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▶ ツェヴェック ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-11
(54)【発明の名称】低レベルのＶＡ－ＲＮＡを有する産生細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 15/35 20060101AFI20231228BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231228BHJP
C12N 15/34 20060101ALI20231228BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20231228BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20231228BHJP
【ＦＩ】
C12N15/35 ZNA
C12N5/10
C12N15/34
C12N15/85 Z
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537252
(86)(22)【出願日】2021-12-20
(85)【翻訳文提出日】2023-08-02
(86)【国際出願番号】 EP2021086768
(87)【国際公開番号】W WO2022136258
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】20215905.9
(32)【優先日】2020-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517238400
【氏名又は名称】ツェヴェック ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100154922
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 允辰
(74)【代理人】
【識別番号】100207158
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 研二
(72)【発明者】
【氏名】ハイン ケルスティン
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ カルモ ギル ゴンカルベス イネス
(72)【発明者】
【氏名】ヴィッシンク ジルケ
(72)【発明者】
【氏名】ハジェッツ ベン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞であって、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１の開始コドンを囲むプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）活性化配列が不活性化されていると同時に、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の機能的発現を維持している、宿主細胞に関する。本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、本発明の宿主細胞において該ＡＡＶを発現させる工程を含む、方法に更に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞であって、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１の開始コドンを囲むプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）活性化配列が不活性化されていると同時に、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の機能的発現を維持している、宿主細胞。
【請求項2】
前記ＰＫＲ活性化配列が、カプシドのプレｍＲＮＡをコードする配列のイントロンのスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を置き換えることにより不活性化されている、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項3】
前記ＰＫＲ活性化配列が、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０を異なるプロモーターと置き換え、カプシドコード配列の外側のスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を含むｐ４０イントロンの一部を異なる起源のイントロンと置き換えることにより不活性化されている、請求項１又は２に記載の宿主細胞。
【請求項4】
天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０が、誘導性プロモーターと置き換えられており、及び／又は天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０のイントロンが、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１の代わりとなり、適切なスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を提供する置換用イントロンとカプシドコード配列の外側で置き換えられている、請求項１～３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項5】
前記置換用イントロンが、ＳＶ４０イントロン、合成ＣＡＧプロモーターイントロン、及びβ－グロビンイントロンからなる群から選択される、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項6】
誘導性プロモーター制御下のＡＡＶレプリカーゼ（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする核酸、及び／又は、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質及びアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする核酸、及び／又は、
誘導性プロモーター制御下のアデノウイルスＥ２Ａタンパク質及びアデノウイルスＥ４ｏｒｆ６タンパク質をコードする核酸、
を更に含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項7】
１種以上の目的遺伝子（ＧＯＩ）を含む導入ベクターをコードする核酸を更に含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項8】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質の発現を制御する誘導性プロモーター及び／又はＡＡＶレプリカーゼタンパク質の発現を制御する誘導性プロモーター及び／又はアデノウイルスＥ２Ａタンパク質及びアデノウイルスＥ４ｏｒｆ６タンパク質の発現を制御する誘導性プロモーターが、ｔｅｔ誘導性プロモーター、ｃｕｍａｔｅ誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、ＦＫＣｓＡ誘導性プロモーター、ＡＢＡ誘導性プロモーター、リボスイッチ制御プロモーター、及び熱ショックプロモーター駆動型システム、光切り替え可能なシステムからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項9】
前記ＰＫＲ活性化配列が、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０を異なるプロモーターと置き換え、カプシドコード配列の外側のスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を含むｐ４０イントロンの一部を異なる起源のイントロンと置き換えることにより不活性化されており、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０が、恒常的プロモーター又は誘導性プロモーターと置き換えられており、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０のイントロンが、部分的に置き換えられ、すなわち、カプシドコード配列の外側が、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１の代わりとなるイントロンと置き換えられており、
プロモーターから前記ＡＡＶカプシドタンパク質のコード配列の開始コドンまでのそれぞれのヌクレオチド配列が、
プロモーター－Ｎ１－イントロン－Ｎ２－ＡＴＧ
（式中、
プロモーターは、前記恒常的プロモーター又は前記誘導性プロモーターであり、
Ｎ１は、１ヌクレオチド～４０００ヌクレオチドの配列であり、
イントロンは、最小コンセンサス配列であるＧＴ／ＡＧを有する適切なスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を供給するイントロンからなる群から選択されるイントロンであり、
Ｎ２は、１ヌクレオチド～４０００ヌクレオチドの配列であり、
ＡＴＧが、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列の開始コドンである）の構造を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項10】
プロモーターが、第三世代のＴＲＥ３Ｇプロモーター等のｔｅｔ誘導性プロモーター、ｃｕｍａｔｅ誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、ＦＫＣｓＡ誘導性プロモーター、ＡＢＡ誘導性プロモーター、リボスイッチ制御プロモーター、及び熱ショックプロモーター駆動型システム、光切り替え可能なシステムからなる群から選択される誘導性プロモーターである、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項11】
イントロンが、ＳＶ４０イントロン、合成ＣＡＧプロモーターイントロン、及びβ－グロビンイントロンからなる群から選択されるイントロンである、請求項９又は１０に記載の宿主細胞。
【請求項12】
前記ＰＫＲ活性化配列が、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０を異なるプロモーターと置き換え、カプシドコード配列の外側のスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を含むｐ４０イントロンの一部を異なる起源のイントロンと置き換えることにより不活性化されており、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０が、異なるプロモーターと置き換えられており、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０のイントロンが、部分的に置き換えられ、すなわち、カプシドコード配列の外側が、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１の代わりとなるＳＶ４０イントロンと置き換えられており、
プロモーターから前記ＡＡＶカプシドタンパク質のコード配列の開始コドンまでのそれぞれのヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号４若しくは配列番号５に記載のヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉ）配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ただし、上記の必要条件が該ヌクレオチド配列に適用され、
配列番号４又は配列番号５の最後の３ヌクレオチドであるＡＴＧが、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列の開始コドンである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項13】
ＣＡＰ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、及びＰｅｒ．Ｃ６細胞からなる群から選択される細胞に由来する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項14】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、請求項１～１３のいずれか１項に記載の宿主細胞において該ＡＡＶを発現させる工程を含む、方法。
【請求項15】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生における請求項１～１３のいずれか１項に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞であって、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１の開始コドンを囲むプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）活性化配列が不活性化されていると同時に、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の機能的発現を維持している、宿主細胞に関する。本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、本発明の宿主細胞において該ＡＡＶを発現させる工程を含む、方法に更に関する。
【背景技術】
【0002】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及び一部の他の霊長類種に感染する小型ウイルスである。それらは、ディペンドウイルス（Dependoparvovirus）属に属し、またディペンドウイルス属は、パルボウイルス（Parvoviridae）科に属する。アデノ随伴ウイルスは、小型（２０ｎｍ）のエンベロープのない複製欠損ウイルスである。
【0003】
ＡＡＶは、なんらの疾患も引き起こさず、非常に軽度の免疫応答を誘発するのみであることが現在知られている。幾つかの更なる特徴のため、ＡＡＶは、遺伝子治療用のウイルスベクターを作製するため、及び同質遺伝子型のヒト疾患モデルを作製するための魅力的な候補である。ＡＡＶを使用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞及び静止細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外の状態で存続することができるが、天然のウイルスでは、ウイルスに保有される遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みが発生する。
【0004】
近年、ＡＡＶ由来のベクターに基づく承認製品の数及び遺伝子治療の臨床試験数が急速に増加している。遺伝子治療におけるＡＡＶベクターの利点は、優れた安全性プロファイル、上述の非病原性、導入遺伝子の安定した発現、並びに分裂細胞及び非分裂細胞への形質導入が可能なことである。
【0005】
現在、組換えＡＡＶの産生は、多数の構成要素を必要とする。組換えウイルスの産生には、ＡＡＶゲノムにより通常コードされるレプリカーゼ（Ｒｅｐ）及びカプシド（Ｃａｐ）タンパク質が必要とされ、これらはトランスで供給される。ヘルパー遺伝子は、異なるヘルパーウイルスに由来し得て、最も一般的なものは、アデノウイルスから得られるヘルパーウイルス遺伝子であるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、及びＶＡ ＲＮＡ（ウイルス関連ＲＮＡ）である。加えて、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれた目的遺伝子（ＧＯＩ）を含む導入ベクターが必要とされる。
【0006】
現在のＡＡＶベースの産生系は、主に以下の技術に依存するが、これらには幾つかの欠点がある。一過性の形質移入は、通常、２つ又は３つのプラスミド系（目的遺伝子を含む導入ベクター；アデノウイルスのヘルパー機能を有するｐＨｅｌｐｅｒ；カプシド及びレプリカーゼ機能を供給するｐＡＡＶ－Ｒｅｐ２ＣａｐＸ（ＣａｐＸ＝異なるＡＡＶ血清型のカプシド機能））を必要とする。しかしながら、かかる技術は、十分な拡張性、頑強性、及び再現性を欠き、プラスミドＤＮＡに高い費用がかかる。目的遺伝子が既に安定的に組み込みこまれた、いわゆる産生細胞株は、主にＨＥＫ細胞又はＨｅＬａ細胞がベースとなっている。しかしながら、かかる細胞は、ヘルパーウイルス、例えばアデノウイルスの追加の感染を必要とする。ＡＡＶ産生におけるヘルパーウイルスのこの追加により、対応するヘルパーウイルスの最初の産生後に、産生されたＡＡＶベクターの徹底的な精製により最終製品からヘルパーウイルスを除去すること、及び高い費用をかけてヘルパーウイルスが存在しないことを証明することが必要となる。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースの系及びバキュロウイルスベースの系にも同じことが当てはまり、加えて後者は、十分な拡張性及び頑強性を欠く。
【0007】
ＡＡＶの産生に必要な全ての構成要素が細胞に安定的に組み込まれている、完全に安定したＡＡＶベースの産生細胞株の作製は、様々な困難により妨げられる。全てのヘルパー機能の細胞への組込みは、困難である。ＣＡＰ又はＨＥＫ２９３細胞では、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは、既に恒常的に発現している。ヘルパー機能Ｅ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６は、細胞に対して有毒である。しかしながら、これらのヘルパー機能は、誘導性プロモーターから発現され得る。誘導性プロモーターからの発現は、自身のコード配列内にそのＰｏｌＩＩＩプロモーターが存在する非コードＶＡ ＲＮＡではより困難である。したがって、ＶＡ ＲＮＡの高レベル発現が実証された安定細胞株は、現時点で存在しない。
【0008】
ＶＡ ＲＮＡは、アデノウイルスにおいて見出される非コードＲＮＡである。これは、翻訳を調節する役割を果たす。ＶＡＩ又はＶＡ ＲＮＡＩ及びＶＡＩＩ又はＶＡ ＲＮＡＩＩと称される２コピーのこのＲＮＡが存在する。これら２つのＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、アデノウイルスゲノム内の別個の遺伝子である。ＶＡ ＲＮＡＩが主要な種であり、ＶＡ ＲＮＡＩＩは低レベルで発現する。ＶＡＩは、Ｅ３及びヘキソンを含む初期及び後期アデノウイルス遺伝子の両方の翻訳を促進する。一過性形質移入アッセイは、ＶＡＩがリボソームに結合した転写物の安定性を増加させることを示した。さらに、ＶＡＩは細胞内でプロセシングされて、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡとして作用することができる２２ヌクレオチド長のＲＮＡを生じる。さらに、ＶＡＩは、普通なら真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）をリン酸化するはずの二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼＲに対するデコイＲＮＡとして機能する。
【0009】
ＡＡＶとの関係において、ＶＡ ＲＮＡは、高力価のＡＡＶ産生に重要である。ＡＡＶ産生におけるＶＡ ＲＮＡの最もよく記述される機能は、ＰＫＲのリン酸化／活性化及びこれによるｅＩＦ２αのリン酸化の抑制であり、ｅＩＦ２αのリン酸化はウイルスタンパク質発現の減少をもたらす。ｅＩＦ２αは、Ｍｅｔ－ｔＲＮＡ及び４０Ｓリボソームに結合して、前開始複合体を形成することにより全般的な翻訳を調節する三量体の真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）のサブユニットである。セリン５１のリン酸化により、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）であるｅＩＦ２ＢによるｅＩＦ２に結合したＧＤＰのＧＴＰへの交換が阻止され、これにより、タンパク質合成の阻害がもたらされる。ＰＫＲは、ＶＰ１のＡＵＧを囲む、カプシド遺伝子ＲＮＡのリーダー配列の短い領域により活性化されることが示されている。この配列は、上流のｒｅｐ遺伝子に組み込まれているｐ４０プロモーターとカプシド遺伝子との間のイントロンの一部である。ＰＫＲ活性の阻害は、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス等の多数の異なるウイルスの感染時に発生する一般的なメカニズムである。
【0010】
この文脈において、非特許文献１は、ＡＡＶ感染サイクルにおいてＶＡ ＲＮＡがカプシドの発現にどのくらい重要であるか、すなわち、カプシドのプレｍＲＮＡがＰＫＲをどのくらい活性化し、次にＰＫＲがｅＩＦ２αをどのくらいリン酸化し、このことが次にどのくらいカプシドタンパク質の低発現をもたらすかを記載している。さらに、上記文献は、欠失実験によりＰＫＲ活性化配列の同定を試みており、これをＶＰ１のＡＵＧ配列周辺の約２００ヌクレオチドに絞り込んでいる。
【0011】
要約すると、現在のＡＡＶベースの産生系は、それらの再現性、拡張性、及び頑強性に関して限界がある。さらに、ヘルパーウイルスが要求されることにより、徹底的な精製、及び高い費用をかけてヘルパーウイルスが存在しないことを証明することが必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Nayak and Pintel (Nayak, R. and Pintel, D. J.; Journal of Virology, 81(21); 2007; pp. 11908-11916)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
したがって、本発明の背景にある技術的課題は、一過性の形質移入又はヘルパーウイルスを必要とせず、これにより、高レベルのＶＡ ＲＮＡの非存在下でのＡＡＶ遺伝子治療ベクターの工業的かつ拡張可能な産生を可能にする、ＡＡＶベクターの安定した産生のための拡張可能な系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
上記の技術的課題の解決は、特許請求の範囲を特徴とする実施の形態によって達成される。
【0015】
特に、第一の態様において、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞であって、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１の開始コドンを囲むプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）活性化配列が不活性化されていると同時に、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の機能的発現を維持している、宿主細胞に関する。
【0016】
本発明におけるＡＡＶは、特定のＡＡＶ血清型に限定されない。したがって、ＡＡＶは、アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ８、及びＡＡＶｒｈ１０から選択され得る。さらに、ＡＡＶは、合成血清型、例えば、上記の血清型のうちの異なる２つ以上のハイブリッド、又はＡＡＶ血清型の指向性を変化させる顕著な変異を有する上記の血清型のうちの１つであり得る。しかしながら、特定の実施の形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９、好ましくは、ＡＡＶ８である。
【0017】
ＡＡＶカプシドタンパク質は、３つのカプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を包含し、これらは、ｐ４０と名付けられた１つのプロモーターから天然に発現され、ｃａｐ遺伝子によりコードされる。これらのタンパク質の分子量は、それぞれ、８７ｋＤａ、７２ｋＤａ、及び６２ｋＤａである。ＡＡＶカプシドは、合計６０個の単量体が正二十面体対称に配置された１：１：１０の比率のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の混合物から構成され、３．９ＭＤａの推定サイズを有する。
【0018】
３つ全てのＶＰは、１つのｍＲＮＡから翻訳される。プレｍＲＮＡは、合成された後、２つのアクセプター部位での選択的スプライシングに起因して２つの異なる様式でスプライシングされ得る（図１）。通常、特にアデノウイルスの存在下では、第２のスプライスアクセプター部位が優先され、いわゆる「主要スプライス」となる。この様式では、ＶＰ１タンパク質の合成が始まる最初のＡＵＧコドンが取り除かれ、これにより、ＶＰ１タンパク質合成の全体的なレベルの減少がもたらされる。主要スプライスに残存する最初のＡＵＧコドンは、ＶＰ３タンパク質の開始コドンである。しかしながら、同じオープンリーディングフレーム内のそのコドンの上流に、最適なＫｏｚａｋコンテキストに囲まれている（トレオニンをコードする）ＡＣＧ配列が存在する。このことが、追加のＮ末端残基を有するＶＰ３タンパク質からなるＶＰ２タンパク質の低レベルの合成をもたらす。
【0019】
より大きなイントロンがスプライシングにより切り出されることが優先されるため、及び主要スプライスにおいてＡＣＧコドンが非常に弱い翻訳開始シグナルであるため、ＡＡＶ構造タンパク質がｉｎ ｖｉｖｏで合成される比率は、約１：１：１０となり、これは成熟ウイルス粒子における比率と同じである。
【0020】
カプシドタンパク質のプレｍＲＮＡにおいて、ｐ４０プロモーターにより転写されるイントロンに存在する、ＶＰ１のＡＵＧを囲む短い配列は、ＰＫＲを活性化する。活性なＰＫＲは、次にｅＩＦ２αをリン酸化し、ここで、リン酸化されたｅＩＦ２αは、次にカプシドタンパク質の発現を抑制し、この系全体は負の調節フィードバックループを構成する。ＶＡ ＲＮＡは、ＰＫＲを抑制し、このことは、ＡＡＶを多量に発現させようとする場合に、高レベルのＶＡ ＲＮＡが必要となることを説明する。
【0021】
非特許文献１は、最初のＡＵＧを囲む配列を除去することによりＶＡ ＲＮＡの必要性をなくすことができることを示した。しかしながら、これはＶＰ１タンパク質の発現の喪失ももたらす。非特許文献１は、３つ全てのカプシドタンパク質を正しい比率で発現させることに対する解決策を提案していない。また彼らは、ＶＡ ＲＮＡなしでのＡＡＶ産生のための安定細胞株を作製するためにこの知見を利用することも提案していない。
【0022】
ＶＰ１の発現を消失させずに高レベルのＶＡ ＲＮＡの必要性をなくすために、有利には、本発明は、カプシドのプレｍＲＮＡのイントロンをコードする配列を部分的に置き換えることにより、特に該イントロンのスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を異なる起源のイントロンと置き換えることにより、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の機能的発現を維持すると同時に、ＶＰ１のＡＵＧを囲むＰＫＲ活性化配列を不活性化することができることを見出した。
【0023】
好ましい実施の形態において、上記ＰＫＲ活性化配列は、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０を異なるプロモーターと置き換え、カプシドコード配列の外側のスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を含むｐ４０イントロンの一部を異なる起源のイントロンと置き換えることにより不活性化されている。好ましくは、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０は、恒常的プロモーター又は誘導性プロモーターと置き換えられ、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０のイントロンは、部分的に置き換えられ、すなわち、カプシドコード配列の外側が、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１の代わりとなるＳＶ４０イントロンと置き換えられる（図１）。しかしながら、ＳＶ４０イントロンの他に、適切なスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位（最小コンセンサス配列であるＧＴ／ＡＧ）を供給する任意のイントロンが置換用イントロンとして機能し得る。それぞれのイントロン、例えば、合成ＣＡＧプロモーターイントロン又は（ヒト）β－グロビンイントロンは、当該技術分野において既知である。
【0024】
好ましい実施の形態において、それぞれ改変されたＡＡＶカプシド配列が宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれている。
【0025】
好ましい実施の形態において、本発明の宿主細胞は、恒常的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下のＡＡＶレプリカーゼ（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする核酸を更に含む。
【0026】
更に好ましい実施の形態において、本発明の宿主細胞は、アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質をコードする核酸を更に含む。
【0027】
この文脈において、上記Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質は、好ましくは、恒常的に発現している。さらに、本発明に好適な宿主細胞は、特に限定されず、当該技術分野において既知である。しかしながら、好ましい実施の形態において、上記宿主細胞は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂの恒常的発現を示す。好ましい実施の形態において、上記宿主細胞は、ＣＡＰ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰｅｒ．Ｃ６細胞であり、すなわち、上記細胞株に由来し、これらは全て、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂの恒常的発現を特徴とする。
【0028】
好ましい実施の形態において、本発明の宿主細胞は、恒常的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下のアデノウイルスＥ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６タンパク質をコードする核酸を更に含む。
【0029】
さらに、本発明の宿主細胞は、好ましくは、１種以上の目的遺伝子（ＧＯＩ）を含む導入ベクターをコードする核酸を更に含み、該１種以上の目的遺伝子は、好ましくは、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれている。
【0030】
本発明の文脈において使用されるＧＯＩは特に限定されず、例えば、眼疾患、失明疾患、筋疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ＧＭ２ガングリオシドーシス及び脊髄小脳失調型、ＡＬＳ、ハンチントン病、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（Ｘ－ＳＣＩＤ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、中枢神経系疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、肝疾患、肝臓酵素オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、レーバー先天黒内障、血友病、β－サラセミア、癌疾患、頭頸部癌、転移性黒色腫、心疾患、肺疾患又は嚢胞性線維症、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）及び重症リポタンパク質リパーゼ欠損障害（ＬＰＬＤ）、感染症、重症複合免疫不全症候群、ＨＩＶ感染症、ニーマン・ピック病Ｃ型及びオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症をはじめとする希少疾患の治療のための、ＡＡＶベクターの受容者へのその移行が目的である任意の遺伝子が含まれる。
【0031】
本発明の文脈において使用される誘導性プロモーターは、特に限定されず、当該技術分野において既知である。しかしながら、好ましい実施の形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質の発現を制御する誘導性プロモーター及び／又はＡＡＶレプリカーゼタンパク質の発現を制御する誘導性プロモーター及び／又はアデノウイルスＥ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６タンパク質の発現を制御する誘導性プロモーターは、第三世代のＴＲＥ３Ｇプロモーター等のｔｅｔ誘導性プロモーターである。本発明の文脈において使用され得る他の誘導性プロモーターとしては、ｃｕｍａｔｅ誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、ＦＫＣｓＡ誘導性プロモーター、ＡＢＡ誘導性プロモーター、リボスイッチ制御プロモーター、熱ショックプロモーター、又は光切り替え可能なシステムが挙げられる。この文脈において、上記のタンパク質のうちの２種以上又は全てが、同じ種類の独立したプロモーターの制御下で発現され得る。
【0032】
この文脈において、代替的な実施の形態において、当該技術分野において既知のように、恒常的発現のための非誘導性プロモーターが使用されてもよい。それぞれのプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＵｂＣ、ＣＡＧ、ＢＯＳ、及びＰＧＫプロモーターが挙げられる。
【0033】
特定の実施の形態において、本発明の宿主細胞では、
ＰＫＲ活性化配列が、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０を異なるプロモーターと置き換え、カプシドコード配列の外側のスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を含むｐ４０イントロンの一部を異なる起源のイントロンと置き換えることにより不活性化されており、
天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０が、恒常的プロモーター又は誘導性プロモーター、好ましくは誘導性プロモーターと置き換えられており、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０のイントロンが、部分的に置き換えられ、すなわち、カプシドコード配列の外側が、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１の代わりとなるイントロン、好ましくはＳＶ４０イントロンと置き換えられており、
誘導性プロモーターからＡＡＶカプシドタンパク質のコード配列の開始コドンまでのそれぞれのヌクレオチド配列が、
プロモーター－Ｎ１－イントロン－Ｎ２－ＡＴＧ
（式中、
プロモーターは、恒常的プロモーター又は誘導性プロモーター、好ましくは誘導性プロモーターであり、
Ｎ１は、１ヌクレオチド～４０００ヌクレオチドの配列であり、
イントロンは、最小コンセンサス配列であるＧＴ／ＡＧを有する適切なスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を供給するイントロンからなる群から選択されるイントロンであり、
Ｎ２は、１ヌクレオチド～４０００ヌクレオチドの配列であり、
ＡＴＧは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列の開始コドンである）の構造を有する。
ＰＫＲ活性化配列が、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０を異なるプロモーターと置き換え、カプシドコード配列の外側のスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を含むｐ４０イントロンの一部を異なる起源のイントロンと置き換えることにより不活性化されており、
天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０が、恒常的プロモーター又は誘導性プロモーター、好ましくは誘導性プロモーターと置き換えられており、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０のイントロンが、部分的に置き換えられ、すなわち、カプシドコード配列の外側が、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１の代わりとなるイントロン、好ましくはＳＶ４０イントロンと置き換えられており、
誘導性プロモーターからＡＡＶカプシドタンパク質のコード配列の開始コドンまでのそれぞれのヌクレオチド配列が、
プロモーター－Ｎ１－イントロン－Ｎ２－ＡＴＧ
（式中、
プロモーターは、恒常的プロモーター又は誘導性プロモーター、好ましくは誘導性プロモーターであり、
Ｎ１は、１ヌクレオチド～４０００ヌクレオチドの配列であり、
イントロンは、最小コンセンサス配列であるＧＴ／ＡＧを有する適切なスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を供給するイントロンからなる群から選択されるイントロンであり、
Ｎ２は、１ヌクレオチド～４０００ヌクレオチドの配列であり、
ＡＴＧは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列の開始コドンである）の構造を有する。
【0034】
好ましくは、上記構造において、プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＵｂＣ、ＣＡＧ、ＢＯＳ、及びＰＧＫプロモーターからなる群から選択される恒常的プロモーターであるか、又は第三世代のＴＲＥ３Ｇプロモーター等のｔｅｔ誘導性プロモーター、ｃｕｍａｔｅ誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、ＦＫＣｓＡ誘導性プロモーター、ＡＢＡ誘導性プロモーター、リボスイッチ制御プロモーター、及び熱ショックプロモーター駆動型システム、光切り替え可能なシステムからなる群から選択される誘導性プロモーターであり、ここで、誘導性プロモーター、特にｔｅｔ誘導性プロモーターが特に好ましい。さらに、上記構造において、イントロンは、好ましくは、ＳＶ４０イントロン、合成ＣＡＧプロモーターイントロン、及び（ヒト）β－グロビンイントロンからなる群から選択されるイントロンである。さらに、Ｎ１及びＮ２は、互いに独立して、好ましくは、１ヌクレオチド～３０００ヌクレオチド、より好ましくは、１ヌクレオチド～２０００ヌクレオチド、より好ましくは、１ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド、より好ましくは、１ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、より好ましくは、１ヌクレオチド～３００ヌクレオチドの配列である。更なる実施の形態において、Ｎ１及びＮ２は、互いに独立して、好ましくは、５０ヌクレオチド～２５０ヌクレオチド又は１００ヌクレオチド～２００ヌクレオチドの配列である。
【0035】
より特定の実施形態において、本発明の宿主細胞では、
ＰＫＲ活性化配列が、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０を異なるプロモーターと置き換え、カプシドコード配列の外側のスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を含むｐ４０イントロンの一部を異なる起源のイントロンと置き換えることにより不活性化されており、
天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０が、誘導性プロモーターと置き換えられており、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０のイントロンが、部分的に置き換えられ、すなわち、カプシドコード配列の外側が、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１の代わりとなるＳＶ４０イントロンと置き換えられており、
誘導性プロモーターからＡＡＶカプシドタンパク質のコード配列の開始コドンまでのそれぞれのヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号４若しくは配列番号５に記載のヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉ）配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ただし、上記の必要条件が該ヌクレオチド配列に適用され、
配列番号４又は配列番号５の最後の３ヌクレオチドであるＡＴＧが、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列の開始コドンである。
ＰＫＲ活性化配列が、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０を異なるプロモーターと置き換え、カプシドコード配列の外側のスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を含むｐ４０イントロンの一部を異なる起源のイントロンと置き換えることにより不活性化されており、
天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０が、誘導性プロモーターと置き換えられており、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０のイントロンが、部分的に置き換えられ、すなわち、カプシドコード配列の外側が、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１の代わりとなるＳＶ４０イントロンと置き換えられており、
誘導性プロモーターからＡＡＶカプシドタンパク質のコード配列の開始コドンまでのそれぞれのヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号４若しくは配列番号５に記載のヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉ）配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ただし、上記の必要条件が該ヌクレオチド配列に適用され、
配列番号４又は配列番号５の最後の３ヌクレオチドであるＡＴＧが、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列の開始コドンである。
【0036】
上記のように、上述した特定のヌクレオチド配列に対して配列同一性を有する核酸は、特定の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。好ましくは、上記ヌクレオチド配列は、上記に記載される核酸に対して少なくとも７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．２％、９８．４％、９８．６％、９８．８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、又は９９．９％の配列同一性を有する。特定の実施の形態において、かかる核酸は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、又は３０個のヌクレオチド欠失、挿入、及び／又は置換（交換）を有する。
【0037】
上記に記載される核酸に対して既定の配列同一性を有するか、又は上記に記載される核酸に対して特定のヌクレオチド欠失、挿入、及び／又は置換を有するそれぞれの核酸には、どの種類のフレームシフト変異を有するどの核酸も含めないものとする。
【0038】
さらに、上述した特定のヌクレオチド配列に対して或る特定の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の文脈における、上記で使用される用語「機能的」は、それぞれのタンパク質が、特定のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質と比較して同じか、又は少なくとも十分な活性若しくは機能を有することを示す。
【0039】
本発明の宿主細胞に含まれる核酸は、誘導性プロモーター、ポリ（Ａ）領域、選択マーカー、ＩＲＥＳ配列、及び増強エレメントからなる群から選択される１種以上のエレメントを更に含み得る。好適な誘導性プロモーターは、特に限定されず、当該技術分野において既知であり、例えば、第三世代のＴＲＥ３Ｇプロモーター等のＴｅｔ誘導性プロモーターである。好適なポリ（Ａ）領域は、特に限定されず、当該技術分野において既知であり、例えば、ＳＶ４０ポリ（Ａ）領域である。好適な選択マーカーは、特に限定されず、当該技術分野において既知であり、例えば、ブラストサイジン又はアンピシリン耐性カセット等の抗生物質耐性カセットである。
【0040】
好ましくは、本発明の宿主細胞において、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸、及び／又はＡＡＶレプリカーゼタンパク質をコードする核酸、及び／又はアデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質をコードする核酸、及び／又はアデノウイルスＥ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６タンパク質をコードする核酸、及び／又はＧＯＩを含む導入ベクターをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれている。
【0041】
好ましくは、本発明の宿主細胞は、ＶＡ ＲＮＡを発現しないか、又は低レベルのＶＡ ＲＮＡしか発現せず、例えば、ＶＡ ＲＮＡ発現レベルは、一過性の形質移入により達成されるＶＡ ＲＮＡの発現と比較して少なくとも１０分の１、好ましくは、少なくとも１００分の１、より好ましくは、少なくとも１０００分の１に低減される。
【0042】
本発明の宿主細胞を作製する方法、すなわち、本発明の核酸を好適な宿主細胞へ導入する方法は、特に限定されず、当該技術分野において既知である。
【0043】
第二の態様において、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、本発明による宿主細胞において該ＡＡＶを発現させる工程を含む、方法に関する。
【0044】
第三の態様において、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生における本発明による宿主細胞の使用に関する。
【0045】
ＡＡＶを産生させるためのそれぞれの手段は、特に限定されず、当該技術分野において既知である。
【0046】
具体的には、好ましい実施の形態において、本発明の方法及び使用は、本発明の宿主細胞に（ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質を発現させる工程であって、本発明により、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１の開始コドンを囲むプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）活性化配列が不活性化されていると同時に、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の機能的発現が維持されている、工程を含む。好ましくは、ＶＰ１のＡＵＧを囲むＰＫＲ活性化配列は、カプシドのプレｍＲＮＡのイントロンを部分的に置き換えることにより、特に該イントロンのスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を異なる起源のイントロンと置き換えることにより不活性化される。好ましい実施の形態において、上記ＰＫＲ活性化配列は、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０を異なるプロモーターと置き換え、カプシドコード配列の外側のスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１を含むｐ４０イントロンの一部を異なる起源のイントロンと置き換えることにより不活性化される。好ましくは、天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０は、誘導性プロモーターと置き換えられ、及び／又は天然のＡＡＶカプシドタンパク質プロモーターであるｐ４０のイントロンは、部分的に置き換えられ、すなわち、カプシドコード配列の外側が、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位１の代わりとなるＳＶ４０イントロンと置き換えられる（図１）。しかしながら、ＳＶ４０イントロンの他に、適切なスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位（最小コンセンサス配列であるＧＴ／ＡＧ）を供給する任意のイントロンが置換用イントロンとして機能し得る。それぞれのイントロンは、当該技術分野において既知である。
【0047】
好ましくは、本発明の方法及び用途において使用される宿主細胞は、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれた、ＡＡＶ ＩＴＲに挟まれた１種以上のＧＯＩを含む導入ベクターを更に有する。好ましくは、上記宿主細胞は、本発明の方法及び使用の過程において、ＶＡ ＲＮＡを発現しないか、又は上記のように低レベルのＶＡ ＲＮＡしか発現しない。
【0048】
具体的には、好ましい実施の形態において、本発明の方法及び使用は、血清含有培地又は無血清培地を利用して、宿主細胞をローラーボトル、セルスタック、若しくは固定床式バイオリアクターのいずれかで接着培養するか、又は宿主細胞を撹拌槽型バイオリアクター、ＷＡＶＥ若しくはバッグ培養システムで懸濁培養して、上記のようなＡＡＶ粒子を産生させることを含む。産生のスケールは、１回の産生の実行あたり、ミリリットル範囲の少量から中規模の量を超えて２０００Ｌ又は２００００Ｌの量を用いる大規模な量まで変わり得る。プロセスの形式は、追加の供給物質を添加しないことを意味する回分培養、又は供給物質のボーラス添加若しくは連続添加を伴う流加培養であり得る。
【0049】
最大力価を達成するために、生存細胞密度、温度、撹拌速度、速度、ｐＨ、及び浸透圧濃度のようなプロセスパラメーターは、産生プロセスの間に変更され得る。加えて、或る特定のアミノ酸、糖、有機酸、補助因子、ビタミン、ミネラル、又は他の要素の欠乏を回避するために、不足している成分を細胞培養に補充することは、産生プロセスの一部であり得る。
【0050】
本発明の宿主細胞においてそれぞれのタンパク質を発現させるための手段は、特に限定されず、当該技術分野において既知である。手段としては、例えば、好適な誘導因子の添加による誘導性プロモーターの誘導が挙げられる。
【0051】
本発明の第一の態様について定義された全ての定義及び限定は、本発明の第二及び第三の態様にも同様に適用される。
【0052】
本明細書において使用する場合、用語「含む」（"comprising"/"comprises"）は、用語「から本質的になる」（"consisting essentially of"/"consists essentially of"）及び「からなる」（"consisting of"/"consists of"）を明確に含み、すなわち、上記用語の全ては互いに互換的である。
【0053】
本発明において、ＡＡＶカプシド配列の改変により、非常に低いＶＡ ＲＮＡ発現レベルを有するか、又はＶＡ ＲＮＡが発現していない安定産生細胞株が可能となる。ＡＡＶ安定産生細胞株は、レプリカーゼ、ヘルパー、及びカプシド機能を十分に発現しなければならない。タンパク質機能は、誘導性プロモーターの制御下で誘導性にすることができる。
【0054】
特に本発明は、有利には、例えば、ｒｅｐ及びｃａｐを分離し、異なるイントロンを導入することにより、ＶＰタンパク質の正確な発現パターンを同時に維持するように、ＰＫＲ活性化配列を含む２００ヌクレオチド領域を改変する方法を同定した。したがって、改変された配列を使用して、低レベルのＶＡ ＲＮＡを発現する安定細胞株が高力価のｒＡＡＶを産生することを可能にすることができる。
【0055】
高レベルのＶＡ ＲＮＡの必要性を回避するために、ＶＰタンパク質の正しい比率を維持し、同時にＰＫＲを活性化しないような様式で、内在性のｐ４０プロモーターが異なるプロモーターと置き換えられ、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）を活性化する配列を含むイントロンの部分が、例えば、ＳＶ４０、β－グロビン、キメライントロン等の他のイントロンと置き換えられるため、高レベルのＡＡＶベクター産生のためにより少ないＶＡ ＲＮＡが必要とされるか、又はＶＡ ＲＮＡが必要とされない。
【0056】
このことは、有利には、再現可能かつ均一な製品品質、優れた拡張性、コスト効率の良い製造を可能にし、ヘルパーウイルスの必要性をなくし、より大規模なバッチの製造を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図1】ｐ４０プロモーター領域をｐ４０イントロンと共に示すカプシド遺伝子座の概略図である（ＳＤ：スプライスドナー部位、ＳＡ１：スプライスアクセプター部位１、ＳＡ２：スプライスアクセプター部位２）。上の図は野生型の構成を示す。下は置換された配列を示す改変型である。この場合、ＳＤ及びＳＡ１はＳＶ４０イントロンにより提供され、プロモーターは、ＣＭＶのような恒常的プロモーター又はＴＲＥ３Ｇのような誘導性プロモーターであり得る。
【図2】プラスミドにコードされるＶＡ ＲＮＡが一過性の形質移入により導入された一過性の手法と比較した、ＶＡ ＲＮＡを含む安定的に組み込まれた核酸を保有するＣＡＰプレパッケージング安定細胞株Ｚ３０８１におけるＶＡ ＲＮＡレベルを示すグラフである。安定的に組み込まれたＶＡ ＲＮＡを有する細胞は、一過性の手法と比較した場合に最大３ｌｏｇ減少した量のＶＡ ＲＮＡを示す。
【図3】ｐ４０プロモーターを有するカプシド構築物又はＳＶ４０イントロンを有する改変されたプロモーター（ＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン）を有するカプシド構築物と空ベクター又は追加のＶＡ ＲＮＡとの組合せでの形質移入時のＣＡＰプレパッケージング安定ＳＣＣ（単一細胞クローン）におけるＡＡＶ８カプシドタンパク質の発現を示す写真である。形質移入の５時間後、ｒｅｐ、Ｅ２Ａ、及びＥ４ｏｒｆ６タンパク質の発現を誘導するために、細胞を１ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンで処理した。形質移入の３日後に、抗ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３抗体（Progen）を使用して、一過性に形質移入されたプレパッケージング細胞の細胞溶解物におけるタンパク質レベルを検出した。
【図4】ｐ４０プロモーターを有するＡＡＶ８カプシド構築物又はＳＶ４０イントロンを有する改変されたＴＲＥ３Ｇプロモーターを有するＡＡＶ８カプシド構築物と空ベクター（ｅＶ）又は追加のＶＡ ＲＮＡとの組合せでの形質移入時のＣＡＰプレパッケージング安定ＳＣＣにおけるＰＫＲの活性化及びｅＩＦ２αのリン酸化を示す写真である。形質移入の５時間後、安定的に組み込まれたレプリカーゼ、Ｅ２Ａ、及びＥ４ＯＲＦ６タンパク質の発現を誘導するために、細胞を１ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンで処理した。形質移入の３日後に、抗ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３抗体（Progen）、抗リン酸化ＰＫＲ抗体（Abcam）、抗ｅＩＦ２α（Cell Signaling）、及びローディングコントロールとして抗ヒストンＨ３抗体（Abcam）を使用して、一過性に形質移入されたＣＡＰプレパッケージング細胞の細胞溶解物におけるタンパク質レベルを検出した。対照として、空ベクターで形質移入した細胞の細胞溶解物が含まれた。
【図5】アセンブルされたカプシド（ＡＡＶ８）のＥＬＩＳＡを示すグラフである。ＨＥＫ２９３ベースのプレパッケージング単一細胞クローンに、改変されたＡＡＶ８カプシド構築物（ＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン）又はＡＡＶ８ ｐ４０イントロン（ＡＡＶ８又はＡＡＶ２）カプシド構築物（ＴＲＥ３Ｇ／ｐ４０イントロン）、及びＩＴＲに挟まれたＡＡＶ ＧＯＩ構築物（ＧＦＰ）を形質移入した。ｐ４０イントロン構築物については、ＶＡ ＲＮＡ構築物と組み合わせた追加の形質移入を実行した。形質移入の５時間後、細胞を１ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンにより誘導した。形質移入の３日後、細胞懸濁液試料を採取し、ProgenのＡＡＶ８カプシドＥＬＩＳＡを製造者の使用説明書に従って使用してカプシド発現について分析した。このＥＬＩＳＡは、完全にアセンブルされたウイルス粒子のみを検出した。ＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン構築物について追加のＶＡ－ＲＮＡの非存在下で１０１２粒子／ｍＬ弱の高レベルのアセンブルされたカプシドが検出されたが、ＴＲＥ３Ｇ／ｐ４０イントロン構築物では、追加のＶＡ－ＲＮＡの同時形質移入時にのみ検出された。
【図6】アセンブルされたカプシド（ＡＡＶ８）のＥＬＩＳＡを示すグラフである。ＣＡＰベースのプレパッケージング単一細胞クローンに、改変されたＡＡＶ８カプシド構築物（ＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン）又はＡＡＶ８ ｐ４０イントロン（ＡＡＶ８）カプシド構築物（ＴＲＥ３Ｇ／ｐ４０イントロン）、及びＩＴＲに挟まれたＡＡＶ ＧＯＩ構築物（ＧＦＰ）を形質移入した。ｐ４０イントロン構築物については、ＶＡ ＲＮＡ構築物と組み合わせた追加の形質移入を実行した。形質移入の５時間後、細胞を１ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンにより誘導した。形質移入の３日後、細胞懸濁液試料を採取し、ProgenのＡＡＶ８カプシドＥＬＩＳＡを製造者の使用説明書に従って使用してカプシド発現について分析した。このＥＬＩＳＡは、完全にアセンブルされたウイルス粒子のみを検出した。ＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン構築物について追加のＶＡ－ＲＮＡの非存在下で１０１２粒子／ｍＬ弱の高レベルのアセンブルされたカプシドが検出されたが、ＴＲＥ３Ｇ／ｐ４０イントロン構築物では、追加のＶＡ－ＲＮＡの同時形質移入時にのみ検出された。
【図7】改変されたＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン及びＴＲＥ３Ｇ／ｐ４０イントロン（ＡＡＶ２及びＡＡＶ８）のカプシド構築物を使用した、ＨＥＫ２９３ベースのプレパッケージングＳＣＣにおけるｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生のｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ＨＥＫ２９３ベースのプレパッケージングＳＣＣに、改変されたカプシド構築物（ＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン）又はｐ４０イントロン（ＴＲＥ３Ｇ／ＡＡＶ８又はＡＡＶ２由来のｐ４０イントロン）のカプシド構築物、及びＡＡＶ２ ＩＴＲに挟まれたＧＯＩ構築物（ＧＦＰ）を形質移入した。ｐ４０イントロン（ＴＲＥ３Ｇ／ｐ４０イントロン）のカプシド構築物については、ＶＡ－ＲＮＡの産生能に対する影響を分析するために、ＶＡ－ＲＮＡ有り無し両方の２つの形質移入を実行した。形質移入の５時間後、安定的に組み込まれたレプリカーゼ及びヘルパー機能の発現を１ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンにより誘導した。形質移入の３日後、細胞懸濁液試料を採取し、ＳＶ４０ポリＡに対して指向されたプライマー／プローブを使用したｑＰＣＲによりパッケージングされたウイルスゲノムを分析した。
【図8】改変されたＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン及びＴＲＥ３Ｇ／ｐ４０イントロン（ＡＡＶ８）のカプシド構築物を使用した、ＣＡＰベースのプレパッケージングＳＣＣにおけるｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生のｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ＣＡＰベースのプレパッケージングＳＣＣに、改変されたカプシド構築物（ＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン）又はｐ４０イントロン（ＴＲＥ３Ｇ／ｐ４０イントロン）のカプシド構築物、及びＡＡＶ２ ＩＴＲに挟まれたＧＯＩ構築物（ＧＦＰ）を形質移入した。ｐ４０イントロン（ＴＲＥ３Ｇ／ｐ４０イントロン）のカプシド構築物については、ＶＡ－ＲＮＡの産生能に対する影響を分析するために、ＶＡ－ＲＮＡ有り無し両方の２つの形質移入を実行した。形質移入の５時間後、安定的に組み込まれたレプリカーゼ及びヘルパー機能の発現を１ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンにより誘導した。形質移入の３日後、細胞懸濁液試料を採取し、ＧＦＰに対して指向されたプライマー／プローブを使用したｑＰＣＲによりパッケージングされたウイルスゲノムを分析した。
【図9】改変されたＣＭＶ／ＳＶ４０イントロン構築物を使用したＣＡＰプレパッケージング安定ＳＣＣにおけるＡＡＶ８カプシドタンパク質の発現を示す写真である。プレパッケージングＳＣＣ＃１に、ＣＭＶ／ＳＶ４０イントロンの改変カプシド構築物とＧＦＰをＧｏＩとして含む導入構築物との組合せを形質移入し、形質移入の５時間後、ドキシサイクリンにより誘導した。形質移入の４日後、一過性に形質移入されたＣＡＰプレパッケージング細胞の細胞溶解物（Ｐ＝ペレット）及び上澄み（ＳＮ）におけるタンパク質レベルを、抗ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３抗体（Progen）を使用して検出した。
【図10】アセンブルされたカプシド（ＡＡＶ８）のＥＬＩＳＡを示すグラフである。３つの異なるプレパッケージングＣＡＰ単一細胞クローン（ＳＣＣ＃１、ＳＣＣ＃２、ＳＣＣ＃３）に、改変されたＡＡＶ８カプシド構築物（ＣＭＶ／ＳＶ４０イントロン）及びＩＴＲに挟まれたＡＡＶ ＧＯＩ構築物（ＧＦＰ）を形質移入した。形質移入の５時間後、細胞を１ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンにより誘導した。形質移入の３日後、細胞懸濁液試料を採取し、ProgenのＡＡＶ８カプシドＥＬＩＳＡを製造者の使用説明書に従って使用してカプシド発現について分析した。このＥＬＩＳＡは、完全にアセンブルされたウイルス粒子のみを検出した。１０１１粒子／ｍＬを越える高レベルのアセンブルされたカプシドが検出された。
【図11】改変されたＣＭＶ／ＳＶ４０イントロンのカプシド構築物を使用したプレパッケージングＳＣＣ（ＳＣＣ＃１、ＳＣＣ＃２、ＳＣＣ＃３）におけるｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生のｑＰＣＲ分析を示すグラフである。３つの異なるプレパッケージングＳＣＣに、改変されたカプシド構築物（ＣＭＶ／ＳＶ４０イントロン）及びＡＡＶ２ ＩＴＲに挟まれたＧＯＩ構築物（ＧＦＰ）を形質移入した。形質移入の５時間後、安定的に組み込まれたレプリカーゼ及びヘルパー機能の発現を１ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンにより誘導した。形質移入の３日後、細胞懸濁液試料を採取し、ＳＶ４０ポリＡに対して指向されたプライマー／プローブを使用したｑＰＣＲによりパッケージングされたウイルスゲノムを分析した。
【図12】プレパッケージングＳＣＣ＃１に由来する材料を使用した形質導入アッセイを示すグラフである。要約すると、形質移入されたプレパッケージングＳＣＣ＃１の細胞懸濁液を凍結解凍サイクルにより溶解させ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入に使用した。形質導入の４８時間後にＧＦＰ陽性のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の測定により形質導入をモニタリングした。
【図13】安定的に組み込まれた誘導性レプリカーゼ、ヘルパー機能、並びに改変された誘導性プロモーター及びＳＶ４０イントロンを含むカプシド構築物を含む安定パッケージングプールＺ３１８９からの細胞溶解物における、ドキシサイクリン誘導時の正しい化学量論比でのカプシド発現（ＡＡＶ８）を示すウェスタンブロットを示す写真である。パッケージングプール細胞における非常に低レベルのＶＡ ＲＮＡにもかかわらず、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３についておよそ１：１：１０の正しい化学量論比でカプシドタンパク質が生成される。
【図14】選択されたｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生ＣＡＰ単一細胞クローンのウイルスゲノム産生を示すグラフである。安定的に組み込まれたレプリカーゼ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、ＶＡ ＲＮＡ、改変されたカプシド構築物（誘導性プロモーター／ＳＶ４０イントロン）、及びＩＴＲに挟まれたＧＯＩを含むｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生ＣＡＰ ＳＣＣにおけるＡＡＶ産生をドキシサイクリンの添加により誘導した。誘導の７日後、細胞懸濁液試料を採取し、ＳＶ４０ポリＡに対して指向されたプライマー／プローブを使用したｑＰＣＲによりパッケージングされたウイルスゲノムを分析した。
【図15】選択されたｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生ＣＡＰ単一細胞クローンのＡＡＶ８－ＥＬＩＳＡ分析を示すグラフである。安定的に組み込まれたレプリカーゼ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、ＶＡ ＲＮＡ、改変されたカプシド構築物、及びＩＴＲに挟まれたＧＯＩを含むｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生ＣＡＰ ＳＣＣにおけるＡＡＶ産生をドキシサイクリンの添加により誘導した。誘導の７日後、細胞懸濁液試料を採取し、ＡＡＶ８－ＥＬＩＳＡ（Progen）を製造者の使用説明書に従って使用することによりアセンブルされたカプシドについて分析した。
【発明を実施するための形態】
【0058】
本発明は、以下のアミノ酸及びヌクレオチド配列に関する：
配列番号１
ＳＶ４０ポリＡフォワードプライマー
AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA
配列番号２
ＳＶ４０ポリＡリバースプライマー
CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT
配列番号３
ＳＶ４０ポリＡプローブ
AGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC
配列番号４
ＴＲＥ３Ｇ－ＳＶ４０イントロン－カプシドのＡＴＧ
gagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtataagctttaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttataccaactttccgtaccacttcctaccctcgtaaagactctagaggatccggtactcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttacttatg
プロモーター
イントロン
開始コドン
配列番号５
ＣＭＶ－ＳＶ４０イントロン－カプシドのＡＴＧ
aattcgagcttgcatgcctgcaggtcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccggactctagaggatccggtactcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttacttctgctctaaaagctgcggaattgtacccgcggccgcttaattaaatcgataccggtttcgaaacgcgtgataaatgccaccatg
プロモーター
イントロン
開始コドン
配列番号６
ＴＲＥ３Ｇ－ｐ４０イントロン（ＡＡＶ２）－カプシドのＡＴＧ
gagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtataagctttaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttataccaactttccgtaccacttcctaccctcgtaaaccgttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggtatg
プロモーター
イントロン
開始コドン
配列番号７
ＴＲＥ３Ｇ－ｐ４０イントロン（ＡＡＶ８）－カプシドのＡＴＧ
gagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtataagctttaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttataccaactttccgtaccacttcctaccctcgtaaacctcgaggaactgaaaaaccagaaagttaacagtcgcggatccatcgacgtcagacgcggaaggagctccggtggactttgccgacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgcgggcatgcttcagatgctgtttccctgcaaaacgtgcgagagaatgaatcagaatttcaacatttgcttcacacacggggtcagagactgctcagagtgtttccccggcgtgtcagaatctcaaccggtcgtcagaaagaggacgtatcggaaactctgtgcgattcatcatctgctggggcgggctcccgagattgcttgctcggcctgcgatctggtcaacgtggacctggatgactgtgtttctgagcaataaatgacttaaaccaggtatg
プロモーター
イントロン
開始コドン
配列番号１
ＳＶ４０ポリＡフォワードプライマー
AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA
配列番号２
ＳＶ４０ポリＡリバースプライマー
CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT
配列番号３
ＳＶ４０ポリＡプローブ
AGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC
配列番号４
ＴＲＥ３Ｇ－ＳＶ４０イントロン－カプシドのＡＴＧ
gagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtataagctttaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttataccaactttccgtaccacttcctaccctcgtaaagactctagaggatccggtactcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttacttatg
プロモーター
イントロン
開始コドン
配列番号５
ＣＭＶ－ＳＶ４０イントロン－カプシドのＡＴＧ
aattcgagcttgcatgcctgcaggtcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccggactctagaggatccggtactcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttacttctgctctaaaagctgcggaattgtacccgcggccgcttaattaaatcgataccggtttcgaaacgcgtgataaatgccaccatg
プロモーター
イントロン
開始コドン
配列番号６
ＴＲＥ３Ｇ－ｐ４０イントロン（ＡＡＶ２）－カプシドのＡＴＧ
gagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtataagctttaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttataccaactttccgtaccacttcctaccctcgtaaaccgttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggtatg
プロモーター
イントロン
開始コドン
配列番号７
ＴＲＥ３Ｇ－ｐ４０イントロン（ＡＡＶ８）－カプシドのＡＴＧ
gagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtataagctttaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttataccaactttccgtaccacttcctaccctcgtaaacctcgaggaactgaaaaaccagaaagttaacagtcgcggatccatcgacgtcagacgcggaaggagctccggtggactttgccgacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgcgggcatgcttcagatgctgtttccctgcaaaacgtgcgagagaatgaatcagaatttcaacatttgcttcacacacggggtcagagactgctcagagtgtttccccggcgtgtcagaatctcaaccggtcgtcagaaagaggacgtatcggaaactctgtgcgattcatcatctgctggggcgggctcccgagattgcttgctcggcctgcgatctggtcaacgtggacctggatgactgtgtttctgagcaataaatgacttaaaccaggtatg
プロモーター
イントロン
開始コドン
【0059】
以下の実施例によって本発明を更に説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【実施例】
【0060】
実験手順
細胞培養：
ＣＡＰ細胞及びこれに由来するプレパッケージング細胞株、パッケージング細胞株、又は産生細胞株を、振盪インキュベーター上の振盪フラスコ（１２５ｍＬ；Corning）内の４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco）を補足した動物性成分を含まない化学合成ＰＥＭ培地（Thermo Fisher Scientific）で、１２０ｒｐｍ～１８５ｒｐｍ（５ｃｍの軌道）、５％ＣＯ２及び３７℃にて汎用的に培養した。
細胞培養：
ＣＡＰ細胞及びこれに由来するプレパッケージング細胞株、パッケージング細胞株、又は産生細胞株を、振盪インキュベーター上の振盪フラスコ（１２５ｍＬ；Corning）内の４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco）を補足した動物性成分を含まない化学合成ＰＥＭ培地（Thermo Fisher Scientific）で、１２０ｒｐｍ～１８５ｒｐｍ（５ｃｍの軌道）、５％ＣＯ２及び３７℃にて汎用的に培養した。
【0061】
汎用的培養の間、細胞を、７２時間～９６時間毎に、新鮮な培地で０．５×１０６細胞／ｍｌ～１×１０６細胞／ｍｌの生存細胞密度に希釈した。生存細胞密度及び生存率を、ＣＥＤＥＸ ＸＳセルカウンター（Innovatis, Roche Applied Science）又はＶｉＣｅｌｌ Ｂｌｕ（Beckman Coulter）を使用したトリパンブルー色素排除法により決定した。
【0062】
ヌクレオフェクション及び安定プールの作製：
安定プールを、LonzaのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを製造者の使用説明書に従って使用して作製した。
安定プールを、LonzaのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを製造者の使用説明書に従って使用して作製した。
【0063】
各ヌクレオフェクション反応のために、１×１０７個の細胞を遠心分離（５００×ｇ、５分）により採取した。細胞を１００μＬのＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ（Lonza）中に再懸濁し、５μｇの直鎖化した発現ベクターと混合した。ＤＮＡ／細胞懸濁液を、キュベットに移し、Ｘ００１プログラムを使用してヌクレオフェクションを実行した。形質移入した細胞を１２．５ｍＬの増殖培地に移し、前述のように３７℃、５％ＣＯ２、１８５ｒｐｍで培養した。
【0064】
安定プールの作製のために、形質移入の後７２時間～９６時間前述のように振盪インキュベーター内で培養し、細胞を遠心分離によりペレット化し、選択培地中に再懸濁した。
【0065】
【表1】
【0066】
一過性の形質移入、並びにカプシドタンパク質の発現並びにＰＫＲ及びＥＩＦ２ａのリン酸化を試験するためのウェスタンブロット：
一過性の形質移入：
一過性の形質移入を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地（Thermo Fisher Scientific）中でＰＥＩｍａｘ（PolySciences）を使用して実行した。形質移入の５時間後、細胞にＰＥＭ完全培地（Thermo Fisher Scientific）を供給し、安定的に組み込まれたレプリカーゼ及びヘルパー機能の発現を１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの添加により誘導した。特に明記されない場合、タンパク質発現の分析を形質移入の７２時間後に実行した。
一過性の形質移入：
一過性の形質移入を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地（Thermo Fisher Scientific）中でＰＥＩｍａｘ（PolySciences）を使用して実行した。形質移入の５時間後、細胞にＰＥＭ完全培地（Thermo Fisher Scientific）を供給し、安定的に組み込まれたレプリカーゼ及びヘルパー機能の発現を１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの添加により誘導した。特に明記されない場合、タンパク質発現の分析を形質移入の７２時間後に実行した。
【0067】
ウェスタンブロット：
形質移入の７２時間後に採取され、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補足したＲＩＰＡ緩衝液を使用して溶解された１×１０５個の形質移入した細胞の細胞溶解物を用いてウェスタンブロット分析を実行した。ウェスタンブロット分析のために、以下の抗体を利用した：マウス抗ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３抗体（Progen、ドイツ）、抗リン酸化ＰＫＲ抗体（Abcam）、抗リン酸化ｅＩＦ２α抗体（Cell Signaling）、並びに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス及び抗ウサギ抗体（Cell Signaling）。タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ ＷＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔを使用して化学発光検出器（INTAS）により検出した。
形質移入の７２時間後に採取され、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補足したＲＩＰＡ緩衝液を使用して溶解された１×１０５個の形質移入した細胞の細胞溶解物を用いてウェスタンブロット分析を実行した。ウェスタンブロット分析のために、以下の抗体を利用した：マウス抗ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３抗体（Progen、ドイツ）、抗リン酸化ＰＫＲ抗体（Abcam）、抗リン酸化ｅＩＦ２α抗体（Cell Signaling）、並びに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス及び抗ウサギ抗体（Cell Signaling）。タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ ＷＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔを使用して化学発光検出器（INTAS）により検出した。
【0068】
改変したカプシド構築物を用いたプレパッケージング細胞、パッケージング細胞、又は産生細胞からのウイルス産生：
ヘルパー機能の安定した組み込みによりもたらされる限られた量のみのＶＡ ＲＮＡの存在下での、改変したカプシド構築物を使用したウイルス産生を試験するために、ＡＡＶの生成に必要な欠けている構成要素を一過性の形質移入により細胞に導入した（表２）。ＡＡＶ産生を、ドキシサイクリンによりレプリカーゼ及びヘルパータンパク質の発現を誘導することにより開始した。
ヘルパー機能の安定した組み込みによりもたらされる限られた量のみのＶＡ ＲＮＡの存在下での、改変したカプシド構築物を使用したウイルス産生を試験するために、ＡＡＶの生成に必要な欠けている構成要素を一過性の形質移入により細胞に導入した（表２）。ＡＡＶ産生を、ドキシサイクリンによりレプリカーゼ及びヘルパータンパク質の発現を誘導することにより開始した。
【0069】
形質移入の３日後、細胞懸濁液試料を採取し、最終濃度０．５％のトリトンＸの添加により溶解した。
【0070】
【表2】
【0071】
ウイルス力価を決定するためのｑＰＣＲ：
ＳＶ４０ポリＡに対する以下のプライマー／二重標識プローブの組合せ（MWG、Eurofins；表３）を使用して、ウイルス力価を測定した。
ＳＶ４０ポリＡに対する以下のプライマー／二重標識プローブの組合せ（MWG、Eurofins；表３）を使用して、ウイルス力価を測定した。
【0072】
【表3】
【0073】
標準として、定義されたコピー数を有する直鎖状導入遺伝子プラスミドを使用した。ｑＰＣＲ反応は以下の成分を含んでいた：２×Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Agilent）、ヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ（Thermo Fisher Scientific）、プライマー／プローブ混合物及び試料／標準物質。ｑＰＣＲは、製造者の使用説明書に従ってＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐで実行した。
【0074】
アセンブルされたカプシドに対するＥＬＩＳＡ：
アセンブルされたカプシドに対して特異的なＥＬＩＳＡは、製造者の使用説明書に従って市販のＥＬＩＳＡキット（Progen）を用いて行った。
アセンブルされたカプシドに対して特異的なＥＬＩＳＡは、製造者の使用説明書に従って市販のＥＬＩＳＡキット（Progen）を用いて行った。
【0075】
ＶＡ ＲＮＡ発現アッセイ：
ＶＡ ＲＮＡ発現を試験するために、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｍｉＲＮＡキットを製造者の使用説明書に従って使用してＲＮＡを単離した。逆転写後、ＶＡ ＲＮＡに特異的なプライマー／プローブの組合せを使用してＶＡ ＲＮＡ発現の分析を実行した。分析は製造者の使用説明書に従ってＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐで実行した。
ＶＡ ＲＮＡ発現を試験するために、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｍｉＲＮＡキットを製造者の使用説明書に従って使用してＲＮＡを単離した。逆転写後、ＶＡ ＲＮＡに特異的なプライマー／プローブの組合せを使用してＶＡ ＲＮＡ発現の分析を実行した。分析は製造者の使用説明書に従ってＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐで実行した。
【0076】
形質導入アッセイ：
要約すると、細胞溶解物を４回の凍結融解サイクルにより調製した。接着性のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、ＡＡＶ粒子を添加した。形質導入の４８時間後、形質導入した細胞をＧＦＰ測定により定量化した。
要約すると、細胞溶解物を４回の凍結融解サイクルにより調製した。接着性のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、ＡＡＶ粒子を添加した。形質導入の４８時間後、形質導入した細胞をＧＦＰ測定により定量化した。
【0077】
実施例１：
ＶＡ ＲＮＡのカプシド発現に対する影響
序論：
ＣＡＰ細胞は、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂをコードする構築物を用いた安定的形質移入により不死化された、ヒト羊膜細胞由来の懸濁細胞である。プレパッケージング細胞は、親ＣＡＰ細胞をベースとしており、（ｉ）ｔｅｔ活性化因子、（ｉｉ）ｔｅｔ誘導性プロモーター制御下のレプリカーゼ（ＡＡＶ２）及びアデノウイルスヘルパー機能（Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６）、並びに（ｉｉｉ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡを安定的に発現する。しかしながら、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡとそのＰｏｌｌＩＩ ＲＮＡプロモーターのプレパッケージング安定細胞株のゲノムへの安定的組込みは、非常に低レベルのＶＡ ＲＮＡをもたらし（図２）、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド上のＶＡ ＲＮＡが細胞に導入される一過性形質移入の手法と比較した場合に、ＲＮＡレベルが約３ｌｏｇ減少する。
ＶＡ ＲＮＡのカプシド発現に対する影響
序論：
ＣＡＰ細胞は、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂをコードする構築物を用いた安定的形質移入により不死化された、ヒト羊膜細胞由来の懸濁細胞である。プレパッケージング細胞は、親ＣＡＰ細胞をベースとしており、（ｉ）ｔｅｔ活性化因子、（ｉｉ）ｔｅｔ誘導性プロモーター制御下のレプリカーゼ（ＡＡＶ２）及びアデノウイルスヘルパー機能（Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６）、並びに（ｉｉｉ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡを安定的に発現する。しかしながら、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡとそのＰｏｌｌＩＩ ＲＮＡプロモーターのプレパッケージング安定細胞株のゲノムへの安定的組込みは、非常に低レベルのＶＡ ＲＮＡをもたらし（図２）、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド上のＶＡ ＲＮＡが細胞に導入される一過性形質移入の手法と比較した場合に、ＲＮＡレベルが約３ｌｏｇ減少する。
【0078】
ＶＡ ＲＮＡは、高力価のＡＡＶ産生に重要である。ＡＡＶ産生におけるＶＡ ＲＮＡの機能は、ＰＫＲのリン酸化／活性化及びこれによるｅＩＦ２αのリン酸化の抑制であり、ｅＩＦ２αのリン酸化はウイルスレプリカーゼ及びカプシドタンパク質のタンパク質発現の減少をもたらす。ＰＫＲは、ＶＰ１のＡＵＧを囲む、カプシドタンパク質のＲＮＡリーダー配列内の配列により活性化されることが示されている。
【0079】
本明細書に記載される実施例において、ＡＡＶ８カプシド構築物は、Ｔｅｔ３Ｇプロモーターと共にＳＶ４０イントロンを含む改変されたカプシド構築物（Ｔｅｔ３Ｇ／イントロン）、又はＡＡＶ２ ｐ５ミニプロモーター及びＡＡＶ２カプシドｐ４０プロモーターとそのイントロンを含むＰ４０プロモーター構築物（ｐ５／ｐ４０／イントロン）のいずれかを含んでいた。これらを、ＶＡ ＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡのみを発現する構築物）、又は対照として機能する空ベクターのいずれかと同時形質移入した（表４）。安定的に組み込まれたｒｅｐ及びヘルパー遺伝子のドキシサイクリンの添加による誘導後、細胞溶解物を調製し、カプシド発現について分析した。
【0080】
【表4】
【0081】
結果：
プレパッケージング細胞株は、一過性の手法と比較して最大３ｌｏｇ減少したＶＡ ＲＮＡレベルを有する（図２）。興味深いことに、ＡＡＶ ｐ４０プロモーター及びそのイントロン領域を有するカプシド構築物は、追加のＶＡ ＲＮＡ構築物無しでは発現を示さなかったが、追加のＶＡ ＲＮＡ機能の同時形質移入により増加を示した。追加のＶＡ ＲＮＡの非存在下であっても、ＴＲＥ３Ｇプロモーター及びＳＶ４０イントロンを含む改変されたプロモーター構築物を使用して、プレパッケージングＳＣＣにおけるＡＡＶ８カプシド発現を検出することができた。加えて、ＳＶ４０イントロン構築物のスプライシングが起こり得ることにより、３つの異なるカプシドタンパク質間の正しい比率（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）が達成され得る（～１：１：１０）。異なるＶＰ間の正しい比率は、ＡＡＶの形質導入効率、生成されたウイルスベクターの効力、及びしたがって、治療用の遺伝子治療製品としてのその潜在的用途にとって重要である（図３）。
プレパッケージング細胞株は、一過性の手法と比較して最大３ｌｏｇ減少したＶＡ ＲＮＡレベルを有する（図２）。興味深いことに、ＡＡＶ ｐ４０プロモーター及びそのイントロン領域を有するカプシド構築物は、追加のＶＡ ＲＮＡ構築物無しでは発現を示さなかったが、追加のＶＡ ＲＮＡ機能の同時形質移入により増加を示した。追加のＶＡ ＲＮＡの非存在下であっても、ＴＲＥ３Ｇプロモーター及びＳＶ４０イントロンを含む改変されたプロモーター構築物を使用して、プレパッケージングＳＣＣにおけるＡＡＶ８カプシド発現を検出することができた。加えて、ＳＶ４０イントロン構築物のスプライシングが起こり得ることにより、３つの異なるカプシドタンパク質間の正しい比率（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）が達成され得る（～１：１：１０）。異なるＶＰ間の正しい比率は、ＡＡＶの形質導入効率、生成されたウイルスベクターの効力、及びしたがって、治療用の遺伝子治療製品としてのその潜在的用途にとって重要である（図３）。
【0082】
実施例２：
ＰＫＲ活性化及び発現レベルに対するカプシドの改変の効果
序論：
プレパッケージング細胞において、元のｐ４０プロモーターでのカプシドの発現は、ＴＲＥ３Ｇプロモーター及びＳＶ４０イントロンを有する改変されたカプシド構築物の使用と比較して非常に低い発現レベルをもたらす。しかしながら、ＶＡ ＲＮＡの追加の発現は、力価を増加させる（実施例１を参照のこと）。カプシドタンパク質のＲＮＡリーダー配列におけるＰＫＲ活性化配列の置換によりＰＫＲ活性化が減弱されるという仮説を調べるために、以下の実験を実行した。
ＰＫＲ活性化及び発現レベルに対するカプシドの改変の効果
序論：
プレパッケージング細胞において、元のｐ４０プロモーターでのカプシドの発現は、ＴＲＥ３Ｇプロモーター及びＳＶ４０イントロンを有する改変されたカプシド構築物の使用と比較して非常に低い発現レベルをもたらす。しかしながら、ＶＡ ＲＮＡの追加の発現は、力価を増加させる（実施例１を参照のこと）。カプシドタンパク質のＲＮＡリーダー配列におけるＰＫＲ活性化配列の置換によりＰＫＲ活性化が減弱されるという仮説を調べるために、以下の実験を実行した。
【0083】
ＴＲＥ３Ｇプロモーターと共にＳＶ４０イントロンを含む改変されたカプシド構築物、又はｐ５ミニプロモーター、ｐ４０プロモーター及びそのイントロンを含むＡＡＶ ｐ４０プロモーター構築物のいずれかを含むＡＡＶ８カプシド構築物を、ＶＡ ＲＮＡをコードする追加のプラスミドの存在下又は非存在下でプレパッケージング細胞に同時形質移入した（表４）。安定的に組み込まれたｒｅｐ及びヘルパー遺伝子の誘導後、細胞溶解物を調製し、カプシド発現並びにＰＫＲ及びｅＩＦ２αリン酸化について分析した。
【0084】
結果：
本明細書に記載されるＡＡＶプレパッケージング細胞株は、一過性の手法と比較して、非常に低いＶＡ ＲＮＡレベルを有し（図２）、このことが、ＰＫＲ活性化配列を含むＡＡＶ ｐ５／ｐ４０／イントロン構築物を使用した細胞におけるカプシドタンパク質力価の減少をもたらす。しかしながら、天然のＡＡＶプロモーターのＰＫＲ活性化配列と別のプロモーターとの置換を含むＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン構築物の使用は、より高い力価をもたらす。カプシド発現を減少させることが記載されている、ＰＫＲ及び下流の標的であるｅＩＦ２αのリン酸化レベルは、ｐ４０プロモーター及びそのイントロンを含むカプシド構築物の形質移入により実際に増加したが、改変された構築物を使用した場合は増加しなかった（図４）。
本明細書に記載されるＡＡＶプレパッケージング細胞株は、一過性の手法と比較して、非常に低いＶＡ ＲＮＡレベルを有し（図２）、このことが、ＰＫＲ活性化配列を含むＡＡＶ ｐ５／ｐ４０／イントロン構築物を使用した細胞におけるカプシドタンパク質力価の減少をもたらす。しかしながら、天然のＡＡＶプロモーターのＰＫＲ活性化配列と別のプロモーターとの置換を含むＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン構築物の使用は、より高い力価をもたらす。カプシド発現を減少させることが記載されている、ＰＫＲ及び下流の標的であるｅＩＦ２αのリン酸化レベルは、ｐ４０プロモーター及びそのイントロンを含むカプシド構築物の形質移入により実際に増加したが、改変された構築物を使用した場合は増加しなかった（図４）。
【0085】
したがって、ｐ４０プロモーターとそのイントロンとの組合せの、改変されたＴＲＥ３ＧプロモーターとＳＶ４０イントロンとの組合せとの置換は、正しい比率のカプシドタンパク質（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）をもたらすだけでなく、ＰＫＲ活性化の減少及びその結果生じたｅＩＦ２αリン酸化の減少に起因してタンパク質発現の増加ももたらす。
【0086】
実施例３：
改変されたカプシド構築物対ｐ４０イントロン構築物でのＡＡＶ産生の比較、及び異なる起源のプレパッケージング細胞株における追加のＶＡ－ＲＮＡの影響
序論：
ＣＡＰ細胞ベースの１種のプレパッケージングＳＣＣ及びＨＥＫ２９３細胞ベースの１種のプレパッケージングＳＣＣにおけるｒＡＡＶ８－ＧＦＰの産生を、改変されたカプシド構築物（ＳＶ４０イントロンを有するＴＲＥ３Ｇプロモーター）又はｐ４０イントロンカプシド構築物（ＡＡＶ２（配列番号６）又はＡＡＶ８（配列番号７）由来のｐ４０イントロンを有するＴＲＥ３Ｇプロモーター）と、ＡＡＶ２ ＩＴＲに挟まれたＧＯＩとしてＧＦＰを含む構築物との組合せをそれらに形質移入することにより評価した。加えて、空ベクター又はＶＡ－ＲＮＡを発現するベクターのいずれかを同時形質移入した。非常に低いＶＡ ＲＮＡレベルを有する、誘導性のｒｅｐ及びヘルパー機能を発現するプレパッケージング単一細胞クローンに形質移入を行った。形質移入の５時間後にＡＡＶ産生をドキシサイクリン誘導により開始した。
改変されたカプシド構築物対ｐ４０イントロン構築物でのＡＡＶ産生の比較、及び異なる起源のプレパッケージング細胞株における追加のＶＡ－ＲＮＡの影響
序論：
ＣＡＰ細胞ベースの１種のプレパッケージングＳＣＣ及びＨＥＫ２９３細胞ベースの１種のプレパッケージングＳＣＣにおけるｒＡＡＶ８－ＧＦＰの産生を、改変されたカプシド構築物（ＳＶ４０イントロンを有するＴＲＥ３Ｇプロモーター）又はｐ４０イントロンカプシド構築物（ＡＡＶ２（配列番号６）又はＡＡＶ８（配列番号７）由来のｐ４０イントロンを有するＴＲＥ３Ｇプロモーター）と、ＡＡＶ２ ＩＴＲに挟まれたＧＯＩとしてＧＦＰを含む構築物との組合せをそれらに形質移入することにより評価した。加えて、空ベクター又はＶＡ－ＲＮＡを発現するベクターのいずれかを同時形質移入した。非常に低いＶＡ ＲＮＡレベルを有する、誘導性のｒｅｐ及びヘルパー機能を発現するプレパッケージング単一細胞クローンに形質移入を行った。形質移入の５時間後にＡＡＶ産生をドキシサイクリン誘導により開始した。
【0087】
アセンブルされたインタクトなＡＡＶウイルス粒子（ｖｐ）の力価をＥＬＩＳＡにより分析し、ウイルスゲノム（ｖｇ）の力価をＳＶ４０ｐＡ又はＧＦＰに対して指向されたプライマー及びプローブを利用するｑＰＣＲにより分析した。
【0088】
結果：
これらの研究で利用されるＥＬＩＳＡは、アセンブルされたカプシドの立体構造エピトープを認識する。したがって、改変されたＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロンカプシド構築物と両方の細胞株ベースのプレパッケージングＳＣＣとの組合せを使用しての、上記の１Ｅ１１粒子／ｍｌの検出は、高力価の完全にアセンブルされた機能的ＡＡＶ粒子がこの構築物から産生されることを示す。比較すると、同じＴＲＥ３Ｇプロモーターの制御下のカプシドを有するｐ４０イントロン構築物を形質移入した場合に産生されたカプシドの力価は、両方の細胞株ベースのプレパッケージングクローンについて顕著により低かった（１０分の１未満）。力価は、ＶＡ－ＲＮＡの添加により、非常に低いＶＡ－ＲＮＡレベルしか有さない細胞においてＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン構築物を使用して達成されるレベルまで回復され得る（図５及び図６）。完全なウイルス粒子の形成に対するイントロン構成及びＶＡ－ＲＮＡ追加の影響を、ｑＰＣＲにより測定されるウイルスゲノム力価により分析した。イントロン構成間でのカプシド発現の差は、ｑＰＣＲで示されたように、ウイルスゲノム力価の差ももたらした。ここでも、ｐ４０イントロン構築物へのＶＡ ＲＮＡの追加は、追加のＶＡ－ＲＮＡ無しにＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン構築物により達成されるレベルまで力価を回復させた（図７及び図８）。要約すると、これらのデータは、ＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン構築物が、ＶＡ－ＲＮＡの非存在下での効率的なＡＡＶ産生をもたらし、これにより、改変されていないｐ４０イントロンではＶＡ－ＲＮＡの存在下でのみ到達することができるレベルに達成することを示す。
これらの研究で利用されるＥＬＩＳＡは、アセンブルされたカプシドの立体構造エピトープを認識する。したがって、改変されたＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロンカプシド構築物と両方の細胞株ベースのプレパッケージングＳＣＣとの組合せを使用しての、上記の１Ｅ１１粒子／ｍｌの検出は、高力価の完全にアセンブルされた機能的ＡＡＶ粒子がこの構築物から産生されることを示す。比較すると、同じＴＲＥ３Ｇプロモーターの制御下のカプシドを有するｐ４０イントロン構築物を形質移入した場合に産生されたカプシドの力価は、両方の細胞株ベースのプレパッケージングクローンについて顕著により低かった（１０分の１未満）。力価は、ＶＡ－ＲＮＡの添加により、非常に低いＶＡ－ＲＮＡレベルしか有さない細胞においてＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン構築物を使用して達成されるレベルまで回復され得る（図５及び図６）。完全なウイルス粒子の形成に対するイントロン構成及びＶＡ－ＲＮＡ追加の影響を、ｑＰＣＲにより測定されるウイルスゲノム力価により分析した。イントロン構成間でのカプシド発現の差は、ｑＰＣＲで示されたように、ウイルスゲノム力価の差ももたらした。ここでも、ｐ４０イントロン構築物へのＶＡ ＲＮＡの追加は、追加のＶＡ－ＲＮＡ無しにＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン構築物により達成されるレベルまで力価を回復させた（図７及び図８）。要約すると、これらのデータは、ＴＲＥ３Ｇ／ＳＶ４０イントロン構築物が、ＶＡ－ＲＮＡの非存在下での効率的なＡＡＶ産生をもたらし、これにより、改変されていないｐ４０イントロンではＶＡ－ＲＮＡの存在下でのみ到達することができるレベルに達成することを示す。
【0089】
実施例４：
改変されたカプシド構築物を使用したＡＡＶ産生
序論：
３つの異なるプレパッケージングＳＣＣにおけるｒＡＡＶ８－ＧＦＰの産生を、改変されたカプシド構築物（ＳＶ４０イントロンを有するＣＭＶプロモーター）及びＡＡＶ２ ＩＴＲに挟まれたＧＯＩとしてＧＦＰを有する構築物をそれらに形質移入することにより評価した。誘導性のｒｅｐ及びヘルパー機能を既に発現しているが、非常に低いレベルのＶＡ ＲＮＡであることが以前に示されたプレパッケージング単一細胞クローンに形質移入を行った。形質移入の５時間後にＡＡＶ産生をドキシサイクリン誘導により開始した。
改変されたカプシド構築物を使用したＡＡＶ産生
序論：
３つの異なるプレパッケージングＳＣＣにおけるｒＡＡＶ８－ＧＦＰの産生を、改変されたカプシド構築物（ＳＶ４０イントロンを有するＣＭＶプロモーター）及びＡＡＶ２ ＩＴＲに挟まれたＧＯＩとしてＧＦＰを有する構築物をそれらに形質移入することにより評価した。誘導性のｒｅｐ及びヘルパー機能を既に発現しているが、非常に低いレベルのＶＡ ＲＮＡであることが以前に示されたプレパッケージング単一細胞クローンに形質移入を行った。形質移入の５時間後にＡＡＶ産生をドキシサイクリン誘導により開始した。
【0090】
アセンブルされたインタクトなＡＡＶウイルス粒子の力価をＥＬＩＳＡにより分析し、ｖｇ／ｍＬの力価をＳＶ４０ｐＡに対して指向されたプライマー及びプローブを利用するｑＰＣＲにより分析した。感染力を形質導入アッセイにより決定した。
【0091】
結果：
これらの研究で利用されるＥＬＩＳＡは、アセンブルされたカプシドの立体構造エピトープを認識する。したがって、改変されたＣＭＶ／ＳＶ４０イントロンカプシド構築物とプレパッケージングＳＣＣとの組合せを使用しての、上記の１Ｅ１１粒子／ｍｌの検出は、完全にアセンブルされた機能的ＡＡＶ粒子がこれらから産生されることを示す（図１０）。これらのＡＡＶ粒子は、ｑＰＣＲにより示されように、ウイルスゲノムと共に効率的にパッケージングされる。評価された３つの異なるプレパッケージング細胞について、およそ１Ｅ１０／ｍＬのウイルスゲノム力価を検出することができた（図１１）。
これらの研究で利用されるＥＬＩＳＡは、アセンブルされたカプシドの立体構造エピトープを認識する。したがって、改変されたＣＭＶ／ＳＶ４０イントロンカプシド構築物とプレパッケージングＳＣＣとの組合せを使用しての、上記の１Ｅ１１粒子／ｍｌの検出は、完全にアセンブルされた機能的ＡＡＶ粒子がこれらから産生されることを示す（図１０）。これらのＡＡＶ粒子は、ｑＰＣＲにより示されように、ウイルスゲノムと共に効率的にパッケージングされる。評価された３つの異なるプレパッケージング細胞について、およそ１Ｅ１０／ｍＬのウイルスゲノム力価を検出することができた（図１１）。
【0092】
ＶＰ１は、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性が後期エンドソームからのＡＡＶ粒子の放出に必要とされるため、ＡＡＶ粒子の感染力に重要である一方で、ＶＰ２及びＶＰ３は、ウイルス粒子の正確なアセンブリに重要である。
【0093】
産生されたＡＡＶ粒子のウェスタンブロットでの分析は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の全３つのタンパク質の予想される比率での発現を明らかにした（図９）。産生されたＡＡＶ粒子の形質導入アッセイでの分析は、約３４％のＡＡＶにより形質導入されたレポーター細胞をもたらし、したがって、改変されたカプシド構築物を使用することにより生成されたＡＡＶ粒子の感染力を証明する（図１２）。また、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の正しい化学量論比を達成することができたカプシド粒子の産生も示す。
【0094】
結論として、異なるプレパッケージングＳＣＣにおける非常に低レベルのＶＡ－ＲＮＡにもかかわらず、完全に機能的なＡＡＶが本明細書に記載される手法により生成される。
【0095】
実施例５：
改変されたカプシドプロモーター領域を使用したパッケージング安定細胞株の作製
序論：
ＳＶ４０イントロンと組み合わされた誘導性プロモーターの制御下の改変されたカプシド構築物をプレパッケージングＳＣＣに導入した。安定プールを選択により作製した。プール作製後、細胞を１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、カプシド産生を、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの添加により誘導した。加えて、誘導されていない対照が含まれた。誘導の３日後、細胞溶解物を調製し、正しい化学量論比でのカプシド産生をウェスタンブロットにより分析した。
改変されたカプシドプロモーター領域を使用したパッケージング安定細胞株の作製
序論：
ＳＶ４０イントロンと組み合わされた誘導性プロモーターの制御下の改変されたカプシド構築物をプレパッケージングＳＣＣに導入した。安定プールを選択により作製した。プール作製後、細胞を１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、カプシド産生を、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの添加により誘導した。加えて、誘導されていない対照が含まれた。誘導の３日後、細胞溶解物を調製し、正しい化学量論比でのカプシド産生をウェスタンブロットにより分析した。
【0096】
結果：
プレパッケージング細胞株をベースとして、誘導性プロモーターの制御下の改変されたカプシド構築物を使用して安定パッケージングプールを作製した。ウェスタンブロット（図１３）により示されるように、ドキシサイクリン誘導により安定細胞株は、低レベルのＶＡ ＲＮＡにもかかわらず、カプシドタンパク質を高効率かつ正しい比率で発現した。
プレパッケージング細胞株をベースとして、誘導性プロモーターの制御下の改変されたカプシド構築物を使用して安定パッケージングプールを作製した。ウェスタンブロット（図１３）により示されるように、ドキシサイクリン誘導により安定細胞株は、低レベルのＶＡ ＲＮＡにもかかわらず、カプシドタンパク質を高効率かつ正しい比率で発現した。
【0097】
実施例６：
産生細胞株
序論：
完全安定産生細胞株を、ＳＶ４０イントロンと組み合わされた誘導性プロモーターの制御下の改変されたカプシド構築物及びＩＴＲに挟まれたＧＯＩであるＧＦＰの、レンチウイルス形質導入によるプレパッケージングＳＣＣへの導入により作製した。このポリクローナルプールは、高産生細胞を得るための単一細胞クローニングの開始点として役立った。２４ディープウェルプレートでの小規模実験で最も有望なＳＣＣを同定した後に、選択されたＳＣＣを、誘導時のｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生についてＡｍｂｒでの培養中に分析した。簡潔には、細胞を１×１０６細胞／ｍＬで播種し、播種の３日後にドキシサイクリンの添加により誘導した。試料を異なる時点で採取し、ＡＡＶ産生をＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲにより測定した。
産生細胞株
序論：
完全安定産生細胞株を、ＳＶ４０イントロンと組み合わされた誘導性プロモーターの制御下の改変されたカプシド構築物及びＩＴＲに挟まれたＧＯＩであるＧＦＰの、レンチウイルス形質導入によるプレパッケージングＳＣＣへの導入により作製した。このポリクローナルプールは、高産生細胞を得るための単一細胞クローニングの開始点として役立った。２４ディープウェルプレートでの小規模実験で最も有望なＳＣＣを同定した後に、選択されたＳＣＣを、誘導時のｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生についてＡｍｂｒでの培養中に分析した。簡潔には、細胞を１×１０６細胞／ｍＬで播種し、播種の３日後にドキシサイクリンの添加により誘導した。試料を異なる時点で採取し、ＡＡＶ産生をＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲにより測定した。
【0098】
結果：
改変されたカプシド構築物を使用して、安定産生細胞株を成功裡に作製した。最も良好なＳＣＣ産生株を、Ａｍｂｒ１５での培養中に産生能について分析した。誘導により、完全安定産生細胞株は、低レベルのＶＡ ＲＮＡしか有さないプレパッケージングクローンがベースであるにもかかわらず、カプシドのＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲで検出されたように、高力価のｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生を示した（図１４及び図１５）。改変された構築物を使用してのカプシドレベルは、ＳＣＣに応じて１０１０カプシド／ｍＬ～１０１３カプシド／ｍＬの範囲であり、ウイルスゲノム産生は、１０９台中程から１０１０台中程までの範囲であった。
改変されたカプシド構築物を使用して、安定産生細胞株を成功裡に作製した。最も良好なＳＣＣ産生株を、Ａｍｂｒ１５での培養中に産生能について分析した。誘導により、完全安定産生細胞株は、低レベルのＶＡ ＲＮＡしか有さないプレパッケージングクローンがベースであるにもかかわらず、カプシドのＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲで検出されたように、高力価のｒＡＡＶ８－ＧＦＰ産生を示した（図１４及び図１５）。改変された構築物を使用してのカプシドレベルは、ＳＣＣに応じて１０１０カプシド／ｍＬ～１０１３カプシド／ｍＬの範囲であり、ウイルスゲノム産生は、１０９台中程から１０１０台中程までの範囲であった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】