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特表2024-501020操作されたガンマデルタＴ細胞ならびにその作製方法および使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-10
(54)【発明の名称】操作されたガンマデルタＴ細胞ならびにその作製方法および使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20231227BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231227BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 33/02 20060101ALI20231227BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20231227BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20231227BHJP
C12N 5/074 20100101ALN20231227BHJP
C12N 5/078 20100101ALN20231227BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231227BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20231227BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20231227BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
A61K35/17
A61P43/00 105
A61P35/00
A61P33/02
A61P31/10
A61P31/12
C12N5/074
C12N5/078
C12N15/12
C12N15/867 Z
C07K14/725
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023539272
(86)(22)【出願日】2021-12-28
(85)【翻訳文提出日】2023-08-24
(86)【国際出願番号】 US2021065349
(87)【国際公開番号】W WO2022147014
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】63/131,170
(32)【優先日】2020-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ヤン， リーリー
(72)【発明者】
【氏名】リー， デレク
(72)【発明者】
【氏名】ジョウ， ヤン
(72)【発明者】
【氏名】リー， ジェ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZB33
4C087ZB35
4C087ZB38
4H045AA10
4H045AA30
4H045CA42
4H045DA50
4H045EA22
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本開示の態様は、少なくとも１つの外因性γδ Ｔ細胞受容体、例えば特定の疾患または病原体（例えば、癌またはＣＯＶＩＤ－１９）を標的とするように選択されるものを含む操作されたＴ細胞を含む、免疫細胞の調製に関連する方法および組成物に関する。Ｔ細胞は、ヒト造血幹細胞／前駆細胞から生成され得、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を誘導せず、宿主免疫同種拒絶に抵抗するので、同種異系細胞療法に適している。したがって、そのような細胞は、臨床治療における既製の使用に適している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの外因性ガンマデルタＴ細胞受容体（γδ ＴＣＲ）核酸分子を含有するように遺伝子改変された細胞である、操作された細胞。
【請求項2】
前記細胞が多能性幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞または免疫細胞である、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項3】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項4】
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、γδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体のクローンであるか、または前記γδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体の配列から改変された配列を有する、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項5】
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、ヒトγδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体のクローンであるか、または前記ヒトγδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体の配列から改変された配列を有する、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項6】
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、ヒトγδ Ｔ細胞受容体から得られた核酸配列を含む、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項7】
前記操作された細胞が外因性癌遺伝子を欠く、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項8】
前記ガンマデルタＴ細胞受容体核酸分子が、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項9】
Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質導入された操作された細胞を含む組成物であって、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項10】
Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を作製する方法であって、前記少なくとも１つの外因性核酸分子によって形質導入された前記ヒト多能性細胞が、前記少なくとも１つの外因性核酸分子によってコードされるガンマ鎖ポリペプチドおよびデルタ鎖ポリペプチドを含むＴ細胞受容体を発現するように、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子でヒト造血幹細胞／前駆細胞を形質導入することと、
前記操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を作製するように前記ヒト造血幹細胞／前駆細胞を分化させることと
を含む、方法。
【請求項11】
前記方法が、（ａ）第１のインビトロ培養物中で、形質導入されたヒト造血幹細胞／前駆細胞を分化することと、
（ｂ）第２のインビトロ培養物中で、（ａ）の分化された細胞を増殖させることと
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記造血幹細胞／前駆細胞が、フィーダー細胞を含まない培地中で培養され、および／または前記造血幹細胞／前駆細胞が、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＭＣＰ－４、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌおよび／またはレトロネクチンのうちの１またはそれを超えるものを含む培地中で培養される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする前記核酸分子で形質導入された前記細胞をインビトロで増殖させることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記操作された細胞のクローン集団をインビボで作製するために、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする前記核酸分子で形質導入された前記造血幹細胞／前駆細胞を対象に移植することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
前記操作された機能的ガンマデルタＴ細胞が、ＨＬＡ－Ｉ低／陰性、
ＨＬＡ－ＩＩ低／陰性、
ＨＬＡ－Ｅ陽性、ならびに
免疫調節遺伝子および／または自殺遺伝子を発現すること
のうちの少なくとも１つであることを特徴とする遺伝子発現プロファイルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項16】
前記外因性核酸分子が、レンチウイルス発現ベクターに含まれ、および／または前記方法が、前記形質導入された細胞を、成長および／または分化を促進するように選択された作用物質と接触させることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項17】
前記方法が、前記形質導入された細胞を、末梢血単核細胞、抗原提示細胞または人工抗原提示細胞と共培養することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記造血幹細胞／前駆細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項19】
前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項20】
請求項１０から１９のいずれか一項に記載の方法によって生成された操作された機能的ガンマデルタＴ細胞。
【請求項21】
ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象を処置する方法であって、請求項１から９または２０に記載の細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項22】
前記ガンマデルタＴ細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞に、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチド、Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチド、ＩＬ－１５および自殺遺伝子をコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を形質導入することによって作製される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記ガンマデルタＴ細胞が、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象が癌と診断されている、または前記ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象が、ウイルス感染、真菌感染または原虫感染と診断されている、
請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよびＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、癌細胞またはウイルス、真菌もしくは原虫に感染した細胞を標的とすることが観察されるγδ Ｔ細胞受容体から選択される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１２月２８日に出願され、「ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＧＡＭＭＡ ＤＥＬＴＡ（γδ）Ｔ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する、同時係属で同一出願人による米国仮特許出願第６３／１３１，１７０号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１２月２８日に出願され、「ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＧＡＭＭＡ ＤＥＬＴＡ（γδ）Ｔ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する、同時係属で同一出願人による米国仮特許出願第６３／１３１，１７０号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。
【0002】
技術分野
本開示の実施形態は、少なくとも免疫学、細胞生物学、分子生物学、および医学の分野に関する。
本開示の実施形態は、少なくとも免疫学、細胞生物学、分子生物学、および医学の分野に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、自然免疫と適応免疫とを橋渡しする能力を有するＴリンパ球の小さな亜集団である。成人の血液中のγδ Ｔ細胞の大部分は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を示し、リン酸化抗原（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ）（ｐＡｇ）と呼ばれる、悪性細胞によって一般的に産生される小さなリン酸化非ペプチド抗原に応答する（例えば、Ｙａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５０、１０４３－１０５３．ｅ５（２０１９）を参照されたい）。従来のαβ Ｔ細胞とは異なり、γδ Ｔ細胞は、多型古典的主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子を認識せず、したがって、同種異系宿主に養子移入した場合、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクがない。さらに、γδ Ｔ細胞は、癌のための既製の細胞療法を開発するための理想的な細胞担体となるいくつかの他の固有の特徴を有する。これらの特徴には以下の１）γδＴ 細胞は、癌免疫監視において役割を有すること、２）γδ Ｔ細胞は、腫瘍抗原および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の制限とは無関係に腫瘍を標的化する顕著な能力を有すること、３）γδ Ｔ細胞は、直接的な殺傷およびアジュバント効果によって腫瘍細胞を攻撃する複数の機構を使用することができること、および４）γδ Ｔ細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与し、癌治療のためのモノクローナル抗体と潜在的に組み合わせることができる表面受容体ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を発現するが含まれる（例えば、Ｌｅｐｏｒｅら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９、１－１１（２０１８）、Ｈａｒｒｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９、５４７－５５８（２０１８）およびＰｒｅｓｔｉら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８、１－１１（２０１７）を参照されたい）。しかしながら、残念なことに、同種異系の既製のγδ Ｔ細胞産物の開発は、それらの利用可能性によって大きく妨げられており、これらの細胞は、ヒトにおいて極めて少数で変動性が高く（ヒト血液中の約１～５％Ｔ細胞）、同種異系ヒトドナーの血液細胞を使用して治療数のγδ Ｔ細胞を生成することを非常に困難にしている（例えば、Ｓｉｌｖａ－Ｓａｎｔｏｓら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５、６８３－６９１（２０１５）を参照されたい）。
養子療法のためのγδ Ｔ細胞、特にＶγ９Ｖδ２サブセットを生成する従来の方法は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）などのアミノビスホスホネートを使用した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来γδ Ｔ細胞のインビトロまたはインビボ増殖を含む。しかしながら、この方法論は、ＰＢＭＣドナーに応じてγδ Ｔ細胞の収率が非常に大きく変動し、最も重要なことには、そのようなγδ Ｔ細胞産物は、典型的にはバイスタンダーαβＴ細胞を含有し、それによってＧｖＨＤリスクを引き起こす（例えば、Ｔｏｒｉｋａｉら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４、１１７８－１１８６（２０１６）を参照されたい）。
ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、自然免疫と適応免疫とを橋渡しする能力を有するＴリンパ球の小さな亜集団である。成人の血液中のγδ Ｔ細胞の大部分は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を示し、リン酸化抗原（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ）（ｐＡｇ）と呼ばれる、悪性細胞によって一般的に産生される小さなリン酸化非ペプチド抗原に応答する（例えば、Ｙａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５０、１０４３－１０５３．ｅ５（２０１９）を参照されたい）。従来のαβ Ｔ細胞とは異なり、γδ Ｔ細胞は、多型古典的主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子を認識せず、したがって、同種異系宿主に養子移入した場合、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクがない。さらに、γδ Ｔ細胞は、癌のための既製の細胞療法を開発するための理想的な細胞担体となるいくつかの他の固有の特徴を有する。これらの特徴には以下の１）γδＴ 細胞は、癌免疫監視において役割を有すること、２）γδ Ｔ細胞は、腫瘍抗原および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の制限とは無関係に腫瘍を標的化する顕著な能力を有すること、３）γδ Ｔ細胞は、直接的な殺傷およびアジュバント効果によって腫瘍細胞を攻撃する複数の機構を使用することができること、および４）γδ Ｔ細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与し、癌治療のためのモノクローナル抗体と潜在的に組み合わせることができる表面受容体ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を発現するが含まれる（例えば、Ｌｅｐｏｒｅら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９、１－１１（２０１８）、Ｈａｒｒｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９、５４７－５５８（２０１８）およびＰｒｅｓｔｉら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８、１－１１（２０１７）を参照されたい）。しかしながら、残念なことに、同種異系の既製のγδ Ｔ細胞産物の開発は、それらの利用可能性によって大きく妨げられており、これらの細胞は、ヒトにおいて極めて少数で変動性が高く（ヒト血液中の約１～５％Ｔ細胞）、同種異系ヒトドナーの血液細胞を使用して治療数のγδ Ｔ細胞を生成することを非常に困難にしている（例えば、Ｓｉｌｖａ－Ｓａｎｔｏｓら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５、６８３－６９１（２０１５）を参照されたい）。
養子療法のためのγδ Ｔ細胞、特にＶγ９Ｖδ２サブセットを生成する従来の方法は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）などのアミノビスホスホネートを使用した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来γδ Ｔ細胞のインビトロまたはインビボ増殖を含む。しかしながら、この方法論は、ＰＢＭＣドナーに応じてγδ Ｔ細胞の収率が非常に大きく変動し、最も重要なことには、そのようなγδ Ｔ細胞産物は、典型的にはバイスタンダーαβＴ細胞を含有し、それによってＧｖＨＤリスクを引き起こす（例えば、Ｔｏｒｉｋａｉら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４、１１７８－１１８６（２０１６）を参照されたい）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｙａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５０、１０４３－１０５３．ｅ５（２０１９）
【非特許文献2】Ｌｅｐｏｒｅら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９、１－１１（２０１８）
【非特許文献3】Ｈａｒｒｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９、５４７－５５８（２０１８）
【非特許文献4】Ｐｒｅｓｔｉら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８、１－１１（２０１７）
【非特許文献5】Ｓｉｌｖａ－Ｓａｎｔｏｓら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５、６８３－６９１（２０１５）
【非特許文献6】Ｔｏｒｉｋａｉら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４、１１７８－１１８６（２０１６）
【発明の概要】
【0005】
発明の要旨
フィーダーフリー分化系を用いてγδ Ｔ細胞の均一なモノクローナル集団を大量に確実に作製することができる新規な方法および材料は、多種多様な病理学的症状の処置に有用な「既製の」γδ Ｔ細胞療法を開発するために極めて重要である。特に、治療用γδ Ｔ細胞集団を製造するために使用することができる細胞を設計する能力は、新しい細胞療法の利用可能性および有用性を高めるであろう。本発明の実施形態は、新しい細胞療法の必要性、より具体的には、自己細胞を使用した個別化治療においてもたらされる課題によって妨げられない細胞療法の必要性に対処するために提供される。
フィーダーフリー分化系を用いてγδ Ｔ細胞の均一なモノクローナル集団を大量に確実に作製することができる新規な方法および材料は、多種多様な病理学的症状の処置に有用な「既製の」γδ Ｔ細胞療法を開発するために極めて重要である。特に、治療用γδ Ｔ細胞集団を製造するために使用することができる細胞を設計する能力は、新しい細胞療法の利用可能性および有用性を高めるであろう。本発明の実施形態は、新しい細胞療法の必要性、より具体的には、自己細胞を使用した個別化治療においてもたらされる課題によって妨げられない細胞療法の必要性に対処するために提供される。
【0006】
本明細書に開示されるように、本発明者らは、多能性細胞（例えば、ＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞）のγδ ＴＣＲ遺伝子操作、続いて遺伝子操作された細胞をインビボまたはインビトロでトランスジェニックγδ Ｔ細胞に選択的に分化させることによって、操作されたγδ Ｔ細胞を生成できることを発見した。以下に論じられるように、そのようなγδ Ｔ細胞は、他の疾患標的化分子（例えば、キメラ抗原受容体、「ＣＡＲ」）ならびに免疫調節分子（例えば、サイトカイン、受容体／リガンドなど）を共発現してそれらの能力を調節するようにさらに操作することができる。重要なことに、これらのインビトロ分化γδ Ｔ細胞の実施形態は、広範囲の疾患（例えば、癌、自己免疫疾患、感染症など）を処置するための同種異系「既製の」細胞療法に使用することができる。
【0007】
本発明の実施形態は、以下の表１に開示されるガンマおよびデルタ鎖ポリペプチドに関する材料および方法を含む。例えば、本発明の実施形態は、表１に示されるアミノ酸配列（配列番号１～配列番号５２）を有するガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはデルタ鎖ポリペプチドを含む組成物を含む。本発明の関連する実施形態は、表１に示されるアミノ酸配列（配列番号１～配列番号５２）を有するガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはデルタ鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を含む。本発明の特定の実施形態では、これらのポリヌクレオチドは、ベクター、例えば細胞内でこれらのガンマおよびデルタ鎖ポリペプチドを発現するように設計された発現ベクターに配置される。本発明の１つのそのような実施形態は、表１に示されるアミノ酸配列（配列番号１～配列番号５２）を有する少なくとも１つのＴ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質導入された免疫細胞を含む組成物である。
【0008】
本発明の実施形態はまた、例えば、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチド（例えば、表１に開示されている）をコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含有するように改変された操作された機能性Ｔ細胞を作製する方法を含む。典型的には、これらの方法は、多能性細胞（例えば、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞）に、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を形質導入し、その結果、外因性核酸分子によって形質導入された細胞が、ガンマ鎖ポリペプチドおよびデルタ鎖ポリペプチドを含むＴ細胞受容体を発現すること、次いで、操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を作製するように、形質導入されたヒト細胞を分化させることを含む。
【0009】
本発明の方法論的実施形態は、例えば、形質導入された多能性細胞をインビトロで分化させることを含み得る。例示的な方法では、形質導入されたＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）を、フィーダー細胞の非存在下においてインビトロで分化させることができ、および／またはＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯおよびＦＬＴ３Ｌの１またはそれを超えるサイトカインなどのサイトカインを含む培地中で、および／またはレトロネクチンなどの核酸形質導入効率を促進するように選択された薬剤の存在下で培養することができる。特定の実施形態では、本方法は、形質導入された細胞をアゴニスト抗原または他の刺激剤と接触させることをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、形質導入された細胞を末梢血単核細胞、抗原提示細胞、または人工抗原提示細胞と共培養することをさらに含む。本発明の特定の実施形態は、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドまたはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする核酸分子で形質導入された多能性細胞をインビトロで増殖させることをさらに含む。本発明の代替方法は、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよびＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする核酸分子で形質導入された細胞を対象に移植して、操作された細胞のクローン集団をインビボで作製することを含み得る。
【0010】
本発明のいくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ陰性、ＨＬＡ－ＩＩ陰性、ＨＬＡ－Ｅ陽性、および／または自殺遺伝子の発現のうちの少なくとも１つの遺伝子発現プロファイルであることを特徴とする遺伝子発現プロファイルを含む。必要に応じて、操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞受容体アルファ鎖ポリペプチドまたはＴ細胞受容体ベータ鎖ポリペプチドをコードする外因性Ｔ細胞受容体核酸分子、および／またはサイトカインをコードする外因性核酸分子、および／または抑制された内因性ＴＣＲをさらに含む。本発明の特定の実施形態では、これらの操作された細胞によって発現されるＴ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドは、表１に示されるアミノ酸配列（配列番号１～配列番号５２）を含む。
【0011】
本発明の実施形態は、本明細書に開示される方法によって生成される操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を含む。例えば、本発明の実施形態は、ＨＬＡ－Ｉ陰性、ＨＬＡ－ＩＩ陰性、ＨＬＡ－Ｅ陽性、自殺遺伝子の発現、ならびに少なくとも１つの外因性Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび少なくとも１つの外因性Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドの発現であることを特徴とする遺伝子発現プロファイルを含む操作されたＴ細胞を含む組成物を含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドまたはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドは、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、臍帯血（ＣＢ）または末梢血から単離することができる。本発明のこのような実施形態では、ＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＣは、商業的供給者（例えば、ＨｅｍａＣａｒｅ）または確立されたＣＢバンクから得ることができる。
【0012】
γδ Ｔガンマ／デルタ細胞産物は、ＭＨＣ制限とは無関係に患者を処置するために使用することができる既製の産物であるため、一旦市販されると、この細胞産物は、様々な潜在的に生命を守る治療法において広範な用途を有する。これに関連して、本発明のさらに別の実施形態は、（例えば、自己免疫疾患または癌またはＣＯＶＩＤ－１９などの感染症などの疾患と戦うために）ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象を処置する方法であって、本明細書に開示される操作された機能性Ｔ細胞を対象に投与することを含む方法である。
【0013】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明のいくつかの実施形態を示しているが、限定ではなく例示として与えられていることを理解されたい。本発明の趣旨を逸脱しない限り、本発明の範囲内で多くの変更および修正が可能であり、本発明はそのようなすべての修正を含む。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【0015】
【0016】
【図3A-3E】図３Ａ～図３Ｅ。クローン化γδ ＴＣＲの機能的特徴付け。ＰＢＭＣ－Ｔ細胞に、示されたγδ ＴＣＲ鎖（すなわち、Ｇ１１５、γδ１）をコードするＬｅｎｔｉ／γδＴベクターを形質導入し、それらのＴＣＲ発現および機能性について分析した。図３（Ａ）は、Ｌｅｎｔｉ／γδＴベクターで形質導入されたＰＢＭＣ－Ｔ細胞上のトランスジェニックγδ ＴＣＲの発現を示す代表的なＦＡＣＳプロットである。図３（Ｂ）は、ＺＯＬ刺激後の、Ｌｅｎｔｉ／γδＴベクターで形質導入されたＰＢＭＣ－Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの細胞内産生のＦＡＣＳ分析である。図３（Ｃ～Ｅ）は、Ｌｅｎｔｉ／γδＴベクターで形質導入されたＰＢＭＣ－Ｔ細胞の腫瘍殺傷の研究である。図３（Ｃ）は、実験計画である。図３（Ｄ）は、Ｌｅｎｔｉ／γδＴベクターで形質導入されたＰＢＭＣ－Ｔ細胞によるヒト黒色腫細胞株（Ａ３７５－ＦＧ）のインビトロでの腫瘍殺傷である。図３（Ｅ）は、Ｌｅｎｔｉ／γδＴベクターで形質導入されたＰＢＭＣ－Ｔ細胞によるヒト多発性骨髄腫細胞株（ＭＭ．１Ｓ－ＦＧ）のインビトロ腫瘍殺傷である。親Ａ３７５およびＭＭ．１ｓヒト腫瘍細胞株は、ホタルルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質二重レポーター（ＦＧ）を発現するように操作されたことに留意されたい。データは平均±ＳＥＭとして提示している。ｎｓは有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。
【0017】
【図4A-4B】図４Ａ～図４Ｂ。ＢＬＴ－γδＴヒト化マウスモデルにおけるＨＳＣ－γδＴ細胞の作製。 図４（Ａ）は、ＢＬＴ－γδＴヒト化マウスモデルにおいてＨＳＣ－γδＴ細胞を作製するための実験計画である。ＢＬＴ、ヒト骨髄－肝臓－胸腺移植ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス。ＢＬＴ－γδＴ、ヒトγδＴＣＲ遺伝子操作されたＢＬＴマウス。図４（Ｂ）は、ＨＳＣ移入後２５週目における、ＢＬＴ－γδＴマウスの様々な組織におけるＨＳＣ－γδＴ細胞のＦＡＣＳ検出である。模擬ベクター形質導入を伴うＣＤ３４＋ＨＳＣを受けたＢＬＴマウスを対照として含めた（ＢＬＴ模擬として示される）。
【0018】
【0019】
【図6A-6B】図６Ａ～図６Ｄ。フィーダーフリーのエクスビボ分化培養におけるＡｌ
ｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の作製。Ｇ－ＣＳＦ動員末梢血（ＰＢＳＣとして示される）または臍帯血（ＣＢ ＨＳＣとして示される）から単離されたＣＤ３４＋ＨＳＣに、ヒトγδ ＴＣＲ遺伝子をコードするＬｅｎｔｉ／γδＴベクターを形質導入し、次いで、フィーダーフリーのエクスビボ細胞培養物に入れて、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞を作製した（図６Ａおよび６Ｂ）。ＰＢＳＣおよびＣＢ ＨＳＣの両方が、トランスジェニックＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞に効果的に分化し、トランスジェニックＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞として増殖することができる（図６Ｃおよび図６Ｄ）。
【図6C-6D】図６Ａ～図６Ｄ。フィーダーフリーのエクスビボ分化培養におけるＡｌ
ｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の作製。Ｇ－ＣＳＦ動員末梢血（ＰＢＳＣとして示される）または臍帯血（ＣＢ ＨＳＣとして示される）から単離されたＣＤ３４＋ＨＳＣに、ヒトγδ ＴＣＲ遺伝子をコードするＬｅｎｔｉ／γδＴベクターを形質導入し、次いで、フィーダーフリーのエクスビボ細胞培養物に入れて、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞を作製した（図６Ａおよび６Ｂ）。ＰＢＳＣおよびＣＢ ＨＳＣの両方が、トランスジェニックＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞に効果的に分化し、トランスジェニックＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞として増殖することができる（図６Ｃおよび図６Ｄ）。
【0020】
【0021】
【0022】
【図9A-9E】図９Ａ～図９Ｅ。ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のインビトロ有効性およびＭＯＡ試験。図９（Ａ）は、インビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイの実験設計である。図９（Ｂ）は、Ａ３７５－ＦＧ腫瘍細胞に対するＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の腫瘍殺傷効果（ｎ＝３）である。図９（Ｃ）は、ＭＭ．１ｓ－ＦＧ腫瘍細胞に対するＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の腫瘍殺傷効果（ｎ＝３）である。図９（Ｄ）は、複数のヒト腫瘍細胞株に対するＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の腫瘍殺傷効果（ｎ＝３）である。図９（Ｅ）は、本試験で試験したヒト腫瘍細胞株である。データは平均±ＳＥＭとして提示している。ｎｓは有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。Ｅ：Ｔはエフェクター対標的比。
【0023】
【0024】
【図11A-11D】図１１Ａ～図１１Ｄ。ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞のインビトロ有効性およびＭＯＡ試験。図１１（Ａ）は、インビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイの実験設計である。図１１（Ｂ）は、ＺＯＬの非存在下または存在下でのＡ３７５－ＦＧ黒色腫細胞に対するＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞の腫瘍殺傷効果（ｎ＝３）である。図１１（Ｃ）は、ＺＯＬの非存在下または存在下でのＭＭ．１Ｓ－ＦＧ骨髄腫細胞に対するＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞の腫瘍殺傷効果である。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲ操作されていないＰＢＭＣ－Ｔ細胞およびＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞を対照として含めた（ｎ＝３）。図１１（Ｄ）は、ＣＡＲ媒介経路、γδ ＴＣＲ媒介経路およびＮＫ受容体媒介経路を含む、腫瘍細胞を標的とするＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞によって展開され得る三重機構を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして提示している。ｎｓは有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。Ｅ：Ｔはエフェクター対標的比。
【0025】
【0026】
【0027】
【図14A】図１４Ａ～図１４Ｆ。Ａｌｌｏ１５ＣＡＲ－γδＴ細胞のＣＭＣ研究およびインビボ持続性。図１４（Ａ）は、臍帯血（ＣＢ）ＨＳＣからモノクローナルＡｌｌｏ１５ＣＡＲ－γδＴ細胞を作製するためのフィーダーフリーエクスビボ分化培養法である。単一のランダムな健常ドナーのＣＢ ＨＳＣから作製することができる多数のＡｌｌｏ１５ＣＡＲ－γδＴ細胞に留意されたい。図１４（Ｂ）は、ＣＢ ＨＳＣからの、段階１でのＡｌｌｏ１５ＣＡＲ－γδＴ細胞の開発および段階２での分化したＡｌｌｏ１５ＣＡＲ－γδＴ細胞の増殖である。図１４（Ｃ）は、Ａｌｌｏ／１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞のインビボ動態を研究するための実験計画である。Ａｌｌｏ／１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞をＦＧ二重レポーターで標識したことに留意されたい。図１４（Ｄ）は、実験マウスにおける経時的なＦＧ標識Ａｌｌｏ／１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞の存在を示すＢＬＩ画像である。図１４（Ｅ）は、Ｄの定量（ｎ＝１～２）である。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【図14B-14F】図１４Ａ～図１４Ｆ。Ａｌｌｏ１５ＣＡＲ－γδＴ細胞のＣＭＣ研究およびインビボ持続性。図１４（Ａ）は、臍帯血（ＣＢ）ＨＳＣからモノクローナルＡｌｌｏ１５ＣＡＲ－γδＴ細胞を作製するためのフィーダーフリーエクスビボ分化培養法である。単一のランダムな健常ドナーのＣＢ ＨＳＣから作製することができる多数のＡｌｌｏ１５ＣＡＲ－γδＴ細胞に留意されたい。図１４（Ｂ）は、ＣＢ ＨＳＣからの、段階１でのＡｌｌｏ１５ＣＡＲ－γδＴ細胞の開発および段階２での分化したＡｌｌｏ１５ＣＡＲ－γδＴ細胞の増殖である。図１４（Ｃ）は、Ａｌｌｏ／１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞のインビボ動態を研究するための実験計画である。Ａｌｌｏ／１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞をＦＧ二重レポーターで標識したことに留意されたい。図１４（Ｄ）は、実験マウスにおける経時的なＦＧ標識Ａｌｌｏ／１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞の存在を示すＢＬＩ画像である。図１４（Ｅ）は、Ｄの定量（ｎ＝１～２）である。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【0028】
【図15A-15F】図１５Ａ～図１５Ｆ。免疫原性試験。図１５（Ａ）は、ＧｖＨ応答の研究のためのインビトロ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイである。図１５（Ｂ）は、１５ＡからのＩＦＮ－γ産生（ｎ＝３）である。ドナー不適合ＰＢＭＣ－ＴおよびＰＢＭＣ－γδ Ｔ細胞を対照として含めた。３人の不適合健常ドナー由来のＰＢＭＣを刺激因子として使用した。Ｎ、ＰＢＭＣ刺激因子なし。図１５（Ｃ）は、ＨｖＧ応答の研究のためのインビトロＭＬＣアッセイである。図１５（Ｄ）は、３人の不適合健常ドナー由来のＣ．ＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ産生をレスポンダーとして試験した。１人の代表的なドナーからのデータを示した（ｎ＝３）。図１５（Ｅ～Ｆ）は、示された刺激細胞上のＢ２Ｍ／ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ発現のＦＡＣＳ分析（ｎ＝３）である。データは平均±ＳＥＭとして提示している。ｎｓは有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。
【0029】
【0030】
【図17A-17D】図１７Ａ～図１７Ｄ。ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、感染した細胞を直接標的化し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２死滅させる。図１７（Ａ）は、人工２９３Ｔ－ＦＧ、２９３Ｔ－ＡＣＥ２－ＦＧ、およびＣａｌｕ３－ＦＧ細胞株を示す概略図である。図１７（Ｂ）は、２９３Ｔ－ＦＧ、２９３Ｔ－ＡＣＥ２－ＦＧ、およびＣａｌｕ３－ＦＧ細胞におけるＡＣＥ２のＦＡＣＳ検出である。図１７（Ｃ～Ｄ）は、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染または非感染標的細胞のインビトロ直接殺傷（ｎ＝３）である。データは平均±ＳＳＥＭとして提示している。ｎｓは有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。
【発明を実施するための形態】
【0031】
発明の詳細な説明
実施形態の説明では、本明細書の一部を形成し、本発明を実施することができる特定の実施形態を例示として示す添付の図を参照することができる。本発明の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、構造的変更を行うことができることを理解されたい。
実施形態の説明では、本明細書の一部を形成し、本発明を実施することができる特定の実施形態を例示として示す添付の図を参照することができる。本発明の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、構造的変更を行うことができることを理解されたい。
【0032】
ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、通常、健康な個体の末梢血リンパ球の１～５％を占める。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される特定のペプチド抗原を認識する古典的なαβ Ｔ細胞とは異なり、γδ Ｔ細胞は、悪性形質転換またはウイルス感染のいずれかの結果として調節不全になった細胞によって発現される一般的決定基を認識することができる。その結果、γδ－Ｔ細胞は、従来の腫瘍特異的抗原の存在を必要としない方法で、広範囲の腫瘍細胞型を認識して死滅させる生得的な能力を有する。
【0033】
当技術分野では、大量の操作されたγδ Ｔ細胞などの様々な操作されたヒトＴ細胞の均一なモノクローナル集団を確実に作製することができる方法および材料が必要とされている。これらの技術は、既製のＴ細胞療法の開発にとって極めて重要である。そのような方法および材料は、例えば、ウイルス感染、真菌感染、原虫感染および癌を含む様々な病理学的症状の処置のために同種異系または自己レシピエント対象で使用することができるγδ Ｔ細胞を提供することができる。
【0034】
以下に考察するように、本発明者らは、ＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞（例えば、ＨＳＣ、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ）などの多能性ヒト細胞のγδ ＴＣＲ遺伝子操作、続いて遺伝子操作された幹細胞および前駆細胞をインビボおよび／またはインビトロでトランスジェニックγδ Ｔ細胞に選択的に分化させることによって、操作されたγδＴ細胞を生成できることを発見した。当技術分野で知られているように、造血幹細胞または前駆細胞は、多分化能を有し、それらが自己再生し、また、赤血球、白血球、血小板およびリンパ球などの成熟血液細胞を生成することを可能にする。ＣＤ３４はヒトＨＳＣのマーカーであり、ヒト骨髄（ＢＭ）細胞のすべてのコロニー形成活性がＣＤ３４＋画分に見出される。例えば、Ｍａｔａら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２０１９ Ｄｅｃ；５９（１２）：３５６０－３５６９．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｔｒｆ．１５５９７を参照されたい。
【0035】
ガンマデルタＴ細胞の発生経路は固有であり、ｉＮＫＴ細胞およびαβ Ｔ細胞などの他のＴ細胞の発生経路とは異なるため、この発見は予想外である（例えば、Ｄｏｌｅｎｓら、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．２０２０ Ｍａｙ ６；２１（５）：ｅ４９００６．ｄｏｉ：１０．１５２５２／ｅｍｂｒ．２０１９４９００６．Ｅｐｕｂ ２０２０およびＳｈｉｓｓｉｅｒら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１０５：１１６－１３０を参照されたい）。重要なことに、本明細書に開示されるインビトロ分化γδ Ｔ細胞は、広範囲の疾患（例えば、癌、感染、自己免疫など）を処置するための同種異系「既製の」細胞療法に使用することができる。さらに、γδ Ｔ細胞はまた、その性能を高めるために、他の疾患標的化分子（例えば、ＣＡＲ）ならびに免疫調節分子（例えば、サイトカイン、受容体／リガンド）を共発現するように操作することもできる。
【0036】
本発明の実施形態は、例えば、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチド、例えば表１に示されるアミノ酸配列を有するガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはデルタ鎖ポリペプチド（配列番号１～配列番号５２）をコードする少なくとも１つの外因性核酸分子（例えば、以下で論じられるレンチウイルスベクターなどの発現ベクターに配置されたもの）を含有するように改変された操作された機能的Ｔ細胞を作製する方法を含む。典型的には、これらの方法は、造血幹細胞／前駆細胞（すなわち、多能性幹細胞、造血幹細胞または造血前駆細胞）などの多能性ヒト細胞に、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を形質導入し、その結果、外因性核酸分子によって形質導入されたヒト細胞が、ガンマ鎖ポリペプチドおよびデルタ鎖ポリペプチドを含むＴ細胞受容体を発現すること、次いで、操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を作製するように、形質導入されたヒト細胞（例えば、造血幹細胞／前駆細胞）を分化させることを含む。本発明の特定の方法論的実施形態では、外因性核酸によってコードされるＴ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよびＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドは、癌細胞またはウイルス、細菌、真菌もしくは原虫に感染した細胞を標的とすることが以前に観察されたγδ Ｔ細胞受容体を形成することが知られているものとして選択される。本発明の特定の方法は、形質導入されたヒト細胞をインビトロ培養において分化させる工程、次いで、これらの分化細胞をインビトロ培養物中でさらに増殖させる工程を含む。本発明のいくつかの方法論的実施形態では、これらの分化細胞をインビトロ培養で増殖させることが、形質導入された細胞の分化した集団を少なくとも２倍、５倍、１０倍または１００倍増殖させるように選択された条件下で行われる。本発明のいくつかの実施形態では、操作された機能的ガンマデルタＴ細胞はゾレドロン酸に曝露される。
【0037】
本発明の方法論的実施形態は、形質導入された多能性ヒト細胞（例えば、ヒト造血幹細胞または前駆細胞）をインビトロまたはインビボで分化させ、次いで、この分化した細胞集団を増殖させることを含む。特定の実施形態では、本方法は、形質導入された細胞をアゴニスト抗原などの刺激剤と接触させることをさらに含む。本発明のいくつかの方法論的実施形態では、γδ Ｔ細胞の集団は、γおよびδポリペプチドをコードする核酸をヒト細胞に形質導入した後の細胞選別工程（例えば、ＦＡＣＳまたは磁気ビーズ選別）を含まない、本明細書に開示の方法によって作製される。本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、形質導入された細胞を末梢血単核細胞、抗原提示細胞、または人工抗原提示細胞と共培養することをさらに含む。典型的には、これらの方法では、形質導入されたヒト細胞は、フィーダー細胞の非存在下でインビトロで分化され、および／または形質導入された造血幹細胞もしくは前駆細胞は、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＭＣＰ－４、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌのうちの１またはそれを超えるものなどのサイトカイン、および／またはレトロネクチンなどの核酸形質導入効率を促進するように選択された薬剤を含む培地中で培養される。本発明の代替方法は、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよびＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする核酸分子で形質導入された細胞を対象に移植して（すなわち、インビボで）、操作された細胞のクローン集団を作製することを含み得る。
【0038】
本発明のいくつかの方法論的実施形態では、操作されたＴ細胞は、例えば、ＨＬＡ－Ｉ陰性、ＨＬＡ－ＩＩ陰性、ＨＬＡ－Ｅ陽性、および／または自殺遺伝子の発現のうちの少なくとも１つの遺伝子発現プロファイルであることを特徴とする特定の遺伝子発現プロファイルを含むように選択される。典型的には、操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞受容体アルファ鎖ポリペプチドおよびＴ細胞受容体ベータ鎖ポリペプチドをコードする１またはそれを超える外因性Ｔ細胞受容体核酸分子、および／またはサイトカインをコードする１またはそれを超える外因性核酸分子、および／または抑制された内因性ＴＣＲをさらに含む。本明細書に開示される本発明のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよびＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドは、以下の表１に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、１またはそれを超える追加の核酸は、１またはそれを超える治療用遺伝子産物をコードする。治療用遺伝子産物の例としては、少なくとも以下が挙げられる：１．抗原認識分子、例えばＣＡＲ（キメラ抗原受容体）および／またはαβ ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）、γδ Ｔ受容体など；２．共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ；および／または３．サイトカイン、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ；４．転写因子、例えば、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３、ＲＯＲγｔ、ＦＯＸＰ３、およびＢｃｌ－６。治療用抗体は、キメラ抗原受容体、一本鎖抗体、モノボディ、ヒト化抗体、抗体、二重特異性抗体、一本鎖ＦＶ抗体またはそれらの組み合わせと同様に含まれる。
【0039】
本発明の実施形態はまた、以下の表１に開示されるガンマおよびデルタ鎖ポリペプチドに関する材料および方法を含む。例えば、本発明の実施形態は、表１に示されるアミノ酸配列（配列番号１～配列番号５２）を有するガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはデルタ鎖ポリペプチドを含む組成物を含む。本発明の関連する実施形態は、表１に示されるアミノ酸配列（配列番号１～配列番号５２）を有するガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはデルタ鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を含む。本発明の特定の実施形態では、これらのポリヌクレオチドは、ベクター、例えば細胞（例えば哺乳動物細胞）内でこれらのガンマおよびデルタ鎖ポリペプチドを発現するように設計された発現ベクターに配置される。本発明の組成物は、保存剤および／または抗菌剤、ならびにｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤、界面活性剤などの生理学的条件に近似するために必要とされる薬学的に許容され得る賦形剤を含有し得る。そのような組成物の場合、「賦形剤」という用語は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２１ ｓｔ ｅｄ．（２００６）に記載されている成分を含むが、これらに限定されないことを意味する。
【0040】
本発明の実施形態は、本明細書に開示される方法によって生成される操作された機能的ガンマデルタＴ細胞およびこれらの細胞の集団をさらに含む。典型的には、これらの集団は本質的に機能的ガンマデルタＴ細胞（例えば、従来のαβ Ｔ細胞を含まない）からなる。本発明の実施形態は、ＨＬＡ－Ｉ陰性、ＨＬＡ－ＩＩ陰性、ＨＬＡ－Ｅ陽性、自殺遺伝子の発現、ならびに外因性Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび外因性Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドの発現であることを特徴とする遺伝子発現プロファイルを含むものなど、本明細書に開示される操作されたγδ Ｔ細胞またはＴ細胞集団を含む組成物を含む。必要に応じて、操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞受容体アルファ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体ベータ鎖ポリペプチドおよび／またはｉＮＫＴ受容体ポリペプチドなどの別のポリペプチドをコードする外因性核酸分子、および／またはサイトカインさらに含み、および／または抑制された内因性ＴＣＲを含む。本発明の実施形態はまた、表１に示されるアミノ酸配列（配列番号１～配列番号５２）を有する少なくとも１つの外因性Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質導入された免疫細胞を含む組成物を含む。
【0041】
本明細書に開示されるγδ Ｔ細胞または細胞集団で患者を処置する方法も提供される。本発明の実施形態は、（例えば、自己免疫疾患または癌またはＣＯＶＩＤ－１９などの感染症などの疾患と戦うために）ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象を処置する方法であって、本明細書に開示される操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を対象に投与することを含む方法を含む。このようにして、操作されたガンマデルタＴ細胞は、治療的介入を必要とする患者を処置するために使用され得る。本発明のいくつかの治療実施形態では、本方法は、以前に凍結および解凍されていてもいなくてもよい、１またはそれを超える追加の核酸をガンマデルタＴ細胞に導入することを含む。この使用は、既製のガンマデルタＴ細胞を作製する利点の１つを提供する。
【0042】
本発明の特定の治療方法では、患者は癌と診断されている。いくつかの実施形態では、患者は、炎症を伴う疾患または症状を有し、いくつかの実施形態では癌を除外する。特定の実施形態では、患者は自己免疫疾患または症状を有する。特定の態様では、細胞または細胞集団は、患者に関して同種異系である。追加の実施形態では、患者は、細胞または細胞集団の拒絶または枯渇の徴候を示さない。いくつかの治療方法は、γδ Ｔ細胞を活性化する刺激分子（例えば、単独で、またはＡＰＣにロードして）、または自殺遺伝子産物を惹起する化合物を患者に投与することをさらに含む。
【0043】
癌患者をγδ Ｔ細胞で処置すると、細胞または細胞集団を患者に投与した後に、癌患者の腫瘍細胞が死滅する可能性がある。炎症性疾患または症状の処置は、炎症の軽減をもたらし得る。他の実施形態では、自己免疫疾患または症状を有する患者は、疾患または症状の徴候の改善を経験し得るか、またはγδ Ｔ細胞から他の治療上の利益を経験し得る。γδ Ｔ細胞と標準的な治療レジメンまたは別の免疫療法レジメンとの併用処置が使用され得る。
【0044】
以下に説明するように、本明細書に含まれる図は、本発明のいくつかの例示的な実施形態の例、ならびに本発明のそのような実施形態から得られたデータを提供する。
【0045】
本開示における発現の便宜上、本発明者らはγ９δ２ ＴＣＲ遺伝子の対をγδＴＣＲ遺伝子と呼ぶ。図１に示すように、γδＴＣＲ遺伝子の各対は、ガンマ鎖およびデルタ鎖を含む。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞は、異種プロモーターの制御下にある核酸を含み、これはプロモーターが核酸の転写を制御するのと同じゲノムプロモーターではないことを意味する。操作されたγδ Ｔ細胞は、１またはそれを超えるコード配列を含む外因性核酸を含み、その一部または全部が本明細書に記載の多くの実施形態では異種プロモーターの制御下にあることが企図される。
【0046】
図２は、γδ ＴＣＲ遺伝子を送達するためのレンチウイルスベクターの構築を示す。図２に示すように、本発明の例示的な実施形態では、γδ ＴＣＲ遺伝子を送達するためにｐＭＮＤＷレンチウイルスベクターを選択した。このベクターは、ＭＮＤレトロウイルスＬＴＲ Ｕ２領域を内部プロモーターとして含有し、ウイルスｍＲＮＡを安定化するためのさらなる切断型ウッドチャック応答エレメント（ＷＰＲＥ）を含有し、したがって、ヒトＨＳＣおよびそれらの子孫ヒト免疫細胞における導入遺伝子の高レベルかつ安定な発現を媒介する。Ｌｅｎｔｉ／γδＴベクターは、ヒトＴＣＲγ９－Ｔ２Ａ－ＴＣＲδ２をコードする合成バイシストロニック性遺伝子をｐＭＮＤＷに挿入することによって構築した。表１のクローンＧ１１５およびγδ１を発現する２つのプラスミドを、この戦略を用いて構築した（図２）。
【0047】
図３は、クローン化γδ ＴＣＲの機能的特徴付けを示す。図３に示すように、Ｌｅｎｔｉ／γδＴベクターの遺伝子送達能力（図３Ａ）、ならびにそのコードされたγδＴＣＲの機能性を、初代ヒトＰＢＭＣ由来の従来のαβＴ（ＰＢＭＣ－Ｔとして示される）細胞にレンチベクターを形質導入し、続いて機能試験を行うことによって研究した。特に、このレンチベクターは、ＰＢＭＣ－Ｔ細胞におけるヒトγδ ＴＣＲ導入遺伝子の効率的な発現を媒介し（図３Ｂ）、形質導入されたＰＢＭＣ－Ｔ細胞をヒト腫瘍細胞と共培養した場合の誘導されたインターフェロン（ＩＦＮ）－γ産生（図３Ｃ）および増強された腫瘍殺傷（図３Ｄ～図３Ｆ）によって証明されるように、得られたトランスジェニックヒトγδ ＴＣＲはゾレドロン酸（ＺＯＬ）刺激に応答した。
【0048】
図４は、γδＴＣＲ遺伝子操作されたＨＳＣの養子移入によるトランスジェニックγδＴ細胞の長期にわたるインビボ提供を示す。癌患者における機能性γδＴ細胞の数の増加は、抗腫瘍免疫を増強し得、これは、γδＴＣＲ遺伝子操作された自己ＨＳＣを癌患者に養子移入することによって潜在的に達成することができる。図４に示すように、ＨＳＣ操作されたγδＴ細胞をインビボで作製させる可能性を証明するために、本発明者らは、Ｇ－ＣＳＦ動員健常ドナーＰＢＭＣ（ＰＢＳＣとして示される）からヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを単離し、Ｌｅｎｔｉ／γδＴベクターで形質導入した後、この遺伝子操作されたＨＳＣをＢＬＴ（骨髄－肝臓－胸腺）ヒト化マウスモデルに養子移入した。多数（例えば、全血球の１５％超）のヒトＨＳＣ－γδＴ細胞がマウスにおいて作製され、８週間の期間にわたって多数の組織および器官において検出された。高レベルのトランスジェニックＨＳＣ－γδＴ細胞は、実験が行われる限り、６ヶ月にわたって長期間維持された。
【0049】
図５は、既製の細胞療法適用のための（人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養における）同種異系造血幹細胞操作されたヒトγδ Ｔ（ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ）細胞のインビトロ作製を示す。自己細胞療法は、血液癌および固形腫瘍の両方の処置において非常に有望であることが示されているが、いくつかの制限がある。自己細胞、特に患者から収集されたＴ細胞は、時間がかかり、事業計画的に困難であり、費用がかかり、さらに、重度のリンパ球減少性前処置を受ける患者は、十分な自己細胞産物を生成することが常に可能であるとは限らない可能性がある。大規模に生成することができ、広範囲の癌患者を処置するために容易に流通させることができる同種異系細胞産物が大いに求められている。図５に示すように、本発明の実施形態は、ＨＳＣ操作的アプローチに基づいて構築され、同種異系細胞療法用途のための多数の既製のヒトγδＴ細胞を生成するための２つのインビトロ培養方法（フィーダー依存性およびフィーダー非依存性培養）を開発した。
【0050】
図６は、フィーダーフリーのエクスビボ分化培養におけるＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の作製を示す。図６に示すように、Ｇ－ＣＳＦ動員末梢血（ＰＢＳＣとして示される）または臍帯血（ＣＢ ＨＳＣとして示される）から単離されたＣＤ３４＋ＨＳＣに、ヒトγδ ＴＣＲ遺伝子をコードするＬｅｎｔｉ／γδＴベクターを形質導入し、次いで、フィーダーフリーのエクスビボ細胞培養物に入れて、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞を作製した（図６Ａおよび６Ｂ）。ＰＢＳＣおよびＣＢ ＨＳＣの両方が、トランスジェニックＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞に効果的に分化し、トランスジェニックＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞として増殖することができる（図６Ｃおよび図６Ｄ）。同様に、ヒトγδ ＴＣＲ遺伝子をＣＡＲ遺伝子と共にコードするレンチウイルスベクターをＨＳＣに形質導入することによって、ＡｌｌｏＣＡＲ－γδＴ細胞を作製することができる（図７）。約１０１３スケールのＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞が、健常ドナーのＰＢＳＣまたはＣＢ試料のＨＳＣのいずれかから生成することができると推定され、これは１０，０００～１００，０００用量（用量あたり約１０８～１０９細胞）に製剤化することができる（図７Ａおよび７Ｂ）。増殖倍率の違いにもかかわらず、ＰＢＳＣおよびＣＢ ＨＳＣから作製されたＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞およびそれらの誘導体は、類似の表現型および機能性を示した。別段の指示がない限り、ＣＢ ＨＳＣ由来ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞およびそれらの誘導体を、以下に記載される原理証明研究のために利用した。次いで、図７は、フィーダーフリーのエクスビボ分化培養におけるＡｌｌｏＣＡＲ－γδＴ細胞の作製を示す。
図８は、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の薬理試験からのデータを示す。ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の表現型および機能性を、フローサイトメトリーを使用して研究した（図８）。３つの対照、１）健常ドナー末梢血から単離し（ＰＢＭＣ－γδ Ｔ細胞として示される）、ＺＯＬ刺激によりインビトロで増殖させ、ＣＤ３＋ＴＣＲＶδ２＋として同定した内因性ヒトγδ Ｔ細胞、２）健常ドナー末梢血から単離し（ＰＢＭＣ－Ｔ細胞として示される）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激によりインビトロで増殖させ、ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋として同定した内因性ヒト従来型αβ Ｔ細胞、３）健常ドナー末梢血から単離し（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞として示される）、Ｋ５６２ベースの人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）刺激でインビトロで増殖させ、ＣＤ３－ＣＤ５６＋として同定した内因性ヒトＮＫ細胞を含めた。ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、非常に高いレベルの複数の細胞傷害性分子（例えば、パーフォリンおよびグランザイムＢ）を産生し、内因性γδ Ｔ細胞のものに似たメモリーＴ細胞マーカーＣＤ２７およびＣＤ４５ＲＯを発現した（図８Ａ）。さらに、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、内因性γδ Ｔ細胞のレベルと同様のレベルで、高レベルのＮＫ活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）および（例えば、ＤＮＡＭ－１）を発現した（図８Ｂ）。興味深いことに、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、内因性γδ Ｔ細胞よりも高レベルのＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４を発現し（図８Ｂ）、このことは、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞が、内因性γδＴ細胞、さらには内因性ＮＫ細胞のＮＫ経路腫瘍殺傷能力よりも強力に増強されたＮＫ経路腫瘍殺傷能力を有し得ることを示唆している。
図８は、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の薬理試験からのデータを示す。ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の表現型および機能性を、フローサイトメトリーを使用して研究した（図８）。３つの対照、１）健常ドナー末梢血から単離し（ＰＢＭＣ－γδ Ｔ細胞として示される）、ＺＯＬ刺激によりインビトロで増殖させ、ＣＤ３＋ＴＣＲＶδ２＋として同定した内因性ヒトγδ Ｔ細胞、２）健常ドナー末梢血から単離し（ＰＢＭＣ－Ｔ細胞として示される）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激によりインビトロで増殖させ、ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋として同定した内因性ヒト従来型αβ Ｔ細胞、３）健常ドナー末梢血から単離し（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞として示される）、Ｋ５６２ベースの人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）刺激でインビトロで増殖させ、ＣＤ３－ＣＤ５６＋として同定した内因性ヒトＮＫ細胞を含めた。ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、非常に高いレベルの複数の細胞傷害性分子（例えば、パーフォリンおよびグランザイムＢ）を産生し、内因性γδ Ｔ細胞のものに似たメモリーＴ細胞マーカーＣＤ２７およびＣＤ４５ＲＯを発現した（図８Ａ）。さらに、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、内因性γδ Ｔ細胞のレベルと同様のレベルで、高レベルのＮＫ活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）および（例えば、ＤＮＡＭ－１）を発現した（図８Ｂ）。興味深いことに、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、内因性γδ Ｔ細胞よりも高レベルのＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４を発現し（図８Ｂ）、このことは、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞が、内因性γδＴ細胞、さらには内因性ＮＫ細胞のＮＫ経路腫瘍殺傷能力よりも強力に増強されたＮＫ経路腫瘍殺傷能力を有し得ることを示唆している。
【0051】
図９は、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のインビトロ有効性およびＭＯＡ試験からのデータを示す。γδ Ｔ細胞の最も魅力的な特徴の１つは、γδ ＴＣＲ媒介経路およびＮＫ受容体媒介経路を含む複数の機構を介して腫瘍を攻撃することができることである。したがって、本発明者らは、そのような腫瘍殺傷能力を試験するためのインビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイを確立した（図９Ａ）。ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）および増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）二重レポーターを過剰発現するようにヒト腫瘍細胞株を操作して、発光の読み取りまたはフローサイトメトリーアッセイを使用して腫瘍細胞殺傷の高感度測定をできるようにした。この試験では、黒色腫細胞株（Ａ３７５）、多発性骨髄腫細胞株（ＭＭ．１Ｓ）、肺癌細胞株（Ｈ２９２－ＦＧ）、乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、前立腺癌（ＰＣ３－ＦＧ）、卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ３およびＯＶＣＡＲ８）、白血病細胞株（Ｋ５６２）を含む複数の操作されたヒト腫瘍細胞株を標的細胞として使用した（図９Ｅ）。予想されるように、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、それ自体でＮＫ経路を介して腫瘍細胞を効果的に殺傷し、腫瘍殺傷効果は、ＺＯＬの添加によってさらに増強することができ、γδ ＴＣＲ媒介殺傷機構の存在を示している（図９Ｂ、図９Ｃおよび図９Ｄ）。
【0052】
図１０は、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のインビボ抗腫瘍有効性およびＭＯＡ試験のからのデータを示す。図１０に示すように、本発明者らは、ヒト卵巣癌異種移植ＮＳＧマウスモデルを使用して、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のインビボ抗腫瘍有効性を評価した。ＯＶＣＡＲ３－ＦＧ腫瘍細胞をＮＳＧマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）接種して腫瘍を形成させた後、ＰＢＭＣ－ＮＫまたはＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のｉ．ｐ．注射を行った（図１０Ａ）。ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、動物生体の経時的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）モニタリングによって証明されるように、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞の有効性と同様またはそれより高い有効性で腫瘍増殖を効果的に抑制した（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。
【0053】
図１１は、ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞のインビトロ有効性およびＭＯＡ試験からのデータを示す。図１１に示すように、同種異系のＨＳＣ操作されたＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）標的化ＣＡＲ修飾γδＴ（ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ）細胞の腫瘍攻撃力を、以前に記載されたような確立されたインビトロ腫瘍殺傷アッセイを使用して研究した（図１１Ａ）。２つのヒト腫瘍細胞株１）ＢＣＭＡ＋であり、ＣＡＲ媒介性殺傷の標的として作用するヒトＭＭ細胞株、ＭＭ．１Ｓ、２）ＢＣＭＡ－であり、ＣＡＲ媒介殺傷の陰性対照標的として作用するヒト黒色腫細胞株、Ａ３７５をこの試験に含めた。両方のヒト腫瘍細胞株を、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）および増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）二重レポーターを過剰発現するように操作し、次いで、得られたＭＭ．１Ｓ－ＦＧおよびＡ３７５－ＦＧ細胞株を試験に利用した。ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞と同様に、ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞は、おそらくＣＡＲ非依存性ＮＫ殺傷経路を介して、ＢＣＭＡ－Ａ３７５－ＦＧ細胞を一定の有効性で殺傷し、腫瘍殺傷効果は、おそらくｇｄＴＣＲ殺傷経路の追加によって、ＺＯＬの存在下でさらに増強された（図１１Ｂ）。より重要なことには、ＢＣＭＡ＋腫瘍株ＭＭを使用して試験した場合、ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞は、ＨＳＣ－γδＴの有効性よりも良好であり、従来のＢＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性に匹敵する有効性で、腫瘍細胞を効果的に殺傷した（図１１Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞が、３つの機構１）ＣＡＲ依存性経路、２）γδ ＴＣＲ依存性経路、および３）ＮＫ経路を用いてヒト腫瘍細胞を標的化することができるという証拠を提供する（図１１Ｄ）。ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞のこの固有の三重標的化能は魅力的であり、その理由は、ＣＡＲ－Ｔ細胞からの攻撃を逃れるために腫瘍細胞がＣＡＲ標的化抗原の発現をダウンレギュレートした自己ＣＡＲ－Ｔ治療臨床試験において報告された現象である抗原エスケープを潜在的に回避することができるためである。
【0054】
図１２は、ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞のインビボ抗腫瘍有効性試験からのデータを示す。図１２に示すように、確立されたＭＭ．１Ｓ－ＦＧ異種移植ＮＳＧマウスモデルを使用して、ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞のインビボ抗腫瘍有効性を試験し、従来のＢＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として含めた。低腫瘍負荷条件下（図１２Ａ）では、ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞は、ＭＭ腫瘍細胞をＢＣＡＲ－Ｔ細胞と同程度に効果的に排除し（図１２Ｂおよび図１２Ｄ）、しかしながら、ＢＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した実験マウスは、腫瘍を含まないにもかかわらず、最終的に移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）で死亡したが、ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞で処置した実験マウスは、腫瘍を含まず、ＧｖＨＤを発症せず、長期間生存した（図１２Ｃ）。
【0055】
図１３は、ＺＯＬ処置と組み合わせたＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞のインビボ抗腫瘍有効性試験からのデータを示す。図１３に示すように、ＺＯＬ処置と組み合わせたＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞のインビボ抗腫瘍有効性も、高腫瘍負荷条件下で確立されたＭＭ．１Ｓ－ＦＧ異種移植ＮＳＧマウスモデルを使用して試験した。ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞の抗腫瘍効果のγδ ＴＣＲ刺激による可能性のある増強を試験するために、ＺＯＬ処置を行った。ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞は腫瘍増殖を有意に抑制し（図１３Ａ）、ＺＯＬ処置は効力をさらに増強した（図１３Ｂ～１３Ｄ）。この結果は、ＺＯＬ処置と組み合わせることにより、ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞の抗腫瘍効果がさらに増強され得ることを示唆している。ＺＯＬは臨床的に利用可能な小分子薬物であるため、ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞とＺＯＬの併用療法の可能性は実現可能であり魅力的である。
【0056】
図１４は、ＩＬ－１５によって増強されたＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞（Ａｌｌｏ１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞として示される）の作製および特徴づけに関する研究からのデータを示す。ＩＬ－１５は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の多くのサブタイプを含む多くの免疫細胞のインビボ持続性および機能性を支持する重要なサイトカインであり、したがって、本発明者らは、ＩＬ－１５をＡｌｌｏＢＣＡＲ－Ｔ細胞産物に含めることの可能な利点を研究した。Ｌｅｎｔｉ／ＢＣＡＲ－ＩＬ１５－γδＴレンチベクターを構築して、ＢＣＡＲ、ＩＬ－１５およびγδ ＴＣＲ遺伝子を共送達した（図１４Ａ）。ＣＢ由来ＣＤ３４＋ＨＳＣにＬｅｎｔｉ／ＢＣＡＲ－ＩＬ１５－γδＴベクターを形質導入し、次いで、確立されたフィーダーフリーのエクスビボＨＳＣ－γδＴ分化培養に入れた（図１４Ａ）。分化経路に従って、塩基性ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞と同様の収率で、Ａｌｌｏ１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞を首尾よく生成した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。重要なことに、塩基性ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞と比較して、ＩＬ－１５によって増強されたＡｌｌｏ１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞は、インビボ持続性が有意に改善されたことを示し、予め確立されたＭＭ腫瘍に遭遇した場合、抗腫瘍応答が有意に改善されたことを示した（例えば、インビボクローン増殖、図１４Ｃ～１４Ｅ）。
【0057】
図１５は、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴおよびＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞の免疫原性試験からのデータを示す。図１５に示すように、同種異系細胞療法については、ａ）移植片対宿主（ＧｖＨ）応答およびｂ）宿主対移植片（ＨｖＧ）応答という２つの免疫原性の懸念がある。ＧｖＨＤは、主要な安全上の懸念である。しかしながら、γδ Ｔ細胞は、不適合ＨＬＡ分子およびタンパク質自己抗原に反応しないので、ＧｖＨＤを誘導することは予想されない。この概念は、同種異系ＨＳＣ移入および自己γδ Ｔ細胞移入でのヒト臨床経験におけるＧｖＨＤの欠如によって証明されており、本発明者らのインビトロ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイによって裏付けられる（図１５Ａ）。ＰＢＭＣ－γδ Ｔ細胞もＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞も、従来のＰＢＭＣ－Ｔ細胞のものとは全く対照的に、同種異系のＰＢＭＣに応答しないことに留意されたい（図１５Ｂ）。一方、ＨｖＧリスクは、主に、不適合ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子を認識する従来のＣＤ８およびＣＤ４ αβ Ｔ細胞による、宿主免疫細胞による同種異系治療細胞の排除を介して媒介される、主に有効性の懸念である。実際、インビトロ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ（図１５Ｃ）では、従来のＰＢＭＣ－Ｔ細胞とＰＢＭＣ－γδＴ細胞の両方が、複数の不適合ドナーのＰＢＭＣ－Ｔ細胞から有意に応答を誘発した（図１５Ｄ）。興味深いことに、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は免疫原性の低下を示し、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩの発現レベルが低い可能性がある（図１５Ｅおよび１５Ｆ）。これらの結果をまとめると、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、ＧｖＨＤを発症せず、ＨｖＧ耐性である既製の細胞療法の理想的な候補として強く支持される。
【0058】
図１６は、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞産物の固有の特性の比較試験からのデータを提供する。ヒトγδ Ｔ細胞産物を生成する既存の方法は、主にヒトＰＢＭＣからのγδ Ｔ細胞の増殖に応答する。この培養方法は、ヒトγδ Ｔ細胞ならびに他の細胞、特に同種異系レシピエントに移入された場合にＧｖＨＤを引き起こし得る不均一な従来のαβ Ｔ（Ｔｃ）細胞を含有する混合細胞集団で開始および終了する（図１６）。結果として、この方法は、ＧｖＨＤを回避するために、「既製の」γδＴ細胞産物を作製するための精製工程を必要とする。本明細書では、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞培養は２つの局面において固有であり、１）ランダムに再編成されたαβＴＣＲ組み換えの作製を支援せず、ランダムに再編成された内因性αβＴＣＲを産生し、そのためＧｖＨＤリスクがなく、２）トランスジェニックＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の同調分化を支援し、それによって未分化の前駆細胞および免疫細胞の他の系統の存在を排除する。結果として、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞産物は純粋で均一であり、ＧｖＨＤリスクがなく、したがって、この方法論では細胞精製／選別工程は必要ない。
【0059】
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の治療可能性を調べるために、インビトロＣＯＶＩＤ－１９感染モデルを確立した（図１７Ａ～図１７Ｄ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は主に、ウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を使用して細胞表面のＡＣＥ２（アンギオテンシン変換酵素２）に結合することによって宿主ヒト細胞に入り、したがって、本発明者らは、２つのＡＣＥ２陽性ヒト細胞を標的細胞として使用し、その一方は、ＡＣＥ２を過剰発現するように操作された２９３Ｔヒト上皮細胞株であり、他方は、ＡＣＥ２を自然発現するＣａｌｕ－３ヒト肺上皮細胞株である（図１７Ａ、図１７Ｂ）。これらの細胞株をさらに操作して、ホタルルシフェラーゼおよび増強された緑色蛍光タンパク質二重レポーター（ＦＧ）を過剰発現させ、発光の読み取りを使用した細胞生存率の高感度測定をできるようにした（図１７Ａ）。ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染により２９３Ｔ－ＡＣＥ２－ＦＧおよびＣａｌｕ－３－ＦＧの両方の標的細胞を効果的に死滅させ、ウイルス感染なしでは標的細胞の死滅は観察されなかった（図１７Ｄ）。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のみでは、ＡＣＥ２陽性標的細胞の生存率に影響を及ぼさなかった（図１７Ｄ）。
【0060】
特定の細胞または細胞集団の実施形態の文脈で論じられる任意の実施形態が、任意の他の細胞または細胞集団の実施形態に関して使用され得ることに特に留意されたい。さらに、特定の方法の文脈で使用される任意の実施形態は、本明細書に記載の任意の他の方法の文脈で実施することができる。さらに、本明細書に記載の異なる方法の態様は、他の方法を達成するために、ならびに任意の細胞または細胞集団の使用を創出または記載するために組み合わせることができる。１またはそれを超える実施形態の態様は、本明細書に記載の１またはそれを超える他の実施形態の態様と組み合わせることができることが特に企図される。さらに、本明細書中に記載される任意の方法は、本明細書中に記載される細胞または細胞集団の１またはそれを超える使用を記載すると言い換えられ得る。例えば、操作されたγδ Ｔ細胞またはγδ Ｔ細胞集団の使用は、本明細書に記載の任意の方法から記載することができる。
【0061】
特定の実施形態では、少なくとも１つのγδ Ｔ細胞受容体（γδ ＴＣＲ）および外因性自殺遺伝子産物を発現する操作されたγδ Ｔ細胞が存在し、少なくとも１つのγδ ＴＣＲは、外因性核酸および／または組換え修飾されたプロモーター領域の転写制御下にある内因性γδ ＴＣＲ遺伝子から発現される。自殺遺伝子を使用するための当該技術分野における方法は、米国特許第８６２８７６７号、米国特許出願公開第２０１４０３６９９７９号、米国特許出願公開第２０１４０２４２０３３号および米国特許出願公開第２００４００１４１９１号などにおいて使用され得、これらはすべて、その全体が参照により組み込まれる。さらなる実施形態では、ＴＫ遺伝子は、ウイルスＴＫ遺伝子、すなわちウイルス由来のＴＫ遺伝子である。特定の実施形態では、ＴＫ遺伝子は単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子産物は、基質によって活性化される。チミジンキナーゼは、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはそれらの誘導体によって活性化される自殺遺伝子産物である。特定の実施形態では、自殺遺伝子産物を活性化する基質は、検出されるために標識される。場合によっては、基質は、イメージングのために標識され得る。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子産物は、ＴＣＲ－ガンマまたはＴＣＲ－デルタの一方または両方をコードする同じまたは異なる核酸分子によってコードされ得る。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である。代替の実施形態では、細胞は外因性自殺遺伝子を発現しない。
【0062】
追加の実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞は、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠いているか、または少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現が低下している。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現の欠如は、個々のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子をコードする遺伝子を破壊することによって、またはすべてのＨＬＡ－Ｉ複合体分子の共通成分であるＢ２Ｍ（ベータ２ミクログロブリン）をコードする遺伝子を破壊することによって、またはすべてのＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現を制御する重要な転写因子であるＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子）をコードする遺伝子を破壊することによって達成される。特定の実施形態では、細胞は、１またはそれを超えるＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠いているか、またはそのような分子の発現レベルが（少なくとも）５０、６０、７０、８０、９０、１００％（またはその中の導き出せる任意の範囲）低下している。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩは、細胞が遺伝子編集によって操作されたので、γδ Ｔ細胞において発現されない。いくつかの実施形態では、関与する遺伝子編集はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９である。Ｃａｓ９の代わりに、ＣａｓＸまたはＣａｓＹが関与し得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＴＡＬＥＮは、Ｃｐｆ１と同様に他の遺伝子編集技術であり、これらのすべてが使用され得る。他の実施形態では、γδ Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子、Ｂ２Ｍおよび／またはＣＩＩＴＡの発現を減少させるように標的化された１またはそれを超える異なるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、本発明のγδ Ｔ細胞は、組換えベクターまたは細胞に導入された組換えベクターからの核酸配列を含む。特定の実施形態では、組換えベクターはウイルスベクターであり、またはウイルスベクターであった。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスであり、またはそれらであった。特定のウイルスベクターの核酸は、宿主ゲノム配列に組み込まれることを理解されたい。
【0064】
いくつかの実施形態では、本発明のγδ Ｔ細胞は、増殖および分化中の選択された培地条件に配置される（例えば、動物血清を含む培地中に配置されない）。さらなる実施形態では、γδ Ｔ細胞は凍結されているか、または凍結された。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞はあらかじめ凍結されており、あらかじめ凍結された細胞は室温で少なくとも１時間安定である。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞はあらかじめ凍結されており、あらかじめ凍結された細胞は、室温で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０、２４、３０、または４８時間（またはその中の導き出せる任意の範囲）安定である。特定の実施形態では、溶液中のγδ Ｔ細胞またはγδ Ｔ細胞の集団は、デキストロース、１またはそれを超える電解質、アルブミン、デキストラン、および／またはＤＭＳＯを含む。さらなる実施形態では、細胞は、滅菌され、非発熱性であり、等張性である溶液中に存在する。
【0065】
複数の細胞を含む実施形態では、γδ Ｔ細胞集団は、いくつかの実施形態では操作されたγδ Ｔ細胞である、約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５個またはそれを超える（またはその中の導き出せる任意の範囲）細胞を含み得るか、少なくともこれらの数の細胞を含み得るか、または最大でこれらの数の細胞を含み得る。場合によっては、細胞集団は、少なくとも約１０６～１０１２個の操作されたγδ Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、これらの数を有する細胞の集団は、単一バッチの細胞から生成され、別々に生成された細胞のバッチをプールした結果ではないことが企図される。
【0066】
特定の実施形態では、γδ Ｔ細胞受容体およびチミジンキナーゼ自殺遺伝子産物をコードする１またはそれを超える外因性核酸を含むクローンγδ Ｔ細胞を含むＴ細胞集団が存在し、クローンγδ Ｔ細胞は、機能性ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）および／またはクラスＩＩ、主要組織適合遺伝子複合体またはトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）を発現しないように操作されており、細胞集団は総細胞が少なくとも約１０６～１０１２個であり、少なくとも約１０２～１０６個の操作されたγδ Ｔ細胞を含む。特定の場合では、細胞は、溶液中で凍結される。
【0067】
いくつかの実施形態は、γδ Ｔ細胞または細胞の集団、特に細胞の一部または全部がクローンである集団を調製する方法に関する。特定の実施形態では、細胞集団は、細胞の少なくともまたは最大で５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％（またはその中の導き出せる任意の範囲）がクローンである細胞、すなわち、集団中の別の細胞と同じ祖先細胞に由来する細胞の割合である細胞を含む。他の実施形態では、細胞集団は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００（またはその中の導き出せる任意の範囲）の異なる親細胞から生じる、少なくともこれらの数の異なる親細胞から生じる、または最大でこれらの数の異なる親細胞から生じる細胞から構成される細胞集団を含む。
【0068】
操作されたγδ Ｔ細胞およびγδ Ｔ細胞集団を調製、作製、製造および使用するための方法が提供される。方法は、実施形態では、以下の工程、多能性細胞を得る工程、造血前駆細胞を得る工程、１またはそれを超える造血細胞になることができる前駆細胞を得る工程、γδ Ｔ細胞になることができる前駆細胞を得る工程、１またはそれを超える細胞表面マーカーを使用して混合細胞の集団から細胞を選択する工程、細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を選択する工程、細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を単離する工程、ＣＤ３４＋およびＣＤ３４－細胞を互いに分離する工程、ＣＤ３４以外の、またはＣＤ３４に加えて、細胞表面マーカーに基づいて細胞を選択する工程、γδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１またはそれを超える核酸を細胞に導入する工程、γδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするウイルスベクターを細胞に感染させる工程、γδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１またはそれを超える核酸で細胞をトランスフェクトする工程、γδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする発現構築物で細胞をトランスフェクトする工程、γδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性核酸を細胞のゲノムに組み込む工程、自殺遺伝子産物をコードする１またはそれを超える核酸を細胞に導入する工程、自殺遺伝子産物をコードするウイルスベクターを細胞に感染させる工程、自殺遺伝子産物をコードする１またはそれを超える核酸で細胞をトランスフェクトする工程、自殺遺伝子産物をコードする発現構築物で細胞をトランスフェクトする工程、自殺遺伝子産物をコードする外因性核酸を細胞のゲノムに組み込む工程、遺伝子編集のための１またはそれを超えるポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする１またはそれを超える核酸を細胞に導入する工程、遺伝子編集のための１またはそれを超えるポリペプチドおよび／または核酸分子をコードするウイルスベクターを細胞に感染させる工程、遺伝子編集のための１またはそれを超えるポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする１またはそれを超える核酸で細胞をトランスフェクトする工程、遺伝子編集のための１またはそれを超えるポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする発現構築物で細胞をトランスフェクトする工程、遺伝子編集のための１またはそれを超えるポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする外因性核酸を組み込む工程、細胞のゲノムを編集する工程、細胞のプロモーター領域を編集する工程、γδ ＴＣＲ遺伝子のためのプロモーター領域および／またはエンハンサー領域を編集する工程、１またはそれを超える遺伝子の発現を排除する工程、単離されたヒトＣＤ３４＋細胞において１またはそれを超えるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子の発現を排除する工程、遺伝子編集のための１またはそれを超える核酸を細胞にトランスフェクトする工程、単離された細胞または選択された細胞を培養する工程、単離された細胞または選択された細胞を増殖させる工程、１またはそれを超える細胞表面マーカーについて選択された細胞を培養する工程、γδ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養する工程、単離されたＣＤ３４＋細胞を増殖させる工程、γδ Ｔ細胞を生成または増殖させる条件下で細胞を培養する工程、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で細胞を培養してγδ Ｔ細胞を生成する工程、無血清培地中で細胞を培養する工程、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択された集団および無血清培地を含む３Ｄ細胞凝集体を含む、ＡＴＯ系で細胞を培養する工程のうち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれを超える工程を含む。一実施形態では、１またはそれを超える工程を除外することができることが特に企図されている。
【0069】
いくつかの実施形態では、クローンγδＴ細胞の集団を調製する方法であって、ａ）ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４＋細胞を選択すること、ｂ）ヒトγδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１またはそれを超える核酸を導入すること、ｃ）単離されたヒトＣＤ３４＋細胞において１またはそれを超えるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子の表面発現を排除すること、ｄ）（例えば、人工胸腺オルガノイド系で）γδ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養してγδ Ｔ細胞を生成することを含む方法が存在する。典型的には、ＡＴＯ系は、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択された集団および無血清培地を含む３Ｄ細胞凝集体を含む。
【0070】
操作されたγδ Ｔ細胞を作製するために使用され得る多能性細胞としては、ＣＤ３４＋造血前駆幹細胞が挙げられる。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、またはそれらの組み合わせに由来し得る。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ３４－細胞を単離すること、またはＣＤ３４－およびＣＤ３４＋細胞を分離することを含む。実施形態はＣＤ３４＋細胞をさらに操作することを含むが、ＣＤ３４－細胞をγδ Ｔ細胞の作製に使用してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３４－細胞がその後使用され、この目的のために保存され得る。
【0071】
特定の方法は、１またはそれを超える核酸を細胞に導入する前に、培地中で選択されたＣＤ３４＋細胞を培養することを含む。細胞を培養することは、選択されたＣＤ３４＋細胞を、１またはそれを超える増殖因子を含む培地とインキュベートすることを含み得る。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える増殖因子は、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む。さらなる実施形態では、培地は、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、およびＴＰＯを含む。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える増殖因子の濃度は、各増殖因子またはこれらの特定の増殖因子のいずれかおよびすべての合計に対して約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌである。培地中の単一の増殖因子または増殖因子の組み合わせの濃度は、約、少なくとも約、または多くとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４１０、４２０、４２５、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４７５、４８０、４９０、５００（または導き出せる任意の範囲）ｎｇ／ｍｌまたはμｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度であってもよい。
【0072】
典型的な実施形態では、核酸は、本明細書で論じるように、γ－ＴＣＲおよび／またはδ－ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つの核酸は、ＴＣＲのガンマ鎖およびデルタ鎖の両方をコードする。いくつかの実施形態では、さらなる核酸は、α－ＴＣＲおよび／もしくはβ－ＴＣＲポリペプチド、ならびに／または１またはそれを超えるｉＮＫＴ ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。追加の実施形態では、核酸は、自殺遺伝子産物をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、選択されたＣＤ３４＋細胞に導入される核酸分子は、ＴＣＲおよび自殺遺伝子産物をコードする。他の実施形態では、方法はまた、選択されたＣＤ３４＋細胞に自殺遺伝子産物をコードする核酸を導入することを含み、この場合、異なる核酸分子が、少なくとも１つのＴＣＲ遺伝子をコードする核酸とは異なる自殺遺伝子産物をコードする。
【0073】
上記のように、いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞は、細胞表面にＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子を発現せず、これはベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、またはＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を破壊することによって達成され得る。特定の実施形態では、方法は、単離されたヒトＣＤ３４＋細胞において１またはそれを超えるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を排除することを伴う。特定の実施形態では、発現を排除することは、細胞のゲノムＤＮＡの遺伝子編集によって達成され得る。いくつかの方法は、ＣＲＩＳＰＲおよびＢ２ＭまたはＣＩＩＴＡに対応する１またはそれを超えるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞に導入することを含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲまたは１またはそれを超えるｇＲＮＡは、エレクトロポレーションまたは脂質媒介性トランスフェクションによって細胞にトランスフェクトされる。その結果、方法は、ＣＲＩＳＰＲおよび１またはそれを超えるｇＲＮＡをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることによって、ＣＲＩＳＰＲおよび１またはそれを超えるｇＲＮＡを細胞に導入することを含み得る。いくつかの実施形態では、異なる遺伝子編集技術を使用してもよい。
【0074】
同様に、いくつかの実施形態では、ＴＣＲ受容体をコードする１またはそれを超える核酸が細胞に導入される。これは、本明細書で論じられるウイルスベクターであってもなくてもよい組換えベクターを細胞にトランスフェクトまたは感染させることによって行うことができる。外因性核酸は、いくつかの実施形態では、細胞のゲノムに組み込まれ得る。
【0075】
いくつかの実施形態では、細胞は無細胞培地で培養される。特定の実施形態では、無血清培地は、外部添加されたアスコルビン酸をさらに含む。特定の実施形態では、方法は、アスコルビン酸培地を添加することを含む。さらなる実施形態では、無血清培地は、以下の外部添加成分、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、インターフェロン－ガンマ、インターフェロン－ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレオトロフィンまたはミッドカインのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６種すべて（またはその中の導き出せる範囲）をさらに含む。追加の実施形態では、無血清培地は１またはそれを超えるビタミンを含む。場合によっては、無血清培地は、以下のビタミンであるビオチン、ＤＬアルファトコフェロールアセテート、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２またはその塩のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種（またはその中の導き出せる任意の範囲）を含む。特定の実施形態では、培地は、ビオチン、ＤＬアルファ－トコフェロールアセテート、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、またはそれらの組み合わせもしくは塩を含むか、または少なくともそれらを含む。追加の実施形態では、無血清培地は１またはそれを超えるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は、以下のタンパク質、アルブミンまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、またはそれらの組み合わせのうちの１、２、３、４、５、６種またはそれを超えるタンパク質（またはその中の導き出せる任意の範囲）を含む。他の実施形態では、無血清培地は、以下の化合物、コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウムもしくはトリヨード－Ｉ－チロニン、またはそれらの組み合わせのうちの１、２、３、４、５、７、８、９、１０または１１種を含む。さらなる実施形態では、無血清培地は、Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ－２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１ＴＭサプリメント、またはそれらの組み合わせを含む。追加の実施形態では、無血清培地は、アミノ酸、単糖および／または無機イオンを含むかまたはさらに含む。いくつかの態様では、無血清培地は、以下のアミノ酸であるアルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシンもしくはバリン、またはそれらの組み合わせのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３種を含む。他の態様では、無血清培地は、以下の無機イオンであるナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、もしくはリン、またはそれらの組み合わせもしくは塩のうちの１、２、３、４、５、または６種を含む。追加の態様では、無血清培地は、以下の元素であるモリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、もしくはマンガン、またはそれらの組み合わせのうちの１、２、３、４、５、６または７種を含む。
【0076】
いくつかの方法では、細胞は人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養される。ＡＴＯ系は、細胞の凝集体である三次元（３Ｄ）細胞凝集体を含む。特定の実施形態では、３Ｄ細胞凝集体は、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む。いくつかの実施形態では、３Ｄ細胞凝集体は、ＣＤ３４＋形質導入された細胞を物理的マトリックスまたはスキャフォールド上の間質細胞の選択された集団と混合することによって作製される。さらなる実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋形質導入された細胞および間質細胞を遠心分離して、物理的マトリックスまたはスキャフォールド上に配置される細胞ペレットを形成することを含む。特定の実施形態では、間質細胞は、インタクトな、部分的な、または改変されたＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、またはそれらの組み合わせであるＮｏｔｃｈリガンドを発現する。さらなる実施形態では、ＮｏｔｃｈリガンドはヒトＮｏｔｃｈリガンドである。他の実施形態では、ＮｏｔｃｈリガンドはヒトＤＬＬ１である。
【0077】
本開示の方法は、マーカーを発現するか、または特定のマーカーの高レベルもしくは低レベルを有し得る、少なくとも１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、１×１０１８、１×１０１９、１×１０２０、または１×１０２１個（またはその中の導き出せる任意の範囲）の細胞を含む細胞集団（例えば、分化および／または増殖工程を介して）を生成し得る。細胞集団数は、マーカー発現に基づく細胞選別なしで、またはγδ Ｔ細胞マーカー発現に基づく細胞選別なしで、またはＴ細胞マーカー発現に基づく細胞選別なしで達成されるものであってもよい。いくつかの実施形態では、細胞集団サイズは、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ＢｉＴＥ、または他の異種腫瘍標的化剤などの異種標的化要素への抗原の結合に基づく細胞選別なしで達成されるものであってもよい。さらに、達成される細胞集団は、少なくとも１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、１×１０１８、１×１０１９、１×１０２０、または１×１０２１個（またはその中の導き出せる任意の範囲）の細胞を含むものであってもよく、その細胞は、例えば、少なくとも、多くとも、または正確には、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１日間または７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０週間（またはその中の導き出せる任意の範囲）である期間など、一定の期間内に生成される。
【0078】
いくつかの実施形態では、方法において使用されるフィーダー細胞はＣＤ３４－細胞を含む。これらのＣＤ３４－細胞は、ＣＤ３４＋細胞について選択された細胞の同じ集団に由来し得る。追加の実施形態では、細胞が活性化され得る。特定の実施形態では、方法は、γδ Ｔ細胞を活性化することを含む。特定の実施形態では、γδ Ｔ細胞は、ＺＯＬで活性化および増殖されている。細胞を活性化および増殖させるために、細胞をＺＯＬと共にインキュベートまたは培養することができる。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞にＺＯＬをパルスした。
【0079】
細胞は直ちに使用されてもよく、または将来の使用のために保存されてもよい。特定の実施形態では、γδ Ｔ細胞を作製するために使用される細胞は凍結されるが、いくつかの実施形態では、生成されたγδ Ｔ細胞は凍結され得る。いくつかの態様では、細胞は、デキストロース、１またはそれを超える電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含む溶液中に存在する。他の実施形態では、細胞は、滅菌され、非発熱性であり、等張性である溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞は、造血幹細胞に由来する。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞は、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、癌を有しないヒト患者由来の細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は内因性ＴＣＲを発現しない。
【0080】
生成サイクルによって生成される細胞の数は、約、少なくとも約、または多くとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５個またはそれを超える（またはその中の導き出せる任意の範囲）細胞であってもよく、いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞である。場合によっては、細胞集団は、少なくとも約１０６～１０１２個の操作されたγδ Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、これらの数を有する細胞の集団は、単一バッチの細胞から生成され、別々に生成された、すなわち単一のサイクルから生成させた細胞のバッチをプールした結果ではないことが企図される。いくつかの実施形態では、細胞集団を凍結し、次いで解凍する。細胞集団は、操作されたγδ Ｔ細胞を作製するために使用され得るか、または操作されたγδ Ｔ細胞を含み得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、方法は、以前に凍結および解凍されていてもいなくてもよい、１またはそれを超える追加の核酸を細胞集団に導入することを含む。この使用は、既製のγδ Ｔ細胞を作製する利点の１つを提供する。特定の実施形態では、１またはそれを超える追加の核酸は、１またはそれを超える治療用遺伝子産物をコードする。治療用遺伝子産物の例としては、少なくとも以下が挙げられる：１．抗原認識分子、例えばＣＡＲ（キメラ抗原受容体）および／またはＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）；２．共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ；および／または３．サイトカイン、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ；４．転写因子、例えば、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３、ＲＯＲγｔ、ＦＯＸＰ３、およびＢｃｌ－６。治療用抗体は、キメラ抗原受容体、一本鎖抗体、モノボディ、ヒト化抗体、抗体、二重特異性抗体、一本鎖ＦＶ抗体またはそれらの組み合わせと同様に含まれる。
【0082】
いくつかの実施形態では、ａ）ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４＋細胞を選択すること、ｂ）ＣＤ３４＋細胞を、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンドおよびヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）などの増殖因子を含む培地で培養すること、ｃ）選択されたＣＤ３４＋細胞に、γ－ＴＣＲ、δ－ＴＣＲ、チミジンキナーゼ、およびレポーター遺伝子産物をコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターを形質導入すること、ｄ）選択されたＣＤ３４＋細胞に、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）および／またはＣＴＩＩＡに対するＣａｓ９およびｇＲＮＡを導入して、Ｂ２ＭまたはＣＴＩＩＡの発現を排除すること、ｅ）形質導入された細胞を、外因性Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する照射された間質細胞株と共に２～１０週間培養して、３Ｄ凝集細胞培養物中でγδ Ｔ細胞を増殖させること、ｆ）Ｂ２Ｍおよび／またはＣＴＩＩＡの発現を欠くγδ Ｔ細胞を選択すること、ならびにｇ）選択されたγδ Ｔ細胞を、照射されたフィーダー細胞と培養することを含む方法によって生成された操作されたγδＴ細胞が存在する。
【0083】
特定の実施形態では、形質導入された細胞（例えばＨＳＰＣ）から生成されたγδ Ｔ細胞は、１またはそれを超える特徴を有するようにさらに改変され、それには、細胞を同種異系使用に適したものにすること、または細胞が１またはそれを超える特徴を有するようにさらに改変されていない場合よりも同種異系使用に適したものにすることが含まれる。本開示は、必要に応じて、同種異系使用に適したＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞を包含する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ－γδ Ｔ細胞は、非アロ反応性であり、外因性ガンマデルタＴＣＲを発現する。これらの細胞は、「既製の」細胞療法に有用であり、患者自身のγδ Ｔまたは他の細胞の使用を必要としない。したがって、本方法は、より費用効果が高く、労働集約的でない細胞免疫療法を提供する。
【0084】
具体的な実施形態では、ＨＳＣ－γδ Ｔ細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こすことなく、また、宿主免疫細胞によって拒絶される（ＨｖＧ拒絶）ことなく、安全かつ成功した同種異系移植を達成するために、ＨＬＡ陰性であるように操作される。特定の実施形態では、トランスジェニックγδ ＴＣＲ遺伝子の発現が対立遺伝子排除を介して内因性ＴＣＲの組換えを遮断するので、同種異系ＨＳＣ－γδ Ｔ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、ＧｖＨＤを引き起こさない。特定の実施形態では、同種異系ＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞は、細胞表面にＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子を発現せず、宿主ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞媒介同種移植片枯渇およびｓｒ３９ＴＫ免疫原標的枯渇に抵抗する。したがって、特定の実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞は、ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、またはＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子を含むがこれらに限定されない、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ発現に関連するタンパク質をコードする遺伝子の破壊によって達成される表面ＨＬＡ－Ｉまたは－ＩＩ分子を発現しない。場合によっては、ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩは、細胞がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含んでも含まなくてもよい遺伝子編集によって操作されたので、γδ Ｔ細胞の表面上に発現されない。
【0085】
γδ Ｔ細胞が任意の種類の１またはそれを超える特徴を示すように改変されている場合、γδ Ｔ細胞は、細胞に導入された組換えベクターからの核酸配列を含み得る。ベクターは、プラスミドなどの非ウイルスベクター、またはレンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、もしくはアデノウイルスなどのウイルスベクターであってもよい。
【0086】
本発明のγδ Ｔ細胞は、それらの生成前、生成中、または生成後に１またはそれを超える特定の条件に曝露されていてもされていなくてもよい。具体的な場合では、細胞は、動物血清を含む培地に曝露されていないか、または曝露されていなかった。細胞は凍結され得る。細胞は、デキストロース、１またはそれを超える電解質、アルブミン、デキストラン、および／またはＤＭＳＯを含む溶液中に存在してもよい。細胞が存在する任意の溶液は、滅菌され、非発熱性であり、等張性である溶液であってもよい。細胞は、例えばＺＯＬで活性化されるなど、任意の適切な方法によって活性化および増殖されていてもよい。
【0087】
本開示の態様は、ｉ）β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のうちの１またはそれを超える外因性発現または活性阻害剤、またはｉｉ）β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のうちの１またはそれを超えるゲノム変異を含むヒト細胞に関する。いくつかの実施形態では、細胞はゲノム変異を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム変異は、細胞のゲノム中の１またはそれを超える内因性遺伝子の変異を含み、１またはそれを超える内因性遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、変異は、機能喪失変異を含む。いくつかの実施形態では、阻害剤は発現阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は阻害性核酸を含む。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンス分子のうちの１またはそれを超えるものを含む。いくつかの実施形態では、細胞は活性阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、改変後、細胞は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２タンパク質のうちの１またはそれを超えるものの任意の検出可能な発現が欠損している。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍの阻害剤またはゲノム変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＩＩＴＡの阻害剤またはゲノム変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＲＡＣの阻害剤またはゲノム変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＲＢＣ１の阻害剤またはゲノム変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＲＢＣ２の阻害剤またはゲノム変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１および／またはＴＲＢＣ２をコードするゲノムＤＮＡの少なくとも９０％が欠失する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１および／またはＴＲＢＣ２をコードするゲノムＤＮＡの少なくともまたは最大で５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％（またはその中の導き出せる任意の範囲）が欠失する。他の実施形態では、欠失、挿入および／または置換がゲノムＤＮＡにおいて行われる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト幹細胞または前駆細胞の子孫である。
【0088】
ＨＬＡ陰性になるように改変されたＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞は、任意の適切な方法によって遺伝子改変され得る。ＣＩＩＴＡおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子などの本開示の遺伝子変異は、当技術分野で公知の方法によって導入することができる。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼを使用して、本明細書で言及される任意の細胞の遺伝子改変のための外因性核酸配列を導入することができる。ゲノム編集、または操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集（ＧＥＥＮ）は、人工的に操作されたヌクレアーゼ、または「分子ハサミ」を使用してＤＮＡがゲノムに挿入、置換、または除去される遺伝子工学の一種である。ヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の位置に特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出し、細胞の内因性機構を利用して、相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然の過程によって誘導された切断を修復する。非限定的な操作されたヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、および操作されたメガヌクレアーゼ再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。当技術分野で公知の操作されたヌクレアーゼのいずれも、方法および組成物の特定の態様で使用することができる。
【0089】
操作されたγδ Ｔ細胞が、必要に応じてその後の枯渇のために１またはそれを超える自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、任意の適切な種類のものであってもよい。本開示のγδ Ｔ細胞は、例えば酵素ベースであってもよい自殺遺伝子産物を発現し得る。自殺遺伝子産物の例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９が挙げられる。したがって、具体的な場合では、自殺遺伝子はチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードし得る。具体的な場合では、ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子などのウイルスＴＫ遺伝子である。特定の実施形態では、自殺遺伝子産物は、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはそれらの誘導体などの基質によって活性化される。
【0090】
いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞は、画像化または他の方法で検出することができる。特定の場合では、細胞は、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含み、イメージングは、蛍光、放射性、比色などであってもよい。具体的な場合では、細胞は、陽電子放射断層撮影法によって検出される。少なくともいくつかの場合における細胞は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポーター／チミジンキナーゼ遺伝子であるｓｒ３９ＴＫ遺伝子を発現しており、ＰＥＴイメージングによってこれらの遺伝子改変された細胞を追跡し、ｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子機能によってこれらの細胞を排除することができる。
【0091】
操作されたγδ Ｔ細胞の集団が本開示に包含される。特定の態様では、γδ Ｔクローン細胞は、γδ Ｔ細胞受容体をコードする外因性核酸を含み、１またはそれを超えるＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠いている。γδ Ｔ細胞は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）などの酵素ベースの自殺遺伝子を含む自殺遺伝子をコードする外因性核酸を含み得る。ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子などのウイルスＴＫ遺伝子であってもよい。集団の細胞において、自殺遺伝子は、例えば、ガンシクロビル、ペンシクロビルまたはその誘導体などの基質によって活性化され得る。細胞は、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含み得、場合によっては、自殺遺伝子産物は、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである。特定の態様では、自殺遺伝子はｓｒ３９ＴＫである。γδ Ｔ細胞集団の特定の場合では、γδ Ｔ細胞は、細胞に導入された組換えベクター、例えばウイルスベクター（少なくともレンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスを含む）からの核酸配列を含む。
【0092】
特定の実施形態では、γδ Ｔ細胞集団の細胞は、１またはそれを超える特定の条件に曝露されていてもされていなくてもよく、または１またはそれを超える特定の条件に曝露される。特定の場合では、例えば、集団の細胞は、動物血清を含む培地に曝露されないか、または曝露されなかった。集団の細胞は凍結されてもされなくてもよい。場合によっては、集団の細胞は、デキストロース、１またはそれを超える電解質、アルブミン、デキストラン、および／またはＤＭＳＯを含む溶液中に存在する。溶液は、デキストロース、１またはそれを超える電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含み得る。細胞は、滅菌され、非発熱性であり、等張性である溶液中に存在してもよい。具体的な場合では、γδ Ｔ細胞は、ＺＯＬで活性化されるなど、活性化されている。特定の態様では、細胞集団は、少なくとも約１０２～１０６個のクローン細胞を含む。細胞集団は、場合によっては、少なくとも約１０６～１０１２個の総細胞を含み得る。
【0093】
特定の実施形態では、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞受容体およびチミジンキナーゼ自殺をコードする１またはそれを超える外因性核酸を含むクローンγδ Ｔ細胞を含むＴ細胞集団が存在し、クローンγδ Ｔ細胞は、機能性ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ならびに／またはＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子を発現しないように操作されており、細胞集団は総細胞が少なくとも約１０６～１０１２個であり、少なくとも約１０２～１０６個のクローン細胞を含む。場合によっては、細胞は、溶液中で凍結される。
【0094】
特定の実施形態では、ＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞および／またはその前駆体は、ＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞を生成するプロセスの任意の段階で、（インビトロＡＴＯ培養系に存在するか否かにかかわらず）特定の培地中で特異的に構築され得、および／または培養され得る。細胞は、有害な影響なしにレシピエントに送達するのに適しているように構築され得る。
【0095】
特定の態様では、培地は、動物細胞を培養するために使用される培地、例えば、ＡＩＭＶ、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ、ＥＧＭ２、ＴｅＳＲ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ－１６４０、およびＦｉｓｃｈｅｒ培地のいずれか、ならびにそれらの任意の組み合わせをそれらの基礎培地として使用して調製することができるが、動物細胞を培養するために使用することができる限り、培地は特にこれらに限定されない。特に、培地は、ゼノフリーまたは化学的に定義されてもよい。
【0096】
培地は、血清含有もしくは無血清培地、またはゼノフリー培地であってもよい。異種動物由来成分の混入を防止する観点から、血清は、幹細胞と同じ動物に由来し得る。無血清培地とは、未処理または未精製の血清を含まない培地を指し、したがって、精製血液由来成分または動物組織由来成分（増殖因子など）を含む培地を含み得る。
【0097】
培地は、血清の代替物を含有してもよく、または含有しなくてもよい。血清の代替物としては、アルブミン（例えば、脂質リッチなアルブミン、ウシアルブミン、アルブミン置換物、例えば、組換えアルブミンまたはヒト化アルブミン、植物デンプン、デキストランおよびタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオグリセロール、またはそれらの等価物を適切に含有する材料を挙げることができる。血清の代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号（その全体が本明細書に組み込まれる）に開示される方法によって調製することができる。あるいは、より簡便にするために、任意の市販の材料を使用することができる。市販の材料としては、ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ）およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
【0098】
さらなる実施形態では、培地は、細胞発生に適した無血清培地であってもよい。例えば、培地は、３Ｄ細胞凝集体からＴ細胞を生成するのに有効な濃度で、Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ－２７（登録商標）サプリメント（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｍｅｄｉａ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．２５０．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブで入手可能）、ＮＳ２１サプリメント（Ｃｈｅｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００８ Ｊｕｎ ３０；１７１（２）：２３９－２４７、その全体が本明細書に組み込まれる）、ＧＳ２１（商標）サプリメント（ａｍｓｂｉｏ．ｃｏｍ／Ｂ－２７．ａｓｐｘのワールドワイドウェブで入手可能）、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【0099】
表１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞（配列番号１～配列番号５２）および／または他のγδ Ｔ細胞は、任意の適切な方法によって生成され得る。１またはそれを超える方法は、細胞に対する１またはそれを超える改変のために１またはそれを超える連続工程を利用してもよく、および／または細胞に対する１またはそれを超える改変のために１またはそれを超える同時工程を利用してもよい。特定の実施形態では、細胞の出発源は、γδ Ｔ細胞として機能するように改変され、その後、１またはそれを超える追加の特徴、例えば、画像化する能力、および／または選択的に死滅させる能力、および／または同種異系で使用することができる能力を細胞に加える１またはそれを超える工程が続く。特定の実施形態では、ＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞を生成するためのプロセスの少なくとも一部は、特定のインビトロ培養系で行われる。特定のインビトロ培養系の例は、特定の細胞の高効率および高収率での分化を可能にするものである。特定の実施形態では、インビトロ培養系は人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系である。
【0100】
具体的な場合では、ＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞は、以下の１）γδ ＴＣＲを（例えば、レンチウイルスベクターを介して）発現し、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子の発現を（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集を介して）排除するためのドナーＨＳＣの遺伝子改変、２）ＡＴＯ培養物を介したγδ Ｔ細胞へのインビトロ分化、３）インビトロγδ Ｔ細胞の精製および増殖、ならびに４）構築および凍結保存および／または使用によって作製され得る。
【0101】
本開示の特定の実施形態は、クローンガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞の集団を調製する方法であって、ａ）ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４＋細胞を選択すること、ｂ）ヒトγδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１またはそれを超える核酸を導入すること、ｃ）単離されたヒトＣＤ３４＋細胞において１またはそれを超えるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子の発現を排除すること、ｄ）人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系でγδ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養してγδ Ｔ細胞を生成することであって、ＡＴＯ系が、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択された集団および無血清培地を含む３Ｄ細胞凝集体を含むことを含む方法を提供する。本方法は、ＣＤ３４－細胞を単離することをさらに含み得る。代替的な実施形態では、２Ｄ培養系または他の形態の３Ｄ培養系（例えば、ＦＴＯＣ様培養、マトリゲル（ｍｅｔｒｉｇｅｌ）支援培養）など、ＡＴＯ系以外の他の培養系が使用される。
【0102】
本開示の特定の態様は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞もしくは前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または幹細胞もしくは前駆細胞などの低分化細胞からγδ Ｔ細胞を生成するための新規な三次元細胞培養系に関する。任意のタイプの幹細胞は、例えば、少なくとも胎児肝臓、臍帯血および末梢血ＣＤ３４＋細胞（Ｇ－ＣＳＦ動員または非Ｇ－ＣＳＦ動員のいずれか）を含む様々な資源から利用され得る。
【0103】
特定の実施形態では、系は、無血清培地を使用することを含む。特定の態様では、系は、三次元細胞凝集体の培養のための細胞発生に適した無血清培地を使用する。そのような系は、十分な量のＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞を生成する。本開示の実施形態では、３Ｄ細胞凝集体は、幹細胞もしくは前駆細胞からＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞、または前駆体からＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞へのインビトロ分化に十分な期間、インスリンを含む無血清培地中で培養される。
【0104】
細胞培養組成物の実施形態は、ヒトＨＳＣからのロバストで高度に再現性のあるＴ細胞分化を促進するために、高度に標準化された無血清成分および間質細胞株を使用するＡＴＯ ３Ｄ培養物を含む。特定の実施形態では、ＡＴＯにおける細胞分化は、内因性胸腺リンパ球形成を詳細に模倣し、単層共培養とは対照的に、機能的ＵＨＳＣ－γδ Ｔの効率的な正の選択を支持した。３Ｄ培養組成物の特定の態様は、無血清条件を使用し、ヒト胸腺組織または独自のスキャフォールド材料の使用を回避し、供給源の細胞からの完全に機能的な成熟ヒトＵＨＳＣ－γδ Ｔ細胞の正の選択およびロバストな作製を促進する。
【0105】
調製方法によって生成された細胞は凍結され得る。生成された細胞は、デキストロース、１またはそれを超える電解質、アルブミン、デキストランおよびＤＭＳＯを含む溶液中に存在してもよい。溶液は、無菌、非発熱性および等張性であってもよい。
【0106】
遺伝子改変を特定の成分に導入して、抗原特異的Ｔ細胞を作製し、正の選択および負の選択をモデル化することもできる。これらの改変の例としては、抗原特異的で対立遺伝子的に排除されたナイーブＴ細胞を作製するための、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスベクターによるＨＳＣの形質導入、特定のリンパ系細胞への分化系列決定を指示するための遺伝子を用いたＨＳＣの形質導入が挙げられる。例えば、ガンマデルタ（γδ）関連ＴＣＲを有するＨＳＣを形質導入して、ＡＴＯにおいて機能性γδ Ｔ細胞を作製すること、ヒトＭＨＣ遺伝子（例えば、ヒトＣＤ１ｄ遺伝子）を用いたＡＴＯ間質細胞株（例えば、ＭＳ５－ｈＤＬＬ１）の形質導入により、ＡＴＯにおいてＴＣＲ操作Ｔ細胞またはＴＣＲ非操作Ｔ細胞の両方の正の選択および成熟を増強すること、ならびに／または抗原＋共刺激分子またはサイトカインを用いたＡＴＯ間質細胞株の形質導入により、ＡＴＯにおいてＣＡＲ Ｔ細胞の正の選択を増強すること。
【0107】
操作されたγδ Ｔ細胞を生成する際に、ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）からのＣＤ３４＋細胞は、特定の外因性遺伝子を導入し、特定の内因性遺伝子をノックアウトすることによって改変され得る。本方法は、１またはそれを超える核酸を細胞に導入する前に、培地中で選択されたＣＤ３４＋細胞を培養することをさらに含み得る。培養は、１またはそれを超える増殖因子を含む培地で選択されたＣＤ３４＋細胞をインキュベートすることを含み得、場合によっては、１またはそれを超える増殖因子は、例えば、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含み得る。増殖因子は、特定の濃度、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌであってもなくてもよい。
【0108】
特定の方法では、細胞に導入される核酸は、γ－ＴＣＲおよびδ－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む１またはそれを超える核酸である（例えば、配列番号１～配列番号５２）。本方法は、選択された細胞に自殺遺伝子をコードする核酸を導入することを含み得る。特定の態様では、１つの核酸がγ－ＴＣＲとδ－ＴＣＲの両方をコードするか、または１つの核酸がγ－ＴＣＲ、δ－ＴＣＲ、および自殺遺伝子をコードする。自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子由来のものなどのウイルスＴＫ遺伝子を含むチミジンキナーゼ（ＴＫ）などの酵素ベースであってもよい。自殺遺伝子は、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはそれらの誘導体などの基質によって活性化され得る。細胞は、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含むように操作され得る。場合によっては、自殺遺伝子産物は、ｓｒ３９ＴＫなどのイメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである。
【0109】
操作されたγδ Ｔ細胞の製造において、細胞は、外部から添加されたアスコルビン酸を含むものを含む特定の無血清培地中に存在し得る。特定の態様では、無血清培地は、外部から添加されたＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、インターフェロン－ガンマ、インターフェロン－ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレオトロフィンまたはミッドカイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む。無血清培地は、ビオチン、ＤＬアルファトコフェロールアセテート、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２、またはそれらの組み合わせもしくはそれらの塩を含むビタミンをさらに含み得る。無血清培地は、アルブミンもしくはウシ血清アルブミン、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、またはそれらの組み合わせなどの１またはそれを超える外部添加（または非添加）タンパク質をさらに含み得る。無血清培地は、コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウムもしくはトリヨード－Ｉ－チロニン、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。無血清培地は、Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ－２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、またはそれらの組み合わせを含み得る。アミノ酸（アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシンもしくはバリン、またはそれらの組み合わせを含む）、単糖、および／または無機イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、もしくはリン、またはそれらの組み合わせもしくは塩を含む）は、無血清培地中に存在し得る。無血清培地は、モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、もしくはマンガン、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。
【0110】
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下のセクションで説明される。
【実施例】
【0111】
ヒトＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲクローン、配列、および遺伝子送達ベクター
ヒトＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲ（本明細書ではγδ ＴＣＲと呼ぶ）を、健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のγδＴ（ＰＢＭＣ－γδＴ）細胞からクローニングした。本明細書に開示される方法の例示的な実施形態、ならびにγδ ＴＣＲ配列（例えば、アミノ酸配列および／または遺伝子コード配列）および例示的なγδ ＴＣＲ遺伝子送達ベクターを以下に考察する。
ヒトＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲ（本明細書ではγδ ＴＣＲと呼ぶ）を、健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のγδＴ（ＰＢＭＣ－γδＴ）細胞からクローニングした。本明細書に開示される方法の例示的な実施形態、ならびにγδ ＴＣＲ配列（例えば、アミノ酸配列および／または遺伝子コード配列）および例示的なγδ ＴＣＲ遺伝子送達ベクターを以下に考察する。
【0112】
方法
ヒトγδ Ｔ細胞は、幹細胞および前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ）のγδ ＴＣＲ遺伝子操作、その後のトランスジェニックγδ Ｔ細胞への分化（インビボまたはエクスビボで）によって作製することができる。
ヒトγδ Ｔ細胞は、幹細胞および前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ）のγδ ＴＣＲ遺伝子操作、その後のトランスジェニックγδ Ｔ細胞への分化（インビボまたはエクスビボで）によって作製することができる。
【0113】
ＨＳＣは、臍帯血またはＧ－ＣＳＦ動員末梢血（ＣＢ ＨＳＣまたはＰＢＳＣ）から直接単離することができる、または胚性もしくは人工多能性幹細胞（ＥＳ－ＨＳＣまたはｉＰＳ－ＨＳＣ）に由来することができるヒトＣＤ３４＋造血前駆細胞および幹細胞を指す。ＨＳＣは、ベクター依存性またはベクター非依存性の遺伝子送達方法を介して、または他の遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーなど）を介して遺伝子操作され得る。
【0114】
モノクローナルトランスジェニックγδ ＴＣＲによって与えられる抗原特異性に加えて、ＨＳＣ－γδＴをさらに操作して、さらなる標的化分子を発現してそれらの疾患標的化能力を増強することができる。そのような標的化分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、天然または合成の受容体／リガンドなどであってもよい。次いで、得られたＣＡＲ－γδＴ細胞を既製の疾患標的化細胞療法に利用することができる。
【0115】
モノクローナルトランスジェニックＴＣＲによって与えられる抗原特異性に加えて、ＨＳＣ－γδＴをさらに操作して、さらなる標的化分子を発現してそれらの疾患標的化能力を増強することができる。そのような標的化分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、天然または合成の受容体／リガンドなどであってもよい。次いで、得られたＣＡＲ－γδＴ細胞を既製の疾患標的化細胞療法に利用することができる。
【0116】
ＨＳＣ－γδＴ細胞および誘導体はまた、Ｔ細胞刺激因子をコードする遺伝子を過剰発現するように、またはＴ細胞阻害因子をコードする遺伝子を破壊するようにさらに操作することができ、その結果、機能的に増強されたＨＳＣ－γδＴ細胞および誘導体が得られる。
【0117】
ＨＳＣ養子療法のためのＨＳＣ操作されたγδＴ（ＨＳＣ－γδＴ）細胞のインビボ作製
インビボでＨＳＣ－γδＴ細胞、疾患を標的とする操作されたＨＳＣ－γδＴ細胞の生涯にわたる供給を患者に潜在的に提供することができる細胞を作製することができる、γδ ＴＣＲ遺伝子操作されたＨＳＣ養子移入方法が開示される。
インビボでＨＳＣ－γδＴ細胞、疾患を標的とする操作されたＨＳＣ－γδＴ細胞の生涯にわたる供給を患者に潜在的に提供することができる細胞を作製することができる、γδ ＴＣＲ遺伝子操作されたＨＳＣ養子移入方法が開示される。
【0118】
手順は、１）選択されたγδ ＴＣＲ遺伝子を発現するためのヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の遺伝子改変、２）患者へのγδ ＴＣＲ遺伝子操作されたＨＳＣの養子移入、３）ＨＳＣ－γδＴ細胞のインビボ作製、４）ＨＳＣの自己再生の寿命のために、本方法は、ＨＳＣ－γδＴ細胞の生涯にわたる供給によって患者を潜在的に保護することができることを含む。
【0119】
既製の細胞療法のための同種異系ＨＳＣ操作されたγδＴ（ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ）細胞のエクスビボ作製
既製の細胞療法用途のためのＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞を作製するためのエクスビボ分化培養方法が開示される。
既製の細胞療法用途のためのＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞を作製するためのエクスビボ分化培養方法が開示される。
【0120】
フィーダー依存性培養
手順は、１）選択されたγδ ＴＣＲ遺伝子を発現するためのヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の遺伝子改変、３）フィーダー細胞を用いたＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のエクスビボ作製（例えば、人工胸腺オルガノイド培養）、３）分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のエクスビボ増殖を含む。
手順は、１）選択されたγδ ＴＣＲ遺伝子を発現するためのヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の遺伝子改変、３）フィーダー細胞を用いたＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のエクスビボ作製（例えば、人工胸腺オルガノイド培養）、３）分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のエクスビボ増殖を含む。
【0121】
フィーダーフリー培養
生成手順は、１）選択されたＴＣＲ遺伝子を発現するためのヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の遺伝子改変、２）フィーダー細胞を用いないＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のエクスビボ生成、３）分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のエクスビボ増殖を含む。
生成手順は、１）選択されたＴＣＲ遺伝子を発現するためのヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の遺伝子改変、２）フィーダー細胞を用いないＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のエクスビボ生成、３）分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のエクスビボ増殖を含む。
【0122】
用途
操作されたγδ Ｔ細胞は、癌および感染性疾患を含む複数の疾患を標的とするために使用することができる。
操作されたγδ Ｔ細胞は、癌および感染性疾患を含む複数の疾患を標的とするために使用することができる。
【0123】
癌のγδ Ｔ細胞療法
血液癌（例えば、多発性骨髄腫）および固形腫瘍（例えば、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、乳癌および肺癌）を含むヒト癌の大きな集合を処置するための原理証明データが提供される。
血液癌（例えば、多発性骨髄腫）および固形腫瘍（例えば、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、乳癌および肺癌）を含むヒト癌の大きな集合を処置するための原理証明データが提供される。
【0124】
感染性疾患に対するγδ Ｔ細胞療法
ＣＯＶＩＤ－１９を標的とするための原理証明データが提供される。
ＣＯＶＩＤ－１９を標的とするための原理証明データが提供される。
【0125】
ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の培養方法の詳細な説明
ＨＳＣ－γδＴ細胞のインビボ作製
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを、組換えヒトＦｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ－３を含有するＸ－ＶＩＶＯ１５無血清造血細胞培地中で、レトロネクチンでコーティングした組織培養処理していないプレートにおいて４８時間以内培養した。濃縮レンチベクターを培養培地に直接添加することによって、ウイルス形質導入を２４時間行った。約４８時間後、ＣＤ３４＋細胞を回収し、２７０ラドの全身照射を受けたＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ヒト胎児の胸腺または出生後の胸腺の１～２個の断片を各レシピエントＮＳＧマウスの腎臓被膜の下に移植した。
ＨＳＣ－γδＴ細胞のインビボ作製
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを、組換えヒトＦｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ－３を含有するＸ－ＶＩＶＯ１５無血清造血細胞培地中で、レトロネクチンでコーティングした組織培養処理していないプレートにおいて４８時間以内培養した。濃縮レンチベクターを培養培地に直接添加することによって、ウイルス形質導入を２４時間行った。約４８時間後、ＣＤ３４＋細胞を回収し、２７０ラドの全身照射を受けたＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ヒト胎児の胸腺または出生後の胸腺の１～２個の断片を各レシピエントＮＳＧマウスの腎臓被膜の下に移植した。
【0126】
ＡｌｌｏＨＳＣ－γδ Ｔ細胞のフィーダー依存性エクスビボ作製
段階１：ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の分化
新鮮または凍結／解凍したＣＤ３４＋ＨＳＣを、レトロネクチンでコーティングしたフラスコ中、幹細胞培養培地（ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌなどを含むサイトカインカクテルを補充したベース培地）中で１２～７２時間培養し、続いてＴＣＲ遺伝子送達ベクターを添加し、さらに１２～４８時間培養する。次いで、ＴＣＲ遺伝子改変ＨＳＣを、フィーダー依存性培養物（例えば、人工胸腺オルガノイド培養）中で４～１０週間かけてＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞に分化させる。人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）は、以前に確立されたプロトコル（Ｓｅｅｔら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１９ Ｍａｒ ７；２４（３）：３７６－３８９）に従って作製された。
段階１：ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の分化
新鮮または凍結／解凍したＣＤ３４＋ＨＳＣを、レトロネクチンでコーティングしたフラスコ中、幹細胞培養培地（ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌなどを含むサイトカインカクテルを補充したベース培地）中で１２～７２時間培養し、続いてＴＣＲ遺伝子送達ベクターを添加し、さらに１２～４８時間培養する。次いで、ＴＣＲ遺伝子改変ＨＳＣを、フィーダー依存性培養物（例えば、人工胸腺オルガノイド培養）中で４～１０週間かけてＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞に分化させる。人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）は、以前に確立されたプロトコル（Ｓｅｅｔら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１９ Ｍａｒ ７；２４（３）：３７６－３８９）に従って作製された。
【0127】
段階２：ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の増殖
段階２で、分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞をＴＣＲ同種抗原（タンパク質、ペプチド、脂質、蛍光体抗原、小分子など）または非特異的ＴＣＲ刺激試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体または抗体被覆ビーズ、コンカナバリンＡ、ＰＭＡ／イオノマイシンなど）で刺激し、Ｔ細胞培養培地中で最大１ヶ月間増殖させる。培養物に、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５など）に対応するＴ細胞を補充することができる。
段階２で、分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞をＴＣＲ同種抗原（タンパク質、ペプチド、脂質、蛍光体抗原、小分子など）または非特異的ＴＣＲ刺激試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体または抗体被覆ビーズ、コンカナバリンＡ、ＰＭＡ／イオノマイシンなど）で刺激し、Ｔ細胞培養培地中で最大１ヶ月間増殖させる。培養物に、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５など）に対応するＴ細胞を補充することができる。
【0128】
ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞誘導体
いくつかの実施形態では、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、追加の導入遺伝子を発現するようにさらに操作することができる。一実施形態では、そのような導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および他の天然または合成の受容体／リガンドなどの疾患標的化分子をコードする。別の実施形態では、そのような導入遺伝子は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＦＯＸＰ３などのＴ細胞調節タンパク質をコードすることができる。様々な培養段階で、導入遺伝子を増殖後のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞またはそれらの前駆細胞（ＨＳＣ、新たに分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞、増殖中のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞）に導入することができる。
いくつかの実施形態では、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、追加の導入遺伝子を発現するようにさらに操作することができる。一実施形態では、そのような導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および他の天然または合成の受容体／リガンドなどの疾患標的化分子をコードする。別の実施形態では、そのような導入遺伝子は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＦＯＸＰ３などのＴ細胞調節タンパク質をコードすることができる。様々な培養段階で、導入遺伝子を増殖後のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞またはそれらの前駆細胞（ＨＳＣ、新たに分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞、増殖中のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞）に導入することができる。
【0129】
いくつかの実施形態では、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、遺伝子編集ツール（ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーなど）を使用して、選択された遺伝子を破壊するようにさらに操作することができる。一実施形態では、破壊された遺伝子は、Ｔ細胞免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３など）をコードする。これらの負の調節遺伝子の欠損は、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の疾患と戦う能力を高め、疾患誘導アネルギーおよび寛容に対する耐性を生じさせる可能性がある。
【0130】
ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞のフィーダーフリーエクスビボ作製
段階１：ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の分化
新鮮または凍結／解凍したＣＤ３４＋ＨＳＣを、レトロネクチンでコーティングしたフラスコ中、幹細胞培養培地（ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌなどを含むサイトカインカクテルを補充したベース培地）中で１２～７２時間培養し、続いてＴＣＲ遺伝子送達ベクターを添加し、さらに１２～４８時間培養する。
段階１：ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の分化
新鮮または凍結／解凍したＣＤ３４＋ＨＳＣを、レトロネクチンでコーティングしたフラスコ中、幹細胞培養培地（ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌなどを含むサイトカインカクテルを補充したベース培地）中で１２～７２時間培養し、続いてＴＣＲ遺伝子送達ベクターを添加し、さらに１２～４８時間培養する。
【0131】
次いで、ＴＣＲ遺伝子改変ＨＳＣを、フィーダーなしで４～１０週間にわたって分化培地中でＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞に分化させる。組織培養処理されていないプレートを、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ培養コーティング材料（ＤＬＬ－１／４、ＶＣＡＭ－１／５、レトロネクチンなど）でコーティングする。ＣＤ３４＋ＨＳＣを増殖培地（血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２－メルカプトエタノール、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、Ｆｌｔ３リガンド、ヒトＬＤＬ、ＵＭ１７１および添加剤を含有するベース培地）に懸濁し、プレートのコーティングウェルに播種し、３～７日間培養する。増殖培地を３～４日ごとに新しくする。次いで、細胞を回収し、成熟培地（血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２－メルカプトエタノール、ＳＣＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、Ｆｌｔ３リガンド、アスコルビン酸および添加剤を含有するベース培地）に懸濁する。成熟培地を１週間に１～２回新しくする。
【0132】
段階２：ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の増殖
分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞をＴＣＲ同種抗原（タンパク質、ペプチド、脂質、蛍光体抗原、小分子など）または非特異的ＴＣＲ刺激試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体または抗体被覆ビーズ、コンカナバリンＡ、ＰＭＡ／イオノマイシン、および人工ＡＰＣ）で刺激し、Ｔ細胞培養培地中で最大１ヶ月間増殖させる。培養物に、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５など）に対応するＴ細胞を補充することができる。
分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞をＴＣＲ同種抗原（タンパク質、ペプチド、脂質、蛍光体抗原、小分子など）または非特異的ＴＣＲ刺激試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体または抗体被覆ビーズ、コンカナバリンＡ、ＰＭＡ／イオノマイシン、および人工ＡＰＣ）で刺激し、Ｔ細胞培養培地中で最大１ヶ月間増殖させる。培養物に、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５など）に対応するＴ細胞を補充することができる。
【0133】
ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞誘導体
いくつかの実施形態では、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、追加の導入遺伝子を発現するようにさらに操作することができる。一実施形態では、そのような導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および他の天然または合成の受容体／リガンドなどの疾患標的化分子をコードする。別の実施形態では、そのような導入遺伝子は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＦＯＸＰ３などのＴ細胞調節タンパク質をコードすることができる。様々な培養段階で、導入遺伝子を増殖後のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞またはそれらの前駆細胞（ＨＳＣ、新たに分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞、増殖中のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞）に導入することができる。
いくつかの実施形態では、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、追加の導入遺伝子を発現するようにさらに操作することができる。一実施形態では、そのような導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および他の天然または合成の受容体／リガンドなどの疾患標的化分子をコードする。別の実施形態では、そのような導入遺伝子は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＦＯＸＰ３などのＴ細胞調節タンパク質をコードすることができる。様々な培養段階で、導入遺伝子を増殖後のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞またはそれらの前駆細胞（ＨＳＣ、新たに分化したＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞、増殖中のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞）に導入することができる。
【0134】
いくつかの実施形態では、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、遺伝子編集ツール（ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーなど）を使用して、選択された遺伝子を破壊するようにさらに操作することができる。一実施形態では、破壊された遺伝子は、Ｔ細胞免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３など）をコードする。これらの負の調節遺伝子の欠損は、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の疾患と戦う能力を高め、疾患誘導アネルギーおよび寛容に対する耐性を生じさせる可能性がある。
【0135】
いくつかの実施形態では、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞または増強されたＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、同種異系養子移入に適したものにするようにさらに操作することができ、それによって既製の細胞産物としての役割を果たすのに適している。一実施形態では、ＭＨＣ分子またはＭＨＣ発現／ディスプレイ調節分子をコードする遺伝子［ＭＨＣ分子、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ（ＭＨＣクラスＩＩ ｍＲＮＡ発現のクラスＩＩ転写活性化因子制御誘導）など］。ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞上のＭＨＣ分子発現の欠如は、同種異系宿主Ｔ細胞媒介性枯渇に対して細胞を耐性にする。別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ欠損ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、宿主ＮＫ細胞媒介性枯渇に対する耐性を付与するＨＬＡ－Ｅ遺伝子を過剰発現するようにさらに操作される。
【0136】
ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞および誘導体は、新鮮な状態で使用することも、凍結保存して使用することもできる。さらに、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞培養中に作製された様々な中間細胞産物は、凍結保存のために一時停止し、継続的な産生のために保管および回収することができる。
【0137】
新規な特徴および利点
フィーダー依存性培養物（例えば、ＡＴＯ培養）を使用してＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞を生成する方法と比較して、本発明は、フィーダー細胞を必要としないインビトロ分化方法を提供する。この新規な方法により、ヒト用途のための治療用細胞のスケールアップ生成およびＧＭＰ適合性製造のためのプロセスが大幅に改善される。
フィーダー依存性培養物（例えば、ＡＴＯ培養）を使用してＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞を生成する方法と比較して、本発明は、フィーダー細胞を必要としないインビトロ分化方法を提供する。この新規な方法により、ヒト用途のための治療用細胞のスケールアップ生成およびＧＭＰ適合性製造のためのプロセスが大幅に改善される。
【0138】
細胞産物であるＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞は、それらの天然の対応物Ｔ細胞ならびに他のエクスビボ培養方法（例えば、ＡＴＯ培養法）を使用して作製されたそれらの対応物Ｔ細胞の表現型／機能性とは異なる表現型／機能性を示し、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞を固有の細胞産物にする。
【0139】
ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞分化培養の固有の特徴には、以下が含まれる。
１）エクスビボでフィーダーフリーである。
２）ＴＣＲＶ／Ｄ／Ｊ組換えを支援しないので、ランダムに再編成された内因性ＴＣＲはなく、したがってＧｖＨＤリスクはない。
３）トランスジェニックＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の同調分化を支援し、それにより、未分化前駆細胞およびバイスタンダー免疫細胞の他の系統の存在を排除する。
４）結果として、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞産物は、モノクローナルＴＣＲ操作Ｔ細胞の均一で純粋な集団を含む。逃避したランダムＴ細胞はなく、免疫細胞の他の系統もなく、未分化前駆細胞もなかった。したがって、精製工程は不要である。
５）高収率。約１０１３個のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞（１０，０００～１００，０００用量）を健常ドナーのＰＢＳＣから作製することができ、約１０１３個のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞（１０，０００～１００，０００用量）を健常ドナーのＣＢ ＨＳＣから作製することができる。
６）ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の固有の表現型－トランスジェニックＴＣＲ＋内因性ＴＣＲ－ＣＤ３＋。
（注：ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞分化培養物のこれらの固有の特徴は、健常ドナーＰＢＭＣベースのＴ細胞培養物、ＡＴＯ培養物などを含む、既製のＴ細胞産物を作製する他の方法とは異なる。）
１）エクスビボでフィーダーフリーである。
２）ＴＣＲＶ／Ｄ／Ｊ組換えを支援しないので、ランダムに再編成された内因性ＴＣＲはなく、したがってＧｖＨＤリスクはない。
３）トランスジェニックＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の同調分化を支援し、それにより、未分化前駆細胞およびバイスタンダー免疫細胞の他の系統の存在を排除する。
４）結果として、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞産物は、モノクローナルＴＣＲ操作Ｔ細胞の均一で純粋な集団を含む。逃避したランダムＴ細胞はなく、免疫細胞の他の系統もなく、未分化前駆細胞もなかった。したがって、精製工程は不要である。
５）高収率。約１０１３個のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞（１０，０００～１００，０００用量）を健常ドナーのＰＢＳＣから作製することができ、約１０１３個のＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞（１０，０００～１００，０００用量）を健常ドナーのＣＢ ＨＳＣから作製することができる。
６）ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の固有の表現型－トランスジェニックＴＣＲ＋内因性ＴＣＲ－ＣＤ３＋。
（注：ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞分化培養物のこれらの固有の特徴は、健常ドナーＰＢＭＣベースのＴ細胞培養物、ＡＴＯ培養物などを含む、既製のＴ細胞産物を作製する他の方法とは異なる。）
【0140】
原理証明
原理証明研究が行われ、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の作製の成功を示している。ＢＣＭＡ ＣＡＲ（ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞産物）、およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）（Ａｌｌｏ１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞産物）をさらに発現するためのＡｌｌｏＣＡＲ－γδＴ細胞のさらなる操作もまた成功したことが証明された。パイロットＣＭＣ、薬理学、有効性、および安全性研究を、これらの細胞産物を分析して行った。
原理証明研究が行われ、ＡｌｌｏＨＳＣ－γδＴ細胞の作製の成功を示している。ＢＣＭＡ ＣＡＲ（ＡｌｌｏＢＣＡＲ－γδＴ細胞産物）、およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）（Ａｌｌｏ１５ＢＣＡＲ－γδＴ細胞産物）をさらに発現するためのＡｌｌｏＣＡＲ－γδＴ細胞のさらなる操作もまた成功したことが証明された。パイロットＣＭＣ、薬理学、有効性、および安全性研究を、これらの細胞産物を分析して行った。
【0141】
表１：クローン化γδ ＴＣＲ ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列
ヒトγδ ＴＣＲ遺伝子を、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲアプローチを使用してクローニングした（例えば、図１を参照されたい）。簡潔には、ヒトγδ Ｔ細胞を健常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から増殖させ、ｈＣＤ３＋Ｖγ９＋Ｖδ２＋としてゲーティングした表面マーカーのストリンジェントな組み合わせに基づいてフローサイトメトリーを使用して選別した（図１Ａおよび１Ｂ）。単一細胞を、細胞溶解緩衝液を含有するＰＣＲプレートに直接選別し、次いで、ワンステップＲＴ－ＰＣＲを使用してＴＣＲクローニングに供し、続いてサンガー配列決定分析を行った（図１Ａ）。以下に示すように、２５対を超えるγδ ＴＣＲ γ９およびδ２鎖遺伝子が同定された。
ヒトγδ ＴＣＲ遺伝子を、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲアプローチを使用してクローニングした（例えば、図１を参照されたい）。簡潔には、ヒトγδ Ｔ細胞を健常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から増殖させ、ｈＣＤ３＋Ｖγ９＋Ｖδ２＋としてゲーティングした表面マーカーのストリンジェントな組み合わせに基づいてフローサイトメトリーを使用して選別した（図１Ａおよび１Ｂ）。単一細胞を、細胞溶解緩衝液を含有するＰＣＲプレートに直接選別し、次いで、ワンステップＲＴ－ＰＣＲを使用してＴＣＲクローニングに供し、続いてサンガー配列決定分析を行った（図１Ａ）。以下に示すように、２５対を超えるγδ ＴＣＲ γ９およびδ２鎖遺伝子が同定された。
【表1-1】
【表1-2】
【0142】
例示的ベクターの配列
ｐＭＮＤＷ－Ｇ１１５ ＤＮＡ配列番号：
ｐＭＮＤＷ－Ｇ１１５ ＤＮＡ配列番号：
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【化1-4】
【化1-5】
【化1-6】
【化1-7】
【0143】
ｐＭＮＤＷ－γδ１ ＤＮＡ配列番号：
【化2-1】
【化2-2】
【化2-3】
【化2-4】
【化2-5】
【化2-6】
【化2-7】
【化2-8】
【0144】
本明細書で言及されるすべての刊行物（例えば、ＰＣＴ公開国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／３６７８６号およびＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３７４８６号、米国特許出願第１５／３２０，０３７号、ならびにＺａｒｉｎら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１５ Ｊｕｌ；２９６（１）：７０－５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌｉｍｍ．２０１５．０３．００７．Ｅｐｕｂ ２０１５、上記に列挙したものなど）は、引用された刊行物に関連する態様、方法および／または材料を開示および記載するために参照により組み込まれる。本明細書に記載または参照される技術および手順の多くは、当業者によってよく理解され、一般的に使用されている。
【0145】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記および他の科学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするためおよび／または容易に参照するために本明細書で定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、当技術分野で一般に理解されるものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。
【図1A-1C】
【図2A-2B】
【図3A-3E】
【図4A-4B】
【図5A-5B】
【図6A-6B】
【図6C-6D】
【図7A-7B】
【図7C-7D】
【図8A】
【図8B】
【図9A-9E】
【図10A-10C】
【図11A-11D】
【図12A-12D】
【図13A-13D】
【図14A】
【図14B-14F】
【図15A-15F】
【図16】
【図17A-17D】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの外因性ガンマデルタＴ細胞受容体（γδ ＴＣＲ）核酸分子を含有するように遺伝子改変された細胞である、操作された細胞。
【請求項2】
前記細胞が多能性幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞または免疫細胞である、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項3】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項4】
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、γδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体のクローンであるか、または前記γδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体の配列から改変された配列を有する、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項5】
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、ヒトγδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体のクローンであるか、または前記ヒトγδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体の配列から改変された配列を有する、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項6】
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、ヒトγδ Ｔ細胞受容体から得られた核酸配列を含む、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項7】
前記操作された細胞が外因性癌遺伝子を欠く、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項8】
前記ガンマデルタＴ細胞受容体核酸分子が、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項9】
Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質導入された操作された細胞を含む組成物であって、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項10】
操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を作製する方法における使用のための組成物であって、前記組成物は、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含み、前記方法は、前記少なくとも１つの外因性核酸分子によって形質導入された前記ヒト多能性細胞が、前記少なくとも１つの外因性核酸分子によってコードされるガンマ鎖ポリペプチドおよびデルタ鎖ポリペプチドを含むＴ細胞受容体を発現するように、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子でヒト造血幹細胞／前駆細胞を形質導入することと、
前記操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を作製するように前記ヒト造血幹細胞／前駆細胞を分化させることと
を含む、組成物。
【請求項11】
前記方法が、（ａ）第１のインビトロ培養物中で、形質導入されたヒト造血幹細胞／前駆細胞を分化することと、
（ｂ）第２のインビトロ培養物中で、（ａ）の分化された細胞を増殖させることと
をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記造血幹細胞／前駆細胞が、フィーダー細胞を含まない培地中で培養され、および／または前記造血幹細胞／前駆細胞が、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＭＣＰ－４、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌおよび／またはレトロネクチンのうちの１またはそれを超えるものを含む培地中で培養される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記方法が、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする前記核酸分子で形質導入された前記細胞をインビトロで増殖させることをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記方法が、前記操作された細胞のクローン集団をインビボで作製するために、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする前記核酸分子で形質導入された前記造血幹細胞／前駆細胞を対象に移植することをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項15】
前記操作された機能的ガンマデルタＴ細胞が、ＨＬＡ－Ｉ低／陰性、
ＨＬＡ－ＩＩ低／陰性、
ＨＬＡ－Ｅ陽性、ならびに
免疫調節遺伝子および／または自殺遺伝子を発現すること
のうちの少なくとも１つであることを特徴とする遺伝子発現プロファイルを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項16】
前記外因性核酸分子が、レンチウイルス発現ベクターに含まれ、および／または前記方法が、前記形質導入された細胞を、成長および／または分化を促進するように選択された作用物質と接触させることをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項17】
前記方法が、前記形質導入された細胞を、末梢血単核細胞、抗原提示細胞または人工抗原提示細胞と共培養することをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記造血幹細胞／前駆細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項19】
前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項20】
請求項１０から１９のいずれか一項に記載の組成物を使用することによって生成された操作された機能的ガンマデルタＴ細胞。
【請求項21】
ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象を処置するための組成物であって、請求項１から９または２０に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項22】
前記ガンマデルタＴ細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞に、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチド、Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチド、ＩＬ－１５および自殺遺伝子をコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を形質導入することによって作製される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
前記ガンマデルタＴ細胞が、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象が癌と診断されている、または前記ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象が、ウイルス感染、真菌感染または原虫感染と診断されている、
請求項２１に記載の組成物。
【請求項25】
前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよびＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、癌細胞またはウイルス、真菌もしくは原虫に感染した細胞を標的とすることが観察されるγδ Ｔ細胞受容体から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0145】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記および他の科学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするためおよび／または容易に参照するために本明細書で定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、当技術分野で一般に理解されるものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
少なくとも１つの外因性ガンマデルタＴ細胞受容体（γδ ＴＣＲ）核酸分子を含有するように遺伝子改変された細胞である、操作された細胞。
（項目２）
前記細胞が多能性幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞または免疫細胞である、項目１に記載の操作された細胞。
（項目３）
前記細胞がヒト細胞である、項目１に記載の操作された細胞。
（項目４）
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、γδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体のクローンであるか、または前記γδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体の配列から改変された配列を有する、項目１に記載の操作された細胞。
（項目５）
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、ヒトγδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体のクローンであるか、または前記ヒトγδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体の配列から改変された配列を有する、項目１に記載の操作された細胞。
（項目６）
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、ヒトγδ Ｔ細胞受容体から得られた核酸配列を含む、項目１に記載の操作された細胞。
（項目７）
前記操作された細胞が外因性癌遺伝子を欠く、項目１に記載の操作された細胞。
（項目８）
前記ガンマデルタＴ細胞受容体核酸分子が、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする、項目１に記載の操作された細胞。
（項目９）
Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質導入された操作された細胞を含む組成物であって、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、組成物。
（項目１０）
Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を作製する方法であって、
前記少なくとも１つの外因性核酸分子によって形質導入された前記ヒト多能性細胞が、前記少なくとも１つの外因性核酸分子によってコードされるガンマ鎖ポリペプチドおよびデルタ鎖ポリペプチドを含むＴ細胞受容体を発現するように、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子でヒト造血幹細胞／前駆細胞を形質導入することと、
前記操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を作製するように前記ヒト造血幹細胞／前駆細胞を分化させることと
を含む、方法。
（項目１１）
前記方法が、
（ａ）第１のインビトロ培養物中で、形質導入されたヒト造血幹細胞／前駆細胞を分化することと、
（ｂ）第２のインビトロ培養物中で、（ａ）の分化された細胞を増殖させることと
をさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記造血幹細胞／前駆細胞が、フィーダー細胞を含まない培地中で培養され、および／または
前記造血幹細胞／前駆細胞が、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＭＣＰ－４、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌおよび／またはレトロネクチンのうちの１またはそれを超えるものを含む培地中で培養される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする前記核酸分子で形質導入された前記細胞をインビトロで増殖させることをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記操作された細胞のクローン集団をインビボで作製するために、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする前記核酸分子で形質導入された前記造血幹細胞／前駆細胞を対象に移植することをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記操作された機能的ガンマデルタＴ細胞が、
ＨＬＡ－Ｉ低／陰性、
ＨＬＡ－ＩＩ低／陰性、
ＨＬＡ－Ｅ陽性、ならびに
免疫調節遺伝子および／または自殺遺伝子を発現することのうちの少なくとも１つであることを特徴とする遺伝子発現プロファイルを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記外因性核酸分子が、レンチウイルス発現ベクターに含まれ、および／または
前記方法が、前記形質導入された細胞を、成長および／または分化を促進するように選択された作用物質と接触させることをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記方法が、前記形質導入された細胞を、末梢血単核細胞、抗原提示細胞または人工抗原提示細胞と共培養することをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記造血幹細胞／前駆細胞がＣＤ３４ ＋ 造血幹細胞または前駆細胞を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目２０）
項目１０から１９のいずれか一項に記載の方法によって生成された操作された機能的ガンマデルタＴ細胞。
（項目２１）
ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象を処置する方法であって、項目１から９または２０に記載の細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２２）
前記ガンマデルタＴ細胞が、ＣＤ３４ ＋ 造血幹細胞または前駆細胞に、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチド、Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチド、ＩＬ－１５および自殺遺伝子をコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を形質導入することによって作製される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ガンマデルタＴ細胞が、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象が癌と診断されている、または
前記ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象が、ウイルス感染、真菌感染または原虫感染と診断されている、
項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよびＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、癌細胞またはウイルス、真菌もしくは原虫に感染した細胞を標的とすることが観察されるγδ Ｔ細胞受容体から選択される、項目２１に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
少なくとも１つの外因性ガンマデルタＴ細胞受容体（γδ ＴＣＲ）核酸分子を含有するように遺伝子改変された細胞である、操作された細胞。
（項目２）
前記細胞が多能性幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞または免疫細胞である、項目１に記載の操作された細胞。
（項目３）
前記細胞がヒト細胞である、項目１に記載の操作された細胞。
（項目４）
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、γδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体のクローンであるか、または前記γδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体の配列から改変された配列を有する、項目１に記載の操作された細胞。
（項目５）
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、ヒトγδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体のクローンであるか、または前記ヒトγδ Ｔ細胞のＴ細胞受容体の配列から改変された配列を有する、項目１に記載の操作された細胞。
（項目６）
前記γδ ＴＣＲ核酸分子が、ヒトγδ Ｔ細胞受容体から得られた核酸配列を含む、項目１に記載の操作された細胞。
（項目７）
前記操作された細胞が外因性癌遺伝子を欠く、項目１に記載の操作された細胞。
（項目８）
前記ガンマデルタＴ細胞受容体核酸分子が、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする、項目１に記載の操作された細胞。
（項目９）
Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質導入された操作された細胞を含む組成物であって、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、組成物。
（項目１０）
Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を作製する方法であって、
前記少なくとも１つの外因性核酸分子によって形質導入された前記ヒト多能性細胞が、前記少なくとも１つの外因性核酸分子によってコードされるガンマ鎖ポリペプチドおよびデルタ鎖ポリペプチドを含むＴ細胞受容体を発現するように、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子でヒト造血幹細胞／前駆細胞を形質導入することと、
前記操作された機能的ガンマデルタＴ細胞を作製するように前記ヒト造血幹細胞／前駆細胞を分化させることと
を含む、方法。
（項目１１）
前記方法が、
（ａ）第１のインビトロ培養物中で、形質導入されたヒト造血幹細胞／前駆細胞を分化することと、
（ｂ）第２のインビトロ培養物中で、（ａ）の分化された細胞を増殖させることと
をさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記造血幹細胞／前駆細胞が、フィーダー細胞を含まない培地中で培養され、および／または
前記造血幹細胞／前駆細胞が、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＭＣＰ－４、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌおよび／またはレトロネクチンのうちの１またはそれを超えるものを含む培地中で培養される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／またはＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする前記核酸分子で形質導入された前記細胞をインビトロで増殖させることをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記操作された細胞のクローン集団をインビボで作製するために、前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドをコードする前記核酸分子で形質導入された前記造血幹細胞／前駆細胞を対象に移植することをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記操作された機能的ガンマデルタＴ細胞が、
ＨＬＡ－Ｉ低／陰性、
ＨＬＡ－ＩＩ低／陰性、
ＨＬＡ－Ｅ陽性、ならびに
免疫調節遺伝子および／または自殺遺伝子を発現することのうちの少なくとも１つであることを特徴とする遺伝子発現プロファイルを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記外因性核酸分子が、レンチウイルス発現ベクターに含まれ、および／または
前記方法が、前記形質導入された細胞を、成長および／または分化を促進するように選択された作用物質と接触させることをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記方法が、前記形質導入された細胞を、末梢血単核細胞、抗原提示細胞または人工抗原提示細胞と共培養することをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記造血幹細胞／前駆細胞がＣＤ３４ ＋ 造血幹細胞または前駆細胞を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよび／または前記Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目２０）
項目１０から１９のいずれか一項に記載の方法によって生成された操作された機能的ガンマデルタＴ細胞。
（項目２１）
ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象を処置する方法であって、項目１から９または２０に記載の細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２２）
前記ガンマデルタＴ細胞が、ＣＤ３４ ＋ 造血幹細胞または前駆細胞に、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチド、Ｔ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチド、ＩＬ－１５および自殺遺伝子をコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を形質導入することによって作製される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ガンマデルタＴ細胞が、配列番号１～配列番号５２に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象が癌と診断されている、または
前記ガンマデルタＴ細胞を必要とする対象が、ウイルス感染、真菌感染または原虫感染と診断されている、
項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記Ｔ細胞受容体ガンマ鎖ポリペプチドおよびＴ細胞受容体デルタ鎖ポリペプチドが、癌細胞またはウイルス、真菌もしくは原虫に感染した細胞を標的とすることが観察されるγδ Ｔ細胞受容体から選択される、項目２１に記載の方法。
【国際調査報告】