知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ クレ バイオテクノロジ （シャンハイ） カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-11
(54)【発明の名称】抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片および適用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20231228BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231228BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231228BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20231228BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20231228BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231228BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20231228BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231228BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231228BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231228BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20231228BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20231228BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231228BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20231228BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20231228BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20231228BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231228BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231228BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231228BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
C12N15/13
A61K39/395 N
A61P3/00 171
A61P7/00
A61P35/00
A61P31/00
A61P29/00
A61P37/02
A61P25/00
A61P17/02
A61P31/04
A61P43/00 105
A61P9/10 101
A61P3/04
A61P3/10
A61P37/06
A61P35/02
A61P19/02
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023532562
(86)(22)【出願日】2021-08-19
(85)【翻訳文提出日】2023-07-20
(86)【国際出願番号】 CN2021113416
(87)【国際公開番号】W WO2022110922
(87)【国際公開日】2022-06-02
(31)【優先権主張番号】202110911478.X
(32)【優先日】2021-08-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202011372817.3
(32)【優先日】2020-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202011602742.3
(32)【優先日】2020-12-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521501093
【氏名又は名称】クレ バイオテクノロジ （シャンハイ） カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チー シャンドン
(72)【発明者】
【氏名】パン チン
(72)【発明者】
【氏名】ジェン ハン
(72)【発明者】
【氏名】ドゥー イエジエ
(72)【発明者】
【氏名】チェン ジシュオ
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB36
4C085BB41
4C085BB43
4C085BB44
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG06
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片および適用。マウスを免疫して抗ヒトＳＩＲＰαモノクローナル抗体を取得し、さらにキメラ抗体およびヒト化抗体を取得する。提供される抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＳＩＲＰαタンパク質に結合し、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル経路を遮断し、食作用の増強等の免疫調節効果を有することができる。医薬組成物および核酸分子、ならびに疾患を阻害または治療するための薬物の調製における抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の用途をさらに提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５に示されるようなＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列が、それぞれ
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、９；
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、３８、９；
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、４０、９；
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４１；
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４２；
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４３；
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１；
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、３８、４１；
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９の配列のいずれか一つに示されるようなＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする、前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記可変領域は、マウス由来またはヒト由来ＦＲ領域をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
前記ＦＲ領域の配列は、マウス由来であり、前記重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有することを特徴とする請求項２に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記ヒト由来ＦＲ領域は、重鎖ＦＲ領域配列および軽鎖ＦＲ領域配列を含み、前記重鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１－１８のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域およびＩＧＨＪ２＊０１のＦＲ４領域を含む、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１－１８およびＩＧＨＪ２＊０１の組み合わせ配列に由来し、前記軽鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ４－１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域およびＩＧＫＪ２＊０１のＦＲ４領域を含む、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ４－１およびＩＧＫＪ２＊０１の組み合わせ配列に由来することを特徴とする請求項２に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５のいずれか１項から選択されるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有することを特徴とする請求項２に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、ヒト由来ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４またはその変異体から選択される重鎖定常領域、ならびにヒト由来κ鎖、λ鎖またはその変異体から選択される軽鎖定常領域をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記重鎖定常領域は、Ｆｃ断片またはその変異体を含み、前記Ｆｃ断片の変異体は、ＩｇＧ１に由来し、ＥＵナンバリングに基づいて、突然変異部位Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３３８Ａを含むことを特徴とする請求項６に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の重鎖配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項9】
抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、もしくは多重特異性抗体であるか、または、前記抗体もしくはその抗原結合断片は、抗体薬物複合体の調製に使用されることを特徴とする請求項１に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項10】
その構造形態は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＳｃＦｖであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項11】
医薬組成物であって、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片、ならびに一つまたは複数の種の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項12】
核酸分子であって、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片をコードするすることを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項13】
疾患、病症または状況を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の用途。
【請求項14】
前記疾患、病症または状況は、癌、固形腫瘍、慢性感染症、炎症性疾患、多発性硬化症、自己免疫性疾患、神経系疾患、脳損傷、神経損傷、赤血球増加症、ヘモクロマトーシス、外傷、敗血症性ショック、線維症、アテローム性動脈硬化症、肥満、ＩＩ型糖尿病、移植片の機能不全または関節炎を含み、前記癌は、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞がん、胆嚢がん、胃がん、肺がん、気管支がん、骨がん、肝胆管がん、膵臓がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、腎盂および尿管がん、唾液腺がん、小腸がん、尿道がん、膀胱がん、頭頚部がん、脊椎がん、脳がん、子宮頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、消化器がん、皮膚がん、前立腺がん、下垂体がん、膣がん、甲状腺がん、喉頭癌、膠芽腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、肉腫、奇形種、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞またはＢ細胞リンパ腫、消化管間質腫瘍、軟部組織腫瘍、肝細胞がんまたは腺がんから選択されることを特徴とする請求項１３に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本発明は、生物医学の技術分野に関し、具体的には、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片および適用に関する。
本発明は、生物医学の技術分野に関し、具体的には、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片および適用に関する。
【0002】
［背景技術］
ＡＡＣＲの推計によると、２０１８年に米国で新たに悪性腫瘍と診断される患者数は１８０万人に達し、癌による死亡者数は６０万人を超え、心臓病に次ぐ２位となる。中国国立がんセンターが発表したデータによると、２０１４年に中国では合計３８０万人が新たにがんと診断され、同年のがんによる死亡者数は２３０万人に達した。制御されない細胞増殖は、悪性腫瘍の形成につながる重要な要因であり、腫瘍細胞は、自身の増殖を加速し、体の免疫系による攻撃から身を守るために、長い進化の過程で、腫瘍細胞に対する宿主の免疫監視を逃れるための一連の経路が取得された。Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒによって提案された癌免疫編集理論によれば、腫瘍細胞と宿主免疫系との関係は、排除（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）、平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）および回避（ｅｓｃａｐｅ）の三つの異なる段階に分けることができる。「排除」状態下で、新しい腫瘍細胞は、強い抗原性を有し、免疫系によって容易に識別され排除されるが、排除から生き残った腫瘍細胞は、免疫系と「平衡」状態に入り、宿主の腫瘍を有する生存状態を示す。しかし、宿主免疫系の選択圧を受けた腫瘍細胞の遺伝子の突然変異がある程度蓄積すると、平衡が崩れ、最終的な「回避」状態に入る。この段階の腫瘍細胞は、一連の悪性表現型を生成し、腫瘍抑制因子反応メカニズムを停止させ、正常な免疫反応を誘導するため、正常細胞として識別される可能性がある。腫瘍細胞中の細胞アポトーシスシグナル経路も変化し、免疫細胞によって誘導される腫瘍細胞のアポトーシスメカニズムが無効になる。さらに、腫瘍細胞は、急速かつ抑制されずに増殖するため、その結果生じる組織構造は、免疫細胞を阻害する微小環境を作り出す。腫瘍微小環境において、腫瘍細胞は、骨髄樹状細胞（ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）の活性化および分化を阻害するＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０等の免疫抑制機能を有する分子を放出し、それによって適応性免疫系を阻害する。同時に、末梢血およびリンパ節でＣＴＬＡ－４を発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することができ、これによりほかの免疫細胞が阻害され、免疫系が腫瘍に対する免疫寛容を発症する可能性がある。
ＡＡＣＲの推計によると、２０１８年に米国で新たに悪性腫瘍と診断される患者数は１８０万人に達し、癌による死亡者数は６０万人を超え、心臓病に次ぐ２位となる。中国国立がんセンターが発表したデータによると、２０１４年に中国では合計３８０万人が新たにがんと診断され、同年のがんによる死亡者数は２３０万人に達した。制御されない細胞増殖は、悪性腫瘍の形成につながる重要な要因であり、腫瘍細胞は、自身の増殖を加速し、体の免疫系による攻撃から身を守るために、長い進化の過程で、腫瘍細胞に対する宿主の免疫監視を逃れるための一連の経路が取得された。Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒによって提案された癌免疫編集理論によれば、腫瘍細胞と宿主免疫系との関係は、排除（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）、平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）および回避（ｅｓｃａｐｅ）の三つの異なる段階に分けることができる。「排除」状態下で、新しい腫瘍細胞は、強い抗原性を有し、免疫系によって容易に識別され排除されるが、排除から生き残った腫瘍細胞は、免疫系と「平衡」状態に入り、宿主の腫瘍を有する生存状態を示す。しかし、宿主免疫系の選択圧を受けた腫瘍細胞の遺伝子の突然変異がある程度蓄積すると、平衡が崩れ、最終的な「回避」状態に入る。この段階の腫瘍細胞は、一連の悪性表現型を生成し、腫瘍抑制因子反応メカニズムを停止させ、正常な免疫反応を誘導するため、正常細胞として識別される可能性がある。腫瘍細胞中の細胞アポトーシスシグナル経路も変化し、免疫細胞によって誘導される腫瘍細胞のアポトーシスメカニズムが無効になる。さらに、腫瘍細胞は、急速かつ抑制されずに増殖するため、その結果生じる組織構造は、免疫細胞を阻害する微小環境を作り出す。腫瘍微小環境において、腫瘍細胞は、骨髄樹状細胞（ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）の活性化および分化を阻害するＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０等の免疫抑制機能を有する分子を放出し、それによって適応性免疫系を阻害する。同時に、末梢血およびリンパ節でＣＴＬＡ－４を発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することができ、これによりほかの免疫細胞が阻害され、免疫系が腫瘍に対する免疫寛容を発症する可能性がある。
【0003】
腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ、ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の食作用は、阻害され、その理由は、ほぼすべての腫瘍細胞が表面でＣＤ４７タンパク質を高度に発現し、骨髄細胞表面のシグナル調節タンパク質α（ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α、ＳＩＲＰα）に結合して、体に「食べないでください（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」または「自己（ｓｅｌｆ）」というシグナルを送ることができ、それによって食作用を阻害する。インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ、ｉｎｔｅｒｇｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれるＣＤ４７は、，免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する広く発現された膜貫通型糖タンパク質である。ＣＤ４７の分子量は、５０ｋＤであり、構造は、多数のグリコシル化Ｎ－末端ＩｇＶ可変ドメイン、五つの高疎水性膜貫通ドメイン、および短いＣ－末端細胞質尾部を含み、Ｃ－末端細胞質尾部の四つの選択的スプライシング形態により、異なる組織におけるＣＤ４７の発現が決定される。それに対応するＳＩＲＰαは、ＳＨＰＳ－１、ＢＩＴまたはＣＤ１７２ａタンパク質と呼ばれ、それは、マクロファージ、骨髄樹状細胞、顆粒球、マスト細胞およびその前駆体細胞を含む骨髄細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ）で主に発現される、膜貫通タンパク質である。ＳＩＲＰαは、三つの細胞外Ｉｇ様ドメインおよび細胞質内の四つのチロシン残基で構成され、当該四つのチロシン残基は、リン酸化部位であると推測される。リン酸化されると、ＳＩＲＰαは、ＳＨＰ－１／２タンパク質のＳＨ２ドメインに結合して活性化することにより、下流のシグナル経路を活性化する。ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２タンパク質の発現は、組織特異的であるため、ＳＩＲＰαは、細胞外刺激に応答して下流のプロテインホスファターゼを動員して活性化するドッキングタンパク質である。Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇは、成熟赤血球（ＲＢＣ、ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）がＣＤ４７と脾臓マクロファージＳＩＲＰαの結合によって赤血球の除去から身を守ることを最初に報告した。その後研究者らは、ＲＢＣが単球ＳＩＲＰαに結合してＦｃγ受容体依存性食作用を阻害することもできることを発見し、これは、食作用における重要な分子であるミオシン－ＩＩＡ（ｍｙｏｓｉｎ－ＩＩＡ）の脱リン酸化によって達成される。臨床的には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、乳がん、膀胱がん、卵巣がん、結腸がん等を含む、様々な固形腫瘍および血液悪性腫瘍でＣＤ４７高発現の現象を発見し、その本質は、腫瘍細胞が上記のメカニズムを通じてマクロファージによる細胞毒性を回避することができる。ＣＤ４７は、他の受容体に結合するか、またはその細胞内細胞質領域を介してシグナル伝達したりすることで、他の生物学的プロセスにも影響を与える。ＣＤ４７とトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１）または血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ－２）との相互作用は、血管新生を阻害し、それによって腫瘍の増殖を制限する。
【0004】
多くの研究により、ＣＤ４７抗体またはＳＩＲＰα－Ｆｃ組換えタンパク質は、異なるマウスＰＤＸモデルにおいて役割を果たすことができることが証明されるが、シタラビン、ドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチン等の従来の化学療法薬またはリツキシマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、トラスツズマブと併用して使用される報告でも、良好な効果を有する。Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙらは、ＣＤ４７ナノボディおよびＰＤ－Ｌ１を併用して黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞のＳｙｎｇｅｎｅｉｃモデルにおいて良好な抗腫瘍効果を示し得ることを初めて報告した。近年、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４（悪性固形腫瘍：ＮＣＴ０２２１６４０９、血液悪性腫瘍：ＮＣＴ０２６７８３３８、ＮＣＴ０３２４８４７９、結腸がん：ＮＣＴ０２９５３７８２、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫：ＮＣＴ０２９５３５０９）、ＣＣ－９０００２（ＡＭＬおよび骨髄異形成症候群：ＮＣＴ０２６４１００２、進行性固形腫瘍および血液腫瘍：ＮＣＴ０２３６７１９６）、ＳＲＦ２３１（進行性固形腫瘍および血液腫瘍：ＮＣＴ０３５１２３４０）、ＳＩＲＰα－Ｆｃ組換えタンパク質ＴＴＩ－６６２（固形腫瘍：ＮＣＴ０２８９０３６８、血液悪性腫瘍および固形腫瘍：ＮＣＴ０２６６３５１８、骨髄腫およびリンパ腫：ＮＣＴ０３５３０６８３）、ＡＬＸ１４８（進行性固形腫瘍およびリンパ腫：ＮＣＴ０３０１３２１８）を含むＣＤ４７－ＳＩＲＰα経路に作用するいくつかの抗体が臨床フェーズＩに入る。
【0005】
ＣＤ４７自体の生物学的機能により、ＣＤ４７治療性抗体およびＳＩＲＰα－Ｆｃ組換えタンパク質が血液系毒性または貧血を引き起こすリスクを有する可能性があることが判明され、これは、ＣＤ４７遺伝子のノックアウトＮＯＤマウスおよびＣＤ４７抗体で処理されたマウスモデルで報告されている。さらに、内皮細胞ＣＤ４７は、細胞接着を介してＳＩＲＰγと相互作用することにより、Ｔ細胞の経内皮遊走（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を促進することが報告されるが、ＳＩＲＰγは、主に骨髄細胞ではなく、Ｔ細胞で発現される。
【0006】
従って、ＳＩＲＰα抗体は、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル経路を遮断するより好ましい選択として使用される。Ｓｔａｎｆｏｒｄ大学のＷｅｉｓｓｍａｎ研究グループは、ヒト化ＳＩＲＰα抗体ＫＷＡＲ２３とリツキシマブとの併用が、ヒトＳＩＲＰα遺伝子をノックインしたＳＲＧマウス（Ｒａｇ２－／－Ｉｌ２ｒγ－／－）におけるＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫の増殖を効果的に阻害できることを証明するが、ＫＷＡＲ２３を単独で使用した場合、明らかな効果はない。
【0007】
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明の目的は、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片および適用を提供することであり、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＳＩＲＰαタンパク質に結合し、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル経路を遮断することができる。
［発明が解決しようとする課題］
本発明の目的は、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片および適用を提供することであり、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＳＩＲＰαタンパク質に結合し、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル経路を遮断することができる。
【0008】
［課題を解決するための手段］
上記の目的を達成するために、本発明は、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片を提供し、それは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５に示されるようなＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列が、それぞれ
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、９；
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、３８、９；
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、４０、９；
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４１；
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４２；
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４３；
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１；
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、３８、４１；
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９の配列のいずれか一つに示されるようなＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む。
上記の目的を達成するために、本発明は、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片を提供し、それは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５に示されるようなＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列が、それぞれ
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、９；
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、３８、９；
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、４０、９；
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４１；
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４２；
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４３；
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１；
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、３８、４１；
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９の配列のいずれか一つに示されるようなＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む。
【0009】
ＶＬＣＤＲの配列は、次の表を参照することができる。
【0010】
【表1】
【0011】
選択可能に、前記可変領域は、マウス由来またはヒト由来ＦＲ領域をさらに含む。
選択可能に、前記ＦＲ領域の配列は、マウス由来であり、前記重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する。
選択可能に、前記ＦＲ領域の配列は、マウス由来であり、前記重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【0012】
選択可能に、前記ヒト由来ＦＲ領域は、重鎖ＦＲ領域配列を含み、前記重鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１－１８のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域およびＩＧＨＪ２＊０１のＦＲ４領域を含む、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１－１８およびＩＧＨＪ２＊０１の組み合わせ配列に由来する。
【0013】
選択可能に、前記ヒト由来ＦＲ領域は、軽鎖ＦＲ領域配列を含み、前記軽鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ４－１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域およびＩＧＫＪ２＊０１のＦＲ４領域を含む、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ４－１およびＩＧＫＪ２＊０１の組み合わせ配列に由来する。
【0014】
選択可能に、前記重鎖可変領域のＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列に由来し、前記重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【0015】
選択可能に、前記軽鎖可変領域のＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列に由来し、前記軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５のいずれか１項から選択されるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【0016】
選択可能に、前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、ヒト由来ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４またはその変異体から選択される重鎖定常領域、ならびにヒト由来κ鎖、λ鎖またはその変異体から選択される軽鎖定常領域をさらに含む。
【0017】
選択可能に、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ断片またはその変異体を含む。
選択可能に、前記Ｆｃ断片の変異体は、ＩｇＧ１に由来し、ＥＵナンバリングに基づいて、突然変異部位Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３３８Ａを含む。
選択可能に、前記Ｆｃ断片の変異体は、ＩｇＧ１に由来し、ＥＵナンバリングに基づいて、突然変異部位Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３３８Ａを含む。
【0018】
選択可能に、前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の重鎖配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を含む。
【0019】
選択可能に、前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、もしくは多重特異性抗体であるか、または、前記抗体もしくはその抗原結合断片は、抗体薬物複合体の調製に使用される。
【0020】
選択可能に、前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の構造形態は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＳｃＦｖである。
本発明は、上記の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片、ならびに一つまたは複数の種の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物をされに提供する。
本発明は、上記の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片、ならびに一つまたは複数の種の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物をされに提供する。
【0021】
本発明は、上記の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸分子をさらに提供する。
本発明は、上記の核酸分子を含む、担体をさらに提供する。
本発明は、上記の核酸分子を含む、担体をさらに提供する。
【0022】
本発明は、上記の担体を使用して形質転換された宿主細胞をさらに提供する。
本発明は、疾患、病症または状況を阻害または治療するための薬物の調製における、上記の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の用途をさらに提供する。
本発明は、疾患、病症または状況を阻害または治療するための薬物の調製における、上記の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の用途をさらに提供する。
【0023】
選択可能に、前記薬物は、前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片を一つまたは複数の種の他の癌治療剤と併用することによって調製される。
【0024】
選択可能に、前記疾患、病症または状況は、癌、固形腫瘍、慢性感染症、炎症性疾患、多発性硬化症、自己免疫性疾患、神経系疾患、脳損傷、神経損傷、赤血球増加症、ヘモクロマトーシス、外傷、敗血症性ショック、線維症、アテローム性動脈硬化症、肥満、ＩＩ型糖尿病、移植片の機能不全または関節炎を含む。
【0025】
選択可能に、前記癌は、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞がん、胆嚢がん、胃がん、肺がん、気管支がん、骨がん、肝胆管がん、膵臓がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、腎盂および尿管がん、唾液腺がん、小腸がん、尿道がん、膀胱がん、頭頚部がん、脊椎がん、脳がん、子宮頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、消化器がん、皮膚がん、前立腺がん、下垂体がん、膣がん、甲状腺がん、喉頭癌、膠芽腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、肉腫、奇形種、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞またはＢ細胞リンパ腫、消化管間質腫瘍、軟部組織腫瘍、肝細胞がんまたは腺がんから選択される。
【0026】
本発明は、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との結合を遮断するための製剤の調製における上記の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の適用をさらに提供し、前記製剤は、検出剤を含む。
【0027】
［発明の効果］
従来技術と比較して、本発明は、次のような有益な効果を有する。
（１）本発明によって提供される抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＳＩＲＰαタンパク質に結合し、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル経路を遮断することができ、腫瘍の治療または腫瘍抗体医薬品の調製への使用が期待される。
従来技術と比較して、本発明は、次のような有益な効果を有する。
（１）本発明によって提供される抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＳＩＲＰαタンパク質に結合し、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル経路を遮断することができ、腫瘍の治療または腫瘍抗体医薬品の調製への使用が期待される。
【0028】
（２）本発明によって提供される抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＳＩＲＰαタンパク質のすべてのサブタイプに結合することができ、臨床開発に有益である。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図2】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図3】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図4】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図5】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図6】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図7】Ｂｌｏｃｋｉｎｇ－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図8】ヒトＳＩＲＰａを天然発現するヒト腎明細胞腺がん細胞７８６－Ｏ細胞に結合するＳＩＲＰα抗体のＦＡＣＳ検出結果である。
【図9】抗ＳＩＲＰα抗体のインビトロ機能実験のＡＤＣＰ結果である。
【図10】抗ＳＩＲＰα抗体のインビトロ機能実験のＡＤＣＰ結果である。
【図11】抗ＳＩＲＰα抗体のインビトロ機能実験のＡＤＣＰ結果である。
【図12】各群における腫瘍画像信号値応答の腫瘍増殖曲線およびＤ１８画像シグナル強度結果を示すグラフである。
【図13】各群の生存曲線である。
【図14】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図15】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図16】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図17】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図18】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図19】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図20】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図21】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図22】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図23】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図24】既知のヒトＳＩＲＰ ａｌｐｈａ結合ドメイ対立遺伝子のアミノ酸配列の比較図である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
以下、添付の図面および実施例を合わせて、本発明の技術的解決策をさらに説明する。
本実験において具体的な条件を定めていない実験方法については、通常、従来の条件に従うか、または原料もしくは商品メーカーが提示する条件に従う。具体的な出所が示されていない試薬は、市場で購入された従来の試薬である。
本実験において具体的な条件を定めていない実験方法については、通常、従来の条件に従うか、または原料もしくは商品メーカーが提示する条件に従う。具体的な出所が示されていない試薬は、市場で購入された従来の試薬である。
【0031】
用語：
「抗体」（ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂ）とは、少なくとも一つの抗原結合部位を含み、かつ抗原に特異的に結合できる免疫グロブリン分子（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ）を指す。
「抗体」（ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂ）とは、少なくとも一つの抗原結合部位を含み、かつ抗原に特異的に結合できる免疫グロブリン分子（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ）を指す。
【0032】
「抗原」は、体内で免疫応答を誘導し、かつ抗体に特異的に結合できる物資である。抗体と抗原との結合は、両者間で形成された水素結合、ファンデルワールス力、イオン結合および疎水結合を含む、相互作用によって媒介される。抗原の表面と抗体とを結合する領域は、「抗原決定基」または「エピトープ」であり、一般に各抗原には、複数の決定基が存在する。
【0033】
本発明で言及される「抗体」という用語は、その最も広い意味で理解され、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体断片、少なくとも二つの異なる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む。抗体は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体および他の起源の抗体をさらに含む。本発明の抗体は、ヒト、非ヒト霊長類動物、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ニワトリ、ラクダ、ラマ（Ｌｌａｍａ）、アルパカ（Ａｌｐａｃａ）、グアナコ（Ｇｕａｎａｃｏ）、ビクーニャ（Ｖｉｃｕｎａｓ）の免疫グロブリン分子等を含むがこれらに限定されない、任意の動物に由来することができる。抗体は、非天然アミノ酸、Ｆｃエフェクター機能の突然変異およびグリコシル化部位の突然変異等の追加の変化を含むことができる。抗体は、これらの抗体が所望の生物学的活性を示す限り、翻訳後修飾された抗体、抗体の抗原決定基を含む融合タンパク質、ならびに抗原識別部位に対する他の任意の修飾を含む免疫グロブリン分子をさらに含む。
【0034】
抗体の基本的構造は、二つの完全同一の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｈ）および二つの完全同一の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｌ）がジスルフィド結合によって連結されたＹ字型のモノマーである。各鎖は、それぞれ、類似した配列を有するが異なる機能を有する約１１０アミノ酸の２～５個のドメイン（機能領域と呼ばれる）で構成される。抗体分子のＮ末端付近の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、大きく変化し、形成されたドメインは、可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、Ｖ領域）と呼ばれ、Ｃ末端近くのアミノ酸配列の比較的一定な領域は、定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ、Ｃ領域）と呼ばれる。
【0035】
重鎖および軽鎖のＶ領域は、それぞれＶＨおよびＶＬと呼ばれ、ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＨＶＲ）と呼ばれる、非常に可変性の高いアミノ酸組成および配列を有する三つの領域があり、当該領域は、抗原性エピトープに相補的な空間構造を形成し、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）と呼ばれる。ＶＨの三つのＣＤＲは、それぞれＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３で表され、ＶＬの三つのＣＤＲは、それぞれＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３で表される。ＶＨおよびＶＬの合計六つのＣＤＲが一緒になって抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を形成する。ＣＤＲ領域のアミノ酸の多様性は、多数の異なる抗原に対する抗体の特異的結合の分子基盤である。Ｖ領域のＣＤＲを除くアミノ酸の組成および配列には、比較的変化が少なく、これは、スケルトン領域またはフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。ＶＨおよびＶＬは、それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で表される四つのスケルトン領域を有する。各ＶＨおよびＶＬは、三つのＣＤＲおよび四つのＦＲで構成され、アミノ基末端からカルボキシル基末端までの配列は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４となる。
【0036】
抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列に従って、ヒト免疫グロブリンは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの五つのクラスに分類されることができる。それは、様々なサブクラス（アイソタイプ）に分類されることができ、例えば、ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分類されることができ、ＩｇＡは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類されることができる。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥには、サブクラスがあることがまだわかっていない。軽鎖のアミノ酸配列に従って、軽鎖は、κ鎖およびλ鎖に分類されることができる。本発明の抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）のものであり得る。
【0037】
重鎖および軽鎖の定常領域は、それぞれＣＨおよびＣＬと呼ばれる。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤの重鎖定常領域には、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の三つのドメインがあり、ＩｇＭおよびＩｇＥの重鎖定常領域には、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４の四つのドメインがある。
【0038】
ＣＨ１とＣＨ２との間は、ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）であり、プロリンが豊富に含まれているため、伸ばしたり曲げたりしやすく、Ｙ字型の２本のアーム間の距離を変更できるため、２本のアームが抗原エピトープに同時に結合しやすくなる。
【0039】
「抗原結合断片」とは、抗原結合活性を有するＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ＳｃＦｖ断片等を指す。「Ｆａｂ断片」（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｆａｂ）とは、単一の抗原性エピトープ（一価）に結合する、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指す。当業者は、パパインがＩｇＧを加水分解して二つの同一のＦａｂセグメントおよび一つのＦｃセグメントを形成し、ペプシンがＩｇＧを加水分解して一つのＦ（ａｂ’）２セグメントおよびいくつかのポリペプチド断片（ｐＦｃ’）を形成する。Ｆ（ａｂ’）２重鎖間のジスルフィド結合が切断される場合、二つのＦａｂ’断片を形成し、後者は、さらに酵素的に分解されてＦｖ断片を形成する。Ｆｖ断片は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むが、定常領域を含まない。一本鎖可変断片ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ）または一本鎖抗体は、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で連結された抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域で構成される。
【0040】
「Ｆｃ」、「Ｆｃセグメント」または「Ｆｃ断片」という用語は、抗原結合活性を有さない結晶化可能な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）を指し、抗体がエフェクター分子または細胞表面Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）と相互作用する部位である。Ｆｃ断片は、重鎖定常領域ＣＨ１を除く抗体の定常領域のポリペプチドを含む。Ｆｃ断片は、その表面に対応するＦｃ受容体を有する細胞に結合し、様々な生物学的効果を生み出す。ＡＤＣＣ効果（交代依存性細胞媒介細胞障害、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）において、抗体のＦａｂセグメントは、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞の抗原エピトープに結合し、そのＦｃセグメントは、殺傷細胞（ＮＫ細胞、マクロファージ等）の表面のＦｃＲに結合し、殺傷細胞による標的細胞の直接の殺傷を媒介する。ＡＤＣＰは。抗体依存性細胞食作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）であり、ＡＤＣＰのメカニズムは、抗体によって作用された標的細胞がマクロファージ表面上のＦｃγＲメカニズムを活性化し、食作用を誘導し、標的細胞を内部に取り込み、ファゴソームを酸性化して分解することである。いくつかの特定の場合では、抗体のＦｃ機能を廃止することが有益な場合がある。これらのシナリオには、（１）細胞シグナル伝達を誘導する受容体アゴニストとして、（２）受容体とリガンドとの結合を遮断し、シグナル伝達を阻害する受容体アンタゴニストとして、または、（３）対応する抗原を発現する標的細胞に薬物を送達するための薬物担体としての抗体の使用が含まれる。Ｆｃの機能が維持されると、抗体医薬品が対応する受容体を発現する細胞を誤って損傷し、抗体とカップリングした薬物が重要な免疫細胞を誤って損傷する可能性がある。
【0041】
Ｆｃ変異体または突然変異の組み合わせは、以下の携帯に限定されない（ＥＵナンバリングに基づく）。
【0042】
【表2】
【0043】
本発明に記載の抗体または抗原結合断片のＣＤＲアミノ酸残基は、数および位置で既知のＫａｂａｔ番号付け規則に従う。
現在、マウス由来抗体は、抗体医薬品の主要な供給源となっている。マウス抗体は、免疫原性があるため、一般にヒト化処理される。以下の実施例では、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体を提供する。「キメラ抗体」とは、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を融合させた抗体であり、マウス抗体によって誘発される免疫応答を軽減することができる。ヒト抗体の定常領域は、ヒト由来ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域から選択されることができ、ならびにヒト由来κ鎖、λ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域から選択されることができる。「ヒト化抗体」とは、マウス抗体のＣＤＲ配列をヒト抗体の可変領域フレームワークに移植した抗体を指し、大量のマウスタンパク質成分を保持するため、キメラ抗体によって引き起こされる強い反応を克服することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースまたは公開された参照文献から入手されることができる。免疫原性の低下による活性の低下を避けるために、ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に最小限の逆突然変異または復帰突然変異を施して、活性維持することができる。
現在、マウス由来抗体は、抗体医薬品の主要な供給源となっている。マウス抗体は、免疫原性があるため、一般にヒト化処理される。以下の実施例では、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体を提供する。「キメラ抗体」とは、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を融合させた抗体であり、マウス抗体によって誘発される免疫応答を軽減することができる。ヒト抗体の定常領域は、ヒト由来ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域から選択されることができ、ならびにヒト由来κ鎖、λ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域から選択されることができる。「ヒト化抗体」とは、マウス抗体のＣＤＲ配列をヒト抗体の可変領域フレームワークに移植した抗体を指し、大量のマウスタンパク質成分を保持するため、キメラ抗体によって引き起こされる強い反応を克服することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースまたは公開された参照文献から入手されることができる。免疫原性の低下による活性の低下を避けるために、ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に最小限の逆突然変異または復帰突然変異を施して、活性維持することができる。
【0044】
理論的には、抗体親和性の向上は、抗体の特異性および効力の向上に役立ち、薬剤の投与量を減少させ、毒性および副作用を軽減するのに役立つ。実際の研究作業では、特に固形腫瘍の治療において、親和性の向上及び抗体力価の向上が必ずしも直線的ではないことが証明されているが、多くの場合、この線形関係は、明らかである。本発明のヒト化抗体は、ファージディスプレイによりＣＤＲをさらに親和性成熟させた後のヒト化抗体も含む。インビトロでの抗体親和性成熟の理論的基礎は、インビボでの抗体親和性のプロセスを模倣することである。ランダム突然変異ライブラリを構築し、インビボでのＢ細胞の高頻度突然変異を模倣することにより、こう親和性抗体をスクリーニングすることができる。
【0045】
本発明によって提供される薬物は、「治療有効量」の抗体または抗原結合断片を含むことができる。「治療有効量」とは、具体的な疾患を効果的に予防または緩和するための治療剤の量を指し、これは、患者の疾患状態、年齢および体重、ならびに患者ごとに望ましい効果を生み出す薬剤の能力などの様々な要因によって異なる場合がある。
【0046】
「配列同一性」とは、二つのポリヌクレオチド配列間または二つのポリペプチド間の配列類似性を指し、二つのポリヌクレオチドまたは二つのポリペプチドの間には、同じ塩基またはアミノ酸を有する程度である。本発明に記載の「少なくとも８５％の配列同一性を有する」とは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性に達することを指す。
【0047】
Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＡＤＣｓ、抗体薬物複合体）とは、一つまたは複数の化学薬品（任意選択で、治療剤または細胞障害性薬剤であり得る）に結合した結合タンパク質を指す。抗体薬物複合体は、細胞障害性小分子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）および抗体を永久または不安定な化学リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して結合することによって取得されることができる。ＡＤＣは、細胞障害性薬剤を選択的かつ持続的に腫瘍に送達されることができる。
【0048】
ＳＩＲＰαをコードする遺伝子は、多型遺伝子（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｇｅｎｅ）であり、ヒト集団には１０種類のＳＩＲＰα変異体が知られている。Ｋａｔｓｕｔｏ Ｔａｋｅｎａｋａらは、ヒトＨａｐＭａｐゲノムプロジェクトから３７人の血縁関係のない正常な白人、アフリカ人、中国人および日本人のＩｇＶをコードするＳＩＲＰ ａｌｐｈａドメインをシーケンシングし、１０個の異なるＳＩＲＰ ａｌｐｈａ ＩｇをＶコードする対立遺伝子を発見した（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ Ｓｉｒｐａ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＮＡＴＵＲＥ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ＶＯＬＵＭＥ ８ ＮＵＭＢＥＲ １２ ＤＥＣＥＭＢＥＲ ２００７）。１０個のＳＩＲＰα変異体は、それぞれＳＩＲＰα Ｖ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプである。ＳＩＲＰａｌｐｈａは、高度に多型的であるが、ＣｈｉａＣｈｉＭ．Ｈｏらによる既知のヒトＳＩＲＰａｌｐｈａ対立遺伝子のアミノ酸配列の比較では、ＳＩＲＰ ａｌｐｈａとＣＤ４７との間の結合海面には、それぞれ対立遺伝子Ｖ１（ａ２ｄ１）型およびＶ２（ａ１ｄ１）型の、二つの固有の配列のみが存在することが示される。（「Ｖｅｌｃｒｏ」 Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＤ４７ Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ａｓ Ｓｉｇｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＩＲＰ ａｌｐｈａ）Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ Ｔｈａｔ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＶＯＬＵＭＥ ２９０ ・ＮＵＭＢＥＲ ２０・ＭＡＹ １５，２０１５）。
【0049】
図２４に示されるように、既知のヒトＳＩＲＰ ａｌｐｈａ結合ドメイン対立遺伝子のアミノ酸配列比較により、ＣＤ４７接触界面における二つの変異のみ、ａ１ｄ１およびａ２ｄ１が明らかになった。図２４の１行目のテキストは、最も顕著なヒトＳＩＲＰ ａｌｐｈａ対立遺伝子Ｖ１（ａ２ｄ１）のアミノ酸配列であり、図１の２行目のテキストは、最も顕著なヒトＳＩＲＰ対立遺伝子Ｖ２（ａ１ｄ１）のアミノ酸配列である。黒のボックスは、ＣＤ４７と相互作用する残基を示し、陰影は、Ｖ１配列とは異なる残基を示す。Ｊａｎｅｔ Ｓｉｍらによる２５３５人の個体ＳＩＲＰα配列および５１０個のサンプルからのＳａｎｇｅｒシーケンシングにより、ホモ接合ｖ１／ｖ１、ホモ接合ｖ２／ｖ２、ヘテロ接合ｖ１／ｖ２の三つの対立遺伝子グループを表す、二つのＳＩＲＰα変異体ｖ１およびｖ２が同定される。様々な集団および無関係な部分集団では、ＳＩＲＰα ｖ１およびｖ２対立遺伝子群の分布および頻度が決定される。ここで、ヨーロッパ（ＥＵＲ）、米国（ＡＭＲ）、東アジア（ＥＡＳ）、アフリカ（ＡＦＲ）および南アジア（ＳＡＳ）の五つのスーパーグループにおけるｖ１／ｖ２ヘテロ接合の分布は、同様であり、分布範囲は、４２．０％～４７．２％である。東アジアの人口におけるｖ２／ｖ２の数は、ｖ１／ｖ１の数よりも大幅に多く、発生頻度は、それぞれ４２．３％および１３．３％であり、アフリカ、ヨーロッパ、米国、および南アジアの集団では、ｖ１／ｖ１の数は、ｖ２／ｖ２の数よりも多く、ｖ１およびｖ２の発生頻度の範囲は、それぞれ３０．３～４９．１％および８．９～２４．２％である（参照文献については、ＭＡＢＳ，２０１９， ＶＯＬ． １１， ＮＯ． ６， １０３６¨Ｃ１０５２，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１９．１６２４１２３を参照する）。Ａｄｕｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｈも、東アジア人口におけるｖ２／ｖ２ホモ接合の発生頻度が４１．３％であり、ｖ１／ｖ１ホモ接合の発生頻度は、３４．６％であることを調査し、これは、東アジア人口の４１．３％の人が、Ｖ２／Ｖ２ホモ接合であることも証明される（参照文献については、Ｖｏｅｔｓ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（２０１９）７：３４０を参照する）。
【0050】
ＳＩＲＰα多型分析の結果に基づくと、臨床開発を促進するには、抗ＳＩＲＰα抗体がＳＩＲＰα ｖ１型遺伝子およびＳＩＲＰａ ｖ２型遺伝子の両方に結合できることが重要である。
【0051】
実施例１：抗ＳＩＲＰαマウス抗体の取得
（１）マウス免疫：
抗ヒトＳＩＲＰαモノクローナル抗体は、マウスを免疫することによって産生される。実験には、生後６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃホワイトマウスを使用する。飼育環境：ＳＰＦグレード。マウスを購入した後、１２／１２時間の明／暗サイクル調節、温度２０～２５℃、湿度４０～６０％の実験室環境で１週間飼育する。Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）５０μｇ／マウスによる組換えタンパク質ＱＰ００９（ＳＩＲＰα）を２週間免疫化した後、その後、ＱＰ００９（ＳＩＲＰα）とフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）またはＱＰ００９（ＳＩＲＰα）とアルミニウム塩Ａｌｕｍ＋ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６を、２５μｇ／マウスで週に１回相互に免疫する。
（１）マウス免疫：
抗ヒトＳＩＲＰαモノクローナル抗体は、マウスを免疫することによって産生される。実験には、生後６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃホワイトマウスを使用する。飼育環境：ＳＰＦグレード。マウスを購入した後、１２／１２時間の明／暗サイクル調節、温度２０～２５℃、湿度４０～６０％の実験室環境で１週間飼育する。Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）５０μｇ／マウスによる組換えタンパク質ＱＰ００９（ＳＩＲＰα）を２週間免疫化した後、その後、ＱＰ００９（ＳＩＲＰα）とフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）またはＱＰ００９（ＳＩＲＰα）とアルミニウム塩Ａｌｕｍ＋ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６を、２５μｇ／マウスで週に１回相互に免疫する。
【0052】
ＱＰ００９（ＳＩＲＰα）は、以下に示されるようなアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有する。
【0053】
【表3】
【0054】
（２）細胞融合：
血清中の抗体力価が高いマウスを選択して、脾細胞を融合する。融合の７２時間前に、選択したマウスを腹腔内注射で免疫する。最適化されたＰＥＧ媒介性融合段階を使用して、脾臓リンパ球を骨髄腫Ｓｐ２／０細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得る。融合したハイブリドーマ細胞をＨＡＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴおよび１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）に再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレート（１×１０５細胞／１５０μｌ／ウェル）に分配し、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。融合後５日目に２０％ＦＢＳのＩＭＤＭ培地（２×ＨＡＴおよび１×ＯＰＩ）を加え、５０μｌ／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。融合後７～８日目に、細胞増殖密度に応じて、培地を完全に交換し、培地は、ＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴおよび１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）であり、２５０μｌ／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
血清中の抗体力価が高いマウスを選択して、脾細胞を融合する。融合の７２時間前に、選択したマウスを腹腔内注射で免疫する。最適化されたＰＥＧ媒介性融合段階を使用して、脾臓リンパ球を骨髄腫Ｓｐ２／０細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得る。融合したハイブリドーマ細胞をＨＡＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴおよび１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）に再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレート（１×１０５細胞／１５０μｌ／ウェル）に分配し、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。融合後５日目に２０％ＦＢＳのＩＭＤＭ培地（２×ＨＡＴおよび１×ＯＰＩ）を加え、５０μｌ／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。融合後７～８日目に、細胞増殖密度に応じて、培地を完全に交換し、培地は、ＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴおよび１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）であり、２５０μｌ／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
【0055】
（３）ハイブリドーマ細胞のスクリーニング：
細胞増殖密度に従って、融合後１０～１４日目に、ＥＬＩＳＡ検出を実施して、ハイブリドーマ上清中の抗ＳＩＲＰα抗体をスクリーニングする。ハイブリドーマ融合ウェルの上清を取り、ＥＬＩＳＡによって、９６ウェルプレートを一次スクリーニングしたところ、上清中の抗ＳＩＲＰα抗体がＳＩＲＰα／ＣＤ４７の結合を遮断でき、即ち、一次スクリーニングの陽性ウェルであることが検出される。一次スクリーニングの陽性ウェルの上清を取り、ＥＬＩＳＡによって、ＱＰ００９（ＳＩＲＰα）に結合し、ＳＩＲＰαに結合し、かつＳＩＲＰα／ＣＤ４７の結合を遮断でき、すべて陽性であるクローンを選択し、即ち、抗ＳＩＲＰα抗体の陽性クローンウェルであることが検出される。陽性クローンを拡大し、かつ適時に２４／６ウェルプレートに移し、ＥＬＩＳＡによって、細胞培養上清のＳＩＲＰαへの結合、およびＳＩＲＰα／ＣＤ４７を遮断できる結合は、すべて陽性クローンウェルであり、即ち、抗ＳＩＲＰα抗体陽性のクローンウェルであることが検出される。陽性クローンを２～３回限界希釈して、単一細胞クローンし、陽性単一細胞株を凍結保存して、単一細胞クローン７１Ｃ１０を得る。
細胞増殖密度に従って、融合後１０～１４日目に、ＥＬＩＳＡ検出を実施して、ハイブリドーマ上清中の抗ＳＩＲＰα抗体をスクリーニングする。ハイブリドーマ融合ウェルの上清を取り、ＥＬＩＳＡによって、９６ウェルプレートを一次スクリーニングしたところ、上清中の抗ＳＩＲＰα抗体がＳＩＲＰα／ＣＤ４７の結合を遮断でき、即ち、一次スクリーニングの陽性ウェルであることが検出される。一次スクリーニングの陽性ウェルの上清を取り、ＥＬＩＳＡによって、ＱＰ００９（ＳＩＲＰα）に結合し、ＳＩＲＰαに結合し、かつＳＩＲＰα／ＣＤ４７の結合を遮断でき、すべて陽性であるクローンを選択し、即ち、抗ＳＩＲＰα抗体の陽性クローンウェルであることが検出される。陽性クローンを拡大し、かつ適時に２４／６ウェルプレートに移し、ＥＬＩＳＡによって、細胞培養上清のＳＩＲＰαへの結合、およびＳＩＲＰα／ＣＤ４７を遮断できる結合は、すべて陽性クローンウェルであり、即ち、抗ＳＩＲＰα抗体陽性のクローンウェルであることが検出される。陽性クローンを２～３回限界希釈して、単一細胞クローンし、陽性単一細胞株を凍結保存して、単一細胞クローン７１Ｃ１０を得る。
【0056】
（４）ハイブリドーマモノクローナル抗体のシーケンシングによって得られる抗体配列：
ハイブリドーマ陽性モノクローナル細胞株７１Ｃ１０を取り、ｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写して、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用し、ＰＣＲ陽性クローンを選択してシーケンシングし、配列を分析して、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列を得る。
ハイブリドーマ陽性モノクローナル細胞株７１Ｃ１０を取り、ｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写して、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用し、ＰＣＲ陽性クローンを選択してシーケンシングし、配列を分析して、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列を得る。
【0057】
７１Ｃ１０の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であり、具体的には、次のとおりである。
【0058】
【表4】
【0059】
７１Ｃ１０の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６であり、具体的には、次のとおりである。
【0060】
【表5】
【0061】
実施例２：抗ＳＩＲＰαキメラ抗体の親和性のＳＰＲ検出
（１）モノクローナル細胞株７１Ｃ１０のマウス可変領域配列をヒト定常領域遺伝子と融合させて、キメラ抗体分子を取得する。抗体軽鎖は、ｋａｐｐａ軽鎖定常領域ＣＬを使用する。同時に、異なる抗原配列は、抗体分子の性能試験に使用されるように設定される。抗原およびキメラ抗体の分子クローニング設計については、表１および表２を参照する。
（１）モノクローナル細胞株７１Ｃ１０のマウス可変領域配列をヒト定常領域遺伝子と融合させて、キメラ抗体分子を取得する。抗体軽鎖は、ｋａｐｐａ軽鎖定常領域ＣＬを使用する。同時に、異なる抗原配列は、抗体分子の性能試験に使用されるように設定される。抗原およびキメラ抗体の分子クローニング設計については、表１および表２を参照する。
【0062】
【表6】
【0063】
ｐＱＤは、シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）断片を有する担体の名称であり、ここで、ｐＱＤＨは、シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ）断片を有する重鎖可変領域の連結および発現に使用され、ｐＱＤＫは、シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＬ）断片を有する軽鎖可変領域の連結および発現に使用される。「Ｈ」は、重鎖を表し、「Ｌ」は、軽鎖を表される。「（ＩｇＧ４）」は、重鎖がヒトＩｇＧ４の定常領域を使用することを表す。「（ＩｇＧ４）」がマークされていない場合、デフォルトでヒト由来ＩｇＧ１の定常領域が使用される。１８０１２２ＶＨは、モノクローナル細胞株７１Ｃ１０由来の重鎖可変領域を表し、１８０１２２ＶＬは、モノクローナル細胞株７１Ｃ１０由来の軽鎖可変領域を表す。
【0064】
例示的に、「ｐＱＤＨ－ＫＷＡＲ２３－Ｈ」は、対照配列ＫＷＡＲ２３がｐＱＤＨ担体に融合されることを表し、ｐＱＤＨは、シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ）断片を有し、ヒト由来ＩｇＧ１の定常領域を使用する。「ｐＱＤＨ－１８０１２２ＶＨ」は、重鎖可変領域配列１８０１２２ＶＨがｐＱＤＨ担体に融合されることを表し、ヒト由来ＩｇＧ１の定常領域を使用する。上記の配列番号に示される配列は、具体的に次のとおりである。
【0065】
【表7】
【0066】
【表8】
【0067】
【表9】
【0068】
【表10】
【0069】
【表11】
【0070】
【表12】
【0071】
【表13】
【0072】
（２）抗原およびキメラ抗体の発現、精製
２９３Ｅ細胞の培養密度は、（０．２～３）×１０６／ｍｌの間に維持され、維持段階培地（ＧＩＢＣＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）で培養し、トランスフェクション前日に、トランスフェクション細胞を遠心分離して培地を交換し、細胞密度を（０．５～０．８）×１０６／ｍｌに調節する。トランスフェクション当日に、２９３Ｅ細胞密度は、（１～１．５）×１０６／ｍｌである。プラスミドおよびトランスフェクション試薬ＰＥＩを準備し、トランスフェクションするプラスミドの量は、１００μｇ／１００ｍｌ細胞であり、ＰＥＩとプラスミドとの質量比は、２：１である。プラスミドおよびＰＥＩを均一に混合し、１５分間放置し、２０分内にする。プラスミドおよびＰＥＩの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーに入れて培養し、トランスフェクション５日目に、水平遠心分離機で４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞上清を収集する。
２９３Ｅ細胞の培養密度は、（０．２～３）×１０６／ｍｌの間に維持され、維持段階培地（ＧＩＢＣＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）で培養し、トランスフェクション前日に、トランスフェクション細胞を遠心分離して培地を交換し、細胞密度を（０．５～０．８）×１０６／ｍｌに調節する。トランスフェクション当日に、２９３Ｅ細胞密度は、（１～１．５）×１０６／ｍｌである。プラスミドおよびトランスフェクション試薬ＰＥＩを準備し、トランスフェクションするプラスミドの量は、１００μｇ／１００ｍｌ細胞であり、ＰＥＩとプラスミドとの質量比は、２：１である。プラスミドおよびＰＥＩを均一に混合し、１５分間放置し、２０分内にする。プラスミドおよびＰＥＩの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーに入れて培養し、トランスフェクション５日目に、水平遠心分離機で４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞上清を収集する。
【0073】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製：カラムを通過する平衡液を少なくとも３ＣＶ使用し、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致するように確保し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎであり、遠心分離後の培地の上清をカラムに通し、４０ｍｌのサンプルをローディングし、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、カラムを通過する平衡液を少なくとも３ＣＶ使用し、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致するように確保し、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに上昇すると溶出ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに低下すると収集を停止し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎである。サンプルを収集完了後、ｐＨ調節液でＰＡＣ－ＥＰを中性に調節する。
【0074】
（３）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性の検出
ヒトＳＩＲＰαＶ１型（タンパク質番号ＱＰ０９４）およびヒトＳＩＲＰαＶ２型（タンパク質番号ＱＰ０９６）に対するＳＩＲＰαキメラ抗体ＱＰ１６３１６４の親和性をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）によって測定する。表３および表４は、ＱＰ１６３１６４およびＱＰ０２６０２７の検出結果を示す。結果によると、ＳＩＲＰαキメラ抗体ＱＰ１６３１６４は、ヒトＳＩＲＰαＶ１型への結合について５．２７Ｅ－１０Ｍの親和性ＫＤ値を有し、ヒトＳＩＲＰαＶ２型への結合について６．７８Ｅ－１０Ｍの親和性ＫＤ値を有することを示す。ヒトＳＩＲＰαＶ１型およびヒトＳＩＲＰαＶ２型の結合親和性は、対照抗体ＫＷＡＲ２３（ＱＰ０２６０２７）の結合よりも大幅に優れている。
ヒトＳＩＲＰαＶ１型（タンパク質番号ＱＰ０９４）およびヒトＳＩＲＰαＶ２型（タンパク質番号ＱＰ０９６）に対するＳＩＲＰαキメラ抗体ＱＰ１６３１６４の親和性をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）によって測定する。表３および表４は、ＱＰ１６３１６４およびＱＰ０２６０２７の検出結果を示す。結果によると、ＳＩＲＰαキメラ抗体ＱＰ１６３１６４は、ヒトＳＩＲＰαＶ１型への結合について５．２７Ｅ－１０Ｍの親和性ＫＤ値を有し、ヒトＳＩＲＰαＶ２型への結合について６．７８Ｅ－１０Ｍの親和性ＫＤ値を有することを示す。ヒトＳＩＲＰαＶ１型およびヒトＳＩＲＰαＶ２型の結合親和性は、対照抗体ＫＷＡＲ２３（ＱＰ０２６０２７）の結合よりも大幅に優れている。
【0075】
【表14】
【0076】
ｂｉａｃｏｒｅによって測定されたキメラ抗体とカニクイザルＳＩＲＰαとの間の親和性は、次のとおりである。
【0077】
【表15】
【0078】
実施例３：抗ＳＩＲＰαハイブリドーマモノクローナル抗体のヒト化
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子データベースおよびＭＯＥソフトウェアを比較することにより、ＱＰ１６３１６４と高い相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子をテンプレートとして選択し、マウス抗体のＣＤＲを対応するヒトテンプレートにそれぞれ移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で可変領域配列を形成する。復帰突然変異の組み合わせに重要なアミノ酸残基をいくつか選択する。ここで、アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定され、かつ注釈される。以下の実施例において、重鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１－１８およびＩＧＨＪ２＊０１の組み合わせ配列に由来し、それは、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１－１８のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域およびＩＧＨＪ２＊０１のＦＲ４領域を含む。軽鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ４－１およびＩＧＫＪ２＊０１の組み合わせ配列に由来し、それは、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ４－１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域およびＩＧＫＪ２＊０１のＦＲ４領域を含む。
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子データベースおよびＭＯＥソフトウェアを比較することにより、ＱＰ１６３１６４と高い相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子をテンプレートとして選択し、マウス抗体のＣＤＲを対応するヒトテンプレートにそれぞれ移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で可変領域配列を形成する。復帰突然変異の組み合わせに重要なアミノ酸残基をいくつか選択する。ここで、アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定され、かつ注釈される。以下の実施例において、重鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１－１８およびＩＧＨＪ２＊０１の組み合わせ配列に由来し、それは、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１－１８のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域およびＩＧＨＪ２＊０１のＦＲ４領域を含む。軽鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ４－１およびＩＧＫＪ２＊０１の組み合わせ配列に由来し、それは、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ４－１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域およびＩＧＫＪ２＊０１のＦＲ４領域を含む。
【0079】
（１）抗ＳＩＲＰα抗体のヒト化分子クローニング
プライマーＰＣＲを設計して、各ヒト化抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子断片を構築し、発現担体ｐＱＤ（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）断片を有する）と相同組換えを行い、抗体全長発現担体ＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＱＤ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＱＤを構築する。
プライマーＰＣＲを設計して、各ヒト化抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子断片を構築し、発現担体ｐＱＤ（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）断片を有する）と相同組換えを行い、抗体全長発現担体ＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＱＤ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＱＤを構築する。
【0080】
オンラインソフトウェアＤＮＡＷｏｒｋｓ（ｖ３．２．２）（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ／）を使用して、組換えに必要な遺伝子断片５’－３０ｂｐシグナルペプチド＋ＶＨ／ＶＫ＋３０ｂｐ ＣＨ１／ＣＬ－３’を含むＶＨ／ＶＫを合成するための複数のプライマーを設計する。ＴａＫａＲａ会社のＰｒｉｍｅｒ ＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼの取扱説明書に従い、上記で設計した複数のプライマーを用いて、２段階ＰＣＲ増幅に分けて、組換えに必要な遺伝子断片を含むＶＨ／ＶＫを取得する。発現担体ｐＱＤを構築および消化し、ＢｓｍＢＩ識別配列および制限部位の異なる特性等、いくつかの特殊な制限酵素を使用して、発現担体ｐＱＤを設計および構築する。ＢｓｍＢＩで担体を消化し、ゲルを切断および回収して備蓄する。重鎖発現担体ｐＱＤ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦＣおよび軽鎖発現担体ｐＱＤ－ＶＬ－ＣＬの構築：重鎖可変領域ＶＨ遺伝子断片を、ＢｓｍＢＩで消化された担体ｐＱＤ（シグナルペプチドおよび重鎖定常領域（ＣＨ１－ＦＣ）断片を有する）と３：１の比率で混合し、軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子断片を、ＢｓｍＢＩで消化された担体ｐＱＤ（シグナルペプチドおよび軽鎖定常領域（ＣＬ）断片を有する）と３：１の比率で混合し、混合物をそれぞれＤＨ５ａコンピテント細胞に移し、０℃で３０分間氷浴し、４２℃で９０秒間ヒートショックし、５倍量のＬＢ培地を加え、３７℃で４５分間インキュベートし、ＬＢ－Ａｍｐプレートに広げ、３７℃で一晩培養し、単一クローンを選択して、シーケンスに送って、各標的クローンを取得する。
【0081】
以下の表は、ＱＰ１６３１６４のヒト化設計の具体的な情報を示す。タンパク質発現番号は、ＱＰ２５６２５３である。この表において、抗体軽鎖は、ｋａｐｐａ軽鎖定常領域ＣＬを使用し、抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ４定常領域（定常領域の具体的な配列は、実施例２を参照してもよい）を使用する。ヒト化設計の軽鎖および重鎖可変領域の配列は、以下の表に示される配列に限定されない。
【0082】
【表16】
【0083】
【表17】
【0084】
ＱＰ２５６２５３の重鎖可変領域は、ＱＤ２５６という番号のプラスミドによってコードされる。重鎖可変領域配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の具体的な配列は、次のとおりである。
【0085】
【表18】
【0086】
（２）抗ＳＩＲＰα抗体のヒト化タンパク質の発現
２９３Ｅ細胞の培養密度は、（０．２～３）×１０６／ｍｌの間に維持され、維持段階培地（ＧＩＢＣＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）で培養され、トランスフェクション前日に、トランスフェクション細胞を遠心分離して培地を交換し、細胞密度を（０．５～０．８）×１０６／ｍｌに調節する。トランスフェクション当日に、２９３Ｅ細胞密度は、（１～１．５）×１０６／ｍｌである。プラスミドおよびトランスフェクション試薬ＰＥＩを準備し、トランスフェクションするプラスミドの量は、１００μｇ／１００ｍｌ細胞であり、ＰＥＩとプラスミドとの質量比は、２：１である。プラスミドおよびＰＥＩを均一に混合し、１５分間放置し、２０分内にする。プラスミドおよびＰＥＩの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーに入れて培養し、トランスフェクション５日目に、水平遠心分離機で４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞上清を収集する。
２９３Ｅ細胞の培養密度は、（０．２～３）×１０６／ｍｌの間に維持され、維持段階培地（ＧＩＢＣＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）で培養され、トランスフェクション前日に、トランスフェクション細胞を遠心分離して培地を交換し、細胞密度を（０．５～０．８）×１０６／ｍｌに調節する。トランスフェクション当日に、２９３Ｅ細胞密度は、（１～１．５）×１０６／ｍｌである。プラスミドおよびトランスフェクション試薬ＰＥＩを準備し、トランスフェクションするプラスミドの量は、１００μｇ／１００ｍｌ細胞であり、ＰＥＩとプラスミドとの質量比は、２：１である。プラスミドおよびＰＥＩを均一に混合し、１５分間放置し、２０分内にする。プラスミドおよびＰＥＩの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーに入れて培養し、トランスフェクション５日目に、水平遠心分離機で４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞上清を収集する。
【0087】
（３）抗ＳＩＲＰα抗体のヒト化タンパク質の精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製：カラムを通過する平衡液を少なくとも３ＣＶ使用し、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致するように確保し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎであり、遠心分離後の培地の上清をカラムに通し、４０ｍｌのサンプルをローディングし、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、カラムを通過する平衡液を少なくとも３ＣＶ使用し、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致するように確保し、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに上昇すると溶出ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに低下すると収集を停止し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎである。サンプルを収集完了後、ｐＨ調節液でＰＡＣ－ＥＰを中性に調節する。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製：カラムを通過する平衡液を少なくとも３ＣＶ使用し、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致するように確保し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎであり、遠心分離後の培地の上清をカラムに通し、４０ｍｌのサンプルをローディングし、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、カラムを通過する平衡液を少なくとも３ＣＶ使用し、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致するように確保し、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに上昇すると溶出ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに低下すると収集を停止し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎである。サンプルを収集完了後、ｐＨ調節液でＰＡＣ－ＥＰを中性に調節する。
【0088】
（４）ヒト化ＳＩＲＰα抗体活性の同定（結合－ＥＬＩＳＡ）
結合－ＥＬＩＳＡ実験方法：それぞれＱＰ０９４（ＳＩＲＰαＶ１－ｆｌａｇ－ｈｉｓ）、ＱＰ０９６（ＳＩＲＰαＶ２－Ｆｌａｇ－ｈｉｓ）、ＱＰ１００（ｃｙｎｏＳＩＲＰα－ｆｌａｇ－ｈｉｓ）０．５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルで、４℃で一晩コーティングする。ＰＢＳで３回洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ ２００μｌ／ウェルで、室温下で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、異なる濃度の抗体を加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体ＨＲＰ－ａｎｔｉ Ｆａｂをインキュベートし、１：２５００で希釈し、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢで発色させ、２ＭのＨ２ＳＯ４で停止させ、４５０ｎｍで読み取る。
結合－ＥＬＩＳＡ実験方法：それぞれＱＰ０９４（ＳＩＲＰαＶ１－ｆｌａｇ－ｈｉｓ）、ＱＰ０９６（ＳＩＲＰαＶ２－Ｆｌａｇ－ｈｉｓ）、ＱＰ１００（ｃｙｎｏＳＩＲＰα－ｆｌａｇ－ｈｉｓ）０．５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルで、４℃で一晩コーティングする。ＰＢＳで３回洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ ２００μｌ／ウェルで、室温下で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、異なる濃度の抗体を加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体ＨＲＰ－ａｎｔｉ Ｆａｂをインキュベートし、１：２５００で希釈し、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢで発色させ、２ＭのＨ２ＳＯ４で停止させ、４５０ｎｍで読み取る。
【0089】
（５）ヒト化ＳＩＲＰα抗体親和性のＳＰＲ同定
ｂｉａｃｏｒｅによって測定されたヒト化抗体とヒトＳＩＲＰαＶ１型、ヒトＳＩＲＰαＶ２型およびカニクイザルＳＩＲＰαとの間の親和性は、以下の表６に示されたとおりであり、結果によると、抗ＳＩＲＰαヒト化抗体ＱＰ２５６２５３が、ヒトＳＩＲＰαＶ１型への結合について３．３６Ｅ－１０Ｍの親和性ＫＤ値を有し、ヒトＳＩＲＰαＶ２型への結合について３．１９Ｅ－１０Ｍの親和性ＫＤ値を有することを示す。
ｂｉａｃｏｒｅによって測定されたヒト化抗体とヒトＳＩＲＰαＶ１型、ヒトＳＩＲＰαＶ２型およびカニクイザルＳＩＲＰαとの間の親和性は、以下の表６に示されたとおりであり、結果によると、抗ＳＩＲＰαヒト化抗体ＱＰ２５６２５３が、ヒトＳＩＲＰαＶ１型への結合について３．３６Ｅ－１０Ｍの親和性ＫＤ値を有し、ヒトＳＩＲＰαＶ２型への結合について３．１９Ｅ－１０Ｍの親和性ＫＤ値を有することを示す。
【0090】
【表19】
【0091】
実施例４：抗ＳＩＲＰα抗体ＱＰ１６３１６４の親和性成熟
（１）ヒト化ファージミド担体の構築
ヒト化ＱＰ２５６２５３を、野生型配列（すなわち、元の配列または開示配列として、親和性成熟スクリーニングによって得られた突然変異配列）それぞれｓｃＦｖモード（ＶＨ－３个ＧＧＧＧＳ－ＶＬ）でファージミド担体に構築する。オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒ－ｌａｐ ＰＣＲ）を使用してＶＨ、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー、ＶＬをスプライスし、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用して、ファージミド担体にライゲーションする。
（１）ヒト化ファージミド担体の構築
ヒト化ＱＰ２５６２５３を、野生型配列（すなわち、元の配列または開示配列として、親和性成熟スクリーニングによって得られた突然変異配列）それぞれｓｃＦｖモード（ＶＨ－３个ＧＧＧＧＳ－ＶＬ）でファージミド担体に構築する。オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒ－ｌａｐ ＰＣＲ）を使用してＶＨ、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー、ＶＬをスプライスし、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用して、ファージミド担体にライゲーションする。
【0092】
（２）ファージディスプレイライブラリーの構築
構築された野生型ｓｃＦｖをテンプレートとして使用し、コドンベース（ｃｏｄｏｎ－ｂａｓｅｄ）プライマーを使用し、プライマー合成プロセスにおいて、突然変異領域のコドンは、５０％の野生型コドンおよび５０％のＮＮＫ（逆向プライマーは、ＭＮＮである）を有し、すべてのＣＤＲ領域に突然変異を導入して突然変異ライブラリーを構築する。ＰＣＲ断片をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ファージミド担体に接続し、最後に大腸菌ＴＧ１を電気形質転換する。各コドンベースのプライマーは、独立したライブラリーを作成する。
構築された野生型ｓｃＦｖをテンプレートとして使用し、コドンベース（ｃｏｄｏｎ－ｂａｓｅｄ）プライマーを使用し、プライマー合成プロセスにおいて、突然変異領域のコドンは、５０％の野生型コドンおよび５０％のＮＮＫ（逆向プライマーは、ＭＮＮである）を有し、すべてのＣＤＲ領域に突然変異を導入して突然変異ライブラリーを構築する。ＰＣＲ断片をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ファージミド担体に接続し、最後に大腸菌ＴＧ１を電気形質転換する。各コドンベースのプライマーは、独立したライブラリーを作成する。
【0093】
（３）ライブラリーのパンニング
ライブラリーをレスキューし、パッケージ化して、パンニング用のファージ粒子を生成した後、ビオチン化ＱＰ０９８（ｃｙｎｏＳＩＲＰα（ＥＣＤ））抗原およびストレプトアビジン磁気ビーズを液相パンニングを使用し、選択の各ラウンドは、前のラウンドと比較して抗原濃度を減少させる。３ラウンドのパンニング後、結合活性を検出するためにファージＥＬＩＳＡ用に２５０クローンを選択し、陽性クローンをシーケンシングする。シーケンシングクローンを比較および分析した後、冗長配列を除去した後、非冗長配列を全長ＩＧに変換して（重鎖定常領域は、ｈＩｇＧ４のＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を選択し、軽鎖定常領域は、κ軽鎖ＣＬを選択する）、哺乳動物細胞での発現を行う。アフィニティー精製後に全長ＩＧタンパク質を得る。具体的な配列は、以下の表に示されたとおりである。この表において、抗体軽鎖は、ｋａｐｐａ軽鎖定常領域ＣＬを使用し、抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ４定常領域（定常領域の具体的な配列は、実施例２を参照してもよい）を使用する。
ライブラリーをレスキューし、パッケージ化して、パンニング用のファージ粒子を生成した後、ビオチン化ＱＰ０９８（ｃｙｎｏＳＩＲＰα（ＥＣＤ））抗原およびストレプトアビジン磁気ビーズを液相パンニングを使用し、選択の各ラウンドは、前のラウンドと比較して抗原濃度を減少させる。３ラウンドのパンニング後、結合活性を検出するためにファージＥＬＩＳＡ用に２５０クローンを選択し、陽性クローンをシーケンシングする。シーケンシングクローンを比較および分析した後、冗長配列を除去した後、非冗長配列を全長ＩＧに変換して（重鎖定常領域は、ｈＩｇＧ４のＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を選択し、軽鎖定常領域は、κ軽鎖ＣＬを選択する）、哺乳動物細胞での発現を行う。アフィニティー精製後に全長ＩＧタンパク質を得る。具体的な配列は、以下の表に示されたとおりである。この表において、抗体軽鎖は、ｋａｐｐａ軽鎖定常領域ＣＬを使用し、抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ４定常領域（定常領域の具体的な配列は、実施例２を参照してもよい）を使用する。
【0094】
【表20】
【0095】
【表21】
【0096】
【表22】
【0097】
【表23】
【0098】
【表24】
【0099】
【表25】
【0100】
【表26】
【0101】
【表27】
【0102】
【表28】
【0103】
上記の太字および下線部分は、それぞれ、各抗体分子のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３であり、野生型配列ＱＰ２５６２５３との具体的な比較は、次のとおりである。
【0104】
【表29】
【0105】
（４）ＥＬＩＳＡ検出
結合－ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｎｄｉｎｇ－ＥＬＩＳＡ）実験方法：それぞれＱＰ０９４（ＳＩＲＰαＶ１－ｆｌａｇ－ｈｉｓ）、ＱＰ０９６（ＳＩＲＰαＶ２－Ｆｌａｇ－ｈｉｓ）、ＱＰ０９８（ｃｙｎｏＳＩＲＰα－ｆｌａｇ－ｈｉｓ）、ＱＰ１００（ｃｙｎｏＳＩＲＰα－ｆｌａｇ－ｈｉｓ）０．５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングする。ＰＢＳで３回洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ ２００μｌ／ウェルで、室温下で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、異なる濃度の抗体を加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体ＨＲＰ－ａｎｔｉ Ｆａｂをインキュベートし、１：２５００で希釈し、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢで発色させ、２ＭのＨ２ＳＯ４で停止させ、４５０ｎｍで読み取る。ＥＣ５０値は、以下の表に示されたとおりである。以下の表には、ヒト化抗体ＱＰ２５６２５３、キメラ抗体ＱＰ１６３２４５、対照抗体ＱＰ０２６２４９の検出結果も示す。結果は、図１～図６に示されたとおりである。
結合－ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｎｄｉｎｇ－ＥＬＩＳＡ）実験方法：それぞれＱＰ０９４（ＳＩＲＰαＶ１－ｆｌａｇ－ｈｉｓ）、ＱＰ０９６（ＳＩＲＰαＶ２－Ｆｌａｇ－ｈｉｓ）、ＱＰ０９８（ｃｙｎｏＳＩＲＰα－ｆｌａｇ－ｈｉｓ）、ＱＰ１００（ｃｙｎｏＳＩＲＰα－ｆｌａｇ－ｈｉｓ）０．５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングする。ＰＢＳで３回洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ ２００μｌ／ウェルで、室温下で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、異なる濃度の抗体を加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体ＨＲＰ－ａｎｔｉ Ｆａｂをインキュベートし、１：２５００で希釈し、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢで発色させ、２ＭのＨ２ＳＯ４で停止させ、４５０ｎｍで読み取る。ＥＣ５０値は、以下の表に示されたとおりである。以下の表には、ヒト化抗体ＱＰ２５６２５３、キメラ抗体ＱＰ１６３２４５、対照抗体ＱＰ０２６２４９の検出結果も示す。結果は、図１～図６に示されたとおりである。
【0106】
【表30】
【0107】
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ－ＥＬＩＳＡ実験方法：ＱＰ００１．２２μｇ／ｍｌで４℃下で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、５％ミルク２５０μｌ／ウェルでブロックし、ビオチン－ＱＰ００２ ０．０５μｇ／ｍｌ＋Ａｂｓ ５０μｇ／ｍｌの１：１混合物、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（１：５０００）、２５℃で１時間インキュベートする。結果は、図７に示されたとおりである。
【0108】
（５）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性の検出
ｂｉａｃｏｒｅによって測定された抗ＳＩＲＰα抗体とヒトＳＩＲＰαＶ１型、ヒトＳＩＲＰαＶ２型およびカニクイザルＳＩＲＰαとの親和性の一部の結果は、表１０に示されたとおりである。表１０から、抗ＳＩＲＰα抗体ＱＰ２５６１５８９、ＱＰ２５６１５８６、ＱＰ２５６１５８１、ＱＰ２５６２７９、ＱＰ２５６１７７０は、すべてヒトＳＩＲＰαＶ１型およびヒトＳＩＲＰαＶ２型に結合することができる。同時に、ＱＰ２５６１５８９、ＱＰ２５６１５８６、ＱＰ２５６２７９、ＱＰ２５６１７７０、ＱＰ２５６２５３は、すべて、異なるカニクイザルおよびアカゲザルＳＩＲＰαタンパク質に結合する。
ｂｉａｃｏｒｅによって測定された抗ＳＩＲＰα抗体とヒトＳＩＲＰαＶ１型、ヒトＳＩＲＰαＶ２型およびカニクイザルＳＩＲＰαとの親和性の一部の結果は、表１０に示されたとおりである。表１０から、抗ＳＩＲＰα抗体ＱＰ２５６１５８９、ＱＰ２５６１５８６、ＱＰ２５６１５８１、ＱＰ２５６２７９、ＱＰ２５６１７７０は、すべてヒトＳＩＲＰαＶ１型およびヒトＳＩＲＰαＶ２型に結合することができる。同時に、ＱＰ２５６１５８９、ＱＰ２５６１５８６、ＱＰ２５６２７９、ＱＰ２５６１７７０、ＱＰ２５６２５３は、すべて、異なるカニクイザルおよびアカゲザルＳＩＲＰαタンパク質に結合する。
【0109】
【表31】
【0110】
上記の表から、親和性成熟抗体ＱＰ２５６１５８９、ＱＰ２５６１５８６、ＱＰ２５６２７９タンパク質のヒトＳＩＲＰα Ｖ１型およびＳＩＲＰα Ｖ２型に対する親和性は、対照抗体ＫＷＡＲ２３（ＱＰ０２６２４９）の親和性よりも５０倍以上高いことがわかる。
【0111】
実施例５：ヒトＳＩＲＰαを天然に発言するヒト腎明細胞腺がん細胞７８６－Ｏ細胞に結合する抗ＳＩＲＰα抗体のＦＡＣＳ検出
実験段階：７８６－Ｏ細胞を２Ｅ５／ウェルで収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、３００ｇで３分間遠心分離し、上清を廃棄する。ブロッキング：２％ＦＢＳで再懸濁し、２Ｅ５／ウェル、２００μｌ／ウェルを９６ウェルＵ底プレートに播種し、１時間氷浴する。３００ｇで３分間遠心分離して、上清を廃棄する。抗体のインキュベーション：抗体１０μｇ／ｍｌをインキュベートして１：３で希釈し、１００μｌ／ウェル、１時間氷浴する。遠心分離し、上清を廃棄する。予冷した２００μｌ／ウェルのＰＢＳを加え、３００ｇで５分間遠心分離して、上清を廃棄し、２回繰り返す。二次抗体：ＰＥ－抗ヒトＦＣ（１：２００）５０μｌ／ウェル、３０分間氷浴する。遠心分離し、上清を廃棄する。予冷した２００μｌ／ウェルのＰＢＳを加え、３００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、３回繰り返す。ＦＡＣＳは、平均蛍光値を読み取る。結果は、図８に示されるように、ＳＩＲＰα抗体ＱＰ１６３２４５、ＱＰ２５６２５３、ＱＰ２５６２７９、ＱＰ２５６１５８６、ＱＰ２５６１５８９は、すべてヒトＳＩＲＰαに天然に発言するヒト腎明細胞腺がん細胞７８６－Ｏ細胞に結合し、その結合親和性は、対照抗体ＱＰ０２６２４９（ＫＷＡＲ２３）の結合親和性よりも良好である。
実験段階：７８６－Ｏ細胞を２Ｅ５／ウェルで収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、３００ｇで３分間遠心分離し、上清を廃棄する。ブロッキング：２％ＦＢＳで再懸濁し、２Ｅ５／ウェル、２００μｌ／ウェルを９６ウェルＵ底プレートに播種し、１時間氷浴する。３００ｇで３分間遠心分離して、上清を廃棄する。抗体のインキュベーション：抗体１０μｇ／ｍｌをインキュベートして１：３で希釈し、１００μｌ／ウェル、１時間氷浴する。遠心分離し、上清を廃棄する。予冷した２００μｌ／ウェルのＰＢＳを加え、３００ｇで５分間遠心分離して、上清を廃棄し、２回繰り返す。二次抗体：ＰＥ－抗ヒトＦＣ（１：２００）５０μｌ／ウェル、３０分間氷浴する。遠心分離し、上清を廃棄する。予冷した２００μｌ／ウェルのＰＢＳを加え、３００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、３回繰り返す。ＦＡＣＳは、平均蛍光値を読み取る。結果は、図８に示されるように、ＳＩＲＰα抗体ＱＰ１６３２４５、ＱＰ２５６２５３、ＱＰ２５６２７９、ＱＰ２５６１５８６、ＱＰ２５６１５８９は、すべてヒトＳＩＲＰαに天然に発言するヒト腎明細胞腺がん細胞７８６－Ｏ細胞に結合し、その結合親和性は、対照抗体ＱＰ０２６２４９（ＫＷＡＲ２３）の結合親和性よりも良好である。
【0112】
実施例６：抗ＳＩＲＰα抗体のインビトロ機能実験ＡＤＣＰ
（１）抗ＳＩＲＰα抗体を様々なＩｇＧサブタイプに作成し、分子クローニング設計は、次のとおりである。
（１）抗ＳＩＲＰα抗体を様々なＩｇＧサブタイプに作成し、分子クローニング設計は、次のとおりである。
【0113】
【表32】
【0114】
ここで、ＱＰ３２７００２７９的重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）の具体的な配列は、次のとおりである。
【0115】
【表33】
【0116】
ＱＰ３２７００２７９の軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されたとおりである。
（２）抗ＳＩＲＰα抗体インビトロ機能実験ＡＤＣＰ
マクロファージ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の準備：ＰＢＭＣを蘇生し、キットＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ－１９３５９）を使用して、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）を分離し、ヒト組換えＭ－ＣＳＦ（最終濃度は、５０ｎｇ／ｍＬである）を加え、完全に混合し、３７℃で細胞を６日間培養してマクロファージを誘導し、細胞を収集して、カウントして備蓄する。ＣＦＳＥでＲａｊｉ細胞を標識する。Ｒａｊｉを２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように再懸濁し、次いで５０μｌ／ウェル（１×１０５／ウェル）に従って、マクロファージ含有９６ウェルプレートに加え、抗体の希釈：リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）を完全培地で８０μｇ／ｍｌに希釈し、九つの勾配を３倍に希釈し、抗－ＳＩＲＰαを完全培地で２０μｇ／ｍｌに希釈し、抗体の混合：Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ群では、二つの希釈抗体を１：１で混合し、リツキシマブ群では、同量の培地と混合し、あらかじめ細胞を置いた９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルを加え、３７℃下で２時間培養し、ＦＡＣＳ検出：生ＣＦＳＥ＋／ＣＤ１４＋細胞をゲーティングすることにより、食作用（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｇａｔｉｎｇ ｌｉｖｅ ＣＦＳＥ＋／ＣＤ１４＋ ｃｅｌｌｓ）を測定する。
（２）抗ＳＩＲＰα抗体インビトロ機能実験ＡＤＣＰ
マクロファージ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の準備：ＰＢＭＣを蘇生し、キットＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ－１９３５９）を使用して、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）を分離し、ヒト組換えＭ－ＣＳＦ（最終濃度は、５０ｎｇ／ｍＬである）を加え、完全に混合し、３７℃で細胞を６日間培養してマクロファージを誘導し、細胞を収集して、カウントして備蓄する。ＣＦＳＥでＲａｊｉ細胞を標識する。Ｒａｊｉを２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように再懸濁し、次いで５０μｌ／ウェル（１×１０５／ウェル）に従って、マクロファージ含有９６ウェルプレートに加え、抗体の希釈：リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）を完全培地で８０μｇ／ｍｌに希釈し、九つの勾配を３倍に希釈し、抗－ＳＩＲＰαを完全培地で２０μｇ／ｍｌに希釈し、抗体の混合：Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ群では、二つの希釈抗体を１：１で混合し、リツキシマブ群では、同量の培地と混合し、あらかじめ細胞を置いた９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルを加え、３７℃下で２時間培養し、ＦＡＣＳ検出：生ＣＦＳＥ＋／ＣＤ１４＋細胞をゲーティングすることにより、食作用（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｇａｔｉｎｇ ｌｉｖｅ ＣＦＳＥ＋／ＣＤ１４＋ ｃｅｌｌｓ）を測定する。
【0117】
親和性成熟分子および対照抗体をリツキシマブと相乗的にＡＤＣＰ実験に使用し、実験結果によると、ＳＩＲＰα抗体とリツキシマブとの併用は、リツキシマブ単独と比較して、ＥＣ５０が小さく、ＡＤＣＰ相乗効果が顕著に増強されたことを示す。結果は、図９、図１０、図１１に示されたとおりである。
【0118】
実施例７：Ｂ－ＮＤＧ－ｈＳＩＲＰΑマウスモデルにおけるＲａｊｉ－Ｌｕｃ腫瘍増殖に対する抗ＳＩＲＰα抗体の阻害効果を評価するＱＰ３２７００２７９
腫瘍に対する抗ＳＩＲＰα抗体の殺傷効果を調査するために、Ｂ－ＮＤＧ－ｈＳＩＲＰΑを使用して、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ腫瘍モデルに静脈内接種し、腫瘍増殖に対するＳＩＲＰα抗体およびリツキシマブの阻害効果を評価する。Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞は、１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養される。ＰＢＳに再懸濁したＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞を、５×１０５細胞／０．２ｍＬの濃度および０．２ｍＬ／匹の体積でＢ－ＮＤＧ－ｈＳＩＰＲａマウスの尾静脈に接種する。接種後０日目、３日目に、小動物用イメージャーを使用して腫瘍画像信号値を測定し、平均画像シグナル強度が約１×１０６Ｐ／Ｓに達し、腫瘍画像信号値および動物の体重に従って、適切な動物を選択してグループ分けし、各実験グループに８匹の動物を含む四つの実験グループに均等に分配する。グループ分けの日に投与を開始し、具体的な投与計画は、以下の表に示される。
腫瘍に対する抗ＳＩＲＰα抗体の殺傷効果を調査するために、Ｂ－ＮＤＧ－ｈＳＩＲＰΑを使用して、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ腫瘍モデルに静脈内接種し、腫瘍増殖に対するＳＩＲＰα抗体およびリツキシマブの阻害効果を評価する。Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞は、１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養される。ＰＢＳに再懸濁したＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞を、５×１０５細胞／０．２ｍＬの濃度および０．２ｍＬ／匹の体積でＢ－ＮＤＧ－ｈＳＩＰＲａマウスの尾静脈に接種する。接種後０日目、３日目に、小動物用イメージャーを使用して腫瘍画像信号値を測定し、平均画像シグナル強度が約１×１０６Ｐ／Ｓに達し、腫瘍画像信号値および動物の体重に従って、適切な動物を選択してグループ分けし、各実験グループに８匹の動物を含む四つの実験グループに均等に分配する。グループ分けの日に投与を開始し、具体的な投与計画は、以下の表に示される。
【0119】
【表34】
【0120】
グループ分けおよび投与日をＤ０としてカウントし、Ｄ１８時点で、各群の腫瘍画像信号値応答の腫瘍増殖曲線およびＤ１８画像シグナル強度データは、図１２および以下の表に示されたとおりである。
【0121】
【表35】
【0122】
腫瘍増殖曲線の結果によると、リツキシマブ、ＱＰ３２７００２７９およびＱＰ３２７００２７９、リツキシマブの併用群は、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ腫瘍の増殖を顕著に阻害することができ、腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は、それぞれ５８．６％、４６．４％および８４．５％であり、併用投与群は、単一投与群よりも強い抗腫瘍活性を示すことが示される。
【0123】
モデル特性のため、試験後半になると、マウスに異常や麻痺の現象が現れるが、その時点でマウスを安楽死させ、生存曲線を記録する。Ｇ１群のすべてのマウスが死亡した時点で（Ｄ２５）、各群の生存曲線は、図１３に示されたとおりである。
【0124】
生存分析は、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法を使用し、群間の比較には、Ｌｏｇ ｒａｎｋ検定を使用し、ｐ＜０．０５を有意差とする。対照群と比較して、ＱＰ３２７００２７９および併用投与群（ＱＰ３２７００２７９＋リツキシマブ）は、すべてＲａｊｉ－Ｌｕｃ担癌マウスの生存期間を優位に延長できるが（ｐ＝０．０４４５＊、ｐ＜０．００１＊＊）、リツキシマブ群は、担癌マウスの生存期間を効果的に延長することができない（ｐ＝０．２３）。当該結果によると、ＱＰ３２７００２７９およびＱＰ３２７００２７９＋リツキシマブの併用投与は、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ担癌マウスの腫瘍増殖状況を効果的に阻害し、それによって、マウスの生存状況を改善できることを示唆する。
【0125】
実施例８：ヒトＳＩＲＰαのすべてのサブタイプに結合する抗ＳＩＲＰα抗体のＥＬＩＳＡ検出
既知の文献（「Ｖｅｌｃｒｏ」 Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＤ４７ Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ａｓ Ｓｉｇｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＩＲＰ ａｌｐｈａ）Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ Ｔｈａｔ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＶＯＬＵＭＥ ２９０ ・ＮＵＭＢＥＲ ２０・ＭＡＹ １５，２０１５）で報告されているＳＩＲＰα Ｖ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０配列によれば、遺伝子合成を介して、上記のＳＩＲＰα Ｃ末端をマウスＩｇＧ２ａサブタイプのＦｃ（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ）に融合させ、真核生物発現担体ｐＱＤを構築し、２９３Ｅ一過性トランスフェクションにより、プロテインＡ精製および５日目の一過性上清を得て、それぞれＳＩＲＰα Ｖ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０融合Ｆｃ（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ）タンパク質を得、さらにＥＬＩＳＡを実行して、ＳＩＲＰαのすべてのサブタイプに対するＳＩＲＰα抗体の結合を検出する。配列は、次のとおりである。
既知の文献（「Ｖｅｌｃｒｏ」 Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＤ４７ Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ａｓ Ｓｉｇｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＩＲＰ ａｌｐｈａ）Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ Ｔｈａｔ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＶＯＬＵＭＥ ２９０ ・ＮＵＭＢＥＲ ２０・ＭＡＹ １５，２０１５）で報告されているＳＩＲＰα Ｖ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０配列によれば、遺伝子合成を介して、上記のＳＩＲＰα Ｃ末端をマウスＩｇＧ２ａサブタイプのＦｃ（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ）に融合させ、真核生物発現担体ｐＱＤを構築し、２９３Ｅ一過性トランスフェクションにより、プロテインＡ精製および５日目の一過性上清を得て、それぞれＳＩＲＰα Ｖ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０融合Ｆｃ（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ）タンパク質を得、さらにＥＬＩＳＡを実行して、ＳＩＲＰαのすべてのサブタイプに対するＳＩＲＰα抗体の結合を検出する。配列は、次のとおりである。
【0126】
【表36】
【0127】
【表37】
【0128】
【表38】
【0129】
【表39】
【0130】
【表40】
【0131】
【表41】
【0132】
【表42】
【0133】
【表43】
【0134】
【表44】
【0135】
【表45】
【0136】
【表46】
【0137】
検出対象のＳＩＲＰα抗体：
ＳＩＲＰα抗体ＱＰ２５６２７９をＣＨＯＳ細胞で安定発現させ、ＣＨＯＳ安定発現タンパク質番号は、ＣＨＯ７１である。
ＳＩＲＰα抗体ＱＰ２５６２７９をＣＨＯＳ細胞で安定発現させ、ＣＨＯＳ安定発現タンパク質番号は、ＣＨＯ７１である。
【0138】
特許ＷＯ２０１７１７８６５３によって提供される配列に従って、分子クローニングは、精製されたＯＳＥ会社抗ＳＩＲＰα抗体１８Ｄ５を実験対照として構築および発現させる。同時に、上記のように、ＱＰ０２６２４９は、４７会社（Ｆｏｒｔｙ Ｓｅｖｅｎ）の抗ＳＩＲＰα抗体ＫＷＡＲ２３であり、ここでは、ＫＷＡＲ２３として表される。
【0139】
ＳＩＲＰα抗体のＳＩＲＰα Ｖ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０への結合のＥＬＩＳＡ検出実験段階：
ＳＩＲＰα Ｖ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０、１μｇ／ｍｌ、６０μｌ／ウェルを４℃下で一晩コーティングし、ＰＢＳＴで２回洗浄し、５％無脂肪ミルク（ＳＡＮＧＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ）でブロッキングに使用し、２００μｌ／ウェルで、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで２回洗浄し、抗体１０μｇ／ｍｌ、５倍希釈、１０勾配、６０μ／ウェルをインキュベートし、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、二次抗体のインキュベーション：抗－ｈＦａｂ１：１００００、６０μｌ／ウェル、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、発色：ＴＭＢを１時間前に室温で平衡化し、１００μｌ／ウェル、１０分間顕色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０ｕｌ／ウェルを停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍで読み取る。
ＳＩＲＰα Ｖ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０、１μｇ／ｍｌ、６０μｌ／ウェルを４℃下で一晩コーティングし、ＰＢＳＴで２回洗浄し、５％無脂肪ミルク（ＳＡＮＧＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ）でブロッキングに使用し、２００μｌ／ウェルで、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで２回洗浄し、抗体１０μｇ／ｍｌ、５倍希釈、１０勾配、６０μ／ウェルをインキュベートし、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、二次抗体のインキュベーション：抗－ｈＦａｂ１：１００００、６０μｌ／ウェル、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、発色：ＴＭＢを１時間前に室温で平衡化し、１００μｌ／ウェル、１０分間顕色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０ｕｌ／ウェルを停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍで読み取る。
【0140】
実験結果は、図１４～図２３に示されるように、本発明のＳＩＲＰα抗体ＣＨＯ７１は、ＳＩＲＰα Ｖ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０のすべてのサブタイプに結合する。ＯＳＥ会社のＳＩＲＰａ抗体１８Ｄ５は、ＳＩＲＰａ Ｖ２／Ｖ３／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ１０に結合しない。
【0141】
本発明の内容を上記の好ましい実施形態を通じて詳細に説明したが、本発明は上記の説明に限定されるものでないことを理解されたい。当業者であれば、上記の内容を読めば、本発明に対する様々な修正および変更が明らかとなるであろう。従って、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５に示されるようなＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列が、それぞれ
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、９；
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、３８、９；
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、４０、９；
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４１；
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４２；
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、４３；
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１；
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、３８、４１；
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９の配列のいずれか一つに示されるようなＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする、前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記可変領域は、ＦＲ領域をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
前記ＦＲ領域の配列は、マウス由来であり、前記重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有することを特徴とし、
あるいは、前記ＦＲ領域の配列は、ヒト由来であり、前記ヒト由来のＦＲ領域は、重鎖ＦＲ領域配列および軽鎖ＦＲ領域配列を含み、前記重鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１－１８のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域およびＩＧＨＪ２＊０１のＦＲ４領域を含む、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１－１８およびＩＧＨＪ２＊０１の組み合わせ配列に由来し、前記軽鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ４－１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域およびＩＧＫＪ２＊０１のＦＲ４領域を含む、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ４－１およびＩＧＫＪ２＊０１の組み合わせ配列に由来することを特徴とする
請求項２に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５のいずれか１つから選択されるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有することを特徴とする請求項２に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、ヒト由来ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４またはその変異体から選択される重鎖定常領域、ならびにヒト由来κ鎖、λ鎖またはその変異体から選択される軽鎖定常領域をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記重鎖定常領域は、Ｆｃ断片またはその変異体を含み、前記Ｆｃ断片の変異体は、ＩｇＧ１に由来し、ＥＵナンバリングに基づいて、突然変異部位Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３３８Ａを含むことを特徴とする請求項５に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の重鎖配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、もしくは多重特異性抗体であることを特徴とし、
あるいは、その構造形態は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＳｃＦｖであることを特徴とする
請求項１に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項9】
抗体薬物複合体であって、
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片を含むことを特徴とする、前記抗体薬物複合体。
【請求項10】
医薬組成物であって、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片、ならびに一つまたは複数の種の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項11】
核酸分子であって、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片をコードするすることを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項12】
ベクターであって、
請求項１１に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、前記ベクター。
【請求項13】
宿主細胞であって、
請求項１２に記載のベクターの形質転換により得られたことを特徴とする、前記宿主細胞。
【請求項14】
疾患、病症または状況を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の使用であって、
前記疾患、病症または状況は、癌、固形腫瘍、慢性感染症、炎症性疾患、多発性硬化症、自己免疫性疾患、神経系疾患、脳損傷、神経損傷、赤血球増加症、ヘモクロマトーシス、外傷、敗血症性ショック、線維症、アテローム性動脈硬化症、肥満、ＩＩ型糖尿病、移植片の機能不全または関節炎を含み、前記癌は、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞がん、胆嚢がん、胃がん、肺がん、気管支がん、骨がん、肝胆管がん、膵臓がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、腎盂および尿管がん、唾液腺がん、小腸がん、尿道がん、膀胱がん、頭頚部がん、脊椎がん、脳がん、子宮頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、消化器がん、皮膚がん、前立腺がん、下垂体がん、膣がん、甲状腺がん、喉頭癌、膠芽腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、肉腫、奇形種、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞またはＢ細胞リンパ腫、消化管間質腫瘍、軟部組織腫瘍、肝細胞がんまたは腺がんから選択されることを特徴とする、前記使用。
【請求項15】
前記薬物は、一つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて使用されることを特徴とする
請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
前記他の薬剤は、リツキシマブを含むことを特徴とする
請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
製剤の調製における、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片の使用であって、
前記製剤は、検出剤を含むことを特徴とする、前記使用。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0029】
【図1】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図2】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図3】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図4】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図5】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図6】結合－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図7】Ｂｌｏｃｋｉｎｇ－ＥＬＩＳＡの検出結果である。
【図8】ヒトＳＩＲＰａを天然発現するヒト腎明細胞腺がん細胞７８６－Ｏ細胞に結合するＳＩＲＰα抗体のＦＡＣＳ検出結果である。
【図9】抗ＳＩＲＰα抗体のインビトロ機能実験のＡＤＣＰ結果である。
【図10】抗ＳＩＲＰα抗体のインビトロ機能実験のＡＤＣＰ結果である。
【図11】抗ＳＩＲＰα抗体のインビトロ機能実験のＡＤＣＰ結果である。
【図12】各群における腫瘍画像信号値応答の腫瘍増殖曲線およびＤ１８画像シグナル強度結果を示すグラフである。
【図13】各群の生存曲線である。
【図14】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図15】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図16】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図17】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図18】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図19】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図20】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図21】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図22】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図23】本発明の抗体ＣＨＯ７１および対照抗体１８Ｄ５、ＫＷＡＲ２３のＳＩＲＰαＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４／Ｖ５／Ｖ６／Ｖ７／Ｖ８／Ｖ９／Ｖ１０サブタイプへの結合をＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフである。
【図24】既知のヒトＳＩＲＰ ａｌｐｈａ結合ドメイン対立遺伝子のアミノ酸配列の比較図である。Ｖ１～Ｖ１０のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されたとおりである。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0042】
【表2】
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0066】
【表8】
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0067】
【表9】
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0070】
【表12】
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0091】
実施例４：抗ＳＩＲＰα抗体ＱＰ１６３１６４の親和性成熟
（１）ヒト化ファージミド担体の構築
ヒト化ＱＰ２５６２５３を、野生型配列（すなわち、元の配列または開示配列として、親和性成熟スクリーニングによって得られた突然変異配列）それぞれｓｃＦｖモード（ＶＨ－３×ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）－ＶＬ）でファージミド担体に構築する。オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒ－ｌａｐ ＰＣＲ）を使用してＶＨ、（ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４））３リンカー、ＶＬをスプライスし、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用して、ファージミド担体にライゲーションする。
（１）ヒト化ファージミド担体の構築
ヒト化ＱＰ２５６２５３を、野生型配列（すなわち、元の配列または開示配列として、親和性成熟スクリーニングによって得られた突然変異配列）それぞれｓｃＦｖモード（ＶＨ－３×ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）－ＶＬ）でファージミド担体に構築する。オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒ－ｌａｐ ＰＣＲ）を使用してＶＨ、（ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４））３リンカー、ＶＬをスプライスし、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用して、ファージミド担体にライゲーションする。
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】