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特表2024-501140抗体断片で修飾され、且つ細胞障害性物質がロードされた多重特異性ヒトアルブミンナノ粒子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-11
(54)【発明の名称】抗体断片で修飾され、且つ細胞障害性物質がロードされた多重特異性ヒトアルブミンナノ粒子
(51)【国際特許分類】
C07K 14/765 20060101AFI20231228BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231228BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231228BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231228BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20231228BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20231228BHJP
A61K 31/513 20060101ALI20231228BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20231228BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20231228BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20231228BHJP
【ＦＩ】
C07K14/765
C07K19/00
A61P35/00
A61K45/00
A61K9/14
A61K47/42
A61K31/513
A61K9/10
A61K47/69
C07K16/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023533217
(86)(22)【出願日】2021-08-24
(85)【翻訳文提出日】2023-07-27
(86)【国際出願番号】 IB2021057740
(87)【国際公開番号】W WO2022112865
(87)【国際公開日】2022-06-02
(31)【優先権主張番号】102020000028952
(32)【優先日】2020-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521104159
【氏名又は名称】アンビション ソチエタ レスポンサビリタ リミタータ
(74)【代理人】
【識別番号】100159905
【弁理士】
【氏名又は名称】宮垣 丈晴
(74)【代理人】
【識別番号】100130443
【弁理士】
【氏名又は名称】遠藤 真治
(74)【代理人】
【識別番号】100142882
【弁理士】
【氏名又は名称】合路 裕介
(74)【代理人】
【識別番号】100158610
【弁理士】
【氏名又は名称】吉田 新吾
(74)【代理人】
【識別番号】100132698
【弁理士】
【氏名又は名称】川分 康博
(72)【発明者】
【氏名】ルヴォ，メノッティ
(72)【発明者】
【氏名】デ ファルコ，サンドロ
(72)【発明者】
【氏名】ロジエロ，ダヴィデ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA16
4C076AA29
4C076AA95
4C076CC27
4C076EE03
4C076EE23
4C076EE41
4C084AA17
4C084MA21
4C084MA41
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC43
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA21
4C086MA41
4C086NA13
4C086ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045CA40
4H045DA76
4H045DA83
4H045EA20
4H045FA70
4H045GA15
(57)【要約】
本発明は、細胞、好ましくは癌細胞の表面に過剰発現された、又は選択的に発現された標的受容体を認識することができる少なくとも１種類の生体分子で、その表面が修飾された、細胞障害性薬物が任意にロードされた、血清アルブミンナノ粒子、好ましくはヒトの血清アルブミンナノ粒子に関する。特に、血清アルブミンナノ粒子（Ａｌｂ－ＮＰ）は、・－Ｓ－チオエーテル結合によってナノ粒子に結合されたリンカー、及び・少なくとも１種類の生体分子を含む少なくとも１つの修飾鎖で修飾される。その少なくとも１種類の生体分子は、（ｉ）リンカーのＸ基の－ＮＨ２残基と、その少なくとも１種類の生体分子に挿入されるペプチドコンセンサス配列に含まれるグルタミンのＣＯ－ＮＨ２残基との間；或いは（ｉｉ）その少なくとも１種類の生体分子に挿入されるペプチド配列に含まれるリジンの－ＮＨ２残基と、リンカーの一部であるコンセンサス配列に挿入されるグルタミンの－ＣＯ－ＮＨ２残基との間で、酵素トランスグルタミナーゼによって仲介されるアミド基転移（又はトランスグルタミネーション）反応によって形成されるアミド結合を介してリンカーに結合される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの修飾鎖で修飾された血清アルブミンナノ粒子（Ａｌｂ－ＮＰ）であって：・－Ｓ－チオエーテル結合によって前記ナノ粒子に結合されたリンカーと、
・少なくとも１種類の生体分子と、
を含み、
前記少なくとも１種類の生体分子が、酵素トランスグルタミナーゼによって仲介されるアミド基転移（又はトランスグルタミネーション）反応により形成されるアミド結合を介して前記リンカーに結合され、
前記ナノ粒子が、以下の式（Ｉ）：
【化1】
式中、Ａｌｂ－ＮＰが、Ｚの求電子性基と反応して、前記－Ｓ－チオエーテル結合を形成するチオール官能基（－ＳＨ）をその表面に含有する血清アルブミンナノ粒子であり；
Ｚ－スペーサー－Ｘ－ＮＨ－が、リンカーであり：
Ｚは、アルブミンの－ＳＨ基と反応することができ、それによって前記－Ｓ－チオエーテル結合が形成される、求電子性基を含有する官能基から誘導され、前記官能基は、２－ブロモ酢酸、３－ブロモプロパン酸，３－クロロプロパン酸、４－ブロモ酪酸、５－クロロ酪酸、５－ブロモペンタン酸、５－クロロペンタン酸、４－ブロモメチル安息香酸、４－クロロメチル安息香酸、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、５－マレイミドペンタン酸、６－マレイミドヘキサン酸、３－マレイミド安息香酸、４－マレイミド安息香酸、４－（２－Ｎ－マレイミド）メチル安息香酸、１－ブロモ酢酸及び１－クロロ酢酸から選択され；
前記スペーサーは：
・－ＮＨ－（ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは２～１０、好ましくは２、３、４及び５である）；
・－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは２～１０、好ましくは２、３、４及び５である）であり；
又は前記スペーサーはＹｍ基であり、
Ｙは：
・－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－アミノ酸（ｎは３～１０、好ましくは３～５、より好ましくはｎ＝３、４又は５である）；
・グリシン、アラニン；
・及びその組み合わせ；から選択され、
ｍは、１～５の数であり；
前記スペーサーの－ＮＨ－基が、Ｚの前駆体のカルボン酸基とのアミド結合を形成し、且つ前記スペーサーの－ＣＯ－基が、次の単位Ｘの－ＮＨ－基とのアミド結合を形成し；
前記－Ｘ－ＮＨ－基が：
・－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－（ｎは、３～１０の範囲であり、好ましくは３、４及び５である）；
・－ＮＨ－（Ｏ－ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－（ｎは、２～１０の範囲であり、好ましくは２、３、４及び５である）；
・－ＮＨ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－（ｎは、２～１０の範囲であり、好ましくは２、３、４及び５である）；
・Ｌ－リジンアミノ酸；
・Ｌ－オルニチンアミノ酸；
・Ｃ末端アミド化Ｌ－リジンアミノ酸；
・Ｃ末端アミド化Ｌ－オルニチンアミノ酸；から選択され、
前記－Ｘ－ＮＨ－基の２つの－ＮＨ－基が、前記スペーサーの－ＣＯ－基とのアミド結合と、式（ＶＩ）：
ＡＡ１－ＡＡ２－Ｑ－ＡＡ３－ＡＡ４ 式（ＶＩ）
を有するコンセンサス配列のグルタミンとのアミド結合とを、それぞれ形成し、
式中：
ＡＡ１はロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）であるか、又は存在せず；
ＡＡ２はロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）であるか、又はトレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）であり；
Ｑは、式－ＣＯ－（ＣＨ２）２－ＣＨ－（ＮＨ）－ＣＯ－を有するグルタミンであり；
ＡＡ３はセリン（Ｓ；Ｓｅｒ）であるか、又はグリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）であり；
ＡＡ４はプロリン（Ｐ；Ｐｒｏ）、アラニン（Ａ；Ａｌａ）であるか、又は存在せず；
好ましくは、ＡＡ１及びＡＡ４は同時には存在せず；
互いに異なる、又は同一であるＲ１及びＲ２が、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ（ＮＢ）、抗体及びその組み合わせから選択され、或いは
前記アルブミンナノ粒子が式（ＩＩ）：
【化2】
式中、Ｚ－スペーサー－ＡＡ１－ＡＡ２－Ｑ－ＡＡ３－ＡＡ４は、リンカーであり；
Ａｌｂ－ＮＰ、Ｚ、スペーサー、Ｒ１及びＲ２は、前記式（Ｉ）で定義される通りであり；
式－ＣＯ－（ＣＨ２）２－ＣＨ－（ＮＨ）－ＣＯ－を有するグルタミンに等しいＱを有するＡＡ１－ＡＡ２－Ｑ－ＡＡ３－ＡＡ４は、前記式（Ｉ）で定義される通りであり、且つ前記スペーサーの－ＣＯ－末端と、存在する場合には前記アミノ酸ＡＡ１の、又はＡＡ２の－ＮＨ－基との間のアミド結合によってスペーサーに結合され；
リジン（Ｋ；Ｌｙｓ）を含有する前記ペプチド配列は式（ＩＸ）：
（ＡＡ）ｗ－Ｋ－（ＡＡ）ｐ 式（ＩＸ）
を有し、
式中、ｗ及びｐは、０～８、好ましくは１～５に含まれる整数であり、但しｗ及びｐは、決して同時に０に等しくならないことを条件とし；
ＡＡは、アラニン（Ａ；Ａｌａ）、チロシン（Ｙ；Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｐ）及びセリン（Ｓ；Ｓｅｒ）から選択されるアミノ酸を示し；
Ｋはリジン（Ｌｙｓ）である、アルブミンナノ粒子。
【請求項2】
前記ナノ粒子が、ヒトアルブミンナノ粒子（ＮＰ－ＨＳＡ）又はウシアルブミンナノ粒子（ＮＰ－ＢＳＡ）である、請求項１に記載のアルブミンナノ粒子。
【請求項3】
前記ナノ粒子が、動的光散乱（ＤＬＳ）技術で測定された、平均直径（又はＺ平均サイズ）１００～５００ｎｍ、好ましくは１００～４００ｎｍ又は３００～４００ｎｍを有する、請求項１又は２に記載のアルブミンナノ粒子。
【請求項4】
５－ＦＵ、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、クラドリビン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ラルチトレキセド、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン及びその組み合わせから選択される、少なくとも１種類の細胞障害性薬物がロードされた、請求項１から３のいずれか一項に記載のアルブミンナノ粒子。
【請求項5】
Ｒ１及びＲ２が互いに異なり、且つＦａｂの２つの異なるタイプ：Ｆａｂ１及びＦａｂ２；ｓｃＦｖの２つの異なるタイプ：ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２；ＮＢの２つの異なるタイプ：ＮＢ１及びＮＢ２；抗体の２つの異なるタイプ：Ａｂ１及びＡｂ２であり、或いはＲ１及びＲ２が、生体分子の混成した組み合わせであり、好ましくはＦａｂ１及びｓｃＦｖ１、Ｆａｂ１及びＮＢ１、ｓｃＦｖ１及びＮＢ１、又はＡｂ１及びＮＢ１である、請求項１から４のいずれか一項に記載のアルブミンナノ粒子。
【請求項6】
前記抗体が、抗体ＤＩ１７Ｅ６、トラスツズマブ、パーツズマブ、セツキシマブ、抗Ｃｒｉｐｔｏ－１モノクローナル抗体、好ましくは抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１Ｂ４又は抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１０Ｄ１から選択されるモノクローナル抗体であり；前記Ｆａｂが、トラスツズマブの組換えＦａｂ、パーツズマブの組換えＦａｂ、抗Ｃｒｉｐｔｏ－１モノクローナル抗体の、好ましくは抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１１Ｂ４及び抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１０Ｄ１から選択される抗Ｃｒｉｐｔｏ－１モノクローナル抗体の組換えＦａｂから選択され；前記ｓｃＦｖが、抗体ＤＩ１７Ｅ６、トラスツズマブ、パーツズマブ、セツキシマブ、抗Ｃｒｉｐｔｏ－１モノクローナル抗体、好ましくは抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１Ｂ４又は抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１０Ｄ１から選択される抗体の機能性断片であり；ナノボディ（ＮＢ）が、抗ＶＥＧＦＲ２ ＮＢ、好ましくはＮＢ ３ＶＧＲ１９；抗Ｈｅｒ２ＮＢ、好ましくはＮＢ ５Ｆ７ＧＧＣ；抗ＥＧＦＲ ＮＢ、好ましくはＮＢ ＥＧａ１から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のアルブミンナノ粒子。
【請求項7】
Ｚが、１－ブロモ酢酸、１－クロロ酢酸及び６－マレイミドヘキサン酸から選択される官能基から誘導される、請求項１から６のいずれか一項に記載のアルブミンナノ粒子。
【請求項8】
前記スペーサーが、－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは２～５に含まれる）であるか、又はグリシンである、請求項１から７のいずれか一項に記載のアルブミンナノ粒子。
【請求項9】
前記Ｘ－ＮＨ－基が、Ｌ－リジンアミノ酸及びＣ末端アミド化Ｌ－リジンアミノ酸から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載のアルブミンナノ粒子。
【請求項10】
前記コンセンサス配列が、ＬＱＳＰ、ＴＱＧＡ、ＬＬＱＧから選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載のアルブミンナノ粒子。
【請求項11】
前記式（ＩＸ）（ＡＡ）ｗ－Ｋ－（ＡＡ）ｐ
において、
ｗが、０に等しく、且つｐが１～３に等しく；好ましくは、ｗが０に等しく、且つｐが３に等しく、より好ましくはそれが、ＫＡＹＡ、ＫＧＹＡ、ＫＳＹＡ、ＫＡＦＡ、ＫＧＦＡ、ＫＳＦＡ、ＫＡＷＡ、ＫＧＷＡ、ＫＳＷＡ、ＫＡＹＧ、ＫＧＹＧ、ＫＳＹＧ、ＫＡＦＧ、ＫＧＦＧ、ＫＳＦＧ、ＫＡＷＧ、ＫＧＷＧ、ＫＳＷＧ、ＫＡＹＳ、ＫＧＹＳ、ＫＳＹＳ、ＫＡＦＳ、ＫＧＦＳ、ＫＳＦＳ、ＫＡＷＳ、ＫＧＷＳ、ＫＳＷＳである、請求項１から８のいずれか一項に記載のアルブミンナノ粒子。
【請求項12】
前記ナノ粒子が、その表面で蛍光色素、好ましくはフルオレセインイソチオシアネートに共有結合される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の血清アルブミンナノ粒子。
【請求項13】
【化3】
【請求項14】
前記少なくとも１種類の生体分子が、（ｉ）リンカーのＸ基の－ＮＨ２残基と、前記少なくとも１種類の生体分子に挿入されるペプチドコンセンサス配列に含まれるグルタミンの－ＣＯ－ＮＨ２残基との間；或いは
（ｉｉ）前記少なくとも１種類の生体分子に挿入されるペプチド配列に含まれるリジンの－ＮＨ２残基と、前記リンカーの一部であるコンセンサス配列に挿入されるグルタミンの－ＣＯ－ＮＨ２残基との間で、酵素トランスグルタミナーゼによって仲介されるアミド基転移（又はトランスグルタミネーション）反応によって形成されるアミド結合を介してリンカーに結合される、請求項１から１３のいずれか一項に記載のアルブミンナノ粒子を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞、好ましくは癌細胞の表面に過剰発現された、又は選択的に発現された標的受容体を認識することができる少なくとも１種類の生体分子で、その表面が修飾された細胞障害性薬物が任意にロードされた、血清アルブミンナノ粒子、好ましくはヒトのナノ粒子に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトアルブミン（ＨＳＡ）は、循環系に導入される薬物及び内因性小分子に対する、最も効率的及び多用途の天然担体タンパク質である。ＨＳＡへの分子の結合は、その薬物動態学的プロファイルを向上させ、腎臓システムを介したその急速な排出及び毒性を低減する。ＨＳＡは、最も豊富な血漿タンパク質（３５～５０ｇ／Ｌ ヒト血清）であり、分子量６６．５ｋＤａを有する。大部分の血漿タンパク質のように、肝臓で合成され、肝臓１グラムにつき速度０．７ｍｇ／時にて産生される（つまり、１０～１５ｇ／日）。ＨＳＡは、１９日の平均血漿半減期を有する。その長い半減期は、高い親和性でＦｃＲｎ受容体に結合するその能力に大きく依存する［１］。ＨＳＡは、長鎖脂肪酸の可溶化剤として働き、したがって、脂質代謝に必須であり、ビリルビン、ヘムの分解生成物に結合し、わずか数例を挙げれば、ペニシリン、スルホンアミド、インドール化合物及びベンゾジアゼピンなどの多くの治療薬に結合する［２］。特異的な手法において銅（ＩＩ）及びニッケル（ＩＩ）、並びに比較的非特異的な手法においてカルシウム（ＩＩ）及び亜鉛（ＩＩ）などの金属を錯化することができ、これらの金属イオンに対して血中の輸送媒体として作用する。
【0003】
ＨＳＡは、非常に可溶性及び極度に安定性の酸性タンパク質であり；４～９に含まれるｐＨ範囲で安定であり、４０％エタノールに可溶性であり、構造損失なく、１０時間の間でさえ６０℃に加熱することができる。腫瘍及び炎症性組織において優先的に吸収されるその能力、即座の、及び広いその利用可能性、その生分解性、並びに毒性及び免疫原性のその本質的な欠如と共に、これらの特性によって、共有又は非共有でそれと結合される治療薬及び他の分子の送達に理想的な分子となる。
【0004】
ＨＳＡは、損傷した毛細管がそれに存在し、且つリンパ液排液システムが存在しない、又はリンパ液排液システムに欠陥があるおかげで、腫瘍及び炎症性組織において優先的に蓄積することができる。「受動的腫瘍ターゲティング」として知られるこの特性は、健康な組織の血管では、小分子のみが、内皮バリアを通過する一方、血管壁が透過性となる血管の欠損のおかげで、腫瘍組織において、約４０ｋＤａを超える分子量を有する分子が透過し、腫瘍組織に保持される能力の増加を利用する。腫瘍微小血管のポアサイズは直径１００～１２００ｎｍの範囲であり［３，４］、一方、ＨＳＡは、有効直径７．２ｎｍを有し、それによって、正常組織ではなく、腫瘍組織でのみ血管外遊出が可能となる。この現象によって、腫瘍組織におけるＨＳＡなどの巨大分子の取込みがより多くなり、且つ通常かなり急速に排泄され、健康な組織においても細胞障害活性を及ぼすであろう、低分子量抗癌薬の担体としてのその使用に有利に働く。
【0005】
アルブミン集積は、肉腫、卵巣癌及びＮｏｖｉｋｏｆ肝癌などの固形腫瘍の多くの動物モデルにおいて確認されている［５］。同系乳癌のモデルにおいて、マウス乳房上皮内新形成の病的増殖物において、及び上皮間葉転換に由来する腫瘍において、アルブミンに対する透過性は、リポソーム又はサイズ１００ｎｍの他の類似の合成ナノ粒子の透過性の約４倍高く［６］、現象はおそらく、ＨＳＡのより高い血漿半減期によって有利に働くこともまた、非常に興味深い。
【0006】
これらのすべての特性のおかげで、小分子及び治療用ペプチド又はホルモン、例えばインスリン又はサイトカインなどの小タンパク質のアルブミンへの接合は、その薬物動態学的プロファイル及び患部組織に対する準特異的輸送の向上のために、広く使用され、且つ有効なアプローチとなっている。
【0007】
腫瘍組織において受動的集積に加えて、ＨＳＡは好ましくは、多くの癌細胞によって細胞内に取り込まれ、さらに、それと結合する治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の細胞内放出のためのその使用に有利に働く。実際に、マクロピノサイトーシスのメカニズムを介して癌細胞は、ＨＳＡなどの細胞外タンパク質を吸収し、代謝して、その増加した代謝ニーズを満たすことが示されている。その過剰発現及び過剰活性化が、基本的にすべての表現型の悪性癌と関連する、発癌遺伝子Ｒａｓ、内部原形質膜タンパク質を発現する癌細胞では、細胞増殖をサポートするために、アミノ酸の供給源として、細胞外タンパク質がより多く使用される［７，８］。例えば、膵管腺癌細胞は、必須アミノ酸を含有しないが、正常細胞に対して癌細胞によって優先的に細胞内に取り込まれることができる生理学的濃度のアルブミンを含有する培地で無期限に増殖させることができる［９］。低アルブミン血症は、進行固形腫瘍を有する患者において一般的な特徴としても確認されている［１０］。
【0008】
一部の癌細胞は、非特異的マクロピノサイトーシスメカニズムを介してだけでなく、受容体媒介メカニズムも介してＨＳＡを内部に取り入れることができる。癌細胞におけるＨＳＡの優先的インターナリゼーションは主に、カベオリン（Ｃａｖｅｏｌｉｎ）、Ｃａｖ－１、他のいずれかの様式で、例えば濾過若しくは拡散によってそれらを通過させることができない抗体、補体因子及び血液凝固因子などの特異的分子が膜を通過することを可能にする特有の脂質組成を特徴とする、細胞膜のミクロドメイン、カベオラに豊富に存在するタンパク質との結合によることが分かっている。
【0009】
Ｃａｖ－１は、膵臓癌、前立腺癌、及び乳癌などの多種多様な癌タイプに過剰発現され、Ｃａｖ－１の過剰発現は、癌の進行と関連する［１１，１２］。
【0010】
ＨＳＡの使用に基づくいくつかのアプローチが、標的化癌療法について記述されている。例えば、ＨＳＡを治療薬と共有結合させること、或いは小分子に対して、又はアルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）に対して特異的なタンパク質結合部位の親和性を利用することによって、非共有的形式でそれらをロードすることが提案されている。ナノボディ（ＮＢ，１５ｋＤａ）などの、より大きな巨大分子又はヒトＴＲＡＩＬ（３０ｋＤａ）などの他のタンパク質に挿入されると、ＡＢＤは、ＨＳＡに結合性を付与し、非常に安定な複合体が形成される［１３，１４］。ＨＳＡ上に共有結合する主な方法では、代わりに、還元型の、したがって求電子性と選択的に反応することができるチオールを有する、アミノ酸システイン３４の存在が利用される。
【0011】
一般的に使用される更なる方策は、リジンの側鎖上へのペイロードの接合を含む。この方策では、アミド又はイミン結合（又は還元的アミノ化反応後の単純なＣ－Ｎ結合）の形成が利用され、より多くのペイロードの結合を可能にする、システイン３４に関する利点を有する。しかしながら、反応の選択性の欠如は、ＦｃＲｎ受容体への結合を損ない、ペイロード－ＨＳＡ接合体の血漿半減期が低減し得る［１５］。この反応を通じて、変化の数及び部位の特異性をコントロールすることは難しく、したがって、構造的観点から不均一であり、制御的観点から特徴付けること、及び枠にはめることは難しい分子が得られると考えるべきである。
【0012】
ＨＳＡに小分子を結合するための、広く使用されている別の方法では、組換え又は天然抽出タンパク質ベースのナノ粒子における薬物カプセル化が利用される。ヒト血清アルブミンナノ粒子（ＮＰ－ＨＳＡ）がこの目的で知られている。ＮＰ－ＨＳＡを使用することにおける利点は、条件の関数として時間の経過にしたがって放出される、非常に多くのペイロードを結合及び／又は捕捉するその能力にある。したがって、ペイロードは、かなり長く血流に維持され、分解から保護され、且つ対象の治療部位（例えば、腫瘍における）へより選択的にアンロードされ、健康な組織とのその相互作用が低減され得る。
【0013】
アルブミンナノ粒子を合成する方法は一般に、脱溶媒和、乳化、熱的ゲル化、乾燥、及び自己集合技術として分類され得る［２，１６］。直径が大きすぎる粒子は、腫瘍組織の血管を透過すること、又はカベオラと相互作用することができないであろうことから、ＮＰ－ＨＳＡのサイズは、その生物学的機能に重要なパラメータである。しかしながら、腫瘍組織に対するＨＳＡの特異性は、高い選択性及び有効性を有する表面受容体を認識する抗体などの分子と比較した場合に、かなり下がる。したがって、癌細胞に対する更なる選択性を付与するために、癌細胞の表面に過剰発現される、又は選択的に発現される特定の標的受容体を認識する、様々な特異的分子（標的化剤又はＴＡ）でアルブミンナノ粒子を修飾することができる。マンノシル化ＨＳＡのＮＰをこの目的に使用して、薬物耐性結腸癌細胞及び腫瘍関連マクロファージを選択的に標的化し、高レベルのマンノース及びＳＰＡＲＣ受容体が発現された。同様なアプローチにおいて、葉酸で修飾されたウシ血清アルブミンナノ粒子が、パクリタキセルの標的化投与のために開発された。
【0014】
高い認識特異性を付与するために、種々の癌細胞において高度に発現されるανインテグリンに対するモノクローナル抗体など、癌細胞及び組織における過剰発現された抗原に対するモノクローナル抗体でＮＰ－ＨＳＡが修飾された［１７］。
【0015】
同様に、癌細胞上で選択的に発現された１つ又は複数の表面抗原を認識する、抗体又は抗体断片を使用することを仮定することができる。Ｈｅｒ２などのこれらの抗原の一部は、モノクローナル抗体での抗癌療法の有効な標的である［１８，１９］。Ｈｅｒ２の場合には、タンパク質の異なるエピトープを認識するが、抗原発現性乳癌の患者における治療効果をどちらも提供することができる、トラスツズマブ又はパーツズマブなどのモノクローナル抗体が使用され得る。受容体は、急速に細胞内に取り込まれ、抗体、抗体断片、並びに標的化療法及びより有効な療法のために細胞障害性薬物と接合された抗体（ＡＤＣ）を細胞内に運ぶことができるため、Ｈｅｒ２に対する抗体はＮＰ－ＨＳＡの修飾に特に有用である。たとえ、マーカーが同じ効率で細胞内に取り込まれなくとも、癌細胞上に選択的に発現される他のマーカーに対する抗体が同じ目的で使用され得る。この場合には、抗体は、癌細胞近くにＮＰ－ＨＳＡをガイドする、認識シグナルとして働くだけであり、その後、カベオラを介してＮＰ－ＨＳＡを細胞内に取り込み得る。２つの異なる認識シグナルの存在は、特異性を高め、粒子は単一のマーカーを介して細胞内に取り込まれ得る。
【0016】
これらの用途に関する対象となる更なる分子は、乳癌、結腸癌、胃癌及び他のタイプの癌の癌細胞表面に過剰発現されることが知られているタンパク質Ｃｒｉｐｔｏ－１である［２０］。細胞表面上のヒトタンパク質を非常に選択的に認識するモノクローナル抗体が、文献に広く報告されている［２０］。
【0017】
ＡＤＣは、永久的又は不安定なリンカーを用いて、小分子抗癌薬又は他の治療薬を抗体に結合することによって構築された高度に強力な生物学的薬物の新たなクラスである。その抗体は、標的細胞上で主に見出される特異的抗原を標的化する。
【0018】
その抗体のおかげで、ＡＤＣは、癌細胞受容体に選択的に結合する。受容体－ＡＤＣ複合体は通常、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、抗体の分解後にリンカーが切断され、細胞死を誘導する細胞障害性薬物は、ＤＮＡ結合又はチューブリンとの相互作用など、様々な作用メカニズムを介して放出される。リンカーからの放出は、細胞障害性物質付近及び抗体付近の両方で起こり得て、リンカーは細胞障害性物質にまだ固定されているままである。これらのアプローチで使用される細胞障害性物質、通常小分子は、非常に強力（≦１ｎＭ）でなければならず、そうでなければ、それを運ぶ抗体又は断片の濃度が高くなりすぎ、無駄となる。したがって、リンカー又はリンカーの断片（ｐｉｅｃｅｓ）の存在がその活性を変化させるのを防ぐために、細胞障害性物質がその元の形で放出されることは必須である。ＮＰ－ＨＳＡを用いた薬物の投与は既に、前臨床的及び臨床的にかなりの成功を示している。ＮＰ－ＨＳＡは、例えば、ソラフェニブ、５ＦＵ及びパクリタキセルなどの種々の薬物を捕捉するために使用されている［２１－２３］。実際に、ＮＰ－ＨＳＡを用いて、これらはナノ粒子のメッシュに捕捉されるため、実際にロードされる薬物分子の数を増加することが可能であり、単純な拡散によって時間が経つにつれてインタクトな状態で放出され得る。
【0019】
この文脈において、ＮＰ－ＨＳＡが、抗体によって癌細胞へガイドされ、構造変化なく放出される細胞障害性物質の多くのコピーを輸送することができる容器として働くことから、抗体又は抗体断片で修飾されたＮＰ－ＨＳＡの使用は特に有用である。
【0020】
したがって、癌細胞に細胞障害性薬物を運ぶことができるアルブミンナノ粒子、さらに具体的には、既知のナノ粒子と比較したアルブミンナノ粒子の必要性は、この分野において感じられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0021】
本発明は、細胞、好ましくは癌細胞の表面の過剰発現された、又は選択的に発現された標的受容体を認識することができる少なくとも１種類の生体分子で修飾された血清アルブミンナノ粒子（Ａｌｂ－ＮＰ）に関する。その少なくとも１種類の生体分子は、リンカー、及び酵素トランスグルタミナーゼによって仲介されるアミド基転移（又はトランスグルタミネーション）反応によって、ナノ粒子表面に固定される。
【0022】
生体分子は好ましくは、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ（ＮＢ）及びその混合物からなる群から選択される。好ましくは、ナノ粒子は、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ（ＮＢ）、ペプチドからなる群から選択される少なくとも２種類の生体分子で修飾され、その少なくとも２種類の生体分子は互いに異なる。
【0023】
好ましくは、ナノ粒子の製造に使用される血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。
【0024】
その少なくとも１種類の生体分子は、ナノ粒子がそれで誘導体化される、リンカーを介してアルブミンナノ粒子に結合される。リンカーでのナノ粒子の誘導体化は、求電子性官能基を含有するリンカーのＺ基と、ＳＨ求核基（チオール）を含有するアルブミンシステインの側鎖と共有結合の形成によって起こる。
【0025】
好ましくは、リンカーのＺ基とアルブミンシステインのチオール基との間に形成する共有結合は、－Ｓ－チオエーテル結合である。
【0026】
リンカーの末端部分は、Ｘ－ＮＨ２基を含有し、それが、生体分子の、少なくとも１つのグルタミン（Ｑ；ＧＬＮ）を含有するコンセンサス配列に結合する。特に、リンカーのＸ－ＮＨ２残基は、酵素トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）によって仲介されるアミド基転移（又はトランスグルタミネーション）反応による、コンセンサス配列のグルタミンに結合する。その代わりとして、－ＮＨ２残基が、例えば、ペプチド配列に挿入されるリジン残基の形態で、少なくとも１種類の生体分子の一方の末端に導入され、少なくとも１つのグルタミン（Ｑ；ＧＬＮ）を含有するコンセンサス配列が、Ｘ－ＮＨ２基の代わりにリンカーの末端に挿入される。この場合には、少なくとも１つのグルタミンを含有するコンセンサス配列は、リンカーの一部である。酵素トランスグルタミナーゼによって仲介されるアミド基転移反応は、少なくとも１種類の生体分子に存在する－ＮＨ２残基と、リンカーの一部を形成するコンセンサス配列のグルタミンとの間で起こる。
【0027】
好ましくは、本発明に従って修飾された血清アルブミンナノ粒子に、５－ＦＵ、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、クラドリビン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ラルチトレキセド、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン及びその組み合わせなどの少なくとも１種類の細胞障害性薬物がロードされる。言い換えると、ナノ粒子がその中に少なくとも１つの細胞障害性薬物を組込み、上記のように粒子の表面が修飾される。
【0028】
本発明は、本発明に従って修飾され、細胞障害性薬物がロードされた血清アルブミンナノ粒子の使用、又は具体的には病態、好ましくは癌病態を治療するための、ナノ粒子を含む医薬組成物にも関する。特に、かかる病態は、黒色腫、乳癌、転移性乳癌、神経膠腫、膠芽腫、腺癌、腸管の癌、膵臓癌、骨癌、腎臓癌、結腸癌、胃癌、慢性リンパ性白血病、非小細胞肺癌、進行及び／又は転移性腎臓癌、頭頚部癌、進行黒色腫、非ホジキンリンパ腫、転移性黒色腫、肺癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫及び加齢性黄斑変性症から選択される。
【0029】
本発明は、本発明によるリンカーで誘導体化された、好ましくはヒトの、血清アルブミンナノ粒子、及び本発明に従って修飾されたアルブミンナノ粒子の製造のためのその使用にも関する。
【0030】
本発明は、チオエーテル結合の形成によって本発明のリンカーでナノ粒子を機能化し、酵素トランスグルタミナーゼによって仲介されるアミド基転移又はトランスグルタミネーション反応によって、少なくとも１種類の生体分子にリンカーを接合する工程を含む、修飾ナノ粒子を合成する方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】トラスツズマブＦａｂで、及びヒトアルブミン粒子に結合された同じＦａｂで得られた、ＨＥＲ２への競合的結合の用量反応曲線を示す（実施例１０）。
【図2A-B】トラスツズマブＦａｂで、及びヒトアルブミン粒子に結合された同じＦａｂで得られた、２時間（Ａ）及び２４時間（Ｂ）の時点での、Ｈｅｒ２受容体発現性ＢＴ４７４細胞への結合の用量反応曲線を示す（実施例１１）。
【図3A】トラスツズマブＦａｂで、及びヒトアルブミン粒子に結合された同じＦａｂで得られた、２時間の時点での、Ｈｅｒ２受容体発現性ＢＴ４７４細胞及び非受容体発現性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合の用量反応曲線を示す（実施例１２）。
【図3B-C】トラスツズマブＦａｂ（Ｂ）及び２時間インキュベートすることによるトラスツズマブ（Ｃ）で得られた、Ｈｅｒ２受容体発現性ＢＴ４７４細胞及び非受容体発現性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合の用量反応曲線を示す（実施例１２）。
【図4】抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１０Ｄ１の組換えＦａｂで、及びヒトアルブミン粒子に結合された同じＦａｂで得られた、２時間及び２４時間の時点での、Ｃｒｉｐｔｏ－１発現性ＮＴＥＲＡ細胞への結合の用量反応曲線を示す（実施例１３）。
【図5A-B】Ｈｅｒ２－ネガティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（Ａ）、並びにＨｅｒ２－ポジティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＢＴ４７４細胞（Ｂ）への、抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１Ｂ４及び抗Ｈｅｒ２トラスツズマブの結合を示す（実施例１４）。
【図5C】１０Ｆ１Ｆａｂ及びトラスツズマブＦａｂで機能化された二重特異性ＮＰ－ＨＳＡの、Ｈｅｒ２－ポジティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＢＴ４７４細胞、並びに及びＨｅｒ２－ネガティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合の用量反応曲線を示す（実施例１４）。
【図6A-D】トラスツズマブＦａｂ及び１０Ｄ１Ｆａｂで機能化された二重特異性Ｐ－ＨＳＡの、Ｈｅｒ２－ポジティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＢＴ４７４細胞、並びにＨｅｒ２－ネガティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合（Ａ）；トラスツズマブＦａｂで機能化されたＮＰ－ＨＳＡと、１０Ｄ１Ｆａｂで機能化されたＮＰ－ＨＳＡとの組み合わせの、Ｈｅｒ２－ポジティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＢＴ４７４細胞、並びにＨｅｒ２－ネガティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合（Ｂ）；１０Ｄ１Ｆａｂで機能化されたＮＰ－ＨＳＡの、Ｈｅｒ２－ポジティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＢＴ４７４細胞、並びにＨｅｒ２－ネガティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合（Ｃ）；トラスツズマブＦａｂで機能化されたＮＰ－ＨＳＡの、Ｈｅｒ２－ポジティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＢＴ４７４細胞、並びにＨｅｒ２－ネガティブ及びＣｒｉｐｔｏ－１－ポジティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合（Ｄ）（実施例１５）を示す。
【図7A-H】Ａ～Ｃは、それぞれ濃度１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬでのＣｒｉｐｔｏ－１発現性ＮＴＥＲＡ２細胞へのＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡの結合を示し；Ｄにおいて、１０００ｎｇ／ｍでのＦＩＴＣで機能化されていないＮＰ－ＨＳＡの、同じ細胞への結合を示し；Ｅ～Ｇは、濃度１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬでの、Ｃｒｉｐｔｏ－１発現性ＮＴＥＲＡ２細胞へのＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂの結合を示し；Ｈは、ＦＩＴＣで機能化されていないＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂの、同じ細胞への結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【0032】
本明細書に示す、すべてのアミノ酸は好ましくは、Ｌ立体配置である。
【0033】
第１の態様において、本発明は、
・－Ｓ－チオエーテル結合によってナノ粒子に結合されるリンカー、及び
・少なくとも１種類の生体分子、
を含む、少なくとも１つの修飾鎖で修飾された血清アルブミンナノ粒子（Ａｌｂ－ＮＰ）に関する。
・－Ｓ－チオエーテル結合によってナノ粒子に結合されるリンカー、及び
・少なくとも１種類の生体分子、
を含む、少なくとも１つの修飾鎖で修飾された血清アルブミンナノ粒子（Ａｌｂ－ＮＰ）に関する。
【0034】
その少なくとも１種類の生体分子が、
（ｉ）リンカーのＸ基の－ＮＨ２残基と、少なくとも１種類の生体分子に挿入されるペプチドコンセンサス配列に含まれるグルタミンのＣＯ－ＮＨ２残基との間；或いは
（ｉｉ）少なくとも１種類の生体分子に挿入されるペプチド配列に含まれるリジンの－ＮＨ２残基と、リンカーの一部であるコンセンサス配列に挿入されるグルタミンの－ＣＯ－ＮＨ２残基との間；で、酵素トランスグルタミナーゼによって仲介されるアミド基転移（又はトランスグルタミネーション）反応によって形成されるアミド結合を介してリンカーに結合される。
（ｉ）リンカーのＸ基の－ＮＨ２残基と、少なくとも１種類の生体分子に挿入されるペプチドコンセンサス配列に含まれるグルタミンのＣＯ－ＮＨ２残基との間；或いは
（ｉｉ）少なくとも１種類の生体分子に挿入されるペプチド配列に含まれるリジンの－ＮＨ２残基と、リンカーの一部であるコンセンサス配列に挿入されるグルタミンの－ＣＯ－ＮＨ２残基との間；で、酵素トランスグルタミナーゼによって仲介されるアミド基転移（又はトランスグルタミネーション）反応によって形成されるアミド結合を介してリンカーに結合される。
【0035】
事例（ｉ）において、リンカーが、式（ＩＶ）：
【0036】
【化1】
式中、Ｘ基の－ＮＨ２残基が、少なくとも１種類の生体分子に含有される、コンセンサス配列のグルタミン（Ｑ；ＧＬＮ）のＣＯ－ＮＨ２残基とアミド結合を形成し、コンセンサス配列が以下の式（ＶＩ）：
ＡＡ１－ＡＡ２－Ｑ－ＡＡ３－ＡＡ４ 式（ＶＩ）
を有し、
式中、ＡＡ１は、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）であるか、又は存在せず；
ＡＡ２は、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）であるか、又はトレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）であり；
Ｑは、式－ＣＯ－（ＣＨ２）２－ＣＨ－（ＮＨ）－ＣＯ－を有するグルタミンであり；
ＡＡ３は、セリン（Ｓ；Ｓｅｒ）であるか、又はグリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）であり；
ＡＡ４は、プロリン（Ｐ；Ｐｒｏ）、アラニン（Ａ；Ａｌａ）であり、又は存在しない。好ましくは、ＡＡ１及びＡＡ４は同時に欠くことはない。
【0037】
コンセンサス配列は、好ましくはＬＱＳＰ、ＴＱＧＡ、ＬＬＱＧから選択される。
【0038】
事例（ｉｉ）において、リンカーは、以下の式（ＶＩＩ）：
【0039】
【化2】
【0040】
どちらの事例においても、Ｚ基は、－Ｓ－チオエーテル結合によってナノ粒子の表面に結合される。
【0041】
本発明に従って修飾される血清アルブミンナノ粒子は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【0042】
【化3】
を有する。
【0043】
式（Ｉ）において、以下の断片が同定され得る：
【0044】
【化4】
【0045】
【化5】
【0046】
【化6】
【0047】
アルブミンナノ粒子は、リンカーのＺ基に、チオエーテル結合（－Ｓ－）により結合された、システイン残基の、好ましくは、アルブミンシステイン３４の側鎖の－ＳＨチオール基を有する。
【0048】
アルブミンナノ粒子（Ａｌｂ－ＮＰ）の前駆体は、以下の式（ＩＩＩ）：
【0049】
【化7】
【0050】
式（Ｉ）におけるシンボル．．．．．は、チオエーテル結合によってナノ粒子に結合された複数の修飾鎖の存在を表す。式（Ｉ）中で、ナノ粒子の１つの修飾鎖のみが、描写の簡略化のために完全に示される。
【0051】
ナノ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）技術で測定される、平均直径（又はＺ平均サイズ）約１００～５００ｎｍ、好ましくは１００～４００ｎｍ又は３００～４００ｎｍを有する。
【0052】
ナノ粒子は、０．０２～０．０５に含まれる多分散性指数（ＰＤＩ）を有する。
【0053】
アルブミンナノ粒子は好ましくは、５－ＦＵ、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、クラドリビン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ラルチトレキセド、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン及びその組み合わせなど少なくとも１つの細胞障害性薬物がロードされる。
【0054】
「ロードされる」という用語は、その製造中、並びにリンカー及び生体分子でのその後の修飾前に、ナノ粒子内に細胞障害性薬物が組み込まれることを意味する。
【0055】
アルブミンナノ粒子は、当技術分野で公知の方法によって、例えば脱溶媒和の方法、及び例えば、グルタルアルデヒド又はジアジリンであり得る架橋剤でのその後の安定化によって製造される。アルブミンナノ粒子を製造する別の方法は、高圧均質化法である。
【0056】
他の既知の製造方法は、乳化、熱的ゲル化、乾燥、及び自己集合である。
【0057】
ナノ粒子に細胞障害性薬物がロードされた場合に、後者は、出発アルブミン溶液に溶解又は懸濁され、次いで、上述の方法によってそれを形成する間に、ナノ粒子内に組み込まれる。
【0058】
式（Ｉ）に示す本発明のナノ粒子を修飾するために使用されるリンカーは、Ｚ基、スペーサー及びＸ－ＮＨ－基を含む。リンカーは、式（ＩＶ）：
【0059】
【化8】
式中、Ｚ基は、アルブミンシステイン、好ましくはシステイン３４の－ＳＨ基と反応することができ、且つ４～９に含まれるｐＨ範囲でチオエーテル結合を形成することができる、求電子性基を含有する官能基から誘導される。
【0060】
好ましくは、Ｚ基は、以下の表１に示す誘導体から出発して、リンカーに導入され得る：
【0061】
【表1】
【0062】
好ましくは、Ｚは、１－ブロモ酢酸、１－クロロ酢酸及び６－マレイミドヘキサン酸から選択される官能基から誘導される。
【0063】
スペーサーは、Ｘ－ＮＨ２基と、後のＺ基との間のスペーサーとして働く、生理学的条件及び極端なｐＨ条件（例えば、ｐＨ＜３又はｐＨ＞９）下での不活性分子である。スペーサーは、拡大された立体配置において、少なくとも１０オングストロームのサイズに達し得る、フレキシブルな分子である。
【0064】
スペーサーは好ましくは：
・－ＮＨ－（ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは、２～１０の範囲であり、好ましくは２、３、４及び５である）；
・－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは、２～１０の範囲であり、好ましくは２、３、４及び５である）から選択され、
又はスペーサーはＹｍ基であり、
Ｙは：
・－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－アミノ酸（ｎは、３～１０の範囲、好ましくは３～５の範囲であり、好ましくはｎ＝３、４又は５である）、つまり、それぞれアミノカプロン酸ε、アミノペンタン酸δ及びアミノ酪酸γ；
・グリシン、アラニン；
・及びその組み合わせから選択され、
ｍは、１～５に含まれる数である。
・－ＮＨ－（ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは、２～１０の範囲であり、好ましくは２、３、４及び５である）；
・－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは、２～１０の範囲であり、好ましくは２、３、４及び５である）から選択され、
又はスペーサーはＹｍ基であり、
Ｙは：
・－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－アミノ酸（ｎは、３～１０の範囲、好ましくは３～５の範囲であり、好ましくはｎ＝３、４又は５である）、つまり、それぞれアミノカプロン酸ε、アミノペンタン酸δ及びアミノ酪酸γ；
・グリシン、アラニン；
・及びその組み合わせから選択され、
ｍは、１～５に含まれる数である。
【0065】
したがって、Ｙｍは、単一アミノ酸、又は指示されたアミノ酸からなり、且つジペプチドとペンタペプチドとの間に含まれる寸法のポリペプチドを示す。
【0066】
スペーサーの－ＣＯ－基は、後のＸ単位の－ＮＨ－基とアミド結合を形成し、スペーサーの－ＮＨ－基は、Ｚの前駆体の酸基とアミド結合を形成する。
【0067】
好ましくは、スペーサーは－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは２～５の範囲である）であり、又はそれはグリシンである。
【0068】
式（Ｉ）のＸ－ＮＨ２基は、正常な生理学的条件下又は極端なｐＨ条件（例えば、ｐＨ＜３又はｐＨ＞９）下でアルキル若しくはメトキシアルキル鎖、又は他の非反応性のフレキシブルな鎖を含むＸ基に結合された第１級アミン基を含む。
好ましくは、Ｘは、少なくとも３個のメチレン基を含有するアルキル鎖、又は少なくとも２個のメトキシエチレン基を含有する鎖である。
好ましくは、Ｘは、少なくとも３個のメチレン基を含有するアルキル鎖、又は少なくとも２個のメトキシエチレン基を含有する鎖である。
【0069】
好ましくは、－Ｘ－ＮＨ２－基は：
・－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２（ｎは３～１０の範囲であり、好ましくは３、４及び５である）；
・－ＮＨ－（Ｏ－ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２（ｎは２～１０の範囲であり、好ましくは２、３、４及び５である）；
・－ＮＨ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２（ｎは２～１０の範囲であり、好ましくは２、３、４及び５である）；
・Ｌ－リジン又はＤ－リジンアミノ酸；
・Ｌ－オルニチン又はＤ－オルニチンアミノ酸；
・Ｃ末端アミド化Ｌ－リジン又はＤ－リジンアミノ酸；
・Ｃ末端アミド化Ｌ－オルニチン又はＤ－オルニチンアミノ酸；
から選択され得る。
・－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２（ｎは３～１０の範囲であり、好ましくは３、４及び５である）；
・－ＮＨ－（Ｏ－ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２（ｎは２～１０の範囲であり、好ましくは２、３、４及び５である）；
・－ＮＨ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２（ｎは２～１０の範囲であり、好ましくは２、３、４及び５である）；
・Ｌ－リジン又はＤ－リジンアミノ酸；
・Ｌ－オルニチン又はＤ－オルニチンアミノ酸；
・Ｃ末端アミド化Ｌ－リジン又はＤ－リジンアミノ酸；
・Ｃ末端アミド化Ｌ－オルニチン又はＤ－オルニチンアミノ酸；
から選択され得る。
【0070】
Ｘ－ＮＨ２基は、Ｘのアミン基と、スペーサーから来るカルボキシル基との間に形成されるアミド結合を介してスペーサー基に連結される。
【0071】
Ｘ－ＮＨ２基が、Ｌ－リジン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－リシンアミド、Ｌ－オルニチン、Ｄ－リジン、Ｄ－オルニチン、Ｄ－リシンアミド及びＤ－オルニチンアミドから選択されるアミノ酸である場合に、アミド結合を形成するアミン基はα－アミン基である。
【0072】
好ましくは、Ｘ－ＮＨ２基は、Ｌ－リジンアミノ酸及びＣ末端アミド化Ｌ－リジンアミノ酸から選択される。
【0073】
一実施形態において、Ｚ基は、１－ブロモ酢酸、１－クロロ酢酸及び６－マレイミドヘキサン酸から選択され；スペーサーは－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは２～５の範囲である）であり、又はそれはグリシンであり；Ｘ－ＮＨ２基は、Ｌ－リジンアミノ酸又はＣ末端アミド化Ｌ－リジンアミノ酸である。
【0074】
一実施形態において、アルブミンナノ粒子、好ましくはＮＰ－ＨＳＡは、１－ブロモ酢酸、１－クロロ酢酸及び６－マレイミドヘキサン酸から選択されるＺ基；スペーサー－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは２～５の範囲である）、又はグリシン；Ｌ－リジンアミノ酸、Ｄ－リジンアミノ酸、Ｃ末端アミド化Ｌ－リジンアミノ酸及びＣ末端アミド化Ｄ－リジンアミノ酸から選択されるＸ－ＮＨ２基；を含むリンカーで誘導体化される。好ましくは、誘導体化ナノ粒子には、５－ＦＵ、ソラフェニブ、パクリタキセル、ドキソルビシン及びその組み合わせから選択される少なくとも１種類の細胞障害性薬物がロードされる。
【0075】
式（Ｉ）によるリンカー前駆体の一例は、式（Ｖ）：
【0076】
【化9】
【0077】
式（Ｖ）は、式（Ｉ）に従う様々な残基の表示により以下：
【0078】
【化10】
【0079】
リンカー前駆体の別の例は、式（ＶＩ）：
【0080】
【化11】
【0081】
式（ＶＩ）は、式（Ｉ）に従う様々な残基の表示により以下：
【0082】
【化12】
【0083】
式（ＩＩ）の場合には、リンカーは、式（ＶＩＩ）：
【0084】
【化13】
式中、Ｚ及びスペーサーは、式（ＩＶ）に関して上記の通りに定義され、Ｘ－ＮＨ２基は、式（ＶＩＩＩ）：
ＡＡ１－ＡＡ２－Ｑ－ＡＡ３－ＡＡ４ 式（ＶＩＩＩ）
の少なくとも１つのグルタミン（Ｑ；ＧＬＮ）を含有するコンセンサスペプチド配列によって置換され、
式中、
ＡＡ１はロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）であるか、又は存在せず；
ＡＡ２はロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）であるか、又はトレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）であり；
Ｑはグルタミンであり；
ＡＡ３はセリン（Ｓ；Ｓｅｒ）であるか、又はグリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）であり；
ＡＡ４はプロリン（Ｐ；Ｐｒｏ）、アラニン（Ａ；Ａｌａ）であるか、又は同時には存在しない。
好ましくは、ＡＡ１及びＡＡ４は同時に欠くことはない。
【0085】
コンセンサス配列は好ましくは、ＬＱＳＰ、ＴＱＧＡ、ＬＬＱＧから選択される。
【0086】
コンセンサス配列は、スペーサーの－ＣＯ－末端と、アミノ酸ＡＡ１（存在する場合）又はＡＡ２の－ＮＨ－基とのアミド結合によってスペーサーに結合される。
【0087】
ナノ粒子表面に存在するアルブミンシステインとリンカーとの反応は、４～９に含まれ、好ましくは８以上のｐＨの緩衝水溶液中で起こる。接合反応は一般に、室温（２５℃）にて１６時間を超えない時間間隔で終了する。
【0088】
ナノ粒子上に結合され得るリンカー分子の数は、その表面に露出されるチオール基の数に応じて異なる。例えば、平均直径１００ｎｍを有するＮＰ－ＨＳＡ及び７～１０ｎｍに含まれる近似の直径を有するＨＳＡ分子に基づく近似計算によって、文献に記載の方法で製造されたＮＰ－ＨＳＡの各ｍｇに対して２～３ｎｍｏｌに含まれる反応性チオール基の量を推定することが可能となる。
【0089】
アルブミンナノ粒子は、ナノ粒子上の遊離チオールの数を増加するため、したがって、その表面に導入され得るリンカーの密度を増加するために、トラウト（Ｔｒａｕｔ）試薬、２－イミノチオランで処理され得る。
【0090】
本発明によるリンカーは、Ｚ基、スペーサー及びＸ基、又はアミド結合によって連結されるグルタミンを含有するコンセンサス配列を含有する。鎖全体に分布されるアミド結合を有するリンカーを有する利点は、得られた修飾ナノ粒子に溶解性を付与する能力において、化学的合成法と、例えば酵素を用いた生物学的方法の両方でのリンカー合成の容易さにおいて、極端な化学的－物理的条件（例えば、１～９に含まれるｐＨ）下でさえ、安定性が高いことにある。
【0091】
リンカーでのナノ粒子の誘導体化によって、グルタミンを含むコンセンサス配列（式（ＩＶ）のリンカー）又はリジンを含むペプチド配列（式（ＶＩＩ）のリンカー）を保持する少なくとも１種類の生体分子と反応し得る、リンカーから誘導されるアミン基で機能化されたナノ粒子を得ることが可能となる。式（ＩＶ）の場合のリンカーのアミン基、又は生体分子に含まれるペプチド配列のアミン基（式（ＶＩＩ）のリンカーの場合）と、コンセンサス配列のグルタミンとの間の反応は、酵素トランスグルタミナーゼによって仲介されるアミド基転移（又はトランスグルタミネーション）反応である。好ましくは、トランスグルタミナーゼは、ＭＴＧと呼ばれる細菌性トランスグルタミナーゼである。
【0092】
この反応によって、生体分子の配向部位特異的手法で、イソペプチドアミド結合を介して、本発明のリンカーでの誘導体化によって導入されるアミン基を保持するアルブミンナノ粒子の表面に、生体分子のポリペプチド鎖を共有結合することが可能となる。
【0093】
アルブミン分子のグルタミン及びリジンは、酵素トランスグルタミナーゼに対して反応性ではないことから、アルブミン分子のＮ末端から誘導される、複数のリジン及びグルタミン、並びにアミン基を保有するが、ナノ粒子のアルブミンは、トランスグルタミナーゼによって仲介されるトランスグルタミネーション反応を受けないことに留意することは重要である。一部の生体分子は、トランスグルタミナーゼ反応性グルタミン残基を含有することが知られている。かかる分子は、これらの用途で同様に使用することができる。
【0094】
式（Ｉ）のアルブミンナノ粒子及び式（ＩＶ）のリンカーの場合には、生体分子に含有されるコンセンサス配列は、上記で設定される式（ＶＩＩＩ）の少なくとも１つのグルタミン（Ｑ；ＧＬＮ）を含有するペプチド配列である。
【0095】
式（ＩＩ）のアルブミンナノ粒子の場合には、リジン（Ｋ；Ｌｙｓ）を含有するペプチド配列は以下の式（ＩＸ）：
（ＡＡ）ｗ－Ｋ－（ＡＡ）ｐ 式（ＩＸ）
を有し、
式中、ｗ及びｐが、０～８、好ましくは１～５に含まれる整数であり、ｗ及びｐは決して、同時に０に等しくならないことを条件とし；
ＡＡは、アラニン（Ａ；Ａｌａ）、チロシン（Ｙ；Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｐ）及びセリン（Ｓ；Ｓｅｒ）から選択されるアミノ酸を示し；
Ｋはリジン（Ｌｙｓ）である。
（ＡＡ）ｗ－Ｋ－（ＡＡ）ｐ 式（ＩＸ）
を有し、
式中、ｗ及びｐが、０～８、好ましくは１～５に含まれる整数であり、ｗ及びｐは決して、同時に０に等しくならないことを条件とし；
ＡＡは、アラニン（Ａ；Ａｌａ）、チロシン（Ｙ；Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｐ）及びセリン（Ｓ；Ｓｅｒ）から選択されるアミノ酸を示し；
Ｋはリジン（Ｌｙｓ）である。
【0096】
好ましくは、ｗは０に等しく、ｐは１～３に等しく；より好ましくは、ｗは０に等しく、ｐは３に等しい。
【0097】
ペプチド配列は好ましくは：
ＫＡＹＡ、ＫＧＹＡ、ＫＳＹＡ、ＫＡＦＡ、ＫＧＦＡ、ＫＳＦＡ、ＫＡＷＡ、ＫＧＷＡ、ＫＳＷＡ、ＫＡＹＧ、ＫＧＹＧ、ＫＳＹＧ、ＫＡＦＧ、ＫＧＦＧ、ＫＳＦＧ、ＫＡＷＧ、ＫＧＷＧ、ＫＳＷＧ、ＫＡＹＳ、ＫＧＹＳ、ＫＳＹＳ、ＫＡＦＳ、ＫＧＦＳ、ＫＳＦＳ、ＫＡＷＳ、ＫＧＷＳ、ＫＳＷＳから選択される。
ＫＡＹＡ、ＫＧＹＡ、ＫＳＹＡ、ＫＡＦＡ、ＫＧＦＡ、ＫＳＦＡ、ＫＡＷＡ、ＫＧＷＡ、ＫＳＷＡ、ＫＡＹＧ、ＫＧＹＧ、ＫＳＹＧ、ＫＡＦＧ、ＫＧＦＧ、ＫＳＦＧ、ＫＡＷＧ、ＫＧＷＧ、ＫＳＷＧ、ＫＡＹＳ、ＫＧＹＳ、ＫＳＹＳ、ＫＡＦＳ、ＫＧＦＳ、ＫＳＦＳ、ＫＡＷＳ、ＫＧＷＳ、ＫＳＷＳから選択される。
【0098】
一実施形態において、アルブミンナノ粒子、好ましくはＮＰ－ＨＳＡは、１－ブロモ酢酸、１－クロロ酢酸及び６－マレイミドヘキサン酸から選択されるＺ基；スペーサー－ＮＨ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－（ｎは３～５の範囲である）又はグリシン；Ｌ－リジンアミノ酸、Ｃ末端アミド化Ｌ－リジンアミノ酸から選択されるＸ－ＮＨ２基；を含むリンカーで誘導体化され、リンカーの末端Ｘ－ＮＨ２基は、生体分子に含まれる、ＬＱＳＰ、ＴＱＧＡ、ＬＬＱＧから選択されるコンセンサス配列におけるグルタミンに、アミド結合によって結合される。
【0099】
好ましくは、かかるナノ粒子に、５－ＦＵ、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、クラドリビン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ラルチトレキセド、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン及びその組み合わせから選択される少なくとも１種類の細胞障害性薬物がロードされる。
【0100】
式（Ｉ）のＲ１及びＲ２基は、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ（ＮＢ）及びその混合物から選択される生体分子を表す。
【0101】
Ｒ１及びＲ２は、同一、又は互いに異なっていてよい。
【0102】
抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、好ましくはトラスツズマブ又はパーツズマブ、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体、乳癌の癌細胞によって選択的に発現される表面タンパク質；タンパク質ＨＥＲ２の異なるエピトープを認識するトラスツズマブ及びパーツズマブ；セツキシマブ、抗ＥＧＦＲ抗体；抗Ｃｒｉｐｔｏ－１モノクローナル抗体、例えば、文献［２４］に最近報告されている抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１Ｂ４若しくは抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１０Ｄ１、又は癌細胞の表面に選択的に発現される抗原に対する他の抗体；から選択される。
【0103】
Ｆａｂは好ましくは、癌細胞表面に選択的に発現される癌抗原に対する抗体などの生物学的対象の受容体に結合するモノクローナル抗体から産生される組換えＦａｂ、例えば、トラスツズマブ（Ｓｅｌｉｓら［２５］に記載のように作成される）若しくはパーツズマブの組換えＦａｂ、又は抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１Ｂ４及び１０Ｄ１などの既知のモノクローナル抗体のポリペプチド配列を変異導入することによって得られる他のＦａｂである。かかるＦａｂは、重鎖のＣ末端のコンセンサス配列、例えばＴＱＧＡ配列を得るために、Ｓｅｌｉｓら［２５］に記載のように組換えで作成され得て、アルブミンナノ粒子の表面に存在するリンカーに酵素的に接合され得る。
【0104】
ＳｃＦｖは、トラスツズマブ、パーツズマブ、セツキシマブ、抗Ｃｒｉｐｔｏ－１モノクローナル抗体、例えば、抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１Ｂ４又は抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１０Ｄ１、癌細胞の表面に選択的に発現される癌抗原に対する抗体から選択される抗体の機能性断片である。
【0105】
ナノボディ（ＮＢ）は、３ＶＧＲ１９ ＮＢ［２６］などのＶＥＧＦＲ２に対する、５Ｆ７ＧＧＣ ＮＢ［２７］などのＨｅｒ２に対する、又はＥＧａ１［２７］などのＥＧＦＲに対するＮＢから選択される。
【0106】
式（Ｉ）に関して、生体分子にコンセンサス配列を導入する方法は、例えば［２５］からの当技術分野で公知である。
【0107】
コンセンサス配列は、分子自体の活性領域から遠い位置で生体分子に導入される。
【0108】
分子自体の活性領域から遠い位置で生体分子に導入されるコンセンサス配列を用いる利点は、本発明のナノ粒子に存在する式（ＩＶ）のリンカーに生体分子を結合する能力にあり、その結果、それらはすべて、活性領域（例えば相補性決定領域（ＣＤＲＳ））が、ナノ粒子の外部に向くように位置付けられる。生体分子の活性領域の外向きは、標的細胞上に存在する、例えば癌細胞上に存在する受容体の認識及び受容体との相互作用を促進する。
【0109】
同様に、式（ＩＩ）の場合において、生体分子上にリジンを含有するペプチド配列を導入する方法は当技術分野で公知である。
【0110】
ペプチド配列は、分子自体の活性領域から遠い位置で生体分子に導入される。
【0111】
分子自体の活性領域から遠い位置で生体分子に導入されるペプチド配列を用いる利点は、本発明のナノ粒子に存在する式（ＶＩＩ）のリンカーに生体分子を結合する能力にあり、その結果、それらはすべて、活性領域（例えば相補性決定領域（ＣＤＲＳ））が、ナノ粒子の外部に向いくように位置付けられる。生体分子の活性領域の外向きは、標的細胞上に存在する、例えば癌細胞上に存在する受容体の認識及び受容体との相互作用を促進する。
【0112】
本発明に記載のリンカーに生体分子を固定する方法を用いて、アルブミンナノ粒子ｍｇ当たり生体分子２～８０μｇ、好ましくは５～５０μｇを固定することが可能である。
【0113】
例えば、生体分子が、分子量約５０ｋＤａを有するＦａｂである場合には、ナノ粒子ｍｇ当たり生体分子を約２００ｐｍｏｌを固定することが可能であり；分子量約２５ｋＤａを有するｓｃＦｖである場合には、その密度は４００ｐｍｏｌ／ｍｇナノ粒子となり；分子量約１２．５ｋＤａを有するＮＢの場合には、密度は、８００ｐｍｏｌ／ｍｇナノ粒子となる。
【0114】
ナノ粒子の単位重量当たりの生体分子密度は、Ｆａｂに対して６～４０％、好ましくは０．２～８％に含まれ、ｓｃＦｖｓに対しては０．４～１６％、ＮＢに対して１～３３％に含まれる。
【0115】
一実施形態において、アルブミンナノ粒子、好ましくはＮＰ－ＨＳＡは、１－ブロモ酢酸、１－クロロ酢酸及び６－マレイミドヘキサン酸から選択されるＺ基；スペーサー－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは３～５の範囲である）又はグリシン；Ｌ－リジンアミノ酸及びＣ末端アミド化Ｌ－リジンアミノ酸から選択されるＸ－ＮＨ２基；を含むリンカーで誘導体化され、末端基Ｘ－ＮＨ２は、生体分子に含まれるＬＱＳＰ、ＴＱＧＡ、ＬＬＱＧから選択されるコンセンサス配列のグルタミンにアミド結合によって結合され、その生体分子は、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ（ＮＢ）及びその混合物から選択される。
【0116】
好ましくは、５－ＦＵ、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、クラドリビン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ラルチトレキセド、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン及びその組み合わせから選択される細胞障害性薬物が、ナノ粒子にロードされる。
【0117】
特に好ましい実施形態において、Ｒ１基及びＲ２基は互いに異なる。
【0118】
例えば、Ｒ１及びＲ２は、Ｆａｂ１及びＦａｂ２と呼ばれ得る、２つの異なるタイプのＦａｂであり、ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２と呼ばれ得る、２つの異なるタイプのｓｃＦｖであり、ＮＢ１及びＮＢ２と呼ばれ得る、２つの異なるタイプのＮＢであり、Ａｂ１及びＡｂ２と呼ばれ得る、２つの異なるタイプの抗体、又は２つの異なるペプチドである。その代わりとして、Ｒ１及びＲ２は、生体分子の混成した組み合わせであり、例えばＦａｂ１及びｓｃＦｖ１、Ｆａｂ１及びＮＢ２、又はｓｃＦｖ１及びＮＢ２、又はＡｂ１及びＮＢ１である。
【0119】
生体分子の組み合わせは、上記の生体分子から選択される。
【0120】
好ましくは、Ｒ１は、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２は抗ＨＥＲ２ Ｆａｂであるか、又はＲ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はセツキシマブであり；Ｒ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はリツキシマブであり；Ｒ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はイピリムマブであり；Ｒ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はアレムツズマブであり；Ｒ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はニボルマブであり；Ｒ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はペムブロリズマブであり；Ｒ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はパニツムマブであり；Ｒ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はイブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）であり；Ｒ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はトシツモマブであり；Ｒ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はベバシズマブであり；Ｒ１はトラスツズマブであり、且つＲ２はオファツムマブであり；Ｒ１は、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はセツキシマブであり；Ｒ１は、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はリツキシマブであり；Ｒ１は、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はイピリムマブであり；Ｒ１は、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はアレムツズマブであり；Ｒ１は、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はニボルマブであり；Ｒ１は、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はペムブロリズマブであり；Ｒ１は、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はパニツムマブであり；Ｒ１は組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はイブリツモマブチウキセタンであり；Ｒ１は組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はトシツモマブであり；Ｒ１は、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はベバシズマブであり；Ｒ１は組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１であり、且つＲ２はオファツムマブである。
【0121】
少なくとも２種類の生体分子でのナノ粒子の修飾が、分子の等モル溶液を使用して行われる。
【0122】
例えば、Ｆａｂ１及びＦａｂ２混合物の総量少なくとも１０μｇを、表面上に保持するナノ粒子を製造することができる。
【0123】
このようにして得たナノ粒子が、それらを過剰発現する癌細胞の表面で少なくとも２種類の異なる受容体を認識することが可能となり、その結果として、抗癌薬の送達特異性が高まることから、本発明のこの態様は特に関連性がある。
【0124】
一実施形態において、アルブミンナノ粒子、好ましくはＮＰ－ＨＳＡは、１－ブロモ酢酸、１－クロロ酢酸及び６－マレイミドヘキサン酸から選択されるＺ基；スペーサー－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯ－（ｎは３～５の範囲である）又はグリシン；Ｌ－リジンアミノ酸及びＣ末端アミド化Ｌ－リジンアミノ酸から選択されるＸ－ＮＨ２基；を含むリンカーで誘導体化され、末端基Ｘ－ＮＨ２は、生体分子に含まれるＬＱＳＰ、ＴＱＧＡ、ＬＬＱＧから選択されるコンセンサス配列のグルタミンにアミド結合によって結合される。生体分子は、式（Ｉ）におけるＲ１及びＲ２によって表され、Ｒ１及びＲ２は同一又は互いに異なる。
【0125】
好ましくは、５－ＦＵ、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、クラドリビン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ラルチトレキセド、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン及びその組み合わせから選択される細胞障害性薬物が、ナノ粒子にロードされる。
【0126】
好ましい実施形態において、ナノ粒子は、式（ＩＶ）又は式（ＶＩＩ）のリンカーで誘導体化され、好ましくは式（ＶＩＩＩ）の少なくとも１つのグルタミンを含むコンセンサス配列によって、組換え抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ及び／又は組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１に接合されたＮＰ－ＨＳＡである。
【0127】
本発明の一実施形態において、細胞障害性薬物がロードされた、又はロードされていないアルブミンナノ粒子が、アルブミン分子のリジンの側鎖に結合する蛍光色素で誘導体化され得て、続いて本発明のリンカーで処理され、次いでトランスグルタミナーゼとの生体接合（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）反応に供され、コンセンサス配列を介して生体分子が固定され得る。その目的に適した蛍光色素は、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であり、アルブミン分子に対して攻撃的又は有害な化学試薬の非存在下にて、アルブミン分子のリジンの第１級アミン基と反応することができる。
【0128】
好ましくは、本発明による修飾アルブミンナノ粒子は、以下の式：
【0129】
【化14】
【0130】
【化15】
【0131】
【化16】
【0132】
【化17】
【0133】
【化18】
から選択される。
【0134】
更なる態様において、本発明は、本発明に従って修飾され、少なくとも１種類の細胞障害性薬物がロードされたアルブミンナノ粒子、好ましくはＮＰ－ＨＳＡと、薬剤として許容される賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。
【0135】
更なる態様において、本発明は、本発明に従って修飾され、細胞障害性薬物がロードされたアルブミンナノ粒子、或いは黒色腫、乳癌、転移性乳癌、神経膠腫、膠芽腫、腺癌、腸管の癌、膵臓癌、骨癌、腎臓癌、結腸癌、胃癌、慢性リンパ性白血病、非小細胞肺癌、進行及び／又は転移性腎臓癌、頭頚部癌、進行黒色腫、非ホジキンリンパ腫、転移性黒色腫、肺癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫及び加齢性黄斑変性症から好ましくは選択される癌病態の治療に使用される、それらを含有する医薬組成物に関する。
【0136】
好ましくは、アルブミンナノ粒子はＮＰ－ＨＳＡであり、少なくとも２種類の異なるタイプの生体分子で修飾されている。すなわち、式（Ｉ）のＲ１及びＲ２は互いに異なる。
【0137】
本発明は、黒色腫、乳癌、転移性乳癌、神経膠腫、膠芽腫、腺癌、腸管の癌、膵臓癌、骨癌、腎臓癌、結腸癌、胃癌、慢性リンパ性白血病、非小細胞肺癌、進行及び／又は転移性腎臓癌、頭頚部癌、進行黒色腫、非ホジキンリンパ腫、転移性黒色腫、肺癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫及び加齢性黄斑変性症から好ましくは選択される癌病態を治療する方法であって、本発明に従って修飾され、細胞障害性薬物がロードされたナノ粒子又はそれらを含有する組成物を有効量で、その必要がある患者に投与することを含む方法にも関する。
【0138】
好ましくは、アルブミンナノ粒子はＮＰ－ＨＳＡであり、少なくとも２種類の異なるタイプの生体分子で修飾されている。すなわち、式（Ｉ）のＲ１及びＲ２は互いに異なる。
【実施例】
【0139】
実施例１
脱溶媒和法及びグルタルアルデヒドを用いた安定化法による、ＮＰ－ＨＳＡ及びＮＰ－ＨＳＡ－５ＦＵの製造。
脱溶媒和法及びグルタルアルデヒドを用いた安定化法による、ＮＰ－ＨＳＡ及びＮＰ－ＨＳＡ－５ＦＵの製造。
【0140】
ＨＳＡナノ粒子の製造のために、脱溶媒和方法［２９，３０］を以下に記載のように用いた：
ヒトアルブミン１００ｍｇ（ＨＳＡ脂肪酸不含，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）を脱イオン水２ｍＬに可溶化し、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加してｐＨ８．６にした。常時攪拌下にて、９９．８％エタノール（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）８ｍＬを溶液に一滴ずつ、流量１ｍＬ／分にて添加した。５－ＦＵがロードされたナノ粒子の製造について、ＨＳＡ１００ｍｇ及び５ＦＵ４ｍｇ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を精製水２．２ｍＬに可溶化し、ｐＨ８．６にした。エタノールでの脱溶媒和を進める前に２時間、インキュベーションで、且つ一定の攪拌下にて溶液を維持した。脱溶媒和プロセス後、常に一定の電磁攪拌下でのＮＰ－ＨＳＡが、Ｈ２Ｏ中で２５％のグルタルアルデヒド、グレードＩＩ（ＭＯ，Ｓｉｇｍａ）３８ｕＬを添加することによって安定化され、２４時間攪拌したまま放置した。次いで、エタノール及びグルタルアルデヒドを除去するために、遠心によるＨ２Ｏでの３回の洗浄サイクルでＮＰ－ＨＳＡを精製した。最後に、それをＰＢＳに再分散し、＋４℃で保存し、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ動的光散乱（ＤＬＳ）システム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、サイズ（直径ｎｍ）、多分散性（多分散性指数，ＰＤＩ）及びゼータ電位（ｍＶにて）によって特徴付けられた。サイズ測定及びＰＤＩの決定のために、ナノ粒子をＰＢＳに濃度０．１ｍｇ／ｍＬ ＮＰ－ＨＳＡまで希釈し、＋２５℃にて多角度散乱で、且つマイクロキュベット（ＵＶ－Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｂｒａｎｄ（登録商標），Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。表面ロードを決定するためのゼータ電位については、ＮＰ－ＨＳＡを超純水に、濃度０．１ｍｇ／ｍＬＮＰまで希釈し、使い捨てのキャピラリーセルＤＴＳ１０７０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって＋２５℃にて分析した。すべてのサイズ及びゼータ電位測定が、三重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行われ、平均±標準偏差として報告された。
ヒトアルブミン１００ｍｇ（ＨＳＡ脂肪酸不含，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）を脱イオン水２ｍＬに可溶化し、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加してｐＨ８．６にした。常時攪拌下にて、９９．８％エタノール（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）８ｍＬを溶液に一滴ずつ、流量１ｍＬ／分にて添加した。５－ＦＵがロードされたナノ粒子の製造について、ＨＳＡ１００ｍｇ及び５ＦＵ４ｍｇ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を精製水２．２ｍＬに可溶化し、ｐＨ８．６にした。エタノールでの脱溶媒和を進める前に２時間、インキュベーションで、且つ一定の攪拌下にて溶液を維持した。脱溶媒和プロセス後、常に一定の電磁攪拌下でのＮＰ－ＨＳＡが、Ｈ２Ｏ中で２５％のグルタルアルデヒド、グレードＩＩ（ＭＯ，Ｓｉｇｍａ）３８ｕＬを添加することによって安定化され、２４時間攪拌したまま放置した。次いで、エタノール及びグルタルアルデヒドを除去するために、遠心によるＨ２Ｏでの３回の洗浄サイクルでＮＰ－ＨＳＡを精製した。最後に、それをＰＢＳに再分散し、＋４℃で保存し、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ動的光散乱（ＤＬＳ）システム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、サイズ（直径ｎｍ）、多分散性（多分散性指数，ＰＤＩ）及びゼータ電位（ｍＶにて）によって特徴付けられた。サイズ測定及びＰＤＩの決定のために、ナノ粒子をＰＢＳに濃度０．１ｍｇ／ｍＬ ＮＰ－ＨＳＡまで希釈し、＋２５℃にて多角度散乱で、且つマイクロキュベット（ＵＶ－Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｂｒａｎｄ（登録商標），Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。表面ロードを決定するためのゼータ電位については、ＮＰ－ＨＳＡを超純水に、濃度０．１ｍｇ／ｍＬＮＰまで希釈し、使い捨てのキャピラリーセルＤＴＳ１０７０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって＋２５℃にて分析した。すべてのサイズ及びゼータ電位測定が、三重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行われ、平均±標準偏差として報告された。
【0141】
ＮＰ－ＨＳＡをＤＬＳによって分析し、多分散性指数（ＰＤＩ）０．０４と共に平均直径が１３０ｎｍであることが判明した。
【0142】
実施例２
脱溶媒和法及びジアジリンを用いた安定化法による、ＮＰ－ＨＳＡの製造。
脱溶媒和法及びジアジリンを用いた安定化法による、ＮＰ－ＨＳＡの製造。
【0143】
ＮＰ－ＨＳＡの製造のために、脱溶媒和法［２９，３０］を以下に記載のように用いた：
ＨＳＡ脂肪酸不含アルブミン１００ｍｇ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）を精製水２ｍＬに可溶化し、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加してｐＨ８．６にした。常時攪拌下にて、９９．８％エタノール（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）８ｍＬを溶液に一滴ずつ、流量１ｍＬ／分にて添加した。脱溶媒和プロセス後に、常に常時電磁攪拌下のナノ粒子を、光架橋剤：ＮＨＳ－ジアジリン（ＳＤＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）の添加によって安定化した。特に、ＨＳＡ／ＮＨＳ－ジアジリンのモル比が１：５に達するように、ＮＨＳ－ジアジリン１．６８ｍｇを無水ＤＭＳＯ ０．５ｍｌに可溶化し、懸濁液に添加し、インキュベーションで３時間放置した。次いで、ＭＷＣＯ ６０００Ｄａのセルロース膜を使用して懸濁液を透析し、最後に、余分なＮＨＳ－ジアジリンを除去した後に、ＮＰ－ＨＳＡを光安定化するために、１０分間、常時攪拌下にて紫外線（３６０ｎｍ）に懸濁液を曝露した。次いで、遠心によってＨ２Ｏでの３回洗浄サイクルでＮＰ－ＨＳＡを精製し、最後にＰＢＳに再分散し、＋４℃で保存し、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、サイズ（ｎｍ）、ＰＤＩ及びゼータ電位（ｍＶ）によって特徴付けた。サイズ測定及びＰＤＩの決定のために、ＮＰ－ＨＳＡをＰＢＳに濃度０．１ｍｇ／ｍＬ ＮＰまで希釈し、＋２５℃にて多角度散乱で、且つマイクロキュベット（ＵＶ－Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｂｒａｎｄ（登録商標），Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。表面ロードを決定するためのゼータ電位については、ＮＰ－ＨＳＡを超純水に、濃度０．１ｍｇ／ｍＬ ＮＰまで希釈し、使い捨てのキャピラリーセルＤＴＳ１０７０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって＋２５℃にて分析した。
ＨＳＡ脂肪酸不含アルブミン１００ｍｇ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）を精製水２ｍＬに可溶化し、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加してｐＨ８．６にした。常時攪拌下にて、９９．８％エタノール（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）８ｍＬを溶液に一滴ずつ、流量１ｍＬ／分にて添加した。脱溶媒和プロセス後に、常に常時電磁攪拌下のナノ粒子を、光架橋剤：ＮＨＳ－ジアジリン（ＳＤＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）の添加によって安定化した。特に、ＨＳＡ／ＮＨＳ－ジアジリンのモル比が１：５に達するように、ＮＨＳ－ジアジリン１．６８ｍｇを無水ＤＭＳＯ ０．５ｍｌに可溶化し、懸濁液に添加し、インキュベーションで３時間放置した。次いで、ＭＷＣＯ ６０００Ｄａのセルロース膜を使用して懸濁液を透析し、最後に、余分なＮＨＳ－ジアジリンを除去した後に、ＮＰ－ＨＳＡを光安定化するために、１０分間、常時攪拌下にて紫外線（３６０ｎｍ）に懸濁液を曝露した。次いで、遠心によってＨ２Ｏでの３回洗浄サイクルでＮＰ－ＨＳＡを精製し、最後にＰＢＳに再分散し、＋４℃で保存し、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、サイズ（ｎｍ）、ＰＤＩ及びゼータ電位（ｍＶ）によって特徴付けた。サイズ測定及びＰＤＩの決定のために、ＮＰ－ＨＳＡをＰＢＳに濃度０．１ｍｇ／ｍＬ ＮＰまで希釈し、＋２５℃にて多角度散乱で、且つマイクロキュベット（ＵＶ－Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｂｒａｎｄ（登録商標），Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。表面ロードを決定するためのゼータ電位については、ＮＰ－ＨＳＡを超純水に、濃度０．１ｍｇ／ｍＬ ＮＰまで希釈し、使い捨てのキャピラリーセルＤＴＳ１０７０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって＋２５℃にて分析した。
【0144】
ＮＰ－ＨＳＡをＤＬＳによって分析し、ＰＤＩ ０．０４と共に平均直径が３４０ｎｍであることが判明した。
【0145】
実施例３
高圧均質化によるＮＰ－ＨＳＡの製造
高圧均質化によるＮＰ－ＨＳＡの製造
【0146】
高圧均質化によるＮＰ－ＨＳＡの製造のために、ＨＳＡ脂肪酸不含アルブミン（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）１００ｍｇを精製水に濃度３０ｍｇ／ｍＬに可溶化する［３１］。このようにして得た溶液に、３％（ｖ／ｖ）クロロホルムを添加し、ＵＬＴＲＡ－ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）Ｔ－２５（ＩＫＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、最初の均質化を５分間進める。次いで、高圧下にて、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ ＥＦ－Ｂ１５（Ａｖｅｓｔｉｎ Ｉｎｃ．，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）を使用し、圧力２００００ｐｓｉ及び１２に等しい均質化サイクル数を適用して、最初のエマルジョンを均質化する。このようにして得たコロイド状分散液を、＋４０℃にて３０分間、回転蒸発器によって真空圧４００ｍｍＨｇにかけて、クロロホルムを除去した。次いで、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、サイズ（ｎｍ）、ＰＤＩ及びゼータ電位（ｍＶ）によってＮＰ－ＨＳＡが特徴付けられた。サイズ決定及びＰＤＩ決定のために、ＮＰ－ＨＳＡをＰＢＳに濃度０．１ｍｇ／ｍＬ ＮＰまで希釈し、＋２５℃にて多角度散乱で、且つマイクロキュベット（ＵＶ－Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｂｒａｎｄ（登録商標），Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。表面ロードを決定するためのゼータ電位については、ＮＰ－ＨＳＡを超純水に、濃度０．１ｍｇ／ｍＬ ＮＰまで希釈し、使い捨てのキャピラリーセルＤＴＳ１０７０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって＋２５℃にて分析した。
【0147】
ＮＰ－ＨＳＡをＤＬＳによって分析し、ＰＤＩ ０．０４と共に平均直径が３４０ｎｍであることが判明した。
【0148】
実施例４
リンカーマレイミド－グリシン－Ｌ－リジン－ＣＯＮＨ２を有するＨＳＡシステイン３４で誘導体化され、且つＭＴＧを用いて組換え抗ＨＥＲ２ Ｆａｂに接合された、ＮＰ－ＨＳＡの製造。
リンカーマレイミド－グリシン－Ｌ－リジン－ＣＯＮＨ２を有するＨＳＡシステイン３４で誘導体化され、且つＭＴＧを用いて組換え抗ＨＥＲ２ Ｆａｂに接合された、ＮＰ－ＨＳＡの製造。
【0149】
抗ＨＥＲ２ Ｆａｂで修飾されたＮＰ－ＨＳＡの製造のために、ＭＴＧの作用に感受性のＴＱＧＡ配列を有する［２５］に記載のように製造された組換えＦａｂを使用した。実施例１又は２として得られたＮＰ－ＨＳＡの外部ＳＨ基はペプチドリンカーマレイミド－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＮＨ２で修飾され、Ｌｙｓ－ＣＯＮＨ２の表記は、Ｃ末端アミド化リジンを示す。式（Ｉ）に報告される表記に関して、「Ｚ」単位はマレイミド基であり、グリシンアミノ酸は「スペーサー」を表し、したがって、Ｌｙｓ－ＣＯＮＨ２は「Ｘ－ＮＨ２」基を表す。誘導体化反応に、１：５のＨＳＡ／リンカーモル比を用いた。室温にて、及び常時攪拌下でインキュベーションして１６時間後に、余分な試薬を除去するために、ＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓと名付けられた修飾ＮＰをＨ２Ｏ中で３回洗浄し、リン酸緩衝液に再懸濁した。ＮＰに導入されたリジンにＭＴＧによって接合できるようにＣ末端にＴＱＧＡテトラペプチドを含有する、［２５］に記載のように製造された抗ＨＥＲ２ Ｆａｂと、ＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓとを反応させた。接合反応のために、ＭＴＧ０．２５Ｕ／ｍｌの存在下にて、ｐＨ７．３のリン酸緩衝液、体積１ｍＬ中で、抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ ４０μｇ／ｍＬをＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ１ｍｇ／ｍＬと反応させた。ＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－ＬｙｓへのＦａｂ接合反応をＲＰ－ＨＰＬＣによって様々な時点（１～１６時間）にてモニターし、上清を分析し、溶解状態の遊離Ｆａｂの濃度の減少を評価した。ＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析から、１６時間後の、接合されたＦａｂの量はＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ１０μｇ／ｍｇであることが分かった。次いで、余分なＭＴＧ及びＦａｂを除去するために、このようにして得たＮＰ－ＨＳＡを、遠心によるＨ２Ｏでの３回洗浄サイクルで精製した。最後に、それらをＰＢＳに再分散し、＋４℃にて保管して、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、サイズ（ｎｍ）、ＰＤＩ及びゼータ電位（ｍＶ）によって特徴付けた。Ｃ４ Ｖｙｄａｃ分析カラム，４．６×２５０ｍｍ，粒径５μｍを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）装置をＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析に使用した。抗ＨＥＲ２ Ｆａｂの定量化のために、以下の方法を用いた：移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ及び移動相Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分で３０％～４５％Ｂの勾配、流量０．７ｍＬ／分。サイズ及びＰＤＩを決定するため、このようにして得たＮＰ－ＨＳＡをＰＢＳに、ＮＰ－ＨＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、＋２５℃にて多角度散乱で、且つマイクロキュベット（ＵＶ－Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｂｒａｎｄ（登録商標），Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。表面ロードを決定するためのゼータ電位については、ナノ粒子を超純水に、ＮＰ－ＨＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、ＤＴＳ１０７０キャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって＋２５℃にて分析した。すべてのサイズ及びゼータ電位の決定が、三重で行われ、平均±標準偏差として示された。
【0150】
ＮＰ－ＨＳＡ及びＦａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡをＤＬＳによって分析し、平均直径が、未修飾ＮＰ－ＨＳＡの１３０ｎｍ（ＰＤＩ０．０４）から、Ｆａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡの１４５ｎｍ（ＰＤＩ０．０９）にわたることが判明した。
【0151】
実施例５
リンカーマレイミド－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＮＨ２を有するＨＳＡシステイン３４で誘導体化され、且つＭＴＧを用いて組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１に接合された、ＮＰ－ＨＳＡの製造。
リンカーマレイミド－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＮＨ２を有するＨＳＡシステイン３４で誘導体化され、且つＭＴＧを用いて組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１に接合された、ＮＰ－ＨＳＡの製造。
【0152】
ＭＴＧを用いて、抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂと接合されたＮＰ－ＨＳＡを製造するために、実施例１で得たＮＰのＳＨ基をペプチドリンカーＭａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＮＨ２で修飾した。１：５のＨＳＡ／リンカーモル比を機能化反応に用いた。室温にて、及び常時攪拌下でインキュベーションして１６時間後に、余分な試薬を除去するために、修飾ＮＰ－ＨＳＡをＨ２Ｏ中で３回洗浄し、リン酸緩衝液に再懸濁した。ＮＰ－ＨＳＡに導入されたリジンにＭＴＧによって接合することができるようにＣ末端にＴＱＧＡテトラペプチドを含有する抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂと、ＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓとを反応させた。抗Ｃｒｉｐｔｏ－１抗体１０Ｄ１のプロパティ（ｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）配列を用いて、［２５］に記載のように抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ［２４］を製造した。接合反応のために、ＭＴＧ０．２５Ｕ／ｍｌの存在下にて、ｐＨ７．３リン酸緩衝液、体積１ｍＬ中で、抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ４０μｇ／ｍＬをＨＳＡ－ＮＰ１ｍｇ／ｍＬと反応させた。ＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－ＬｙｓへのＦａｂ接合反応をＲＰ－ＨＰＬＣによって様々な時点（１～１６時間）にてモニターし、上清を分析し、溶解状態の遊離Ｆａｂの濃度の減少を評価した。ＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析から、１６時間後の、接合されたＦａｂの量はＮＰ－ＨＳＡ１０μｇ／ｍｇであることが分かった。次いで、余分なＭＴＧ及びＦａｂを除去するために、遠心によるＨ２Ｏでの３回洗浄サイクルでナノ粒子を精製した。最後に、それらをＰＢＳに再分散し、＋４℃にて保管して、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、サイズ（ｎｍ）、ＰＤＩ及びゼータ電位（ｍＶ）によって特徴付けた。Ｃ４ Ｖｙｄａｃ分析カラム、４．６×２５０ｍｍ、粒径５μｍを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）装置をＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析に使用した。抗ＨＥＲ２ Ｆａｂの定量化のために、以下の方法を用いた：移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ及び移動相Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分で３０％～４５％Ｂの勾配、流量０．７ｍＬ／分。サイズの測定及びＰＤＩの決定のため、ナノ粒子をＰＢＳに、ＮＰ０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、＋２５℃にて多角度散乱で、且つマイクロキュベット（ＵＶ－Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｂｒａｎｄ（登録商標），Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。表面ロードを決定するためのゼータ電位測定のために、ナノ粒子を超純水に、ＮＰ－ＨＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、ＤＴＳ１０７０キャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって＋２５℃にて分析した。すべてのサイズ及びゼータ電位の測定が、三重で行われ、平均±標準偏差として示された。
【0153】
非誘導体化ＮＰ－ＨＳＡ及びＦａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡを、ＤＬＳによって分析し、平均直径が、未修飾ＮＰの１３０ｎｍ（ＰＤＩ０．０４）から、Ｆａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡの１４５ｎｍ（ＰＤＩ０．０９）にわたることが判明した。
【0154】
実施例６
リンカーＢｒ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ２Ｏｃ－Ｋ－ＮＨ２と、ＨＳＡシステイン３４とで誘導体化され、且つＭＴＧを用いて組換え抗ＨＥＲ２ Ｆａｂに接合された、ＮＰ－ＨＳＡの製造。
リンカーＢｒ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ２Ｏｃ－Ｋ－ＮＨ２と、ＨＳＡシステイン３４とで誘導体化され、且つＭＴＧを用いて組換え抗ＨＥＲ２ Ｆａｂに接合された、ＮＰ－ＨＳＡの製造。
【0155】
ＭＴＧを用いて、抗ＨＥＲ２ Ｆａｂと接合されたＮＰ－ＨＳＡを製造するために、実施例１で得たＮＰ－ＨＳＡのＳＨ基をペプチドリンカーＢｒ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ２Ｏｃ－Ｋ－ＮＨ２で修飾した。式（Ｉ）に報告される表記に関して、「Ｚ」単位は、ブロモ酢酸基であり、Ｏ２Ｏｃの表記は、非天然アミノ酸８－アミノ－３，６－ジオキソ－オクタン酸を意味し、「スペーサー」を表し、したがってＬｙｓ－ＮＨ２は「Ｘ－ＮＨ２」基を表す。
【0156】
１：５のＨＳＡ／リンカーモル比を機能化反応に用いた。室温にて、及び常時攪拌下でインキュベーションして１６時間後に、余分な試薬を除去するために、ＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｏ２Ｏｃ－Ｌｙｓとして定義される修飾ＮＰ－ＨＳＡをＨ２Ｏ中で３回洗浄し、リン酸緩衝液に再懸濁した。ＮＰ－ＨＳＡに導入されたリジンにＭＴＧによって接合できるようにＣ末端にＴＱＧＡテトラペプチドを含有する抗ＨＥＲ２ Ｆａｂと、ＮＰｓ－Ｃｙｓ－Ｏ２Ｏｃ－Ｌｙｓとを反応させた［３２－３５］。接合反応のために、ＭＴＧ０．２５Ｕの存在下にて、最終体積１ｍＬのｐＨ７．３リン酸緩衝液中で、抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ４０μｇ／ｍＬをＨＳＡ ＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｏ２Ｏｃ－Ｌｙｓ１ｍｇと反応させた。ＮＰｓ－Ｃｙｓ－Ｏ２Ｏｃ－ＬｙｓへのＦａｂ接合反応を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって様々な時点（１～１６時間）にてモニターし、上清を分析し、溶解状態の遊離Ｆａｂの濃度の減少を評価した。ＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析から、１６時間後の、接合されたＦａｂの量はＮＰ－ＨＳＡ１０μｇ／ｍｇであることが分かった。次いで、余分なＭＴＧ及びＦａｂを除去するために、遠心によるＨ２Ｏでの３回洗浄サイクルでナノ粒子を精製した。最後に、それらをＰＢＳに再分散し、＋４℃にて保管して、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、サイズ（ｎｍ）、多分散性（ＰＤＩ）及びゼータ電位（ｍＶ）によって特徴付けた。Ｃ４ Ｖｙｄａｃ分析カラム、４．６×２５０ｍｍ、粒径５μｍを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）装置をＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析に使用した。抗ＨＥＲ２ Ｆａｂの定量化のために、以下の方法を用いた：移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ及び移動相Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分で３０％～４５％Ｂの勾配、流量０．７ｍＬ／分。サイズの測定及びＰＤＩの決定のため、ＮＰ－ＨＳＡをＰＢＳに、ＮＰ０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、＋２５℃にて多角度散乱で、且つマイクロキュベット（ＵＶ－Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｂｒａｎｄ（登録商標），Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。表面ロードを決定するためのゼータ電位測定のために、ナノ粒子を超純水に、ＮＰ０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、ＤＴＳ１０７０キャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって＋２５℃にて分析した。すべてのサイズ及びゼータ電位の測定が三重で行われ、平均±標準偏差として示された。
【0157】
非誘導体化ＮＰ－ＨＳＡ及びＦａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡを、ＤＬＳによって分析し、平均直径が、未修飾ＮＰの１３０ｎｍ（ＰＤＩ０．０４）から、Ｆａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡの１４５ｎｍ（ＰＤＩ０．０９）にわたることが判明した。
【0158】
実施例７
リンカーＢｒ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ２Ｏｃ－Ｋ－ＮＨ２と、ＨＳＡシステイン３４とで誘導体化され、且つＭＴＧを用いて組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１及び抗ＨＥＲ２ Ｆａｂに接合された、ＮＰ－ＨＳＡの製造。
リンカーＢｒ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ２Ｏｃ－Ｋ－ＮＨ２と、ＨＳＡシステイン３４とで誘導体化され、且つＭＴＧを用いて組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１及び抗ＨＥＲ２ Ｆａｂに接合された、ＮＰ－ＨＳＡの製造。
【0159】
ＭＴＧを用いて、２つの抗ＨＥＲ２及び抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂと接合されたＨＳＡナノ粒子を製造するために、実施例１で得たＮＰ－ＨＳＡのＳＨ基を最初に、先の実施例に記載のペプチドリンカーＢｒ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ２Ｏｃ－Ｋ－ＮＨ２で修飾した。１：５のＨＳＡ／リンカーモル比を機能化反応に用いた。室温にて、及び常時攪拌下でインキュベーションして１６時間後に、余分な試薬を除去するために、修飾ＮＰ－ＨＳＡ（ＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｏ２Ｏｃ－Ｌｙｓ）をＨ２Ｏ中で３回洗浄し、リン酸緩衝液に再懸濁した。どちらも、ＮＰ－ＨＳＡに導入されたリジンにＭＴＧによって接合できるようにＣ末端にＴＱＧＡタグを含有する、２つの異なるＦａｂ：抗ＨＥＲ２及び抗Ｃｒｉｐｔｏ－１の１：１混合物と、ＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｏ２Ｏｃ－Ｌｙｓとを同時に反応させた。接合反応のために、ＭＴＧ０．２５Ｕの存在下にて、最終体積５ｍＬのｐＨ７．３リン酸緩衝液中で、抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ２０μｇ及び抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ２０ｕｇをＨＳＡ ＮＰｓ－Ｏ２Ｏｃ－Ｌｙｓ１ｍｇと反応させた。ＮＰ－ＨＳＡ－Ｃｙｓ－Ｏ２Ｏｃ－ＬｙｓへのＦａｂ接合反応を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって様々な時点（１～１６時間）にてモニターし、上清を分析し、溶解状態の２種類のＦａｂの濃度の減少を評価した。ＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析から、１６時間後の、２つのＦａｂ接合体の量が、ＮＰ１ｍｇに対して、抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂについては５μｇ、トラスツズマブＦａｂについては２μｇであることが判明した。次いで、不活性なＭＴＧ及びＦａｂを除去するために、遠心によるＨ２Ｏでの３回洗浄サイクルでナノ粒子を精製した。最後に、それらをＰＢＳに再分散し、＋４℃にて保管して、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、サイズ（ｎｍ）、多分散性（ＰＤＩ）及びゼータ電位（ｍＶ）によって特徴付けた。Ｃ４ Ｖｙｄａｃ分析カラム、４．６×２５０ｍｍ、粒径５μｍを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）装置をＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析に使用した。２種類のＦａｂの定量化のために、以下の方法を用いた：移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ及び移動相Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分で３０％～４５％Ｂの勾配、流量０．７ｍＬ／分。
【0160】
サイズの測定及びＰＤＩの決定のため、ナノ粒子をＰＢＳに、ＮＰ０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、＋２５℃にて多角度散乱で、且つマイクロキュベット（ＵＶ－Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｂｒａｎｄ（登録商標），Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。表面ロードを決定するためのゼータ電位測定のために、ナノ粒子を超純水に、ＮＰ０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、ＤＴＳ１０７０キャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって＋２５℃にて分析した。すべてのサイズ及びゼータ電位の測定が三重で行われ、平均±標準偏差として示された。
【0161】
非誘導体化ＮＰ－ＨＳＡ及びＦａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡを、ＤＬＳによって分析し、平均直径が、未修飾ＮＰの１３０ｎｍ（ＰＤＩ０．０４）から、Ｆａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡの１４５ｎｍ（ＰＤＩ０．０９）にわたることが判明した。
【0162】
実施例８
リンカーＢｒ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ２Ｏｃ－Ｋ－ＮＨ２の化学合成
リンカーＢｒ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ２Ｏｃ－Ｋ－ＮＨ２の化学合成
【0163】
リンカーの構造はＢｒ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ２Ｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ－ＣＯＮＨ２であり、Ｂｒ－ＣＨ２－ＣＯ－の表記は、Ｎ末端のブロモ酢酸の残基（「Ｚ」単位）を意味し、Ｏ２Ｏｃの表記は、非天然アミノ酸８－アミノ－３，６－ジオキソ－オクタン酸を意味し、Ｌ－Ｌｙｓ－ＣＯＮＨ２の表記は、天然Ｃ末端アミド化Ｌ－リジンアミノ酸を意味する。Ｆｍｏｃ法を用いて、ＭＢＨＡ Ｒｉｎｋアミド樹脂（ＩＲＩＳ ＢＩＯＴＥＣＨ，０．７４ｍｍｏｌ／ｇ）を使用した固相合成によって、ペプチドが調製された。合成は、５９０μｍｏｌのスケールで実施した。樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，Ｒｏｍｉｌ，ＤＥＬＴＥＫ）中で３回（５ｍＬ×３）洗浄し、ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン（ＲＯＭＩＬ，ＤＥＬＴＥＫ）で１０分間洗浄して、樹脂からＦｍｏｃ基を除去した。次に、Ｌ－リジンアミノ酸が、ＤＭＦ中に濃度０．５Ｍで溶解されたＦｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ誘導体（ＩＲＩＳ ＢＩＯＴＥＣＨ）の形で結合された。５倍の過剰量で使用されたアミノ酸を、文献［３６］に記載のようにＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、過剰な１：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）（ＩＲＩＳ ＢＩＯＴＥＣＨ）で予め活性化され、室温にて樹脂と１時間接触させた状態で置いた。樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、次いでＤＭＦ中の４０％（ｖ／ｖ）ピペリジン５ｍＬで２０分間処理した。樹脂を排液し、ＤＭＦで３回洗浄した。次いで、ＤＭＦ中に濃度０．５Ｍで溶解された導体Ｆｍｏｃ－Ｏ２Ｏｃ－ＯＨ（８－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル－アミノ）－３，６－ジオキサオクタン酸，ＩＲＩＳ ＢＩＯＴＥＣＨ）で樹脂を処理し、文献［３６］に記載のように過剰量のＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ１：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で室温にて１時間、予め活性化させた。最後に、樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、ＤＭＦ中の４０％（ｖ／ｖ）ピペリジン５ｍＬで２０分間処理した。樹脂を排液し、ＤＭＦで３回洗浄した。最後に、ＤＩＥＡ（１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ））が添加されたＤＣＭ（ジクロロメタン，ＲＯＭＩＬ，ＤＥＬＴＥＫ）中で濃度１Ｍにてブロモ酢酸２５当量で室温にて２時間処理した。最後に、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦ、再びＤＣＭで洗浄し、次いで真空下にて乾燥させた。ペプチドの脱離のために、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／Ｔｉｓ（トリイソプロピルシラン）／Ｈ２Ｏ９０／５／５（ｖ／ｖ／ｖ）溶液５ｍＬで樹脂を室温にて３時間処理した。樹脂を濾過除去し、ペプチドを冷たいエチルエーテルで沈殿させ、遠心によって単離し、Ｈ２Ｏ及びＡＣＮ（アセトニトリル，ＲＯＭＩＬ，ＤＥＬＴＥＫ）によって凍結乾燥させた。分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって粗製材料を精製し、最後にＨＰＬＣ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムに連結されたＬＣ－ＭＳ ＥＳＩ－ＴＯＦシステム（６２３０ ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析計）上でＸｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５０×２．１ｍｍ ＩＤ，５μｍ）を用いたＬＣ－ＭＳによって特徴付けた。流量０．２ｍＬ／分にて１０分で１％溶媒Ｂ（ＡＣＮ，０．０５％ＴＦＡ）～８０％Ｂの勾配。溶媒ＡはＨ２Ｏ、０．０５％ＴＦＡであった。純粋な生成物約１８０ｍｇ（９５％，ＨＰＬＣ）、収率７４％が得られた。決定された実験質量は４１０．１３原子質量単位（ａｍｕ）であり、実験質量４１０．１２ａｍｕとほぼ完全に一致した。
【0164】
実施例９
リンカーＭａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＣＯＮＨ２の合成
リンカーＭａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＣＯＮＨ２の合成
【0165】
リンカーの構造はＭａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＣＯＮＨ２であり、Ｍａｌの表記は、Ｎ末端の６－マレイミドヘキサン酸（「Ｚ」単位）を意味し、Ｇｌｙの表記は、天然グリシンアミノ酸を意味し、Ｌ－Ｌｙｓ－ＣＯＮＨ２の表記は、天然Ｃ末端アミド化Ｌ－リジンアミノ酸を意味する。Ｆｍｏｃ法を用いてＭＢＨＡ Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．７４ｍｍｏｌ／ｇ）を使用した固相合成によって、ペプチドを製造した。５９０μｍｏｌのスケールで合成を行った。樹脂はＤＭＦ中で３回（５ｍＬ×３）洗浄し、ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで１０分間処理して、樹脂からＦｍｏｃ基を除去した。次に、ＤＭＦ中に０．５Ｍの濃度で溶解されたＦｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ誘導体の形でＬ－リジンアミノ酸が結合された。５倍の過剰量で使用されたアミノ酸を、文献［３６］に記載のようにＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、過剰な１：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）（ＩＲＩＳ ＢＩＯＴＥＣＨ）で予め活性化し、室温にて樹脂と１時間接触させた状態で置いた。樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、次いでＤＭＦ中の４０％（ｖ／ｖ）ピペリジン５ｍＬで２０分間処理した。樹脂を排液し、ＤＭＦで３回洗浄した。次いで、ＤＭＦ中に濃度０．５Ｍで溶解された誘導体Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル－グリシン，ＩＲＩＳ ＢＩＯＴＥＣＨ）で樹脂を処理し、文献［３６］に記載のように１：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の過剰量のＨＢＴＵ／ＤＩＥＡで室温にて１時間、予め活性化させた。樹脂を最後にＤＭＦで３回洗浄し、ＤＭＦ中の４０％（ｖ／ｖ）ピペリジン５ｍＬで２０分間処理した。樹脂を排液し、ＤＭＦで３回洗浄した。樹脂を最後に、ＤＩＥＡが添加されたＤＭＦ（１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ））中で濃度１Ｍの６－マレイミドヘキサン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈコード：７５５８４２）２５当量で室温にて２時間処理した。最後に、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦ及び再びＤＣＭで洗浄し、次いで真空下にて乾燥させた。ペプチドの脱離のために、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／Ｔｉｓ（トリイソプロピルシラン）／Ｈ２Ｏ ９０／５／５（ｖ／ｖ／ｖ）溶液５ｍＬで樹脂を室温にて３時間処理した。樹脂を濾過除去し、ペプチドを冷たいエチルエーテルで沈殿させ、遠心によって単離し、Ｈ２Ｏ及びＡＣＮによって凍結乾燥させた。分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって粗製材料を精製し、最後にＨＰＬＣ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムに連結されたＬＣ－ＭＳ ＥＳＩ－ＴＯＦシステム（６２３０ ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析計）上でＸｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５０×２．１ｍｍ ＩＤ，５μｍ）を用いたＬＣ－ＭＳによって特徴付けた。流量０．２ｍＬ／分にて１０分で１％溶媒Ｂ（ＡＣＮ，０．０５％ＴＦＡ）～８０％Ｂの勾配。溶媒ＡはＨ２Ｏ、０．０５％ＴＦＡであった。
【0166】
純粋な生成物約１６３ｍｇ（９５％，ＨＰＬＣ）、収率約７０％が得られた。決定された実験質量は３９４．６４ａｍｕであり、実験質量３９４．６１ａｍｕとほぼ完全に一致した。
【0167】
実施例１０
トラスツズマブＦａｂ及びトラスツズマブで修飾されたＮＰ－ＨＳＡ間の組換えＨｅｒ２結合の競合的結合。
トラスツズマブＦａｂ及びトラスツズマブで修飾されたＮＰ－ＨＳＡ間の組換えＨｅｒ２結合の競合的結合。
【0168】
受容体に結合するアンタゴニストの量が、同じリガンド、又はレポーターでマークされたその代替物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を用いた置き換え試験によって間接的に検出され得る。置き換え試験は、実施例４及び実施例６に記載のように調製された、トラスツズマブＦａｂで機能化されたＮＰ－ＨＳＡ、マルチウェルプレートの表面に固定化された組換え受容体Ｈｅｒ２－Ｆｃ（組換えヒトＥｒｂＢ２ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ／Ｒ＆Ｄ １１２９－ＥＲ－０５０）、及び抗体ビオチン標識トラスツズマブを使用して実施された。９６ウェルのマルチウェルプレートの表面に固定化された受容体への、ビオチン標識トラスツズマブの結合を置き換える、トラスツズマブＦａｂで機能化されたＮＰ－ＨＳＡの能力を測定することによって実験を行った。並行実験において、ＮＰ－ＨＳＡに結合していないＦａｂを用いて、実験を行った。リン酸緩衝液中で濃度０．５μｇ／ｍＬの溶液のインキュベーション（１００μＬ／ウェル）によって、９６ウェルのポリスチレンマルチウェルプレートにＨｅｒ２－Ｆｃ受容体を、４℃で一晩固定化した。リン酸緩衝液中のＢＳＡの１％溶液（ウシ血清アルブミン／Ｍｅｒｃｋ Ａ７９０６，３００μＬ／ｍＬ）と共にインキュベーション（３７℃で２時間のインキュベーション）することによって、ブロッキングを行った。次いで、０．３９ｎＭ（ＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂ約２μｇ／ｍＬ）～１００ｎＭ（ＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂ０．５ｍｇ／ｍＬ）の間に含まれるＦａｂの増加モル濃度でＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂ（ＮＰ－ＨＳＡ１０μｇ／ｍｇ）を含有する、ビオチン標識トラスツズマブ溶液（ＣＮＲ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇによって提供された）を、固定濃度１００ｐＭにて様々なウェルに添加した。実験は四重（１つの濃度につき４ウェル）で実施した。固定化受容体に結合されたビオチン標識トラスツズマブの検出は、濃度５０ｎｇ／ｍＬ（１００μＬ／ウェル）のストレプトアビジン－ペルオキシダーゼ（Ｍｅｒｃｋ Ｓ５５１２）の溶液を用いて行い、それに続いて、基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン／Ｍｅｒｃｋ Ｔ０４４０）とインキュベーションした。反応を１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でブロックし、マルチプレートリーダー（６８０モデル，ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用して４５０ｎｍにて吸光度を読み取った。４５０ｎｍで得た吸光度値は、ブランク値（Ｈｅｒ２－Ｆｃで固定化されていないウェルの吸光度）から引き算され、平均され、ビオチン標識トラスツズマブのみのコントロールと比較してパーセンテージで表された。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用してＳ字状曲線に適合させて、阻害ＩＣ５０を決定した。実験を３回繰り返し行い、平均した。ＩＣ５０データを以下の表２に報告する。阻害曲線を図１に示す。このデータから、Ｆａｂで機能化されたＨＰ－ＮＳＡが、単独のＦａｂ受容体に結合する同じ能力を有することが実証される。
【0169】
【表2】
【0170】
実施例１１
トラスツズマブＦａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡ及び非接合組換えＦａｂの、Ｈｅｒ２－ポジティブＢＴ４７４細胞への結合。
トラスツズマブＦａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡ及び非接合組換えＦａｂの、Ｈｅｒ２－ポジティブＢＴ４７４細胞への結合。
【0171】
Ｈｅｒ２－ポジティブＢＴ４７４細胞、ヒト乳癌細胞系を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）９６ ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ ＴＣ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において細胞密度１０，０００細胞／ウェルにてプレーティングした。＋３７℃で５％ＣＯ２と共に一晩インキュベートした後、４％ホルムアルデヒドで細胞を室温で１５分間固定し、次いでＰＢＳ（１×）で２回洗浄し、最後に３％過酸化水素で室温にて１０分間処理した。ＰＢＳ（１×）で２回洗浄した後、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ－Ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ３２９４）で細胞を室温にて１時間処理した。０．１２～１．０μＭに含まれる濃度範囲で、ＮＰ－ＨＳＡ及びトラスツズマブＦａｂを用いて、実施例４及び実施例６に記載のように調製された、トラスツズマブＦａｂと接合されたＮＰ－ＨＳＡで、ウェルを二重で処理し、ＰＢＳ－Ａを使用して最終体積１００μＬ／ウェルにした。細胞を試料と共に室温にて２時間及び２４時間インキュベートし、ＰＢＳ（１×）で３回洗浄後に、ヒトＦａｂを認識することができるＨＲＰ結合マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。最後に、１：１０００の希釈で室温にて１時間、ウェルをＧＡＭ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、暗所で５分間ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ９１８７）（１００μＬ／ウェル）で処理した。２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４（５０μＬ／ウェル）を使用して、反応をブロックした。ＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を使用して、４９０ｎｍにて試料の吸光度を読み取った。その値を平均し、ブランクを引き（非機能化ＮＰ－ＨＳＡで処理したウェルでの値）、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ６．０を使用してプロットし、結合定数を決定した。結合曲線を図２ＡＢに示す。このデータから、同じ濃度のＦａｂの場合に、トラスツズマブＦａｂで機能化されたＮＰ－ＨＳＡは、２時間後及び２４時間後の両方で単独のＦａｂよりも高い効率で細胞上の受容体に結合できることが実証される。
【0172】
実施例１２
トラスツズマブＦａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡ及び非接合組換えＦａｂの、Ｈｅｒ２－ポジティブＢＴ４７４細胞及びＨｅｒ２－ネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合。
トラスツズマブＦａｂに接合されたＮＰ－ＨＳＡ及び非接合組換えＦａｂの、Ｈｅｒ２－ポジティブＢＴ４７４細胞及びＨｅｒ２－ネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合。
【0173】
Ｈｅｒ２－ポジティブＢＴ４７４細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）９６ ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ ＴＣ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において細胞密度１０，０００細胞／ウェルにてプレーティングした。Ｈｅｒ２－ネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ヒト乳癌細胞系を、同一の第２プレートにおいて細胞密度５，０００細胞／ウェルにてプレーティングした。＋３７℃で５％ＣＯ２と共に一晩インキュベートした後、４％ホルムアルデヒドで細胞を室温で１５分間固定し、次いでＰＢＳ（１×）で２回洗浄し、最後に３％過酸化水素で室温にて１０分間処理した。ＰＢＳ（１×）で２回洗浄した後、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ＰＢＳ－Ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ３２９４）で細胞を室温にて１時間処理した。０．０３μＭ～５０ｎＭに含まれる濃度範囲で、実施例４及び実施例６に記載のように調製された、トラスツズマブＦａｂ接合ＮＰ－ＨＳＡでウェルを二重で処理した。ＢＴ４７４細胞上での受容体の発現及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞上でのその発現の欠如を検証するために、最終体積１００μＬ／ウェルのＰＢＳ－Ａに溶解された、濃度５００、２００及び１００μｇ／ｍＬでトラスツズマブＦａｂ及び濃度１０、１．０及び０．１μｇ／ｍＬで全トラスツズマブ抗体を用いて、同じ濃度で、非機能化ＮＰ－ＨＳＡと並行して実験を行った。細胞を試料と共に室温にて２時間及び２４時間インキュベートし、ＰＢＳ（１×）中で３回洗浄後、ヒトＦａｂを認識することができるＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と接合されたマウスＩｇＧで処理した。最後に、１：１０００の希釈で室温にて１時間、ウェルをＧＡＭ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、暗所で５分間ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ９１８７）（１００μＬ／ウェル）で処理した。２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４（５０μＬ／ウェル）を使用して、反応をブロックした。ＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を使用して、４９０ｎｍにて試料の吸光度を読み取った。その値を平均し、ブランクを引き（非機能化ＮＰ－ＨＳＡで処理したウェルでの値）、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ｐｒｉｓｍ ６．０を使用してプロットし、結合定数を決定した。結合曲線を図３ＡＢＣに示す。図３Ａのデータから、トラスツズマブＦａｂで機能化されたＮＰ－ＨＳＡは、非受容体発現性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１系細胞にごくわずかしか結合しないが、その表面にＨｅｒ２受容体を発現するＢＴ４７４細胞に結合することができることが実証される。非常に高い濃度の組換えＦａｂ及び全抗体を用いて得られた図３Ｂ及び３Ｃのデータから、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１コントロール細胞上でのＨｅｒ２受容体発現の欠如が実証されている。非機能化ＮＰ－ＨＳＡは、検出可能なシグナルを提供しなかった。
【0174】
実施例１３
組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１に接合されたＮＰ－ＨＳＡ及び非接合組換えＦａｂのＮＴＥＲＡ細胞への結合。
組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１に接合されたＮＰ－ＨＳＡ及び非接合組換えＦａｂのＮＴＥＲＡ細胞への結合。
【0175】
Ｃｒｉｐｔｏ－１－ポジティブ細胞、ＮＴＥＲＡを、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）９６ ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ ＴＣ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において細胞密度５０００細胞／ウェルにてプレーティングした。＋３７℃で５％ＣＯ２と共に一晩インキュベートした後、４％ホルムアルデヒドで細胞を室温で１５分間固定し、次いでＰＢＳ（１×）で２回洗浄し、最後に３％過酸化水素で室温にて１０分間処理した。ＰＢＳ（１×）で２回洗浄した後、３％ＰＢＳ－Ａで細胞を室温にて１時間処理した。実施例５に記載のように調製された、抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１で機能化されたＮＰ－ＨＳＡ、及び単独のＦａｂ及び空のＮＰ－ＨＳＡを用いて、０．０００１１７μＭ～０．５μＭに含まれる濃度範囲で二組のウェルを処理し、３％ＰＢＳ－ＢＳＡ溶液で最終体積１００μＬ／ウェルにした。細胞を試料と共に室温にて２時間及び２４時間インキュベートし、ＰＢＳ（１×）中で３回洗浄後、Ｆａｂを認識することができるＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と接合された抗ヒトマウスＩｇＧで処理した。最後に、１：１０００の希釈で室温にて１時間、各ウェルにＧＡＭ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、暗所にて５分間ＯＰＤ（１００μＬ／ウェル）で処理した。続いて、２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して、反応をブロックした。ＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を使用して、４９０ｎｍにて試料の吸光度を読み取った。その結合曲線を図４に示し、単独のＦａｂが同じ条件下にて結合することができないのに対して、Ｆａｂ １０Ｄ１で機能化されたＮＰ－ＨＳＡは、用量反応及び飽和的様式で２時間後及び２４時間後の両方でＮＴＥＲＡ細胞に結合することができることが実証されている。非機能化ＮＰ－ＨＳＡは、検出可能なシグナルを提供しなかった。
【0176】
実施例１４
組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１及び組換えトラスツズマブＦａｂで機能化された二重特異性ＮＰ－ＨＳＡの、Ｈｅｒ２－ポジティブＢＴ４７４細胞及びＨｅｒ２－ネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合。
組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１及び組換えトラスツズマブＦａｂで機能化された二重特異性ＮＰ－ＨＳＡの、Ｈｅｒ２－ポジティブＢＴ４７４細胞及びＨｅｒ２－ネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合。
【0177】
Ｃｒｉｐｔｏ－１及びＨｅｒ２－ポジティブ細胞、ＢＴ４７４を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）９６ ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ ＴＣ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において細胞密度１０，０００細胞／ウェルにてプレーティングした。代わりに、Ｃｒｉｐｔｏ－１－ポジティブ及びＨｅｒ２－ネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、９６ウェルプレートにおいて細胞密度５，０００細胞／ウェルにてプレーティングした。＋３７℃で５％ＣＯ２と共に一晩インキュベートした後、４％ホルムアルデヒドで細胞を室温で１５分間固定し、次いでＰＢＳ（１×）で２回洗浄し、最後に３％過酸化水素で室温にて１０分間処理した。ＰＢＳ（１×）で２回洗浄した後、３％ＰＢＳ－Ａで細胞を室温にて１時間処理した。実施例７に記載のように調製され、Ｆａｂ １０Ｄ１密度５．０μｇ／ｍｇ ＮＰ－ＨＳＡ及びトラスツズマブＦａｂ密度２．０μｇ／ｍｇ ＮＰ－ＨＳＡを有する、２種類の組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１及びトラスツズマブＦａｂで機能化されたＮＰ－ＨＳＡで二組のウェルを処理した。０．０９７ｎＭ（０．３４３μｇ／ｍＬ ＮＰ－ＨＳＡ）～５０ｎＭ（１７５μｇ／ｍＬ ＮＰ－ＨＳＡ）の総Ｆａｂの当量濃度として表される、増加濃度で機能化ＮＰ－ＨＳＡが使用された。並行して、全１Ｂ４抗体（抗Ｃｒｉｐｔｏ－１，［３０］及びトラスツズマブで濃度０．１及び１．０μｇ／ｍＬにて、同じ細胞を処理した。すべての試料を、３％ＰＢＳ－ＢＳＡを用いて最終体積１００μＬ／ウェルで使用した。細胞を試料と共に室温にて２時間インキュベートし、ＰＢＳ（１×）中で３回洗浄後、Ｆａｂを認識することができるＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と接合された抗ヒトマウスＩｇＧで処理した。最後に、１：１０００の希釈で室温にて１時間、各ウェルにＧＡＭ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、暗所にて５分間ＯＰＤ（１００μＬ／ウェル）で処理した。続いて、２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して、反応をブロックした。ＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を使用して、４９０ｎｍにて試料の吸光度を読み取った。図５ＡＢは、濃度０．１μｇ／ｍＬ及び１．０μｇ／ｍＬでの２つの細胞系への全Ｂ４抗体抗Ｃｒｉｐｔｏ－１及びトラスツズマブの結合データを示し、ＢＴ４７４細胞が、Ｈｅｒ２受容体を発現し、それより少ない程度でＣｒｉｐｔｏ－１を発現すること、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が、Ｃｒｉｐｔｏ－１を小さな程度でのみ発現することが実証されている。図５Ｃは、用量反応結合曲線を示し、抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂが単独で存在することによって、２つの組換えＦａｂで機能化されたＮＰ－ＨＳＡが、Ｈｅｒ２－ネガティブＢＴ４７４及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のどちらにも結合することができることを示す。非機能化ＮＰ－ＨＳＡは、検出可能なシグナルを提供しなかった。
【0178】
実施例１５
２種類のＮＰ－ＨＳＡの混合物で得られた結合と比較した、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１及び組換えトラスツズマブＦａｂで機能化された二重特異性ＮＰ－ＨＳＡの、Ｈｅｒ２－ポジティブＢＴ４７４細胞及びＨｅｒ２－ネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合。
２種類のＮＰ－ＨＳＡの混合物で得られた結合と比較した、組換え抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１及び組換えトラスツズマブＦａｂで機能化された二重特異性ＮＰ－ＨＳＡの、Ｈｅｒ２－ポジティブＢＴ４７４細胞及びＨｅｒ２－ネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合。
【0179】
Ｃｒｉｐｔｏ－１及びＨｅｒ２ポジティブ細胞、ＢＴ４７４を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）９６ ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ ＴＣ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において細胞密度１０，０００細胞／ウェルにてプレーティングした。Ｃｒｉｐｔｏ－１ポジティブ及びＨｅｒ２ネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、９６ウェルプレートにおいて細胞密度５，０００細胞／ウェルにてプレーティングした。＋３７℃で５％ＣＯ２と共に一晩インキュベートした後、４％ホルムアルデヒドで細胞を室温で１５分間固定し、次いでＰＢＳ（１×）で２回洗浄し、最後に３％過酸化水素で室温にて１０分間処理した。ＰＢＳ（１×）で２回洗浄した後、３％ＰＢＳ－Ａで細胞を室温にて１時間処理した。密度３．０μｇ／ｍｇ ＮＰ－ＨＳＡ（１０Ｄ１）及び２μｇ／ｍｇ ＮＰ－ＨＳＡ（トラスツズマブ）にて実施例７に記載のように調製されたＮＰ－ＨＳＡ機能化二重特異性ＮＰ－ＨＳＡで、密度１０．０μｇ／ｍｇ ＮＰ－ＨＳＡにて、２４ｐＭ～１２ｎＭの増加濃度で、実施例５に記載のようにＦａｂ １０Ｄ１のみで機能化されたＮＰ－ＨＳＡで、２４ｐＭ～１２ｎＭのＦａｂの増加濃度にて、実施例４及び実施例６に記載のように調製された、密度１０．０μｇ／ｍｇ ＮＰ－ＨＳＡでトラスツズマブＦａｂのみで機能化されたＮＰ－ＨＳＡで、濃度１．０μｇ／ｍＬ及び０．１μｇ／ｍＬの両方で使用された２種類の抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ ｍＡｂトラスツズマブ及び１Ｂ４［３０］で、二組のウェルを、総Ｆａｂの２４ｐＭ～１２ｎＭの増加濃度にて処理した。すべての試料を、３％ＰＢＳ－ＢＳＡを用いて最終体積１００μＬ／ウェルで使用した。細胞を試料と共に室温にて２時間インキュベートし、ＰＢＳ（１×）中で３回洗浄後、Ｆａｂを認識することができるＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と接合された抗ヒトマウスＩｇＧで処理した。最後に、１：１０００の希釈で室温にて１時間、各ウェルにＧＡＭ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、暗所にて５分間ＯＰＤ（１００μＬ／ウェル）で処理した。続いて、２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して、反応をブロックした。ＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を使用して、４９０ｎｍにて試料の吸光度を読み取った。用量反応結合曲線を図６ＡＢＣＤに示し、２つの組換えＦａｂで機能化された二重特異性ＮＰ－ＨＳＡが、２つの異なるＦａｂで機能化された２種類のＮＰ－ＨＳＡの組み合わせと同じ効率で、ＢＴ４７４細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の両方に結合することができることが実証されている。非機能化ＮＰ－ＨＳＡは、検出可能なシグナルを提供しなかった。
【0180】
実施例１６
フルオレセインで、及び抗体抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ１０Ｄ１で機能化されたＮＰ－ＨＳＡの製造、並びにサイトフローメトリー（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）によるＣｒｉｐｔｏ－１を発現するＮＴＥＲＡ２細胞結合性の実験。
フルオレセインで、及び抗体抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ１０Ｄ１で機能化されたＮＰ－ＨＳＡの製造、並びにサイトフローメトリー（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）によるＣｒｉｐｔｏ－１を発現するＮＴＥＲＡ２細胞結合性の実験。
【0181】
ＮＰ－ＨＳＡは、実施例１に記載のように製造された。ＮＰ－ＨＳＡ５．０ｍｇを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１．０ｍＬに懸濁した。ＨＳＡ：ＦＩＴＣ比１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）に達するように、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ，Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈコードＦ４２７４）０．１４ｍｇを懸濁液に添加し、無水ＤＭＳＯ５０μＬに可溶化した。懸濁液を３７℃で３時間攪拌し続けた。
【0182】
ＦＩＴＣへのＮＰ－ＨＳＡ接合反応は、ＲＰ－ＨＰＬＣによって様々な時点でモニター（１～３時間）され、上清を分析し、溶解状態の遊離ＦＩＴＣの濃度の減少を評価した。ＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析から、反応から３時間後のＦＩＴＣ接合体の量は８μｇ／ｍｇ ＮＰであることが分かった。次いで、余分なＦＩＴＣを除去するために、遠心によるＨ２Ｏでの３回洗浄サイクルでナノ粒子を精製した。最後に、それらをＰＢＳに再分散し、＋４℃にて保管した。そのナノ粒子はＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡと定義された。抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂ １０Ｄ１とのＭＴＧによる接合に、ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡのアリコート（４．０ｍｇ）を使用し、２つのＦａｂに接合されたＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ（ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂ）を得た。ＨＳＡ／リンカー比１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を用いて、ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ４．０ｍｇをペプチドリンカーＢｒ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ２Ｏｃ－Ｋ－ＮＨ２（実施例６及び実施例８参照）で処理した。室温にて、及び常時攪拌下でインキュベーションして１６時間後に、余分な試薬を除去するために、修飾ＮＰ（ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ－Ｌｙｓ）をＨ２Ｏ中で３回洗浄し、次いでリン酸緩衝液に再懸濁した。ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ－Ｌｙｓを抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ １０Ｄ１で機能化し（実施例７参照）；その機能化は、Ｃ末端のＴＱＧＡタグの存在を利用してＭＴＧを使用して実施された。機能化反応のために、ＭＴＧ０．２５Ｕの存在下にて、最終体積１ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中で、Ｆａｂ４０μｇを使用した。ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ－ＬｙｓへのＦａｂ接合反応をＲＰ－ＨＰＬＣによって様々な時点（１～１６時間）でモニターし、上清を分析し、溶解状態の遊離Ｆａｂの濃度の減少を評価した。ＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析から、１６時間後の、Ｆａｂ接合体の量が１０μｇ／ｍｇ ＮＰ－ＨＳＡであることが判明した。このようにして得られた、ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂと呼ばれるＮＰ－ＨＳＡを次いで、余分なＭＴＧ及びＦａｂを除去するために、遠心によるＨ２Ｏでの３回洗浄サイクルで精製した。最後に、それらをＰＢＳに再分散し、＋４℃にて保管して、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、サイズ（ｎｍ）、多分散性（ＰＤＩ）及びゼータ電位（ｍＶ）によって特徴付けた。Ｃ４ Ｖｙｄａｃ分析カラム，４．６×２５０ｍｍ，粒径５μｍを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）装置をＲＰ－ＨＰＬＣにおける分析に使用した。溶解状態でのＦａｂの定量化のために、以下の方法を用いた：移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ及び移動相Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分で３０％～４５％Ｂの勾配、流量０．７ｍＬ／分。
【0183】
サイトフローメトリー分析のために、グルタミン及び抗生物質を添加して、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で密度４０％にてＮＴＥＲＡ２細胞をプレーティングした。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、以下のナノ粒子ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ、ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂを含有する血清不含培地を添加した。ＦＩＴＣを使用せず、ＦａｂでマークしたＮＰ－ＨＳＡをネガティブコントロールとして使用した。使用されたＮＰの量は、ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂに対して正規化され、抗Ｃｒｉｐｔｏ Ｆａｂ濃度１０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬを有するように使用された。細胞をＮＰと共に３７℃で４時間インキュベートし、次いで洗浄し、０．５％ＢＳＡ ＰＢＳに再懸濁した。「ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡＩＩＩ細胞選別機」で試料を獲得し、ＦＩＴＣのサイズ及び強度について分析した。その結果から、ＦＩＴＣポジティブ細胞（ゲートＰ３）のパーセンテージ及び分析された総母集団の平均蛍光強度（Ｐ１ ＭＦＩ）が報告される。１００ｎｇ／ｍＬにて、Ｆａｂを含まないＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ（０．５％）と比較して、ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂ（１．５％）で有利に、わずかなシグナルが確認された。１０００ｎｇ／ｍＬにて、シグナルは、両方の試料（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）に関して、かなり強い。マークされた細胞の数に関して、Ｆａｂで修飾されたＮＰ（５３．５％）と修飾されていないＮＰ（６３．６％）の間で実質的な差はないことが確認される。ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡ－Ｆａｂで確認された蛍光強度は、ＦＩＴＣ－ＮＰ－ＨＳＡで確認された蛍光強度と比べてかなり高く、それぞれＭＦＩ３３１３及び７５２である。次いで、４．４倍高い蛍光シグナルは、未修飾ＮＰ－ＨＳＡと比べて、Ｆａｂで修飾されたＮＰ－ＨＳＡ処理細胞で確認され、抗Ｃｒｉｐｔｏ－１ Ｆａｂの存在によって、一部の細胞内へのより多くのＮＰ－ＨＳＡインプットが可能となることが示唆される。
参考文献
参考文献
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［２３］ Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｙ．；Ｈｅ，Ｂ．；Ｑｕ，Ｗ．；Ｃｕｉ，Ｚ．；Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｂ．；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．；Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｂｕｍｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ａｎｄ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ，２０１１，２８，（６），５２８－５３６．
【0207】
［２４］ Ｆｏｃａ，Ｇ．；Ｉａｃｃａｒｉｎｏ，Ｅ．；Ｆｏｃａ，Ａ．；Ｓａｎｇｕｉｇｎｏ，Ｌ．；Ｕｎｔｉｖｅｒｏｓ，Ｇ．；Ｃｕｅｖａｓ－Ｎｕｎｅｚ，Ｍ．；Ｓｔｒｉｚｚｉ，Ｌ．；Ｌｅｏｎａｒｄｉ，Ａ．；Ｒｕｖｏ，Ｍ．；Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｒｉｐｔｏ－１ ｗｉｔｈ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，２０１９，１５８，２４６－２５６．
【0208】
［２５］ Ｓｅｌｉｓ，Ｆ．；Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．；Ｃａｎｔｉｌｅ，Ｍ．；Ｓａｎｎａ，Ｒ．；Ｃａｌｖａｎｅｓｅ，Ｌ．；Ｆａｌｃｉｇｎｏ，Ｌ．；Ｄｅｌｌ’Ｏｍｏ，Ｐ．；Ｅｓｐｅｒｔｉ，Ａ．；Ｄｅ Ｆａｌｃｏ，Ｓ．；Ｆｏｃａ，Ａ．；Ｃａｐｏｒａｌｅ，Ａ．；Ｉａｃｃａｒｉｎｏ，Ｅ．；Ｔｒｕｐｐｏ，Ｅ．；Ｓｃａｒａｍｕｚｚａ，Ｓ．；Ｔｏｎｏｎ，Ｇ．；Ｒｕｖｏ，Ｍ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ Ｆａｂｓ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ，２０２０．
【0209】
［２６］ Ｂｅｈｄａｎｉ，Ｍ．；Ｚｅｉｎａｌｉ，Ｓ．；Ｋｈａｎａｈｍａｄ，Ｈ．；Ｋａｒｉｍｉｐｏｕｒ，Ｍ．；Ａｓａｄｚａｄｅｈ，Ｎ．；Ａｚａｄｍａｎｅｓｈ，Ｋ．；Ｋｈａｂｉｒｉ，Ａ．；Ｓｃｈｏｏｎｏｏｇｈｅ，Ｓ．；Ｈａｂｉｂｉ Ａｎｂｏｕｈｉ，Ｍ．；Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ－Ｇｈａｓｓａｂｅｈ，Ｇ．；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎａｎｏｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２；ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２，５０，（１－２），３５－４１．
【0210】
［２７］ Ｐｒｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｋｏｕｍａｒｉａｎｏｕ，Ｅ．；Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ，Ｇ．；Ｒｅｖｅｔｓ，Ｈ．；Ｄｅｖｏｏｇｄｔ，Ｎ．；Ｌａｈｏｕｔｔｅ，Ｔ．；Ｚａｌｕｔｓｋｙ，Ｍ．Ｒ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｙ．Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ，２０１３，４０，（１），５２－５９．
【0211】
［２８］ Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｓ．；Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．；ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｅｋｅｎ，Ｊ．；ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｌ，Ｒ．；Ｖｏｎｇｐｒｏｍｅｋ，Ｒ．；ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ Ｅｎ Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎ，Ｐ．Ｍ．；Ｓｔｏｒｍ，Ｇ．；Ｒｏｏｖｅｒｓ，Ｒ．Ｃ．，Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＦＲ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｎａｎｏｂｏｄｙ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１０，１４５，（２），１６５－１７５．
【0212】
［２９］ Ｗｅｂｅｒ，Ｃ．；Ｃｏｅｓｔｅｒ，Ｃ．；Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２０００，１９４，（１），９１－１０２．
【0213】
［３０］ Ｌａｎｇｅｒ，Ｋ．；Ｂａｌｔｈａｓａｒ，Ｓ．；Ｖｏｇｅｌ，Ｖ．；Ｄｉｎａｕｅｒ，Ｎ．；ｖｏｎ Ｂｒｉｅｓｅｎ，Ｈ．；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ （ＨＳＡ） ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００３，２５７，（１－２），１６９－１８０．
【0214】
［３１］ Ｌｏｍｉｓ，Ｎ．；Ｗｅｓｔｆａｌｌ，Ｓ．；Ｆａｒａｈｄｅｌ，Ｌ．；Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ｍ．；Ｓｈｕｍ－Ｔｉｍ，Ｄ．；Ｐｒａｋａｓｈ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ （Ｂａｓｅｌ），２０１６，６，（６）．
【0215】
［３２］ Ｃａｐｏｒａｌｅ，Ａ．；Ｍｏｎｔｉ，Ａ．；Ｓｅｌｉｓ，Ｆ．；Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．；Ｔｏｎｏｎ，Ｇ．；Ｒｕｖｏ，Ｍ．；Ｄｏｔｉ，Ｎ．，Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１９，３０２，４８－５７．
【0216】
［３３］ Ｃａｐｏｒａｌｅ，Ａ．；Ｓｅｌｉｓ，Ｆ．；Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．；Ｊｏｔｔｉ，Ｇ．Ｓ．；Ｔｏｎｏｎ，Ｇ．；Ｒｕｖｏ，Ｍ．，Ｔｈｅ ＬＱＳＰ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ，２０１５，１０，（１），１５４－１６１．
【0217】
［３４］ Ｄｏｔｉ，Ｎ．；Ｃａｐｏｒａｌｅ，Ａ．；Ｍｏｎｔｉ，Ａ．；Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．；Ｓｅｌｉｓ，Ｆ．；Ｒｕｖｏ，Ｍ．，Ａ ｒｅｃｅｎｔ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０２０，３６，（４），５３．
【0218】
［３５］ Ｓｅｌｉｓ，Ｆ．；Ｆｏｃａ，Ｇ．；Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．；Ｍａｒｒａ，Ｃ．；Ｄｉ Ｍａｕｒｏ，Ｃ．；Ｓａｃｃａｎｉ Ｊｏｔｔｉ，Ｇ．；Ｓｃａｒａｍｕｚｚａ，Ｓ．；Ｐｏｌｉｔａｎｏ，Ａ．；Ｓａｎｎａ，Ｒ．；Ｒｕｖｏ，Ｍ．；Ｔｏｎｏｎ，Ｇ．，Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ａｃｑｕｉｒｅ ａｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｂｕｔ Ｓｈｏｗ ａ Ｌａｒｇｅｌｙ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎｔｉｇｅｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２０１６，１７，（４），４９１．
【0219】
［３６］ Ｃａｐｏｒａｌｅ，Ａ．；Ｄｏｔｉ，Ｎ．；Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．；Ｒｕｖｏ，Ｍ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｕｓｅ ｏｆ Ｏｘｙｍａ ａｎｄ ＨＡＴＵ ｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ，２０１７，２３，（４），２７２－２８１．
【図1】
【図2AB】
【図3A】
【図3BC】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【国際調査報告】