特表 2024-501254 脱細胞化された哺乳動物細胞外マトリックスモルセル、その製造方法および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-11

(54)【発明の名称】脱細胞化された哺乳動物細胞外マトリックスモルセル、その製造方法および使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/36 20060101AFI20231228BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61L 27/50 20060101ALI20231228BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20231228BHJP

【ＦＩ】

A61L27/36 130

C12N1/00 F

A61L27/50

A61L27/36 400

A61L27/36 410

A61L27/38 120

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023538045

(86)(22)【出願日】2021-12-22

(85)【翻訳文提出日】2023-08-17

(86)【国際出願番号】 US2021064834

(87)【国際公開番号】W WO2022140530

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】63/129,966

(32)【優先日】2020-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ｉＰｈｏｎｅ

(71)【出願人】

【識別番号】512241232

【氏名又は名称】ブラウン ユニバーシティ

【住所又は居所原語表記】３５０ Ｅｄｄｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｂｏｘ １９４９， Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ， ＲＩ ０２９０３ （ＵＳ）

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】アイピー，ブランシェ シー．

(72)【発明者】

【氏名】モーガン，ジェフリー アール．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C081

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90

4B065BC46

4B065BD05

4B065CA02

4B065CA44

4C081AB11

4C081AB13

4C081AB36

4C081BA12

4C081CD34

4C081DA14

(57)【要約】

組織の再生および修復における使用のための脱細胞化ヒト細胞外マトリックス（ＥＣＭ）モルセルが記載される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脱細胞化哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む、カスタマイズされた流動性組成物であって、
物理的特性、生化学的／化学的特性、機械的特性、またはコラーゲン構造の少なくとも１つにおいて、インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルを含むＥＣＭを含む、カスタマイズされた流動性組成物。

【請求項2】

前記インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、異なる物理的特性を含む、請求項１に記載のカスタマイズされた流動性組成物。

【請求項3】

前記インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、異なる生化学的／化学的特性を含む、請求項１に記載のカスタマイズされた流動性組成物。

【請求項4】

前記インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、異なる機械的特性を含む、請求項１に記載のカスタマイズされた流動性組成物。

【請求項5】

前記インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、異なるコラーゲン構造を含む、請求項１に記載のカスタマイズされた流動性組成物。

【請求項6】

カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）モルセルを生産する方法であって、以下のステップ：
培養哺乳動物細胞をマイクロウェルに播種するステップであって、前記培養哺乳動物細胞が、前記培養哺乳動物細胞およびＥＣＭから構成されるＥＣＭ微小組織を生成する、ステップ；
前記ＥＣＭ微小組織を収集するステップ；ならびに
前記ＥＣＭ微小組織を脱細胞化するステップ、を含み、
ここで、前記カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物ＥＣＭモルセルが、物理的特性、生化学的／化学的特性、機械的特性、またはコラーゲン構造のうちの少なくとも１つにおいて、インビボ由来のＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルを含む、方法。

【請求項7】

前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ヒト細胞が、心臓細胞および肺細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ヒト細胞が心臓細胞を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ヒト細胞が肺細胞を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記脱細胞化するステップが、前記微小組織を界面活性剤、緩衝液、ＤＮＡｓｅ、またはＲＮａｓｅのうちの少なくとも１つと混合するステップを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項12】

前記ＥＣＭ微小組織が球状粒子を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項13】

前記ＥＣＭ微小組織が、８００μｍ未満または８００μｍに等しい直径を有する球状粒子を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記細胞が組換えヒト細胞を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項15】

前記細胞が、心臓線維芽細胞、心筋細胞、および心臓微小血管内皮細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項16】

培養哺乳動物細胞をマイクロウェルに播種するステップであって、前記培養哺乳動物細胞が、前記培養哺乳動物細胞およびＥＣＭから構成されるＥＣＭ微小組織を生成する、ステップ；
前記ＥＣＭ微小組織を収集するステップ；ならびに
前記ＥＣＭ微小組織を脱細胞化するステップ、を含む方法によって作製された脱細胞化哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む、カスタマイズされた流動性組成物であって、
物理的特性、生化学的／化学的特性、機械的特性、またはコラーゲン構造のうちの少なくとも１つにおいて、インビボ由来のＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルを含むＥＣＭを含む、カスタマイズされた流動性組成物。

【請求項17】

前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記ヒト細胞が、心臓細胞および肺細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記ヒト細胞が心臓細胞を含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記ヒト細胞が肺細胞を含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項21】

前記脱細胞化するステップが、前記哺乳動物細胞を界面活性剤、緩衝液、ＤＮＡｓｅ、またはＲＮａｓｅのうちの少なくとも１つと混合するステップを含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項22】

前記方法が、前記混合物をシリンジに通過させるステップをさらに含む、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記シリンジが２７Ｇの針を含む、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

前記細胞が組換えヒト細胞を含む、請求項１７に記載の組成物。

【請求項25】

前記細胞が、心臓線維芽細胞、心筋細胞、および心臓微小血管内皮細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の組成物。

【請求項26】

心血管系の損傷を治療する方法であって、前記損傷の領域に脱細胞化ＥＣＭ組成物を投与することを含む方法。

【請求項27】

前記心血管系の損傷が心筋梗塞の結果である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＥＣＭがヒト細胞由来である、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記ヒト細胞が、心臓細胞および肺細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ヒト細胞が心臓細胞を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ヒト細胞が肺細胞を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

美容状態を治療する方法であって、脱細胞化ＥＣＭ組成物を所望の治療領域に投与するステップを含む方法。

【請求項33】

前記ＥＣＭがヒト細胞由来である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記マイクロウェルに足場がない、請求項６に記載の方法。

【請求項35】

前記マイクロウェルに足場がない、請求項１６に記載の組成物。

【請求項36】

前記インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、哺乳動物細胞の起源、哺乳動物細胞の年齢、哺乳動物細胞の疾患状態、または哺乳動物細胞の培養条件のうちの少なくとも１つの改変によって達成される、請求項６に記載の方法。

【請求項37】

前記改変が、細胞培養培地の組成、培養時間、酸素レベル、または追加の生物学的因子の存在もしくは量のうちの少なくとも１つを調整することを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項38】

前記追加の生物学的因子が、成長因子、サイトカイン、および薬物のうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項39】

カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）モルセルを生産する方法であって、以下のステップ：
培養哺乳動物細胞をマイクロウェルに播種するステップであって、前記培養哺乳動物細胞が、前記培養哺乳動物細胞およびＥＣＭから構成されるＥＣＭ微小組織を生成する、ステップ；
前記ＥＣＭ微小組織を収集するステップ；ならびに
前記ＥＣＭ微小組織を脱細胞化するステップ、を含み、
ここで、前記カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物ＥＣＭモルセルが、所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルを含む、方法。

【請求項40】

前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、物理的特性、生化学的／化学的特性、機械的特性、またはコラーゲン構造のうちの少なくとも１つを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、哺乳動物細胞の起源、哺乳動物細胞の年齢、哺乳動物細胞の疾患状態、または前記哺乳動物細胞の培養条件のうちの少なくとも１つの改変により達成される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、細胞培養培地の組成、培養時間、酸素レベル、および追加の生物学的因子の存在または量のうちの少なくとも１つを改変することによって達成される、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、成長因子、サイトカイン、および薬物のうちの少なくとも１つを含む生物学的因子を添加することによって前記哺乳動物細胞の前記培養条件を改変することによって達成される、請求項４０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、一般に、組織の再生および修復の分野に関し、特に、脱細胞化ヒトＥＣＭモルセル（ｍｏｒｓｅｌ）などの脱細胞化哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）モルセルを利用することに関する。

【0002】

政府ライセンス権
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号Ｒ０３ ＥＢ０２８０５６の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

疾患または外傷に起因する臓器不全は、社会に重大な健康とコストの問題を引き起こす。例えば、治療を成功させるには、しばしば臓器の修復や移植が必要となるが、移植可能な臓器の不足のために、米国だけでも１０万人を超える患者の待機リストが発生している。心血管疾患の患者にとって状況は特に悲惨である；毎年、およそ７９万人のアメリカ人が心筋梗塞（ＭＩ）を患っている。ＭＩ患者の最大５０％は生存する一方で、全員が進行性の心臓組織損傷を負い、この進行性損傷は世界中のＭＩ生存者の主な死亡原因となっている。実際、生存者の多くはその後心不全を発症し、５年生存率はわずか５０％である。

【0004】

現在の治療法では、ＭＩ後の心不全を防ぐことはできない；末期心不全のための選択肢は、心臓移植および左心室補助デバイスのみである。どちらの選択肢も高価であり、ドナー臓器の不足を含む、制限がある。

【0005】

心臓は、内因性および外因性の幹細胞および前駆細胞集団に由来する再生の可能性を持っているが、基本的な再生能力は治療レベルには達していないようである。この限界は最初、心筋損傷後の心筋形成能を持つ細胞の欠如に起因するものとされていた。しかしながら、疾患の心臓においては心筋細胞前駆細胞の数が増加していることが、最近の研究により実証されている。限界要因は細胞の量ではなく、むしろ機能的な心筋細胞の充足であると思われることを考えると、前駆細胞の分化を阻害する潜在的なメカニズムを理解することが重要である。心臓病治療における関心の高い分野は、疾患の心臓でＥＣＭの組成および機械的特性の両方が変化する、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリングである。

【0006】

組織工学を利用した代替治療は、利用可能な臓器と、生存のために新しい臓器を必要とする患者との間のギャップの橋渡しをするのに役立つ可能性がある。例えば、天然の足場であるＥＣＭは、組織の修復と再生をサポートすることができる。動物からの脱細胞化器官組織は、注射部位でゲルに固化する、注射可能な液体に加工することができる。しかしながら、動物のＥＣＭは、有効性を制限したり、さらなる組織損傷を引き起こしたりする免疫反応を誘発する可能性がある、ヒトにとって外来の生体分子とタンパク質配列で構成されている。同時に、ヒト由来組織からＥＣＭを抽出することは困難であり、ヒト組織のさまざまな病状および死後劣化もまた、組織修復のためには受け入れられないＥＣＭ材料となっている。

【0007】

したがって、組織の修復および再生に使用する脱細胞化哺乳動物、例えばヒト、のＥＣＭモルセル（スフェロイド状の微小組織）を調製する新規の供給源および方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

本開示は、部分的には、新規な供給源、組成物、および脱細胞化哺乳動物ＥＣＭ粒子またはモルセルを調製ならびに使用する方法に関する。一般に、本明細書に開示される方法および組成物は、例えば治療または美容処置における、組織の修復および再生を目的としたヒトＥＣＭの使用に関する。

【0009】

開示される実施形態は、特定の患者および適応症に適した特別に調整された微小組織を操作するための三次元（３Ｄ）インビトロ細胞培養システムを含む。実施形態において、三次元（３Ｄ）インビトロ細胞培養システムは、足場を含まないシステムを含む。

【0010】

開示された組織は、脱細胞化されて、例えば直径８００μｍに等しいか直径８００μｍ未満の小さな多孔質粒子またはモルセルの形態で、脱細胞化された哺乳動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を作製することができ、このようにして、例えば、針のようなカニューレで投与できる「流動性」組成物を提供することができる。開示された組成物は、ＥＣＭ粒子／モルセルのサイズおよび形状により、注射によって投与することができる。

【0011】

得られた脱細胞化哺乳動物ＥＣＭ粒子／モルセルは、組織再生のサポートを含むがこれに限定されない、多くの臨床的な応用を有することができる。

【0012】

本明細書には、カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物ＥＣＭ組成物が開示される。例えば、実施形態では、開示された組成物は培養ヒト細胞に由来する。実施形態において、ヒト細胞は心臓細胞または肺細胞を含むことができる。実施形態において、ヒト細胞は、組換えヒト細胞を含むことができる。

【0013】

本明細書では、カスタマイズされた脱細胞化ＥＣＭ組成物、例えば哺乳動物ＥＣＭ組成物を生成する方法が開示される。例えば、実施形態において、開示される方法は、培養ヒト細胞に由来するＥＣＭの生成を含む。実施形態において、ヒト細胞は心臓細胞または肺細胞を含むことができる。実施形態において、ヒト細胞は、組換えヒト細胞を含むことができる。開示された方法は、当該技術分野において以前に知られている方法と比較して、より速く、より効率的な脱細胞化を提供する。

【0014】

本明細書においては、カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物ＥＣＭ組成物を使用する方法が開示される。例えば、実施形態において、開示された使用方法は、例えば、ヒトなどの哺乳動物における、例えば、心血管系の損傷の修復および再生を含む。実施形態において、開示された使用方法は、開示されたＥＣＭ組成物を治療領域、例えば心臓へ投与することを含むことができる。実施形態において、開示された組成物は、注射によって、エアロゾルのような液体として、または含浸パッチとして投与することができる。実施形態において、開示された流動性組成物は、針のようなカニューレ、例えばシリンジを使用して投与することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】三次元（３Ｄ）構造に配置されたタンパク質、プロテオグリカン、および糖タンパク質の繊維状ネットワークであるＥＣＭ（図１Ａ）、ならびに心筋梗塞などの損傷の後のヒト組織再生におけるその使用（図１Ｂ）を示す図である。

【図2-1】ヒトＥＣＭモルセルを作製するためのスフェロイド形状の微小組織を生成する方法を示す図である。このプロセスは、非接着性マイクロモールドプラットフォーム技術を使用して、培養ヒト細胞をマイクロウェルに播種することから始まる（図２Ａおよび２Ｂ）。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３６１，７８１号（モーガンら）を参照されたい。播種された細胞は、凝集、合成、集合し、ヒトＥＣＭを堆積する。各マイクロウェル（各々、直径およそ４００～８００μｍ）内で得られたＥＣＭ微小組織またはスフェロイド（各々、直径およそ５０～３００μｍ）を図２Ｃおよび図２Ｄに示す。

【図2-2】ヒトＥＣＭモルセルを作製するためのスフェロイド形状の微小組織を生成する方法を示す図である。このプロセスは、非接着性マイクロモールドプラットフォーム技術を使用して、培養ヒト細胞をマイクロウェルに播種することから始まる（図２Ａおよび２Ｂ）。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３６１，７８１号（モーガンら）を参照されたい。播種された細胞は、凝集、合成、集合し、ヒトＥＣＭを堆積する。各マイクロウェル（各々、直径およそ４００～８００μｍ）内で得られたＥＣＭ微小組織またはスフェロイド（各々、直径およそ５０～３００μｍ）を図２Ｃおよび図２Ｄに示す。

【図3】マスターモールドの概略図（図３Ａ）、ならびに対応する３Ｄプリントモールド、シリコーンネガティブ、およびマイクロウェル内にＥＣＭ微小組織を有するアガロースモールドの画像を含む、開示された非接着性マイクロモールドプラットフォーム技術を示す図である。図３Ｂは、リング状およびハニカム状のモールド、アガロース中の対応するネガティブ複製、ならびにアガロースゲルから除去して、生細胞をカルセイン－ＡＭ（ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）で染色した、得られたリング状およびハニカム状の３ＤヒトＥＣＭ微小組織（６００万個の細胞、直径２ｃｍ）を含む別の実施形態を示す図である。また、ヒト皮膚線維芽細胞（１，４００万個の細胞）の脱細胞化されたハニカム形状の３Ｄ組織も示され、わずか３日後にＥＣＭが作成されたことを示す；直径２センチメートル。

【図4】脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを生成する方法を示す図である。図４において、胎児および成人のヒト心臓細胞または成人肺細胞を培養し、マイクロウェルに播種してＥＣＭ微小組織またはスフェロイドを生成することができる。ＥＣＭスフェロイド微小組織は、マイクロウェル内で脱細胞化することができる。得られた脱細胞化された胎児および成人のヒト心臓またはヒト肺ＥＣＭモルセルは、脱細胞化処置後もそのスフェロイドの形状を維持する。スケールバー＝２００μｍ。

【図5】脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを生成する追加のまたは代替の方法を示す図である。図５において、胎児および成人のヒト心臓細胞を培養し、マイクロウェルに播種して、ＥＣＭ微小組織またはスフェロイドを生成することができる。ＥＣＭスフェロイド微小組織は、収集、脱細胞化、および、例えば、ボルテックスにより混合することができる。得られた脱細胞化された胎児および成人のヒト心臓ＥＣＭモルセルは、脱細胞化処置後もそのスフェロイドの形状を維持する。

【図6】２７Ｇシリンジを１０回通過させた前後の脱細胞化ヒト胎児ＥＣＭモルセル（Ａ）、または２７Ｇシリンジを１回通過させた前後の１０倍の対物レンズを備えた明視野における倒立顕微鏡での画像（Ｂ）を示す図である。

【図7-1】図７Ａは、トランスフォーミング増殖因子ベータ１で処理または未処理の、特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者由来の細胞または健康な細胞のいずれかからの、ヒト肺細胞からの染色されたＥＣＭスフェロイド微小組織を示す、一実施形態を示す図であり、図７Ｂは、成人および胎児のヒト心臓細胞からのＥＣＭスフェロイド微小組織（線維芽細胞のみ、または心筋細胞および微小血管内皮細胞と共培養）を示す図である。線維芽細胞のみの成人または胎児心臓ＥＣＭ微小組織は３、６、９、または１２日間培養されたが、三種培養物（ｔｒｉ－ｃｕｌｔｕｒｅｓ）は６日間のみ培養された。脱細胞化前のヘマトキシリンおよびエオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）（Ｈ＆Ｅ）またはシリウス・レッド（ＳＩＲＩＵＳ ＲＥＤ）（商標）で染色した明視野におけるＥＣＭスフェロイド微小組織の画像が示されており、脱細胞化後の成人および胎児のヒト心臓細胞または成人肺細胞からのＥＣＭスフェロイド微小組織も示されている。スケールバー＝５０μｍ。

【図7-2】図７Ａは、トランスフォーミング増殖因子ベータ１で処理または未処理の、特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者由来の細胞または健康な細胞のいずれかからの、ヒト肺細胞からの染色されたＥＣＭスフェロイド微小組織を示す、一実施形態を示す図であり、図７Ｂは、成人および胎児のヒト心臓細胞からのＥＣＭスフェロイド微小組織（線維芽細胞のみ、または心筋細胞および微小血管内皮細胞と共培養）を示す図である。線維芽細胞のみの成人または胎児心臓ＥＣＭ微小組織は３、６、９、または１２日間培養されたが、三種培養物（ｔｒｉ－ｃｕｌｔｕｒｅｓ）は６日間のみ培養された。脱細胞化前のヘマトキシリンおよびエオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）（Ｈ＆Ｅ）またはシリウス・レッド（ＳＩＲＩＵＳ ＲＥＤ）（商標）で染色した明視野におけるＥＣＭスフェロイド微小組織の画像が示されており、脱細胞化後の成人および胎児のヒト心臓細胞または成人肺細胞からのＥＣＭスフェロイド微小組織も示されている。スケールバー＝５０μｍ。

【図8】３日目から１２日目までのヒト胎児心臓微小組織のサイズの増加は、コラーゲン（μｇ）および硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ） （μｇ）含有量の増加と関連しているが、ＤＮＡ含有量（ｎｇ／ｍＬ）の変化とは関連しないことを示す図である。

【図9】線維状コラーゲン構造を三次元で捕捉するための、多光子共焦点第二高調波発生（ＳＨＧ）顕微鏡下での肺および心臓ＥＣＭ微小組織を示す図である。ヒト成人健康肺ＥＣＭ微小組織（図９Ａ）は、ヒト成人線維化肺ＥＣＭ（図９Ｂ）およびヒト成人健康心臓ＥＣＭ微小組織（図９Ｃ）とは異なる線維状コラーゲン構造を明らかにする。

【図10】培養ヒト胎児心臓ＥＣＭの機械的剛性は、健康なヒトの心臓組織と同等であることを示す図である。成人肺（Ｌ－Ａ）、成人心臓（Ｈ－Ａ）、および胎児心臓（Ｈ－Ｆ）の培養ヒトＥＣＭ弾性率（平均±ＳＤ ｋＰａ）を、健康なヒト心臓の剛性範囲（赤色の陰影）ならびに別の研究室からの公表された研究で報告された、ゲル化コラーゲン（Ｃｏｌ）、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ） （Ｍａｔ）、非架橋ブタ心臓ＥＣＭ （Ｐｉｇ － Ｎ）、および架橋ブタ心臓ＥＣＭ （Ｐｉｇ － Ｃ）の同等の弾性率と比較したグラフ表示。Ｎ ＝ ９／グループ。

【図11】培養ＥＣＭがインビトロで生体適合性であることを示す図である。細胞播種２４時間後、固定前に４８時間（ＨＣＭ）または２４時間（ＨＣＭＥＣ）、ＥｄＵ （５－エチニル－２’－デオキシウリジン）とともにインキュベートした、培養ヒト成人または胎児心臓ＥＣＭを含むかまたは含まないマイクロウェルに播種されたヒト心筋細胞（ＨＣＭ）または微小血管内皮細胞（ＨＣＭＥＣ）の固定および包埋切片の代表的な画像。切片を、Ｈ＆ＥまたはＣｌｉｃｋ－ｉＴ（商標）ＥｄＵ細胞増殖キット（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）で染色し、増殖細胞はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８色素（赤）で標識し、全ての核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ （青）で対比染色した。Ｎ ＝ ３。

【発明を実施するための形態】

【0016】

定義
以下にいくつかの定義が提供される。それにも関わらず、定義は以下の「実施形態」セクションに記載される場合があり、上記のヘッダー「定義」は、「実施形態」セクションにおけるそのような開示が定義ではないことを意味するものではない。

【0017】

「投与」または「投与する」は、医療デバイス、材料、または薬剤を対象に与える（すなわち、投与する）ステップを意味する。本明細書に開示される物質は、多くの適切な経路を介して投与することができるが、典型的には外科的処置に関連して使用される。

【0018】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「コンポーネント」または「前記コンポーネント」への言及には、２つ以上のコンポーネントが含まれる。

【0019】

「Ｘおよび／またはＹ」の文脈で使用される「および／または」という用語は、「Ｘ」、または「Ｙ」、または「ＸおよびＹ」として解釈されるべきである。同様に、「ＸまたはＹの少なくとも１つ」は、「Ｘ」、または「Ｙ」、または「ＸおよびＹ」と解釈されるべきである。

【0020】

「ＥＣＭの物理的特性」とは、ＥＣＭモルセル／粒子の形状、サイズ、表面粗さ、多孔度、線維状コラーゲンの二次元構造、線維状コラーゲンの三次元構造を含むがこれらに限定されない特性を指す。

【0021】

「ＥＣＭ生化学的特性」とは、生化学分子（アミノ酸、ペプチド、タンパク質、修飾タンパク質、炭水化物、脂肪酸、グリコサミノグリカン、酵素、シグナル伝達分子（トランスフォーミング成長因子ベータ１）、サイトカイン、ホルモンなど）の種類（アイデンティティ）および含有量（相対量）、ならびにＥＣＭモルセル／粒子の分解性および生体適合性を含むがこれらに限定されない特性を指す。

【0022】

「ＥＣＭ機械的特性」とは、ＥＣＭモルセル／粒子の引張強度、圧縮強度、弾性率、せん断弾性率を含むがこれらに限定されない特性を指す。

【0023】

「インビボＥＣＭ特性」とは、天然に存在するＥＣＭに関連する物理的、生化学的、または機械的特性を指す。

【0024】

「カスタマイズされたＥＣＭ」とは、天然に存在するＥＣＭに関連するものとは異なる物理的、生化学的、または機械的特性を有するＥＣＭを指し、そのような違いは開示された方法の結果である。

【0025】

「ＥＣＭ微小組織」とは、細胞およびＥＣＭを含む３Ｄ組成物を指す。

【0026】

「ＥＣＭモルセル」または「ＥＣＭ粒子」は、脱細胞化されたＥＣＭ微小組織を指す。

【0027】

本明細書において、範囲は、「約」または「およそ」１つの特定の値、および／または「約」または「およそ」から別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態には、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までが含まれる。同様に、先行詞「約」または「およそ」を使用することによって、値が近似値として表現される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。

【0028】

「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され、投与または治療の標的となる任意の個人を指す。「対象」は、哺乳動物などの脊椎動物であり得る。「対象」は、ヒトまたは獣医の患者であり得る。「患者」という用語は一般に、臨床医、例えば内科医または医療専門家の治療を受けている「対象」を指す。

【0029】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。

【0030】

「治療上有効な」という用語は、疾患または障害の１つまたは複数の原因または症状を寛解させるのに十分な量である、使用される組成物の量を指す。そのような寛解は、低減または変更が必要であるのみであり、必ずしも消失する必要はない。さらに、「治療上有効な」という用語には、使用される組成物の量が、身体の組織または器官の修復プロセスを開始および／またはサポートするのに十分な量であることが含まれる。

【0031】

「治療」という用語は、疾患、病理学的状態、または障害を治癒、寛解、安定化、予防することを意図とした患者の医学的管理を指す。さらに、「治療」という用語は、損傷、組織損傷、臓器損傷の修復、再生、または身体の修復または再生プロセスのサポートを提供することを意図とした患者の医学的管理を指す。この用語には、積極的な治療、すなわち、疾患、損傷、傷害、病理学的状態、または障害の改善に、特に向けた治療が含まれる。さらに、この用語には、緩和的治療、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の治癒ではなく、症状の緩和をデザインした治療；予防的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、損傷、または障害の発症を最小限に抑えるか、または部分的もしくは完全に阻害することに向けた治療；ならびに支持的療法、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、損傷、または障害の改善に向けた別の特定の療法を補完するために利用される治療が含まれる。

【0032】

対象への「投与」という用語には、対象に薬剤を導入または送達する任意の経路が含まれる。「投与」は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮、筋肉内、関節内、非経口、細動脈内、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、直腸内、膣内、吸入による、埋め込みリザーバー経由、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、腹腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入技術）などを含むがこれらに限定されない、任意の適切な経路によって行うことができる。

【0033】

本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語、およびその文法的変形には、１つまたは複数の疾患もしくは状態の強度または頻度、疾患もしくは状態の症状、または疾患もしくは状態の根本的な原因を、部分的または完全に予防、遅延、治癒（ｃｕｒｉｎｇ）、治癒（ｈｅａｌｉｎｇ）、修復、再生、緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）、緩和（ｒｅｌｉｅｖｉｎｇ）、変更、治療（ｒｅｍｅｄｙｉｎｇ）、寛解、改善、安定化、軽減（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ）、および／または軽減（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）する意図または目的を持った組成物の投与が含まれる。本発明による治療は、予防的に（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅｌｙ）、予防的に（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ）、緩和的に、または治療的に適用することができる。

【0034】

実施形態
本開示による組成物のさまざまな非網羅的、非限定的な態様は、単独で、または本明細書に記載される１つまたは複数の他の態様と組み合わせて有用であり得る。開示されたシステム、組成物、および方法は、患者および医師の両方に独特の利点を提供する。例えば、開示された実施形態は、特定の患者に対する使用および／または特定の治療のために特に調整された、カスタマイズされた３Ｄ微小組織を作成することができる。実施形態において、これらの微小組織を使用して、肺線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、心臓線維芽細胞、心臓微小血管内皮細胞、異なる年齢（成人、胎児、若年者など）の心筋細胞を含むがこれらに限定されない、哺乳動物細胞の多くの異なるタイプおよび組み合わせから脱細胞化哺乳動物ＥＣＭ粒子／モルセルを作製することができる。したがって、本明細書では、インビボ組織から作製できないＥＣＭを含む、カスタマイズ可能なＥＣＭをインビトロで作成する方法が提供される。

【0035】

微小組織内の哺乳動物細胞によって生成されるＥＣＭ粒子／モルセルの生化学的／化学的組成（生化学／化学種および／またはその内容の両方）、コラーゲン構造、および機械的特性は、使用される哺乳動物細胞のタイプ（組織起源、年齢、疾患状態など）に独自に依存する。したがって、特定の細胞を利用して、所望のＥＣＭ特性を達成することができる。

【0036】

微小組織内の哺乳動物細胞によって生成されるＥＣＭ粒子／モルセルの生化学的／化学的組成（生化学／化学種および／またはその内容の両方）、コラーゲン構造、および機械的特性は、微小組織を形成するため、哺乳動物細胞の培養条件にさらに依存する。例えば、細胞培養培地の組成、培養時間、酸素レベル、および成長因子、サイトカイン、薬剤などを含むがこれらに限定されない追加の生物学的因子の存在または量は、所望のＥＣＭ特性を産生するように調整できる。

【0037】

微小組織中の哺乳動物細胞によって生成される開示されたＥＣＭ粒子／モルセルの生化学的／化学的組成（生化学／化学種および／またはそれらの内容の両方）、コラーゲン構造、および機械的特性は、自然界に見られる哺乳動物組織（例えば、豚の心臓、人間の心臓など）から抽出されたＥＣＭとは異なる可能性がある。

【0038】

開示されたＥＣＭ粒子／モルセルは、取り付けた針を備えたシリンジを通過することができる流動性組成物を形成することができ、針の内径（ＩＤ）はＥＣＭ粒子／モルセルのサイズに依存すると思われる。例えば、直径が約２００μｍのＥＣＭ粒子／モルセルは、２７Ｇの針のＩＤ （ＩＤ ＝ ２１０μｍ）に等しいかそれを超えるＩＤを持つ針を通過することができる。

【0039】

開示されたＥＣＭ粒子は、動物またはヒトの組織および器官から抽出されたＥＣＭよりも少ないステップを使用して作製することができる。開示されたＥＣＭ粒子は、無菌条件を使用して作製することができる。

【0040】

開示された脱細胞化哺乳動物ＥＣＭ粒子／モルセルは、インビトロで生体適合性があり、その結果、脱細胞化哺乳動物ＥＣＭ粒子／モルセル上に置かれた哺乳動物細胞は生存し、増殖することができる。

【0041】

異なるＥＣＭの特徴（例えば、物理的特性、生化学的／化学的組成、コラーゲン構造、機械的特性、およびそれらの組み合わせを含む）は、インビボで移植されると、周囲の組織に異なる影響を及ぼす可能性があり、あらゆる数の臨床状態について、カスタマイズされたＥＣＭの開発が可能になる。

【0042】

ＥＣＭ組成物
本明細書では、その特性を特定の患者（または患者群）および特定の適応症に適合するように特に調整することができる、カスタマイズされた脱細胞化組成物、例えば脱細胞化哺乳動物ＥＣＭ組成物が開示される。図１は、三次元（３Ｄ）構造に配置されたタンパク質、プロテオグリカン、および糖タンパク質の繊維状ネットワークであるＥＣＭ（図１Ａ）、ならびに心筋梗塞などの損傷の後のヒト組織再生におけるその使用を示す（図１Ｂ）。組織の再生および／または修復に外来の非ヒト脱細胞化ＥＣＭを使用すると、対象において免疫反応が生じやすい可能性がある。脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルは、ＥＣＭがヒトのものであるため、免疫反応の問題を克服する。したがって、実施形態において、脱細胞化細胞はヒト細胞である。実施形態において、ヒト細胞は、心臓細胞または肺細胞を含むことができる。実施形態において、ヒト細胞は、組換えヒト細胞を含むことができる。実施形態において、ヒト細胞は、心臓線維芽細胞、心筋細胞、および心臓微小血管内皮細胞のうちの少なくとも１つを含むことができる。

【0043】

実施形態において、開示される組成物は、脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを形成するために使用される培養ヒト細胞に由来する。ＥＣＭは、プロテオグリカン、酵素、および成長因子とともに、コラーゲンおよびエラスチンなどの構造タンパク質の複雑な３Ｄ構造を含むことができる（図１Ａ）。実施形態において、ＥＣＭは、構造的サポート、ならびに組織再生のためのシグナルを提供する（図１Ｂ）。

【0044】

ＥＣＭ組成物－ 製造方法
本明細書では、所望の物理的または化学的特性を有するカスタマイズされた脱細胞化哺乳動物由来ＥＣＭ組成物を製造する方法が開示される。例えば、実施形態において、開示された方法は培養ヒト細胞に由来する。

【0045】

開示された方法は以下のステップを含むことができる：
１．培養細胞（哺乳動物細胞など）をマイクロウェルに播種するステップであって、培養哺乳動物細胞は３Ｄ微小組織を生成し、各微小組織は培養哺乳動物細胞および細胞分泌された可溶性ＥＣＭおよび不溶性ＥＣＭから構成される、ステップ；
２．微小組織を収集するステップ；ならびに
３．ＥＣＭモルセルまたは粒子を形成するために、微小組織を界面活性剤、緩衝液、ＤＮａｓｅ、およびＲＮａｓｅと混合し、混合物を混合／ボルテックスすることを含むステップを用いて、微小組織を脱細胞化するステップ。

【0046】

開示された脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルの供給源として、さまざまなヒト細胞株を利用することができる。実施形態において、ヒト細胞は、例えば、心臓細胞または肺細胞を含むことができる。実施形態において、ヒト細胞は、組換えヒト細胞を含むことができる。例えば、実施形態において、供給源として利用されるヒト細胞株は、心臓線維芽細胞、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、および肺線維芽細胞を含むことができる。さらに、他のヒト細胞タイプおよび異なる成熟度のヒト細胞をＥＣＭモルセルの供給源として使用することもできる。実施形態において、脱細胞化ＥＣＭモルセルの供給源として使用されるヒト細胞株は、成人細胞、若年細胞、または胎児細胞など、異なる成熟度のものであってもよい。

【0047】

実施形態において、ヒトＥＣＭ微小組織またはスフェロイドを作製する方法が提供される。実施形態において、開示される方法は、非細胞接着性マイクロモールドプラットフォーム技術を使用して、例えばヒトなどの培養哺乳動物細胞を、例えばマイクロウェルに播種するステップを含む。

【0048】

図２は、ヒトＥＣＭモルセルを作製するためのスフェロイド形状の微小組織を生成するための開示された方法を示す図である。このプロセスは、非接着性マイクロモールドプラットフォーム技術を使用して、培養ヒト細胞をマイクロウェルに播種することから始まる（図２Ａおよび２Ｂ）。播種された細胞は、凝集、合成、集合し、ヒトＥＣＭを堆積する。各マイクロウェル（各々、直径およそ４００～８００μｍ）内で得られたＥＣＭ微小組織またはスフェロイド（各々、直径およそ５０～３００μｍ）を図２Ｃおよび図２Ｄに示す。

【0049】

実施形態において、マイクロウェルは、アガロースなどの任意の適切な材料から生成することができる。例えば、２％アガロースを使用して、生きたヒト細胞などの細胞が凝集して合成、集合し、ヒトＥＣＭを堆積することができるマイクロウェルを生成できる。

【0050】

図３は、マスターモールドの概略図（図３Ａ）、ならびに対応する３Ｄプリントモールド、シリコーンネガティブ、およびマイクロウェル内にＥＣＭ微小組織を有するアガロースモールドの画像を含む、開示された非接着性マイクロモールドプラットフォーム技術を利用した実施形態を示す図である。図３Ｂは、リング状およびハニカム状のモールド、アガロース中の対応するネガティブ複製、ならびにアガロースゲルから除去して、生細胞をカルセイン－ＡＭ（ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）で染色した、得られたリング状およびハニカム状の３ＤヒトＥＣＭ微小組織（６００万個の細胞、直径２ｃｍ）を使用した、別の実施形態を示す図である。また、ヒト皮膚線維芽細胞（１４００万個の細胞）の脱細胞化されたハニカム形状の３Ｄ組織も示され、わずか３日後にＥＣＭが作成されたことを示す；直径２センチメートル。

【0051】

図４は、脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを生成するさらなる方法を示す図である。図４の実施形態において、胎児および成人のヒト心臓細胞または成人肺細胞を培養し、マイクロウェルに播種してＥＣＭ微小組織またはスフェロイドが生成される。ＥＣＭスフェロイド微小組織は、マイクロウェル内で脱細胞化することができる。得られた脱細胞化された胎児および成人のヒト心臓またはヒト肺ＥＣＭモルセルは、脱細胞化処置後もそのスフェロイドの形状を維持する。スケールバー＝ ２００μｍ。

【0052】

図５は、脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを生成する追加のまたは代替の方法を示す図である。図５において、胎児および成人のヒト心臓細胞を培養し、マイクロウェルに播種して、ＥＣＭ微小組織またはスフェロイドを生成することができる。ＥＣＭスフェロイド微小組織は、収集、脱細胞化、および、例えば、ボルテックスされることにより混合することができる。得られた脱細胞化された胎児および成人のヒト心臓ＥＣＭモルセルは、脱細胞化処置後もそのスフェロイドの形状を維持する。

【0053】

実施形態において、マイクロモールドされた非接着性の細胞凝集デバイスは、例えば窪みまたはトラフの形状の複数の細胞凝集凹部を含むことができる。実施形態において、ヒドロゲル材料としてアガロースを利用することができ、実施形態において、以下のように細胞凝集凹部を確立することができる。トラフは幅４００μｍ、底は例えば２００μｍの半径で丸くすることができる。開示された実施形態は、ゲル当たり長さが増加するトラフの列を含むことができる。例えば、一実施形態において、各列は１１個のトラフを有することができ、そのうちの２個は４００μｍの長さであり、次いで６００μｍから１８００μｍの各１個が２００μｍずつ長さが増加し、次に２２００μｍのトラフが２個となることができる。実施形態において、円環状の凹部は、深さが８００μｍであり、円形トラックの幅が４００μｍであり得る。実施形態において、凹部の底は２００μｍの半径を含むことができる。

【0054】

実施形態において、細胞が哺乳動物、例えばヒトのＥＣＭ微小組織またはスフェロイドに集合し、ＥＣＭの生成を開始するまでに、例えば約４時間～約２４時間かかり得る（図２Ｃ）。例えば、実施形態において、細胞の集合には、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間などかかり得る。

【0055】

実施形態において、細胞の集合には、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１４時間、少なくとも１６時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２２時間、少なくとも２４時間、少なくとも２６時間、少なくとも２８時間などかかり得る。

【0056】

マイクロモールド技術を使用して哺乳動物、例えばヒトＥＣＭ微小組織またはスフェロイドを生成する開示された方法は、高い細胞密度で３ＤヒトＥＣＭ微小組織またはスフェロイドを形成するための、安定した、長期間の、再現可能な培養プラットフォームを提供する（図２Ｃ）。さらに、マイクロモールド技術は、足場材料を使用する必要がなく、したがって、実施形態において、スフェロイド形状の微小組織を生成するためには、培養細胞、例えばヒト細胞のみをマイクロウェルに加えればよい。このアプローチにより、最適な細胞から細胞へのコミュニケーションおよび移動が可能になり、複雑な３Ｄ形態学的変化および分化を起こしながら、異なるタイプの細胞の混合物が相互作用することが可能になる。マイクロモールド技術により、細胞培養培地を交換しながらマイクロウェル内の細胞を静的に培養できるため、細胞から分泌されたＥＣＭを分泌部位に濃縮できる。さらに、マイクロモールドは、初期モールドの幾何学形状に基づいて、多種多様な組織の形状およびサイズに合わせてカスタマイズ可能である（図３Ａおよび３Ｂ）。さらに、モールドの幾何学形状は細胞の整列と組織化を指示し、その後、ＥＣＭの微細構造および整列、ならびにバルクの機械的特性に影響を及ぼす。したがって、足場ベースの方法または細胞シートの方法とは異なり、マイクロモールド技術を使用すると、ＥＣＭの整列を促進して天然の組織をよりよく模倣でき、細胞の接着および遊走を促進することによって、治療効果を増加することができる。播種された細胞がヒトＥＣＭを十分に生成するのに必要な時間は、細胞のタイプならびに増殖条件に依存している。一実施形態において、播種されたヒト心臓線維芽細胞は、約３日から約１２日でＥＣＭを生成することができる。例えば、実施形態において、播種されたヒト心臓線維芽細胞は、約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日などでＥＣＭを生成することができる。

【0057】

実施形態において、ヒトＥＣＭ微小組織をその後、収集して脱細胞化するか、またはマイクロモールド内で直接脱細胞化することができる。脱細胞化は、中性界面活性剤で処理し、続いてＤＮＡを除去する処理によって達成することができる（図３）。開示されたＥＣＭ微小組織は、例えばピペッティングによってマイクロウェルから収集することができ、任意の凍結融解ステップに供されて、塩溶液および中性界面活性剤で処理され、続いてヒト微小組織からのＤＮＡとＲＮＡを除去するために、酵素ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅでの処理を使用することができる。

【0058】

実施形態において、脱細胞化が成功すると、細胞が死滅し、細胞物質の大部分が除去され、ＤＮＡの大部分が除去または破壊され、年齢に特異的な三次元構造および機械的剛性のヒトＥＣＭが組織に残される。得られた組成物は、脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルまたはヒトＥＣＭの小さな多孔質球体を含み、小さな直径の皮下注射針を自由に通過することができ（図４）、したがって、組織の修復または再生が必要な器官または組織に容易に注入することができる。開示された脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルは、当業者に既知である技術を使用してＤＮＡの存在について評価することができる。ＤＮＡを含まない脱細胞化ＥＣＭは、副作用を最小限に抑えながらインビボで建設的なリモデリングを受けることができる。図６は、２７Ｇシリンジを１０回通過させた前後の脱細胞化ヒト胎児ＥＣＭモルセルを示す図である。

【0059】

図７Ａは、特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者由来の細胞および健康な細胞の両方の、ヒト肺細胞からの染色されたＥＣＭスフェロイド微小組織を含む、一実施形態を示す図であり、図７Ｂは、成人および胎児のヒト心臓細胞からのＥＣＭスフェロイド微小組織（線維芽細胞のみ、または心筋細胞および微小血管内皮細胞と共培養）を示す図である。線維芽細胞のみの成人または胎児心臓ＥＣＭ微小組織は３、６、９、または１２日間培養されたが、三種培養物（ｔｒｉ－ｃｕｌｔｕｒｅｓ）は６日間のみ培養された。脱細胞化前のヘマトキシリンおよびエオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）（Ｈ＆Ｅ）またはシリウス・レッド（商標）で染色した明視野におけるＥＣＭスフェロイド微小組織の画像が示されており、脱細胞化後の成人および胎児のヒト心臓細胞または成人肺細胞からのＥＣＭスフェロイド微小組織も示されている。スケールバー＝５０μｍ。

【0060】

上述の各態様または任意の態様と組み合わせて使用することができる、本開示の別の非限定的な態様に従って、脱細胞化哺乳動物、例えばヒトのＥＣＭモルセルの組成物は、それを必要とする特定の患者のためにデザインすることができる。実施形態において、脱細胞化されたヒトＥＣＭモルセル組成物は、脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを生成するために、所望の細胞型を選択するか、または異なる細胞型の組み合わせもしくは混合物を選択することによって生成することができる。開始細胞型としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：心臓線維芽細胞、心筋細胞、および心臓微小血管内皮細胞を組み合わせて使用して、それを必要とする特定の患者に投与できる脱細胞化ヒトＥＣＭを生成することができる。これらの「デザイナー」ＥＣＭ組成物は、天然の組織または器官全体には存在しない独特の組成物および効力を含み、したがって、特定の患者の所望の治療のために特に適合した組成物をデザインおよび製造する能力を医師に提供する。

【0061】

前述したように、異なる細胞型を選択するか、異なる細胞型を組み合わせて開始ＥＣＭ微小組織を形成することに加えて、「デザイナー」ＥＣＭ組成物は、ＥＣＭの生産およびその品質を変更および／または改善することができる成長因子および／または薬物で、開始３Ｄ ＥＣＭ微小組織を処理することによって生成することもできる。いくつかの実施形態において、増殖因子、サイトカインおよび薬物などの培地への添加物は、細胞によって産生されるＥＣＭの量およびタイプに影響を与える可能性がある。微小組織を例えばインターロイキン４、インターロイキン１０、インターロイキン１１またはインターロイキン１３などの抗炎症性メディエーターとインキュベートすることにより、微小組織に影響を与えて「抗炎症性デザイナー」ＥＣＭを生成することができる。さらなる「デザイナー」ＥＣＭ組成物は、組換え細胞、例えばサイトカインを産生する組換え細胞から生成されるＥＣＭを含むことができる。

【0062】

さらに、または代替的に、前述したように、脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルの所望のサイズ（すなわち、直径）および／または形状は、マイクロモールドに播種された細胞の数、初期マイクロモールドの幾何学形状、またはヒト細胞で作られたＥＣＭモルセルの培養時間の長さによって、変更または調整することができる。特定のマイクロモールドを使用して、正確なサイズの３Ｄ ＥＣＭスフェロイド微小組織を生成することができ、投与中に所望の必要なサイズを通過できる脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを生成できる。

【0063】

本開示の別の非限定的な態様に従って、培養細胞から脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを生成する方法は、自動プロセスを使用して実行することができる。

【0064】

組織修復および再生に使用するために、培養細胞から脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを生成する本開示の方法は、出発材料が一般に、脂肪、筋膜もしくは結合組織、細菌、および／または臓器全体を汚染する可能性のあるその他の物質を含まずにより高度に定義されているため、より純粋なＥＣＭ組成物をもたらすことができる。また、臓器全体よりも培養細胞に由来するＥＣＭ組成物のバッチ間のばらつきが少なくなる可能性もある。さらに、培養細胞由来の脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルは、臓器全体または培養細胞シート由来の脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルと比較して、必要なステップが少ない、機能を維持できるより穏やかなプロセスである。脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを製造するための開示されたプロセスは、典型的にはより手間がかかり、コストがかかり、および最も重要なことには、ＥＣＭの構造およびその効力を破壊する、凍結乾燥、消化、および再構成のステップを省く。

【0065】

ＥＣＭ組成物－使用方法
本明細書では、開示されカスタマイズされた脱細胞化ヒトＥＣＭ組成物を使用する方法が開示される。例えば、実施形態において、開示された使用方法は、例えば心臓病の治療を含む。

【0066】

ＥＣＭの構造的、生化学的、機械的な手がかりは、細胞の接着、遊走、シグナル伝達を促進し、その全てが組織の再生および修復に不可欠であることが示されている。健康な心筋と同様の剛性が、心臓組織工学には理想的であるという仮説が立てられている。図１０は、脱細胞化ヒト胎児心臓ＥＣＭモルセルが健康な心臓組織と同等の機械的剛性（弾性率）を有し、したがって心臓治療での使用に理想的な機械的特性を提供することを示している。

【0067】

一態様では、組織修復、組織再生、および組織増大を目的とした治療としての脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを使用する方法が本明細書に開示される。脱細胞化ヒトＥＣＭ組成物は、注射剤、パッチ、および／またはエアロゾルとして製剤化されてもよい。パッチ基材を含む実施形態において、パッチは生分解性材料、すなわち、しばらくすると患者の体に自然に吸収される生分解性材料を含むことができる。実施形態において、生分解性材料は生体適合性であり、すなわち、材料が投与される患者に悪影響を与えることはない。したがって、生体適合性マトリックスは、タンパク質または多糖類などの生体高分子、例えばコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、多糖類、例えば、ヒアルロン酸、キトサンおよびその誘導体、コラーゲン、キトサンなどの生体材料から選択される生体材料であり得る。

【0068】

別の実施形態において、カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物、例えばヒトのＥＣＭモルセルを皮膚に注射して、組織修復のための戦略としてだけでなく、例えば唇の治療、頬の治療、額の治療、ダーマルフィラー治療などの美容的応用および治療としての増大を達成することができる。例えば、一実施形態において、ヒアルロン酸を含む開示されたＥＣＭ組成物を対象の唇に投与して膨満感を加えることができる。

【0069】

開示される実施形態は、皮膚などの組織に対する老化の影響を減少するための治療を含むことができる。例えば、時間の経過とともに、さまざまな身体構造が予測できない順序で機能を失う。ＥＣＭは、これらの複雑なプロセス間に共通性を提供し、したがって、開示される方法は、皮膚に対する加齢の影響を低減するための治療を含むことができる。

【0070】

さらに、別の実施形態において、脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを、例えば溶液、ゲル、またはパッチとして、創傷治癒を助けるために局所的に適用することができる。

【0071】

他の態様と組み合わせて使用され得る、本開示の別の非限定的な態様に従って、脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルの組成物は、幹細胞と混合され、投与された細胞を安全に移植するための細胞担体として使用されてもよく、注射などによる送達剤として治療用化合物／薬物と混合することができることが記載されている。

【0072】

また、投与した脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルが、インビボで細胞生存能、細胞増殖、細胞遊走、走化性、および／または毛細血管形成を促進する能力も本明細書で開示される。

【0073】

本明細書に記載された実施形態に対するさまざまな変更および修正が当業者には明らかであることを理解されたい。このような変更および修正は、本発明の主題の精神および範囲から逸脱することなく、またその意図された利点を損なうことなく行うことができる。したがって、そのような変更および修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。

【0074】

本発明の範囲から逸脱することなく、上記の情報源および方法にさまざまな変更を加えることができるため、上記の説明および以下に示す実施例に含まれる全ての事項は、限定的でなく、例示的な意味として解釈されることが意図されている。

【実施例】

【0075】

実施例１
カスタマイズされた脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルを作成する例示的な方法が、実施例１に示される。

【0076】

材料および方法
細胞培養、マイクロモールド作製、微小組織（単一多細胞構造）の形成。

【0077】

ヒト肺線維芽細胞（ＬＦ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－４０５８）を、０．６２５～１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトランスフォーミング成長因子ベータ１ （ＴＧＦ－β１）タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス、２４０－Ｂ）の存在下または非存在下で処理した、線維芽細胞増殖キット－低血清（ＡＴＣＣ－２０１－０４１）および０．３μｇ／ｍＬの濃度のピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ａ１１１３８０３）を添加した線維芽細胞基本培地（ＡＴＣＣ ＰＣＳ－２０１－０３０）で増殖させた。特発性線維症患者（ＩＰＦ、ＡＴＣＣ ＰＣＳ－２０１－０２０）からのヒト肺線維芽細胞を、０．６２５～１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＧＦ－β１タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、２４０－Ｂ）の存在下または非存在下で処理した、線維芽細胞増殖キット－低血清（ＡＴＣＣ－２０１－０４１）を添加した線維芽細胞基本培地（ＡＴＣＣ ＰＣＳ－２０１－０３０）で増殖させた。

【0078】

慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、ＡＴＣＣ ＰＣＳ－２０１－０１７）患者からのヒト肺線維芽細胞を、線維芽細胞増殖キット－低血清（ＡＴＣＣ－２０１－０４１）を添加した線維芽細胞基本培地（ＡＴＣＣ ＰＣＳ－２０１－０３０）中で増殖させた。ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ； Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ Ｃ－１２３７５）を線維芽細胞増殖培地３ （Ｃ－２３０２５）で増殖させた。ヒト心筋細胞（ＨＣＭ； Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ Ｃ－１２８１０）をミオサイト増殖培地３ （Ｃ－２２０７０）で増殖させた。ヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＣＭＥＣ； Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ Ｃ－１２２８５）を内皮細胞増殖培地ＭＶ （Ｃ－２２０２０）中で増殖させた。ヒト胎児心臓線維芽細胞（ＨＦＣＦ、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ、３０６－０５ｆ）をＨＣＦ増殖培地（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３１６－５００）で増殖させた。細胞をトリプシン処理し、計数し、各実験のために所望の細胞密度になるように再懸濁した。

【0079】

本発明者らは、Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏら（２００７） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４３（４）：４９４、４９６～５００ページによって以前に記載されているように、３Ｄペトリディッシュ（登録商標）マイクロモールド（Ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅｓ、 Ｉｎｃ．、プロビデンス、ロードアイランド州、米国）からアガロースゲルをキャストした。アガロースゲルは、オートクレーブ滅菌した粉末アガロース（低ＥＥＯ／多目的／分子生物学グレード、Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３０２５６．ＦＳ）に１．５～２％（重量／体積）になるまで溶解して作成した。円形マイクロウェルを備えたマイクロモールドを使用して、スフェロイド形状の微小組織を作成した。スフェロイドのための円形マイクロウェルは直径４００～８００μｍで、ゲルごとに３５、９６、または２５６個のマイクロウェルが含まれていた。

【0080】

追加として、または代替的に、組織工学分野の当業者であれば、コンピュータ支援デザイン（例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｗｏｒｋｓ、マサチューセッツ州コンコード）を使用して、所望のゲル特徴のテンプレート（例えば、細胞播種チャンバー、半球底状の底を持つ７２１個のマイクロウェル、深さ８００μｍ×幅６００μｍ）を作成することができるであろう。次いで、プロトタイピングマシン（例えば、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）プラスチック（Ｐｒｏｔｏｌａｂｓ）で構成される）を使用して、ネガティブプラスチックモールドを生成することができる。次に、ネガティブを充填して（例えば、シリコーンゴムコンパウンド；ＭＯＬＤＭＡＸ（商標）２５、Ｓｍｏｏｔｈ－Ｏｎ、Ｍａｃｕｎｇｉｅ、ＰＡ）ポジティブ複製を作成することができる。ポジティブ複製物は使用前に洗浄され（例えば、７０％エタノールを用い、その後、蒸留水でリンスされる）、オートクレーブされる。その後、組織工学の当業者は、例えばＮａｐｏｌｉｔａｎｏら（２００７） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４３（４）：４９４、４９６～５００ページの方法に従って、無菌環境において、溶融した１．５～２％アガロースＰＢＳ溶液の４ｍＬアリコートを、各シリコンモールドにピペッティングすることによって、シリコンモールドから直接マイクロウェルを備えたアガロースゲルをキャストすることができる。

【0081】

マイクロウェルを備えたアガロースゲルに、スフェロイドマイクロウェル当たり５００～４０００細胞の密度で、トリプシン処理し、計数した細胞を播種した。細胞はアガロースゲル内の各マイクロウェル内で凝集し、細胞播種後４～２４時間で、マイクロウェル当たり１つのスフェロイド形状の微小組織に自己集合した。

【0082】

マイクロウェル内の細胞は、細胞播種後３、６、９または１２日間、５％ＣＯ^２、３７℃の加湿インキュベーター内で、３日ごとに培地を交換しながら培養された。

【0083】

微小組織の視覚検査。

【0084】

アガロースゲル中の微小組織を、カメラ付き倒立型光学顕微鏡（例えば、Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ２、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１または同等装置）で検査し、微小組織のサイズを調べた。微小組織の断面積は、ＩｍａｇｅＪ （米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）を使用して測定した。

【0085】

微小組織の組織学を検査する。

【0086】

異なる日数、培養した微小組織を、アガロースゲル中、１０％緩衝ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ ４２７０９８）で固定し、パラフィン包埋し、５μｍで切片化した後、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはシリウス・レッド（商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、ペンシルベニア州ウォリントン、２４９０１－２５０）で染色し、それぞれ微小組織の形態または線維状コラーゲンの沈着を検査した。

【0087】

線維状コラーゲン構造微小組織を検査する。

【0088】

異なる日数、培養した微小組織を、アガロースゲル中、１０％緩衝ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ ４２７０９８）で固定した。線維状コラーゲンは、線維状コラーゲンの第二高調波信号を選択するため、励起波長が７９０ｎｍに設定されたＭａｉ Ｔａｉ ＨＰ波長可変レーザーおよび４０５／４０フィルターキューブを備えたオリンパスＦＶ－１０００－ＭＰＥ多光子顕微鏡（オリンパス、東京、日本）を使用して視覚化された。１０％緩衝ホルマリンで固定した微小組織を、ＰＢＳに浸した２５倍（開口数１．０５、作動距離２ｍｍ）の対物レンズを使用してアガロースゲル中で画像化した。

【0089】

微小組織のプロテオミクスを検査する。

【0090】

アガロースゲル中の微小組織をＰＢＳで３回洗浄し、その後チューブに収集した。微小組織のプロテオミクス分析のために、Ｎａｂａら（２０１５） Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ、２０１５（１０１）：ｐ． ｅ５３０５７によって以前に記載されているようにＥＣＭ濃縮およびプロテオミクス処置を使用して、微小組織を脱細胞化し、ＥＣＭタンパク質を濃縮した。データ依存取得（ｄａｔａ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）（ＤＤＡ）による質量分析およびＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．３ （１％ ＦＤＲ）を用いたデータ分析を、ＥＣＭタンパク質のプロテオミクス分析に使用した。Ｓｃｈｗａｎｈａｕｓｓｅｒら（２０１１） Ｎａｔｕｒｅ、２０１１． ４７３（７３４７）：３３７～４２ページによって記載されている確立されたｉＢＡＱアルゴリズムを使用して、個々のタンパク質の総強度を長さ６～３０アミノ酸の間のトリプシンペプチドの理論数で割ることにより、ＥＣＭ成分を半定量化した（総ＥＣＭタンパク質の％モル） （ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓ、ＳＩＢ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）。

【0091】

微小組織の脱細胞化。

【0092】

アガロースゲル中の微小組織をＰＢＳで３回洗浄した。微小組織の脱細胞化は、微小組織がアガロースゲル内に残った状態で完了するか、または微小組織がチューブに収集された後に完了する。ゲルまたはチューブ内の微小組織は、最初に、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ； ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＩ７８４３９）を含む滅菌ＰＢＳ中の２０ｍＭ ＮＨ_４ＯＨ （ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、０９８５９）中の０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００ （ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス、Ｔ９２８４）で、インキュベーションごとに６０ｒｐｍで４５分間、３ラウンド処理し、その後、滅菌ＰＢＳ ＋ ＰＩで、インキュベーションごとに６０ｒｐｍで４５分間、３ラウンド洗浄し、その後ＤＮａｓｅ Ｉ （ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、４７１６７２８００１） ＋ＲＮａｓｅ Ａ （Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ、１９１０１） ＋ ＰＩを用い、６０ｒｐｍ回転、７２時間で、１ラウンドのインキュベーションに供し、その後、滅菌ＰＢＳ ＋ ＰＩで、インキュベーションごとに６０ｒｐｍ回転で４５分間、３ラウンド洗浄する。得られた脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルは、目視検査および機械的試験のために滅菌ＰＢＳ中、４℃で保存され、組織学的分析のために１０％緩衝ホルマリンで固定されるか、またはその後の生化学分析のために液体窒素中で瞬間凍結され、－８０℃で保存された。

【0093】

脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルの目視検査。

【0094】

アガロースゲル中の脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルを、脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルのサイズおよび構造を調べるため、以前に記載したようにカメラを備えた倒立光学顕微鏡で検査した。滅菌ＰＢＳ中のチューブ内の脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルをボルテックスしてからｉＰｈｏｎｅで写真撮影するか、または滅菌２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、 ＮＹ、 ３５２７）に移し、その後、以前に記載のように倒立光学顕微鏡で画像化した。

【0095】

脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルの組織学を検査する。

【0096】

アガロースゲル中の脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルをアガロースゲル中、１０％緩衝ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ ４２７０９８）で固定し、パラフィン包埋し、５μｍで切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはシリウス・レッド（商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、ペンシルベニア州ウォリントン、２４９０１－２５０）を用いて染色し、脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルの細胞核または線維状コラーゲン沈着の存在をそれぞれ検査する。

【0097】

脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルのｄｓＤＮＡ濃度を検査する。

【0098】

脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルのＤｓＤＮＡ濃度は、Ｂｌａｈｅｔａら（１９９８） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９８年２月１日；２１１（１～２）：１５９～６９ページによって以前に記載されているように測定された。チューブに収集した脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルをソニケーター内でパパイン溶液（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｐ４７６２、１２５μｇ／ｍＬ）中、６５℃で７２時間消化した。消化されたＥＣＭのｄｓＤＮＡ濃度は、製造業者のプロトコールに従って、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（商標）ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ７５８９）を使用して測定された。

【0099】

微小組織のコラーゲン含有量を検査する。

【0100】

微小組織のコラーゲン含有量は、Ｃｉｓｓｅｌｌら（２０１７） Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１７年４月； ２３（４）：２４３～２５０ページによって以前に記載されているように測定された。微小組織は１０％ホルマリンで固定され、さらに処理されるまで４℃で保存された。固定した微小組織をチューブに収集し、１Ｘ ＰＢＳで３回洗浄し、パパイン溶液（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｐ４７６２、１２５μｇ／ｍＬ）中でソニケーター内、６５℃で１０日間消化した。消化された微小組織は、Ｃｉｓｓｅｌｌら（２０１７年）によって記載された修飾ヒドロキシプロリンアッセイを使用して測定された。

【0101】

微小組織の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）含有量を検査する。

【0102】

微小組織のｓＧＡＧ含有量は、Ｆａｒｎｄａｌｅら、（１９８２） Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ９（４）：２４７～２４８ページ、およびＷｈｉｔｌｅｙら、（１９８９） Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３５（３）：３７４～３７９ページによって記載された１，９－ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）アッセイを使用して測定された。微小組織は１０％ホルマリンで固定され、さらに処理されるまで４℃で保存された。固定した微小組織をチューブに収集し、１Ｘ ＰＢＳで３回洗浄し、パパイン溶液（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｐ４７６２、１２５μｇ／ｍＬ）中でソニケーター内、６５℃で１０日間消化した。消化された微小組織は、Ｆａｒｎｄａｌｅら、（１９８２年）およびＷｈｉｔｌｅｙら、（１９８９年）によって記載されるようにＤＭＭＢアッセイを使用して測定された。

【0103】

脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルのプロテオミクスを検査する。

【0104】

チューブに収集された脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルは、微小組織のプロテオミクス分析のために、Ｎａｂａら、（２０１５） Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ、２０１５（１０１）： ｐ． ｅ５３０５７によって以前に記載されるようにプロテオミクス処置を受けた。データ依存取得（ＤＤＡ）による質量分析およびＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．３ （１％ ＦＤＲ）によるデータ分析をＥＣＭタンパク質のプロテオミクス分析に使用した。Ｓｃｈｗａｎｈａｕｓｓｅｒら（２０１１） Ｎａｔｕｒｅ、２０１１． ４７３（７３４７）：３３７～４２ページによって記載されている確立されたｉＢＡＱアルゴリズムを使用して、個々のタンパク質の総強度を長さ６～３０アミノ酸の間のトリプシンペプチドの理論数で割ることにより、ＥＣＭ成分を半定量化した（総ＥＣＭタンパク質の％モル） （ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓ、ＳＩＢ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）。

【0105】

ＥＣＭモルセルの機械的剛性を検査する。

【0106】

試験されたサンプルは脱細胞化プロセスを経て、コラーゲンでコーティングされたカバースリップ上にプレーティングされ、試験前にカバースリップ上で、４℃で４８時間インキュベートされた。力の測定は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｕ落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、シカゴ、イリノイ州）に接続された原子間力顕微鏡（ＡＦＭ、ＭＦＰ－３Ｄ－ＢＩＯ、Ａｓｙｌｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州サンタバーバラ）を使用して収集された。使用したカンチレバーのバネ定数は０．０３Ｎ／ｍであった。系統的な誤差を考慮するために、さまざまなサンプルに対して複数の試験セッションが実行された。フォース対押し込みのデータは、ヘルツ接触モデルを利用したカスタムＭＡＴＬＡＢスクリプト（Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、マサチューセッツ州ナティック）を使用して分析された。

【0107】

全ての実験は、室温の流体環境で行われた。偏向レーザーおよび／またはピエゾドリフトを最小限に抑えるために、試験前にＡＦＭを平衡化させた。コンタクトモードでのフォースマッピング技術を使用して、さまざまなサンプルについてフォースマップが収集された。簡単に述べると、目的領域にわたる離散点で個々のフォースカーブが取得された。分析中、データの空間配置は、弾性率値のマトリックスを作成するために保持された。フォース－押し込みのデータは、５ｋＨｚ、１０μｍ／秒の接近速度でサンプリングされた。全てのサンプルに対して、約４ｎＮのトリガーフォースを使用し、たわみを１００ｎＭに設定した。使用したスキャンサイズは５μｍ、解像度は４×４ポイントであった。

【0108】

ＥＣＭモルセルの注射可能性を試験する。

【0109】

胎児心臓微小組織を単一のチューブに収集し、脱細胞化した。チューブ内の脱細胞化培養胎児心臓ＥＣＭをボルテックス後、カメラで画像化した（図６Ａ）。その後、チューブ内の培養胎児心臓ＥＣＭを２７ゲージのシリンジ（内径０．２１ｍｍ）に１０回通過させ、シリンジ通過後、再度チューブ内の培養ＥＣＭを画像化した。

【0110】

培養胎児心臓ＥＣＭの一部を、滅菌したトランスファーピペット（広い開口部を持つ）を使用して、２％ （ｗ／ｖ）アガロースの薄層を敷いた２４ウェルプレートの清潔なウェルに移し、１０倍の対物レンズを備えたニコン製の顕微鏡下でイメージングした（図６Ｂ）。外科的な培養ＥＣＭ注射プロセスを模倣するために、１ｍＬ滅菌シリンジのプランジャーを取り外し、滅菌したトランスファーピペットを用いて培養胎児心臓ＥＣＭを２７ゲージの針に接続した１ｍＬシリンジの開口端に移した。その後、シリンジプランジャーを、培養ＥＣＭを含むシリンジの開口端に戻した。その後、培養胎児心臓ＥＣＭを２７ゲージの針に通過させて、２％ （ｗ／ｖ）アガロースの薄層を敷いた２４ウェルプレートの未使用のウェルに直接１回入れ、１０倍の対物レンズを備えたニコン製の顕微鏡下でイメージングした（図６Ｂ）。

【0111】

ＥＣＭモルセルのインビトロ生体適合性を検査する。

【0112】

脱細胞化した成人または胎児の心臓ＥＣＭモルセルにＨＣＭまたはＨＣＭＥＣを播種し、２４時間インキュベートした。増殖を検査するために、細胞播種の２４時間後にヌクレオシドアナログＥｄＵ （５－エチニル－２’－デオキシウリジン）を添加した。ＥｄＵ中のＥＣＭモルセル上の細胞をさらに２４時間（ＨＣＭＥＣ）または４８時間（ＨＣＭ）培養した後、製造業者のプロトコールに従って、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ（商標）ＥｄＵ細胞増殖キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して免疫組織化学的評価のために１０％ホルマリンで固定した。

【0113】

実施例２
結果
さまざまなヒト細胞から作られたスフェロイド状のＥＣＭ微小組織はＥＣＭを沈着する。

【0114】

８つの異なるタイプのヒト微小組織が、ＴＧＦ－β１を含むかまたは含まないヒト肺線維芽細胞（ＬＦ）、ＴＧＦ－β１を含むかまたは含まない線維化ヒト肺線維芽細胞（ＩＰＦ）、ＣＯＰＤヒト肺線維芽細胞（ＣＯＰＤ）、成人ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）、胎児ヒト心臓線維芽細胞（ＨＦＣＦ）、ＨＣＦとヒト心筋細胞（ＨＣＭ）およびヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＣＭＥＣ）との三種培養物、ならびに以前に記載のＨＦＣＦ、ＨＣＭおよびＨＣＭＥＣの三種培養物から生成された。図４は、播種６日後の明視野における９つの異なるタイプのＥＣＭ微小組織のうちの８つを示し、図７は、８つのＥＣＭ微小組織全てにおける線維状コラーゲン（一般的なタイプのＥＣＭ）の存在についてＨ＆Ｅおよびシリウス・レッド（商標）で染色した微小組織切片を示す。図７Ｂおよび図８は、成人の心臓微小組織ではなくヒト胎児の心臓微小組織のサイズが成長し、培養時間にわたって線維状コラーゲンの沈着が増加し、より大きな線維状コラーゲンのリモデリングを示したことを説明する図である。

【0115】

図９は、多光子共焦点第二高調波発生（ＳＨＧ）顕微鏡下で、ヒト成人健康肺ＥＣＭ微小組織（図９Ａ）が、ヒト線維化肺（図９Ｂ）およびヒト成人健康心臓ＥＣＭ微小組織（図９Ｃ）とは異なる原線維状コラーゲン構造を持っていたことを示す図である。

【0116】

プロテオミクス分析により、ＥＣＭタンパク質組成物微小組織は、微小組織の作成に使用される細胞のタイプに依存することが示された。

【0117】

微小組織のＥＣＭ濃縮後、プロテオミクスを実行して、さまざまなヒトＥＣＭ微小組織のＥＣＭ組成物を分析した。表１は、９つのタイプのヒトＥＣＭ微小組織のうち７つについて、各タンパク質のクラスの割合を示している。

【0118】

【表1】

【0119】

ヒトＥＣＭ微小組織のコラーゲンおよびｓＧＡＧ含有量は、組織および年齢に特異的である。ＥＣＭ微小組織の消化後、修正ヒドロキシプロリンアッセイおよびＤＭＭＢアッセイをそれぞれ使用して、コラーゲンおよびｓＧＡＧの含有量を評価した。表２は、８つのタイプのヒトＥＣＭ微小組織のうち５つについて、スフェロイド微小組織の細胞１００万個当たりのコラーゲンおよびｓＧＡＧ含有量をマイクログラム単位で示している。

【0120】

【表2】

【0121】

スフェロイド形状の微小組織は、マイクロウェルを備えたアガロースゲル内で脱細胞化され、ＥＣＭをモルセル幾何学形状に保持しながら細胞核を効率的に除去できる。以前に記載したように、６つの異なるタイプの脱細胞化ヒトＥＣＭモルセルは、ＴＧＦ－β１を含むかまたは含まないヒトＬＦ、ＴＧＦ－β１を含むかまたは含まないＩＰＦ、ＨＣＦ、およびＨＦＣＦから生成された。図４は、播種６日後の明視野における個々のマイクロウェル内の６つの異なるタイプの脱細胞化ＥＣＭモルセルを示し、図７は、６つ全ての脱細胞化ＥＣＭモルセルにおける、細胞核の不在を示すＨ＆Ｅを用いて染色した脱細胞化モルセル切片、および脱細胞化後の線維状コラーゲン（一般的なタイプのＥＣＭ）の存在を示すシリウス・レッド（商標）を示す。

【0122】

スフェロイド状の微小組織はチューブに収集され、その後、脱細胞化されモルセルとして保持される。

【0123】

図５は、胎児および成人のヒト心臓ＥＣＭスフェロイド微小組織を１つのチューブに収集し、脱細胞化し、混合した場合、得られた脱細胞化された胎児および成人のヒト心臓ＥＣＭモルセルは、脱細胞化処置後に、さらなる処理を行わずにそのスフェロイド形状を維持することを示す。

【0124】

脱細胞化された胎児ヒト心臓ＥＣＭモルセルをさらに処理することなく２７Ｇシリンジに１０回通過させた図６。

【0125】

成人または胎児心臓線維芽細胞で作成された脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルは、５０ｎｇ／ｍｇ未満のＥＣＭ乾燥重量ｄｓＤＮＡを有していた。

【0126】

脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルの機械的剛性は、組織および年齢に特異的である。

【0127】

脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルの機械的剛性（弾性率）を、ＡＦＭを使用して測定した。図１０は、９つのタイプのヒト脱細胞化微小組織ＥＣＭモルセルのうちの３つについてのｋＰａ単位の弾性率、Ｚｉｌｅ ＭＲら、（２０１５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２０１５；１３１（１４）：１２４７～５９ページおよびＧｕｉｍａｒａｅｓ ＣＦら、（２０２０） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２０２０；５（５）：３５１～７０ページによって引用された健康なヒト心臓組織の範囲、ならびにＳｉｎｇｅｌｙｎ ＪＭら、（２０１１） Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ． ２０１１；１１（６）：７３１～８ページに引用されるように固化した注射可能なハイドロゲルの等価弾性率（コラーゲン、マトリゲル、０．１％グルタルアルデヒドで架橋したかまたは架橋していないブタ心筋ＥＣＭ）を示している。Ｎｅｍｉｒ Ｓら、（２０１０） Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ． ２０１０；３８（１）：２～２０ページで引用されているように、ポアソン比ν～０．５を仮定すると、等価弾性率は貯蔵弾性率のレオロジー測定値の３倍となる。

【0128】

培養ＥＣＭはインビトロにおいて生体適合性である。

【0129】

生体適合性を試験するために、胎児心臓微小組織を個々のアガロースマイクロウェル内に置いたまま脱細胞化し、洗浄した（インサイツ脱細胞化）。得られた脱細胞化培養ヒト胎児心臓ＥＣＭは、マイクロウェル内に留まった（図１１）。その後、ヒト心筋細胞（ＨＣＭ）および心臓微小血管内皮細胞（ＨＣＭＥＣ）をアガロースモールド上に播種した。細胞は重力によって培養されたＥＣＭ上に沈降した。細胞は容易に接着し、ＥＣＭ上で生存した（図１１）。細胞はまた、ＥＣＭなしで培養した場合よりも大きな増殖を示した（図１１）。

【0130】

その後、プロテオミクスを実行して、脱細胞化されたＥＣＭモルセルのＥＣＭ組成物を分析した。

【0131】

実施例３
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、ＭＩを治療する方法において使用される。組成物はエアロゾルの形態で患部に適用される。心臓組織は１６週間以内に再生する。

【0132】

実施例４
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、ＭＩを治療する方法において使用される。組成物はパッチの形態で患部に適用される。心臓組織は１２週間以内に再生する。

【0133】

実施例５
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、ＭＩを治療する方法において使用される。この組成物は、注射によって患部に適用される。心臓組織は２４週間以内に再生する。

【0134】

実施例６
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、創傷を治療する方法において使用される。この組成物は、注射によって患部に適用される。組織は２０週間以内に再生する。

【0135】

実施例７
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、創傷を治療する方法において使用される。組成物は患部に局所的に適用される。組織は３２週間以内に再生する。

【0136】

実施例８
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、創傷を治療する方法において使用される。組成物はパッチの形態で患部に適用される。組織は１６週間以内に再生する。

【0137】

実施例９
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、美容状態を治療する方法において使用される。組成物は、注射によって所望の治療領域に適用される。

【0138】

最後に、本明細書の態様は、特定の実施形態を参照することによって強調されているが、当業者であれば、これらの開示された実施形態が、本明細書に開示される主題の原理の単なる例示にすぎないことを容易に理解するであろうことが理解されるべきである。したがって、開示された主題は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および／または試薬などに決して限定されないことが理解される。したがって、本明細書の精神から逸脱することなく、本明細書の教示に従って、開示された主題のさまざまな修正または変更、または代替的な構成を為すことができる。最後に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としているのであって、特許請求の範囲によってのみ定義される本開示の範囲を限定することを意図するものではない。したがって、本開示の実施形態は、正確に図示され説明されたものに限定されない。

【0139】

本明細書に記載の方法およびデバイスを実行するための発明者が知る最良のモードを含む特定の実施形態が本明細書に記載される。もちろん、これらの記載された実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、適用される法律によって認められる、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載された主題の全ての変更および均等物を含む。さらに、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、上述の実施形態のあらゆる可能な変形における任意の組み合わせが本開示に包含される。

【0140】

本開示の代替的な実施形態、要素、またはステップのグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個別に、または本明細書に開示された他のグループメンバーとの任意の組み合わせで参照および請求され得る。利便性および／または特許性の理由から、グループの１つまたは複数のメンバーが、グループに含まれたり、グループから削除されたりする場合があることが予想される。このような包含または削除が行われた場合、本明細書は変更されたグループを含むものとみなされ、したがって、添付の特許請求の範囲で使用される全てのマーカッシュグループの記述を満たすものとみなされる。

【0141】

別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される特徴、項目、量、パラメータ、特性、期間などを表す全ての数値は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。本明細書で使用される「約」という用語は、そのように修飾された特徴、項目、数量、パラメータ、特性、または期間が、記載された特徴、項目、数量、パラメータ、特性、または期間の値の上下にプラスマイナス１０パーセントの範囲を包含することを意味する。したがって、別段の指示がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、変動する可能性がある近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に均等論の適用を制限する試みではないが、各数値表示は、少なくとも報告された有効桁数を考慮して、通常の丸め手法を適用して解釈されるべきである。本開示の広範な範囲を示す数値範囲および数値が近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載される数値範囲および数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、いかなる数値範囲または値にも、それぞれの試験測定で見出された標準偏差から必然的に起因する一定の誤差が本質的に含まれている。本明細書における値の数値範囲の記載は、その範囲内にある各々の個別の数値を個別に参照する簡単な方法としての役割を単に意図するものである。本明細書に別段の指示がない限り、数値範囲の個々の値は、あたかも本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0142】

本開示を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）で使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および類似の指示対象は、別段の指示がない限り、または明らかに文脈と矛盾していない限り、単数形および複数形の両方を包含するものと解釈されるべきである。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供されるあらゆる例、または例示的な文言（例えば、「など（のような）」）の使用は、単に開示をより良く説明することを意図したものであり、別途請求される範囲に制限を限定するものではない。本明細書のいかなる文言も、本明細書に開示された実施形態の実施に不可欠な非請求要素を示すものとして解釈されるべきではない。

【0143】

本明細書に開示される特定の実施形態は、特許請求の範囲において、からなる、またはから本質的になるという文言を使用して、さらに限定され得る。特許請求の範囲で使用される場合、出願されたものであるか、補正によって追加されたものであるかにかかわらず、「からなる」という移行用語は、特許請求の範囲で特定されていない要素、ステップ、または成分を除外する。「から本質的になる」という移行用語は、特許請求の範囲を特定の材料またはステップ、および基本的および新規な特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。そのように請求される本開示の実施形態は、本質的にまたは明示的に本明細書に記載され、有効化される。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【手続補正書】

【提出日】2023-08-31

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脱細胞化哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む、カスタマイズされた流動性組成物であって、
物理的特性、生化学的／化学的特性、機械的特性、またはコラーゲン構造の少なくとも１つにおいて、インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルを含むＥＣＭを含む、カスタマイズされた流動性組成物。

【請求項2】

前記インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、異なる物理的特性を含む、請求項１に記載のカスタマイズされた流動性組成物。

【請求項3】

前記インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、異なる生化学的／化学的特性を含む、請求項１に記載のカスタマイズされた流動性組成物。

【請求項4】

前記インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、異なる機械的特性を含む、請求項１に記載のカスタマイズされた流動性組成物。

【請求項5】

前記インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、異なるコラーゲン構造を含む、請求項１に記載のカスタマイズされた流動性組成物。

【請求項6】

カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）モルセルを生産する方法であって、以下のステップ：
培養哺乳動物細胞をマイクロウェルに播種するステップであって、前記培養哺乳動物細胞が、前記培養哺乳動物細胞およびＥＣＭから構成されるＥＣＭ微小組織を生成し、前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含み、前記ヒト細胞が、心臓細胞および肺細胞のうちの少なくとも１つを含む、ステップ；
前記ＥＣＭ微小組織を収集するステップ；ならびに
前記ＥＣＭ微小組織を脱細胞化するステップ、を含み、
ここで、前記カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物ＥＣＭモルセルが、物理的特性、生化学的／化学的特性、機械的特性、またはコラーゲン構造のうちの少なくとも１つにおいて、インビボ由来のＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルを含む、方法。

【請求項7】

前記ヒト細胞が心臓細胞を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ヒト細胞が肺細胞を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記脱細胞化するステップが、前記微小組織を界面活性剤、緩衝液、ＤＮＡｓｅ、またはＲＮａｓｅのうちの少なくとも１つと混合するステップを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項10】

前記ＥＣＭ微小組織が球状粒子を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項11】

前記ＥＣＭ微小組織が、８００μｍ未満または８００μｍに等しい直径を有する球状粒子を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記細胞が組換えヒト細胞を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項13】

前記細胞が、心臓線維芽細胞、心筋細胞、および心臓微小血管内皮細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項14】

培養哺乳動物細胞をマイクロウェルに播種するステップであって、前記培養哺乳動物細胞が、前記培養哺乳動物細胞およびＥＣＭから構成されるＥＣＭ微小組織を生成する、ステップ；
前記ＥＣＭ微小組織を収集するステップ；ならびに
前記ＥＣＭ微小組織を脱細胞化するステップ、を含む方法によって作製された脱細胞化哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む、カスタマイズされた流動性組成物であって、
物理的特性、生化学的／化学的特性、機械的特性、またはコラーゲン構造のうちの少なくとも１つにおいて、インビボ由来のＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルを含むＥＣＭを含む、カスタマイズされた流動性組成物。

【請求項15】

前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記ヒト細胞が、心臓細胞および肺細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記ヒト細胞が心臓細胞を含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記ヒト細胞が肺細胞を含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項19】

前記脱細胞化するステップが、前記哺乳動物細胞を界面活性剤、緩衝液、ＤＮＡｓｅ、またはＲＮａｓｅのうちの少なくとも１つと混合するステップを含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項20】

前記方法が、前記混合物をシリンジに通過させるステップをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記シリンジが２７Ｇの針を含む、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記細胞が組換えヒト細胞を含む、請求項１５に記載の組成物。

【請求項23】

前記細胞が、心臓線維芽細胞、心筋細胞、および心臓微小血管内皮細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の組成物。

【請求項24】

心血管系の損傷を治療する方法であって、前記損傷の領域に脱細胞化ＥＣＭ組成物を投与することを含む方法。

【請求項25】

前記心血管系の損傷が心筋梗塞の結果である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記ＥＣＭがヒト細胞由来である、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

前記ヒト細胞が、心臓細胞および肺細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ヒト細胞が心臓細胞を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ヒト細胞が肺細胞を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

美容状態を治療する方法であって、脱細胞化ＥＣＭ組成物を所望の治療領域に投与するステップを含む方法。

【請求項31】

前記ＥＣＭがヒト細胞由来である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記マイクロウェルに足場がない、請求項６に記載の方法。

【請求項33】

前記マイクロウェルに足場がない、請求項１４に記載の組成物。

【請求項34】

前記インビボ由来ＥＣＭの物理的または生化学的／化学的プロファイルとは異なる前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、哺乳動物細胞の起源、哺乳動物細胞の年齢、哺乳動物細胞の疾患状態、または哺乳動物細胞の培養条件のうちの少なくとも１つの改変によって達成される、請求項６に記載の方法。

【請求項35】

前記改変が、細胞培養培地の組成、培養時間、酸素レベル、または追加の生物学的因子の存在もしくは量のうちの少なくとも１つを調整することを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項36】

前記追加の生物学的因子が、成長因子、サイトカイン、および薬物のうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項37】

カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）モルセルを生産する方法であって、以下のステップ：
培養哺乳動物細胞をマイクロウェルに播種するステップであって、前記培養哺乳動物細胞が、前記培養哺乳動物細胞およびＥＣＭから構成されるＥＣＭ微小組織を生成し、前記ＥＣＭ微小組織が８００μｍ未満または８００μｍに等しい直径を有する球状粒子を含む、ステップ；
前記ＥＣＭ微小組織を収集するステップ；ならびに
前記ＥＣＭ微小組織を脱細胞化するステップ、を含み、
ここで、前記カスタマイズされた脱細胞化哺乳動物ＥＣＭモルセルが、所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルを含む、方法。

【請求項38】

前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、物理的特性、生化学的／化学的特性、機械的特性、またはコラーゲン構造のうちの少なくとも１つを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、哺乳動物細胞の起源、哺乳動物細胞の年齢、哺乳動物細胞の疾患状態、または前記哺乳動物細胞の培養条件のうちの少なくとも１つの改変により達成される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、細胞培養培地の組成、培養時間、酸素レベル、および追加の生物学的因子の存在または量のうちの少なくとも１つを
改変することによって達成される、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

前記所望の物理的または生化学的／化学的プロファイルが、成長因子、サイトカイン、および薬物のうちの少なくとも１つを含む生物学的因子を添加することによって前記哺乳動物細胞の前記培養条件を改変することによって達成される、請求項３８に記載の方法。

【国際調査報告】