特表 2024-501316 構造的に無秩序な配列に特異的な抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-11

(54)【発明の名称】構造的に無秩序な配列に特異的な抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/44 20060101AFI20231228BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231228BHJP

   C07K 4/00 20060101ALI20231228BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20231228BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20231228BHJP

   A61K 39/44 20060101ALI20231228BHJP

【ＦＩ】

C07K16/44 ZNA

C12N15/13

C07K4/00

C07K14/00

C07K1/22

A61K39/39

A61K47/68

A61K39/44

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539757

(86)(22)【出願日】2021-12-22

(85)【翻訳文提出日】2023-08-18

(86)【国際出願番号】 EP2021087365

(87)【国際公開番号】W WO2022136582

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】20216744.1

(32)【優先日】2020-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523238911

【氏名又は名称】イクスエル－プロテイン・ゲーエムベーハー

(71)【出願人】

【識別番号】504150162

【氏名又は名称】テクニシェ ユニバーシタット ミュンヘン

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(72)【発明者】

【氏名】シュルツ，ヨナス

(72)【発明者】

【氏名】ビンデル，ウーリ

(72)【発明者】

【氏名】フリードリッヒ，ラース

(72)【発明者】

【氏名】ゲバウアー，ミカエラ

(72)【発明者】

【氏名】シュラプシー，マルティン

(72)【発明者】

【氏名】スケラ，アルネ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA13

4C085AA38

4C085BB11

4C085BB41

4C085BB43

4C085EE01

4C085FF13

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA18

4H045BA19

4H045BA20

4H045BA21

4H045BA50

4H045BA60

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA50

4H045EA60

4H045FA33

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、動物において、特に哺乳動物において、免疫学的に不活性であり、免疫原性を欠く傾向がある天然変性タンパク質（ＩＤＰ）および／または天然変性タンパク質のドメインに対する特異的結合部分を生成および／または取得するための方法に関する。本発明はまた、構造的に無秩序な配列および／または天然変性配列に、特にＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）に特異的に結合するそのような特異的結合部分、特に抗体および／またはそれらの抗原結合断片にも関する。これらの結合部分、抗体、抗原結合断片は、そのような「天然変性タンパク質」、特にＰＡＳポリペプチドにも含まれるような無秩序なペプチドまたはポリペプチド断片に結合し／それらを認識するので、ファーストインクラスである。本発明の結合部分、抗体、抗原結合断片は、限定するものではないが、診断の場面ならびに研究ツールにおいて特に有用である。本発明は、動物において、特に哺乳動物において、免疫学的に不活性であり、免疫原性を欠く傾向がある天然変性タンパク質（ＩＤＰ）および／または天然変性タンパク質のドメインに対する特異的結合部分を生成および／または取得するための方法に関する。本発明はまた、構造的に無秩序な配列および／または天然変性配列に、特にＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）に特異的に結合するそのような特異的結合部分、特に抗体および／またはそれらの抗原結合断片にも関する。これらの結合部分、抗体、抗原結合断片は、そのような「天然変性タンパク質」、特にＰＡＳポリペプチドにも含まれるような無秩序なペプチドまたはポリペプチド断片に結合し／それらを認識するので、ファーストインクラスである。本発明の結合部分、抗体、抗原結合断片は、限定するものではないが、診断の場面ならびに研究ツールにおいて特に有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

天然変性ペプチド／タンパク質および／または天然変性ペプチド／タンパク質のドメインに対して向けられた抗原結合分子、好ましくは抗体またはその抗原結合断片を生成するための方法であって、非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップを含み、
前記抗原は、免疫アジュバントと１つまたは複数のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートであり、
各Ｐ／Ａペプチドは独立して約５個～約１００個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、前記ペプチドのアミノ酸残基のうちの少なくとも６０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、保護基Ｒ^Ｎが前記ペプチドのＮ末端アミノ基に結合している、方法。

【請求項2】

各Ｐ／Ａペプチドは独立してペプチドＲ^Ｎ－（Ｐ／Ａ）－Ｒ^Ｃであり、
ここで、（Ｐ／Ａ）は、約８個～約９０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも７０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含み、
Ｒ^Ｎは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基に結合している保護基であり、
Ｒ^Ｃはアミノ酸残基であって、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端カルボキシ基に結合され、そのアミノ基とそのカルボキシ基との間に少なくとも１個の炭素原子を含む、アミノ酸残基であり、
各Ｐ／Ａペプチドは、Ｐ／ＡペプチドのＣ末端アミノ酸残基Ｒ^Ｃのカルボキシ基と免疫アジュバントの遊離アミノ基とから形成されるアミド結合を介して免疫アジュバントにコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記抗原中の（Ｐ／Ａ）は、約１０個～約８０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも７０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％はプロリン、アラニンおよびセリンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記抗原中の（Ｐ／Ａ）は、プロリン、アラニンおよびセリンから独立して選択される２０個～４０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも７０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

（Ｐ／Ａ）に含まれるプロリン残基の数と（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の総数との割合が、≧１０％および≦７０％、好ましくは≧２０％および≦５０％、より好ましくは≧２５％および≦４０％である、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記抗原中の（Ｐ／Ａ）は、（ｉ）ＡＳＰＡ（配列番号８６）、ＡＰＡＰ（配列番号８７）、ＳＡＰＡ（配列番号８８）、ＡＡＰＡ（配列番号８９）およびＡＰＳＡ（配列番号８４）から独立して選択される５つ以上の部分配列、ならびに（ｉｉ）任意選択で、プロリン、アラニンおよびセリンから独立して選択される１個、２個または３個のさらなるアミノ酸残基からなる、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

（Ｐ／Ａ）は、（ｉ）配列ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＳＡＰＡ、（ｉｉ）配列ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ、（ｉｉｉ）配列ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ、（ｉｖ）前述の配列のいずれかの重複、または（ｖ）前述の配列のうちの２つの組み合わせからなる、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

Ｒ^Ｎは、ピログルタモイル（Ｐｇａ）、ホモピログルタモイル、ホルミル、アセチル、ヒドロキシアセチル、メトキシアセチル、エトキシアセチル、プロポキシアセチル、プロピオニル、２－ヒドロキシプロピオニル、３－ヒドロキシプロピオニル、２－メトキシプロピオニル、３－メトキシプロピオニル、２－エトキシプロピオニル、３－エトキシプロピオニル、ブチリル、２－ヒドロキシブチリル、３－ヒドロキシブチリル、４－ヒドロキシブチリル、２－メトキシブチリル、３－メトキシブチリル、４－メトキシブチリル、グリシンベタイニル（ｇｌｙｃｉｎｅ ｂｅｔａｉｎｙｌ）、ｏ－アミノベンゾイル、－ＮＨ－（Ｃ_１～６アルキル）、－Ｎ、Ｎ（Ｃ_１～８アルキル）_２、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ（Ｃ_１～６－アルキル）_３、Ｎ，Ｎ－テトラメチレン、およびＮ，Ｎ－ペンタメチレンから選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

Ｒ^ＣはＨ_２Ｎ－（Ｃ_１～１２ヒドロカルビル）－ＣＯＯＨであり、Ｒ^Ｃは、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_１～１０－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－フェニル－ＣＯＯＨ、およびＨ_２Ｎ－シクロヘキシル－ＣＯＯＨから選択されることが好ましく、Ｒ^Ｃは、Ｈ_２Ｎ－ＣＨ_２－ＣＯＯＨ（Ｇｌｙ）、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_２－ＣＯＯＨ（β－Ａｌａ）、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_３－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_４－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_５－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_６－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ２）_８－ＣＯＯＨ、ｐ－アミノ安息香酸、および４－アミノシクロヘキサンカルボン酸から選択されることがより好ましく、Ｒ^ＣはＨ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_５－ＣＯＯＨであることがさらにより好ましい、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記抗原に含まれるＰ／Ａペプチドはランダムコイルコンフォメーションをとり、かつ／または前記抗原に含まれるＰ／Ａペプチドは荷電残基を欠く、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

免疫アジュバントは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から選択され、好ましくは、免疫アジュバントはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗原。

【請求項13】

非ヒト哺乳動物の免疫を含む、天然変性ペプチド／タンパク質および／または天然変性ペプチド／タンパク質のドメインに対して向けられた抗原結合分子、好ましくは抗体またはその抗原結合断片の生成のための請求項１２に記載の抗原の非治療的使用。

【請求項14】

前記天然変性ペプチド／タンパク質および／または天然変性ペプチド／タンパク質のドメインは、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列であり、
好ましくは、前記Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列は、ランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも２０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、これによって、前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）から、好ましくはＰｒｏ（Ｐ）およびＡｌａ（Ａ）から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法、または請求項１３に記載の非治療的使用。

【請求項15】

前記Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列は、構造
（Ｐ／Ｓ）Ａ（Ａ／Ｓ）Ｐ；および／または
ＰＡ（Ａ／Ｓ）Ｐ
の少なくとも１つのエピトープを含み、
好ましくは、前記エピトープは、ＰＡＡＰ、ＰＡＳＰ、ＰＡＰＡＳＰ、ＰＡＰＡＡＰ、ＰＡＳＰＡＡＰ、およびＡＰＳＡからなる群から選択されるエピトープストレッチを含む、請求項１４に記載の方法または非治療的使用。

【請求項16】

請求項１から１１、１４または１５のいずれか一項に記載の方法によって取得可能である、天然変性ペプチド／タンパク質および／または天然変性ペプチド／タンパク質のドメインに対して向けられた抗原結合分子、好ましくは抗体またはその抗原結合断片。

【請求項17】

ａ）配列番号３５において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と、
配列番号３６において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と、
配列番号３７において定義されるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号３８において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と、
配列番号３９において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と、
配列番号４０において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ａ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片；
ｂ）配列番号４１において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と、
配列番号４２において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と、
配列番号４３において定義されるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号４４において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と、
配列番号４５において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と、
配列番号４６において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ｂ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片；
ｃ）配列番号４７において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と、
配列番号４８において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と、
配列番号４９において定義されるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号５０において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と、
配列番号５１において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と、
配列番号５２において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ｃ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片；
ｄ）配列番号５３において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と、
配列番号５４において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と、
配列番号５５において定義されるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号５６において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と、
配列番号５７において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と、
配列番号５８において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ｄ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片；
ｅ）配列番号５９において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と、
配列番号６０において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と、
Trp-Gly-Argのアミノ酸配列を含むか、その配列からなるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号６２において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と、
配列番号６３において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と、
配列番号６４において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ｅ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片；
ならびに
ｆ）配列番号６５において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と、
配列番号６６において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と、
配列番号６７において定義されるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と；
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号６８において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と、
配列番号６９において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と、
配列番号７０において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ｆ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片
からなる群から選択される、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項18】

抗体またはその抗原結合断片であり、
（ａ）配列番号１１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］、配列番号１３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］、配列番号：１５［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］、配列番号１７［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］、配列番号１９［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］もしくは配列番号２１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］のアミノ酸配列、
もしくは配列番号１１、１３、１５、１７、１９もしくは２１と８５％、好ましくは８７％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み；かつ／もしくは
配列番号１２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］、配列番号１４［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］、配列番号１６［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］、配列番号１８［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］、配列番号２０［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］もしくは配列番号２２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］のアミノ酸配列、
もしくは配列番号１２、１４、１６、１８、２０もしくは２２と８５％、好ましくは８７％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含むか；
または
（ｂ）（ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、
抗体またはその抗原結合断片である、請求項１６または１７に記載の抗原結合分子。

【請求項19】

Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片から選択される抗原結合断片である、請求項１７または１８に記載の抗原結合分子。

【請求項20】

レポーター分子および／または標識にコンジュゲートまたは融合される、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の抗原結合分子。

【請求項21】

マトリクスベースのタンパク質／ペプチドの精製または固定化において用いられる、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の抗原結合分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、動物において、特に哺乳動物において、免疫学的に不活性であり、免疫原性を欠く傾向がある天然変性タンパク質（ＩＤＰ）および／または天然変性タンパク質のドメインに対する特異的結合部分を生成および／または取得するための方法に関する。本発明はまた、構造的に無秩序な配列および／または天然変性配列に、特にＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）に特異的に結合するそのような特異的結合部分、特に抗体および／またはそれらの抗原結合断片にも関する。これらの結合部分、抗体、抗原結合断片は、そのような「天然変性タンパク質」、特にＰＡＳポリペプチドにも含まれるような無秩序なペプチドまたはポリペプチド断片に結合し／それらを認識するので、ファーストインクラスである。本発明の結合部分、抗体、抗原結合断片は、限定するものではないが、診断の場面ならびに研究ツールにおいて特に有用である。

【0002】

本発明は、具体的にはおよび特定の一実施形態では、天然変性ペプチド／タンパク質および／または天然変性ペプチド／タンパク質のドメインに対して向けられた抗原結合分子、好ましくは抗体またはその抗原結合断片を生成するための方法であって、非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップを含み、前記抗原は、免疫アジュバントと１つまたは複数のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートであり、各Ｐ／Ａペプチドは独立して約５個～約１００個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、前記ペプチドのアミノ酸残基のうちの少なくとも６０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、保護基Ｒ^Ｎが前記ペプチドのＮ末端アミノ基に結合している、方法に関する。

【0003】

本発明はまた、本発明の特異的結合部分／抗体／抗体断片をコードする核酸配列、ならびに／または、前記本発明の特異的結合部分／抗体／抗体断片の可変領域（可変重鎖配列および／もしくは可変軽鎖配列など）および／もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸配列を含む、構造明確な特異的ハイブリドーマにも関する。本発明はさらに、本発明の抗体のＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域もしくは重鎖可変領域をコードする核酸分子、ならびに前記核酸分子を含むベクターに関する。本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞に、ならびに、本発明の結合部分／抗体／抗体断片の生産方法であって、適切な条件下で、本発明の宿主細胞および／または本発明のハイブリドーマを培養するステップと、生産された結合部分／抗体／抗体断片を単離するステップとを含む生産方法にも関する。したがって、本発明はまた、本発明の結合部分／抗体／抗体断片を発現するハイブリドーマおよび／または宿主細胞にも関する。

【0004】

さらに、本発明は、本発明の方法によって取得可能な結合部分／抗体／抗体断片に、本発明の少なくとも１つの結合部分、抗体または抗原結合断片を含む組成物に、本発明のハイブリドーマおよび／もしくは宿主細胞、本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明のハイブリドーマ／宿主細胞、または本発明の方法によって生産される結合部分、抗体もしくは抗原結合断片に関する。本発明はまた、天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメイン、特にＰＡＳ配列および／またはＰＡＳ配列を含む分子を検出、定量化および／または識別するための、本発明の結合部分、抗体または抗原結合断片の使用に関する。このような検出、定量化または識別はまた、本発明による生体試料に関して、例えば血液試料もしくは血漿試料に関して、または脳脊髄液、眼の硝子体、組織切片の試料等に関して実施され得る。本発明はまた、ＰＡＳ化生物製剤の前臨床および臨床開発のための研究ツールおよび／または診断試薬も提供する。また、本明細書では、そのようなＰＡＳ化生物製剤、すなわち、生物学的に活性な（タンパク質）薬物と、例えば小さい残基Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒ、またはＰｒｏおよびＡｌａのみを含むＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）とを含む薬物コンジュゲートで処置された対象、特にヒト患者から取得された生体試料のスクリーニングのための手段および方法も提供される。前記薬物コンジュゲートは、タンパク質薬物または生物製剤に限定されず、「小分子」薬物および化学薬物、ならびに炭水化物薬物および核酸薬物も含むことができる。

【0005】

本発明はまた、診断の場面における、実験室での使用のための、前臨床開発もしくは臨床開発を含む研究および／または開発における、精製方法における等の、手段の調製のための、本発明の結合部分、抗体または抗原結合断片の使用にも関する。例えば、本発明の結合部分、抗体または抗原結合断片は、マトリクスベースのタンパク質／ペプチドの精製または固定化において用いられ得る。とりわけ、天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメイン、特にＰＡＳ配列および／またはＰＡＳ配列を含む分子の精製のためのアフィニティーマトリクスが、本発明の抗体またはそれらの抗原結合断片など、本明細書で提供される本発明の化合物を用いて調製され得る。

【0006】

本明細書では、特許出願および製造業者のマニュアルを含むいくつかの文献が引用される。これら文献の開示は、本発明の特許性に関連があるものとみなされないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、あらゆる参照文献は、それぞれ個々の文献が参照により組み込まれると具体的かつ個別に指示されているかのように同程度まで、参照により組み込まれる。

【背景技術】

【0007】

天然変性のタンパク質またはタンパク質のドメイン（ＩＤＰ）は、自然において普通であり、例えば、シナプトジャニンまたはＲｅｌＡの転写活性化ドメインの場合のように（Ｓｎｅａｄ ＆ Ｅｌｉｅｚｅｒ、２０１９；Ｔａｎｔｏｓら、２０１２；Ｗｒｉｇｈｔ ＆ Ｄｙｓｏｎ、２０１５）、シグナル伝達およびタンパク質トラフィキングにおいて重要な役割を担う。このようなＩＤＰはまた、広範囲の病原体に多量に存在しており、したがって、感染症と闘うための可能性を秘める標的である（Ｆｅｎｇら、２００６）。構造化タンパク質との特異的な相互作用とは対照的に、無秩序なペプチドまたはポリペプチドのセグメント（ＩＤＰにも含まれるような）の特性は、同族抗体の生成において免疫系に難題をもたらすことがしばしばであるが、免疫応答を回避するために病原体によって活用されるという特徴である（Ｇｉｒｉら、２０１６；Ｇｏｈら、２０１６）。

【0008】

抗原はほとんどがタンパク質またはペプチドであり、これらの表面エピトープは特異的な抗体認識のための相互作用点として働く。エピトープは一般に、（ｉ）その一次構造によって定義される線状エピトープ、および（ｉｉ）キーとなるアミノ酸はアミノ酸配列内では非連続であるが、（構造明確な）三次元フォールド内では極めて接近されている、構造的エピトープ（Ｂａｒｌｏｗら、１９８６）の２つのカテゴリーに分類される。エピトープは圧倒的に非連続であると長い間想定されてきた（Ｂａｒｌｏｗら、１９８６）；実際、より最近の分析が示唆するところは、構造的エピトープが、天然タンパク質に存在するあらゆるＢ細胞エピトープの約９０％を占めることである（Ｈｕａｎｇ ＆ Ｈｏｎｄａ、２００６）。

【0009】

無秩序なタンパク質間の相互作用は詳細に解析されてきたが（Ｆｏｎｇら、２００９；Ｍｅｓｚａｒｏｓら、２００７；Ｕｖｅｒｓｋｙ、２０１９）、少数の研究のみが、無秩序なタンパク質抗原と抗体などの構造明確な結合パートナーとの間の複合体形成の構造的側面について、取り組んできた（Ｆａｓｓｏｌａｒｉら、２０１３；ＭａｃＲａｉｌｄら、２０１６）。一般に、ペプチドは、多くの場合ペプチド骨格が関与するが、水素結合によって支配される、抗体とのインターフェースを形成し、タンパク質よりも平面様式で結合する傾向がある（Ｌｏｎｄｏｎら、２０１０）。さらに、ＩＤＰは折りたたまれた抗原よりも小さいエピトープを提示し、接触残基あたりの自由エネルギー利得の点でより効率的であるように見える（ＭａｃＲａｉｌｄら、２０１６）。タンパク質抗原の構造解析が示したところは、無秩序なエピトープ内の残基は、構造的エピトープ内の残基よりも水素結合および塩橋に関与する傾向が強いことである（ＭａｃＲａｉｌｄら、２０１６）。より具体的には、先行技術が仮定したように、ペプチドとのインターフェースは通常、結合のためのホットスポットとして機能する、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＩｌｅなどの、大きな疎水性側鎖に富んでいる（Ｌｏｎｄｏｎら、２０１０）。

【0010】

過去１０年間で、構造的に無秩序な人工ポリペプチドは、製薬バイオテクノロジーの分野で注目を集めており、この分野では、高親水性の化学ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の機能的代替物として、タンパク質融合パートナーまたは薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ特性を目的に合わせるために、使用される（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００９；Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３）。例えば、３つの小さいアミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａ、および／またはＳｅｒを含む長いポリペプチドとの、薬理学的に活性なタンパク質もしくはペプチドのまたは（「小」）分子のコンジュゲーションは、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）として知られるが、流体力学的容積を劇的に増大し、腎臓ろ過を遅延させることにより血漿半減期を延長する（Ｂｉｎｄｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１７）。したがって、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）ポリペプチドは、血漿半減期が延長されたバイオ医薬品を生成するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の生物学的代替品として開発された。化学巨大分子ＰＥＧと同じくらい、組換えＰＡＳポリペプチドは立体構造的に無秩序であり、水中で高溶解性を示す。実際、いかなる荷電側鎖または明白な疎水性側鎖をも欠くこれらの生合成ポリマーは、ＩＤＰの極端な例である。

【0011】

上で論じられているように、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）アプローチは、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）、すなわち小さい残基Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒまたはＰｒｏおよびＡｌａのみを含む、増大した流体力学的容積を有する立体構造的に無秩序なポリペプチド鎖に依拠する。こういったＰＡＳ配列は、薬物へのその化学コンジュゲーションが血漿半減期延長のための確立された方法であるＰＥＧと、非常に似た生物物理学的特性を有する親水性で非荷電の生体ポリマーである。ＰＥＧとは対照的に、ＰＡＳポリペプチドは、遺伝子レベルで治療用タンパク質またはペプチドへの単純な融合を行うことができ、その結果、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）または他の宿主細胞での十分に活性な治療用タンパク質の産生を可能にし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのカップリングまたは修飾のステップを不要とすると記載される（Ｂｉｎｄｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１７）。さらに、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）／ＰＡＳポリペプチドは生分解性であり、したがって、臓器蓄積を回避するが、一方、血清中での安定性を示すとともに毒性がない。ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）技術のさらなる利点の一つは、実際、免疫学的に不活性であり、したがって医療用および治療用途にとって大きく有利であるＰＡＳポリペプチドを提供することである。しかし、免疫原性の欠如はまた、かかる天然変性タンパク質（ＩＤＰ）および／または天然変性タンパク質のドメインに対する抗体が当技術分野でまったく記載されていない、理由でもある。しかし、そのような特異的抗体は、特に研究ツールとして、および患者の層別化および／または処置応答のモニタリングを含む診断の場面において所望されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

したがって、本発明の根底にある技術的課題は、天然変性のタンパク質またはタンパク質のドメイン、特に、アミノ酸残基ＰｒｏおよびＡｌａならびに／またはＰｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒ（ＰＡＳ）を含む増大した流体力学的容積を有する無秩序なポリペプチド鎖を特異的に結合する、結合部分、特に抗体および／または抗体断片の調製のための手段および方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本技術的課題は、本明細書において提供される実施形態によっておよび添付の特許請求の範囲において解決される。
第１の実施形態では、本発明は、天然変性ペプチド／タンパク質および／または天然変性ペプチド／タンパク質のドメインに対して向けられた抗原結合分子、好ましくは抗体またはその抗原結合断片を生成するための方法であって、
非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップを含み、
前記抗原は、免疫アジュバントと１つまたは複数のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートであり、各Ｐ／Ａペプチドは独立して約５個～約１００個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、前記ペプチドのアミノ酸残基のうちの少なくとも６０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、保護基Ｒ^Ｎが前記ペプチドのＮ末端アミノ基に結合している、方法に関する。

【0014】

本発明の文脈においてまた実施例で例示されるように、驚くべきことに、本発明者らが発見したところは、本明細書において開示されるような免疫スキームと組み合わせて、ＫＬＨなどの免疫アジュバント／高免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされる場合、このＫＬＨは、約５メガダルトン（５ＭＤａ）超の分子質量を有するタンパク質複合体を好ましくは形成するが、非ヒト哺乳動物において、特にマウスにおいて、ＰＡＳポリペプチドがＰＡＳ指向性抗体応答を誘発することができることである。このことは、予想外であり、本明細書において開示されるような手段および方法によって可能になる。一般に、免疫アジュバントへのコンジュゲーションはさらなるＴ細胞エピトープを提供し、したがって、コンジュゲートのペプチド部分の免疫原性を高めると考えられる。したがって、免疫系の能力が高められて、そういったペプチドに特異的に結合する抗体を生成すると思われる。しかし、本発明において使用された同じＢＡＬＢ／ｃマウス系統において先に示されたところは（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３）、ヒトＩＦＮα２ｂなどのタンパク質部分へのＰＡＳ部分のコンジュゲーションそしてマウスを繰り返し免疫することは、免疫増強剤（ブースター）としてフロイントのアジュバンをたとえ使用しても、ＰＡＳ特異的抗体の生成をまったくもたらさず、それよりも、ＩＦＮα２ｂ特異的抗体の生成をもたらしたことである。同様に、ＰＡＳ－ｈＧＨで繰り返し処置されていたマウスの血漿試料では、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）部分に対して反応性のＩｇＧがウエスタンブロットで検出可能であったが、他のタンパク質に融合されたＰＡＳ配列との交差反応性はなかった、そして、このことが指摘するところは、ＰＡＳポリペプチド自体が免疫原性ではないことである（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３）。実際、タンパク質部分に融合された場合でも、ＰＡＳ指向性免疫原性に関するこういった完全な欠如は、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ技術のキーとなる特徴であり、この特徴は、かかるＰＡ（Ｓ）ペプチドを構成する小さく生化学的に不活性なアミノ酸Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒの本質にまたはＰｒｏおよびＡｌａに直接帰するとし得る。

【0015】

先行技術が仮定したところは、ペプチドとのインターフェースは通常、結合のためにホットスポットとして機能する、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＩｌｅ（キャリアタンパク質へのコンジュゲーションに使用されたペプチドに含有される）などの大きな疎水性側鎖に富んでいることである（Ｌｏｎｄｏｎら、２０１０）。反対に、したがって驚くべきことに、本発明の結合部分の添付の結晶構造が明らかにするところは、ＰＡ（Ｓ）ペプチドの認識におけるＡｌａの特に関連があり前例のない役割である。これは特に驚くべきことであり、なぜなら、ＰＡ（Ｓ）ペプチドに含まれるアミノ酸のすべてが免疫学的に／化学的に不活性な側鎖を有し、強力な疎水性および／または静電的相互作用を形成する可能性のあるいかなる荷電側鎖および／または明白な疎水性側鎖をも欠くからである。加えて、生理学的条件下でのＰＡ（Ｓ）（ポリ）ペプチドのランダムコイル挙動は、抗体などの結合タンパク質との複合体形成時の無秩序－秩序転移にあたり相当のエントロピーコストを引き起こす。このことはまた、ＰＡＳ化抗体断片を用いる多数のｉｎ ｖｉｖｏイメージング研究によってならびにタンパク質の反復投薬を伴う前臨床動物実験においても証明されており、この場合、非標的組織または臓器へのいかなる非特異的結合もＰＡＳ特異的免疫応答もどちらも検出可能ではなかった（Ｂｏｌｚｅら、２０１６；Ｈａｒａｒｉら、２０１４；Ｍｅｎｄｌｅｒら、２０１５；Ｒｉｃｈｔｅｒら、２０２０）。まとめると、こういったＰＡＳ特異的配列／構造の特徴は、したがって、ＰＡ（Ｓ）特異的抗体を生成するための独特かつ重要な難題を提起するが、この難題は、本明細書において開示されるような本発明の方法およびペプチド／抗原によって克服された。相当する例示的Ｐ／Ａペプチド／抗原も本明細書において以下に記載される。

【0016】

本発明は、特定の実施形態では、天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメインもしくはペプチドに対して向けられた特異的結合部分、特に抗原結合分子を生成するための方法であって、非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップを含み、
これによって、前記抗原は、免疫アジュバントと１つまたは複数のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートであり、
ここで、各Ｐ／Ａペプチドは独立してペプチドＲ^Ｎ－（Ｐ／Ａ）－Ｒ^Ｃであり、
（Ｐ／Ａ）は、約５個～約１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも６０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含み、
Ｒ^Ｎは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基に結合している保護基であり、
Ｒ^Ｃはアミノ酸残基であって、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端カルボキシ基に結合され、そのアミノ基とそのカルボキシ基との間に少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個の炭素原子を含むアミノ酸残基であり、
各Ｐ／Ａペプチドは、Ｐ／ＡペプチドのＣ末端アミノ酸残基Ｒ^Ｃのカルボキシ基と免疫アジュバントの遊離アミノ基とから形成されるアミド結合を介して免疫アジュバントにコンジュゲートされる、方法に関する。

【0017】

好ましい実施形態では、本明細書において記載されるような前記抗原結合分子、好ましくは前記抗体または前記その抗原結合断片（天然変性ペプチド／タンパク質および／または天然変性ペプチド／タンパク質のドメインに対して向けられた）を生成するための方法は、前記Ｐ／Ａペプチドを用いる非ヒトの免疫方法であり、
ここで、Ｐ／Ａペプチドは、独立してペプチドＲ^Ｎ－（Ｐ／Ａ）－Ｒ^Ｃであり、約８個～約９０個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、
（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも７０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含み、
Ｒ^Ｎは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基に結合している保護基であり、
Ｒ^Ｃはアミノ酸残基であって、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端カルボキシ基に結合され、そのアミノ基とそのカルボキシ基との間に少なくとも１個の炭素原子を含む、アミノ酸残基であり、
各Ｐ／Ａペプチドは、Ｐ／ＡペプチドのＣ末端アミノ酸残基Ｒ^Ｃのカルボキシ基と免疫アジュバントの遊離アミノ基とから形成されるアミド結合を介して免疫アジュバントにコンジュゲートされる。

【0018】

本明細書で使用される場合、「特異的結合部分（単数／複数）」という用語は、特に、本明細書で論じられている、記載される抗原結合分子、抗体およびそれらの抗原結合断片を含む。しかし、上記用語はまた、前記天然変性ペプチド／タンパク質を特異的に結合することができるが、普通の抗体フォーマットではない他の分子も含む。そのような「結合部分」は、とりわけ、本明細書において提供される手段および方法を用いて取得可能な抗体に基づくまたはそれに由来する結合部分を含む融合タンパク質または（タンパク質）構築物のような分子を含むことができる。このような構築物は、とりわけ、本明細書において提供される、および／または本発明の方法を用いて取得可能な抗体／抗体断片の少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。

【0019】

特定の実施形態では、本発明は、天然変性ペプチド／タンパク質および／または天然変性ペプチド／タンパク質のドメインに対して向けられた抗原結合分子、好ましくは抗体またはそれらの抗原結合断片を生成するための手段および方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、天然変性ペプチド／タンパク質（ＩＤＰ）および／または天然変性タンパク質のドメインに対して向けられた、かつ／またはそれらに特異的に結合する、特にＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（「ＰＡＳ」）、「ＰＡＳ」配列／「ＰＡＳ」部分に特異的に結合する抗体および／またはそれらの抗原結合断片を生成するための手段および方法を提供する。

【0020】

Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（「ＰＡＳ」）、「ＰＡＳ」配列／「ＰＡＳ」部分については本明細書において定義されており、ＷＯ２００８／１５５１３４およびＷＯ２０１１／１４４７５６にも記載されている。これらの「ＰＡＳ」部分は、（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３）または（Ｂｉｎｄｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１７）にさらに記載されるように、ランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも７個のアミノ酸残基からなるペプチドにも関連し、これによって、前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）から、またはＰｒｏ（Ｐ）およびＡｌａ（Ａ）から選択される。とりわけ、タンパク質性薬物コンジュゲートに含まれるようなＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列は、例えばＷＯ２０１８／２３４４５５において「（Ｐ／Ａ）」配列としても記載される。こういった（Ｐ／Ａ）配列、すなわち、ここではＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列は、約７個～約１２００個のアミノ酸残基からなることができ、ここで、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む。さらに、本明細書の開示から明らかであり、当技術分野でも知られるように、「Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）」、「ＰＡＳ」、「ＰＡＳ部分」、または「ＰＡＳ配列」という用語は、天然変性タンパク質／ペプチド（ＩＤＰ）ならびに／またはＰｒｏおよびＡｌａのみを含むランダムコイルコンフォメーションを形成するタンパク質／ペプチドに限定されるものと解釈されるべきではない。上記用語はまた、主にＰｒｏ、Ａｌａ、およびＳｅｒから構成される相応するタンパク質／ペプチドも包含する。また、とりわけ上記のＷＯ２００８／１５５１３４、ＷＯ２０１１／１４４７５６またはＷＯ２０１８／２３４４５５（すべて参照により組み込まれる）にも開示されるように、わずかな程度までさらなるアミノ酸が含まれてもよい。

【0021】

本明細書において論じられるように、そのような（Ｐ／Ａ）配列および／またはＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）との薬物のコンジュゲーションは、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）としても知られ、これは、流体力学的容積を劇的に増大し、ｉｎ ｖｉｖｏでの腎臓ろ過を遅延させることにより血漿半減期を延長する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、２０１９；Ｌａｎｇｉｎら、２０１８；Ｒｉｃｈｔｅｒら、２０２０）。

【0022】

したがって、本発明は、構造的に無秩序な配列および／または天然変性配列、特にＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）に特異的に結合する特異的結合部分、特に抗体および／またはそれらの抗原結合断片を取得するための手段および方法を提供する。先行技術は、構造的に無秩序な配列および／または天然変性配列、特にＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列に対して向けられた抗体および／または抗原結合断片を何一つ提供しておらず、これらについて何一つ記載もしていない。さらに、先に記載されたところは、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒから、またはさらにはＰｒｏおよびＡｌａのみから、構成される組換えポリペプチドは、正確なアミノ酸配列にかかわらず － ある特定の反復パターンまたは長いホモアミノ酸ストレッチが回避される場合、高新水性および構造的に無秩序であることである（Ｂｒｅｉｂｅｃｋ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１８；Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３）。とりわけ、そのアミノ酸配列が遺伝子レベルで正確に定義されるＰＡＳポリペプチドは完全に中性であるが、一方、その側鎖は － 特にＳｅｒを含まないＰ／Ａ配列の場合 － 明白な極性基を欠く。したがって、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）の強力な親水性は、堅固な二次構造の非存在下での水性溶媒へのペプチド基の曝露によって説明される（Ｂｒｅｉｂｅｃｋ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１８）。最後にといっても大事なことであるが、明白な極性基の欠如に起因して、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列／（ＰＡＳ）配列は動物では、特に哺乳動物では免疫原性を欠く。この低免疫原性は実際、製薬分野および医療分野ではＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）技術のホールマークの１つである。

【0023】

ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）技術において用いられるようなＰＡＳポリペプチドは、哺乳動物において、特にマウス、ラットまたはウサギのようなげっ歯類、すなわち（モノクローナル）抗体の調製にルーチンに使用される動物において、免疫原性を欠く（「免疫学的に不活性」である）と知られる。実際、その制限されたアミノ酸組成の結果として、ＰＡＳポリペプチドは、とりわけ免疫応答において分子認識の役割を正常に担う荷電側鎖と嵩高い疎水性側鎖の両方を欠く。加えて、生理学的条件下でのそのランダムコイル挙動は、抗体などの結合タンパク質との複合体形成時の無秩序－秩序転移にあたり莫大なエントロピーコストを引き起こす。このことはまた、ＰＡＳ化抗体断片を用いる多数のｉｎ ｖｉｖｏイメージング研究によってならびにタンパク質の反復投薬を伴う前臨床動物実験においても証明されており、この場合、非標的組織または臓器へのいかなる非特異的結合もＰＡＳ特異的免疫応答もどちらも検出可能ではなかった（Ｂｏｌｚｅら、２０１６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、２０１９；Ｈａｒａｒｉら、２０１４；Ｍｅｎｄｌｅｒら、２０１５；Ｒｉｃｈｔｅｒら、２０２０）。

【0024】

しかし、本発明者らは、以前の動物研究におけるＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）の免疫原性に関するこういった欠如にもかかわらず、異なるＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）、特に（モノクローナル）抗体に特異的に結合する結合部分を生成することに成功した。本成功は、非ヒト動物の免疫において用いられる特異的抗原の新規で進歩性のある手立てに基づく。前記進歩性のある抗原は、本明細書では、（Ｐ／Ａ）配列［（Ｐ／Ａ）はアミノ酸配列である］または（Ｐ／Ａ）抗原［本明細書において定義されるフォーマットＲ^Ｎ－（Ｐ／Ａ）－Ｒ^Ｃのフォーマットでの］を含んで表されるが、これらは、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）など、高免疫原性のキャリアタンパク質（「免疫アジュバント」）とのそれらのコンジュゲーションによって特徴付けられる。（Ｐ／Ａ）配列または（Ｐ／Ａ）抗原は、（Ｐ／Ａ）配列／抗原のＣ末端アミノ酸またはリンカー残基のカルボキシ基（本明細書では「Ｒ^Ｃ」）と免疫アジュバントの１個または複数の遊離アミノ基との間に形成されるアミド結合を介して前記免疫アジュバントにコンジュゲートされる。さらに、本発明の文脈において用いられる（Ｐ／Ａ）配列／抗原は、Ｎ末端がブロックされる、すなわち、前記（Ｐ／Ａ）配列／抗原のＮ末端アミノ基に結合しており「Ｒ^Ｎ」と本明細書では表される保護基によってブロックされる。このことはまた、Ｎ末端特異的抗体の形成を不要とする。

【0025】

本発明の方法は、本明細書において開示されるようなそして特に本明細書で論じられるＲ^Ｎ－（Ｐ／Ａ）－Ｒ^Ｃ形態で提供されるような、（Ｐ／Ａ）ペプチド／配列／抗原による非ヒト哺乳動物（特にマウス（単数または複数））の免疫を含む。これらの（Ｐ／Ａ）配列／抗原は、本明細書において定義される免疫原、すなわちＮ末端にての保護基「Ｒ^Ｎ」およびＣ末端に連結された免疫アジュバントを含む免疫原として、直接使用される。しかし、免疫に使用される抗原が複数の前記（Ｐ／Ａ）ペプチド／配列／抗原を含むことも想定される。したがって、本発明の文脈において使用される抗原は、免疫アジュバントと、本明細書において開示されるような１つまたは複数の（Ｐ／Ａ）ペプチド／配列／抗原とのコンジュゲートである。

【0026】

好ましい（Ｐ／Ａ）ペプチド／配列／抗原は：
約５個～約１００個のアミノ酸残基、より好ましくは約８個～約９０個のアミノ酸残基からなる、アミノ酸配列／抗原であって、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも６０％、少なくとも７０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、アミノ酸配列／抗原；
約５個～約１００個のアミノ酸残基、より好ましくは約１０個～約８０個のアミノ酸残基からなる、アミノ酸配列／抗原であって、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも７０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％がプロリン、アラニンおよびセリンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、アミノ酸配列／抗原；ならびに／または
プロリン、アラニンおよびセリンから独立して選択される約２０～約４０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列／抗原であって、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも７０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、アミノ酸配列／抗原
を含むことができる。

【0027】

本発明の一実施形態では、非ヒト哺乳動物の免疫のために本明細書において提供される方法で使用される（Ｐ／Ａ）ペプチド／配列／抗原は、前記（Ｐ／Ａ）に含まれるプロリン残基の数と（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の総数との割合が、≧約１０％および≦約７０％、好ましくは≧約２０％および≦約５０％、より好ましくは≧約２５％および≦約４０％である、（Ｐ／Ａ）配列／抗原であり得る。

【0028】

上記に従って、本発明の文脈において用いられる（Ｐ／Ａ）ペプチド／配列／抗原は、（ｉ）「ＡＳＰＡ」、「ＡＰＡＰ」、「ＳＡＰＡ」、「ＡＡＰＡ」および「ＡＰＳＡ」から独立して選択される５つ以上の部分配列、ならびに（ｉｉ）任意選択で、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）およびセリン（Ｓ）から独立して選択される１個、２個または３個のさらなるアミノ酸残基からなる（Ｐ／Ａ）ペプチド／配列／抗原であり得る。（Ｐ／Ａ）ペプチド／配列／抗原はまた、「ＡＳＰＡ」、「ＡＰＡＰ」、「ＳＡＰＡ」、「ＡＡＰＡ」および「ＡＰＳＡ」から独立して選択されるこれらの部分配列のマルチマーならびに組み合わせも含むことができる。一実施形態では、前記（Ｐ／Ａ）ペプチド／配列／抗原は、（ｉ）配列ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＳＡＰＡ（配列番号１）、（ｉｉ）配列ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ（配列番号２）、（ｉｉｉ）配列ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ（配列番号３）、（ｉｖ）前述の配列のいずれかの重複、または（ｖ）前述の配列のうちの少なくとも２つの組み合わせからなる。

【0029】

かかるペプチド／配列／抗原の非限定的な例は、（ｉ）配列ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＳＡＰＡ－ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＳＡＰＡ、（ｉｉ）配列ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ－ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ、または（ｉｉｉ）配列ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡからなる（Ｐ／Ａ）である。また、これらの配列のマルチマーも本発明の要旨に含まれ、本明細書において提供される非ヒト動物の免疫方法において用いられ得る。実施形態の非限定的な例も、「ＰＡＳ＃１」、「Ｐ／Ａ＃１」、または「ＡＰＳＡ」として実験部において提供される。実験部では、（「免疫アジュバント」）にコンジュゲートされ、Ｎ末端がブロックされたかかる２０マーペプチド（または配列番号５、６または７に例示される４０マーなど、そのマルチマー）を例示的な例として用いた。驚くべきことに、ＰＡＳ配列モチーフに対する高結合活性および高特異性を有するいくつかのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が、本明細書において開示される新規で進歩性のある方法を用いて取得された。

【0030】

したがって、本発明の好ましい実施形態では、前記抗原結合分子、前記抗体および／または前記抗原結合断片を生成するための方法は、１つまたは複数のＰ／Ａペプチドを含む抗原による非ヒト動物の免疫を含み、
ここで、前記Ｐ／Ａペプチドは独立してペプチド
Ｒ^Ｎ－（Ｐ／Ａ）－Ｒ^Ｃ
であり、
前記Ｐ／Ａペプチドは約５個～約１００個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも７０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、（Ｐ／Ａ）は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含み、
Ｒ^Ｎは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基に結合している保護基であり、
Ｒ^Ｃはアミノ酸残基であって、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端カルボキシ基に結合され、そのアミノ基とそのカルボキシ基との間に少なくとも１個の炭素原子を含む、アミノ酸残基であり、
各Ｐ／Ａペプチドは、Ｐ／ＡペプチドのＣ末端アミノ酸残基Ｒ^Ｃのカルボキシ基と免疫アジュバントの遊離アミノ基とから形成されるアミド結合を介して免疫アジュバントにコンジュゲートされる。

【0031】

また、本発明のこの好ましい実施形態の文脈では、上で本明細書において提供されたＰ／Ａペプチド／抗原および／または（Ｐ／Ａ）についての説明がここでも当てはまる。
上で本明細書において論じられているように、本発明者らは、驚くべきことに、とりわけ、既知のＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）アプローチ／技術において用いられるような、天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメインもしくはペプチドに対して、特にＰＡＳ配列に対して向けられた（非ヒト）モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の生成にあたり、本明細書で提供される手段および方法により、成功を収めた。ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）技術において用いられるようなこういった天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメインもしくはペプチドまたはＰＡＳポリペプチドは、哺乳動物において、特にマウス、ラットまたはウサギのようなげっ歯類、すなわち（モノクローナル）抗体の調製にルーチンに使用される動物において、免疫原性を欠く（「免疫学的に不活性」である）と知られる。本成功は、本明細書でならびに添付の実験部で、実施例でおよび添付の図で例示されるように、本明細書に定義されるＰ／Ａペプチド／抗原または（Ｐ／Ａ）（またはそれらのマルチマー）からなるかおよび／またはそれらを含む、免疫のための抗原の使用の結果である。本明細書において論じられているように、前記Ｐ／Ａペプチド／抗原は、ランダムコイルコンフォメーションをとることができる。さらに、抗原は、本明細書において定義される２つ以上の「Ｐ／Ａペプチド」を含むことができる。前記抗原に含まれるＰ／Ａペプチドは、「ＡＳＰＡ」、「ＡＰＡＰ」、「ＳＡＰＡ」、「ＡＡＰＡ」および「ＡＰＳＡ」から独立して選択される非限定的な配列など、本明細書において定義されたとおり、同じＰ／Ａ配列の多重のコピーであり得る。例が本明細書において提供され、配列番号５、６または７のような配列においても例示される。ここでも、本発明の文脈において用いられる抗原は、免疫アジュバントと１つまたは複数のＰ／Ａペプチドとの抗原コンジュゲートであり、ここで、各Ｐ／Ａペプチドは独立して構造
Ｒ^Ｎ－（Ｐ／Ａ）－Ｒ^Ｃ
のペプチドである。

【0032】

本発明の文脈において、Ｒ^Ｎは、本明細書で定義される（Ｐ／Ａ）アミノ酸配列のＮ末端アミノ基に結合している保護基である。前記Ｒ^Ｎは、ピログルタモイル（Ｐｇａ；２－ピロリドン－５－カルボン酸または５－オキソプロリンとして知られる）、ホモピログルタモイル、ホルミル、アセチル、ヒドロキシアセチル、メトキシアセチル、エトキシアセチル、プロポキシアセチル、プロピオニル、２－ヒドロキシプロピオニル、３－ヒドロキシプロピオニル、２－メトキシプロピオニル、３－メトキシプロピオニル、２－エトキシプロピオニル、３－エトキシプロピオニル、ブチリル、２－ヒドロキシブチリル、３－ヒドロキシブチリル、４－ヒドロキシブチリル、２－メトキシブチリル、３－メトキシブチリル、４－メトキシブチリル、グリシンベタイニル（ｇｌｙｃｉｎｅ ｂｅｔａｉｎｙｌ）、ｏ－アミノベンゾイル、－ＮＨ－（Ｃ_１～６アルキル）、－Ｎ、Ｎ（Ｃ_１～８アルキル）_２、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ（Ｃ_１～６アルキル）_３、Ｎ，Ｎ－テトラメチレン、およびＮ，Ｎ－ペンタメチレンから選択され得る。

【0033】

Ｒ^Ｎが、Ｎ－（Ｃ_１～６アルキル）基、Ｎ，Ｎ－ジ（Ｃ_１～６アルキル）基、またはＮ，Ｎ，Ｎ－トリ（Ｃ_１～６アルキル）基である場合、保護される（Ｐ／Ａ）部分のアミノ基の窒素原子に結合される１個、２個または３個のＣ_１～６アルキル基が存在することになることを理解されたい。窒素原子に結合された２個または３個のアルキル基の場合では、それぞれのアルキル基はそれぞれ独立してＣ_１～６アルキル基であり、したがって、同一でも異なっていてもよい。３個のアルキル基の場合では、前記窒素原子はアンモニウム基である。

【0034】

さらに、Ｒ^ＮがＮ，Ｎ－テトラメチレン基またはＮ，Ｎ－ペンタメチレン基である場合、テトラメチレンまたはペンタメチレンの炭素鎖の両端は、保護される同じアミノ基の窒素原子に結合すること、および、したがって、それらが結合する窒素原子と一緒になって、飽和の５員環または６員環（すなわち、ピロリジン環またはピペリジン環）を形成することになることを理解されたい。

【0035】

本明細書で使用される場合、「Ｒ^Ｃ」とは、そのアミノ基を介して本明細書で定義される（Ｐ／Ａ）アミノ酸配列のＣ末端カルボキシ基に結合されるアミノ酸残基であり、「Ｒ^Ｃ」は、そのアミノ基とそのカルボキシ基との間に少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または６個の炭素原子を含む。好ましい実施形態では、前記「Ｒ^Ｃ」は、Ｈ_２Ｎ－（Ｃ_１～１２ヒドロカルビル）－ＣＯＯＨであり得る。別の好ましい実施形態では、「Ｒ^Ｃ」は、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_１～１０－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－フェニル－ＣＯＯＨ、およびＨ_２Ｎ－シクロヘキシル－ＣＯＯＨからなる群から選択され得る。さらにより好ましいのは、「Ｒ^Ｃ」は、Ｈ_２Ｎ－ＣＨ_２－ＣＯＯＨ（Ｇｌｙ）、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_２－ＣＯＯＨ（β－Ａｌａ）、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_３－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_４－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_５－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_６－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ２）_８－ＣＯＯＨ、ｐ－アミノ安息香酸、および４－アミノシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択されることである。最も好ましいのは、Ｒ^ＣはＨ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_５－ＣＯＯＨ（アミノヘキサン酸）であることである。

【0036】

好ましい実施形態では、そして添付の実施例に例示されるように、本発明の手段および方法において用いられる抗原に含まれるＰ／Ａペプチドは、ランダムコイルコンフォメーションをとる。さらに、前記抗原に含まれる前記Ｐ／Ａペプチドは荷電残基を欠く。本明細書において論じられるように、また、とりわけ上記のＷＯ２００８／１５５１３４、ＷＯ２０１１／１４４７５６またはＷＯ２０１８／２３４４５５（すべて参照により組み込まれる）にも開示されるように、わずかな程度までさらなるアミノ酸が含まれてもよい。また、こういったさらなるアミノ酸は、いかなる荷電残基をも欠くこと、および／またはいかなる明白な疎水性側鎖をも欠くことが好ましい。例示的な非限定的なアミノ酸はグリシンであり得る。

【0037】

本発明の文脈において用いられ、本明細書において提供されるような抗原は、免疫アジュバントと本明細書において定義される１つまたは複数のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートである。このような「免疫アジュバント」は当技術分野で知られ、高免疫原性キャリアタンパク質として記載されるが、この高免疫原性キャリアタンパク質は、これが投与される対象に対して排他的にではないが好ましくは外来性（すなわち、異なる種に由来する）である。好ましくは、そして実施例に例示されるように、そのような免疫アジュバントは、約５メガダルトン（５ ０００ ０００Ｄａ）を超える分子質量を有するタンパク質複合体を形成する。このような免疫アジュバントの好ましい例はＫＬＨである。同様に、こういった高免疫原性のキャリアタンパク質は、「免疫アジュバント」／高免疫原性キャリアタンパク質自体に対して向けられた検出可能な抗体力価（すなわち、それらに結合する抗体）を誘導する。本発明の文脈では、本明細書において定義されるＰ／Ａペプチドまたは（Ｐ／Ａ）アミノ酸配列は、リジン残基のε－アミノ基または前記免疫アジュバントの遊離Ｎ末端アミノ基にコンジュゲートされる。免疫アジュバントは、限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる群から選択され得る。好ましくは、前記免疫アジュバントはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。

【0038】

上記に従って、本発明の抗原のおよび本明細書において提供される手段および方法の文脈において用いられる抗原の非限定的な例は：
Ｐｇａ－ＰＡＳ＃１（４０）－Ａｈｘ：（Ｐｇａ－ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＳＡＰＡ－ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＳＰＡ－ＡＰＡＰ－ＳＡＰＡ－Ａｈｘ；配列番号５）；
Ｐｇａ－Ｐ／Ａ＃１（４０）－Ａｈｘ：（Ｐｇａ－ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ－ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ－ＡＰＡＰ－ＡＡＰＡ－Ａｈｘ；配列番号６）；
Ｐｇａ－ＡＰＳＡ（４０）－Ａｈｘ：（Ｐｇａ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－ＡＰＳＡ－Ａｈｘ；配列番号７）
である。

【0039】

Ｐｇａはピログルタミル残基（２－ピロリドン－５－カルボン酸または５－オキソプロリンとしても知られる）を意味し、Ａｈｘはアミノヘキサン酸を意味する。したがって、これらの例示的な４０マー「Ｐ／Ａ」ペプチドは、相当する「ＰＡＳ反復配列」の少なくとも２つのコピーを包含するように設計される。上記ペプチドは化学的に不活性な側鎖のみを含有し、ブロックされたＮ末端を有し、その単一のＣ末端カルボキシレート基（実際には、Ａｈｘリンカー残基のうちの一つ）が選択的に活性化され、免疫アジュバント、すなわち、添付の例ではＫＬＨのＬｙｓ側鎖のε－アミノ基への特異的化学コンジュゲーションに使用される。

【0040】

したがって、本発明は、一実施形態では、新規で進歩性のある抗原を提供するが、この抗原は、非ヒト動物において、特にマウスやラットのようなげっ歯類において、非限定的にウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ科動物等を含む他の哺乳動物においても、天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメインもしくはペプチドに対して向けられた抗原結合分子（特に抗体）を生成するための本発明の方法においてとりわけ例外なく用いられ得る。したがって、本発明はまた、本明細書において定義および提供される抗原にも関する。また、本発明の要旨は、本発明の方法におけるこういった（単数／複数の）抗原の使用でもある。それ故、本発明はまた、非ヒト哺乳動物の免疫を含む、天然変性ペプチド／タンパク質および／または天然変性ペプチド／タンパク質のドメインに対して向けられた抗原結合分子、好ましくは抗体またはその抗原結合断片を生成するための、本明細書において提供されるような抗原の非治療的使用にも関する。

【0041】

本発明によって取得可能であり取得されるような、結合部分、特に抗原結合分子、最も特に抗体またはそれらの抗原結合断片は、天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメインもしくはペプチドに対して向けられる。これらの結合部分、抗原結合分子、抗体またはそれらの抗原結合断片も本発明の一部であり、それらは、本技術分野においてまた知られるように、構造的に無秩序な配列および／または天然変性配列に、特にＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）に好ましくかつ特異的に結合する。このようなＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）は、本明細書において定義され、また、ＷＯ２００８／１５５１３４およびＷＯ２０１１／１４４７５６に記載もされる。上で論じられるように、これらの「ＰＡＳ」部分は、（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３）または（Ｂｉｎｄｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１７）にさらに記載されるように、ランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも７個のアミノ酸残基および約２０００個までのアミノ酸残基からなるペプチドにも関連し、これによって、前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）、またはＰｒｏ（Ｐ）およびＡｌａ（Ａ）から選択される。本明細書で提供される抗原結合分子の、最も特に抗体またはそれらの抗原結合断片の「結合標的」は、したがって、好ましい実施形態では、天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメインであるが、これらは、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）であり、かつ／または、ランダムコイルコンフォメーションを形成する、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも８０個、少なくとも１００個、少なくとも１２０個、少なくとも１４０個、少なくとも１６０個、少なくとも１８０個、少なくとも１９０個、少なくとも２００個、または約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、約１０００個、約１５００個または約２０００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、これによって、前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）から選択されるか、またはＰｒｏ（Ｐ）およびＡｌａ（Ａ）である。ランダムコイルコンフォメーションを形成するＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）に関するさらなる定義および説明は、とりわけ、ＷＯ２００８／１５５１３４およびＷＯ２０１１／１４４７５６に提供されており、これらの両方が参照により本明細書に組み込まれる。

【0042】

本発明のさらなる実施形態では、結合部分、特に抗原結合分子、最も特に抗体またはそれらの抗原結合断片は、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ分子；「ＰＡＳ」）に結合することができ、ここで、前記ＰＡＳは、約７個～約２０００個の、好ましくは約７個～約１２００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり得、「ＰＡＳ」中のアミノ酸残基の数の少なくとも８０％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、前記「ＰＡＳ」は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む。前記ＰＡＳはまた、約８個～約４００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり得、ここで、「ＰＡＳ」中のアミノ酸残基の数の少なくとも８５％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、「ＰＡＳ」中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％はプロリン、アラニン、グリシンおよびセリンから独立して選択され、「ＰＡＳ」は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む。本発明の結合部分はまた、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ分子；「ＰＡＳ」）に特異的に結合することができ、ここで、「ＰＡＳ」は、プロリン、アラニン、グリシンおよびセリンから独立して選択される１０個～６０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、「ＰＡＳ」中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％はプロリンおよびアラニンから独立して選択され、「ＰＡＳ」は少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む。相当する「ＰＡＳ分子」は、参照によりまた組み込まれるＷＯ２０１８／２３４４５５にも記載される。

【0043】

したがって、特定の実施形態では、本発明の結合部分、抗原結合分子または抗体（もしくはそれらの抗原結合断片）は、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）に、および／または、ランダムコイルコンフォメーションを形成する、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも４０個、好ましくは少なくとも６０個、好ましくは少なくとも８０個、より好ましくは少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１２０個、より好ましくは少なくとも１４０個、より好ましくは少なくとも１６０個、より好ましくは少なくとも１８０個、より好ましくは少なくとも２００個、より好ましくは、より好ましくは少なくとも３００個～約１２００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に、特異的に結合し、これによって、前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）から選択されるか、またはＰｒｏ（Ｐ）およびＡｌａ（Ａ）である。したがって、本発明の結合部分の好ましい標的Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ分子；「ＰＡＳ」）は、アラニン、セリンおよびプロリンを含むかもしくはそれらからなる、または、アラニンおよびプロリンを含む。

【0044】

本発明の一実施形態では、本発明の結合部分、特に抗原結合分子、最も特に抗体またはそれらの抗原結合断片は、前記ＰＡＳ標的配列上の少なくとも１つのエピトープに結合し、かつ／またはそれを検出することができる。本エピトープは線状エピトープであってもよいが、三次元構造によってもたらされるエピトープであってもよい。添付の非限定的な実施例は、エピトープマッピング、ＳＰＯＴエピトープ解析、抗原親和性測定（例えばＥＬＩＳＡによる）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）リアルタイム測定、ウエスタンブロッティングを含めて、抗原結合断片（特にＦａｂ断片）の共結晶化等によっても、相応する結合研究に対する十分な証拠を提供する。限定するものではないが、本発明の一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、最も特に抗体またはそれらの抗原結合断片は、構造
（Ｐ／Ｓ）Ａ（Ａ／Ｓ）Ｐ；および／または
ＰＡ（Ａ／Ｓ）Ｐ
の少なくとも１つのエピトープを含む、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列を結合することができる。

【0045】

前記エピトープは、ＰＡＰＡＡＰ（配列番号８）、ＰＡＰＡＳＰ（配列番号９）、ＰＡＳＰＡＡＰ（配列番号１０）、ＰＳＡＡＰＳ（配列番号７９）、ＡＳＰＡＡＰ（配列番号８０）、ＰＡＳＰＡＡ（配列番号８１）、ＰＡＡＰ（配列番号８２）、ＰＡＳＰ（配列番号８３）、ＡＰＳＡ（配列番号８４）およびＰＳＡＡ（配列番号８５）からなる群から選択されるエピトープストレッチであってもよく、またはこれを含んでもよい。

【0046】

本明細書で添付の実施例に、および以下に例示されるように、本発明は、複数の新規で進歩性のある抗体またはその抗原結合断片を提供する。ここでも、限定することなく、理論に拘束されることなく、
「ＰＡＡＰ」のエピトープ検出が、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２に対して推定される；
「ＰＡＳＰ」のエピトープ検出が、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２に対して推定される；
「ＰＡＰＡＳＰ」のエピトープ検出が、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１に対して推定される；
「ＰＡＰＡＡＰ」のエピトープ検出が、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１に対して推定される；
「ＰＡＳＰＡＡＰ」のエピトープ検出が、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２に対して推定される；
「ＰＡＳＰＡＡ」のエピトープ検出が、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１に対して推定される；
「ＡＳＰＡＡＰ」のエピトープ検出が、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２に対して推定される；
「ＡＰＳＡ」のエピトープ検出が、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２に対して推定される；
「ＰＳＡＡ」のエピトープ検出が、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２に対して推定される；
「ＰＳＡＡＰＳ」のエピトープ検出が、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２に対して推定される。

【0047】

また、本明細書において提供される抗原結合分子（Ｆａｂ断片）の添付の、非限定的であるが高度に例示的な（共）結晶化データのとおり、実施例のさらなるエピトープ研究が例示するところは、本発明の抗原結合分子（すなわち、抗体／それらの抗原結合断片）は、アラニン残基（Ａ、Ａｌａ）を含むエピトープに結合する。興味深いことに、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列のうちの少なくとも１個のＡｌａ残基は、抗ＰＡＳ Ｆａｂとの適切な相互作用に関与する；したがって、限定するものではないが、アラニンは、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列内のＰＡＳエピトープとの本発明の抗体の相互作用のための「ホットスポット」と考えられ得る。本発明に至るまで、最小の側鎖を有するアミノ酸であるＡｌａは、タンパク質－タンパク質／ペプチド認識において取るに足りない役割を担うとされてきた。事実、アラニンスキャニング突然変異誘発の戦略（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ Ｗｅｌｌｓ、１９８９）は、受容体－リガンド結合または抗体－抗原結合にクリティカルな残基を精査するための幅広い応用を見出し、その結果、分子相互作用に対するＡｌａメチル側鎖の準不活性な役割を想定した。予想外なことに、本発明が明らかにするところは、特に本発明の文脈において提供される結晶構造研究によって例示されるように、Ａｌａが実際に抗原認識において中心的な役割を取ることができることである。

【0048】

これに関連して、本発明はまた、本発明の結合部分、抗原結合分子、抗体／その抗原結合断片と、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）分子および本明細書において提供されるようなエピトープ、特にアラニンを含むエピトープとの間の複合体を提供する。これらのエピトープは、（Ｐ／Ｓ）Ａ（Ａ／Ｓ）Ｐおよび／またはＰＡ（Ａ／Ｓ）Ｐのような構造を含むことができる。例が本明細書において提供される。

【0049】

本発明のさらなる実施形態では、本明細書において提供される手段および方法によって取得可能であるような特異的結合部分、特に本発明の抗原結合分子（抗体およびそれらの抗原結合断片など）と、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列／（ＰＡＳ）分子との間の、複合体が本明細書で提供され、特許請求される。また、本発明の結合部分または抗原結合分子（抗体およびそれらの抗原結合断片など）と、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（（ＰＡＳ）分子）を含む融合タンパク質および／または薬物コンジュゲートとの間の複合体は、本発明の一部である。本発明のそのような「抗「ＰＡＳ」複合体」は、限定するものではないが、診断、スクリーニングの方法において、また本明細書において提供される研究ツールとしても特に有用である。

【0050】

上で論じられているように、そして添付の実施例で例示されているように、本発明者らは、初めて、天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメインもしくはペプチド、特に、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）分子および／またはこういったＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）分子によって構成されるかまたはそれらによって形成されるエピトープを特異的に結合する結合部分、抗原結合分子、抗体／それらの抗原結合断片を提供する。

【0051】

したがって、本発明は、本明細書で提供される手段、特に方法によって取得可能であるようなおよび／または取得されるような結合部分、抗原結合分子、抗体／それらの抗原結合断片を含む。したがって、本発明はまた、本明細書において提供される方法によって取得可能な、特異的結合部分、好ましくは抗原結合分子、より好ましくは抗体、ならびに／または、天然変性タンパク質および／もしくは天然変性タンパク質のドメインに、または前記天然変性タンパク質および／もしくは天然変性タンパク質のドメインの抗原性部分に、特異的に結合する、特異的結合部分、好ましくは抗原結合分子、より好ましくは抗体を提供し、
（ｉ）ここで、前記天然変性タンパク質および／もしくは天然変性タンパク質のドメインは、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）であり、および／またはランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも２０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、これによって、前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）から選択されるか、またはＰｒｏ（Ｐ）およびＡｌａ（Ａ）であり、ならびに／または
（ｉｉ）前記特異的結合部分、好ましくは前記抗原結合分子は、構造：（Ｐ／Ｓ）Ａ（Ａ／Ｓ）Ｐおよび／またはＰＡ（Ａ／Ｓ）Ｐのエピトープに結合する。このようなエピトープは、ＰＡＰＡＡＰ（配列番号８）、ＰＡＰＡＳＰ（配列番号９）、ＰＡＳＰＡＡＰ（配列番号１０）、ＰＳＡＡＰＳ（配列番号７９）、ＡＳＰＡＡＰ（配列番号８０）、ＰＡＳＰＡＡ（配列番号８１）、ＰＡＡＰ（配列番号８２）、ＰＡＳＰ（配列番号８３）、ＡＰＳＡ（配列番号８４）およびＰＳＡＡ（配列番号８５）からなる群から選択され得る。

【0052】

本発明の結合部分は、抗原結合分子ならびに抗体（ＭＡｂ）またはそれらの抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ）であり得る。前記抗原結合分子は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、抗体、その抗原結合断片、二重特異性抗体、ＩｇＧ抗体、ラクダ／ラマ重鎖抗体（ラクダ科動物の抗体）、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）または抗体模倣物であり得る。本発明はまた、本発明の結合部分、抗原結合分子ならびに抗体またはそれらの抗原結合断片に基づいて組換え手段を介して操作され、かつ、本明細書において提供される手段および方法によって取得可能であるような、抗体、抗体構築物のそれらの抗原結合断片を含む。例えば、抗原結合分子の相当する配列情報は、そのような操作された／組換え結合部分／抗原結合分子の構築において用いられ得る。このような操作された／組換え結合部分／抗原結合分子は、とりわけ、本発明の方法によって取得される、または本明細書において例示的に提供されるような、抗体のＣＤＲ配列に基づくことができる。

【0053】

本発明はまた、モノクローナル抗体、キメラ抗体、組換え抗体、および組換え抗体またはキメラ抗体の抗原結合断片からなる群から選択され得る抗原結合分子／抗体も提供する。発明にかかわる抗原結合断片は、限定するものではないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、（Ｆａｂ’）_２断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインもしくはナノボディなどの断片であり得る。本明細書において使用されるような「抗体」という用語は、ヒト化抗体、またはファージ、酵母細胞、細菌細胞もしくは哺乳動物細胞の表面で提示される抗体も含む。本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の各抗体であり得る。

【0054】

本発明のＰＡＳ結合部分／抗体（抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ）は、構造的に無秩序なＰＡＳ配列、配列ストレッチ、（ポリ）ペプチドセグメントまたはタンパク質のドメインを欠くタンパク質との交差反応性を実質的に示さないか、または非常に低い交差反応性を示す。具体的には、前記抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂは、ヒト血漿タンパク質および／または霊長類、哺乳動物、げっ歯類由来の、特にサル、マカク、ヒヒ、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ由来の血漿タンパク質とまったく交差反応性を示さないか、または非常に低い交差反応性を示す。さらに、別の実施形態では、前記抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂは、組換えタンパク質生産、遺伝子工学またはバイオテクノロジーの分野において通常に用いられるような生産生物体、例えば、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）もしくはシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のような細菌、または、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母、またはＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳ０もしくはＣＯＳの各細胞のような哺乳動物細胞由来の宿主細胞タンパク質との交差反応性をまったく示さないか、または非常に低い交差反応性を示す。

【0055】

本発明によるＰＡＳ結合部分／抗体（抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ）は、ＰＡＳ配列、ＰＡＳポリペプチドおよび／またはＰＡＳ融合タンパク質もしくはコンジュゲートに対して高親和性／低解離定数（Ｋ_Ｄ値）を示す。このようなＫ_Ｄ値は、当技術分野でよく知られる多くの技法を使用して、例えば、下に本明細書においてさらに開示される実施例に例示されるようなＥＬＩＳＡまたはＳＰＲ測定を使用して決定され得る。注目すべきことに、かかる測定は、インタクトな抗体（ＭＡｂ）についてまたはそれらの抗原結合断片について、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片について実施され得、相当するＫ_Ｄ値は、抗体タンパク質のタイプ（インタクトなまたは断片）および使用されるまさにそのアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、蛍光滴定等）に応じて異なることができる。一般に、好ましいＫ_Ｄ値は、５００μＭ未満、２００μＭ未満、１００μＭ未満、５０μＭ未満、１０μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満、５００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、さらにより好ましくは１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満または１００ｐＭ未満である。生物分析アッセイまたは診断アッセイにおける本発明による抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂの使用の場合、特に低いＫ_Ｄ値が好ましいが、例えば、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満または２ｎＭ未満、さらにより好ましくは１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満または１００ｐＭ未満である。

【0056】

理論に拘束されることなく、添付の実施例にも示されるように、本発明の結合部分／抗体の見かけの親和性は、アビディティ効果によって影響され、多重のエピトープを含有する長いＰＡＳ反復配列と相互作用する場合、二価ＭＡｂに対して最も明白であると思われる。その同族のＰＡＳエピトープペプチドと複合体を形成した本発明の抗体の組換えＦａｂ断片のＸ線構造解析が明らかにしたところは、その相互作用は、ペプチド骨格による水素結合ネットワークならびに密接な形状相補性からもたらされる多重のファンデルワールス相互作用によって支配されることである。上で論じられているように、そして最も驚くべきことに、最小の側鎖を有するアミノ酸であるＡｌａが（側鎖を欠くＧｌｙは別として）、本発明の結合部分／抗体の抗原認識にとって極めて重要な機能として浮かび上がった。前記Ａｌａは、さまざまな「抗ＰＡＳ複合体」のパラトープの中心で大きな貢献をもたらす。

【0057】

本発明はまた、本発明の結合部分／抗原結合分子／抗体および／またはこれらの本発明の抗体の抗原結合断片の具体的であるが非限定的な例も提供する。また、これに関連して、「抗原結合分子」という用語は抗原結合断片を含むが、一方、上記用語は特に、本明細書において提供され、本明細書において記載されるような天然変性ペプチド／タンパク質および／または天然変性ペプチド／タンパク質のドメインに対して向けられた、および／または、本発明の方法によって取得可能である、本発明の抗体の抗原結合断片も好ましくは含む。

【0058】

したがって、本発明は、
ａ）配列番号３５において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と、
配列番号３６において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と、
配列番号３７において定義されるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号３８において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と、
配列番号３９において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と、
配列番号４０において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または、
（ａ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片；
ｂ）配列番号４１において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と、
配列番号４２において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と、
配列番号４３において定義されるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号４４において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と、
配列番号４５において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と、
配列番号４６において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ｂ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片；
ｃ）配列番号４７において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と、
配列番号４８において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と、
配列番号４９において定義されるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号５０において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と、
配列番号５１において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と、
配列番号５２において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ｃ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片；
ｄ）配列番号５３において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と、
配列番号５４において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と、
配列番号５５において定義されるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号５６において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と、
配列番号５７において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と、
配列番号５８において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ｄ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片；
ｅ）配列番号５９において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と、
配列番号６０において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と、
アミノ酸Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇを含むかまたはそれからなるＣＤＲ－Ｈ３と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号６２において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と、
配列番号６３において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と、
配列番号６４において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ｅ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片；
ならびに
ｆ）配列番号６５において定義されるＣＤＲ－Ｈ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と、
配列番号６６において定義されるＣＤＲ－Ｈ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と、
配列番号６７において定義されるＣＤＲ－Ｈ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と
を含む可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは
配列番号６８において定義されるＣＤＲ－Ｌ１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と、
配列番号６９において定義されるＣＤＲ－Ｌ２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と、
配列番号７０において定義されるＣＤＲ－Ｌ３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］と
を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むか、または
（ｆ）のＣＤＲのいずれか１つもしくは複数を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片
からなる群から選択される、抗原結合ドメインも提供する。

【0059】

抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ３．１を構成するような配列「Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ」は、本明細書では配列番号６１として指示される。しかし、添付の配列表では、この配列番号は「０００」として表されるが、なぜなら、本配列は３個のアミノ酸のみからなり、ＢｉＳＳＡＰは３個のアミノ酸残基のみを有する配列を含めることを許可しないからであることを理解されたい。また、ＳＴ．２５規格が指示するところは、長さが４個以上のアミノ酸残基を有する配列のみが対応する配列表に含まれるものとすることである。

【0060】

一実施形態では、本発明は、本発明の抗体もしくは抗原結合断片のいずれかと同じエピトープに結合する、または本発明の手段および方法によって取得可能であるような、抗原結合分子に関する。本発明の特定の一実施形態では、前記抗原結合分子は、（ａ）～（ｆ）により上に本明細書において定義される抗体または抗原結合断片のいずれかと同じエピトープに結合する。

【0061】

上で本明細書において論じられているように、本発明はまた、本発明の抗体の抗原結合断片である抗原結合分子を含む。これらの抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片からなる群から選択され得る。このような抗原結合断片は、タンパク質結晶学からのデータおよびエピトープ結合に関するデータをも含めて、添付の実施例に例示される。また、エピトープの解明のためとともにエピトープ結合のための、他の手段および方法も、添付の実験部に十分に提供される。相当する技法は、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットのような免疫学的アッセイ、ならびにエピトープマッピングのためのＳＰＯＴアッセイ、さらには、例えば、組換えＦａｂ断片とＰＡＳエピトープペプチドの間の複合体に関するＸ線構造解析のようなより複雑な技法も含む。しかし、当業者であれば、抗体および／またはその抗原結合断片を含めて、所定の抗原結合分子のエピトープ結合を容易に推定することができる立場にいる。

【0062】

本発明の文脈では、「同じエピトープへの結合」という用語は、線状エピトープに限定されず、本用語は、同じ三次元立体構造へのまたは「立体構造」エピトープへの結合も含むことができる。

【0063】

さらなる実施形態では、本発明は、抗原結合分子、特に抗体またはその抗原結合断片に関し、ここで、前記抗原結合分子、抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号１１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］、配列番号１３［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］、配列番号：１５［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］、配列番号１７［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］、配列番号１９［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］もしくは配列番号２１［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］のアミノ酸配列、
もしくは配列番号１１、１３、１５、１７、１９もしくは２１と８５％、好ましくは８７％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
を含む可変重（ＶＨ）鎖配列；ならびに
配列番号１２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１］、配列番号１４［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２］、配列番号１６［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１］、配列番号１８［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２］、配列番号２０［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］もしくは配列番号２２［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２］のアミノ酸配列、
もしくは配列番号１２、１４、１６、１８、２０もしくは２２と８５％、好ましくは８７％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含むか；または、
（ｂ）（ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体である。

【0064】

これに関して、配列番号１１、１３、１５、１７、１９または２１は、例示的な抗体の重鎖可変領域／可変重（ＶＨ）鎖配列を提供し、一方、配列番号１２、１４、１６、１８、２０または２２は、例示的な抗体の軽鎖可変領域／軽重（ＶＬ）鎖配列を提供する。注目すべきことに、配列番号１９に示されるような重鎖配列番号１９［抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１］のＣＤＲ－Ｈ３は比較的短く、単に３個のアミノ酸、すなわちアミノ酸Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ（配列番号６１；「抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１」についての添付の配列プロトコルにおけるプレースホルダーとして「０００」配列によって特徴付けられる）を含む。

【0065】

本発明の特に好ましい抗原結合分子または抗体、すなわち、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１として本明細書において表される抗体は、
ａ）配列番号３５において定義されるＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号３６において定義されるＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３７において定義されるＣＤＲ－Ｈ３とを含む可変重（ＶＨ）鎖、および、配列番号３８において定義されるＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号３９において定義されるＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号４０において定義されるＣＤＲ－Ｌ３とを含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含むか、または、
ｂ）（ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体である、
抗原結合分子または抗体である。

【0066】

本発明のさらに好ましい抗原結合分子または抗体、すなわち、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２として本明細書において表される抗体は、
ａ）配列番号４１において定義されるＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号４２において定義されるＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号４３において定義されるＣＤＲ－Ｈ３とを含む可変重（ＶＨ）鎖、および、配列番号４４において定義されるＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号４５において定義されるＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号４６において定義されるＣＤＲ－Ｌ３とを含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含むか、または
ｂ）（ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体である、
抗原結合分子または抗体である。

【0067】

本発明のさらに好ましい抗原結合分子または抗体、すなわち、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１として本明細書において表される抗体は、
ａ）配列番号４７において定義されるＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号４８において定義されるＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号４９において定義されるＣＤＲ－Ｈ３とを含む可変重（ＶＨ）鎖、および、配列番号５０において定義されるＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５１において定義されるＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号５２において定義されるＣＤＲ－Ｌ３とを含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含むか、または
ｂ）（ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体である、
抗原結合分子または抗体である。

【0068】

本発明のさらに好ましい抗原結合分子または抗体、すなわち、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１として本明細書において表される抗体は、
ａ）配列番号５９において定義されるＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号６０において定義されるＣＤＲ－Ｈ２と、アミノ酸配列Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇを含むかまたはそれからなるＣＤＲ－Ｈ３とを含む可変重（ＶＨ）鎖、および、配列番号６２において定義されるＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号６３において定義されるＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６４において定義されるＣＤＲ－Ｌ３とを含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含むか、または
ｂ）（ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体である、
抗原結合分子または抗体である。

【0069】

本発明の結合部分／抗体は、「免疫学的に不活性」として知られる抗原（ＰＡＳ配列など）に対する抗体が、本明細書において提供されるような免疫アプローチを介してどのように取得され得るかということへの、貴重な洞察を提供する。さらに、本発明はまた、明白な疎水性側鎖もしくは荷電側鎖を欠く、および／または明確な二次構造がない、および／またはランダムコイルのコンフォメーションもしくは立体配置を含む、「特徴のないペプチド」に特異的に結合するかつ／またはそれを認識する結合部分／抗体が取得され得る、手段および方法も提供する。本発明の文脈において提供され、本明細書において特徴付けられるような結合部分／抗体はまた、ＰＡＳ化生物製剤またはＰＡＳ化（小分子）薬物のような － 「ＰＡＳ化」とはＰＡＳ分子／配列（ポリ）ペプチドとコンジュゲートされることを意味する － 薬物コンジュゲートの前臨床および臨床開発のための貴重なツールも提供する。

【0070】

例示的なＰＡＳ化タンパク質またはペプチドとしては、それらに限定されないが、以下が挙げられる：アデノシンデアミナーゼ、アガルシダーゼアルファ、アルファヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリンまたはアナログ、抗ＨＩＶ融合阻害剤（エンフルビチドなど）、アスパラギナーゼ（カラスパルガーゼなど）、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子（ベロクトコグアルファまたはオクトファクターなど）、エンドリシンおよびエクトリシンを含むバクテリシン、二環式ペプチド（ＴＧ－７５８など）、ブラジキニンアンタゴニスト（イカチバントなど）、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰまたはＢ型ナトリウム利尿ペプチド）、カルシトニン、ＣＤ１９アンタゴニスト、ＣＤ２０アンタゴニスト（Ｒｉｔｕｘａｎなど）、ＣＤ３受容体アンタゴニスト、ＣＤ４０アンタゴニスト、ＣＤ４０Ｌアンタゴニスト（ダピロリズマブまたはアントバなど）、セレブロシドスルファターゼ、絨毛性ゴナドトロピン、凝固第ＩＶ因子、凝固第ＩＸ因子、凝固第ＶＩＩａ因子（エプタコグアルファなど）、凝固第ＶＩＩＩ因子（スソクトコグアルファなど）、凝固第Ｘａ因子、凝固ＸＩＩＩ因子（カトリデカコグなど）、補体成分５ａアンタゴニスト、補体因子Ｃ３阻害剤、Ｃペプチド、クリサンタスパーゼ、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ドルナーゼアルファなど）、ＥＧＦＲ受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（エリスロポエチンアルファまたはエリスロポエチンゼータなど）、エキセンディン－４、エキセンディン－４アナログ（エキセンディン９－３９など）、ＦｃγＩＩＢ受容体アンタゴニスト、線維芽細胞増殖因子１（ヒト酸性線維芽細胞増殖因子）、線維芽細胞増殖因子１８、線維芽細胞増殖因子２（ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子）、線維芽細胞増殖因子２１、線維芽細胞増殖因子受容体２アンタゴニスト（ＦＰＡ１４４など）、卵胞刺激ホルモン（フォリトロピンアルファまたはフォリトロピンベータなど）、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、ＧＩＰアナログ、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１アナログ（リキシセナチド、リラグルチドまたはセミグルチドなど）、ＧＬＰ－２、ＧＬＰ－２アナログ（テドゥグルチドなど）、グルカゴンまたはアナログ、グルコセレブロシダーゼ（イミグルセラーゼなど）、ゴナドレリン、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ゴセレリン、ブセレリン、トリプトレリン、ロイプロリド、プロチレリン、レシレリン、フェルチレリンまたはデシオレリン）、ゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニスト（アバレリクス、セトロレリクス、デガレリクス、ガニレリクスまたはテベレリクスなど）、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、グレリン、成長ホルモン（ヒト、ネコ、ウシまたはブタの成長ホルモンなど）、ヘマタイド、肝細胞増殖因子、ヘプシジンアンタゴニスト、ｈｓｐ７０アンタゴニスト、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（絨毛性ゴナドトロピンアルファなど）、ヒト副甲状腺ホルモン、ヒアロシダーゼまたはボブヒアルロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ（ヒトヒアルロニダーゼＰＨ－２０など）、グルコセレブロシダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、インスリン、インスリンアナログ、インスリン様増殖因子１、インスリン様増殖因子２、インテグリンα４β１アンタゴニスト、インターフェロンタウ、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－アルファアンタゴニスト、インターフェロン－アルファスーパーアゴニスト、インターフェロン－アルファ－ｎ３（アルフェロンＮ注射液など）、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ、インターフェロン－ラムダ、インターロイキン、インターロイキン２融合タンパク質（ＤＡＢ（３８９）ＩＬ－２など）、インターロイキン受容体アンタゴニスト（インターロイキン１受容体アンタゴニスト、ＥＢＩ－００５またはアナキンラなど）、インターロイキン－１１（オプレレブキンなど）、インターロイキン－１２、インターロイキン－１７受容体アンタゴニスト、インターロイキン－１８結合タンパク質、インターロイキン－２、インターロイキン－２２、インターロイキン－２２受容体サブユニットアルファ（ＩＬ－２２ｒａ）アンタゴニスト、インターロイキン－３８（ＩＬ－３８）、インターロイキン－４、インターロイキン－６受容体アンタゴニスト、インターロイキン－７、キヌレニナーゼ、Ｌ－アルギニン分解酵素（アルギナーゼまたはアルギニンデイミナーゼなど）、レプチン、Ｌ－イズロニダーゼ、Ｌ－フェニルアラニン分解酵素（フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたはフェニルアラニンアンモニアリアーゼなど）、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ（エロスルファーゼアルファなど）、ナノフィチン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、アンチカリン、オクトレオチド、オルニトドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ）補体阻害剤（ＯｍＣＩ／コバーシン）、パラソルモン（ＰＴＨ）、ＰＤ１アンタゴニスト、ＰＤ１Ｌアンタゴニスト、ＰＤＧＦアンタゴニスト、（ＰＹＹ３－３６）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（バリアーゼなど）、ファイロマー、血小板由来増殖因子、リラキシン、リラキシンアナログ、セクレチン、ＲＧＤペプチド、セリンプロテアーゼ阻害剤（コネスタットアルファなど）、可溶性ＣＤ６４、可溶性ＤＣＣ（結腸直腸がんで欠失）受容体、可溶性Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４など）、可溶性腫瘍壊死因子Ｉ受容体（ｓＴＮＦ－ＲＩ）、可溶性腫瘍壊死因子ＩＩ受容体（ｓＴＮＦ－ＲＩＩ）、可溶性ＶＥＧＦ受容体、ソマトスタチン、ソマトスタチンアナログ（パシレオチドまたはＣＡＰ－２３２など）、ストレスコピン、Ｔ細胞受容体リガンド、テリパラチド（ＰＴＨ１－３４）、チモシンアルファ１、チモシンベータ４、チモシンベータ１５、腫瘍壊死因子（ＴＮＦアルファ）、腫瘍壊死因子アルファアンタゴニスト、ウリカーゼ（ラスブリカーゼまたはペガドリカーゼなど）、ウロコルチン、血管作動性腸管ペプチド、バソプレシン、バソプレシンアナログ（デスモプレシン、フェリプレシンまたはテリプレシンなど）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（ランビズマブまたはベバシズマブなど）、ＶＥＧＦアンタゴニスト、アドネクチン、ＰＤＧＦアンタゴニスト、ＤＡＲＰｉｎ、フォン・ヴィレブランド因子（ヴォニコグアルファなど）。

【0071】

例示的なＰＡＳ化小分子薬物としては、それらに限定されないが、アマニチン、オーリスタチン、カリケアマイシン、カンプトテシン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ドキソルビシン、フマギリン、デキサメタゾン、ゲルダナマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、シクロスポリン、ブプレノルフィン、ナルトレキソン、ナロキソン、ビンデシン、バンコマイシン、リスペリドン、アリピプラゾール、パロノセトロン、グラニセトロン、シタラビン、核酸（アンチセンス核酸など）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）阻害剤、マイクロＲＮＡ模倣物、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＲＮＡワクチン、ＤＮＡワクチン、ワクチンの調製に適した炭水化物、例えば腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ、α－ＧａｌＮＡｃ－Ｏ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、シアリルＴｎ抗原（例えばＮｅｕＡｃα（２，６）－ＧａｌＮＡｃα－Ｏ－Ｓｅｒ）／Ｔｈｒ）、トムセン・フリーデンライヒ抗原（Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１）、ルイスＹ（例えば、Ｆｕｃα（１，２）－Ｇａｌβ（１，４）－［Ｆｕｃα（１，３）］－ＧａｌＮＡｃ）、シアリル－ルイスＸまたはシアリル－ルイスＡが挙げられる。

【0072】

特定の文脈では、例えば研究目的の場合、診断ツールとして、患者層別化等を含めて、スクリーニング方法において、本発明の抗原結合分子、特に抗体またはその抗原結合断片は、タグおよび／またはラベルを含むことが、有用である場合がある。したがって、本発明はまた、本発明の手段および方法によって取得可能であるような、および／または本明細書において提供されるような抗原結合分子／抗体／それらの抗原結合断片にも関し、ここで、前記抗原結合分子／抗体／その抗原結合断片は、レポーター分子（単数または複数の）、タグ（単数または複数の）、および／または標識（単数または複数の）にコンジュゲートされるかまたは融合される。このようなレポーター分子、タグおよび／または標識は、当技術分野で非常によく知られており、とりわけ、キサンテン誘導体、例えばフルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ４８８のようなＡｌｅｘａ色素などの、化学的に活性化された様式で例えば適用される小分子蛍光色素（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、ヨードアセテートまたはマレイミドを含む）、Ｃｙ３またはＣｙ５などのシアニン誘導体、４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）などの有機ホウ素化合物、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどの小分子（ハプテン）、緑色蛍光タンパク質もしくはその誘導体、赤色蛍光タンパク質もしくはその誘導体またはアロフィコシアニンなどの蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素、またはルシフェラーゼなどの可視光放射（生物発光）を触媒する酵素を含む。

【0073】

本発明はまた、本発明の抗原結合分子、特に抗体または抗原結合断片の可変重（ＶＨ）鎖配列および／または可変軽（ＶＬ）鎖配列の少なくとも１つをコードする、ポリヌクレオチドも提供する。本発明の好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、以下の少なくとも１つをコードする：Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）および／またはランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも４個もしくは少なくとも１０個もしくは少なくとも２０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に、特異的に結合することができ、これによって、前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）から選択されるか、またはＰｒｏ（Ｐ）およびＡｌａ（Ａ）であり、あるいは、その抗原性部分に特異的に結合することができる、抗原結合分子、特に抗体またはその抗原結合断片の可変重（ＶＨ）鎖配列および／または可変軽（ＶＬ）鎖配列。本発明のポリヌクレオチドは、構造：
（Ｐ／Ｓ）Ａ（Ａ／Ｓ）Ｐ；および／または
ＰＡ（Ａ／Ｓ）Ｐ
のエピトープに結合することができる抗原結合分子（またはその断片）をコードすることができる。

【0074】

本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、本明細書において提供されるような抗原結合分子、特に抗体または抗原結合断片の可変重（ＶＨ）鎖配列の少なくとも１つおよび／または可変軽（ＶＬ）鎖配列の少なくとも１つをコードする。好ましくは、前記抗原結合分子、特に抗体または抗原結合断片は、天然変性タンパク質上のおよび／または天然変性タンパク質のドメインもしくはペプチド上のエピトープを結合する。好ましくは、前記天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメインもしくはペプチドは、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）を含むか、またはそれらからなる。前記エピトープは、本明細書において開示されるようなエピトープ／エピトープストレッチを含むことができ、ＰＡＰＡＡＰ（配列番号８）、ＰＡＰＡＳＰ（配列番号９）、ＰＡＳＰＡＡＰ（配列番号１０）、ＰＳＡＡＰＳ（配列番号７９）、ＡＳＰＡＡＰ（配列番号８０）、ＰＡＳＰＡＡ（配列番号８１）、ＰＡＡＰ（配列番号８２）、ＰＡＳＰ（配列番号８３）、ＡＰＳＡ（配列番号８４）およびＰＳＡＡ（配列番号８５）からなる群から選択され得る。

【0075】

ＤＮＡまたはＲＮＡを含めて、相当するポリヌクレオチド分子／核酸分子は、当業者に知られ、添付の実施例にも例示されるようなルーチンの配列決定法を介して容易に取得され得る。このような配列決定技法のソースとして、本発明の方法に従って免疫された非ヒト動物由来のＢ細胞が使用され得る。このような細胞は、例えば（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、１９８８）など、モノクローナル抗体の生成に関するマニュアルに例示されるように、例外なく生産され得る「ハイブリドーマ細胞」を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡを含めて、そのような本発明のポリヌクレオチド分子／核酸分子の例は、寄託されたクローンＤＳＭ ＡＣＣ３３６５、ＤＳＭ ＡＣＣ３３６６またはＤＳＭ ＡＣＣ３３６７に含まれるＤＮＡを含めて、上記ポリヌクレオチド分子／核酸分子である。これらの寄託されたクローンは、本発明の例示的なモノクローナル抗体（抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ）、それぞれ、抗ＰＡ（Ｓ） Ｍａｂ １．１、抗ＰＡ（Ｓ） Ｍａｂ ２．１および抗ＰＡ（Ｓ） Ｍａｂ ３．１をコードすることができるポリヌクレオチドを含む、ハイブリドーマである。

【0076】

同封の寄託受領書から明白なように、これら３つのハイブリドーマはＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙの規定に基づいて、２０２０年１１月１３日（２０２０－１１－１３）に「ＤＳＭＺ」（Ｌｅｉｂｎｉｔｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ－Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）に寄託され、前記Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙからの受託番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３３６５（抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ １．１）；ＤＳＭ ＡＣＣ３３６６（抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ ２．１）およびＤＳＭ ＡＣＣ３３６７（抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ ３．１）を受領した。

【0077】

本発明はまた、これらの寄託物、したがってハイブリドーマＤＳＭ ＡＣＣ３３６５、ＤＳＭ ＡＣＣ３３６６およびＤＳＭ ＡＣＣ３３６７にも関する。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、すなわち、本発明の、抗原結合分子、特に抗体または抗原結合断片の可変重（ＶＨ）鎖配列および／または可変軽（ＶＬ）鎖配列の少なくとも１つをコードする、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本発明の（宿主）細胞はまた、ＤＳＭ ＡＣＣ３３６５、ＤＳＭ ＡＣＣ３３６６またはＤＳＭ ＡＣＣ３３６７など、本明細書において提供されるようなハイブリドーマに含まれるポリヌクレオチドを発現する細胞でもあり得る。前記ハイブリドーマはまた、本発明の宿主細胞でもあり得る。

【0078】

また、本明細書では、本発明の抗原結合分子、特に抗体または抗原結合断片を生産するための方法であって、本発明のハイブリドーマを培養するステップ、および／または本発明の宿主細胞、例えば細菌細胞もしくは哺乳動物細胞を培養するステップを含む、方法も提供される。前記本発明の抗原結合分子の前記生産は、本発明の宿主細胞および／またはハイブリドーマのルーチンの培養ステップを含んでもよい。本発明の、抗原結合分子、特に抗体または抗原結合断片を産生するさらなるハイブリドーマは、本明細書において定義される天然変性タンパク質および／または天然変性タンパク質のドメインもしくはペプチドに対して向けられたかつ／またはそれらに特異的に結合する、結合部分、特に抗原結合分子を生成するための本明細書において提供される手段および方法によって、例外なく取得され得る。本発明の抗原結合分子の生産方法はまた、培養系からの、例えば宿主細胞／ハイブリドーマの培養ブロスからの前記抗原結合分子の単離または精製も含むことができる。

【0079】

一実施形態では、本発明はまた、本明細書において定義されるＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）にまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体を生産するための方法を提供し、前記方法は、非ヒト哺乳動物に、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）、および／または
ランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも２０個、好ましくは４０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を投与するステップを含み、これによって、前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）から選択されるか、またはＰｒｏ（Ｐ）およびＡｌａ（Ａ）であるか、またはその抗原性部分に対するものであり、
（ｉ）前記Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）および／またはランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも２０個、好ましくは４０個のアミノ酸残基からなる前記アミノ酸配列は、
構造：
（Ｐ／Ｓ）Ａ（Ａ／Ｓ）Ｐおよび／または
ＰＡ（Ａ／Ｓ）Ｐ
の少なくとも１つのエピトープ／エピトープストレッチを含み、
（ｉｉ）前記Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）および／またはランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも２０個、好ましくは４０個のアミノ酸残基からなる前記アミノ酸配列は、Ｎ末端に結合している保護基を含み；
（ｉｉｉ）免疫アジュバントが、前記Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）および／またはランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも２０個、好ましくは４０個のアミノ酸残基からなる前記アミノ酸配列に、Ｃ末端に連結される。

【0080】

一実施形態では、上記のようなＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）に特異的に結合する抗体を生産するための前記方法において、（ｉ）の前記エピトープは、ＰＡＰＡＡＰ（配列番号８）、ＰＡＰＡＳＰ（配列番号９）、ＰＡＳＰＡＡＰ（配列番号１０）、ＰＳＡＡＰＳ（配列番号７９）、ＡＳＰＡＡＰ（配列番号８０）、ＰＡＳＰＡＡ（配列番号８１）、ＰＡＡＰ（配列番号８２）、ＰＡＳＰ（配列番号８３）、ＡＰＳＡ（配列番号８４）およびＰＳＡＡ（配列番号８５）からなる群から選択されるエピトープ／エピトープストレッチを含む。さらなる実施形態では、そのエピトープ／エピトープストレッチは、Ｒ^Ｎ－（Ｐ／Ａ）－Ｒ^Ｃとして上で本明細書において定義されるペプチドに含まれる。

【0081】

本発明はまた、天然変性タンパク質のドメインまたはペプチドを特異的に結合することができる、本発明の手段および方法によって生成されるような、結合部分、特に抗原結合分子を含む組成物にも関する。特許請求される組成物はまた、前記本発明の方法によって取得可能であるような結合部分、特に抗原結合分子、ならびに、上で本明細書において提供される方法によって生産された結合部分への、特に抗原結合分子への、結合部分を含むことができる。

【0082】

また、本発明には、免疫アジュバントと上で定義される１つまたは複数のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートである本明細書において定義される特異的抗原を含む組成物も含まれ、ここで、前記Ｐ／Ａペプチドのそれぞれは、独立して、構造Ｒ^Ｎ－（Ｐ／Ａ）－Ｒ^Ｃのペプチドであり得る。

【0083】

本発明の結合部分、特に抗原結合分子／抗体またはそれらの抗原結合断片は、研究ツールとしておよび生物分析ツールとして特に有用である。それらは、ＰＡＳ化の薬物および／またはタンパク質で処置された個体から取得された血液試料など、患者試料のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングにも使用され得る。他方、ＰＡＳ化の薬物および／またはタンパク質を決して受けたことがない個体から得られた試料も、本発明の結合部分、特に抗原結合分子／抗体またはそれらの抗原結合断片を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験され得る。これは「陰性対照」とみされ得、本発明の抗体の偽陽性反応を評価するのにまたは回避するのに役立つであり得る。したがって、本発明の組成物は、特に、抗原結合分子／抗体またはそれらの抗原結合断片を含む組成物は、（患者）のスクリーニングにおいて、および／またはＰＡＳ化の（小分子）薬物および／またはタンパク質／ペプチド薬物による前記患者／個体の（併用の）処置に関する時間経過を追跡するのに有用であり得る。したがって、本発明はまた、診断用組成物にも関する。

【0084】

上記に従って、本発明はまた、生体試料中の、
（ｉ）Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）、
（ｉｉ）タンパク質、ペプチドもしくは小分子薬物とＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）とのコンジュゲート、ならびに／または
（ｉｉｌ）タンパク質、ペプチドもしくは小分子薬物と、ランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも２０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であって、これによって、前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基はＰｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）から選択されるか、またはＰｒｏ（Ｐ）およびＡｌａ（Ａ）である、アミノ酸配列との、コンジュゲート
を検出する方法も提供する。

【0085】

したがって、特許請求された方法は、ＰＡＳ化薬物および／またはタンパク質／ペプチドにより処置されたかまたはそれらにより処置されることになっている、個体から、特に哺乳動物から、好ましくはヒトから取得された、生体試料を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であり得る。

【0086】

前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、前記生体試料を、（ｉ）もしくは（ｉｉ）の前記Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）へのおよび／または（ｉｉｉ）の前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基への、抗原結合分子および／または抗体の結合に許容的な条件下で、本発明の抗原結合分子および／または抗体と接触させるステップを含むことができる。前記方法はまた、さらなる工程として、前記抗原結合分子および／または前記抗体と、前記Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）および／または前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基との間で複合体が形成されるかどうかの検出も含むことができる。前記生体試料中のＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）および／または前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基の（陽性）検出が指示し得るところは、例えば、Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）を含む薬物／タンパク質、すなわち「ＰＡＳ化（小分子）薬物および／またはタンパク質薬物またはペプチド薬物」が、当該個体の体内にまだ存在しているかどうかということである。これは定性的なアッセイであると思われる。しかし、こういった生体試料中のＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）を含む薬物／タンパク質の時間経過および／または定量化も想定される。このようなアッセイはまた、個体の生体試料の「スクリーニングアッセイ」も含む。

【0087】

本発明の結合部分、特に抗原結合分子／抗体またはそれらの抗原結合断片と、前記Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）および／またはこのようなＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）を含むタンパク質／ペプチド薬物／小薬物の前記コンジュゲートとの間に、形成される複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出は、当業者にとってルーチンワークである。形成された複合体のそのような検出は、免疫組織化学、免疫蛍光イメージング、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ）、ラテラルフローイムノアッセイ、紙ベースのイムノアッセイ、音波ベースのイムノアッセイ、干渉法ベースのイムノアッセイ、ナノマテリアルおよびマイクロマテリアルベースのイムノアッセイ、マイクロカンチレバーベースのセンサー、水晶微量天秤ベースのセンサー、電気化学的免疫センサー、Ｌａｂ－ｏｎ－ａ－Ｃｈｉｐ（ＬＯＣ）イムノアッセイ、スマートフォンベースのイムノアッセイ、質量分析ベースのイムノアッセイ（ＭＳＩＡ、Ｉｍｍｕｎｏ－ＭＡＬＤＩ、Ｉｍｍｕｎｏ－ＭＲＭ、ＳＩＳＣＡＰＡ）または免疫沈降など、既知の技法を含むことができる。また、例えば、当技術分野でよく知られるような、放射性物質による本発明の結合部分の相当する標識後の、Ｘ線検査法およびイメージングも想定される。

【0088】

結合部分、特に抗原結合分子／抗体またはそれらの抗原結合断片が、例えば研究の場面において、個体に関してｉｎ ｖｉｖｏで使用され、これによって、非ヒト動物がこれらの本発明の化合物および組成物を用いて試験およびスクリーニングされることも想定される。

【0089】

上記に従って、本発明はまた、ＰＡＳ化薬物コンジュゲートによる対象または動物の処置に対する応答をモニタリングするための方法に関し、前記方法は、
（ａ）Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）との、タンパク質もしくはペプチドもしくは小分子薬物のコンジュゲート、ならびに／または、
（ｂ）ランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも２０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であって、これによって、前記ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸残基は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）から選択されるか、またはＰｒｏ（Ｐ）およびＡｌａ（Ａ）である、アミノ酸配列との、タンパク質薬物もしくはペプチドもしくは小分子のコンジュゲート
を用いる、対象／患者または非ヒト試験個体の処置前の１つまたは複数の時点にての、および、それらを用いる処置後の１つまたは複数の時点にての、血液試料中の、好ましくは血漿試料または血清試料中の、循環しているＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）分子ならびに／またはＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）分子を含む融合タンパク質および／もしくは薬物コンジュゲートのレベルを測定するためのおよび／またはそれらを測定する上での、本発明の、抗原結合分子および／もしくは抗体または組成物の使用を含む。

【0090】

本方法はまた、特に、上掲の（ａ）または（ｂ）において定義されるコンジュゲートのいずれかによる前記対象／患者または前記非ヒト被験個体の前記処置後のさまざまな時点で採取される試料がスクリーニングされる場合、時間経過および／または時間－投薬量の関係の検出も含むことができる。

【0091】

また、本発明の結合部分、特に抗原結合分子／抗体またはそれらの抗原結合断片と、前記Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）および／またはこのようなＰｒｏ／Ａｌａリッチ配列（ＰＡＳ）を含むタンパク質薬物／小薬物の前記コンジュゲートとの間に形成される複合体の検出はルーチンワークであり、上で本明細書において提供される実施形態はまた、必要な変更を加えて本「モニタリングの方法」に適用する。

【0092】

本発明は、以下の非限定的な図および実施例によってさらに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0093】

【図1】本発明の抗ＰＡＳ抗体のＶ_Ｈ（Ａ）ドメインおよびＶ_Ｌ（Ｂ）ドメインのアミノ酸配列アラインメント（サブクローニングのための隣接する制限部位の導入前）の図である。ＣＤＲは黒の外郭線で標識される。各アラインメントの上部に示される抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１のＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列に関して同一のアミノ酸位置は“・”として図示され、アミノ酸配列アラインメントにおけるギャップは“－”として指示される。

【図2】本発明のさまざまな抗ＰＡＳ抗体が相当するＰＡＳ化融合タンパク質に特異的に結合することを実証する例示的なウエスタンブロット解析の図である。（Ａ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２、（Ｂ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１、（Ｃ）精製抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１、（Ｄ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１、（Ｅ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２、（Ｆ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１、（Ｇ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２の各ハイブリドーマクローン、および（Ｈ）対照としての抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的アルカリホスファターゼ（ヤギで製造、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）二次抗体からの細胞培養上清とともにインキュベートされたウエスタンブロット。以下の試料をウエスタンブロッティング用にＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用した：Ｍ － ＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ、１０～１８０ｋＤａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；１ － ＰＡＳ＃１（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７２）；２ － Ｐ／Ａ＃１（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７３）；３ － ＡＰＳＡ（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７４）；４ － プールされたヒト血清（ＳＥＱＥＮＳ ＩＶＤ／Ｈ２Ｂ）、ｄｄＨ_２Ｏで１：２００希釈しＩＬ１Ｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ／Ａｎａｋｉｎｒａ、ＳＯＢＩ）１μｇを添加した；５ － 大腸菌ＢＬ２１全細胞タンパク質、ＳＤＳ試料緩衝液で溶解させた。

【図3】本発明の抗ＰＡＳ抗体を用いるＰＡＳ配列またはＰＡＳ化融合タンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡ実験の例示的な結果の図である：（Ａ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１のＦａｂ断片と、試験物質としてのＩＬ１Ｒａ－ＰＡＳ＃１（８００）（８００）、ＰＡＳ＃１（６００）－レプチンおよびＰ／Ａ＃１（６００）－ＧＭＣＳＦならびに対照としてのＢＳＡとを用いるＥＬＩＳＡ。（Ｂ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２のＦａｂ断片と試験物質としてのＰ／Ａ＃１（６００）とを用いるＥＬＩＳＡ。（Ｃ）試験物資としての、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２のＦａｂ断片と、ＩＬ１Ｒａ－ＰＡＳ＃１（８００）、ＰＡＳ＃１（６００）－レプチンおよびＰ／Ａ＃１（６００）－ＧＭＣＳＦの各試験物質ならびに対照としてのＢＳＡとを用いるＥＬＩＳＡ。（Ｄ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２のハイブリドーマ上清と、マイクロタイタープレートに予め吸着させたヤギ由来の抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的を使用して捕捉されるが、試験物質としてのｈｕ４Ｄ５－ＰＡＳ＃１（２００）とを用いるＥＬＩＳＡ。

【図4】本発明の抗ＰＡＳ抗体を用いるＰＡＳ配列またはＰＡＳ化融合タンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡ実験の例示的な結果を示す図である：（Ａ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１のＦａｂ断片と試験物質としてのＡＰＳＡ（２００）－ＩＬ１Ｒａとを用いるＥＬＩＳＡ。（Ｂ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２のＦａｂ断片と試験物質としてのＡＰＳＡ（２００）－ＩＬ１Ｒａとを用いるＥＬＩＳＡ。（Ｃ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１のＦａｂ断片と試験物質としてのＰＡＳ＃１（６００）－レプチンとを用いるＥＬＩＳＡ。（Ｄ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１のハイブリドーマ上清と試験物質としてのｈｕ４Ｄ５－Ｐ／Ａ＃１（２００）とを用いるＭＡｂ捕捉ＥＬＩＳＡ（図３Ｄを参照されたい）。

【図5】抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２のハイブリドーマ培養上清のＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。それぞれ、配列番号５および６において１残基ずつそれぞれシフトした、ＰＡＳ＃１配列およびＰ／Ａ＃１配列からの連続する１２マーペプチドを、親水性膜上にＣ末端固定で合成した。メンブレンの発色現像後、スポット強度を、ソフトウェアＣＬＩＱＳ ｖｅｒ．１．２．０４４（ＴｏｔａｌＬａｂ）を用いてスキャンし、定量化したが、スポット強度は棒グラフとして表示される。エピトープ配列は太字体で強調表示される。

【図6】抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１のＦａｂ断片および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２のハイブリドーマ培養上清のＳＰＯＴアッセイの結果の図である。説明については、図５を参照されたい。

【図7】抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２のハイブリドーマ培養上清のＳＰＯＴアッセイの結果の図である。配列ＡＡＰＳＡＡＰＳＡＡを含む１０マーペプチドを、親水性膜上にＣ末端固定で合成し、これによって、位置３～８を、タンパク質原性の全２０種のアミノ酸によって連続的に置換した。メンブレンの発色現像後、スポット強度を、ソフトウェアＣＬＩＱＳ ｖｅｒ．１．２．０４４（ＴｏｔａｌＬａｂ）を用いてスキャンし、定量化したが、スポット強度は棒グラフとして表示される。元の配列ＡＡＰＳＡＡＰＳＡＡの残基に相当するバーは塗りつぶされる。

【図8】抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１（被検物質としてＡＰＳＡ（２００）－ＩＬ１Ｒａ）ならびに抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１（被検物質としてＰＡＳ＃１（２００）－ＩＬ１Ｒａ）および抗－ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ １００機器で測定された被検物質としてＰＡＳ＃１（２００）－ＩＬ１Ｒａ）の例示的ＳＰＲセンサーグラムの図である。ハイブリドーマ上清を、抗マウス抗体（Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でコーティングされたＣＭ３センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。注入フェーズは、注入された被験物質の相当する濃度と一緒に、黒いバーで標識される。

【図9】固定化抗ＰＡＳ Ｆａｂ １．２を有するカラムを使用するＰＡＳ化タンパク質のアフィニティー精製の原理の図である。（Ａ）ＰＡＳ化タンパク質のワンステップ精製の概略図：（ｉ）目的のＰＡＳ化タンパク質を含有する細胞抽出物の適用、（ｉｉ）ランニング緩衝液によるカラム洗浄、および（ｉｉｉ）Ｌ－プロリンアミドの１Ｍランニング緩衝液を適用することによる目的のＰＡＳ化タンパク質の溶出。（Ｂ）Ｆａｂ １．２のＰＡＳ＃１エピトープペプチド（最上部にてスティックモデルとして示される）と複合体を形成したＦａｂ １．２（模式ダイヤグラム）の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：７Ｏ３１）。（Ｃ）Ｆａｂ １．２によって認識されるＰＡＳ＃１ペプチドエピトープの関連部分。（Ｄ）Ｌ－プロリンアミドの化学構造。

【図10】本発明の固定化抗ＰＡＳ抗体を使用するＰＡＳ化タンパク質のアフィニティー精製の例示的なクロマトグラムの図である。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２のＦａｂ断片を、アフィニティーマトリクスとして機能するように、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合で固定化した。ＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）融合タンパク質（配列番号７１）を、（Ａ、Ｃ）事前に精製したタンパク質溶液、および、（Ｂ、Ｄ）ＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）を発現するＢＬ２１大腸菌細胞の全細胞抽出物から精製するための試験タンパク質として適用した。クロマトグラフィーカラムからのタンパク質の溶出は、２８０ｎｍにての一般吸光度および４８８ｎｍにてのｅＧＦＰ発色団の比吸光度も並行して測定することによってモニタリングした（Ａ、Ｂ）。タンパク質試料を適用し、緩衝液で洗浄した後、結合したＰＡＳ融合タンパク質をＬ－プロリンアミドの１Ｍ溶液で溶出したが、この溶液も２８０ｎｍで強力な吸光度を示した（芳香族アミノ酸による汚染に起因する可能性がある）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析（Ｃ、Ｄ）が明らかにしたところは、これらの溶出画分におけるＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）の存在である。試料：Ｍ － Ｐｉｅｒｃｅ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＷ Ｍａｒｋｅｒ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；０ － 純粋ＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）；１ － 画分７～７．５ｍｌ；２ － 画分７．５～８ｍｌ；３ － 画分８～８．５ｍｌ；４ － 画分８．５～９ｍｌ；５ － 画分９～９．５ｍｌ；６ － 画分９．５～１０ｍｌ；７ － 画分１０～１０．５ｍｌ。１＊ － ＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）を発現するＢＬ２１大腸菌細胞の全細胞溶解物；２＊ － 画分２～４ｍｌ；３＊ － 画分７～７．５ｍｌ；４＊ － 画分７．５～８ｍｌ；５＊ － 画分８～８．５ｍｌ；６＊ － 画分８．５～９ｍｌ；７＊ － 画分９～９．５ｍｌ；８＊ － 画分９．５～１０ｍｌ；９＊ － 画分１０～１０．５ｍｌ。本実験が実証するところは、抗ＰＡＳアフィニティーカラムが、ＰＡＳ化試験タンパク質、ＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）を特異的に結合し、これが、Ｌ－プロリンアミド溶液を適用することにより穏和な条件下で溶出され得ることである。

【図11】本発明の固定化抗ＰＡＳ抗体を使用する、治療用関連ＰＡＳ化タンパク質のワンステップＰＡＳアフィニティー精製を記録する例示的なクロマトグラムおよびＳＤＳ ＰＡＧＥ解析の図である。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２のＦａｂ断片を、アフィニティーマトリクスとして機能するように、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合で固定化した。Ｃ末端でＰＡＳ化のアンチカリンＨ１ＧＡ－ＰＡＳ＃１（２００）－Ｈｉｓ_６（配列番号９０）（Ａ、Ｂ）およびＮ末端でＰＡＳ化のサイトカインＰＡＳ＃１（８００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号９１）（Ｃ、Ｄ）を、それぞれ大腸菌ＢＬ２１の周辺質画分または細胞画分のいずれかから精製した。クロマトグラフィーカラムからのタンパク質の溶出は、２８０ｎｍにての吸光度を測定することによってモニタリングした。タンパク質試料を適用し、緩衝液で洗浄した後、結合したＰＡＳ融合タンパク質をＬ－プロリンアミドの１Ｍランニング緩衝液で溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析（Ｂ、Ｄ）が明らかにしたところは、溶出画分におけるＰＡＳ化タンパク質の存在である。試料：Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＷ Ｍａｒｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） － ＰＥ／ＣＥ（それぞれのタンパク質を発現する大腸菌ＢＬ２１細胞の周辺質抽出物／全細胞抽出物） － ＦＴ（フロースルー） － 洗浄 － 溶出。矢印は、それぞれＨ１ＧＡ－ＰＡＳ＃１（２００）－Ｈｉｓ_６およびＰＡＳ＃１（８００）－ＩＬ１Ｒａに相当するタンパク質バンドを指示する。本実験が実証するところは、２００～８００残基を含むＰＡＳタグ担持のＮ末端にてのおよびＣ末端にてのＰＡＳ化タンパク質が、高選択性で精製され得ることである。

【図12】本発明の固定化抗ＰＡＳ抗体を使用するＰＡＳ化タンパク質のアフィニティー精製の例示的なクロマトグラムの図である。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２のＦａｂ断片を、アフィニティーマトリクスとして機能するように、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合で固定化した。予め精製したＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）融合タンパク質（配列番号７１）を、試験タンパク質として適用した。クロマトグラフィーカラムからのタンパク質の溶出は、４８８ｎｍにてのｅＧＦＰ発色団の比吸光度を測定することによってモニタリングした。タンパク質試料を適用し、緩衝液で洗浄した後、結合したＰＡＳ融合タンパク質を特に穏和な条件（１Ｍ Ｌ－プロリンアミド、１００ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ＨＣｌでｐＨを８．０に調整）下で溶出した。本実験が実証するところは、抗ＰＡＳアフィニティーカラムがＰＡＳ化試験タンパク質、ＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）を定量的に結合し、これが、Ｌ－プロリンアミド溶液を適用することにより穏和な緩衝条件下で溶出され得ることである。

【図13】本発明の抗ＰＡＳ抗体の組換えＦａｂ断片と複合体を形成した合成ＰＡＳエピトープペプチドの結晶構造の図である：（Ａ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２に結合されたＰ／Ａ＃１－エピトープペプチド、（Ｂ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１に結合されたＰＡＳ＃１－エピトープペプチド、（Ｃ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２および（Ｄ）抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１に結合されたＰｇａ－（ＡＰＳＡ）_３ペプチド。エピトープペプチドはスティック（濃灰色）として示され、Ｆａｂ重（中間の灰色）鎖および軽（明灰色）鎖はワイヤとして示される。

【図14】ウイスターラットにおけるＰＡＳ化チモシンアルファ１の薬物動態（ＰＫ）研究の図である。（Ａ）図１５に概略的に例示される、ＥＬＩＳＡセットアップＡを介する、ラット血漿試料中のＰＡＳ化チモシンアルファ１の定量化に使用された標準曲線の直線範囲。（Ｂ）ＰＡＳ化チモシンアルファ１を、用量３．４ｍｇ／ｋｇ体重で雌性ウイスターラット（Ｎ＝５）に皮下注射した。血漿中の融合タンパク質の濃度を、捕捉抗体として抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１を、検出試薬としてアルカリホスファターゼコンジュゲート抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量化した。データを注射後のサンプリング時間に対してプロットし、１－コンパートメントモデルを使用して当てはめた。ＰＫプロファイルが示すところは、ＰＡＳ化ペプチド薬物の明確に異なる吸収相と排出相である（ＰＫパラメータについては表１を参照されたい）。

【図15】ＰＡＳ化分子の検出のための例示的なＥＬＩＳＡセットアップの図である。（Ａ）ＰＡＳ化分子を捕捉するためにマイクロタイタープレートに吸着させた抗ＰＡＳ抗体と、検出試薬としてレポーター酵素にコンジュゲートされた第２の抗ＰＡＳ抗体とを使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ。（Ｂ）ＰＡＳ化分子を捕捉するためにマイクロタイタープレートに吸着させた抗ＰＡＳ抗体と、ＰＡＳ化薬物の生物学的活性部分に対して向けられた第２の酵素カップリング抗体とを使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ。（Ｃ）ＰＡＳ化分子を捕捉するためにマイクロタイタープレートに吸着されたタンパク質、ペプチドまたは小分子薬物の結合パートナー（例えば、受容体、ここでは標的と称する）と、ＰＡＳ化薬物を検出する本発明の酵素カップリング抗ＰＡＳ抗体とを使用するＥＬＩＳＡ。（Ｄ）マイクロタイタープレートに吸着された抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂの結合部位に対して、ＰＡＳ化分子およびビオチン化分子と競合するＰＡＳ化被験物質分子を示す、競合ＥＬＩＳＡの概略図。ＭＡｂに結合されたＰＡＳ化分子およびビオチン化分子は、ストレプトアビジン酵素コンジュゲートによって、次いで検出される。

【図16】合成エピトープペプチドＡｂｚ－ＡＰＡＰＡＡＰＡによる、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５中の１μＭで適用された、抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ２．２のＦａｂ断片の蛍光滴定の図である。ＲＦＵ－相対蛍光単位（２８０ｎｍにての蛍光励起、３４０ｎｍにてのシグナル検出）。

【図17】抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ１．１を使用して、ＰＡＳ化抗ガレクチンＦａｂ断片を捕捉し、その抗原ガレクチン－３に対するＰＡＳ－Ｆａｂ結合動態を決定するＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００装置（Ｃｙｔｉｖａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法の図である。（Ａ）ＣＭ５表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ）上のＰＡＳ化抗体断片の固定化を示すセンサーグラム。（１）チップのデキストランヒドロゲル表面上のカルボキシレート基を、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用して、反応性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）基に変換した。（２）抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ１．１を、活性化ＮＨＳエステルを介してチップ表面に共有結合でコンジュゲートさせ、（３）未反応のＮＨＳエステルを０．１Ｍエタノールアミンを使用して飽和させた。（Ｂ）（１）ＰＡＳ化抗ガレクチンＦａｂの非共有結合性の固定化、これに続く、（２）ガレクチン－３の１：２希釈系列（０．１ｎＭ～１．６ｎＭ）からの５回の連続注入ならびに２回の酸性再生ステップを示す単一サイクルの動態実験。（Ｃ）（Ｂ）からの単一サイクル動態実験の基準補正センサーグラムのベースラインをゼロ、ならびに開始時間＝０秒に設定し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアを使用してグローバル１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0094】

実施例１：本発明において用いられる方法
Ａ．免疫用のＰＡＳペプチドコンジュゲートの調製
異なる３つのペプチドを固相合成によって得たが（Ｐｇａ－ＰＡＳ＃１（４０）－ＡｈｘおよびＰｇａ－Ｐ／Ａ＃１（４０）－Ａｈｘ：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ － ＰＳＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ；Ｐｇａ－ＡＰＳＡ（４０）－Ａｈｘ：Ａｌｍａｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）、それぞれがブロックされたＮ末端を有する：Ｐｇａ－ＰＡＳ＃１（４０）－Ａｈｘ（Ｐｇａ－ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ－ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ－Ａｈｘ；配列番号５）；Ｐｇａ－Ｐ／Ａ＃１（４０）－Ａｈｘ（Ｐｇａ－ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ－ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ－Ａｈｘ；配列番号６）；Ｐｇａ－ＡＰＳＡ（４０）－Ａｈｘ（Ｐｇａ－ＡＰＳＡＡＰＳＡＡＰＳＡＡＰＳＡＡＰＳＡ－ＡＰＳＡＡＰＳＡＡＰＳＡＡＰＳＡＡＰＳＡ－Ａｈｘ；配列番号７）。

【0095】

Ｐｇａとはピログルタミル残基（２－ピロリドン－５－カルボン酸または５－オキソプロリンとしても知られる）を意味し、Ａｈｘとはアミノヘキサン酸を意味する；他のすべての残基は、それらの一文字略名により記述される標準的なタンパク質原性のＬ－アミノ酸である。４０マーのＰＡＳペプチドを、相当するＰＡＳ反復配列の少なくとも２つのコピーを包含するように十分な長さをもって設計したが、一部の実施形態では、結果として、隣接する２つの反復配列の間の接合部の少なくとも１つのインスタンスも含めて、２０個の残基を含んだ。注目すべきことに、そのような接合部はまた、より長い組換えＰＡＳポリペプチドにおいて可能性のあるエピトープも構成すると思われる。すべてのペプチドは化学的に不活性な側鎖のみを含有し、ブロックされたＮ末端を有したので、それらの単一のＣ末端カルボキシレート基（実際には、Ａｈｘリンカー残基の一つ）を選択的に活性化し、ＫＬＨのＬｙｓ側鎖のε－アミノ基への直接化学コンジュゲーションに使用したが、このＫＬＨは、高免疫原性のキャリアタンパク質として用いたものである（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎら、２０１４）。この目的のため、各ペプチド５０ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１４５０μｌに溶解し、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ；Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ、ドイツ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）、それぞれの１０倍モル量で活性化した。ＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）１０ｍｇを水に溶解し、ＰＢＳ（４ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１６ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１１５ｍＭ ＮａＣｌ）に対して透析し、４．３５ｍｌの容量で２．３ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、活性化ペプチド溶液と混合した。氷上で３０分間インキュベートした後、溶液を２５ｍＭ Ｎａホウ酸塩、ｐＨ９．０に対して透析し、コンジュゲートを同じ緩衝液で平衡化したＳｏｕｒｃｅ １５Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）での陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。コンジュゲートを、ランニング緩衝液に適用させた０～５００ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出し、２８０ｎｍでモニタリングした。メインピークの溶出画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶＰＶＤＦフィルター（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を通してろ過滅菌し、液体窒素中で瞬間凍結した。
Ｂ．マウスの免疫およびハイブリドーマ細胞の生成
抗原として上記のＰＡＳペプチド－ＫＬＨコンジュゲートを使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫し、標準手順に従ってハイブリドーマを調製した（ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）。各抗原について、Ｂａｌｂ／ｃマウス５匹を、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）と一緒に抗原５０μｇで皮下免疫した。プライミングの３週間後、３回のブースター注射（ＡＰＳＡ（４０）－ＫＬＨについては５回）を、それぞれ抗原２５μｇおよびフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）を用いて、２週間の間隔で適用した。最後の上記ブーストの２週間後に、アジュバント無しで抗原５０μｇによる最終ブーストを腹腔内投与した。脾臓細胞を動物から採取し、当技術分野でよく知られる標準手順を使用してハイブリドーマクローン生成に向けてＳｐ２／０骨髄腫細胞と融合させた。

【0096】

有望なハイブリドーマクローンを、１０％ｖ／ｖＦＣＳ（Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ＩｇＧ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ）、６ｍＭ Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、１：１００ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を含有し１０％ｖ／ｖハイブリドーマプレミアム培地（ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した、ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）を使用して細胞培養で増殖させた。細胞培養上清中の分泌抗ＰＡＳ ＭＡｂを、リアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって特徴付けた。

【0097】

一部の研究については、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０クロマトグラフィーワークステーション（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する１ｍｌ／分の流速で操作される１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂをハイブリドーマ上清から精製した。ハイブリドーマ上清を、結合緩衝液（２０ｍＭ ＮａＰ_ｉ ｐＨ７．０）で１：１の比で希釈し、結合緩衝液１０カラム容量で予め平衡化しておいたカラムに適用した。結合緩衝液１０カラム容量で洗浄した後、溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７）２カラム容量で抗体を溶出した。酸不安定性ＩｇＧの活性を保つために、分画の前に、収集容量１ｍｌ当たり１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ９．０ ２００μｌを各コレクションチューブに添加した。続いて、アフィニティー精製のＭＡｂを含有する画分を保存緩衝液（２０ｍＭ ＫＰｉ、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５０％グリセロール、ｐＨ７．２）２００容量に対して透析し、－２１℃で凍結した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍにての吸光度を測定することによって決定した（Ａ_２８０＝１．４はＩｇＧ １．０ｍｇ／ｍｌの濃度に等しい）。
Ｃ．ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲによるハイブリドーマＭＡｂの特性評価
抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的ヤギ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の５μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液５０μｌでコーティングし、これに続いてＰＢＳにより２回洗浄しかつ３％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ／Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０）で１時間ブロッキングした、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）を使用して、ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマＭＡｂの特性評価を実施した。ＰＢＳ／Ｔで洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ／Ｔで１：１００に希釈した各ハイブリドーマ上清５０μｌとともに１時間インキュベートし、再度洗浄した。次いで、以下のＰＡＳ化タンパク質：ｈｕ４Ｄ５－ＰＡＳ＃１（２００）（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３）、ｈｕ４Ｄ５－Ｐ／Ａ＃１（２００）（ＷＯ２０１１／１４４７５６Ａ１）またはＡＰＳＡ（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７４）、（それぞれ８ｎＭ）５０μｌ溶液をＰＢＳで１：２希釈系列で適用し、１時間インキュベートしたが、これらＰＡＳ化タンパク質は、製造業者の取扱説明書に従って、ＤＩＧ－ＮＨＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）で標識しておいたものである。ＰＢＳ／Ｔで洗浄した後、抗ヒトカッパ軽鎖抗体アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）または抗ＤＩＧ－Ｆａｂアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の１：１０００希釈液５０μｌを各ウェルに適用し、１時間インキュベートした。ＰＢＳで最終洗浄した後、ｐ－ニトロフェニルリン酸０．５ｍｇ／ｍｌのＡＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）５０μｌを添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２光度計（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂａｄ Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｈａｌｌ、ドイツ）を使用して、４０５ｎｍで１分間隔で１５分間、シグナル発生を記録した。濃度依存シグナル（ΔＡ／Δｔ）を式：
［ＭＡｂ・Ａｇ］＝［ＭＡｂ］_ｔ・［Ａｇ］_ｔ／（ＫＤ＋Ａｇ］_ｔ）
を使用して公開された手順（Ｖｏｓｓ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、１９９７）に従って評価した。 ［ＭＡｂ・Ａｇ］は抗体／抗原複合体の検出可能な量であり、この量は、各ウェルについて測定されたΔＡ／Δｔシグナルに比例する；［ＭＡｂ］_ｔは固定化した抗体の総量であり、この量は、結合曲線の漸近最大シグナルに相当する；［Ａｇ］_ｔは、各ウェルに適用されたＰＡＳ抗原の（可変）総濃度であり、Ｋ_Ｄは、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ）で評価された、曲線当てはめからもたらされる抗体／抗原複合体の解離定数である。

【0098】

ＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ １００またはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ 機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかで、マウス抗体捕捉キットおよびＣＭ３センサーチップ（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を使用して２５℃で実施した。培養上清をＨＢＳ－ＥＴ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０）で１：５に希釈し、試料３０μｌを流速１０μｌ／分で注入した。必要に応じて、以下の試験抗原の濃度系列を、シングルサイクルカイネティクス（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、２００６）を使用して、流速３０μｌ／分でセンサーシップ上へと注入した：ＰＡＳ＃１（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７２）、Ｐ／Ａ＃１（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７３）、Ｐ／Ａ＃１（６００）－ＧＭＣＳＦ（配列番号７５）、ＡＰＳＡ（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７４）およびｈｕ４Ｄ５－Ｐ／Ａ＃１（２００）ＷＯ２０１１／１４４７５６Ａ１。センサーチップを、１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ ｐＨ１．７で１００秒間再生した。ＨＢＳ－ＥＴ緩衝液で測定した参照チャンネルとブランクベースライからのシグナルの減算後、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアｖｅｒ．２．０．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および二価被験物質モデル（ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎａｌｙｔｅ ｍｏｄｅｌ）を使用してデータを当てはめた。フィッティングアルゴリズムにより使用される速度方程式は以下のとおりである：
二価被験物質（Ａ）がリガンド（Ｂ）に結合する。

【0099】

Ａ（溶液）＝濃度
Ａ［０］＝０
ｄＡ／ｄｔ＝（ｔｃ＊ｆ＾（１／３））＊（濃度Ａ）－（（２＊ｋａ１）＊Ａ＊Ｂ－ｋｄ１＊ＡＢ）
Ｂ［０］＝ＲＭａｘ
ｄＢ／ｄｔ＝－（（２＊ｋａ１）＊Ａ＊Ｂ－ｋｄ１＊ＡＢ）－（ｋａ２＊ＡＢ＊Ｂ－（２＊ｋｄ２）＊ＡＢ２）
ＡＢ［０］＝０
ｄＡＢ／ｄｔ＝（（２＊ｋａ１）＊Ａ＊Ｂ－ｋｄ１＊ＡＢ）－（ｋａ２＊ＡＢ＊Ｂ－（２＊ｋｄ２）＊ＡＢ２）
ＡＢ２［０］＝０
ｄＡＢ２／ｄｔ＝（ｋａ２＊ＡＢ＊Ｂ－（２＊ｋｄ２）＊ＡＢ２）
合計応答：
ＡＢ＋ＡＢ２＋ＲＩ
パラメータ：濃度、分析対象物濃度［Ｍ］；ｔｃ、物質移動定数；ｆ、フローセルを通る溶液の体積流量［ｍ^３・ｓ^－１］；ＲＭａｘ、結合キャパシティ；ＲＩ、屈折率。
Ｄ．ハイブリドーマ細胞由来のＶ遺伝子のクローニング
ハイブリドーマ細胞を機械的に溶解し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、これに続いてオリゴ（ｄＴ）_１８プライマーを用いるＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡ合成を行った。軽鎖用のリバースプライマーＲＭＫ（５’－ＧＡＣ ＣＴＣ ＣＡＣ ＧＧＡ ＧＴＣ ＡＧＣ－３’；配列番号７７）および重鎖用のＲＭＧ（５’－ＡＧＧ ＴＣＧ ＣＣＡ ＣＡＣ ＧＴＧ ＴＧＧ－３’；配列番号７８）（Ｌｏｅｒｓら、２０１４）と一緒に、すべてのマウス生殖系列Ｖ_Ｌ／Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントをカバーする６３のフォワードプライマーのセットを使用して、Ｑ ５ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍ．ドイツ）を用いて、ＩｇＶ遺伝子領域をそのｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した（Ｃｈａｒｄｅｓら、１９９９）。ＰＣＲ反応数の必要数を減少させるために、そしてこのようなプールについてＰＣＲ産物を特定した後に個別に単一のＰＣＲ産物を生成するために、フォワードプライマーを５～１５個のプールで最初に適用した。その後、適切なＰＣＲ産物を、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用するアガロースゲル電気泳動によって単離し、Ｍｉｘ２Ｓｅｑ Ｋｉｔ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）を使用して二本鎖ＤＮＡ配列決定に供した。
Ｅ．Ｆａｂ断片用の細菌発現プラスミドの構築
細菌発現ベクターｐＡＳＫ８８（Ｓｃｈｉｗｅｃｋ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、１９９５）上でのＶ遺伝子のクローニングの場合、上記のＶ遺伝子増幅由来の産物を、先に公開されたルーチン手順（Ｌｏｅｒｓら、２０１４；Ｐｅｐｌａｕら、２０２０）に従って、適切な隣接制限部位を導入するように設計されたプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した。生成するＰＣＲ産物を相当する制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動により単離し、Ｖ_Ｈ遺伝子およびＶ_Ｌ遺伝子それぞれをｐＡＳＫ８８に挿入したが、これは、相当する制限酵素を用いて、２回の連続ライゲーションにおいて、切断しておいたものである。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２、および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１のコード領域を、ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりこれらのハイブリドーマ向けに決定されたＶ遺伝子配列に基づいた適切な隣接制限部位（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）を用いる遺伝子合成によって取得した。
Ｆ．Ｆａｂ断片の大腸菌産生および精製
抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２のＶ遺伝子を内部に持つｐＡＳＫ８８派生体を使用して、大腸菌株ＪＭ８３（Ｙａｎｉｓｃｈ－Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５）を使用する６×２ｌ振盪フラスコ培養において、または、ＫＳ２７２株（Ｍｅｅｒｍａｎ ＆ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ、１９９４）を使用するおよび公開された手順（Ｓｃｈｉｗｅｃｋ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、１９９５；Ｓｋｅｒｒａ、１９９４）に従った８ｌ卓上発酵を介して、いずれかでキメラＦａｂ断片（ヒト定常ドメインに融合させたハイブリドーマ由来のマウス可変ドメイン）を発現させた。組換えタンパク質を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、これに続いて、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ６ｍｌカラムでの陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、およびＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５プレップグレードカラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を介して、周辺質細胞抽出物から精製した。それぞれ、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１または抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２のキメラＦａｂ断片について、８８４０５Ｍ^－１ｃｍ^－１、８９８９５Ｍ^－１ｃｍ^－１、７７４０５Ｍ^－１ｃｍ^－１、６６４０５Ｍ^－１ｃｍ^－１、６９９５Ｍ^－１ｃｍ^－１または５７４６５Ｍ^－１ｃｍ^－１の算出された吸光係数（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒら、２００３）を使用して２８０ｎｍで吸光度を測定することによって、タンパク質濃度を決定した。タンパク質の完全性および純度について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｆｌｉｎｇ ＆ Ｇｒｅｇｅｒｓｏｎ、１９８６）およびｍａＸｉｓ Ｑ－ＴＯＦ装置（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ）でのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によってチェックした。
Ｇ．ＥＬＩＳＡ、蛍光滴定およびＳＰＲによるＦａｂの抗原親和性測定
抗ＰＡ（Ｓ）ＭＡｂ ２．１および抗ＰＡ（Ｓ）ＭＡｂ ２．２の組換えＦａｂ断片の場合には、Ｐ／Ａ＃１（６００）ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂｒｅｉｂｅｃｋ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１８）１０μｇ／ｍｌのＰＢＳ ５０μｌ、抗ＰＡ（Ｓ）ＭＡｂ １．１および抗ＰＡ（Ｓ）ＭＡｂ １．２のＦａｂ断片の場合には、ＰＡＳ＃１（６００）－レプチン（Ｍｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．、２０１５）１０μｇ／ｍｌのＰＢＳ ５０μｌ、または、ＭＡｂ ３．１および抗ＰＡ（Ｓ）ＭＡｂ ３．２のＦａｂ断片の場合には、ＡＰＳＡ（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７４）１０μｇ／ｍｌ ５０μｌ、のいずれかで、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ ９６ウェルプレートをコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔによる１回の洗浄ステップの後、ウェルを、３％ｗ／ｖ ＢＳＡ（ＮｅｏＦＲＯＸＸ、Ｅｉｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）のＰＢＳ／Ｔで１時間ブロッキングし、これに続いて洗浄し、ＰＢＳ／Ｔ中の精製Ｆａｂ断片それぞれの適当な希釈系列５０μｌとともに１時間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ／Ｔで再度洗浄し、これに続いてアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）にコンジュゲートされた抗ヒトカッパ軽鎖ヤギ抗体の１：１０００希釈液のＰＢＳ／Ｔ ５０μｌとともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ／ＴおよびＰＢＳでそれぞれ２回の最終洗浄後、シグナルを、ｐ－ニトロフェニルリン酸で発生させ、上に本明細書において記載されるように測定および評価した。

【0100】

蛍光滴定を、励起には２８０ｎｍ、検出には３４０ｎｍの波長で、２５℃に温度調節された２ｍｌ石英キュベットを備えるＬＳ－５０Ｂ発光分光計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を使用して、先に記載のように（Ｖｏｓｓ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、１９９７）実施した（５秒にわたってシグナルを積分）。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５中に抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２の精製Ｆａｂ断片１μＭを含む溶液２ｍｌを、１μｌ～合計容量２２μｌまでの一定分量中のＡｂｚ－ＡＰＡＰＡＡＰＡペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ－ＰＳＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）（Ａｂｚはオルト－アミノベンゾイルを意味する）５ｍＭ溶液を用いて滴定した。データを、初期蛍光１００％に正規化し、同じペプチドによるＮ－アセチル－トリプトファンアミドの滴定による内部フィルター効果の補正を含めて、記載されるように（Ｅｄｗａｒｄｒａｊａら、２０１７）、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ）を用いる非線形最小二乗回帰によって当てはめた。

【0101】

相当する抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂのＦａｂ断片を用いるＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２５℃で実施した。ＰＡＳ＃１（２００）－ＩＬ１Ｒａ、Ｐ／Ａ＃１（２００）－ＩＬ１Ｒａ、またはチオレドキシンＡ－ＡＰＳＡ（２００）を、製造者の取扱説明書に従ってスクシンイミジル－６－（ビオチンアミド）ヘキサオネート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）２０倍モル量でビオチン化し、製造業者のプロトコルに従ってビオチンＣＡＰｔｕｒｅチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にリガンドとして個別に固定化した。各リガンドの固定化前に、１２０秒間の３０％ｖ／ｖアセトニトリル、０．２５Ｍ ＮａＯＨならびに１２０秒間の６Ｍグアニジン／ＨＣｌ、０．２５Ｍ ＮａＯＨで２回の連続注入で、センサーチップを再生した。組換えＦａｂ断片の濃度系列を、シングルサイクルカイネティクスおよび流速３０μｌ／分使用してセンサーチップ上へと注入した。ＨＢＳ－ＥＴ緩衝液で測定した参照チャンネルとブランクベースラインの両方からのシグナルの減算後、１：１結合モデルを用いるＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアｖｅｒ．２．０．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してデータを当てはめた。フィッティングアルゴリズムにより使用される速度方程式は以下のとおりである：
Ａ（溶液）＝濃度
Ａ［０］＝０
ｄＡ／ｄｔ＝（ｔｃ＊ｆ＾（１／３））＊（濃度Ａ）－（ｋａ＊Ａ＊Ｂ－ｋｄ＊ＡＢ）
Ｂ［０］＝ＲＭａｘ
ｄＢ／ｄｔ＝－（ｋａ＊Ａ＊Ｂ－ｋｄ＊ＡＢ）
ＡＢ［０］＝０
ｄＡＢ／ｄｔ＝（ｋａ＊Ａ＊Ｂ－ｋｄ＊ＡＢ）
合計応答：
ＡＢ＋ＲＩ
パラメータ：濃度、分析対象物濃度［Ｍ］；ｔｃ、物質移動定数；ｆ、フローセルを通る溶液の体積流量［ｍ^３・ｓ^－１］；ＲＭａｘ、結合キャパシティ；ＲＩ、屈折率。
Ｈ．固定化ペプチドアレイのＳＰＯＴ合成およびエピトープマッピング
ＰＡＳ＃１またはＰ／Ａ＃１のアミノ酸反復配列の全体のアミノ酸配列をカバーするオーバーラップする２０個の１２マーペプチドのアレイ、または、３～８位にてタンパク質原性の全２０種のアミノ酸によって連続的に置換されている配列ＡＡＰＳＡＡＰＳＡＡを含む１０マーペプチドのアレイを、ＭｕｌｔｉＰｅｐ ＳＰＯＴシンセサイザー（Ｉｎｔａｖｉｓ、Ｋｏｌｎ、ドイツ）を使用して、標準プロトコル（Ｆｒａｎｋ、２００２）に従って親水性膜上で合成した。膜上の結合活性の検出については、精製Ｆａｂ断片または分泌されたＭＡｂを含有するハイブリドーマ細胞培養上清のいずれかとともに、これに続いて、それぞれ、抗ヒトカッパ軽鎖抗体アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）または抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、インキュベートした後、公開された手順（Ｚａｎｄｅｒら、２００７）に従って実施した。
Ｉ．ウエスタンブロッティングによるＰＡＳ化タンパク質の検出
ハイブリドーマ上清由来の抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂを、ウエスタンブロットでのＰＡＳ化タンパク質の検出について試験した。水で１：２００希釈し、ＩＬ１Ｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ／Ａｎａｋｉｎｒａ；Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｏｒｐｈａｎ Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スウェーデン）１μｇと大腸菌ＢＬ２１全細胞溶解物とを添加した、１セットのさまざまなＰＡＳ化タンパク質（ＰＡＳ＃１（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７２）、Ｐ／Ａ＃１（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７３）、ＡＰＳＡ（２００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号７４））ならびに対照の場合、ヒト血清（ヒト血清（ＰＬ）、プールされたもの、ＳＥＱＥＮＳ ＩＶＤ／Ｈ２Ｂ、Ｌｉｍｏｇｅｓ、フランス）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、これに続いて、ニトロセルロース膜上でセミドライエレクトロトランスファーに供した。ＰＢＳ／Ｔで洗浄した後、膜を、ハイブリドーマ上清として抗ＰＡＳ ＭＡｂのＰＢＳ／Ｔ中１：２０００希釈液、または精製した抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１の場合で１：２０００００希釈液とともにインキュベートした。結合したＭａｂを、アルカリホスファターゼとコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧＦｃ特異的ヤギ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のＰＢＳ／Ｔ １：５０，０００希釈液、これに続いて、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－リン酸塩（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（両方ともＣａｒｌ Ｒｏｔｈ製、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）との発色反応を使用して、検出した。
Ｊ．ラットにおける薬物動態解析
８～９週齢にての雌性ウイスターラットで薬物動態（ＰＫ）研究を、適用される動物福祉規制に準じてＡｕｒｉｇｏｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＴＲＣ、Ｄｕｎａｋｅｓｚｉ、ハンガリー）で実施した。ケージ当たり最大３匹の動物を、２２±３℃にての、相対湿度５０±２０％、１２時間明１２時間暗での制御された環境に収容した。精製したＰＡＳ化チモシンアルファ１（配列番号７６）（３．４ｍｇ／ｋｇ）を、ラットの背部領域への単回注射を介して皮下投与した。血液試料（１００μｌ）を、さまざまな時点で５匹の動物それぞれから採取した。Ｋ３－ＥＤＴＡチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）への採取に続いて、試料を室温で１０分間遠心分離し（３０００×ｇ）、生成する血漿を－１５～－３０℃で保存した。これらの試料中のＰＡＳ化チモシンアルファ１を、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して定量化した（方法Ｋおよび図１５Ａを参照されたい）。動物またはヒト患者の血液または血漿／血清試料中のＰＡＳ化ペプチドまたはタンパク質の定量化に適切な、可能性のある代替ＥＬＩＳＡセットアップを図１５、パネルＢ～Ｄに例示する。
Ｋ．ＥＬＩＳＡによるラット血漿中のＰＡＳ化チモシンアルファ１の定量化
８～９週齢にての雌性ウイスターラット（ｎ＝５）（Ａｕｒｉｇｏｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｕｎａｋｅｓｚｉ、ハンガリー）に、ＰＡＳ化チモシンアルファ１（配列番号７６）（３．４ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、血液試料（１００μｌ）を、さまざまな時点でＫ３－ＥＤＴＡチューブ（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－Ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）に採取した。ラットＰＫ研究（方法Ｊ）において投与されたＰＡＳ化チモシンアルファ１の定量化の場合、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１のＰＢＳ １００μｇ／ｍｌで４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ／Ｔで２回洗浄した後、遊離の結合部位を、室温で１時間、３％ｗ／ｖ ＢＳＡのＰＢＳ／Ｔを用いてブロッキングした。

【0102】

次いで、プレートをＰＢＳ／Ｔで３回洗浄し、ラット血漿試料を、それぞれ１：２希釈系列で、ＰＢＳ／Ｔ中に適用したが、このＰＢＳ／Ｔは、ラット血漿成分の一定の割合を維持するために、未処理の動物由来の０．５％（ｖ／ｖ）血漿を補充しておいたものである。同様に、試験試料と同量のラット血漿を含有するＰＢＳ／Ｔに含まれる規定濃度にての精製ＰＡＳ化チモシンアルファ１の希釈系列を使用して、標準曲線を作製した。室温にての１時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。結合ＰＡＳ化チモシンアルファ１を検出するために、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２の１μｇ／ｍｌ ＰＢＳ／Ｔ溶液５０μｌとともに１時間、ウェルをインキュベートしたが、この抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋアルカリホスファターゼ抗体標識キット（ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）を使用してアルカリホスファターゼとコンジュゲートさせておいたものである。ＰＢＳ／Ｔで２回、ＰＢＳで２回洗浄した後、酵素活性を、ｐ－ニトロフェニルリン酸（０．５ｍｇ／ｍｌ）を使用して検出した。この目的のため、プレートを３０℃で２０分間インキュベートし、吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅマイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して４０５ｎｍで測定し、ＰＡＳ化チモシンアルファ１濃度を標準曲線との比較により定量化した（図１４Ａ）。

【0103】

データを、注射後のサンプリング時間に対してプロットし、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３ソフトウェアを使用する１－コンパートメントモデルを使用して当てはめた。生成するＰＫパラメータ（表１）およびＰＫプロファイル（図１４Ｂ）は、長時間作用型ペプチド薬物に典型的なものであり、本発明の抗ＰＡＳ抗体が哺乳動物血漿中のＰＡＳ化薬物の濃度の定量化に適していることを証明する。注目すべきことに、本方法に適用されるＥＬＩＳＡセットアップ（図１５Ａ）は、捕捉抗体として抗ＰＡＳ抗体を使用する、したがって、ヒトペプチドと１００％の配列同一性を共有する内在性ラットチモシンアルファ１の検出を回避する。代替のＥＬＩＳＡセットアップは、例えば図１５に例示されており、当技術分野でよく知られる（Ｖａｓｈｉｓｔ ＆ Ｌｕｏｎｇ、２０１８）。

【0104】

【表1】

【0105】

Ｌ．ＰＡＳペプチドとの抗ＰＡＳ Ｆａｂ断片の共結晶化、Ｘ線データ収集および分子モデルの建設
抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１、および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１の精製組換えＦａｂ断片を、それらの同族ＰＡＳペプチドと直接共結晶化したが、一方、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２のＦａｂの場合では、（Ｅｒｅｎｏ－Ｏｒｂｅａら、２０１８）に記載の抗ヒトカッパＶ_ＨＨドメインとの複合体を最初に調製した。この目的のため、精製Ｆａｂを３倍モル量のＶ_ＨＨドメイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに４℃で１時間インキュベートした。タンパク質混合物をＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５プレップグレードカラムでＳＥＣに供し、Ｆａｂ・Ｖ_ＨＨ複合体を過剰な抗ヒトカッパＶ_ＨＨドメインから分離し、ランニング緩衝液として１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ６．５、７０ｍＭ ＮａＣｌを使用してワンピークで単離した。

【0106】

さまざまなタンパク質溶液を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｌ遠心フィルターユニット（ＭＷＣＯ １０ ｋＤａ；Ｍｉｉｉｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して以下のように濃縮した：抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ６．５、８０ｍＭ ＮａＣｌ中９．６ｍｇ／ｍｌまでに；抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ中９．２ｍｇ／ｍｌまでに；抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１を８．４ｍｇ／ｍｌまでにおよび抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２を、Ｆａｂ・Ｖ_ＨＨとして、１３．７ｍｇ／ｍｌまでに、両方とも１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ６．５、７０ｍＭ ＮａＣｌ中で。共結晶化の場合、各濃縮タンパク質溶液を、水の＞５０ｍＭストック溶液からの適当なペプチドと１：３（Ｆａｂ：ペプチド）のモル比で混合し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、タンパク質結晶化スクリーニングを、シッティングドロップ蒸気拡散法およびタンパク質とリザーバー溶液の等量混合物を介して実施し、結果として３００～１０００ｎｌの範囲の総ドロップ容量をとした。有望な結晶化条件の精密化に当たっては、リザーバー容量１ｍｌおよびタンパク質１μｌとリザーバー溶液１μｌから構成されるドロップレットを用いるハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して、さらなるスクリーニングを設定した。表３に列記する条件下で２０℃で１週間以内に結晶が出現した。タンパク質結晶を回収し、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２の場合は２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ２００、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２ の場合は２０％ｗ／ｖエチレングリコール、または抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１の場合は２０％ｗ／ｖグリセロールを補充した沈殿緩衝液に移し、液体窒素中で即座に凍結させた。

【0107】

単一波長Ｘ線シンクロトロンデータセットを、Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ－Ｚｅｎｔｒｕｍ Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツにより運用されるＢＥＳＳＹ ＩＩのＭＸビームラインＢＬ１４．２で、または、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１のＦａｂ断片の場合は、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＳＬＳ）、Ｖｉｌｌｉｇｅｎ－ＰＳＩ、スイスのタンパク質結晶構造解析ビームラインＸ０６ＳＡ－ＰＸＩで、各結晶から１００Ｋで収集した。回折データ（表３）を、ＸＤＳプログラムパッケージ（Ｋａｂｓｃｈ、２０１０）で整理し、分子置換を、検索モデルとしてＦａｂ １０１Ｆ（ＰＤＢ ＩＤ：３ＱＱ９）の定常ドメインおよび可変ドメインを使用して、Ｐｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙら、２００７）を用いて実施し、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２ Ｆａｂ・Ｐ／Ａ＃１複合体の構造を解析した。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１ Ｆａｂ・ＰＡＳ＃１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２ Ｆａｂ・ＰＡＳ＃１の構造を、後者の場合では抗ヒトカッパＶ_ＨＨドメイン（ＰＤＢ ＩＤ：６ＡＮＡ）も含めて、検索モデルとして抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２のＦａｂの精密構造との分子置換によって解析した。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１Ｆａｂ・ＡＰＳＡの構造を、抗ヒトカッパＶ_ＨＨドメインを含めずに、検索モデルとして抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２ Ｆａｂの精密構造との分子置換によって解析した。タンパク質モデルを、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙら、２０１０）で手動で調整し、Ｒｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、２０１１）で精密化した。ペプチド分子と水分子を、精製化プロセスの過程でＣｏｏｔ内に手動で構成した。最終的な構造モデルを、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙサーバーを使用して検証した（Ｗｉｉｉｉａｍｓら、２０１８）。結晶の接触部位ならびに露出表面積および埋没表面積（それぞれＡＳＡおよびＢＳＡ）をＰＩＳＡ（Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ ＆ Ｈｅｎｒｉｃｋ、２００７）（入力ファイル内で連続し非中断のアミノ酸鎖として接続した軽鎖および重鎖を用いて算出）を用いて解析した。分子グラフィックスを、静電気の算出のためにＡＰＢＳモジュール（Ｂａｋｅｒら、２００１）を使用して、ＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて作成した。原子間距離はＣＯＮＴＡＣＴ（Ｗｉｎｎら、２０１１）を用いて算出した。

【0108】

ポリペプチドを、Ｉｇ軽鎖についてはＬ、Ｉｇ重鎖についてはＨ、結合ＰＡＳペプチドそれぞれについてはＰと記述し、一方、抗ヒトカッパＶ_ＨＨドメインに、鎖識別子Ｘを割り当てた。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１の場合、非対称ユニットに２つのＦａｂ・ペプチド複合体がある場合、より高い平均結晶学的Ｂ因子を有するものに、それぞれ鎖識別子Ａ、Ｂ、Ｑを割り当てた。
Ｍ．セファロースカラム上に固定化した抗ＰＡＳ Ｆａｂを使用するＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）、Ｈ１ＧＡ－ＰＡＳ＃１（２００）－Ｈｉｓ_６およびＰＡＳ＃１（８００）－ＩＬ１Ｒａのアフィニティー精製
抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２の精製Ｆａｂ断片合計５ｍｇを、製造業者のプロトコルに従って、１ｍｌのＨｉＴｒａｐＮＨＳ活性化ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に共有結合で固定化した。簡潔に言うと、カラムを、氷冷１ｍＭ ＨＣｌで洗浄し、その後、Ｆａｂのカップリング緩衝液（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ_３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）１ｍｌを注入し、２５℃で３０分間、インキュベートした。過剰な反応基の洗浄および不活性化を、０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３と０．１Ｍ酢酸Ｎａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４との繰返し交互注入によって実施した。

【0109】

このカラム上のＰＡＳ化試験タンパク質、ＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）、Ｈ１ＧＡ－ＰＡＳ＃１（２００）－Ｈｉｓ_６およびＰＡＳ＃１（８００）－ＩＬ１Ｒａの精製を、流速１ｍｌ／分で操作するＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５クロマトグラフィーシステムを使用して実施した。カラムを、ランニング緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）２ｍｌで最初に平衡化し、これに続いて（ｉ）純粋なＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）（配列番号７１）または（ｉｉ）ＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）を発現する大腸菌ＢＬ２１細胞の全細胞溶解物、または（ｉｉｉ）Ｈ１ＧＡ－ＰＡＳ＃１（２００）－Ｈｉｓ_６（配列番号９０）を発現する大腸菌ＢＬ２１細胞の周辺質抽出物、または（ｉｖ）ＰＡＳ＃１（８００）－ＩＬ１Ｒａ（配列番号９１）を発現する大腸菌ＢＬ２１細胞の全細胞溶解物のいずれかを注入した。非結合タンパク質をランニング緩衝液２ｍｌでカラムから洗い落し、次いで、Ｌ－プロリンアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の１Ｍランニング緩衝液２～３ｍｌを適用することによって、または代替的にｐＨをＨＣｌで８．０に調整した１Ｍ Ｌ－プロリンアミド、１００ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを適用することによって、結合タンパク質を溶出し、これに続いて、ランニング緩衝液によるカラム再生を行った。一般のタンパク質の存在とＳｔｒｅｐＩＩ－ｅＧＦＰ－ＰＡＳ＃１（２００）の特異的存在の両方をモニタリングするために、ＵＶ吸光度をそれぞれ２８０ｎｍおよび４８８ｎｍで検出した（図１０Ａ、Ｂ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析が、純粋なＰＡＳ化タンパク質の特異的溶出を確認した（図１０Ｃ、Ｄ）。２８０ｎｍでバックグラウンド吸収をもたらした市販のＬ－プロリンアミド物質中の見かけ上の不純物により、ブランククロマトグラム（ＰＡＳ化タンパク質の適用なし）を記録し、減算に使用して、Ｈ１ＧＡ－ＰＡＳ＃１（２００）－Ｈｉｓ_６およびＰＡＳ＃１（８００）－ＩＬ１Ｒａの補正クロマトグラムを取得した（図１１Ａ、Ｃ）。純粋なＰＡＳ化タンパク質の特異的溶出を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析によって確認した（図１１Ｂ、Ｄ）。
Ｎ．ＰＡＳ化試験タンパク質の調製
本明細書に記載の方法で使用される、さまざまな組成および長さを有するＰＡＳ配列に融合されたすべての試験タンパク質およびペプチドを、当技術分野において、例えば、ＷＯ２００８／１５５１３４Ａ１、ＷＯ２０１１／１４４７５６Ａ１、ＷＯ２０１７／１０９０８７Ａ１、ＷＯ２０１８／２３４４５５Ａ１においてまたは、（Ｂｉｎｄｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１７； Ｂｒｅｉｂｅｃｋ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１８； Ｍｏｒａｔｈら、２０１５； Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３）において、十分に記載されるルーチンの手順に従って、相当する合成遺伝子を内部に持つ従来の発現ベクターからの細胞質発現を介してまたは周辺質分泌を介して、大腸菌内で産生させた。
Ｏ．寄託
本発明の以下のＭＡｂは、１９９１年２月２８日に、動物およびヒトの細胞培養物の寄託に関するブダペスト条約に準じてＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ ＡｕｔｈｏｒｉｔｙとしてＷｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎによって認められた、Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ － Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ、３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツにての細胞培養物として、ＸＬ－ｐｒｏｔｅｉｎ ＧｍｂＨ、Ｌｉｓｅ－Ｍｅｉｔｎｅｒ－Ｓｔｒａｓｓｅ ３０、８５３５４ Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、ドイツによって、寄託されたものである。

【0110】

・抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ １．１＝ＤＳＭ ＡＣＣ３３６５
・抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ ２．１＝ＤＳＭ ＡＣＣ３３６６
・抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ ３．１＝ＤＳＭ ＡＣＣ３３６７
実施例２：モノクローナル抗ＰＡＳ抗体の生成およびＰＡＳ配列のその特異的検出
異なる３つのＰＡＳペプチド配列、ＰＡＳ＃１（配列番号１）、Ｐ／Ａ＃１（配列番号２）およびＡＰＳＡ（配列番号３）に対する抗体をマウスにおいて産生させた。この目的のため、動物を、上で本明細書に実施例１に記載のように、相当する合成Ｎ末端保護４０マーペプチドで免疫したが、この４０マーペプチドは、高免疫原性のＴ細胞依存性キャリア抗原／「免疫アジュバント」として海洋養殖キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に、Ｃ末端カルボキシレート基を介して化学的にカップリングされたものである（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎら、２０１４）。ＰＡＳ＃１およびＰ／Ａ＃１の場合、４０マーは設計した２０マー反復配列の２コピーを正確にカバーしたが（Ｂｒｅｉｂｅｃｋ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１８；Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３）、一方、「ＡＰＳＡ」ペプチドは４残基モチーフの１０コピーを構成したが、これは、一種の単純化Ｐｒｏ／Ａｌａリッチ配列パターンと考えられ得る。

【0111】

これらの２×２０マーおよび／または４０マーＰＡＳペプチドを、結果として、隣接する２つの反復配列間の接合部の少なくとも１コピーを含めて、相当するＰＡＳ反復配列の少なくとも２コピーを包含するように設計したが、これはまた、より長い組換えＰＡＳポリペプチドにおいて可能性のあるエピトープも構成する。それぞれ抗原２５～５０μｇによる４～６ラウンドの免疫ならびに最終ブーストの後、脾臓細胞を、抗原当たり５匹のマウスから分離し、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成した。各免疫キャンペーンについて、４０個のハイブリドーマクローン由来の抗体を、相当するＰＡＳポリペプチド（２００～６００残基）を含む組換え融合タンパク質を使用するＥＬＩＳＡによって特徴付けたが、この場合（ｉ）ＰＡＳ配列の配列特異性認識および状況独立性認識、ならびに（ｉｉ）異なるＰＡＳ配列間の可能性のある交差反応性を示す抗体の特定を、スクリーニングすることを目標とする。ハイブリドーマ培養上清を用いるＭＡｂ捕捉ＥＬＩＳＡを実施し、濃度依存性様式でＰＡＳ融合タンパク質を適用して、解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。有望な候補のハイブリドーマ培養上清を、リアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法により、抗原親和性および結合動態に関して特徴付けた。相当する方法は例１に記載される。

【0112】

ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲの測定によるそのＫ_Ｄ値に基づいて、また濃度依存ＥＬＩＳＡの吸収振幅も考慮して、明確に異なる特性を有する８つのクローンを、ＰＡＳ＃１（４０）－ＫＬＨおよびＰ／Ａ＃１（４０）－ＫＬＨの免疫からそれぞれ選択し、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒメンブレン（ＳＰＯＴ）技法（Ｆｒａｎｋ、２００２）を使用して、合成ペプチドアレイ上の線状エピトープの認識について試験した。本アッセイが明らかにしたところは、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１および２．２のエピトープ配列としての「ＰＡＰＡＡＰ」（配列番号８）および「ＰＡＰＡＳＰ」（配列番号９）であり、一方、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および１．２は、ペプチドモチーフ「ＰＡＳＰＡＡＰ」（配列番号１０）を優勢に認識したことである（図５および６を参照されたい）。ＡＰＳＡ配列の反復性がより単純であることから、この抗原に対してＳＰＯＴ置換解析を実施した（図７）。したがって、３～８位にて本質的な全２０種のアミノ酸に連続的に置換されている配列ＡＡＰＳＡＡＰＳＡＡを含む１０マーペプチドを、親水性膜上にＣ末端固定で合成した。興味深いことに、ＰＡＳ＃１（４０）－ＫＬＨによる免疫によって生成した抗体は、ＰＡＳ＃１ポリペプチド配列（抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および１．２）のみを認識したが、一方、Ｐ／Ａ＃１（４０）－ＫＬＨ免疫由来の一部のＭＡｂはまた、Ｐ／Ａ＃１エピトープを超えてＰＡＳ＃１（抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１）との交差反応性も示した。驚くべきことに、本発明のすべての抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂによって認識される一般化配列モチーフが、「（Ｐ／Ｓ）Ａ（Ａ／Ｓ）Ｐ」としてまたはＰＡ（Ａ／Ｓ）Ｐとして浮上した。

【0113】

ＰＡＳ化融合タンパク質の検出における本発明のモノクローナル抗体の適用性について検証するために、ハイブリドーマ上清由来の抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂをウエスタンブロッティング実験で試験し、ここで、ＰＡＳ化融合タンパク質の特異的検出が確認された。さらに、非ＰＡＳ化タンパク質バージョン、ヒト血清タンパク質、または大腸菌全細胞溶解物中のタンパク質に対する非交差反応性はまったく検出されなかった（図２）。

【0114】

実施例３：ＭＡｂのＶ遺伝子配列のクローニングおよびＦａｂ生産
各抗原について、標的配列へのその親和性ならびに他のＰＡＳ配列への交差反応性に基づいて、さらなる解析のために最も有望な２つのハイブリドーマクローン（抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１および抗ＰＡ（Ｓ））を選択した：Ｐ／Ａ＃１の場合は抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２；ＰＡＳ＃１の場合は抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２、ＡＰＳＡの場合は抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡからのそれらのＶ遺伝子配列を決定するために、上で本明細書に実施例１に記載のように、各Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインのコード領域を逆転写し、適切なオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。クローン化したＶ遺伝子配列（抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１、および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２の場合）、または、代替的に、相当する合成ＤＮＡ断片（抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２、および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１の場合）を、第１のヒトＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖定常領域をコードする細菌発現ベクターに次いで挿入して、相当するキメラＦａｂ断片の発現を可能にした（Ｓｃｈｉｗｅｃｋ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、１９９５；Ｓｋｅｒｒａ、１９９４）。Ｆａｂ断片を、振盪フラスコと卓上型発酵槽スケールの両方で大腸菌における周辺質分泌によって機能的な状態で産生させ、ＩＭＡＣ、ＣＥＸおよびＳＥＣによって均一に精製した（実施例１を参照されたい）。

【0115】

以下のアミノ酸配列を取得した（図１を参照されたい；（Ｋａｂａｔら、１９９１）による定義に従ったＣＤＲは黒枠で標識される）：
ＶＨ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１（配列番号２３）：
ＶＬ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１（配列番号２４）：
ＶＨ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２（配列番号２５）：
ＶＬ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２（配列番号２６）：
ＶＨ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１（配列番号２７）：
ＶＬ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１（配列番号２８）：
ＶＨ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２（配列番号２９）：
ＶＬ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２（配列番号３０）：
ＶＨ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１（配列番号３１）：
ＶＬ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１（配列番号３２）：
ＶＨ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２（配列番号３３）：
ＶＬ抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．２（配列番号３４）：
注目すべきことに、異種間の配列多様性に大部分基づいている、ＣＤＲを決定するための方法（Ｋａｂａｔら、１９９１）とは別に、抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づいている、当技術分野でよく知られる少なくとも１つの他のアプローチがある（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９）。本明細書で使用される場合、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔ（上掲）による定義を優先的に指すが、他の前記アプローチによってまたは両アプローチの組み合わせによって定義されるＣＤＲを指す場合もある。連続番号を使用してアミノ酸を番号付けした。

【0116】

実施例４：結合親和性の特性評価（抗ＰＡＳモノクローナル抗体および抗ＰＡＳ Ｆａｂ）
本発明のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）および本明細書において提供される方法および実施例によって取得されるようなモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、ならびに相当する組換え抗ＰＡＳ Ｆａｂについて、さまざまなＰＡＳポリペプチドに対してのそれらのＫ_Ｄ値を正確に決定するために、定量的ＥＬＩＳＡおよびリアルタイムＳＰＲの測定で調査した（表２も参照されたい）。これらの測定は、予備的なハイブリドーマスクリーニングからの知見を本質的に確認した。ＰＡＳ抗原の各タイプについて、特に高親和性を有する少なくとも１つのＭＡｂが特定されたが、ここでは、Ｆａｂについて測定された１桁のナノモル範囲のＫ_Ｄ値から明白である：抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１についてはＰ／Ａ＃１に対して２ｎＭ；抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１についてはＰＡＳ＃１に対して２３ｎＭ；抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１についてはＡＰＳＡに対して２ｎＭ。以前に調査したインタクトのＭＡｂと比較して、Ｆａｂについて測定された親和性は通常１～２桁より弱かったが、このことは、アビディティ効果による可能性が最も高く、この効果は、エピトープの多重のコピー（例えば、６００残基のＰＡＳポリペプチドにおける、３０コピーの反復的な２０個のＰＡＳ＃１アミノ酸ストレッチ）を内部に持つ長いＰＡＳポリペプチドと二価Ｍａｂが相互作用する場合に起こる。抗Ｐ／Ａ＃１Ｆａｂは、Ｐ／Ａ＃１配列に特異的であるか、またはＰＡＳ＃１配列とも交差反応性であるかいずれかであったが、一方、抗ＰＡＳ＃１ＦａｂはＰＡＳ＃１配列に対してのみ特異性を示した。抗ＡＰＳＡ抗体断片は、ＡＰＳＡ配列に特異的であるか、またはＰＡＳ＃１およびＰ／Ａ＃１のポリペプチドと交差反応性であるかいずれかであった（以下の表２を参照されたい）。

【0117】

【表2】

【0118】

それらのエピトープ配列に対する抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２の一価の親和性を決定するために、相当する組換えＦａｂ断片および合成ペプチドＡｂｚ－ＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号４）（蛍光共鳴エネルギー転移プローブとしてＮ末端ｏ－アミノベンゾイル基を担持する）を用いて、蛍光滴定（ＦＴ）実験を実施した。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１のＦａｂについては信頼できるＫ_Ｄ値を導出することはできなかったが、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２のＦａｂについてはＫ_Ｄ＝９．２±０．１μＭを決定した（図１６）。この値は、ＥＬＩＳＡで純粋なＰ／Ａ＃１（６００）抗原について測定されたＫ_Ｄ＝８±１ｎＭと比較せねばならず、これはおよそ１０００倍高かった（表２を参照されたい）。この差異は、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１のＦａｂについてはさらにより高いとせねばならず、このことが指示するところは、アビディティ効果だけでなく、エピトープペプチドの正確な分子近傍または多数の反復配列を有するポリペプチド内のエピトープ密度などの、より特異な側面もまた、見かけの親和性に相当に影響を及ぼし得ることである。

【0119】

実施例５：抗ＰＡＳ Ｆａｂとの共結晶化によるＰＡＳペプチド結合の構造特性評価
本発明の抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂの一部による抗原認識の構造メカニズムを、Ｘ線結晶構造解析を使用して解析した。したがって、上で本明細書に実施例１に記載の方法を使用して調製した組換え抗ＰＡ（Ｓ）Ｆａｂ断片を、それらの同族合成ペプチドとの共結晶化実験に供したが、その配列は、上記のようなＳＰＯＴアッセイによって決定されたエピトープ配列に基づくものであるか、または、単純なＡＰＳＡモチーフの場合は、３つのＡＰＳＡ反復を有する１２個のアミノ酸のストレッチを含んだ。より長い（ポリ）ペプチドストレッチでは非存在であると思われる、Ｎ末端にての荷電を回避するために、これらをピログルタミン酸（Ｐｇａ）でまたはアセチル化によってブロックした。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２ Ｆａｂ・Ｐ／Ａ＃１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１ Ｆａｂ・ＰＡＳ＃１のＦａｂ・ペプチド複合体について、回折品質の結晶が得られた（添付の表３を参照されたい）。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２の場合、本発明者らは、抗ヒトカッパ軽鎖Ｖ_ＨＨドメインを利用して（本発明者らのキメラの）Ｆａｂ断片の（共）結晶化を促進する最近公表された戦略を適用した（Ｅｒｅｎｏ－Ｏｒｂｅａら、２０１８）。実際、このアプローチは、ＰＡＳ＃１エピトープペプチドと複合体を形成した抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２のＦａｂの結晶をもたらし、この結晶はシンクロトロンＸ線源で１．５５Åの高分解能で回折した。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２ Ｆａｂ・Ｐ／Ａ＃１複合体の構造を、検索モデルとして機能的に非関連の抗ヒトＲＳＶ Ｆａｂ １０１Ｆ（ＰＤＢ ＩＤ：３ＱＱ９）の定常ドメインおよび可変ドメインを使用する分子置換によって解析した。続いて、複合体、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１ Ｆａｂ・ＰＡＳ＃１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２ Ｆａｂ・ＰＡＳ＃１・Ｖ_ＨＨの構造を、検索モデルとしてＦａｂ ３Ｆ３Ｅ２抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２の精密構造、ならびに後者の場合では抗ヒトカッパ軽鎖ＶＨＨドメイン（ＰＤＢ ＩＤ：６ＡＮＡ）の精密構造を用いる分子置換によって、解析した。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１ Ｆａｂ・（ＡＰＳＡ）_３の構造を、この場合では、抗ヒトカッパＶＨＨドメインを含めずに、検索モデルとして抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２ Ｆａｂの精密構造を用いる分子置換によって解析した。ＰＡＳ＃１、Ｐ／Ａ＃１および（ＡＰＳＡ）_３の各ペプチドのマニュアルでの位置決めの後、結晶学的精製を完了させ、結果的にＲ_ｆｒｅｅ値２３～２７％となった（表３）。

【0120】

【表3】

【0121】

これらの結晶構造のさらなる解析が示したところは、ＰＡＳペプチドは、多少とも緩和したコンフォメーションで４つのＦａｂすべてに結合され、その結果、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも４つが関与した状態で、抗原結合部位の広い領域をカバーすることである。極性側鎖の欠如が理由で － ＰＡＳ＃１エピトープペプチドの１個のＳｅｒ残基と（ＡＰＳＡ）_３ペプチドの３個のＳｅｒ残基を除いて － 相互作用は、ペプチド主鎖の原子との水素結合（添付の表４を参照されたい）および一部の局所的な疎水性相互作用を含むファンデルワールス接触（添付の表５を参照されたい）を通して優勢に媒介されるが、一方、予想どおり塩橋は完全に非存在である。興味深いことに、いずれの場合も、ＰＡＳペプチドのうちの少なくとも１個のＡｌａ残基が抗ＰＡＳ Ｆａｂとの適切な相互作用に関与する；したがって、ＡｌａはＰＡＳエピトープにおける抗体相互作用のホットスポットと考えられ得る。これまでに、最小の側鎖を有するアミノ酸であるＡｌａは、タンパク質－タンパク質／ペプチド認識において取るに足りない役割を担うとされてきた。事実、アラニンスキャニング突然変異誘発の戦略（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ Ｗｅｌｌｓ、１９８９）は、受容体－リガンド結合または抗体－抗原結合にクリティカルな残基を精査するための幅広い応用を見出し、その結果、分子相互作用に対するＡｌａメチル側鎖の準不活性な役割を想定した。予想外なことに、本発明が明らかにするところは、特に２つの結晶構造、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２ Ｆａｂ・Ｐ／Ａ＃１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１ Ｆａｂ・ＰＡＳ＃１により例示されるように、Ａｌａが事実、抗原認識において中枢的な役割を取ることができることである。実際、Ａｌａ^Ｐ５は、結合ポケットに完全に埋め込まれ、そのカルボニル酸素が２つの水素結合に関与し、複合体項ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２ Ｆａｂ・Ｐ／Ａ＃１の抗体－ペプチドインターフェースにおいて「ホットスポット」残基として働く（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ＆ Ｗｅｌｌｓ、１９９５）。同様に、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１ Ｆａｂの構造が明らかにするところは、抗原結合部位の中央にあるホールであり、このホールは、Ａｌａ^Ｐ７のメチル基を収容するように完全に成形され、それによって、高い形状相補性および密集したインターフェースを可能にする。

【0122】

（ＡＰＳＡ）_３ペプチドと複合体を形成した抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１ Ｆａｂの構造が明らかにするところは、Ｖ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖の間のパラトープにある特徴的なグルーブであり、そこで、ペプチドが伸長した形状で結合される。結合にはペプチド内の３つのＡＰＳＡ反復すべてからの残基が関与し、結合は、ペプチド主鎖の原子またはペプチドのＳｅｒ側鎖との水素結合、ならびにペプチドのＰｒｏ側鎖およびＡｌａ側鎖の疎水性相互作用によって主に媒介される。抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２ Ｆａｂ・Ｐ／Ａ＃１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１ Ｆａｂ・ＰＡＳ＃１の構造と同様に、エピトープ内のＡｌａ残基は水素結合およびファンデルワールス接触を媒介する上で、重要な役割を担う（表４および５）。

【0123】

予想外なことに、ＰＡＳ＃１エピトープペプチドと複合体を形成した抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２ Ｆａｂの場合、ペプチドのＮ末端ピログルタミル残基もまた、３つの水素結合による複合体形成に寄与する。こういった水素結合は、Ｐｇａ残基の位置がＰｒｏによって占められることになる、より長いＰＡＳ＃１（ポリ）ペプチドとの複合体では不可能であると思われる。Ｐｒｏ残基は結晶構造においてこの位置に完全にフィットすることになるが、一方、より長いポリペプチド鎖のさらなるＮ末端コースはＦａｂとの立体障害をもたらすことになる。

【0124】

抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１ Ｆａｂまたは抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２ Ｆａｂとの複合体中の結合したＰＡＳ＃１ペプチドの間の任意の立体構造の類似性を解明するために、それら構造間の重ね合わせを実施した。実際、Ｓｅｒ^Ｐ５～Ａｌａ^Ｐ８の４個の残基は、これらのＣ_α位置の優れたマッチングを示したが、この場合、二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）はわずか０．１５Åであった。ＳＴＲＩＤＥによる二次構造解析（Ｆｒｉｓｈｍａｎ ＆ Ａｒｇｏｓ、１９９５）は、この４残基ストレッチの間にＩ型β－ターンを特定した。Ｓｅｒ^Ｐ５のカルボニル酸素とＡｌａ^Ｐ８アミド水素の間の分子内水素結合とは別に、このターンは、Ｓｅｒ^Ｐ５ヒドロキシル基とＡｌａ^Ｐ７アミド水素の間の水素結合によって安定化される。このタイプのβターンは、ＳＰＸＸターンとして分類され、遺伝子調節タンパク質において発生するが、そこにおいて、このターンがＤＮＡ結合モチーフとして働く（Ｓｕｚａｋｉ ＆ Ｙａｇｉ、１９９１）。しかし、２つの Ｆａｂ複合体におけるこれらの相互の類似性にもかかわらず、こういったターンはさまざまな配向性で結合される：抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１ Ｆａｂ・ＰＡＳ＃１の複合体では、このターンは結合ポケットに寄り添うが、一方、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２ Ｆａｂ・ＰＡＳ＃１との複合体では溶媒に晒される。注目すべきことに、ＳＴＲＩＤＥを用いる同様の解析は、抗Ｐ／Ａ＃１ＭＡｂ ２．２ Ｆａｂとの複合体中のＰ／Ａ＃１エピトープペプチドについても、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１ Ｆａｂと複合体を形成した（ＡＰＳＡ）_３ペプチドについても、二次構造の特徴を特定しなかった。

【0125】

本発明の文脈では、異なる３つの配列：すなわち、配列番号１、２および３で提供されるような配列を有する構造的に無秩序なＰｒｏ／Ａｌａリッチ（ポリ）ペプチド中の線状エピトープを特異的に認識するＭＡｂが、本明細書において提供されるような手段および方法によって生成される。本発明の抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ、またはその組換えバージョンおよび断片は、臨床研究に適したアッセイを含めて、ＰＡＳ化薬物候補の生化学研究ならびに生物医薬品開発のための貴重な生物解析ツールおよび診断ツールを提供する（Ｂｉｎｄｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１７；Ｇｅｂａｕｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、２０１８；Ｒｉｃｈｔｅｒら、２０２０）。

【0126】

【表4】

【0127】

【表5】

【0128】

本明細書において提供されるすべての結晶化 Ｆａｂ複合体では、パラトープにおける高存在量のＴｙｒ残基が明白である。こういった残基は疎水性接触の大部分を担い（添付の表５を参照されたい）、したがって、荷電側鎖または極性側鎖に乏しい抗原を結合するのに十分に適する表面を創り出す。実際、≦４．０Åの全接触のうちの６２％、４９％、４３％、および２３％が、それぞれ、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１中のＴｙｒによって媒介される。興味深いことに、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ２．２は、高Ｔｙｒ含有量を明らかにし、結晶化複合体のうちで高親和性も有した。このことは以前の解析と一致するが、この解析が指示するところは、抗体パラトープ中の高含量のＴｙｒが、増強した抗原特異性および親和性に全体的に寄与することである（Ｂｉｒｔａｌａｎら、２００８；Ｂｉｒｔａｌａｎら、２０１０）。

【0129】

本明細書において提供されるデータは、抗体による無秩序なエピトープの分子認識のメカニズムに光を当てる。評価したすべてのＦａｂ構造においてＰＡＳエピトープペプチドから生じる塩橋および明白な側鎖相互作用がない状況では、複合体の形成は、ペプチド骨格が関与する水素結合（添付の表４）ならびに一部の局所的な疎水性相互作用を含むファンデルワールス接触（添付の表５）によって主に駆動される。ＰＡＳペプチドの単調性に起因して、極性相互作用が可能な少数の原子団が効率的に活用されることが求められる。このことは、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．２の構造によりうまく実証されるが、例えば、この場合、ＰＡＳ＃１ペプチドとの骨格水素結合ネットワークの短いセグメントが逆平行βシートに似ている。１個のＳｅｒ残基を含むＰＡＳ＃１エピトープペプチドとの２つのＦａｂ複合体では、両方の抗体は水素結合の形成に利用可能な唯一の極性側鎖と係合する。同じことが抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ ３．１の構造にも当てはまり、この場合、３つのＳｅｒ側鎖のうちの２つが水素結合に関与する。それにもかかわらず、競合する水性環境におけるそのような水素結合の限定されたエネルギー利得と一致して（Ｇａｏら、２００９）。実際、抗ＰＡ（Ｓ） ＭＡｂ １．１および１．２は、抗Ｐ／Ａ＃１に対して産生された最良のＭＡｂと比較してのその著しくより低い親和性を考慮すると、この相互作用から大して恩恵を受けないと思われる（表２を参照されたい）。６つのＣＤＲのうち少なくとも４つが、評価したすべての Ｆａｂ複合体においてペプチド－抗体相互作用に関与するという観察結果（表６を参照されたい）が強調するところは、拡張したインターフェースを関わらせて、構造的に柔軟な抗原を多少とも緊密に結合することの必要性である。

【0130】

【表6】

【0131】

実施例６：抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ１．１を使用して、ＰＡＳ化抗ガレクチンＦａｂ断片を捕捉し、その抗原ガレクチン－３に対するＰＡＳ－Ｆａｂ結合動態を決定する、ＳＰＲ分光法
本発明の抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ１．１抗体を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップ上でのＰＡＳ化ヒト化抗ガレクチンＦａｂ断片（Ｐｅｐｌａｕら、２０２１）の非共有結合での安定した捕捉のためのツールとして使用して、その断片の抗原であるガレクチン－３へのそのＦａｂの親和性を決定した。流速３０μｌ／分にてのランニング緩衝液としてＨＢＳ／Ｔ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０）で運転の、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００装置（Ｃｙｔｉｖａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）に、カルボキシメチルデキストランコーティングのＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ）を装入した。両フローチャネル内のデキストランヒドロゲルのカルボキシレート基を、４８３ｍＭ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）と１００ｍＭ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の１：１混合物を流速５μｌ／分で４３０秒間注入することによって、アミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、反応性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基に変換した。次に、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）から入手したプロテインＡアフィニティー精製組換え抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ１．１を、１０ｍＭ酢酸Ｎａ ｐＨ４．５に含まれる抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ１．１の溶液１００μｇ／ｍｌの、流速５μｌ／ｍｉｎにての６００秒間の注入によりチップ表面上へと共有結合で固定した。未反応ＮＨＳエステル基を、０．１Ｍエタノールアミン溶液の流速５μｌ／分にての４３０秒間の注入によって最終的にブロックした。この手順（図１７）は、概１３５００共鳴単位（ΔＲＵ）の抗ＰＡ（Ｓ）Ｍａｂ１．１表面密度をもたらした。

【0132】

Ｃ１７３Ｔ突然変異およびＣ末端Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ（配列番号９４）を担持する組換えガレクチン－３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ Ｐ１７９３１）に対する抗ガレクチン－ＰＡＳ（２００）Ｆａｂ断片（配列番号９２および配列番号９３）の結合動態を調査するため、精製ＰＡＳ化 Ｆａｂ断片を、ＨＢＳ／Ｔで３．５７μｇ／ｍｌに希釈し、流速５μｌ／分で４０秒間フローチャネル２に注入し、これに続いて６００秒間、緩衝液をフローさせた。これは、概５８０共鳴単位（ΔＲＵ）のＰＡＳ－ Ｆａｂ表面密度をもたらしたが、この表面密度は±７％以内で安定したままであった（図１７Ｂ）。続いて、流速３０μＬ／分にての、それぞれ６０秒間の抗原ガレクチン－３の１：２希釈系列（１．６ｎＭ～０．１ｎＭ）からの５回連続注入使用して、最終的にこれに続いて３６００秒の解離期間を使用して、シングルサイクルカイネティクス実験を実施した。その後、流速３０μｌ／分にての６０秒間の、１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．４の２回連続注入よってチップを再生した。こういった再生手順により、２か月超にわたるＰＡＳ化タンパク質を用いるさらなる測定のために、同じＭＡｂ官能化センサー表面の再利用が可能となった。

【0133】

参照補正のセンサーグラム（図１７Ｃ）が示したところは、抗ガレクチン－ＰＡＳ（２００）Ｆａｂ断片とその抗原ガレクチン－３との間の二分子反応に関しての典型的な結合曲線である。これらのデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ）を使用してグローバル１：１ラングミュア結合モデルに当てはめたが、会合速度は７．９×１０^６Ｍ^－１ｓ^－１、解離速度３．０×１０^－５ｓ^－１、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ値）は３．８ｐＭという結果であった。

【0134】

これらの発見が実証するところは、本発明の高特異性抗ＰＡＳ１．１ＭＡｂが、ＳＰＲセンサーチップ上でＰＡＳ化タンパク質の非共有結合での安定した捕捉のため貴重なツールを提供することである。さらに、１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．４を使用する弱酸性再生は、ＰＡＳ化タンパク質を、そのリガンドと一緒に、完全に除去し、その結果、同じＭＡｂ官能化センサー表面をＰＡＳ化タンパク質のさらなる測定に再利用する能力を提供した。
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【0135】

【化1-1】

【0136】

【化1-2】

【0137】

【化1-3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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【国際調査報告】