特表 2024-501024 ペイロードを細胞に送達するためのシステムにおける使用のための増加したスループットを有するマイクロ流体チップ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-10

(54)【発明の名称】ペイロードを細胞に送達するためのシステムにおける使用のための増加したスループットを有するマイクロ流体チップ

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20231227BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231227BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539284

(86)(22)【出願日】2021-12-27

(85)【翻訳文提出日】2023-08-25

(86)【国際出願番号】 US2021073121

(87)【国際公開番号】W WO2022147428

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】63/131,423

(32)【優先日】2020-12-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518071763

【氏名又は名称】スクイーズ バイオテクノロジーズ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ダドガー， マイサム

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA23

4B029BB11

4B029CC01

4B029GA08

4B029GB09

4B029GB10

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BD21

4B065BD39

4B065CA44

(57)【要約】

第１の層と、第２の層と、第１の層と第２の層との間の流体流れ領域とを含む、細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップが提供される。このマイクロ流体チップは、流体流れ領域への細胞懸濁液の流れを受け入れるように構成される。マイクロ流体チップの第１の層は、第２の層に向かって延在して、突出部と第２の層との間に狭窄部を形成する突出部を含み、狭窄部は、細胞が狭窄部を通過するときに細胞懸濁液の細胞の細胞膜の摂動を引き起こすように構成される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップであって、前記チップが、
第１の層と、
第２の層と、
前記第１の層と前記第２の層との間の流体流れ領域とを含み、前記チップが、前記流体流れ領域への細胞懸濁液の流れを受け入れるように構成され、前記細胞懸濁液が複数の細胞を含み、
前記第１の層が、前記第２の層に向かって延在して突出部と前記第２の層との間に狭窄部を形成する前記突出部を含み、前記狭窄部が、前記細胞が前記狭窄部を通過する際に、前記複数の細胞の細胞の細胞膜の摂動を引き起こすように構成される、マイクロ流体チップ。

【請求項2】

前記第１の層がシリコンを含む、請求項１に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項3】

前記第２の層がガラスを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項4】

前記突出部が、前記第１の層の内面に垂直な高さ方向に前記第１の層の前記内面から離れて延在し、前記第１の層の前記内面に隣接する近位端を含む、請求項１～３のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項5】

前記突出部が、前記第１の層の内面に垂直な高さ方向に前記第１の層の前記内面から離れて延在し、前記突出部の遠位端と前記第２の層の内面との間に前記狭窄部を形成する前記突出部の前記遠位端を含み、前記高さ方向に測定した場合、前記突出部の前記遠位端と前記第２の層の前記内面との間の前記狭窄部の高さが、５ミクロンより小さいまたはそれと等しい、請求項１～４のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項6】

前記狭窄部の前記高さが、前記複数の細胞の前記細胞の直径よりも小さい、請求項５に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項7】

前記マイクロ流体チップが入口および出口を含み、前記入口が、前記チップの第１の端部に配置され、前記出口が、前記第１の端部の反対側の前記チップの第２の端部に配置され、前記入口と前記出口との間の距離が、前記第１の層の内面に垂直な方向に延在する、請求項１～６のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項8】

前記突出部の前記近位端が、前記高さ方向に垂直に延在し、前記突出部の上流側から前記突出部の下流側に延在する厚さを有し、前記突出部の前記近位端の前記厚さが１０ミクロンより大きいまたはそれと等しい、請求項４～７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項9】

前記突出部の前記遠位端が、前記高さ方向に垂直に延在し、前記狭窄部の上流側から前記狭窄部の下流側に延在する厚さを有し、前記突出部の前記遠位端の前記厚さが５ミクロンより大きいまたはそれと等しい、請求項５～８のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項10】

前記突出部が、前記高さ方向に垂直に延在し、前記狭窄部の上流側と前記狭窄部の下流側との間の界面に沿って延在する長さを有し、前記長さが０．５ｃｍより大きいまたはそれと等しい、請求４～９のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項11】

前記狭窄部の前記上流側と前記狭窄部の前記下流側との間の前記界面が、曲線および角度のうちの一方または両方を含む、請求項１０に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項12】

前記狭窄部の前記上流側と前記狭窄部の前記下流側との間の前記界面が、蛇行経路を形成する、請求項１～１１のいずれかに記載マイクロ流体チップ。

【請求項13】

前記界面の前記蛇行経路が、前記蛇行経路に沿った全ての位置で前記高さ方向に垂直である、請求項１２に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項14】

前記蛇行経路が、１またはそれを超える直角を含む、請求項１２または１３に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項15】

前記第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に対して垂直に延在する前記マイクロ流体チップの第１の寸法が１８～２４ｍｍである、請求項１～１４のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項16】

前記第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に対して垂直に延在する前記マイクロ流体チップの第２の寸法が８～１５ｍｍである、請求項１～１５のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項17】

前記第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に延在する前記マイクロ流体チップの高さ寸法が１０００～１５００ミクロンである、請求項１～１６のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項18】

前記第２の層が複数の支持ピラーで前記第１の層に接触し、前記複数の支持ピラーの各支持ピラーが前記第１の層の内面から前記第２の層まで延在する、請求項１～１７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項19】

前記第１の層が、前記第１の層の平面に垂直な高さ方向に測定した場合、５００～７５０ミクロンの全高を有する、請求項１～１８のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項20】

前記第１の層が４５０～６５０ミクロンの最小高さを有し、前記最小厚さが、前記第１の層の内面に垂直な高さ方向に測定され、前記最小厚さが、前記第１の層の外面から、前記流体流れ領域と接する前記第１の層の最も近い内面まで測定される、請求項１～１９のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項21】

前記第２の層が、前記第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に測定した場合、４５０～８００ミクロンの厚さを有する、請求項１～２０のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項22】

前記突出部の最上面が、前記第１の層の内面に並列であり、前記突出部が前記第１の層の前記内面から延在する高さ方向に垂直な平面を含む、請求項１～２１のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項23】

前記突出部の最上面が、前記第２の層の内面に並列であり、前記突出部が前記第１の層の前記内面から延在する高さ方向に垂直な平面を含む、請求項１～２２のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項24】

前記突出部の側面が、前記第１の層の内面からある角度で上方に延在する、請求項１～２３のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項25】

前記突出部の前記側面が、前記第１の層の前記内面から５０～６０度傾斜している、請求項２４に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項26】

前記突出部の前記側面が、前記第１の層の前記内面から５４．７度傾斜している、請求項２４または２５に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項27】

前記細胞懸濁液がペイロードを含む、請求項１～２６のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項28】

前記チップが１０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成される、請求項１～２７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項29】

前記狭窄部の周囲長に対する前記狭窄部の断面積の商が０．５ミクロンより大きいまたはそれと等しい、請求項１～２８のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【請求項30】

ペイロードを細胞に送達させる方法であって、前記方法が、
マイクロ流体チップの流体流れ領域への細胞懸濁液の流れを受け取ることであって、前記細胞懸濁液が複数の細胞を含む、細胞懸濁液の流れを受け取ることと、
前記マイクロ流体チップの突出部と第２の層との間に形成された狭窄部を通して前記細胞を流動させることによって、前記複数の細胞の細胞の細胞膜を摂動させることとを含み、前記突出部が、前記マイクロ流体チップの第１の層の内面から前記マイクロ流体チップの前記第２の層に向かって延在し、前記細胞膜の前記摂動が、ペイロードの前記細胞への進入を可能にする、方法。

【請求項31】

前記マイクロ流体チップの突出部と第２の層との間に形成された狭窄部を通して前記細胞を流動させることによって前記複数の細胞の細胞の細胞膜を摂動させることが、前記狭窄部を通して前記細胞を０．５ｍ／秒より大きいまたはそれと等しい流量で流動させることを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記マイクロ流体チップが、１０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成される、請求項３０または３１に記載の方法。

【請求項33】

前記細胞懸濁液が前記ペイロードを含む、請求項３０～３２のいずれか記載の方法。

【請求項34】

前記細胞膜の摂動後に前記ペイロードを前記細胞懸濁液と接触させることを含む、請求項３０～３３のいずれかに記載の方法。

【請求項35】

ペイロードを細胞に送達させるためのマイクロ流体チップを製造する方法であって、前記方法が、
第１の層にエッチングして、前記第１の層の凹部面および前記第１の層の突出部を形成することと、
前記第１の層に第２の層を固定して、前記凹部面と前記第２の層との間に画定された流体流れ領域と、前記突出部と前記第２の層との間に画定された狭窄部とを有するマイクロ流体チップを形成することと、を含む、方法。

【請求項36】

第１の層にエッチングして前記第１の層の凹部面および前記第１の層の突出部を形成することが、湿式または乾式化学エッチング剤を使用することを含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

第１の層にエッチングして前記第１の層の凹部面および前記第１の層の突出部を形成することが、前記流体流れ領域を画定するために３０ミクロンより大きいまたはそれと等しい深さまで前記第１の層にエッチングすることを含む、請求項３５または３６に記載の方法。

【請求項38】

第１の層にエッチングして前記第１の層の凹部面および前記第１の層の突出部を形成することが、前記突出部の遠位端を形成するために５ミクロンより小さいまたはそれと等しい深さまで前記第１の層にエッチングすることを含む、請求項３５～３７のいずれかに記載の方法。

【請求項39】

第１の層にエッチングして前記第１の層の凹部面および前記第１の層の突出部を形成することが、前記突出部の遠位端を形成するために前記第１の層にエッチングすることを含み、前記突出部の前記遠位端が、前記第１の層の平面に垂直な高さ方向に垂直に延在する厚さを有し、前記遠位端の厚さが、前記突出部の上流側から前記突出部下流側に向かって延在し、前記突出部の前記遠位端の厚さが５ミクロンより大きいまたはそれと等しい、請求項３５～３８のいずれかに記載の方法。

【請求項40】

前記突出部が、前記高さ方向に垂直に延在し、前記狭窄部の上流側と前記狭窄部の下流側との間の界面に沿って延在する長さを有し、前記長さが０．５ｃｍより大きいまたはそれと等しい、請求項３５に記載の方法。

【請求項41】

前記狭窄部の前記上流側と前記狭窄部の前記下流側との間の前記界面が、曲線および角度のうちの一方または両方を含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記狭窄部の前記上流側と前記狭窄部の前記下流側との間の界面が、蛇行経路を形成する、請求項４０または４１に記載の方法。

【請求項43】

前記界面の前記蛇行経路が、前記蛇行経路に沿った全ての位置で前記高さ方向に垂直である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記蛇行経路が、１またはそれを超える直角を含む、請求項４２または４３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２９日に出願された米国仮出願第６３／１３１，４２３号の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、ペイロードを細胞内に送達するためのシステムに関し、より具体的には、細胞膜の摂動を引き起こしてペイロードが摂動した細胞膜を通過することを可能にするための狭窄部を有するマイクロ流体チップに関する。

【背景技術】

【0003】

背景
細胞への様々な材料の制御された送達は、細胞療法の発展中の医療分野において重要である。例えば、様々な研究および治療用途は、細胞膜を通して細胞内へのペプチド、核酸、タンパク質、小分子およびナノ材料の送達を含み得る。国際公開第２０１３０５９３４３号、国際公開第２０１５０２３９８２号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５８４８９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６０６８９号、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／１３１１３号で論じられているように、狭窄マイクロ流体チャネルを使用して、化合物および他のペイロードを細胞に送達することができる。ＰＣＴ／ＵＳ１８／６６２９５に開示されているように、卓上実験室および／または臨床システムは、狭窄部カートリッジを通して細胞懸濁液を押し出すように構成されてもよく、狭窄部カートリッジは、細胞懸濁液中の細胞の膜に摂動を引き起こすために、狭窄チャネルまたは狭窄部細孔を有する、１またはそれを超える狭窄部含有要素（例えば、マイクロ流体チップまたはフィルタ等の部分、部品、デバイス、構成要素等）を収容する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２０１３０５９３４３号

【特許文献2】国際公開第２０１５０２３９８２号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

発明の要旨
上記で説明したように、細胞内ペイロード送達のためのシステムは、細胞膜の摂動を引き起こすために、細胞懸濁液の細胞をマイクロ流体チップの１またはそれを超える狭窄部に押し出すように構成されたシステムを含む。しかしながら、細胞内ペイロード送達のための公知のシステムは、狭窄部の中および周囲の細胞の目詰まりを起こしやすく、スループット速度が不十分であり、製造するのに十分に簡単かつ効率的ではない。
したがって、高いスループット速度および低い細胞目詰まり速度を有する改善されたマイクロ流体チップの必要性を含む、細胞内ペイロード送達のための改善されたシステム、方法、および技術が必要とされている。改善されたスループット、および細胞目詰まりまたは他の故障に対する改善された耐性、ならびに改善された製造の容易さおよび効率を可能とする改善された幾何学的構成を有するマイクロ流体チップも必要とされている。本明細書に開示されるシステム、方法、および技術は、幾何学的構成、スループット、目詰まりまたは他の故障に対する耐性、およびマイクロ流体チップおよび／またはシステムの製造の容易さおよび効率、使用方法、および／または製造方法を改善するための１またはそれを超えるこれらの必要性に対処することができる。

【0006】

本明細書では、細胞内ペイロード送達のためのシステムにおける使用のためのハイスループットマイクロ流体チップが提供される。本明細書に開示されるマイクロ流体チップは、細胞が狭窄部を通って流れるときに細胞懸濁液中の細胞の細胞膜を摂動させるための狭窄部を有する。特に、本明細書に記載のマイクロ流体チップは、上述のマイクロ流体チップ等の既知のマイクロ流体チップよりもスループットの向上および細胞目詰まりの減少を可能にする。さらに、本明細書に記載のマイクロ流体チップはまた、より一貫した直接的で効率的な方法を使用して製造される。したがって、細胞膜を摂動させ、ペイロードを細胞に導入するためのマイクロ流体チップは、細胞内送達ペイロードのための既知のマイクロ流体チップと比較して、製造がより容易であり得、より高いスループットを達成し得、細胞目詰まりの量を最小化し得る。

【0007】

具体的には、本明細書に開示されるマイクロ流体チップは、上流側の流体流れ領域と下流側の流体流れ領域との間に配置された１またはそれを超える狭窄部を含む。この狭窄部は、既知のマイクロ流体チップの狭窄領域よりも著しく長く、より多くの細胞が狭窄部を同時に通過することを可能にする。したがって、本明細書に記載のマイクロ流体チップに提供される狭窄部は、より大きな摂動された細胞スループットを提供する。本明細書で提供されるマイクロ流体チップはまた、以下で詳細に説明する開示されたチップの固有の幾何学的形状に起因して、狭窄部（複数可）またはその付近での細胞目詰まりの発生を最小限に抑える。

【0008】

細胞膜を摂動させるための狭窄部に加えて、本明細書で提供されるマイクロ流体チップはまた、第１の層と第２の層との間に形成された流体流れ領域を有する第１の層および第２の層を含み、流体流れ領域を通じて細胞懸濁液およびペイロードが流れるように構成される。第１の層は、第１の層の内面から第２の層に向かって延在する１またはそれを超える突出部を含み得る。突出部の端部と第２の層との間の空間は、上述の狭窄部を画定する。狭窄部の高さは、細胞が狭窄部を通って流れるときにその膜が摂動されるように、細胞の直径に依存する。摂動後、細胞膜が閉じる前にペイロードは細胞に入ることができる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、マイクロ流体チップの表面を横切る蛇行経路をたどる単一の突出部を含み得る。蛇行経路は、例えば、既知のマイクロ流体チップのものよりもはるかに長い狭窄部を提供することができ、上記で説明したように、より大きな細胞スループットおよび最小限の細胞目詰まりを可能にする。

【0009】

一部の実施形態では、細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップであって、チップは、第１の層と、第２の層と、第１の層と第２の層との間の流体流れ領域とを含み、チップは、流体流れ領域への細胞懸濁液の流れを受け入れるように構成され、細胞懸濁液が複数の細胞を含み、第１の層は、第２の層に向かって延在して突出部と第２の層との間に狭窄部を形成する突出部を含み、狭窄部は、細胞が狭窄部を通過する際に、複数の細胞の細胞の細胞膜の摂動を引き起こすように構成される、マイクロ流体チップが提供される。

【0010】

チップの一部の実施形態では、第１の層がシリコンを含む。

【0011】

チップの一部の実施形態では、第２の層がガラスを含む。

【0012】

チップの一部の実施形態では、突出部は、第１の層の内面に垂直な高さ方向に第１の層の内面から離れて延在し、第１の層の内面に隣接する近位端を含む。

【0013】

チップの一部の実施形態では、突出部は、第１の層の内面に垂直な高さ方向に第１の層の内面から離れて延在し、突出部の遠位端と第２の層の内面との間に狭窄部を形成する突出部の遠位端を含み、高さ方向に測定した場合、突出部の遠位端と第２の層の内面との間の狭窄部の高さは、５ミクロンより小さいまたはそれと等しい。

【0014】

チップの一部の実施形態では、狭窄部の高さは、複数の細胞の細胞の直径よりも小さい。

【0015】

チップの一部の実施形態では、マイクロ流体チップが入口および出口を含み、入口は、チップの第１の端部に配置され、出口は、第１の端部の反対側のチップの第２の端部に配置され、入口と出口との間の距離は、第１の層の内面に垂直な方向に延在する。

【0016】

チップの一部の実施形態では、突出部の近位端は、高さ方向に垂直に延在し、突出部の上流側から突出部の下流側に延在する厚さを有し、突出部の近位端の厚さが１０ミクロンより大きいまたはそれと等しい。

【0017】

チップの一部の実施形態では、突出部の遠位端は、高さ方向に垂直に延在し、狭窄部の上流側から狭窄部の下流側に延在する厚さを有し、突出部の遠位端の厚さが５ミクロンより大きいまたはそれと等しい。

【0018】

チップの一部の実施形態では、突出部は、高さ方向に垂直に延在し、狭窄部の上流側と狭窄部の下流側との間の界面に沿って延在する長さを有し、長さが０．５ｃｍより大きいまたはそれと等しい。

【0019】

チップの一部の実施形態では、狭窄部の上流側と狭窄部の下流側との間の界面は、曲線および角度のうちの一方または両方を含む。

【0020】

チップの一部の実施形態では、狭窄部の上流側と狭窄部の下流側との間の界面は、蛇行経路を形成する。

【0021】

チップの一部の実施形態では、界面の蛇行経路は、蛇行経路に沿った全ての位置で高さ方向に垂直である。

【0022】

チップの一部の実施形態では、蛇行経路は、１またはそれを超える直角を含む。

【0023】

チップの一部の実施形態では、第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に対して垂直に延在するマイクロ流体チップの第１の寸法が１８～２４ｍｍである。

【0024】

チップの一部の実施形態では、第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に対して垂直に延在するマイクロ流体チップの第２の寸法が８～１５ｍｍである。

【0025】

チップの一部の実施形態では、第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に延在するマイクロ流体チップの高さ寸法が１０００～１５００ミクロンである。

【0026】

チップの一部の実施形態では、第２の層が複数の支持ピラーで第１の層に接触し、複数の支持ピラーの各支持ピラーが第１の層の内面から第２の層まで延在する。

【0027】

チップの一部の実施形態では、第１の層は、第１の層の平面に垂直な高さ方向に測定した場合、５００～７５０ミクロンの全高を有する。

【0028】

チップの一部の実施形態では、第１の層が４５０～６５０ミクロンの最小高さを有し、最小厚さは、第１の層の内面に垂直な高さ方向に測定され、最小厚さは、第１の層の外面から、流体流れ領域と接する第１の層の最も近い内面まで測定される。

【0029】

チップの一部の実施形態では、第２の層は、第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に測定した場合、４５０～８００ミクロンの厚さを有する。

【0030】

チップの一部の実施形態では、突出部の最上面は、第１の層の内面に並列であり、突出部が第１の層の内面から延在する高さ方向に垂直な平面を含む。

【0031】

チップの一部の実施形態では、突出部の最上面は、第２の層の内面に並列であり、突出部が第１の層の内面から延在する高さ方向に垂直な平面を含む。

【0032】

チップの一部の実施形態では、突出部の側面は、第１の層の内面からある角度で上方に延在する。

【0033】

チップの一部の実施形態では、突出部の側面は、第１の層の内面から５０～６０度傾斜している。

【0034】

チップの一部の実施形態では、突出部の側面は、第１の層の内面から５４．７度傾斜している。

【0035】

チップの一部の実施形態では、細胞懸濁液がペイロードを含む。

【0036】

チップの一部の実施形態では、チップが１０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成される。

【0037】

チップの一部の実施形態では、狭窄部の周囲長に対する狭窄部の断面積の商が０．５ミクロンより大きいまたはそれと等しい。

【0038】

一部の実施形態では、ペイロードを細胞に送達させる方法が提供され、方法は、マイクロ流体チップの流体流れ領域への細胞懸濁液の流れを受け取ることであって、細胞懸濁液が複数の細胞を含む、細胞懸濁液の流れを受け取ることと、マイクロ流体チップの突出部と第２の層との間に形成された狭窄部を通して細胞を流動させることによって、複数の細胞の細胞の細胞膜を摂動させることとを含み、突出部は、マイクロ流体チップの第１の層の内面からマイクロ流体チップの第２の層に向かって延在し、細胞膜の摂動は、ペイロードの細胞への進入を可能にする。

【0039】

方法の一部の実施形態では、マイクロ流体チップの突出部と第２の層との間に形成された狭窄部を通して細胞を流動させることによって複数の細胞の細胞の細胞膜を摂動させることは、狭窄部を通して細胞を０．５ｍ／秒より大きいまたはそれと等しい流量で流動させることを含む。

【0040】

方法の一部の実施形態では、マイクロ流体チップは、１０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成される。

【0041】

方法の一部の実施形態では、細胞懸濁液がペイロードを含む。

【0042】

方法の一部の実施形態では、方法は、細胞膜の摂動後にペイロードを細胞懸濁液と接触させることを含む。

【0043】

一部の実施形態では、ペイロードを細胞に送達させるためのマイクロ流体チップを製造する方法が提供され、方法は、第１の層にエッチングして、第１の層の凹部面および第１の層の突出部を形成することと、第１の層に第２の層を固定して、凹部面と第２の層との間に画定された流体流れ領域と、突出部と第２の層との間に画定された狭窄部とを有するマイクロ流体チップを形成することと、を含む。

【0044】

方法の一部の実施形態では、第１の層にエッチングして第１の層の凹部面および第１の層の突出部を形成することは、湿式または乾式化学エッチング剤を使用することを含む。

【0045】

方法の一部の実施形態では、第１の層にエッチングして第１の層の凹部面および第１の層の突出部を形成することは、流体流れ領域を画定するために３０ミクロンより大きいまたはそれと等しい深さまで第１の層にエッチングすることを含む。

【0046】

方法の一部の実施形態では、第１の層にエッチングして第１の層の凹部面および第１の層の突出部を形成することは、突出部の遠位端を形成するために５ミクロンより小さいまたはそれと等しい深さまで第１の層にエッチングすることを含む。

【0047】

方法の一部の実施形態では、第１の層にエッチングして第１の層の凹部面および第１の層の突出部を形成することは、突出部の遠位端を形成するために第１の層にエッチングすることを含み、突出部の遠位端は、第１の層の平面に垂直な高さ方向に垂直に延在する厚さを有し、遠位端の厚さは、突出部の上流側から突出部下流側に向かって延在し、突出部の遠位端の厚さが５ミクロンより大きいまたはそれと等しい。

【0048】

方法の一部の実施形態では、突出部は、高さ方向に垂直に延在し、狭窄部の上流側と狭窄部の下流側との間の界面に沿って延在する長さを有し、長さが０．５ｃｍより大きいまたはそれと等しい。

【0049】

方法の一部の実施形態では、狭窄部の上流側と狭窄部の下流側との間の界面は、曲線および角度のうちの一方または両方を含む。

【0050】

方法の一部の実施形態では、狭窄部の上流側と狭窄部の下流側との間の界面は、蛇行経路を形成する。

【0051】

方法の一部の実施形態では、界面の蛇行経路は、蛇行経路に沿った全ての位置で高さ方向に垂直である。

【0052】

方法の一部の実施形態では、蛇行経路は、１またはそれを超える直角を含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、実施形態のいずれかに関して上述した１またはそれを超える特徴、特性、または要素のいずれかは、上述したまたは本明細書の他の箇所に記載された他の実施形態のいずれかに組み込まれ得る。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】図１は、いくつかの実施形態による、マイクロ流体チップの上面図を示す。

【0055】

【図2A】図２Ａは、いくつかの実施形態による、マイクロ流体チップの突出部上および狭窄部を通って流れる細胞のアイソメトリック図を示す。

【0056】

【図2B】図２Ｂは、いくつかの実施形態による、マイクロ流体チップの突出部上および狭窄部を通って流れる細胞の側面図を示す。

【0057】

【図2C】図２Ｃは、いくつかの実施形態による、マイクロ流体チップの突出部上および狭窄部を通って流れる細胞の上面図を示す。

【0058】

【図2D】図２Ｄは、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップを保持するカートリッジの分解立体図を示す。

【0059】

【図3】図３は、いくつかの実施形態による、細胞にペイロードを送達させる方法を示す。

【0060】

【図4】図４は、いくつかの実施形態による、本明細書に記載のマイクロ流体チップの流路剪断応力データを示す。

【0061】

【図5】図５は、いくつかの実施形態による、本明細書に記載のマイクロ流体チップの流路剪速度データを示す。

【0062】

【図6】図６は、いくつかの実施形態による、本明細書に提供されるマイクロ流体チップの突出部によって形成された狭窄部を通って流れる細胞の断面図を示す。

【0063】

【図7】図７は、いくつかの実施形態による、マイクロ流体チップの突出部を形成するためにシリコンの層をエッチングするプロセスを示す。

【0064】

【図8】いくつかの実施形態による、５つの異なるマイクロ流体チップの幾何学的形状のゴースト成分（ｇｈｏｓｔ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｃｙ）データを示す。

【0065】

【図9】図９は、いくつかの実施形態による、５つの異なるマイクロ流体チップの幾何学的形状の総ＯＶＡ ６４７送達割合を示す。

【0066】

【図10】図１０は、いくつかの実施形態による、５つの異なるマイクロ流体チップの幾何学的形状の総ＯＶＡ ６４７平均蛍光強度を示す。

【0067】

【図11】図１１は、いくつかの実施形態による、５つの異なるマイクロ流体チップの幾何学的形状に対するアネキシンＶ＋細胞の総割合を示す。

【0068】

【図12】図１２は、いくつかの実施形態による、５つの異なるマイクロ流体チップの幾何学的形状についてのアネキシンＶ＋細胞の平均蛍光強度の合計を示す。

【0069】

【図13】図１３は、いくつかの実施形態による、５つの異なるマイクロ流体チップの幾何学的形状についての細胞集団によるＯＶＡ ６４７送達割合を示す。

【0070】

【図14】図１４は、いくつかの実施形態による、５つの異なるマイクロ流体チップの幾何学的形状についての細胞集団によるＯＶＡ ６４７平均蛍光強度を示す。

【0071】

【図15】図１５は、いくつかの実施形態による、５つの異なるマイクロ流体チップの幾何学的形状についての細胞集団によるアネキシンＶ＋細胞の割合を示す。および、

【0072】

【図16】図１６は、いくつかの実施形態による、５つの異なるマイクロ流体チップの幾何学的形状についての細胞集団によるアネキシンＶ＋細胞の平均蛍光強度を示す。

【発明を実施するための形態】

【0073】

発明の詳細な説明
部分的または完全に自動化された細胞内ペイロード送達のためのシステムにおける使用のためのマイクロ流体チップ、ならびに関連する装置、システム、方法、および技術の例示的な実施形態を以下に説明する。

【0074】

本明細書で提供されるマイクロ流体チップは、スループットの向上および細胞目詰まりの発生の減少を提供することができる。具体的には、本明細書で提供されるマイクロ流体チップの総狭窄部領域は、既知のマイクロ流体チップの総狭窄部領域よりも著しく大きく、これにより、より多くの細胞が狭窄部を通過し、狭窄部によって摂動されることが可能になる。より多くの細胞をより速く摂動させることができるため、本明細書で提供されるマイクロ流体チップは、送達されたペイロードを有する細胞の出力の増加を可能にすることができる。

【0075】

さらに、本明細書で提供されるマイクロ流体チップの狭窄部は、マイクロ流体チップの第１の層の底面からマイクロ流体チップの第２の層の上面まで測定される高さ方向に細胞を狭窄する。したがって、狭窄部は、マイクロ流体チップの第１の層（例えば、突出部の上面）とマイクロ流体チップの第２の層との間に形成される。対照的に、当技術分野で知られているマイクロ流体チップの多くの狭窄部は、エッチングされたチャネルの側壁の間に狭窄部が形成されるように、マイクロ流体チップの層に狭いチャネルをエッチングすることによって製造される。本明細書で提供されるマイクロ流体チップの狭窄部の幾何学的形状は、当技術分野で知られているものよりもかなり大きな狭窄部領域を可能にし、これにより、既知のマイクロ流体チップのものよりも多くの細胞を同時におよび／または規定の期間中に摂動させることが可能になる。

【0076】

本明細書で使用されるいくつかの用語の定義、細胞内ペイロードシステムにおける使用のためのマイクロ流体幾何学的形状の説明、本明細書に記載のマイクロ流体チップを使用して細胞にペイロードを送達させる方法、本明細書で提供されるマイクロ流体チップを通る流体流れの流れ特性、本明細書で提供されるマイクロ流体チップを製造する方法、および本明細書で提供されるマイクロ流体チップを使用した細胞摂動の例を以下に提供する。以下、各トピックについて詳細に説明する。
定義

【0077】

本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、必要に応じて、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。以下に記載する定義が参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合、記載する定義が優先するものとする。

【0078】

本明細書で使用される場合、単数「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、特に指示されない限り、複数の言及を含む。

【0079】

本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むことが理解される。

【0080】

「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載された特徴、整数、工程、動作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１またはそれを超える他の特徴、整数、工程、動作、要素、構成要素、および／またはそれらのグループの存在または追加を排除するものではないことが更に理解される。

【0081】

「場合（ｉｆ）」という用語は、文脈に応じて、「とき、場合（ｗｈｅｎ）」または「時（ｕｐｏｎ）」または「判定に応答して（ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」または「検出に応答して（ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」を意味すると解釈され得る。

【0082】

本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値またはパラメータ「約」への言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および説明する）。

【0083】

本明細書における説明の目的のために、マイクロ流体チップの方向および寸法は、以下の慣例によって参照され得る：ｘ方向またはｘ寸法は、図１において水平に延びる寸法を指し得る（ｘ方向は、流れ入口から流れ出口への図１のチップ１００を通る流体の全体的な流れの方向である）；ｙ方向またはｙ寸法は、図１において垂直に延びる寸法を指し得る；ｚ方向またはｚ次元は、図１の紙面の内外を通る次元を指し得る。

【0084】

本明細書の説明では、様々な要素を説明するために第１、第２等の用語を使用しているが、これらの要素はこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある要素を別の要素と区別するためにのみ使用される。

【0085】

本明細書に記載の構造的および機能的特性のいずれについても、これらの特性を決定する方法は当技術分野で公知である。

【0086】

特許出願および刊行物を含む本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
細胞内ペイロード送達システムにおける使用のためのマイクロ流体チップの幾何学的形状

【0087】

スループットの増加および細胞目詰まりの減少をもたらす細胞内ペイロード送達システムにおける使用のためのマイクロ流体チップを以下に記載する。具体的には、図１～図２Ｃは、本明細書で提供されるマイクロ流体チップの例示的な幾何学的形状を示す。図１は、マイクロ流体チップの上面図を示し、図２Ａは、マイクロ流体チップの一部のアイソメトリック図を示し（突出部および流体流れの方向に注目する）、図２Ｂは、マイクロ流体チップの一部の側面図を示し（突出部および狭窄部に注目する）、図２Ｃは、マイクロ流体チップの一部の上面図（狭窄部に注目する）を示す。以下、それぞれについて詳細に説明する。

【0088】

図１は、いくつかの実施形態によるマイクロ流体チップ１００の上面図を示す。マイクロ流体チップ１００は、細胞内ペイロード送達システムで使用され得る。細胞内ペイロード送達システムおよびデバイスの特徴は、ＰＣＴ／ＵＳ１８／６６２９５により完全に記載されている。手短に言えば、細胞内ペイロード送達システムは、マイクロ流体チップの狭窄部を通って細胞を強制的に流動させることによって細胞内へのペイロードの送達を可能にし、それによって細胞の膜を摂動させ、ペイロードを細胞に進入させ得る。

【0089】

図１に示すように、マイクロ流体チップ１００は、第１の層１０２、突出部１０４、流体流れ領域１０６、ピラー１０８、流体入口１１０、および流体出口１１２を含み得る。

【0090】

マイクロ流体チップ１００は、流体入口１１０で流体の流れを受け取るように構成される。流体が流体入口１１０でマイクロ流体チップ１００に入ると、流体は流体流れ領域１０６を通って流れる。流体流れ領域１０６は、マイクロ流体チップ１００の第１の層１０２、マイクロ流体チップの第２の層、および１またはそれを超える突出部１０４によって画定され得る。

【0091】

いくつかの実施形態では、流体入口１１０は、マイクロ流体チップ１００の第１の端部に配置され、流体出口１１２は、第１の端部の反対側のマイクロ流体チップ１００の第２の端部に配置される。流体入口１１０と流体出口１１２との間の距離は、第１の層１０２の平面（例えば、内面）に垂直な方向に延在し得る。流体入口１１０と流体出口１１２との間の距離は、５～３０ｍｍ、８～２５ｍｍ、または１０～２０ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、流体入口１１０と流体出口１１２との間の距離は、４５０ｍｍ、２５０ｍｍ、１００ｍｍ、５０ｍｍ、３０ｍｍ、２５ｍｍ、２０ｍｍ、１５ｍｍ、１０ｍｍ、または８ｍｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、流体入口１１０と流体出口１１２との間の距離は、５ｍｍ、８ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、２０ｍｍ、２５ｍｍ、３０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２５０ｍｍ、または４５０ｍｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の流体入口１１０および流体出口１１２は交換可能であってもよい。いくつかの実施形態では、流体入口１１０および／または流体出口１１２は、第２の層に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、流体入口１１０および／または流体出口１１２は、第１の層１０２上に配置されてもよい。

【0092】

マイクロ流体チップ１００は、圧力下で動作して、流体の細胞を突出部の上を、突出部の遠位端とマイクロ流体チップ１００の第２の層とによって画定される狭窄部領域を通って強制的に流動させる。狭窄部／狭窄部領域は、図２Ａ～図２Ｃを参照してより詳細に説明される。

【0093】

第１の層１０２は、第１の層１０２の内面から上方に延在する突出部１０４を備える。具体的には、突出部１０４は、第１の層１０２の内面からマイクロ流体チップ１００の第２の層に向かって延在する。突出部１０４は、第１の層１０２の内面の近位にある近位端と、マイクロ流体チップ１００の第２の層の近位にある遠位端とを含む。マイクロ流体チップ１００の突出部１０４の遠位端と第２の層との間に狭窄部が形成される。

【0094】

流体が流体流れ領域１０６を通って突出部１０４を通過した後、流体は流体出口１１２を通ってマイクロ流体チップ１００を出る。流体が流体流れの出口１１２を出るとき、流体はペイロードを含む複数の細胞を含む。

【0095】

マイクロ流体チップ１００はまた、複数のピラー１０８を含む。マイクロ流体チップ１００の第２の層は、複数のピラー１０８においてのみ第１の層１０２と接触するように構成されている。いくつかの実施形態では、ピラー１０８は、マイクロ流体チップ１００の第２の層が狭窄部（複数可）を形成するのに十分に第１の層１０２から離間していることを確実にすることができる。いくつかの実施形態では、ピラー１０８の最上面は、突出部１０４の最上面よりも高い（または第１の層１０２の平面に垂直に延在する高さ方向において第１の層１０２の外面から更に高い）。

【0096】

マイクロ流体チップ１００の長さまたは第１の寸法は、マイクロ流体チップ１００の高さ方向に対してｘ方向に垂直に延在し得る。高さ方向は、第１の層１０２の平面（例えば、内面または外面）に対して垂直に延在する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の長さは、２～５００ｍｍ、１０～５０ｍｍ、１２～３５ｍｍ、１５～３０ｍｍ、または１８～２５ｍｍである。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の長さは、２ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２５０ｍｍ、４５０ｍｍ、または５００ｍｍより大きいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の長さは、２ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２５０ｍｍ、４５０ｍｍ、または５００ｍｍより小さいまたはそれと等しい。マイクロ流体チップ１００の幅、または第２の寸法はまた、マイクロ流体チップ１００の高さ方向に対してｙ方向に垂直に延在し得る。高さ方向は、第１の層１０２の平面（例えば、内面または外面）に対して垂直に延在する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の幅は、２～１００ｍｍ、５～５０ｍｍ、５～２５ｍｍ、または８～１５ｍｍである。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の幅は、２ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２５０ｍｍ、４５０ｍｍ、または５００ｍｍより小さいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の幅は、２ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２５０ｍｍ、４５０ｍｍ、または５００ｍｍより大きいまたはそれと等しい。

【0097】

マイクロ流体チップ１００の高さ寸法は、マイクロ流体チップ１００の高さ方向に延在する。高さ方向は、第１の層１０２の平面（例えば、内面または外面）に対して垂直に延在する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の高さは、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、または５ｍｍより小さいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の高さは、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、または５ｍｍより大きいまたはそれと等しい。

【0098】

上記で説明したように、マイクロ流体チップ１００は、流体の流れを受け取るように構成される。流体は、細胞懸濁液を含み得る。いくつかの実施形態では、流体は、細胞への送達のためのペイロードを含み得、ペイロードは、細胞への送達のための任意の適切なカーゴを含み得る。

【0099】

図２Ａ～図２Ｃは、本明細書で提供されるマイクロ流体チップ（例えば、図１のマイクロ流体チップ１００）の狭窄部および突出部を含むマイクロ流体チップの一部の様々な図を示す。図２Ａは、突出部２０４Ａおよび狭窄部２１４Ａを含む部分マイクロ流体チップ２００Ａのアイソメトリック図を示す。マイクロ流体チップの部分２００Ａの上流側領域からマイクロ流体チップ２００Ａの下流側領域に流れる複数の細胞が示される。図２Ｂは、狭窄部２１４Ｂを通って流れる際に摂動されている細胞を示す、マイクロ流体チップの部分２００Ｂの側面断面図を示す。図２Ｃは、マイクロ流体チップの部分２００Ｃの上流側領域から下流側領域まで流体流れ領域内を流れる複数の細胞を含むマイクロ流体チップの部分２００Ｃの上面図を示し、いくつかの細胞は狭窄部２１４Ｃを通過するときに摂動される。

【0100】

図２Ａに示すマイクロ流体チップの部分２００Ａは、第１の層２０２Ａ、無傷の細胞２２０Ａ、狭窄部２１４Ａを通過するスクイーズされた細胞２２２Ａ、およびペイロードを含む細胞２２４Ａを更に含む。

【0101】

図２Ａに示すように、流体流れ領域の上流側領域から流体流れ領域の下流側領域まで流体流れ領域内を流れる複数の細胞が示される。具体的には、無傷な細胞２２０Ａが上流側領域に位置し、ペイロードを含む細胞２２４Ａが下流側領域に位置する。上流側領域から下流側領域に通過するために、細胞は突出部２０４Ａを通り、狭窄部２１４Ａを通過しなければならない。狭窄部２１４Ａを通過する細胞２２２Ａが示される。狭窄部２１４Ａは、狭窄部２１４Ａの高さ（例えば、突出部２０４Ａの近位端とマイクロ流体チップの第２の層との間の距離）が細胞の直径よりも小さくなるように形成される。したがって、細胞２２２Ａが狭窄部２１４Ａを通過するとき、細胞２２２Ａは、その細胞膜が損傷または摂動されるようにスクイーズされる。この摂動は、マイクロ流体チップの下流側領域におけるペイロードの取り込みを可能にする。

【0102】

マイクロ流体チップの部分２００Ａの第１の層２０２Ａは、突出部２０４Ａを含む。図示のように、突出部２０４Ａは、第１の層２０２Ａの内面から上方に延在する。突出部２０４Ａの１またはそれを超える側面は、傾斜していてもよい。突出部２０４Ａは、第１の層２０２Ａに近接する近位端と、第２の層に近接する遠位端とによって画定される。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ａの近位端の幅は、突出部２０４Ａの遠位端の幅よりも大きくてもよい。いくつかの実施形態では、狭窄部２１４Ａは、突出部２０４Ａの遠位端とマイクロ流体チップの第２の層とによって画定される。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ａの遠位端は平面を含む。平面は、マイクロ流体チップの高さ方向に垂直であってもよく、高さ方向は、第１の層２０４Ａの外面から第２の層の外面まで測定される。

【0103】

突出部２０４Ａの遠位端の平面は、突出部２０４Ａの上流側から突出部２０４Ａの下流側まで測定された幅を有し得る。この測定値をまた、突出部２０４Ａの遠位端の幅として特徴付けてもよい。いくつかの実施形態では、幅は、２～５０ミクロン、２～４０ミクロン、２～３０ミクロン、２～２０ミクロン、５～１５ミクロン、または８～１２ミクロンであり得る。いくつかの実施形態では、幅は、２ｃｍ、１ｃｍ、５ｍｍ、１ｍｍ、５００ミクロン、１００ミクロン、５０ミクロン、４０ミクロン、３０ミクロン、２０ミクロン、１５ミクロン、１２ミクロン、１０ミクロン、８ミクロン、または５ミクロンより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、幅は、２ミクロン、５ミクロン、８ミクロン、１０ミクロン、１２ミクロン、１５ミクロン、２０ミクロン、３０ミクロン、４０ミクロン、１００ミクロン、５００ミクロン、１ｍｍ、５ｍｍ、１ｃｍ、または２ｃｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。

【0104】

突出部２０４Ａの近位端は、突出部２０４Ａの遠位端の幅よりも大きい幅を有してもよい。突出部２０４Ａの近位端の幅は、突出部２０４Ａの上流側から突出部２０４Ａの下流側まで測定され得る。いくつかの実施形態では、幅は、１０～３００ミクロン、５０～２００ミクロン、８０～１５０ミクロン、または１００～１２５ミクロンであり得る。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ａの近位端の幅は、３００ミクロン、２００ミクロン、１５０ミクロン、１２５ミクロン、１００ミクロン、９０ミクロン、８０ミクロン、または５０ミクロンより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ａの近位端の幅は、１０ミクロン、５０ミクロン、８０ミクロン、９０ミクロン、１００ミクロン、１２５ミクロン、１５０ミクロン、または２００ミクロンより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。

【0105】

いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、第１の層２０２Ａの内面を横切って様々な方向に延在する複数のセグメントまたは部分を有する単一の突出部２０４Ａを含む。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ａは、マイクロ流体チップの高さ方向に垂直な方向に延在する。（マイクロ流体チップの高さ方向は、第１の層の内面の平面に垂直に延びる）。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ａは、狭窄部２１４Ａの上流側と下流側との間の界面に沿って延在する。いくつかの実施形態では、単一突出部２０４Ａの長さ（例えば、突出部２０４Ａの全てのセグメント／部分の全長）は、０．５～２００ｃｍ、５～１７５ｃｍ、２５～１５０ｃｍ、または７５～１２５ｃｍである。いくつかの実施形態では、単一突出部２０４Ａの長さは、２００ｃｍ、１７５ｃｍ、１５０ｃｍ、１２５ｃｍ、１００ｃｍ、７５ｃｍ、５０ｃｍ、２５ｃｍ、または５ｃｍより小さいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、単一突出部２０４Ａの長さは、０．５ｃｍ、５ｃｍ、２５ｃｍ、５０ｃｍ、７５ｃｍ、１００ｃｍ、１２５ｃｍ、１５０ｃｍ、または１７５ｃｍより大きいまたはそれと等しい。

【0106】

上述のように、マイクロ流体チップは、第１の層２０２Ａの内面を横切って１またはそれを超える方向に延在する単一の突出部２０４Ａを含み得る。例えば、突出部２０４Ａは、２つの隣接するセグメントまたは部分が第１の層２０２Ａの内面を横切って異なる方向に延在するように、複数のセグメントまたは部分を含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、第１の層２０２Ａの内面を横切って１またはそれを超える方向に延在する複数の突出部２０４Ａを含み得る。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ａは、狭窄部の上流側と狭窄部の下流側との間の界面に沿って延在する。いくつかの実施形態では、狭窄部の上流側と狭窄部の下流側との間の界面は、曲線および／または角度を含む。いくつかの実施形態では、狭窄部の上流側と狭窄部の下流側との間の界面は蛇行経路を形成する。いくつかの実施形態では、界面の蛇行経路は、蛇行経路に沿った全ての位置で高さ方向に垂直である（例えば、第１の層２０２Ａまたは第２の層の１またはそれを超える平面に垂直に延びる）。いくつかの実施形態では、狭窄部の上流側と狭窄部の下流側との間の界面の蛇行経路は、１またはそれを超える直角を含む。

【0107】

図２Ｂは、狭窄部２１４Ｂを通って流れる際に摂動されている細胞を示す、マイクロ流体チップの部分２００Ｂの側面断面図を示す。図２Ｂに示すマイクロ流体チップの部分２００Ｂは、第１の層２０２Ｂ、第２の層２３０Ｂ、流体流れ領域２０６Ｂ、突出部２０４Ｂ、狭窄部２１４Ｂ、および狭窄部２１４Ｂを通過するスクイーズされた細胞２２２Ｂを更に含む。スクイーズされた細胞２２２Ｂが狭窄部２１４Ｂを通過すると、その細胞膜が損傷または摂動され、ペイロードが摂動された細胞膜を通って細胞内に取り込まれる。

【0108】

流体流れ領域２０６Ｂは、第１の層２０２Ｂの内面、第２の層２３０Ｂの内面、および突出部２０４Ｂの表面によって画定される。図２Ｂに示す矢印は、細胞２２２Ｂの進行方向を示す。具体的には、細胞２２２Ｂは、流体流れ領域２０６Ｂの上流側領域から狭窄部２１４Ｂを通って、流体流れ領域２０６Ｂの下流側領域に移動する。

【0109】

いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップの高さ方向に測定した場合の第１の層２０２Ｂの内面と第２の層２３０Ｂの内面との間の距離は、２０～３００ミクロン、３０～２００ミクロン、または５０～１００ミクロンである。いくつかの実施形態では、距離は、３００ミクロン、２００ミクロン、１００ミクロン、５０ミクロン、または３０ミクロンより小さいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、距離は、２０ミクロン、３０ミクロン、５０ミクロン、１００ミクロン、または２００ミクロンより大きいまたはそれと等しい。

【0110】

図示のように、細胞は、突出部２０４Ｂの上流側から突出部２０４Ｂの下流側に狭窄部２１４Ｂを通って移動する。狭窄部２１４Ｂを通るこの距離は、突出部２０４Ｂの遠位端の平面によって画定される。図２Ａを参照して上述したように、突出部２０４Ｂの遠位端のこの距離または幅は、２～１００ミクロン、２～７５ミクロン、２～５０ミクロン、２～２５ミクロン、５～１５ミクロン、または８～１２ミクロンであってもよい。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ｂの遠位端の幅は、１００ミクロン、７５ミクロン、５０ミクロン、２５ミクロン、１５ミクロン、１２ミクロン、１０ミクロン、８ミクロン、または５ミクロンより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ｂの遠位端の幅は、２ミクロン、５ミクロン、８ミクロン、１０ミクロン、１２ミクロン、１５ミクロン、２５ミクロン、５０ミクロン、または７５ミクロンより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。

【0111】

高さ方向（第１の層２０２Ｂの外面から第２の層２３０Ｂの外面に向かう高さ方向）に測定した場合、マイクロ流体チップの第１の層２０２Ｂの全高は、第１の層２０２Ｂの外面から第１の層２０２Ｂのピラーの最上面まで（例えば、第２の層２３０Ｂが第１の層２０２Ｂと接触する唯一の位置）を測定することとして特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップの第１の層２０２Ｂの全高は、４００～２０００ミクロン、４５０～８００ミクロン、５００～７５０ミクロン、５５０～７００ミクロン、または６００～６５０ミクロンであってもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップの第１の層２０２Ｂの全高は、２０００ミクロン、１５００ミクロン、１０００ミクロン、８００ミクロン、７５０ミクロン、７００ミクロン、６５０ミクロン、６００ミクロン、５５０ミクロン、５００ミクロン、または４５０ミクロンより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップの第１の層２０２Ｂの全高は、４００ミクロン、４５０ミクロン、５００ミクロン、５５０ミクロン、６００ミクロン、６５０ミクロン、７００ミクロン、７５０ミクロン、８００ミクロン、１０００ミクロン、または１５００ミクロンより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。

【0112】

高さ方向（第１の層２０２Ｂの外面から第２の層２３０Ｂの外面まで延びる高さ方向）で測定した場合、マイクロ流体チップの第１の層２０２Ｂの最小高さは、第１の層２０２Ｂの外面から、流体流れ領域２０６Ｂと接する第１の層２０２Ｂの最も近い内面まで測定することとして特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態では、最小高さは、２００～１０００ミクロン、４００～７００ミクロン、４５０～６５０ミクロン、５００～６００ミクロン、または５２５～５７５ミクロンであってもよい。いくつかの実施形態では、最小高さは、１０００ミクロン、７００ミクロン、６５０ミクロン、６００ミクロン、６００ミクロン、５７５ミクロン、５２５ミクロン、５００ミクロン、４５０ミクロン、または４００ミクロンより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、最小高さは、２００ミクロン、４００ミクロン、４５０ミクロン、５００ミクロン、５２５ミクロン、５７５ミクロン、６００ミクロン、６５０ミクロン、７００ミクロン、または８００ミクロンより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。

【0113】

第２の層２３０Ｂの高さは、第２の層２３０Ｂの内面から２３０Ｂの外面まで測定され得る。いくつかの実施形態では、第２の層２３０Ｂの高さは、４００～２０００ミクロン、４５０～８００ミクロン、５００～７５０ミクロン、５５０～７００ミクロン、または６００～６５０ミクロンであってもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップの第２の層２３０Ｂの高さは、２０００ミクロン、１５００ミクロン、１０００ミクロン、８００ミクロン、７５０ミクロン、７００ミクロン、６５０ミクロン、６００ミクロン、５５０ミクロン、５００ミクロン、または４５０ミクロンより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップの第２の層２３０Ｂの高さは、４００ミクロン、４５０ミクロン、５００ミクロン、５５０ミクロン、６００ミクロン、６５０ミクロン、７００ミクロン、７５０ミクロン、８００ミクロン、１０００ミクロン、または１５００ミクロンより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。

【0114】

突出部２０４Ｂの遠位端の幅は、図２Ａの突出部２０４Ａに関して上述したような測定値を含み得る。突出部２０４Ｂの近位端の幅は、図２Ａの突出部２０４Ａに関して上述したような測定値を含み得る。

【0115】

突出部２０４Ｂの遠位端の平面から第２の層２３０Ｂの内面まで測定した場合、狭窄部２１４Ｂの高さは、マイクロ流体チップを通って流れる流体の細胞の直径よりも小さくなければならない。具体的には、この高さは、スクイーズされていない細胞（例えば、流体流れ領域２０６の上流側領域内または流体流れ領域２０６Ｂの下流側領域内の細胞）の直径よりも小さくなければならない。いくつかの実施形態では、狭窄部２１４Ｂの高さは、１～８ミクロン、１．２５～５ミクロン、１．５～３ミクロン、１．７５～２．７５ミクロン、または２～２．５ミクロンである。いくつかの実施形態では、狭窄部２１４Ｂの高さは、８ミクロン、７ミクロン、６ミクロン、５ミクロン、４ミクロン、３．５ミクロン、３．２５ミクロン、３ミクロン、２．７５ミクロン、２．５ミクロン、２ミクロン、１．７５ミクロン、１．５ミクロン、または１．２５ミクロンより小さいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、狭窄部２１４Ｂの高さは、１ミクロン、１．２５ミクロン、１．５ミクロン、１．７５ミクロン、２ミクロン、２．２５ミクロン、２．７５ミクロン、３ミクロン、３．２５ミクロン、３．５ミクロン、４ミクロン、５ミクロン、６ミクロン、または７ミクロンより大きいまたはそれと等しい。

【0116】

狭窄部２１４Ｂを、狭窄部の周囲長に対する断面積の商によって特徴付けてもよい。いくつかの実施形態では、狭窄部の周囲長に対する断面積の商は０．５～５ミクロンである。いくつかの実施形態では、狭窄部の周囲長に対する断面積の商は、５、４、３、２．５、２、１．５、または１ミクロンより小さいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、狭窄部の周囲長に対する断面積の商は、０．５、１、１．５、２、２．５、３、または４ミクロンより大きいまたはそれと等しい。

【0117】

いくつかの実施形態では、突出部２０４Ｂの１またはそれを超える側面は傾斜していてもよい。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ｂの側面と突出部２０４Ｂの基部との間で、突出部２０４Ｂが第１の層２０２Ｂの内面から延在する基部角度は、４０～７０度、４５～６５度、または５０～６０度であってもよい。いくつかの実施形態では、基部角度は、７０度、６５度、６０度、５５度、５０度、または４５度より小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、基部角度は、４０度、４５度、５０度、５５度、６０度、または６５度より大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、基部角度は５４．７度である。いくつかの実施形態では、突出部２０４Ｂの両方の基部角度は５４．７度である。いくつかの実施形態では、基部角度は、マイクロ流体チップ製造方法に依存する。例えば、基部角度は、シリコンの第１の層２０２Ｂにエッチングするための水酸化カリウム（ＫＯＨ）エッチング方法に依存し得る。

【0118】

いくつかの実施形態では、第１の層２０２Ｂおよび第２の層２３０Ｂはそれぞれ、シリコン、ガラス、ポリマー（例えば、ポリスチレン（ＰＳ）ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）またはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））、または任意の他の適切な材料を含む。いくつかの実施形態では、第１の層２０２Ｂおよび第２の層２３０Ｂは、同じ材料組成を含む。いくつかの実施形態では、第１の層２０２Ｂの材料組成は、第２の層２３０Ｂの材料組成とは異なる。いくつかの実施形態では、一方の層（例えば、第１の層または第２の層）はガラスであり、他方の層（例えば、第１の層または第２の層）はシリコンである。そのような実施形態では、狭窄部は、ガラスとケイ素との間の陽極接合によって画定される。この陽極接合は、マイクロ流体チップの全高に影響を及ぼさない。

【0119】

図２Ｃは、マイクロ流体チップの部分２００Ｃの上面図を示す。具体的には、図２Ｃは、（矢印によって示されるように）突出部２０４Ｃ、および狭窄部２１４Ｃによって流体流れ領域の上流側領域から流体流れ領域の下流側領域まで通過する複数の細胞の上面図を示す。図２Ｃに示すマイクロ流体チップの部分２００Ｃは、突出部２０４Ｃ、狭窄部２１４Ｃ、無傷の細胞２２０Ｃ、スクイーズされた細胞２２２Ｃ、およびペイロードを含む細胞２２４Ｃを含む。

【0120】

図２Ｃに示すように、突出部２０４Ｃは、図２Ａの突出部２０４Ａおよび図２Ｂの突出部２０４Ｂを参照して上述したように、狭窄部２１４Ｃを画定する平面によって特徴付けられる。平面表面に対向して、マイクロ流体チップの第２の層の内面が存在する。マイクロ流体チップが加圧下で動作すると、細胞は上流側領域から狭窄部２１４Ｃを通って下流側領域に押し出される。狭窄部２１４Ｃは、突出部２０４Ｃの遠位端の平面と第２の層の内面との間の距離（例えば、高さ）が、スクイーズされていない細胞（例えば、流体流れ領域の上流側領域に配置された細胞２２０Ｃ、またはペイロードを含み、流体流れ領域の下流側領域に配置された細胞２２４Ｃ）の直径よりも小さくなるように構成される。狭窄部２１４Ｃは、図２Ｂの狭窄部２１４Ｂを参照して上述したような高さを有し得る。

【0121】

図２Ａ～図２Ｃに示す例では、突出部２０４Ａ～２０４Ｃの遠位端と第２の層の内面との間に狭窄部２１４Ａ～２１４Ｃが形成される。具体的には、図２Ｂでは、突出部２０４Ｂの遠位端の平面と第２の層２３０Ｂの内面との間の空間によって、狭窄部２１４Ｂが形成される。図２Ｂの例では、狭窄部は、突出部２０４Ｂの遠位端の平面と第２の層２３０Ｂの内面との間の距離として画定されるように、流れ方向のその全長にわたって一定の高さを有する。したがって、図２Ｂに示す角度から見て、狭窄部２１４Ｂは、矩形形状を有する。しかしながら、いくつかの追加または代替の実施形態では、狭窄部（狭窄部２１４Ｂ等）は、図２Ｂに示す俯角から見て、台形、湾曲、階段状、または他の不規則な断面形状を有し得る。

【0122】

例えば、いくつかの実施形態では、（図２Ｂに示す垂直方向の）均一な断面狭窄部高さを有するのではなく、狭窄部は、垂直方向におけるその断面高さが（図２Ｂに示す水平方向の）狭窄部長さに沿って（直線的にまたは他の方法で）増加または減少するようなテーパ状形状を有し得る。いくつかの実施形態では、先細りする狭窄部の断面高さは、狭窄部全体の長さに沿って（本明細書に示される断面狭窄高さのいずれかから）約１％、２％、３％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、または５００％増加または減少し得る。

【0123】

いくつかの実施形態では、狭窄部は、（図２Ｂに示す垂直方向の）均一な断面狭窄部高さを有するのではなく、多段階狭窄部高さを有してもよく、狭窄部は、狭窄部の（図２Ｂに示す水平方向の）複数の段が１またはそれを超える他の段のとは異なる断面高さを有する階段状の形状を有する。例えば、いくつかの実施形態では、狭窄部は、第１の段が第２の段よりも狭い（例えば、低い高さを有する）、または第２の段が第１の段よりも狭い（例えば、低い高さを有する）２つの段を有し得る。狭窄部の段の断面高さは、狭窄部の流れの方向に単調に増加してもよく、狭窄部の流れの方向に単調に減少してもよく、または狭窄部の流れの方向に増加および減少の両方であってもよい（例えば、３つまたはそれを超える狭窄部の段を有する狭窄部の場合）。段は、（例えば、突出部２０４Ｂの遠位端の平坦表面および／または第２の層２３０Ｂの内表面の）１つの狭窄部壁または両方の狭窄部壁に形成された（図２Ｂに示す垂直方向の）ステップによって互いに区別され得る。狭窄部内の段間のステップは、直角のステップとして形成されてもよく、および／またはステップ間のテーパ状の移行領域によって形成されてもよい。

【0124】

いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える狭窄部の段は、本明細書に開示される断面狭窄部高さのいずれかに等しい断面狭窄部高さ（例えば、図２Ｂに示す垂直方向の）を有し得る。いくつかの実施形態では、隣接する狭窄部の段は、互いに約１％、２％、３％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、または５００％ｄ異なる断面狭窄部高さを有し得る。

【0125】

いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える狭窄部の段は、本明細書に開示される狭窄部長さ（例えば、流れの方向の）のいずれかに等しい狭窄部長さを有し得る。あるいは、狭窄部全体を形成する狭窄部の段のセットは、合計して本明細書に開示される狭窄部長さのいずれかに等しい長さを有し得る。

【0126】

隣接する狭窄部段がテーパ状の狭窄部移行領域によって分離されているいくつかの実施形態では、テーパ状の狭窄部移行領域の長さ（例えば、流れの方向の）は、本明細書に開示される狭窄部長さのいずれかの約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、２５％、５０％、または１００％に等しくてもよい。

【0127】

いくつかの実施形態では、不均一な（例えば、先細りしている）断面高さの狭窄部および／または異なる断面高さの多段を有する狭窄部は、チップが、狭窄部を通過する細胞が狭窄部壁からの圧力を受ける時間を延長することを可能にし、それによって、細胞壁の細孔が開いている時間を延長し、ペイロード送達効率および有効性を増加させ得る。いくつかの実施形態では、最初のより狭い部分とその後のより広い部分とを有する狭窄部は、細孔が最初の部分に迅速かつ効果的に形成され、細胞がより広い部分を通過するときに細孔が開いたままにされることを可能にし得る。より狭い狭窄部に続いてより広い狭窄部を使用することにより、狭窄部全体がより狭い狭窄部幅を有する実施と比較して、細胞生存率を増加させながら効果的なペイロード送達を達成し得る。
カートリッジ内に配置されたチップ

【0128】

図２Ｄは、４つのチップ２４０Ａ、２４０Ｂ、２４０Ｃ、２４０Ｄを内部に保持するカートリッジ２００Ｄを示す。カートリッジ２００Ｄは、内部にチップを保持し、内部に保持されたチップとの間で流体の流れを導くことができる。図２Ｄの分解立体図によって示されるように、Ｏリング２４２は、チップを押圧し、チップの入口または出口ポートを取り囲み、チップを定位置に保持し、入口／出口ポートの周りにシールを形成し、漏れなくチップに出入りする流体の流れを容易にし得る。
本明細書で提供されるマイクロ流体チップを使用して細胞にペイロードを送達させる方法

【0129】

図３は、本明細書に記載のマイクロ流体チップを使用して細胞にペイロードを送達させるための例示的な方法３００を示す。

【0130】

工程３０２において、マイクロ流体チップ（例えば、図１のマイクロ流体チップ１０２）は、流体流れ領域への流体の流れを受け取る。流体は、複数の細胞を含む。いくつかの実施形態ではまた、流体はペイロードも含むことができる。具体的には、マイクロ流体チップは、流体流れ領域の上流側領域で流体の流れを受け取る。

【0131】

工程３０４において、マイクロ流体チップ（例えば、図１のマイクロ流体チップ１０２）は、マイクロ流体チップ内の狭窄部を通って細胞を流動させることによって、流体から細胞の細胞膜を摂動させる。狭窄部は、突出部とマイクロ流体チップの第２の層との間に形成される。突出部は、マイクロ流体チップの第１の層の内面からマイクロ流体チップの第２の層まで延在する。

【0132】

工程３０６において、摂動された細胞へのペイロードの送達が行われる。これは、流体流れ領域の下流側領域で起こる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、流体流れ領域の下流側領域で摂動後に導入される。ペイロードの送達後、細胞膜は治癒し得る。

【0133】

いくつかの実施形態では、例えば方法３００に従って、本明細書に記載のマイクロ流体チップの狭窄部を通して処理された細胞は、７０～１００％、８０～１００％、９０～１００％、または９５～１００％の狭窄部を通過した後の生存割合を示し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のマイクロ流体チップの狭窄部を通して処理された細胞は、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％より小さいまたはそれと等しい狭窄部を通過した後の生存割合を示し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のマイクロ流体チップの狭窄部を通して処理された細胞は、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より大きいまたはそれと等しい狭窄部を通過した後の生存割合を示し得る。

【0134】

いくつかの実施形態では、例えば方法３００に従って、本明細書に記載のマイクロ流体チップの狭窄部を通して処理された細胞は、３０～１００％のペイロード送達割合を示し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のマイクロ流体チップの狭窄部を通過した細胞は、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、または３５％より小さいまたはそれと等しいペイロード送達割合を示し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のマイクロ流体チップの狭窄部を通過した細胞は、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より大きいまたはそれと等しいペイロード送達割合を示し得る。
本明細書で提供されるマイクロ流体チップの流れ特性

【0135】

本明細書に記載のマイクロ流体チップを通って流れ得る流体の様々な流体流れ特性を以下に説明する。具体的には、圧力、剪断応力、剪断速度、流速、細胞体積流量、細胞目詰まり速度、および細胞スループットが以下に提供される。

【0136】

上記で説明したように、本明細書で提供されるマイクロ流体チップは、細胞懸濁液の細胞が、細胞の膜が摂動されるように狭窄部を通過することによって、流体流れ領域の上流側領域から流体流れ領域の下流側領域に強制されることを確実にするため、圧力下で動作することによって細胞をスクイーズするように設計される。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、１～２００ＰＳＩ、１０～１５０ＰＳＩ、または２５～１００ＰＳＩで動作するように構成され得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００ＰＳＩより小さいまたはそれと等しい圧力で動作することで細胞をスクイーズするように構成され得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００ＰＳＩより大きいまたはそれと等しい圧力でスクイーズするように構成され得る。

【0137】

本明細書で提供されるマイクロ流体チップの突出部および／またはピラーのエッジ効果を除去することにより、狭窄部を通過する細胞の剪断応力が減少され得る。例えば、本明細書で提供されるマイクロ流体チップの狭窄部を通過する細胞の最大剪断応力は、０．００１～０．１ＭＰａ、０．０１～０．１ＭＰａ、または０．０１～０．０５ＭＰａであり得る。いくつかの実施形態では、最大剪断応力は、０．１、０．０５、または０．０１ＭＰａより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、最大剪断応力は、０．００１、０．０１、または０．０５ＭＰａより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。例えば、図４は、本明細書で提供されるマイクロ流体チップ（例えば、堰型チップ）の剪断断応力データを示す。図示のように、本明細書で提供されるマイクロ流体チップの最大剪断応力は、狭窄部を通っておよそ０．００４ｍｍの距離で０．０２ＭＰａ程度で発生する。

【0138】

本明細書で提供されるマイクロ流体チップの狭窄部を通過する細胞の剪断速度はまた、突出部および／またはピラーのエッジ効果を除去することによって減少され得る。例えば、本明細書で提供されるマイクロ流体チップの狭窄部を通過する細胞の最大剪断速度は、５～９（１０^６Ｈｚ）または６～８（１０^６Ｈｚ）であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるマイクロ流体チップの狭窄部を通過する細胞の最大剪断速度は、９、８．５、８、７．５、７、６．５、６、または５．５（１０^６Ｈｚ）より小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるマイクロ流体チップの狭窄部を通過する細胞の最大剪断速度は、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、または８．５（１０^６Ｈｚ）より大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。例えば、図５は、本明細書で提供されるマイクロ流体チップ（例えば、堰型チップ）の剪断断速度データを示す。示されるように、本明細書に提供されるマイクロ流体チップによって引き起こされる最大剪断速度は、狭窄部の長さにわたって約６．７５（１０^６Ｈｚ）およびおよそ０．００４５ｍｍで生じる。

【0139】

いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、０．５～１５ｍ／秒、２～１２ｍ／秒、または３～１０ｍ／秒のマイクロ流体チップ１００の狭窄部を通る流速を提供することができる。いくつかの実施形態では、狭窄部を通る流速は、１５、１２、１０、８、５、３、２、または１ｍ／秒より小さいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、狭窄部を通る流速は、０．５、１、２、３、５、８、１０、または１２ｍ／秒より大きいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、目詰まりなしに狭窄部を通過する流体（例えば、細胞懸濁液）の流れを受け入れるように構成される。

【0140】

例えば、図６は、本明細書に提供されるマイクロ流体チップの突出部によって形成された狭窄部を通って流れる細胞の断面図を示す。図６に示すように、マイクロ流体チップの狭窄部を通る細胞によって達成される最大流量は５．２８６ｍ／秒である。

【0141】

いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、５０～３００ｍｍ^３／秒、７５～２５０ｍｍ^３／秒、または１００～１５０ｍｍ^３／秒の狭窄部を通る体積流量を提供し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の狭窄部を通る体積流量は、３００、２５０、２００、１５０、１００ｍｍまたは７５ｍｍ^３／秒より小さいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の狭窄部を通る体積流量は、５０、７５、１００、１５０、２００、または２５０ｍｍ^３／秒より大きいまたはそれと等しい。

【0142】

本明細書に記載のマイクロ流体チップは、流体流れ領域および／または狭窄部面積における細胞の目詰まりを最小限に抑えるように設計されている。本明細書で提供される実施形態によるマイクロ流体チップを詰まらせるのに必要な細胞の数は、狭窄部の断面積、粒子／細胞直径、および粒子／細胞流量に依存する。この関係は、以下のように定義することができる：

【数1】

Ａ＝断面積、Ｄ＝粒子径、Ｖ＝粒子流量

【0143】

本明細書に記載の特定のマイクロ流体チップの断面積、ならびに使用される粒子／細胞の直径および速度に基づいて、本明細書に記載のマイクロ流体チップの区域を閉塞するのに必要な細胞の数を、以下のように定義することができる。

【数2】

【0144】

上記で説明したように、本明細書で提供されるマイクロ流体チップは、高スループットを有するように具体的に設計される。特定の狭窄部の幾何学的形状のために、狭窄部を通過することができる（そして狭窄部によって摂動され得る）細胞数は、所与の時間単位で既知のマイクロ流体チップよりも多い。
本明細書に記載のマイクロ流体チップのエッチング方法

【0145】

様々なエッチング方法を使用して、本明細書に提供されるマイクロ流体チップの第１の層にエッチングして流体流れ領域（突出部および狭窄部を含む）が形成され得る。例えば、使用され得る様々なエッチング方法としては、水酸化カリウム（ＫＯＨ）エッチング、深堀反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）、ならびに様々なウェットエッチングおよびドライエッチング技術を含む他の適切なエッチング技術が挙げられる。マイクロ流体チップはまた、成形技術（例えば、射出成形）を使用して製造され得る。

【0146】

図７は、本明細書に記載のマイクロ流体チップの突出部出および狭窄部を含む流体流れ領域を達成するために使用され得る例示的なＫＯＨエッチング方法を示す。ＫＯＨエッチングは、シリコンにキャビティを形成するために使用することができる湿式化学エッチングプロセスである。ＫＯＨエッチングプロセスは、エッチング温度、使用されるＫＯＨの割合、ストップとして作用する結晶面の実装、異方性の程度、シリコン中の任意の原子欠陥の存在、およびシリコン中に自然に見られる他の不純物の存在によって制御することができる。ＫＯＨのエッチング速度はよく理解されているプロセスであるため、シリコン層のＫＯＨエッチングは、いくつかのマイクロ流体チップにわたって一貫したエッチングを達成することができる。

【0147】

図７に示すように、シリコンウエハは、１１００°Ｃで酸化されて、シリコンウエハの表面上に二酸化ケイ素のマスクを形成する。次いで、シリコンウエハリソグラフィの表面にフォトレジストが形成される。具体的には、フォトレジストを形成するためにフォトレジストスピニング法が使用され得る。フォトレジストがシリコンウエハ表面にコーティングされた後、コーティングされたシリコンウエハは、フォトレジストの一部（例えば、流体流れ領域がエッチングされる部分）を除去するために紫外光に曝露される。フォトレジストを現像し、フッ化水素酸を用いて二酸化ケイ素層にアンダーカットをエッチングする。次いで、フォトレジストがシリコン表面から除去され、マスクされたシリコンウエハをＫＯＨ溶液に浸漬することにより、ＫＯＨを使用してシリコンがエッチングされる。ＫＯＨエッチングはシリコンの結晶面に沿ってエッチングするため、ＫＯＨエッチングは傾斜した突出部プロファイルを達成する。これにより、正確に５４．７４度（例えば、突出部の傾斜した側面と突出部の基部との間の角度）の角度を有する突出部プロファイルが得られる。他の全てのエッチングされた表面は、平坦であってもよい。シリコン層が長期間ＫＯＨ溶液に曝露されると、矩形の特徴のみが形成され得る（５４．７４度傾斜した突出部は形成されない）。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるマイクロ流体チップは、２つまたはそれを超えるＫＯＨエッチングプロセスを使用して製造され得る。例えば、第１のＫＯＨエッチングは上流側および／または下流側の流体流れ領域をエッチングすることができ、第２のＫＯＨエッチングは狭窄部領域をエッチングすることができる。

【実施例】

【0148】

異なる圧力でスクイーズする様々なマイクロ流体チップの幾何学的形状を試験し、その結果を、以下の図８～図１６に記載する。試験されたマイクロ流体チップは全て、本明細書で提供される実施形態と一致する。以下に提供されるように、マイクロ流体チップの各々は、チップの第１の層の平面に垂直な高さ方向（ｚ方向）に測定した場合、チップの狭窄部の高さ測定値によって特徴付けられる。マイクロ流体チップは以下を含む：
・１．８ミクロンの高さを有し、５０ＰＳＩで圧迫される狭窄部を有するマイクロ流体チップ；
・１．８ミクロンの高さを有し、５５ＰＳＩで圧迫される狭窄部を有するマイクロ流体チップ；
・２．０ミクロンの高さを有し、５０ＰＳＩで圧迫される狭窄部を有するマイクロ流体チップ；
・２．０ミクロンの高さを有し、６０ＰＳＩで圧迫される狭窄部を有するマイクロ流体チップ；および
・７０ＰＳＩで圧迫される２．２ミクロンの高さを有する狭窄部を有するマイクロ流体チップ。

【0149】

図８は、様々なタイプのマイクロ流体チップにおけるゴースト発生を評価する研究からのデータを示す。ゴーストの発生は、いくつかの実施形態では、その後の生物学的活性に有利である。例えば、ゴーストの発生は、国際公開第２０１７／１９２７８５号および国際公開第２０２０／１５０９８号に更に詳細に記載されており、これらは両方ともその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、狭窄部を通過した後のゴースト形成は、約５％～約１００％である。いくつかの実施形態では、狭窄部を通過した後のゴースト形成は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％である。いくつかの実施形態では、ゴースト形成は、細胞が狭窄部を通過した約１．０×１０^－２秒後から少なくとも約１０日後まで測定される。

【0150】

図９および図１０は、抗原特異的免疫応答を研究するためのモデルタンパク質として使用される特異的抗原であるＯＶＡ（オボアルブミン）の送達データを示す。図９は、上に列挙した異なるマイクロ流体チップの各々に対するＯＶＡ送達割合を示す。図１０は、上に列挙した異なるマイクロ流体チップの各々に対するＯＶＡ ６４７送達平均蛍光強（ＭＦＩ）を示す。ＯＶＡ ６４７は、比較的低分子量のタンパク質であるオボアルブミンコンジュゲートである。蛍光強度は、どのくらいのペイロードが各細胞に送達されるかを示し、これは送達割合を提供することができる。

【0151】

図１１および図１２は、アネキシンＶ＋で染色した細胞の分析を示す。図１１は、上に列挙した異なるマイクロ流体チップの各々を通過させた後の無核細胞のアネキシンＶ＋染色のデータを示す。アネキシンＶ＋染色の結果は、細胞懸濁液中のゴーストの割合を定量するのに役立ち得る指標である。また、試験した特定のマイクロ流体チップの狭窄部で細胞がどの程度強くスクイーズされたかを示すことができる。図１２は、異なるマイクロ流体チップの各々についてのアネキシンＶ＋ＭＦＩのデータを示す。

【0152】

図１３および図１４は、上記で提供されたマイクロ流体チップの各々を通過させた後のゴースト、非ゴーストおよび残存する無核細胞へのＯＶＡの送達を示す。ＯＶＡ（オボアルブミン）は、抗原特異的免疫応答を研究するためのモデルタンパク質として使用される特異的抗原である。図１４は、上記で提供されたマイクロ流体チップの各々に無核細胞を通過させた後のゴースト、非ゴーストおよび残存する細胞のＭＦＩを示す。

【0153】

図１５および図１６は、アネキシンＶ＋による染色による細胞の分析を示す。図１５は、上記で提供されたマイクロ流体チップの各々に無核細胞を通過させた後のゴースト、非ゴースト、および残存する細胞の総アネキシンＶ＋染色率を示す。図１６は、上記で提供されたマイクロ流体チップの各々に無核細胞を通過させた後のゴースト、非ゴースト、および残存する細胞のＭＦＩを示す。

【0154】

上記の説明は、例示的なシステム、方法、技術、パラメータ等を記載する。しかしながら、そのような説明は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、代わりに例示的な実施形態の説明として提供されることを認識されたい。
実施形態

【0155】

以下は、特定の実施形態の列挙されたリストである。いくつかの実施形態では、実施形態の依存関係が実施形態を組み合わせることができることを明示的に示さない場合であっても、いずれか１またはそれを超える以下の実施形態のいずれか１またはそれを超える特徴のいずれか１またはそれを超える他の実施形態と組み合わせることができる。

【0156】

実施形態１． 細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップであって、前記チップが、
第１の層と、
第２の層と、
前記第１の層と前記第２の層との間の流体流れ領域とを含み、前記チップが、前記流体流れ領域への細胞懸濁液の流れを受け入れるように構成され、前記細胞懸濁液が複数の細胞を含み、
前記第１の層が、前記第２の層に向かって延在して突出部と前記第２の層との間に狭窄部を形成する前記突出部を含み、前記狭窄部が、前記細胞が前記狭窄部を通過する際に、前記複数の細胞の細胞の細胞膜の摂動を引き起こすように構成される、マイクロ流体チップ。

【0157】

実施形態２． 前記第１の層がシリコンを含む、実施形態１に記載のマイクロ流体チップ。

【0158】

実施形態３． 前記第２の層がガラスを含む、実施形態１または２に記載のマイクロ流体チップ。

【0159】

実施形態４． 前記突出部が、前記第１の層の内面に垂直な高さ方向に前記第１の層の前記内面から離れて延在し、前記第１の層の前記内面に隣接する近位端を含む、実施形態１～３のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0160】

実施形態５． 前記突出部が、前記第１の層の内面に垂直な高さ方向に前記第１の層の前記内面から離れて延在し、前記突出部の遠位端と前記第２の層の内面との間に前記狭窄部を形成する前記突出部の前記遠位端を含み、前記高さ方向に測定した場合、前記突出部の前記遠位端と前記第２の層の前記内面との間の前記狭窄部の高さが、５ミクロンより小さいまたはそれと等しい、実施形態１～４のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0161】

実施形態６． 前記狭窄部の前記高さが、前記複数の細胞の前記細胞の直径よりも小さい、実施形態５に記載のマイクロ流体チップ。

【0162】

実施形態７． 前記マイクロ流体チップが入口および出口を含み、前記入口が、前記チップの第１の端部に配置され、前記出口が、前記第１の端部の反対側の前記チップの第２の端部に配置され、前記入口と前記出口との間の距離が、前記第１の層の内面に垂直な方向に延在する、実施形態１～６のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0163】

実施形態８． 前記突出部の前記近位端が、前記高さ方向に垂直に延在し、前記突出部の上流側から前記突出部の下流側に延在する厚さを有し、前記突出部の前記近位端の前記厚さが１０ミクロンより大きいまたはそれと等しい、実施形態４～７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0164】

実施形態９． 前記突出部の前記遠位端が、前記高さ方向に垂直に延在し、前記狭窄部の上流側から前記狭窄部の下流側に延在する厚さを有し、前記突出部の前記遠位端の前記厚さが５ミクロンより大きいまたはそれと等しい、実施形態５～８のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0165】

実施形態１０． 前記突出部が、前記高さ方向に垂直に延在し、前記狭窄部の上流側と前記狭窄部の下流側との間の界面に沿って延在する長さを有し、前記長さが０．５ｃｍより大きいまたはそれと等しい、請求４～９のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0166】

実施形態１１． 前記狭窄部の前記上流側と前記狭窄部の前記下流側との間の前記界面が、曲線および角度のうちの一方または両方を含む、実施形態１０に記載のマイクロ流体チップ。

【0167】

実施形態１２． 前記狭窄部の前記上流側と前記狭窄部の前記下流側との間の前記界面が、蛇行経路を形成する、実施形態１～１１のいずれかに記載マイクロ流体チップ。

【0168】

実施形態１３． 前記界面の前記蛇行経路が、前記蛇行経路に沿った全ての位置で前記高さ方向に垂直である、実施形態１２に記載のマイクロ流体チップ。

【0169】

実施形態１４． 前記蛇行経路が、１またはそれを超える直角を含む、実施形態１２または１３に記載のマイクロ流体チップ。

【0170】

実施形態１５． 前記第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に対して垂直に延在する前記マイクロ流体チップの第１の寸法が１８～２４ｍｍである、実施形態１～１４のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0171】

実施形態１６． 前記第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に対して垂直に延在する前記マイクロ流体チップの第２の寸法が８～１５ｍｍである、実施形態１～１５のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0172】

実施形態１７． 前記第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に延在する前記マイクロ流体チップの高さ寸法が１０００～１５００ミクロンである、実施形態１～１６のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0173】

実施形態１８． 前記第２の層が複数の支持ピラーで前記第１の層に接触し、前記複数の支持ピラーの各支持ピラーが前記第１の層の内面から前記第２の層まで延在する、実施形態１～１７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0174】

実施形態１９． 前記第１の層が、前記第１の層の平面に垂直な高さ方向に測定した場合、５００～７５０ミクロンの全高を有する、実施形態１～１８のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0175】

実施形態２０． 前記第１の層が４５０～６５０ミクロンの最小高さを有し、前記最小厚さが、前記第１の層の内面に垂直な高さ方向に測定され、前記最小厚さが、前記第１の層の外面から、前記流体流れ領域と接する前記第１の層の最も近い内面まで測定される、実施形態１～１９のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0176】

実施形態２１． 前記第２の層が、前記第１および第２の層の一方または両方の平面に垂直な高さ方向に測定した場合、４５０～８００ミクロンの厚さを有する、実施形態１～２０のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0177】

実施形態２２． 前記突出部の最上面が、前記第１の層の内面に並列であり、前記突出部が前記第１の層の前記内面から延在する高さ方向に垂直な平面を含む、実施形態１～２１のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0178】

実施形態２３． 前記突出部の最上面が、前記第２の層の内面に並列であり、前記突出部が前記第１の層の前記内面から延在する高さ方向に垂直な平面を含む、実施形態１～２２のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0179】

実施形態２４． 前記突出部の側面が、前記第１の層の内面からある角度で上方に延在する、実施形態１～２３のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0180】

実施形態２５． 前記突出部の前記側面が、前記第１の層の前記内面から５０～６０度傾斜している、実施形態２４に記載のマイクロ流体チップ。

【0181】

実施形態２６． 前記突出部の前記側面が、前記第１の層の前記内面から５４．７度傾斜している、実施形態２４または２５に記載のマイクロ流体チップ。

【0182】

実施形態２７． 前記細胞懸濁液がペイロードを含む、実施形態１～２６のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0183】

実施形態２８． 前記チップが１０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成される、実施形態１～２７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0184】

実施形態２９． 前記狭窄部の周囲長に対する前記狭窄部の断面積の商が０．５ミクロンより大きいまたはそれと等しい、実施形態１～２８のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

【0185】

実施形態３０． ペイロードを細胞に送達させる方法であって、前記方法が、
マイクロ流体チップの流体流れ領域への細胞懸濁液の流れを受け取ることであって、前記細胞懸濁液が複数の細胞を含む、細胞懸濁液の流れを受け取ることと、
前記マイクロ流体チップの突出部と第２の層との間に形成された狭窄部を通して前記細胞を流動させることによって、前記複数の細胞の細胞の細胞膜を摂動させることとを含み、前記突出部が、前記マイクロ流体チップの第１の層の内面から前記マイクロ流体チップの前記第２の層に向かって延在し、前記細胞膜の前記摂動が、ペイロードの前記細胞への進入を可能にする、方法。

【0186】

実施形態３１． 前記マイクロ流体チップの突出部と第２の層との間に形成された狭窄部を通して前記細胞を流動させることによって前記複数の細胞の細胞の細胞膜を摂動させることが、前記狭窄部を通して前記細胞を０．５ｍ／秒より大きいまたはそれと等しい流量で流動させることを含む、実施形態３０に記載の方法。

【0187】

実施形態３２． 前記マイクロ流体チップが、１０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成される、実施形態３０または３１に記載の方法。

【0188】

実施形態３３． 前記細胞懸濁液が前記ペイロードを含む、実施形態３０～３２のいずれか記載の方法。

【0189】

実施形態３４． 前記細胞膜の摂動後に前記ペイロードを前記細胞懸濁液と接触させることを含む、実施形態３０～３３のいずれかに記載の方法。

【0190】

実施形態３５． ペイロードを細胞に送達させるためのマイクロ流体チップを製造する方法であって、前記方法が、
第１の層にエッチングして、前記第１の層の凹部面および前記第１の層の突出部を形成することと、
前記第１の層に第２の層を固定して、前記凹部面と前記第２の層との間に画定された流体流れ領域と、前記突出部と前記第２の層との間に画定された狭窄部とを有するマイクロ流体チップを形成することと、を含む、方法。

【0191】

実施形態３６． 第１の層にエッチングして前記第１の層の凹部面および前記第１の層の突出部を形成することが、湿式または乾式化学エッチング剤を使用することを含む、実施形態３５に記載の方法。

【0192】

実施形態３７． 第１の層にエッチングして前記第１の層の凹部面および前記第１の層の突出部を形成することが、前記流体流れ領域を画定するために３０ミクロンより大きいまたはそれと等しい深さまで前記第１の層にエッチングすることを含む、実施形態３５または３６に記載の方法。

【0193】

実施形態３８． 第１の層にエッチングして前記第１の層の凹部面および前記第１の層の突出部を形成することが、前記突出部の遠位端を形成するために５ミクロンより小さいまたはそれと等しい深さまで前記第１の層にエッチングすることを含む、実施形態３５～３７のいずれかに記載の方法。

【0194】

実施形態３９． 第１の層にエッチングして前記第１の層の凹部面および前記第１の層の突出部を形成することが、前記突出部の遠位端を形成するために前記第１の層にエッチングすることを含み、前記突出部の前記遠位端が、前記第１の層の平面に垂直な高さ方向に垂直に延在する厚さを有し、前記遠位端の厚さが、前記突出部の上流側から前記突出部下流側に向かって延在し、前記突出部の前記遠位端の厚さが５ミクロンより大きいまたはそれと等しい、実施形態３５～３８のいずれかに記載の方法。

【0195】

実施形態４０． 前記突出部が、前記高さ方向に垂直に延在し、前記狭窄部の上流側と前記狭窄部の下流側との間の界面に沿って延在する長さを有し、前記長さが０．５ｃｍより大きいまたはそれと等しい、実施形態３５に記載の方法。

【0196】

実施形態４１． 前記狭窄部の前記上流側と前記狭窄部の前記下流側との間の前記界面が、曲線および角度のうちの一方または両方を含む、実施形態４０に記載の方法。

【0197】

実施形態４２． 前記狭窄部の前記上流側と前記狭窄部の前記下流側との間の界面が、蛇行経路を形成する、実施形態４０または４１に記載の方法。

【0198】

実施形態４３． 前記界面の前記蛇行経路が、前記蛇行経路に沿った全ての位置で前記高さ方向に垂直である、実施形態４２に記載の方法。

【0199】

実施形態４４． 前記蛇行経路が、１またはそれを超える直角を含む、実施形態４２または４３に記載の方法。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【国際調査報告】