特表 2024-501276 Ｆｃ受容体ＣＡＲ構築物及び細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-11

(54)【発明の名称】Ｆｃ受容体ＣＡＲ構築物及び細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20231228BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20231228BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20231228BHJP

   C07K 14/735 20060101ALI20231228BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20231228BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20231228BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20231228BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K14/725

C07K19/00

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/19

C12N15/867 Z

C12N5/0783

C07K14/735

C07K14/705

C07K16/28

C12N15/63 Z

C12N5/10

A61P35/00

A61P35/02

A61K35/17

A61P31/12

【審査請求】有

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023538151

(86)(22)【出願日】2021-12-20

(85)【翻訳文提出日】2023-08-21

(86)【国際出願番号】 US2021064408

(87)【国際公開番号】W WO2022140284

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】63/129,340

(32)【優先日】2020-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520393015

【氏名又は名称】イミュニティーバイオ、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】ローラン、エイチ．ボワッセル

(72)【発明者】

【氏名】バリー、ジェイ．シモン

(72)【発明者】

【氏名】ウェンチエ、フー

(72)【発明者】

【氏名】ハンス、ジー．クリンゲマン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA92Y

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA05

4C087NA13

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZB33

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA42

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

治療用細胞内、特に、ＮＫ－９２細胞又はその誘導体内で組み換え細胞から好ましくは発現される、抗体結合ドメインを有するキメラ抗原受容体が提供される。特に、このような修飾細胞は、細胞毒性、改善されたオンターゲットの細胞殺滅、減少したオフターゲットの細胞殺滅の複数のモードを有し、組み換えＣＡＲのかなりの発現、及び／又は増加したＣＡＲ媒介性細胞毒性を示す。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組み換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
配列番号１２、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチドの抗体結合部分を有する抗体結合ドメインを含み；
前記抗体結合ドメインが、任意選択のヒンジ部分、膜貫通部分、及びシグナル伝達ドメインを配列中に含むポリペプチドに結合される、組み換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項2】

前記抗体結合ドメインが、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、及び配列番号３２からなる群から選択されるペプチド配列を有する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項3】

前記任意選択のヒンジ部分が、配列番号３のペプチド配列を有する、請求項１又は２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項4】

前記膜貫通部分が、配列番号５、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、又は配列番号８４のペプチド配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記シグナル伝達ドメインが、配列番号１のペプチド配列を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

少なくとも１つの第２のシグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記第２のシグナル伝達ドメインが、前記シグナル伝達ドメインと異なる、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

前記シグナル伝達ドメインが、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群から選択されるペプチド配列を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項9】

前記抗体結合ドメインが、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、及び配列番号３２からなる群から選択されるペプチド配列を有し、前記シグナル伝達ドメインが、配列番号１のペプチド配列を有する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項10】

前記任意選択のヒンジ部分が、配列番号３のペプチド配列を有する、請求項９に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項11】

前記膜貫通部分が、配列番号５、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、又は配列番号８４のペプチド配列を有する、請求項９又は請求項１０に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項12】

少なくとも１つのさらなるシグナル伝達ドメインをさらに含み、任意選択的に、前記さらなるシグナル伝達ドメインが、配列番号１のペプチド配列を有する、請求項９～１１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項13】

前記さらなるシグナル伝達ドメインが、配列番号１のペプチド配列を有する、請求項９～１２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項14】

前記キメラ抗原受容体が、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４ｘｘ、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、又は配列番号７２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項15】

前記キメラ抗原受容体が、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、又は配列番号７１のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項16】

請求項１～１３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする組み換え核酸。

【請求項17】

前記核酸が、ヒトコドン使用のためにコドン最適化される、請求項１６に記載の組み換え核酸。

【請求項18】

サイトカイン、ＣＤ１６、ホーミング受容体、及び／又はＴＧＦ－βトラップをコードする配列部分をさらに含む、請求項１６又は１７に記載の組み換え核酸。

【請求項19】

前記核酸が、前記キメラ抗原受容体をコードし、前記サイトカイン、前記ＣＤ１６、前記ホーミング受容体、及び／又は前記ＴＧＦ－βトラップをコードする前記配列部分が、ポリシストロニック核酸として構成される、請求項１８に記載の組み換え核酸。

【請求項20】

前記組み換え核酸が、レンチウイルスベクターの一部である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組み換え核酸。

【請求項21】

前記組み換え核酸が、ＤＮＡベクターの一部である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組み換え核酸。

【請求項22】

請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組み換え核酸でトランスフェクトされた細胞。

【請求項23】

前記細胞が、ＮＫ細胞又はＴ細胞である、請求項２２に記載の細胞。

【請求項24】

前記細胞が、ＮＫ－９２細胞、遺伝子組み換えＮＫ－９２細胞、又は自己ＮＫ細胞である、請求項２２に記載の細胞。

【請求項25】

請求項１～１３又は請求項１５のいずれか一項に記載の組み換えキメラ抗原受容体をコードする組み換え核酸でトランスフェクトされた組み換えＮＫ細胞。

【請求項26】

前記ＮＫ細胞が、ＮＫ－９２細胞、遺伝子組み換えＮＫ－９２細胞、又は自己ＮＫ細胞である、請求項２５に記載の組み換えＮＫ細胞。

【請求項27】

請求項１４～１９のいずれか一項に記載の組み換え核酸でトランスフェクトされた、請求項２５に記載の組み換えＮＫ細胞。

【請求項28】

癌を治療する必要がある患者の癌を治療する方法であって、治療有効量の、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の細胞を前記患者に投与し、それによって前記癌を治療することを含む、方法。

【請求項29】

ウイルス癌ワクチン、細菌癌ワクチン、酵母癌ワクチン、Ｎ－８０３、抗体、幹細胞移植、及び腫瘍標的化サイトカインからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる治療実体を投与する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記癌が、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、限定はされないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫などの肉腫及び癌腫を含む固形腫瘍から選択される、請求項２８又は２９に記載の方法。

【請求項31】

前記患者の体表面積のｍ^２当たり約１×１０^８～約１×１０^１１個の細胞が、前記患者に投与される、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

癌又はウイルス感染の治療における、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の細胞の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２０年１２月２２日に出願された出願番号６３／１２９，３４０号を有する本発明者らの同時係属中の米国仮特許出願に対する優先権を主張するものであり、この仮特許出願は、全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

配列表
１４４ＫＢのサイズであり、２０２１年１２月１６日に作成され、本出願と共にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、１０４０７７．００２１＿ＲＥＶ００５＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、全体が参照により本明細書に援用される。

【0003】

本発明の分野は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びこのようなＣＡＲを発現する組み換え細胞であり、特に、それらは、ＣＤ１６ Ｆｃ結合ドメイン、ＣＤ３２ Ｆｃ結合ドメイン、又はＣＤ６４ Ｆｃ結合ドメインなどの抗体のＦｃ部分に結合する抗原結合ドメインを有するＣＡＲに関する。

【背景技術】

【0004】

背景技術の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。それは、本明細書に示される情報のいずれかが先行技術であるか若しくは本明細書において権利請求される発明に関連すること、又は具体的に若しくは黙示的に言及されるいずれかの刊行物が先行技術であることを認めるものではない。

【0005】

本明細書における全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は本出願が、参照により援用されることが具体的に及び個々に示されているのと同程度に参照により援用される。援用される参考文献中の用語の定義又は使用が、本明細書に示されるその用語の定義と合致しない又は矛盾する場合、本明細書に示されるその用語の定義が適用され、参考文献中のその用語の定義は適用されない。

【0006】

多くの場合、治療用抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をもたらすために使用され得、これは、遺伝子組み換えＮＫ細胞を用いた様々な癌の免疫療法のための有望な手段となっている。ＡＤＣＣは、治療用抗体に結合し、抗体結合標的細胞に対するグランザイム及びグラニュリシン放出を引き起こすＣＤ１６受容体によって媒介される。しかしながら、残念ながら、ＣＤ１６受容体の発現は、多くの場合、急速に下方制御され、それによって天然ＮＫ細胞を用いたこれらの抗体の治療的有用性を制限する。さらに、天然ＮＫ細胞におけるＣＤ１６は、抗体のＦｃ部分に対する比較的低い親和性を有し、したがって、さらに治療的使用を制限する。より最近では、ＣＤ１６の高親和性形態を発現する組み換えＮＫ細胞が開発され（ｈａＮＫ細胞としてＮａｎｔＫｗｅｓｔから市販されている）、したがって、組み換えＣＤ１６変異体が下方制御に曝されず、抗体のＦｃ部分に対するより高い親和性を有するため、治療可能性を大幅に増加させている。

【0007】

別の手法において、ＣＤ１６細胞内及び膜貫通部分並びにＣＤ６４細胞外部分を有し、それによってＣＤ６４部分により増加した親和性でＡＤＣＣ能を維持するキメラタンパク質が生成された（例えば、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１８，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ ２８７３を参照）。概念的に魅力的である一方、様々な欠点が残っている。中でも特に、インビボ抗腫瘍活性は、証明されておらず、著者は、ＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ細胞が、連続殺滅にあまり効率的でないことがあると仮定した。さらなる試みにおいて、国際公開第２０１５／１７９８３３号パンフレットに記載されるように、ＣＤ６４の多量体が膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに結合されて、それによってＴ細胞がキメラ受容体を備えたハイブリッド構築物が製造され、これは、抗体結合によって誘導されるＴ細胞の細胞傷害性細胞殺滅を活性化することができた。

【0008】

さらに別の手法において、米国特許出願公開第２０１８／０１３３２５２号明細書に記載されるように様々なシグナル伝達ドメインに結合されたＣＤ１６Ｖドメインを含むキメラ抗原受容体が製造された。同様に、米国特許第７６１８８１７号明細書は、ＣＤ１６部分を用いて、ＮＫ－９２細胞内でレトロウイルス構築物から発現されたＣＡＲにおいて結合特異性を提供した特定のＣＡＲ構築物を記載していた。このような手法が、抗体に結合することが可能な組み換え細胞傷害性細胞をもたらした一方、このような細胞株の生成は、このような構築物が第２世代又は第３世代ＣＡＲ構築物である場合でさえ、天然の細胞毒性の喪失若しくは減少、天然ＮＫ細胞と比較して、減少したオンターゲットの細胞殺滅及び／又は増加したオフターゲットの細胞殺滅、組み換えＣＡＲの弱められた発現、及び／又はＣＡＲ構築物の少なくとも一部についての減少したＣＡＲ媒介性細胞毒性に関連することが多い。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

したがって、抗体のＦｃ部分に結合するＣＡＲの様々なシステム及び方法が、当該技術分野において公知であるが、それらの全て又はほとんど全てには、いくつかの欠点がある。したがって、細胞毒性、改善されたオンターゲットの細胞殺滅、減少したオフターゲットの細胞殺滅、組み換えＣＡＲのかなりの発現、及び／又は増加したＣＡＲ媒介性細胞毒性の複数のモードを有する改善されたＣＡＲ及びＣＡＲ発現細胞のための組成物及び方法が依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の主題は、組み換えＣＡＲ及びこのようなＣＡＲを発現する細胞の様々な組成物及び方法に関し、ここで、このような細胞は、細胞毒性、改善されたオンターゲットの細胞殺滅、減少したオフターゲットの細胞殺滅、組み換えＣＡＲのかなりの発現、及び／又は増加したＣＡＲ媒介性細胞毒性の複数のモードを示す。

【0011】

本発明の主題の一態様において、本発明者らは、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチドの抗体結合部分を有する抗体結合ドメインを含む組み換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を想定している。このようなＣＡＲにおいて、抗体結合ドメインは、任意選択のヒンジ部分、膜貫通部分、及びシグナル伝達ドメインを配列中に含むポリペプチドにさらに結合される。

【0012】

選択された実施形態において、抗体結合ドメインは、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、及び配列番号３２からなる群から選択されるペプチド配列を有する。典型的に、ヒンジ部分は、配列番号３のペプチド配列を有し、膜貫通部分は、配列番号５、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、又は配列番号８４のペプチド配列を有し、及び／又はシグナル伝達ドメインは、配列番号１のペプチド配列を有する。さらなる想定される実施形態において、ＣＡＲは、最初のシグナル伝達ドメインと異なり得る少なくとも１つの第２のシグナル伝達ドメインを含み得る。例えば、ある実施形態において、シグナル伝達ドメインは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群から選択されるペプチド配列を有する。

【0013】

さらなる例示的な実施形態において、このようなＣＡＲ中の抗体結合ドメインは、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、及び配列番号３２からなる群から選択されるペプチド配列を有し、シグナル伝達ドメインは、配列番号１のペプチド配列を有する。好ましくは、ヒンジ部分は、配列番号３のペプチド配列を有し、及び／又は膜貫通部分は、配列番号５、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、又は配列番号８４のペプチド配列を有する。必要に応じて、ＣＡＲは、少なくとも１つのさらなるシグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号１の配列を有する又は他のシグナル伝達ドメイン）をさらに含み得る。

【0014】

さらなる想定される態様において、本発明者らは、本明細書に示されるキメラ抗原受容体をコードする組み換え核酸を想定している。好ましくは、必ずしもではないが、核酸は、ヒトコドン使用のためにコドン最適化される。さらに、核酸が、サイトカイン、ＣＤ１６、ホーミング受容体、及び／又はＴＧＦ－βトラップをコードする配列部分（これらは全て、ポリシストロニック配置で配置され得る）も含み得ることが考えられる。例えば、組み換え核酸は、レンチウイルスベクターの一部、又はＤＮＡベクターの一部であり得る。

【0015】

さらに他の想定される態様において、本発明者らは、本明細書に示される組み換え核酸でトランスフェクトされた（典型的に、哺乳動物）細胞を想定している。例えば、細胞は、ＮＫ細胞（例えば、ＮＫ－９２細胞、遺伝子組み換えＮＫ－９２細胞、又は自己ＮＫ細胞）又はＴ細胞である。異なる観点から見ると、本発明者らは、本明細書に記載される組み換えキメラ抗原受容体をコードする組み換え核酸でトランスフェクトされた組み換えＮＫ細胞（例えば、ＮＫ－９２細胞、遺伝子組み換えＮＫ－９２細胞、又は自己ＮＫ細胞）も想定している。

【0016】

その結果として、本発明者らは、必要としている患者における癌を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に示される細胞が、患者に投与され、それによって癌を治療する方法も想定している。最も典型的に、患者の体表面積のｍ^２当たり約１×１０^８～約１×１０^１１個の細胞が、患者に投与される。さらに、ウイルス癌ワクチン、細菌癌ワクチン、酵母癌ワクチン、Ｎ－８０３、抗体、幹細胞移植、及び／又は腫瘍標的化サイトカインなどの少なくとも１つのさらなる治療実体が、患者に投与され得る。例えば、治療されることが想定される癌としては、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、限定はされないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫などの肉腫及び癌腫を含む固形腫瘍が挙げられる。

【0017】

したがって、本明細書に示される細胞の使用が、癌の治療において想定される。

【0018】

本発明の主題の様々な目的、特徴、態様及び利点が、類似の数字が類似の構成要素を表す添付の図面と共に、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】本明細書に示される様々なキメラ抗原受容体の概略図である。

【図2】ａＮＫ細胞、ｈａＮＫ細胞、及びＣＤ１６－ＣＡＲ ２８．Ｅ細胞についての例示的なＣＤ１６ ＦＡＣＳスキャン結果を示す。

【図3】ｈａＮＫ細胞と比較した、ＮＫ感受性Ｋ５６２細胞に対するＣＤ１６－ＣＡＲ ２８．Ｅ細胞の細胞毒性についての例示的な結果を示す。

【図4】オンターゲット及びオフターゲット抗体の存在及び非存在下におけるＳＵＰ－Ｂ１５^{ＣＤ２０＋}細胞に対するＣＤ１６－ＣＡＲ ２８．Ｅ細胞のＡＤＣＣ活性についての例示的な結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明者らは、組み換えＣＡＲ及びこのようなＣＡＲを発現する細胞の様々な組成物及び方法を発見し、ここで、このような細胞が、細胞毒性、改善されたオンターゲットの細胞殺滅、減少したオフターゲットの細胞殺滅、組み換えＣＡＲのかなりの発現、及び／又は増加したＣＡＲ媒介性細胞毒性の複数のモードを示す。

【0021】

第１世代型構築物におけるシグナル伝達ドメインとしてＦｃεＲＩγを用いる様々なＣＡＲ構築物が、改善された発現を有し、このようなＣＡＲ構築物を発現するＮＫ－９２細胞内で増加した標的特異的殺滅を可能にしたという本発明者らによる以前の発見に基づいて、本発明者らは、様々な細胞、特に、ＮＫ－９２細胞及び遺伝子組み換えＮＫ－９２細胞を修飾して、このような細胞に、抗体（特に、ＩｇＧ抗体）のＦｃ部分に結合する高親和性ＣＡＲ構築物及びこのようなＣＡＲを発現する細胞のそのように強化された細胞傷害効果を備えさせることに着手した。実際に、これらのＣＡＲが、ＮＫ細胞において発現された場合、これらの細胞のＡＤＣＣが、非修飾ＮＫ細胞よりかなり増加された。

【0022】

予想外にも、以下により詳細に記載されるように、そのように生成された組み換えＮＫ細胞は、非修飾ＮＫ細胞、ＮＫ－９２細胞と比較して、ある場合には、ＣＤ１６を発現し、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ポリペプチド又はＣＤ３ζ鎖を共発現するＮＫ細胞とさらに比較して、細胞毒性、改善されたオンターゲットの細胞殺滅、減少したオフターゲットの細胞殺滅、組み換えＣＡＲのかなりの発現、及び／又は増加したＣＡＲ媒介性細胞毒性の複数のモードを有していた（例えば、米国特許第９１８１３２２号明細書において教示されるように）。

【0023】

好ましい実施形態において、本発明者らは、単一のポリペプチド鎖中に、抗体結合部分、続いて、順に、細胞外の任意選択のヒンジ部分、膜貫通部分、及び細胞内シグナル伝達ドメインを有する抗体結合ドメインを含むＣＡＲ構築物を想定している。細胞内シグナル伝達ドメインの特定の使用及び／又は配置に応じて、そのように調製されたＣＡＲ構築物が、第１、第２、又は第３世代ＣＡＲであり得ることが理解されるべきである。図１は、本明細書に示される教示に従って有用な想定されるＣＡＲを例示的に示す。例えば、第１世代ＣＡ構築物は、単一シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、より好ましくは、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを含み得る。特に、ＣＡＲ構築物が、第１世代構造を有していた場合、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するこのようなＣＡＲは、他のＣＡＲ構築物と比較して、ＮＫ細胞内で優れた特性を有していた。このような発見は、Ｔ細胞内のこれまで知られていた第１世代ＣＡＲが、第２及び第３世代ＣＡＲにおいて一般的に見られる、ＣＤ３ζ、４－１ＢＢ、又はＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び任意にさらなるシグナル伝達ドメインを有していたＣＡＲと比較して、比較的不十分に機能していたため、特に予想外であった。容易に理解されるように、想定されるＣＡＲは、複数のＦｃεＲＩγ及び／又はＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインも含み得る。

【0024】

さらなる例において、ＣＡＲ構築物は、少なくとも２つの異なる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよく、このようなＣＡＲ構築物の典型的な例は、図１の第２世代ＣＡＲ構築物において例示的に示されるように、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン又は４－１ＢＢシグナル伝達ドメインに結合されるものを含む。さらに、想定されるＣＡＲ構築物が、３つ以上のシグナル伝達ドメイン（これらは、典型的に、異なる）を含み得ることが留意され、例示的な第３世代ＣＡＲ構築物は、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢシグナル伝達ドメインに結合されるものを含む。当然ながら、細胞内シグナル伝達ドメインの特定の配列順序が変化し得、全ての配置が、本明細書における使用に好適であると見なされることが認識されるべきである。

【0025】

抗体結合ドメインに関連して、本明細書に示されるＣＡＲが、抗体のＦｃ部分、最も好ましくは、ＩｇＧのＦｃ部分に結合する、少なくとも抗体結合部分を有することが一般に想定される。しかしながら、代替的な態様において、Ｆｃ部分はまた、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＥを含む、ＩｇＧ以外の抗体クラスに属し得る。したがって、好適な抗体結合ドメインは、好ましくは、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、及びＣＤ６４Ｃの完全長ポリペプチド又は抗体結合部分を含み、あまり好ましくない態様において、プロテインＡ及びプロテインＧも含む。したがって、好適な完全長ポリペプチド又は抗体結合部分は、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３１で表されるアミノ酸配列（又はこれらの配列のそれぞれの部分）を有するか又は含むであろう。抗体結合部分が、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４の細胞外ドメインである場合、特に想定される細胞外ドメインは、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、及び配列番号３２で表されるアミノ酸配列（又はこれらの配列のそれぞれの部分）を有するか又は含むであろう。

【0026】

抗体結合ドメインのタイプにかかわらず、ほとんどの場合、抗体結合ドメインが、膜貫通部分と比べて抗体結合ドメインの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供するようにヒンジ部分を介して膜貫通部分に結合されることが理解されるべきである。しかしながら、特定の実施形態において、ヒンジ部分が、以下の一連の例のいくつかに示されるように省略されることが認識されるべきである。存在する場合、ヒンジ部分は、最も典型的に、必ずしもではないが、約５～１００個の（主に親水性）アミノ酸残基を有する短鎖フレキシブルポリペプチドである。したがって、好適な高い部分は、特に、配列番号３で表されるアミノ酸配列（又はその部分）を有するか又は含むＣＤ８ヒンジ部分（特に、ヒトＣＤ８ヒンジ部分）を含む。

【0027】

さらなる想定される態様において、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ抗体などの、抗体のヒンジドメインも、本明細書に記載されるキメラ受容体において使用するのに好適であると考えられる。ある実施形態において、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１及びＣＨ２に結合するヒンジドメインである。他の実施形態において、ヒンジドメインは、抗体のものであり、抗体のヒンジドメイン及び抗体の１つ以上の定常領域を含む。さらなる実施形態において、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン及び抗体のＣＨ３定常領域を含む。さらに他の実施形態において、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン並びに抗体のＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。

【0028】

さらなる好ましい態様において、抗体結合ドメイン及びヒンジ部分（存在する場合）は、膜貫通部分を介して細胞膜に固定される。例えば、ある実施形態において、本明細書に記載されるキメラ受容体の膜貫通ドメインは、Ｉ型１回膜貫通タンパク質に由来し得る。１回膜貫通タンパク質としては、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及びＦＧＦＲ２Ｂが挙げられる。好ましい例において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α又はＣＤ２８又はＣＤ３４に由来する。したがって、特に好ましい膜貫通部分は、配列番号５、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、又は配列番号８４で表されるアミノ酸配列（又は直前のアミノ酸配列のいずれかに関してその部分）を有するか又は含むであろう。

【0029】

さらに他の態様において、複数回膜貫通タンパク質からの膜貫通ドメインはまた、本明細書に記載されるキメラ受容体において使用するのに適合し得る。複数回膜貫通タンパク質は、複雑な（少なくとも２、３、４、５、６、７つ又はそれ以上の）αヘリックス又はβシート構造を含み得る。好ましくは、複数回膜貫通タンパク質のＮ末端及びＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在し、例えば、タンパク質のＮ末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し得、タンパク質のＣ末端は、細胞外側に存在し得る。複数回膜貫通タンパク質からの１つ又は複数のヘリックス通過のいずれかが、本明細書に記載されるキメラ受容体を構築するために使用され得る。

【0030】

本明細書に記載されるキメラ受容体において使用するための膜貫通ドメインは、合成、非天然タンパク質セグメントの少なくとも一部も含み得る。ある実施形態において、膜貫通ドメインは、合成、非天然αヘリックス又はβシートである。ある実施形態において、タンパク質セグメントは、少なくとも約２０のアミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例が、当該技術分野において、例えば、米国特許第７０５２９０６号明細書及び国際公開第２０００／０３２７７６号パンフレットにおいて公知であり、これらは両方とも、参照により本明細書に援用される。

【0031】

好適なシグナル伝達ドメインに関連して、表面受容体のシグナル伝達部分、例えば、ＣＤ３ζ及びＦｃεＲＩγ並びに共刺激タンパク質のシグナル伝達部分、例えば、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、及びＰＤＣＤ６）、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣｌ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦＳ、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、及び任意の他の共刺激分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙｌ、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、及びＮＫＧ２Ｃを含み得る全てのシグナル伝達部分（典型的に、細胞内）が、本明細書において使用するのに好適であると考えられることが一般に想定される。

【0032】

しかしながら、特に好ましいシグナル伝達ドメインとしては、配列番号９で表されるアミノ酸配列（又はその部分）を有するか又は含むＣＤ３ζ、配列番号１で表されるアミノ酸配列（又はその部分）を有するか又は含むＦｃεＲＩγ、配列番号７で表されるアミノ酸配列（又はその部分）を有するか又は含むＣＤ２８、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列（又はその部分）を有するか又は含む４－１ＢＢからのものが挙げられる。

【0033】

したがって、さらに別の観点から見ると、本発明者らは、表１に記載される様々なＣＡＲ構築物を想定し、表中で、ドメインのいずれか１つが、本明細書に示されるアミノ酸配列の１つ以上を用いて構築され得る。さらに、以下の表が、例示的な配列を列挙するが、アミノ酸変化が、表中に示される配列との少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９１％の同一性を有するように、同定される各配列が、１つ以上のアミノ酸変化を含み得ることが理解されるべきである。さらに、切断された配列が示される機能を依然として保持する限り、表中に示される配列が（いずれかの側又は両側で）より短い配列に切断され得ることも認識されるべきである。当然ながら、これらの配列が、エクスポート又はトラフィッキングのためのいずれかのさらなる配列部分（例えば、リーダーペプチド）を有さない成熟ポリペプチド配列を表すことが認識されるべきである。

【0034】

【表1】

【0035】

本発明の主題のさらなる態様において、本明細書に示されるポリペプチド配列だけでなく、本明細書において想定される配列をコードする核酸配列及び構築物も想定されることが認識されるべきである。当然ながら、容易に理解されるように、想定される核酸配列は、全てのコドン使用パターン、特に、ヒトコドン使用を利用し得る。さらに、組み換え核酸は、組み換え核酸でトランスフェクトされた細胞内のＣＡＲ構築物の発現をもたらすために全ての必要な調節要素も含むであろう。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスＬＴＲ、例えば、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ－ＬＴＲ、ＨＴＬＶ－１ ＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターなどを含む様々な公知のプロモーターが、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物の発現のために使用され得る。キメラ受容体の発現のためのさらなるプロモーターは、免疫細胞内の任意の構成的に活性なプロモーターを含む。或いは、任意の調節可能なプロモーターが、その発現が免疫細胞内で調節され得るように使用され得る。

【0036】

さらに、必要に応じて、組み換え核酸は、所望の機能を有する１つ以上のさらなるタンパク質をコードし得る１つ以上のさらなる配列部分を含み得る。例えば、好適なさらなる配列部分は、サイトカイン、特に、小胞体保留（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）配列を介して細胞内に保持され得る、ＩＬ－２及び／又はＩＬ１５などのＮＫ細胞の自己分泌増殖刺激に必要とされるサイトカイン、Ｎ－８０１、インターフェロンγなどの免役刺激サイトカイン、並びに細胞移動（例えば、ケモカイン受容体）又は腫瘍微小環境の調節（例えば、ＩＬ－８又はＴＧＦ－βトラップ）を助ける１つ以上の機能タンパク質を含むであろう。

【0037】

さらに、組み換え核酸は、選択可能マーカー遺伝子（例えば、宿主細胞内の安定した又は一過性トランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子）、増加したレベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子由来の１つ以上のエンハンサー／プロモーター配列、ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０由来の転写終結及びＲＮＡプロセシングシグナル、ＳＶ４０ポリオーマ複製起点及び細菌中の複製のためのＣｏｌＥｌ、１つ以上の内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳｅｓ）、多重クローニング部位、センス及びアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７及びＳＰ６ ＲＮＡプロモーター、誘発されると、ベクターを保有する細胞を死滅させる「自殺スイッチ」又は「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ｉＣａｓｐ９などの誘導性カスパーゼ）、及び／又はＣＡＲ構築物の発現を評価するための１つ以上のレポーター遺伝子などのさらなる機能要素を含有し得る。例示的なポリシストロニック構築物が、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／２２６７０８号パンフレットに記載されている。そのために、想定される核酸構築物は、同じｍＲＮＡによってコードされる等モルレベルのポリペプチドを生成するために、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、又はＦ２Ａペプチドなどの２Ａペプチドをコードする配列を含み得る。

【0038】

様々な他の核酸配列の中でも、例示的な核酸配列は、配列番号２（ＦｃεＲＩγ細胞内シグナル伝達ドメインをコードする）、配列番号４（ヒトＣＤ８ヒンジをコードする）、配列番号６（ヒトＣＤ２８膜貫通部分をコードする）、配列番号１０（ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインをコードする）、配列番号１１（低親和性ＣＤ１６Ａをコードする）、配列番号１３（高親和性ＣＤ１６Ａをコードする）、配列番号１５（ＣＤ６４Ａをコードする）、配列番号１８（ＣＤ６４Ｂをコードする）、配列番号２１（ＣＤ６４Ｃをコードする）、配列番号２４（ＣＤ３２Ａをコードする）、配列番号２７（ＣＤ３２Ｂをコードする）、及び配列番号３０（ＣＤ１６Ｂをコードする）で表される配列を有するであろう。さらなる想定される核酸配列は、配列番号７３（ＣＤ１６Ａ膜貫通ドメインをコードする）、配列番号７５（ＣＤ３２Ａ膜貫通ドメインをコードする）、配列番号７７（ＣＤ３２Ｂ膜貫通ドメインをコードする）、配列番号７９（ＣＤ６４Ａ膜貫通ドメインをコードする）、配列番号８１（ＣＤ６４Ｂ膜貫通ドメインをコードする）、又は配列番号８３（ＣＤ１６Ｃ膜貫通ドメインをコードする）で表される核酸配列を有するであろう。上述されるように、上記に列挙される核酸配列が、例えば、コドン選択及び１つ以上のアミノ酸交換のため（好ましくは、それらのそれぞれの機能を維持しながら）ある程度変化し得ることが認識されるべきである。したがって、本明細書において想定される核酸配列は、本明細書に開示される核酸配列との少なくとも９９％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列も含む。その結果として、本明細書において想定されるアミノ酸配列は、本明細書に開示されるアミノ酸配列との少なくとも９９％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列も含む。

【0039】

したがって、想定される核酸配列は、ＣＡＲ構築物のトランスフェクション、伝播、及び／又は発現に好適な様々な組み換え構築物も含むであろう。例えば、このような組み換え核酸は、線状又は環状ＤＮＡ及びＲＮＡ、例えば線状化ＤＮＡ及びＲＮＡ、クローニングベクター、発現ベクター、及びさらに組み換えウイルスを含むであろう。他の好ましい選択肢の中でも特に、このような構築物は、典型的に、線状化形態、ウイルス形態（例えば、アデノウイルス又はレンチウイルス）又はウイルス発現ベクターのいずれかにおけるポリシストロニック構築物として構成されるであろう。

【0040】

さらに他の想定される態様において、本明細書に示されるＣＡＲ構築物は、典型的に、哺乳動物細胞内で、最も好ましくは、治療用細胞内で、又は細胞を受ける個体に対して自己若しくは異種であり得る免疫担当細胞内で発現されるであろう。例えば、本明細書に示されるＣＡＲ構築物の発現のための好適な細胞は、特に、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞を含む。

【0041】

好適なＮＫ細胞に関連して、全てのＮＫ細胞が、本明細書において使用するのに好適であると考えられ、したがって、初代ＮＫ細胞（保存（ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）細胞、増殖細胞、及び／又は新鮮細胞）、不死化、自己又は異種ＮＫ細胞（バンクに保存された（ｂａｎｋｅｄ）細胞、保存細胞、新鮮細胞など）であった二次ＮＫ細胞、及び以下により詳細に記載される修飾ＮＫ細胞を含むことが留意されるべきである。ある実施形態において、ＮＫ細胞がＮＫ－９２細胞であることが好ましい。ＮＫ－９２細胞株は、インターロイキン２（ＩＬ－２）の存在下で増殖することが発見された独自の細胞株である（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８：６５２－６５８（１９９４）を参照）。ＮＫ－９２細胞は、好適な培養培地中で増殖後に広い抗腫瘍細胞毒性及び予測可能な収量を有する癌性ＮＫ細胞である。有利なことに、ＮＫ－９２細胞は、様々な癌に対する高い細胞溶解活性を有する。

【0042】

元のＮＫ－９２細胞株は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２８、ＣＤ４５、及びＣＤ５４表面マーカーを発現し、ＣＤ１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、及びＣＤ３４マーカーを提示しなかった。培養物中のこのようなＮＫ－９２細胞の増殖は、インターロイキン２（例えば、ｒＩＬ－２）の存在に依存し、１ＩＵ／ｍＬ程度の用量が、増殖を維持するのに十分である。ＩＬ－７及びＩＬ－１２は、長期の増殖を支持せず、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、腫瘍壊死因子α、インターフェロンα、及びインターフェロンγを含む試験される様々な他のサイトカインも有さない。初代ＮＫ細胞と比較して、ＮＫ－９２は、典型的に、比較的低いエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、例えば１：１でさえ、高い細胞毒性を有する。代表的なＮＫ－９２細胞は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）により、名称ＣＲＬ－２４０７で寄託されている。さらに他の想定されるＮＫ－９２細胞は、自己分泌増殖刺激のためにサイトカインを発現するように遺伝子操作されたもの、及び／又はＣＤ１６の高親和性形態を発現するように遺伝子操作されたものを含む。

【0043】

さらに他の実施形態において、本発明者らは、疾患（例えば、癌、ウイルス感染、細菌感染など）、特に、治療用抗体が利用可能な疾患の治療における、本明細書に示される１つ以上のＣＡＲ構築物を発現する組み換え細胞の使用を想定している。このような治療的使用及び方法において、治療有効量の組み換え細胞は、単独で、又は治療用抗体と共に投与されるであろう。

【0044】

想定される疾患としては、特に、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、限定はされないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫などの肉腫及び癌腫を含む固形腫瘍が挙げられる。

【0045】

想定されるトランスフェクトされた細胞（例えば、トランスフェクトされたＮＫ－９２）細胞は、絶対数の細胞によって個体に投与され得る。例えば、個体は、約１０００個の細胞／注入から最大で約１００億個の細胞／注入、例えば、約、少なくとも約、又は多くても約、１×１０^８、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^３、５×１０^３個の細胞／注入、又はこれらの数値のいずれか２つの間の任意の範囲（端点を含む）で投与され得る。他の実施形態において、細胞は、相対数の細胞によって個体に投与され得、例えば、前記個体は、個体のキログラム当たり約１０００個の細胞から最大で約１００億個の細胞、例えば、個体のキログラム当たり、約、少なくとも約、又は多くても約、１×１０^８、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^３、５×１０^３個の細胞、又はこれらの数値のいずれか２つの間の任意の範囲（端点を含む）で投与され得る。他の実施形態において、総用量は、ｍ^２当たり約１×１０^１１、１×１０^１０、１×１０^９、１×１０^８、１×１０^７、又は数値のいずれか２つの間の任意の範囲（端点を含む）を含む体表面積のｍ^２によって計算され得る。平均的な人は、約１．６～約１．８ｍ^２である。好ましい実施形態において、約１０億～約３０億個のＮＫ－９２細胞が、患者に投与される。

【0046】

トランスフェクトされた細胞（例えば、トランスフェクトされたＮＫ－９２細胞）、及び任意の他の抗癌又は抗ウイルス剤は、癌に罹患した又はウイルスに感染した患者に１回投与され得るか、又は複数回、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３時間に１回、又は１、２、３、４、５、６若しくは７日に１回、又は治療中１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間若しくはそれ以上で１回、又はこれらの数値のいずれか２つの間の任意の範囲（端点を含む）で投与され得る。

【実施例】

【0047】

本明細書に示される教示と共に使用される例示的な核酸及びアミノ酸配列は、配列番号３３～７２を含む。より具体的には、配列番号３３は、ＥＣＤ－ＣＤ１６ａ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを有する例示的なＣＤ１６ａＶ ＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号３４は、ＥＣＤ－ＣＤ１６ａ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを有する例示的なＣＤ１６ａＶ ＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号３５は、ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを有する例示的なＣＤ１６ａＶ ＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号３６は、ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを有する例示的なＣＤ１６ａＶ ＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号３７は、ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを有する例示的なＣＤ１６ａＶ ＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号３８は、ＣＤ１６ａＶ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号３９は、ＣＤ１６ｂ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号４０は、ＣＤ１６ｂ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号４１は、ＣＤ１６ｂ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号４２は、ＣＤ１６ｂ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号４３は、ＣＤ６４ａ ＥＣＤ－ＣＤ６４ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号４４は、ＣＤ６４ａ ＥＣＤ－ＣＤ６４ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号４５は、ＣＤ６４ａ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号４６は、ＣＤ６４ａ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号４７は、ＣＤ６４ａ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号４８は、ＣＤ６４ａ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号４９は、ＣＤ６４ｂ ＥＣＤ－ＣＤ６４ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号５０は、ＣＤ６４ｂ ＥＣＤ－ＣＤ６４ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号５１は、ＣＤ６４ｂ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号５２は、ＣＤ６４ｂ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号５３は、ＣＤ６４ｂ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号５４は、ＣＤ６４ｂ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号５５は、ＣＤ６４ｃ ＥＣＤ－ＣＤ６４ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号５６は、ＣＤ６４ｃ ＥＣＤ－ＣＤ６４ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号５７は、ＣＤ６４ｃ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号５８は、ＣＤ６４ｃ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号５９は、ＣＤ６４ｃ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号６０は、ＣＤ６４ｃ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号６１は、ＣＤ３２ａ ＥＣＤ－ＣＤ３２ａ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号６２は、ＣＤ３２ａ ＥＣＤ－ＣＤ３２ａ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号６３は、ＣＤ３２ａ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号６４は、ＣＤ３２ａ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号６５は、ＣＤ３２ａ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号６６は、ＣＤ３２ａ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号６７は、ＣＤ３２ｂ ＥＣＤ－ＣＤ３２ｂ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号６８は、ＣＤ３２ｂ ＥＣＤ－ＣＤ３２ｂ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号６９は、ＣＤ３２ｂ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号７０は、ＣＤ３２ｂ ＥＣＤ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示し、配列番号７１は、ＣＤ３２ｂ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲをコードする核酸を示し、配列番号７２は、ＣＤ３２ｂ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲのためのアミノ酸を示す。

【0048】

本明細書において、ＥＣＤは、Ｆｃ受容体の細胞外ドメイン（それは、例えば、ＣＤ３２Ｂ Ｆｃ受容体の細胞外ドメインのための「ＣＤ３２ｂ ＥＣＤ」として、又はＣＤ１６ａ Ｆｃ受容体の細胞外ドメインのためのＥＣＤ－ＣＤ１６ａとして適格とされ得る）を指し、ＴＭは、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８膜貫通ドメインＣＤ２８ ＴＭ）を指し、ＦｃｅＲＩｇは、シグナル伝達ドメイン形態ＦｃｅＲＩｇを指し、ＣＤ８は、ＣＤ８ヒンジドメインを指す。

【0049】

本明細書に示される教示と共に使用されるさらなる例示的な核酸及びアミノ酸配列は、配列番号７３～８４を含む。より具体的には、配列番号７３は、例示的なＣＤ１６Ａ膜貫通ドメインをコードする核酸を示し、配列番号７４は、例示的なＣＤ１６Ａ膜貫通ドメインのためのアミノ酸を示し、配列番号７５は、例示的なＣＤ３２Ａ膜貫通ドメインをコードする核酸を示し、配列番号７６は、例示的なＣＤ３２Ａ膜貫通ドメインのためのアミノ酸を示し、配列番号７７は、例示的なＣＤ３２Ｂ膜貫通ドメインをコードする核酸を示し、配列番号７８は、例示的なＣＤ３２Ｂ膜貫通ドメインのためのアミノ酸を示し、配列番号７９は、例示的なＣＤ６４Ａ膜貫通ドメインをコードする核酸を示し、配列番号８０は、例示的なＣＤ６４Ａ膜貫通ドメインのためのアミノ酸を示し、配列番号８１は、例示的なＣＤ６４Ｂ膜貫通ドメインをコードする核酸を示し、配列番号８２は、例示的なＣＤ６４Ｂ膜貫通ドメインのためのアミノ酸を示し、配列番号８３は、例示的なＣＤ６４Ｃ膜貫通ドメインをコードする核酸を示し、配列番号８４は、例示的なＣＤ６４Ｃ膜貫通ドメインのためのアミノ酸を示す。これに関連して、膜貫通ドメイン配列の全てが、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物において同義的に使用され得ることが理解されるべきである。したがって、例えば、ＣＤ３２ｂ ＥＣＤ－ＣＤ８－ＣＤ２８ ＴＭ－ＦｃｅＲＩｇドメインを含む例示的なＣＡＲはまた、ＣＤ２８ ＴＭドメインの代わりに、配列番号７３～８４において上記に示されるようにＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、又はＣＤ６４Ｃ ＴＭドメインのいずれか１つを含むＣＡＲとして調製され得る。

【0050】

実施例１．ａＮＫ細胞のトランスフェクション：Ｆｃ－ＣＡＲ ａＮＫ細胞が、Ｆｃ－ＣＡＲ及びＩＬ－２のための配列を含有する２シストロン性プラスミドベースのベクターでａＮＫ細胞をエレクトロポレートすることによって生成される。ＩＬ－２配列は、小胞体（ＥＲ）からのＩＬ－２タンパク質分泌を防止するために小胞体保留シグナル、ＫＤＥＬで標識され、ＥＲＩＬ－２と呼ばれる。

【0051】

様々なＦｃ－ＣＡＲ構築物をコードする核酸は、配列表において提供され、ヒンジ領域を含んでも又は含まなくてもよい。これらの構築物は、ＧｅｎｅＷｉｚ，Ｉｎｃ．によって生成される合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から組み合わされる。構築物は、アンピシリン耐性カセット、ＥＦ－１αプロモーター、及びＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有する、２シストロン性ｐＮＥＵＫｖ１ ＩＲＥＳ＿ＥＲＩＬ２ベクター骨格へとクローニングされる。得られたプラスミドＤＮＡは、形質転換された細菌から精製され、それらの濃度は、ＵＶ分光法によって決定される。ａＮＫ細胞は、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターデバイスを用いて様々な精製されたＦｃ－ＣＡＲプラスミドでエレクトロポレートされる。エレクトロポレートされた細胞は、ＩＬ－２の添加なしで、５％の加熱不活性化ヒトＡＢ血清が補充されたＸ－ＶＩＶＯ １０培地に戻され、５％のＣＯ_２培養器において３７℃でインキュベートされる。

【0052】

予想される結果：プラスミド構築物を上首尾に組み込んだポリクローナルａＮＫ細胞集団が、培養培地中のＩＬ－２の非存在下で増殖することが可能であろう。Ｆｃ－ＣＡＲ ａＮＫ細胞の増殖する集団が、エレクトロポレーションの３～５週間以内に検出可能であり、さらに２～３週間以内に試験に供することができるはずである。

【0053】

実施例２．フェノタイピング：フローサイトメトリー分析が、エレクトロポレートされたａＮＫ細胞におけるＦｃ－ＣＡＲの表面発現を測定するために行われる。細胞は、製造業者の説明書に従ってヒトＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４を認識する蛍光色素コンジュゲート抗体で染色され、フローサイトメーターデバイスにおいて分析される。

【0054】

予想される結果：Ｆｃ－ＣＡＲ分子の表面発現は、エレクトロポレーション後の３～５週間の培養後の細胞の少なくとも３０％において観察されるはずである。より具体的には、選択された実験結果において、図２は、ａＮＫ細胞（ＣＤ１６－ＣＡＲ．２８Ｅ細胞）内で発現されるＣＤ１６－ＣＡＲ．２８Ｅ構築物についてのデータを示し、ここで、ＣＡＲを、ＦＣＧＲＩＩＩＡのＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ変異体の細胞外ドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、及びＦＣＥＲＩＧのシグナル伝達ドメインから構築した。このような構築物をコードする核酸を、ｐＮＥＵＫｖ１－ＩＲＥＳ－ＥＲＩＬ２プラスミドへとサブクローニングした。ａＮＫ細胞を、ＮｅｏｎＴＭエレクトロポレーターデバイスを用いてこのプラスミドでエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの３週間後、細胞を、抗ＣＤ１６抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。エレクトロポレートされた細胞を、非エレクトロポレートａＮＫ及びｈａＮＫ細胞と比較した。スキャンから容易に分かるように、ａＮＫ細胞が、それらの細胞表面においてＣＤ１６を発現しなかった一方、ｈａＮＫ細胞は、細胞表面においてかなりのＣＤ１６発現を示した。同様に、ＣＤ１６－ＣＡＲ ２８．Ｅ細胞は、ＣＤ１６表面提示についての強力なシグナルを有していた。

【0055】

実施例３．直接又は天然細胞毒性：Ｋ５６２細胞が、１０％の加熱不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）において増殖され、５％のＣＯ_２培養器において３７℃でインキュベートされる。Ｋ５６２細胞が、緑色蛍光色素（ＰＫＨ６７－ＧＬ）で染色され、Ｆｃ－ＣＡＲ ａＮＫエフェクター細胞が、９６ウェルプレートにおいて異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で組み合わされ、短時間遠心分離され、５％のＣＯ_２培養器において４時間にわたって３７℃でインキュベートされる。インキュベーション後、細胞が、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中１μｇ／ｍｌで、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色され、フローサイトメトリーによって直ぐに分析される。標的細胞及びエフェクター細胞がまた、自然発生細胞溶解を評価するために、ＰＩで別々に染色される。

【0056】

死標的細胞が、ＰＫＨ６７－ＧＬ及びＰＩについて二重陽性として同定される。死細胞のパーセンテージが、ＰＫＨ６７^＋標的細胞集団内のＰＩ^＋のパーセンテージによって決定される。殺滅％が、以下のように計算される＝［サンプル中の％死標的細胞－％自然発生死標的細胞］／［１００－％自然発生死標的細胞］。

【0057】

予想される結果：Ｋ５６２標的細胞のパーセンテージ殺滅は、最も高いＥ：Ｔ比で、５０％超であるはずである。より具体的には、選択された実験結果において、図３は、ＮＫ感受性ヒト細胞株Ｋ５６２に対するフローベースのインビトロ細胞傷害性アッセイによって決定され、ｈａＮＫ細胞のものと比較される、ＣＤ１６－ＣＡＲ．２８Ｅ細胞の細胞毒性活性についてのデータを示す。エフェクター及び標的細胞を、１０：１～０．０６：１の範囲のＥ：Ｔ比で混合し、４時間にわたって３７℃でインキュベートした。図３中のグラフから容易に分かるように、細胞毒性が同等であり、より高いＥ：Ｔ比で、ｈａＮＫ細胞の細胞毒性より良好でさえあった。

【0058】

実施例４．ＡＤＣＣ：ＮＫ耐性ＳＵＰ－Ｂ１５標的細胞のＣＤ２０発現変異体が、アッセイに使用される。ＣＤ２０＋ ＳＵＰ－Ｂ１５標的細胞が、２０％の加熱不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）及び０．２％のβ－メルカプトエタノールが補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）中で増殖され、５％のＣＯ２培養器において３７℃でインキュベートされる。ＣＤ２０＋ ＳＵＰ－Ｂ１５細胞が、緑色蛍光色素（ＰＫＨ６７－ＧＬ）で染色される。次に、染色された標的細胞は、２０分間にわたって２ｕｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体リツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）又はトラスツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ対照抗体、ＳＵＰ－Ｂ１５細胞は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性である）と共に、又は抗体なしでプレインキュベートされる。プレインキュベートされた染色された標的細胞は、９６ウェルプレートにおいて異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＦｃ－ＣＡＲ ａＮＫエフェクター細胞と組み合わされ、短時間遠心分離され、５％のＣＯ２培養器において４時間にわたって３７℃でインキュベートされる。インキュベーションの後、細胞が、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中１μｇ／ｍｌで、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色され、フローサイトメトリーによって直ぐに分析される。標的細胞及びエフェクター細胞が、自然発生細胞溶解を評価するために、ＰＩで別々に染色される。死標的細胞が、ＰＫＨ６７－ＧＬ及びＰＩについて二重陽性として同定される。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（％ＡＤＣＣ）が、以下のように計算される＝［（サンプルＥ＋ＴプラスｍＡｂ中の％死標的細胞）－（サンプルＥ＋ＴマイナスｍＡｂ中の％死標的細胞）］／［１００－（サンプルＥ＋ＴマイナスｍＡｂ中の％死標的細胞）］、（Ｅ＝エフェクター、Ｔ＝標的、ｍＡｂ＝モノクローナル抗体）。

【0059】

予想される結果：ＣＤ２０＋ ＳＵＰ－Ｂ１５標的細胞のパーセンテージＡＤＣＣ殺滅は、トラスツズマブの存在下よりリツキシマブの存在下で有意に高いはずである。％ＡＤＣＣは、最も高いＥ：Ｔ比で少なくとも２０％であるはずである。より具体的には、選択された実験結果において、図４は、ＣＤ２０陽性、ＨＥＲ２陰性、ＮＫ耐性ヒト細胞株ＳＵＰ－Ｂ１５^{ＣＤ２０＋}に対するフローベースのインビトロ細胞毒性アッセイによって決定した際のＣＤ１６－ＣＡＲ．２８Ｅ細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性についてのデータを示す。標的細胞を、２μｇ／ｍＬのリツキシマブ（オンターゲット抗ＣＤ２０）若しくはトラスツズマブ（オフターゲット抗ＨＥＲ２）抗体のいずれかと共に、又は抗体なしで、室温で２０分間にわたってプレインキュベートした。次に、エフェクター及びプレインキュベートされた標的細胞を、１０：１～０．０６：１の範囲のＥ：Ｔ比で混合し、４時間にわたって３７℃でインキュベートした。ｈａＮＫ細胞が、比較のためにアッセイに含まれていた。図４中のグラフから明らかに分かるように、ｈａＮＫ細胞及びＣＤ１６－ＣＡＲ．２８Ｅ細胞の両方が、オフターゲット抗体の存在下でＡＤＣＣ活性を有していなかった。逆に、ｈａＮＫ細胞及びＣＤ１６－ＣＡＲ．２８Ｅ細胞の両方が、オンターゲット抗体の存在下で有意なＡＤＣＣ活性を有しており、ＣＤ１６－ＣＡＲ．２８Ｅ細胞は、ｈａＮＫ細胞より有意に機能が優れていた。異なる観点から見ると、ＣＤ１６－ＣＡＲ．２８Ｅ構築物は、予想外にも、細胞表面においてＣＤ１６ １５８Ｖ高親和性変異体を発現する同等のＮＫ細胞より強力なＡＤＣＣ活性を提供した。

【0060】

本明細書に示される教示に従って使用するのに好適なさらなる態様、考慮事項、及び方法が、米国特許出願公開第２０１８／０１３３２５２号明細書及び米国特許出願公開第２０１６／００６７３５６号明細書に記載され、これらは両方とも、参照により本明細書に援用される。

【0061】

ある実施形態において、本発明の特定の実施形態を説明し、権利請求するのに使用される、成分の量、濃度、反応条件などの特性を表す数値は、ある場合には「約」という用語によって修飾されているものと理解されるべきである。したがって、ある実施形態において、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、特定の実施形態によって得ようとされる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。本明細書における値の範囲の記載は、その範囲内に含まれる各別個の値を個々に示す簡単な方法として機能することが意図されるに過ぎない。本明細書に特に示されない限り、各個々の値は、本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0062】

本明細書において使用される際、医薬組成物又は薬物を「投与する」という用語は、医薬組成物又は薬物の直接の及び間接的な投与の両方を指し、ここで、医薬組成物又は薬物の直接の投与は、典型的に、医療従事者（例えば、医師、看護師など）によって行われ、間接的な投与は、医薬組成物又は薬物を、直接の投与（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達などによって）のために医療従事者に提供又は利用可能にする工程を含む。病態、疾患の発生に対する感受性、又は意図される治療に対する応答を「予想する」又は「予測する」という用語は、対象における病態の進行速度、改善、及び／又は期間を含む、病態、感受性及び／又は応答を予測する行為又は予測（それらの治療又は診断ではなく）を包含することが意図されることがさらに留意されるべきである。

【0063】

本明細書に記載される全ての方法が、本明細書に特に示されない限り又は文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行われ得る。本明細書における特定の実施形態に関連して提供されるあらゆる例、又は例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく例示することが意図されるに過ぎず、本来権利請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に不可欠な権利請求されない要素を示すものと解釈されるべきではない。

【0064】

本明細書における説明において及び後続の特許請求の範囲を通して使用される際、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」の意味は、文脈上特に明記されない限り、複数の言及を含む。また、本明細書における説明において使用される際、「における（ｉｎ）」の意味は、文脈上特に明記されない限り、「における（ｉｎ）」及び「における（ｏｎ）」を含む。また、本明細書において使用される際、及び文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「に結合される（ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ）」という用語は、直接の結合（ここで、互いに結合される２つの要素が、互いに接触する）及び間接的な結合（ここで、少なくとも１つのさらなる要素が、２つの要素の間に位置する）の両方を含むことが意図される。したがって、「に結合される（ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ）」及び「と結合される（ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ）」という用語は、同義語として使用される。

【0065】

既に記載されるものに加えて多くのさらなる変更が、本明細書における本発明の概念から逸脱せずに可能であることが当業者に明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲内を除き、限定されるものではない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈する際、全ての用語が、文脈に合致してできるだけ広義に解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非限定的に要素、構成要素、又は工程に言及するものと解釈されるべきであり、言及される要素、構成要素、又は工程が、明示的に言及されていない他の要素、構成要素、又は工程と共に、存在するか、又は用いられるか、又は組み合わされてもよいことを示す。本明細書及び／又は特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ・・・及びＮからなる群から選択されるものの少なくとも１つを指す場合、その文章は、ＡプラスＮ、又はＢプラスＮなどではなく、群からの１つのみの要素を必要とするものと解釈されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【手続補正書】

【提出日】2023-08-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＮＫ細胞において発現される組み換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
配列番号１２、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチドの抗体結合部分を有する抗体結合ドメインを含み；
前記抗体結合ドメインが、任意選択のヒンジ部分、膜貫通部分、及び配列番号１を有するＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを配列中に含むポリペプチドに結合される、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項2】

前記抗体結合ドメインが、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、及び配列番号３２からなる群から選択されるペプチド配列を有する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項3】

前記任意選択のヒンジ部分が、配列番号３のペプチド配列を有する、請求項１又は２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項4】

前記膜貫通部分が、配列番号５、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、又は配列番号８４のペプチド配列を有する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

少なくとも１つの第２のシグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

前記第２のシグナル伝達ドメインが、前記シグナル伝達ドメインと異なる、請求項５に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記シグナル伝達ドメインが、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群から選択されるペプチド配列を有する、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

前記抗体結合ドメインが、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、及び配列番号３２からなる群から選択されるペプチド配列を有し、前記シグナル伝達ドメインが、配列番号１のペプチド配列を有する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項9】

前記任意選択のヒンジ部分が、配列番号３のペプチド配列を有する、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項10】

前記膜貫通部分が、配列番号５、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、又は配列番号８４のペプチド配列を有する、請求項８又は請求項９に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項11】

少なくとも１つのさらなるシグナル伝達ドメインをさらに含み、任意選択的に、前記さらなるシグナル伝達ドメインが、配列番号１のペプチド配列を有する、請求項８～１０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項12】

前記さらなるシグナル伝達ドメインが、配列番号１のペプチド配列を有する、請求項８～１１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項13】

前記キメラ抗原受容体が、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４ｘｘ、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、又は配列番号７２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項14】

前記キメラ抗原受容体が、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、又は配列番号７１のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項15】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする組み換え核酸。

【請求項16】

前記核酸が、ヒトコドン使用のためにコドン最適化される、請求項１５に記載の組み換え核酸。

【請求項17】

サイトカイン、ＣＤ１６、ホーミング受容体、及び／又はＴＧＦ－βトラップをコードする配列部分をさらに含む、請求項１５又は１６に記載の組み換え核酸。

【請求項18】

前記核酸が、前記キメラ抗原受容体をコードし、前記サイトカイン、前記ＣＤ１６、前記ホーミング受容体、及び／又は前記ＴＧＦ－βトラップをコードする前記配列部分が、ポリシストロニック核酸として構成される、請求項１７に記載の組み換え核酸。

【請求項19】

前記組み換え核酸が、レンチウイルスベクターの一部である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の組み換え核酸。

【請求項20】

前記組み換え核酸が、ＤＮＡベクターの一部である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の組み換え核酸。

【請求項21】

請求項１５～２０のいずれか一項に記載の組み換え核酸でトランスフェクトされたＮＫ細胞。

【請求項22】

前記細胞が、ＮＫ－９２細胞、遺伝子組み換えＮＫ－９２細胞、又は自己ＮＫ細胞である、請求項２１に記載の細胞。

【請求項23】

請求項１～１２又は請求項１４のいずれか一項に記載の組み換えキメラ抗原受容体をコードする組み換え核酸でトランスフェクトされた組み換えＮＫ細胞。

【請求項24】

前記ＮＫ細胞が、ＮＫ－９２細胞、遺伝子組み換えＮＫ－９２細胞、又は自己ＮＫ細胞である、請求項２３に記載の組み換えＮＫ細胞。

【請求項25】

請求項１３～１８のいずれか一項に記載の組み換え核酸でトランスフェクトされた、請求項２３に記載の組み換えＮＫ細胞。

【請求項26】

癌を治療する必要がある患者の癌を治療する方法であって、治療有効量の、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の細胞を前記患者に投与し、それによって前記癌を治療することを含む、方法。

【請求項27】

ウイルス癌ワクチン、細菌癌ワクチン、酵母癌ワクチン、Ｎ－８０３、抗体、幹細胞移植、及び腫瘍標的化サイトカインからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる治療実体を投与する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記癌が、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、限定はされないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫などの肉腫及び癌腫を含む固形腫瘍から選択される、請求項２６又は２７に記載の方法。

【請求項29】

前記患者の体表面積のｍ^２当たり約１×１０^８～約１×１０^１１個の細胞が、前記患者に投与される、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

癌又はウイルス感染の治療における、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の細胞の使用。

【国際調査報告】