛍光値を測定した。

【0103】

その結果、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を添加した場合には、過酸化水素によりＲＯＳレベルが増加した酸化損傷誘導群に比べてＲＯＳレベルが有意に低いことを確認した（図２３）。これは、臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液を予め添加することによって、ヒト真皮線維芽細胞内の抗酸化システム活性の増加により、同じ濃度の過酸化水素にさらされても低レベルのＲＯＳをほうし保持することができることを意味する。

【0104】

これにより、本発明の一実施形態による臍帯（へその緒）由来間葉系幹細胞培養液は皮膚抗酸化効果があることが分かった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

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【国際調査報告】