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特表2024-501022ＨＢＶを標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-10
(54)【発明の名称】ＨＢＶを標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20231227BHJP
C12N 15/51 20060101ALI20231227BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20231227BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20231227BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231227BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20231227BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231227BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20231227BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231227BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20231227BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/51 ZNA
C12N15/88 Z
C12N15/54
C12N5/10
A61P31/20
A61P43/00 121
A61K45/00
A61P1/16
A61P31/14
A61K31/7105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023539281
(86)(22)【出願日】2021-12-10
(85)【翻訳文提出日】2023-07-18
(86)【国際出願番号】 US2021062749
(87)【国際公開番号】W WO2022146654
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】63/131,145
(32)【優先日】2020-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516144072
【氏名又は名称】アークトゥルス セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】トレジェス， ラモン ディアス
(72)【発明者】
【氏名】ラム， マン ルー
(72)【発明者】
【氏名】タチカワ， キヨシ
(72)【発明者】
【氏名】カルマリ， プリヤ プラカシュ
(72)【発明者】
【氏名】チブクラ， パッドマナブ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA96Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA31
4B065CA44
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZB33
(57)【要約】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムを標的化するための転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードする核酸分子が記載される。また、ＴＡＬＥＮを含有する組成物、宿主細胞、脂質、及び薬学的組成物も記載される。本発明の薬学的組成物を使用して、特に慢性ＨＢＶ感染を有する個体において肝炎感染を治療するための方法も記載される。特定の実施形態において、第１及び第２のｍＲＮＡ分子は各々、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールのうちの１つ以上、好ましくは全てを更に含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肝炎感染の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、前記第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、前記第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、前記標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含むｍＲＮＡ分子の組み合わせを前記対象に投与することを含み、
前記第１のＴＡＬＥＮ単量体及び前記第２のＴＡＬＥＮ単量体は、前記第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが前記第１の半部位配列に結合し、前記第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが前記第２の半部位配列に結合する場合に、前記標的核酸配列を切断する二量体を形成することができ、
好ましくは、前記第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、前記第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである、方法。
【請求項2】
前記標的核酸配列が、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）をコードする配列内にあり、好ましくは、（ａ）前記標的核酸配列の前記第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、前記標的核酸配列の前記第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｂ）前記標的核酸配列の前記第１の半部位配列が、配列番号３の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、前記標的核酸配列の前記第２の半部位配列が、配列番号４の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｃ）前記標的核酸配列が、配列番号５若しくは配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１及び第２のｍＲＮＡ分子が各々、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールのうちの１つ以上、好ましくは全てを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
それぞれ、前記第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８又は配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインが各々、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＨＢＶゲノムが、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記対象に、好ましくは抗ＨＢＶ剤を含む第２の治療用組成物を投与することを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記対象が、ＨＢＶ感染、好ましくは慢性ＨＢＶ感染を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記対象が、ＨＢＶ及びＨＤＶに同時感染している、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
脂質ナノ粒子中に封入されたｍＲＮＡ分子の組み合わせを含む組成物であって、前記ｍＲＮＡ分子の組み合わせが、（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、前記第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、前記第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、前記標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含み、
前記第１のＴＡＬＥＮ単量体及び前記第２のＴＡＬＥＮ単量体は、前記第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが前記第１の半部位配列に結合し、前記第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが前記第２の半部位配列に結合する場合に、前記標的核酸配列を切断する二量体を形成することができ、
好ましくは、前記第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、前記第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである、組成物。
【請求項10】
前記標的核酸配列が、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）をコードする配列内にあり、好ましくは、（ａ）前記標的核酸配列の前記第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、前記標的核酸配列の前記第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｂ）前記標的核酸配列の前記第１の半部位配列が、配列番号３の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、前記標的核酸配列の前記第２の半部位配列が、配列番号４の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｃ）前記標的核酸配列が、配列番号５若しくは配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記第１及び第２のｍＲＮＡ分子が各々、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールのうちの１つ以上、好ましくは全てを更に含む、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項12】
それぞれ、前記第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８又は配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインが各々、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＨＢＶゲノムが、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記ｍＲＮＡ分子の組み合わせを封入する前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質と、アニオン性脂質、双性イオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、リン脂質、糖脂質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの他の脂質と、を含む、請求項９～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子であって、前記第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができ、前記第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子と、（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子であって、前記第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、前記標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができ、前記第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子と、の組み合わせであって、
前記第１のＴＡＬＥＮ単量体及び前記第２のＴＡＬＥＮ単量体は、前記第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが前記第１の半部位配列に結合し、前記第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが前記第２の半部位配列に結合する場合に、前記標的核酸配列を切断する二量体を形成することができる、組み合わせ。
【請求項16】
前記ＨＢＶゲノムが、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである、請求項１５に記載の組み合わせ。
【請求項17】
請求項１５又は１６に記載の組み合わせを含む組成物であって、前記第１及び第２の核酸が、脂質ナノ粒子中に別々に又は一緒に封入されている、組成物。
【請求項18】
請求項１５に記載の第１のｍＲＮＡ分子及び第２のｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをコードする、核酸分子。
【請求項19】
請求項１８に記載の核酸分子を含む、単離された宿主細胞。
【請求項20】
前記宿主細胞が肝細胞である、請求項１９に記載の単離された宿主細胞。
【請求項21】
請求項９～１４若しくは１７のいずれか一項に記載の組成物、請求項１５若しくは１６に記載の組み合わせ、請求項１８に記載の核酸分子、又は請求項１９若しくは２０に記載の単離された宿主細胞と、薬学的に受容可能な担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項22】
ＨＢＶゲノム中の標的核酸配列を切断する方法であって、前記ＨＢＶゲノムを、請求項９～１４若しくは１７のいずれか一項に記載の組成物、請求項１５若しくは１６に記載の組み合わせ、請求項１８に記載の核酸分子、請求項１９若しくは２０に記載の単離された宿主細胞、又は請求項２１に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項23】
ＨＢＶゲノム中の標的核酸配列の遺伝子編集を誘導するための方法であって、前記ＨＢＶゲノムを、請求項９～１４若しくは１７のいずれか一項に記載の組成物、請求項１５若しくは１６に記載の組み合わせ、請求項１８に記載の核酸分子、請求項１９若しくは２０に記載の単離された宿主細胞、又は請求項２１に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項24】
前記ＨＢＶゲノムが、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項25】
肝炎感染の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、請求項２１に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項26】
対象におけるＨＢＶの感染及び／又は複製を低減するための方法であって、請求項２１に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項27】
前記対象に、好ましくは抗ＨＢＶ剤を含む第２の治療用組成物を投与することを更に含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項28】
前記対象が、ＨＢＶ感染、好ましくは慢性ＨＢＶ感染を有する、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記対象が、ＨＢＶ及びＨＤＶに同時感染している、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ、又は組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡのうちの１つ以上の発現レベルが、前記対象において低減される、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記発現レベルが、肝細胞レベル、核若しくは細胞レベル、肝臓レベル、血清レベル、又は血漿レベルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
請求項１８に記載の核酸分子をインビトロ又はインビボで転写することを含む、ＴＡＬＥＮを産生する方法。
【請求項33】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導性疾患の治療を必要とする対象であって、好ましくは慢性ＨＢＶ感染を有する、対象においてその治療に使用するための、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項34】
前記ＨＢＶ誘導性疾患が、進行性線維症、肝硬変及び肝細胞がん（ＨＣＣ）からなる群から選択される、任意選択的に別の治療剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ剤と組み合わされた、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／１３１，１４５号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／１３１，１４５号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、一般に、遺伝子標的化及び遺伝子発現調節のための転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription activator-like effector nuclease、ＴＡＬＥＮ）配列の使用を含む、分子生物学及び遺伝子工学の分野に関する。
【0003】
電子的に提出された配列表への参照
本出願は、ファイル名「０６５８１４＿１１５１５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」及び２０２１年１２月７日の作成日を有し、９１ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ファイル名「０６５８１４＿１１５１５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」及び２０２１年１２月７日の作成日を有し、９１ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus、ＨＢＶ）は、４つのオープンリーディングフレーム及び７つのタンパク質をコードする小さな３．２ｋｂの肝指向性ＤＮＡウイルスである。約２０億人がＨＢＶに感染しており、約２億４０００万人が慢性Ｂ型肝炎感染（慢性ＨＢＶ）を有している。慢性Ｂ型肝炎感染は、血液中で６ヶ月超にわたって持続するウイルス及びサブウイルス粒子を特徴とする（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．（２０１１）１８（６），３７７－８３）。持続的なＨＢＶ感染は、ウイルスペプチド及び循環抗原によるＨＢＶ特異的Ｔ細胞受容体の慢性的な刺激を介して、循環及び肝臓内ＨＢＶ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴ細胞疲弊をもたらす。結果として、Ｔ細胞の多機能性が減少する（すなわち、ＩＬ－２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ（tumor necrosis factor））－α、ＩＦＮ－γのレベルの低下、及び増殖の欠如）。
【0005】
慢性ＨＢＶ（Chronic HBV、ＣＨＢ）は現在、ＩＦＮ－α及びヌクレオシド又はヌクレオチド類似体で治療されているが、ウイルスＲＮＡ、したがって新しいビリオンの鋳型として基本的な役割を果たす共有結合閉環状ＤＮＡ（covalently closed circular DNA、ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる細胞内ウイルス複製中間体が感染肝細胞内に残存するため、最終的には治癒しない。誘導されたウイルス特異的Ｔ細胞及びＢ細胞応答は、ｃｃｃＤＮＡを保有する肝細胞を効果的に排除し得ると考えられる。ＨＢＶポリメラーゼを標的とする現在の療法はウイルス血症を抑制するが、核内に存在するｃｃｃＤＮＡ及び循環抗原の関連産生に対して限られた効果しか与えない。治癒の最も厳密な形態は、生物からのＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの排除であり得、これは、自然の転帰としても、任意の治療的介入の結果としても観察されていない。しかしながら、ＨＢＶ表面抗原（HBV surface antigen、ＨＢｓＡｇ）の喪失は、臨床的に信頼できる治癒等価物である。その理由は、疾患の再発が重篤な免疫抑制の場合にしか起こり得ず、予防的処置によって予防できるからである。したがって、少なくとも臨床的観点から、ＨＢｓＡｇの喪失は、ＨＢＶに対する免疫再構成の最も厳格な形態に関連する。
【0006】
Ｄ型肝炎ウイルス（Hepatitis D virus、ＨＤＶ）感染は、ＨＤＶが感染性ウイルス粒子を形成するためにＨＢｓＡｇの存在を必要とするので、ＨＢＶとの同時感染の状況においてのみ生じる。同時感染は、肝硬変の早期発症、肝細胞がん（hepatocellular、ＨＣＣ）の発症リスクの増加、並びに肝臓関連及び全体的な死亡率の増加に関連する。
したがって、高い効率及び低減された細胞傷害性で、慢性的に感染した患者におけるＨＢＶゲノムの標的化切断を可能にする組成物及び方法を有することは有用である。
したがって、高い効率及び低減された細胞傷害性で、慢性的に感染した患者におけるＨＢＶゲノムの標的化切断を可能にする組成物及び方法を有することは有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．（２０１１）１８（６），３７７－８３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
したがって、肝炎、特にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、より具体的には慢性ＨＢＶの治療において、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ、具体的にはＨＢｓＡｇの標的遺伝子編集に対する医学的必要性は未だ満たされていない。本発明は、特定のＤＮＡ配列の指向性切断を誘導するための組成物及び方法を提供することによって、この必要性を満たす。
【0009】
一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、肝炎感染の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含む、ｍＲＮＡ分子の組み合わせを対象に投与することを含み、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができ、
好ましくは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである、方法である。
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含む、ｍＲＮＡ分子の組み合わせを対象に投与することを含み、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができ、
好ましくは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである、方法である。
【0010】
特定の実施形態において、標的核酸配列は、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶポリメラーゼ（polymerase、ｐｏｌ）をコードする配列内にあり、好ましくは
（ａ）標的核酸配列の第１の半部位配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｂ）標的核酸配列の第１の半部位配列は、配列番号３の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列は、配列番号４の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｃ）標的核酸配列は、配列番号５若しくは配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
（ａ）標的核酸配列の第１の半部位配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｂ）標的核酸配列の第１の半部位配列は、配列番号３の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列は、配列番号４の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｃ）標的核酸配列は、配列番号５若しくは配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
【0011】
特定の実施形態において、第１及び第２のｍＲＮＡ分子は各々、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールのうちの１つ以上、好ましくは全てを更に含む。
【0012】
特定の実施形態において、それぞれ、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８又は配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインは各々、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0013】
特定の実施形態において、ＨＢＶゲノムは、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである。
【0014】
特定の実施形態において、本方法は、好ましくは抗ＨＢＶ剤を含む第２の治療用組成物を対象に投与することを更に含む。
【0015】
特定の実施形態において、対象は、ＨＢＶ感染、好ましくは慢性ＨＢＶ感染を有する。
【0016】
特定の実施形態において、対象は、ＨＢＶ及びＨＤＶに同時感染している。
【0017】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、脂質ナノ粒子中に封入されたｍＲＮＡ分子の組み合わせを含む組成物であって、ｍＲＮＡ分子の組み合わせが、
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含み、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができ、
好ましくは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである、組成物である。
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含み、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができ、
好ましくは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである、組成物である。
【0018】
特定の実施形態において、標的核酸配列は、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）をコードする配列内にあり、好ましくは
（ａ）標的核酸配列の第１の半部位配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｂ）標的核酸配列の第１の半部位配列は、配列番号３の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列は、配列番号４の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｃ）標的核酸配列は、配列番号５若しくは配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
（ａ）標的核酸配列の第１の半部位配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｂ）標的核酸配列の第１の半部位配列は、配列番号３の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列は、配列番号４の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
（ｃ）標的核酸配列は、配列番号５若しくは配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
【0019】
特定の実施形態において、第１及び第２のｍＲＮＡ分子は各々、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールのうちの１つ以上、好ましくは全てを更に含む。
【0020】
特定の実施形態において、それぞれ、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８又は配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインは各々、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0021】
特定の実施形態において、ＨＢＶゲノムは、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである。
【0022】
特定の実施形態において、ｍＲＮＡ分子の組み合わせを封入する脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質と、アニオン性脂質、双性イオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、リン脂質、糖脂質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの他の脂質と、を含む。
【0023】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができ、第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができ、第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子と、の組み合わせであって、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができる、組み合わせである。
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができ、第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができ、第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子と、の組み合わせであって、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができる、組み合わせである。
【0024】
特定の実施形態において、ＨＢＶゲノムは、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである。
【0025】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される第１の核酸と第２の核酸との組み合わせを含む組成物であって、第１及び第２の核酸が、脂質ナノ粒子中に別々に又は一緒に封入されている、組成物である。
【0026】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の第１のｍＲＮＡ分子及び第２のｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをコードする、核酸分子である。
【0027】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の核酸分子を含む、単離された宿主細胞である。
【0028】
特定の実施形態において、宿主細胞は肝細胞である。
【0029】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の組成物、本明細書に記載の組み合わせ、本明細書に記載の核酸分子、又は本明細書に記載の単離された宿主細胞と、薬学的に受容可能な担体と、を含む、薬学的組成物である。
【0030】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、ＨＢＶゲノム中の標的核酸配列を切断する方法であって、ＨＢＶゲノムを、本明細書に記載の組成物、本明細書に記載の組み合わせ、本明細書に記載の核酸分子、本明細書に記載の単離された宿主細胞、又は本明細書に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法である。
【0031】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、ＨＢＶゲノム中の標的核酸配列の遺伝子編集を誘導するための方法であって、ＨＢＶゲノムを、本明細書に記載の組成物、本明細書に記載の組み合わせ、本明細書に記載の核酸分子、本明細書に記載の単離された宿主細胞、又は本明細書に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法である。
【0032】
特定の実施形態において、ＨＢＶゲノムは、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである。
【0033】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、肝炎感染の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法である。
【0034】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、対象におけるＨＢＶの感染及び／又は複製を低減するための方法であって、本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法である。
【0035】
特定の実施形態において、本方法は、好ましくは抗ＨＢＶ剤を含む第２の治療用組成物を対象に投与することを更に含む。
【0036】
特定の実施形態において、対象は、ＨＢＶ感染、好ましくは慢性ＨＢＶ感染を有する。
【0037】
特定の実施形態において、対象は、ＨＢＶ及びＨＤＶに同時感染している。
【0038】
特定の実施形態において、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ、又は組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡのうちの１つ以上の発現レベルが、対象において低減される。特定の実施形態において、発現レベルは、肝細胞レベル、核若しくは細胞レベル、肝臓レベル、血清レベル、又は血漿レベルである。
【0039】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される核酸分子をインビトロ又はインビボで転写することを含む、ＴＡＬＥＮを産生する方法である。
【0040】
別の一般的な態様において、本明細書で提供されるのは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導性疾患の治療を必要とする対象であって、好ましくは慢性ＨＢＶ感染を有する、対象においてその治療に使用するための、本明細書に記載の薬学的組成物である。
【0041】
特定の実施形態において、ＨＢＶ誘導性疾患は、進行性線維症、肝硬変及び肝細胞がん（ＨＣＣ）からなる群から選択され、任意選択的に別の治療剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ剤と組み合わされる。
【0042】
本発明の他の態様、特徴及び利点は、本発明の詳細な説明及びその好ましい実施形態並びに添付の特許請求の範囲を含む以下の開示から明らかになるであろう。
【0043】
本発明の前述の概要並びに以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、より良く理解されるであろう。本発明は、図面に示される正確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、請求及び必要な手数料の支払いに応じて、特許庁によって提供される。
特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、請求及び必要な手数料の支払いに応じて、特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1A】ＨＢＶ ＤＮＡゲノム内のＴＡＬＥＮ ２８及び３３の標的部位を示す。図１Ａ：ＨＢＶゲノム及びウイルスタンパク質（ｐｒｅＣ／Ｃｏｒｅ、ｐｏｌ、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、ＨＢｓＡｇ、及びＨＢｘ）の重複オープンリーディングフレームの概略図。ＴＡＬＥＮ ２８及び３３は、ＨＢｓＡｇ／ｐｏｌをコードする遺伝子内の部位を標的とする。図１Ｂ：ＴＡＬＥＮ２８（上、配列番号５）及びＴＡＬＥＮ３３（下、配列番号６）の左及び右のＴＡＬＥＮアームが標的とするＨＢＶ ＤＮＡ配列。図１Ｃ：ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ構築物の概略図。ＨＢＶ ＤＮＡ結合ドメインは、１５～１９個のＴＡＬＥ反復のアレイ内に位置し、それらの各々は、ＨＢＶ配列を標的とするように設計された反復可変二残基（Repeat Variable Diresidue、ＲＶＤ）として知られる２つのアミノ酸を含有する。
【図1B】ＨＢＶ ＤＮＡゲノム内のＴＡＬＥＮ ２８及び３３の標的部位を示す。図１Ａ：ＨＢＶゲノム及びウイルスタンパク質（ｐｒｅＣ／Ｃｏｒｅ、ｐｏｌ、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、ＨＢｓＡｇ、及びＨＢｘ）の重複オープンリーディングフレームの概略図。ＴＡＬＥＮ ２８及び３３は、ＨＢｓＡｇ／ｐｏｌをコードする遺伝子内の部位を標的とする。図１Ｂ：ＴＡＬＥＮ２８（上、配列番号５）及びＴＡＬＥＮ３３（下、配列番号６）の左及び右のＴＡＬＥＮアームが標的とするＨＢＶ ＤＮＡ配列。図１Ｃ：ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ構築物の概略図。ＨＢＶ ＤＮＡ結合ドメインは、１５～１９個のＴＡＬＥ反復のアレイ内に位置し、それらの各々は、ＨＢＶ配列を標的とするように設計された反復可変二残基（Repeat Variable Diresidue、ＲＶＤ）として知られる２つのアミノ酸を含有する。
【図1C】ＨＢＶ ＤＮＡゲノム内のＴＡＬＥＮ ２８及び３３の標的部位を示す。図１Ａ：ＨＢＶゲノム及びウイルスタンパク質（ｐｒｅＣ／Ｃｏｒｅ、ｐｏｌ、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、ＨＢｓＡｇ、及びＨＢｘ）の重複オープンリーディングフレームの概略図。ＴＡＬＥＮ ２８及び３３は、ＨＢｓＡｇ／ｐｏｌをコードする遺伝子内の部位を標的とする。図１Ｂ：ＴＡＬＥＮ２８（上、配列番号５）及びＴＡＬＥＮ３３（下、配列番号６）の左及び右のＴＡＬＥＮアームが標的とするＨＢＶ ＤＮＡ配列。図１Ｃ：ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ構築物の概略図。ＨＢＶ ＤＮＡ結合ドメインは、１５～１９個のＴＡＬＥ反復のアレイ内に位置し、それらの各々は、ＨＢＶ配列を標的とするように設計された反復可変二残基（Repeat Variable Diresidue、ＲＶＤ）として知られる２つのアミノ酸を含有する。
【図2A】ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ２８標的配列保存分析を示す。保存ロゴは、ＴＡＬＥＮ ２８の左（図２Ａ）アーム及び右（図２Ｂ）アームについての各標的ヌクレオチドの存在量に基づいて作成した。保存性が高いほど、豊富なヌクレオチドのサイズが大きくなる。
【図2B】ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ２８標的配列保存分析を示す。保存ロゴは、ＴＡＬＥＮ ２８の左（図２Ａ）アーム及び右（図２Ｂ）アームについての各標的ヌクレオチドの存在量に基づいて作成した。保存性が高いほど、豊富なヌクレオチドのサイズが大きくなる。
【図3A】ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ３３標的配列保存分析を示す。保存ロゴは、ＴＡＬＥＮ ３３の左（図３Ａ）アーム及び右（図３Ｂ）アームについての各標的ヌクレオチドの存在量に基づいて作成した。保存性が高いほど、豊富なヌクレオチドのサイズが大きくなる。
【図3B】ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ３３標的配列保存分析を示す。保存ロゴは、ＴＡＬＥＮ ３３の左（図３Ａ）アーム及び右（図３Ｂ）アームについての各標的ヌクレオチドの存在量に基づいて作成した。保存性が高いほど、豊富なヌクレオチドのサイズが大きくなる。
【図4A】ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３が広範なＨＢＶ遺伝子型範囲を標的とすることを示す。ＴＡＬＥＮ ２８（図４Ａ）及びＴＡＬＥＮ ３３（図４Ｂ）のそれぞれの左ＴＡＬＥＮは、高度に保存された配列を標的とし、右ＴＡＬＥＮアーム内の遺伝子型（genotype、ＧＴ）Ａ及びＧＴ Ｃに単一のミスマッチが観察される。図４Ｃは、ＧＴ Ａ～ＨからのＨＢＶ ＤＮＡ単離物に対するインビトロ翻訳ＴＡＬＥＮタンパク質のＤＮＡ切断結果を示す。
【図4B】ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３が広範なＨＢＶ遺伝子型範囲を標的とすることを示す。ＴＡＬＥＮ ２８（図４Ａ）及びＴＡＬＥＮ ３３（図４Ｂ）のそれぞれの左ＴＡＬＥＮは、高度に保存された配列を標的とし、右ＴＡＬＥＮアーム内の遺伝子型（genotype、ＧＴ）Ａ及びＧＴ Ｃに単一のミスマッチが観察される。図４Ｃは、ＧＴ Ａ～ＨからのＨＢＶ ＤＮＡ単離物に対するインビトロ翻訳ＴＡＬＥＮタンパク質のＤＮＡ切断結果を示す。
【図4C】ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３が広範なＨＢＶ遺伝子型範囲を標的とすることを示す。ＴＡＬＥＮ ２８（図４Ａ）及びＴＡＬＥＮ ３３（図４Ｂ）のそれぞれの左ＴＡＬＥＮは、高度に保存された配列を標的とし、右ＴＡＬＥＮアーム内の遺伝子型（genotype、ＧＴ）Ａ及びＧＴ Ｃに単一のミスマッチが観察される。図４Ｃは、ＧＴ Ａ～ＨからのＨＢＶ ＤＮＡ単離物に対するインビトロ翻訳ＴＡＬＥＮタンパク質のＤＮＡ切断結果を示す。
【図5A】ＨｅｐＧ２．２．１５細胞におけるＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３の効果を示す。図５Ａ：ＴＡＬＥＮプラスミドをインビトロで転写し、細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、核をＤＡＰＩで染色し、核内でのＴＡＬＥＮ発現を免疫蛍光法によって確認した。６日後、細胞を、細胞培養培地中のＨＢｓＡｇ分泌タンパク質レベル（図５Ｂ）、細胞生存率（図５Ｃ）及びＨＢＶ ＤＮＡ遺伝子編集（図５Ｄ）に対するＴＡＬＥＮ活性の効果について評価した。
【図5B】ＨｅｐＧ２．２．１５細胞におけるＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３の効果を示す。図５Ａ：ＴＡＬＥＮプラスミドをインビトロで転写し、細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、核をＤＡＰＩで染色し、核内でのＴＡＬＥＮ発現を免疫蛍光法によって確認した。６日後、細胞を、細胞培養培地中のＨＢｓＡｇ分泌タンパク質レベル（図５Ｂ）、細胞生存率（図５Ｃ）及びＨＢＶ ＤＮＡ遺伝子編集（図５Ｄ）に対するＴＡＬＥＮ活性の効果について評価した。
【図5C】ＨｅｐＧ２．２．１５細胞におけるＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３の効果を示す。図５Ａ：ＴＡＬＥＮプラスミドをインビトロで転写し、細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、核をＤＡＰＩで染色し、核内でのＴＡＬＥＮ発現を免疫蛍光法によって確認した。６日後、細胞を、細胞培養培地中のＨＢｓＡｇ分泌タンパク質レベル（図５Ｂ）、細胞生存率（図５Ｃ）及びＨＢＶ ＤＮＡ遺伝子編集（図５Ｄ）に対するＴＡＬＥＮ活性の効果について評価した。
【図5D】ＨｅｐＧ２．２．１５細胞におけるＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３の効果を示す。図５Ａ：ＴＡＬＥＮプラスミドをインビトロで転写し、細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、核をＤＡＰＩで染色し、核内でのＴＡＬＥＮ発現を免疫蛍光法によって確認した。６日後、細胞を、細胞培養培地中のＨＢｓＡｇ分泌タンパク質レベル（図５Ｂ）、細胞生存率（図５Ｃ）及びＨＢＶ ＤＮＡ遺伝子編集（図５Ｄ）に対するＴＡＬＥＮ活性の効果について評価した。
【図6A】ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞（primary human hepatocyte、ＰＨＨ）におけるＴＡＬＥＮ ２８の効果を示す。図６Ａ：ＰＨＨを用いたＨＢＶ感染及びＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの概略図。ＨＢＶ感染後５日目に、ＴＡＬＥＮ ２８ ｍＲＮＡ対を用いて又は用いずにＰＨＨを処置した。図６Ｂ：ＴＡＬＥＮ ２８の発現を免疫蛍光法（赤色）によって検出し、トランスフェクションの６時間後にＤＡＰＩ（青色）を用いて細胞核を染色した。図６Ｃ：ＴＡＬＥＮ ２８処置細胞からのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ産生に対する抗ウイルス効果。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを感染後１１日目に測定した。図６Ｄ：ＴＡＬＥＮ誘導性の標的化ｃｃｃＤＮＡ配列破壊を、ＴＡＬＥＮ処置の６日後にＴ７Ｅ１消化アッセイによって調べた。星印は、破壊された配列を示す。図６Ｅ：遺伝子編集されたｃｃｃＤＮＡは、ＴＡＬＥＮ ２８標的配列内にほとんどの欠失を示した。配列を次世代配列決定によって分析した。
【図6B】ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞（primary human hepatocyte、ＰＨＨ）におけるＴＡＬＥＮ ２８の効果を示す。図６Ａ：ＰＨＨを用いたＨＢＶ感染及びＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの概略図。ＨＢＶ感染後５日目に、ＴＡＬＥＮ ２８ ｍＲＮＡ対を用いて又は用いずにＰＨＨを処置した。図６Ｂ：ＴＡＬＥＮ ２８の発現を免疫蛍光法（赤色）によって検出し、トランスフェクションの６時間後にＤＡＰＩ（青色）を用いて細胞核を染色した。図６Ｃ：ＴＡＬＥＮ ２８処置細胞からのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ産生に対する抗ウイルス効果。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを感染後１１日目に測定した。図６Ｄ：ＴＡＬＥＮ誘導性の標的化ｃｃｃＤＮＡ配列破壊を、ＴＡＬＥＮ処置の６日後にＴ７Ｅ１消化アッセイによって調べた。星印は、破壊された配列を示す。図６Ｅ：遺伝子編集されたｃｃｃＤＮＡは、ＴＡＬＥＮ ２８標的配列内にほとんどの欠失を示した。配列を次世代配列決定によって分析した。
【図6C】ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞（primary human hepatocyte、ＰＨＨ）におけるＴＡＬＥＮ ２８の効果を示す。図６Ａ：ＰＨＨを用いたＨＢＶ感染及びＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの概略図。ＨＢＶ感染後５日目に、ＴＡＬＥＮ ２８ ｍＲＮＡ対を用いて又は用いずにＰＨＨを処置した。図６Ｂ：ＴＡＬＥＮ ２８の発現を免疫蛍光法（赤色）によって検出し、トランスフェクションの６時間後にＤＡＰＩ（青色）を用いて細胞核を染色した。図６Ｃ：ＴＡＬＥＮ ２８処置細胞からのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ産生に対する抗ウイルス効果。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを感染後１１日目に測定した。図６Ｄ：ＴＡＬＥＮ誘導性の標的化ｃｃｃＤＮＡ配列破壊を、ＴＡＬＥＮ処置の６日後にＴ７Ｅ１消化アッセイによって調べた。星印は、破壊された配列を示す。図６Ｅ：遺伝子編集されたｃｃｃＤＮＡは、ＴＡＬＥＮ ２８標的配列内にほとんどの欠失を示した。配列を次世代配列決定によって分析した。
【図6D】ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞（primary human hepatocyte、ＰＨＨ）におけるＴＡＬＥＮ ２８の効果を示す。図６Ａ：ＰＨＨを用いたＨＢＶ感染及びＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの概略図。ＨＢＶ感染後５日目に、ＴＡＬＥＮ ２８ ｍＲＮＡ対を用いて又は用いずにＰＨＨを処置した。図６Ｂ：ＴＡＬＥＮ ２８の発現を免疫蛍光法（赤色）によって検出し、トランスフェクションの６時間後にＤＡＰＩ（青色）を用いて細胞核を染色した。図６Ｃ：ＴＡＬＥＮ ２８処置細胞からのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ産生に対する抗ウイルス効果。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを感染後１１日目に測定した。図６Ｄ：ＴＡＬＥＮ誘導性の標的化ｃｃｃＤＮＡ配列破壊を、ＴＡＬＥＮ処置の６日後にＴ７Ｅ１消化アッセイによって調べた。星印は、破壊された配列を示す。図６Ｅ：遺伝子編集されたｃｃｃＤＮＡは、ＴＡＬＥＮ ２８標的配列内にほとんどの欠失を示した。配列を次世代配列決定によって分析した。
【図6E】ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞（primary human hepatocyte、ＰＨＨ）におけるＴＡＬＥＮ ２８の効果を示す。図６Ａ：ＰＨＨを用いたＨＢＶ感染及びＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの概略図。ＨＢＶ感染後５日目に、ＴＡＬＥＮ ２８ ｍＲＮＡ対を用いて又は用いずにＰＨＨを処置した。図６Ｂ：ＴＡＬＥＮ ２８の発現を免疫蛍光法（赤色）によって検出し、トランスフェクションの６時間後にＤＡＰＩ（青色）を用いて細胞核を染色した。図６Ｃ：ＴＡＬＥＮ ２８処置細胞からのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ産生に対する抗ウイルス効果。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを感染後１１日目に測定した。図６Ｄ：ＴＡＬＥＮ誘導性の標的化ｃｃｃＤＮＡ配列破壊を、ＴＡＬＥＮ処置の６日後にＴ７Ｅ１消化アッセイによって調べた。星印は、破壊された配列を示す。図６Ｅ：遺伝子編集されたｃｃｃＤＮＡは、ＴＡＬＥＮ ２８標的配列内にほとんどの欠失を示した。配列を次世代配列決定によって分析した。
【図7A】ＨＢＶ感染ＰＨＨにおけるＴＡＬＥＮ ３３の効果を示す。図７Ａ：ＰＨＨを用いたＨＢＶ感染及びＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの概略図。ＨＢＶ感染後５日目に、ｆＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡ対を用いて又は用いずにＰＨＨを処置した。図７Ｂ：ＴＡＬＥＮ ３３の発現を免疫蛍光法（緑色）によって検出し、トランスフェクションの６時間後にＤＡＰＩ（青色）を用いて細胞核を染色した。図７Ｃ：ＴＡＬＥＮ ３３処置細胞からのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ産生に対する抗ウイルス効果。ＴＡＬＥＮ ３３の存在下又は不在下でのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを、感染後１１日目に測定した。データは、少なくとも３つの独立した研究から計算し、エラーバーを有する平均値を表す。図７Ｄ：ＴＡＬＥＮ誘導性の標的化ｃｃｃＤＮＡ配列破壊を、Ｔ７Ｅ１消化アッセイによって調べた。星印は、破壊された配列を示す。
【図7B】ＨＢＶ感染ＰＨＨにおけるＴＡＬＥＮ ３３の効果を示す。図７Ａ：ＰＨＨを用いたＨＢＶ感染及びＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの概略図。ＨＢＶ感染後５日目に、ｆＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡ対を用いて又は用いずにＰＨＨを処置した。図７Ｂ：ＴＡＬＥＮ ３３の発現を免疫蛍光法（緑色）によって検出し、トランスフェクションの６時間後にＤＡＰＩ（青色）を用いて細胞核を染色した。図７Ｃ：ＴＡＬＥＮ ３３処置細胞からのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ産生に対する抗ウイルス効果。ＴＡＬＥＮ ３３の存在下又は不在下でのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを、感染後１１日目に測定した。データは、少なくとも３つの独立した研究から計算し、エラーバーを有する平均値を表す。図７Ｄ：ＴＡＬＥＮ誘導性の標的化ｃｃｃＤＮＡ配列破壊を、Ｔ７Ｅ１消化アッセイによって調べた。星印は、破壊された配列を示す。
【図7C】ＨＢＶ感染ＰＨＨにおけるＴＡＬＥＮ ３３の効果を示す。図７Ａ：ＰＨＨを用いたＨＢＶ感染及びＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの概略図。ＨＢＶ感染後５日目に、ｆＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡ対を用いて又は用いずにＰＨＨを処置した。図７Ｂ：ＴＡＬＥＮ ３３の発現を免疫蛍光法（緑色）によって検出し、トランスフェクションの６時間後にＤＡＰＩ（青色）を用いて細胞核を染色した。図７Ｃ：ＴＡＬＥＮ ３３処置細胞からのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ産生に対する抗ウイルス効果。ＴＡＬＥＮ ３３の存在下又は不在下でのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを、感染後１１日目に測定した。データは、少なくとも３つの独立した研究から計算し、エラーバーを有する平均値を表す。図７Ｄ：ＴＡＬＥＮ誘導性の標的化ｃｃｃＤＮＡ配列破壊を、Ｔ７Ｅ１消化アッセイによって調べた。星印は、破壊された配列を示す。
【図7D】ＨＢＶ感染ＰＨＨにおけるＴＡＬＥＮ ３３の効果を示す。図７Ａ：ＰＨＨを用いたＨＢＶ感染及びＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの概略図。ＨＢＶ感染後５日目に、ｆＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡ対を用いて又は用いずにＰＨＨを処置した。図７Ｂ：ＴＡＬＥＮ ３３の発現を免疫蛍光法（緑色）によって検出し、トランスフェクションの６時間後にＤＡＰＩ（青色）を用いて細胞核を染色した。図７Ｃ：ＴＡＬＥＮ ３３処置細胞からのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ産生に対する抗ウイルス効果。ＴＡＬＥＮ ３３の存在下又は不在下でのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを、感染後１１日目に測定した。データは、少なくとも３つの独立した研究から計算し、エラーバーを有する平均値を表す。図７Ｄ：ＴＡＬＥＮ誘導性の標的化ｃｃｃＤＮＡ配列破壊を、Ｔ７Ｅ１消化アッセイによって調べた。星印は、破壊された配列を示す。
【図8】ＴＡＬＥＮ ３３が、ＨＢＶ ＧＴ Ａ～Ｄに感染したＰＨＨ由来のｃｃｃＤＮＡを編集したことを示す。Ｔ７Ｅ１アッセイを、ＴＡＬＥＮ ３３をコードするｍＲＮＡ対で処置した（＋）又は処置していない（－）ＨＢＶ感染ＰＨＨから抽出したｃｃｃＤＮＡに対して実行した。星印は、破壊された配列を示す。
【図9A】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ－ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）に封入されたＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡ対が、血清ＨＢｓＡｇ（図９Ａ）及び血清ＨＢＶ ＤＮＡ（図９Ｂ）を低減し、ＡＡＶ－ＨＢＶ感染マウスにおいて用量依存的遺伝子編集活性（図９Ｃ）を示したことを示す。
【図9B】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ－ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）に封入されたＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡ対が、血清ＨＢｓＡｇ（図９Ａ）及び血清ＨＢＶ ＤＮＡ（図９Ｂ）を低減し、ＡＡＶ－ＨＢＶ感染マウスにおいて用量依存的遺伝子編集活性（図９Ｃ）を示したことを示す。
【図9C】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ－ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）に封入されたＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡ対が、血清ＨＢｓＡｇ（図９Ａ）及び血清ＨＢＶ ＤＮＡ（図９Ｂ）を低減し、ＡＡＶ－ＨＢＶ感染マウスにおいて用量依存的遺伝子編集活性（図９Ｃ）を示したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0045】
様々な刊行物、論文及び特許が、背景技術及び本明細書全体において引用又は記載されている。これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品などに関する考察は、本発明の内容を提供する目的のためである。そのような考察は、これらの事項のいずれか又は全てが、開示又は特許請求される任意の発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
【0046】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。本明細書において引用した全ての特許、公開された特許出願、及び刊行物は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
【0047】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形を含むことに留意されたい。
【0048】
特に明記しない限り、本明細書に記載される配列同一性％又は配列同一性％範囲などの任意の数値は、全ての事例において「約（about）」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載された値の±１０％を含む。例えば、１０ｍｇの投与量は、９ｍｇ～１１ｍｇを含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用は、文脈が明らかに他を示さない限り、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値（そのような範囲内の整数及び値の分数を含む）を明示的に含む。
【0049】
本明細書で使用される場合、複数の記載された要素間の接続詞「及び／又は」は、個々の選択肢及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって結合される場合、第１の選択肢は、第２の要素を伴わずに第１の要素を適用できることを指す。第２の選択肢は、第１の要素を伴わずに第２の要素を適用できることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素を一緒に適用できることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、その意味の範囲内に入ると理解され、したがって、本明細書で使用される用語「及び／又は」の要件を満たす。選択肢のうちの２つ以上の同時適用可能性もまた、その意味の範囲内にあると理解され、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たす。
【0050】
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連の要素内の全ての要素を指すものと理解されたい。当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0051】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「含む（comprise）」並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を排除することを意味しないことが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」若しくは「含む（including）」という用語で置き換えることができ、又は本明細書で使用される場合、「有する（having）」という用語で置き換えることもできる。
【0052】
本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素に明記されていない任意の要素、ステップ、又は構成要素を除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又はステップを除外しない。「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」及び「有する（having）」という前述の用語はいずれも、本発明の態様又は実施形態の文脈において本明細書で使用されるときはいつでも、「からなる（consisting of）」又は「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語で置き換えて、本開示の範囲を変えることができる。
【0053】
「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び核酸類似体を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む核酸分子を含む、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の両方を指す。「相補的ヌクレオチド塩基」という用語は、互いに水素結合を形成する一対のヌクレオチド塩基を意味する。アデニン（Adenine、Ａ）は、ＲＮＡ中のチミン（thymine、Ｔ）又はウラシル（uracil、Ｕ）と対合し、グアニン（guanine、Ｇ）はシトシン（cytosine、Ｃ）と対合する。互いにハイブリダイズする（すなわち、水素結合によって接合する）核酸の相補的セグメント又は鎖。「相補的」とは、核酸が、伝統的なワトソン－クリック又は他の非伝統的な結合様式のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。核酸分子は、任意の三次元構造を有し得る。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）であり得る。核酸分子の非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、核酸プローブ及び核酸プライマーが挙げられる。核酸分子は、非従来型又は修飾ヌクレオチドを含有し得る。「ポリヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、本明細書で互換的に使用される場合、ポリヌクレオチド分子の配列を指す。
【0054】
「パーセント（％）配列同一性」又は「％同一性」又は「～と％同一」という語句は、アミノ酸配列に関して使用される場合、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較した、２つ以上のアラインメントされたアミノ酸配列の同一アミノ酸のマッチ（「ヒット」）の数を記載する。言い換えれば、アラインメントを使用して、２つ以上の配列について、同じであるアミノ酸残基のパーセンテージ（例えば、アミノ酸配列の全長にわたって９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性）は、配列を比較し、当技術分野で既知の配列比較アルゴリズムを使用して測定される最大一致についてアラインメントさせる場合、又は手動でアラインメントさせ、視覚的に検査する場合に決定することができる。同じ決定をヌクレオチド配列について行うことができる。したがって、配列同一性を決定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加又は欠失によって異なる場合がある。タンパク質配列をアラインメントさせるための好適なプログラムは、当業者に既知である。タンパク質配列の配列同一性パーセンテージは、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。
【0055】
本明細書で使用される場合、「結合」又は「特異的結合」という用語は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合性相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）。
【0056】
本明細書中で使用される場合、「組み合わせ」、「組み合わせて」、「と組み合わせて」、「共送達」、及び「と一緒に投与される」という用語及び語句は、２つ以上の療法又は成分（例えば、２つの核酸分子（ｍＲＮＡ分子など）又は治療用組成物と脂質）の対象への投与の文脈では、２つ以上の療法又は成分の同時投与を指す。「同時投与」は、少なくとも同日内に２つの成分を投与することであり得る。２つの成分が「～と一緒に投与される」又は「～と組み合わせて投与される」場合、それらは、２４時間、２０時間、１６時間、１２時間、８時間若しくは４時間、又は１時間以内などの短い期間内に連続して別々の組成物で投与され得るか、又はそれらは、同時に単一の組成物で投与され得る。「～と組み合わせて」という用語の使用は、療法又は成分が対象に投与される順序を制限しない。例えば、第１の療法又は成分（例えば、第１の核酸分子）は、第２の療法又は成分（例えば、第２の核酸分子）の投与の前（例えば、５分～１時間前）、それと同時若しくは同時に、又はその後（例えば、５分～１時間後）に投与することができる。いくつかの実施形態において、第１の療法又は成分（例えば、第１の核酸分子）及び第２の療法又は成分（例えば、例えば、第２の核酸分子）は、同じ組成物中で投与される。他の実施形態において、第１の治療又は成分（例えば、第１の核酸分子）及び第２の治療又は成分（例えば、例えば、第２の核酸分子）は、別々の組成物で投与される。
【0057】
「細胞傷害性」という用語は、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、又はそれらの組み合わせを死滅させること、又はそれらに対して有害な、毒性の、若しくは致死的な効果を引き起こすことを指す。
【0058】
「送達」という用語は、化合物、物質、実体、部分、カーゴ又はペイロードを送達する行為又は様式を指す。
【0059】
「送達剤」という用語は、標的細胞へのポリヌクレオチドのインビボ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
【0060】
「操作された」という用語は、構造的又は化学的にかかわらず、出発点、野生型又は天然分子から変化する特徴又は特性を有するように設計された分子を指す。
【0061】
核酸配列の「発現」という用語は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端プロセシングによる）、（３）ＲＮＡのポリペプチド又はタンパク質への翻訳、及び（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。
【0062】
「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含み、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする有機化合物を意味する。脂質は、通常、少なくとも３つのクラスに分類される：（１）脂肪及び油及びワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」、並びに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。
【0063】
「脂質送達ビヒクル」という用語は、治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するために使用することができる脂質製剤を意味する。脂質送達ビヒクルは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、リン脂質）、粒子の凝集を防止するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質）、及び任意選択的にコレステロールから形成され得る核酸－脂質粒子であり得る。典型的には、治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、粒子の脂質部分に封入されてもよく、それによってそれを酵素分解から保護する。
【0064】
「脂質封入された」という用語は、完全な封入、部分的な封入、又はその両方を有するｍＲＮＡなどの治療用核酸を提供する脂質粒子を意味する。好ましい実施形態において、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、脂質粒子中に完全に封入される。
【0065】
本明細書中で使用される場合、「天然に存在しない」核酸又はポリペプチドは、天然に存在しない核酸又はポリペプチドを指す。「天然に存在しない」核酸又はポリペプチドは、実験室及び／又は製造環境において合成、処理、製作、及び／又は他の方法で操作することができる。場合によっては、天然に存在しない核酸又はポリペプチドは、処理前に天然に存在する核酸又はポリペプチドに存在しなかった特性を示すように処理、加工、又は操作された天然に存在する核酸又はポリペプチドを含むことができる。本明細書中で使用される場合、「天然に存在しない」核酸又はポリペプチドは、それが発見された天然の供給源から単離又は分離された核酸又はポリペプチドであり得、天然の供給源においてそれが会合していた配列に対する共有結合を欠く。「天然に存在しない」核酸又はポリペプチドは、組換えにより、又は化学合成などの他の方法を介して作製することができる。
【0066】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結された」とは、そのように記載される成分が、それらの意図される様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、連結又は並置を指す。例えば、目的の核酸配列に作動可能に連結された調節配列は、目的の核酸配列の転写を指向し得るか、又は目的のアミノ酸配列に作動可能に連結されたシグナル配列は、膜を越えて目的のアミノ酸配列を分泌又は転位し得る。
【0067】
本明細書で使用される場合、「対象」は、本出願の実施形態による方法によって治療されるか、又は治療された任意の動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される場合、「哺乳類」という用語は、任意の哺乳類を包含する。哺乳類の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル又は類人猿などの非ヒト霊長類（non-human primate、ＮＨＰ）、ヒトなどが挙げられるが、これらに限定されず、より好ましくはヒトである。ヒト対象は患者を含むことができる。本明細書に記載される化合物、組成物、及び方法は、ＨＢＶによって慢性的に感染され得る種に対するヒト治療及び獣医学的適用の両方において有用であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＢＶ感染、より具体的には慢性ＨＢＶ（ＣＨＢ）感染を有する。対象は、ウイルス共感染を伴う又は伴わないＣＨＢを有し得る。本明細書で使用される場合、「ウイルス同時感染」は、少なくとも２つのタイプのウイルスによる感染を指す。「ウイルス同時感染」は、少なくとも２つのタイプのウイルスによる同時感染であり得る。「ウイルス同時感染」はまた、１つ以上の型のウイルスによる感染が、１つ以上の他の型のウイルスによる既存の感染に追加される、重複感染であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＢＶ－ＨＤＶ同時感染を有する。好ましくは、対象は、ＣＨＢ－ＨＤＶ同時感染を有する。より好ましくは、対象は、ＣＨＢ及び慢性ＨＤＶのウイルス同時感染を有する。
【0068】
「標的部位」又は「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在するという条件で、結合分子又はドメインが結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。本明細書で使用される標的配列の「半部位配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子又はドメインが結合する標的配列の部分を指す。一般に、標的核酸配列内には２つの半部位配列が存在し、これらはスペーサー配列によって分離され得る。例えば、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、標的核酸の第１の半部位配列に結合することができ、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、同じ標的核酸の第２の半部位配列に結合することができる。好ましくは、第１の半部位配列及び第２の半部位配列は異なり、スペーサー配列によって分離される。
【0069】
本明細書の説明は、本出願の様々な実施形態を対象とする。任意の実施形態の議論は、例示的であることのみを意味し、特許請求の範囲を含む本開示の範囲がこれらの例に限定されることを示唆することを意図しない。例えば、本明細書に記載される出願の核酸配列の実施形態は、特定の順序で配置された特定のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼ触媒ドメインなどを含むがこれらに限定されない特定の構成要素を含有し得るが、当業者は、本明細書に開示される概念が、出願の核酸配列において使用され得る他の順序で配置された他の構成要素に等しく適用され得ることを理解するであろう。本出願は、特定の組み合わせが明示的に記載されているか否かにかかわらず、本出願の核酸配列において使用することができる任意の配列を有する任意の組み合わせにおける適用可能な構成要素のうちのいずれかの使用を企図する。
【0070】
肝炎
肝炎は肝臓の炎症であり、最も一般的にはウイルス感染によって引き起こされる。Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型と呼ばれる５つの主要な肝炎ウイルスが存在する。Ａ型肝炎及びＥ型肝炎は、典型的には、汚染された食物又は水の摂取によって引き起こされる。Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎及びＤ型肝炎は、通常、感染した体液（例えば、輸血又は汚染された機器を使用する侵襲的医療処置から）との非経口接触の結果として生じる。Ｂ型肝炎は性的接触によっても伝染する。
肝炎は肝臓の炎症であり、最も一般的にはウイルス感染によって引き起こされる。Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型と呼ばれる５つの主要な肝炎ウイルスが存在する。Ａ型肝炎及びＥ型肝炎は、典型的には、汚染された食物又は水の摂取によって引き起こされる。Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎及びＤ型肝炎は、通常、感染した体液（例えば、輸血又は汚染された機器を使用する侵襲的医療処置から）との非経口接触の結果として生じる。Ｂ型肝炎は性的接触によっても伝染する。
【0071】
Ａ型肝炎ウイルス（Hepatitis A virus、ＨＡＶ）は、発熱、倦怠感、拒食症、吐気、腹部不快感及び黄疸を引き起こす腸内伝染ウイルス疾患である。ＨＡＶは、通常、糞便－経口経路によって、ヒトからヒトへの接触、汚染された食物若しくは水の摂取、又はプールされた血漿製剤による伝染のいずれかによって獲得される。脂質エンベロープが存在しないことにより、ＨＡＶは物理化学的不活性化に対して非常に耐性となり、ウイルスは血液製剤の従来の熱処理に耐えることができる。感染した個体におけるＨＡＶ抗原及び／又は抗体を同定するための高感度かつ特異的な診断アッセイ、並びにウイルス血症試料を検出してそれらを輸血から排除するための核酸ベースの試験の開発は、重要な公衆衛生上の課題である。
【0072】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のＨｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ属に分類される小さな非エンベロープ球状ウイルスである。ＨＡＶゲノムは、ウイルス複製に必要な構造タンパク質及び酵素活性を生じるようにプロセシングされるポリタンパク質前駆体をコードする一本鎖線状の７．５ｋｂ ＲＮＡ分子からなる。ＨＡＶは、感染した個体の抗体によって認識される主要な抗原性ドメインを含む４つのカプシドタンパク質（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）をコードする。カプシドタンパク質に加えて、抗原性ドメインは、２Ａ及びウイルスコードプロテアーゼなどの非構造タンパク質において報告されている。
【0073】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はヒトに感染し、２つの臨床転帰をもたらし得る。成人における臨床感染の大部分（９０～９５％）において、ウイルスは数週間又は数ヶ月後に除去され、患者は生涯にわたって再感染に対する免疫を発達させる。しかしながら、残りの症例では、ウイルスは組織から排除されず、患者は慢性的に感染したままである。慢性感染の続発症は重篤である。このような個体は、肝臓組織の瘢痕化（肝硬変）を発症する可能性が高く、最終的に肝細胞がんを発症し得る。ＨＢＶは、分娩、性行為、又は感染した血液によって汚染された針の共有の間に、感染した血液又は他の体液、特に唾液及び精液を介して伝染する。
【0074】
慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）感染は、肝硬変及び肝細胞がん（ＨＣＣ）の最も一般的な原因であり、推定で年間５００，０００～９００，０００人が死亡している。ＨＢＶ複製の継続は、肝硬変及びＨＣＣへの進行のリスクを増加させる。
【0075】
Ｃ型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus、ＨＣＶ）は、非Ａ非Ｂ型肝炎として最初に同定された大部分が慢性の肝臓感染の原因因子である。ＨＣＶは、米国で約４００万人、世界中で１億７０００万人に感染しており、ＨＩＶの約４倍であり、輸血に起因する肝炎の９０～９５％を占める。感染の主な経路は、感染した個体からの汚染された体液、特に血液との接触によるものと推定される。ＨＣＶ感染は、米国及び他の国における肝移植の主な原因のうちの１つである。米国における肝移植の約４０～５０％は、ＨＣＶ感染に基づく。この疾患はしばしば慢性肝損傷に進行する。ＨＣＶ感染の病理は主に肝臓に影響を及ぼすが、このウイルスは、末梢血リンパ球を含む体内の他の細胞型において見出される。
【0076】
ＨＣＶは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ属のＲＮＡウイルスであり、ペスチウイルス（pestivirus）、ＢＶＤＶ及びＧＢＶ－Ｂに最も近縁である。ＨＣＶゲノムは、長さ約９．６ｋｂのＲＮＡの一本鎖プラス鎖から構成される。ＨＣＶゲノムは、約３，０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする連続した翻訳オープンリーディングフレーム（open reading frame、ＯＲＦ）を有する。構造タンパク質は、ＯＲＦのＮ末端領域のおよそ最初の四分の一にコードされるようであり、残りは非構造タンパク質をコードする。ポリタンパク質は、子孫ウイルス粒子の複製及びアセンブリに重要な少なくとも１０個の別個のウイルスタンパク質に対する前駆体として働く。ＨＣＶポリタンパク質における構造タンパク質及び非構造タンパク質の構成は、以下の通りである：Ｃ－Ｅ１－Ｅ２－ｐ７－ＮＳ２－ＮＳ３－ＮＳ４ａ－ＮＳ４ｂ－ＮＳ５ａ－ＮＳ５ｂ。
【0077】
デルタ型肝炎ウイルス（hepatitis delta virus、ＨＤＶ）は、Ｂ型肝炎表面抗原に依存してそのエンベロープを組み立て、新たなビリオンを形成して感染を伝播させるサテライトＲＮＡウイルスである。ＨＤＶは、小さな１．７Ｋｂのゲノムを有し、それを最小の既知のヒトウイルスにする。Ｄ型肝炎環状ゲノムは、ＧＣヌクレオチド含有量が高いために、動物性ウイルスの中で独特である。しかしながら、ＨＤＶは、ウイルス性肝炎の最も重篤な形態である。ウイルス性肝炎の他の因子と比較して、急性ＨＤＶ感染は、劇症肝炎（肝臓の大部分が破壊される、急速進行性の、しばしば致死的な形態の本疾患）とより頻繁に関連する。慢性Ｄ型肝炎は、典型的には、慢性ＨＢＶ感染に類似した壊死性炎症性病変によって特徴付けられるが、より重症であり、肝硬変及び肝不全に急速に進行することが多く、慢性ＨＤＶ感染と末期肝疾患との不均衡な関連性の原因となる。ＨＤＶ感染に罹患する個体は、ＨＢＶのみに罹患する個体よりも少数であるが、結果として生じる急性又は慢性肝不全は、欧州及び北アメリカにおける肝移植の一般的な適応症である。慢性ＨＤＶ疾患は、世界中で１５００万人が罹患しており、そのうちの約７０，０００人が米国にいる。Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌは、ＨＤＶ感染に起因して米国で毎年１，０００人が死亡していると推定する。
【0078】
ＨＤＶビリオンは、リボ核タンパク質コア及びエンベロープから構成される。コアは、ＨＤＶ－ＲＮＡ、及びこのウイルスによってコードされる唯一のタンパク質である肝炎デルタ抗原（hepatitis delta antigen、ＨＤＡｇ）を含有する。エンベロープは、ヘルパーウイルス、Ｂ型肝炎の表面抗原タンパク質（Ｂ型肝炎表面抗原、又はＨＢｓＡｇ）によって形成される。エンベロープは、ＨＢＶによって提供される唯一のヘルパー機能である。ＨＤＶは、ＨＢＶの不在下で細胞内でそのＲＮＡを複製することができるが、ＨＤＶビリオンのパッケージング及び放出のため、並びに感染性のためにＨＢｓＡｇを必要とする。ＨＤＶがＨＢＶに依存の結果として、ＨＤＶは、ＨＢＶに関連してのみ個体に感染する。
【0079】
Ｅ型肝炎ウイルス（Hepatitis E virus、ＨＥＶ）は、世界の多くの資源が限られた地域に固有の急性ウイルス性肝炎の一形態であるＥ型肝炎ウイルスの原因病原体である。世界人口の約３分の１である約２０億人が、ＨＥＶに固有の地域に住み、感染のリスクがあると推定される。これらの領域では、Ｅ型肝炎は急性肝炎の主要な形態である。例えばインドでは、急性肝炎の約５０％がＨＥＶによるものである。
【0080】
ＨＥＶは、２７～３４ｎｍのサイズを有する小さな非エンベロープウイルスであり、Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ科のＨｅｐｅｖｉｒｕｓに分類される。ＨＥＶゲノムは、プラス鎖である約７．２ｋｂの一本鎖ＲＮＡであり、５’－メチルグアニンキャップ及び３’ポリ（Ａ）ストレッチを有し、ｏｒｆ１、ｏｒｆ２及びｏｒｆ３と呼ばれる３つの部分的に重複するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。１６９３アミノ酸のポリタンパク質であるＨＥＶ ｏｒｆ１は、ウイルスの非構造機能をコードする。ＨＥＶ非構造ポリタンパク質において同定された機能ドメインとしては、（Ｎ末端から開始して）メチルトランスフェラーゼ（methyltransferase、ＭｅＴ）、パパイン様システインプロテアーゼ（papain-like cysteine protease、ＰＣＰ）、ＲＮＡヘリカーゼ（helicase、Ｈｅｌ）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（RNA dependent RNA polymerase、ＲｄＲｐ）が挙げられる。ＨＥＶ ｏｒｆ２は６６０アミノ酸のウイルスカプシドタンパク質をコードし、ウイルスＲＮＡゲノムをカプシド化すると考えられている。ＨＥＶ ｏｒｆ３は、インビトロでの複製に必須ではない１１４アミノ酸タンパク質を発現すると考えられており、ウイルスアクセサリータンパク質として機能し、感染に対する宿主応答に影響を及ぼす可能性があると考えられている。
【0081】
ＧＢＶ－Ｃ、又はＨＣＶのようなＧ型肝炎ウイルス（hepatitis G virus、ＨＧＶ）は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科に属する。ＧＢＶ－Ｃは、世界的な分布を有し、米国ドナー集団において高い有病率を有し、ＨＣＶ及びＨＢＶと同様に、汚染された血液の輸血及び性的接触によって拡散され得る。現在、ＧＢＶ－Ｃは、ポリメラーゼ連鎖反応によって血清中のそのＲＮＡを検出することによってのみ診断することができる。急性又は慢性肝炎に関するＧＢＶ－Ｃ感染の臨床的意義は十分に理解されていないが、他の証拠の優勢は、ＧＢＶ－Ｃがヒトにおいて肝炎を引き起こさないことを示唆する。ウイルスのゲノムは、正の極性を有する一本鎖ＲＮＡによって表される。ＧＢＶ－Ｃゲノムは、その構成においてＨＣＶ ＲＮＡに類似しており、すなわち構造遺伝子はゲノム５’領域に位置し、非構造遺伝子は３’末端に位置する。５’末端の非翻訳領域は、ＲＮＡコード領域の翻訳を確実にする内部リボソーム搭載部位として機能し得る。
【0082】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
本明細書で使用される場合、「Ｂ型肝炎ウイルス」又は「ＨＢＶ」は、ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科の特定のウイルスを指す。ＨＢＶは、４つのオープンリーディングフレーム及び７つのタンパク質をコードする小さな（例えば、３．２ｋｂ）肝指向性ＤＮＡウイルスである。ＨＢＶによってコードされる７つのタンパク質には、小（small、Ｓ）、中（middle、Ｍ）、及び大（large、Ｌ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）又はエンベロープ（envelope、Ｅｎｖ）タンパク質、プレコアタンパク質、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ（polymerase、Ｐｏｌ）、並びにＨＢｘタンパク質が含まれる。ＨＢＶは、３つの表面抗原又はエンベロープタンパク質、Ｌ、Ｍ、及びＳを発現し、Ｓは最小であり、Ｌは最大であり、Ｍは中間である。Ｌタンパク質はＰｒｅ－Ｓ１－Ｐｒｅ－Ｓ２－Ｓドメインを含み、Ｍタンパク質はＰｒｅ－Ｓ２－Ｓドメインを含み、Ｓタンパク質はＳドメインのみを含む。コアタンパク質は、ウイルスヌクレオカプシドのサブユニットである。Ｐｏｌは、ウイルスＤＮＡ（逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、及びプライマー）の合成に必要であり、これは感染した肝細胞の細胞質に局在するヌクレオカプシドにおいて生じる。プレコアは、Ｎ末端シグナルペプチドを有するコアタンパク質であり、感染細胞からいわゆるＢ型肝炎ｅ抗原（hepatitis B e-antigen、ＨＢｅＡｇ）として分泌される前に、そのＮ末端及びＣ末端でタンパク質分解的にプロセシングされる。ＨＢｘタンパク質は、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の効率的な転写に必要である。ＨＢｘはウイルス構造タンパク質ではない。ＨＢＶの全てのウイルスタンパク質は、ｍＲＮＡを共有するコア及びポリメラーゼを除いて、それら自身のｍＲＮＡを有する。タンパク質プレコアを除いて、ＨＢＶウイルスタンパク質はいずれも翻訳後タンパク質分解プロセシングを受けない。
本明細書で使用される場合、「Ｂ型肝炎ウイルス」又は「ＨＢＶ」は、ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科の特定のウイルスを指す。ＨＢＶは、４つのオープンリーディングフレーム及び７つのタンパク質をコードする小さな（例えば、３．２ｋｂ）肝指向性ＤＮＡウイルスである。ＨＢＶによってコードされる７つのタンパク質には、小（small、Ｓ）、中（middle、Ｍ）、及び大（large、Ｌ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）又はエンベロープ（envelope、Ｅｎｖ）タンパク質、プレコアタンパク質、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ（polymerase、Ｐｏｌ）、並びにＨＢｘタンパク質が含まれる。ＨＢＶは、３つの表面抗原又はエンベロープタンパク質、Ｌ、Ｍ、及びＳを発現し、Ｓは最小であり、Ｌは最大であり、Ｍは中間である。Ｌタンパク質はＰｒｅ－Ｓ１－Ｐｒｅ－Ｓ２－Ｓドメインを含み、Ｍタンパク質はＰｒｅ－Ｓ２－Ｓドメインを含み、Ｓタンパク質はＳドメインのみを含む。コアタンパク質は、ウイルスヌクレオカプシドのサブユニットである。Ｐｏｌは、ウイルスＤＮＡ（逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、及びプライマー）の合成に必要であり、これは感染した肝細胞の細胞質に局在するヌクレオカプシドにおいて生じる。プレコアは、Ｎ末端シグナルペプチドを有するコアタンパク質であり、感染細胞からいわゆるＢ型肝炎ｅ抗原（hepatitis B e-antigen、ＨＢｅＡｇ）として分泌される前に、そのＮ末端及びＣ末端でタンパク質分解的にプロセシングされる。ＨＢｘタンパク質は、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の効率的な転写に必要である。ＨＢｘはウイルス構造タンパク質ではない。ＨＢＶの全てのウイルスタンパク質は、ｍＲＮＡを共有するコア及びポリメラーゼを除いて、それら自身のｍＲＮＡを有する。タンパク質プレコアを除いて、ＨＢＶウイルスタンパク質はいずれも翻訳後タンパク質分解プロセシングを受けない。
【0083】
ＨＢＶビリオンは、ウイルスエンベロープ、ヌクレオカプシド、及び部分的二本鎖ＤＮＡゲノムの単一コピーを含有する。ヌクレオカプシドは、コアタンパク質の１２０個の二量体を含み、Ｓ、Ｍ、及びＬウイルスエンベロープ又は表面抗原タンパク質が埋め込まれた脂質膜によって覆われている。細胞への侵入後、ウイルスはコーティングされず、共有結合したウイルスポリメラーゼを有するカプシド含有不完全環状ＤＮＡ（relaxed circular DNA、ｒｃＤＮＡ）が核に移動する。そのプロセスの間、コアタンパク質のリン酸化は構造変化を誘導し、核局在化シグナルを露出させて、カプシドといわゆるインポーチンとの相互作用を可能にする。これらのインポーチンは、核孔複合体へのコアタンパク質の結合を媒介し、その際にカプシドが分解し、ポリメラーゼ／ｒｃＤＮＡ複合体が核内に放出される。核内で、ｒｃＤＮＡは除タンパクされ（ポリメラーゼの除去）、宿主ＤＮＡ修復機構によって共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）ゲノムに変換され（更に、ヒストン及び他の宿主因子の付加によってミニ染色体に変換される）、そこから重複転写物がＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ及びＨＢｘタンパク質をコードする。コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、及びプレゲノムＲＮＡ（pre-genomic RNA、ｐｇＲＮＡ）は、細胞質中で会合し、未成熟ｐｇＲＮＡ含有カプシド粒子に自己集合し、これは更に成熟ｒｃＤＮＡカプシドに変換され、感染性ウイルス粒子としてエンベロープに包まれて分泌されるか、又は核に輸送されて戻って安定なｃｃｃＤＮＡプールを補充及び維持する共通の中間体として機能する。
【0084】
現在まで、ＨＢＶは、エンベロープタンパク質上に存在する抗原エピトープに基づいて４つの血清型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）に分けられ、ウイルスゲノムの配列に基づいて８つの遺伝子型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）に分けられている。２つの新しい遺伝子型Ｉ及びＪが最近同定された。ＨＢＶ遺伝子型は、異なる地理的領域にわたって分布している。例えば、アジアで最も一般的な遺伝子型は、遺伝子型Ｂ及びＣである。遺伝子型Ｄは、アフリカ、中東、及びインドで優勢であるが、遺伝子型Ａは、北欧、サハラ以南のアフリカ、及び西アフリカに広く分布している。
【0085】
本明細書で使用される場合、「慢性ＨＢＶ感染」、「慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＣＨＢ）感染」、「ＣＨＢ」、「ＣＨＢ感染」又は「ＣＨＢウイルス感染」を有する患者又は対象は、当技術分野における通常の意味を指し、より具体的には、ＨＢＶに慢性的に感染しており、ＨＢＶ検出後６ヶ月以上にわたって血液中に検出可能なＨＢｓＡｇ（ＨＢｅＡｇを含む又は含まない）を有する患者又は対象を指す。ＣＨＢ感染は、４つの相に分類することができ、常にではないが、典型的には、ある相から次の相に進行する：（Ｉ）ＨＢｅＡｇ陽性慢性感染（以前は免疫寛容として知られていた）、（ＩＩ）ＨＢｅＡｇ陽性慢性肝炎（以前は免疫活性として知られていた）、（ＩＩＩ）ＨＢｅＡｇ陰性慢性感染（以前は不活性担体として知られていた）、及び（ＩＶ）ＨＢｅＡｇ陰性慢性肝炎（以前は再活性化として知られていた）。慢性ＨＢＶ感染の異なる段階はまた、ウイルス負荷、肝臓酵素レベル（壊死炎症活性）、ＨＢｅＡｇ、若しくはＨＢｓＡｇ負荷、又はこれらの抗原に対する抗体の存在における差異によって特徴付けられ得る。未処置の対象におけるｃｃｃＤＮＡレベルは、細胞当たり約１０～５０コピーで比較的一定のままであるが、ウイルス血症がかなり変動し得る場合であっても、ヌクレオシ（チ）ド類似体療法によって抑制される場合、細胞当たり１～２コピー程度に低くあり得る。ｃｃｃＤＮＡ種の持続は慢性化をもたらす。いくつかの実施形態において、慢性ＨＢＶ感染は、（ｉ）Ｂ型肝炎コア抗原に対するＩｇＭ抗体（ＩｇＭ抗ＨＢｃ）について陰性であり、かつＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、若しくはＢ型肝炎ウイルスＤＮＡについての核酸検査について陽性であるか、又は（ｉｉ）ＨＢｓＡｇ若しくはＨＢＶ ＤＮＡについての核酸検査について陽性であるか、又は少なくとも６ヶ月間隔で２回ＨＢｅＡｇについて陽性であるなどの、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）によって公開された検査基準によって特徴付けることができる。
【0086】
本出願のいくつかの実施形態において、標的核酸配列は、ＨＢＶゲノム内にある。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列に結合することができる。本出願のいくつかの実施形態において、標的核酸配列は、ＨＢＶ抗原をコードする核酸配列内にある。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＢＶ抗原をコードする核酸配列内の標的核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸配列の第１及び第２の半部位配列は、ＨＢＶ抗原をコードする核酸配列内にある。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の半部位配列に結合することができる。ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列に結合することができるＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ単量体は、本出願全体を通して「ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ」とも呼ばれる。任意の遺伝子型のＨＢＶゲノムの核酸配列は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合のための標的核酸配列であり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸配列は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のＨＢＶゲノム内にある。いくつかの実施形態において、ＨＢＶゲノムは、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのうちの１つ以上のものである。
【0087】
本出願のいくつかの実施形態において、標的核酸配列は、ＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸配列内にある。特定の実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸配列内の標的核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸配列の第１及び第２の半部位配列は、ＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸配列内にある。
【0088】
本出願のいくつかの実施形態において、標的核酸配列は、ＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）をコードする核酸配列内にある。特定の実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＢＶ ｐｏｌをコードする核酸配列内の標的核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸配列の第１及び第２の半部位配列は、ＨＢＶ ｐｏｌをコードする核酸配列内にある。
【0089】
本出願のいくつかの実施形態において、標的核酸配列は、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする核酸配列内にある。特定の実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＢｓＡｇをコードする核酸配列内の標的核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸配列の第１及び第２の半部位配列は、ＨＢｓＡｇをコードする核酸配列内にある。
【0090】
ＴＡＬＥＮ
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工制限酵素である。これらの試薬は、効率的でプログラム可能で特異的なＤＮＡ切断を可能にし、インサイチュでのゲノム編集のための強力なツールとなる。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際に任意のＤＮＡ配列に結合するように迅速に操作することができる。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書で使用される場合、広義であり、別のＴＡＬＥＮからの補助なしに二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語は、一緒に働いて同じ部位でＤＮＡを切断するように操作されたＴＡＬＥＮの対の一方又は両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に作用するＴＡＬＥＮは、左ＴＡＬＥＮ及び右ＴＡＬＥＮと呼ばれる場合があり、これはＤＮＡの掌性を指す。米国特許出願第１２／９６５，５９０号、米国特許出願第１３／４２６，９９１号（米国特許第８，４５０，４７１号）、米国特許出願第１３／４２７，０４０号（米国特許第８，４４０，４３１号）、米国特許出願第１３／４２７，１３７号（米国特許第８，４４０，４３２号）、及び米国特許出願第１３／７３８，３８１号（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工制限酵素である。これらの試薬は、効率的でプログラム可能で特異的なＤＮＡ切断を可能にし、インサイチュでのゲノム編集のための強力なツールとなる。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際に任意のＤＮＡ配列に結合するように迅速に操作することができる。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書で使用される場合、広義であり、別のＴＡＬＥＮからの補助なしに二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語は、一緒に働いて同じ部位でＤＮＡを切断するように操作されたＴＡＬＥＮの対の一方又は両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に作用するＴＡＬＥＮは、左ＴＡＬＥＮ及び右ＴＡＬＥＮと呼ばれる場合があり、これはＤＮＡの掌性を指す。米国特許出願第１２／９６５，５９０号、米国特許出願第１３／４２６，９９１号（米国特許第８，４５０，４７１号）、米国特許出願第１３／４２７，０４０号（米国特許第８，４４０，４３１号）、米国特許出願第１３／４２７，１３７号（米国特許第８，４４０，４３２号）、及び米国特許出願第１３／７３８，３８１号（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0091】
ＴＡＬエフェクターは、植物病原性Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ細菌によって分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目及び１３番目のアミノ酸を除いて、３３～３４アミノ酸配列の高度に保存された反復セグメントを含有する。これらの２つの位置は高度に可変であり（反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる）、特異的ヌクレオチド認識と強い相関を示す（図１Ｃ参照）。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間のこの単純な関係は、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組み合わせを選択することによって、特異的ＤＮＡ結合ドメインの操作を可能にしている。ＲＶＤにおけるわずかな変化及び「非従来型」ＲＶＤ配列の組み込みは、標的化特異性を改善することができる。
【0092】
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの末端からの非特異的ＤＮＡ切断ドメインを使用して、酵母アッセイにおいて活性であるハイブリッドヌクレアーゼを構築することができる。これらの試薬はまた、植物細胞及び動物細胞において活性である。最初のＴＡＬＥＮ研究は、野生型ＦｏｋＩ切断ドメインを使用したが、いくつかのその後のＴＡＬＥＮ研究も、切断特異性及び切断活性を改善するように設計された突然変異を有するＦｏｋＩ切断ドメインバリアントを使用した。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向及び間隔で標的ゲノム中の部位のための固有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つのＴＡＬＥＮ構築物を必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメイン（Ｃ末端ドメイン）との間のアミノ酸残基の数、及び２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位（スペーサー）間の塩基の数の両方が、高レベルの活性を達成するためのパラメータである。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のＣ末端ドメイン中のアミノ酸残基の数は、スペーサー配列中の塩基の数に従ってアミノ酸を導入又は欠失することによって改変され得る。ＤＮＡ標的配列中のスペーサーは、約１２～約３０ヌクレオチドであり得る。
【0093】
ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の関係は、設計可能なタンパク質を可能にする。ＴＡＬＥＮ遺伝子が組み立てられると、それらは、例えば、プラスミド又はウイルス構築物に挿入することができ、次いで、それらを使用して標的細胞をトランスフェクトし、そこで遺伝子産物が発現され、核に入ってゲノムにアクセスする。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡにおいて二本鎖切断（double-strand break、ＤＳＢ）を誘導することによってゲノムを編集するために使用することができる。例えば、標的細胞においてＴＡＬＥＮを発現させ、ゲノム編集をもたらすために、任意の方法及び方法の任意の組み合わせを使用することができる。いくつかの実施形態において、プラスミドＤＮＡなどの１つ以上のＴＡＬＥＮ遺伝子を含むＤＮＡが標的細胞にトランスフェクトされる。細胞には、１つ以上のＴＡＬＥＮ遺伝子を含む１つ以上のプラスミドがトランスフェクトされ得る。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＴＡＬＥＮ遺伝子を送達するウイルスベクターで形質導入される。細胞は、１つ以上のウイルスベクターで形質導入され得、各ウイルスベクターは、１つ以上のＴＡＬＥＮ遺伝子を送達する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡは、インビトロ転写（in vitro transcription、ＩＶＴ）によって調製される。いくつかの実施形態において、インビトロ転写されたＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡは、標的細胞にトランスフェクトされる。細胞には、１つ以上のＴＡＬＥＮ遺伝子をコードする１つ以上のｍＲＮＡがトランスフェクトされ得る。
【0094】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬヌクレアーゼ単量体は、標的核酸配列の２つのＤＮＡ半部位配列のうちの１つに結合する。好ましくは、半部位配列はスペーサー配列によって分離される。この間隔は、ヌクレアーゼ触媒ドメインが二量体化し、半部位配列間のスペーサー配列中にＤＳＢを作製することを可能にする。好ましくは、第１の半部位配列及び第２の半部位配列は異なる配列であり、スペーサー配列によって分離されている。
【0095】
いくつかの実施形態において、ＤＳＢはインデルを誘導するだろう。本明細書で使用される場合、「インデル」は、挿入、欠失又はそれらの組み合わせから生じる突然変異を指す。当業者によって理解されるであろうように、ゲノム配列のコード領域におけるインデルは、インデルの長さが３の倍数でない限り、フレームシフト突然変異をもたらす。いくつかの実施形態において、ＤＳＢは点突然変異を誘導するだろう。本明細書で使用される場合、「点突然変異」は、ヌクレオチドのうちの１つの置換を指す。好ましくは、インデル又は点突然変異は、標的核酸配列のスペーサー配列内にある。
【0096】
いくつかの実施形態において、標的核酸配列の切断は、標的遺伝子の発現の減少をもたらす。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の発現の減少は、ｍＲＮＡレベルの低下である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の発現の減少は、タンパク質レベルの低下又はタンパク質機能性の低下である。「低下した（decreased）」という用語は、一般に、統計的に有意な減少量を意味するために本明細書で使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「低下した」とは、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は最大１００％の減少（すなわち、参照試料と比較してレベルがない）、又は参照レベルと比較して１０％～１００％の間の任意の減少を意味する。参照レベルは、例えば、未処置の試料若しくは対象、又は対照処置を受けた試料若しくは対象における発現のレベルであり得る。「統計的に有意な」又は「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に、マーカーの正常濃度よりも２標準偏差（two standard deviation、２ＳＤ）低い、又はより低い濃度を意味する。この用語は、差異の存在についての統計的証拠を指す。これは、帰無仮説が実際に真である場合に帰無仮説を棄却する決定を下す確率として定義される。判定は、ｐ値を用いて行われることが多い。
【0097】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物又は組み合わせは、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１のＴＡＬＥＮ単量体であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる第１のＴＡＬＥＮ単量体と、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる第２のＴＡＬＥＮ単量体と、を含み、第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができる。第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、それらの触媒ドメインを介して二量体を形成することができる。好ましくは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインは第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインは第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである。好ましくは、第１の半部位配列及び第２の半部位配列は異なる配列であり、スペーサー配列によって分離されている。
【0098】
いくつかの実施形態において、標的核酸配列は、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）をコードする配列内にある。好ましくは、標的核酸配列の第１の半部位配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は、標的核酸配列の第１の半部位配列は、配列番号３の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列は、配列番号４の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、又は、標的核酸配列は、配列番号５若しくは配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
【0099】
いくつかの実施形態において、第１及び第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインはそれぞれ、反復単位を含み、各反復単位は、標的核酸配列中の塩基対の認識を決定する反復可変二残基（ＲＶＤ）として知られる２つのアミノ酸の超可変領域を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインはそれぞれ、１５～２０個のＲＶＤ、例えば、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個のＲＶＤを含む。
【0100】
いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１０と少なくとも９０％同一、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインは各々、配列番号１１と少なくとも９０％同一、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインはそれぞれ、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインはそれぞれ、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列からなり、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列からなり、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインはそれぞれ、配列番号１１のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列からなり、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列からなり、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインはそれぞれ、配列番号１１のアミノ酸配列からなる。
【0101】
いくつかの実施形態において、それぞれ、第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含み、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができ、第１の半部位配列は配列番号１又は配列番号３の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、第２の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体は、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができ、第２の半部位配列は配列番号２又は配列番号４の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸配列は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及び／又はＪのうちの１つ以上のＨＢＶゲノム内にある。いくつかの実施形態において、ＨＢＶゲノムは、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及び／又はＨのうちの１つ以上のものである。
【0102】
一態様において、本出願は、ＨＢＶゲノム中の標的核酸配列を切断する方法であって、ＨＢＶゲノムを、本明細書に記載の任意の組成物、組み合わせ、核酸分子、単離された宿主細胞、又は薬学的組成物と接触させることを含む、方法を提供する。別の態様において、本出願は、ＨＢＶゲノム中の標的核酸配列の遺伝子編集を誘導するための方法であって、ＨＢＶゲノムを、本明細書に記載の任意の組成物、組み合わせ、核酸分子、単離された宿主細胞、又は薬学的組成物と接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＨＢＶゲノムは、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである。いくつかの実施形態において、ＨＢＶゲノムは、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのうちの１つ以上のものである。
【0103】
ポリヌクレオチド及びベクター
一般的な態様において、本出願は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができ、第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子と、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができ、第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子と、の組み合わせであって、第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができる、組み合わせを提供する。
一般的な態様において、本出願は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができ、第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子と、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができ、第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子と、の組み合わせであって、第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができる、組み合わせを提供する。
【0104】
核酸分子は、本出願のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードする任意の天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含むことができ、これは、本開示を考慮して当技術分野において既知の方法を使用して作製することができる。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの形態、又は組換え技術（例えば、クローニング）によって得られるか若しくは合成的に産生される（例えば、化学合成）ＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、一本鎖若しくは二本鎖であり得るか、又は二本鎖配列及び一本鎖配列の両方の部分を含み得る。ＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はそれらの組み合わせを含むことができる。ポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。本出願のポリヌクレオチド及びベクターは、組換えタンパク質産生、宿主細胞におけるタンパク質の発現、又はウイルス粒子の産生のために使用することができる。
【0105】
別の一般的な態様において、本出願は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含む、ｍＲＮＡ分子の組み合わせであって、第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができる、ｍＲＮＡ分子の組み合わせを提供する。
【0106】
好ましくは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインは第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインは第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである。第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインは、同じ又は異なり得る。いくつかの実施形態において、ＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、各ＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインは、独立して、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、各ＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列からなる。
【0107】
いくつかの実施形態において、第１及び第２のｍＲＮＡ分子は各々、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールのうちの１つ以上、好ましくは全てを更に含む。
【0108】
好ましくは、本明細書に記載のｍＲＮＡは、５’キャップを含む。様々な基及びそれらの類似体でキャップされた５’末端は、当技術分野において既知である。全ての真核生物（及び一部のウイルス）に存在するｍＲＮＡの５’末端上のＣａｐ構造は、インビボでｍＲＮＡを安定化するために重要である。天然に存在するＣａｐ構造は、グアニン塩基のＮ７位がメチル化されているリボグアノシン残基を含む。この７－メチルグアノシン（7－methylguanosine、ｍ７Ｇ）は、ｍＲＮＡ分子の５’末端で５’－三リン酸鎖を介して５’－三リン酸鎖に連結される。５’末端上のｍ７Ｇｐｐｐ断片の存在は、それがエキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護し、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を促進し、翻訳開始複合体の構築において重要な役割を果たすので、ｍＲＮＡ成熟に必須である（Ｃｅｌｌ ９：６４５－６５３，（１９７６）、Ｎａｔｕｒｅ ２６６：２３５，（１９７７）、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｌｅｔｔｅｒ ９６：１－１１，（１９７８）、Ｃｅｌｌ ４０：２２３－２４，（１９８５）、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５：１７３－２０７，（１９８８）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：９１３－９６３，（１９９９）、及びＪ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０３３７－３０４０，（１９９９））。
【0109】
Ｃａｐ構造を有するｍＲＮＡのみがＣａｐ依存性翻訳において活性であり、ｍＲＮＡの「断頭」は、タンパク質合成のためのそれらの鋳型活性のほぼ完全な喪失をもたらす（Ｎａｔｕｒｅ，２５５：３３－３７，（１９７５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５３：５２２８－５２３１（１９７８）、及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：１１８９－１１９３，（１９７５））。
【0110】
真核生物ｍＲＮＡの別の要素は、転写位置１（Ｃａｐ １）における２’－Ｏ－メチルヌクレオシド残基の存在であり、場合によっては、転写位置１及び２（Ｃａｐ ２）における２’－Ｏ－メチルヌクレオシド残基の存在である。ｍＲＮＡの２’－Ｏ－メチル化は、インビボでのｍＲＮＡ翻訳のより高い有効性を提供し（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３９５２－３９５６（１９８０））、５’キャップされたｍＲＮＡのヌクレアーゼ安定性を更に改善する。Ｃａｐ １（及びＣａｐ ２）を有するｍＲＮＡは、細胞が真正ｍＲＮＡ ５’末端を認識することを可能にし、いくつかの事例では、感染性遺伝因子から発する転写物を区別することを可能にする特有のマークである（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３：４８２－４９２（２０１５））。
【0111】
５’キャップ構造及びそれを含むｍＲＮＡを調製するための方法のいくつかの例は、ＷＯ２０１５／０５１１６９Ａ２、ＷＯ／２０１５／０６１４９１、ＵＳ２０１８／０２７３５７６、並びに米国特許第８，０９３，３６７号、同第８，３０４，５２９号及び同第１０，４８７，１０５号に示されている。５’キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、又は抗逆キャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ及びそれらの四リン酸誘導体）から選択され得る（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ９：１１０８－１１２２（２００３）を参照されたい）。５’キャップは、ＡＲＣＡキャップ（３’－ＯＭｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ）であり得る。５’キャップはｍＣＡＰ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ，Ｎ７－メチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン）であってもよい。５’キャップは加水分解に対して耐性であり得る。いくつかの実施形態において、５’キャップは、当技術分野において既知のｍ７ＧｐｐｐＡｍｐＧである。いくつかの実施形態において、５’キャップはｍ７ＧｐｐｐＧ又はｍ７ＧｐｐｐＧｍであり、これらは当技術分野において既知である。５’キャップ構造の実施形態についての構造式を以下に提供する。
【0112】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、式（Ｃａｐ Ｉ）の構造を有する５’キャップを含む。
【0113】
【化1】
【0114】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、式（Ｃａｐ ＩＩ）の構造を有する５’キャップを含む。
【0115】
【化2】
【0116】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、式（Ｃａｐ ＩＩＩ）の構造を有する５’キャップを含む。
【0117】
【化3】
【0118】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、式（Ｃａｐ ＩＶ）の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＧ ５’キャップ類似体を含む。
【0119】
【化4】
【0120】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、式（Ｃａｐ Ｖ）の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＡｍｐＧ ５’キャップ類似体を含む。
【0121】
【化5】
【0122】
好ましくは、本明細書に記載のｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）配列を更に含む。当該技術分野で理解されているように、５’－ＵＴＲ及び／又は３’－ＵＴＲは、ｍＲＮＡの安定性又は翻訳効率に影響を及ぼし得る。５’－ＵＴＲは、翻訳可能なオリゴマーの安定性を増加させるために、比較的安定であることが当技術分野において既知のｍＲＮＡ分子（例えば、ヒストン、チューブリン、グロビン、グリセルアルデヒド１－リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde 1-phosphate dehydrogenase、ＧＡＰＤＨ）、アクチン、又はクエン酸回路酵素）に由来し得る。他の実施形態において、５’－ＵＴＲ配列は、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）最初期１（immediate-early 1、ＩＥ１）遺伝子の部分配列を含み得る。
【0123】
好ましくは、５’－ＵＴＲは、ヒトＩＬ－６、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノーゲンアルファ鎖、ヒトトランスサイレチン、ヒトハプトグロビン、ヒトアルファ１－抗キモトリプシン、ヒトアンチトロンビン、ヒトアルファ１－アンチトリプシン、ヒトアルブミン、ヒトベータグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト補体Ｃ５、ＳｙｎＫ（シアノバクテリア、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．に由来するチラコイドカリウムチャネルタンパク質）、マウスベータグロビン、マウスアルブミン、及びタバコエッチウイルスの５’－ＵＴＲ、又は前述のもののうちのいずれかの断片から選択される配列を含む。好ましくは、５’－ＵＴＲは、タバコエッチウイルス（tobacco etch virus、ＴＥＶ）に由来する。好ましくは、本明細書に記載のｍＲＮＡは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａによって発現される遺伝子に由来する５’－ＵＴＲ配列を含む。好ましくは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａによって発現される遺伝子の５’－ＵＴＲ配列は、ＡＴ１Ｇ５８４２０である。好ましい５’－ＵＴＲ配列は、配列番号１２～１７を含む。好ましくは、５’－ＵＴＲ配列は、配列番号１３（ＡＴ１Ｇ５８４２０）を含む。
【0124】
好ましくは、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、３’－ＵＴＲを含む。好ましくは、３’－ＵＴＲは、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノーゲンアルファ鎖、ヒトハプトグロビン、ヒトアンチトロンビン、ヒトアルファグロビン、ヒトベータグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト成長因子、ヒトヘプシジン、ＭＡＬＡＴ－１、マウスベータグロビン、マウスアルブミン、及びＸｅｎｏｐｕｓベータグロビンの３’－ＵＴＲ、又は前述のもののうちのいずれかの断片から選択される配列を含む。好ましくは、３’－ＵＴＲはＸｅｎｏｐｕｓベータグロビンに由来する。好ましい３’－ＵＴＲ配列は、配列番号１８～２４を含む。
【0125】
好ましくは、本明細書に記載のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する働きをすることができる３’テール領域を含む。テール領域は、３’ポリ（Ａ）及び／又は３’ポリ（Ｃ）領域であり得る。好ましくは、テール領域は、３’ポリ（Ａ）テールである。本明細書で使用される場合、「３’ポリ（Ａ）テール」又は「ポリアデノシンテール」は、例えば、１０～２５０個の連続アデノシンヌクレオチド、６０～１２５個の連続アデノシンヌクレオチド、９０～１２５個の連続アデノシンヌクレオチド、９５～１２５個の連続アデノシンヌクレオチド、９５～１２１個の連続アデノシンヌクレオチド、１００～１２１個の連続アデノシンヌクレオチド、１１０～１２１個の連続アデノシンヌクレオチド、１１２～１２１個の連続アデノシンヌクレオチド、１１４～１２１個のアデノシン連続ヌクレオチド、及び１１５～１２１個の連続アデノシンヌクレオチド、のサイズの範囲であり得る連続アデノシンヌクレオチドのポリマーである。好ましくは、本明細書に記載される３’ポリアデノシンテールは、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４又は１２５個の連続アデノシンヌクレオチドを含む。３’ポリ（Ａ）テールは、当該分野において既知の種々の方法を使用して（例えば、合成ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡにテールを付加するためにポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して）付加され得る。他の方法としては、ポリＡテールをコードする転写ベクターの使用又はリガーゼの使用（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ及び／又はＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用するスプリントライゲーションによる）が挙げられ、ポリ（Ａ）は、センスＲＮＡの３’末端にライゲーションされ得る。好ましくは、上記方法のうちのいずれかの組み合わせが利用される。
【0126】
いくつかの実施形態において、第１及び第２のｍＲＮＡ分子は各々、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列、ヌクレアーゼ触媒ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のｍＲＮＡ分子は各々、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、Ｎ末端ドメインをコードする配列、ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列、ヌクレアーゼ触媒ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のｍＲＮＡ分子は各々、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のｍＲＮＡ分子は各々、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、Ｎ末端ドメインをコードする配列、ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールを含む。
【0127】
本出願はまた、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードする核酸の組み合わせを含む、ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、遺伝物質を別の細胞に運ぶために使用される核酸分子であり、ここで、遺伝物質が複製及び／又は発現され得る。本開示を考慮して当業者に既知の任意のベクターを使用することができる。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、コスミド、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、ＤＮＡベクター又はＲＮＡベクターであり得る。当業者は、本開示を考慮して、標準的な組換え技術を通じて本出願のベクターを構築することができる。
【0128】
本出願のベクターは、発現ベクターであり得る。本明細書中で使用される場合、用語「発現ベクター」は、転写され得るＲＮＡをコードする核酸を含む任意の型の遺伝子構築物を指す。発現ベクターとしては、組換えタンパク質発現のためのベクター（例えば、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクター）、及び対象の組織における発現のために対象に核酸を送達するためのベクター（例えば、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクター）が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの因子に依存し得ることは、当業者によって理解されるであろう。
【0129】
本出願のベクターは、様々な調節配列を含有することができる。本明細書中で使用される場合、用語「調節配列」は、複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定、及び／又は宿主若しくは生物への核酸若しくはその誘導体のうちの１つ（すなわち、ｍＲＮＡ）の輸送を含む、核酸分子の機能調節を可能にするか、これに寄与するか、又はこれを調節する任意の配列を指す。本開示との関連において、この用語は、プロモータ、エンハンサ及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びｍＲＮＡ安定性に影響を及ぼすエレメント）を包含する。
【0130】
本出願のいくつかの実施形態において、ベクターは非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの例としては、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、非ウイルスベクターはＤＮＡプラスミドである。「ＤＮＡプラスミドベクター」、「プラスミドＤＮＡ」又は「プラスミドＤＮＡベクター」と互換的に使用される「ＤＮＡプラスミド」は、好適な宿主細胞中で自己複製することができる二本鎖の一般的に環状のＤＮＡ配列を指す。コードされたポリヌクレオチドの発現のために使用されるＤＮＡプラスミドは、典型的には、複製起点、マルチクローニング部位、及び選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子であり得る）を含む。使用され得る好適なＤＮＡプラスミドの例としては、周知の発現系（原核生物系及び真核生物系の両方を含む）において使用するための市販の発現ベクター、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるタンパク質の産生及び／又は発現のために使用することができるｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）；酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株における産生及び／又は発現のために使用することができるｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；昆虫細胞における産生及び／又は発現のために使用することができるＭＡＸＢＡＣ（登録商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；哺乳類細胞における高レベルの構成的タンパク質発現のために使用することができるｐｃＤＮＡ（商標）又はｐｃＤＮＡ３（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；並びにほとんどの哺乳類細胞における目的のタンパク質の高レベル一過性発現のために使用することができるｐＶＡＸ又はｐＶＡＸ－１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。任意の市販のＤＮＡプラスミドの骨格は、日常的な技術及び容易に入手可能な出発物質を使用することによって、宿主細胞におけるタンパク質発現を最適化するように、例えば、特定のエレメント（例えば、複製起点及び／又は抗生物質耐性カセット）の配向を逆転させるように、プラスミドに対して内因性のプロモータ（例えば、抗生物質耐性カセット中のプロモータ）を置換するように、及び／又は転写されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子のコード配列）を置換するように修飾され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。
【0131】
好ましくは、ＤＮＡプラスミドは、哺乳類宿主細胞におけるタンパク質発現に適した発現ベクターである。哺乳類宿主細胞におけるタンパク質発現に適した発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ（商標）、ｐｃＤＮＡ３（商標）、ｐＶＡＸ、ｐＶＡＸ－１、ＡＤＶＡＸ、ＮＴＣ８４５４などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、発現ベクターは、ｐＶＡＸ－１に基づいており、哺乳類細胞におけるタンパク質発現を最適化するように更に修飾され得る。ｐＶＡＸ－１は、ＤＮＡワクチンにおいて一般的に使用されるプラスミドであり、強力なヒト最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ－ＩＥ）プロモータ、続いてウシ成長ホルモン（bovine growth hormone、ｂＧＨ）由来ポリアデニル化配列（ｐＡ）を含有する。ｐＶＡＸ－１は、細菌プラスミド増殖を可能にする小さな原核生物プロモータによって駆動されるｐＵＣ複製起点及びカナマイシン耐性遺伝子を更に含有する。
【0132】
本出願のベクターはまた、ウイルスベクターであり得る。一般に、ウイルスベクターは、非感染性にされた改変ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡを保有する遺伝子操作されたウイルスであるが、依然としてウイルスプロモータ及び導入遺伝子を含有し、したがってウイルスプロモータを介した導入遺伝子の翻訳を可能にする。ウイルスベクターはしばしば感染性配列を欠いているので、それらは大規模トランスフェクションのためにヘルパーウイルス又はパッケージング株を必要とする。特定の実施形態において、本明細書に記載されるベクターは、例えば、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、ワクシニアウイルス（例えば、改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara、ＭＶＡ））などの組換えポックスウイルス、セムリキ森林ウイルスなどの組換えアルファウイルス、組換え麻疹ウイルスなどの組換えパラミクソウイルス、又は別の組換えウイルスである。使用することができるウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に記載のベクターはＭＶＡベクターである。ベクターはまた、非ウイルスベクターであり得る。
【0133】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated viral、ＡＡＶ）ベクターである。「ＡＡＶ」という用語は、任意の血清型のＡＡＶ及び任意の種のＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶなどを含む。いくつかのいくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルスベクターである。組換えアデノウイルスベクターは、例えば、ヒトアデノウイルス（human adenovirus、ＨＡｄＶ若しくはＡｄＨｕ）、あるいはチンパンジー若しくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ若しくはsimian adenovirus、ＳＡｄＶ）又はアカゲザルアデノウイルス（rhesus adenovirus、ｒｈＡｄ）などのシミアンアデノウイルスに由来し得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、組換えヒトアデノウイルスベクター、例えば、組換えヒトアデノウイルス血清型２６、又は組換えヒトアデノウイルス血清型５、４、３５、７、４８などのうちのいずれか１つである。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、ｒｈＡｄベクター、例えば、ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２、又はｒｈＡｄ５３である。本出願に有用な組換えウイルスベクターは、本開示を考慮して当技術分野において既知の方法を使用して調製することができる。例えば、遺伝暗号の縮重を考慮して、同じポリペプチドをコードするいくつかの核酸配列を設計することができる。本出願のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドは、任意選択的に、宿主細胞（例えば、細菌細胞又は哺乳類細胞）における適切な発現を確実にするためにコドン最適化することができる。コドン最適化は、当技術分野において広く適用されている技術であり、コドン最適化ポリヌクレオチドを得るための方法は、本開示を考慮すれば当業者に周知であろう。
【0134】
本出願のベクター、例えば、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクター（特にＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、若しくはハイブリッドＡＡＶを含む肝臓指向性を有する任意の他のＡＡＶ、又はアデノウイルスベクター）は、ベクターのポリヌクレオチド配列によってコードされるＨＢＶ ＴＡＬＥＮの複製及び発現を含むがこれらに限定されないベクターの従来の機能を確立するための任意の調節エレメントを含むことができる。調節エレメントとしては、プロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化シグナル、翻訳終止コドン、リボソーム結合エレメント、転写ターミネーター、選択マーカー、複製起点などが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、１つ以上の発現カセットを含み得る。「発現カセット」は、細胞機構にＲＮＡ及びタンパク質を作製するように指示するベクターの一部である。発現カセットは、典型的には、３つの構成要素：であるプロモータ配列、オープンリーディングフレーム、及び任意選択的にポリアデニル化シグナルを含む３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンから終止コドンまでの目的のタンパク質（例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）のコード配列を含有するリーディングフレームである。発現カセットの調節エレメントは、目的のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、その最も広い合理的な文脈で解釈されるべきであり、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと機能的な関係に置かれる場合、「作動可能に連結されている」。例えば、プロモータは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。本明細書に記載される発現カセットにおける使用に適した任意の成分は、本出願のベクターを調製するために任意の組み合わせ及び任意の順序で使用することができる。
【0135】
ベクターは、目的のＨＢＶ ＴＡＬＥＮの発現を制御するために、好ましくは発現カセット内にプロモータ配列を含むことができる。「プロモータ」という用語は、その従来の意味で使用され、作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するヌクレオチド配列を指す。プロモータは、それが転写するヌクレオチド配列の近くの同じ鎖上に位置する。プロモータは、構成的、誘導性、又は抑制性であり得る。プロモータは、天然に存在するか又は合成であり得る。プロモータは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源に由来し得る。プロモータは、同種プロモータ（すなわち、ベクターと同じ遺伝子源に由来する）又は異種プロモータ（すなわち、異なるベクター又は遺伝子源に由来する）であり得る。例えば、使用されるベクターがＤＮＡプラスミドである場合、プロモータは、プラスミドに対して内因性（同種）であり得るか、又は他の供給源に由来し得る（異種）。好ましくは、プロモータは、発現カセット内のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。
【0136】
使用され得るプロモータの例としては、シミアンウイルス４０（simian virus 40、ＳＶ４０）由来のプロモータ、マウス乳がんウイルス（mouse mammary tumor、ＭＭＴＶ）プロモータ、レンチウイルスプロモータ（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus、ＨＩＶ）又はウシ免疫不全ウイルス（bovine immunodeficiency virus、ＢＩＶ）の長い末端反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）プロモータ）、モロニーウイルスプロモータ、トリ白血病ウイルス（avian leukosis virus、ＡＬＶ）プロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ（例えば、ＣＭＶ最初期プロモータ（ＣＭＶ－ＩＥ））、エプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr virus、ＥＢＶ）プロモータ、又はラウス肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus、ＲＳＶ）プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。プロモータはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子由来のプロモータであり得る。プロモータは、天然又は合成の筋肉又は皮膚特異的プロモータなどの組織特異的プロモータであり得る。
【0137】
ベクターは、発現された転写物を安定化させ、ＲＮＡ転写物の核外輸送を増強し、かつ／又は転写－翻訳共役を改善する追加のポリヌクレオチド配列を含むことができる。このような配列の例としては、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサ配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、典型的には、ベクターの発現カセット内の目的のタンパク質（例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）のコード配列の下流に位置する。エンハンサ配列は、転写因子によって結合される場合に、関連する遺伝子の転写を増強する調節ＤＮＡ配列である。エンハンサ配列は、好ましくは、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチド配列の上流であるが、ベクターの発現カセット内のプロモータ配列の下流に位置する。
【0138】
本開示を考慮して当業者に既知の任意のポリアデニル化シグナルを使用することができる。例えば、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（human growth hormone、ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、又はヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。
【0139】
本開示を考慮して当業者に既知の任意のエンハンサ配列を使用することができる。例えば、エンハンサ配列は、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はウイルスエンハンサ（例えば、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、若しくはＥＢＶ由来のエンハンサ）であり得る。特定のエンハンサの例としては、ウッドチャックＨＢＶ転写後調節エレメント（Woodchuck HBV Post-transcriptional regulatory element、ＷＰＲＥ）、ヒトアポリポタンパク質Ａ１前駆体（apolipoprotein A1 precursor、ＡｐｏＡＩ）由来のイントロン／エキソン配列、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（human T-cell leukemia virus type 1、ＨＴＬＶ－１）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）の非翻訳Ｒ－Ｕ５ドメイン、スプライシングエンハンサ、合成ウサギβ－グロビンイントロン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0140】
ベクターは、タンパク質の局在化のためのシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。好ましくは、シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチド配列の上流、例えば、Ｎ末端領域に位置する。好ましくは、シグナル配列は、ＴＡＬＥＮタンパク質の核への局在化を指示してＤＮＡ結合及び編集を容易にすることができる核局在化シグナル（nuclear localization signal、ＮＬＳ）配列である。本開示を考慮して当技術分野において既知の任意のシグナルペプチドを使用することができる。例えば、シグナルペプチドは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号３１）、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号３２）、ＥＧＬ－１３ ＮＬＳ（ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ）（配列番号３３）、ｃ－Ｍｙｃがん原タンパク質ＮＬＳ（ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ）（配列番号３４）、又はＴＵＳタンパク質ＮＬＳ（ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ）（配列番号３５）であり得る。
【0141】
ベクターは、ポリペプチド又はペプチド親和性タグ、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（glutathione S-transferase、ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein、ＧＦＰ）並びに黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein、ＹＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙなどの他の蛍光タンパク質、例えば、マルトース結合タンパク質、プロテインＡ、ＦＬＡＧタグ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３６）又はＥＹＫＥＥＥＥＫ（配列番号３７）、ヘキサヒスチジン（例えば、ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号３８）、ｍｙｃタグ（例えば、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号３９）、インフルエンザＨＡタグ（例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号４０）、ＡｃＶ５タグ（ＳＷＫＤＡＳＧＷＳ）（配列番号４１）、ＡＬＦＡ－タグ（例えば，ＳＲＬＥＥＥＬＲＲＲＬＴＥ）（配列番号４２）、ＡｖｉＴａｇ（例えば、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号４３）、Ｅ－タグ（例えば、ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）（配列番号４４）、Ｓ－タグ（例えば、ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）（配列番号４５）、Ｓｔｒｅｐ－タグ（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（配列番号４６）、Ｔ７タグ（例えば、ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）（配列番号４７）、Ｔｙ１タグ（例えば、ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ）（配列番号４８）、Ｖ５タグ（例えば、ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）（配列番号４９）、ＶＳＶ－Ｇタグ（例えば、ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）（配列番号５０）、又はＸｐｒｅｓｓタグ（例えば、ＤＬＹＤＤＤＤＫ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。親和性タグ又はレポーター融合物は、翻訳融合物が生成されるように、目的のポリペプチド（例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）のリーディングフレームを親和性タグをコードする遺伝子のリーディングフレームに接合する。融合遺伝子の発現は、目的のポリペプチド（例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）及び親和性タグの両方を含む単一のポリペプチドの翻訳をもたらす。親和性タグが利用されるいくつかの場合において、プロテアーゼ認識部位をコードするＤＮＡ配列は、親和性タグ及び目的のポリペプチド（例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）についてのリーディングフレームの間に融合されるだろう。
【0142】
ＤＮＡプラスミドなどのベクターはまた、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択及び維持のための細菌複製起点及び抗生物質耐性発現カセットを含むことができる。細菌の複製起点及び抗生物質耐性カセットは、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードする発現カセットと同じ配向で、又は反対（逆）の配向でベクター中に位置することができる。複製起点（origin of replication、ＯＲＩ）は、複製が開始される配列であり、プラスミドが細胞内で複製及び生存することを可能にする。本出願における使用に適したＯＲＩの例としては、ＣｏｌＥ１、ｐＭＢ１、ｐＵＣ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６Ｋ、及び１５Ａが挙げられるが、これらに限定されず、好ましくはｐＵＣである。
【0143】
細菌細胞における選択及び維持のための発現カセットは、典型的には、抗生物質耐性遺伝子に作動可能に連結されたプロモータ配列を含む。好ましくは、抗生物質耐性遺伝子に作動可能に連結されたプロモータ配列は、目的のタンパク質（例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ配列とは異なる。抗生物質耐性遺伝子はコドン最適化することができ、抗生物質耐性遺伝子の配列組成は通常、細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に合わせて調整される。本開示を考慮して当業者に既知の任意の抗生物質耐性遺伝子が使用され得、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、及びテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔｒ）、並びにクロラムフェニコール、ブレオマイシン、スペクチノマイシン、カルベニシリンなどに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0144】
本出願のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチド及び発現ベクターは、本開示を考慮して当技術分野において既知の任意の方法によって作製することができる。例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知である標準的な分子生物学技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）などを使用して発現ベクターに導入又は「クローニング」することができる。
【0145】
本明細書中で使用される場合、核酸配列又はポリペプチド配列に関する用語「パーセント同一性」又は「相同性」又は「共有配列同一性」又は「パーセント（％）配列同一性」は、最大パーセント同一性について配列をアラインメントさせ、必要な場合、最大パーセント相同性を達成するためにギャップを導入した後の、既知のポリヌクレオチド又はポリペプチドと同一である候補配列中のヌクレオチド残基又はアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。Ｎ末端又はＣ末端の挿入又は欠失は、相同性に影響を及ぼすと解釈されるべきではなく、約３０未満、約２０未満、又は約１０未満、又は５未満のアミノ酸残基のヌクレオチド又はポリペプチド配列への内部欠失及び／又は挿入は、相同性に影響を及ぼすと解釈されるべきではない。ヌクレオチド又はアミノ酸配列レベルでの相同性又は同一性は、配列類似性検索のために調整されたプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９－３４０２、及びＫａｒｌｉｎ（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，２２６４－２２６８）によって使用されるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（基本ローカルアラインメント検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool））分析によって決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、まず、問い合わせ配列とデータベース配列との間の類似するセグメント（ギャップあり及びギャップなし）を考慮し、次いで、同定される全てのマッチの統計的有意性を評価し、最後に、予め選択された有意性の閾値を満たすマッチのみを要約することである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の考察については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６，１１９－１２９を参照されたい。ヒストグラム、記述、アラインメント、期待値（すなわち、データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性の閾値）、カットオフ、マトリックス、及びフィルター（低複雑性）のための検索パラメータは、デフォルト設定であり得る。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、長さが８５を超える（ヌクレオチド塩基又はアミノ酸）問い合わせ配列について推奨されているＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，１０９１５－１０９１９）。
【0146】
ヌクレオチド配列を比較するために設計されたｂｌａｓｔｎについて、スコアリングマトリックスは、Ｎ（すなわち、ミスマッチ残基についてのペナルティスコア）に対するＭ（すなわち、マッチする残基の対についての報酬スコア）の比によって設定され、Ｍ及びＮについてのデフォルト値は、それぞれ＋５及び－４であり得る。４つのｂｌａｓｔｎパラメータを以下のように調整することができる：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティ）、Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）、ｗｉｎｋ＝１（クエリに沿った全てのｗｉｎｋ番目の位置でワードヒットを生成する）、及びｇａｐｗ＝１６（ギャップ付きアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）。アミノ酸配列の比較のための等価なＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１、及びｇａｐｗ＝３２であり得る。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間のＢＥＳＴＦＩＴ（登録商標）比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティ）及びＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を使用することができ、タンパク質比較における同等の設定は、ＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２であり得る。
【0147】
本明細書における核酸又はポリペプチド配列、例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ単量体、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼ触媒ドメイン、標的配列、スペーサー配列、調節エレメント、非翻訳領域、エンハンサ配列、プロモータの配列の開示において、元の配列に基づくか又は由来すると考えられる配列も開示される。したがって、開示される配列は、それぞれ、配列番号１～５５などの本明細書に記載される任意のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の全長ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列、及びそれらの断片と、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性、又は８５～９９％、若しくは８５～９５％、若しくは９０～９９％、若しくは９５～９９％、若しくは９７～９９％、若しくは９８～９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を含む。本明細書中に開示される配列のいずれかの断片又は部分もまた開示される。配列の断片又は部分は、配列全体の少なくとも５個若しくは少なくとも７個若しくは少なくとも１０個若しくは少なくとも２０個若しくは少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、１５０個以上若しくは５～１０個若しくは１０～１２個若しくは１０～１５個若しくは１５～２０個若しくは２０～４０個若しくは２０～５０個若しくは３０～５０若しくは３０～７５個若しくは３０～１００個のアミノ酸又は核酸残基、又は少なくとも１００個若しくは少なくとも２００個若しくは少なくとも３００個若しくは少なくとも４００個若しくは少なくとも５００個若しくは少なくとも６００個若しくは少なくとも７００個若しくは少なくとも８００個若しくは少なくとも９００個若しくは少なくとも１０００個若しくは１００～２００個若しくは１００～５００個若しくは１００～１０００個若しくは５００～１０００個のアミノ酸又は核酸残基、あるいはこれらの量であるが、配列番号１～５５のうちのいずれか又は本明細書中に開示されるいずれかの断片の５００個未満若しくは７００個未満若しくは１０００個未満若しくは２０００個未満の連続するアミノ酸又は核酸のうちのいずれかを有する配列を含み得る。例えば、少なくとも１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つのアミノ酸残基が、挿入及び置換を含む開示された配列のＮ末端及び／若しくはＣ末端、かつ／又はその中に挿入されている、そのような配列のバリアント、並びにそのようなバリアントをコードする核酸配列も開示される。意図されるバリアントは、更に又は代わりに、例えば、相同組換え又は部位特異的変異誘発若しくはＰＣＲ変異誘発による所定の突然変異を含むバリアント、及び他の種の対応するポリペプチド若しくは核酸（本明細書中に記載されるもの、挿入及び置換を含むポリペプチド若しくは核酸のファミリーの対立遺伝子若しくは他の天然に存在するバリアントを含むがこれらに限定されない）；並びに／又はポリペプチドが、挿入及び置換を含む天然に存在するアミノ酸以外の部分（例えば、酵素のような検出可能な部分）での置換、化学的手段、酵素的手段、若しくは他の適切な手段によって共有結合的に改変されている誘導体を含み得る。本明細書に記載される核酸配列は、ｍＲＮＡ配列であり得る。
【0148】
「天然に存在しない」、「組換え」、又は「操作された」核酸分子又はポリヌクレオチド配列という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトの介入によって改変された核酸分子又は天然に存在しないポリヌクレオチド配列を指す。非限定的な例として、組換え核酸分子は、１）例えば、化学的又は酵素的技術を使用して（例えば、化学的核酸合成の使用によって、又は核酸分子の複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化を含む）、又は組換え（相同組換え及び部位特異的組換えを含む）のための酵素の使用によって）、インビトロで合成又は修飾されている、２）天然に結合していない結合ヌクレオチド配列を含む、３）天然に存在する核酸分子配列に対して１つ以上のヌクレオチドを欠くように分子クローニング技術を使用して操作されている、かつ／又は４）天然に存在する核酸配列に対して１つ以上の配列変化又は再配列を有するように分子クローニング技術を使用して操作されている。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、インビトロポリメラーゼ反応（複数可）によって生成された、又はリンカーが結合された、又はクローニングベクター若しくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子と同様に、組換えＤＮＡ分子である。
【0149】
脂質ベースの製剤
標的細胞への核酸の細胞内送達に基づく療法は、細胞外及び細胞内障壁の両方に直面する。実際、裸の核酸物質は、それらの毒性、血清中での低い安定性、迅速な腎クリアランス、標的細胞による取り込みの減少、食細胞取り込み、及び免疫応答を活性化するそれらの能力、それらの臨床開発を妨げる全ての特徴のために、容易に全身投与することができない。外因性核酸物質（例えば、ｍＲＮＡ）がヒト生物系に入ると、それは細網内皮系（reticuloendothelial system、ＲＥＳ）によって外来病原体として認識され、血管系内又は外の標的細胞に遭遇する機会を有する前に血液循環から除去される。血流中の裸の核酸の半減期はおよそ数分であることが報告されている（Ｋａｗａｂａｔａ Ｋ，Ｔａｋａｋｕｒａ Ｙ，Ｈａｓｈｉｄａ Ｍ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１９９５ Ｊｕｎ；１２（６）：８２５－３０）。化学修飾及び適切な送達方法は、ＲＥＳによる取り込みを低減し、核酸を遍在性ヌクレアーゼによる分解から保護することができ、これは核酸ベースの療法の安定性及び有効性を増加させる。更に、ＲＮＡ又はＤＮＡは、細胞による取り込みに好ましくないアニオン性親水性ポリマーであり、これもまた表面でアニオン性である。したがって、核酸ベースの療法の成功は、遺伝物質を標的細胞に効率的かつ効果的に送達し、最小限の毒性で十分なレベルの発現をインビボで得ることができるビヒクル又はベクターの開発に大きく依存する。
標的細胞への核酸の細胞内送達に基づく療法は、細胞外及び細胞内障壁の両方に直面する。実際、裸の核酸物質は、それらの毒性、血清中での低い安定性、迅速な腎クリアランス、標的細胞による取り込みの減少、食細胞取り込み、及び免疫応答を活性化するそれらの能力、それらの臨床開発を妨げる全ての特徴のために、容易に全身投与することができない。外因性核酸物質（例えば、ｍＲＮＡ）がヒト生物系に入ると、それは細網内皮系（reticuloendothelial system、ＲＥＳ）によって外来病原体として認識され、血管系内又は外の標的細胞に遭遇する機会を有する前に血液循環から除去される。血流中の裸の核酸の半減期はおよそ数分であることが報告されている（Ｋａｗａｂａｔａ Ｋ，Ｔａｋａｋｕｒａ Ｙ，Ｈａｓｈｉｄａ Ｍ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１９９５ Ｊｕｎ；１２（６）：８２５－３０）。化学修飾及び適切な送達方法は、ＲＥＳによる取り込みを低減し、核酸を遍在性ヌクレアーゼによる分解から保護することができ、これは核酸ベースの療法の安定性及び有効性を増加させる。更に、ＲＮＡ又はＤＮＡは、細胞による取り込みに好ましくないアニオン性親水性ポリマーであり、これもまた表面でアニオン性である。したがって、核酸ベースの療法の成功は、遺伝物質を標的細胞に効率的かつ効果的に送達し、最小限の毒性で十分なレベルの発現をインビボで得ることができるビヒクル又はベクターの開発に大きく依存する。
【0150】
更に、標的細胞への内在化の際に、核酸送達ベクターは、エンドソーム捕捉、リソソーム分解、ベクターからの核酸アンパッキング、核膜を横切るトランスロケーション（ＤＮＡの場合）、及び細胞質での放出（ＲＮＡの場合）を含む細胞内障壁によって攻撃される。したがって、核酸ベースの療法の成功は、十分なレベルの遺伝子発現などの所望の活性を得るために核酸を細胞内部の標的部位に送達するベクターの能力に依存する。
【0151】
いくつかの遺伝子療法は、ウイルス送達ベクター（例えば、ＡＡＶ）を首尾よく利用することができたが、脂質ベースの製剤は、それらの生体適合性及びそれらの大規模生産の容易さに起因して、ＲＮＡ及び他の核酸化合物のための最も有望な送達系のうちの１つとしてますます認識されている。脂質ベースの核酸療法における最も顕著な進歩のうちの１つは２０１８年８月に起こり、パチシラン（Patisiran）（ＡＬＮ－ＴＴＲ０２）が、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ）の両方によって承認された最初のｓｉＲＮＡ治療薬となった。ＡＬＮ－ＴＴＲ０２は、いわゆる安定核酸脂質粒子（Stable Nucleic Acid Lipid Particle、ＳＮＡＬＰ）トランスフェクション技術に基づくｓｉＲＮＡ製剤である。パチシランの成功にもかかわらず、脂質製剤を介したｍＲＮＡを含む核酸治療薬の送達は、依然として開発中である。
【0152】
いくつかの当技術分野で認識されている核酸治療薬のための脂質製剤化送達ビヒクルとしては、様々な実施形態によれば、ポリエチレンイミン（polyethyleneimine、ＰＥＩ）などのポリマーベースの担体、リピドイド含有製剤、脂質ナノ粒子及びリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、多小胞リポソーム、プロテオリポソーム、天然及び合成由来エキソソームの両方、天然、合成及び半合成ラメラ体、ナノ微粒子、ミセル、並びにエマルジョンが挙げられる。
【0153】
これらの脂質製剤は、その構造及び組成が異なり、急速に発展している分野で予想され得るように、いくつかの異なる用語が、単一の種類の送達ビヒクルを説明するために当該分野で使用されている。同時に、脂質製剤に関する用語は、科学文献全体を通して頻繁に混同されており、この一貫性のない使用は、脂質製剤に関するいくつかの用語の正確な意味について混乱を引き起こしている。いくつかの潜在的な脂質製剤の中で、リポソーム、カチオン性リポソーム、及び脂質ナノ粒子は、本開示の目的のために本明細書において具体的に詳細に記載され、定義される。
【0154】
脂質－ｍＲＮＡ製剤
本明細書に開示されるｍＲＮＡ、その薬学的に許容される塩、及び／又はＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードする核酸の組み合わせは、脂質製剤（すなわち、脂質ベースの送達ビヒクル）に組み込むことができる。
本明細書に開示されるｍＲＮＡ、その薬学的に許容される塩、及び／又はＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードする核酸の組み合わせは、脂質製剤（すなわち、脂質ベースの送達ビヒクル）に組み込むことができる。
【0155】
本開示との関連において、脂質ベースの送達ビヒクルは、典型的には、所望のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを標的細胞又は組織に輸送する役割を果たす。脂質ベースの送達ビヒクルは、当該分野において既知の任意の好適な脂質ベースの送達ビヒクルであり得る。いくつかの実施形態において、脂質ベースの送達ビヒクルは、本開示のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを含有するリポソーム、カチオン性リポソーム、又は脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、脂質ベースの送達ビヒクルは、ナノ粒子又は脂質分子の二重層、及び本開示のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、脂質二重層は、好ましくは、中性脂質又はポリマーを更に含む。「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで非荷電又は中性双性イオン形態のいずれかで存在する脂質種を意味する。生理学的ｐＨにおいて、このような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが挙げられる。いくつかの実施形態において、脂質製剤は、好ましくは液体媒体を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、好ましくは、核酸を更に封入する。いくつかの実施形態において、脂質製剤は、好ましくは、核酸及び中性脂質又はポリマーを更に含む。いくつかの実施形態において、脂質製剤は、好ましくは核酸を封入する。
【0156】
本明細書は、脂質製剤内に封入された１つ以上の治療用ｍＲＮＡ分子を含む脂質製剤を提供する。いくつかの実施形態において、脂質製剤はリポソームを含む。いくつかの実施形態において、脂質製剤はカチオン性リポソームを含む。いくつかの実施形態において、脂質製剤は脂質ナノ粒子を含む。
【0157】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせは、脂質製剤中のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせが水溶液中でヌクレアーゼ分解に対して耐性であるように、脂質製剤の脂質部分内に完全に封入されている。「完全に封入された」という用語は、遊離ＲＮＡを有意に分解する血清又はヌクレアーゼアッセイへの曝露後に、核酸－脂質粒子中の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）が有意に分解されないことを意味する。完全に封入されている場合、通常１００％の遊離核酸を分解する処理において、好ましくは、粒子中の核酸の２５％未満が分解され、より好ましくは、粒子中の核酸の１０％未満が、最も好ましくは５％未満が分解される。本明細書で使用される場合、「完全に封入された」はまた、核酸－脂質粒子がインビボ投与時にそれらの成分部分に急速に分解しないことを意味する。他の実施形態において、本明細書に記載される脂質製剤は、ヒトなどの哺乳類に対して実質的に非毒性である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子の組み合わせは、同じ脂質ナノ粒子内に封入される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子の組み合わせ中の各ｍＲＮＡ分子は、個々の脂質ナノ粒子に独立して封入される。
【0158】
本開示の脂質製剤はまた、典型的には、約１：１～約１００：１、約１：１～約５０：１、約２：１～約４５：１、約３：１～約４０：１、約５：１～約３８：１、又は約６：１～約４０：１、又は約７：１～約３５：１、又は約８：１～約３０：１、又は約１０：１～約２５：１、又は約８：１～約１２：１、又は約１３：１～約１７：１、又は約１８：１～約２４：１、又は約２０：１～約３０：１の総脂質：ＲＮＡ比（質量／質量比）を有する。いくつかの好ましい実施形態において、総脂質：ＲＮＡ比（質量／質量比）は、約１０：１～約２５：１である。比は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値又はサブ値であり得る。
【0159】
本開示の脂質製剤は、典型的には、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、又は約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、又は約１５０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。直径は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値又はサブ値であり得る。加えて、核酸は、本開示の脂質ナノ粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性である。
【0160】
好ましい実施形態において、脂質製剤は、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせ、カチオン性脂質（例えば、本明細書に記載される１つ以上のカチオン性脂質又はその塩）、リン脂質、及び粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、１つ以上のＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含む。脂質製剤はコレステロールも含むことができる。「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質を意味する。そのような脂質コンジュゲートとしては、例えば、ジアルキルオキシプロピルにカップリングしたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールにカップリングしたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールにカップリングしたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンにカップリングしたＰＥＧ、及びセラミドにカップリングしたＰＥＧなどのＰＥＧ－脂質コンジュゲート、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミドオリゴマー、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧ又はＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートされ得るか、又はリンカー部分を介して脂質に連結され得る。例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧ又はＰＯＺを脂質にカップリングするのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。特定の好ましい実施形態において、非エステル含有リンカー部分（例えば、アミド又はカルバメート）が使用される。
【0161】
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、正の親水性頭部基と、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の疎水性（すなわち、無極性基を有する）脂肪酸又は脂肪アルキル鎖と、これら２つのドメイン間のコネクターと、を有する両親媒性脂質及びそれらの塩を指す。イオン化可能又はプロトン化可能なカチオン性脂質は、典型的には、そのｐＫａ未満のｐＨでプロトン化され（すなわち、正に荷電され）、ｐＫａを超えるｐＨで実質的に中性である。好ましいイオン化可能なカチオン性脂質は、典型的には約７．４である生理学的ｐＨよりも低いｐＫａを有するものである。本開示のカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質とも呼ばれ得る。カチオン性脂質は、プロトン化可能な三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）頭部基を有する「アミノ脂質」であり得る。いくつかのアミノの例示的なアミノ脂質は、Ｃ１８アルキル鎖を含むことができ、各アルキル鎖は、独立して、０～３個の（例えば、０、１、２、又は３個の）二重結合、及び頭部基とアルキル鎖との間のエーテル、エステル、又はケタール結合を有する。そのような陽イオン性脂質としては、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ－ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２、及びＣ２Ｋとしても知られる）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ｙ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＭＣ２としても知られる）、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（ＭＣ３としても知られる）、及び（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂｌ １としても知られる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0162】
本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電している脂質を指す。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロール（palmitoyloleyolphosphatidylglycerol、ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に接合した他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。
【0163】
核酸－脂質製剤において、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせは、製剤の脂質部分内に完全に封入されていてもよく、それによって核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを含む脂質製剤は、脂質製剤の脂質部分内に完全に封入され、それによって核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。特定の事例では、脂質製剤中のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせは、３７℃で少なくとも２０、３０、４５、又は６０分間ヌクレアーゼへ粒子を曝露した後にも実質的に分解されない。特定の他の事例では、脂質製剤中のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせは、３７℃で少なくとも３０、４５、若しくは６０分間、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、若しくは３６時間血清中で製剤をインキュベーションした後にも実質的に分解されない。他の実施形態において、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせは、製剤の脂質部分と複合体化される。
【0164】
核酸との関連において、完全な封入は、膜不透過性蛍光色素排除アッセイを実行することによって判定され得、このアッセイは、核酸と会合した場合に増強された蛍光を有する色素を使用する。封入は、色素を脂質製剤に添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察された蛍光と比較することによって判定される。脂質層の界面活性剤が媒介する破壊は、封入された核酸を放出させ、それが膜不透過性色素と相互作用することを可能にする。核酸封入は、Ｅ＝（Ｉ０－Ｉ）／Ｉ０として計算することができ、式中、Ｉ及びＩ０は、界面活性剤の添加前後の蛍光強度を指す。
【0165】
他の実施形態において、本開示は、複数の核酸－リポソーム、核酸－カチオン性リポソーム、又は核酸－脂質ナノ粒子を含む核酸－脂質組成物を提供する。いくつかの実施形態において、核酸－脂質組成物は、複数のｍＲＮＡ－リポソームを含む。いくつかの実施形態において、核酸－脂質組成物は、複数のｍＲＮＡ－カチオン性リポソームを含む。いくつかの実施形態において、核酸－脂質組成物は、複数のｍＲＮＡ－脂質ナノ粒子を含む。
【0166】
いくつかの実施形態において、脂質製剤は、粒子の約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約３０％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、又は少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％若しくは約９９％（又はその任意の分数若しくはその中の範囲）がその中に封入されたｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを有するような、製剤の脂質部分内に完全に封入されたｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを含む。量は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値又はサブ値であり得る。
【0167】
脂質製剤の意図される用途に応じて、成分の割合を変えることができ、特定の製剤の送達効率は、当技術分野において既知のアッセイを使用して測定することができる。
【0168】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される発現可能なポリヌクレオチド及びｍＲＮＡ構築物は、脂質製剤化される。脂質製剤は、好ましくは、リポソーム、カチオン性リポソーム、及び脂質ナノ粒子から選択されるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態において、脂質製剤は、
（ａ）本開示のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせと、
（ｂ）カチオン性脂質と、
（ｃ）凝集低減剤（例えば、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）脂質又はＰＥＧ修飾脂質）と、
（ｄ）任意選択的に、非カチオン性脂質（中性脂質など）と、
（ｅ）任意選択的に、ステロールと、を含む、カチオン性リポソーム又は脂質ナノ粒子（lipid nanoparticle、ＬＮＰ）である。
（ａ）本開示のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせと、
（ｂ）カチオン性脂質と、
（ｃ）凝集低減剤（例えば、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）脂質又はＰＥＧ修飾脂質）と、
（ｄ）任意選択的に、非カチオン性脂質（中性脂質など）と、
（ｅ）任意選択的に、ステロールと、を含む、カチオン性リポソーム又は脂質ナノ粒子（lipid nanoparticle、ＬＮＰ）である。
【0169】
好ましくは、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを封入する脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質と、アニオン性脂質、双性イオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、リン脂質、糖脂質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの他の脂質と、を含む。
【0170】
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質である。一実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）少なくとも１種のカチオン性脂質と、（ｉｉ）ヘルパー脂質と、（ｉｉｉ）ステロール（例えば、コレステロール）と、（ｉｖ）約２０％～約４０％のイオン化可能なカチオン性脂質：約２５％～約４５％のヘルパー脂質：約２５％～約４５％のステロールのモル比のＰＥＧ－脂質と、約０．５～５％のＰＥＧ－脂質と、からなる。例示的なカチオン性脂質（イオン化可能なカチオン性脂質を含む）、ヘルパー脂質（例えば、中性脂質）、ステロール、及びリガンド含有脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質）は、本明細書において以下に記載される。
【0171】
特定の脂質及びそれらの相対％組成物の選択は、所望の治療効果、意図されるインビボ送達標的、並びに計画された投薬レジメン及び頻度を含むいくつかの因子に依存する。一般に、高い効力（すなわち、ノックダウン活性又は翻訳効率などの治療効果）及び迅速な組織クリアランスをもたらす生分解性の両方に対応する脂質が最も好ましい。しかしながら、生分解性は、対象内への１回又は２回のみの投与が意図される製剤についてはあまり重要ではない場合がある。更に、脂質組成物は、脂質製剤がインビボ投与及び意図された標的へのその移動の間はその形態を保存するが、その後、標的細胞への取り込みの際に活性薬剤を放出することができるように、注意深い操作を必要とし得る。したがって、いくつかの製剤は、典型的には、脂質の最良の可能なモル比並びに有効成分に対する総脂質の比での脂質の最良の可能な組み合わせを見出すために評価される必要がある。
【0172】
好適な脂質成分及び脂質ナノ粒子を製造する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２３４４２、Ｕ．Ｓ．８，０５８，０６９、Ｕ．Ｓ．８，８２２，６６８、Ｕ．Ｓ．９，７３８，５９３、Ｕ．Ｓ．９，１３９，５５４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６６２４２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３０２１８、ＰＣＴ／２０１７／０１５８８６、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６７７５６（これらの内容は参照により組み込まれる）に記載されている。
【0173】
カチオン性脂質
脂質製剤は、好ましくは、カチオン性リポソーム又は脂質ナノ粒子を形成するのに適したカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に荷電した膜に結合して取り込みを誘導することができるので、核酸送達について広く研究されている。一般に、カチオン性脂質は、正の親水性頭部基と、２つ（又はそれ以上）の親油性テール、又はステロイド部分と、これらの２つのドメイン間のコネクターと、を含有する両親媒性物質である。好ましくは、カチオン性脂質は、ほぼ生理学的ｐＨで正味の正電荷を有する。カチオン性リポソームは、伝統的に、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴ、及びｓｉＲＮＡ／小ヘアピンＲＮＡ－ｓｈＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドのための最も一般的に使用される非ウイルス送達系であった。ＤＯＴＡＰ、（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルスルフェート）などのカチオン性脂質は、静電相互作用によって負に荷電した核酸と複合体又はリポプレックスを形成することができ、高いインビトロトランスフェクション効率を提供する。
脂質製剤は、好ましくは、カチオン性リポソーム又は脂質ナノ粒子を形成するのに適したカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に荷電した膜に結合して取り込みを誘導することができるので、核酸送達について広く研究されている。一般に、カチオン性脂質は、正の親水性頭部基と、２つ（又はそれ以上）の親油性テール、又はステロイド部分と、これらの２つのドメイン間のコネクターと、を含有する両親媒性物質である。好ましくは、カチオン性脂質は、ほぼ生理学的ｐＨで正味の正電荷を有する。カチオン性リポソームは、伝統的に、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴ、及びｓｉＲＮＡ／小ヘアピンＲＮＡ－ｓｈＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドのための最も一般的に使用される非ウイルス送達系であった。ＤＯＴＡＰ、（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルスルフェート）などのカチオン性脂質は、静電相互作用によって負に荷電した核酸と複合体又はリポプレックスを形成することができ、高いインビトロトランスフェクション効率を提供する。
【0174】
本開示の脂質製剤において、カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロライド（ＤＯＴＡＰ）（Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド及び１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロライド塩としても知られる）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－ｙ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレイルオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、若しくは３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）若しくはそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３ １－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｃ１２－２００）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ）－Ｋ－ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８ ３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ）、３－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＭＣ３エーテル）、４－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルブタン－１－アミン（ＭＣ４エーテル）、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。他のカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、３Ｐ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｉ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）、及び２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＸＴＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。更に、カチオン性脂質の市販の調製物（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む）、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む））が使用され得る。
【0175】
他の好適なカチオン性脂質は、国際公開第０９／０８６５５８号、同第０９／１２７０６０号、同第１０／０４８５３６号、同第１０／０５４４０６号、同第１０／０８８５３７号、同第１０／１２９７０９号、及び同第２０１１／１５３４９３号；米国特許公開第２０１１／０２５６１７５号、同第２０１２／０１２８７６０号、及び同第２０１２／００２７８０３号；米国特許第８，１５８，６０１号；並びにＬｏｖｅｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０７（５），１８６４－６９，２０１０（これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【0176】
他の好適なカチオン性脂質としては、代替脂肪酸基及び他のジアルキルアミノ基を有するものが挙げられ、アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ－、及びＮ－プロピル－Ｎ－エチルアミノ－）が挙げられる。これらの脂質は、アミノ脂質と呼ばれるカチオン性脂質のサブカテゴリーの一部である。本明細書に記載される脂質製剤のいくつかの実施形態において、カチオン性脂質はアミノ脂質である。一般に、飽和アシル鎖が少ないアミノ脂質は、特に複合体が濾過滅菌の目的のために約０．３ミクロン未満にサイジングされる必要がある場合、より容易にサイジングされる。Ｃ１４～Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する不飽和脂肪酸を含有するアミノ脂質を使用してもよい。他の足場もまた、アミノ脂質のアミノ基及び脂肪酸又は脂肪アルキル部分を分離するために使用され得る。
【0177】
いくつかの実施形態において、脂質製剤は、特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４０６６号による式Ｉを有するカチオン性脂質を含む。これに関連して、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４０６６の開示も参照により本明細書に組み込まれる。
【0178】
いくつかの実施形態において、本開示のアミノ又はカチオン性脂質はイオン化可能であり、脂質が生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下のｐＨで正に荷電し、第２のｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨ以上で中性であるように、少なくとも１つのプロトン化可能基又は脱プロトン化可能基を有する。もちろん、ｐＨの関数としてのプロトンの付加又は除去は平衡プロセスであり、荷電又は中性脂質への言及は優勢な種の性質を指し、脂質の全てが荷電又は中性形態で存在することを必要としないことが理解されるであろう。２つ以上のプロトン化可能基若しくは脱プロトン化可能基を有する脂質、又は双性イオン性である脂質は、本開示における使用から除外されない。特定の実施形態において、プロトン化可能な脂質は、約４～約１１の範囲のプロトン化可能な基のｐＫａを有する。いくつかの実施形態において、イオン化可能なカチオン性脂質は、約５～約７のｐＫａを有する。いくつかの実施形態において、イオン化可能なカチオン性脂質のｐＫａは、約６～約７である。
【0179】
いくつかの実施形態において、脂質製剤は、式Ｉのイオン化可能なカチオン性脂質：
【0180】
【化6】
【0181】
いくつかの実施形態において、Ｘ７はＳである。
【0182】
いくつかの実施形態において、Ｘ５は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、それによって－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ６が形成され、Ｘ６は－Ｃ（Ｏ）Ｏであり、それによって－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ５が形成される。
【0183】
いくつかの実施形態において、Ｒ７及びＲ８は、各々独立して、メチル、エチル及びイソプロピルからなる群から選択される。
【0184】
いくつかの実施形態において、Ｌ５及びＬ６は、各々独立して、Ｃ１～Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ５はＣ１～Ｃ３アルキルであり、Ｌ６はＣ１～Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ６はＣ１～Ｃ２アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ５及びＬ６はそれぞれ、直鎖Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ５及びＬ６はそれぞれ、直鎖Ｃ９アルキルである。
【0185】
いくつかの実施形態において、Ｒ５及びＲ６は各々独立してアルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ６はアルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ６は、Ｃ２～Ｃ９アルケニルである。いくつかの実施形態において、アルケニルは、単一の二重結合を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ５及びＲ６はそれぞれアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は分岐アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、Ｃ９アルキル、Ｃ９アルケニル及びＣ９アルキニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、Ｃ１１アルキル、Ｃ１１アルケニル及びＣ１１アルキニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、Ｃ７アルキル、Ｃ７アルケニル及びＣ７アルキニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、－ＣＨ（（ＣＨ２ｐＣＨ３）２又は－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）（（ＣＨ２）ｐ－１ＣＨ３）であり、式中、ｐは４～８である。いくつかの実施形態において、ｐは５であり、Ｌ５はＣ１～Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態において、ｐは６であり、Ｌ５はＣ３アルキルである。いくつかの実施形態において、ｐは７である。いくつかの実施形態において、ｐは８であり、Ｌ５はＣ１～Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）（（ＣＨ２）ｐ－１ＣＨ３）からなり、式中、ｐは７又は８である。
【0186】
いくつかの実施形態において、Ｒ４はエチレン又はプロピレンである。いくつかの実施形態において、Ｒ４はｎ－プロピレン又はイソブチレンである。
【0187】
いくつかの実施形態において、Ｌ７は存在せず、Ｒ４はエチレンであり、Ｘ７はＳであり、Ｒ７及びＲ８はそれぞれメチルである。いくつかの実施形態において、Ｌ７は存在せず、Ｒ４はｎ－プロピレンであり、Ｘ７はＳであり、Ｒ７及びＲ８はそれぞれメチルである。いくつかの実施形態において、Ｌ７は存在せず、Ｒ４はエチレンであり、Ｘ７はＳであり、Ｒ７及びＲ８はそれぞれエチルである。
【0188】
いくつかの実施形態において、Ｘ７はＳであり、Ｘ５は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、それによって－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ６が形成され、Ｘ６－Ｃ（Ｏ）Ｏであり、それによって－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ５が形成され、Ｌ５及びＬ６は、各々独立して、直鎖状Ｃ３～Ｃ７アルキルであり、Ｌ７は存在せず、Ｒ５は－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）２であり、Ｒ６はＣ７～Ｃ１２アルケニルである。いくつかの更なる実施形態において、ｐは６であり、Ｒ６はＣ９アルケニルである。
【0189】
いくつかの実施形態において、脂質製剤は、
【0190】
【化7】
【0191】
【化8】
【0192】
【化9】
【0193】
【化10】
【0194】
【化11】
【0195】
【化12】
【0196】
【化13】
【0197】
【化14】
【0198】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意の１つ以上の脂質は、明示的に除外され得る。
【0199】
ヘルパー脂質及びステロール
本開示のｍＲＮＡ－脂質製剤は、ヘルパー脂質を含むことができ、ヘルパー脂質は、中性脂質、中性ヘルパー脂質、非カチオン性脂質、非カチオン性ヘルパー脂質、アニオン性脂質、アニオン性ヘルパー脂質、又は双性イオン性脂質と呼ぶことができる。脂質製剤、特にカチオン性リポソーム及び脂質ナノ粒子は、ヘルパー脂質が製剤中に存在する場合、細胞取り込みを増加させることが見出されている。（Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．２０１４；１５（９）８８２－９２）。例えば、いくつかの研究は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジ－オレオイル－ホスファチジル－エタノアラミン（ＤＯＰＥ）及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）のような中性及び双性イオン性脂質は、カチオン性脂質よりも融合性であり（すなわち、融合を容易にする）、脂質－核酸複合体の多形特性に影響を及ぼして、ラメラ相から六方晶相への転移を促進し、したがって、細胞膜の融合及び破壊を誘導することができることを示している。（Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．２０１４ Ｊａｎ；９（１）：１０５－２０）。更に、ヘルパー脂質の使用は、毒性及び免疫原性のような多くの優勢なカチオン性脂質を使用することからの任意の潜在的な有害な影響を低減するのに役立ち得る。
本開示のｍＲＮＡ－脂質製剤は、ヘルパー脂質を含むことができ、ヘルパー脂質は、中性脂質、中性ヘルパー脂質、非カチオン性脂質、非カチオン性ヘルパー脂質、アニオン性脂質、アニオン性ヘルパー脂質、又は双性イオン性脂質と呼ぶことができる。脂質製剤、特にカチオン性リポソーム及び脂質ナノ粒子は、ヘルパー脂質が製剤中に存在する場合、細胞取り込みを増加させることが見出されている。（Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．２０１４；１５（９）８８２－９２）。例えば、いくつかの研究は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジ－オレオイル－ホスファチジル－エタノアラミン（ＤＯＰＥ）及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）のような中性及び双性イオン性脂質は、カチオン性脂質よりも融合性であり（すなわち、融合を容易にする）、脂質－核酸複合体の多形特性に影響を及ぼして、ラメラ相から六方晶相への転移を促進し、したがって、細胞膜の融合及び破壊を誘導することができることを示している。（Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．２０１４ Ｊａｎ；９（１）：１０５－２０）。更に、ヘルパー脂質の使用は、毒性及び免疫原性のような多くの優勢なカチオン性脂質を使用することからの任意の潜在的な有害な影響を低減するのに役立ち得る。
【0200】
本開示の脂質製剤に適した非カチオン性脂質の非限定的な例としては、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイオール－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びそれらの混合物などのリン脂質が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用することができる。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸、例えばラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルに由来するアシル基である。
【0201】
非カチオン性脂質の更なる例としては、コレステロールなどのステロール及びその誘導体が挙げられる。１つの研究は、ヘルパー脂質として、コレステロールは、核酸と接触する脂質層の電荷の間隔を増加させ、電荷分布を核酸の電荷分布により密接に一致させると結論付けた。（Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．２０１２Ｍａｒ７；９（６８）：５４８－５６１）。コレステロール誘導体の非限定的な例としては、５α－コレスタノール、５α－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノールなどの極性類似体、５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５α－コレスタノン、及びコレステリルデカノエートなどの非極性類似体、並びにそれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態において、コレステロール誘導体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルなどの極性類似体である。
【0202】
いくつかの実施形態において、脂質製剤中に存在するヘルパー脂質は、１つ以上のリン脂質及びコレステロール又はその誘導体の混合物を含むか、又はそれからなる。他の実施形態において、脂質製剤中に存在するヘルパー脂質は、１つ以上のリン脂質、例えばコレステロールを含まない脂質製剤を含むか、又はそれからなる。更に他の実施形態において、脂質製剤中に存在するヘルパー脂質は、コレステロール又はその誘導体、例えばリン脂質を含まない脂質製剤を含むか、又はそれからなる。
【0203】
ヘルパー脂質の他の例としては、非リン含有脂質、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン－ラウリルスルフェート、アルキル－アリールスルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロマイド、セラミド、及びスフィンゴミエリンが挙げられる。
【0204】
いくつかの実施形態において、ヘルパー脂質は、脂質製剤中に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％、約２２モル％～約４８モル％、約２４モル％～約４６モル％、約２５モル％～約４４モル％、約２６モル％～約４２モル％、約２７モル％～約４１モル％、約２８モル％～約４０モル％、又は約２９モル％、約３０モル％、約３１モル％、約３２モル％、約３３モル％、約３４モル％、約３５モル％、約３６モル％、約３７モル％、約３８モル％、若しくは約３９モル％（又はその任意の分数若しくはその中の範囲）を構成する。
【0205】
いくつかの実施形態において、製剤中のヘルパー脂質の合計は、２つ以上のヘルパー脂質を含み、ヘルパー脂質の総量は、脂質製剤中に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％、約２２モル％～約４８モル％、約２４モル％～約４６モル％、約２５モル％～約４４モル％、約２６モル％～約４２モル％、約２７モル％～約４１モル％、約２８モル％～約４０モル％、又は約２９モル％、約３０モル％、約３１モル％、約３２モル％、約３３モル％、約３４モル％、約３５モル％、約３６モル％、約３７モル％、約３８モル％、若しくは約３９モル％（又はその任意の分数若しくはその中の範囲）を構成する。いくつかの実施形態において、ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣ及びＤＯＴＡＰの組み合わせである。いくつかの実施形態において、ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣ及びＤＯＴＭＡの組み合わせである。
【0206】
脂質製剤中のコレステロール又はコレステロール誘導体は、脂質製剤中に存在する総脂質の最大約４０モル％、約４５モル％、約５０モル％、約５５モル％、又は約６０モル％を構成し得る。いくつかの実施形態において、コレステロール又はコレステロール誘導体は、脂質製剤中に存在する総脂質の約１５モル％～約４５モル％、約２０モル％～約４０モル％、約３０モル％～約４０モル％、又は約３５モル％、約３６モル％、約３７モル％、約３８モル％、約３９モル％、又は約４０モル％を構成する。
【0207】
脂質製剤中に存在するヘルパー脂質のパーセンテージは目標量であり、製剤中に存在するヘルパー脂質の実際の量は、例えば、±５モル％変動し得る。
【0208】
カチオン性脂質化合物又はイオン化可能なカチオン性脂質化合物を含有する脂質製剤は、モル基準で、約２０～４０％のカチオン性脂質化合物、約２５～４０％のコレステロール、約２５～５０％のヘルパー脂質、及び約０．５～５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質であってもよく、パーセントは、製剤中に存在する総脂質のパーセントである。いくつかの実施形態において、組成物は、約２２～３０％のカチオン性脂質化合物、約３０～４０％のコレステロール、約３０～４０％のヘルパー脂質、及び約０．５～３％のＰＥＧ－脂質であり、パーセントは、製剤中に存在する総脂質のパーセントである。
【0209】
脂質コンジュゲート
本明細書に記載される脂質製剤は、脂質コンジュゲートを更に含み得る。コンジュゲート脂質は、粒子の凝集を防止するのに有用である。好適なコンジュゲート脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー－脂質コンジュゲート、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。更に、脂質送達ビヒクルは、リガンド（例えば、抗体、ペプチド、及び炭水化物）をその表面又は結合したＰＥＧ鎖の末端に結合させることによって、特異的標的化のために使用することができる（Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５Ｄｅｃ１；６：２８６）。
本明細書に記載される脂質製剤は、脂質コンジュゲートを更に含み得る。コンジュゲート脂質は、粒子の凝集を防止するのに有用である。好適なコンジュゲート脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー－脂質コンジュゲート、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。更に、脂質送達ビヒクルは、リガンド（例えば、抗体、ペプチド、及び炭水化物）をその表面又は結合したＰＥＧ鎖の末端に結合させることによって、特異的標的化のために使用することができる（Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５Ｄｅｃ１；６：２８６）。
【0210】
好ましい実施形態において、脂質コンジュゲートはＰＥＧ－脂質である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をコーティング又は表面リガンドとして脂質製剤中に含めること（ＰＥＧ化と呼ばれる技術）は、ナノ粒子を免疫系から保護し、それらがＲＥＳ取り込みから逃れるのを助ける（Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．２０１１Ｊｕｎ；６（４）：７１５－２８）。ＰＥＧ化は、物理的、化学的、及び生物学的機構を介して脂質製剤及びそれらのペイロードを安定化させるために広く使用されている。界面活性剤様ＰＥＧ脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）は、脂質製剤に入って、表面上に水和層及び立体障壁を形成することができる。ＰＥＧ化の程度に基づいて、表面層は、一般に、ブラシ様層及びマッシュルーム様層の２つのタイプに分けることができる。ＰＥＧ－ＤＳＰＥ安定化製剤では、ＰＥＧは、低度のＰＥＧ化（通常５モル％未満）でマッシュルーム型立体構造をとり、ＰＥＧ－ＤＳＰＥの含有量が特定のレベルを超えて増加するとブラシ型立体構造にシフトするだろう（Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１；２０１１：１２）。ＰＥＧ化の増加は、脂質製剤の循環半減期の有意な増加をもたらすことが示されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２０１１Ａｕｇ１５；１３：５０７－３０；Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１０Ａｕｇ３；１４５（３）：１７８－８１）。
【0211】
ＰＥＧ－脂質の好適な例としては、ジアルキルオキシプロピルにカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＡ）、ジアシルグリセロールにカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質にカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＰＥ）、セラミドにカップリングしたＰＥＧ、コレステロール又はその誘導体にカップリングしたＰＥＧ、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0212】
ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンＰＥＧ繰り返し単位の直鎖水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、それらの分子量によって分類され、以下を含む：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ－ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール－スクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール－スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－アミン（ＭｅＰＥＧ－ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール－トレシレート（ＭｅＰＥＧ－ＴＲＥＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－イミダゾリル－カルボニル（ＭｅＰＥＧ－ＩＭ）、並びに末端メトキシ基の代わりに末端ヒドロキシル基を含有するそのような化合物（例えば、ＨＯ－ＰＥＧ－Ｓ、ＨＯ－ＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ、ＨＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２）。
【0213】
本明細書に記載されるＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を含み得る。特定の事例において、ＰＥＧ部分は、約７５０ダルトン～約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン～約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約２，０００ダルトン）の平均分子量を有する。好ましい実施形態において、ＰＥＧ部分は、約２，０００ダルトン又は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。平均分子量は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値又はサブ値であり得る。
【0214】
特定の事例において、ＰＥＧ単量体は、アルキル、アルコキシ、アシル、又はアリール基によって任意選択的に置換され得る。ＰＥＧは、脂質に直接コンジュゲートされ得るか、又はリンカー部分を介して脂質に連結され得る。例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧを脂質にカップリングするのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。好ましい実施形態において、リンカー部分は非エステル含有リンカー部分である。好適な非エステル含有リンカー部分としては、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、アミノ（－ＮＲ－）、カルボニル（－Ｃ（Ｏ）－）、カルバメート（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、エーテル（－Ｏ－）、スクシニル（－（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－）、スクシンアミジル（－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、エーテル、並びにそれらの組み合わせ（例えば、カルバメートリンカー部分及びアミドリンカー部分の両方を含むリンカー）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、カルバメートリンカーは、ＰＥＧを脂質にカップリングするために使用される。
【0215】
他の実施形態において、エステル含有リンカー部分は、ＰＥＧを脂質にカップリングさせるために使用される。好適なエステル含有リンカー部分としては、例えば、カーボネート（－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－）、スクシノイル、リン酸エステル（－Ｏ－（Ｏ）ＰＯＨ－Ｏ－）、スルホン酸エステル、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【0216】
様々な鎖長及び飽和度の様々なアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンをＰＥＧにコンジュゲートして、脂質コンジュゲートを形成することができる。このようなホスファチジルエタノールアミンは、市販されているか、又は当業者に既知の従来の技術を使用して単離若しくは合成され得る。Ｃ１０～Ｃ２０の範囲の炭素鎖長を有する飽和又は不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンが好ましい。モノ又はジ不飽和脂肪酸及び飽和及び不飽和脂肪酸の混合物を有するホスファチジルエタノールアミンも使用することができる。好適なホスファチジルエタノールアミンとしては、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（dimyristoyl- phosphatidylethanolamine、ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine、ＤＰＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（dioleoyl-phosphatidylethanolamine、ＤＯＰＥ）、及びジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（distearoyl-phosphatidylethanolamine、ＤＳＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0217】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲートである。これらの実施形態において、ＰＥＧは、好ましくは、約７５０～約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。特定の実施形態において、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基は、メチル基で置換される。
【0218】
上記に加えて、他の親水性ポリマーをＰＥＧの代わりに使用することができる。ＰＥＧの代わりに使用され得る好適なポリマーの例としては、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル、メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、及びポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、並びに誘導体化セルロース（例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロース）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0219】
いくつかの実施形態において、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質）は、脂質製剤中に存在する総脂質の約０．１モル％～約２モル％、約０．５モル％～約２モル％、約１モル％～約２モル％、約０．６モル％～約１．９モル％、約０．７モル％～約１．８モル％、約０．８モル％～約１．７モル％、約０．９モル％～約１．６モル％、約０．９モル％～約１．８モル％、約１モル％～約１．８モル％、約１モル％～約１．７モル％、約１．２モル％～約１．８モル％、約１．２モル％～約１．７モル％、約１．３モル％～約１．６モル％、若しくは約１．４モル％～約１．６モル％（又はその任意の分数若しくはその中の範囲）を構成する。他の実施形態において、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質）は、脂質製剤中に存在する総脂質の約０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、若しくは５％（又はその任意の分数若しくはその中の範囲）を含む。量は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値又はサブ値であり得る。
【0220】
いくつかの好ましい実施形態において、ＰＥＧ－脂質はＰＥＧ５５０－ＰＥである。いくつかの好ましい実施形態において、ＰＥＧ－脂質はＰＥＧ７５０－ＰＥである。いくつかの好ましい実施形態において、ＰＥＧ－脂質はＰＥＧ２０００－ＤＭＧである。
【0221】
本開示の脂質製剤中に存在する脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質）のパーセンテージは、目標量であり、製剤中に存在する脂質コンジュゲートの実際の量は、例えば、±０．５モル％変動し得る。当業者は、脂質コンジュゲートの濃度が、使用される脂質コンジュゲート及び脂質製剤が融合性になる速度に依存して変化し得ることを理解するであろう。
【0222】
脂質製剤の細胞取り込みのための作用機序
核酸の細胞内送達のための脂質製剤、特にリポソーム、カチオン性リポソーム、及び脂質ナノ粒子は、脂質送達ビヒクルの内容物が標的細胞の細胞質ゾルに送達される標的細胞のエンドサイトーシス機構を利用して標的細胞に浸透することによる細胞取り込みのために設計される。（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２８（３）：１４６－１５７，２０１８）。具体的には、本明細書に記載される肝細胞を標的とするｍＲＮＡ－脂質製剤の場合、ｍＲＮＡ－脂質製剤は、受容体媒介エンドサイトーシスを通じて肝細胞に入る。エンドサイトーシスの前に、脂質送達ビヒクルの表面のＰＥＧ－脂質などの官能化リガンドが表面から脱落し、これが標的細胞への内部移行を誘発する。エンドサイトーシスの間、細胞の原形質膜のある部分がベクターを取り囲み、それを小胞に包み込み、次に小胞が細胞膜からピンチオフし、細胞質ゾルに入り、最終的にエンドリソソーム経路を経る。イオン化可能なカチオン性脂質含有送達ビヒクルについて、エンドソームが老化するにつれて酸性度が増加することにより、表面上に強い正電荷を有するビヒクルが生じる。次いで、送達ビヒクルとエンドソーム膜との相互作用が、ペイロードの細胞質送達につながる膜融合事象をもたらす。ｍＲＮＡペイロードについて、細胞自体の内部翻訳プロセスは、次いで、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを、コードされたタンパク質（例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）に翻訳することになる。コードされたタンパク質は更に、細胞内の標的化細胞小器官又は位置への輸送を含む翻訳後プロセシングを受けることができる。本明細書に記載されるＨＢＶ ＴＡＬＥＮの場合、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮタンパク質は、ＨＢＶゲノムが編集され得る核に転座される。
核酸の細胞内送達のための脂質製剤、特にリポソーム、カチオン性リポソーム、及び脂質ナノ粒子は、脂質送達ビヒクルの内容物が標的細胞の細胞質ゾルに送達される標的細胞のエンドサイトーシス機構を利用して標的細胞に浸透することによる細胞取り込みのために設計される。（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２８（３）：１４６－１５７，２０１８）。具体的には、本明細書に記載される肝細胞を標的とするｍＲＮＡ－脂質製剤の場合、ｍＲＮＡ－脂質製剤は、受容体媒介エンドサイトーシスを通じて肝細胞に入る。エンドサイトーシスの前に、脂質送達ビヒクルの表面のＰＥＧ－脂質などの官能化リガンドが表面から脱落し、これが標的細胞への内部移行を誘発する。エンドサイトーシスの間、細胞の原形質膜のある部分がベクターを取り囲み、それを小胞に包み込み、次に小胞が細胞膜からピンチオフし、細胞質ゾルに入り、最終的にエンドリソソーム経路を経る。イオン化可能なカチオン性脂質含有送達ビヒクルについて、エンドソームが老化するにつれて酸性度が増加することにより、表面上に強い正電荷を有するビヒクルが生じる。次いで、送達ビヒクルとエンドソーム膜との相互作用が、ペイロードの細胞質送達につながる膜融合事象をもたらす。ｍＲＮＡペイロードについて、細胞自体の内部翻訳プロセスは、次いで、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを、コードされたタンパク質（例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ）に翻訳することになる。コードされたタンパク質は更に、細胞内の標的化細胞小器官又は位置への輸送を含む翻訳後プロセシングを受けることができる。本明細書に記載されるＨＢＶ ＴＡＬＥＮの場合、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮタンパク質は、ＨＢＶゲノムが編集され得る核に転座される。
【0223】
脂質コンジュゲートの組成及び濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質製剤から交換される速度、次いで、脂質製剤が融合性になる速度を制御し得る。更に、例えば、ｐＨ、温度、又はイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質製剤が融合性になる速度を変化させる及び／又は制御することができる。脂質製剤が融合性になる速度を制御するために使用することができる他の方法は、本開示を読めば当業者に明らかになるであろう。また、脂質コンジュゲートの組成及び濃度を制御することによって、リポソーム又は脂質の粒径を制御することができる。
【0224】
脂質製剤の製造
核酸、例えばｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを含む脂質製剤を調製するための多くの異なる方法が存在する。（Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ．２０１４，１５，８８２－８９２、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ２０１４，１７７，８－１８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｔｕｄ．Ｒｅｓ．２０１２，３，１４－２０）。薄膜水和、二重エマルジョン、逆相蒸発、マイクロ流体調製、二重非対称遠心分離、エタノール注入、界面活性剤透析、エタノール希釈による自発的小胞形成、及び予め形成されたリポソーム中への封入の技術が、本明細書中で簡単に記載される。
核酸、例えばｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子の組み合わせを含む脂質製剤を調製するための多くの異なる方法が存在する。（Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ．２０１４，１５，８８２－８９２、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ２０１４，１７７，８－１８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｔｕｄ．Ｒｅｓ．２０１２，３，１４－２０）。薄膜水和、二重エマルジョン、逆相蒸発、マイクロ流体調製、二重非対称遠心分離、エタノール注入、界面活性剤透析、エタノール希釈による自発的小胞形成、及び予め形成されたリポソーム中への封入の技術が、本明細書中で簡単に記載される。
【0225】
薄膜水和
薄膜水和（Thin Film Hydration、ＴＦＨ）又はＢａｎｇｈａｍ法では、脂質を有機溶媒に溶解し、次いでロータリーエバポレーターを使用して蒸発させ、薄い脂質層を形成する。充填される化合物を含有する水性緩衝液による層の水和の後、多重膜小胞（Multilamellar Vesicle、ＭＬＶ）が形成され、これは、膜を通しての押出しによって、又は出発ＭＬＶの超音波処理によって小型化されて、小型単層小胞又は大型単層小胞（Large Unilamellar vesicle、ＬＵＶ及びSmall Unilamellar vesicle、ＳＵＶ）を生成することができる。
薄膜水和（Thin Film Hydration、ＴＦＨ）又はＢａｎｇｈａｍ法では、脂質を有機溶媒に溶解し、次いでロータリーエバポレーターを使用して蒸発させ、薄い脂質層を形成する。充填される化合物を含有する水性緩衝液による層の水和の後、多重膜小胞（Multilamellar Vesicle、ＭＬＶ）が形成され、これは、膜を通しての押出しによって、又は出発ＭＬＶの超音波処理によって小型化されて、小型単層小胞又は大型単層小胞（Large Unilamellar vesicle、ＬＵＶ及びSmall Unilamellar vesicle、ＳＵＶ）を生成することができる。
【0226】
二重エマルジョン
脂質製剤は、脂質を水／有機溶媒混合物に溶解させることを含む二重エマルジョン技術によって調製することもできる。水滴を含有する有機溶液を過剰の水性媒体と混合し、水中油中水型（water-in-oil-in-water、Ｗ／Ｏ／Ｗ）二重エマルジョン形成をもたらす。機械的に激しく振盪した後、水滴の一部が崩壊して、大型単層小胞（ＬＵＶ）が得られる。
脂質製剤は、脂質を水／有機溶媒混合物に溶解させることを含む二重エマルジョン技術によって調製することもできる。水滴を含有する有機溶液を過剰の水性媒体と混合し、水中油中水型（water-in-oil-in-water、Ｗ／Ｏ／Ｗ）二重エマルジョン形成をもたらす。機械的に激しく振盪した後、水滴の一部が崩壊して、大型単層小胞（ＬＵＶ）が得られる。
【0227】
逆相蒸発
逆相蒸発（Reverse Phase Evaporation、ＲＥＶ）法はまた、核酸を充填したＬＵＶを達成することを可能にする。この技術では、有機溶媒及び水性緩衝液中にリン脂質を溶解することによって二相系が形成される。次いで、得られた懸濁液を、混合物が透明な１相分散液になるまで短時間超音波処理する。脂質製剤は、減圧下で有機溶媒を蒸発させた後に得られる。この技術は、核酸を含む異なる大小の親水性分子を封入するために使用されてきた。
逆相蒸発（Reverse Phase Evaporation、ＲＥＶ）法はまた、核酸を充填したＬＵＶを達成することを可能にする。この技術では、有機溶媒及び水性緩衝液中にリン脂質を溶解することによって二相系が形成される。次いで、得られた懸濁液を、混合物が透明な１相分散液になるまで短時間超音波処理する。脂質製剤は、減圧下で有機溶媒を蒸発させた後に得られる。この技術は、核酸を含む異なる大小の親水性分子を封入するために使用されてきた。
【0228】
マイクロ流体調製
マイクロ流体法は、他のバルク技術とは異なり、脂質水和プロセスを制御する可能性を与える。この方法は、流れが操作される方法に従って、連続流マイクロ流体及び液滴ベースのマイクロ流体に分類され得る。連続フローモードで動作するマイクロ流体流体力学的集束（microfluidic hydrodynamic focusing、ＭＨＦ）法では、脂質をイソプロピルアルコールに溶解し、イソプロピルアルコールを２つの水性緩衝液流の間のマイクロチャネル交差接合部に流体力学的に集束させる。小胞サイズは、流速を調節することによって制御され得、したがって、脂質溶液／緩衝液希釈プロセスを制御する。この方法は、３つの入口ポート及び１つの出口ポートからなるマイクロ流体デバイスを使用することによって、オリゴヌクレオチド（oligonucleotide、ＯＮ）脂質製剤を製造するために使用され得る。
マイクロ流体法は、他のバルク技術とは異なり、脂質水和プロセスを制御する可能性を与える。この方法は、流れが操作される方法に従って、連続流マイクロ流体及び液滴ベースのマイクロ流体に分類され得る。連続フローモードで動作するマイクロ流体流体力学的集束（microfluidic hydrodynamic focusing、ＭＨＦ）法では、脂質をイソプロピルアルコールに溶解し、イソプロピルアルコールを２つの水性緩衝液流の間のマイクロチャネル交差接合部に流体力学的に集束させる。小胞サイズは、流速を調節することによって制御され得、したがって、脂質溶液／緩衝液希釈プロセスを制御する。この方法は、３つの入口ポート及び１つの出口ポートからなるマイクロ流体デバイスを使用することによって、オリゴヌクレオチド（oligonucleotide、ＯＮ）脂質製剤を製造するために使用され得る。
【0229】
二重非対称遠心分離
二重非対称遠心分離（Dual Asymmetric Centrifugation、ＤＡＣ）は、それ自体の垂直軸を中心とした追加の回転を使用するので、より一般的な遠心分離とは異なる。生成された２つの重なり合う動きにより、効率的な均質化が達成される。試料は、通常の遠心分離機におけるように外側に押され、次いで、追加の回転によりバイアルの中心に向かって押される。脂質及びＮａＣｌ溶液を混合することにより、粘性の小胞リン脂質ゲル（vesicular phospholipid gel、ＶＰＣ）が得られ、次いでこれを希釈して脂質製剤分散液を得る。脂質製剤サイズは、ＤＡＣ速度、脂質濃度及び均質化時間を最適化することによって調節することができる。
二重非対称遠心分離（Dual Asymmetric Centrifugation、ＤＡＣ）は、それ自体の垂直軸を中心とした追加の回転を使用するので、より一般的な遠心分離とは異なる。生成された２つの重なり合う動きにより、効率的な均質化が達成される。試料は、通常の遠心分離機におけるように外側に押され、次いで、追加の回転によりバイアルの中心に向かって押される。脂質及びＮａＣｌ溶液を混合することにより、粘性の小胞リン脂質ゲル（vesicular phospholipid gel、ＶＰＣ）が得られ、次いでこれを希釈して脂質製剤分散液を得る。脂質製剤サイズは、ＤＡＣ速度、脂質濃度及び均質化時間を最適化することによって調節することができる。
【0230】
エタノール注入
エタノール注入（Ethanol Injection、ＥＩ）法を核酸封入に使用することができる。この方法は、脂質が溶解されているエタノール溶液を、封入される核酸を含有する水性媒体中に、針を使用して迅速に注入することを提供する。小胞は、リン脂質が媒体全体に分散したときに自発的に形成される。
エタノール注入（Ethanol Injection、ＥＩ）法を核酸封入に使用することができる。この方法は、脂質が溶解されているエタノール溶液を、封入される核酸を含有する水性媒体中に、針を使用して迅速に注入することを提供する。小胞は、リン脂質が媒体全体に分散したときに自発的に形成される。
【0231】
界面活性剤透析
界面活性剤透析法は、核酸を封入するために使用され得る。簡単に述べると、脂質及びプラスミドを適切なイオン強度の界面活性剤溶液中で可溶化し、透析によって界面活性剤を除去した後、安定化された脂質製剤を形成する。次いで、封入されていない核酸をイオン交換クロマトグラフィーによって除去し、そして空の小胞をスクロース密度勾配遠心分離によって除去する。この技術は、カチオン性脂質含有量及び透析緩衝液の塩濃度に非常に敏感であり、また、この方法は規模を拡大することが困難である。
界面活性剤透析法は、核酸を封入するために使用され得る。簡単に述べると、脂質及びプラスミドを適切なイオン強度の界面活性剤溶液中で可溶化し、透析によって界面活性剤を除去した後、安定化された脂質製剤を形成する。次いで、封入されていない核酸をイオン交換クロマトグラフィーによって除去し、そして空の小胞をスクロース密度勾配遠心分離によって除去する。この技術は、カチオン性脂質含有量及び透析緩衝液の塩濃度に非常に敏感であり、また、この方法は規模を拡大することが困難である。
【0232】
エタノール希釈による自発的小胞形成
安定な脂質製剤はまた、エタノール希釈法による自発的小胞形成によって生成され得、この方法において、段階的又は滴下のエタノール希釈は、核酸を含有する迅速に混合する水性緩衝液へのエタノールに溶解した脂質の制御された添加によって、核酸を充填した小胞の即時形成を提供する。
安定な脂質製剤はまた、エタノール希釈法による自発的小胞形成によって生成され得、この方法において、段階的又は滴下のエタノール希釈は、核酸を含有する迅速に混合する水性緩衝液へのエタノールに溶解した脂質の制御された添加によって、核酸を充填した小胞の即時形成を提供する。
【0233】
予め形成されたリポソーム中への封入
核酸の捕捉はまた、予め形成されたリポソームから出発して、以下の２つの異なる方法によって得ることができる：（１）「リポプレックス」と呼ばれる静電複合体を与えるカチオン性リポソームと核酸との単純な混合であって、それらは細胞培養物をトランスフェクトするために首尾よく使用され得るが、インビボでのそれらの低い封入効率及び乏しい性能によって特徴付けられる、混合；及び（２）リポソームの不安定化であって、４０％ｖ／ｖの濃度までカチオン性小胞の懸濁液に無水エタノールをゆっくりと添加し、その後、核酸を滴下して、充填された小胞を達成する、不安定化。しかしながら、封入プロセスを特徴付ける２つの主なステップは、非常に敏感であり、粒子は小型化されなければならない。
核酸の捕捉はまた、予め形成されたリポソームから出発して、以下の２つの異なる方法によって得ることができる：（１）「リポプレックス」と呼ばれる静電複合体を与えるカチオン性リポソームと核酸との単純な混合であって、それらは細胞培養物をトランスフェクトするために首尾よく使用され得るが、インビボでのそれらの低い封入効率及び乏しい性能によって特徴付けられる、混合；及び（２）リポソームの不安定化であって、４０％ｖ／ｖの濃度までカチオン性小胞の懸濁液に無水エタノールをゆっくりと添加し、その後、核酸を滴下して、充填された小胞を達成する、不安定化。しかしながら、封入プロセスを特徴付ける２つの主なステップは、非常に敏感であり、粒子は小型化されなければならない。
【0234】
特定の実施形態において、脂質及び脂質ナノ粒子、脂質を含む薬学的組成物、脂質を作製する方法又は脂質及び核酸分子を含む薬学的組成物を製剤化する方法、並びに疾患を治療又は予防するために薬学的組成物を使用する方法の例は、米国又は国際特許出願公開、例えばＵＳ２０１７／０１９０６６１、ＵＳ２００６／０００８９１０、ＵＳ２０１５／００６４２４２、ＵＳ２００５／００６４５９５、ＷＯ／２０１９／０３６０３０、ＵＳ２０１９／００２２２４７、ＷＯ／２０１９／０３６０２８、ＷＯ／２０１９／０３６００８、ＷＯ／２０１９／０３６０００、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、ＵＳ２０１７／０１１９９０４、ＷＯ／２０１８／２００９４３、ＷＯ／２０１８／１９１６５７、ＷＯ／２０１８／１１８１０２、ＵＳ２０１８０１６９２６８、ＷＯ２０１８１１８１０２、ＷＯ２０１８１１９１６３、ＵＳ２０１４／０２５５４７２、及びＵＳ２０１３／０１９５９６８（これらのそれぞれの関連する内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【0235】
細胞及びポリペプチド
本出願はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチド及びベクターのうちのいずれかを含む細胞、好ましくは単離された細胞を提供する。細胞は、例えば、組換えタンパク質産生のため、又はウイルス粒子の産生のために使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮの産生のために使用することができる。本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、それが最初に見出された生物から取り出された細胞、又はそのような細胞の子孫を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞は、単離される代わりに、対象内にあるか、又は対象の一部であってもよい。これらの実施形態において、対象の細胞は、インビボ組換えタンパク質産生又はウイルス粒子の産生のために使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、後に第２の生物に導入されるか、又はそれが単離された生物（又はそれが由来する細胞）に再導入される。
本出願はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチド及びベクターのうちのいずれかを含む細胞、好ましくは単離された細胞を提供する。細胞は、例えば、組換えタンパク質産生のため、又はウイルス粒子の産生のために使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮの産生のために使用することができる。本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、それが最初に見出された生物から取り出された細胞、又はそのような細胞の子孫を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞は、単離される代わりに、対象内にあるか、又は対象の一部であってもよい。これらの実施形態において、対象の細胞は、インビボ組換えタンパク質産生又はウイルス粒子の産生のために使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、後に第２の生物に導入されるか、又はそれが単離された生物（又はそれが由来する細胞）に再導入される。
【0236】
本出願のＨＢＶ ＴＡＬＥＮ又はＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードする核酸を含む宿主細胞もまた、本発明の一部を形成する。ＨＢＶ ＴＡＬＥＮは、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞株、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などのヒト細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、若しくは酵母、細菌、真菌、昆虫細胞など、又はトランスジェニック動物若しくは植物における分子の発現を含む組換えＤＮＡ技術を介して産生され得る。特定の実施形態において、細胞は多細胞生物由来であり、特定の実施形態において、それらは脊椎動物又は無脊椎動物起源のものである。特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞などの哺乳類細胞、又は昆虫細胞である。特定の実施形態において、細胞は、初代細胞、例えば、肝臓細胞、より具体的には感染肝臓細胞、ＨＢＶ感染肝臓細胞、又はＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを保有する肝臓細胞である。一般に、宿主細胞における本発明のＨＢＶ ＴＡＬＥＮなどの組換えタンパク質の産生は、発現可能な形式のタンパク質をコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入、核酸分子の発現をもたらす条件下での細胞の培養、及び当該細胞におけるタンパク質の発現を可能にすることを含む。発現可能な形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態であってもよく、通常、エンハンサ、プロモータ、ポリアデニル化シグナルなどの核酸の発現をもたらすことができる配列を必要とする。当業者は、種々のプロモータが宿主細胞における遺伝子の発現を得るために使用され得ることを承知している。プロモータは、構成的であっても調節されていてもよく、ウイルス、原核生物若しくは真核生物供給源を含む様々な供給源から得ることができ、又は人工的に設計することができる。更なる調節配列を付加してもよい。多くのプロモータが、導入遺伝子の発現のために使用され得、当業者に既知であり、例えば、これらは、ウイルスプロモータ、哺乳類プロモータ、合成プロモータなどを含み得る。真核細胞における発現を得るための好適なプロモータの非限定的な例は、ＣＭＶプロモータ（ＵＳ５，３８５，８３９）、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサ／プロモータ由来のｎｔ．－７３５～＋９５を含むＣＭＶ最初期プロモータなどである。ポリアデニル化シグナル、例えば、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル（ＵＳ５，１２２，４５８）は、導入遺伝子の後ろに存在し得る。あるいは、いくつかの広く使用されている発現ベクターは、当技術分野において、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ及びｐＥＦベクターシリーズ、ＢＤ ＳｃｉｅｎｃｅｓからのｐＭＳＣＶ及びｐＴＫ－Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔなどの商業的供給源から市販されており、これらは、目的のタンパク質を組換え発現させるために、又は好適なプロモータ及び／若しくは転写ターミネーター配列、ポリＡ配列などを得るために使用することができる。
【0237】
細胞培養物は、接着細胞培養物、例えば、培養容器の表面又はマイクロ担体に付着した細胞、並びに懸濁培養物を含む、任意のタイプの細胞培養物であり得る。ほとんどの大規模懸濁培養は、操作及びスケールアップが最も簡単であるため、バッチプロセス又は流加プロセスとして操作される。今日では、灌流原理に基づく連続プロセスがより一般的になりつつあり、また好適である。好適な培養培地も当業者に周知であり、一般に商業的供給源から大量に得ることができるか、又は標準的なプロトコルに従って特注することができる。培養は、例えば、ディッシュ、ローラーボトル又はバイオリアクター中で、バッチ、流加、連続系などを用いて行うことができる。細胞を培養するための好適な条件は既知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ ０－４７１－３４８８９－９）を参照されたい）。細胞培養培地は様々な供給業者から入手可能であり、宿主細胞が目的のタンパク質、ここではＨＢＶ ＴＡＬＥＮを発現するために適した培地を日常的に選択することができる。適切な培地は、血清を含んでも含まなくてもよい。
【0238】
したがって、本出願の実施形態は、本出願のＨＢＶ ＴＡＬＥＮを産生する方法にも関する。本方法は、プロモータに作動可能に連結された本出願のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた細胞をＨＢＶ ＴＡＬＥＮの発現に適した条件下で増殖させることと、任意選択的に、細胞内で発現されたＨＢＶ ＴＡＬＥＮを精製又は単離することと、を含む。ＨＢＶ ＴＡＬＥＮは、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどを含む当技術分野において既知の任意の方法によって細胞から単離又は回収することができる。組換えタンパク質発現のために使用される技術は、本開示を考慮して当業者に周知である。発現されたＨＢＶ ＴＡＬＥＮはまた、発現されたタンパク質を精製又は単離することなく、例えば、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードする発現ベクターをトランスフェクトし、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮの発現に適した条件下で増殖させた細胞の上清を分析することによって研究することもできる。
【0239】
したがって、配列番号２５、２６、２７又は２８のうちの１つ以上のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、天然に存在しないポリペプチド又は組換えポリペプチドも提供される。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを有する天然に存在しないポリペプチド又は組換えポリペプチドは、配列番号２５、２６、２７又は２８のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとの天然に存在しないポリペプチド又は組換えポリペプチドの組み合わせは、配列番号２５及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとの天然に存在しないポリペプチド又は組換えポリペプチドの組み合わせは、配列番号２７及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む。上記及び下記のように、これらの配列をコードする単離された核酸分子、プロモータに作動可能に連結されたこれらの配列を含むベクター、及びポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はベクターを含む組成物もまた、本出願によって企図される。
【0240】
本出願の一実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号２５、２６、２７又は２８のうちの１つ以上のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、例えば、配列番号２５、２６、２７又は２８のうちの１つ以上とそれぞれ９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドの組み合わせは、配列番号２５及び２６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、例えば、配列番号２５及び２６とそれぞれ９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドの組み合わせは、配列番号２７及び２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、例えば、配列番号２７及び２８とそれぞれ９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、天然に存在しないポリペプチド又は組換えポリペプチドは、配列番号２５、２６、２７又は２８のうちの１つ以上からなる。好ましくは、天然に存在しないポリペプチド又は組換えポリペプチドの組み合わせは、配列番号２５及び２６、又は配列番号２７及び２８からなる。
【0241】
組成物
本出願はまた、本出願による１つ以上のＨＢＶ ＴＡＬＥＮ、組み合わせ、１つ以上のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチド（ＲＮＡ及びＤＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを含む）、ベクター、ＬＮＰ及び／又は宿主細胞を含む、組成物、より具体的には薬学的組成物に関する。本明細書に記載される本出願のＨＢＶ ＴＡＬＥＮ、組み合わせ、核酸、ベクター、ＬＮＰ及び／又は宿主細胞のいずれも、本出願の組成物又は薬学的組成物において使用することができる。
本出願はまた、本出願による１つ以上のＨＢＶ ＴＡＬＥＮ、組み合わせ、１つ以上のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチド（ＲＮＡ及びＤＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを含む）、ベクター、ＬＮＰ及び／又は宿主細胞を含む、組成物、より具体的には薬学的組成物に関する。本明細書に記載される本出願のＨＢＶ ＴＡＬＥＮ、組み合わせ、核酸、ベクター、ＬＮＰ及び／又は宿主細胞のいずれも、本出願の組成物又は薬学的組成物において使用することができる。
【0242】
本出願は、例えば、本明細書に記載される任意の核酸分子、ベクター、組み合わせ、ＬＮＰ又は宿主細胞を、薬学的に受容可能な担体とともに含む薬学的組成物を提供する。薬学的に受容可能な担体は、非毒性であり、有効成分の有効性を妨げてはならない。薬学的に受容可能な担体は、結合剤、崩壊剤、膨潤剤、懸濁化剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、香味剤、甘味剤、保存剤、色素、可溶化剤及びコーティングなどの１つ以上の賦形剤を含むことができる。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、筋内、皮内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば腸）、鼻腔内又は腹膜内経路に依存し得る。液体の注射可能な調製物（例えば、懸濁物及び溶液）について、好適な担体及び添加剤としては、水、グリコール、油、アルコール、防腐剤、着色剤などが挙げられる。固体経口製剤、例えば、散剤、カプセル剤、カプレット剤、ゲルキャップ剤及び錠剤の場合、好適な担体及び添加剤としては、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。鼻腔スプレー／吸入剤混合物の場合、水溶液／懸濁液は、好適な担体及び添加剤として、水、グリコール、油、皮膚軟化剤、安定剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、香料などを含むことができる。
【0243】
本出願の薬学的組成物は、投与を容易にし、有効性を改善するために、経口（経腸）投与及び非経口注射を含むがこれらに限定されない、対象への投与に適した任意の方法（matter）で製剤化することができる。非経口注射には、静脈内注射又は注入、皮下注射、皮内注射、及び筋肉内注射が含まれる。本出願の薬学的組成物は、経粘膜、眼、直腸、長時間作用型移植、舌下投与、舌下、門脈循環を迂回する口腔粘膜から、吸入、又は鼻腔内を含む他の投与経路用に製剤化することもできる。
【0244】
本出願の好ましい実施形態において、本出願の薬学的組成物は、非経口注射、好ましくは皮下、皮内注射、又は筋肉内注射、より好ましくは筋肉内注射用に製剤化される。
【0245】
本出願の実施形態によれば、投与のための薬学的組成物は、典型的には、薬学的に受容可能な担体、例えば緩衝生理食塩水など、例えばリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）などの水性担体中に緩衝溶液を含むであろう。組成物はまた、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に受容可能な物質（例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤）を含み得る。例えば、プラスミドＤＮＡを含む本出願の薬学的組成物は、薬学的に受容可能な担体としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含有することができる。プラスミドＤＮＡは、例えば、０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、又は５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。
【0246】
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子を含む本出願の薬学的組成物は、例えば、約２０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、例えば、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１１０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬ、１３０μｇ／ｍＬ、１４０μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、１６０μｇ／ｍＬ、１７０μｇ／ｍＬ、１８０μｇ／ｍＬ、１９０μｇ／ｍＬ、又は２００μｇ／ｍＬの濃度で投与することができる。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子を含む本出願の薬学的組成物は、２０μｇ／ｍＬ未満の濃度で投与することができる。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子を含む本出願の薬学的組成物は、２００μｇ／ｍＬを超える濃度で投与することができる。
【0247】
本出願はまた、本出願の薬学的組成物を作製する方法を提供する。薬学的組成物を製造する方法は、本出願のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードする単離されたポリヌクレオチド、ベクター、及び／又はＬＮＰを、１つ以上の薬学的に受容可能な担体と混合することを含む。当業者は、このような組成物を調製するために使用される従来の技術に精通しているであろう。
【0248】
治療方法
本出願は、肝炎を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、具体的にはＨＢＶ感染の治療を必要とする対象においてそれを行うためのものであり、有効量の本出願の薬学的組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態は、ＨＢＶ／ＨＤＶ同時感染を治療する方法に関する。いくつかの実施形態は、ＨＢＶ表面抗原を低減する方法に関する。いくつかの実施形態は、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを低減又は根絶する方法に関する。いくつかの実施形態は、組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡを標的化する方法に関する。本明細書に記載される本出願の薬学的組成物のいずれも、本出願の方法において使用することができる。本出願はまた、対象におけるＨＢＶの感染及び／又は複製を低減するための方法であって、本出願の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。ウイルスの感染又は複製に関して本明細書で使用される場合、「低減する（reducing）」又は「低下した（reduced）」という用語は、一般に、未処置対象又は対照処置を投与された対象などの基準レベルと比較して、感染及び／又は複製の量が統計的に有意に減少していることを意味する。しかしながら、誤解を避けるために、「低減する」とは、参照レベルと比較して少なくとも１０％低減すること、例えば、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は最大１００％減少すること（すなわち、参照試料と比較してレベルがない）、又は参照レベルと比較して１０％～１００％の間の任意の減少を意味する。感染及び／又は複製のレベルは、本開示を考慮して当業者によって確認することができる。
本出願は、肝炎を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、具体的にはＨＢＶ感染の治療を必要とする対象においてそれを行うためのものであり、有効量の本出願の薬学的組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態は、ＨＢＶ／ＨＤＶ同時感染を治療する方法に関する。いくつかの実施形態は、ＨＢＶ表面抗原を低減する方法に関する。いくつかの実施形態は、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを低減又は根絶する方法に関する。いくつかの実施形態は、組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡを標的化する方法に関する。本明細書に記載される本出願の薬学的組成物のいずれも、本出願の方法において使用することができる。本出願はまた、対象におけるＨＢＶの感染及び／又は複製を低減するための方法であって、本出願の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。ウイルスの感染又は複製に関して本明細書で使用される場合、「低減する（reducing）」又は「低下した（reduced）」という用語は、一般に、未処置対象又は対照処置を投与された対象などの基準レベルと比較して、感染及び／又は複製の量が統計的に有意に減少していることを意味する。しかしながら、誤解を避けるために、「低減する」とは、参照レベルと比較して少なくとも１０％低減すること、例えば、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は最大１００％減少すること（すなわち、参照試料と比較してレベルがない）、又は参照レベルと比較して１０％～１００％の間の任意の減少を意味する。感染及び／又は複製のレベルは、本開示を考慮して当業者によって確認することができる。
【0249】
本明細書で使用される「治療する」、「治療された」、又は「治療すること」という用語は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を指し、その目的は、望ましくない生理学的状態、障害、若しくは疾患に対して（部分的若しくは全体的に）保護するか、若しくは遅延させる（例えば、その発症を軽減若しくは延期する）こと、又は異常になった若しくは異常になるであろうパラメータ、値、機能、若しくは結果の低下の部分的若しくは全体的な回復若しくは阻害などの有益な若しくは所望の臨床結果を得ることである。本開示の目的のために、有益な又は所望の臨床結果としては、症状の緩和、状態、障害又は疾患の発症の程度又は活力又は速度の減少、状態、障害又は疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、状態、障害又は疾患の発症の遅延又は進行の減速、状態、障害又は疾患状態の改善、及び寛解（部分的であるか全体的であるかにかかわらず）（それが実際の臨床症状の即時の軽減、又は状態、障害若しくは疾患の向上若しくは改善に転化するかどうかにかかわらず）が挙げられるが、これらに限定されない。治療は、過剰なレベルの副作用を伴わずに臨床的に有意な応答を誘発しようとする。治療はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することを含む。
【0250】
本明細書で使用される場合、「感染」という用語は、病原体による宿主の侵入を指す。病原体は、宿主に侵入し、宿主内で複製又は増殖することができる場合、「感染性」であると考えられる。感染性因子の例としては、ウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＤＶ及び特定の種のアデノウイルス、プリオン、細菌、真菌、原生動物など）が挙げられる。「ＨＢＶ感染」とは、具体的には、宿主生物の細胞及び組織などの宿主生物へのＨＢＶの侵入を指す。いくつかの実施形態において、感染は、ＨＢＶ及びＨＤＶの同時感染である。
【0251】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」又は「有効量」は、それを必要とする対象において所望の効果又は応答を誘導するのに十分な組成物、ポリヌクレオチド、又はベクターの量を意味する。有効量は、ＨＢＶ感染などの疾患に対する治療効果を提供するのに十分な量であり得る。有効量は、対象の身体状態、年齢、体重、健康など；特定の用途、例えば、治療的処置；及び免疫が所望される特定の疾患、例えば、ウイルス感染などの様々な要因に応じて変化し得る。有効量は、本開示を考慮して当業者によって容易に決定することができる。治療有効量は、例えば、化合物の血中濃度をアッセイすることによって実験的に、又は本開示を考慮して当業者によって生物学的利用能を計算することによって理論的に確認することができる。
【0252】
本出願の特定の実施形態において、有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を達成するのに十分な組成物又は組み合わせの量を指す：（ｉ）ＨＢＶ感染若しくはそれに関連する症状の重症度を低減若しくは改善する効果、（ｉｉ）ＨＢＶ感染若しくはそれに伴う症状の持続期間を低減する効果、（ｉｉｉ）ＨＢＶ感染若しくはそれに伴う症状の進行を予防する効果、（ｉｖ）ＨＢＶ感染若しくはそれに伴う症状の回帰を引き起こす効果、（ｖ）ＨＢＶ感染若しくはそれに関連する症状の発症若しくは発症（development or onset）を予防する効果、（ｖｉ）ＨＢＶ感染若しくはそれに伴う症状の再発を予防する効果、（ｖｉｉ）ＨＢＶ感染を有する対象の入院期間を短縮する効果、（ｖｉｉｉ）ＨＢＶ感染を有する対象の入院期間を短縮する効果、（ｉｘ）ＨＢＶ感染を有する対象の生存期間を延長する効果、（ｘ）対象におけるＨＢＶ感染を排除する効果、（ｘｉ）対象におけるＨＢＶ複製を阻害若しくは低減する効果、及び／又は（ｘｉｉ）別の療法の予防若しくは治療効果を増強若しくは改善する効果。
【0253】
治療有効量はまた、臨床セロコンバージョンへの進化と一致してＨＢｓＡｇレベルを低減する；及び／又は対象の免疫系による感染肝細胞の減少に関連する持続的ＨＢｓＡｇクリアランスを達成する；ＨＢＶ抗原特異的活性化Ｔ細胞集団を誘導する；及び／又は治療中若しくは治療後に検出可能なＨＢｓＡｇの喪失であって、その後好ましくは治療終了後６ヶ月以上、最も好ましくは生涯持続する、喪失を達成するのに十分な化合物の量であり得る。標的指標の例としては、例えば、１００ＩＵ／ｍＬのＨＢｓＡｇの閾値未満である血清ＨＢｓＡｇレベル、及び／又は例えば、処置の開始時よりも多い数若しくは多い多機能性のＨＢＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答が挙げられる。標的指標の更なる例としては、定量下限（lower limit of quantification、ＬＬｏＱ）より低い血清ＨＢＶ ＲＮＡレベル；及び／又は対象が男性の場合には正常上限の３倍未満若しくは１２９Ｕ／Ｌ未満、若しくは対象が女性の場合には１０８Ｕ／Ｌ未満の血清ＡＬＴ濃度、より具体的には、対象が男性の場合には１２０Ｕ／Ｌ未満、若しくは対象が女性の場合には１０５Ｕ／Ｌ未満の血清ＡＬＴ濃度、より具体的には、対象が男性の場合には９０Ｕ／Ｌ未満、若しくは対象が女性の場合には５７Ｕ／Ｌ未満の血清ＡＬＴ濃度；及び／又はＨＢｅＡｇ陰性血清；及び／又は１００ＩＵ／ｍＬ以下、より具体的には、正規化されたとみなされる１０ＩＵ／ｍＬ以下の血清ＨＢｓＡｇレベル；及び／又はＨＢｓセロコンバージョン；及び／又はＬＬｏＱ未満のコア関連抗原（core-related antigen、ｃｒＡｇ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、有効量は、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ、又は組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡのうちの１つ以上の発現レベルが対象において低減されるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、発現レベルは、肝細胞レベル、核若しくは細胞レベル、肝臓レベル、血清レベル、又は血漿レベルである。いくつかの好ましい実施形態において、有効量は、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、及びＨＢＶ ＤＮＡのうちの１つ以上の血清及び／又は血漿レベルが対象において低減されるのに十分な量である。
【0254】
一般的な指針として、核酸分子又はベクターに関して使用される場合の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇの核酸分子又はベクター～約５ｍｇ／ｋｇの核酸分子又はベクターの範囲、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、又は約５．０ｍｇ／ｋｇなどであり得る。好ましくは、核酸分子又はベクターの有効量は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇである。薬学的組成物中の核酸分子又はベクターに関して使用される場合の有効量は、核酸分子又はベクター全体の約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬの濃度の範囲、例えば０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０４ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、又は２ｍｇ／ｍＬであり得る。好ましくは、分子又はベクターの有効量は、１ｍｇ／ｍＬ未満、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ未満である。有効量は、１つの核酸分子若しくはベクターから、又は複数の核酸分子若しくはベクターからのものであり得る。有効量は、単一の組成物で、又は複数の組成物、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の組成物（例えば、錠剤、カプセル若しくは注射剤、又は皮内送達、例えば皮内送達パッチを使用した皮内送達に適合させた任意の組成物）で投与することができ、複数のカプセル又は注射剤の投与が集合的に対象に有効量を提供する。例えば、２つのＤＮＡプラスミドが使用される場合、有効量は３～４ｍｇ／ｍＬであり得、各プラスミドは１．５～２ｍｇ／ｍＬである。有効量は、単一の治療有効用量として、又は１、２、３、４、５、若しくはそれ以上の用量などの一連の治療有効用量で投与することができるか、又は一連の用量が集合的に対象に治療有効量を提供する。複数回用量が投与される場合、各用量は、同じ量及び／若しくは濃度、又は異なる量及び／若しくは濃度であり得る。投薬戦略の最適化は、当業者によって容易に理解され、実施されるであろう。
【0255】
２つの核酸分子又はベクター、例えば、第１のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードする第１のベクター及び第２のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードする第２のベクターを含む組み合わせは、両方のベクター又は核酸分子を混合し、混合物を単一の解剖学的部位に送達することによって対象に投与することができる。あるいは、各々が単一のベクター又は核酸分子を送達する２回の別々の投与を実行することができる。このような実施形態において、ベクター又は核酸分子の両方が、混合物としての単回投与で投与されるか、又は２回の別々の投与で投与されるかにかかわらず、第１のベクター又は核酸分子及び第２のベクター又は核酸分子は、１０：１～１：１０の重量比（例えば、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、又は１：１０）で投与され得る。好ましくは、第１及び第２のベクター又は第１及び第２の核酸分子は、１：１の重量比で投与される。
【0256】
好ましくは、本出願の方法に従って治療される対象は、肝炎に感染した対象、好ましくはＨＢＶに感染した対象、特に慢性ＨＢＶ感染を有する対象である。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＢＶ及びＨＤＶに同時感染している。急性ＨＢＶ感染は、その後の広範な適応応答（例えば、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞、中和抗体）で補完される自然免疫系の効率的な活性化によって特徴付けられ、これにより、通常、感染した肝細胞の複製が首尾よく抑制又は除去される。対照的に、このような応答は、高いウイルス負荷及び抗原負荷に起因して損なわれるか又は減少し、例えば、ＨＢＶエンベロープタンパク質が、豊富に産生され、感染性ウイルスに対して１，０００倍過剰でサブウイルス粒子中に放出され得る。
【0257】
慢性ＨＢＶ感染は、ウイルス負荷、肝酵素レベル（壊死炎症活性）、ＨＢｅＡｇ、若しくはＨＢｓＡｇ負荷、又はこれらの抗原に対する抗体の存在によって特徴付けられる段階で説明される。ｃｃｃＤＮＡレベルは、ウイルス血症がかなり変動し得るとしても、細胞当たり約１０～５０コピーで比較的一定である。ｃｃｃＤＮＡ種の持続は慢性化をもたらす。より具体的には、慢性ＨＢＶ感染の段階は、（ｉ）高いウイルス負荷及び正常な又は最小限に上昇した肝酵素によって特徴付けられる免疫寛容段階、（ｉｉ）有意に上昇した肝酵素を伴うウイルス複製のより低いレベル又はレベルの低下が観察される免疫活性化ＨＢｅＡｇ陽性段階、（ｉｉｉ）ＨＢｅＡｇセロコンバージョンに続く可能性がある、低いウイルス負荷及び血清中の正常な肝酵素レベルを有する低複製状態である不活性ＨＢｓＡｇ担体段階、並びに（ｉｖ）肝酵素レベルの変動を伴ってウイルス複製が周期的に起こり（再活性化）、プレコア及び／又は基底コアプロモータにおける突然変異が一般的であり、その結果、ＨＢｅＡｇが感染細胞によって産生されないＨＢｅＡｇ陰性段階を含む。好ましくは、有効量は、慢性ＨＢＶ感染を治療するのに十分な組成物又は本出願の組み合わせの量を指す。
【0258】
いくつかの実施形態において、慢性ＨＢＶ感染を有する対象は、ヌクレオシド類似体（ＮＵＣ）治療を受けており、ＮＵＣ抑制されている。本明細書で使用される場合、「ＮＵＣ抑制」は、ＨＢＶのウイルスレベルが検出不能であり、アラニンアミノトランスフェラーゼ（alanine aminotransferase、ＡＬＴ）レベルが少なくとも６ヶ月間安定である対象を指す。ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体処置の例としては、ＨＢＶポリメラーゼインヒビター（例えば、エンタカビル及びテノホビル）が挙げられる。好ましくは、慢性ＨＢＶ感染を有する対象は、進行性肝線維症又は肝硬変を有しない。このような対象は、代表的には、線維症について３未満のＭＥＴＡＶＩＲスコア及び９ｋＰａ未満の線維スキャン結果を有する。ＭＥＴＡＶＩＲスコアは、Ｂ型肝炎患者の肝生検における組織病理学的評価によって炎症及び線維症の程度を評価するために一般的に使用されるスコアリングシステムである。スコアリングシステムは、２つの標準化された数（１つは炎症の程度を反映する数であり、１つは線維症の程度を反映する数）を割り当てる。
【0259】
慢性ＨＢＶの排除又は低減は、ウイルス誘導性肝硬変及び肝細胞がんを含む重篤な肝疾患の早期疾患遮断を可能にし得ると考えられている。したがって、本出願の方法は、ＨＢＶ誘導性疾患を治療するための療法として使用することもできる。ＨＢＶ誘導性疾患の例としては、肝硬変、がん（例えば、肝細胞がん）、及び線維症、特に、線維症について３以上のＭＥＴＡＶＩＲスコアを特徴とする進行性線維症が挙げられるが、これらに限定されない。そのような実施形態において、有効量は、１２ヶ月以内のＨＢｓＡｇの持続的喪失及び臨床疾患（例えば、肝硬変、肝細胞がんなど）の有意な減少を達成するのに十分な量である。
【0260】
語句「免疫応答を誘導する」は、本明細書に記載される方法に関して使用される場合、病原性因子（例えば、ＨＢＶ）に対して処置するための治療的免疫を提供することを包含する。一実施形態において、「免疫応答を誘導する」とは、例えば、ＨＢＶ感染又はＨＢＶとＨＤＶとの同時感染などの疾患に対する治療効果を提供するために、それを必要とする対象において免疫を産生することを意味する。特定の実施形態において、「免疫応答を誘導する」とは、細胞性免疫、例えば、ＨＢＶ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き起こす又は改善することを指す。特定の実施態様において、このＴ細胞応答は、ＣＨＢを有する治療された患者の機能的治癒をもたらすことができる。特定の実施形態において、「免疫応答を誘導する」とは、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ及びＨＤＶの同時感染に対する体液性免疫応答を引き起こすか又は改善することを指す。特定の実施形態において、「免疫応答を誘導する」とは、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ及びＨＤＶの同時感染に対する細胞性及び体液性免疫応答を引き起こすか又は改善することを指す。
【0261】
本明細書で使用される場合、「機能的治癒」又は「ＦＣ」という用語は、ＣＨＢを有していた対象の状態であって、対象が少なくとも６ヶ月間、全てのＨＢＶ治療を中止した後に、対象の血清が検出可能なＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇを含まないままである、ＣＨＢを有していた対象の状態を指す。例えば、ＦＣを有する対象の血清は、検出不可能なＨＢＶ ＤＮＡを有し、ＨＢＶ治療の終了後６ヶ月でＨＢｓＡｇ陰性である。ＦＣを有する対象におけるＨＢｓＡｇ喪失は、ＨＢｓＡｇセロコンバージョンを伴っても伴わなくてもよい。いくつかの実施形態において、ＦＣは、少なくとも１年、好ましくは少なくとも２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年又は１０年持続する。最も好ましくは、ＦＣは一生涯持続する。
【0262】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞機能の回復」とは、消耗したＨＢＶ特異的Ｔ細胞及びそうでなければ非機能的なＨＢＶ特異的Ｔ細胞が、それらの正常なエフェクター機能を実行し得るような、それらの再活性化を指す。回復されたＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答の例としては、ＨＢＶ感染肝細胞の殺傷又は非細胞溶解性制御、ＨＢｓＡｇを発現する組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡを有する肝細胞の殺傷、並びに一旦ＦＣが達成されると、監視の実行及び経時的に再活性化する感染細胞の殺傷が挙げられるが、これらに限定されない。正味の効果は、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及び他のＨＢＶタンパク質などのウイルス産物を含まない血清を維持することである。
【0263】
いくつかの実施形態において、開示されたｍＲＮＡ分子は、複製肝炎感染（例えば、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ）を処置及び／又は阻害するための１つ以上の更なる薬剤と組み合わせて使用され得る。更なる薬剤は、１つ以上の免疫調節薬であり得る。更なる薬剤としては、インターフェロン、ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体、カプシドアセンブリモジュレータ、配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又はｓｉＲＮＡ）、侵入阻害剤、及び／又は治療用ＨＢＶワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、開示されるｍＲＮＡ分子は、サイトカインと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、開示されるｍＲＮＡ分子は、チモシンアルファ－１と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、開示されるｍＲＮＡ分子は、肝炎感染のための標準治療処置と組み合わせて投与される。ＨＢＶ感染の標準治療処置は、ヌクレオチド／ヌクレオチド類似体（例えば、ラミブジン、テルビブジン、エンテカビル、アデホビル、テノホビル、及びクレブジン、テノホビルアラフェナミド（Tenofovir alafenamide、ＴＡＦ）、ＣＭＸ１５７、及びＡＧＸ－１００９）、並びにインターフェロン（例えば、Ｐｅｇ－ＩＦＮ－２ａ及びＩＦＮ－ａ－２ｂ、インターフェロンラムダ、組換えインターフェロンアルファ２ｂ、ＩＦＮ－ａ）などのウイルスポリメラーゼの阻害剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、開示されるｍＲＮＡ分子は、インターフェロンアルファ－２ａ、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－Ｎ３、インターフェロンベータ－１ａ、インターフェロンベータ－１ｂ、インターフェロンガマ－１ｂ、インターフェロンラムダ－１、インターフェロンラムダ－２、インターフェロンラムダ－３、ペグ化インターフェロンアルファ－２ａ、ペグ化インターフェロンアルファ－２ｂ、ペグ化インターフェロンラムダ－１、及びペグ化インターフェロンラムダ－２からなる群から選択されるインターフェロンと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、開示されたｍＲＮＡ分子は、１つ以上のＴＬＲ７アゴニストと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、開示されたｍＲＮＡ分子は、１つ以上のＴＬＲ８アゴニストと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、開示されるｍＲＮＡ分子は、ＧＳ－９６２Ｏ（４－アミノ－２－ブトキシ－８－３－（ピロリジン－１－イルメチル）フェニル）メチル－５，７－ジヒドロプテリジン－６－オン）又はＧＳ－９６８８（Ｓｅｌｇａｎｔｏｌｉｍｏｄ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、開示されるｍＲＮＡ分子は、Ｂｕｌｅｖｉｒｔｉｄｅと組み合わせて投与される。
【0264】
いくつかの実施形態において、開示されるｍＲＮＡ分子は、同時（simultaneous）（同時投与（co-administration））又は連続投与のいずれかの後に、１つ以上のオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与される。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ギャップマー、及び／又は核酸ポリマー（nucleic acid polymer、ＮＡＰ）を含み得る。いくつかの実施形態において、開示されるｍＲＮＡ分子は、ウイルス複製阻害剤などの１つ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、開示されるｍＲＮＡ分子は、ＨＢＶカプシドアセンブリモジュレータ（Capsid assembly modulator、ＣＡＭ）と組み合わせて投与される。ＨＢＶ ＣＡＭ分子は、ＪＮＪ ６３７９、ＮＶＲ ３－７７８、ＡＢ－４２３、ＧＬＳ－４、Ｂａｙｅｒ ４１－４１０９、ＨＡＰ－１、及びＡＴ－１を含むことができる。いくつかの実施形態において、開示されるオリゴヌクレオチド構築物は、ＴＬＲアゴニストなどの１つ以上の免疫調節薬と組み合わせて投与される。ＴＬＲアゴニストは、ＧＳ－９６２０、ＧＳ－９６８８、ＡＲＢ－１５９８、ＡＮＡ９７５、ＲＧ７７９５（ＡＮＡ７７３）、ＭＥＤＩ９１９７、ＰＦ－３５１２６７６、及びＩＭＯ－２０５５を含むことができる。いくつかの実施形態において、開示されたｍＲＮＡ分子は、ＨＢＶワクチンと組み合わせて投与される。ＨＢＶワクチンは、Ｈｅｐｌｉｓｌａｖ、ＡＢＸ２０３及びＩＮＯ－１８００を含むことができる。
【0265】
一態様において、ｓｉＲＮＡ成分は、１つ以上のｓｉＲＮＡ剤を含む。本明細書に開示される各ｓｉＲＮＡ剤は、少なくともセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに部分的に、実質的に、又は完全に相補的であり得る。本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ剤センス鎖及びアンチセンス鎖の長さはそれぞれ、１６～３０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１７～２６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１９～２６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して２１～２６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して２１～２４ヌクレオチド長である。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さ又は異なる長さのいずれかであり得る。本明細書に開示されるＨＢＶ ｓｉＲＮＡ剤は、ＨＢＶの既知の血清型の大部分にわたって保存されているＨＢＶゲノム中の配列に少なくとも部分的に相補的であるアンチセンス鎖配列を含むように設計されている。本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ剤は、ＨＢＶを発現する細胞に送達されると、１つ以上のＨＢＶ遺伝子の発現をインビボで又はインビトロで阻害する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、ＪＮＪ ３９８９、ＶＩＲ－２２１８；又はＡＲＢ－１４６７であり得る。
【0266】
ｓｉＲＮＡ剤は、第１の配列を含むセンス鎖（パッセンジャー鎖とも呼ばれる）と、第２の配列を含むアンチセンス鎖（ガイド鎖とも呼ばれる）と、を含む。本明細書に記載されるＨＢＶ ｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、ＨＢＶ ｍＲＮＡ中の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して少なくとも約８５％の同一性を有するコアストレッチを含む。いくつかの実施形態において、ＨＢＶ ｍＲＮＡ中の配列に対して少なくとも約８５％の同一性を有するセンス鎖コアヌクレオチドストレッチは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチド長である。ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、ＨＢＶ ｍＲＮＡ及び対応するセンス鎖中の配列に対して少なくとも１６個の連続したヌクレオチドのコアストレッチにわたって少なくとも約８５％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＢＶ ｍＲＮＡ又は対応するセンス鎖中の配列に対して少なくとも約８５％の相補性を有するアンチセンス鎖コアヌクレオチド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチド長である。
【0267】
本出願の実施形態による方法は、それを必要とする対象に、別の抗ＨＢＶ剤（ヌクレオシド類似体又は他の抗ＨＢＶ剤など）を本出願の薬学的組成物と組み合わせて投与することを更に含む。例えば、別の抗ＨＢＶ剤は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＴＩＭ－３など）、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、ＴＬＲ７アゴニスト及び／又はＴＬＲ８アゴニスト）、ＲＩＧ－１アゴニスト、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（Altor Bioscience）、突然変異体ＩＲＦ３及びＩＲＦ７遺伝子アジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ａｄｕｒｏ）、ＦＬＴ３Ｌ遺伝子アジュバント、ＩＬ－１２遺伝子アジュバント、ＩＬ－７－ｈｙＦｃ；ＨＢＶ ｅｎｖを結合するＣＡＲ－Ｔ（Ｓ－ＣＡＲ細胞）；カプシドアセンブリモジュレータ；ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（例えば、エンテカビル及びテノホビル）を含むがこれらに限定されない小分子又は抗体であり得る。１つ又は他の抗ＨＢＶ活性薬剤は、例えば、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ポリペプチド、タンパク質、又は核酸であり得る。
【0268】
送達方法
本出願の薬学的組成物及び組み合わせは、非経口投与（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、又は皮内注射）、経口投与、経皮投与、及び経鼻投与を含むがこれらに限定されない、本開示を考慮して当技術分野において既知の任意の方法によって対象に投与することができる。好ましくは、薬学的組成物及び組み合わせは、非経口的に（例えば、静脈内注射、筋肉内注射又は皮内注射によって）又は経皮的に投与される。
本出願の薬学的組成物及び組み合わせは、非経口投与（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、又は皮内注射）、経口投与、経皮投与、及び経鼻投与を含むがこれらに限定されない、本開示を考慮して当技術分野において既知の任意の方法によって対象に投与することができる。好ましくは、薬学的組成物及び組み合わせは、非経口的に（例えば、静脈内注射、筋肉内注射又は皮内注射によって）又は経皮的に投与される。
【0269】
薬学的組成物又は組み合わせが１つ以上のＤＮＡプラスミドを含む本出願のいくつかの実施形態において、投与は、皮膚を通した注射、例えば、筋肉内注射又は皮内注射、好ましくは筋肉内注射によるものであり得る。筋肉内注射は、エレクトロポレーション、すなわち、細胞へのＤＮＡプラスミドの送達を促進するための電場の適用と組み合わせることができる。本明細書で使用される場合、「エレクトロポレーション」という用語は、生体膜に微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電場パルスの使用を指す。インビボエレクトロポレーションの間、適切な大きさ及び持続時間の電場が細胞に印加され、増強された細胞膜透過性の一過性状態を誘導し、したがって、それ自体では細胞膜を通過することができない分子の細胞取り込みを可能にする。エレクトロポレーションによるそのような細孔の作製は、細胞膜の一方の側から他方の側への、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物などの生体分子の通過を容易にする。ＤＮＡの送達のためのインビボエレクトロポレーションは、宿主細胞によるプラスミド取り込みを有意に増加させる一方で、注射部位における軽度～中程度の炎症ももたらすことが示されている。結果として、トランスフェクション効率は、従来の注射と比較して、皮内又は筋肉内エレクトロポレーションで有意に改善される（例えば、それぞれ最大１，０００倍及び１００倍）。
【0270】
典型的な実施形態において、エレクトロポレーションは筋肉内注射と組み合わされる。しかしながら、エレクトロポレーションを他の形態の非経口投与、例えば皮内注射、皮下注射などと組み合わせることも可能である。
【0271】
エレクトロポレーションを介した本出願の薬学的組成物、組み合わせ、又はワクチンの投与は、細胞膜に可逆的孔を形成させるのに有効なエネルギーパルスを哺乳類の所望の組織に送達するように構成することができるエレクトロポレーションデバイスを使用して達成することができる。エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーション構成要素及び電極アセンブリ又はハンドルアセンブリを含むことができる。エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーションデバイスの以下の構成要素：コントローラ、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、状態報告要素、通信ポート、メモリ構成要素、電源、及び電力スイッチ、のうちの１つ以上を含むことができる。エレクトロポレーションは、インビボエレクトロポレーションデバイスを使用して達成することができる。本出願の組成物及び免疫原性組み合わせ、特にＤＮＡプラスミドを含むものの送達を容易にすることができるエレクトロポレーションデバイス及びエレクトロポレーション方法の例としては、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）、Ｅｌｇｅｎエレクトロポレータ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）Ｔｒｉ－Ｇｒｉｄ（商標）送達システム（Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１）、並びに米国特許第７，６６４，５４５号、米国特許第８，２０９，００６号、米国特許第９，４５２，２８５号、米国特許第５，２７３，５２５号、米国特許第６，１１０，１６１号、米国特許第６，２６１，２８１号、米国特許第６，９５８，０６０号、及び米国特許第６，９３９，８６２号、米国特許第７，３２８，０６４号、米国特許第６，０４１，２５２号、米国特許第５，８７３，８４９号、米国特許第６，２７８，８９５号、米国特許第６，３１９，９０１号、米国特許第６，９１２，４１７号、米国特許第８，１８７，２４９号、米国特許第９，３６４，６６４号、米国特許第９，８０２，０３５号、米国特許第６，１１７，６６０号、及び国際特許出願公開２０１７／１７２８３８号（これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。例えば、米国特許第６、６９７，６６９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなパルス電場の使用も、本出願の組成物及び組み合わせの送達によって企図される。
【0272】
薬学的組成物又は組み合わせが１つ以上のＤＮＡプラスミドを含む本出願の他の実施形態において、投与方法は経皮である。経皮投与は、細胞へのＤＮＡプラスミドの送達を容易にするために表皮皮膚擦過傷と組み合わせることができる。例えば、皮膚用パッチは表皮皮膚擦過傷に使用することができる。皮膚用パッチを除去すると、組成物又は組み合わせは、剥奪された皮膚上に付着させることができる。
【0273】
送達方法は、上記の実施形態に限定されず、細胞内送達のための任意の手段を使用することができる。本出願の方法によって企図される他の細胞内送達方法としては、リポソーム封入、リポプレックス、ナノ粒子などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本出願の１つ以上のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡは、１つ以上の脂質分子、好ましくは正に荷電した脂質分子を含む組成物中に製剤化することができる。いくつかの実施形態において、本開示の１つ以上のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡは、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、及び／又は脂質ナノ粒子を使用して製剤化することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるリポソーム又は脂質ナノ粒子製剤は、ポリカチオン性組成物を含むことができる。いくつかの実施形態において、ポリカチオン性組成物を含む製剤は、本明細書に記載されるＨＢＶ ＴＡＬＥＮをインビボ及び／又はエクスビボで送達するために使用することができる。
【0274】
実施形態
実施形態１は、肝炎感染の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含む、ｍＲＮＡ分子の組み合わせを対象に投与することを含み、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができ、
好ましくは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである、方法を含む。
実施形態１は、肝炎感染の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含む、ｍＲＮＡ分子の組み合わせを対象に投与することを含み、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができ、
好ましくは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである、方法を含む。
【0275】
実施形態１ａは、第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインが同じである、実施形態１の方法を含む。
【0276】
実施形態１ｂは、第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインが異なる、実施形態１の方法を含む。
【0277】
実施形態２は、標的核酸配列が、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）をコードする配列内にある、実施形態１～１ｂのうちのいずれか１つの方法を含む。
【0278】
実施形態２ａは、標的核酸配列の第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２の方法を含む。
【0279】
実施形態２ｂは、標的核酸配列の第１の半部位配列が、配列番号３の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列が、配列番号４の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２の方法を含む。
【0280】
実施形態２ｃは、標的核酸配列が、配列番号５又は配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２の方法を含む。
【0281】
実施形態３は、第１及び第２のｍＲＮＡ分子がそれぞれ、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールのうちの１つ以上、好ましくは全てを更に含む、実施形態１～２ｃのうちのいずれか１つの方法を含む。
【0282】
実施形態３ａは、第１及び第２のｍＲＮＡ分子がそれぞれ、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、Ｎ末端ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールを含む、実施形態３の方法を含む。
【0283】
実施形態３ｂは、第１及び第２のｍＲＮＡ分子がそれぞれ、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールを含む、実施形態３の方法を含む。
【0284】
実施形態４は、それぞれ、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８又は配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～３ｂのうちのいずれか１つの方法を含む。
【0285】
実施形態４ａは、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態４の方法を含む。
【0286】
実施形態４ａ１は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号７のアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号８のアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態４ａの方法を含む。
【0287】
実施形態４ａ２は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号７のアミノ酸配列からなり、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号８のアミノ酸配列からなり、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ配列番号１１のアミノ酸配列からなる、実施形態４ａの方法を含む。
【0288】
実施形態４ｂは、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ、配列番号１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態４の方法を含む。
【0289】
実施形態４ｂ１は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号９のアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号１０のアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態４ｂの方法を含む。
【0290】
実施形態４ｂ２は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号９のアミノ酸配列からなり、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号１０のアミノ酸配列からなり、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ配列番号１１のアミノ酸配列からなる、実施形態４ｂの方法を含む。
【0291】
実施形態５は、ＨＢＶゲノムが遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである、実施形態１～４ｂ２のうちのいずれか１つの方法を含む。
【0292】
実施形態５ａは、ＨＢＶゲノムが、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのうちの１つ以上のものである、実施形態５の方法を含む。
【0293】
実施形態６は、対象に、好ましくは抗ＨＢＶ剤を含む第２の治療用組成物を投与することを更に含む、実施形態１～５ａのうちのいずれか１つの方法を含む。
【0294】
実施形態７は、対象が、ＨＢＶ感染、好ましくは慢性ＨＢＶ感染を有する、実施形態１～６のうちのいずれか１つの方法を含む。
【0295】
実施形態８は、対象が、ＨＢＶ及びＨＤＶに同時感染している、実施形態１～７のうちのいずれか１つの方法を含む。
【0296】
実施形態９は、脂質ナノ粒子中に封入されたｍＲＮＡ分子の組み合わせを含む組成物であって、ｍＲＮＡ分子の組み合わせが、
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含み、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができ、
好ましくは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである、組成物を含む。
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができる、第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮ単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができる、第２のｍＲＮＡ分子と、を含み、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができ、
好ましくは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインであり、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインである、組成物を含む。
【0297】
実施形態９ａは、第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインが同じである、実施形態９の組成物を含む。
【0298】
実施形態９ｂは、第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインが異なる、実施形態９の組成物を含む。
【0299】
実施形態９ｃは、各ｍＲＮＡ分子が、脂質ナノ粒子中に個別に封入されている、実施形態９～９ｂのうちのいずれか１つの組成物を含む。
【0300】
実施形態９ｄは、複数のｍＲＮＡ分子が、個々の脂質ナノ粒子中に封入されている、実施形態９～９ｂのうちのいずれか１つの組成物を含む。
【0301】
実施形態１０は、標的核酸配列が、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）をコードする配列内にある、実施形態９～９ｄのうちのいずれか１つの組成物を含む。
【0302】
実施形態１０ａは、標的核酸配列の第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１０の組成物を含む。
【0303】
実施形態１０ｂは、標的核酸配列の第１の半部位配列が、配列番号３の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列の第２の半部位配列が、配列番号４の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１０の組成物を含む。
【0304】
実施形態１０ｃは、標的核酸配列が、配列番号５又は配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１０の組成物を含む。
【0305】
実施形態１１は、第１及び第２のｍＲＮＡ分子がそれぞれ、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、核局在化シグナルをコードする配列、Ｎ末端ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、３’－ＵＴＲ、及びポリアデノシンテールのうちの１つ以上を更に含む、実施形態９～１０ｃのうちのいずれか１つの組成物を含む。
【0306】
実施形態１２は、それぞれ、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８又は配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態９～１１のうちのいずれか１つの組成物を含む。
【0307】
実施形態１２ａは、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１２の組成物を含む。
【0308】
実施形態１２ａ１は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号７のアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号８のアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態１２ａの組成物を含む。
【0309】
実施形態１２ａ２は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号７のアミノ酸配列からなり、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号８のアミノ酸配列からなり、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ配列番号１１のアミノ酸配列からなる、実施形態１２ａの組成物を含む。
【0310】
実施形態１２ｂは、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ、配列番号１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態１２の組成物を含む。
【0311】
実施形態１２ｂ１は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号９のアミノ酸配列を含み、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号１０のアミノ酸配列を含み、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態１２ｂの組成物を含む。
【0312】
実施形態１２ｂ２は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号９のアミノ酸配列からなり、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが配列番号１０のアミノ酸配列からなり、第１及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインがそれぞれ配列番号１１のアミノ酸配列からなる、実施形態１２ｂの組成物を含む。
【0313】
実施形態１３は、ＨＢＶゲノムが遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである、実施形態９～１２ｂ２のうちのいずれか１つの組成物を含む。
【0314】
実施形態１３ａは、ＨＢＶゲノムが、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのうちの１つ以上のものである、実施形態１３の組成物を含む。
【0315】
実施形態１４は、ｍＲＮＡ分子の組み合わせを封入する脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質と、アニオン性脂質、双性イオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、リン脂質、糖脂質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの他の脂質と、を含む、実施形態９～１３ａのうちのいずれか１つの組成物を含む。
【0316】
実施形態１５は、
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができ、第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができ、第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子と、の組み合わせであって、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができる、組み合わせを含む。
（１）第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子であって、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ＨＢＶゲノム内の標的核酸配列の第１の半部位配列に結合することができ、第１の半部位配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第１の核酸、好ましくは第１のｍＲＮＡ分子と、
（２）第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む第２の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）単量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子であって、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、標的核酸配列の第２の半部位配列に結合することができ、第２の半部位配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、第２の核酸、好ましくは第２のｍＲＮＡ分子と、の組み合わせであって、
第１のＴＡＬＥＮ単量体及び第２のＴＡＬＥＮ単量体は、第１のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第１の半部位配列に結合し、第２のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが第２の半部位配列に結合する場合に、標的核酸配列を切断する二量体を形成することができる、組み合わせを含む。
【0317】
実施形態１５ａは、第１の半部位配列が配列番号１の核酸配列を含み、第２の半部位配列が配列番号２の核酸配列を含む、実施形態１５の組み合わせを含む。
【0318】
実施形態１５ｂは、第１の半部位配列が配列番号１の核酸配列からなり、第２の半部位配列が配列番号２の核酸配列からなる、実施形態１５の組み合わせを含む。
【0319】
実施形態１６は、ＨＢＶゲノムが遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである、実施形態１５～１５ｂのうちのいずれか１つの組み合わせを含む。
【0320】
実施形態１６ａは、ＨＢＶゲノムが遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのうちの１つ以上のものである、実施形態１６の組み合わせを含む。
【0321】
実施形態１７は、実施形態１５～１６ａのうちのいずれか１つの組み合わせを含む組成物であって、第１及び第２の核酸が、脂質ナノ粒子中に別々に又は一緒に封入されている、組成物を含む。
【0322】
実施形態１８は、実施形態１５～１５ｂのうちのいずれか１つの第１のｍＲＮＡ分子及び第２のｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをコードする、核酸分子を含む。
【0323】
実施形態１９は、実施形態１８の核酸分子を含む、単離された宿主細胞を含む。
【0324】
実施形態２０は、宿主細胞が肝細胞である、実施形態１９の単離された宿主細胞を含む。
【0325】
実施形態２１は、実施形態９～１４若しくは１７のうちのいずれか１つの組成物、実施形態１５若しくは１６ａの組み合わせ、実施形態１８の核酸分子、又は実施形態項１９若しくは２０の単離された宿主細胞と、薬学的に受容可能な担体と、を含む、薬学的組成物を含む。
【0326】
実施形態２２は、ＨＢＶゲノム中の標的核酸配列を切断する方法であって、ＨＢＶゲノムを、実施形態９～１４若しくは１７のうちのいずれか１つの組成物、実施形態１５～１６ａのうちのいずれか１つの組み合わせ、実施形態１８の核酸分子、実施形態１９若しくは２０の単離された宿主細胞、又は実施形態２１の薬学的組成物と接触させることを含む、方法を含む。
【0327】
実施形態２３は、ＨＢＶゲノム中の標的核酸配列の遺伝子編集を誘導するための方法であって、ＨＢＶゲノムを、実施形態９～１４若しくは１７のうちのいずれか１つの組成物、実施形態１５～１６ａのうちのいずれか１つの組み合わせ、実施形態１８の核酸分子、実施形態１９若しくは２０の単離された宿主細胞、又は実施形態２１の薬学的組成物と接触させることを含む、方法を含む。
【0328】
実施形態２４は、ＨＢＶゲノムが、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪのうちの１つ以上のものである、実施形態２２又は２３の方法を含む。
【0329】
実施形態２４ａは、ＨＢＶゲノムが、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのうちの１つ以上のものである、実施形態２４の方法を含む。
【0330】
実施形態２５は、肝炎感染の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、実施形態２１に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を含む。
【0331】
実施形態２６は、対象におけるＨＢＶの感染及び／又は複製を低減するための方法であって、実施形態２１に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を含む。
【0332】
実施形態２７は、対象に、好ましくは抗ＨＢＶ剤を含む第２の治療用組成物を投与することを更に含む、実施形態２５又は２６の方法を含む。
【0333】
実施形態２８は、対象が、ＨＢＶ感染、好ましくは慢性ＨＢＶ感染を有する、実施形態２５～２７のうちのいずれか１つの方法を含む。
【0334】
実施形態２９は、対象が、ＨＢＶ及びＨＤＶに同時感染している、実施形態２５～２８のうちのいずれか１つの方法を含む。
【0335】
実施形態３０は、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ、又は組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡのうちの１つ以上の発現レベルが、対象において低減される、実施形態２５～２９のうちのいずれか１つの方法を含む。
【0336】
実施形態３０ａは、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、及びＨＢＶ ＤＮＡのうちの１つ以上の血清及び／又は血漿レベルが、対象において低減される、実施形態３０の方法を含む。
【0337】
実施形態３１は、発現レベルが、肝細胞レベル、核若しくは細胞レベル、肝臓レベル、血清レベル、又は血漿レベルである、実施形態３０の方法を含む。
【0338】
実施形態３２は、実施形態１８の核酸分子をインビトロ又はインビボで転写することを含む、ＴＡＬＥＮを産生する方法を含む。
【0339】
実施形態３３は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導性疾患の治療を必要とする対象であって、好ましくは慢性ＨＢＶ感染を有する、対象においてその治療に使用するための、実施形態２１の薬学的組成物を含む。
【0340】
実施形態３３ａは、別の治療剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ剤と組み合わせた、実施形態３３の薬学的組成物を含む。
【0341】
実施形態３４は、ＨＢＶ誘導性疾患が、進行性線維症、肝硬変及び肝細胞がん（ＨＣＣ）からなる群から選択される、実施形態３３又は３３ａの薬学的組成物を含む。
【0342】
実施例１～６の材料及び方法
細胞及び培養
凍結保存したＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）を解凍し、１０％ＦＢＳを含有し、抗生物質、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及びＧ４１８を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞をコラーゲンＩ被覆フラスコ及びプレート上で培養した。
細胞及び培養
凍結保存したＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）を解凍し、１０％ＦＢＳを含有し、抗生物質、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及びＧ４１８を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞をコラーゲンＩ被覆フラスコ及びプレート上で培養した。
【0343】
凍結保存した初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）（Ｌｏｎｚａ、ロット８３１７）を解凍し、１０％ＦＢＳ並びにＨＥＰＥＳ、Ｌ－プロリン、インスリン、上皮成長因子、デキサメタゾン、アスコルビン酸－２－リン酸、及び２％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含むサプリメントカクテルを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。
【0344】
ＨＢＶ接種物
遺伝子型（ＧＴ）Ｄ ＨＢＶ接種物を収集し、ＧＴ Ｄ ＨＢＶ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ９５５５１）を構成的に発現するＨｅｐＧ２．２．１５ヒト肝芽腫細胞の上清から濃縮した。患者血清由来のＧＴ Ａ（ＰＳ ３．５７）、Ｂ（ＰＳ ３．４）、Ｃ（ＰＳ ３．７）、及びＤ（ＰＳ ３．５６）ＨＢＶ接種物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓから購入した。
遺伝子型（ＧＴ）Ｄ ＨＢＶ接種物を収集し、ＧＴ Ｄ ＨＢＶ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ９５５５１）を構成的に発現するＨｅｐＧ２．２．１５ヒト肝芽腫細胞の上清から濃縮した。患者血清由来のＧＴ Ａ（ＰＳ ３．５７）、Ｂ（ＰＳ ３．４）、Ｃ（ＰＳ ３．７）、及びＤ（ＰＳ ３．５６）ＨＢＶ接種物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓから購入した。
【0345】
ＨＢＶ ＤＮＡプラスミド
ＣＭＶプロモータの制御下にある１．１ｘ遺伝子型Ｂ ＨＢＶゲノムを含むプラスミドＤＮＡは、ＨＢＶ感染患者の血清から以前にクローニングされた（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＹ２２０６９８，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｉｎａ）。遺伝子型Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ３０５４２２）、Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ０３３５５０）、Ｄ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ０１４６０）、Ｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ２７４９７１）、Ｆ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ０３６９１２）、Ｇ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ１６０５０１）、及びＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ３７５１５９）由来のＨＢＶ配列は、１．１ｘゲノムとして遺伝子合成され、５’末端にＣＭＶプロモータの一部を含んだ。遺伝子合成された片を配列決定によって確認し、制限部位ＳａｌＩ及びＮｄｅＩ（Ｇｅｎｅｗｉｚ，ＵＳＡ）を使用してｐＣＭＶ－ＨＢＶプラスミドにサブクローニングした。
ＣＭＶプロモータの制御下にある１．１ｘ遺伝子型Ｂ ＨＢＶゲノムを含むプラスミドＤＮＡは、ＨＢＶ感染患者の血清から以前にクローニングされた（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＹ２２０６９８，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｉｎａ）。遺伝子型Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ３０５４２２）、Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ０３３５５０）、Ｄ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ０１４６０）、Ｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ２７４９７１）、Ｆ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ０３６９１２）、Ｇ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ１６０５０１）、及びＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ３７５１５９）由来のＨＢＶ配列は、１．１ｘゲノムとして遺伝子合成され、５’末端にＣＭＶプロモータの一部を含んだ。遺伝子合成された片を配列決定によって確認し、制限部位ＳａｌＩ及びＮｄｅＩ（Ｇｅｎｅｗｉｚ，ＵＳＡ）を使用してｐＣＭＶ－ＨＢＶプラスミドにサブクローニングした。
【0346】
ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ
ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ配列を、インビトロ転写のためのＴ７プロモータを有するプラスミドにクローニングした。プラスミドを、ＢｓｐＱＩ制限部位を使用して線状化し、インビトロ転写した。簡単に述べると、ヌクレオチド三リン酸（nucleotide triphosphate、ＮＴＰ）及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを、緩衝水溶液中で線状化鋳型と合わせ、インキュベートした。得られたｍＲＮＡ転写物を、カラムクロマトグラフィーを使用して精製し、ＤＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ混入を、酵素反応を使用してｍＲＮＡから除去し、ｍＲＮＡを濃縮し、緩衝液を交換した。
ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ配列を、インビトロ転写のためのＴ７プロモータを有するプラスミドにクローニングした。プラスミドを、ＢｓｐＱＩ制限部位を使用して線状化し、インビトロ転写した。簡単に述べると、ヌクレオチド三リン酸（nucleotide triphosphate、ＮＴＰ）及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを、緩衝水溶液中で線状化鋳型と合わせ、インキュベートした。得られたｍＲＮＡ転写物を、カラムクロマトグラフィーを使用して精製し、ＤＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ混入を、酵素反応を使用してｍＲＮＡから除去し、ｍＲＮＡを濃縮し、緩衝液を交換した。
【0347】
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を用いたＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡのトランスフェクション
トランスフェクションの日に、右又は左ＴＡＬＥＮタンパク質をコードするｍＲＮＡを、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中で１：１の比で組み合わせた後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡの不在下でのトランスフェクション混合物もまた、非ＴＡＬＥＮ対照として調製した。成長させたＨｅｐＧ２．２．１５細胞の逆トランスフェクションのために、トランスフェクション混合物を９６ウェルプレートウェルに入れ、３０，０００／ウェルの密度でトランスフェクション混合物の上に播種し、３７℃で維持した。その後、トランスフェクション混合物を含有する培地を除去し、新鮮な細胞培養培地を補充した。トランスフェクトされた細胞を３０℃で維持し、トランスフェクション後３日目に培地を更に交換した。遺伝子編集及び分泌されたＨＢｓＡｇを、トランスフェクション後６日目にモニターした。
トランスフェクションの日に、右又は左ＴＡＬＥＮタンパク質をコードするｍＲＮＡを、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中で１：１の比で組み合わせた後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡの不在下でのトランスフェクション混合物もまた、非ＴＡＬＥＮ対照として調製した。成長させたＨｅｐＧ２．２．１５細胞の逆トランスフェクションのために、トランスフェクション混合物を９６ウェルプレートウェルに入れ、３０，０００／ウェルの密度でトランスフェクション混合物の上に播種し、３７℃で維持した。その後、トランスフェクション混合物を含有する培地を除去し、新鮮な細胞培養培地を補充した。トランスフェクトされた細胞を３０℃で維持し、トランスフェクション後３日目に培地を更に交換した。遺伝子編集及び分泌されたＨＢｓＡｇを、トランスフェクション後６日目にモニターした。
【0348】
ＰＨＨを用いたＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡのＨＢＶ感染及びトランスフェクション
ＰＨＨを、ＨＢＶ感染の少なくとも１日前に、コラーゲン被覆２４ウェルプレートに２４０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。ＰＨＨを、４％ＰＥＧ－８０００（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中、細胞当たり２００ゲノム当量のＨＢＶ接種物で感染させた。翌日、ＨＢＶ接種物を除去し、ｃｃｃＤＮＡ及びウイルス複製を、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション前に少なくとも５日間確立させた。トランスフェクションの日に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合する前に、右又は左ＴＡＬＥＮタンパク質をコードするｍＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地中で１：１の比で組み合わせた。ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡの不在下でのトランスフェクション混合物も、非ＴＡＬＥＮ対照として調製した。３７℃でＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを用いて又は用いずにＨＢＶ感染ＰＨＨを一晩トランスフェクトし、その後、トランスフェクション混合物を含有する培地を除去し、新鮮なＰＨＨ培養培地を補充した。トランスフェクトされた細胞を３０℃で維持し、トランスフェクション後３日目に培地を更に交換した。遺伝子編集並びに分泌されたＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを、トランスフェクション後６日目にモニターした。
ＰＨＨを、ＨＢＶ感染の少なくとも１日前に、コラーゲン被覆２４ウェルプレートに２４０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。ＰＨＨを、４％ＰＥＧ－８０００（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中、細胞当たり２００ゲノム当量のＨＢＶ接種物で感染させた。翌日、ＨＢＶ接種物を除去し、ｃｃｃＤＮＡ及びウイルス複製を、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション前に少なくとも５日間確立させた。トランスフェクションの日に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合する前に、右又は左ＴＡＬＥＮタンパク質をコードするｍＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地中で１：１の比で組み合わせた。ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡの不在下でのトランスフェクション混合物も、非ＴＡＬＥＮ対照として調製した。３７℃でＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを用いて又は用いずにＨＢＶ感染ＰＨＨを一晩トランスフェクトし、その後、トランスフェクション混合物を含有する培地を除去し、新鮮なＰＨＨ培養培地を補充した。トランスフェクトされた細胞を３０℃で維持し、トランスフェクション後３日目に培地を更に交換した。遺伝子編集並びに分泌されたＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを、トランスフェクション後６日目にモニターした。
【0349】
細胞培養におけるＨＢＶ ＴＡＬＥＮタンパク質及びＨＢＶ抗原の検出
トランスフェクトされたＰＨＨにおけるＨＢＶ ＴＡＬＥＮタンパク質の発現を、トランスフェクションの６時間後に免疫蛍光法によって検出した。細胞をＰｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＶＷＲ）で固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ １００を用いて透過処理し、ＰＢＳ中の３％正常ヤギ血清（normal goat serum、ＮＧＳ）でブロッキングした。３％ＮＧＳを含有する一次ペプチドタグ特異的抗体を使用し、続いて３％ＮＧＳを含有するＰＢＳ中で１：１０００に希釈したヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で二次染色することによって、免疫染色を実行した。核染色は、１：１０００に希釈したＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を二次抗体と混合した二次染色と併せて行った。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを、ＨＢＶ感染ＰＨＨ又はＨｅｐＧ２．２．１５細胞の上清から、それぞれＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの定量的検出に対応するＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用することによってモニターした。免疫蛍光染色及び画像化をＯｐｅｒａシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で実行した。
トランスフェクトされたＰＨＨにおけるＨＢＶ ＴＡＬＥＮタンパク質の発現を、トランスフェクションの６時間後に免疫蛍光法によって検出した。細胞をＰｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＶＷＲ）で固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ １００を用いて透過処理し、ＰＢＳ中の３％正常ヤギ血清（normal goat serum、ＮＧＳ）でブロッキングした。３％ＮＧＳを含有する一次ペプチドタグ特異的抗体を使用し、続いて３％ＮＧＳを含有するＰＢＳ中で１：１０００に希釈したヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で二次染色することによって、免疫染色を実行した。核染色は、１：１０００に希釈したＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を二次抗体と混合した二次染色と併せて行った。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを、ＨＢＶ感染ＰＨＨ又はＨｅｐＧ２．２．１５細胞の上清から、それぞれＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの定量的検出に対応するＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用することによってモニターした。免疫蛍光染色及び画像化をＯｐｅｒａシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で実行した。
【0350】
ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ遺伝子編集検出
ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡのトランスフェクション後６日目に、ＰＨＨを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０を含有する溶解緩衝液で、室温で１０分間処理した。細胞をスピンダウンして核を単離し、そこからゲノムＤＮＡ及びＨＢＶ ＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した。ＨＢＶ ＤＮＡの弛緩環状形態をｃｃｃＤＮＡから除去するために、抽出したＤＮＡを１０単位のＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で３７℃で６０分間処理した。次いで、Ｔ５エキソヌクレアーゼを９０℃で５分間加熱することにより不活性化させた。ＨＢｓＡｇコード領域内の標的ＨＢＶ配列を、９５℃で１０分間を１サイクル、９５℃で３０秒間（変性ステップ）、６４℃で３０秒間（アニーリングステップ）、７２℃で３０秒間（伸長ステップ）を４５サイクル、続いて７２℃で１０分間の最終伸長のサイクリング条件を使用して、順方向プライマー５’－ＣＣＴ ＡＧＧ ＡＣＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＴ（配列番号２９）及び逆方向プライマー５’－ＡＣＴ ＧＡＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＣＧ ＧＧ（配列番号３０）、並びにＰｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって増幅した。１０×ＮＥＢ２緩衝液及び水を１０ｕＬのＰＣＲ反応物に添加して１×の最終濃度にし、９５℃で１０分間変性させ、次いで温度を最初に毎秒３℃で８５℃に低下させ、次いで更に毎秒０．３℃で２５℃に低下させることによって再アニーリングした。ミスマッチＤＮＡ配列を、５単位のＴ７Ｅ１ヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の添加及び３７℃で１時間のインキュベーションによって切断した。消化及び未消化産物を、Ｎｏｖｅｘ １０％ＴＢＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた電気泳動、及びＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｍ ｉｍａｇｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いたＵＶによる可視化のためのＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）による染色によって分析した。更に、アンプリコンを次世代配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に供して、ＴＡＬＥＮ標的領域内の変化を決定した。
ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡのトランスフェクション後６日目に、ＰＨＨを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０を含有する溶解緩衝液で、室温で１０分間処理した。細胞をスピンダウンして核を単離し、そこからゲノムＤＮＡ及びＨＢＶ ＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した。ＨＢＶ ＤＮＡの弛緩環状形態をｃｃｃＤＮＡから除去するために、抽出したＤＮＡを１０単位のＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で３７℃で６０分間処理した。次いで、Ｔ５エキソヌクレアーゼを９０℃で５分間加熱することにより不活性化させた。ＨＢｓＡｇコード領域内の標的ＨＢＶ配列を、９５℃で１０分間を１サイクル、９５℃で３０秒間（変性ステップ）、６４℃で３０秒間（アニーリングステップ）、７２℃で３０秒間（伸長ステップ）を４５サイクル、続いて７２℃で１０分間の最終伸長のサイクリング条件を使用して、順方向プライマー５’－ＣＣＴ ＡＧＧ ＡＣＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＴ（配列番号２９）及び逆方向プライマー５’－ＡＣＴ ＧＡＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＣＧ ＧＧ（配列番号３０）、並びにＰｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって増幅した。１０×ＮＥＢ２緩衝液及び水を１０ｕＬのＰＣＲ反応物に添加して１×の最終濃度にし、９５℃で１０分間変性させ、次いで温度を最初に毎秒３℃で８５℃に低下させ、次いで更に毎秒０．３℃で２５℃に低下させることによって再アニーリングした。ミスマッチＤＮＡ配列を、５単位のＴ７Ｅ１ヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の添加及び３７℃で１時間のインキュベーションによって切断した。消化及び未消化産物を、Ｎｏｖｅｘ １０％ＴＢＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた電気泳動、及びＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｍ ｉｍａｇｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いたＵＶによる可視化のためのＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）による染色によって分析した。更に、アンプリコンを次世代配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に供して、ＴＡＬＥＮ標的領域内の変化を決定した。
【0351】
脂質ナノ粒子内のＨＢＶ ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡの製剤
エタノール中の脂質（カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＭＧ）を、クエン酸緩衝液に溶解した所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡと混合することによって、脂質封入ｍＲＮＡ粒子を調製した。混合した材料をリン酸緩衝液で瞬時に希釈した。エタノールを、再生セルロース膜（１００ｋＤ ＭＷＣＯ）を使用するリン酸緩衝液に対する透析によって、又は修飾ポリエーテルスルホン（modified polyethersulfone、ｍＰＥＳ）中空糸膜（１００ｋＤ ＭＷＣＯ）を使用する接線流濾過（tangential flow filtration、ＴＦＦ）によって除去した。エタノールが完全に除去されたら、緩衝液を、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び９％スクロースを含有するＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．３）と交換した。製剤を濃縮し、続いてＰＥＳフィルターを使用して０．２μｍ濾過した。次いで、製剤中のｍＲＮＡ濃度をＲｉｂｏｇｒｅｅｎ蛍光定量アッセイによって測定し、その後、グリセロールを含有する、５０ｍＭ ＮａＣｌ、９％スクロース（ｐＨ７．３）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈することによって、濃度を最終所望濃度に調整した。次いで、最終製剤を０．２μｍフィルターで濾過し、ガラスバイアルに充填し、栓をし、キャップをして、－７０±５℃に置いた。凍結製剤を、ＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによるそれらのｍＲＮＡ含有量及び封入率、断片アナライザーによるｍＲＮＡ完全性、高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）による脂質含有量、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳでの動的光散乱による粒径、ｐＨ及び浸透圧について特徴付けた。
エタノール中の脂質（カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＭＧ）を、クエン酸緩衝液に溶解した所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡと混合することによって、脂質封入ｍＲＮＡ粒子を調製した。混合した材料をリン酸緩衝液で瞬時に希釈した。エタノールを、再生セルロース膜（１００ｋＤ ＭＷＣＯ）を使用するリン酸緩衝液に対する透析によって、又は修飾ポリエーテルスルホン（modified polyethersulfone、ｍＰＥＳ）中空糸膜（１００ｋＤ ＭＷＣＯ）を使用する接線流濾過（tangential flow filtration、ＴＦＦ）によって除去した。エタノールが完全に除去されたら、緩衝液を、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び９％スクロースを含有するＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．３）と交換した。製剤を濃縮し、続いてＰＥＳフィルターを使用して０．２μｍ濾過した。次いで、製剤中のｍＲＮＡ濃度をＲｉｂｏｇｒｅｅｎ蛍光定量アッセイによって測定し、その後、グリセロールを含有する、５０ｍＭ ＮａＣｌ、９％スクロース（ｐＨ７．３）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈することによって、濃度を最終所望濃度に調整した。次いで、最終製剤を０．２μｍフィルターで濾過し、ガラスバイアルに充填し、栓をし、キャップをして、－７０±５℃に置いた。凍結製剤を、ＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによるそれらのｍＲＮＡ含有量及び封入率、断片アナライザーによるｍＲＮＡ完全性、高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）による脂質含有量、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳでの動的光散乱による粒径、ｐＨ及び浸透圧について特徴付けた。
【0352】
ＡＡＶ－ＨＢＶ感染マウスモデル
Ｃ５７Ｂｌ６雄マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、１×１０＾１１個のＡＡＶ－１．３×ＨＢＶ（ＦｉｖｅＰｌｕｓ）のアデノウイルス感染性粒子を静脈内尾静脈注射によって感染させた。感染の４週間後、血清を採取し、分析してＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルを定量した。４Ｌｏｇ以上のＨＢｓＡｇを有するマウスを、有効性インビボ研究のために選択した。
Ｃ５７Ｂｌ６雄マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、１×１０＾１１個のＡＡＶ－１．３×ＨＢＶ（ＦｉｖｅＰｌｕｓ）のアデノウイルス感染性粒子を静脈内尾静脈注射によって感染させた。感染の４週間後、血清を採取し、分析してＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルを定量した。４Ｌｏｇ以上のＨＢｓＡｇを有するマウスを、有効性インビボ研究のために選択した。
【0353】
血清中のＨＢＶ抗原及びＨＢＶ ＤＮＡの検出及び定量
ＡＡＶ－ＨＢＶマウスのマウス血清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用することによって測定した。血清を、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ ＣＬＩＡ検出のために、それぞれＰＢＳで１：１００及び１：２５０に希釈した。
ＡＡＶ－ＨＢＶマウスのマウス血清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルを、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用することによって測定した。血清を、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ ＣＬＩＡ検出のために、それぞれＰＢＳで１：１００及び１：２５０に希釈した。
【0354】
ＨＢＶ ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号５１３０６）、ウイルスＤＮＡのための添付プロトコルの指示に従って、５μｌの血清から抽出した。簡単に説明すると、プロテイナーゼＫ緩衝液中５６Ｃで１０分間インキュベートした後、試料を１００％エタノールと混合し、ＱＩＡｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎカラムに適用した。スピンカラムを遠心分離し、説明書に示されるように洗浄し、単離されたＤＮＡを３０μｌの水に再懸濁した。
【0355】
精製した血清ＨＢＶ ＤＮＡを、２×ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅ Ｆａｓｔ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号４４４４５５７）を用いて増幅し、２０×ｓＡｇプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、アッセイＩｄ Ｖｉ０３４５３４０６＿ｓ１ ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（ＦＡＭ）Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌ ａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ＦＡＭ－ＭＧＢ）と混合し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ ｑＰＣＲ装置を使用し、５０℃で２分間及び９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で１０秒間（変性ステップ）、６０℃で２０秒間（アニーリングステップ）、７２℃で３０秒間（伸長ステップ）の４５サイクル、ランプ速度１．６℃／秒のサイクリング条件を使用して実行した。定量のために、ＡＡＴＣ（定量的合成Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－３２３２ＳＤ（商標））による既知のコピー数の合成ＨＢＶ ＤＮＡの連続希釈を使用して、標準曲線を並行して実行した。データを抽出し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して分析し、一方、統計解析はＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して実行した。
【0356】
マウス肝臓組織におけるＨＢＶ ＤＮＡ遺伝子編集検出
遺伝子編集分析のために、Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ番号Ｄ４０６８）からの試薬及びプロトコルを使用して、急速冷凍したマウス肝臓からＨＢＶ ＤＮＡを抽出した。最初に、急速凍結したマウス肝臓組織をプロテイナーゼＫ消化緩衝液に入れ、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ，Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）内で、軟組織用のＰｒｅｃｅｌｌｙｓ Ｌｙｓｉｎｇキット０．５ｍｌからのチューブ（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ、カタログ番号Ｐ０００９３３－ＬＹＳＫ０－Ａ）を使用して両方の機械的破壊によって均質化し、次いで消化により、試料を５５℃で２０分間インキュベートした。次いで、ＨＢＶ ＤＮＡを、スピンカラムクリーンアップによって、Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔに示されるように精製した。ゲノムＤＮＡを５０ｕｌのＤＮＡ溶出緩衝液中に溶出し、定量した。
遺伝子編集分析のために、Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ番号Ｄ４０６８）からの試薬及びプロトコルを使用して、急速冷凍したマウス肝臓からＨＢＶ ＤＮＡを抽出した。最初に、急速凍結したマウス肝臓組織をプロテイナーゼＫ消化緩衝液に入れ、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ，Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）内で、軟組織用のＰｒｅｃｅｌｌｙｓ Ｌｙｓｉｎｇキット０．５ｍｌからのチューブ（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ、カタログ番号Ｐ０００９３３－ＬＹＳＫ０－Ａ）を使用して両方の機械的破壊によって均質化し、次いで消化により、試料を５５℃で２０分間インキュベートした。次いで、ＨＢＶ ＤＮＡを、スピンカラムクリーンアップによって、Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔに示されるように精製した。ゲノムＤＮＡを５０ｕｌのＤＮＡ溶出緩衝液中に溶出し、定量した。
【0357】
２×ＳｕｐｅｒＦＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３５８２５０）、順方向プライマー５’－ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＧＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ＣＴＧ ＣＧ－３’（配列番号２９）及び逆方向プライマー５’－ＧＡＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＣＡ ＧＡＣ ＧＴＧ ＴＧＣ ＴＣＴ ＴＣＣ ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＣＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＴＴＧ ＧＴＡ ＣＡＧ Ｃ－３’（配列番号３０）を用いた２５ｕｌのＰＣＲ反応物中で混合した５ｎｇ／ｕｌの精製ＤＮＡを使用し、９８℃で２分間を１サイクル、９５℃で１５秒間（変性ステップ）、６０℃で１５秒間（アニーリングステップ）、７２℃で３０秒間（伸長ステップ）を３５サイクル、続いて７２℃で５分間の最終伸長のサイクリング条件を使用するＰＣＲによって、ＨＢＶ ＤＮＡ標的配列を増幅した。ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いてキットの説明書に従って洗浄し、ＮＥ緩衝液中に溶出し、定量し、ＮＧＳ配列決定のために必要に応じて２０ｎｇ／ｕｌに希釈した。試料をアンプリコン配列決定（アンプリコン－ＥＺ）及びＧｅｎｅｗｉｚでの分析に供した。
【実施例】
【0358】
実施例１：ＴＡＬＥＮ標的部位及びＴＡＬＥＮ構造
公的に利用可能なバイオインフォマティクスツールを使用して、コンセンサスＨＢＶゲノム配列内の潜在的なＴＡＬＥＮ標的部位を予測した。ＨＢｓＡｇ分泌及びウイルス複製を低減するために、ＨＢｓＡｇ／ｐｏｌをコードする遺伝子内からＴＡＬＥＮ標的部位を選択した（図１Ａ）。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３は、それぞれ５０及び５３塩基対長のＨＢＶゲノム領域を標的とし、左アームＴＡＬＥＮ配列、右アームＴＡＬＥＮ配列、及び両アーム間のスペーサー配列を含む（図１Ｂ）。全てのＴＡＬＥＮタンパク質は、キャップ、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、タグペプチドをコードする配列、核局在化シグナルをコードする配列、ＴＡＬＥＮ Ｎ末端ドメインをコードする配列、反復可変二残基（ＲＶＤ）を含有する反復ドメインを有するＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、ＦｏｋＩヌクレアーゼをコードする配列、３’ＵＴＲ及びポリＡテールを含むｍＲＮＡ分子によってコードされた。任意選択的に、キャップ、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、核局在化シグナルをコードする配列、ＴＡＬＥＮ Ｎ末端ドメインをコードする配列、反復可変二残基（ＲＶＤ）を含有する反復ドメインを有するＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、ＦｏｋＩヌクレアーゼをコードする配列、３’ＵＴＲ及びポリＡテールを含む構築物を作製することができる。４つのＤＮＡヌクレオチド塩基を標的化するために使用したＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３ ＲＶＤは、ＮＮ（標的Ａ及びＧ）、ＮＩ（標的Ｔ）、ＮＧ（標的Ｃ）及びＨＤ（標的Ｇ）であった（図１Ｃ）。
公的に利用可能なバイオインフォマティクスツールを使用して、コンセンサスＨＢＶゲノム配列内の潜在的なＴＡＬＥＮ標的部位を予測した。ＨＢｓＡｇ分泌及びウイルス複製を低減するために、ＨＢｓＡｇ／ｐｏｌをコードする遺伝子内からＴＡＬＥＮ標的部位を選択した（図１Ａ）。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３は、それぞれ５０及び５３塩基対長のＨＢＶゲノム領域を標的とし、左アームＴＡＬＥＮ配列、右アームＴＡＬＥＮ配列、及び両アーム間のスペーサー配列を含む（図１Ｂ）。全てのＴＡＬＥＮタンパク質は、キャップ、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、タグペプチドをコードする配列、核局在化シグナルをコードする配列、ＴＡＬＥＮ Ｎ末端ドメインをコードする配列、反復可変二残基（ＲＶＤ）を含有する反復ドメインを有するＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、ＦｏｋＩヌクレアーゼをコードする配列、３’ＵＴＲ及びポリＡテールを含むｍＲＮＡ分子によってコードされた。任意選択的に、キャップ、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、核局在化シグナルをコードする配列、ＴＡＬＥＮ Ｎ末端ドメインをコードする配列、反復可変二残基（ＲＶＤ）を含有する反復ドメインを有するＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列、Ｃ末端ドメインをコードする配列、ＦｏｋＩヌクレアーゼをコードする配列、３’ＵＴＲ及びポリＡテールを含む構築物を作製することができる。４つのＤＮＡヌクレオチド塩基を標的化するために使用したＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３ ＲＶＤは、ＮＮ（標的Ａ及びＧ）、ＮＩ（標的Ｔ）、ＮＧ（標的Ｃ）及びＨＤ（標的Ｇ）であった（図１Ｃ）。
【0359】
実施例２：ＴＡＬＥＮ標的部位は保存されており、ＴＡＬＥＮは広範な機能的遺伝子型範囲を示す
ＴＡＬＥＮ ２８及び３３の左及び右アームについてのＨＢＶ標的配列の保存分析を、全ての異なるＨＢＶ遺伝子型を含む何百ものＨＢＶゲノム配列にわたって実行した。異なる遺伝子型にわたるＨＢＶ標的配列のアラインメントは、ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３について９７～１００％の非常に高い保存を示した（それぞれ、以下の表１及び表２）。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３の右アームが標的とする配列については、遺伝子型Ａ及びＣについて２つの位置がミスマッチを示した（以下の表１及び表２）。
ＴＡＬＥＮ ２８及び３３の左及び右アームについてのＨＢＶ標的配列の保存分析を、全ての異なるＨＢＶ遺伝子型を含む何百ものＨＢＶゲノム配列にわたって実行した。異なる遺伝子型にわたるＨＢＶ標的配列のアラインメントは、ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３について９７～１００％の非常に高い保存を示した（それぞれ、以下の表１及び表２）。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３の右アームが標的とする配列については、遺伝子型Ａ及びＣについて２つの位置がミスマッチを示した（以下の表１及び表２）。
【0360】
【表1】
【0361】
【表2】
【0362】
【表3】
【0363】
【表4】
【0364】
ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３が標的とする配列の保存を図式的に表すために、保存ロゴを、異なるＨＢＶゲノムにおける各標的化ヌクレオチドの存在量に基づいて生成した。保存が高いほど、豊富なヌクレオチドのサイズが大きい。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３の左アームは、全ての標的ヌクレオチドにわたって非常に高い保存を示した（図２Ａ及び図３Ａ）。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３の両方の右アームが標的とするＨＢＶ配列については、２つの位置が見出された（ＴＡＬＥＮ ２８については６位及び９位、図２Ｂ；ＴＡＬＥＮ ３３については９位及び１２位、図３Ｂ）、これは、ＨＢＶ遺伝子型に応じて２つの代替塩基（Ｃ又はＴ）を示した。
【0365】
ＨＢＶ標的配列の可変性がＴＡＬＥＮ有効性にどのように影響し得るかを理解するために、ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３遺伝子型範囲を、生化学的アッセイを使用して評価した。８つの異なる遺伝子型からのＨＢＶ配列をプラスミドにクローニングし、それらのＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３標的配列をアラインメントさせたところ、遺伝子型Ａ及びＣにおいて単一のミスマッチが示された（図４Ａ及び図４Ｂ）。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡからの左及び右アームを、網状赤血球インビトロ翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してインビトロで翻訳し、異なるＨＢＶ遺伝子型の配列を含有する線状化プラスミドとともにインキュベートした。ＨＢＶ標的配列を含有するプラスミドのＴＡＬＥＮ消化を、ポリアクリルアミドゲルを使用して分析し、未切断ＤＮＡには存在しない新しいＤＮＡ断片の存在によって検出した。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３は、試験した全てのＨＢＶ遺伝子型（Ａ～Ｈ）についてＤＮＡ切断を示し、したがって、広い遺伝子型範囲を示した（図４Ｃ）。生化学的アッセイにおいて観察されたＴＡＬＥＮ ３３の遺伝子型範囲を、初代ヒト肝細胞を異なる遺伝子型（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）のＨＢＶに感染させ、細胞にＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡをトランスフェクトすることによって検証した。ＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡをトランスフェクトした全ての試料において、ＨＢＶ ＤＮＡの破壊が観察された（図８、表３）。
【0366】
【表5】
【0367】
【表6】
【0368】
【表7】
【0369】
【表8】
【0370】
【表9】
＃ＴＡＬＥＮ ３３標的配列内のＨＢＶ Ｐｏｌ及びＨＢｓＡｇのオープンリーディングフレーム。
【0371】
実施例３：ＨｅｐＧ２．２．１５細胞におけるＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ＨＢｓＡｇの低減及び遺伝子編集
ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡの有効性を、ＨＢＶを構成的に発現するＨｅｐＧ２．２．１５細胞株において試験した。簡潔には、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを、線状化ＴＡＬＥＮプラスミドからインビトロで転写した。ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを、リポフェクタミン試薬を用いてＨｅｐＧ２．２．１５細胞にトランスフェクトした。ＴＡＬＥＮ発現は、ＴＡＬＥＮタンパク質に特異的な抗体を使用する免疫蛍光法によって、２４時間後にトランスフェクト細胞において検出することができた（図５Ａ）。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡを異なる濃度でＨｅｐＧ２．２．１５細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの６日後に細胞培養培地中のＨＢｓＡｇのレベルを評価した。細胞培養培地中のＨＢｓＡｇのレベルの低下は用量依存的であった（図５Ｂ）。高濃度のｍＲＮＡのトランスフェクションは、細胞生存率に対して負の効果を有した（図５Ｃ）。ＨＢＶ ＤＮＡ編集活性を、ｍＲＮＡトランスフェクションの６日後に次世代配列決定によって同じ試料において評価した。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３遺伝子編集活性を、スペーサー領域における挿入及び欠失の存在量を決定することによって定量した（図５Ｄ）。図５Ｄに示されるように、遺伝子編集活性は用量依存的であり、ＨＢｓＡｇ低減と相関した。
ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡの有効性を、ＨＢＶを構成的に発現するＨｅｐＧ２．２．１５細胞株において試験した。簡潔には、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを、線状化ＴＡＬＥＮプラスミドからインビトロで転写した。ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを、リポフェクタミン試薬を用いてＨｅｐＧ２．２．１５細胞にトランスフェクトした。ＴＡＬＥＮ発現は、ＴＡＬＥＮタンパク質に特異的な抗体を使用する免疫蛍光法によって、２４時間後にトランスフェクト細胞において検出することができた（図５Ａ）。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡを異なる濃度でＨｅｐＧ２．２．１５細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの６日後に細胞培養培地中のＨＢｓＡｇのレベルを評価した。細胞培養培地中のＨＢｓＡｇのレベルの低下は用量依存的であった（図５Ｂ）。高濃度のｍＲＮＡのトランスフェクションは、細胞生存率に対して負の効果を有した（図５Ｃ）。ＨＢＶ ＤＮＡ編集活性を、ｍＲＮＡトランスフェクションの６日後に次世代配列決定によって同じ試料において評価した。ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３遺伝子編集活性を、スペーサー領域における挿入及び欠失の存在量を決定することによって定量した（図５Ｄ）。図５Ｄに示されるように、遺伝子編集活性は用量依存的であり、ＨＢｓＡｇ低減と相関した。
【0372】
実施例４：初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるＨＢＶ ＴＡＬＥＮ ＨＢｓＡｇの低減及び遺伝子編集
初代ヒト肝細胞を５日間感染させた後、ＴＡＬＥＮ ２８又はＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に培地を交換した後、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ及び細胞培養培地を、遺伝子編集及び抗ウイルスアッセイのために収集した（それぞれＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３について図６Ａ及び図７Ａ）。ＴＡＬＥＮ ２８発現を、異なるｍＲＮＡ量のトランスフェクションの２４時間後に免疫蛍光法によって検出した（図６Ｃ）。トランスフェクトされていない細胞におけるレベルと比較して、ＴＡＬＥＮ ２８ ｍＲＮＡのトランスフェクションの６日後に、細胞培養培地におけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルの強い減少が検出された（図６Ｃ）。ＨＢＶ ＤＮＡ切断活性を、Ｔ７Ｅ１消化アッセイによって同じ処置細胞及び未処置細胞から抽出したＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡにおいて分析した（図６Ｄ）。図６Ｄに示すように、編集されたＨＢＶ ＤＮＡに対応するＤＮＡを、トランスフェクトされた細胞において検出することができた。対照的に、編集されたＤＮＡは、トランスフェクトされていない細胞には存在しなかった（図６Ｄ）。ＴＡＬＥＮ ２８によって導入されたＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ修飾の性質を確認するために、標的ＨＢＶ ＤＮＡ領域をＮＧＳによって配列決定した。検出された修飾の大部分は、予測されるＦｏｋＩ切断部位における欠失に対応し（図６Ｅ）、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを修飾するＴＡＬＥＮ ２８の有効性が確認された。
初代ヒト肝細胞を５日間感染させた後、ＴＡＬＥＮ ２８又はＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に培地を交換した後、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ及び細胞培養培地を、遺伝子編集及び抗ウイルスアッセイのために収集した（それぞれＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３について図６Ａ及び図７Ａ）。ＴＡＬＥＮ ２８発現を、異なるｍＲＮＡ量のトランスフェクションの２４時間後に免疫蛍光法によって検出した（図６Ｃ）。トランスフェクトされていない細胞におけるレベルと比較して、ＴＡＬＥＮ ２８ ｍＲＮＡのトランスフェクションの６日後に、細胞培養培地におけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルの強い減少が検出された（図６Ｃ）。ＨＢＶ ＤＮＡ切断活性を、Ｔ７Ｅ１消化アッセイによって同じ処置細胞及び未処置細胞から抽出したＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡにおいて分析した（図６Ｄ）。図６Ｄに示すように、編集されたＨＢＶ ＤＮＡに対応するＤＮＡを、トランスフェクトされた細胞において検出することができた。対照的に、編集されたＤＮＡは、トランスフェクトされていない細胞には存在しなかった（図６Ｄ）。ＴＡＬＥＮ ２８によって導入されたＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ修飾の性質を確認するために、標的ＨＢＶ ＤＮＡ領域をＮＧＳによって配列決定した。検出された修飾の大部分は、予測されるＦｏｋＩ切断部位における欠失に対応し（図６Ｅ）、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを修飾するＴＡＬＥＮ ２８の有効性が確認された。
【0373】
同じ分析をＴＡＬＥＮ ３３について実施した（図７Ａ）。最初に、ＰＨＨにおけるＴＡＬＥＮタンパク質発現を、ｍＲＮＡトランスフェクションの６時間後に免疫蛍光染色によって確認した（図７Ｂ）。トランスフェクションの６日後（ＨＢＶ遺伝子型Ｄによる感染の１１日後）に感染細胞においてＴＡＬＥＮ ３３の有効性を評価した。ＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡトランスフェクションは、処置されたＰＨＨの細胞培養培地中のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの両方のレベルを低下させた（図７Ｃ）。同じＰＨＨ試料からＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを抽出した後、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１消化アッセイにより、ＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞における修飾ＨＢＶ ＤＮＡの存在が確認された（図７Ｄ）。更に、ＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡトランスフェクションは、Ｔ７Ｅ１消化アッセイ（図８）及びＮＧＳによる遺伝子編集の定量（表３）によって示されるように、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤ遺伝子型のＨＢＶに感染したＰＨＨ細胞からのＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを破壊することができた。これらの結果は、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションが、細胞培養培地へのＨＢＶウイルスマーカーの分泌を低減し、遺伝子編集によって異なる遺伝子型のＨＢＶ ＤＮＡを修飾する能力を確認する。
【0374】
実施例５：ＬＮＰ－ＴＡＬＥＮは、ＡＡＶ ＨＢＶマウスモデルにおいてインビボでＨＢＶマーカーを低減する
インビボでのＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ処置の有効性を評価するために、ＡＡＶ－ＨＢＶマウスに、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又は陰性対照としてのＰＢＳ中に製剤化された異なる濃度のＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡを注射した。０日目（Ｄ０）に単回投与した後、ＨＢｓＡｇの血清レベルは、０．５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇを注射したマウスでは投与後７日目から有意に低下し、０．２５ｍｇ／ｋｇを注射したマウスではより低い程度まで低下した（図９Ａ）。ＨＢｓＡｇの減少は、評価される最後の時点である投与後７１日目まで維持された。ＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ ２８及び３３の最高用量（１ｍｇ／ｋｇ）では、ＨＢｓＡｇの減少は、定量に使用したＣＬＩＡ系の定量の下限に近い、２ｌｏｇのＨＢｓＡｇに達した。ＨＢｓＡｇレベルの低下と並行して、血清中のＨＢＶ ＤＮＡレベルもまた、７１日目まで、試験した全ての用量（すなわち、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量）で処置後７日目までに有意に低下した（図９Ｂ）。血清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡマーカーの減少は、投与後７１日目まで維持され、不可逆的減少と一致した。処置されたＡＡＶ－ＨＢＶマウスにおけるＴＡＬＥＮタンパク質のＨＢＶ ＤＮＡ修飾活性を検証するために、肝臓組織から全ＤＮＡを抽出し、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ標的部位をＮＧＳによって配列決定した。ＮＧＳデータの分析は、ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３がＨＢＶ ＤＮＡ標的配列においてインデル修飾を誘導したこと、及び検出された修飾ＤＮＡの量がＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ用量の増加とともに増加したことを示した（図９Ｃ）。理論に制限されるものではないが、ＴＡＬＥＮによって誘導されるＨＢＶ ＤＮＡ修飾は不可逆的であるため、ＨＢｓＡｇ又はＨＢＶ ＤＮＡの血清レベルにおけるリバウンドの可能性が低減される。
インビボでのＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ処置の有効性を評価するために、ＡＡＶ－ＨＢＶマウスに、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又は陰性対照としてのＰＢＳ中に製剤化された異なる濃度のＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３ ｍＲＮＡを注射した。０日目（Ｄ０）に単回投与した後、ＨＢｓＡｇの血清レベルは、０．５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇを注射したマウスでは投与後７日目から有意に低下し、０．２５ｍｇ／ｋｇを注射したマウスではより低い程度まで低下した（図９Ａ）。ＨＢｓＡｇの減少は、評価される最後の時点である投与後７１日目まで維持された。ＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ ２８及び３３の最高用量（１ｍｇ／ｋｇ）では、ＨＢｓＡｇの減少は、定量に使用したＣＬＩＡ系の定量の下限に近い、２ｌｏｇのＨＢｓＡｇに達した。ＨＢｓＡｇレベルの低下と並行して、血清中のＨＢＶ ＤＮＡレベルもまた、７１日目まで、試験した全ての用量（すなわち、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量）で処置後７日目までに有意に低下した（図９Ｂ）。血清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡマーカーの減少は、投与後７１日目まで維持され、不可逆的減少と一致した。処置されたＡＡＶ－ＨＢＶマウスにおけるＴＡＬＥＮタンパク質のＨＢＶ ＤＮＡ修飾活性を検証するために、肝臓組織から全ＤＮＡを抽出し、ＨＢＶ ＴＡＬＥＮ標的部位をＮＧＳによって配列決定した。ＮＧＳデータの分析は、ＴＡＬＥＮ ２８及びＴＡＬＥＮ ３３がＨＢＶ ＤＮＡ標的配列においてインデル修飾を誘導したこと、及び検出された修飾ＤＮＡの量がＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ用量の増加とともに増加したことを示した（図９Ｃ）。理論に制限されるものではないが、ＴＡＬＥＮによって誘導されるＨＢＶ ＤＮＡ修飾は不可逆的であるため、ＨＢｓＡｇ又はＨＢＶ ＤＮＡの血清レベルにおけるリバウンドの可能性が低減される。
【0375】
実施例６：単一ＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ処置後のインビボでのＨＢＶ血清マーカーの減少は、ヌクレオシド阻害剤と比較して不可逆的である
ヌクレオシド阻害剤治療薬をＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ処置と比較するために、ＡＡＶ－ＨＢＶマウスモデルを使用した。ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡの４ｌｏｇを超える血清レベルを有するマウスを選択し、７日間毎日（ＱＤ）投与されるヌクレオシド阻害剤エンテカビル（ＥＴＶ、０．０１ｍｇ／ｋｇ）、２ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ注射として投与されるＨＢＶ標的化ＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ ３３、又は２ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ注射として投与される非ＨＢＶ標的化ＴＡＬＥＮ ＴＴＲのいずれかで処置した。ＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ ３３の単回注射は、血漿ＨＢｓＡｇ（図１０Ａ）及びＨＢＶ ＤＮＡ（図１０Ｂ）レベルを９１日間にわたって恒久的に低下させた。ＨＢＶを標的としないＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ ＴＴＲ処置では、ＨＢＶ血清マーカーに対する効果は検出されなかった（図１０Ａ、１０Ｂ）。ＥＴＶ処置により、処置期間中、血漿ＨＢＶ ＤＮＡレベルのみが低下し、ＨＢｓＡｇレベルは低下せず（図１０Ａ及び１０Ｂ）、処置が終了すると（７日目）ウイルスのリバウンドが見られた（図１０Ｂ）。
ヌクレオシド阻害剤治療薬をＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ処置と比較するために、ＡＡＶ－ＨＢＶマウスモデルを使用した。ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡの４ｌｏｇを超える血清レベルを有するマウスを選択し、７日間毎日（ＱＤ）投与されるヌクレオシド阻害剤エンテカビル（ＥＴＶ、０．０１ｍｇ／ｋｇ）、２ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ注射として投与されるＨＢＶ標的化ＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ ３３、又は２ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ注射として投与される非ＨＢＶ標的化ＴＡＬＥＮ ＴＴＲのいずれかで処置した。ＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ ３３の単回注射は、血漿ＨＢｓＡｇ（図１０Ａ）及びＨＢＶ ＤＮＡ（図１０Ｂ）レベルを９１日間にわたって恒久的に低下させた。ＨＢＶを標的としないＬＮＰ－ＴＡＬＥＮ ＴＴＲ処置では、ＨＢＶ血清マーカーに対する効果は検出されなかった（図１０Ａ、１０Ｂ）。ＥＴＶ処置により、処置期間中、血漿ＨＢＶ ＤＮＡレベルのみが低下し、ＨＢｓＡｇレベルは低下せず（図１０Ａ及び１０Ｂ）、処置が終了すると（７日目）ウイルスのリバウンドが見られた（図１０Ｂ）。
【0376】
【表10-1】
【表10-2】
【表10-3】
【表10-4】
【表10-5】
【表10-6】
【0377】
本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して様々な置換及び修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【0378】
本明細書中で言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が属する当業者のレベルを示す。
【0379】
本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数又は複数）、制限（単数又は複数）の不在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。使用された用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、そのような用語及び表現の使用において、示され、説明された特徴又はその一部の任意の均等物を除外する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。更に、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者は、本発明がそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても記載されていることを認識するであろう。例えば、Ｘが臭素、塩素及びヨウ素からなる群から選択されると記載されている場合、Ｘが臭素である請求項並びにＸが臭素及び塩素である請求項が完全に記載されている。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【配列表】
【国際調査報告】