特表 2024-501025 免疫グロブリンＧのプロセススケールでの単離のためのシステム及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-10

(54)【発明の名称】免疫グロブリンＧのプロセススケールでの単離のためのシステム及び方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/36 20060101AFI20231227BHJP

   C07K 1/18 20060101ALN20231227BHJP

   C07K 1/30 20060101ALN20231227BHJP

   C07K 1/34 20060101ALN20231227BHJP

   C07K 16/06 20060101ALN20231227BHJP

【ＦＩ】

C07K1/36

C07K1/18

C07K1/30

C07K1/34

C07K16/06

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539286

(86)(22)【出願日】2021-12-22

(85)【翻訳文提出日】2023-07-24

(86)【国際出願番号】 US2021065017

(87)【国際公開番号】W WO2022146856

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】63/131,097

(32)【優先日】2020-12-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/208,778

(32)【優先日】2021-06-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/272,605

(32)【優先日】2021-10-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518276450

【氏名又は名称】プラズマ テクノロジーズ エルエルシー

【氏名又は名称原語表記】ＰＬＡＳＭＡ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＬＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】ズルロ、ユージーン

(72)【発明者】

【氏名】カーティン、デニス

(72)【発明者】

【氏名】ラトケ、クラウス ピーター

(72)【発明者】

【氏名】ドーフマン、ライアン

(72)【発明者】

【氏名】ウェリハン、マシュー

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA20

4H045AA40

4H045BA10

4H045CA42

4H045DA75

4H045EA20

4H045GA23

(57)【要約】

血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の単離のための方法であって、ＩｇＧが最初に塩沈殿によって分画され、続いて連続的なイオン交換ステップで、ＩｇＧがイオン交換ステップの未結合のフロースルー画分に現れる方法が提供される。いくつかの実施形態は、連続的な陰イオン交換ステップを使用する。他の実施形態は、陰イオン交換ステップの後、陰イオン交換ステップから陽イオン交換ステップへのフロースルーを適用し、ＩｇＧは陽イオン交換ステップからのフロースルー画分に集められる。ＩｇＧは高収率（通常約７５％以上）かつ高純度で収集される。クロマトグラフィー媒体からの結合及び溶出を回避することで、ＩｇＧの品質や収率を犠牲にすることなく処理及びスケールアップが簡素化される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的タンパク質及び複数の夾雑物を含む溶液から前記標的タンパク質を単離する方法であって、
前記溶液に塩を添加することで上清及び沈殿物を生成すること、
前記沈殿物を水溶液に溶解することで、前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第１の部分を含む溶解した沈殿物を生成すること、
前記溶解した沈殿物を、第１の極性の第１の電荷を有する第１のイオン交換媒体に適用することで、前記複数の夾雑物の第２の部分を含む第１の結合画分と、前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第３の部分を含む第１のフロースルーとを生成すること、及び、
前記第１のフロースルーを、前記第１の極性とは反対の第２の極性の第２の電荷を有する第２のイオン交換媒体に適用することで、前記複数の夾雑物の第３の部分を含む第２の結合画分と、前記標的タンパク質を含む第２のフロースルーとを生成すること
を含み、
前記第２の交換媒体の容量は、前記第２のイオン交換媒体を使用したイオン交換中に失われる前記標的タンパク質が前記溶液中の前記標的タンパク質の量の約１０％未満となるように選択される方法。

【請求項2】

前記溶液が血漿である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記溶液が分離ステップの産物である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記塩がクエン酸塩又は酢酸塩である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のイオン交換媒体が陰イオン交換媒体であり、前記第２の陰イオン交換媒体が陽イオン交換媒体であり、前記標的タンパク質が免疫グロブリンＧである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記複数の夾雑物が第ＸＩ因子又は活性化第ＸＩ因子を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第１のイオン交換媒体が粒子又はビーズとして構成されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記第２のイオン交換媒体がフィルターとして構成されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記溶解した沈殿物にカプリル酸塩を添加することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

カプリル酸塩の添加後に固体を除去することを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

固体を除去することが濾過ステップの適用を含み、前記フィルターは珪藻土を含み、第ＸＩ因子又は第ＸＩＩ因子を選択的に保持するフィルターを選択することを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記デプスフィルターはパーライトを含まない、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記標的タンパク質の収率が少なくとも７０％である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記上清から少なくとも１つの追加のタンパク質を回収することを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記溶液の体積が少なくとも５００Ｌである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

標的タンパク質及び複数の夾雑物を含む溶液から前記標的タンパク質を単離するためのシステムであって、
前記溶液を受け取り塩分画ステップを行うように構成された分画モジュールであって、前記塩分画ステップは、上清及び沈殿物を生成し、前記上清を前記沈殿物から分離し、前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第１の部分を含む前記沈殿物を第１の出力として提供するものである、前記分画モジュール、
第１の極性の第１の電荷を有する第１のイオン交換媒体を含むとともに前記第１の出力に連通する第１の分離モジュールであって、前記第１の分離モジュールはフロースルー画分を含む第２の出力を提供するように構成されており、前記フロースルー画分は前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第２の部分を含むものである、前記第１の分離モジュール、及び、
前記第１の極性とは反対の第２の極性の第２の電荷を有する第２の交換媒体を含む第２の分離モジュールであって、前記第２の分離モジュールは、前記複数の夾雑物の第３の部分を保持し、前記標的タンパク質を含む第３の出力を提供するように構成されており、前記第２の分離モジュールは、前記第２のイオン交換媒体でのクロマトグラフィーで失われる前記標的タンパク質が前記溶液中の前記標的タンパク質の量の約１０％未満となる前記第２のイオン交換媒体の容量を提供するように選択された量の前記第２のイオン交換媒体を含む、前記第２の分離モジュール
を含む、システム。

【請求項17】

前記分画モジュールと前記第１の分離モジュールとの間の流体経路内にウイルス不活化モジュールを含む、請求項１６に記載のシステム。

【請求項18】

前記第１のイオン交換媒体が陰イオン交換体であり、前記第２の陰イオン交換媒体が陽イオン交換体であり、前記標的タンパク質が免疫グロブリンＧである、請求項１６又は１７に記載のシステム。

【請求項19】

前記複数の夾雑物が、第ＸＩ因子、活性化第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、及び活性化第ＸＩＩ因子からなる群から選択される凝固因子を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項20】

前記溶液が血漿である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項21】

前記溶液が、血漿に適用された沈殿ステップに由来する上清又は沈殿物である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項22】

前記第１の出力と前記第１の分離モジュールとの間に挿入されたデプスフィルターをさらに含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項23】

前記デプスフィルターは、珪藻土を含むとともに、前記デプスフィルターを通過する物質の第ＸＩ因子又は第ＸＩＩ因子含有量を選択的に低下させるように選択される、請求項２２に記載のシステム。

【請求項24】

前記デプスフィルターはパーライトを含まない、請求項２３に記載のシステム。

【請求項25】

前記溶液の体積が少なくとも５００Ｌである、請求項１６～２４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項26】

標的タンパク質及び複数の夾雑物を含む溶液から前記標的タンパク質を単離する方法であって、
前記溶液に塩を添加することで、前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第１の部分を含む上清と、沈殿物とを生成すること、
前記上清を、第１の極性の第１の電荷を有する第１のイオン交換媒体に適用することで、前記複数の夾雑物の第２の部分を含む第１の結合画分と、前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第３の部分を含む第１のフロースルーとを生成すること、及び、
前記第１のフロースルーを、前記第１の極性とは反対の第２の極性の第２の電荷を有する第２のイオン交換媒体に適用することで、前記複数の夾雑物の第３の部分を含む第２の結合画分と、前記標的タンパク質を含む第２のフロースルーとを生成すること
を含み、
前記第２の交換媒体の容量は、前記第２のイオン交換媒体を使用したイオン交換中に失われる前記標的タンパク質が前記溶液中の前記標的タンパク質の量の約１０％未満となるように選択される方法。

【請求項27】

前記溶液が血漿である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記溶液が分画ステップの産物である、請求項２６又は２７に記載の方法。

【請求項29】

前記塩がクエン酸塩又は酢酸塩である、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記第１の交換媒体が、粒子、ビーズ、又はフィルターとして構成されている、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記第２のイオン交換媒体がフィルターとして構成されている、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記上清にカプリル酸塩を添加することをさらに含む、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

カプリル酸塩の添加後に固体を除去することを含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

固体を除去することが、珪藻土を含むデプスフィルターの使用を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記デプスフィルターはパーライトを含まない、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記タンパク質の収率は少なくとも７０％である、請求項２６～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記沈殿物から少なくとも１つの追加のタンパク質を回収することを含む、請求項２６～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記溶液の体積が少なくとも５００Ｌである、請求項２６～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

標的タンパク質及び複数の夾雑物を含む溶液から前記標的タンパク質を単離するためのシステムであって、
前記血液製剤を受け取り塩分画ステップを行うように構成された分画モジュールであって、前記塩分画ステップは、上清及び沈殿物を生成し、前記上清を前記沈殿物から分離し、前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第１の部分を含む前記上清を第１の出力として提供するものである、前記分画モジュール、
第１の極性の第１の電荷を有する第１のイオン交換媒体を含むとともに前記第１の出力に連通する第１の分離モジュールであって、前記第１の分離モジュールはフロースルー画分を含む第２の出力を提供するように構成されており、前記フロースルー画分は前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第２の部分を含むものである、前記第１の分離モジュール、及び、
前記第１の極性とは反対の第２の極性の第２の電荷を有する第２の交換媒体を含む第２の分離モジュールであって、前記第２の分離モジュールは、前記複数の夾雑物の第３の部分を保持し、前記標的タンパク質を含む第３の出力を提供するように構成されており、前記第２の分離モジュールは、前記第２のイオン交換媒体でのクロマトグラフィーで失われる前記標的タンパク質が前記溶液中の前記標的タンパク質の量の約３％未満となる前記第２のイオン交換媒体の容量を提供するように選択された量の前記第２のイオン交換媒体を含む、前記第２の分離モジュール
を含む、システム。

【請求項40】

前記分画モジュールと前記第１の分離モジュールとの間の流体経路内にウイルス不活化モジュールを含む、請求項３９に記載のシステム。

【請求項41】

前記溶液が血漿である、請求項３９又は４０に記載のシステム。

【請求項42】

前記溶液が、血漿に適用された分画ステップに由来する上清又は沈殿物である、請求項３９又は４０に記載のシステム。

【請求項43】

前記溶液の体積が少なくとも５００Ｌである、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項44】

免疫グロブリンＧを単離する方法であって、
複数のＩｇＧサブクラスを含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含む水溶液に、少なくとも１０重量％までの濃度のクエン酸を添加することにより、第１の上清及び第１の沈殿物を生成すること、
前記第１の上清を前記第１の沈殿物から分離すること、
前記第１の上清に、少なくとも２２重量％の濃度までクエン酸ナトリウムを添加することにより、第２の上清及び第２の沈殿物を生成すること、
前記第２の上清を前記第２の沈殿物から分離すること、
前記第２の沈殿物を溶解させることで溶解した第２の沈殿物を生成すること、
前記溶解した第２の沈殿物の導電率を１ｍＳ～１０ｍＳ（７ｍＳよりも５ｍＳ～１０ｍＳに調整して、希釈タンパク質溶液を形成すること、
前記希釈タンパク質溶液を、陰イオン交換媒体を含む第１のイオン交換カラムに適用することで第１のフロースルーを生成すること、及び、
前記第１のフロースルーを、陰イオン交換媒体を含む第２のイオン交換カラムに適用することで、免疫グロブリンＧ調製物を含む第２のフロースルーを生成することであって、前記第２のフロースルーは２つ以上の免疫グロブリンＧサブクラスの少なくとも部分的な分離を提供すること、及び、前記免疫グロブリンＧ調製物は少なくとも８５重量％の純度を有すること
を含む方法。

【請求項45】

前記溶解した第２の沈殿物に脂肪酸を添加することで懸濁液を形成することを含み、前記脂肪酸は炭素数４～１０の炭素鎖を含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記溶解した第２の沈殿物をデプスフィルターに適用することを含む、請求項４４又は４５に記載の方法。

【請求項47】

前記溶解した第２の沈殿物に存在する凝固因子の活性化を回避するために前記デプスフィルターの組成及びサイズを選択することを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

導電率の調整はバッファー交換によっては行われない、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記陰イオン交換媒体は第四級アミンを含む、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

免疫グロブリンを含有する前記第２のフロースルーを、ＩｇＧが陽イオン交換媒体に結合する条件下で陽イオン交換媒体に適用すること、
陽イオン交換媒体を洗浄すること、及び
結合したＩｇＧを前記陽イオン交換媒体から溶出すること
を含む、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記陽イオン交換媒体がカルボン酸基を含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記第１のイオン交換カラム及び前記第２のイオン交換カラムが、流体流路によって互いに直列に接続されている、請求項４４～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記第１のフロースルーが、前記第２のイオン交換カラムに適用される前に収集及びプールされる、請求項４４～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記水溶液の体積が少なくとも５００Ｌである、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

少なくとも４０ｍｇ／ｍＬの濃度のイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）であって、９５％を超える純度を有し、かつクロマトグラフィー媒体から溶出されたものではない前記ＩｇＧ、及び
１０μｇ／ｍＬ未満の濃度のイムノグロブリンＡ
を含む医薬組成物。

【請求項56】

活性化第ＸＩ因子の含有量が１ｍＵ／ｍＬ未満である、請求項５５に記載の医薬組成物。

【請求項57】

第ＸＩＩ因子の含有量が０．１μｇ／ｍＬ未満である、請求項５５又は５６に記載の医薬組成物。

【請求項58】

ＩｇＧが少なくとも２Ｌの血漿から単離される、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項59】

治療用タンパク質の忍容性を向上させ、及び点滴速度を高める方法であって、
前記治療用タンパク質を、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法によって単離することであって、前記治療用タンパク質は少なくとも９５％の純度を有し、かつ変性条件にさらされていないものであること、及び
前記治療用タンパク質を点滴に提供すること
を含む方法。

【請求項60】

前記治療用タンパク質がＩｇＧである、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

治療用タンパク質の忍容性を向上させ、及び点滴速度を高める方法であって、
前記治療用タンパク質を、請求項２６～３８のいずれか一項に記載の方法によって単離することであって、前記治療用タンパク質は少なくとも９５％の純度を有し、かつ変性条件にさらされていないものであること、及び
前記治療用タンパク質を点滴に提供すること
を含む方法。

【請求項62】

前記治療用タンパク質がＩｇＧである、請求項６１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書におけるすべての参照された外部資料は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる参考文献における用語の定義又は使用が、本明細書に提供されるその用語の定義と一致しない、又は矛盾する場合、本明細書に提供されるその用語の定義が優先されるものとみなされる。

【0002】

発明の分野
本発明の分野は、特に血清及び／又は血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の単離である。

【背景技術】

【0003】

背景技術の説明には、本発明を理解するのに役立ち得る情報が含まれる。ここで提供される情報が先行技術であること、又は現在請求されている発明に関連していること、あるいは具体的又は黙示的に参照されている出版物が先行技術であることを自認するものではない。

【0004】

免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、原発性免疫不全症やその他の様々な免疫疾患の治療のためにヒトの血漿から調製されるタンパク質産物である。さらに、ＩｇＧは、病原体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）の除去の促進、及び感染の予防又は治療のための受動免疫伝達に使用できる。７０年以上にわたり、ＩｇＧはコーン（Ｃｏｈｎ）プロセスで製造されてきた。コーンプロセスでは、温度、ｐＨ、エタノール濃度、イオン強度、及びタンパク質濃度を変化させながら、血漿タンパク質を、エタノールにおけるその溶解度の違いに基づいて分離又は分画する。市販の血漿分別装置によるコーンプロセスからの全体的なＩｇＧ収率は一般に開示されていないが、最新のコーンプロセスでは、達成される収率は出発物質中に存在するＩｇＧのわずか約５０～６０％であると広く考えられている。さらに、このプロセスが完了するまでに約７～１０日かかると認識されている。

【0005】

Ｚｕｒｌｏらの特許文献１は、クエン酸塩を使用した血漿の連続分画を利用することでＩｇＧを含む沈殿物を得るＩｇＧの単離方法を記載している。溶解及びバッファー交換の後に得られるＩｇＧが豊富な溶液をイオン交換クロマトグラフィーで処理することで、ＩｇＧを含む溶出液を生成する。この溶出画分をさらに陰イオン交換クロマトグラフィーにかける。残念ながら、この技術をイオン交換ステップに適したバッファーへのバッファー交換に利用する場合、このプロセスはダイアフィルトレーション膜の急速なファウリングを生じる可能性がある。そのため、ダイアフィルトレーションを適用できる規模が制限される。さらに、ＩｇＧの結合とその後のイオン交換媒体からの溶出でのタンパク質の損失は避けられない。

【0006】

したがって、高収率及び高純度でＩｇＧを単離するための、迅速で効率的かつスケーラブルな方法が依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許第７，８７９，３３１号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の主題は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）又は他のタンパク質（例えば、アルブミン、ＡＡＴ）の高純度かつ高収率での単離を提供する組成物、方法、及びシステムを提供する。そのような方法は、ＩｇＧがフロースルー画分に留まる連続的なイオン交換ステップを利用することで、溶出ステップの必要性を回避する。従来の結合、洗浄、及び溶出ステップを回避することで、処理及びスケールアッププロセスが簡素化され、同時に収率も向上する。さらに、非ＩｇＧタンパク質を、プロセスの様々な廃棄物の流れ（イオン交換ステップからの結合画分など）から単離できる。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の概念の一実施形態は、溶液（例えば、血漿、分離ステップの産物）に塩（クエン酸塩又は酢酸塩など）を添加することで上清及び沈殿物を生成すること、前記沈殿物を水溶液に溶解することで前記タンパク質及び少なくとも１つの夾雑物を含む溶解した沈殿物を生成すること、前記溶解した沈殿物を陰イオン交換媒体に適用することで第１の結合画分及び第１のフロースルー（第１のフロースルーは前記タンパク質及び夾雑物を含む）を生成すること、及び、前記タンパク質及び前記夾雑物の両方と結合できる陽イオン交換媒体に第１のフロースルーを適用することで、前記タンパク質を含む第２のフロースルー及び前記夾雑物を含む第２の結合画分を生成することによって、その溶液からタンパク質（例えば、ＩｇＧ）を単離する方法である。そのような方法では、陽イオン交換媒体の容量は、陽イオン交換ステップ中に失われる前記タンパク質が、前記溶液中の前記タンパク質の量の約３％未満（分かっている範囲？？？３～１０％）となるように選択される。そのような実施形態のいくつかでは、前記タンパク質は免疫グロブリンＧであり、前記夾雑物は第ＸＩ因子又は活性化第ＸＩ因子であり得る。そのような方法では、陽イオン交換媒体は粒子、ビーズ、又はフィルターとして提供され得る。そのような実施形態のいくつかでは、カプリル酸塩を前記溶解した沈殿物に添加し、続いて固体を除去するステップを含むことができる。そのような固体除去は、第ＸＩ因子及び／又は第ＸＩＩ因子を保持するように選択されたデプスフィルター、例えば珪藻土を含むデプスフィルターを使用して達成することができる。そのようなデプスフィルターはパーライトを除外することができる。そのような方法からのタンパク質の収率は、（出発タンパク質溶液中のタンパク質の量に対して）７０％以上であり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のタンパク質が、塩添加ステップからの上清から回収される。

【0010】

本発明の概念の別の実施形態は、溶液（例えば、血漿、又は血漿から得られる画分）からタンパク質（例えば、ＩｇＧ）を単離するためのシステムである。そのようなシステムは、前記溶液を受け取り、上清と沈殿物を生成し、上清を沈殿物から分離し、沈殿物を第１の出力として提供する塩分画を行うように構成された分画モジュールを含む。それはまた、陰イオン交換媒体を含むとともに第１の出力に接続され、及びフロースルー画分（前記タンパク質及び少なくとも１つの夾雑物を含む）用の第２の出力を有する第１の分離モジュールを含む。前記夾雑物（例えば、第ＸＩ因子及び／又は活性化第ＸＩ因子）と結合する陽イオン交換媒体を含み、かつ前記タンパク質を含む第２のフロースルー画分用の第３の出力を有する第２の分離モジュールが提供される。この第２の分離モジュールは、陽イオン交換ステップ中に失われるのが、血液製剤中の前記タンパク質の量の３％未満（範囲３～１０％）となるような陽イオン交換能力を提供する量の陽イオン交換媒体を含む。そのようなシステムは、分画モジュールと第１の分離モジュールとの間の流体経路内にウイルス不活化モジュールを含むことができる。いくつかの実施形態では、デプスフィルターが第１の出力と第１の分離モジュールとの間に挿入される。そのようなデプスフィルターは、第ＸＩ因子及び／又は第ＸＩＩ因子を保持するように選択することができ、珪藻土を含むことができる。そのような実施形態のいくつかでは、デプスフィルターはパーライトを除外することができる。

【0011】

本発明の概念の別の実施形態は、塩（例えば、クエン酸塩又は酢酸塩）を溶液（例えば、血漿又は単離ステップの生成物）に添加することで上清及び沈殿物（前記上清は前記タンパク質及び少なくとも１つの夾雑物を含む）を生成すること、前記上清を陰イオン交換媒体に適用することで第１の結合画分及び第１のフロースルー（第１のフロースルーは前記タンパク質及び夾雑物を含む）を生成すること、及び、第１のフロースルーを陽イオン交換媒体に適用することで、前記タンパク質を含む第２のフロースルー及び前記夾雑物を含む第２の結合画分を生成することによって、前記溶液からタンパク質（例えば、ＩｇＧ、アルブミン、ＡＡＴ）を単離するための方法である。陽イオン交換媒体の容量は、陽イオン交換中に失われるのが、前記溶液中の前記タンパク質の量の約３％未満（範囲３～１０％？？？）となるように選択される。陽イオン交換媒体は、粒子、ビーズ、又はフィルターとして提供され得る。そのような実施形態のいくつかでは、溶解された上清にカプリル酸塩を添加し、その後、得られた溶液から固体を除去することができる。そのような固体は、珪藻土を含むデプスフィルターを使用して除去できる。いくつかの実施形態では、パーライトはそのようなデプスフィルターから除外される。典型的には、前記タンパク質（例えば、ＩｇＧ）の収率は、（前記溶液中の前記タンパク質の量に対して）７０％以上である。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のタンパク質を沈殿物から回収することができる。

【0012】

本発明の概念の別の実施形態は、溶液（血漿又は血漿由来の画分など）からタンパク質（例えば、ＩｇＧ、アルブミン、ＡＡＴ）を単離するためのシステムであり、このシステムは、前記溶液を受け取り、塩分画ステップを行うことで上清及び沈殿物を生成するとともに前記上清を前記沈殿物から分離して前記上清を第１の出力に提供する分画モジュールを含む。このシステムはまた、陰イオン交換媒体を含む第１の分離モジュールを含み、第１の分離モジュールは、第１の出力を受け取り、フロースルー画分（前記タンパク質及び少なくとも１つの夾雑物を含む）を含む第２の出力を提供する。第２の出力は、第２の分離モジュールであって、前記夾雑物及び前記タンパク質と結合できる陽イオン交換媒体を含むとともに前記タンパク質を含む第２のフロースルー画分を含む第３の出力を提供する第２の分離モジュールに向けられる。第２の分離モジュールは、陽イオン交換ステップ中に失われるのが、第２の出力中の前記タンパク質の量の約３％未満（範囲３～１０％？？？）となるように選択された容量を提供する量の陽イオン交換媒体を含む。そのようなシステムは、分画モジュールと第１の分離モジュールとの間の流体経路内にウイルス不活化モジュールを含むことができる。

【0013】

本発明の概念の別の実施形態は、２つ以上のＩｇＧサブクラスに存在する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含む水溶液にクエン酸塩を添加することで少なくとも１１重量％の濃度にし、第１の上清及び第１の沈殿物を生成することにより、免疫グロブリンＧを単離する方法である。第１の上清を第１の沈殿物から分離し、追加のクエン酸塩を第１の上清に２２～２６重量％の濃度まで添加することにより、第２の上清及び第２の沈殿物を生成する。第２の沈殿物を第２の上清から分離し、溶解させる。溶解した第２の沈殿物の導電率を５ｍＳ～１０ｍＳ（例えば、約７ｍＳ）に調整して、希釈タンパク質溶液を形成する。この希釈されたタンパク質溶液を、陰イオン交換媒体（例えば、第四級アミンを含むもの）を含む第１のイオン交換カラムに適用して第１のフロースルーを生成し、次にこれを陰イオン交換媒体を含む第２のイオン交換カラムに適用して第２のフロースルーを生成する。第１及び第２の陰イオン交換カラムは直列に配置することができる。あるいは、第１のフロースルーを集めてプールしてから第２の陰イオン交換カラムに適用することもできる。この第２のフロースルーはＩｇＧを含み、また、２つ以上の免疫グロブリンクラス又はＩｇＧサブクラスの少なくとも部分的な分離も提供する。得られたＩｇＧは少なくとも約８５重量％の純度を有する。そのような実施形態のいくつかでは、溶解した第２の沈殿物に脂肪酸（例えば、炭素数４～１０の炭素鎖を有する脂肪酸）を添加することで懸濁液を形成し、次いでこれをデプスフィルターに適用することができる。デプスフィルターの組成及びサイズは、溶解した第２の沈殿物中に存在する凝固因子の活性化を回避し、フィルターを通過する物質中の凝固因子の濃度を低下させるように選択される。そのような実施形態のいくつかでは、第２のフロースルー画分を、ＩｇＧが陽イオン交換媒体に結合し、そこに結合したままであるような条件下で陽イオン交換媒体（例えば、スルホン酸基及び／又はカルボン酸基を含むもの）に適用することによってさらに処理することができる。次いで、陽イオン交換媒体を洗浄し、その後、ＩｇＧを陽イオン交換媒体から溶出させる。

【0014】

本発明の概念の別の実施形態は、少なくとも４０ｍｇ／ｍＬの濃度の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）及び２μｇ／ｍＬ未満の濃度の免疫グロブリンＡとを含み、前記ＩｇＧが９８％超の純度を有し、かつクロマトグラフィー媒体から溶出されたものではない医薬組成物である。いくつかの実施形態では、そのような医薬組成物は、１ｍＵ／ｍＬ未満の活性化第ＸＩ因子を含む。いくつかの実施形態では、そのような医薬組成物は、０．１μｇ／ｍＬ未満の第ＸＩＩ因子を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物に含有されるＩｇＧは、少なくとも２Ｌの血漿から単離される。

【0015】

本発明の主題の様々な目的、特徴、態様及び利点は、添付の図面とともに、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、２つの陰イオン交換ステップを連続して利用する本発明の概念の例示的なプロセスを概略的に示す。

【図2】図２は、２つの陰イオン交換ステップを連続して利用する本発明の概念の例示的なプロセスを概略的に示す。

【図3】図３は、２つの陰イオン交換ステップを連続して使用する、血液製剤からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の単離に適用される本発明の概念の例示的なプロセスを概略的に示す。

【図4】図４は、還元条件下、様々なクエン酸濃度での第２の沈殿ステップ中に生成された上清及び沈殿物に対して行ったＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。矢印は、還元条件下でのＩｇＧの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を示す。

【図5】図５は、ＩｇＧ沈殿試験の結果及び二次沈殿ＩｇＧ回収率の平均（Ｎ＝３）を示す。

【図6】図６は、Ｑ－セファロース（商標）カラムブレークスルー試験から得られたサンプルのビス－トリスＳＤＳ－ＰＡＧＥの典型的な結果を示す。

【図7】図７は、様々なイオン交換カラム配置から得られたサンプルの還元ビス－トリスＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。ＩｇＧ産物は様々なイオン交換クロマトグラフィーのカラム配置に由来した。

【図8】図８は、連続する２Ｌ Ｑ－セファロース（商標）カラムで実施された２Ｌパイロットスケール法のクロマトグラフィー中に得られた典型的なＡ２８０測定値を示す。個々の画分は垂直線で示されている。

【図9】図９は、本発明の概念の２Ｌスケールプロセスのクロマトグラフィー中に得られたサンプルの非還元ビス－トリスＳＤＳ－ＰＡＧＥの典型的な結果を示す。レーンのラベルは、図８のラベルされた画分に対応する。「最終プール」は画分１～５で構成される。

【図10】図１０は、４つの市販の静脈内ＩｇＧ製品及び本発明の概念の方法によって製造された３つの２Ｌスケールバッチからの最終産物の非還元ビス－トリスＳＤＳ－ＰＡＧＥの典型的な結果を示す。１レーン当たり５μｇのタンパク質をロードした。

【図11】図１１は、陰イオン交換及び最小限の陽イオン交換を利用する本発明の概念の例示的なプロセスを概略的に示す。

【図12】図１２は、陰イオン交換及び制限容量陽イオン交換を利用する本発明の概念の例示的なプロセスを概略的に示す。

【図13】図１３は、陰イオン交換及び制限容量陽イオン交換を使用する、血液製剤からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の単離に適用される本発明の概念の例示的なプロセスを概略的に示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

詳細な説明
本発明者らは、ＦＤＡが市販製品に対して設定した純度基準を満たしながら、約７５％～８０％又はそれ以上のＩｇＧ収率を提供できる商業的に拡張可能な方法を開発した。これは、現在のコーンプロセスのＩｇＧ収率５０～６０％に劣らない。このプロセスはまた、最終産物における第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、及び／又はＩｇＡによる夾雑物を劇的に減少させ、そのような夾雑物を現在では検出できないレベルまで減少させることができる。

【0018】

開示された技術は、プロセススケールでの高純度及び高収率での免疫グロブリンＧの迅速な提供を含む、多くの有利な技術的効果を提供することが理解される。
本発明者らの方法は、アルコールの使用を排除し、変性条件（例えば、極端なｐＨ変化など）を最小限に抑えるため、より自然なＩｇＧを生成する。さらに、特許請求の範囲に記載の方法では、ＩｇＧはクロマトグラフィー媒体に結合しその後溶出されるのではない。これにより、収率が向上し、変性の可能性が低下すると同時に、単離プロセスが簡素化され、処理時間が大幅に短縮されるという利点がある。そのため、これらの方法は現在のＩｇＧ単離方法とは異なり（そしてはるかにコスト効率が高く）、また、ＩｇＧ産物を、より高いタンパク質安定性で、より長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期で、より速い点滴速度で、より向上した患者忍容性で、及びより低下した免疫原性で提供できる。コーンプロセスに依存する方法では完了するまでに約７～１０日かかるのに対し、本発明者らの製造方法は約２日である。この新しい方法の製造プラントの建設及び操業コストは、既存のプラントのコストの数分の一で済むと予測されており、同時に他の治療用タンパク質も活性型及び天然型で、より高収率で生産される。さらに、可燃性／爆発性の化学物質は使用されないため、設備投資が削減され、作業者の安全性が向上し、環境への悪影響が軽減される。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の単離が本明細書で論じられているが、本発明者らは、商業的価値のある他の血清タンパク質（例えば、ＡＡＴ、アルブミン）も様々な中間プロセスの流れ（例えば、沈殿ステップからの上清又は沈殿物、クロマトグラフィー媒体に結合した物質など）から単離され得ることを意図していることが理解される。

【0019】

本発明の概念のいくつかの実施形態は、同じイオン交換効果（例えば、陰イオン交換）を有する２つ以上のイオン交換クロマトグラフィーステップを連続して利用し、ここでのバッファー条件及びカラム結合容量は、各イオン交換クロマトグラフィーステップのフロースルー画分に標的タンパク質（例えば、ＩｇＧ）を提供するために選択又は最適化される。そのようなイオン交換ステップは、同様の容量の媒体（例えば、体積が同様又は同一である同じイオン交換媒体）を使用して実施することができる。あるいは、いくつかの実施形態では、同様のイオン交換機能を有するが容量が異なるイオン交換媒体（例えば、体積が異なる２つの同じイオン交換媒体）を使用することができる。そのようなイオン交換媒体は、第１の体積又は量のイオン交換媒体のフロースルー画分が第２の体積又は量のイオン交換媒体の入口に向けられるように配置することができる。あるいは、いくつかの実施形態では、第１の体積又は量のイオン交換媒体のフロースルー画分のすべて又は一部を、第２の体積又は量のイオン交換媒体に適用する前にプールすることができる。

【0020】

本発明の概念の実施形態は、陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかを利用することができ、バッファー条件及びカラム結合容量は、各クロマトグラフィーステップのフロースルー画分に標的タンパク質（例えば、ＩｇＧ）を提供するように選択又は最適化される。

【0021】

本発明の概念による方法の一例が図１に示されている。この状況では、血液製剤は、血清、血漿、脱クリオ（ｃｒｙｏ－ｐｏｏｒ）血漿、クリオプレシピテートが再溶解された脱クリオ血漿、又はそのような材料に適用される分離ステップから得られる画分（例えば、クロマトグラフィー溶出液、クロマトグラフィーフロースルー、上清、又は溶解した沈殿物）であり得ることが理解される。また、血液製剤が具体的に引用されているが、そのような方法は、目的のタンパク質を含む任意の溶液（例えば、細胞培養培地、細胞培養からの細胞の溶解物、細菌溶解物、溶媒和封入体など）に適用できることも理解される。図１に示す方法では、分画プロセスからの沈殿物は、イオン交換媒体に適用する前に溶解される。

【0022】

いくつかの実施形態では、そのような再溶解物質は、クロマトグラフィー媒体を詰まらせる可能性のある残留未溶解物質又は沈殿物質を除去するために、例えば１つ以上のフィルターを通すことによって清澄化され得る。いくつかの実施形態では、そのような再溶解沈殿物のバッファー組成は、イオン交換媒体に適用する前に変更することができる。これは、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアリシス、ダイアフィルトレーション、及び／又は再沈殿（例えば、ＰＥＧを使用）及びそれに続く再溶解などによるバッファー交換（すなわち、タンパク質含有溶液から塩を除去するプロセス）によって達成できる。あるいは、いくつかの実施形態では、そのような再溶解した沈殿物は、所望の浸透圧及び／又は導電率（例えば、２～１０ｍＳ）が達成されるまで、希釈することができる（これは、再溶解した沈殿物中に元々存在していた塩を保持する）。第１のイオン交換ステップからのフロースルー画分は、同様の電荷特性（すなわち、陰イオン交換、陽イオン交換）を有するイオン交換媒体を利用する第２のイオン交換ステップに送られ、目的のタンパク質が、この第２のイオン交換ステップのフロースルー画分において高収率（例えば、出発物質中の目的のタンパク質の量に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％を超える）かつ高純度（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％を超える）で回収される。本発明者らは、いくつかの実施形態では、２つのイオン交換カラムの代わりに単一の大きいイオン交換カラムを使用できることを想定しているが、そのようなアプローチは必然的に操作の規模を制限することになる。イオン交換ステップは陰イオン交換ステップとして示されているが、イオン交換ステップが陽イオン交換媒体を使用して実施される実施形態も想定され、ＩｇＧ以外のタンパク質の単離に適用することができる。

【0023】

本発明の概念の別の実施形態が図２に示されている。ここでは、第１のイオン交換ステップが、分画ステップから得られた上清に対して実施される。いくつかの実施形態では、そのような上清は、クロマトグラフィー媒体を詰まらせる可能性のある残留粒子や沈殿物質を除去するために、例えば１つ以上のフィルターを通過させることによって清澄化され得る。いくつかの実施形態では、そのような上清のバッファー組成は、イオン交換媒体に適用する前に変更することができる。これは、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアリシス、ダイアフィルトレーション、及び／又は沈殿（例えば、ＰＥＧを使用）及びそれに続く溶解などによるバッファー交換（すなわち、タンパク質含有溶液から塩を除去するプロセス）によって達成できる。あるいは、いくつかの実施形態では、そのような上清は、所望の浸透圧及び／又は導電率（例えば、２～１０ｍＳ）が達成されるまで、希釈することができる（これは、上清中に元々存在していた塩を保持する）。第１のイオン交換ステップからのフロースルー画分は、同様の電荷特性（すなわち、陰イオン交換、陽イオン交換）を有するイオン交換媒体を利用する第２のイオン交換ステップに送られ、目的のタンパク質が、この第２のイオン交換ステップのフロースルー画分において高収率（例えば、出発物質中の目的のタンパク質の量に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％を超える）かつ高純度（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％を超える）で回収される。

【0024】

また、図１及び２では血液製剤が具体的に引用されているが、そのような方法は、目的のタンパク質を含む任意の溶液（例えば、細胞培養培地、細胞培養からの細胞の溶解物、細菌溶解物、溶媒和封入体など）に適用可能であることも理解される。イオン交換ステップは陰イオン交換ステップとして示されているが、イオン交換ステップが陽イオン交換媒体を使用して実施される実施形態もまた想定される。そのような方法は、例えば、ＩｇＧ以外のタンパク質の単離に使用することができる。

【0025】

本発明者らは、本発明の概念の方法が血漿からのＩｇＧの単離に特に有用であることを発見したが、ＩｇＧを含む他の溶液（例えば、細胞培養培地、細胞溶解物、溶解した封入体、他の体液など）への適用も想定される。本願の文脈内では、血漿には、採取したての血清、採取したての血漿、凍結乾燥血漿を再構成したもの、冷蔵血漿、凍結血漿、回収した血漿（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｐｌａｓｍａ）、脱クリオ血漿、クリオプレシピテートが再溶解された脱クリオ血漿、及びこれらの２つ以上の混合物が含まれるものとみなされる。そのような血漿は、例えば、血液又は血漿収集センターからプールされた材料として入手することができる。血漿からＩｇＧを単離するための本発明の概念の方法の例を図３に示す。

【0026】

最初の２つのステップについて、本発明者らは、２つの沈殿ステップに幅広い塩濃度を用いて塩分画プロセスを変更及び／又は最適化し、最適濃度（例えば、第１の塩沈殿では約１１％及び第２の塩沈殿では約２６％）を決定し、また、不要なタンパク質を最小限に抑えながらＩｇＧ収率を最大化した。クエン酸塩又は酢酸塩が好ましいが、任意の適切な塩を使用することができる。そのような塩は、塩溶液として（例えば、計算量で５０重量％の塩溶液として）、及び／又は乾燥形態で（例えば、粉末又は結晶固体として）迅速に添加することができる。示されているように、第１の沈殿ステップではＩｇＧに富んだ上清が生成され、第２の沈殿ステップではＩｇＧに富んだ沈殿又はペーストが生成される。このＩｇＧに富んだ沈殿物は、イオン交換ステップの前に（例えば水に）溶解される。そのような実施形態では、バッファー交換ステップ（例えば、ダイアリシス、ダイアフィルトレーション、限外濾過とそれに続く希釈、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を、イオン交換ステップの前に実施することができる。あるいは、再溶解した沈殿物を、所望の導電率（例えば、２～１０ｍＳ）又はイオン強度が達成されるまで希釈することもできる。バッファー交換ステップ中に沈殿が発生する場合があること、及び、最初のイオン交換ステップの前にそのような沈殿した物質を除去するために追加の濾過ステップ（例えば、深層濾過、又は深層濾過とそれに続く清澄化又は研磨濾過ステップ）を実施できることが理解される。図３に示すように、本発明の概念の大規模ＩｇＧプロセスにおいて、ＩｇＧは、第２の陰イオン交換ステップからのフロースルー（すなわち、非結合）画分において回収され得る。

【0027】

いくつかの実施形態では、ウイルス不活化ステップが、イオン交換ステップの前に、溶解したＩｇＧに富む沈殿物に適用される。例えば、エンベロープウイルスを不活化するために、ｐＨを５．７に下げ、カプリル酸塩を添加することができる。そのようなステップは重大なＩｇＧ損失に寄与するとは考えられず、カプリル酸塩はその後のイオン交換ステップで効果的に除去できる。

【0028】

従来のタンパク質精製プロセスでは、最終タンパク質産物の純度のために収率が犠牲になる。驚くべきことに、本明細書に記載の方法では、ＩｇＧは通常、高収率（出発物質中に存在するＩｇＧの７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％を超える）及び高純度（８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％を超える）の両方で回収される。

【0029】

実施例
沈殿剤としてクエン酸ナトリウムを使用する２回の沈殿ステップで、クリオプレシピテートに乏しい血漿からのＩｇＧの複数の塩分画を実施した。２リットルのテストバッチをパイロット施設で調製した。達成されたＩｇＧ収率は、第２の沈殿物（すなわち、第２の沈殿ステップから生じる沈殿物）では９０％であり、第２の上清（すなわち、第２の沈殿ステップから生じる上清）ではわずか３％であったが、２回目は、第２の沈殿物では９５％及び第２の上清ではわずか３％の収率が達成された。第２の上清に約３％のＩｇＧが同様に存在することは、塩分画プロセスが安定しており、血漿中の出発ＩｇＧの約９５％が得られることを示している。

【0030】

塩分画プロセスによるＩｇＧ収率及び純度の最適なプロトコルを開発するために、幅広いクエン酸ナトリウム濃度を調査した。脱クリオ血漿に最初の１１％クエン酸ナトリウム（ｗ／ｖ）で１時間沈殿させるステップを行い、続いて４，５００×ｇで遠心分離した。得られた第１の上清１を２２％～２８％（ｗ／ｖ）のクエン酸ナトリウム濃度での２時間の第２のクエン酸ナトリウム沈殿ステップでさらに分画し、続いて４，５００×ｇで遠心分離した。第１の沈殿ステップからのペースト（すなわち、第１の沈殿物）及び第２の沈殿ステップからのペースト（すなわち、第２の沈殿物）を、湿潤ペースト１グラム当たり水１０ｍＬの濃度で注射用水に溶解した。分画プロセス中、温度（２～８℃）及びｐＨ（７．０±０．１）の両方を維持した。クエン酸濃度は、周囲温度（２０～２５℃）で５０％ｗ／ｖクエン酸ナトリウムを添加することによって調整した。

【0031】

総タンパク質及びＩｇＧ含有量の分析は、主に、それぞれＡ_２８０測定及び総ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって行った。総ＩｇＧ ＥＬＩＳＡの測定精度は、脱クリオ血漿などの複雑な溶液では正確性が低くなる可能性があるが、これは純度の高いＩｇＧを使用するプロセスステップで相対的なＩｇＧ濃度を測定するのには適した方法である。

【0032】

最初の１１％（ｗ／ｖ）クエン酸塩沈殿ステップでは典型的に、第１の上清中のＩｇＧの９８％回収率が見られた（データは示されていない）。表１に示すように、第２の沈殿ステップからの第２の沈殿物におけるＩｇＧ収率は、クエン酸濃度が２２％から２４％（ｗ／ｖ）に上昇するにつれて上昇し、その後、クエン酸濃度が２６％及び２８％ｗ／ｖになると頭打ちになる（第１の上清からの約８５％のＩｇＧ回収率）。これらのデータは、対応する第２の上清で観察されたＩｇＧ濃度が逆の傾向を示すことによってさらに裏付けられる。

【0033】

【表1】

【0034】

第２の沈殿物重量が増加してもそれに対応するＩｇＧ収率の増加が伴っていないことは、２６％（ｗ／ｖ）クエン酸塩を超える沈殿物に望ましくない夾雑タンパク質が蓄積することを示している。これはＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認された（図４）。図４は、脱クリオ血漿に適用された分画プロセスの還元条件下で行われた４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果を示す。矢印は、ＩｇＧの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を示す。ゲルには、レーンごとに２０Ａ_２８０単位のタンパク質をロードした。示されるように、ＩｇＧは第１の上清（Ｓ１）及び第２の沈殿（ペレット２）で明らかであり、第２の沈殿ステップにおいて高い（例えば、２６％、２８％ｗ／ｖ）クエン酸濃度では、第２の沈殿物で夾雑タンパク質の増加が観察される。

【0035】

沈殿ステップの安定性は、同じ脱クリオ血漿プールのアリコートを１１～１３％（ｗ／ｖ）クエン酸塩、次に２２～２６％（ｗ／ｖ）クエン酸塩で分画することによって特徴付けられた。得られた上清及び沈殿物中のＩｇＧ収率をＥＬＩＳＡによって分析した。得られた平均ＩｇＧレベルを図５に示す。図５は、第１の沈殿クエン酸濃度及び第２の沈殿クエン酸濃度の様々なペアで得られた平均結果のヒストグラムを示す（例えば、「１１－２２％」は、第１の沈殿ステップでは１１％ｗ／ｖクエン酸塩及び第２の沈殿ステップでは２２％ｗ／ｖクエン酸塩を示す）。示されるように、第１の沈殿ステップでは１１％クエン酸塩（ｗ／ｖ）及び第２の沈殿ステップでは２４％～２６％（ｗ／ｖ）クエン酸塩１１－２４％が、最大ＩｇＧ収率を達成するのに最適であった。１２又は１３％（ｗ／ｖ）クエン酸塩での第１の沈殿では、第２の沈殿ステップを様々な濃度で行った場合、ＩｇＧ収率が比較的低いように見えた。

【0036】

初期沈殿ステップの安定性をさらに特徴付けるために、２Ｌ体積のプールされた脱クリオ血漿を４つ処理した。それぞれの処理では、初期沈殿に１１％（ｗ／ｖ）クエン酸濃度を使用し、第２の沈殿ステップに２６％（ｗ／ｖ）クエン酸濃度を使用した。これらのそれぞれからの第２の沈殿物を注射用水に溶解した（湿潤ペースト１ｇ当たり１０ｍＬ）。ＩｇＧ濃度を比濁法により測定した。結果を表２に示す。

【0037】

【表2】

【0038】

示されるように、比濁分析データは非常に一貫しており、出発脱クリオ血漿から最初の１１％沈殿ステップ後に得られた第１の上清中のＩｇＧの平均回収率が９８．１％であることを示している。このデータは、第１の沈殿物にＩｇＧが欠乏している（＜１％）ことと一致する。Ｐ２における４つのバッチにわたる第２の沈殿物における最終ＩｇＧ収率は９０．３％ＩｇＧであり、第２の上清中に残存するＩｇＧの平均値は６．２％であった。本発明者らは、遠心分離中に一部のＩｇＧ含有沈殿物が収集されなかったため、より大規模な遠心分離により第２の沈殿物におけるＩｇＧの回収率は約９５％以上になり得ると考えている。

【0039】

そのような第２の沈殿物を注射用水に１０ｍＬ／ｇ湿潤ペーストで溶解すると、溶液が濁り及び／又は乳白色を呈する場合があることが分かった。本発明者らは、濁りは懸濁脂質及び不溶化不純物の結果である可能性が高いと考えている。小規模な研究では、次のイオン交換ステップの前に、バッファー交換（すなわち、ＩｇＧ含有溶液からの塩の除去）にダイアリシスを使用した。そのような沈殿した物質は、ダイアリシスされた物質をイオン交換媒体に適用する前に、詰まりを避けるために遠心分離又は濾過（例えば、デプスフィルターを使用）によって除去することができる。ダイアフィルトレーションの使用中に同様の沈殿が認められたため、ダイアフィルトレーションはイオン交換クロマトグラフィー前のバッファー交換には不適切であった。

【0040】

本発明者らは、スケールアップにおいて、再溶解した第２の沈殿物から沈殿する物質を除去するために深層濾過を使用すると、追加の非ＩｇＧタンパク質がイオン交換クロマトグラフィーに導入されることを発見した。小規模では、そのような非ＩｇＧタンパク質はダイアリシス／遠心分離プロセスで除去され、イオン交換カラムへのタンパク質負荷には寄与しなかった。

【0041】

陰イオン交換媒体の容量研究では、Ｑ－セファロース（商標）カラムでのブレークスルーは、樹脂１ｍＬあたり約１４Ａ_２８０単位で発生することが確認された。３５Ａ_２８０単位を２回（１４Ａ_２８０／ｍＬ）、５ｍＬのＱ－セファロース（商標）カラムに注入した後、高分子量の夾雑物が６２ｋＤａマーカーの上の数か所に現れ始め、３回目の３５Ａ_２８０単位注入（２１Ａ_２８０／ｍＬ）の後に顕著なアルブミン（約６０ｋＤａ）のブレークスルーが発生する。そのような研究の典型的な結果は、図６のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに示されている。

【0042】

図６は、Ｑ－セファロース（商標）カラムブレークスルー研究から得られたサンプルの還元ビス－トリスＳＤＳ－ＰＡＧＥページゲルを示す。５ｍＬ Ｑ－セファロース（商標）カラムに、ＤＬ１０デプスフィルターとＸＬＧフィルターをそれぞれ通過させた３５Ａ_２８０のＰ２物質を３回の注入により連続的にロードした。レーン１は分子量標準を含む。レーン２は、濾過された第２の沈殿物を含む。レーン３は、注入１後のフロースルー画分を含む（上記のとおり）。レーン４は、注入２後のフロースルー画分を含む。レーン５は、注入３後のフロースルー画分を含む。デプスフィルター処理した溶解した第２の沈殿物の３つのバッチにわたる平均±ＳＤタンパク質負荷は、２３，１６２±２，０００Ａ_２８０単位であった。これは、上限標準偏差及び１０％の安全マージンを満たすための、出発血漿１Ｌあたり少なくとも約１ＬのＱ－セファロースカラムサイズに相当する。

【0043】

通常、イオン交換クロマトグラフィーを使用したＩｇＧの単離では、ネガティブ選択（すなわち、ＩｇＧが結合しない）としての陰イオン交換を、ＩｇＧが結合し、結合したＩｇＧから夾雑物が洗浄された後に溶出されるポジティブセレクターとしての陽イオン交換と組み合わせて利用する。陽イオン交換クロマトグラフィーにおけるそのような結合、洗浄、及び溶出のステップは、そのようなアプローチのスケーラビリティを制限し、また、プロセス中にＩｇＧが損失する追加の機会も提供する。

【0044】

本発明者らは、別のクロマトグラフィーフレームワークを開発するために、図６に示すようなＱ－セファロース（商標）カラム容量に関する情報を使用した。溶解及び深層濾過した第２の沈殿物質を最初にＱ－セファロース（商標）（陰イオン交換体）カラム（１４Ａ_２８０／ｍＬ）で処理して物質のプールを生成し、これを様々な下流クロマトグラフィースキームに適用した。単一の５ｍＬ Ｑ－セファロース（商標）カラム操作からのフロースルーを表すそのようなプールされた物質の量を、続いて第２の５ｍＬ Ｑ－セファロース（商標）カラム、５ｍＬ ＤＥＡＥセファロース（商標）カラム、５ｍＬ ＣＭ－セファロース（商標）カラム、又は５ｍＬ ＣＭセファロース（商標）カラムに連結された５ｍＬ ＤＥＡＥセファロース（商標）カラムのそれぞれに適用した。連結されたＤＥＡＥ／ＣＭカラムの場合、ＣＭセファロース（商標）カラムの溶出前にＤＥＡＥセファロース（商標）カラムをＣＭセファロース（商標）カラムから分離した。図７は、様々なクロマトグラフィーカラムスキームから得られたＩｇＧ産物のビス－トリスＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを提供する。レーン１は分子量標準を含む。レーン２は、単一のＱ－セファロース（商標）カラムからの初期フロースルーを含む。レーン３は、ＣＭセファロース（商標）カラムからの溶出液を含む。レーンは、ＤＥＡＥセファロース（商標）カラムからのフロースルーを適用することで得られる物質と、このフロースルーをＣＭセファロース（商標）カラムに適用することで得られる溶出液を含む。レーン５は、ＤＥＡＥセファロース（商標）カラムからのフロースルーを含む。レーン６は、ＤＥＡＥセファロース（商標）カラムからの溶出液を含む。レーン７は、第２のＱ－セファロースカラムからのフロースルーを含む。レーン８は、第２のＱ－セファロース（商標）カラムからの溶出液を含む。矢印は、高分子量成分を除去した結果、より高純度の産物を生成した樹脂の組み合わせを示す。

【0045】

図７において矢印で示す材質をＬＣＭＳで分析することで、各カラムスキームで生成された相対ＩｇＧ純度を決定した。すべてのカラム配置の産物は同様の純度を有するように見える。

【0046】

２Ｌスケールの脱クリオ血漿と、直列に配置された２本の同様のサイズの２Ｌ Ｑ－セファロース（商標）カラムとを使用して、３回の完全な操作を行った。クロマトグラフィーはＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣ（商標）システムで実施した。これらのプロセスの最終条件は次のとおりである：２×２Ｌ Ｑ－セファロース（商標）カラム（１×Ａｘｉｃｈｒｏｍｅ（商標）１００／３００及び１×Ａｘｉｃｈｒｏｍｅ（商標）１４０／３００）を直列に結合し、２０ｍＭ ＮａＯＡＣ ｐＨ５．７で平衡化した。カラムに４５ｍＬ／分でロードし、５０ｍＬ／分で洗浄し、２Ｍ ＮａＣｌステップ（９５００ｍＬで実施）で溶出した。Ａ_２８０読み取り値に基づいて１リットルの画分を収集した。これらの条件下で、許容可能なＦＸＩａレベルの高純度ＩｇＧが得られ、この方法がスケーラブルであることが示された。濾過後の３つのバッチ（バッチＤ、Ｅ、及びＦ）の物理的特性を以下の表３に示す。

【0047】

【表3】

【0048】

総じて、クロマトグラフィーではすべての２Ｌスケールの方法が全く同じように行われ、プロファイルや分画収集に大きな違いはなかった。説明の目的で、バッチＥを代表例として選択した。産物の分画収集は、Ａ_２８０が５０ｍＡＵに達したときに開始し、吸光度が１２５ｍＡＵに低下したときに終了した。図８に示すように、主要なフロースルーピーク（画分１～５）は、驚くべきことに形状が均一ではなく、９００ｍＡＵ／ｍＬの最大Ａ_２８０で頂点に達する３～４つの異なる特徴を含んでいた。２つの小さな特徴（画分６、二相ピーク及び画分８の単一ピーク）がメインピークの後に観察された。溶出ピーク（溶出画分）は、主に形状が均一で、物質の複雑な尾部がある。図８に示すクロマトグラムにおいて、個々の画分は垂直バーで示される。

【0049】

図９は、バッチＥ Ｑ－セファロース（商標）／Ｑ－セファロース（商標）クロマトグラフィーから収集したそれぞれの画分を１レーン当たり１０Ａ_２８０ユニットでロードしたゲル上の非還元ビス－トリスＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。レーンラベルは、図８でラベルされた画分に対応する。「最終プール」は画分１～５のプールで構成されており、それぞれは純粋なＩｇＧ（１５０ｋＤａ）であると考えられる。画分５にわずかな余分なバンド（約２００ｋＤａ）が見られる。このバンドは明らかに、画分６に含まれる物質の二相ピークからの「にじみ」であり、ＩｇＧ種と混合された約２００ｋＤａのタンパク質種から構成されているようである。最終プール（画分１～５）は、＞９５％ＩｇＧであるとみられ、明らかな夾雑物は存在していないようである。

【0050】

法的規制により、ヒトでの使用のために製造されたヒト由来製品の生物学的処理には２つのウイルス不活化／除去ステップを含めることが必要となる場合がある。そのために、本発明の概念の方法は、第２の沈殿物に適用されるウイルス不活化ステップ、及び／又はイオン交換クロマトグラフィー後にウイルスを除去するためのナノフィルトレーションを含むことができる。

【0051】

２リットル規模の方法は、例えば、深層濾過の前にウイルス不活化のために室温で１時間２０ｍＭのカプリル酸ナトリウムでの処理を含むように修正することができる。溶解した第２の沈殿物にカプリル酸塩を添加すると、少量の白色の沈殿物が形成されることがある。表４は、Ｑ－セファロース（商標）クロマトグラフィーによる処理で得られたサンプルのカプリル酸含有量を示す。Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ（登録商標）ＤＬ１０深層濾過後、元のボーラスのカプリル酸塩の６３％が浄化されたサンプルで検出可能である。Ｐ２深層濾過後のサンプルの希釈がＳａｒｔｏｃｌｅａｒ（登録商標）ＸＬＧ滅菌フィルター後のサンプルで考慮される場合、この濾過ステップではカプリル酸塩の損失はない。残りのカプリル酸塩はすべてＱ－セファロース（商標）クロマトグラフィー中に除去され、このプロセスステップ後のＩｇＧ画分には検出可能なレベルのカプリル酸塩は観察されない。

【0052】

【表4】

【0053】

ウイルスの不活化に加えて、ウイルス除去（例えば、ナノフィルトレーションによる）をウイルス除去に適用することができる。例えば、ナノフィルトレーションを、本発明の概念の方法における２つのウイルス不活化／除去ステップのうちの２番目として適用することができる。ウイルス除去は、任意の適切なナノフィルター／ナノフィルトレーション装置及び／又は方法を使用して達成することができる。適切なナノフィルトレーション装置には、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）Ｍａｘ（商標）０．１μｍプレフィルターとその後のＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＨＣ（商標）０．０２μｍウイルス除去フィルターが含まれるが、これに限定されない。典型的なウイルス除去ステップでは、製品材料を添加する前に、メーカーの指示に従ってプレフィルターとウイルス除去フィルターが順番に取り付けられ、水で洗い流される。例えば、２２０ｃｍ^２Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）Ｍａｘ（商標）フィルターとＶｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＨＣ（商標）フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）の組み合わせセットを使用して、約２Ｌの血漿に由来する物質を処理できる。あるいは、そのような結合フィルターの２つ以上の組み合わせセットを使用して、フィルターアセンブリを通るフラックスの損失を減少させ、処理時間を短縮することができる。

【0054】

目的のタンパク質を単離するための本発明の概念の方法全体を通してフロースルー画分を使用すると、標的タンパク質の濃度が臨床応用にとって最適ではない溶液が得られる可能性がある。したがって、本発明の概念の方法は、目的のタンパク質が精製された後に行われ、当技術分野で知られている技術を利用する最終タンパク質濃縮ステップを含むことができる。そのような濃縮ステップは、例えば、限外濾過によって行うことができ、薬学的に許容されるバッファー組成物へのバッファー交換を可能にするダイアフィルトレーションステップを組み込むことができる。例えば、ＩｇＧの単離では、高度に精製された産物材料を約４％（ｗ／ｖ）以上（例えば、約５％ｗ／ｖ）のＩｇＧに濃縮することができ、濃縮ステップ中にダイアフィルトレーションを使用して、現存するバッファーを、０．２Ｍグリシンを含むバッファー（ｐＨ４．２～６．５）又はその他の薬学的に許容されるバッファーに置換することができる。例えば、そのような濃縮／ダイアフィルトレーションステップは：（１）ナノフィルトレーションされたタンパク質溶液を約５００ｍＬの体積まで濃縮すること、（２）上記約５００ｍＬの体積を製剤バッファー（例えば、８又はそれ以上のダイアボリューム）にダイアフィルトレーションすること、及び（３）ダイアフィルトレーションされた体積を、タンパク質の標的濃度（例えば、約５％ｗ／ｖのＩｇＧ）に濃縮すること、の３つのステップで行うことができる。タンパク質濃度は、例えば２８０ｎｍでの吸光度によってモニタリングできる。

【0055】

３つのバッチ（Ｅ、Ｆ、Ｇ）の全体的なＩｇＧ収率を、出発血漿について及び沈殿ステップの後続の画分について有効とされている比濁分析アッセイを使用して決定した。精製作業によりＩｇＧ純度が９０％以上に達したら、Ａ_２８０測定値と吸光係数１．３を使用してＩｇＧを定量した。表５は、各プロセスステップで存在する３つのバッチすべての平均総ＩｇＧを示す。平均プロセス収率は７５％であり、最も重大なプロセス損失は深層濾過（約８％）及びＱ－セファロース（商標）クロマトグラフィー（約９％）ステップで発生する。

【0056】

【表5】

【0057】

直列に配置された２つの陰イオン交換カラムを使用して行われるクロマトグラフィーステップでは、ＩｇＧ以外のすべてのタンパク質の＞９９％が除去される。驚くべきことに、物質の２つの小さい後続ピーク（図８の画分６及び８）はＩｇＧ種を含み、（ＥＬＩＳＡによる）測定可能なＩｇＡもＩｇＭも含まないことが判明した。これらの画分の両方におけるＩｇＧ種は、ＩｇＧ４に偏っている（約３０％）。本発明者らは、Ｑ－セファロース（商標）クロマトグラフィーフロースルー画分の変則的な形状は、カラムに投入されたサンプル中に見出される４つのＩｇＧサブクラスの差異的で一時的な保持によるものであると考えている。ＩｇＧサブクラスＥＬＩＳＡデータは、ＩｇＧ１がフロースルー画分全体にわたって継続的に出現し、第２のショルダー（図１０の画分３）はタイプ２及び３に富んでいるようである一方、ＩｇＧ４は主にメインＵＶ「ピーク」の終わりに向かって溶出する（画分５）ことを示している。この予期せぬ結果は、使用したバッファー導電率（約７ｍＳ）での陰イオン交換樹脂のＩｇＧ相互作用が制限されたため、結合せずにカラムを通過する一部のＩｇＧサブクラスの進行を本質的に遅らせたことによるものであり得る。本発明者らは、血液製剤から始まる統合プロセスにおいて、バッファー条件及び陰イオン交換媒体の選択及び／又は容量を最適化することで、陰イオン交換クロマトグラフィーからのフロースルー画分におけるＩｇＧサブクラスの分離を提供できると考えている。

【0058】

従来技術のタンパク質単離プロセスでは、一般に、タンパク質産物の収率と純度の間には反比例の関係がある。驚くべきことに、本発明者らは、本発明の概念の方法が、非常に高い収率（出発物質のＩｇＧの量の７０％を超える）及び高純度の両方を提供できることを見出した。直列に配置された２つのＱ－セファロース（商標）カラムを使用し、ＩｇＧがフロースルー画分で収集される本発明の概念の方法を使用して、いくつかのＩｇＧ産物の精製について、安全性及び同時精製の非ＩｇＧタンパク質量を調べるために、包括的な分析試験を実施した。

【0059】

図１０に示すように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、＞９８％のＩｇＧ純度の産物純度を示し、これはヒト用に現在市販されているＩｇＧ産物の純度に匹敵するか、又はそれを上回る。具体的には、市販の静脈内ＩｇＧ製品（ガンマガード（Ｇａｍｍａｇａｒｄ）（登録商標）、Ｇａｍｕｎｅｘ（登録商標）、プリバジェン（Ｐｒｉｖａｇｅｎ）（登録商標）、及びビビガム（Ｂｉｖｉｇａｍ）（商標））と比較して試験すると、最終産物のＩｇＧにはＨＭＷ夾雑物が少なくなる。

【0060】

２つのＱ－セファロース（商標）を使用する本発明の概念の方法によるＩｇＧ産物の分析試験結果を表６に示す。この目的のために、本発明の概念のそのような方法を使用して生成された２Ｌ規模のバッチからのＩｇＧ産物を、総タンパク質約５％を目標として、０．２Ｍグリシン、ｐＨ４．２に配合した。これは、ヒト用の治療用ＩｇＧ製品に関する現行方式と一致している。ＩｇＧ濃度を、分光測光法による２８０ｎｍでの吸光度により測定した。最終産物製剤に対して追加のタンパク質含有量の測定を行った。３つのそれぞれの最終製剤の方法全体の平均濃度（Ｎ＝５）は、それぞれ４１．２、５２．９、及び５０．９ｍｇ／ｍＬであった。ＩｇＧサブクラス分布をＩｇＧサブクラスＥＬＩＳＡによって測定し、３つの最終製剤全体で６３％のＩｇＧ１、２８％のＩｇＧ２、７％のＩｇＧ３、及び２％のＩｇＧ４であると決定された。それぞれの脱クリオ血漿出発物質の値は、５９％のＩｇＧ１、２９％のＩｇＧ２、７％のＩｇＧ３、及び４％のＩｇＧ４であった。他の免疫グロブリン種に関しては、ＩｇＡのみがＥＬＩＳＡで検出され（３．３μｇ／ｍＬ）、ＬＣＭＳで確認された。ただし、ＩｇＡ含有量は４μｇ／ｍＬ未満である。ＩｇＭはＥＬＩＳＡでは検出されず、ＬＣＭＳでは微量のＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤペプチドのみが検出された。

【0061】

【表6】

【0062】

直列に配置された２つの陰イオン交換カラムを使用する本発明の概念のＩｇＧ単離方法からの産物を、安全性及び有効性に関する内容について特性評価した。したがって、抗Ａ、Ｂ、及びＤ抗体、抗補体活性（ＡＣＡ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性、Ｆｃ機能、トロンビン生成アッセイ又はＴＧＡによる活性化凝固因子ＸＩ（ＦＸＩａ）活性、及び非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）活性を、いくつかの２Ｌ規模の最終産物製剤について特性評価した。結果は次のとおりである。

【0063】

・抗Ａ、Ｂ、Ｄ抗体：試験した３つの産物バッチはすべて、ヒト用製品の一般的な許容基準に合格した。
・Ｆｃ機能／重合：３つの産物バッチすべてのＦｃ機能は、試験した２つのＩｇＧ濃度で＞１００％であり、これはヒト用ＩｇＧ製品の一般的な許容基準を満たすかそれを超えている。さらに、ＳＥ－ＨＰＬＣデータは、ＩｇＧの＞９６％が単量体であり、二量体が＜４％、高次ポリマー＜０．２％であり、Ｉｇ断片がほとんど検出できないレベルであることを示している。これは、ヒト用のＩｇＧ製品に関するＦＤＡ及びＥＵの両方の仕様を満たしている。

【0064】

・ＰＫＡ及びＡＣＡ活性：ＰＫＡ及びＡＣＡ活性は、それぞれのタンパク質分解カスケードを通じて自然免疫の活性化／不活性化を引き起こす可能性がある夾雑物の存在を検査するものである。ＰＫＡ活性は低く（平均＝１．３ＩＵ／ｍＬ）、ヒト用のＩｇＧ製品の一般的な許容基準である３５ＩＵ／ｍＬを十分に下回っていた。しかし、ＡＣＡ活性は１．０ＣＨ５０Ｕ／ｍｇを超えていた。

【0065】

・凝固促進活性：凝固時間は固有の凝固促進活性（供給源に関係なく）を測定するが、ＴＧＡアッセイはＦＸＩａ様活性を測定する。最も低い希釈率では、バッチＥ（１４１秒）は＞１５０秒の許容基準をほとんど満たさなかったが、バッチＦとＧは合格であった。３つのバッチすべてにおけるＦＸＩａ様活性はやや高く（＞２．０ｍＵ／ｍＬ）、これは精製プロセス中のある時点で凝固の接触経路が活性化されたことを示している。ＦＸＩａ（すなわち、活性化第ＸＩ因子）やその他の微量夾雑物を除去するには、直列に配置されたＱ－セファロース（商標）カラムからの流出液に適用される陽イオン交換カラムを使用することができ、セファロース（商標）溶出液に見られるＩｇＧを結合させ、その後、陽イオン交換媒体からＩｇＧを溶出する。このプロセスの条件を最適化している間に、本発明者らは驚くべきことに、夾雑接触活性化因子（例えば、活性化第ＸＩ因子）及び他の夾雑物が、ＩｇＧよりも高い親和性で陽イオン交換媒体に結合することを発見した。この観察結果は、夾雑物の量に合わせて陽イオン交換媒体の容量を調整するために使用され、それによってＩｇＧの陽イオン交換媒体への結合を防止した。この調整により、以下に示すように、陽イオン交換媒体をネガティブ選択モード（すなわち、フロースルーで所望のタンパク質産物を収集するモード）で使用できる。

【0066】

あるいは、本発明の概念のいくつかの実施形態は、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィーの両方を利用し、バッファー条件、差異のあるタンパク質親和性、及びイオン交換クロマトグラフィー媒体の結合容量が、各クロマトグラフィーステップのフロースルー画分に標的タンパク質（例えば、ＩｇＧ）を提供するように選択又は最適化される。この目的に向けて、最初のイオン交換ステップ（例えば、陰イオン交換、陽イオン交換）は、目的のタンパク質にあまり結合しない高容量イオン交換媒体を使用して実施され得る。例えば、ＩｇＧの単離では、大容量／高容量の陰イオン交換ステップを実施して、ＩｇＧを含むフロースルー画分を提供し、夾雑タンパク質を含む結合画分を保持することができる。次いで、フロースルー画分を（いくつかの実施形態では、イオン強度／導電率を調整するための塩の添加に続いて）小容量又は低容量の陽イオン交換媒体に適用する。陰イオン及び陽イオン交換の両方を利用する従来のプロセスでは、陽イオン媒体が陰イオン交換ステップ（ＩｇＧがフロースルー画分に見られる）とは反対のモードで利用されることが理解される。従来のＩｇＧ単離プロセスでは、標的タンパク質（ＩｇＧ）は陽イオン交換媒体上に保持されるが、残りのタンパク質夾雑物はフロースルー画分に見られる。陽イオン交換媒体を洗浄又はリンスした後、ＩｇＧは溶出によって（例えば、高塩含有量のバッファーの適用によって）回収される。

【0067】

典型的な方法とは対照的に、本発明の概念のこの実施形態では、陽イオン交換ステップは、不純物を結合しながら、目的のタンパク質（ＩｇＧ）はフロースルー画分に残るように設計される。この小容量又は低容量の陽イオン交換媒体のサイズは、陰イオン交換媒体のフロースルー中に見出される夾雑タンパク質がブレークスルーとなる（バッファー条件を考慮に入れる）量又は容量とほぼ同じか、それをわずかに（例えば、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％）上回るように選択される。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、これにより、陽イオン交換媒体に一時的に結合する可能性のある任意のＩｇＧを夾雑タンパク質で置き換えることが可能になると考えている。陽イオン交換媒体の量／容量を慎重に選択すると、夾雑タンパク質を効率的に除去できると同時に、フロースルー画分で高収率のＩｇＧが得られる。

【0068】

本発明の概念のプロセスの別の例を以下の図１１に示す。これに関連して、血液製剤は、血清、血漿、冷蔵血漿、凍結血漿、回収血漿、再構成された凍結乾燥血漿、脱クリオ血漿、クリオプレシピテートが再溶解された脱クリオ血漿、又はそのような材料に適用される沈殿及び／又は精製ステップから得られる画分（例えば、上清又は溶解した沈殿物）であり得ることが理解される。また、血液製剤が具体的に引用されているが、そのような方法は、目的のタンパク質を含む任意の溶液（例えば、細胞培養培地、細胞培養からの細胞の溶解物、細菌溶解物、溶媒和封入体など）に適用できることも理解される。塩沈殿（例えば、クエン酸塩又は酢酸塩による）によって生成された沈殿物は、再溶解され、陰イオン交換媒体に適用される。

【0069】

いくつかの実施形態では、そのような再溶解物質は、クロマトグラフィー媒体を詰まらせる可能性のある残留未溶解物質又は沈殿物質を除去するために、例えば１つ以上のフィルターを通すことによって清澄化され得る。いくつかの実施形態では、そのような再溶解沈殿物のバッファー組成は、陰イオン交換媒体に適用する前に変更することができる。いくつかの実施形態では、これは、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアリシス、ダイアフィルトレーション、限外濾過による濃縮とそれに続く希釈、エレクトロダイアリシス、及び／又は再沈殿（例えばＰＥＧを使用）とそれに続く再溶解などのバッファー交換（すなわち、タンパク質含有溶液から塩が除去されるプロセス）を通じて達成され得る。あるいは、好ましい実施形態では、そのような再溶解沈殿物を、所望の浸透圧及び／又は導電率（例えば、２～１０ｍＳ）が達成されるまで希釈することができる（これは、再溶解沈殿物中に元々存在していた塩を保持する）。陰イオン交換ステップからのフロースルー画分は、陽イオン交換媒体を使用する低容量陽イオン交換ステップに送られる。他のプロセスとは対照的に、目的のタンパク質は、この第２の陽イオン交換ステップのフロースルー画分で高収率（例えば、出発物質中の目的のタンパク質の量と比較して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％を超える）かつ高純度（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％を超える）で回収される。最初のイオン交換ステップは陰イオン交換ステップとして示されているが、最初のイオン交換ステップが高容量陽イオン交換媒体を使用して行われ、続いて低容量陰イオン交換ステップが行われる実施形態（目的のタンパク質が主に、両方のイオン交換ステップのフロースルー体積に存在する）も想定されており、ＩｇＧ以外のタンパク質の単離に適用できる。

【0070】

本発明の概念の別の実施形態が図１２に示されている。ここでは、最初のイオン交換ステップが、分画ステップから得られた上清に対して行われる。血液製剤が具体的に引用されているが、そのような方法は、目的のタンパク質を含む任意の溶液（例えば、細胞培養培地、細胞培養からの細胞の溶解物、細菌溶解物、溶媒和封入体など）に適用できることも理解される。最初のイオン交換ステップは陰イオン交換ステップとして示されているが、最初のイオン交換ステップが高容量陽イオン交換媒体を使用して行われ、第２のイオン交換ステップが低容量陰イオン交換媒体を使用して行われる実施形態も想定される。そのような方法は、例えば、ＩｇＧ以外のタンパク質の単離に使用することができる。

【0071】

そのような実施形態のいくつかでは、塩分画から得られた上清は、クロマトグラフィー媒体を詰まらせる可能性のある残留粒子又は沈殿物質を除去するために、例えば１つ以上のフィルターを通すことによって清澄化され得る。いくつかの実施形態では、そのような上清のバッファー組成は、陰イオン交換媒体に適用する前に変更することができる。これは、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアリシス、ダイアフィルトレーション、及び／又は沈殿（例えばＰＥＧを使用）とそれに続く溶解などのバッファー交換（すなわち、タンパク質含有溶液から塩が除去されるプロセス）を通じて達成され得る。あるいは、好ましい実施形態では、そのような上清を、所望の浸透圧及び／又は導電率（例えば、２～１０ｍＳ）が達成されるまで希釈することができる（これは、上清中に元々存在していた塩を保持する）。陰イオン交換ステップからのフロースルー画分は、陽イオン交換媒体（例えば、カルボン酸基及び／又はスルホン酸基を含む媒体）を使用する低容量陽イオン交換ステップに送られる。従来技術のプロセスとは対照的に、目的のタンパク質は陰イオン交換ステップのフロースルー画分に見られ、第２の陽イオン交換ステップのフロースルー画分で高収率（例えば、出発物質中の目的のタンパク質の量に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％を超える）かつ高純度（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％を超える）で回収される
図１１及び図１２における最初のイオン交換ステップは、陰イオン交換ステップとそれに続く低容量陽イオン交換ステップへのフロースルー画分の適用（その後、陽イオン交換流出液から目的のタンパク質を回収）を使用することを示しているが、本発明者らは、最初の陽イオン交換ステップに続いて、低容量陰イオン交換ステップへのフロースルー画分の適用、及び陰イオン交換からのフロースルー画分からの目的のタンパク質の回収を利用する類似の方法を想定している。そのような方法は、非ＩｇＧタンパク質の単離に適用できる。

【0072】

本発明者らは、本発明の概念の方法が、血漿からのＩｇＧの単離に特に有用であることを発見したが、ＩｇＧを含む他の溶液（例えば、細胞培養培地、細胞溶解物、他の体液など）への適用も想定される。本願の文脈内では、血漿には、採取したての血漿、冷蔵血漿、凍結血漿、脱クリオ血漿、及びクリオプレシピテートが再溶解された脱クリオ血漿が含まれるとみなされる。そのような血漿は、例えば、商業収集センターから入手することができる。血漿からＩｇＧを単離するための本発明の概念の方法の一例を図１３に示す。

【0073】

図１３に示す最初の２つのステップについて、本発明者らは、２つの沈殿ステップに幅広い塩濃度を用いて塩分画プロセスを変更及び／又は最適化し、最適濃度（すなわち、第１の塩沈殿では約１１％及び第２の塩沈殿では約２６％）を決定し、また、不要なタンパク質を最小限に抑えながらＩｇＧ収率を最大化した。そのような塩は、塩溶液として（例えば、計算量で５０重量％の塩溶液として）、及び／又は乾燥形態（例えば、粉末又は結晶固体として）迅速に添加することができる。示されているように、第１の沈殿ステップではＩｇＧに富んだ上清が生成され、第２の沈殿ステップではＩｇＧに富んだ沈殿又はペーストが生成される。このＩｇＧに富んだ沈殿物は、イオン交換ステップの前に（例えば水に）溶解される。以下に記載するように、そのような方法の好ましい実施形態では、バッファー交換ステップ（例えば、ダイアリシス、ダイアフィルトレーション、限外濾過とそれに続く希釈、サイズ排除クロマトグラフィーなど）は、イオン交換ステップの前には行われない。

【0074】

大規模プロセスを成功させるには、処理ステップで使用される媒体（例えば、クロマトグラフィー媒体など）の詰まりを回避する必要がある。そのような大規模プロセスでは、約５００～６００Ｌ（例えば高度免疫の場合）から８，０００Ｌ以上（例えば正常ＩｇＧの場合）の血漿又は血清を利用することができる。出願人らは、最初の分画ステップでクエン酸塩沈殿を利用する先行技術の方法（米国特許第７，８７９，３３１号に記載されているものなど）は、バッファー交換のための単純なバッグダイアリシスが非実用的になる規模（例えば、約１Ｌ以下）では有用ではないことを発見した。本発明者らは、より大規模な適用をサポートするためにバッグダイアリシスをダイアフィルトレーションに置き換える試みは、たとえ処理されるタンパク質溶液中に沈殿物質が明らかに見えなくても、ダイアフィルトレーション膜の急速な詰まりのため非現実的であることを発見した。

【0075】

最終的に、本発明者らは、濾過を使用することで、残留する未溶解物質又は懸濁物質、及び／又はＩｇＧに富む沈殿物の溶解後に沈殿する物質（例えば、ウイルス不活化時）を除去できることを発見した。驚くべきことに、本発明者らは、イオン交換ステップの前に使用される濾過媒体の選択が、ＩｇＧ及び望ましくない夾雑物（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子）の両方の濃度に大きな影響を与えることを見出した。大規模なＩｇＧ単離に有用なフィルターのスクリーニング研究の典型的な結果を表７に示す。

【0076】

【表7】

【0077】

フィルター組成が、フィルター材料上の所望のＩｇＧ産物の保持、ならびに第ＸＩ因子及び第ＸＩＩ因子などの夾雑物の保持に影響を与えることは明らかである。特に、珪藻土デプスフィルター（例えば、Ｆ１）の使用は、最小限のＩｇＧ保持（総タンパク質の関数として）と、第ＸＩ因子及び第ＸＩＩ因子の両方の夾雑物の顕著な減少を示す。対照的に、シリカ（例えば、Ｆ９）は第ＸＩ因子及び第ＸＩＩ因子を効果的に除去することが判明したが、タンパク質含有量の全体的な損失はＩｇＧ収率に悪影響を及ぼす。同様に、第四級アミン／ＰＥＳフィルターはタンパク質をほとんど保持しなかったが、夾雑タンパク質はほとんど、又はまったく保持されなかった。

【0078】

したがって、本発明の概念のいくつかの実施形態では、イオン交換ステップの前に、珪藻土を含むデプスフィルターを大規模なＩｇＧ単離プロセスに組み込むことができる。そのような実施形態のいくつかでは、珪藻土フィルターはデプスフィルターとすることができる。いくつかの実施形態では、本方法で使用される珪藻土フィルターはパーライトを除外することができる。いくつかの実施形態では、後続のステップにおけるクロマトグラフィー媒体の詰まりを低減するために、そのような濾過ステップの後に追加の粒子濾過ステップ（例えば、１μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍ細孔濾過）を実施することができる。いくつかの実施形態では、デプスフィルターのサイズは、第ＸＩ因子及び／又は第ＸＩＩ因子の活性化をもたらし得る利用可能な表面積を最小限に抑えながら、十分なフィルター容量及びフラックス保持を提供するように最適化することができる。

【0079】

図６に示すように、本発明の概念のＩｇＧ単離プロセスにおいて、第１のイオン交換ステップは、陰イオン交換媒体を使用して実施することができる。そのような陰イオン交換媒体は、第四級アミン（Ｑ）媒体であり得る。そのような陰イオン交換媒体は、広範囲のｐＨ条件（例えば、ｐＨ１～１４、ｐＨ２～１３、ｐＨ３～１２、ｐＨ４～１１）にわたって正電荷を維持することができる。陰イオン交換媒体は、任意の適切な支持体（例えば、アガロース、架橋アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ガラス、又はそれらの組み合わせ）上に、任意の適切な構成（例えば、多孔質ビーズ、非多孔質ビーズ、繊維、ウール、フィルターなど）で提供することができる。

【0080】

本発明の概念の好ましい実施形態では、第２の沈殿ステップからの再溶解した沈殿物は、陰イオン交換媒体に適用する前にバッファー交換プロセスに供されない。本願の文脈において、バッファー交換プロセスとは、目的のタンパク質（例えば、ＩｇＧ）を含む溶液から塩を除去するプロセスを指す。そのようなプロセスの例としては、ダイアリシス、ダイアフィルトレーション、限外濾過による濃縮とそれに続く希釈、及びサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなバッファー交換プロセスには、濃縮されていない再溶解沈殿物の単純な希釈（これはタンパク質溶液中に存在する塩を保持する）は含まれない。目的のタンパク質（例えば、ＩｇＧ）はイオン交換ステップのフロースルー画分で回収されるため、希釈を行う場合は、最小体積（例えば、元の体積の３倍未満、元の体積の約１．５倍から２．５倍、元の体積の約２倍、元の体積の約１．５倍、又はほぼ元の体積）の希釈剤を使用して行うことが好ましい。

【0081】

図６に示すように、本発明の概念の大規模ＩｇＧプロセスでは、ＩｇＧは陰イオン交換媒体からのフロースルー（すなわち、非結合）画分で回収される。この第１のフロースルー画分は、続いて、夾雑タンパク質を保持しながらＩｇＧ（これも通常、陽イオン交換媒体に結合する）をフロースルー画分（すなわち、第２のフロースルー画分）中で通過させるようにサイズ／容量、及びバッファー条件が選択された小容量又は低容量の陽イオン交換媒体（例えば、カルボン酸基又はスルホン酸基を含む媒体）に適用される。典型的には、陽イオン交換媒体の容量又はサイズは、第１のフロースルー画分に存在する夾雑物に対する容量と同等又はそれをわずかに（例えば、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、５０％、７５％、又は１００％）超えるように選択される。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、陽イオン交換媒体及び結合条件がそのように選択されると、ＩｇＧが夾雑タンパク質によって置き換えられることで第２のフロースルー画分に残るために、ＩｇＧを結合させてから溶出する方法よりも収率が上がると考えている。好ましい実施形態では、陽イオン交換ステップにおけるＩｇＧの損失は、出発物質のＩｇＧの量の約１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満である。

【0082】

そのような陽イオン交換媒体は、任意の適切な支持体（例えば、アガロース、架橋アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ガラス、又はそれらの組み合わせ）上に、任意の適切な構成（例えば、多孔質ビーズ、非多孔質ビーズ、繊維、ウール、フィルターなど）で提供することができる。本発明者らは、使用される陽イオン交換媒体の容量は非常に小さくてよく、好ましい実施形態ではペンダント陽イオン交換基を有するフィルターによって提供できることを発見した。これは、精製ステップと清澄化ステップを有利に組み合わせる。

【0083】

本発明の概念のいくつかの実施形態では、夾雑物に対する容量及び選択性を最適化するために、陽イオン交換媒体に適用する前に、第１のフロースルー画分のバッファー組成、導電率、及び／又はｐＨを変更することができる。好ましい実施形態では、塩を添加することで、第１のフロースルー画分のイオン強度又は導電率を所望の範囲内に収まるように高めることができる。

【0084】

いくつかの実施形態では、第２のフロースルー画分を追加の処理ステップにかけることができる。そのような追加の処理ステップには、ウイルス除去のためのナノフィルトレーション、例えば０．０２μｍの細孔膜を使用する濾過が含まれ得る。本発明者らは、これが収量損失を最小限に抑えながら、残留するウイルス粒子を効果的に保持できることを発見した。

【0085】

いくつかの実施形態では、精製タンパク質溶液は、安定性を提供する薬理学的に適合するバッファー中で有用な濃度を有する医薬品を提供するために、濃縮及びダイアフィルトレーションによる使用のために調製され得る。ＩｇＧの場合、そのようなステップは、適切な製剤バッファー（例えば、０．２Ｍグリシン、ｐＨ４．２～ｐＨ６．５）中で、損失を最小限に抑えながら、例えば、約４％～６％ＩｇＧ（ｗ／ｖ）以上のＩｇＧ濃度を提供することができる。濃度は、既知の方法を使用して高めるなどの調整をすることができる。

【0086】

本発明の概念のＩｇＧ単離プロセスの典型的なＩｇＧ収率の結果を表８に示す。

【0087】

【表8】

【0088】

表８に示す材料から得られた試験結果は、商用ＩｇＧ製品のリリース基準をすべて満たしていた。結果は表９及び表１０である。

【0089】

【表9】

【0090】

【表10】

【0091】

著しく低いレベルの第ＸＩ因子夾雑物に加えて、本発明者らは、本発明の概念の方法が驚くほど低いレベルのＩｇＡ夾雑物を提供することを発見した。
上述の方法は、わずか２４～７２時間（好ましくは約４８時間）で出発血漿から約７２～８５％の収率のＩｇＧ（出発物質のＩｇＧ量と比較して）を一貫して生成する、安定しておりかつ商業的にスケーラブルなプロセスである。得られる産物は、１００％の機能性を備えた９９％を超える純度のＩｇＧ産物である。

【0092】

本発明の概念の方法によって生成される様々な中間廃棄物流、例えば、第１の分画ステップで生成された沈殿物、第２の分画ステップで生成された上清、陰イオン交換ステップからの結合画分、及び／又は陽イオン交換ステップからの結合画分から、追加の血漿タンパク質が回収され得ることが理解される。いくつかの実施形態では、そのような中間産物流の２つ以上を、単離される非ＩｇＧ血漿タンパク質の供給源として組み合わせることができる。そのような中間産物は、任意の適切な方法（例えば、追加の沈殿ステップ、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び／又は混合モードクロマトグラフィー）によって処理することで、出発材料からの追加の非ＩｇＧタンパク質の単離を促進することができる。

【0093】

本発明者らは、クエン酸塩沈殿ステップは従来技術のエタノール沈殿プロセスよりも穏やかであり、ＩｇＧ産物がアルコール、極端なｐＨ変化、極端な温度への多数及び長時間の曝露、ならびに長い処理時間なしで得られるため、タンパク質変性のリスクを最小限に抑えると考えている。アルコール及び低ｐＨを避けることは、タンパク質の安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、タンパク質治療薬の免疫原性、患者の忍容性、及び点滴速度の向上に影響する。

【0094】

本発明者らの方法はまた、環境に優しく（塩対アルコール）、コーン分画ベースのプロセスよりも費用対効果が高い。
本明細書における本発明の概念から逸脱することなく、すでに説明したもの以外のさらに多くの修正が可能であることは、当業者には明らかである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の趣旨以外によって制限されるべきではない。さらに、明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈する際には、すべての用語は、文脈と一致する可能な限り広い方法で解釈されるべきである。特に、「含む」という用語は、非排他的な方法で要素、コンポーネント、又はステップを指すものとして解釈されるべきであり、参照された要素、コンポーネント、又はステップが、明示的に参照されていない他の要素、コンポーネント、又はステップと共に存在し、利用され、又は組み合わされてよいことを指す。明細書、特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．．及びＮからなる群から選択されるもののうちの少なくとも１つに言及している場合、その文脈は、Ａ＋ＮやＢ＋Ｎなどではなく、その群から１つの要素のみを必要とすると解釈されるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【手続補正書】

【提出日】2023-07-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的タンパク質及び複数の夾雑物を含む溶液から前記標的タンパク質を単離する方法であって、
前記溶液に塩を添加することで上清及び沈殿物を生成すること、
前記沈殿物を水溶液に溶解することで、前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第１の部分を含む溶解した沈殿物を生成すること、
前記溶解した沈殿物を、第１の極性の第１の電荷を有する第１のイオン交換媒体に適用することで、前記複数の夾雑物の第２の部分を含む第１の結合画分と、前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第３の部分を含む第１のフロースルーとを生成すること、及び、
前記第１のフロースルーを、前記第１の極性とは反対の第２の極性の第２の電荷を有する第２のイオン交換媒体に適用することで、前記複数の夾雑物の第３の部分を含む第２の結合画分と、前記標的タンパク質を含む第２のフロースルーとを生成すること
を含み、
前記第２のイオン交換媒体の容量は、前記第２のイオン交換媒体を使用したイオン交換中に失われる前記標的タンパク質が前記溶液中の前記標的タンパク質の量の約１０％未満となるように選択される方法。

【請求項2】

前記溶液が血漿である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記溶液が分離ステップの産物である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記塩がクエン酸塩又は酢酸塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のイオン交換媒体が陰イオン交換媒体であり、前記第２のイオン交換媒体が陽イオン交換媒体であり、前記標的タンパク質が免疫グロブリンＧである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記複数の夾雑物が第ＸＩ因子又は活性化第ＸＩ因子を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記溶解した沈殿物にカプリル酸塩を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

カプリル酸塩の添加後に、第ＸＩ因子又は第ＸＩＩ因子を選択的に保持する濾過ステップの適用によって固体を除去することを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記標的タンパク質の収率が少なくとも７０％である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記溶液の体積が少なくとも５００Ｌである、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

標的タンパク質及び複数の夾雑物を含む溶液から前記標的タンパク質を単離するためのシステムであって、
前記溶液を受け取り塩分画ステップを行うように構成された分画モジュールであって、前記塩分画ステップは、上清及び沈殿物を生成し、前記上清を前記沈殿物から分離し、前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第１の部分を含む前記沈殿物を第１の出力として提供するものである、前記分画モジュール、
第１の極性の第１の電荷を有する第１のイオン交換媒体を含むとともに前記第１の出力に連通する第１の分離モジュールであって、前記第１の分離モジュールはフロースルー画分を含む第２の出力を提供するように構成されており、前記フロースルー画分は前記標的タンパク質及び前記複数の夾雑物の第２の部分を含むものである、前記第１の分離モジュール、及び、
前記第１の極性とは反対の第２の極性の第２の電荷を有する第２の交換媒体を含む第２の分離モジュールであって、前記第２の分離モジュールは、前記複数の夾雑物の第３の部分を保持し、前記標的タンパク質を含む第３の出力を提供するように構成されており、前記第２の分離モジュールは、前記第２のイオン交換媒体でのクロマトグラフィーで失われる前記標的タンパク質が前記溶液中の前記標的タンパク質の量の約１０％未満となる前記第２のイオン交換媒体の容量を提供するように選択された量の前記第２のイオン交換媒体を含む、前記第２の分離モジュール
を含む、システム。

【請求項12】

前記分画モジュールと前記第１の分離モジュールとの間の流体経路内にウイルス不活化モジュールを含む、請求項１１に記載のシステム。

【請求項13】

前記第１のイオン交換媒体が陰イオン交換体であり、前記第２の陰イオン交換媒体が陽イオン交換体であり、前記標的タンパク質が免疫グロブリンＧである、請求項１１に記載のシステム。

【請求項14】

前記複数の夾雑物が、第ＸＩ因子、活性化第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、及び活性化第ＸＩＩ因子からなる群から選択される凝固因子を含む、請求項１１に記載のシステム。

【請求項15】

前記溶液が、血漿、血漿に適用された沈殿ステップに由来する上清、及び血漿に適用された沈殿ステップに由来する沈殿物からなる群から選択される、請求項１１に記載のシステム。

【請求項16】

前記第１の出力と前記第１の分離モジュールとの間に挿入されたデプスフィルターをさらに含み、前記デプスフィルターは、前記デプスフィルターを通過する物質の第ＸＩ因子又は第ＸＩＩ因子含有量を選択的に低下させる、請求項１１に記載のシステム。

【請求項17】

前記溶液の体積が少なくとも５００Ｌである、請求項１１に記載のシステム。

【国際調査報告】