特表 2024-501385 プロトパルボウイルス及びテトラパルボウイルスの組成物及び遺伝子療法のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-11

(54)【発明の名称】プロトパルボウイルス及びテトラパルボウイルスの組成物及び遺伝子療法のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/35 20060101AFI20231228BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20231228BHJP

   C07K 14/015 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20231228BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231228BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/866 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 39/23 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231228BHJP

   A61K 31/65 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 31/138 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20231228BHJP

   C07K 1/22 20060101ALN20231228BHJP

   C07D 498/18 20060101ALN20231228BHJP

【ＦＩ】

C12N15/35

C12N7/01 ZNA

C07K14/015

C12N15/113 Z

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N15/55

C12N15/12

C12N5/10

C12P21/00 C

C12N15/63 Z

C12N15/86 Z

C12N15/866 Z

C12N15/85 Z

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P1/04

A61P17/06

A61P25/00

A61K31/7088

A61K31/713

A61P43/00 111

A61K48/00

A61K39/23

A61K35/76

A61K31/65

A61K31/138

A61K31/436

A61P43/00 121

C07K1/22

C07D498/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023563914

(86)(22)【出願日】2021-12-23

(85)【翻訳文提出日】2023-07-18

(86)【国際出願番号】 US2021065108

(87)【国際公開番号】W WO2022140683

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】63/129,848

(32)【優先日】2020-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523239491

【氏名又は名称】シンテニー セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】コティン， ロバート

(72)【発明者】

【氏名】アギーレ， セバスチャン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C072

4C084

4C085

4C086

4C087

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA93X

4B065AA94X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA44

4C072AA03

4C072BB03

4C072CC01

4C072CC12

4C072DD07

4C072EE09

4C072FF15

4C072GG07

4C072HH01

4C072UU01

4C084AA13

4C084AA17

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA01

4C084ZA68

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB15

4C084ZC41

4C084ZC75

4C085BA75

4C085CC08

4C085CC21

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG08

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB22

4C086DA29

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA68

4C086ZA89

4C086ZA96

4C086ZB15

4C086ZC41

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087CA20

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA68

4C087ZA89

4C087ZA96

4C087ZB15

4C087ZC41

4C087ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA23

4C206MA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA11

4C206NA05

4C206NA14

4C206ZA01

4C206ZA68

4C206ZA89

4C206ZA96

4C206ZB15

4C206ZC41

4C206ZC75

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA01

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスのキャプシドタンパク質またはそのバリアント、及び異種核酸を含む核酸を有する組換えビリオンが開示される。（１）プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントと；（２）核酸と、を含む、組換えビリオンであって、前記核酸が、異種核酸を含む、前記組換えビリオン。（１）テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントと；（２）核酸と、を含む、組換えビリオンであって、前記核酸が、異種核酸を含む、前記組換えビリオン。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントと；（２）核酸と、を含む、組換えビリオンであって、前記核酸が、異種核酸を含む、前記組換えビリオン。

【請求項2】

（１）テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントと；（２）核酸と、を含む、組換えビリオンであって、前記核酸が、異種核酸を含む、前記組換えビリオン。

【請求項3】

前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、肉食動物プロトパルボウイルス、肉食動物プロトパルボウイルス１、翼手目プロトパルボウイルス１、真無盲腸目プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス２、霊長類プロトパルボウイルス３、霊長類プロトパルボウイルス４、げっ歯類プロトパルボウイルス１、げっ歯類プロトパルボウイルス２、げっ歯類プロトパルボウイルス３、有蹄動物プロトパルボウイルス１、及び有蹄動物プロトパルボウイルス２から選択される種のものである、請求項１に記載の組換えビリオン。

【請求項4】

前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、請求項１または３に記載の組換えビリオン。

【請求項5】

前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、翼手目テトラパルボウイルス１、霊長類テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス２、有蹄動物テトラパルボウイルス３、及び有蹄動物テトラパルボウイルス４から選択される種のものである、請求項２に記載の組換えビリオン。

【請求項6】

前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、請求項２または５に記載の組換えビリオン。

【請求項7】

前記テトラパルボウイルスが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、またはそれらの遺伝子型バリアントである、請求項６に記載の組換えビリオン。

【請求項8】

前記ビリオンが、正二十面体である、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項9】

前記キャプシドタンパク質またはそのバリアントが、構造タンパク質ＶＰ１及び／またはＶＰ２を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項10】

ＶＰ２がＶＰ１よりも多く存在する、請求項９に記載の組換えビリオン。

【請求項11】

ＶＰ１が、配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２から選択される配列と、少なくとも約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９または１０に記載の組換えビリオン。

【請求項12】

ＶＰ２が、配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、及び２３から選択される配列と、少なくとも約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項13】

前記異種核酸が、標的細胞の核酸配列と少なくとも約６０％同一である核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項14】

前記異種核酸が、哺乳動物の前記核酸と少なくとも約６０％同一であり、前記哺乳動物が、好ましくはヒトである、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項15】

前記異種核酸が、プロトパルボウイルスプロモーターまたはテトラパルボウイルスプロモーターに作動可能に連結されていない、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項16】

前記核酸が、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項17】

前記少なくとも１つのＩＴＲが、以下を含む、請求項１６に記載の組換えビリオン：
（ａ）ディペンドパルボウイルスＩＴＲ、
（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲ、任意によりＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｃ）プロトパルボウイルスＩＴＲ、または
（ｄ）テトラパルボウイルスＩＴＲ。

【請求項18】

前記プロトパルボウイルスＩＴＲが、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントのＩＴＲから選択される、請求項１７に記載の組換えビリオン。

【請求項19】

前記テトラパルボウイルスＩＴＲが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントのＩＴＲから選択される、請求項１７に記載の組換えビリオン。

【請求項20】

前記テトラパルボウイルスＩＴＲが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、及びそれらの遺伝子型バリアントのＩＴＲから選択される、請求項１７または１９に記載の組換えビリオン。

【請求項21】

前記核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項22】

前記ＤＮＡが、一本鎖または自己相補的二本鎖である、請求項２１に記載の組換えビリオン。

【請求項23】

前記核酸が、Ｒｅｐタンパク質依存性複製起点（ｏｒｉ）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項24】

前記核酸が、任意により２つのＩＴＲ間に配置される、プロモーターに作動可能に連結された核酸を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項25】

前記プロモーターが、以下から選択される、請求項２４に記載の組換えビリオン：
（ａ）作動可能に連結している前記核酸に対して異種のプロモーター；
（ｂ）前記核酸の組織特異的発現を促進するプロモーター、好ましくは、前記プロモーターが、造血細胞特異的発現または赤血球系統特異的発現を促進する；
（ｃ）前記核酸の構成的発現を促進するプロモーター；及び
（ｄ）任意により、代謝産物、低分子、または化学エンティティに応答して、誘導的に発現されるプロモーター。

【請求項26】

前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、β－グロビンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＡＨＳＰプロモーター、ＭＮＤプロモーター、Ｗｉｓｋｏｔｔ－Ａｌｄｒｉｃｈプロモーター、及びＰＫＬＲプロモーターから選択される、請求項２４または２５に記載の組換えビリオン。

【請求項27】

前記異種核酸が、コーディングＲＮＡ及び／またはノンコーディングＲＮＡをコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項28】

コーディングＲＮＡをコードする前記異種核酸が以下を含む、請求項２５に記載の組換えビリオン：
（ａ）タンパク質またはそのフラグメント、好ましくはヒトタンパク質またはそのフラグメントをコードする遺伝子；
（ｂ）ヌクレアーゼ、任意により転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアント）；
（ｃ）レポーター、例えばルシフェラーゼまたはＧＦＰをコードする核酸；及び／または
（ｄ）薬剤耐性タンパク質、例えばネオマイシン耐性をコードする核酸。

【請求項29】

コーディングＲＮＡをコードする前記異種核酸が、標的細胞中での発現のためにコドン最適化される、請求項２７または２８に記載の組換えビリオン。

【請求項30】

前記異種核酸が、（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、及び／またはＨＢＺ）、アルファヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、フォン・ヴィレブランド因子、ジストロフィンまたは短縮型ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィンまたは短縮型ユートロフィン、マイクロユートロフィン、ウシェリン（ＵＳＨ２Ａ）、ＣＥＰ２９０、ＡＴＰＢ１、ＡＴＰＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＣＰＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣ１、Ｃｏｌ７Ａ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＡ６、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、ＫＩＮＤ１、ＩＮＳ、Ｆ８またはそれらのフラグメント（例えば、Ｂドメイン欠失ポリペプチド（例えば、ＶＩＩＩ ＳＱ、ｐ－ＶＩＩＩ）をコードするフラグメント）、及び嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）から選択されるポリペプチドまたはそれらのフラグメントをコードする遺伝子を含む異種核酸を含む、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項31】

前記ノンコーディングＲＮＡが、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及び／またはガイドＲＮＡを含む、請求項２７に記載の組換えビリオン。

【請求項32】

前記コーディングＲＮＡ、前記タンパク質、または前記ノンコーディングＲＮＡが、標的細胞の内因性遺伝子の発現を増加または回復させる、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項33】

前記コーディングＲＮＡ、前記タンパク質、または前記ノンコーディングＲＮＡが、標的細胞の内因性遺伝子の発現を減少させるまたは消失させる、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項34】

前記組換えビリオンが、以下をコードする核酸を含む、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の組換えビリオン：（ａ）ヘプシジンまたはそのフラグメント、及び／または恒常性鉄調節因子（ＨＦＥ）またはそのフラグメント；（ｂ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【請求項35】

前記組換えビリオンが、（ａ）前記形質導入細胞中でのＨＦＥ及び／またはヘプシジンの発現を増加させる；及び／または（ｂ）前記形質導入細胞中でのＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態の発現を減少させる、請求項３４に記載の組換えビリオン。

【請求項36】

前記組換えビリオンが、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、及び／またはウィルソン病を予防または治療する、請求項３４または３５に記載の組換えビリオン。

【請求項37】

前記組換えビリオンが、（ａ）可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、及び／または可溶型のＩＬ－１β受容体；（ｂ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせを含む、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項38】

前記組換えビリオンが、（ａ）前記形質導入細胞中において、可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、または可溶型のＩＬ－１β受容体の発現を増加させる；及び／または（ｂ）前記形質導入細胞中において、ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、またはＩＬ－１β受容体の発現を減少させる、請求項３７に記載の組換えビリオン。

【請求項39】

前記組換えビリオンが、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、乾癬、及び／または強直性脊椎炎を予防または治療する、請求項３７または３８に記載の組換えビリオン。

【請求項40】

前記組換えビリオンが、ＩＲＧＭ、ＮＯＤ２、ＡＴＧ２Ｂ、ＡＴＧ９、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＢＥＣＮ１、ＥＩ２４／ＰＩＧ８、ＴＥＣＰＲ２、ＷＤＲ４５／ＷＩＰ１４、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ダイニン、ＥＰＧ５、ＨｓｐＢ８、ＬＡＭＰ２、ＬＣ３ｂ ＵＶＲＡＧ、ＶＣＰ／ｐ９７、ＺＦＹＶＥ２６、ＰＡＲＫ２／パーキン、ＰＡＲＫ６／ＰＩＮＫ１、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２、ＳＭＵＲＦ、ＡＭＰＫ、及びＵＬＫ１から選択されるタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項41】

前記組換えビリオンが、前記形質導入細胞中での前記タンパク質またはそのフラグメントの発現を増加させる、請求項４０に記載の組換えビリオン。

【請求項42】

オートファジーを調節する、請求項４０または４１に記載の組換えビリオン。

【請求項43】

オートファジー関連疾患を予防または治療する、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項44】

前記オートファジー関連疾患が、がん、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調）、炎症性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ、肺線維症、嚢胞性線維症、シェーグレン病、高血糖障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、ウェルナー症候群、妖精症、及び脂肪萎縮性糖尿病）、脂質異常症、高脂血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下、トリグリセリドの上昇、メタボリックシンドローム、肝疾患、腎疾患、心血管疾患、虚血、脳卒中、再灌流中の合併症、筋肉変性、萎縮、老化の症状（例えば、筋萎縮、虚弱、代謝障害、軽度の炎症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、加齢に伴う認知症及び散発性アルツハイマー病、前癌状態、及びうつ病を含む精神状態）、脊髄損傷、動脈硬化、感染症（例えば、細菌性、真菌性、ウイルス性など）、ＡＩＤＳ、結核、胚子発生異常、不妊症、リソソーム蓄積症、活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、（アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、（乳児、後期乳児／若年、成人／慢性）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｓｃｈｅｉｅ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオＡ型及びＢ型、マロトー・ラミー、Ｓｌｙ病、ムコリピドーシス、マルチプルスルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ６病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、テイ＝サックス病、及びウォルマン病から選択される、請求項４３に記載の組換えビリオン。

【請求項45】

前記組換えビリオンが、以下をコードする核酸を含む、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の組換えビリオン：（ａ）ＣＦＴＲまたはそのフラグメント；（ｂ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【請求項46】

前記組換えビリオンが、（ａ）前記形質導入細胞中でのＣＦＴＲまたはそのフラグメントの発現を増加させる；及び／または（ｂ）前記形質導入細胞中でのＣＦＴＲの内因性変異形態の発現を減少させる、請求項４５に記載の組換えビリオン。

【請求項47】

嚢胞性線維症を予防または治療する、請求項４５または４６に記載の組換えビリオン。

【請求項48】

前記核酸が、ノンコーディングＤＮＡを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項49】

前記ノンコーディングＤＮＡが以下を含む、請求項４８に記載の組換えビリオン：
（ａ）転写調節エレメント（例えば、エンハンサー、転写終結配列、非翻訳領域（５’または３’ＵＴＲ）、近位プロモーターエレメント、遺伝子座制御領域、ポリアデニル化シグナル配列）、及び／または
（ｂ）翻訳調節エレメント（例えば、Ｋｏｚａｋ配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）。

【請求項50】

前記転写調節エレメントが、遺伝子座制御領域であり、任意によりβ－グロビンＬＣＲまたはβ－グロビンＬＣＲのＤＮａｓｅ過敏部位（ＨＳ）である、請求項４９に記載の組換えビリオン。

【請求項51】

前記核酸が、前記標的細胞のゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）の前記核酸配列と少なくとも約８０％同一である核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項52】

ＧＳＨと少なくとも約８０％同一である前記核酸配列が、組み込まれる前記核酸の５’及び３’に配置され、それにより相同組換えによる前記標的ゲノム内の特定の遺伝子座への組み込みが可能になる、請求項５１に記載の組換えビリオン。

【請求項53】

前記ＧＳＨが、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、ＮＵＰＬ２の遺伝子間領域、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １（ＨＩ １遺伝子座のチミジンキナーゼをコードする核酸）、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、またはＲＮＦ３８である、請求項５１または５２に記載の組換えビリオン。

【請求項54】

前記ＧＳＨが、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、またはＮＵＰＬ２の遺伝子間領域である、請求項５３に記載の組換えビリオン。

【請求項55】

前記核酸が、形質導入の際に標的細胞のゲノムに組み込まれる、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項56】

前記核酸が、形質導入の際に標的細胞のゲノムのＧＳＨに組み込まれる、請求項５５に記載の組換えビリオン。

【請求項57】

前記核酸が、少なくとも１つの複製タンパク質及びキャプシドタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項58】

前記ビリオンが、自律的に複製している、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項59】

前記ビリオンが、がん細胞もしくは非がん細胞に結合する及び／または形質導入される、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項60】

前記ビリオンが、幹細胞（例えば、造血幹細胞、ＣＤ３４＋幹細胞、ＣＤ３６＋幹細胞、間葉系幹細胞、がん幹細胞）に結合する及び／または形質導入される、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項61】

前記ビリオンが、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）を発現する細胞に結合する及び／または形質導入される、請求項１、３、４、８～１８、または２１～６０のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項62】

前記組換えビリオンが、造血細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞、赤血球系列細胞、巨核球、赤血球前駆細胞（ＥＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３６＋細胞、間葉系幹細胞、神経細胞、腸細胞、腸幹細胞、腸上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、エンテロサイト、肝臓細胞（例えば、肝細胞、肝星細胞（ＨＳＣ）、クッパー細胞（ＫＣ）、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ））、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）、赤血球前駆細胞、リンパ前駆細胞、Ｂリンパ芽球細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好塩基性風土性バーキットリンパ腫（ＥＢＬ）、多染性赤芽球、表皮幹細胞、Ｐ６３陽性ケラチノサイト由来幹細胞、ケラチノサイト、膵β細胞、Ｋ細胞、Ｌ細胞及び／または正染性赤芽球に結合する及び／または形質導入される、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項63】

前記少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントが、イヌパルボウイルス株Ｎ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１２９３０）または配列番号２７のアミノ酸配列に関して１つ以上の変異を有するＶＰ２配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項64】

前記１つ以上の変異が、アミノ酸残基（ｉ）９１～９５、（ｉｉ）２９７～３０１、及び／または（ｉｉｉ）３２０～３２４を有するＶＰ２の領域にある、請求項６３に記載の組換えビリオン。

【請求項65】

前記１つ以上の変異が、置換、欠失、及び／または挿入を含む、請求項６３または６４に記載の組換えビリオン。

【請求項66】

前記１つ以上の変異が、前記組換えビリオンの内在化に関与する少なくとも１つの細胞受容体に対する前記組換えビリオンの親和性及び／または特異性を改変させ、任意により、前記少なくとも１つの細胞受容体が、トランスフェリン受容体である、請求項６３～６５のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【請求項67】

前記１つ以上の変異が、以下を改変する、請求項６３～６６のいずれか１項に記載の組換えビリオン：
ａ）細胞に対する前記組換えビリオンの向性または親和性；
ｂ）細胞に形質導入する前記組換えビリオンの能力；及び／または
ｃ）前記組換えビリオンが前記細胞を通過してトランスサイトーシスする能力。

【請求項68】

前記少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントが、異種ペプチドタグを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【請求項69】

前記異種ペプチドタグにより、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、またはナノボディを使用したアフィニティー精製が可能になる、請求項６８に記載の組換えビリオン。

【請求項70】

前記異種ペプチドタグが、ヘマグルチニン、Ｈｉｓ（例えば、６Ｘ－Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、Ｅタグ、ＴＫ１５、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｍｙｃ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＫＴ３、及びＩＲＳから選択されるエピトープ／タグを含む、請求項６８または６９に記載の組換えビリオン。

【請求項71】

先行請求項のいずれか１項に記載の組換えビリオン、ならびに担体及び／または希釈剤を含む医薬組成物。

【請求項72】

疾患を予防または治療する方法であって、有効量の請求項１～７１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換えビリオン、または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項73】

疾患を予防または治療する方法であって、
（ａ）複数の細胞を得ることと、
（ｂ）請求項１～７１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物を前記細胞に形質導入し、任意により前記形質導入細胞をさらに選択またはスクリーニングすることと；
（ｃ）有効量の前記形質導入細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含む、前記方法。

【請求項74】

前記細胞が、前記対象にとって自家または同種他家である、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

請求項７２～７４のいずれか１項に記載の方法であって、
（ａ）前記核酸が、タンパク質をコードするか；または
（ｂ）前記核酸が、内因性遺伝子の発現を減少させるか、または消失させる、前記方法。

【請求項76】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、血管内、脳内、非経口、腹腔内、静脈内、硬膜外、脊髄内、胸骨内、関節内、滑膜内、髄腔内、動脈内、心臓内、筋肉内、鼻腔内、肺内、皮膚移植、または経口投与を介して投与される、請求項７２～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

前記疾患が、内皮機能不全、嚢胞性線維症、心血管疾患、腎疾患、がん、ヘモグロビン症、貧血、血友病（例えば、血友病Ａ）、骨髄増殖性障害、凝固障害、鎌状赤血球症、アルファ－サラセミア、ベータ－サラセミア、ファンコニ貧血、家族性肝内胆汁うっ滞、表皮水疱症、ファブリー、ゴーシェ、ニーマンピックＡ、ニーマンピックＢ、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ムコ多糖症（ＭＰＳ）Ｉ（Ｈｕｒｌｅｒ、Ｓｃｈｅｉｅ、Ｈｕｒｌｅｒ／Ｓｃｈｅｉｅ）、ＭＰＳ ＩＩ（Ｈｕｎｔｅｒ）、ＭＰＳ ＶＩ（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ－Ｌａｍｙ）、血液癌、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、肝硬変、肝細胞癌、膵炎、糖尿病、心筋症、関節炎、性腺機能低下症、心臓疾患、心臓発作、甲状腺機能低下症、耐糖能異常、関節症、肝線維症、ウィルソン病、潰瘍性大腸炎、クローン病、テイ＝サックス病、神経変性疾患、脊髄性筋萎縮症１型、ハンチントン病、カナバン病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、乾癬、及び強直性脊椎炎、ならびに自己免疫疾患、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調）、炎症性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ、肺線維症、シェーグレン病、高血糖障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、ウェルナー症候群、妖精症、及び脂肪萎縮性糖尿病）、脂質異常症、高脂血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下、トリグリセリドの上昇、メタボリックシンドローム、肝疾患、腎疾患、心血管疾患、虚血、脳卒中、再灌流中の合併症、筋肉変性、萎縮、老化の症状（例えば、筋萎縮、虚弱、代謝障害、軽度の炎症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、加齢に伴う認知症及び散発性アルツハイマー病、前癌状態、及びうつ病を含む精神状態）、脊髄損傷、動脈硬化、感染症（例えば、細菌性、真菌性、ウイルス性など）、ＡＩＤＳ、結核、胚子発生異常、不妊症、リソソーム蓄積症、活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、（乳児、後期乳児／若年、成人／慢性）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｓｃｈｅｉｅ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオＡ型及びＢ型、マロトー・ラミー、Ｓｌｙ病、ムコリピドーシス、マルチプルスルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ６病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、及びウォルマン病から選択される、請求項７２～７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、プロトパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントまたはその遺伝子型バリアントを含む、請求項７２～７７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項79】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、以下をコードする核酸を含む、請求項７８に記載の方法：（ａ）ヘプシジンまたはそのフラグメント、及び／または恒常性鉄調節因子（ＨＦＥ）またはそのフラグメント；（ｂ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【請求項80】

前記対象には、以下をコードする核酸を含む前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が投与される、請求項７８または７９に記載の方法：
ａ）ヘプシジンまたはそのフラグメントであって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に静脈内投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝細胞に形質導入される、前記ヘプシジンまたはそのフラグメント；
ｂ）ＨＦＥまたはそのフラグメントであって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に静脈内投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝細胞に形質導入される、前記ＨＦＥまたはそのフラグメント；
ｃ）ＨＦＥまたはそのフラグメントであって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に経口投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される、前記ＨＦＥまたはそのフラグメント；
ｄ）ＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）であって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に静脈内投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝細胞に形質導入される、前記少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ；
ｅ）ＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）であって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に経口投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される、前記少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ；
ｆ）ＤＭＴ－１を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）であって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に経口投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される、前記少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ；
ｇ）フェロポーチンを標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）であって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に経口投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される、前記少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ；または
ｈ）ａ）～ｇ）のいずれか２つ以上の組み合わせ。

【請求項81】

前記組み合わせが、ｂ）～ｅ）のいずれか１つのうちの２つ以上を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記組換えビリオンまたは医薬組成物が、ａ）前記形質導入細胞中におけるＨＦＥまたはそのフラグメント、及び／またはヘプシジンまたはそのフラグメントの発現を増加させる；及び／またはｂ）前記形質導入細胞中におけるＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態の発現を減少させる、請求項７８～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項83】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、及び／またはウィルソン病を予防または治療する、請求項７８～８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、以下をコードする核酸を含む、請求項７８に記載の方法：（ａ）可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、及び／または可溶型のＩＬ－１β受容体；（ｂ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【請求項85】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、（ａ）前記形質導入細胞中において、可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、または可溶型のＩＬ－１β受容体の発現を増加させる；及び／または（ｂ）前記形質導入細胞中において、ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、またはＩＬ－１β受容体の発現を減少させる、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、乾癬、及び／または強直性脊椎炎を予防または治療する、請求項７８、８４、及び８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物または形質導入細胞が、ＩＲＧＭ、ＮＯＤ２、ＡＴＧ２Ｂ、ＡＴＧ９、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＢＥＣＮ１、ＥＩ２４／ＰＩＧ８、ＴＥＣＰＲ２、ＷＤＲ４５／ＷＩＰ１４、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ダイニン、ＥＰＧ５、ＨｓｐＢ８、ＬＡＭＰ２、ＬＣ３ｂ ＵＶＲＡＧ、ＶＣＰ／ｐ９７、ＺＦＹＶＥ２６、ＰＡＲＫ２／パーキン、ＰＡＲＫ６／ＰＩＮＫ１、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２、ＳＭＵＲＦ、ＡＭＰＫ、及びＵＬＫ１から選択されるタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項88】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、前記形質導入細胞中で前記タンパク質またはそのフラグメントの発現を増加させる、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、オートファジーを調節する、請求項７８、８７、及び８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、オートファジー関連疾患を予防または治療する、請求項７８及び８７～８９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項91】

前記オートファジー関連疾患が、がん、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調）、炎症性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ、肺線維症、嚢胞性線維症、シェーグレン病、高血糖障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、ウェルナー症候群、妖精症、及び脂肪萎縮性糖尿病）、脂質異常症、高脂血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下、トリグリセリドの上昇、メタボリックシンドローム、肝疾患、腎疾患、心血管疾患、虚血、脳卒中、再灌流中の合併症、筋肉変性、萎縮、老化の症状（例えば、筋萎縮、虚弱、代謝障害、軽度の炎症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、加齢に伴う認知症及び散発性アルツハイマー病、前癌状態、及びうつ病を含む精神状態）、脊髄損傷、動脈硬化、感染症（例えば、細菌性、真菌性、ウイルス性など）、ＡＩＤＳ、結核、胚子発生異常、不妊症、リソソーム蓄積症、活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、（アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、（乳児、後期乳児／若年、成人／慢性）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｓｃｈｅｉｅ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオＡ型及びＢ型、マロトー・ラミー、Ｓｌｙ病、ムコリピドーシス、マルチプルスルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ６病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、テイ＝サックス病、及びウォルマン病から選択される、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記プロトパルボウイルスが、クタウイルスである、請求項７８に記載の方法。

【請求項93】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／またはリンパ前駆細胞を標的とする、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、がんを予防するまたは治療する、請求項７８、９２、及び９３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項95】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣ１、Ｃｏｌ７Ａ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＡ６、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、及び／またはＫＩＮＤ１をコードする核酸を含む、請求項７８または９２に記載の方法。

【請求項96】

前記形質導入細胞が、表皮幹細胞、Ｐ６３陽性ケラチノサイト由来幹細胞、またはケラチノサイトである、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記形質導入細胞を前記対象の皮膚に移植することをさらに含む、請求項９５または９６に記載の方法。

【請求項98】

前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、表皮水疱症を予防するまたは治療する、請求項９５～９７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項99】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、テトラパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントまたはその遺伝子型バリアントを含む、請求項７２～７７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項100】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、ヘモグロビン遺伝子（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、及び／またはＨＢＺ）、アルファヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、フォン・ヴィレブランド因子、ジストロフィンまたは短縮型ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィンまたは短縮型ユートロフィン、マイクロユートロフィン、ウシェリン（ＵＳＨ２Ａ）、ＣＥＰ２９０、ＡＴＰＢ１、ＡＴＰＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＣＰＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣ１、Ｃｏｌ７Ａ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＡ６、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、ＫＩＮＤ１、ＩＮＳ、Ｆ８またはそれらのフラグメント（例えば、Ｂドメイン欠失ポリペプチド（例えば、ＶＩＩＩ ＳＱ、ｐ－ＶＩＩＩ）をコードするフラグメント）、及び嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）から選択されるタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、以下に形質導入される、請求項９９または１００に記載の方法：（ａ）ＣＤ３４＋幹細胞、任意によりｅｘ ｖｉｖｏで形質導入される；（ｂ）間葉系幹細胞、任意によりｅｘ ｖｉｖｏで形質導入される；（ｃ）肝臓細胞（例えば、肝細胞）、（ｄ）小腸細胞、及び／または（ｅ）肺細胞。

【請求項102】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝動脈、門脈、または静脈内投与を介して肝臓に送達される、請求項９９～１０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項103】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、経口投与によって小腸に送達される、請求項９９～１０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項104】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、（ａ）ＣＦＴＲまたはそのフラグメント；（ｂ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせをコードする核酸を含む、請求項９９～１０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項105】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、鼻腔内または肺内投与を介して肺に送達される、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、（ａ）前記形質導入細胞中でＣＦＴＲまたはそのフラグメントの発現を増加させる；及び／または（ｂ）前記形質導入細胞中でＣＦＴＲの内因性変異形態の発現を減少させる、請求項９９～１０１、１０４及び１０５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項107】

前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、嚢胞性線維症を予防または治療する、請求項９９～１０１、及び１０４～１０６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項108】

少なくとも１つの追加量の前記ビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞を再投与することをさらに含む、請求項７２～１０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項109】

前記少なくとも１つの追加量の前記再投与が、前記有効量の前記ビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞の前記投与後の治療の減弱後に行われる、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記少なくとも１つの追加量が、前記有効量と同じである、請求項１０８または１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記有効量と比較して、前記少なくとも１つの追加量を増加または減少させることをさらに含む、請求項１０８または１０９に記載の方法。

【請求項112】

前記少なくとも１つの追加の量を、内因性遺伝子及び／または前記組換えビリオンの前記核酸の発現に基づいて増加または減少させる、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記核酸の前記発現を調節する剤を前記対象に投与すること、または前記細胞を前記剤に接触させることをさらに含む、請求項７２～１１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項114】

前記剤が、低分子、代謝産物、オリゴヌクレオチド、リボスイッチ、ペプチド、ペプチド模倣体、ホルモン、ホルモン類似体、及び光から選択される、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

前記剤が、テトラサイクリン、キュメート（ｃｕｍａｔｅ）、タモキシフェン、エストロゲン、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ラパマイシン、ＦＫＣｓＡ、青色光、アブシジン酸（ＡＢＡ）、及びリボスイッチから選択される、請求項１１３または１１４に記載の方法。

【請求項116】

間隔をおいて、前記剤を１回以上再投与することをさらに含む、請求項７２～１１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項117】

前記剤の前記再投与が、前記核酸の周期的発現をもたらす、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記間隔間の時間及び／または前記剤の量を、前記核酸から発現した前記タンパク質の血清濃度及び／または半減期に基づいて増加または減少させる、請求項１１６または１１７に記載の方法。

【請求項119】

細胞内の（ｉ）遺伝子発現、または（ｉｉ）タンパク質の機能及び／または構造を調節する方法であって、前記方法が、前記細胞内の前記遺伝子発現または前記タンパク質の前記機能及び／または構造を調節する核酸を含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載のビリオンまたは医薬組成物を前記細胞に形質導入することを含む、前記方法。

【請求項120】

前記核酸が、ＣＲＩＳＰＲｉまたはＣＲＩＳＰＲａ剤をコードする配列を含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

前記遺伝子発現、または前記タンパク質の前記機能及び／または構造が増加するかまたは回復される、請求項１１９または１２０に記載の方法。

【請求項122】

前記遺伝子発現、または前記タンパク質の前記機能及び／または構造が減少するかまたは消失する、請求項１１９または１２０に記載の方法。

【請求項123】

異種核酸を細胞内のＧＳＨに組み込む方法であって、
（ａ）前記標的ＧＳＨ核酸と少なくとも約８０％同一であるドナー核酸配列が５’末端及び３’末端で隣接する異種核酸を含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の１つ以上のビリオンまたは医薬組成物を前記細胞に形質導入すること、または
（ｂ）請求項１～７１のいずれか１項に記載の１つ以上のビリオンまたは医薬組成物を前記細胞に形質導入することであって、前記ビリオンまたは医薬組成物が、（ｉ）前記標的ＧＳＨ核酸と少なくとも約８０％同一であるドナー核酸配列が５’末端及び３’末端で隣接する異種核酸と、（ｉｉ）ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアント、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ）及び／またはガイドＲＮＡをコードする核酸と、を含み、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ複合体が、前記ＧＳＨにおいてＤＮＡを切断し、これは、前記ドナー核酸を使用して修復され、それによって異種核酸がＧＳＨにおいて組み込まれる、前記方法。

【請求項124】

（ｉ）前記標的ＧＳＨ核酸と少なくとも約８０％同一であるドナー核酸が隣接する前記異種核酸が、１つのビリオン内に形質導入され、かつ（ｉｉ）前記核酸がヌクレアーゼをコードする、及び／または前記ｇＲＮＡが別のビリオンに形質導入される、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記ＧＳＨが、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、ＮＵＰＬ２の遺伝子間領域、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １（ＨＩ １遺伝子座のチミジンキナーゼをコードする核酸）、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、またはＲＮＦ３８である、請求項１２３または１２４に記載の方法。

【請求項126】

前記ＧＳＨが、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、またはＮＵＰＬ２の遺伝子間領域である、請求項１２３～１２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項127】

請求項１～７０のいずれか１項に記載の組換えビリオンを産生する方法であって、
（１）以下を含む少なくとも１つのベクターを提供することと；
（ｉ）少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列であって、任意により標的細胞における発現のためにプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含む、前記ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）前記プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはそのバリアントをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列であって、昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、前記ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：
（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、
（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの前記少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、前記複製タンパク質、または
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、
（２）前記少なくとも１つのベクターを昆虫細胞に導入することと；
（３）請求項１～７０のいずれか１項に記載の組換えビリオンが産生されるような条件下で、前記昆虫細胞を維持することと、を含む、前記方法。

【請求項128】

２つのベクターが提供される、請求項１２７に記載の方法であって、
（ａ）第１のベクターは、少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列、任意により標的細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含むヌクレオチド配列を含み、
（ｂ）第２のベクターは、
（ｉ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、前記プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはそのバリアントをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び
（ｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：
（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、
（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの前記少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、前記複製タンパク質、または
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、を含む、前記方法。

【請求項129】

３つのベクターが提供される、請求項１２７に記載の方法であって、
（ａ）第１のベクターは、少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列、任意により標的細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含むヌクレオチド配列を含み、
（ｂ）第２のベクターは、昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、前記プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはそのバリアントをコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含み、及び
（ｃ）第３のベクターは、以下を含むヌクレオチド配列：
（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、
（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの前記少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、前記複製タンパク質、または
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、を含む、前記方法。

【請求項130】

昆虫細胞において請求項１～７０のいずれか１項に記載の組換えビリオンを産生する方法であって、前記方法が、
（１）昆虫細胞を提供することであって、前記昆虫細胞は、
（ｉ）少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列、任意により標的細胞における発現のためにプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含む、ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、前記プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはそのバリアントをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：
（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、
（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの前記少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、前記複製タンパク質、または
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、を含み、
ここで、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（Ａ）、（ｉｉｉ）（Ｂ）、及び（ｉｉｉ）（Ｃ）のうちの少なくとも１つは、前記昆虫細胞ゲノムに安定に組み込まれており、少なくとも１つのベクターが、存在する場合、前記昆虫細胞のゲノムに安定に組み込まれていない（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（Ａ）、（ｉｉｉ）（Ｂ）、及び（ｉｉｉ）（Ｃ）のヌクレオチド配列の残りの部分を含む、前記提供することと、
（２）前記組換えビリオンが産生されるような条件下で、前記昆虫細胞を維持することと、を含む、前記方法。

【請求項131】

前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、肉食動物プロトパルボウイルス、肉食動物プロトパルボウイルス１、翼手目プロトパルボウイルス１、真無盲腸目プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス２、霊長類プロトパルボウイルス３、霊長類プロトパルボウイルス４、げっ歯類プロトパルボウイルス１、げっ歯類プロトパルボウイルス２、げっ歯類プロトパルボウイルス３、有蹄動物プロトパルボウイルス１、及び有蹄動物プロトパルボウイルス２から選択される種のものである、請求項１２７～１３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項132】

前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、請求項１２７～１３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項133】

前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、翼手目テトラパルボウイルス１、霊長類テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス２、有蹄動物テトラパルボウイルス３、及び有蹄動物テトラパルボウイルス４から選択される種のものである、請求項１２７～１３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項134】

前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、請求項１２７～１３０、及び１３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項135】

前記テトラパルボウイルスが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、またはそれらの遺伝子型バリアントである、請求項１２７～１３０、１３３、及び１３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項136】

プロトパルボウイルスの前記少なくとも１つの複製タンパク質が、イヌパルボウイルス、ブファウイルス、クタウイルス、またはそれらの遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である、請求項１２７～１３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項137】

テトラウイルスの前記少なくとも１つの複製タンパク質が、ヒトパルボウイルス４またはその遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である、請求項１２７～１３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項138】

前記昆虫細胞が、鱗翅目の種に由来する、請求項１２７～１３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項139】

前記鱗翅目の種が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉである、請求項１３８に記載の方法。

【請求項140】

前記昆虫細胞が、Ｓｆ９である、請求項１２７～１３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項141】

前記少なくとも１つのベクターが、バキュロウイルスベクター、ウイルスベクター、またはプラスミドである、請求項１２７～１４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項142】

前記少なくとも１つのベクターが、バキュロウイルスベクターである、請求項１２７～１４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項143】

ＶＰ１が、配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２から選択される配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２７～１４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項144】

ＶＰ２が、配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、及び２３から選択される配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２７～１４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項145】

前記少なくとも１つのＩＴＲが、
（ａ）ディペンドパルボウイルスＩＴＲ、
（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲ、任意によりＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｃ）プロトパルボウイルスＩＴＲ、及び／または
（ｄ）テトラパルボウイルスＩＴＲ、を含む、請求項１２７～１４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項146】

昆虫細胞における発現のための前記少なくとも１つの発現制御配列が、
（ａ）プロモーター、及び／または
（ｂ）Ｋｏｚａｋ様発現制御配列を含む、請求項１２７～１４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項147】

前記プロモーターが、
（ａ）動物ＤＮＡウイルスの最初期プロモーター、
（ｂ）昆虫ウイルスの最初期プロモーター、または
（ｃ）昆虫細胞プロモーターを含む、請求項１４６に記載の方法。

【請求項148】

前記動物ＤＮＡウイルスが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、プロトパルボウイルス、テトラパルボウイルス、またはＡＡＶである、請求項１４７に記載の方法。

【請求項149】

前記昆虫ウイルスが、鱗翅目ウイルスまたはバキュロウイルスであり、任意により前記バキュロウイルスが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチキャプシド核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）である、請求項１４７に記載の方法。

【請求項150】

前記プロモーターが、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーターまたは最初期１遺伝子（ＩＥ－１）プロモーターである、請求項１４６～１４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項151】

ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質を含む前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ５２及び／またはＲｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１２７～１５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項152】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２である、請求項１２７～１５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項153】

少なくとも１つのベクターを含む昆虫細胞であって、
（ｉ）少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（ｉｉ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、前記プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはそのバリアントをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：
（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、
（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの前記少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、前記複製タンパク質、または
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、を含む、前記昆虫細胞。

【請求項154】

（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（Ａ）、（ｉｉｉ）（Ｂ）、及び（ｉｉｉ）（Ｃ）のうちの少なくとも１つが、前記昆虫細胞ゲノムに安定して組み込まれる、請求項１５３に記載の昆虫細胞。

【請求項155】

前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、肉食動物プロトパルボウイルス、肉食動物プロトパルボウイルス１、翼手目プロトパルボウイルス１、真無盲腸目プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス２、霊長類プロトパルボウイルス３、霊長類プロトパルボウイルス４、げっ歯類プロトパルボウイルス１、げっ歯類プロトパルボウイルス２、げっ歯類プロトパルボウイルス３、有蹄動物プロトパルボウイルス１、及び有蹄動物プロトパルボウイルス２から選択される種のものである、請求項１５３または１５４に記載の昆虫細胞。

【請求項156】

前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、請求項１５３～１５５のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項157】

前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、翼手目テトラパルボウイルス１、霊長類テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス２、有蹄動物テトラパルボウイルス３、及び有蹄動物テトラパルボウイルス４から選択される種のものである、請求項１５３または１５４に記載の昆虫細胞。

【請求項158】

前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、請求項１５３、１５４、及び１５７のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項159】

前記テトラパルボウイルスが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、またはそれらの遺伝子型バリアントである、請求項１５３、１５４、１５７、及び１５８のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項160】

プロトパルボウイルスの前記少なくとも１つの複製タンパク質が、イヌパルボウイルス、ブファウイルス、クタウイルス、またはそれらの遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である、請求項１５３～１５９のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項161】

テトラウイルスの前記少なくとも１つの複製タンパク質が、ヒトパルボウイルス４またはその遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である、請求項１５３～１５９のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項162】

前記昆虫細胞が、鱗翅目の種に由来する、請求項１５３～１６１のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項163】

前記鱗翅目の種が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉである、請求項１６２に記載の昆虫細胞。

【請求項164】

前記昆虫細胞が、Ｓｆ９である、請求項１５３～１６３のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項165】

前記少なくとも１つのベクターが、バキュロウイルスベクター、ウイルスベクター、またはプラスミドである、請求項１５３～１６４のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項166】

前記少なくとも１つのベクターが、バキュロウイルスベクターである、請求項１５３～１６５のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項167】

ＶＰ１が、配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２から選択される配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５３～１６６のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項168】

ＶＰ２が、配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、及び２３から選択される配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５３～１６７のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項169】

前記少なくとも１つのＩＴＲが、
（ａ）ディペンドパルボウイルスＩＴＲ、
（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲ、任意によりＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｃ）プロトパルボウイルスＩＴＲ、及び／または
（ｄ）テトラパルボウイルスＩＴＲ、を含む、請求項１５３～１６８のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項170】

昆虫細胞における発現のための前記少なくとも１つの発現制御配列が、
（ａ）プロモーター、及び／または
（ｂ）Ｋｏｚａｋ様発現制御配列を含む、請求項１５３～１６９のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項171】

前記プロモーターが、
（ａ）動物ＤＮＡウイルスの最初期プロモーター、
（ｂ）昆虫ウイルスの最初期プロモーター、または
（ｃ）昆虫細胞プロモーターを含む、請求項１７０に記載の昆虫細胞。

【請求項172】

前記動物ＤＮＡウイルスが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、プロトパルボウイルス、テトラパルボウイルス、またはＡＡＶである、請求項１７１に記載の昆虫細胞。

【請求項173】

前記昆虫ウイルスが、鱗翅目ウイルスまたはバキュロウイルスであり、任意により前記バキュロウイルスが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチキャプシド核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）である、請求項１７１に記載の昆虫細胞。

【請求項174】

前記プロモーターが、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーターまたは最初期１遺伝子（ＩＥ－１）プロモーターである、請求項１７０～１７３のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項175】

ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質を含む前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ５２及び／またはＲｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１５３～１７４のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【請求項176】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２である、請求項１５３～１７５のいずれか１項に記載の昆虫細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１２９，８４８号の優先権の利益を主張するものであり、参照により、その内容全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

治療用導入遺伝子の効率的な送達は、遺伝子療法を成功させるための前提条件である。遺伝子療法が１９７０年代初頭に概念化されたとき、哺乳動物ウイルスは、遺伝子「薬物」を送達するための有効なビヒクルとして提唱された。それ以来、ウイルスベクターは、集中的に調査され、遺伝子導入用途で広く使用されている。近年、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、幅広い種類の細胞に形質導入する、血液脳関門を通過する、及びエピソームエレメントとして主に長期的に安定した発現を維持する能力を有することから、遺伝子療法にとって好ましいウイルスベクターとして台頭している。パルボウイルスファミリーの非病原性ディペンドパルボウイルス属に由来するＡＡＶベクターは、ウイルス遺伝子を保持せず、ヒト用途のために開発され、ベクターに関連する重篤な有害事象に関する報告は比較的少ない。

【0003】

しかし、ＡＡＶの特定の特性が、遺伝子療法への適用への制限となる。特に、ＡＡＶがパッケージングできるのは、５ｋｂ未満の治療用ＤＮＡのみであり、開発から多くの治療用遺伝子及びアプローチが排除されている。例えば、最も高い発生率を有する重篤な遺伝性疾患、すなわちデュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病Ａ、及び嚢胞性線維症を治療するための治療用遺伝子は、ＡＡＶのサイズ制限を超えるため、これらの疾患の治療選択肢としては、ＡＡＶ媒介遺伝子療法は除外される。さらに、多くのＡＡＶ血清型は風土病であると考えられ、その結果、ヒト集団において広範な抗ウイルス免疫が生じ、多くの対象においてＡＡＶの遺伝子導入が複雑になる。ＡＡＶへのセロコンバージョンの有病率は、成人で７０％以上と推定されている。セロコンバージョンは、典型的には、野生型ＡＡＶ及びヘルパーウイルス（多くの場合アデノウイルス）による生産的（共）感染により小児期に発生し、ほとんどの霊長類ＡＡＶキャプシドに共通のエピトープと交差反応する抗体を生成する。現在、将来の遺伝子療法患者は、中和抗体（ｎＡｂ）についてスクリーニングされ、ｎＡｂが任意に選択された閾値力価を超える場合、ＡＡＶ遺伝子療法に不適格となり得る。したがって、患者集団の大部分は、ＡＡＶによる遺伝子療法から除外される。さらに、ＡＡＶの自然な多様性が広大であるが、宿主の向性は、ＡＡＶ種によって異なり、遺伝子療法のためのいくつかの重要な細胞型及び組織は、標的化できない制限が依然として残ったままである。

【0004】

したがって、制限を克服しながらＡＡＶベクターの有用性を組み込む遺伝子療法のためのウイルス組成物及び方法が大いに必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、少なくとも部分的に、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントを含む組換えビリオンが、遺伝子療法のビヒクルとして特に有利であるという発見に基づく。

【0006】

第一に、ビリオンのゲノムサイズが大きいため、プロトパルボウイルス（約４．７ｋｂのＡＡＶと比較して約５．３ｋｂ（例えば、イヌパルボウイルス））またはテトラパルボウイルス（約５．３ｋｂ）は、ＡＡＶよりも少なくとも０．６ｋｂ大きい核酸をパッケージングでき、それにより、ＡＡＶの容量を超えるサイズの治療用遺伝子（複数可）の送達が可能になる。ビリオンゲノムのサイズがより大きいことにより、所望のゲノム位置での導入遺伝子（複数可）の部位特異的組換えに対応するゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）配列と共に治療用導入遺伝子（複数可）を送達することも可能になる。このような部位特異的組換えにより、必須遺伝子及びその発現を破壊し得るランダムな組み込みとは対照的に、ゲノムの不活性な位置に導入遺伝子を組み込むことができる。第二に、ＡＡＶとは異なり、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスは、ＡＡＶほど広まっていない。したがって、例えば治療用遺伝子を含む、プロトパルボウイルスまたはテトラパボウイルスのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオンを投与することにより、効率的な遺伝子送達を妨げる広範な抗ウイルス免疫反応を引き起こすことはない。したがって、プロトパルボウイルスまたはテトラパボウイルスのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオンは、ＡＡＶの比ではない効率で遺伝子送達を達成することができる。第三に、プロトパルボウイルス及びテトラパボウイルスは、特定の組織に対して並でない向性を有する。例えば、プロトパルボウイルスは、造血幹細胞に対する向性を有し、異常ヘモグロビン症、貧血、骨髄増殖性障害、凝固障害、及びがんなどの血液疾患の治療または予防に特に有用である。さらに、プロトパルボウイルスは、トランスフェリン受容体との相互作用を介して、効率的な細胞のトランスサイトーシスが可能になる。したがって、プロトパルボウイルスは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、内皮バリアの後ろに隠れている神経細胞に治療用遺伝子を送達できる。したがって、プロトパルボウイルスのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオンは、例えば神経変性疾患または神経筋疾患に罹患している患者のための遺伝子療法の新規手段を提供する。同様に、テトラパルボウイルスは、幹細胞（ＣＤ３４＋幹細胞；間葉系幹細胞）、骨髄、肺、小腸、及び肝臓などの細胞／臓器に対する向性を有する。したがって、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質（複数可）のいずれかを含む組換えビリオンは、広範囲のヒト疾患の治療または予防のために特定の細胞／組織／臓器を標的とすることができる遺伝子療法の新しいモダリティとなる。

【0007】

特定の態様では、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質（またはそのバリアント）を含む組換えビリオン、またはこの組換えビリオンを含む医薬組成物が、本明細書に提供される。標的ゲノム内の特定の部位への異種核酸の組み込みを容易にすることができる相同性アーム（例えば、標的細胞のゲノムＤＮＡと相同性を有する配列）を有する組換えビリオン、及び標的ゲノム内でこの核酸を組み込む方法もまた、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、組み込みは、相同組換えまたは非相同末端結合などの細胞プロセスによって媒介される。いくつかの実施形態では、外因的に導入されたヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ）によって組み込みが開始され、促進される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキャプシドタンパク質のバリアントは、組換えビリオンの内在化に関与する少なくとも１つの細胞受容体に対する組換えビリオンの親和性及び／または特異性を変化させ、及び／またはアフィニティー精製が可能になる。

【0008】

特定の態様では、本明細書に記載の組換えビリオンを使用して、対象における疾患を予防または治療する方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組換えビリオンを対象に投与し、それによってｉｎ ｖｉｖｏで疾患を予防または治療する。いくつかの実施形態では、方法は、対象から複数の細胞を得ることと、本明細書に記載の組換えビリオンを形質導入することと、有効量の形質導入された細胞を対象に投与することと、を含む。異なる細胞型に対してプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質（複数可）の親和性及び特異性が高いことにより、これらの組換えビリオンは、幅広いヒト疾患のための遺伝子療法に特に有用である。いくつかの実施形態では、方法は、追加量のビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞を再投与することをさらに含む（例えば、弱毒化後の反復投与または較正のため）。

【0009】

いくつかの実施形態では、組換えビリオン及び／または医薬組成物の核酸は、タンパク質、例えば治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、（例えば、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲを介して）内因性遺伝子の発現を減少させるかまたは消失させる。

【0010】

特定の態様では、本明細書において提供されるのは、核酸の発現を調節する剤を対象に投与すること、または細胞を上記剤に接触させることをさらに含む、疾患を治療する方法である。いくつかの実施形態では、剤は、低分子、代謝産物、オリゴヌクレオチド、リボスイッチ、ペプチド、ペプチド模倣体、ホルモン、ホルモン類似体、及び光から選択される。いくつかの実施形態では、剤は、テトラサイクリン、キュメート（ｃｕｍａｔｅ）、タモキシフェン、エストロゲン、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、間隔をおいて、剤を１回以上再投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、剤の再投与により、核酸の周期的発現（ｐｕｌｓａｔｉｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）がもたらされる。いくつかの実施形態では、間隔間の時間及び／または剤の量は、核酸から発現したタンパク質の血清濃度及び／または半減期に基づいて増加または減少させる。

【0011】

特定の態様では、本開示は、対象の疾患の治療または予防のための組換えビリオン及び／または医薬組成物の使用を提供する。特定の態様では、本開示は、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）を治療するための医薬品を調製するために、本明細書に記載の組換えビリオン及び／または医薬組成物の使用を提供する。

【0012】

特定の態様では、細胞または対象における遺伝子発現を調節する方法であって、本明細書に記載の組換えビリオン及び／または医薬組成物を形質導入することを含む、方法が本明細書に提供される。そのような調節は、健康な対象における発現よりも異常に低い内因性遺伝子の発現を増加または回復させることを含み得る。あるいは、調節は、その発現が健康な対象における発現よりも異常に高い内因性遺伝子の発現を減少させるかまたは消失させることを含み得る。

【0013】

特定の態様において、本明細書において提供されるのは、標的細胞中のタンパク質の機能及び／または構造を調節する方法であって、その機能及び／または構造が、（例えば、変異または異常な遺伝子発現により）野生型タンパク質とは異なる方法である。特定の実施形態では、この調節は、疾患に罹患している対象の細胞における欠損タンパク質の機能及び／または構造を改善及び／または回復させ得る。

【0014】

特定の態様では、本明細書に記載の組換えビリオンを産生するための方法及び組成物が本明細書にさらに提供される。いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質ならびにビリオンゲノムを発現する一連の遺伝子を導入することによって、哺乳動物細胞において産生される。好ましい実施形態では、組換えビリオンは、昆虫細胞を感染させることによって産生される。特定の実施形態では、ビリオンを産生するために必要な配列を含む核酸（例えば、少なくとも１つのＩＴＲ配列またはビリオンＤＮＡ複製起点を含む核酸、少なくとも１つのウイルス複製タンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのキャプシドタンパク質をコードする核酸）は、哺乳動物細胞または昆虫細胞に一過性に導入される。いくつかの実施形態では、この核酸は、哺乳動物または昆虫細胞ゲノム内に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】ＡＡＶ ＩＴＲの二次構造及びローリングヘアピン複製モデルの概略図を示す。広範な二次構造を形成するＡＡＶ ＩＴＲの構造を示す。ＩＴＲは、２つの構成（フリップ及びフロップ）を得ることができる。

【図1B】ＡＡＶ ＩＴＲの二次構造及びローリングヘアピン複製モデルの概略図を示す。ウイルス核酸が複製するローリングヘアピン複製モデルを示す。

【図1C】ＡＡＶ ＩＴＲの二次構造及びローリングヘアピン複製モデルの概略図を示す。ＡＡＶの異なる血清型に属するＩＴＲの例示的な配列のアラインメントを示す。

【図2】１つ以上のＨＳ配列が５’末端において隣接するβ－グロビンプロモーターに作動可能に連結されたβ－グロビン遺伝子を含む異種核酸／導入遺伝子構築物を表す概略図を示す。哺乳動物のβ－グロビン遺伝子は、一連の５つのＤＮａｓｅ Ｉ過敏部位（ＨＳ１～ＨＳ５）を含む遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と呼ばれる調節領域によって調節されている。ＨＳは、β－グロビン遺伝子の効率的な発現に必要である。各導入遺伝子構築物は、２つの相同性アーム（５’相同性アームと３’相同性アーム）の間に配置され、相同組換えによる標的細胞ゲノムへの部位特異的組み込みが促進される。

【図3】種々のプロモーターを含む異種核酸／導入遺伝子構築物を表す概略図を示す。各プロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーター、ＡＨＳＰプロモーター、ＭＮＤプロモーター、Ｗ－Ａプロモーター、ＰＫＬＲプロモーター）は、目的の導入遺伝子に作動可能に連結されており、構築物全体が、２つの相同性アーム（５’相同性アームと３’相同性アーム）の間に配置され、相同組換えによる標的細胞ゲノムへの部位特異的組み込みが促進される。

【図4】ＰＫＬＲの赤血球特異的プロモーターの部分的ＤＮＡ配列を示す。上流の調節ドメインを構成する４６９ｂｐの領域。ヒト及びラットのＰＫ－Ｒプロモーター間で保存されているエレメントは点線で示す。ＰＫ－Ｒ転写開始部位のシトシンは、下線で示す。ＧＡＴＡ－１、ＣＡＣ／Ｓｐ１モチーフ、及び上流での２７０ｂｐ領域の調節エレメントＰＫＲ－ＲＥ１は、四角で囲っている（向きは、矢印により示す）。

【図5A-1】本明細書に記載の組換えビリオンによって標的化され得る例示的なｍｉＲＮＡを示す。エリスロパルボウイルス組換えビリオンは、ｍｉＲＮＡ配列を含み得る。あるいは、組換えビリオンは、ｍｉＲＮＡを不活性化する核酸配列を含み得る。

【図5A-2】本明細書に記載の組換えビリオンによって標的化され得る例示的なｍｉＲＮＡを示す。エリスロパルボウイルス組換えビリオンは、ｍｉＲＮＡ配列を含み得る。あるいは、組換えビリオンは、ｍｉＲＮＡを不活性化する核酸配列を含み得る。

【図5B-1】本明細書に記載の組換えビリオンによって標的化され得る例示的なｍｉＲＮＡを示す。エリスロパルボウイルス組換えビリオンは、ｍｉＲＮＡ配列を含み得る。あるいは、組換えビリオンは、ｍｉＲＮＡを不活性化する核酸配列を含み得る。

【図5B-2】本明細書に記載の組換えビリオンによって標的化され得る例示的なｍｉＲＮＡを示す。エリスロパルボウイルス組換えビリオンは、ｍｉＲＮＡ配列を含み得る。あるいは、組換えビリオンは、ｍｉＲＮＡを不活性化する核酸配列を含み得る。

【図6】周期的導入遺伝子発現系を示す。概略図は、発現の負の調節及び正の調節の両方を示す。実施例Ｉ（上のパネル）は、ＡＳＯ（アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳＯまたはＡＯＮ）が転写後に遺伝子発現を負に調節できることを示す。ＡＳＯがない場合には、一次転写産物（左）は、翻訳可能なｍＲＮＡにスプライシングされる（上の行）。イントロンの３’末端／エクソン２の５’末端のスプライスアクセプターに相補的なＡＳＯ（赤線）を付加して、スプライシングを妨ぐ。したがって、ＡＳＯの存在下では、イントロンは、転写産物内に残る。このプロセシングを受けていないＲＮＡは、翻訳できないか、または翻訳時に非機能的タンパク質を産生する。実施例ＩＩ（下のパネル）は、ＡＳＯが転写後に遺伝子発現に正の影響を与えることができることを示している。一次転写産物（左）には治療用タンパク質をコードする４つのエクソン：エクソン１、エクソン３、及びエクソン４が含まれ、エクソン２は、ナンセンス変異（複数可）またはフレーム外変異（ＯＯＦ）のいずれかを含む。このようなエクソン２は、任意の導入遺伝子に操作させ得る。ＡＳＯがない場合には、転写産物は、プロセシングを受けて、４つのエクソンを含む成熟ｍＲＮＡになる（下の行）。すなわち、エクソン２は、ナンセンス変異（複数可）またはＯＯＦ変異を含む。したがって、得られたｍＲＮＡは、短縮された、または非機能タンパク質に翻訳される。対照的に、ＡＳＯの付加により、スプライシングが妨害され、成熟ｍＲＮＡはエクソン１、エクソン３、及びエクソン４からなる。すなわち、ナンセンス変異（複数可）またはＯＯＦ変異を有するエクソン２がスプライシングで、切り出される。したがって、初期状態（ＡＳＯがない）では、治療用タンパク質は産生されない。ＡＳＯを付加した場合にのみ、治療用タンパク質が産生され、それによって正の調節が行われる。

【図7】本開示の組換えビリオンを製造するために必要な構成要素を生成し、特徴付けるためのバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）系の概略図を示す。

【図8】図８Ａ及び図８Ｂは、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）キャプシドタンパク質が上手く過剰発現したことを示す。図８Ａは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離された、過剰発現したＣＰＶキャプシドタンパク質（ＶＰ１及びＶＰ２）を示す。ゲルをクマシーブルーで染色した。レーン１：分子量マーカー。レーン２：過剰発現したＣＰＶキャプシド（細胞画分）。レーン３：過剰発現したＣＰＶキャプシド（上清）。図８Ｂは、ウエスタンブロット分析を示す。過剰発現したＣＰＶ ＶＰ２は、抗ＣＰＶ ＶＰ２抗体を使用して検出された。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ設計を利用して、ＶＰタンパク質の開始コドンを同定した。ＣＰＶキャプシドタンパク質の発現は、ＢＥＶ発現系に首尾よく適応された。過剰発現は、望ましいＣＰＶ ＶＰ１／ＶＰ２化学量論比１：２５を達成した。

【図9】Ａ～Ｃは、本開示の組換えビリオンを産生するために必要な追加の試薬の展開及び特徴付けを示す。Ａは、ウエスタンブロット分析を示す。過剰発現したＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質（ｐ５（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８）及びｐ１９（Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）タンパク質）は、抗ＡＡＶ Ｒｅｐ抗体を使用して検出した。Ｒｅｐ ａ、Ｒｅｐ ｂ、及びＲｅｐ ｃは、Ｒｅｐタンパク質を発現する細胞の独立したクローンを指す。Ｂは、ＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接するレポーターＧＦＰ遺伝子構築物（ＡＡＶ２ ＩＴＲ－ＧＦＰ導入遺伝子）の概略図を示す。機能的組換えビリオンは、ウイルスＩＴＲ、例えばＡＡＶ２ ＩＴＲに囲まれた導入遺伝子の効率的な増幅を必要とする。Ｃは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ－ＧＦＰ導入遺伝子の増幅の成功を示し、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＲｅｐ系コンポーネントの機能性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

特定の態様では、効率的な遺伝子療法を可能にする組換えビリオン、医薬組成物、及び方法が本明細書において提供される。

【0017】

定義
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すように使用している。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。

【0018】

「投与する」という用語は、治療法がその意図された機能を果たすことを可能にする投与経路を含むことを意図する。投与経路の例としては、注射（筋肉内、皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内、鼻腔内、頭蓋内、硝子体内、網膜下など）経路が挙げられる。投与経路には、骨髄への直接注射も含まれる。注射は、ボーラスであってもよく、または持続注入であってもよい。投与の経路に依存して、剤は、その意図された機能を行う能力に悪影響を及ぼし得る自然条件からこの剤を保護するために、選択された材料でコーティングする、またはその中に配置することができる。

【0019】

「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連する任意の核酸を指すために広く使用される。「遺伝子」という用語は、特定のゲノム配列、及びそのゲノム配列によってコードされるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに適用される。遺伝子は、エンハンサー、プロモーター、及び遺伝子座制御領域、非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン、ポリアデニル化シグナル、Ｋｏｚａｋモチーフ、ＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡレスプロモーター、及び転写後エレメント、例えば、ＷＰＲＥなどの調節エレメントに連結させ得る。

【0020】

「異種」という用語は、当技術分野で認識されており、組換えビリオン中の核酸に関して使用される場合、異種核酸は、少なくとも１つのキャプシドタンパク質が由来するウイルスに対して異種である。

【0021】

「相同組換え」という用語は、当技術分野で認識されており、標的ゲノムへの核酸挿入に関して使用される場合、相同依存性修復を含むことを意図する。

【0022】

２つの核酸分子の核酸配列間の「同一性」は、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（他のプログラムには、ＧＣＧプログラムパッケージが含まれる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（Ｉ）：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４、及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３）など、デフォルトのパラメータを使用する「ＦＡＳＴＡ」プログラムなど、既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、同一性パーセンテージとして決定され得る。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのデータベースのＢＬＡＳＴ機能を使用して、同一性を確認できる。他の商業的または公的に入手可能なプログラムとしては、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．））が挙げられる。

【0023】

「対象」または「患者」という用語は、任意の健康なまたは疾患を有する動物、哺乳動物もしくはヒト、または任意の動物、哺乳動物もしくはヒトを指す。いくつかの実施形態では、対象は、血液疾患に罹患している。本発明の方法の様々な実施形態において、対象は、治療を受けていない。他の実施形態では、対象は、治療を受けている。

【0024】

物質または細胞またはビリオンの「治療有効量」は、好ましくはヒトまたはヒト以外の哺乳動物において、許容可能な利益：リスク比で、治療される患者において医学的に望ましい結果（例えば、臨床的改善）をもたらすことができる量である。

【0025】

「治療する」という用語は、予防的及び／または治療的処置を含む。「予防的または治療的」処置という用語は、当該技術分野で認識されており、これには、本明細書に記載の組成物のうちの１つ以上を対象に投与することを含む。望ましくない状態（例えば、対象の疾患または他の望ましくない状態）の臨床症状の前に投与される場合、治療は、予防的である（すなわち、望ましくない状態の発症から対象を保護する）。一方で、望ましくない状態の発現後に投与される場合、その治療は、治療的である（すなわち、既存の望ましくない状態またはその副作用を軽減、改善、または安定化することを意図している）。

【0026】

組換えビリオン
特定の態様では、本明細書において提供されるのは、（１）プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントと；（２）核酸と、を含む、組換えビリオンであって、核酸は、異種核酸を含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、肉食動物プロトパルボウイルス、肉食動物プロトパルボウイルス１、翼手目プロトパルボウイルス１、真無盲腸目プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス２、霊長類プロトパルボウイルス３、霊長類プロトパルボウイルス４、げっ歯類プロトパルボウイルス１、げっ歯類プロトパルボウイルス２、げっ歯類プロトパルボウイルス３、有蹄動物プロトパルボウイルス１、及び有蹄動物プロトパルボウイルス２から選択される種のものである。

【0028】

いくつかの実施形態では、プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される。

【0029】

特定の態様では、本明細書において提供されるのは、（１）テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントと；（２）核酸と、を含む、組換えビリオンであって、核酸は、異種核酸を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、翼手目テトラパルボウイルス１、霊長類テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス２、有蹄動物テトラパルボウイルス３、及び有蹄動物テトラパルボウイルス４から選択される種のものである。

【0031】

いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される。

【0032】

いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルスは、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、またはそれらの遺伝子型バリアントである。

【0033】

組換えビリオンは、正二十面体であり得る。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質またはそのバリアントは、構造タンパク質ＶＰ１及び／またはＶＰ２を含む。

【0034】

ＶＰ２は、ＶＰ１より多く存在し得る。例えば、ＶＰ２は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１０００％、１５００％、２０００％、２５００％、３０００％、３５００％、４０００％、４５００％、５０００％、５５００％、６０００％、６５００％、７０００％、７５００％、８０００％、９０００％、または１００００％、ＶＰ１より多く存在し得る。

【0035】

いくつかの実施形態では、ＶＰ１は、配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２から選択される配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、ＶＰ２は、配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、及び２３から選択される配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0037】

特定の態様では、異種核酸を含む組換えビリオンが本明細書に提供され、異種核酸は、標的細胞の核酸配列と、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である核酸配列を含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、異種核酸は、哺乳動物の核酸と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であり、好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。

【0039】

いくつかの実施形態では、異種核酸は、プロトパルボウイルスプロモーターまたはテトラパルボウイルスプロモーターに作動可能に連結されない。

【0040】

いくつかの実施形態では、本開示の組換えビリオンは、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲは、（ａ）ディペンドパルボウイルスＩＴＲ、（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲ、任意によりＡＡＶ２ ＩＴＲ、（ｃ）プロトパルボウイルスＩＴＲ、または（ｄ）テトラパルボウイルスＩＴＲを含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、プロトパルボウイルスＩＴＲは、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントのＩＴＲから選択される。

【0042】

いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルスＩＴＲは、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントのＩＴＲから選択される。

【0043】

いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルスＩＴＲは、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、及びそれらの遺伝子型バリアントのＩＴＲから選択される。

【0044】

特定の態様では、核酸を含む組換えビリオンが本明細書に提供され、ここで核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、一本鎖または自己相補的二本鎖である。

【0045】

いくつかの実施形態では、核酸は、Ｒｅｐタンパク質依存性複製起点（ｏｒｉ）を含み、それにより、（例えば、ベクター産生のための）上記核酸の複製が可能になる。いくつかの実施形態では、核酸は、任意に２つのＩＴＲの間に配置された、プロモーターに作動可能に連結された核酸を含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、（ａ）作動可能に連結している核酸に対して異種であるプロモーター；（ｂ）核酸の組織特異的発現を促進するプロモーターであって、好ましくはプロモーターが、造血細胞特異的発現または赤血球系統特異的発現を促進するプロモーター；（ｃ）核酸の構成的発現を促進する、プロモーター；及び（ｄ）任意により代謝産物または低分子または化学エンティティに応答して、誘導的に発現されるプロモーターから選択される。

【0047】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、β－グロビンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＡＨＳＰプロモーター、ＭＮＤプロモーター、Ｗｉｓｋｏｔｔ－Ａｌｄｒｉｃｈプロモーター、及びＰＫＬＲプロモーターから選択される。

【0048】

いくつかの実施形態では、核酸は、ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されておらず、代わりに、発現のためにゲノム領域に、異種遺伝子座－例えば、融合タンパク質を産生するために、ＨＤＲを利用してアルブミンエクソンに、またはオープンリーディングフレームを回復させるために、相同遺伝子座に、組み込むために相同依存性修復（ＨＤＲ）に依存する。これらのいずれの場合でも、転写活性を可能にする部位において、細胞ゲノムに組み込まれない限り、ベクターＤＮＡは「サイレント」のままである。

【0049】

本開示の組換えビリオンは、コーディングＲＮＡ及び／またはノンコーディングＲＮＡをコードする異種核酸を含み得る。

【0050】

例えば、コーディングＲＮＡは、（ａ）タンパク質またはそのフラグメント、好ましくはヒトタンパク質またはそのフラグメントをコードする遺伝子；（ｂ）ヌクレアーゼ、任意により転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアント）をコードする核酸；（ｃ）レポーター、例えばルシフェラーゼまたはＧＦＰをコードする核酸；及び／または（ｄ）薬剤耐性タンパク質、例えばネオマイシン耐性タンパク質をコードする核酸を含み得る。

【0051】

いくつかの実施形態では、コーディングＲＮＡは、標的細胞中での発現のためにコドン最適化される。

【0052】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、及び／またはＨＢＺ）、アルファヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、フォン・ヴィレブランド因子、ジストロフィンまたは短縮型ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィンまたは短縮型ユートロフィン、マイクロユートロフィン、ウシェリン（ＵＳＨ２Ａ）、ＣＥＰ２９０、ＩＮＳ、Ｆ８またはそれらのフラグメント（例えば、Ｂドメイン欠失ポリペプチド（例えば、ＶＩＩＩ ＳＱ、ｐ－ＶＩＩＩ）をコードするフラグメント）、及び嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）から選択されるポリペプチドまたはそれらのフラグメントをコードする遺伝子を含む異種核酸を含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、ノンコーディングＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及び／またはガイドＲＮＡを含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、コーディングＲＮＡ、タンパク質、またはノンコーディングＲＮＡは、標的細胞の内因性遺伝子の発現を増加または回復させる。あるいは、いくつかの実施形態では、コーディングＲＮＡ、タンパク質、またはノンコーディングＲＮＡは、標的細胞の内因性遺伝子の発現を減少または消失させる。

【0055】

特定の態様において、本明細書において提供されるのは、以下をコードする核酸を含む組換えビリオンである：（ａ）ヘプシジンまたはそのフラグメント、及び／または恒常性鉄調節因子（ＨＦＥ）またはそのフラグメント；（ｂ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【0056】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、（ａ）形質導入細胞中でのＨＦＥ及び／またはヘプシジンの発現を増加させる；及び／または（ｂ）形質導入細胞中でのＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態の発現を減少させる。

【0057】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、及び／またはウィルソン病を予防または治療する。

【0058】

特定の態様では、本明細書において提供されるのは、（ａ）可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、及び／または可溶型のＩＬ－１β受容体；（ｂ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせを含む組換えビリオンである。

【0059】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、（ａ）形質導入細胞中において、可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、または可溶型のＩＬ－１β受容体の発現を増加させる；及び／または（ｂ）形質導入細胞中において、ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、またはＩＬ－１β受容体の発現を減少させる。

【0060】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、乾癬、及び／または強直性脊椎炎を予防または治療する。

【0061】

特定の態様では、本明細書では、ＩＲＧＭ、ＮＯＤ２、ＡＴＧ２Ｂ、ＡＴＧ９、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＢＥＣＮ１、ＥＩ２４／ＰＩＧ８、ＴＥＣＰＲ２、ＷＤＲ４５／ＷＩＰ１４、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ダイニン、ＥＰＧ５、ＨｓｐＢ８、ＬＡＭＰ２、ＬＣ３ｂ ＵＶＲＡＧ、ＶＣＰ／ｐ９７、ＺＦＹＶＥ２６、ＰＡＲＫ２／パーキン、ＰＡＲＫ６／ＰＩＮＫ１、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２、ＳＭＵＲＦ、ＡＭＰＫ、及びＵＬＫ１から選択されるタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む組換えビリオンが提供される。

【0062】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、形質導入細胞中での上記タンパク質またはそのフラグメントの発現を増加させる。いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、オートファジーを調節する。

【0063】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、オートファジー関連疾患を予防または治療する。いくつかの実施形態では、オートファジー関連疾患は、がん、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調）、炎症性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ、肺線維症、嚢胞性線維症、シェーグレン病、高血糖障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、ウェルナー症候群、妖精症、及び脂肪萎縮性糖尿病）、脂質異常症、高脂血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下、トリグリセリドの上昇、メタボリックシンドローム、肝疾患、腎疾患、心血管疾患、虚血、脳卒中、再灌流中の合併症、筋肉変性、萎縮、老化の症状（例えば、筋萎縮、虚弱、代謝障害、軽度の炎症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、加齢に伴う認知症及び散発性アルツハイマー病、前癌状態、及びうつ病を含む精神状態）、脊髄損傷、動脈硬化、感染症（例えば、細菌性、真菌性、ウイルス性など）、ＡＩＤＳ、結核、胚子発生異常、不妊症、リソソーム蓄積症、活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、（アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、（乳児、後期乳児／若年、成人／慢性）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｓｃｈｅｉｅ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオＡ型及びＢ型、マロトー・ラミー、Ｓｌｙ病、ムコリピドーシス、マルチプルスルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ６病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、テイ＝サックス病、及びウォルマン病から選択される。

【0064】

特定の態様において、本明細書において提供されるのは、以下をコードする核酸を含む組換えビリオンである：（ａ）ＣＦＴＲまたはそのフラグメント；（ｂ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【0065】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、（ａ）形質導入細胞中でのＣＦＴＲまたはそのフラグメントの発現を増加させる；及び／または（ｂ）形質導入細胞中でのＣＦＴＲの内因性変異形態の発現を減少させる。いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、嚢胞性線維症を予防または治療する。

【0066】

特定の態様では、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症の異なる形態に関連する、ＡＴＰＢ１、ＡＴＰＢ１１、またはＡＢＣＢ４、またはそのフラグメントをコードする核酸を含む組換えビリオンが本明細書に提供される。

【0067】

特定の態様では、本明細書において提供されるのは、リソソーム蓄積障害に関連するＣＰＳ１またはそのフラグメントをコードする核酸を含む組換えビリオンである。

【0068】

特定の態様では、本明細書において提供されるのは、肝臓における銅の過剰な蓄積によって駆動される病状であるウィルソン病関連遺伝子である、ＡＴＰＢ７またはそのフラグメントをコードする核酸を含む組換えビリオンである。

【0069】

特定の態様では、本明細書に提供されるのは、表皮水疱症（ＥＢ）に関連する遺伝子である、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣ１、Ｃｏｌ７Ａ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＡ６、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、もしくはＫＩＮＤ１、またはそれらのフラグメントをコードする核酸を含む組換えビリオンである。

【0070】

特定の態様では、本明細書において提供されるのは、ノンコーディングＤＮＡを含む組換えビリオンである。いくつかの実施形態では、ノンコーディングＤＮＡは、（ａ）転写調節エレメント（例えば、エンハンサー、転写終結配列、非翻訳領域（５’または３’ＵＴＲ）、近位プロモーターエレメント、遺伝子座制御領域、ポリアデニル化シグナル配列）、及び／または（ｂ）翻訳調節エレメント（例えば、Ｋｏｚａｋ配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）を含む。いくつかの実施形態では、転写調節エレメントは、遺伝子座制御領域であり、任意によりβ－グロビンＬＣＲまたはβ－グロビンＬＣＲのＤＮａｓｅ過敏部位（ＨＳ）である。

【0071】

特定の態様では、本明細書に提供されるのは、標的細胞のゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）の核酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である核酸配列を含む組換えビリオンである。

【0072】

いくつかの実施形態では、ＧＳＨと少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である核酸配列は、組み込まれる核酸の５’及び３’に配置され、それにより相同組換えによる標的ゲノム内の特定の遺伝子座への組み込みが可能になる。

【0073】

特定の実施形態では、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、ＮＵＰＬ２の遺伝子間領域、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １（ＨＩ １遺伝子座のチミジンキナーゼをコードする核酸）、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、またはＲＮＦ３８である。いくつかの実施形態では、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、またはＮＵＰＬ２の遺伝子間領域である。

【0074】

いくつかの実施形態では、核酸は、形質導入時に、標的細胞のゲノムに組み込まれる。好ましい実施形態では、核酸は、形質導入時に標的細胞のゲノムのＧＳＨに組み込まれる。いくつかの実施形態は、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、ＮＵＰＬ２の遺伝子間領域、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １（ＨＩ １遺伝子座のチミジンキナーゼをコードする核酸）、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、またはＲＮＦ３８である。いくつかの実施形態では、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、またはＮＵＰＬ２の遺伝子間領域である。

【0075】

いくつかの実施形態では、核酸は、相同組換え及びその後の外因性ヌクレアーゼによって誘導されるＤＮＡ破断形成によって標的ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアント）である。

【0076】

本開示の組換えビリオンは、少なくとも１つの複製タンパク質及びキャプシドタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸配列を含む核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、自律的に複製している。

【0077】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、がん細胞または非がん細胞に結合する及び／または形質導入される。いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、幹細胞（例えば、造血幹細胞、ＣＤ３４＋幹細胞、ＣＤ３６＋幹細胞、間葉系幹細胞、がん幹細胞）に結合する及び／または形質導入される。いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）を発現する細胞に結合する及び／または形質導入される。

【0078】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、造血細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞、赤血球系列細胞、巨核球、赤血球前駆細胞（ＥＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３６＋細胞、間葉系幹細胞、神経細胞、腸細胞、腸幹細胞、腸上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、エンテロサイト、肝臓細胞（例えば、肝細胞、肝星細胞（ＨＳＣ）、クッパー細胞（ＫＣ）、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ））、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）、赤血球前駆細胞、リンパ前駆細胞、Ｂリンパ芽球細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好塩基性風土性バーキットリンパ腫（ＥＢＬ）、多染性赤芽球、表皮幹細胞、Ｐ６３陽性ケラチノサイト由来幹細胞、ケラチノサイト、膵β細胞、Ｋ細胞、Ｌ細胞及び／または正染性赤芽球に結合する及び／または形質導入される。

【0079】

プロトパルボウイルスキャプシドタンパク質の合理的修飾
プロトパルボウイルスは、標的細胞上に発現するトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）との相互作用を介して細胞に形質導入する。プロトパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス）が様々な種のＴｆＲと相互作用する能力は、ＶＰ２タンパク質中に位置する特定のアミノ酸残基に依存する。イヌパルボウイルスの場合、これらの相互作用は、ＶＰ２のアミノ酸残基９３、３００、及び３２３にマッピングされる（Ｈｕｅｆｆｅｒ，Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．２００３、Ｈｕｅｆｆｅｒ，Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３）。さらに、ＶＰ２の３００位は、肉食動物パルボウイルス種のゲノム中で最も可変性の高いアミノ酸であり、これは、宿主範囲の決定に関連する役割を示唆している（Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｏｒｇａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１６）。トランスフェリン受容体は、翻訳後修飾、特にＮ結合グリコシル化を受け、末端シアル酸部分を有するアンテナ構造をもたらす。ＶＰ２中のこれらの残基は、トランスフェリン受容体のシアル酸と相互作用する。トランスフェリン受容体のシアル酸との相互作用は、ウイルスキャプシドが細胞の頂端から基底側にトランスサイトーシスするために重要である。したがって、ＶＰ２（ＣＰＶ ａａ９０～９５、ａａ２９９～３０１及び／または３２０～３２５）中に特定の変異を保有するパルボウイルスキャプシドの使用は、宿主範囲及びトランスサイトーシスに対するその能力を合理的に調節するために本明細書で使用される。

【0080】

したがって、特定の態様では、本明細書に記載の組換えビリオンは、野生型ＶＰ２及び／または１つ以上の変異を含むＶＰ２を含む組換えウイルス粒子を包含する。好ましい実施形態では、そのような組換えビリオンは、改変された向性、生体内分布、ＴｆＲ及び／またはＴｆＲを発現する細胞との改変された相互作用、ＴｆＲを発現する細胞に形質導入させる改変された能力、及び／または細胞の頂端から基底側への改変されたトランスサイトーシス能力を示す。

【0081】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＶＰ２変異を含む組換えビリオンは、第１の標的細胞（例えば、エンテロサイト）に特異的に形質導入されるが、トランスサイトーシスによって上皮バリアを通過して他の組織に到達する能力が低下し、これにより第１の標的細胞内に蓄積する。これにより、最初の標的細胞の標的化及び遺伝子送達が増強される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＶＰ２変異を含む組換えビリオンの経口投与により、ＴｆＲを発現する腸上皮、例えばエンテロサイトの細胞の優先的な標的化及び遺伝子送達がもたらされ、それによってそれをヘモクロマトーシスなどの疾患のための理想的なウイルスベクターにする（後述）。

【0082】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＶＰ２変異を含む組換えビリオンは、第１の標的細胞に特異的に形質導入し、トランスサイトーシスによって上皮バリアを通過して他の組織に到達することができる。好ましい実施形態では、１つ以上のＶＰ２変異を含む組換えビリオンは、上皮バリアを通過するトランスサイトーシスにおいて増強された効率を示す。これにより、血液脳関門を通過することにより、神経系の細胞への標的化及び遺伝子送達が増強される。

【0083】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、イヌパルボウイルスＶＰ２中に１つ以上の変異を含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、バリアントキャプシドタンパク質を含み、バリアントキャプシドは、イヌパルボウイルスＮ株（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１２９３０）または配列番号２７のアミノ酸配列に関して１つ以上の変異を有するＶＰ２配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号２７のアミノ酸残基（ｉ）９１～９５、（ｉｉ）２９７～３０１、及び／または（ｉｉｉ）３２０～３２４、または他のプロトパルボウイルスのＶＰ２の対応するアミノ酸残基を有するＶＰ２の領域にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、置換、欠失、及び／または挿入を含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、組換えビリオンの内在化に関与する少なくとも１つの細胞受容体に対する組換えビリオンの親和性及び／または特異性を改変させ、任意により、少なくとも１つの細胞受容体は、トランスフェリン受容体である。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、以下を改変する：ａ）細胞に対する組換えビリオンの向性または親和性、ｂ）細胞に形質導入する組換えビリオンの能力；及び／または
ｃ）組換えビリオンが細胞を通過してトランスサイトーシスする能力。

【0086】

特定の態様では、少なくとも１つのキャプシドタンパク質または異種ペプチドタグを含むそのバリアントを含む組換えビリオンが本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、異種ペプチドタグにより、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、またはナノボディを使用したアフィニティー精製が可能になる。いくつかの実施形態では、異種ペプチドタグは、ヘマグルチニン、Ｈｉｓ（例えば、６Ｘ－Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、Ｅタグ、ＴＫ１５、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｍｙｃ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＫＴ３、及びＩＲＳから選択されるエピトープ／タグを含む。

【0087】

医薬組成物
特定の態様では、本明細書に記載の組換えビリオン及び担体及び／または希釈剤を含む医薬組成物が本明細書に提供される。本明細書では「薬学的に許容される担体」は、薬剤投与に適合する任意の及びすべての溶媒、分散媒体、抗菌剤及び抗真菌剤、等張性及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。適合性を判断するために、浸透圧、粘度、及び／またはバリシティなどの様々な関連要因が考慮され得る。補足的活性化合物もまた、組成物中に組み込むことができる。

【0088】

本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、鼻腔内（例えば、吸入）、経皮、経粘膜、血管内、脳内、非経口、腹腔内、硬膜外、脊髄内、胸骨内、関節内、滑膜内、髄腔内、動脈内、心臓内、筋肉内、肺内、及び直腸内投与が挙げられる。特定の実施形態では、骨髄への直接注射が企図される。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液としては、次の成分を挙げることができる：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、及び張性を調整するための剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整させ得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製またはプラスチック製の複数回投与バイアルに封入させ得る。

【0089】

注射使用に好適である医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び滅菌注射液または分散液の即時調製用の滅菌粉剤が挙げられる。例えば、リンゲル液及び乳酸リンゲル液は、ＩＶ治療剤を製剤化するためにＵＳＰ承認されており、これらの溶液はいくつかの実施形態で使用される。特定の実施形態では、生物活性を保持するための賦形剤及びベクターの適合性は、好適な方法に従って確立される。静脈内投与または骨髄への注射の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌化注射用蒸留水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、滅菌でなければならず、容易に注射できる程度に流体でなければならない。これは、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の阻害は、本明細書に記載のウイルス組成物の完全性／活性に影響を与えない程度に、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。

【0090】

滅菌注射溶液は、必要に応じて、上に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込み、その後ろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。

【0091】

吸入による投与の場合、本明細書に記載のウイルス粒子は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含む加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。

【0092】

全身投与は、経粘膜的手段によるものでもあり得る。経粘膜投与のために、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られており、例えば、経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、点鼻スプレーまたは坐剤を使用して行うことができる。

【0093】

プロトパルボウイルス
プロトパルボウイルス種には、ヒトブファウイルス遺伝子型１、２、及び３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、イヌパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、及びオオコウモリブファウイルスが含まれる（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ （ＩＣＴＶ）によって指定された命名法については、表１も参照されたい；ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ ｔａｌｋ．ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｔａｘｏｎｏｍｙ／）。

【0094】

プロトパルボウイルスは、次の固有の特性を考慮すると、遺伝子療法ベクターとして特に興味深い。第一に、ヒトプロトパルボウイルス、ブファウイルス、ｔｕｓａｖｉｒｕｓ、及びクタウイルスに対する中和抗体は、多くの西側諸国では低い有病率を有する（Ｖａｉｓａｎｅｎ，Ｍｏｈａｎｒａｊ ｅｔ ａｌ．２０１８）。ウイルス特異的抗体の有病率から推測されるヒトプロトパルボウイルスの循環は、中東またはアフリカで５０％を超えることが示されているが、欧州諸国及び米国での循環は非常に低く、０％～５％の間で変化する（Ｖａｉｓａｎｅｎ，Ｍｏｈａｎｒａｊ ｅｔ ａｌ．２０１８）。この態様により、プロトパルボウイルスは、４０～７０％のヒトＩｇＧの有病率を有するＡＡＶ由来ベクターと比較して、遺伝子療法にとって特に有望となる。

【0095】

第二に、プロトパルボウイルスは、より大きい核酸分子を内包化して送達する能力を有する。ブファウイルスは、約５．１ＫｂのＤＮＡ分子を組み込むことができ、これらのベクター中においてより大きなタンパク質をコードするゲノム、またはシス作用性調節エレメントを含むゲノムの設計及び送達が可能になる（ＡＡＶと比較した場合）。一方で、ｔｕｓａｖｉｒｕｓ及びクタウイルスは、ＡＡＶ（約４．６Ｋｂ）と同様のサイズのゲノムを組み込むことができる。

【0096】

第三に、プロトパルボウイルスは、特定の細胞型／組織／臓器を標的とすることができる。ヒトブファウイルス及びｔｕｓａｖｉｒｕｓは、ヒトの呼吸器及び胃腸（ＧＩ）経路（または便）から分離されており、ヒト以外の霊長類で行われた試験では、ブファウイルスが全身感染を誘発し得ることが示唆されている（（Ｖａｉｓａｎｅｎ，Ｍｏｈａｎｒａｊ ｅｔ ａｌ．２０１８）。したがって、ブファウイルスは、これらに限定されないが、小腸、肝臓、心臓、肺、脳、及び筋肉など、異なるヒト臓器を標的とする遺伝子療法に使用できる。さらに、パルボウイルス由来のキャプシドは、低いｐＨレベルまたは胃で見られる生理学的条件などの過酷な環境条件に耐性があり得る。このような耐性により、プロトパルボウイルスのキャプシドタンパク質（複数可）を含む組換えビリオンが、腸幹細胞などの胃腸管の細胞に形質導入するのに好適なものとなる。小腸上皮は、絨毛及び陰窩という２つの基本的な構造で構成されている。絨毛は、エンテロサイト、杯細胞、腸内分泌細胞、タフト細胞、及びｍｉｃｒｏｆｏｌｄ細胞などの多様な分化細胞群によって形成される機能的吸収ユニットを形成する。各絨毛は、少なくとも６つの陥入、またはリーベルキューン腺小窩によってサポートされている（Ｃｌｅｖｅｒｓ ２０１３）。陰窩は、主にｔｒａｎｓｉｔ増幅細胞などの未分化細胞によって占められているが、分化した腸内分泌細胞及びパネート細胞も陰窩中に存在する。パネート細胞の間には、陰窩底柱状細胞が挟まれており、自己再生及び、絶えず入れ替わる分化細胞の継続的な置換の両方によって恒常性を維持している。したがって、本開示のプロトパルボウイルスキャプシド（複数可）を含む組換えビリオンにより腸幹細胞を標的とすることは、遺伝性ヘモクロマトーシスまたは炎症性腸疾患など、様々なＧＩ関連合併症を予防または治療する可能性を開く。腸幹細胞中の導入遺伝子を標的とするために、検証済みのゲノムセーフハーバーを使用することは、長期的な発現を提供すること、及び多くの場合ランダムなゲノム挿入に関連するあらゆる分化効果を回避するために非常に有益である。

【0097】

特徴：
プロトパルボウイルス属のメンバーは、単系統性であり、標準的ＮＳ１配列同一性基準を共有している。この属は２つの分岐に分かれており、１つ目の分岐は、非常に詳細に研究されているファミリーのファウンダーのメンバーによって占められているが、２つ目の分岐は、予測されたウイルスによって独占的に占められており、そのコード配列は、ウイルス発見アプローチを使用して、野生で近年同定されたものであり、この生物学は、依然として、調査が最小限である。ファウンダープロトパルボウイルスのゲノムは、ＮＳ１二本鎖ＤＮＡ認識部位のモジュラー結合モチーフであるテトラヌクレオチド配列５’－ＴＧＧＴ－３’（またはその補体５’－ＡＣＣＡ－３’）の反復を多く含むため、特徴的であり、一般に（ＴＧＧＴ）２－３として表される（Ｃｏｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。マウス微小ウイルスのＮＳ１は、ＴＧＧＴモチーフの様々な間隔のタンデム及び反転したクラスターを認識し、複製型ウイルスＤＮＡ全体に分布する様々な配列に結合できるようにする。ＴＧＧＴ／ＡＣＣＡテトラヌクレオチドクラスターも新しいウイルスのゲノム全体に分散しており、これは、ファウンダーメンバーとの重要な生物学的類似性を示唆している。例えば、ブファウイルス１ａ（ヒト）（ＪＸ０２７２９６）の４８２２ ｎｔ配列には、９５コピーのＡＣＣＡまたはＴＧＧＴがあり、メラノーマ関連ヒトクタウイルス（ＫＸ６８５９４５）の４４５２ ｎｔ配列には１０５の別個のコピーがある。

【0098】

ビリオン
Ｘ線再構成は、プロトパルボウイルスキャプシド内の最初の整然とした構造のＶＰ残基が、５倍細孔の基部の粒子内に位置し、それぞれ約１８０残基及び３７残基のＶＰ１及びＶＰ２のＮ末端が未分解であることを示している（Ｈａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｘｉｅ ａｎｄ Ｃｈａｐｍａｎ １９９６）。この未分解配列のＣ末端領域は、ＶＰ１及びＶＰ２の両方に存在する細いグリシンに富む鎖を形成し、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）バリアントでは、変異ＶＬＰは、いくつかのｃｒｙｏＥＭ再構成で、５倍未満のチャネルのカプシド内に位置する爪のような密度にモデル化される（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。しかし、空の粒子ではなく、ＭＶＭビリオンのＸ線構造では、この配列（ＶＰ２ Ｇ３７～Ｇ２８）の単一コピーからの最初の１０アミノ酸は、ほとんどの５倍体円筒形の中心孔を占めるモル以下の密度にモデル化できる。すべてのＶＰ１及びＶＰ２のＮ末端ペプチドは、空の粒子中に隔離されているが、ＭＶＭ ＶＰ２のＮ末端のサブセットは、おそらく５倍体円筒形状の拡張を伴う、十分に理解されていないコンフォメーションシフトを介して、ゲノムキャプシド形成の初期段階で、ビリオン表面に露出する（Ｃｏｔｍｏｒｅ ａｎｄ Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ ２００５ａ）。これらの外在化したＶＰ２のＮ末端には、核外輸送シグナルが含まれており（Ｍａｒｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）、このシグナルは、一部の細胞中で、輸送中立キャプシドを核外輸送可能粒子に効果的に変換する。ビリオンは、感染細胞からこの形態で放出される（Ｃｏｔｍｏｒｅ ａｎｄ Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ ２００５ａ）が、細胞外環境及び細胞侵入の両方において、露出したＮ末端がタンパク質分解切断を受け、約２５個のアミノ酸が除去され、ＶＰ２が、ＶＰ３と呼ばれる形態に変換される。Ｘ線構造では、各円筒体を通過する１つよりわずかに少ないポリグリシントラクトが示されるため、約５０のＭＶＭ ＶＰ２末端の約９０％が、最終的に表面に露出して切断されることが重要である。切断された、主にＶＰ３のビリオンのＸ線構造では、このタンパク質分解により、切断されたタンパク質のポリグリシントラクトが、キャプシド内部に引き込まれ得、そこで折り返され、ＶＰ２ Ｎ末端の新しいクラスターにより円筒体内で置換されながら、残基Ｇ３０まで伸長する追加の正二十面体の配列をとることがビリオンによって示されている（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ Ｌ，Ｇｕｒｄａ ＢＬ，Ｈａｌｄｅｒ Ｓ，Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ Ｋ，ＭｃＫｅｎｎａ Ｒ，Ｃｏｔｍｏｒｅ ＳＦ，Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ Ｐ，Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ．２０１０，未公開の観察）。外在化されたＶＰ２ Ｎ末端も重要な構造的役割を果たし、細胞に入る前に円筒体を安定させ、ＶＰ１ Ｎ末端と最終的にはゲノムの成熟前の曝露を防ぐ（Ｃｏｔｍｏｒｅ ａｎｄ Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ ２０１２）。したがって、プロトパルボウイルス属のメンバーでは、５倍体円筒体が３つの異なるカーゴ形態のポータルとして機能し、１）無傷の粒子への及びそこからのゲノム転座、２）二重層通過前のＶＰ１ＳＲの押し出し、及び３）ゲノムのキャプシド形成に付随する一部のＶＰ２ Ｎ末端の初期の外在化を媒介する。これは、これらのポータル機能の１つまたは２つのみに依存する他の多くのパルボウイルス属のウイルスとは明確に対照的である。

【0099】

プロトパルボウイルスビリオンの２つ目の際立った特徴は、Ｘ線構造では、キャプシドが正二十面体の配列であるのみでなく、一本鎖ＤＮＡゲノムの約１１～３４％も構造化されており、内部キャプシド表面上の空洞の下に位置する各非対称ユニットにパッチを形成していることである。この整然と構造化されたＤＮＡは、２～３本の短い（８～１１ｎｔ）の一本鎖で構成され、２つのＭｇ＋＋イオンによって内部でキレート化されたリン酸塩を含む逆ループ構成を採用し、塩基は、特定のアミノ酸側鎖との非共有結合による相互作用を確立するキャプシド殻に向かって外側に向ける（Ｈａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ １９９５）。原子間力顕微鏡を使用して、個々のＭＶＭ粒子の５倍体、３倍体、及び２倍体の対称軸に沿った剛性を調べ、ＤＮＡ含有ビリオンではないが、空の粒子では、２倍軸は、ナノインデンテーションによって容易に歪む可能性があり、これは、ゲノムがこの領域のキャプシドの剛性に大きな影響を有することを示している（Ｃａｒｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。キャプシド内相互作用を損なわないが、キャプシドと、結合したＤＮＡパッチとの間の主要な相互作用を破壊する１つのアラニン変異は、空の粒子には影響を有しないが、完全粒子中に見られるゲノムによって強化された２倍体の剛性は無効になった。これは、これらの整然と構造化されたＤＮＡ：キャプシド相互作用に主に由来するものであることを示している（Ｃａｒｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）。これはおそらく、野生型キャプシドのダイナミクスを確立する上で全長５ｋｂのゲノムが重要であることを示しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏのアンコーティング試験でも示唆されている（Ｃｏｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0100】

ゲノムの編成及び複製
プロトパルボウイルスは、約５ｋｂのヘテロテロメアゲノムを有し、左端に約１２０ｎｔのヘアピンテロメアが隣接し、通常は、１つの配列方向であるが、右端のヘアピンは、約２５０ｎｔであり、２つの逆向きの相補的配列（「フリップ」及び「フロップ」と呼ばれる）のいずれかとして存在し得る。プロトパルボウイルスゲノムの右端は、ヘアピントランスファーによってヘアピン構造の複製中間体から切り出すことができる。ＭＶＭでは、ＮＳ１複合体が、（ＴＧＧＴ）２－３結合部位の２つの別のクラスターに結合することを伴い、１つ目は、ＮＳ１が切断部位（５’－ＣＴＡＴＣＡ－３’）上に位置し、２つ目は、約１２０ｂｐ離れて、ヘアピン軸にある。切断を生じさせるには、これら２つの部位のＮＳ１複合体が連繋され、宿主ＨＭＧＢファミリーからＤＮＡ曲げタンパク質を動員することによって起点が再度折り返される必要がある。これは、ＮＳ１に結合し、介在するＧリッチ起点ＤＮＡ内に、必須の約３０ｂｐの二重らせんループを創出する（Ｃｏｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）。対照的に、このウイルスの左端から生成された起点配列は、ヘアピンステム内に重大なＴＣ／ＧＡＡミスマッチがあるため、ヘアピン構造内で切断されない。活性起点を創出するには、左側のヘアピンの折り畳みを展開してコピーし、二量体ＲＦ内の隣接するゲノムにまたがる塩基対結合領域を形成する必要がある。この領域では、ヘアピンの２つのアームが、対称軸の両側で効率よく分離される。しかし、ＴＣアームのみが活性起点を生じさせる。これは、ジヌクレオチドが、ＮＳ１結合部位とパルボウイルス開始因子（ＰＩＦ、糖質コルチコイド調節エレメント結合タンパク質ＧＭＥＢとしても知られている）と呼ばれる必須補因子の結合部位との間に位置するスペーサーエレメントとして作用するためである。ＰＩＦは、ＤＮＡパリンドロームの軸の近くに位置する２つの間隔をあけた５’－ＡＣＧＴ－３’半部位に結合するヘテロ二量体宿主複合体である。活性な起点では、ＰＩＦは、ＴＣジヌクレオチドを介してＮＳ１と相互作用し、比較的弱いＮＳ１結合部位への結合を安定化するが、非活性（ＧＡＡ）アームでのＧＡＡトリヌクレオチドを介した同一の結合部位へのＮＳ１の結合を安定化することはできない（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。その結果、ＧＡＡ配列を保有するヘアピン構造または完全二重ヘアピンアーム中の配列は切断されず、これは、隣接するＰ４プロモーターから転写を駆動するなど、別の役割に利用できる可能性がある（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。左端起点と右端起点との間の切断効率の不一致が大きいことにより、子孫のネガティブセンス一本鎖は、ゲノムの右端から優先的に置換され、その結果、プロトパルボウイルスは、典型的には、主に（約９９％）ネガティブセンス子孫ｓｓＤＮＡに置換されてパッケージングされる。

【0101】

この属のウイルスは、マップ単位（ｍｕ）４及び３８の２つの転写プロモーターと、ｍｕ９５に対応する１つのポリアデニル化部位を使用して、ｍＲＮＡの３つの主要なサイズクラスを創出する。これらはすべて、４６～４８ｍｕの除去された短いイントロン配列を有する（Ｐｉｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。ＭＶＭでは、このスプライスは、異なる強度の代替ドナー（Ｄ１及びＤ２）及びアクセプター（Ａ１及びＡ２）を有し、これらは、１２０ｎｔの領域内に位置するため、潜在的なＤ２：Ａ１スプライスが、最小限のイントロンサイズの制約によって排除される。したがって、スプライシングにより、異なる化学量論で発現する各ｍＲＮＡサイズクラスの３つの形態が創出される（Ｈａｕｔ ａｎｄ Ｐｉｎｔｅｌ １９９９）。この中央のイントロンのみが除去されたＰ４から生じる転写産物は、１つの形態のＮＳ１をコードし、その翻訳は、Ｄ１の上流で終結する。しかし、一部のＰ４転写産物では、１０～４０ｍｕの２番目の長いイントロンも切り出され、約２５ｋＤａのＮＳ２タンパク質をコードするｍＲＮＡが創出される。これらは、ＮＳ１とＮ末端配列の８５のアミノ酸を共有するが、その後異なるリーディングフレームにスプライシングされ、最終的に、２つの異なるＣ末端ヘキサペプチドを付加できる短い中央イントロンに到達する。これにより、約５：１の比率で発現するＮＳ２Ｐ及びＮＳ２Ｙと呼ばれるバリアントが生成される。Ｐ３８転写は、上流の５’－ＴＧＧＴ－３’反復配列に結合するＮＳ１によって媒介される、ＮＳ１のＣ末端ドメインによって強くトランス活性化される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｌｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。短いイントロンでのオルタナティブスプライシングにより、キャプシドタンパク質の２つのサイズのバリアントが、２つのアクセプター部位間に位置するＡＴＧコドンにおいて開始するＶＰ１（約８３ｋＤａ）と、約１：５の化学量論比で発現され、ＶＰ２（約６４ｋＤａ）は、スプライスの下流で開始する。

【0102】

感染中、新たに合成されたキャプシドタンパク質は、細胞質内で２種類の三量体（ＶＰ２のみ及び１ｘＶＰ１＋２ｘＶＰ２）として集合し、従来とは異なる構造依存性輸送モチーフを使用して、キャプシドアセンブリのために核に輸送される（Ｌｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。しかし、この転座は、Ｓ期に限定されており（Ｇｉｌ－Ｒａｎｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、細胞のＲａｆ－１キナーゼによる三量体のリン酸化に依存している（Ｒｉｏｌｏｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0103】

プロトパルボウイルスによってコードされる補助タンパク質には、主に宿主タンパク質との相互作用によって媒介される複数の機能を有すると考えられるＮＳ２バリアント、及び小さいオルタナティブ翻訳（ＳＡＴ）タンパク質が含まれる（Ｚａｄｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＭＶＭ ＮＳ２は、形質転換されたヒト細胞株には必須ではないが、マウス細胞では、存在しない場合には、未知のメカニズムによって感染サイクルの初期に二本鎖ＤＮＡ増幅が急速に停止する（Ｎａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，２００６）。この初期の欠陥は、比較的低レベルのＮＳ２の発現によって無効にされ得るが、効率的なキャプシドのアセンブリを可能にするために、サイクルの後半で、はるかに高いレベルのＮＳ２が必要とされ（Ｃｏｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、このことは、その後の子孫ＤＮＡ一本鎖の蓄積及びビリオン放出の前提条件である。後期キャプシド欠損では、ＶＰタンパク質が発現するが、そのほとんどがキャプシドに集合できず、急速に分解される。これは、おそらく、以下で論ずるとおり、通常の核／細胞質タンパク質輸送における重度の転位に関連する前駆体サブユニットの核転座が不十分であることを反映している。ＭＶＭ感染中、ＮＳ２は、細胞の１４－３－３ファミリーのタンパク質（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）及び核外輸送因子ＣＲＭ１（Ｂｏｄｅｎｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，１９９９）と結合する。重要なことに、ＮＳ２核外輸送シグナル（ＮＥＳ）は、ＲａｎＧＴＰの存在とは関係なく、「超生理学的」親和性でＣＲＭ１に係合し、このため、細胞質放出に抵抗し得る（Ｅｎｇｅｌｓｍａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。野生型ＭＶＭ感染の間、ＣＲＭ１は、核周囲の細胞質中で検出できるが、この再分布は、ＣＲＭ１をさらに高い親和性で結合させるＮＳ２ ＮＥＳの近くに点変異を保持する変異ウイルスによる感染で悪化する（Ｌｏｐｅｚ－Ｂｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらの変異はまた、感染の後期段階の開始を加速させ、これは、ＮＳ１及び空のキャプシドを含む、典型的には、核構造の大きな細胞質への蓄積を特徴とし、ここでも、正常な核／細胞質輸送経路の大きな破壊を示唆している。Ａ９線維芽細胞へのトランスフェクション後、野生型ＭＶＭｉゲノムは、低レベルのＮＳ２を発現するが、これらのゲノムがＮＳ２－ＮＥＳ変異のうちの１つを発現するように操作された場合、結果として生じる低レベルの変異ＮＳ２が、野生型レベルのウイルス子孫蓄積を駆動することができ、不十分なＮＳ２を発現する細胞で見られる累積後期感染ブロックは、ＮＳ２：ＣＲＭ１相互作用の化学量論的制限に起因することが確認された（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。同様に、ＮＳ２：ＣＲＭ１結合が増強されるのではなく損なわれる変異ウイルスを用いた試験では、感染時にこの相互作用が、ビリオンの効率的な放出に必要であることが示されている（Ｅｉｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｐｉｎｔｅｌ ２００２）。

【0104】

２番目のプロトパルボウイルス補助タンパク質であるＳＡＴは、キャプシド遺伝子内でコードされ、ＶＰ２と同じｍＲＮＡから後期に発現する。ＳＡＴは、感染細胞の小胞体（ＥＲ）内に蓄積する（Ｚａｄｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＮＳ２と同様に、ウイルスが、培養物を介して拡散する速度を高めるが、不可逆的なＥＲストレスの誘導を含む別のメカニズムを介して作用し、細胞壊死の増強に関連する（Ｍｅｓｚａｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ）。ＳＡＴ及びディペンドパルボウイルスの補助タンパク質であるＡＡＰは両方とも、キャプシド遺伝子中の類似の位置を占め、必須のＮ末端疎水性ドメインを含んでいるが、これらのタンパク質は、機能的相同性を呈することは知られていない。したがって、プロトパルボウイルスでは、初期のビリオン排出は、細胞溶解の前に発生し、細胞タイプによって異なるＶＰ２シグナルまたはＣｒｍ１相互作用によって媒介されるか、細胞壊死の増強に関連してＳＡＴによって駆動される、複数のメカニズムによって駆動されることができる特徴的な機能である。輸送中、一部のビリオンは、小胞体中のＣＯＰＩＩ小胞に内在化され、ゴルジ体へのゲルゾリン依存性輸送を受けることが知られており、ここでは、おそらく、その後の粒子対感染力の比率を高める他の修飾によって、チロシンリン酸化を受ける（Ｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。サイクルの初期に放出されると、急速な感染拡散が可能になり、感染した組織からの全体的な子孫の産生が中和抗体の蓄積前に増強され得る。

【0105】

生物学
パルボウイルス科を確立するために使用された元のウイルスの１つであるＫｉｌｈａｍラットウイルス（ＫＲＶ）は、１９５９年に実験ラット腫瘍の溶解物から単離された（Ｋｉｌｈａｍ ａｎｄ Ｏｌｉｖｉｅｒ １９５９）。次の１０年間で、連続した同様の一本鎖ＤＮＡウイルスが、移植可能な腫瘍、組織培養細胞株、または他のウイルスの実験室株で発見された。ＭＶＭなどの一部は、野生のげっ歯類に感染することが現在知られているウイルスに非常によく似ているが、ＬｕＩＩＩ（Ｍ８１８８８）などの同じ種の他のメンバー（げっ歯類プロトパルボウイルス１）は、自然界に見られるウイルスの遠い組換え体のようである。これらのウイルスは、その間の年月において広く研究され、その科の基本的な特徴及び基礎となる生物学を定義するための重要なモデルシステムとして機能した。げっ歯類では、げっ歯類プロトパルボウイルス１種由来のウイルスは、無症候性のウイルス血症から奇形発生、胎児または新生児の細胞死まで、様々な病状を呈する。これらのウイルスは、正常ヒト細胞に感染できないが、多くの場合、ヒト細胞が発がん性形質転換を受けたときに宿主の制限が緩和され、ウイルスが優先的に腫瘍溶解性になり得、このことから、臨床がんウイルス療法での使用の可能性が示唆される。この目的のために、ウイルスＨ－１（Ｘ０１４５７）を使用して進行性神経膠芽腫を標的とする第Ｉ／ＩＩａ相臨床試験が最近完了した。この試験では、ウイルスが十分に許容され、このがんに一般的に関連する局所免疫抑制を部分的に破壊し得るエビデンスがもたらされた（Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ａｎｇｅｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

【0106】

一部の細胞では、パルボウイルス感染により、遅延はあるものの顕著な１型ＩＦＮ放出が引き起こされ、その一方で、外因性ＩＦＮ－βによる前処理は、ウイルスのライフサイクルを強力に阻害する（Ｇｒｅｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍａｔｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）のＭＶＭｐ感染中、ＩＦＮ応答は、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質（ＭＡＶＳ）及びＲＩＧ－Ｉセンシングを伴わず、ウイルスＤＮＡ複製を著しく阻害することはなかった（Ｍａｔｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）が、別の試験では、ＩＦＮ－ベータ中和抗体で細胞を前処理することにより、感染が増強された（Ｇｒｅｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。しかし、感染したＭＥＦは、ポリ（Ｉ：Ｃ）刺激に応答しなくなり、これは、ウイルスが、Ｉ型ＩＦＮによって誘発される抗ウイルス免疫メカニズムを不活性化できることを示唆している。

【0107】

この属の重要な病原体には、ネコ汎白血球減少症ウイルスとしても知られるネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、及び１００年超にわたって存在している密接に関連するミンク及びアライグマのパルボウイルス、１９７０年代中期にバリアントとして発生し、１９７８年に世界中に蔓延したイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）が挙げられ、イヌ、オオカミ、及びコヨーテの間で疾患のパンデミックを引き起こしている。これらのバリアントはすべて、単一の種である肉食動物プロトパルボウイルス１に属する。成体動物では、この種のウイルスは、主にリンパ系組織に感染し、白血球減少症またはリンパ球減少症を引き起こし、腸上皮の感染では、結果として、重度の下痢、脱水症、及び発熱が生じる。対照的に、新生児の感染は、運動失調につながる可能性のある子猫またはフェレットの小脳病変、または子犬の心筋炎を特徴とする。疾患は、ワクチン接種によって十分に制御されているが、罹患した同腹児の死亡率は、２０～１００％の間で変動する（（Ｋａｉｌａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）で概説）。

【0108】

有蹄動物プロトパルボウイルス１種のメンバーであるブタパルボウイルス（ＰＰＶ）は、世界中のブタの胎児死亡及び不妊症の主因であるが、ＰＰＶ感染のみでは、非妊娠ブタまたは子豚に疾患を引き起こすことはまれである。しかし、血清検査陰性の妊娠中の雌豚が、妊娠初期の７０日間に有毒なＰＰＶ株にさらされると、経胎盤感染により、ＳＭＥＤＩ（死産、ミイラ化、胚死、及び不妊症）と呼ばれる症候群が引き起こされ得る（Ｍｅｓｚａｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７ａ）。ＰＰＶの弱い病原性及びワクチン株（ＮＡＤＬ－２など）が存在し、これらは羊水中に入った場合、致死的ではあるが、病原性株（例えば、Ｋｒｅｓｓｅ）ほど効率的に胎盤関門を通過しないため、疾患は、まれである。ＳＭＥＤＩを予防するための広範なワクチン接種プログラムが実施されているが、新たに出現した有毒なＰＰＶバリアントの中には、現在のワクチン株への曝露によって生じた抗体によって中和できないものがある（Ｍｅｓｚａｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７ａ）。ＰＰＶとの同時感染は、離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）の発症におけるブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ－２、ブタサーコウイルス２、サーコウイルス科）の影響を増強することもある。

【0109】

新たに発見されたウイルスのほとんどは、ブファウイルス１ａ（ヒト）用に確立されたプロトパルボウイルスツリーの新しい枝の種に分離される。このウイルスの２つの遺伝子型、ＢｕＶ１及びＢｕＶ２は、２０１２年にブルキナファソ及びチュニジアの下痢症の小児の糞便サンプルのウイルスメタゲノム解析で特定された（したがって、「ブファウイルス」という名前が付けられた）（Ｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。３つ目の型ＢｕＶ３は、後にブータンの小児の下痢便から発見された（Ｙａｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。現在までに、ＢｕＶ ＤＮＡは、ブルキナファソ、チュニジア、ブータン、タイ、トルコ、中国、及びフィンランドの小児の下痢、及びフィンランド、オランダ、タイ、及び中国の成人の下痢で検出されているが、非下痢性糞便中には発見されず、これは、因果関係を示唆するものである（Ｖａｉｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。抗ＢｕＶ１キャプシドＩｇＧの存在を分析すると、フィンランド及び米国の成人の血清有病率は低かった（約２～４％）が、イラク（約８５％）、イラン（約５６％）及びケニア（約７２％）の成人では、より高い率であることが判明した。（Ｖａｉｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。

【0110】

クタウイルス（ＣｕＶ）と呼ばれるブファウイルス枝中２番目のヒトプロトパルボウイルスは、ブラジル及びボツワナの小児からの少数の下痢サンプル、及びこのウイルスの名前の由来となった皮膚Ｔ細胞リンパ腫の４つのフランスの皮膚生検（Ｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、及びデンマークの黒色腫患者の悪性皮膚病変（Ｍｏｌｌｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，２０１７）で検出された。ヒト疾患におけるＣｕＶの病因学的意義は、まだ決定されていない。

【0111】

ＣｕＶに対するＩｇＧの有病率は、ブファウイルスの上記の同じサンプルシリーズで均一に低く（０～約６％）、ＣｕＶがヒト集団全体に広く分布していることが確認された（Ｖａｉｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。対照的に、チュニジアのヒト糞便サンプルで検出された、まだ分類されていない３番目の新しいプロトパルボウイルスに対するＩｇＧ（したがって、ｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ＴｕＶ）（Ｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）は、同じパネルの血清には存在せず、そのＤＮＡは、他の糞便サンプルではまだ検出されていないため（Ｖａｉｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｖａｉｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、ＴｕＶがヒトウイルスであるという証拠はこれまでのところ不十分である。それは、前述のプロトパルボウイルス系統ツリーの元の枝を占めるウイルスと系統発生的に分離する。

【表1】

【0112】

テトラパルボウイルス
テトラパルボウイルス属としては、ヒトパルボウイルス４（ＰＡＲＶ４）、ブタパルボウイルス２、ストローオオコウモリパルボウイルス、ヤクパルボウイルス、ブタホコウイルス、及びヒツジホコウイルスが挙げられる。ＰＡＲＶ４は、注射薬の使用を介してＨＩＶに感染するリスクのあるヒトの血漿中で最初に検出された（Ｊｏｎｅｓ，Ｋａｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ．２００５）。ゲノムは、約５．３Ｋｂで、ＡＡＶより６００ｎｔ大きく、そのキャプシドは、温度に対して非常に耐性があるため、非常に用途が広く、安定したウイルスベクターになる。ＰＡＲＶ４は、特定の地理的地域で風土病だが、他の場所では、薬物を注射するヒト及び複数回の輸血の既往があるヒトなど、ＨＩＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶ感染患者などの特定の高リスク群に限定されて発見されている。ＰＡＲＶ４が、実際に、観察された疾患を引き起こしているのか、それとも非常に曝露された（ウイルス感染の）リスクのある集団で検出された非病原性の日和見ウイルスなのかは依然として不明である。一般集団におけるＰＡＲＶ４の血清有病率は、世界の様々な地域で０％～２５％の範囲で変動する（Ｓｈａｒｐ，Ｌａｉｌ ｅｔ ａｌ．２００９）。慢性ウイルス感染症患者における抗ＰＡＲＶ４抗体の有病率は、世界の様々な地域で１５～３５％であると報告されているが、他の西側諸国の健康な個体における有病率は、１％未満であることが示されている。英国の献血者のＰＡＲＶ４ ＩｇＧスクリーニングでは、霊長類ＡＡＶ抗原について、観察された血清陽性率よりも有意に低い４．８％の血清陽性率が特定された（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．２０１７）。これは、ＰＡＲＶ４を遺伝子療法ベクターとして使用することの主な利点の１つを強調するものである。米国などいくつかの西側諸国の集団における中和抗体の血清有病率の低下と、特定の標的組織に対する向性により、これは用途の広い遺伝子療法ベクターになる。ＰＡＲＶ４の向性及び潜伏部位は、完全には理解されていないが、説得力のあるデータでは、骨髄、気道、肝臓、及び腸が、潜在的なウイルス複製部位を表し、潜伏または持続的な感染個体のウイルスの貯蔵庫であり得ることが示唆されている。したがって、ＰＡＲＶ４は、広範なヒト疾患を予防または治療する目的の遺伝子を送達するのに有用である。

【0113】

ゲノムの編成及び複製
ＰＡＲＶ４は、型種である霊長類テトラパルボウイルス１の典型的なウイルスである。この種には、３％未満のアミノ酸配列の相違を有する３つの異なるＰＡＲＶ４遺伝子型（Ｇ１ ＡＹ６２２９４３、Ｇ２ ＤＱ８７３３９０、及びＧ３ ＥＵ８７４２４８）と、チンパンジーに感染するウイルス（ＨＱ１１３１４３）が挙げられる。ＰＡＲＶ４の現在の知識は、他の場所で詳細に概説している（Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７， Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。現在欧州及び北米で流行している主な型はＧ１であるが、Ｇ２（ＰＡＲＶ５として知られることもある）もこれらの地域で流行しており、１９８０年代に感染した可能性が高いヒトにおいて最もよく見られ、これは、当時はこれらが主流形態であった可能性があることを示唆している。Ｇ２及びＧ２様形態は、アジア及びブラジルでも流行しているが、Ｇ３は、アフリカで見られる主要菌株である。完全ゲノムが利用できないため、ＰＡＲＶ４遺伝子発現プロファイルは、そのコード配列を組織培養細胞にトランスフェクトすることによって暫定的に調査されている。ＤＮＡ複製は、一般にパルボウイルスの転写パターンに影響を与えるため、これらの配列は、最初にアデノ随伴ウイルス５（ＡＡＶ５）末端ヘアピンの間に挿入され、得られたハイブリッドは、ＡＡＶ５Ｒｅｐ７８及びアデノウイルスヘルパー因子をコードする構築物を用いて、２９３細胞へのコトランスフェクションによって複製を誘導した（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＮＳ及びＶＰタンパク質をそれぞれコードする転写産物を生成する２つのプロモーター、Ｐ６及びＰ３８が同定された。ＮＳ１と同じフレーム内で開始すると予測されるいくつかのＰ６転写産物は、別のフレームにスプライシングされ、ＮＳ２低タンパク質が生じる可能性があるが、この産物は、検出されなかった。ＶＰ２及びＮＳ１をコードするメッセンジャーＲＮＡが観察され、それぞれ約８０ｋＤａ及び約６５ｋＤａの分子量を有するタンパク質が生成されたが、推定されるＰＬＡ２ドメインを含む少なくとも２６１アミノ酸のＶＰ１特異的領域を含む、予測されたＶＰ１コード配列がどのようにアクセスされるかは、依然として不明である。

【0114】

生物学
この属のメンバーの生物学または臨床的意義についてはほとんど知られていない。ＰＡＲＶ４ゲノムは、急性感染時に血漿中に検出されているが、多くの場合、ウイルス量は低く（３×１０４ゲノムコピー／ｍｌ未満）、ウイルス血症は、長引くと考えられ、典型的には、１ヶ月から数ヶ月継続する。ウイルスのゲノムは、肝臓及び骨髄のサンプル中でも検出されているが、ウイルスが複製される場所は、依然として不明である。ＰＡＲＶ４ ＤＮＡ陽性またはＰＡＲＶ４ ＩｇＧ陽性の血漿は、北米及び欧州の一般集団ではまれだが、他の血液媒介性ウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスを保有する個体、静脈内薬物使用またはプールされたヒト血漿からの血液製剤への依存など、非経口感染の行動的リスク因子を有する個体においては、より高い頻度で生じる（Ｌａｈｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，２００９）。しかし、アフリカでは、ＰＡＲＶ４は風土病であり、その疫学は、非常に異なると考えられ、サハラ以南アフリカ及び南アフリカの一般集団の約３０～５０％がＰＡＲＶ４ ＩｇＧの血清結果陽性を示している。ウイルス血症も高頻度で検出され、例えば、ある研究では、ガーナにおいて、無症候性の若年小児の８．６％がＤＮＡ陽性であり（Ｐａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、アフリカの小児の鼻及び便のサンプル中でウイルスＤＮＡが検出された。これは、この場所での伝播が、食品媒介、呼吸器、または接触媒介経路による可能性が高いことを示唆している。

【0115】

ＰＡＲＶ４遺伝子型１及び２は、欧州及び北アフリカで優勢だが、アフリカではＧ３が主要な形態である。したがって、ウイルス生物学に影響を与える遺伝的差異は、これらの極端な疫学的格差の一因となり得る。あるいは、宿主集団の特性が重要である場合がある。したがって、現在の多くの研究は、ウイルスの感受性及び伝播経路を明らかにすることに向けられている。例えば、循環しているＧ２ウイルスが、非経口経路／高リスク群のパターンに従うことが予測される可能性があるブラジルの最近の研究では、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）に感染した個体の約６％もＰＡＲＶ４ ＤＮＡ陽性であることが明らかになったが、これらの同時感染個体の大部分は、非経口伝播経路を示唆する病歴を有さず、これは、さらなる要因または経路がこの場所に関与している可能性が高いことを示唆している（Ｓｌａｖｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

【0116】

ヒト以外の宿主に感染するテトラパルボウイルスも風土病と考えられる。例えば、カメルーンでサンプルが採取された７３匹の野生類人猿群のチンパンジーの６３％及びゴリラの１８％が、霊長類テトラパルボウイルス１型中のチンパンジーウイルスに対する抗体に対して血清検査陽性であり（Ｂｅｉｅｒｗａｌｔｅｓ １９９１）、４種の有蹄動物（有蹄動物テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス２、有蹄動物テトラパルボウイルス３、及び有蹄動物テトラパルボウイルス４）中のウイルスは、家畜の血清及び組織で一般的に検出された（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。同様に、コウモリウイルス（翼手目テトラパルボウイルス１種）が、ガーナのストローオオコウモリの血液サンプル及び組織から高濃度で検出された。このウイルスは、脾臓及び腎臓由来のサンプル中に特に豊富に含まれており、これは、これらの臓器がウイルス複製部位であり得ることを示唆している（Ｃａｎｕｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【表2】

【0117】

ウイルスの遺伝子バリアント
当業者は、ウイルスの種が遺伝子バリアントのクラスターを含むことを認識している（Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ ＭＨＶ（２０００）Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ－Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ）。遺伝的バリアントは、変異（点変異及び異なる長さの挿入－欠失を含む）、超変異、数種類の組換え、及びゲノムセグメントの再集合を含み得る。変異は、すべてのウイルスで観察され、既知の例外はない（Ｄｏｍｉｎｇｏ（２０１９）Ｖｉｒｕｓ ａｓ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ２０２０：３５－７１）。組換えも広く行われており、ＤＮＡウイルスならびにＲＮＡウイルスについて、その発生がすぐに認められた。ゲノムセグメントの再集合は、有性生殖における染色体交換に近い変異の一種であり、インフルエンザウイルスの進行中の進化によって継続的に証明されるように、セグメント化されたウイルスゲノムの適応アセットである。ウイルスゲノム変異の３つのモードは互換性があり、現在のウイルスでは、再集合体、組換え体、変異体のゲノムが継続的に発生している。

【0118】

したがって、本明細書に記載のウイルスの遺伝子バリアントは、本明細書に記載のポリペプチド、または本明細書に記載のウイルスに属するポリペプチド（例えば、キャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２）、ＮＳタンパク質など）を含み得、アミノ酸配列が、本明細書に提示される例示的な配列のアミノ酸配列または本明細書で参照される例示的なウイルスのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも、約、または３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるか、もしくはこれら以下同一である。

【0119】

ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）
ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）は、ヒト及びモデル種のゲノムの遺伝子内、遺伝子間、または遺伝子外領域であり、宿主細胞または生物に重大な悪影響を与えることなく、新しく組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に対応することができる。ＧＳＨは、イントロンまたはエクソン遺伝子配列、ならびに遺伝子間または遺伝子外配列を含み得る。理論に限定されるものではないが、有用なセーフハーバーは、導入遺伝子にコードされたタンパク質またはノンコーディングＲＮＡの所望のレベルをもたらすのに十分な導入遺伝子の発現を可能にするものとする。また、ＧＳＨは、細胞が悪性形質転換しやすくなること、前駆細胞の分化を妨害すること、または正常な細胞機能を大幅に改変することもないものである。何がＧＳＨを偶然の良好な組み込みイベントと区別するかというと、結果の予測可能性であり、これは、ＧＳＨの事前の知識及び検証に基づく。

【0120】

本明細書に記載の組換えビリオンのゲノムサイズがより大きいことにより、ＧＳＨ配列と一緒に治療用導入遺伝子（複数可）を送達することが可能になるが、これは、制限されたゲノムサイズを有するビリオン、例えばＡＡＶでは不可能である。したがって、本開示の組換えビリオンは、例えばＡＡＶと比較して、より大きな導入遺伝子の送達を促進するのみでなく、ＧＳＨ配列の共送達を可能にすることによって導入遺伝子の安全な送達を促進し、宿主細胞に悪影響を与えることなく、導入遺伝子の予測可能な発現が確実に行われる。導入遺伝子を付加する標的とされた典型的なＧＳＨとしては、（ｉ）アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、染色体１９上のＡＡＶウイルスＤＮＡの組み込みの天然に存在する非生殖細胞系部位；（ｉｉ）ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、ＨＩＶ－１補助受容体として知られるケモカイン受容体遺伝子；（ｉｉｉ）マウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログ、遍在的に発現する導入遺伝子の挿入について、マウス環境において、広く検証されている遺伝子座；及び（ｉｖ）マウス細胞中のアルブミンが挙げられる（例えば、米国特許第７，９５１，９２５号；同第８，７７１，９８５号；同第８，１１０，３７９号；及び同第７，９５１，９２５号；米国特許公開第２０１０／０２１８２６４号；同第２０１１／０２６５１９８号；同第２０１３／０１３７１０４号；同第２０１３／０１２２５９１号；同第２０１３／０１７７９８３号；同第２０１３／０１７７９６０号；同第２０１５／００５６７０５号及び同第２０１５／０１５９１７２号を参照のこと；これらはすべて参照により組み込まれる）。さらなるＧＳＨとしては、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １（ＨＩ １遺伝子座の核酸をコードするチミジンキナーゼ）、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ＮＵＰＬ２またはその遺伝子間領域、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、ＲＮＦ３８または本明細書に記載のゲノムセーフハーバーの基準を満たす遺伝子座が挙げられる（例えば、ＷＯ２０１９／１６９２３３Ａ１、ＷＯ２０１７／０７９６７３Ａ１；参照により組み込まれる）。これらのＧＳＨは、本明細書に記載の組換えビリオンと共に使用できるＧＳＨの非限定的な表現を提供する。本開示は、当技術分野で知られている任意のＧＳＨの使用を意図している。

【0121】

いくつかの実施形態では、ＧＳＨは、制限されたオフターゲット活性及び最小限の遺伝子毒性のリスクを有するか、または外来ＤＮＡの組み込み時に挿入性腫瘍形成を引き起こす安全で標的化された遺伝子送達を可能にする一方で、オフターゲット活性が最小限である高度に特異的なヌクレアーゼにアクセス可能である。

【0122】

いくつかの実施形態では、ＧＳＨは、以下の特性のうちの任意の１つ以上を有する：（ｉ）遺伝子転写ユニットの外側にある；（ｉｉ）任意の遺伝子の５’末端から５～５０キロベース（ｋｂ）離れた位置にある；（ｉｉｉ）がん関連遺伝子から５～３００ｋｂ離れた位置にある；（ｉｖ）任意の特定されたマイクロＲＮＡから５～３００ｋｂ離れた位置にある；（ｖ）超保存領域及び長いノンコーディングＲＮＡの外側にある。いくつかの実施形態では、ＧＳＨ遺伝子座は、以下の特性のうちの任意の１つ以上を有する：（ｉ）遺伝子転写ユニットの外側にある；（ｉｉ）任意の遺伝子の５’末端から５０キロベース（ｋｂ）を超える位置にある；（ｉｉｉ）がん関連遺伝子から３００ｋｂを超える位置にある；（ｉｖ）任意の同定されたマイクロＲＮＡから３００ｋｂを超える位置にある；（ｖ）超保存領域及び長い非コードＲＮＡの外側にある。形質導入により導入された多能性幹細胞におけるレンチウイルスベクターの組み込みの試験では、５，０００を超える組み込み部位の分析により、組み込みの約１７％がセーフハーバー中で生じたことが明らかになった。これらのセーフハーバーに組み込まれたベクターは、内因性遺伝子の発現を混乱させることなく、これらの導入遺伝子から治療レベルのβーグロビンを発現することができた。

【0123】

いくつかの実施形態では、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１である。ＡＡＶＳ１は、１９番染色体上のアデノ随伴ウイルス共通組み込み部位として同定され、１９番染色体（位置ｌ９ｑｌ３．４２）内に位置し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＡＶに感染した培養ヒト細胞株のゲノム中での野生型ＡＡＶの組み込みの繰り返し回復された部位として主に同定された。ＡＡＶＳ１遺伝子座への組み込みは、明確に描写されていない機能を有するタンパク質をコードする遺伝子ホスファターゼ１調節サブユニット１２Ｃ（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ；ＭＢＳ８５としても知られる）を中断する。ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの一方または両方の対立遺伝子を破壊した場合の生物への影響は、現在のところ不明である。ＡＡＶＳ１を標的とする導入遺伝子を保有するヒト及びマウスの多能性幹細胞では、全体的な異常または分化欠損は、観察されなかった。もともと、ＡＡＶＳ１部位へのＡＡＶ ＤＮＡの組み込みは、Ｒｅｐ依存性であったが、標的対立遺伝子の機能を保存し、非標的細胞中のレベルと同等のレベルで、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの発現を維持した、標的化に利用できる市販のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬がある。ＡＡＶＳ１はまた、ｉＰＳＣまたはＣＤ３４＋細胞へのＺＦＮ媒介組換えを使用して評価した。

【0124】

最初に特徴付けられたように、ＡＡＶＳ１遺伝子座は、４ｋｂ超であり、染色体１９ヌクレオチド５５，１ １３，８７３～５５，１ １７，９８３（ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）として同定され、プロテインホスファターゼ１調節サブユニット１２ＣをコードするＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のエクソン１と重複する。この４ｋｂを超える領域は、Ｇ＋Ｃヌクレオチド含有量が非常に豊富であり、特に遺伝子が豊富な１９番染色体の遺伝子リッチ領域である（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｓ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２；１２；５１－５８の図１Ａを参照）。いくつかの組み込まれたプロモーターは、実際に隣接する遺伝子を活性化またはシス活性化することができるが、異なる組織での結果は、現在は不明である。ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃエクソン１の５’非翻訳領域には、既知の配列内に示されたＤＮＡ合成の機能的なＡＡＶ起点が含まれている（Ｕｒｃｅｌａｙ ｅｔ ａｌ．１９９５）。

【0125】

ＡＡＶＳ１ ＧＳＨは、潜伏感染したヒト細胞株のＡＡＶプロウイルス構造を、潜伏感染したクローン細胞株（Ｄｅｔｒｏｉｔ ６クローン７３７４ ＩＩＩＤ５）から生成された組換えバクテリオファージゲノムライブラリーにより特徴付けることによって同定し（Ｋｏｔｉｎ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ １９８９）、Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌは、プロウイルスに隣接する非ウイルス細胞ＤＮＡを単離し、「左」及び「右」隣接ＤＮＡフラグメントのサブセットをプローブとして使用して、独立して誘導された潜伏感染したクローン細胞株のパネルをスクリーニングした。クローン単離株の約７０％で、ＡＡＶ ＤＮＡが細胞特異的プローブにより検出された（Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９０）。組み込み前部位の配列分析により、ＡＡＶ逆方向末端反復の一部とほぼ相同であることが確認された（Ｋｏｔｉｎ、Ｌｉｎｄｅｎ、及びＢｅｅｒｎｓ １９９２）。特徴的な中断されたパリンドロームを欠いているが、ＡＡＶＳ１遺伝子座は、ＡＡＶ ＩＴＲに相同なＲｅｐ結合エレメント及び末端分解部位を保持していた（図１Ａ）。

【0126】

外来ＤＮＡの挿入及び発現は、内在性遺伝子の発現を破壊する可能性が高いため、エクソン組み込み部位の選択は非自明であり、おそらく直観に反するものである。明らかに、この遺伝子座へのＡＡＶゲノムの挿入は、細胞の生存率またはｉＰＳＣ分化に悪影響を与えない（ＤｅＫｅｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１１）。ＡＡＶＳ１遺伝子座は、高度に保存されたＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子の５’ＵＴＲ内にある。ＤＮＡ合成のＲｅｐ依存性最小起点は、ヒト、チンパンジー及びゴリラのＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子の５’ＵＴＲ内に保存されている。しかし、ＤＮＡをＡＡＶＳ１に組み込むために使用される市販のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬は、エクソンではなくＰＰＰ１Ｒ１２Ｃイントロン１を標的にする。

【0127】

いくつかの実施形態は、ＧＳＨは、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ＮＵＰＬ２の遺伝子間領域、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、及びＲＮＦ３８のうちのいずれか１つである。

【0128】

いくつかの実施形態では、ＧＳＨは、Ｐａｘ５遺伝子遺伝子（Ｐａｉｒｅｄ Ｂｏｘ５、または「Ｂ細胞系統特異的アクチベータータンパク質」、またはＢＳＡＰとしても知られる）である。ヒトでは、ＰＡＸ５は、染色体９の９ｐ１３．２に位置し、ヒト、チンパンジー、マカク、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、フクロネズミ、カモノハシ、ニワトリ、トカゲ、ツメガエル、Ｃ．線虫、ショウジョウバエ、及びゼブラフィッシュなど、多くの脊椎動物種におけるオルソログを有する。ＰＡＸ５遺伝子は、第９染色体：３６，８３３，２７５～３７，０３４，１８５逆鎖（ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６７ｌ．２）またはＧＲＣｈ３７座標で３６，８３３，２７２～３７，０３４，１８２に位置する。

【0129】

追加の例示的なＧＳＨを表３Ａ及び表３Ｂに列挙する。

【表3A】

【表3B-1】

【表3B-2】

【0130】

標的ゲノムへの組み込み
標的ゲノムへの組み込みは、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの細胞プロセスによって駆動され得る。組み込みはまた、外因的に導入されたヌクレアーゼによって開始及び／または促進され得る。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組換えビリオン内にパッケージングされた核酸は、ゲノム内の特定の遺伝子座、例えばＧＳＨに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＧＳＨは、所望のレベルの導入遺伝子コードタンパク質またはノンコーディングＲＮＡをもたらすのに十分な導入遺伝子発現を可能にする任意の遺伝子座である。また、ＧＳＨは、細胞が悪性転換しやすくなる、または正常な細胞機能を著しく変化させるはずはない。ＧＳＨへの部位特異的組み込みは、組み込まれる核酸に対して５’及び３’に配置されたＧＳＨに相同な核酸によって媒介され得る。そのような相同なドナー配列は、所望の遺伝子座での組み込みを可能にする相同依存性修復のための鋳型を提供し得る。

【0131】

好ましい実施形態では、本明細書に記載の組換えビリオンは、標的細胞のゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）の核酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である核酸配列を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＨと少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である当該核酸は、組み込まれる核酸の５’及び３’（相同性アーム）に配置され、それにより相同組換えによる標的ゲノム内の特定の遺伝子座への（相同性アーム間に位置する核酸の）挿入が可能になる。いくつかの実施形態では、組み込まれる核酸は、本明細書に記載のプロモーターに作動可能に連結された核酸のいずれか１つである。いくつかの実施形態は、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、ＮＵＰＬ２の遺伝子間領域、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １（ＨＩ １遺伝子座のチミジンキナーゼをコードする核酸）、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、またはＲＮＦ３８である。いくつかの実施形態では、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、またはＮＵＰＬ２の遺伝子間領域である。

【0132】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンの核酸は、形質導入時に、標的細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、核酸は、ＧＳＨまたはＥＶＥに組み込まれる。いくつかの実施形態は、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、ＮＵＰＬ２の遺伝子間領域、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １（ＨＩ １遺伝子座のチミジンキナーゼをコードする核酸）、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、またはＲＮＦ３８である。いくつかの実施形態では、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、またはＮＵＰＬ２の遺伝子間領域である。いくつかの実施形態では、核酸は、相同組換え、及びその後の外因的に導入されたヌクレアーゼによって誘導されるＤＮＡ破断形成によって標的ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアント）である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと複合体を形成している。

【0133】

特定の態様では、異種核酸を細胞内のＧＳＨに組み込む方法が本明細書に提供され、本方法は、（ａ）標的ＧＳＨ核酸と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるドナー核酸配列が５’末端及び３’末端で隣接する異種核酸を含む、本明細書に記載の１つ以上のビリオンを細胞に形質導入することと；または（ｂ）本明細書に記載される１つ以上のビリオンを細胞に形質導入することであって、ビリオンが、（ｉ）標的ＧＳＨ核酸と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるドナー核酸配列が５’末端及び３’末端で隣接する異種核酸、及び（ｉｉ）ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアント、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ）及び／またはガイドＲＮＡをコードする核酸であって、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ複合体は、ＧＳＨにおいてＤＮＡ破断を行い（これは、ドナー核酸を使用して修復される）、これにより、ＧＳＨにおいて異種核酸を組み込む、核酸、を含む、形質導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）標的ＧＳＨ核酸と少なくと約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるドナー核酸が隣接する異種核酸、及び（ｉｉ）ヌクレアーゼをコードする核酸及び／またはｇＲＮＡは、別個のビリオンに形質導入される。いくつかの実施形態は、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、ＮＵＰＬ２の遺伝子間領域、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １（ＨＩ １遺伝子座のチミジンキナーゼをコードする核酸）、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、またはＲＮＦ３８である。いくつかの実施形態では、ＧＳＨは、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、またはＮＵＰＬ２の遺伝子間領域である。

【0134】

５’相同性アームと３’相同性アームとの間に位置する核酸の組み込みのために、５’相同性アーム及び３’相同性アームは、ＧＳＨを標的とし、相同組換えによるゲノムへの組み込み（例えば、ガイド）を可能にするのに十分な長さである必要がある。正確な位置での組み込みの可能性を高め、相同組換えの確率を高めるために、５’及び３’相同性アームは、十分な数の核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、５’及び３’相同性アームは、少なくとも１０塩基対で、５，０００塩基対以下、少なくとも５０塩基対で、５，０００塩基対以下、少なくとも１００塩基対で、５，０００塩基対以下、少なくとも２００塩基対で、５，０００塩基対以下、少なくとも２５０塩基対で、５，０００塩基対以下、または少なくとも３００塩基対で、５，０００塩基対以下を含み得る。いくつかの実施形態では、５’及び３’相同性アームは、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、または５００塩基対を含む。相同性アームの長さ及び組換え頻度に関する詳細な情報は当技術分野で知られており、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｅｃｉｓｅ ｋｎｏｃｋ ｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｄｏｕｂｌｅ ｃｕｔ ＨＤＲ ｄｏｎｏｒ ａｆｔｅｒ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ”Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ １８．１（２０１７）：３５を参照、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0135】

５’及び３’相同性アームは、宿主細胞のゲノム中のＧＳＨ標的配列と相同である任意の配列であり得る。いくつかの実施形態では、５’及び３’相同性アームは、本明細書に記載のＧＳＨの部分と相同であり得る。さらに、５’及び３’相同性アームは、ノンコーディングヌクレオチド配列またはコーディングヌクレオチド配列であり得る。

【0136】

いくつかの実施形態では、５’及び／または３’相同性アームは、染色体上の組み込みまたはＤＮＡ切断部位のすぐ上流及び／または下流の配列と相同であり得る。あるいは、５’及び／または３’相同性アームは、組み込みまたはＤＮＡ切断部位から離れている、例えば組み込み部位またはＤＮＡ切断部位から少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００もしくはそれ以上の塩基対など離れている配列と相同であり得るか、またはＤＮＡ切断部位と部分的または完全に重複している（例えば、外因的に導入されたヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ破断であり得る）配列と相同であり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の３’相同性アームは、ＩＴＲに近位である。

【0137】

遺伝子編集システム
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物を使用して、本明細書に記載の組換えビリオンによって送達された核酸を、標的ゲノム内の任意の特定の遺伝子座（例えば、ＧＳＨ）に組み込む。いくつかの実施形態では、組み込みは、外因的に導入されたヌクレアーゼによって開始及び／または促進され、ヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ破断は、相同組換えのためのガイドとして相同性アームを使用して修復され、それによって、当該相同性アームが隣接した核酸が標的ゲノムに挿入される。

【0138】

例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの部位特異的ヌクレアーゼによって、二本鎖切断（ＤＳＢ）を創出させ得る。例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６－５１；米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号を参照のこと；これらの開示は、参照により組み込まれる。

【0139】

別のヌクレアーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとして知られる細菌及び古細菌中に見られる、いわゆる獲得免疫系の使用を伴う。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細菌の４０％及び古細菌の９０％中に見られ、システムの複雑さが異なる。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号を参照のこと。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復配列）は、生物のゲノム内の領域であり、外来ＤＮＡの短いセグメントが、短い反復回文配列の間に組み込まれている。これらの遺伝子座は転写され、ＲＮＡ転写産物（「ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ」）は、短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには３つのタイプがあり、いずれもこれらのＲＮＡ及び「Ｃａｓ」タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連）として知られるタンパク質を組み込んでいる。Ｉ型及びＩＩＩ型はいずれもｐｒｅ－ｃｒＲＮＡをプロセシングするＣａｓエンドヌクレアーゼを保有し、完全にプロセシングされてｃｒＲＮＡになると、ｃｒＲＮＡに相補的な核酸を切断できるマルチＣａｓタンパク質複合体が組み立てられる。

【0140】

タイプＩＩシステムでは、ｃｒＲＮＡは、異なるメカニズムを使用して産生され、このメカニズムでは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ中の反復配列に相補的なトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が、Ｃａｓ９タンパク質またはそのバリアントの存在下で、二本鎖特異的ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるプロセシングを引き起こす。その後、Ｃａｓ９は、成熟ｃｒＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡを切断できるが、Ｃａｓ９による切断は、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対形成と、ＰＡＭ配列（プロトスペーサー隣接モチーフ）と呼ばれるｃｒＲＮＡ中の短いモチーフの存在の両方に依存する（Ｑｉ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｃｅｌｌ １５２：１１７３を参照）。さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端で、ｃｒＲＮＡと塩基対を形成するため、存在する必要があり、この結合が、Ｃａｓ９の活性を引き起こす。

【0141】

Ｃａｓ９タンパク質には、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインがある。１つのヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと同様であり、もう１つは、Ｒｕｖエンドヌクレアーゼドメインに類似している。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の切断に関与していると考えられるが、Ｒｕｖドメインは、非相補鎖を切断する。Ｃａｓ９のバリアントは、オフターゲット活性を低下させるＣａｓ９ニッカーゼ変異体（例えば、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ １５４（６）：１３８０－１３８９を参照）、ｎＣａｓ、Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａなど、当業者により認識されている。

【0142】

ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要性は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む、操作された「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）を使用することで回避できる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６及びＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３）を参照）。したがって、外因的に導入されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアント）及びガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）は、標的細胞のゲノム内の特定の遺伝子座において、ＤＮＡ破断を誘導することができる。標的化に好適であるシングルガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）配列の非限定的な例は、米国出願２０１５／００５６７０５の表１に示され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡは、表３Ａ及び表３Ｂのものなど、本明細書に記載のＧＳＨ遺伝子座の配列を含み得る。

【0143】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集核酸配列は、配列特異的ヌクレアーゼ、１つまた以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子編集核酸分子をコードする。いくつかの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、ＴＡＬヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質、例えば、ＣＡＳ１～９、Ｃｓｙ、Ｃｓｅ、Ｃｐｆｌ、Ｃｍｒ、Ｃｓｘ、Ｃｓｆ、ｃｐｆｌ、ｎＣＡＳなど）を含む。これらの遺伝子編集システムは、当業者に知られている。例えば、ＴＡＬＥＮＳは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３８５３６、及び米国特許公開第２０１７－０１９１０７８－Ａ９に記載されており、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ ｃａｓ９システムは、当技術分野で知られており、２０１３年３月に出願された米国特許出願第１３／８４２，８５９号、及び米国特許第８，６９７，３５９号、同第８７７１，９４５号、同第８７９５，９６５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８７１，４４５号に記載されている。本明細書に記載の組換えビリオンは、ＣＲＩＳＰＲｉまたはＣＲＩＳＰＲａ ｄＣａｓ系、ｎＣａｓ、またはＣａｓ１３系などの不活性化ヌクレアーゼシステムにも有用である。

【0144】

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、選択されたゲノム標的配列に対するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体の配列特異的標的化に向けるために、標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列、及び例えば、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成することができるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に結合する。

【0145】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列は、ｇＲＮＡ配列をゲノム内の所望の部位に向けて、ガイド配列とＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼとの会合を可能にするｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列に融合させるターゲティング配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以上である。最適なアライメントは、配列を整列させるための適切なアルゴリズム、例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムのほか、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ （Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ、及びＭａｑを使用して、決定可能である。

【0146】

ガイド配列は、任意の標的配列を標的とするように選択できる。いくつかの実施形態では、標的配列は、本明細書に開示されるとおり、細胞のゲノム内またはＧＳＨ内の配列である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列のいずれかの鎖に相補的であり得る。当業者は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼによる標的切断の目的のために、ゲノム中において固有である標的配列が、ゲノム中に２回以上生じる標的配列よりも好ましいことを理解する。バイオインフォマティクスソフトウェアを使用して、ガイドＲＮＡのオフターゲット効果を予測し、最小限に抑えることができる（例えば、以下を参照：Ｎａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．“ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ：ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４），ｅｐｕｂ；Ｈｅｉｇｗｅｒ ｅｔ ａｌ．“Ｅ－ＣＲＩＳＰ：ｆａｓｔ ＣＲＩＳＰＲ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：１２２－１２３（２０１４）；Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．“Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ： ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｈａｔ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｃａｓ９ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０（１０）：１４７３－１４７５（２０１４）；Ａａｃｈ ｅｔ ａｌ．“ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ”ＢｉｏＲｘｉｖ（２０１４））。

【0147】

一般に、「ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ融合配列」という用語は、本明細書で使用される場合、固有のターゲティング配列に融合され、ガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを含む複合体の形成を可能にするように機能する核酸配列を指す。このような配列は、（ｉ）本明細書に記載の標的配列に対応する「プロトスペーサー」と呼ばれる可変配列、及び（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ反復を含む原核生物中のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列をモデルにすることができる。同様に、融合体のｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）部分は、エンドヌクレアーゼ複合体の形成を可能にするために、原核生物中におけるｔｒａｃｒＲＮＡ配列と同様の二次構造（例えば、ヘアピン）を含むように設計することができる。いくつかの実施形態では、１つの転写産物は、ポリＴ配列などの転写終結配列、例えば６つのＴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ分子を含むことができ、本明細書では「二重ガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含み得る。第１及び第２のＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ上のフラグポールとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成を介して、ＲＮＡ二本鎖を形成し得る。ｄｇＲＮＡを使用する場合、フラグポールの長さに上限はない。

【0148】

他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１つのＲＮＡ分子を含むことができ、本明細書では「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに共有結合により連結したｃｒＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合により連結され得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ上のフラグポールとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対合を介してステムループ構造を含むことができる。いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡは、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、またはそれ以上のヌクレオチド長（例えば、７５～１２０、７５～１１０、７５～１００、７５～９０、７５～８０、８０～１２０、８０～１１０、８０～１００、８０～９０、８５～１２０、８５～１１０、８５～１００、８５～９０、９０～１２０、９０～１１０、９０～１００、１００～１２０、１００～１２０ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、目的の核酸をＧＳＨ遺伝子座に組み込むための本明細書に記載の核酸ベクター、またはその組成物は、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸を含む。例えば、第２のポリヌクレオチド配列は、１ｇＲＮＡ～５０ｇＲＮＡ、または１～５０までの任意の整数をコードし得る。異なるｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列の各々は、プロモーターに作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、異なるｇＲＮＡに作動可能に連結されたプロモーターは、同じプロモーターであってもよい。異なるｇＲＮＡに作動可能に連結されるプロモーターは、異なるプロモーターであってもよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節性プロモーターであり得る。

【0149】

いくつかの実施形態では、ＧＳＨ遺伝子座への組み込みのための核酸がＣａｓニッカーゼ（ｎＣａｓ；例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼまたはＣａｓ９－Ｄ１０Ａ）をコードするか、または当該核酸を含む組換えビリオンが、Ｃａｓニッカーゼ（ｎＣａｓ；例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼまたはＣａｓ９－Ｄ１０Ａ）をコードする核酸を含む別のビリオンと共に投与される。そのようなｎＣａｓ酵素は、本明細書に記載のＧＳＨとの相同性を含むガイドＲＮＡと併せて使用され、例えば、物理的に拘束された配列を解放するため、またはねじり解放を提供するために使用できることが本明細書で企図される。物理的に拘束された配列の解放は、例えば、ゲノム配列との相互作用のために相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型相同性アーム（複数可）が露出されるように、ベクターを「ほどく」ことができる。

【0150】

いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、所望の核酸の組み込みを促進するＤＮＡ破断を誘導する。本明細書で交換可能に使用される「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」は、完全に組み立てられたときにＤＮＡを切断することができる少なくとも１つのヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの一部に効率よく連結された少なくとも１つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質分子を指す。本明細書で使用される「ジンクフィンガー」は、ＤＮＡ配列を認識して結合するタンパク質構造を指す。ジンクフィンガードメインは、ヒトプロテオームで最も一般的なＤＮＡ結合モチーフである。１つのジンクフィンガーには、約３０のアミノ酸が含まれており、ドメインは典型的には、塩基対ごとに１つのアミノ酸側鎖の相互作用を介してＤＮＡの３つの連続塩基対に結合することによって機能する。

【0151】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み込みのための核酸は、例えばＰｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｒｅｓｃｕｅｓ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｏｆ ａ Ｃｒｉｇｌｅｒ－Ｎａｊｊａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ，ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，（２０１７）に記載されているように、ヌクレアーゼを含まない相同依存性修復系で標的ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子ターゲティングアプローチは、ヌクレアーゼを使用しないドナー配列の挿入に好適である。いくつかの実施形態では、ドナー配列は、プロモーターレスであってもよい。

【0152】

いくつかの実施形態では、制限部位間に位置するヌクレアーゼは、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであり得る。本明細書で使用される用語「ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ」は、選択された標的ＤＮＡ配列に相補的な領域を含むＲＮＡ分子と複合体を形成するエンドヌクレアーゼを指し、これにより、ＲＮＡ分子が、選択された配列に結合して、本明細書で同定されるＧＳＨ中の選択された標的ＤＮＡ配列に対してエンドヌクレアーゼ活性を向けるようになる。

【0153】

ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステム
当該分野で認識され、上記で説明されているように、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムは、生物の遺伝子配列を改変することができるタンパク質及びリボ核酸（「ＲＮＡ」）の組み合わせを含む（例えば、米国公開第２０１４／０１７０７５３号を参照）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、哺乳動物細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換えを介したＣａｓ９媒介ゲノム編集のための一連のツールを提供する。当業者は、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型など、複数の既知のＣＲＩＳＰＲシステムから選択することができる。いくつかの実施形態では、目的の核酸をＧＳＨ遺伝子座に組み込むための本明細書に記載の核酸は、ガイドＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアント）など、これらのシステムの１つ以上のコンポーネントをコードする配列を含むように設計され得る。特定の実施形態では、１つのプロモーターが、ガイド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡの発現を駆動し、別個のプロモーターがＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアント）の発現を駆動する。当業者は、特定のＣａｓヌクレアーゼが、標的核酸配列に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在を必要とすることを理解するであろう。

【0154】

Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアント）を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼは、本明細書に記載の組換えビリオンによって送達される核酸の組み込みを開始する及び／または促進するのに好適である。ガイドＲＮＡは、ＤＮＡの同じ鎖または相補鎖に向けることができる。

【0155】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、宿主細胞にＣＲＩＳＰＲｉ（ＣＲＩＳＰＲ干渉）及び／またはＣＲＩＳＰＲａ（ＣＲＩＳＰＲ活性化）システムを含むことができる、及び／またはこれらのシステムを送達するために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲｉ及びＣＲＩＳＰＲａシステムは、二本鎖破断（ＤＳＢ）を生成することができない不活性化ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアント）を含む。これにより、エンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと組み合わせて、ゲノム内の標的配列に特異的に結合し、ＲＮＡ指向性可逆的転写制御を提供する。

【0156】

したがって、いくつかの実施形態では、目的の核酸をＧＳＨ遺伝子座に組み込むための本明細書に記載の核酸組成物及び方法は、不活性化されたエンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及び／またはＣａｓ９もしくはそのバリアントを含むことができ、不活性化されたエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性を欠いているが、例えば１つ以上のガイドＲＮＡ及び／またはｓｇＲＮＡと組み合わせて、部位特異的方法でＤＮＡに結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、不活性化エンドヌクレアーゼは、転写活性化ドメインをさらに含むことができる。

【0157】

いくつかの実施形態では、目的の核酸をＧＳＨ遺伝子座に組み込むための本明細書に記載の核酸組成物及び方法は、ハイブリッドリコンビナーゼを含むことができる。例えば、Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーまたはＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したセリンリコンビナーゼのリゾルバーゼ／インベルターゼファミリーに由来する活性化触媒ドメインをベースにしたハイブリッドリコンビナーゼは、哺乳動物細胞におけるターゲティング特異性を改善すること、及び優れた部位特異的組み込み率を達成できる任意のクラスの試薬である。好適なハイブリッドリコンビナーゼとしては、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ －Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｄｉｍｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｒｅｄｅｓｉｇｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，（２０１４）に記載のものが挙げられる。

【0158】

本明細書に記載のヌクレアーゼは、改変することができ、例えば、配列特異的ヌクレアーゼを設計するように操作することができる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号を参照）。ヌクレアーゼは、以下に記載の方法を用いて設計することができる：例えばＣｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３－９７５；米国特許第８，３０４，２２２号；同第８，０２１，８６７号；同第８，１１９，３８１号；同第８，１２４，３６９号；同第８，１２９，１３４号；同第８，１３３，６９７号；同第８，１４３，０１５号；同第８，１４３，０１６号；同第８，１４８，０９８号；または同第８，１６３，５１４号、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。あるいは、部位特異的な切断特性を有するヌクレアーゼは、市販の技術、例えばＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓのＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を使用して得ることができる。

【0159】

ＭＥＧＡＴＡＬ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヌクレアーゼは、ｍｅｇａＴＡＬであり得る。ＭｅｇａＴＡＬは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタードメイン及びメガヌクレアーゼドメインを含む遺伝子操作された融合タンパク質である。ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬの標的特異性操作の容易さを保持しながら、オフターゲット効果及び全体的な酵素サイズを減少させ、活性を高める。ＭｅｇａＴＡＬの構築及び使用は、例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（４）：２５９ｌ－６０ｌ及びＢｏｉｓｓｅｌ ２０１５ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １２３９：１７１－１９６に詳細に記載されている。ｍｅｇａＴＡＬ媒介遺伝子ノックアウト及び遺伝子編集のためのプロトコールは、当技術分野で公知である。例えば、Ｓａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１５ ７（３０７）：ｒａｌ５６及びＢｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（４）：２５９ｌ－６０ｌを参照されたい。ＭｅｇａＴＡＬは、本明細書に記載の方法及び組成物のいずれにおいても代替エンドヌクレアーゼとして使用することができる。

【0160】

マーカー／レポーター遺伝子
例示的なマーカー遺伝子には、生物発光レポーター遺伝子と同様に、蛍光レポーター遺伝子、例えばＧＦＰ、ＲＦＰなどのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。例示的なマーカー遺伝子としては、これらに限定されないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰｌ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ １、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６ｌ １、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。

【0161】

マーカー遺伝子には、これらに限定されないが、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該分野でよく知られている他のものをコードするＤＮＡ配列も挙げられる。レポーター配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントと結合すると、酵素、放射線、比色分析、蛍光または他の分光学的アッセイ、蛍光活性化セルソーティングアッセイのほかに、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫組織化学など、従来の手段で検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列が、ＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを運ぶベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性のアッセイによって検出される。いくつかの実施形態では、マーカー遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを運ぶベクターは、ルミノメーターにおける可視光吸光度または光生成にそれぞれ基づいて比色的に測定され得る。そのようなレポーターは、例えば、核酸の組織特異的ターゲティング能力及び組織特異的プロモーター調節活性を検証するのに有用であり得る。

【0162】

マーカー遺伝子としては、これらに限定されないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色タンパク質、蛍光タンパク質、または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、及び細胞代謝を媒介し、その結果細胞成長速度及び／または遺伝子増幅を増強するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）が挙げられる。

【0163】

核酸
ノンコーディングＲＮＡ＆コーディングＲＮＡ
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、受容体、毒素、ホルモン、酵素、マーカー遺伝子によってコードされるマーカータンパク質（上記参照）、または細胞表面タンパク質もしくは治療用タンパク質、ペプチドもしくは抗体もしくはそれらのフラグメントをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクター組成物中で使用するための目的の核酸は、細胞内での発現が望まれる任意のポリペプチド、例えば、これに限定されないが、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、成長因子、及び上記のいずれかの機能的フラグメントなどをコードする。

【0164】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えビリオン中で使用するための目的の核酸は、本明細書に記載の疾患のいずれかを含むがこれらに限定されない疾患を有する対象において欠失しているかまたは非機能的であるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、疾患は、遺伝性疾患である。

【0165】

いくつかの態様において、本明細書で定義される目的の核酸は、哺乳動物における１つ以上の遺伝的欠陥または機能障害、例えば、哺乳動物におけるポリペプチド欠乏またはポリペプチド過剰（例えば、哺乳動物におけるポリペプチド欠損またはポリペプチド過剰）を予防または治療する、特に細胞及び組織におけるそのようなポリペプチドの欠損に関連する障害のうちの１つ以上を呈しているヒトにおける欠損の重症度または程度を予防する、治療する、または軽減するための方法において使用するための核酸をコードする。この方法は、好ましくは、薬学的に許容される組成物中、本明細書に記載の組換えビリオンにパッケージされた１つ以上の治療用ペプチド、ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチドなどをコードする目的の核酸（例えば、本開示によって記載される核酸）を、そのような障害に罹患している対象の欠損または障害を予防または治療するのに十分な量及び期間で、対象に投与することを含む。

【0166】

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクター組成物中で使用するための目的の核酸は、哺乳動物対象における疾患の治療または予防に有用な、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードすることができる。

【0167】

本明細書に開示される組成物及び方法中で使用するための例示的な目的の核酸としては、これらに限定されないが、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ－ＳＣＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ゴナドトロピン、ＩＦＮ、ＩＦＧ－１、Ｍ－ＣＳＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＥＤＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－Ｂ２、ＴＮＦ、プロラクチン、ソマトトロピン、ＸＩＡＰ１、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０（１８７Ａ）、ウイルス性ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＳＤＦ－１、コネキシン４０、コネキシン４３、ＳＣＮ４ａ、ＨＩＦｉａ、ＳＥＲＣａ２ａ、ＡＤＣＹｌ、及びＡＤＣＹ６が挙げられる。

【0168】

いくつかの実施形態では、核酸は、以下からなる群から選択されるコード配列またはそのフラグメントを含み得る：哺乳動物のβグロビン遺伝子（例えば、ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、及び／またはＨＢＺ）、αヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、クルッペル様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、Ｆ８またはその断片（例えば、Ｂドメイン欠失ポリペプチドをコードする断片（例えば、ＶＩＩＩ ＳＱ、ｐ－ＶＩＩＩ））、サーファクタントプロテインＢ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡ Ｂ遺伝子、ＨＬＡ Ｃ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原プロセシングに関連するトランスポーター（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター（ＣＵＴ Ａ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、糖質コルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、ＺＰ１５遺伝子、ＫＡＳＩＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子、及び／またはＥＰＳＰＳ遺伝子。

【0169】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えビリオン中で使用する目的の核酸を使用して、対象において発現が低下している、サイレンシングされている、またはそうでなければ機能不全である遺伝子の発現を回復させることができる。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えビリオン中で使用するための目的の核酸は、対象において異常に発現する遺伝子の発現をノックダウンするために使用することもできる。

【0170】

いくつかの実施形態では、機能不全遺伝子は、がんを有する対象においてサイレンシングされた腫瘍抑制因子である。いくつかの実施形態では、機能不全遺伝子は、がんを有する対象において異常に発現するがん遺伝子である。がんに関連する例示的な遺伝子（がん遺伝子及びがん抑制因子）としては、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＡＡＲＳ、ＡＢＣＢ １、ＡＢＣＣ４、ＡＢＩ２、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＫ１、ＡＣＰ２、ＡＣＹ１、ＡＤＳＬ、ＡＫ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＡＫＴ１、ＡＬＢ、ＡＮＰＥＰ、ＡＮＸＡＳ、ＡＮＸＡ７、ＡＰ２Ｍｌ、ＡＰＣ、ＡＲＨＧＡＰＳ、ＡＲＨＧＥＦＳ、ＡＲＩＤ４Ａ、ＡＳＮＳ、ＡＴＦ４、ＡＴＭ、ＡＴＰＳＢ、ＡＴＰＳＯ、ＡＸＬ、ＢＡＲＤ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＢＨＬＨＢ２、ＢＬＭＨ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＴＫ、ＣＡＮＸ、ＣＡＰ１、ＣＡＰＮ１、ＣＡＰＮＳ１、ＣＡＶ１、ＣＢＦＢ、ＣＢＬＢ、ＣＣＬ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＴＳ、ＣＣＹＲ６１、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ２５、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＤＣ２ＬＳ、ＣＤＫ１０、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ９、ＣＤＫＬ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｄ、ＣＥＢＰＧ、ＣＥＮＰＣ１、ＣＧＲＲＦ１、ＣＨＡＦ１Ａ、ＣＩＢ１、ＣＫＭＴ１、ＣＬＫ１、ＣＬＫ２、ＣＬＫ３、ＣＬＮＳ１Ａ、ＣＬＴＣ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＯＸ７Ａ２、ＣＲＡＴ、ＣＲＨＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＫ、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＣＴＮＮＡ１、ＣＴＮＮＢ１、ＣＴＰＳ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＣＵＬ１、ＣＹＲ６１、ＤＣＣ、ＤＣＮ、ＤＤＸ１０、ＤＥＫ、ＤＨＣＲ７、ＤＨＲＳ２、ＤＨＸ８、ＤＬＧ３、ＤＶＬ１、ＤＶＬ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ５、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＩＦ５、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣＣ３、ＥＴＶ１、ＥＴＶ３、ＥＴＶ６、Ｆ２Ｒ、ＦＡＳＴＫ、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＦＥＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＲ、ＦＫＢＰ８、ＦＮ１、ＦＯＳ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＳＬ２、ＦＯＸＧ１Ａ、ＦＯＸＯ１Ａ、ＦＲＡＰ１、ＦＲＺＢ、ＦＴＬ、ＦＺＤ２、ＦＺＤＳ、ＦＺＤ９、Ｇ２２Ｐ１、ＧＡＳ６、ＧＣＮＳＬ２、ＧＤＦ１Ｓ、ＧＮＡ１３、ＧＮＡＳ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ２Ｌｌ、ＧＰＲ３９、ＧＲＢ２、ＧＳＫ３Ａ、ＧＳＰＴ１、ＧＴＦ２１、ＨＤＡＣ１、ＨＤＧＦ、ＨＭＭＲ、ＨＰＲＴ１、ＨＲＢ、ＨＳＰＡ４、ＨＳＰＡＳ、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＢ１、ＨＳＰＨ１、ＨＹＡＬ１、ＨＹＯＵ１、ＩＣＡＭ１、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤＵＡ、ＩＥＲ３、ＩＦＩＴＭ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰＳ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬＫ、ＩＮＧ１、ＩＲＦ３、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＪＡＫ１、ＪＡＲＩＤ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、Ｋ－ＡＬＰＨＡ－１、ＫＩＴ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＫ１０、ＫＰＮＡ２、ＫＲＡＳ２、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＰ２、ＬＣＫ、ＬＣＮ２、ＬＥＰ、ＬＩＴＡＦ、ＬＲＰＡＰ１、ＬＴＦ、ＬＹＮ、ＬＺＴＲ１、ＭＡＤＨ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ１３、ＭＡＰＫＡＰＫ３、ＭＡＰＲＥ１、ＭＡＲＳ、ＭＡＳ１、ＭＣＣ、ＭＣＭ２、ＭＣＭ４、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＧＳＴ１、ＭＩＣＢ、ＭＬＬＴ３、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ２、ＭＮＤＡ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴ３、ＭＹＢ、ＭＹＢＬ１、ＭＹＢＬ２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＬ９、ＭＹＬＫ、ＮＥＯ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＫＢ Ｉ、ＮＦＫＢ２、ＮＦＳＦ７、ＮＩＤ、ＮＩＮＪ１、ＮＭＢＲ、ＮＭＥ１、ＮＭＥ２、ＮＭＥ３、ＮＯＴＣＨ １、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ４、ＮＰＭ１、ＮＱＯ１、ＮＲｌＤ１、ＮＲ２Ｆｌ、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＳＥＰ１、ＯＳＭ、ＰＡ２Ｇ４、ＰＡＢＰＣ１、ＰＣＮＡ、ＰＣＴＫ１、ＰＣＴＫ２、ＰＣＴＫ３、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＰＫ１、ＰＥＡｌ５、ＰＦＤＮ４、ＰＦＤＮ５、ＰＧＡＭ１、ＰＨＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＭ１、ＰＫＭ２、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＩＨ、ＰＰＰ１ＣＡ、ＰＰＰ２ＲＳＡ、ＰＲＤＸ２、ＰＲＤＸ４、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＢＰ１、ＰＲＮＰ、ＰＲＳＳ１５、ＰＳＭＡ１、ＰＴＣＨ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ１、ＰＴＭＡ、ＰＴＮ、ＰＴＰＲＮ、ＲＡＢＳＡ、ＲＡＣ１、ＲＡＤＳＯ、ＲＡＦ１、ＲＡＬＢＰ１、ＲＡＰ１Ａ、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＲＡＳＧＲＦ１、ＲＢ１、ＲＢＢＰ４、ＲＢＬ２、ＲＥＡ、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＲＥＴ、ＲＦＣ２、ＲＧＳ１９、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ、ＲＨＯＣ、ＲＨＯＤ、ＲＩＰＫ１、ＲＰＮ２、ＲＰＳ６ＫＢ １、ＲＲＭ１、ＳＡＲＳ、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＳＥＰＰ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＦＮ、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＳ７、ＳＨＢ、ＳＨＨ、ＳＩＡＨ２、ＳＩＶＡ、ＳＩＶＡ ＴＰ５３、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１Ａ４、ＳＬＣ２０Ａｌ、ＳＭＯ、ＳＭＰＤ１、ＳＮＡＩ２、ＳＮＤ１、ＳＮＲＰＢ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＳＯＤ１、ＳＯＲＴ１、ＳＰＩＮＴ２、ＳＰＲＹ２、ＳＲＣ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＣ１、ＴＡＦ１、ＴＢＬ３、ＴＢＲＧ４、ＴＣＦ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＴＦＤＰ１、ＴＦＤＰ２、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＢＳ１、ＴＩＥ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、ＴＪＰ１、ＴＫ１、ＴＬＥ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＫ１、ＴＯＢ１、ＴＰ５３、ＴＰ５３ＢＰ２、ＴＰ５３１３、ＴＰ７３、ＴＰＢＧ、ＴＰＴ１、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＭ１、ＴＲＲＡＰ、ＴＳＧ１０１、ＴＵＦＭ、ＴＸＮＲＤ１、ＴＹＲ０３、ＵＢＣ、ＵＢＥ２Ｌ６、ＵＣＨＬ１、ＵＳＰ７、ＶＤＡＣ１、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＶＩＬ２、ＷＥＥ１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴＳＡ、ＷＴ１、ＸＲＣＣ １、ＹＥＳ １、ＹＷＨＡＢ、ＹＷＨＡＺ、ＺＡＰ７０、及びＺＮＦ９。

【0171】

いくつかの実施形態では、機能不全遺伝子は、ＨＢＢである。いくつかの実施形態では、ＨＢＢは、β－グロビン産生を低減または排除する少なくとも１つのナンセンス、フレームシフト、またはスプライシング変異を含む。いくつかの実施形態では、ＨＢＢは、ＨＢＢのプロモーター領域またはポリアデニル化シグナル中に少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、ＨＢＢ変異は、以下のうちの少なくとも１つである：ｃ．１７Ａ＞Ｔ、ｃ．－１３６０Ｇ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋６Ｔ＞Ｃ、ｃ．９３－２１Ｇ＞Ａ、ｃ．１１８０Ｔ、ｃ．３１６－１０６ＯＧ、ｃ．２５＿２６ｄｅｌＡＡ、ｃ．２７＿２８ｉｎｓＧ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．１１８０Ｔ、ｃ．ｌ３５ｄｅｌＣ、ｃ．３１５＋ｌＧ＞Ａ、ｃ．－７８Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ、ｃ．５９Ａ＞Ｇ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．ｌ２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．３１６－１９７０Ｔ、ｃ．－７８Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ、ｃ．ｌ２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．３１６－１９７Ｃ＞Ｔ、Ｃ．－１３８０Ｔ、ｃ．－７９Ａ＞Ｇ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．７５Ｔ＞Ａ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｇ、及びｃ．３１６－２Ａ＞Ｃ。

【0172】

特定の実施形態では、鎌状赤血球症は、抗鎌状赤血球症活性を含む１つ以上の変異を含むＨＢＢバリアントを導入する遺伝子療法（例えば、幹細胞遺伝子療法）によって改善される。いくつかの実施形態では、ＨＢＢバリアントは、二重変異体（βＡＳ２；Ｔ８７Ｑ及びＥ２２Ａ）であってもよい。他の実施形態では、ＨＢＢバリアントは、三重変異βグロビンバリアント（βＡＳ３；Ｔ８７Ｑ、Ｅ２２Ａ、及びＧ１６Ｄ）であってもよい。β１６でのグリシンからアスパラギン酸への修飾は、α鎖への結合に関して鎌状グロビン（βＳ、ＨｂＳ）よりも優れた利点を提供する。β２２でのグルタミン酸からアラニンへの修飾は、α２０ヒスチジンとの軸相互作用を部分的に増強する。これらの修飾により、１つのＴ８７Ｑ修飾バリアントよりも優れた抗鎌状特性が得られ、胎児グロビンに適合する。ＳＣＤマウスモデルでは、βＡＳ３を保有するＳＩＮレンチウイルスを形質導入する骨髄幹細胞の移植により、赤血球の生理機能及びＳＣＤの臨床症状を逆転させた。したがって、このバリアントは、臨床試験でテストされているところである（識別子番号：ＮＣＴ０２２４７８４３）、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１８）２０（７）：８９９－９１０。

【0173】

いくつかの実施形態では、機能不全遺伝子は、ＣＦＴＲである。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲは、ΔＦ５０８、Ｒ５５３Ｘ、Ｒ７４Ｗ、Ｒ６６８Ｃ、Ｓ９７７Ｆ、Ｌ９９７Ｆ、Ｋ１０６０Ｔ、Ａ１０６７Ｔ、Ｒ１０７０Ｑ、Ｒ１０６６Ｈ、Ｔ３３８１、Ｒ３３４Ｗ、Ｇ８５Ｅ、Ａ４６Ｄ、Ｉ３３６Ｋ、Ｈ１０５４Ｄ、Ｍ１Ｖ、Ｅ９２Ｋ、Ｖ５２０Ｆ、Ｈ１０８５Ｒ、Ｒ５６０Ｔ、Ｌ９２７Ｐ、Ｒ５６０Ｓ、Ｎ１３０３Ｋ、Ｍ１１０１Ｋ、Ｌ１０７７Ｐ、Ｒ１０６６Ｍ、Ｒ１０６６Ｃ、Ｌ１０６５Ｐ、Ｙ５６９Ｄ、Ａ５６１Ｅ、Ａ５５９Ｔ、Ｓ４９２Ｆ、Ｌ４６７Ｐ、Ｒ３４７Ｐ、Ｓ３４１Ｐ、Ｉ５０７ｄｅｌ、Ｇ１０６１Ｒ、Ｇ５４２Ｘ、Ｗ１２８２Ｘ、及び２１８４ＩｎｓＡから選択される変異を含む。

【0174】

いくつかの実施形態では、本明細書で定義される目的の核酸は、がんに関連する遺伝子産物（例えば、がん遺伝子）の発現を阻害する低分子干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）をコードし、がんを予防または治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で定義される目的の核酸は、例えば研究目的で、例えばがんを研究するためまたはがんを予防もしくは治療する治療剤を特定するために使用するために、がんに関連する遺伝子産物（またはがんに関連する遺伝子の発現を阻害する機能的ＲＮＡ）をコードする。

【0175】

当業者はまた、目的の核酸が、タンパク質またはポリペプチドの機能的に同等なバリアントまたは相同体を提供し得る保存的アミノ酸置換をもたらす１つ以上の変異を含み得ることを理解する。さらに、本開示では、ドミナントネガティブ変異を有する、本明細書に記載の組換えビリオン中の目的の核酸が企図される。例えば、目的の核酸は、野生型タンパク質と同じエレメントと相互作用し、それによって野生型タンパク質の機能のいくつかの態様を遮断する変異タンパク質をコードすることができる。

【0176】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えビリオン中の目的の核酸は、ｍｉＲＮＡを含む。ｍｉＲＮＡ及び他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解または標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して、遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、１９～２５の最終非翻訳ＲＮＡ産物としてネイティブに発現する。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を介して活性を呈する。これらの内因的に発現したｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し、これは、その後プロセシングされて、ｍｉＲＮＡ二本鎖に、さらに「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子になる。この成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡに対する相補性に基づいて、標的ｍＲＮＡの、例えば、３’ＵＴＲ領域中において、標的部位を同定する多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣをガイドする。図５Ａ及び図５Ｂには、ｍｉＲＮＡ遺伝子、及びそれらの相同体、または本明細書に記載の核酸によってコードされる低分子干渉核酸の標的（例えば、ｍｉＲＮＡスポンジ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴｕＤ ＲＮＡ）の非限定的リストを開示する。

【0177】

ｍｉＲＮＡは、標的とするｍＲＮＡの機能を阻害し、その結果、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を阻害する。したがって、ｍｉＲＮＡの活性を（部分的または完全に）遮断する（例えば、ｍｉＲＮＡをサイレンシングする）ことにより、発現が阻害される（ポリペプチドの抑制を解除する）ポリペプチドの発現を効果的に誘導または回復することができる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的によってコードされるポリペプチドの抑制を解除することは、様々な方法のいずれか１つによって細胞内のｍｉＲＮＡ活性を阻害することにより達成される。例えば、ｍｉＲＮＡの活性の遮断は、ｍｉＲＮＡに相補的であるかまたは実質的に相補的な低分子干渉核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡスポンジ、ＴｕＤ ＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションによって達成され得、それによってｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの相互作用を遮断する。本明細書において、ｍｉＲＮＡに実質的に相補的な低分子干渉核酸は、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし、ｍｉＲＮＡの活性を遮断することができるものである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡに実質的に相補的な低分子干渉核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８塩基以外のすべてにおいて、ｍｉＲＮＡに相補的な低分子干渉核酸である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡと実質的に相補的な低分子干渉核酸配列は、少なくとも１塩基において、ｍｉＲＮＡと相補的な小さい干渉核酸配列である。

【0178】

調節配列
本明細書に開示される組換えビリオンの核酸は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチド及び／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列も含み得る。

【0179】

いくつかの実施形態では、調節配列は、好適なプロモーター配列を含み、本明細書に記載の目的の核酸などのプロモーター配列に作動可能に連結された遺伝子の転写を指示することができる。実施形態において、エンハンサー配列は、プロモーターの有効性を高めるためにプロモーターの上流に提供される。いくつかの実施形態では、調節配列は、エンハンサー及びプロモーターを含み、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の上流にイントロン配列を含み、イントロンは、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位（複数可）を含み、プロモーターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

【0180】

本明細書に記載のものなどの好適なプロモーターは、ウイルスに由来することができ、したがってウイルスプロモーターと呼ぶことができ、または原核生物もしくは真核生物などの任意の生物に由来し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、昆虫細胞または哺乳動物細胞に由来する。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）による発現を駆動することができる。プロモーターの例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、増強Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）など。いくつかの実施形態では、これらのプロモーターは、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含むように改変される。

【0181】

プロモーターは、発現をさらに増強するため、及び／またはその空間的発現及び／または時間的発現を変化させるために、１つ以上の特異的転写調節配列を含み得る。プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはレプレッサエレメントを含んでいてもよく、それは転写開始部位から何千もの塩基対が離れた箇所に位置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物などの供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が生じる成長段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、構造的または特異的に遺伝子コンポーネントの発現を制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶ ＩＥプロモーター、ならびに以下に列挙するプロモーターが挙げられる。このようなプロモーター及び／またはエンハンサーは、目的の任意の遺伝子、例えば、遺伝子編集分子、ドナー配列、治療用タンパク質などの発現のために使用することができる。例えば、核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのシステムに作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのシステムまたは部位特異的ヌクレアーゼコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の肝臓特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介して肝細胞へのベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的ターゲティングを使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、調節エレメントの集合体を有するｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計された合成プロモーターが使用される。これらの合成プロモーターは、天然に存在するものではなく、標的組織中での最適な発現、調節された発現、またはウイルスキャプシド中での調整のために設計されている。

【0182】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、（ａ）核酸に対して異種であるプロモーター；（ｂ）核酸の組織特異的発現を促進するプロモーターであって、好ましくはプロモーターが、造血細胞特異的発現または赤血球系統特異的発現を促進するプロモーター；（ｃ）核酸の構成的発現を促進するプロモーター；及び（ｄ）任意により代謝産物または低分子または化学エンティティに応答して、誘導的に発現されるプロモーターから選択され得る。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、キュメート（ｃｕｍａｔｅ）、ラパマイシン、ＦＫＣｓＡ、ＡＢＡ、タモキシフェン、青色光、及びリボスイッチによって調節されるプロモーターが挙げられる。追加の詳細は、例えば、Ｋａｌｌｕｎｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｅｌｌｓ ８：Ｅ７９６で報告されており、これは、参照により、組み込まれる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、β－グロビンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＡＨＳＰプロモーター、ＭＮＤプロモーター、Ｗｉｓｋｏｔｔ－Ａｌｄｒｉｃｈプロモーター、及びＰＫＬＲプロモーターから選択される。

【0183】

配列
本明細書において、コーディング領域は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、ノンコーディング領域は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域を指す。転写されたノンコーディング配列は、上流（５’－ＵＴＲ）、下流（３’－ＵＴＲ）、またはイントロンであり得る。転写されないノンコーディング配列は、エンハンサー及びプロモーターなどのシス作用性調節機能を有し得るか、または、ＤＮＡ内の官能基を分離するために使用される非転写ＤＮＡである「スペーサー」、例えば、ベクターゲノムのサイズを増大させるために使用されるポリリンカーまたは「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」ＤＮＡなどとして作用し得る。

【0184】

相補または相補的とは、２つの核酸鎖の領域間、または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広い概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミンまたはウラシルである場合、第１の領域に対して逆平行である第２の核酸領域の残基と特異的な水素結合を形成（「塩基対形成」）できることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合、第１の鎖に対して逆平行である第２の核酸鎖の残基と塩基対形成できることが知られている。核酸の第１の領域は、２つの領域が逆平行様式で配置されるときに、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が、第２の領域の残基と塩基対形成できる場合、同じかまたは異なる核酸の第２の領域と相補的である。いくつかの実施形態では、第１の領域は、第１の部分を含み、第２の領域は、第２の部分を含み、それにより、第１及び第２の部分が、逆平行様式で配置される場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、第２の部分中のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。他の実施形態では、第１の部分のすべてのヌクレオチド残基は、第２の部分中のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。

【0185】

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、作動可能に連結されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列に関して、作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、２つのタンパク質コーディング領域を結合する必要がある場合、隣接して読み枠内にあることを意味する。

【0186】

特定のタンパク質のアミノ酸配列と、そのタンパク質をコードできるヌクレオチド配列との間には、（以下に示す）遺伝コードによって定義されているように、既知の明確な対応がある。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と、遺伝コードによって定義される、その核酸によってコードされるアミノ酸配列との間には、既知の明確な対応関係が存在する。

【0187】

遺伝コード
アラニン（Ａｌａ、Ａ） ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＴ
アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ） ＡＧＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ
アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ） ＡＡＣ、ＡＡＴ
アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ） ＧＡＣ、ＧＡＴ
システイン（Ｃｙｓ、Ｃ） ＴＧＣ、ＴＧＴ
グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ） ＧＡＡ、ＧＡＧ
グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ） ＣＡＡ、ＣＡＧ
グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ） ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＴ
ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ） ＣＡＣ、ＣＡＴ
イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ） ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＴ
ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ） ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ
リジン（Ｌｙｓ、Ｋ） ＡＡＡ、ＡＡＧ
メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ） ＡＴＧ
フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ） ＴＴＣ、ＴＴＴ
プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ） ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ
セリン（Ｓｅｒ、Ｓ） ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ
スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ） ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ
トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ） ＴＧＧ
チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ） ＴＡＣ、ＴＡＴ
バリン（Ｖａｌ、Ｖ） ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＴ
終結シグナル（終了） ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ

【0188】

遺伝コードの重要かつよく知られている特徴は、その縮重であり、タンパク質の作製に使用されるほとんどのアミノ酸について、複数のコーディングヌクレオチドトリプレットが使用され得る（上図）。したがって、複数の異なるヌクレオチド配列が所与のアミノ酸配列をコードし得る。ミトコンドリア、及び色素体、及び同様の共生オルガネラは、わずかに異なる遺伝コードを有するが、遺伝コードの普遍性により、そのようなヌクレオチド配列は、すべての生物において、同じアミノ酸配列を産生するため、機能的に同等であるとみなされる。すべてのコドンが同様の翻訳効率で利用されるものではないが、希少なコドンは、ｔＲＮＡプールの制限によりタンパク質産生を低下させ得る。さらに、場合によっては、プリンまたはピリミジンのメチル化バリアントが、所定のヌクレオチド配列中に見られ得る。そのようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコード関係に影響を与えない。

【0189】

ポリペプチドのアミノ配列を変更する際、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質に相互作用的生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野において概して理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性が、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与し、それがタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義することと解釈されている。各アミノ酸には、次のように、疎水性及び電荷特性に基づいて、ハイドロパシー指数が割り当てられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（＜ＲＴＩ３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；及びアルギニン（－４．５）。

【0190】

特定のアミノ酸が類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換されても、類似の生物学的活性を有するタンパク質が得られ得る、すなわち、生物学的に機能的に同等のタンパク質が得られ得ることは、当技術分野で知られている。

【0191】

したがって、上で概説したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前述の特徴の様々を考慮に入れる例示的な置換は、当業者に周知であり、アルギニンとリジン；グルタメートとアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、及びイソロイシンを含む。

【0192】

アミノ酸配列を改変することなく、ポリペプチドをコードする核酸を特定の宿主細胞に対してコドン最適化できることも当技術分野で知られている。コドン最適化は、同義のコドン変更を使用してタンパク質産生を増加させる遺伝子工学的アプローチについて説明している。これが可能なのは、ほとんどのアミノ酸が複数のコドンによってコードされているためである。まれなコドンを高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、タンパク質の発現が増加することが示されている。

【0193】

上記を考慮して、本明細書に記載の核酸（またはその任意の部分）（例えば、治療用核酸）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列を使用して、ポリペプチドのアミノ酸配列を駆動し、遺伝コードを使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳することができる。同様に、ポリペプチドのアミノ酸配列については、ポリペプチドをコードすることができる対応するヌクレオチド配列を、遺伝コードから推定することができる（その冗長性のために、任意の所定のアミノ酸配列に対して複数の核酸配列が産生される）。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の本明細書における説明及び／または開示は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の説明及び／または開示も含むとみなされるべきである。同様に、本明細書におけるポリペプチドアミノ酸配列の記載及び／または開示は、そのアミノ酸配列をコードし得るすべての可能なヌクレオチド配列の記載及び／または開示も含むものとみなされるものとする。

【0194】

最後に、本発明において有用な核酸及びポリペプチド分子の核酸及びアミノ酸配列情報は、当技術分野で周知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）などの公的に利用可能なデータベースで容易に入手可能である。

【0195】

表４：配列表
上記のとおり、当業者は、ウイルス配列の遺伝子型変異を理解する。したがって、本明細書に提示される配列は、典型的な分離株の配列を表す。

【0196】

配列番号１、２、及び３は、ＡＡＶ ＩＴＲの例を表す。

【化1】

＊配列番号４は、ＣＰＶ－Ｎ株のＶＰ１及びＶＰ２の両方の配列を含む。配列全体は、ＶＰ１に対応するが、ＶＰ２配列は、ＶＰ２の最初のメチオンを示す太字の「Ｍ」で始まる。

【0197】

下線で示す残基は、内在化及びトランスサイトーシスに影響を与える受容体結合ドメインを画定する。これらの領域内の変異は、受容体の相互作用を変化させ、トランスサイトーシスを調節する。

【0198】

ＶＰ２のアミノ酸９３（太字の「Ｍ」から始まる番号）及び隣接残基は、ＴｆＲ相互作用と宿主範囲に関与する。

【0199】

ＶＰ２のアミノ酸３００及び隣接残基（太字の「Ｍ」から始まる）は、宿主範囲（ＴｆＲとの相互作用）に影響を与える。

【0200】

ＶＰ２のアミノ酸３２３及び隣接残基（太字の「Ｍ」から始まる）は、ＴｆＲ相互作用及び宿主範囲に関与する。
配列番号５ イヌパルボウイルスＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＸＱ００３５０）
１ ｍａｐｐａｋｒａｒｒ ｇｌｖｐｐｇｙｋｙｌ ｇｐｇｎｓｌｄｑｇｅ ｐｔｎｐｓｄａａａｋ ｅｈｄｅａｙａａｙｌ ｒｓｇｋｎｐｙｌｙｆ
６１ ｓｐａｄｑｒｆｉｄｑ ｔｋｄａｋｄｗｇｇｋ ｉｇｈｙｆｆｒａｋｋ ａｉａｐｖｌｔｄｔｐ ｄｈｐｓｔｓｒｐｔｋ ｐｔｋｒｓｋｐｐｐｈ
１２１ ｉｆｉｎｌａｋｋｋｋ ａｇａｇｑｖｋｒｄｎ ｌａｐｍｓｄｇｇｖｑ ｐｄｇｇｑｐａｖｒｎ ｅｒａｔｇｓｇｎｇｓ ｇｇｇｇｇｇｇｓｇｇ
１８１ ｖｇｉｓｔｇｔｆｎｎ ｑｔｅｆｋｆｌｅｎｇ ｗｖｅｉｔａｎｓｓｒ ｌｖｈｌｎｍｐｅｓｅ ｎｙｒｒｖｖｖｎｎｌ ｄｋｔａｖｎｇｎｍａ
２４１ ｌｄｄｔｈａｑｉｖｔ ｐｗｓｌｖｄａｎａｗ ｇｖｗｆｎｐｇｄｗｑ ｌｉｖｎｔｍｓｅｌｈ ｌｖｓｆｅｑｅｉｆｎ ｖｖｌｋｔｖｓｅｓａ
３０１ ｔｑｐｐｔｋｖｙｎｎ ｄｌｔａｓｌｍｖａｌ ｄｓｎｎｔｍｐｆｔｐ ａａｍｒｓｅｔｌｇｆ ｙｐｗｋｐｔｉｐｔｐ ｗｒｙｙｆｑｗｄｒｔ
３６１ ｌｉｐｓｈｔｇｔｓｇ ｔｐｔｎｉｙｈｇｔｄ ｐｄｄｖｑｆｙｔｉｅ ｎｓｖｐｖｈｌｌｒｔ ｇｄｅｆａｔｇｔｆｙ ｆｄｃｋｐｃｒｌｔｈ
４２１ ｔｗｑｔｎｒａｌｇｌ ｐｐｆｌｎｓｌｐｑａ ｅｇｇｔｎｆｇｙｉｇ ｖｑｑｄｋｒｒｇｖｔ ｑｍｇｎｔｎｉｉｔｅ ａｔｉｍｒｐａｅｖｇ
４８１ ｙｓａｐｙｙｓｆｅａ ｓｔｑｇｐｆｋｔｐｉ ａａｇｒｇｇａｑｔｄ ｅｎｒａａｄｇｄｐｒ ｙａｆｇｒｑｈｇｑｋ ｔｔｔｔｇｅｔｐｅｒ
５４１ ｆｔｙｉａｈｑｄｔｇ ｒｙｐｅｇｄｗｉｑｎ ｉｎｆｎｌｐｖｔｅｄ ｎｖｌｌｐｔｄｐｉｇ ｇｋｔｇｉｎｙｔｎｉ ｆｎｔｙｇｐｌｔａｌ
６０１ ｎｎｖｐｐｖｙｐｎｇ ｑｉｗｄｋｅｆｄｔｄ ｌｋｐｒｌｈｖｎａｐ ｆｖｃｑｎｎｃｐｇｑ ｌｆｖｋｖａｐｎｌｔ ｎｅｙｄｐｄａｓａｎ
６６１ ｍｓｒｉｖｔｙｓｄｆ ｗｗｋｇｋｌｖｆｋａ ｋｌｒａｓｈｔｗｎｐ ｉｑｑｍｓｉｎｖｄｎ ｑｆｎｙｖｐｓｎｉｇ ｇｍｋｉｖｙｅｋｓｑ
７２１ ｌａｐｒｋｌｙ
配列番号６ イヌパルボウイルスＶＰ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ８６６１２）
１ ｍｓｄｇａｖｑｐｄｇ ｇｑｐａｖｒｎｅｒａ ｔｇｓｇｎｇｓｇｇｇ ｇｇｇｇｓｇｇｖｇｉ ｓｔｇｔｆｎｎｑｔｅ ｆｋｆｌｅｎｇｗｖｅ
６１ ｉｔａｎｓｓｒｌｖｈ ｌｎｍｐｅｓｅｎｙｒ ｒｖｖｖｎｎｌｄｋｔ ａｖｎｇｎｍａｌｄｄ ｔｈａｑｉｖｔｐｗｓ ｌｖｄａｎａｗｇｖｗ
１２１ ｆｎｐｇｄｗｑｌｉｖ ｎｔｍｓｅｌｈｌｖｓ ｆｅｑｅｉｆｎｖｖｌ ｋｔｖｓｅｓａｔｑｐ ｐｔｋｖｙｎｎｄｌｔ ａｓｌｍｖａｌｄｓｎ
１８１ ｎｔｍｐｆｔｐａａｍ ｒｓｅｔｌｇｆｙｐｗ ｋｐｔｉｐｔｐｗｒｙ ｙｆｑｗｄｒｔｌｉｐ ｓｈｔｇｔｓｇｔｐｔ ｎｉｙｈｇｔｄｐｄｄ
２４１ ｖｑｆｙｔｉｅｎｓｖ ｐｖｈｌｌｒｔｇｄｅ ｆａｔｇｔｆｆｆｄｃ ｋｐｃｒｌｔｈｔｗｑ ｔｎｒａｌｇｌｐｐｆ ｌｎｓｌｐｑｓｅｇｇ
３０１ ｔｎｆｇｙｉｇｖｑｑ ｄｋｒｒｇｖｔｑｍｇ ｎｔｎｙｉｔｅａｔｉ ｍｒｐａｅｖｇｙｓａ ｐｙｙｓｆｅａｓｔｑ ｇｐｆｋｔｐｉａａｇ
３６１ ｒｇｇａｑｔｄｅｎｑ ａａｄｇｄｐｒｙａｆ ｇｒｑｈｇｑｋｔｔｔ ｔｇｅｔｐｅｒｆｔｙ ｉａｈｑｄｔｇｒｙｐ ｅｇｄｗｉｑｎｉｎｆ
４２１ ｎｌｐｖｔｄｄｎｖｌ ｌｐｔｄｐｉｇｇｋｔ ｇｉｎｙｔｎｉｆｎｔ ｙｇｐｌｔａｌｎｎｖ ｐｐｖｙｐｎｇｑｉｗ ｄｋｅｆｄｔｄｌｋｐ
４８１ ｒｌｈｖｎａｐｆｖｃ ｑｎｎｃｐｇｑｌｆｖ ｋｖａｐｎｌｔｎｅｙ ｄｐｄａｓａｎｍｓｒ ｉｖｔｙｓｄｆｗｗｋ ｇｋｌｖｆｋａｋｌｒ
５４１ ａｓｈｔｗｎｐｉｑｑ ｍｓｉｎｖｄｎｑｆｎ ｙｖｐｓｎｉｇｇｍｋ ｉｖｙｅｋｓｑｌａｐ ｒｋｌｙ
配列番号７ ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＣＴＧ－ＶＰ１－３－Ｌｅｕ－ＶＰ２）

【化2】

【0201】

配列番号７は、ネコ汎白血球減少症ウイルスのこの株のＶＰ１及びＶＰ２の両方の配列を含む。配列全体は、ＶＰ１に対応するが、ＶＰ２配列は、ＶＰ２の最初のメチオンを示す太字の「Ｍ」で始まる。
配列番号８ ネコ汎白血球減少症ウイルスＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＫＩ８８０７１）
１ ｍａｐｐａｋｒａｒｒ ｇｌｖｐｐｇｙｋｙｌ ｇｐｇｎｓｌｄｑｇｅ ｐｔｎｐｓｄａａａｋ ｅｈｄｅａｙａａｙｌ ｒｓｇｋｎｐｙｌｙｆ
６１ ｓｐａｄｑｒｆｉｄｑ ｔｋｄａｋｄｗｇｇｋ ｉｇｈｙｆｆｒａｋｋ ａｉａｐｖｌｔｄｔｐ ｄｈｐｓｔｓｒｐｔｋ ｐｔｋｒｓｋｐｐｐｈ
１２１ ｉｆｉｎｌａｋｋｋｋ ａｇａｇｑｖｋｒｄｎ ｌａｐｍｓｄｇａｖｑ ｐｄｇｇｑｐａｖｒｎ ｅｒａｔｇｓｇｎｇｓ ｇｇｇｇｇｇｇｓｇｇ
１８１ ｖｇｉｓｔｇｔｆｎｎ ｑｔｅｆｋｆｌｅｎｇ ｗｖｅｉｔａｎｓｓｒ ｌｖｈｌｎｍｐｅｓｅ ｎｙｋｒｖｖｖｎｎｍ ｄｋｔａｖｋｇｎｍａ
２４１ ｌｄｄｔｈｖｑｉｖｔ ｐｗｓｌｖｄａｎａｗ ｇｖｗｆｎｐｇｄｗｑ ｌｉｖｎｔｍｓｅｌｈ ｌｖｓｆｅｑｅｉｆｎ ｖｖｌｋｔｖｓｅｓａ
３０１ ｔｑｐｐｔｋｖｙｎｎ ｄｌｔａｓｌｍｖａｌ ｄｓｎｎｔｍｐｆｔｐ ａａｍｒｓｅｔｌｇｆ ｙｐｗｋｐｔｉｐｔｐ ｗｒｙｙｆｑｗｄｒｔ
３６１ ｌｉｐｓｈｔｇｔｓｇ ｔｐｔｎｖｙｈｇｔｄ ｐｄｄｖｑｆｙｔｉｅ ｎｓｖｐｖｈｌｌｒｔ ｇｄｅｆａｔｇｔｆｆ ｆｄｃｋｐｃｒｌｔｈ
４２１ ｔｗｑｔｎｒａｌｇｌ ｐｐｆｌｎｓｌｐｑｓ ｅｇａｔｎｆｇｄｉｇ ｖｑｑｄｋｒｒｇｖｔ ｑｍｇｎｔｄｙｉｔｅ ａｔｉｍｒｐａｅｖｇ
４８１ ｙｓａｐｙｙｓｆｅａ ｓｔｑｇｐｆｋｔｐｉ ａａｇｒｇｇａｑｔｄ ｅｎｑａａｄｇｄｐｒ ｙａｆｇｒｑｈｇｑｋ ｔｔｔｔｇｅｔｐｅｒ
５４１ ｆｔｙｉａｈｑｄｔｇ ｒｙｐｅｇｄｗｉｑｎ ｉｎｆｎｌｐｖｔｎｄ ｎｖｌｌｐｔｄｐｉｇ ｇｋｔｇｉｎｙｔｎｉ ｆｎｔｙｇｐｌｔａｌ
６０１ ｎｎｖｐｐｖｙｐｎｇ ｑｉｗｄｋｅｆｄｔｄ ｌｋｐｒｌｈｖｎａｐ ｆｖｃｑｎｎｃｐｇｑ ｌｆｖｋｖａｐｎｌｔ ｎｅｙｄｐｄａｓａｎ
６６１ ｍｓｒｉｖｔｙｓｄｆ ｗｗｋｇｋｌｖｆｋａ ｋｌｒａｓｈｔｗｎｐ ｉｑｑｍｓｉｎｖｄｎ ｑｆｎｙｖｐｎｎｉｇ ａｍｋｉｖｙｅｋｓｑ
７２１ ｌａｐｒｋｌｙ
配列番号９ ネコ汎白血球減少症ウイルスＶＰ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＩ３１２０３）
１ ｍｓｄｇａｖｑｐｄｇ ｇｑｐａｖｒｎｅｒａ ｔｇｓｇｎｇｓｇｇｇ ｇｇｇｇｓｇｇｖｇｉ ｓｔｇｔｆｎｎｑｔｅ ｆｋｆｌｅｎｇｗｖｅ
６１ ｉｔａｎｓｓｒｌｖｈ ｌｎｍｐｅｓｅｎｙｋ ｒｖｖｖｎｎｍｄｋｔ ａｖｋｇｎｍａｌｄｄ ｉｈｖｑｉｖｔｐｗｓ ｌｖｄａｎａｗｇｖｗ
１２１ ｆｎｐｇｄｗｑｌｉｖ ｎｔｍｓｅｌｈｌｖｓ ｆｅｑｅｉｆｎｖｖｌ ｋｔｖｓｅｓａｔｑｐ ｐｔｋｖｙｎｎｄｌｔ ａｓｌｍｖａｌｄｓｎ
１８１ ｎｔｍｐｆｔｐａａｍ ｒｓｅｔｌｇｆｙｐｗ ｋｐｔｉｐｔｐｗｒｙ ｙｆｑｗｄｒｔｌｉｐ ｓｈｔｇｔｓｇｔｐｔ ｎｉｙｈｇｔｄｐｄｄ
２４１ ｖｑｆｙｔｉｅｎｓｖ ｐｖｈｌｌｒｔｇｄｅ ｆａｔｇｔｆｆｆｄｃ ｋｐｃｒｌｔｈｔｗｑ ｔｎｒａｌｇｌｐｐｆ ｌｎｓｌｐｑｓｅｇａ
３０１ ｔｎｆｇｄｉｇｖｑｑ ｄｋｒｒｇｖｔｑｍｇ ｎｔｎｙｉｔｅａｔｉ ｍｒｐａｅｖｇｙｓａ ｐｙｙｓｆｅａｓｔｑ ｇｐｆｋｔｐｉａａｇ
３６１ ｒｇｇａｑｔｄｅｎｑ ａａｄｇｄｐｒｙａｆ ｇｒｑｈｇｑｋｔｔｔ ｔｇｅｔｐｅｒｆｔｙ ｉａｈｑｄｔｇｒｙｐ ｅｇｄｗｉｑｎｉｎｆ
４２１ ｎｌｐｖｔｎｄｎｖｌ ｌｐｔｄｐｉｇｇｋｔ ｇｉｎｙｔｎｉｆｎｔ ｙｇｐｌｔａｌｎｎｖ ｐｐｖｙｐｎｇｑｉｗ ｄｋｅｆｄｔｄｌｋｐ
４８１ ｒｌｈｖｎａｐｆｖｃ ｑｎｎｃｐｇｑｌｆｖ ｋｖａｐｎｌｔｎｅｙ ｄｐｄａｓａｎｍｓｒ ｉｖｔｙｓｄｆｗｗｋ ｇｋｌｖｆｋａｋｌｒ
５４１ ａｓｈｔｗｎｐｉｑｑ ｍｓｉｎｖｄｎｑｆｎ ｙｖｐｓｎｉｇａｍｋ ｉｖｙｅｋｓｑｌａｐ ｒｋｌｙ
配列番号１０ ブファウイルス（ＣＴＧ－ＶＰ１－３－Ｌｅｕ－ＶＰ２）

【化3】

【0202】

配列番号１０は、ブファウイルスのこの株のＶＰ１及びＶＰ２の両方の配列を含む。配列全体は、ＶＰ１に対応するが、ＶＰ２配列は、ＶＰ２の最初のメチオンを示す太字の「Ｍ」で始まる。
配列番号１１ ブファウイルスＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦＮ４４２７１）
１ ｍｐａｉｒｋａｒｇｗ ｖｐｐｇｙｎｙｌｇｐ ｆｎｑｄｆｓｋｋｐｔ ｎｐｓｄｎａａｒｋｈ ｄｌｅｙｎｋｌｉｋｑ ｇｈｎｐｙｗｎｙｎｈ
６１ ａｄｅｄｆｉｋｅｔｄ ｑａｔｄｗｇｇｋｆｇ ｎｆｖｆｒａｋｒａｌ ａｐｅｌａｐｐａｋｋ ｋｔｋｔｋｈｔｅｐｅ ｙｓｈｋｈｉｋａｇｔ
１２１ ｋｒｇｋｐｆｙｌｆｖ ｎｌａｒｋｋａｒｍｔ ｄｔｑｄｖｓｅｑｑｓ ｄｑｐｓｖａｓｔｓａ ｋａｇｇｇｇｇｇｇｇ ｓｇｖｇｈｓｔｇｎｙ
１８１ ｎｎｒｔｅｆｙｙｈｇ ｄｅｖｔｉｖｃｈｓｓ ｒｈｉｈｌｎｍｓｅｓ ｅｅｙｋｉｙｄｔｄｒ ｇｐｔｆｐｔｄｑｔｌ ｑｇｒｄｔｉｎｄｓｙ
２４１ ｈａｑｖｅｔｐｗｆｌ ｉｎｐｎｓｗｇｔｗｍ ｎｐａｄｆｑｑｌｔｔ ｔｃｒｅｖｔｌｅｈｌ ｄｑｔｌｄｎｉｖｉｋ ｔｖｓｋｑｇｓｇａｅ
３０１ ｅｔｔｑｙｎｎｄｌｔ ａｌｌｑｖａｌｄｋｓ ｎｑｌｐｗｖａｄｎｍ ｙｌｄｓｌｇｙｉｐｗ ｒｐｃｋｌｋｑｙｓｙ ｈｖｎｆｗｎｔｉｄｉ
３６１ ｉｓｇｐｑｑｎｑｗｑ ｑｖｋｋｅｉｋｗｄｄ ｌｑｆｔｐｉｅｔｔｔ ｅｉｄｌｌｒｔｇｄｓ ｗｔｓｇｐｙｋｆｎｔ ｋｐｔｑｌｓｙｈｗｑ
４２１ ｓｔｒｈｔｇｓｖｈｐ ｔｅｐｐｎａｉｇｑｑ ｇｒｎｉｉｄｉｎｇｗ ｑｗｇｄｒｓｎｐｍｓ ａａｔｒｖｓｎｆｈｉ ｇｙｓｗｐｅｗｒｉｈ
４８１ ｙｇｓｇｇｐａｉｎｐ ｇａｐｆｓｑａｐｗｓ ｔｄｐｑｖｒｌｔｑｇ ａｓｅｋａｉｆｄｙｎ ｈｇｄｄｄｐａｈｒｄ ｑｗｗｑｎｎｌｐｍｔ
５４１ ｇｑｔｄｗａｐｋｎａ ｈｑｔｎｖｓｎｎｉｐ ｓｒｑｅｆｗｔｑｄｙ ｈｎｔｆｇｐｆｔａｖ ｄｄｖｇｉｑｙｐｗｇ ａｉｗｔｋｔｐｄｔｔ
６０１ ｈｋｐｍｍｓａｈａｐ ｆｉｃｋｄｇｐｐｇｑ ｌｌｖｋｌａｐｎｙｔ ｅｎｌｑｔｄｇｌｇｎ ｎｒｉｖｔｙａｔｆｗ ｗｔｇｋｌｖｌｋｇｋ
６６１ ｌｒｌｐｒｑｆｎｌｙ ｎｌｐｇｒｐｒｇｔｅ ａｋｋｆｌｐｎｅｉｇ ｈｆｅｌｐｆｍｐｇｒ ｃｍｐｎｙｔｉ
配列番号１２ ブファウイルスＶＰ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦＮ４４２７２）
１ ｍｔｄｔｑｄｖｓｅｑ ｑｓｄｑｐｓｖａｓｔ ｓａｋａｇｇｇｇｇｇ ｇｇｓｇｖｇｈｓｔｇ ｎｙｎｎｒｔｅｆｙｙ ｈｇｄｅｖｔｉｖｃｈ
６１ ｓｓｒｈｉｈｌｎｍｓ ｅｓｅｅｙｋｉｙｄｔ ｄｒｇｐｔｆｐｔｄｑ ｔｌｑｇｒｄｔｉｎｄ ｓｙｈａｑｖｅｔｐｗ ｆｌｉｎｐｎｓｗｇｔ
１２１ ｗｍｎｐａｄｆｑｑｌ ｔｔｔｃｒｅｖｔｌｅ ｈｌｄｑｔｌｄｎｉｖ ｉｋｔｖｓｋｑｇｓｇ ａｅｅｔｔｑｙｎｎｄ ｌｔａｌｌｑｖａｌｄ
１８１ ｋｓｎｑｌｐｗｖａｄ ｎｍｙｌｄｓｌｇｙｉ ｐｗｒｐｃｋｌｋｑｙ ｓｙｈｖｎｆｗｎｔｉ ｄｉｉｓｇｐｑｑｎｑ ｗｑｑｖｋｋｅｉｋｗ
２４１ ｄｄｌｑｆｔｐｉｅｔ ｔｔｅｉｄｌｌｒｔｇ ｄｓｗｔｓｇｐｙｋｆ ｎｔｋｐｔｑｌｓｙｈ ｗｑｓｔｒｈｔｇｓｖ ｈｐｔｅｐｐｎａｉｇ
３０１ ｑｑｇｒｎｉｉｄｉｎ ｇｗｑｗｇｄｒｓｎｐ ｍｓａａｔｒｖｓｎｆ ｈｉｇｙｓｗｐｅｗｒ ｉｈｙｇｓｇｇｐａｉ ｎｐｇａｐｆｓｑａｐ
３６１ ｗｓｔｄｐｑｖｒｌｔ ｑｇａｓｅｋａｉｆｄ ｙｎｈｇｄｄｄｐａｈ ｒｄｑｗｗｑｎｎｌｐ ｍｔｇｑｔｄｗａｐｋ ｎａｈｑｔｎｖｓｎｎ
４２１ ｉｐｓｒｑｅｆｗｔｑ ｄｙｈｎｔｆｇｐｆｔ ａｖｄｄｖｇｉｑｙｐ ｗｇａｉｗｔｋｔｐｄ ｔｔｈｋｐｍｍｓａｈ ａｐｆｉｃｋｄｇｐｐ
４８１ ｇｑｌｌｖｋｌａｐｎ ｙｔｅｎｌｑｔｄｇｌ ｇｎｎｒｉｖｔｙａｔ ｆｗｗｔｇｋｌｖｌｋ ｇｋｌｒｌｐｒｑｆｎ ｌｙｎｌｐｇｒｐｒｇ
５４１ ｔｅａｋｋｆｌｐｎｅ ｉｇｈｆｅｌｐｆｍｐ ｇｒｃｍｐｎｙｔｉ
配列番号１３ Ｔｕｓａｖｉｒｕｓ（ＣＴＧ－ＶＰ１－３－Ｌｅｕ－ＶＰ２）

【化4】

【0203】

配列番号１３は、ｔｕｓａｖｉｒｕｓのこの株のＶＰ１及びＶＰ２の両方の配列を含む。配列全体は、ＶＰ１に対応するが、ＶＰ２配列は、ＶＰ２の最初のメチオンを示す太字の「Ｍ」で始まる。
配列番号１４ Ｔｕｓａｖｉｒｕｓ ＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＩＴ１８９３０）
１ ｍａｐａａｒｐｒｋｇ ｗｖｐｐｇｙｎｙｌｇ ｐｇｎｄｌｄａｇｅｐ ｔｎｋｓｄａａａｒｋ ｈｄｆａｙｓａｙｌｋ ｑｇｌｄｐｙｗｎｆｎ
６１ ｋａｄｅｋｆｉｒｄｔ ｅｇａｔｄｗｇｇｒｌ ｇｈｗｉｆｒａｋｋｈ ｉｌｐｈｌｋｅｐｔｌ ａｇｒｋｒｐａｐａｈ ｉｆｖｎｌａｎｋｒｋ
１２１ ｋｇｌｐｔｒｋｄｑｑ ｋｄｔｌｄｓｎａｑｑ ｐｖｒｅａｄｑｐｄｇ ｍａａｓｓｓｄｓｇｐ ｓｓｓｇｇｇａｒａｇ ｇｖｇｖｓｔｇｄｆｄ
１８１ ｎｔｔｌｗｄｆｈｅｄ ｇｔａｔｉｔｃｎｓｔ ｒｌｖｈｌｔｒｐｄｓ ｌｄｙｋｉｉｐｔｑｎ ｎｔａｖｑｔｖｇｈｍ ｍｄｄｄｎｈｔｑｖｌ
２４１ ｔｐｗｓｌｖｄｃｎａ ｗｇｖｗｌｓｐｈｄｗ ｑｈｉｍｎｉｇｅｅｌ ｅｌｌｓｌｅｑｅｖｆ ｎｖｔｌｋｔａｔｅｔ ｇｐｐｅｓｒｉｔｍｙ
３０１ ｎｎｄｌｔａｖｍｍｉ ｔｔｄｔｎｎｑｌｐｙ ｔｐａａｉｒｓｅｔｌ ｇｆｙｐｗｒｐｔｖｖ ｐｒｗｒｙｙｆｄｗｄ ｒｆｌｓｖｔｓｓｓｄ
３６１ ｑｓｔｓｉｉｎｈｓｓ ｔｑｓａｉｇｑｆｆｖ ｉｅｔｑｌｐｉａｌｌ ｒｔｇｄｓｙａｔｇｇ ｙｋｆｄｃｎｋｖｎｌ ｇｒｈｗｑｔｔｒｓｌ
４２１ ｇｌｐｐｋｉｅｐｐｔ ｓｅｓａｌｇｔｉｎｑ ｎａｒｌｇｗｒｗｇｉ ｎｄｖｈｅｔｎｖｖｒ ｐｃｔａｇｙｎｈｐｅ ｗｆｙｔｈｔｌｅｇｐ
４８１ ａｉｄｐａｐｐｔｓｉ ｐｓｎｗｇｇｇｔｐｐ ｄｔｒａｓｓｈｎｑｑ ｒｉｔｙｎｙｎｈｇｎ ｋｄｅｎｌｎｎｆｓｌ ｎｐｎｉｅｌｇｓｉｉ
５４１ ｎｑｇｎｆｌｓｙｅｇ ｎｇｑｑｉｎｔｔａｇ ｖｇｋｎｇｅｔａｔｓ ｄｐｎｌｖｒｙｍｐｎ ｔｙｇｖｙｔａｖｄｈ ｑｇｐｖｙｐｈｇｑｉ
６０１ ｗｄｋｑｉｈｔｄｋｋ ｐｅｌｈｃｌａｐｆｔ ｃｋｎｎｐｐｇｑｍｆ ｖｒｉａｐｎｌｔｄｔ ｆｎａｔｐｔｆｓｅｉ ｉｔｙａｄｆｗｗｋｇ
６６１ ｔｌｋｍｋｉｋｌｒｐ ｐｈｑｗｎｉａｔｖｌ ｇａａｖｎｉｇｄａａ ｒｆｖｐｎｒｌｇｑｌ ｅｆｐｖｉｎｇｒｉｖ ｐｓｔｖｙ
配列番号１５ Ｔｕｓａｖｉｒｕｓ ＶＰ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＩＴ１８９２９）
１ ｍａａｓｓｓｄｓｇｐ ｓｓｓｇｇｇａｒａｇ ｇｖｇｖｓｔｇｄｆｄ ｎｔｔｌｗｄｆｈｅｄ ｇｔａｔｉｔｃｎｓｔ ｒｌｖｈｌｔｒｐｄｓ
６１ ｌｄｙｋｉｉｐｔｑｎ ｎｔａｖｑｔｖｇｈｍ ｍｄｄｄｎｈｔｑｖｌ ｔｐｗｓｌｖｄｃｎａ ｗｇｖｗｌｓｐｈｄｗ ｑｈｉｍｎｉｇｅｅｌ
１２１ ｅｌｌｓｌｅｑｅｖｆ ｎｖｔｌｋｔａｔｅｔ ｇｐｐｅｓｒｉｔｍｙ ｎｎｄｌｔａｖｍｍｉ ｔｔｄｔｎｎｑｌｐｙ ｔｐａａｉｒｓｅｔｌ
１８１ ｇｆｙｐｗｒｐｔｖｖ ｐｒｗｒｙｙｆｄｗｄ ｒｆｌｓｖｔｓｓｓｄ ｑｓｔｓｉｉｎｈｓｓ ｔｑｓａｉｇｑｆｆｖ ｉｅｔｑｌｐｉａｌｌ
２４１ ｒｔｇｄｓｙａｔｇｇ ｙｋｆｄｃｎｋｖｎｌ ｇｒｈｗｑｔｔｒｓｌ ｇｌｐｐｋｉｅｐｐｔ ｓｅｓａｌｇｔｉｎｑ ｎａｒｌｇｗｒｗｇｉ
３０１ ｎｄｖｈｅｔｎｖｖｒ ｐｃｔａｇｙｎｈｐｅ ｗｆｙｔｈｔｌｅｇｐ ａｉｄｐａｐｐｔｓｉ ｐｓｎｗｇｇｇｔｐｐ ｄｔｒａｓｓｈｎｑｑ
３６１ ｒｉｔｙｎｙｎｈｇｎ ｋｄｅｎｌｎｎｆｓｌ ｎｐｎｉｅｌｇｓｉｉ ｎｑｇｎｆｌｓｙｅｇ ｎｇｑｑｉｎｔｔａｇ ｖｇｋｎｇｅｔａｔｓ
４２１ ｄｐｎｌｖｒｙｍｐｎ ｔｙｇｖｙｔａｖｄｈ ｑｇｐｖｙｐｈｇｑｉ ｗｄｋｑｉｈｔｄｋｋ ｐｅｌｈｃｌａｐｆｔ ｃｋｎｎｐｐｇｑｍｆ
４８１ ｖｒｉａｐｎｌｔｄｔ ｆｎａｔｐｔｆｓｅｉ ｉｔｙａｄｆｗｗｋｇ ｔｌｋｍｋｉｋｌｒｐ ｐｈｑｗｎｉａｔｖｌ ｇａａｖｎｉｇｄａａ
５４１ ｒｆｖｐｎｒｌｇｑｌ ｅｆｐｖｉｎｇｒｉｖ ｐｓｔｖｙ
配列番号１６ クタウイルス（ＣＴＧ－ＶＰ１－３－Ｌｅｕ－ＶＰ２）

【化5】

【0204】

配列番号１６は、このクタウイルス株のＶＰ１及びＶＰ２の両方の配列を含む。配列全体は、ＶＰ１に対応するが、ＶＰ２配列は、ＶＰ２の最初のメチオンを示す太字の「Ｍ」で始まる。
配列番号１７ クタウイルスＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ＿００９５０８８０５）
１ ｍｐａｉｒｋａｒｇｗ ｖｐｐｇｙｎｆｌｇｐ ｆｎｑｄｆｎｋｅｐｔ ｎｐｓｄｎａａｋｑｈ ｄｌｅｙｎｋｌｉｎｑ ｇｈｎｐｙｗｙｙｎｋ
６１ ａｄｅｄｆｉｋａｔｄ ｑａｐｄｗｇｇｋｆｇ ｎｆｉｆｒａｋｋｈｉ ａｐｅｌａｐｐａｋｋ ｋｓｋｔｋｈｓｅｐｅ ｆｓｈｋｈｉｋｐｇｔ
１２１ ｋｒｇｋｐｆｈｉｆｖ ｎｌａｒｋｒａｒｍｓ ｅｐａｎｄｔｎｅｑｐ ｄｎｓｐｖｅｑｇａｇ ｑｉｇｇｇｇｇｇｇｇ ｓｇｖｇｈｓｔｇｄｙ
１８１ ｎｎｒｔｅｆｉｙｈｇ ｄｅｖｔｉｉｃｈｓｔ ｒｌｖｈｉｎｍｓｄｒ ｅｄｙｉｉｙｅｔｄｒ ｇｐｌｆｐｔｔｑｄｌ ｑｇｒｄｔｌｎｄｓｙ
２４１ ｈａｋｖｅｔｐｗｋｌ ｌｈａｎｓｗｇｃｗｆ ｓｐａｄｆｑｑｍｉｔ ｔｃｒｄｉａｐｉｋｍ ｈｑｋｉｅｎｉｖｉｋ ｔｖｓｋｔｇｔｇｅｔ
３０１ ｅｔｔｎｙｎｎｄｌｔ ａｌｌｑｉａｑｄｎｓ ｎｌｌｐｗａａｄｎｆ ｙｉｄｓｖｇｙｖｐｗ ｒａｃｋｌｐｔｙｃｙ ｈｖｄｔｗｎｔｉｄｉ
３６１ ｎｑａｄｔｐｎｑｗｒ ｅｉｋｋｇｉｑｗｄｎ ｉｑｆｔｐｌｅｔｍｉ ｎｉｄｌｌｒｔｇｄａ ｗｅｓｇｎｙｎｆｈｔ ｋｐｔｎｌａｙｈｗｑ
４２１ ｓｑｒｈｔｇｓｃｈｐ ｔｖａｐｌｖｅｒｇｑ ｇｔｎｉｑｓｖｎｃｗ ｑｗｇｄｒｎｎｐｓｓ ａｓｔｒｖｓｎｉｈｉ ｇｙｓｆｐｅｗｑｉｈ
４８１ ｙｓｔｇｇｐｖｉｎｐ ｇｓａｆｓｑａｐｗｇ ｓｔｔｅｇｔｒｌｔｑ ｇａｓｅｋａｉｙｄｗ ｓｈｇｄｄｑｐｇａｒ ｅｔｗｗｑｎｎｑｈｖ
５４１ ｔｇｑｔｄｗａｐｋｎ ａｈｔｓｅｌｎｎｎｖ ｐａａｔｈｆｗｋｎｓ ｙｈｎｔｆｓｐｆｔａ ｖｄｄｈｇｐｑｙｐｗ ｇａｉｗｇｋｙｐｄｔ
６０１ ｔｈｋｐｍｍｓａｈａ ｐｆｌｌｈｇｐｐｇｑ ｌｆｖｋｌａｐｎｙｔ ｄｔｌｄｎｇｇｖｔｈ ｐｒｉｖｔｙｇｔｆｗ ｗｓｇｑｌｉｆｋｇｋ
６６１ ｌｒｔｐｒｑｗｎｔｙ ｎｌｐｓｌｄｋｒｅｔ ｍｋｎｔｖｐｎｅｖｇ ｈｆｅｌｐｙｍｐｇｒ ｃｌｐｎｙｔｌ
配列番号１８ クタウイルスＶＰ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ＿００９５０８８０７）
１ ｍｓｅｐａｎｄｔｎｅ ｑｐｄｎｓｐｖｅｑｇ ａｇｑｉｇｇｇｇｇｇ ｇｇｓｇｖｇｈｓｔｇ ｄｙｎｎｒｔｅｆｉｙ ｈｇｄｅｖｔｉｉｃｈ
６１ ｓｔｒｌｖｈｉｎｍｓ ｄｒｅｄｙｉｉｙｅｔ ｄｒｇｐｌｆｐｔｔｑ ｄｌｑｇｒｄｔｌｎｄ ｓｙｈａｋｖｅｔｐｗ ｋｌｌｈａｎｓｗｇｃ
１２１ ｗｆｓｐａｄｆｑｑｍ ｉｔｔｃｒｄｉａｐｉ ｋｍｈｑｋｉｅｎｉｖ ｉｋｔｖｓｋｔｇｔｇ ｅｔｅｔｔｎｙｎｎｄ ｌｔａｌｌｑｉａｑｄ
１８１ ｎｓｎｌｌｐｗａａｄ ｎｆｙｉｄｓｖｇｙｖ ｐｗｒａｃｋｌｐｔｙ ｃｙｈｖｄｔｗｎｔｉ ｄｉｎｑａｄｔｐｎｑ ｗｒｅｉｋｋｇｉｑｗ
２４１ ｄｎｉｑｆｔｐｌｅｔ ｍｉｎｉｄｌｌｒｔｇ ｄａｗｅｓｇｎｙｎｆ ｈｔｋｐｔｎｌａｙｈ ｗｑｓｑｒｈｔｇｓｃ ｈｐｔｖａｐｌｖｅｒ
３０１ ｇｑｇｔｎｉｑｓｖｎ ｃｗｑｗｇｄｒｎｎｐ ｓｓａｓｔｒｖｓｎｉ ｈｉｇｙｓｆｐｅｗｑ ｉｈｙｓｔｇｇｐｖｉ ｎｐｇｓａｆｓｑａｐ
３６１ ｗｇｓｔｔｅｇｔｒｌ ｔｑｇａｓｅｋａｉｙ ｄｗｓｈｇｄｄｑｐｇ ａｒｅｔｗｗｑｎｎｑ ｈｖｔｇｑｔｄｗａｐ ｋｎａｈｔｓｅｌｎｎ
４２１ ｎｖｐａａｔｈｆｗｋ ｎｓｙｈｎｔｆｓｐｆ ｔａｖｄｄｈｇｐｑｙ ｐｗｇａｉｗｇｋｙｐ ｄｔｔｈｋｐｍｍｓａ ｈａｐｆｌｌｈｇｐｐ
４８１ ｇｑｌｆｖｋｌａｐｎ ｙｔｄｔｌｄｎｇｇｖ ｔｈｐｒｉｖｔｙｇｔ ｆｗｗｓｇｑｌｉｆｋ ｇｋｌｒｔｐｒｑｗｎ ｔｙｎｌｐｓｌｄｋｒ
５４１ ｅｔｍｋｎｔｖｐｎｅ ｖｇｈｆｅｌｐｙｍｐ ｇｒｃｌｐｎｙｔｌ
配列番号１９ Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス（ＣＴＧ－ＶＰ１－３－Ｌｅｕ－ＶＰ２）

【化6】

【0205】

配列番号１９は、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルスのこの株のＶＰ１及びＶＰ２の両方の配列を含む。配列全体は、ＶＰ１に対応するが、ＶＰ２配列は、ＶＰ２の最初のメチオンを示す太字の「Ｍ」で始まる。
配列番号２０ ＷｕｈａｒｖパルボウイルスＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ＿００９５０８８０３）
１ ｍｌｉｗａｌｆｉｗｌ ｆｙｆｈｅｇｔｉｅｑ ｌｎｉｙｈｎｇｎｓｌ ｑｌｌｈｈｓｓｓｌｔ ｇｗｖｐｐｇｙｎｙｌ ｇｐｋｋｆｋｌｑｋｋ
６１ ｐｔｎｐｓｄａａａｒ ｋｈｄｌｅｙｎｋｌｉ ｑｑｇｈｎｐｙｆｙｙ ｎｈａｄｅｄｆｉｋｅ ｔｎｑａｋｄｗｇｇｋ ｆｇｎｙｉｆｒａｋｒ
１２１ ａｌａｐｅｌａｐｐｋ ｋｋｓｋｔｅｋｇｅｐ ｓｙｓｙｋｎｉｋｐｇ ｔｋｒｇｋｐｆｙｌｆ ｖｎｌａｋｋｋｒｍｓ ａｐａａｅｎｎｄｑｑ
１８１ ｐｄａａｅｐｓｖａｇ ａｋａｔｇｇｇｇｇｇ ｇｓｇｖｇｈｓｔｇｓ ｆｎｎｒｔｅｆｉｙｈ ｇｓｅｖｔｉｉｃｈａ ｔｒｈｉｈｌｎｍｐｄ
２４１ ｓｅｅｙｋｉｙｅｔｎ ｒｇｐｒｆｐｔｄｑｔ ｌｑｇｒｄｔｉｎｄｓ ｙｈａｋｖｑｔｐｗｑ ｌｌｈａｎｃｗｇｃｗ ｆｓｐａｄｗｑｑｍｉ
３０１ ｔｔｃｒｅｆｋｖｅｈ ｌｅｑａｉｄｎｉｖｉ ｋｔｖｔｋｑｇｔｇａ ｅｅｉｔｑｙｎｎｄｌ ｔａｌｌｑｖａｅｄｋ ｓｎｌｍｐｗａａｄｎ
３６１ ｍｙｉｄｓｉｇｙｖｐ ｗｒｐｓｋｌｐｔｙｃ ｙｈｖｎｆｗｎｔｉｄ ｉｎａｇａｑｑｎｑｗ ａｅｖｋｋｇｉｑｗｄ ｎｉｑｆｔｐｉｅｎｍ
４２１ ｖｄｉｅｌｌｒｔｇｄ ｒｗｄｓｇｐｙｔｆｙ ｃｋｐｓｓｌｅｙｈｗ ｑｓｔｒｈｔｇｓｃｈ ｐｓｔｔｐｑａｉｇｓ ｖｇｎｎｌｅｔｌｎａ
４８１ ｗｑｗｇｄｒｎｎｐｓ ｓａｓｔｒｖｓｎｆｈ ｉｇｙｓｗｐｅｗｑｆ ｈｙｓｔｇｇｐｖｖｎ ｐｇｑｐｆｓｑａｐｗ ｇｓｅｖａｇｔｒｌｔ
５４１ ｑｇａｓｅｋａｉｙｄ ｗｎｈｇｄｅｅｈｑｆ ｒｅｔｗｗｑｎｎｅｎ ｍｔｇｑｔｎｗａｐｋ ｎｉｈｑｋｅｌｔｎｎ ｖａａｑｔａｆｗａｑ
６０１ ｇｙｈｎｔｆｇｐｆｔ ａｆｄｄｈｇａｑｙｐ ｗｇａｉｗｇｋｅｐｎ ｔｔｈｋｐｌａｓｓｈ ａｐｆｍｔａｎｐｐｇ ｑｉｆｖｋｌａｐｎｙ
６６１ ｔｄｔｖｄｎｎｇｎｓ ｓｒｉｖｔｆｇｔｆｗ ｗｔｇｋｌｖｉｋａｋ ｌｒｔｐｒｑｗｎｔｙ ｑｌｐｓｌａａｒｅｔ ｍｋｅｔｖｐｎｅｉｇ
７２１ ｎｆｅｉｐｙｍｐｇｒ ａｍｐｎｙｔｌ
配列番号２１ ＷｕｈａｒｖパルボウイルスＶＰ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ＿００９５０８８０３．１）
１ ｍｓａｐａａｅｎｎｄ ｑｑｐｄａａｅｐｓｖ ａｇａｋａｔｇｇｇｇ ｇｇｇｓｇｖｇｈｓｔ ｇｓｆｎｎｒｔｅｆｉ ｙｈｇｓｅｖｔｉｉｃ
６１ ｈａｔｒｈｉｈｌｎｍ ｐｄｓｅｅｙｋｉｙｅ ｔｎｒｇｐｒｆｐｔｄ ｑｔｌｑｇｒｄｔｉｎ ｄｓｙｈａｋｖｑｔｐ ｗｑｌｌｈａｎｃｗｇ
１２１ ｃｗｆｓｐａｄｗｑｑ ｍｉｔｔｃｒｅｆｋｖ ｅｈｌｅｑａｉｄｎｉ ｖｉｋｔｖｔｋｑｇｔ ｇａｅｅｉｔｑｙｎｎ ｄｌｔａｌｌｑｖａｅ
１８１ ｄｋｓｎｌｍｐｗａａ ｄｎｍｙｉｄｓｉｇｙ ｖｐｗｒｐｓｋｌｐｔ ｙｃｙｈｖｎｆｗｎｔ ｉｄｉｎａｇａｑｑｎ ｑｗａｅｖｋｋｇｉｑ
２４１ ｗｄｎｉｑｆｔｐｉｅ ｎｍｖｄｉｅｌｌｒｔ ｇｄｒｗｄｓｇｐｙｔ ｆｙｃｋｐｓｓｌｅｙ ｈｗｑｓｔｒｈｔｇｓ ｃｈｐｓｔｔｐｑａｉ
３０１ ｇｓｖｇｎｎｌｅｔｌ ｎａｗｑｗｇｄｒｎｎ ｐｓｓａｓｔｒｖｓｎ ｆｈｉｇｙｓｗｐｅｗ ｑｆｈｙｓｔｇｇｐｖ ｖｎｐｇｑｐｆｓｑａ
３６１ ｐｗｇｓｅｖａｇｔｒ ｌｔｑｇａｓｅｋａｉ ｙｄｗｎｈｇｄｅｅｈ ｑｆｒｅｔｗｗｑｎｎ ｅｎｍｔｇｑｔｎｗａ ｐｋｎｉｈｑｋｅｌｔ
４２１ ｎｎｖａａｑｔａｆｗ ａｑｇｙｈｎｔｆｇｐ ｆｔａｆｄｄｈｇａｑ ｙｐｗｇａｉｗｇｋｅ ｐｎｔｔｈｋｐｌａｓ ｓｈａｐｆｍｔａｎｐ
４８１ ｐｇｑｉｆｖｋｌａｐ ｎｙｔｄｔｖｄｎｎｇ ｎｓｓｒｉｖｔｆｇｔ ｆｗｗｔｇｋｌｖｉｋ ａｋｌｒｔｐｒｑｗｎ ｔｙｑｌｐｓｌａａｒ
５４１ ｅｔｍｋｅｔｖｐｎｅ ｉｇｎｆｅｉｐｙｍｐ ｇｒａｍｐｎｙｔｌ
配列番号２２ ヒトパルボウイルス４ ＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥＥ６９１２９）
１ ｍｓａａｄａｙｒｐｇ ｇｋｌｐｌｄｅｌｍｑ ｒｍｎｒａｉｐｖｇｐ ｅｐｓｓｐａｎｒｇｇ ｇｐｙｑｔｈｆａｉｇ ｉｍｙｓｋａｆｑｇｌ
６１ ｌｋｆａｎａｌｐａｅ ｌｓｐｖｋｑｌｖｎｑ ｌｅｈｙｒｒｋｔｓｄ ｔｒｖｗｙｒｖｙｌｄ ｍｔｒｌｌｉｓｖａｐ ｐｇａａｎｋｌｒｑａ
１２１ ａａｇｉｔｈｓｋａｐ ｎａｅｔｌｒｇｉｖｒ ｆａａａａｆｖｐｔｉ ｅｎｉｄｒｆｆｅｄｓ ｌｔｎｆａｋｅｄｌｄ ｔｗｋｑｌｈｅｑｆｉ
１８１ ｋｌｆｈｐｐｄｖｇｖ ｈｌｖｓｄｓｒｄｅｇ ａｄｓｉｖｅｐｄｌｅ ｒｐａｇｇｇｌｔｌｐ ｇｙｎｙｖｇｐｇｎｐ ｌｄｓｇｐｐｑｇｐｖ
２４１ ｄｅａａｋｈｈｄｅｒ ｙａｅｍｉｅｈｇｄｉ ｐｙｌｈｇｈｇａｄｒ ｌｍｎｋｅｌｅｅｋｋ ｒｒｇｄｉｔｈｌｔｄ ｖｖｖｇｎａｉｒｇｌ
３０１ ｗｑａｋｅｔｖｇｄｉ ａｄｖｑｌｓｑｖｌｐ ｐａｐｐｓｓｄｑｑｐ ａｙｓａｇｅｐｓａｋ ｋａｒｉｇｔｐｅｅｓ ｅｐｔｌｐｖｑｓｄｔ
３６１ ｎｔｍｓｖｅｐａｇｇ ｇｇｇｖｋｖｋａｑｗ ｉｇｇｔｓｆｓｄｓｖ ｖｉｔｓｈｔｒｔｓｍ ｌａｄｒｇｇｙｖｐｖ ｙｋｐｇｓｈｖｄｓｓ
４２１ ｑｐｖｍｇｍｋｔｐｙ ｓｙｉｄｖｎａｌｓａ ｈｆｔｐｒｄｆｑｑｌ ｌｄｅｙｄｅｉｋｐｋ ｓｌｔｉａｉｓａｉｖ ｉｋｄｖａｔｎｑｔｇ
４８１ ｔｎｖｓｄｓａｓｇｇ ｉｔｖｆａｄｄｓｙｄ ｙｐｙｖｌｇｈｎｑｄ ｔｌｐｇｈｌｐｇｅｎ ｙｖｌｐｑｙｇｙｉｔ ｒｇｒｅｉｄｑｑｎｓ
５４１ ｉｖａｉｓｄｈｋｔｅ ｌｆｆｌｅｈｈｄａｅ ｃｌｇｔｇｄｈｗｓｈ ｈｙｅｆｐｄｄｌｐｗ ｒｋｌｓｔｐｎｑｔｌ ｙａｒｈｎｐｉｐｓｓ
６０１ ｒｌａｉｍｔｇｖｄｎ ｄｇｔａｖｗｋｒｐｅ ｇｍｄｖｇｒｌｐｌｎ ｙｖｐｇｐａｌｍｍｐ ｔｄｔｑｉｒｎｔｔｆ ｒｄｐｖａｉｇｎｐａ
６６１ ｔｓｄｒｙｓｖａｐｌ ｖｈｑｐｗｓｖｒｔｅ ｅｗｌａｎｋｔｄｙｓ ｖｈｎｙｌｇｇｖａｙ ｔｒｒｋｈｅｅｓｙｄ ｋｈｅｅｄｒｄｇｒｖ
７２１ ｓｎｐｓｒｖｖｑｉｄ ｇｄｌａａｐｈｖｇｈ ｔｆｆｖｐｇｈｔｒｖ ｔｓｇｇｔｄｔｖｙｓ ｐｋｌｙｑｅｐｖｆｐ ｌｆｐｇａｖｗｎｐｎ
７８１ ｐｌｓｙｄｃｑｉｗｔ ｋｉｐｎｔｅｃｈｆｆ ａｑｙｐｌｌｇｇｗｇ ｖｍｔｐｐｐｍｉｆｖ ｋｌｒｓｑｐｇｐｐｓ ｐｇａｈｔｖｐｑｓｎ
８４１ ｌｎｑｙａｉｆｈｌｈ ｙｓｍｑｆｌｖｋｒｒ ｋｒｓｒｒｈｎｐｅｋ ｐａｐｆｐｔｔｄｓｇ ｒｍｐｆｔｌａｎｓｌ ｑｄｐｓｔｐｖｙｅｖ
９０１ ｐｓｄｑｗｉａｒｎｙ ｓｈｌｌ
配列番号２３ ヒトパルボウイルス４ ＶＰ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥＥ６９１３０）
１ ｍｓｖｅｐａｇｇｇｇ ｇｖｋｖｋａｑｗｉｇ ｇｔｓｆｓｄｓｖｖｉ ｔｓｈｔｒｔｓｍｌａ ｄｒｇｇｙｖｐｖｙｋ ｐｇｓｈｖｄｓｓｑｐ
６１ ｖｍｇｍｋｔｐｙｓｙ ｉｄｖｎａｌｓａｈｆ ｔｐｒｄｆｑｑｌｌｄ ｅｙｄｅｉｋｐｋｓｌ ｔｉａｉｓａｉｖｉｋ ｄｖａｔｎｑｔｇｔｎ
１２１ ｖｓｄｓａｓｇｇｉｔ ｖｆａｄｄｓｙｄｙｐ ｙｖｌｇｈｎｑｄｔｌ ｐｇｈｌｐｇｅｎｙｖ ｌｐｑｙｇｙｉｔｒｇ ｒｅｉｄｑｑｎｓｉｖ
１８１ ａｉｓｄｈｋｔｅｌｆ ｆｌｅｈｈｄａｅｃｌ ｇｔｇｄｈｗｓｈｈｙ ｅｆｐｄｄｌｐｗｒｋ ｌｓｔｐｎｑｔｌｙａ ｒｈｎｐｉｐｓｓｒｌ
２４１ ａｉｍｔｇｖｄｎｄｇ ｔａｖｗｋｒｐｅｇｍ ｄｖｇｒｌｐｌｎｙｖ ｐｇｐａｌｍｍｐｔｄ ｔｑｉｒｎｔｔｆｒｄ ｐｖａｉｇｎｐａｔｓ
３０１ ｄｒｙｓｖａｐｌｖｈ ｑｐｗｓｖｒｔｅｅｗ ｌａｎｋｔｄｙｓｖｈ ｎｙｌｇｇｖａｙｔｒ ｒｋｈｅｅｓｙｄｋｈ ｅｅｄｒｄｇｒｖｓｎ
３６１ ｐｓｒｖｖｑｉｄｇｄ ｌａａｐｈｖｇｈｔｆ ｆｖｐｇｈｔｒｖｔｓ ｇｇｔｄｔｖｙｓｐｋ ｌｙｑｅｐｖｆｐｌｆ ｐｇａｖｗｎｐｎｐｌ
４２１ ｓｙｄｃｑｉｗｔｋｉ ｐｎｔｅｃｈｆｆａｑ ｙｐｌｌｇｇｗｇｖｍ ｔｐｐｐｍｉｆｖｋｌ ｒｓｑｐｇｐｐｓｐｇ ａｈｔｖｐｑｓｎｌｎ
４８１ ｑｙａｉｆｈｌｈｙｓ ｍｑｆｌｖｋｒｒｋｒ ｓｒｒｈｎｐｅｋｐａ ｐｆｐｔｔｄｓｇｒｍ ｐｆｔｌａｎｓｌｑｄ ｐｓｔｐｖｙｅｖｐｓ
５４１ｄｑｗｉａｒｎｙｓｈ ｌｌ
配列番号２４ ヒトパルボウイルス４ ＮＳ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥＥ６９１２８．１）
１ ｍｄａｐａｗｉａｖｌ ｑｉｐｔｇｆｌｓｎｐ ａｎｗｒｄｗｄｇｌｑ ｒｐｒｎｌｌａｄｄｗ ｐｖｑｅｌｒｅｓｖｐ ｌｆｄｈａｖｎｌｇｙ
６１ ｃｉｌｑｑｌｆａｓｈ ａｖｔｌｐｃｒｖｋｐ ｓｍｆｌｑｌｅｐｓｓ ｇｅｅｎｅｍｈｙｈｌ ｖｖｎｑａｄｍｖｇｒ ｅｃｓｎｗｌｒｔｗｋ
１２１ ｖｆｍａｇｙｌｖａｐ ｔｗｔｌｓｗｎｉｒｋ ｔｒｑｇｒｌｙｑａｄ ｍｓｆｖｋｎｙｌｌｐ ｋｌｐｌｎｄｃｙｙａ ｗｔｎｉｄｒｆｅａａ
１８１ ｖｌｓｖｒｎｒｑｌｓ ｇｐｑｇａｉａｌｐｆ ｔｄａｑｐｑａｐａａ ｅｇｖｐｐｔｍａｇｋ ｇｔｑｒｆｍｄｌｉｄ ｗｌｖｅｎｇｉａｔｅ
２４１ ｋｒｗｌｓｖｎｋｌｓ ｙｒｓｆｌｇｓｓｇｇ ｖｌｑａｋｎａｌｑｉ ａｋｒｅｍｖｌａｈｐ ｌｌｇｙｌｔｋｎａｓ ｔｆｅｅｓｎｋｖａｑ
３０１ ｌｆｓｌｎｇｙｎｐｖ ｄａａｗｙｆａａｗａ ｒｇｖｗｐｋｒｒａｉ ｗｌｗｇｐａｓｔｇｋ ｔｌｌａａａｉａｎｌ ｓｐｓｙｇｃｖｎｗｔ
３６１ ｎｑｎｆｐｆｎｄｃｈ ｃｑｓｌｖｗｗｅｅｇ ｒｍｔｅｎｉｖｅｖａ ｋａｖｌｇｇａｐｖｒ ｌｄｖｋｎｋｇｓｅｄ ｙｉｐｔｃｖｉｉｔｓ
４２１ ｎｇｄｌｔｖｔｖｄｇ ｐｖｖｓｔｑｈｑｅａ ｌｑｔｒｉｔｍｆｑｆ ｑｒｍｖｐｄｇｌａｐ ｌｐｅｅｅｖｒｓｆｆ ｋｌｇｅｑｅｌｎｍｋ
４８１ ｇｔｐｐｅｅｆｒｖｐ ｒｎｆｄｋｑｐｍａｓ ｔｓｎｌｐｋａｌｃａ ｐｉｄｅｄｑｖｑｗｄ ｓｅｄｄｗｆｐｐｐｔ ｑｋｒｒｒａｖｑｅｔ
５４１ ｐｐｒｔｐｓｅｉｉｅ ｆｓｓｐｓｐｖａｄａ ｐｐｔｔｐｄｓｐｇｅ ｌｓｌｔｐｔｓｖｓｑ ｉｖｓａｐｆｐｅｅｔ ａｅｒｙｇａｇｄｉｅ
６０１ ａｆｗｓｅｈｖｆｄａ ｄｗａｔｒｌｈｉｃｐ ｐｇｇｐｒｐｙｇｌｆ ｗｔｙｌｗｓｒｅｆｗ ｒｆｋｑｓｖｓｒｓｅ ａｈｌｖｎｒｒｆｉｗ
６６１ ａｗｗ

【0206】

代表的なＧＳＨ配列
配列番号２５ ＰＡＸ５ゲノムセーフハーバー配列
＞ＮＧ＿０３３８９４．１：１８４７１６－１８６３８２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓペアボックス５（ＰＡＸ５）、染色体９上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ（ＬＲＧ＿１３８４）
ＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＡＴＧＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＣＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＴＴＴＴＣＡＴＣＴ
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ＡＣＴＣＴＡＡＧＡＧＧＣＴＴＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＡＴＡ
ＣＡＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＣＡＴＡＴＴＡＴＴＡＣＧＴＡＴＡＣＡＴＡＣＡＣＡＧＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＴＧＣＡＴＧＴ
ＧＴＡＣＧＴＧＴＡＴＡＴＣＧＧＧＡＧＴＧＴＣＴＡＴＡＣＡＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＧＴＧＴＧＡＴＧＣＣＧＴ
ＧＣＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＡＴＣＣＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＣＣＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡ
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ＧＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＴＣＴＡＡＧＣＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＴＴＧ
ＧＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＧＧ
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ＴＴＴＧＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＡＣＴＧＡＧＣＣＣＧＴＴＴＡＣＣＴＧＴＣＡＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＴＴＴＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧＡＣＴ
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ＴＣＴＧＧＧＡＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＧＴＧＣＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＡＴ
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ＣＡＴＴＣＣＴＣＴＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴＧＴＡＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＣＡ
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ＴＣＣＣＣＡＧＡＴＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＣＡＡＴＡＧＧＣＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＴＡＴＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴ
ＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＴＡＴＴＡＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＧＴＡＧＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＣＡＡＡ
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配列番号２６ ＫＩＦ６ゲノムセーフハーバー配列
＞ＮＧ＿０５４９２８．１：３０３７１２－３０５３４８Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓキネシンファミリーメンバー６（ＫＩＦ６）、染色体６上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ
ＡＧＴＧＧＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＡＣＣ
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ＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＴＣＡＡＡＴＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＣＡＡＡＧ
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ＴＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＡＴＴＴＣＴＡＧＣＡＴＣＴＣＴＡＡＧＣＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧ
ＡＡＧＴＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＣＡＴＧＡＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＣＧＣＣＣＴＴＴＧＧＴ
ＧＡＡＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＡＴＣＡＣＡ
ＴＴＴＴＣＣＡＧＧＣＡＴＧＡＣＴＣＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＡ
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ＴＣＡＧＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＡＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＧＧＧＡＧＡＴＴＡＡＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴ
ＧＡＡＡＡＴＧＴＡＡＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＡＧＡＡＴＣＡＡＡＣＡＧ
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ＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＴＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＣＣＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＡＧＡＴＴＡＧ
ＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＴＡＣＴＣＡＡＡ
ＡＡＡＣＡＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＣＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＡＴＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧ
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ＴＧＡＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＣＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＴＡＣＴＡＧＣＡＴＴＴＴ
ＴＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＴＧＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＡＡＧＧＴ
ＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＣＣＡＧＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧ
ＧＴＡＴＴＧＧＡＴＧＴＴＣＡＣＴＣＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＡＧＴＴＡＧＴＴＧＴＴＣＴＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＧ
ＡＴＡＴＴＧＴＡＧＧＡＡＣＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＴＧＧＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＣＡ
ＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＴＴ
ＴＧＧＣＣＣＡＴＧＧＧＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣ

【0207】

追加の代表的なＡＡＶ ＩＴＲ配列
配列番号１、２、及び３と同様に、ＡＡＶ２ ＩＴＲの代表的な配列を本明細書にさらに提供する。

【化7】

Ｂ／Ｂ’及びＣ／Ｃ’ステムの方向は、５’から３’である：Ｂ－＞Ｂ’－＞Ｃ－＞Ｃ’
配列番号２９ ＡＡＶ２ ＩＴＲ「フリップ」配座異性体核酸配列

【化8】

Ｂ／Ｂ及びＣ／Ｃ’ステムの方向は、５’から３’である：ｒＢ’－＞ｒＢ－＞ｒＣ’－＞ｒＣ 「ｒ」は、Ｂ／Ｂ’及びＣ／Ｃ’ステムの逆配列を表す。
配列番号３０ ＡＡＶ２ ＩＴＲ「フロップ」配座異性体核酸配列

【化9】

Ｂ／Ｂ’及びＣ／Ｃ’ステムの方向は、５’から３’である：Ｃ－＞Ｃ’－＞Ｂ－＞Ｂ’
配列番号３１ ＡＡＶ２ ＩＴＲ「フロップ」配座異性体核酸配列

【化10】

Ｂ／Ｂ’及びＣ／Ｃ’ステムの方向は、５’から３’である：ｒＣ’－＞ｒＣ－＞ｒＢ’－＞ｒＢ。「ｒ」は、Ｂ／Ｂ’及びＣ／Ｃ’ステムの逆配列を表す。

【0208】

ＡＡＶ２及び他のＡＡＶ血清型のさらなる代表的なＩＴＲ配列が、当技術分野で知られている。このような配列の例は、少なくとも国際公開ＷＯ２０１７／１５２１４９；Ｌｕｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ３４：４０２－４０９；Ｂｅｒｎｓ（２０２０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３１：５１８－５２３；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３１：１５１－１６２；及びＴｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ １４４：１５５－１６９；に見出すことができ、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0209】

機能的ＡＡＶ ＩＴＲは、図１Ａに示すとおり、（ｉ）ｐ５ Ｒｅｐタンパク質に対する結合部位、（ｉｉ）ニッキング部位（ｔｒｓ）配列、及び（ｉｉｉ）分断されたパリンドローム配列によって形成されるエネルギー的に安定な二次構造を含む核酸配列を含む。

【0210】

当業者であれば、ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、機能的態様、すなわち、ｐ５ Ｒｅｐタンパク質の結合部位、ｔｒｓ配列、及び分断されたパリンドローム配列によって形成される二次構造を保存しているため、可変であるにもかかわらず機能的に同等であり得ることを理解する。特に、記載した理由により、相補的、逆方向、または逆相補的である機能配列を含むＡＡＶ ＩＴＲ配列は、同等に機能する。

【0211】

プロトパルボウイルス及びテトラパルボウイルスのＩＴＲ配列
ＡＡＶ ＩＴＲと同様に、機能的プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスＩＴＲは、（ｉ）ＮＳタンパク質（Ｒｅｐ）に対する結合部位、（ｉｉ）ニッキング部位（ｔｒｓ）配列、及び（ｉｉｉ）分断されたパリンドローム配列によって形成されるエネルギー的に安定な二次構造を含む核酸配列を含む。代表的な配列は、当技術分野で知られている。

【0212】

当業者であれば、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスのＩＴＲ配列が、機能的態様、すなわち、ＮＳタンパク質の結合部位、ｔｒｓ配列、及び分断されたパリンドローム配列によって形成される二次構造を保存しているため、可変であるにもかかわらず機能的に同等であり得ることを理解する。特に、記載した理由により、相補的、逆方向、または逆相補的である機能配列を含むプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスのＩＴＲ配列は、同等に機能する。

【0213】

上記には、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、及びＲＮＡ核酸分子（例えば、ウリジンで置換されたチミジン）、コードされたタンパク質のオルソログまたはバリアントをコードする核酸分子、ならびに上述の配列番号のいずれかの核酸配列、またはその一部と、それらの全長にわたって少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上の同一性を有する核酸配列を含む核酸配列が含まれる。このような核酸分子は、本明細書にさらに記載されるように、全長核酸の機能を有し得る。

【0214】

上記に含まれるのは、タンパク質のオルソログまたはバリアント、ならびに上記のいずれかの配列番号のアミノ酸配列またはその一部と全長にわたって少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子である。このようなポリペプチドは、本明細書にさらに記載されるように、全長ポリペプチドの機能を有し得る。

【0215】

周期的遺伝子発現及び調整可能な遺伝子発現
特定の態様では、本開示の組換えビリオン、医薬組成物、及び／または方法は、周期的及び／または調整可能な遺伝子発現を利用する。本明細書で使用されるとおり、調整可能な遺伝子発現は、例えば、低分子またはオリゴヌクレオチド（例えば、それぞれテトラサイクリンまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯまたはＡＯＮ））を使用して、導入遺伝子の発現を随意に調整して、導入遺伝子の発現をオンにするまたはオフにすることができる。調整可能な遺伝子発現は、多くの場合、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターを使用して達成されるが、調整可能な調節には、転写を超えた遺伝子発現の調節が含まれることが意図される。

【0216】

したがって、調整可能な遺伝子発現は、転写、転写後、翻訳、及び／または翻訳後レベルでの一時的調節を包含することを意図する。調整可能な発現は、遺伝子発現の空間的制御と適合する。例えば、導入遺伝子の空間的制御は、導入遺伝子を組織特異的プロモーター下に置き、その後、時間的制御を媒介する発現調節剤（例えば、テトラサイクリンまたはＡＳＯ）と組み合わせることによって促進させ得る。

【0217】

周期的遺伝子発現とは、一定の間隔で導入遺伝子の産生をオンまたはオフにすることを指す。任意の調整可能な遺伝子発現系を、周期的遺伝子発現に利用することができる。さらに、本明細書では、本明細書に記載の任意の遺伝子発現の調節を周期的遺伝子発現と組み合わせて使用され得ることが企図される。

【0218】

遺伝子療法の成功には、周期的遺伝子発現が重要である。生理的及び長期的なタンパク質発現レベルを得ることは、遺伝子療法の適用において依然として大きな課題である。高レベルでの導入遺伝子発現は、治療後数ヶ月でＥＲストレス及び折り畳まれていないタンパク質応答が誘導され、これが、炎症促進状態及び細胞死につながり、治療の利点が損なわれ得る。周期的導入遺伝子発現戦略（ＰＴＥＳ）は、標的細胞を過剰発現ストレスから守ることができ、時間の経過とともに発現が徐々に低下することなく、導入遺伝子の長期発現が可能になる。さらに、周期的及び／または調整可能な発現により、例えば、導入遺伝子によってコードされるタンパク質の産生効率及び／または安定性が改善され得る。

【0219】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＰＴＥＳは、試薬が発現をオンにするか、または発現の阻害を解除するまで初期状態がオフである調整可能発現系であり、これにより、患者の特定のニーズを満たすために用量を較正可能であり、これにより、さらに安全で、長期的な利益がもたらされる。周期のタイミングは、目的のタンパク質の初期血清レベル（ｔ０）及び半減期（ｔ１／２）から決定することができる（実施例１１を参照）。

【0220】

例示的な調整可能な表現系
テトラサイクリン制御オペレーター系
細菌の調節エレメントであるＥ．ｃｏｌｉのＴｎ１０特異的テトラサイクリン耐性オペロンは、遺伝子発現の調節に使用可能である。例えば、この系には、３つの構成例がある：（１）抑制ベースの構成。この構成では、構成プロモーターと目的の遺伝子との間にＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）が挿入され、ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）がオペレーターに結合することにより、下流の遺伝子発現が抑制される。この系では、テトラサイクリンを添加することにより、ＴｅｔＲとＴｅｔＯとの結合が破壊され、これにより、ＴｅｔＯ依存性の遺伝子発現が引き起こされる。（２）Ｔｅｔ－ｏｆｆ構成。タンデムＴｅｔＯ配列は、最小構成プロモーターの上流に位置し、その後に目的の遺伝子のｃＤＮＡが続く。ここでは、単純ヘルペスウイルス１型由来の真核生物トランスアクチベーターであるＴｅｔＲ及びＶＰ１６（ｔＴＡ）からなるキメラタンパク質を転写活性化因子に変換し、発現プラスミドをオペレータープラスミドと一緒にトランスフェクトする。したがって、テトラサイクリンを含む細胞を培養することにより、外来遺伝子発現のスイッチがオフになり、テトラサイクリンを除去することにより、オンに切り替わる。（３）Ｔｅｔ－ｏｎ構成。テトラサイクリンを成長培地に添加したときに、外来遺伝子が発現する。テトラサイクリンは、ＴｅｔＯ依存性遺伝子発現の調節に必要な低濃度では哺乳動物細胞に対して無毒であるが、継続的に存在することは望ましくない場合がある。したがって、ｒｔＴＡと呼ばれる４つのアミノ酸置換を有する変異体ｔＴＡが、ｔＴＡのランダム突然変異誘発によって発現した。ｔＴＡとは異なり、ｒｔＴＡは、テトラサイクリンの存在下でＴｅｔＯ配列に結合し、それによってサイレント最小プロモーターを活性化する。

【0221】

キュメート（ｃｕｍａｔｅ）制御のオペレーター系
キュメート（ｃｕｍａｔｅ）制御オペレーターは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのｐ－ｃｍｔ及びｐ－ｃｙｍオペロンに由来する。対応するリプレッサーは、プロモーターとｐ－シメン分解経路の最初の遺伝子の始まりとの間の不完全な反復を認識するＮ末端ＤＮＡ結合ドメインを含む。テトラサイクリン制御オペレーター系と同様に、キュメートオペレーター（ＣｕＯ）及びそのリプレッサー（ＣｙｍＲ）は、３つの構成に操作できる：（１）リプレッサー構成、この構成は、構成プロモーターの下流にＣｕＯを配置することによって実現され、ＣｙｍＲがＣｕＯへ結合することにより、下流の遺伝子発現を効率的に抑制する。キュメートを添加することにより、ＣｙｍＲが放出され、それによって下流の遺伝子発現が引き起こされる。（２）活性化因子構成、この構成では、ＣｙｍＲとＶＰ１６との融合によりキメラ分子（ｃＴＡ）が形成される。この構成では、最小のプロモーターが、多量体化オペレーター結合部位（６ｘＣｕＯ）の下流に配置された。（３）逆活性化因子構成、この構成では、ランダム突然変異誘発及びスクリーニングの後、キュメートを添加することにより、ＣｕＯに結合するｃＴＡ変異体（ｒｃＴＡ）が生成された。この構成では、キュメートの添加により、下流の遺伝子発現が引き起こされた。

【0222】

タンパク質間相互作用ベースキメラ系
１．ＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲとの相互作用の制御による標的遺伝子の誘導
ラパマイシン及びその類似体ＦＫ５０６は、サイトゾルタンパク質ＦＫＢＰ１２に結合する。この複合体は、ｍＴＯＲにさらに結合し、三部構成（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）複合体を形成する。したがって、ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲを、それぞれ、ＺＦＨＤ１のＤＮＡ結合ドメイン及びＮＦ－κＢ ｐ６５タンパク質の活性化ドメインと融合させることにより、両方のドメインが架橋され、ラパマイシン依存的に目的の遺伝子の発現が駆動される。ＦＫ５０６及びラパマイシンの免疫抑制効果及び細胞周期阻害効果により、ＦＫ５０６及びシクロスポリンＡ（タンパク質シクロフィリンと複合体を形成した免疫抑制剤）のヘテロ二量体である新しい合成化合物ＦＫＣｓＡが開発され、毒性または免疫抑制効果のいずれも呈しないことが示された。遺伝子発現を引き起こすには、細胞にＦＫＣｓＡを追加することにより、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４ＤＢＤ）と融合したＦＫＢＰ１２及びＶＰ１６と融合したシクロフィリンをつなぎ、それによって上流の活性化配列（ＵＡＳ、Ｇａｌ４ＤＢＤ結合部位）の下流で目的の遺伝子の発現が活性化される。

【0223】

２．ＰＹＬ１とＡＢＩ１との相互作用の制御による標的遺伝子の誘導
アブシジン酸（ＡＢＡ）によって調節される２つの植物タンパク質間の相互作用は、哺乳動物細胞における遺伝子発現を一時的かつ定量的に調節するために使用される。２つのタンパク質は、ＰＹＬ１（アブシジン酸受容体）及びＡＢＩ１（プロテインホスファターゼ２Ｃ５６）であり、植物におけるストレス応答及び発育決定に必要なＡＢＡシグナル伝達経路の重要な役割を果たす。ＰＹＬ１－ＡＢＡ－ＡＢＩ１複合体の結晶構造に従って、ＰＹＬ１（アミノ酸３３～２０９）及びＡＢＩ１（アミノ酸１２６～４２３）の相互作用する相補的表面をキメラタンパク質構築のために選択した。同様に、Ｇａｌ４ＤＢＤは、ＡＢＩ１と融合し、ＶＰ１６はＰＹＬ１と融合した。したがって、このＡＢＡ活性化因子カセット及びＵＡＳ駆動レポーターを哺乳動物細胞にトランスフェクトした後、ＡＢＡは、レポーターの産生を顕著に誘導した。ラパマイシン系と比較して、ＡＢＡ系は、２つの魅力的な利点を有する：第一に、ＡＢＡは、植物抽出物及び油を含む多くの食品中に存在する。その毒性がないことは、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＥＰＡ）による広範な評価によって裏付けられている。第二に、ＡＢＡシグナル伝達経路は、哺乳動物細胞中には存在しないため、ラパマイシン系のように競合する内因性結合タンパク質は存在しない。ＡＢＩ１による予想外の基質のいかなる触媒作用もさらに回避するために、そのホスファターゼ活性にとって重要な変異をキメラタンパク質に導入した。

【0224】

３．光感受性タンパク質間相互作用による標的遺伝子の誘導
光誘導タンパク質間相互作用を利用して、２つの光スイッチ可能な導入遺伝子系を開発した。最初のものは、真菌類の概日リズムの分子基盤からインスピレーションを得た。Ｖｉｖｉｄ（ＶＶＤ）は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来の光受容体及びＬＯＶ（光－酸素－電圧）ドメインを含むタンパク質であり、青色光の活性化により急速に交換される二量体を形成する。したがって、ＶＶＤ及びＧａｌ４残基１～６５からなるキメラタンパク質は、二量体化し、青色光照射下では転写活性化因子になるが、青色光が存在しない場合には、活性二量体は解離する。これは、青色光を利用して、ＵＡＳの下流のレポーターの発現を時空間的にオン／オフの切り替えができることを意味する。さらに、ＶＶＤの突然変異誘発の最適化により、バックグラウンド発現が最小レベルまでさらに減少し、この系の実現可能性がさらに上昇した。別の光スイッチ可能な導入遺伝子系（光活性化可能（ＰＡ）－Ｔｅｔ－ＯＦＦ／ＯＮ）は、クリプトクロム２（Ｃｒｙ２）光受容体及びクリプトクロムと相互作用する塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス１（ＣＩＢ１）からなるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の青色光応答性ヘテロ二量体形成を利用する。Ｃｒｙ２のＮ末端部分にあるフォトリアーゼ相同領域（ＰＨＲ）は、非共有結合によって、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）に結合する発色団結合ドメインである。ＣＩＢ１は、青色光に依存してＣｒｙ２と相互作用する。したがって、誘導性発現系を作製するために、ＰＨＲをｐ６５の転写活性化ドメインと融合し、ＣＩＢ１をＴｅｔＲのＤＮＡ結合ドメイン、二量体化ドメイン及びテトラサイクリン結合ドメイン（残基１～２０６）と融合した。したがって、レポーター遺伝子は、青色光照射により、スイッチをオンにすることができるが、スイッチオフは、青色光が不在であるかまたはテトラサイクリンを添加するかの２つのいずれかの方法で達成できる。一方、テトラサイクリン非感受性変異であるＨ１００Ｙは、純粋に照明に依存するように確立された。同じキメラ構造を適用するが、ＴｅｔＲをｒｔＴＡに置き換えることにより、レポーター遺伝子は、青色光照射またはテトラサイクリンのいずれかでスイッチをオンにし、青色光が不在であるかまたはテトラサイクリンを除去することにより、スイッチをオフにすることができる。概して、光スイッチ可能な導入遺伝子系の２つの利点は、他のすべての系を大きく上回る。１つ目は、オンとオフのサイクルが迅速であることである。概日リズムの性質により、上記の２つのタンパク質間相互作用が動的であり、これが、速い応答及び代謝回転につながる。ルシフェラーゼ発現を誘導するには、１～２分間の短い光パルスでも十分であり、１．１時間後にピークに達し、３時間後にバックグラウンドレベルまで低下することが示されている。他の利点は、正確な空間誘導である。制限された領域または細胞集団内の照明は、高度な照明源を使用して実現でき、これにより、特定の細胞または目的の細胞内領域でレポーター発現が選択的に誘導され得る。これらの固有の機能は、今後の細胞間挙動研究を大幅に促進するのみでなく、臨床遺伝子療法に膨大な可能性をもたらす。

【0225】

４．タモキシフェン制御系
タモキシフェン誘導系は、最もよく特徴付けられた「可逆スイッチ」モデルの１つであり、複数の有益な特徴を有する（例えば、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１５（３）：２２７－２３４により概説されている）。この系では、哺乳動物のエストロゲン受容体のホルモン結合ドメインが異種調節ドメインとして使用される。リガンドが結合すると、受容体は、その阻害複合体から放出され、融合タンパク質は、機能的になる。例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を導入遺伝子と融合させることができ、その産物は、抗エストロゲンタモキシフェンまたはその誘導体４－ＯＨタモキシフェン（４－ＯＨ－ＴＡＭ）によって活性化できるキメラタンパク質である。

【0226】

この系は、ゲノムを改変する調節可能なリコンビナーゼを生成するために、リコンビナーゼと組み合わせて使用されている。例えば、１つまたは２つのプラスミド系を使用して、誘導性遺伝子の発現を達成できる。最初の成功例は、マウスの胚細胞で行われた。２つのプラスミドを一緒にトランスフェクトさせた。１つは、Ｃｒｅ－ＥＲ構成的発現プラスミドで、もう１つは、ＬｏｘＰに隣接した遺伝子トラップ配列とそれに続くβ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）オープンリーディングフレームを含む。結果として、ＬａｃＺの発現は、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ媒介組換えが引き起こされ、遺伝子トラップ配列が切除された場合にのみ回復させることができた。これらの手段により、未分化胚性幹細胞及び胚様体のみでなく、生後１０日のキメラ胎児内の全組織または特定の分化した成体組織内にもレポーター遺伝子を誘導することができた。別の例では、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞中で増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現を誘導し、プラスミド構築を簡素化するために、ＬｏｘＰ部位に隣接するＣｒｅ－ＥＲ ｃＤＮＡをホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターとＥＧＦＰコード配列との間に挿入した。この系では、Ｃｒｅ－ＥＲは、４－ＯＨ－ＴＡＭなしでＥＧＦＰの転写を遮断する遺伝子トラップとして機能する。４－ＯＨ－ＴＡＭによるリコンビナーゼ活性の開始により、Ｃｒｅ－ＥＲカセットが溶解し、ＰＧＫプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰ発現が回復する。内因性ステロイドによる影響を排除するために、主に３つの異なるＥＲが利用される：（１）Ｇ５２５Ｒ変異を有するマウスＥＲＴＭ、（２）Ｇ５２１Ｒ変異を有するヒトＥＲＴ、及び（３）３つの変異Ｇ４００Ｖ／Ｍ５４３／Ｌ５４４Ａを含むヒトＥＲＴ２。

【0227】

５．リボスイッチ調節可能発現系
リボスイッチ制御可能発現系は、ハンマーヘッドリボザイム（アプタザイム）と連結した細菌由来ＲＮＡアプタマーを利用する。アプタマーは、装置全体の分子センサー及びトランスデューサーとして機能し、リボザイムは、コンフォメーション変化及びｍＲＮＡ切断によってシグナルに応答する。例えば、グラム陽性菌のアプタザイムは、過剰なグルコサミン－６－リン酸（ＧｌｃＮ６Ｐ）を直接感知して、ｇｌｍｓ遺伝子のｍＲＮＡを切断することができ、そのタンパク質産物は、フルクトース－６－リン酸（Ｆｒｕ６Ｐ）及びグルタミンをＧｌｃＮ６Ｐに変換する酵素である。テトラサイクリン、テオフィリン、グアニンなどに応答するこれらのアプタザイムは、目的の遺伝子をノックダウン及び過剰発現するように操作させた（例えば、Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５２：７２－７８に概説されるように）。

【0228】

６．ＡＳＯ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）調節発現系
ＡＳＯは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合できる。ＡＳＯは、ＲＮＡレベルで作用してＲＩＳＣ複合体を活性化してｍＲＮＡを分解するか、またはシス作用エレメントの認識を妨害する効果的な遺伝子制御を実証している。ＡＳＯは、細胞に効率的にトランスフェクトする脂質ナノ粒子として日常的に製剤化される。ＡＳＯは、機能獲得（すなわち、ドミナントネガティブ）、転写産物、またはホモ接合性劣性疾患のいずれかの「ノックダウン」用途に使用される。ＡＳＯが変異対立遺伝子からの転写産物に特異的ではないドミナントネガティブ変異によって引き起こされる疾患（例えば、ハンチントン病及び他のポリグルタミン伸長（ｐｏｌｙ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）疾患）では、ベクター送達導入遺伝子を使用して、外因性ＡＳＯとの配列相補性を低下させる代替の同義コドンとの遺伝子置換を用いて、正常な細胞機能の回復が達成され得る。したがって、ＡＳＯは、内因性対立遺伝子から転写産物を枯渇させるが、ベクター駆動転写産物は、影響を受けない。

【0229】

図１１に示すとおり、ＡＳＯは、スプライシングを調節して、遺伝子発現を負または正に制御することができる（Ｈａｖｅｎｓ ａｎｄ Ｈａｓｔｉｎｇｓ（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４：６５４９－６５６３）も参照）。図１１の実施例Ｉは、ＡＳＯ（アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳＯまたはＡＯＮ）が転写後に遺伝子発現を負に調節できることを示す。ＡＳＯがない場合には、一次転写産物は、翻訳可能なｍＲＮＡにスプライシングされる。イントロンの３’末端／エクソン２の５’末端のスプライスアクセプターに相補的なＡＳＯ（赤線）を付加して、スプライシングを妨ぐ。したがって、ＡＳＯの存在下では、イントロンは、転写産物内に残る。イントロンを含むこのプロセシングを受けていないＲＮＡは、翻訳できないか、または翻訳時に非機能的タンパク質を産生する。

【0230】

図１１の実施例ＩＩはまた、ＡＳＯが転写後の遺伝子発現にプラスの影響を及ぼし得ることを示している。一次転写産物（左）には治療用タンパク質をコードする４つのエクソン：エクソン１、エクソン３、及びエクソン４が含まれ、エクソン２は、ナンセンス変異（複数可）またはフレーム外変異（ＯＯＦ）（複数可）のいずれかを含む。このようなエクソン２は、任意の導入遺伝子に操作して含み得る。ＡＳＯがない場合には、転写産物は、プロセシングを受けて、４つのエクソンを含む成熟ｍＲＮＡになる。すなわち、エクソン２には、ナンセンス変異（複数可）またはＯＯＦ変異が残る。したがって、得られたｍＲＮＡは、短縮された、または非機能タンパク質に翻訳される。対照的に、ＡＳＯの付加により、スプライシングが妨害され、成熟ｍＲＮＡはエクソン１、エクソン３、及びエクソン４からなる。すなわち、ナンセンス変異（複数可）またはＯＯＦ変異を有するエクソン２がスプライシングで切り出される。したがって、初期状態（ＡＳＯがない）では、治療用タンパク質は産生されない。ＡＳＯを付加した場合にのみ、治療用タンパク質が産生され、それによって正の調節が行われる。

【0231】

これらのアプローチにより、構成的に活性な導入遺伝子発現のノックダウン、すなわちデフォルトでのオンが可能になる。いくつかの実施形態では、デフォルトのオン状態が好ましい。他の実施形態では、デフォルトのオフ状態が好ましい。

【0232】

血友病Ａの例示的な周期的遺伝子発現
特定の態様では、本明細書で提供される組換えビリオン、医薬組成物、及び方法は、血友病Ａに罹患している対象の遺伝子療法のために周期的遺伝子発現を使用する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯ制御発現系を使用して、血友病Ａに罹患している対象中の肝細胞にヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする遺伝子を導入する。いくつかの実施形態では、周期的遺伝子発現（ＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子が特定の間隔でオン及びオフになる）を使用して、産生されるＦＶＩＩＩの量を調節する（実施例１１を参照）。ＦＶＩＩＩまたはその活性フラグメント（例えば、そのＢドメイン欠失を有する）をコードする導入遺伝子の送達及び調節、本明細書に記載の組成物及び方法により、未だ解決策のない長年の医学的必要性に対処する。

【0233】

２０２０年、ＦＤＡは、血友病Ａ（ＨｅｍＡ）の治療薬としてのバロクトコジーンロクサパルボベク（またはＢＭＮ２７０）のバイオマリン生物製剤ライセンス申請（ＢＬＡ）を承認しなかった。組換えアデノ随伴ウイルス５型（ｒＡＡＶ５）は、ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の遺伝子誘導体をＨｅｍＡ患者の肝臓に送達させた。より高用量では、ＦＶＩＩＩは、生理学的レベル以上のレベルで発現し、患者の循環中に分泌され、治療を受けた患者を効果的に「治癒」させた。しかし、長期的な発現レベルは、３年間の追跡調査中に毎年０．５～０．３３減少した。ＦＶＩＩＩ発現は、臨床的に有益なレベルで維持されているが、ＦＤＡは、発現が同じ割合で低下し続ける場合、患者は、血友病表現型に逆戻りするだろうとの懸念を表明した。発現減少パターンについての決定的な説明はない。血友病Ｂに関する以前の臨床研究では、ＦＩＸ発現の喪失が主にプロセシングされたＡＡＶキャプシド抗原によって誘発される急性炎症に起因することが確立された。しかし、予防的ステロイド治療は、キャプシド免疫応答を減弱させるかまたは排除させ、現在ではこの治療は、肝臓指向ｒＡＡＶ治療において日常的に行われている。ＦＶＩＩＩ発現の喪失の原因となるいくつかの考えられる説明が本明細書において企図される。

【0234】

ＦＶＩＩＩは、以前から微生物または真核生物の発現系のいずれかでの産生が困難である組換えタンパク質である。ＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」欠失型の開発により、オープンリーディングフレームのサイズが縮小し、発現レベルが改善された。しかし、ＦＶＩＩＩ発現レベルは、他のタンパク質よりも依然として大幅に低かった。これらの低レベルを克服するために、Ｂｉｏｍａｒｉｎは、臨床研究でベクターの用量を増加した。患者は、１ｋｇあたり６Ｅ＋１３個のベクター粒子（ベクターゲノム、またはｖｇと呼ばれる）により治療された。大型動物モデルに基づくと、少数の肝細胞がｒＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩを取り込み（形質導入され）、細胞あたりのｖｇ数が多い結果、比較的大量のＦＶＩＩＩを発現する。ＦＶＩＩＩ発現に対する代謝要求は、肝細胞タンパク質の発現に対する通常の要求を破壊させる可能性がある。ＦＶＩＩＩが、タンパク質の折り畳み及び分泌に通常関与する肝細胞の細胞コンパートメントに集積され得る。ＦＶＩＩＩの産生を生じさせる内皮細胞は、この活性に特化している可能性が高く、高度に調節されたネイティブＦＶＩＩＩプロモーターの転写制御下で１つのＸ染色体上の対立遺伝子からＦＶＩＩＩを産生する。

【0235】

したがって、ＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子の発現が徐々に低下するのを防ぐために、導入遺伝子は、一定の間隔でオンとオフを切り替えて、長期的有効性を達成する。周期のタイミングは、血清レベル及びＦＶＩＩＩタンパク質の半減期に基づいて決定する（詳細については、実施例１１を参照）。血友病Ａの予防または治療のためのＦＶＩＩＩの場合、理想的な状態は、一時的に活性化されるまでオフである。ＡＳＯを使用して、一次転写産物中のシス作用エレメントを妨害することにより、マイナス効果またはプラス効果のいずれかを誘発することができ、それにより周期的遺伝子発現の制御に柔軟性がもたらされる。

【0236】

疾患の予防または治療の方法
特定の態様では、本明細書に記載の組換えビリオンまたは医薬組成物を使用して、疾患を予防または治療する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えビリオンは、目的の核酸（例えば、治療用タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸）を対象に一時的に提供し、例えば、組換えビリオンによって形質導入された核酸は、特定の発現期間後に最終的に喪失する。好ましい実施形態では、組換えビリオンによって形質導入された核酸は、細胞内に安定して組み込まれる。

【0237】

いくつかの実施形態では、疾患を予防または治療する方法であって、有効量の本開示の組換えビリオンまたは医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、核酸は、タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、内因性遺伝子の発現を減少させるか、または消失させる。いくつかの実施形態では、疾患を予防または治療する方法が本明細書に提供され、本方法は、（ａ）遺伝子の発現を増加または回復させる核酸を含む、有効量の本明細書に記載の組換えビリオンを、それを必要とする対象に投与することであって、内因性発現が、健康な対象における発現よりも異常に低い、投与すること、または、（ｂ）遺伝子の発現を減少させるまたは消失させる核酸を含む、有効量の本明細書に記載のビリオンを、それを必要とする対象に投与することであって、内因性発現が、健康な対象における発現よりも異常に高い、投与すること、を含む。

【0238】

いくつかの実施形態では、疾患を予防または治療する方法であって、本方法は、（ａ）疾患を有する対象から複数の細胞を得ることと、（ｂ）細胞に本明細書に記載のビリオンを形質導入すること、任意により形質導入された細胞をさらに選択またはスクリーニングすることと、（ｃ）有効量の形質導入された細胞を対象に投与することと、を含む方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象にとって自家である。他の実施形態では、細胞は、対象にとって同種他家である。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで形質導入細胞を調製することには利点がある。まず、患者に投与する前に、標的細胞ゲノム中での導入遺伝子の存在及び位置を検証できるため、これにより、細胞機能への干渉またはオフターゲット効果を回避できる。これにより、ＧＳＨを使用することなく、安全性が改善される。第二に、形質導入された細胞は、組換えビリオンなしで、それを必要とする対象に投与することができる。これにより、免疫応答の引き金となる、または組換えビリオンを不活性化する中和抗体を誘導することに関するあらゆる懸念がなくなる。したがって、形質導入された細胞は、いかなる悪影響を及ぼすこともなく、安全に再投与することができるか、またはその用量を設定することができる。

【0239】

いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞は、血管内、脳内、非経口、腹腔内、静脈内、硬膜外、脊髄内、胸骨内、関節内、滑膜内、髄腔内、動脈内、心臓内、筋肉内、鼻腔内、肺内、皮膚移植、または経口投与を介して投与される。

【0240】

いくつかの実施形態では、疾患は、内皮機能不全、嚢胞性線維症、心血管疾患、腎疾患、がん、ヘモグロビン症、貧血、血友病、骨髄増殖性障害、凝固障害、鎌状赤血球症、アルファ－サラセミア、ベータ－サラセミア、血友病（例えば、血友病Ａ）、ファンコニ貧血、家族性肝内胆汁うっ滞、表皮水疱症、ファブリー、ゴーシェ、ニーマンピックＡ、ニーマンピックＢ、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ムコ多糖症（ＭＰＳ）Ｉ（Ｈｕｒｌｅｒ、Ｓｃｈｅｉｅ、Ｈｕｒｌｅｒ／Ｓｃｈｅｉｅ）、ＭＰＳ ＩＩ（Ｈｕｎｔｅｒ）、ＭＰＳ ＶＩ（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ－Ｌａｍｙ）、血液癌、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、肝硬変、肝細胞癌、膵炎、糖尿病、心筋症、関節炎、性腺機能低下症、心臓疾患、心臓発作、甲状腺機能低下症、耐糖能異常、関節症、肝線維症、ウィルソン病、潰瘍性大腸炎、クローン病、テイ＝サックス病、神経変性疾患、脊髄性筋萎縮症１型、ハンチントン病、カナバン病、リソソーム蓄積症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、乾癬、及び強直性脊椎炎、ならびに自己免疫疾患、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調）、炎症性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ、肺線維症、シェーグレン病、高血糖障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、ウェルナー症候群、妖精症、及び脂肪萎縮性糖尿病）、脂質異常症、高脂血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下、トリグリセリドの上昇、メタボリックシンドローム、肝疾患、腎疾患、心血管疾患、虚血、脳卒中、再灌流中の合併症、筋肉変性、萎縮、老化の症状（例えば、筋萎縮、虚弱、代謝障害、軽度の炎症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、加齢に伴う認知症及び散発性アルツハイマー病、前癌状態、及びうつ病を含む精神状態）、脊髄損傷、動脈硬化、感染症（例えば、細菌性、真菌性、ウイルス性など）、ＡＩＤＳ、結核、胚子発生異常、不妊症、リソソーム蓄積症、活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、（乳児、後期乳児／若年、成人／慢性）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｓｃｈｅｉｅ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオＡ型及びＢ型、マロトー・ラミー、Ｓｌｙ病、ムコリピドーシス、マルチプルスルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ６病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、及びウォルマン病から選択される。

【0241】

いくつかの実施形態では、ヘモグロビン症を予防または治療する方法が本明細書に提供され、本方法は、（ａ）ヘモグロビンサブユニットをコードする核酸を含む、有効量の本明細書に記載のビリオンを、それを必要とする対象に投与すること、または（ｂ）それを必要とする対象から赤血球系列細胞または骨髄細胞を得て、ヘモグロビンサブユニットをコードする核酸を含む本明細書に記載のビリオンを細胞に形質導入し、任意により、形質導入された細胞をさらに選択またはスクリーニングすることと、有効量の細胞を対象に投与することと、を含む。いくつかの実施形態では、ヘモグロビン症は、ベータ－サラセミアまたは鎌状赤血球症である。

【0242】

特定の態様では、プロトパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質もしくはそのバリアントもしくはその遺伝子型バリアントを含む少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物を使用して、疾患を予防または治療する方法が本明細書に提供される。

【0243】

イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）は、最も研究されているプロトパルボウイルス種のうちの１つである。ＣＰＶは、野生犬及び飼い犬に感染する。ＣＰＶのゲノムサイズは、約５．３ｋｂで、ＡＡＶより６００ｂｐ大きい。ＣＰＶは、ゲノムが大きいことにより、ＡＡＶ由来ベクター中には収容できないヒト細胞での遺伝子導入にとって特に有望である。ＣＰＶは、通常ヒトに感染しないため、ヒト集団中には、ＣＰＶに対する体液性免疫が既存しない。すなわち、ヒトは、ＣＰＶキャプシド抗原に対して血清陰性である。これは、ＡＡＶとはまったく対照的である。ヒトは、ＡＡＶキャプシド抗原に対して血清陽性であるため、中和ＡＡＶ抗体の存在により、ＡＡＶ遺伝子療法について適格である患者の大部分が除外される。したがって、ヒトにおいては、ＣＰＶ抗原に対する中和抗体が欠如しているため、ＣＰＶウイルス粒子、またはＣＰＶまたはそのバリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオンは、ＡＡＶ由来ベクターでは効率的に治療できない様々なヒト遺伝性疾患を予防または治療するための非常に強力な遺伝子療法用途に特に有用となる。ＣＰＶは、細胞に侵入するための細胞受容体としてイヌトランスフェリン受容体（ＴｆＲまたはＣＤ７１）を使用し、このタンパク質は、イヌ宿主細胞の外膜で発現する（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｌｙｉ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＣＰＶはまた、ヒトＴｆＲ対応物と相互作用することができるため、内在化し、ヒト細胞に形質導入される。さらに、上記のように、ＣＰＶのＶＰ２キャプシドタンパク質は、標的細胞相互作用の向性及び特異性／親和性、最終的には標的細胞の形質導入の効率を変化させる１つ以上の変異を含むように操作することができる。

【0244】

本明細書に記載のとおり、プロトパルボウイルスは、標的細胞上に発現するトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）との相互作用を介して細胞に形質導入する。ＴｆＲまたはＣＤ７１は、血液脳関門（ＢＢＢ）の主要エレメントである脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）中に発現する（Ｎａｖｏｎｅ，Ｍａｒｆｉａ ｅｔ ａｌ．２０１３）。ＢＢＢは、可溶性物質及び細胞性物質の両方が血液から脳内へ通過するための主な制限を構成する。ＣＤ７１は、受容体特異的トランスシストーシスを駆動し、抗体などの巨大分子を脳実質に送達するための代替手段となっている。したがって、プロトパルボウイルス（例えば、ＣＰＶ）は、ＣＤ７１の使用を活用して、全身投与を介して脳に移行し、脳細胞に形質導入して、これらに限定されないが、脊髄性筋萎縮症１型、ハンチントン病、カナバン病、及びリソソーム蓄積症など、様々な神経変性疾患及び神経筋疾患を予防または治療することができる。ＴｆＲまたはＣＤ７１は、分化の初期段階の赤血球前駆細胞及びＢリンパ芽球細胞中でも高度に発現する。ＣＤ７１発現は、リンパ系または赤血球系に分化する前に、前駆細胞におけるＣＤ３４発現と一時的に重複する。したがって、プロトパルボウイルス（例えば、ＣＰＶ）は、幹細胞に形質導入することができ、幹細胞から分化後、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞由来の治療法に使用できる。これらの用途の一部は、がん治療、抗微生物薬、または自己免疫関連の治療法に使用される。ＨＳＣが骨髄前駆細胞系統に分化した後、ＣＤ７１／ＴｆＲは、無核赤血球を産生する最終段階の前に、赤血球生成中に、好塩基性風土性バーキットリンパ腫（ＥＢＬ）、多染性赤芽球及び正染性赤芽球で高度に発現し、このため、プロトパルボウイルス（例えば、ＣＰＶなど）ベクターは、ヘモグロビン遺伝子の抗鎌状赤血球型を発現することにより、鎌状赤血球症などの非悪性異常ヘモグロビン症の治療または予防に使用できる。

【0245】

特定の態様では、ブファウイルス、クタウイルス、またはｔｕｓａｖｉｒｕｓの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントを含む少なくとも１つの組換えビリオンを使用して、疾患を予防または治療する方法が本明細書に提供される。ブファウイルス、クタウイルス、ｔｕｓａｖｉｒｕｓ、または上記ウイルスのいずれか１つの少なくとも１つのキャプシドタンパク質もしくはそのバリアントを含む組換えビリオンは、胃腸障害及び他の標的組織に対して広範な用途を有する。例えば、クタウイルスは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫及び黒色腫患者の皮膚サンプルから単離されており、Ｔ細胞及びＢ細胞に対する向性を示す。このような向性により、クタウイルスは、リンパ前駆細胞における遺伝子導入用途、及びその後の（ｉ）ＣＡＲ－Ｔなどの分化Ｔ細胞及び関連がん治療法、または（ｉｉ）分化Ｂ細胞におけるその後の用途、及び侵入する病原体、腫瘍細胞（例えば、腫瘍抗原またはネオアンチゲン）、または慢性自己免疫疾患に対する治療用ヒト抗体を発現させるためのそれらの用途にとって有望のものになる。

【0246】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンは、クタウイルスのキャプシドタンパク質（複数可）またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／またはリンパ前駆細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞は、がんを予防または治療する。

【0247】

特定の態様では、テトラパルボウイルス、例えば、ヒトパルボウイルス４（ＰＡＲＶ４）の少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントを含む少なくとも１つの組換えビリオンを使用して、疾患を予防または治療する方法が本明細書に提供される。テトラパルボウイルス属には、ヒトパルボウイルス４（ＰＡＲＶ４）、ブタパルボウイルス２、ストローオオコウモリパルボウイルス、ヤクパルボウイルス、ブタホコウイルス、及びヒツジホコウイルスが含まれる。ヒトパルボウイルス４（ＰＡＲＶ４）は、注射薬の使用によりＨＩＶに感染するリスクのあるヒトの血漿中で最初に検出された（Ｊｏｎｅｓ，Ｋａｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ．２００５）。ＰＡＲＶ４のゲノムは、約５．３Ｋｂで、ＡＡＶよりも９００ヌクレオチド大きい。ＰＡＲＶ４のキャプシドは、温度に対する耐性が高いため、非常に用途の広く、安定したウイルスベクターとなっている。ＰＡＲＶ４は、特定の地理的地域で風土病だが、他の場所では、薬物を注射するヒト（ＰＷＩＤ）及び複数回の輸血の既往があるヒトなど、ＨＩＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶ感染患者などの特定の高リスク群に限定されて発見されている。ＰＡＲＶ４が、実際に、観察された疾患を引き起こしているのか、それとも非常に曝露された（ウイルス感染の）リスクのある集団で検出された非病原性の日和見ウイルスなのかは依然として不明である。一般集団におけるＰＡＲＶ４の血清有病率は、世界の様々な地域で０％～２５％の範囲で変動する（Ｓｈａｒｐ，Ｌａｉｌ ｅｔ ａｌ．２００９）。慢性ウイルス感染症患者における抗ＰＡＲＶ４抗体の有病率は、世界の様々な地域で１５～３５％であると報告されているが、他の西側諸国の健康な個体における有病率は、１％未満であることが示されている。英国の献血者のＰＡＲＶ４ ＩｇＧスクリーニングでは、霊長類ＡＡＶ抗原で、観察された血清陽性率よりも有意に低い４．８％の血清陽性率が特定された（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．２０１７）。これは、ＰＡＲＶ４を遺伝子療法ベクターとして使用することの主な利点の１つを強調している。米国などいくつかの西側諸国の集団における中和抗体の血清有病率の低下と、特定の標的組織に対する向性により、これは用途の広い遺伝子療法ベクターになる。ＰＡＲＶ４の向性及び潜伏部位は、完全には理解されていないが、説得力のあるデータは、骨髄、気道、肝臓、及び腸が、潜在的なウイルス複製部位を表し、潜伏または持続的な感染個体のウイルスの貯蔵庫であり得ることを示唆している。したがって、ＰＡＲＶ４ベクターは、血液疾患を含む広範囲のヒト疾患を予防または治療するための治療用遺伝子の送達に特に有用である。

【0248】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物は、ヘモグロビン遺伝子（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、及び／またはＨＢＺ）、アルファヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、フォン・ヴィレブランド因子、ジストロフィンまたは短縮型ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィンまたは短縮型ユートロフィン、マイクロユートロフィン、ウシェリン（ＵＳＨ２Ａ）、ＣＥＰ２９０、ＩＮＳ、Ｆ８またはそれらのフラグメント（例えば、Ｂドメイン欠失ポリペプチド（例えば、ＶＩＩＩ ＳＱ、ｐ－ＶＩＩＩ）をコードするフラグメント）、及び嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）から選択されるタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む。

【0249】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物は、以下に形質導入される：（ａ）ＣＤ３４＋幹細胞、任意によりｅｘ ｖｉｖｏで形質導入される；（ｂ）間葉系幹細胞、任意によりｅｘ ｖｉｖｏで形質導入される；（ｃ）肝臓細胞、（ｄ）小腸細胞、及び／または（ｅ）肺細胞。

【0250】

例えば、いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルス（例えば、ＰＡＲＶ４）の少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオンは、ＣＤ３４＋幹細胞中において、ｅｘ ｖｉｖｏ修飾（例えば、治療用遺伝子及び／または疾患関連変異遺伝子を下方制御する剤の送達）のために使用される。いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルス（例えば、ＰＡＲＶ４）の少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオンは、間葉系幹細胞中において、ｅｘ ｖｉｖｏ修飾（例えば、治療用遺伝子及び／または疾患関連変異遺伝子を下方制御する剤の送達）のために使用される。いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルス（例えば、ＰＡＲＶ４）の少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオンは、好ましくは経口投与を介して小腸に送達される。いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、全身静脈内投与を介して肝臓細胞に投与される。いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、好ましくは肝動脈または門脈を介して肝臓細胞に投与される。

【0251】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物は、（ａ）ＣＦＴＲまたはそのフラグメント；（ｂ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物は、鼻腔内または肺内投与を介して肺に送達される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物は、（ａ）形質導入細胞中でのＣＦＴＲまたはそのフラグメントの発現を増加させる；及び／または（ｂ）形質導入細胞中でのＣＦＴＲの内因性変異形態の発現を減少させる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物は、嚢胞性線維症を予防または治療する。

【0252】

いくつかの実施形態では、疾患を予防または治療する方法は、少なくとも１つの追加量のビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞を再投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加量の再投与は、初期有効量ビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞の投与後の治療の減弱後に行われる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の量は、初期有効量と同じである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加量は、初期有効量より多い。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の量は、初期有効量より少ない。特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の量は、内因性遺伝子及び／または組換えビリオンの核酸の発現に基づいて増加または減少させる。内因性遺伝子には、発現が、例えば疾患の診断及び／または予後に指標となるか、またはそれに関連するバイオマーカー遺伝子が含まれる。

【0253】

特定の態様では、疾患を予防または治療する方法は、核酸の発現を調節する剤を対象に投与すること、または細胞を上記剤に接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、剤は、低分子、代謝産物、オリゴヌクレオチド、リボスイッチ、ペプチド、ペプチド模倣体、ホルモン、ホルモン類似体、及び光から選択される。いくつかの実施形態では、剤は、テトラサイクリン、キュメート（ｃｕｍａｔｅ）、タモキシフェン、エストロゲン、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、剤を間隔をおいて１回または複数回再投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、剤の再投与は、核酸の周期的発現（ｐｕｌｓａｔｉｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をもたらす。いくつかの実施形態では、間隔間の時間及び／または剤の量は、核酸から発現したタンパク質の血清濃度及び／または半減期に基づいて増加または減少する。

【0254】

特定の態様では、細胞内の（ｉ）遺伝子発現、または（ｉｉ）タンパク質の機能及び／または構造を調節する方法がさらに本明細書に提供され、この方法は、細胞内の遺伝子発現またはタンパク質の機能及び／または構造を調節する核酸を含む、本明細書に記載のビリオンまたは医薬組成物を細胞に形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、そのような核酸は、ＣＲＩＳＰＲｉ剤またはＣＲＩＳＰＲａ剤をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子発現、またはタンパク質の機能及び／または構造が増加するかまたは回復する。いくつかの実施形態では、遺伝子発現、またはタンパク質の機能及び／または構造が減少するかまたは消失する。

【0255】

例示的疾患
特定の態様では、本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、様々な疾患の予防及び／または治療に使用され得る。

【0256】

プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオン及び／または医薬組成物は、造血細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞、赤血球系列細胞、巨核球、赤血球前駆細胞（ＥＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３６＋細胞、間葉系幹細胞、神経細胞、腸細胞、腸幹細胞、腸上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、エンテロサイト、肝臓細胞（例えば、肝細胞、肝星細胞（ＨＳＣ）、クッパー細胞（ＫＣ）、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ））、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）、赤血球前駆細胞、リンパ前駆細胞、Ｂリンパ芽球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好塩基性風土性バーキットリンパ腫（ＥＢＬ）、多染性赤芽球、及び／または正染性赤芽球の形質導入に有用である。

【0257】

さらに、本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、核酸（例えば、治療用核酸）をｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、ウイルス向性を介して特定の組織を標的として、例えば、対象に直接投与する）ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ（対象から複数の細胞を得て、組換えビリオンを使用して当該細胞に形質導入し、有効数の形質導入細胞を対象に投与する）で送達するのに特に有用である。

【0258】

ヘモクロマトーシス
経口投与されたプロトパルボウイルス遺伝子療法ベクターの生体内分布は、腸上皮におけるＴｆＲ媒介トランスサイトーシスによって決定される。遺伝子療法ベクターによる腸上皮バリアの転座により、その生体内分布が拡大し得る。本明細書に記載のプロトパルボウイルスキャプシド（例えば、ＶＰ２）の合理的修飾によって、本発明は、腸上皮内において、内腔から固有層へのトランスサイトーシスができないためにエンテロサイトに制限された向性、または主にエンテロサイトを標的とする向性を有するそのような操作されたウイルスベクターの使用を包含する。このような操作されたビリオンを使用する遺伝子療法は、遺伝性ヘモクロマトーシスなどの腸上皮中の遺伝性疾患を予防または治療するための理想的な手段を提供する。

【0259】

遺伝性ヘモクロマトーシス（ＨＨ）は、常染色体劣性遺伝病であり、白人において最も有病率の高い遺伝病である（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｓ；Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ，ｃｄｃ．ｇｏｖ）。米国では推定１００万人が遺伝性ヘモクロマトーシスを有し、これは、嚢胞性線維症及び筋ジストロフィーを合わせた有病率を上回る（Ｂａｃｏｎ，Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９９）。ＨＨは、鉄吸収の調節不全を特徴とする。ＨＨ患者では、鉄の吸収が不十分であり、身体が過剰に鉄を吸収する。高レベルの細胞内鉄沈着は、遺伝毒性酸素ラジカル及び脂質過酸化の形成を誘導し、炎症促進応答を確立し、複数の臓器に対して慢性的な損傷を引き起こす。この疾患の臨床的特徴は、肝臓、心臓、及び膵臓の実質細胞における鉄の数十年にわたる継続的な蓄積の結果として生じる。最も進行した形態では、ＨＨは、肝硬変、肝細胞癌、糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、性腺機能低下症、心筋症、関節炎、及び皮膚の色素沈着として現れる。腸絨毛内のエンテロサイトは、腸腔からの鉄の頂端側の取り込みを媒介し、その後、鉄は、細胞から循環へと排出される。頂端二価金属トランスポーター１（ＤＭＴ１）は、内腔から細胞内に鉄を輸送するが、基底側膜結合トランスポーターであるフェロポーチンは、鉄をエンテロサイトから循環系に輸送する（Ｅｚｑｕｅｒ，Ｎｕｎｅｚ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＨＨ患者は、経上皮鉄取り込み量の増加を示し、これが身体内の鉄の蓄積及びその後の慢性合併症（肝硬変、肝細胞癌、膵炎、心筋症、関節炎、及び糖尿病）を引き起こす。

【0260】

遺伝性ヘモクロマトーシスの最も一般的な原因は、染色体６上で特定されるヒト恒常性鉄調節因子（ＨＦＥ）遺伝子の変異である。ＨＦＥ中の変異は、ＨＨ症例のほぼ９０％の原因である。ＨＦＥ遺伝子は、主要組織適合性複合体ＭＨＣクラスＩ様分子をコードする。ＨＦＥは、β２ミクログロブリンに結合し、これによって原形質膜への局在が決定される（Ｗａｈｅｅｄ，Ｐａｒｋｋｉｌａ ｅｔ ａｌ．１９９７）。ＨＨに関連するＨＦＥについて記載されている主な変異は、エクソン４中での１つのヌクレオチドの変化であり、その結果、未プロセシングのＨＦＥタンパク質の２８２位（Ｃ２８２Ｙ）において、システインのアミノ酸のチロシンへの置換が生じる（Ｆｅｄｅｒ，Ｇｎｉｒｋｅ ｅｔ ａｌ．１９９６）。この変異は、ゴルジ体における適切な翻訳後プロセシングに影響を与え、β２－ミクログロブリンとの相互作用、及びその後の細胞膜中への局在を破壊する（Ｆｅｄｅｒ，Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｗａｈｅｅｄ， Ｐａｒｋｋｉｌａ ｅｔ ａｌ．１９９７）。ＨＦＥタンパク質の６３位（Ｈ６３Ｄ）において、ヒスチジンがアスパラギン酸部分に置き換わるＨＦＥ遺伝子中の第２の変異も報告されている（Ｇｏｃｈｅｅ，Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００２）。変異して折り畳まれていないＨＦＥタンパク質は、ＥＲ－ゴルジネットワークに蓄積され、折り畳まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）の活性化を誘導し、したがって、炎症促進プログラム及びその後の疾患の転帰を悪化させる（ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ ａｎｄ ｄｅ Ｓｏｕｓａ ２００８，Ｌｉｕ，Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１１）。ＨＦＥは、腸細胞中で鉄輸入機構及び鉄排出機構の両方の活性を調整し、肝臓におけるヘプシジン遺伝子の転写制御に関与する多タンパク質複合体の一部である。ＨＦＥ機能の喪失は、鉄の取り込みの負の調節因子であるヘプシジン発現の大幅な減少にも関連する。ＨＦＥまたはヘプシジンの欠如により、結果的に食事からの鉄の取り込みが増加し、様々な臓器内に蓄積される。

【0261】

本疾患のもう１つのより重篤な形態は、若年性ヘモクロマトーシス（ＪＨ）である。このタイプのヘモクロマトーシスは遺伝し、ＩＩ型ヘモクロマトーシスと呼ばれる。ＩＩ型ヘモクロマトーシスは、影響を受けた遺伝子に応じて、ＩＩａ型またはＩＩｂ型に分類される。ＩＩａ型及びＩＩｂ型では、早期の鉄過剰症の発症は、３０歳未満で生じる。その結果、重度の心臓疾患または心臓発作、甲状腺機能低下症、月経がほとんどもしくはまったくない、または性腺機能低下症が引き起こされる。ヘモクロマトーシスＩＩａ型は、染色体１９中のヘプシジン遺伝子中の常染色体劣性変異によって引き起こされる。

【0262】

若年性ヘモクロマトーシスは、典型的には生後１０年～３０年に起こる重度の鉄過剰症の発症を特徴とする。男性及び女性が同様に罹患する。顕著な臨床的特徴としては、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、心筋症、耐糖能異常及び糖尿病、関節症、及び肝線維症または肝硬変が挙げられる。肝細胞癌は、時折報告されているが、心臓病変が罹患率及び死亡率の主因である。

【0263】

興味深いことに、この疾患の唯一受け入れられている治療法は古式なもの（ｍｅｄｉｅｖａｌ）であり、主に赤血球内のヘム分子との非共有結合によって生じる鉄負荷を減少させるための定期的な出血（瀉血）が必要である。現在は、血清フェリチンレベルが、５０ｎｇ／ｍｌ未満低下し、トランスフェリン飽和度が、３０％未満の値まで低下するまで（２～３年を要する）最初は、それぞれ２００～２５０ｍｇの鉄を含む１～２単位の血液（５００～１０００ｍｌ）を毎週取り除く。トランスフェリン飽和値を５０％未満、血清フェリチンレベルを１００ｎｇ／ｍｌ未満に維持するには、出血はそれほど多くないが、生涯にわたる維持療法が必須である（Ｗｏｊｃｉｋ，Ｓｐｅｅｃｈｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２００２）。

【0264】

様々な病因によるヘモクロマトーシスに対する１つの治療法は、エンテロサイト中でのｓｉＲＮＡの使用によるＤＭＴ１タンパク質合成の阻害であり、これは腸上皮細胞による頂端の鉄取り込みを顕著に阻害する（Ｅｚｑｕｅｒ，Ｎｕｎｅｚ ｅｔ ａｌ．２００６）。二価金属輸送体ＤＭＴ－１は、最近、銅イオンも輸送することが示された（Ａｒｒｅｄｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、ＤＭＴ－１遺伝子発現の阻害は、細胞からの銅の排出が減少する状態であるウィルソン病において、肝損傷を減少させるのに重要である。ＨＨ患者におけるエンテロサイト中での制御されていない鉄の取り込みが減少することにより、いくつかの罹患臓器中での鉄の蓄積が制限される。

【0265】

鉄負荷を制御する別のアプローチは、エンテロサイト中において、フェロポーチン遺伝子の発現を阻害し、基底側の鉄の排出を減少させることである。この場合、吸収された鉄は、エンテロサイト内にのみ蓄積する。さらに、鉄の蓄積は、ＩＲＥ／ＩＲＰ機構による頂端ＤＭＴ－１輸送体遺伝子の発現の減少をもたらし、二重の阻害効果を生み出すこととなる。さらに、蓄積された鉄はいずれも、腸腔へのエンテロサイトの正常な剥がれ落ちによって失う。

【0266】

エンテロサイト内で野生型ＨＦＥを発現させるために、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントを含む組換えビリオンを使用することにより、ＨＦＥ活性を回復させることができ、またＤＭＴ－１及びフェロポーチンの発現を積極的に調節することができ、それによって広範な治療効果を持つことになる。ＤＭＴ－１をサイレンシングするために野生型ＨＦＥ及びｓｉＲＮＡを同時発現及び／または同時投与する、本明細書に記載の１つ以上の組換えビリオンを使用する併用戦略も、臨床利益を向上させ得る。

【0267】

ペプチドヘプシジンは、鉄代謝の重要な調節因子である。これは、主に肝臓内で合成され、２０～２５アミノ酸のペプチドとして分泌される。ヘプシジン遺伝子の変異は、若年性ヘモクロマトーシスの原因となる（Ｒｏｅｔｔｏ，Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．２００３）。ＨＦＥは、肝臓中でのヘプシジンの発現を調節する。ヘプシジンは、細網内皮マクロファージ及び鉄の腸吸収を媒介するエンテロサイトからの鉄の放出を負に制御する（Ｎｅｍｅｔｈ，Ｔｕｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｎｅｍｅｔｈ，Ｒｏｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｒｉｖｅｒａ，Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００５）。肝臓中でヘプシジンを送達し発現させるための本明細書に記載の組換えビリオンの使用は、身体による鉄の取り込みを減少させ、鉄過剰症に関連する毒性を減少させることができ、それによってすべての形態のヘモクロマトーシスを予防することができる。

【0268】

遺伝性ヘモクロマトーシスの主な特徴のうちの１つは（例えば、機能的なＨＦＥタンパク質の欠如に起因する）、ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）など、エンテロサイト中での鉄恒常性に関与する因子の上方制御である。上述のように、ＴｆＲまたはＣＤ７１は、プロトパルボウイルスまたはそのキャプシドタンパク質の少なくとも１つを含む組換えビリオンの形質導入を促進する、プロトパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス）の細胞受容体である。したがって、遺伝性ヘモクロマトーシスに罹患している対象におけるＴｆＲの上方制御は、プロトパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス）の少なくとも１つキャプシドタンパク質またはそのバリアントを含む組換えビリオンを使用して、エンテロサイト中での鉄恒常性に関与する様々なタンパク質の発現を調節する治療用遺伝子及び／または剤を標的にし、濃縮する絶好の機会を提供する。プロトパルボウイルスまたはそのキャプシドタンパク質の少なくとも１つを含む組換えビリオンのゲノムサイズが大きいことにより、ヘモクロマトーシスを予防または治療するための遺伝子療法のためのより大きな遺伝子及び／または剤をパッケージングする際の柔軟性がさらにもたらされる。

【0269】

特定の態様において、本明細書において提供されるのは、以下をコードする核酸を含む少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞を使用して、疾患を予防または治療する方法である：（ａ）ヘプシジンまたはそのフラグメント、及び／または恒常性鉄調節因子（ＨＦＥ）またはそのフラグメント；（ｂ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【0270】

いくつかの実施形態では、フラグメントは、生物学的活性フラグメントである。

【0271】

いくつかの実施形態では、対象には、以下をコードする核酸を含む少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が投与される：
ａ）ヘプシジンまたはそのフラグメント、ここで、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が対象に静脈内投与され、任意により、（ｉ）当該核酸がプロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝細胞に形質導入される；
ｂ）ＨＦＥまたはそのフラグメント、ここで、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が対象に静脈内投与され、任意により、（ｉ）当該核酸がプロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝細胞に形質導入される；
ｃ）ＨＦＥまたはそのフラグメント、ここで、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が対象に経口投与され、任意により、（ｉ）当該核酸がプロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物がエンテロサイトに形質導入される；
ｄ）ＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）であって、ここで、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が対象に静脈内投与され、任意により、（ｉ）当該核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝細胞に形質導入される；
ｅ）ＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、ここで、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が対象に経口投与され、任意により、（ｉ）当該核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される；
ｆ）ＤＭＴ－１を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、ここで、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が対象に経口投与され、任意により、（ｉ）当該核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される；
ｇ）フェロポーチンを標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、ここで、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が対象に経口投与され、任意により、（ｉ）核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される；または
ｈ）ａ）～ｇ）のいずれか２つ以上の組み合わせ。

【0272】

いくつかの実施形態では、この方法は、ｂ）～ｅ）のいずれか１つの２つ以上の組み合わせを含む。

【0273】

いくつかの実施形態では、組換えビリオンまたは医薬組成物は、ａ）形質導入細胞におけるＨＦＥまたはそのフラグメント、及び／またはヘプシジンまたはそのフラグメントの発現を増加させる；及び／またはｂ）形質導入細胞におけるＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態の発現を減少させる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞は、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、及び／またはウィルソン病を予防または治療する。

【0274】

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）には、ヒトの消化管の慢性炎症を伴う一連の疾患が含まれる。ＩＢＤの最も一般的な形態は、潰瘍性大腸炎及びクローン病である。これらは、慢性的に再発する腸炎症を特徴とする複雑な多因子疾患である。病因は依然としてその多くが不明であるが、最近の研究では、遺伝的要因、環境、微生物叢、及び自己免疫応答が病因の寄与因子であることが示唆されている（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｇｏｋｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．２００２）。米国では、推定３００万人がＩＢＤと診断されており（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ，ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｉｂｄ／ｄａｔａ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｈｔｍ）、毎年７０，０００人が新たにクローン病または潰瘍性大腸炎と診断されている。現在、これらの疼痛を伴う疾患を治癒させる方法はなく、治療による年間推定医療費は、６３億ドルである（Ｌｉｍａｎｓｋｉｙ，Ｖｙａｓ ｅｔ ａｌ．２０１９）。ＩＢＤに関連する多因子構成要素は、ＮＦｋＢ経路によって活性化される遺伝子によって基本的に媒介される、炎症誘発性プログラムの活性化に集中する。ＩＢＤの病理生物学を媒介する、ＩＢＤ中に誘導される主な炎症誘発性サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２及びＩＬ－６である。異なるプロトパルボウイルス及びテトラパルボウイルス由来のビリオンの低ｐＨに対する高い耐性、及びこれらのウイルスベクターのヒトエンテロサイトに形質導入する能力を考慮すると、本開示の組換えビリオンは、様々なサイトカインの発現及び／または機能同様に、その後の胃腸上皮バリアの完全性の維持を調節するための新規な治療アプローチを構成する。

【0275】

いくつかの実施形態では、プロトパルボウイルスもしくはテトラパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオン、または操作されたキャプシドタンパク質を含むビリオンは、可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、及び／または可溶型のＩＬ－１β受容体の発現に使用される。上記これらの可溶型の受容体は、小腸固有層に分泌され得、そこでリガンド（例えば、炎症誘発性サイトカイン）を特異的に中和する。

【0276】

可溶型の膜結合受容体は、可溶性分泌形態の受容体をコードする遺伝子を送達することによって発現させることができる。例えば、ＴＮＦαの１７ｋＤａ可溶性部分は、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ；ＡＤＡＭ－１７）による２６ｋＤａのＩＩ型膜貫通アイソフォームのタンパク質分解的切断後に細胞から放出されることが知られている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ５３：４５－５３）。したがって、シグナルペプチド（例えば、ＩＬ－２シグナルペプチド；例えば、Ａｒｄｅｓｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７３：３９３８－３９５０を参照）に融合された１７ｋＤａ部分（または細胞外ドメインの任意の所望の部分、例えば、拮抗／中和されるリガンドと相互作用する部分）をコードする遺伝子を含む本開示の組換えビリオンは、対象において可溶型のＴＮＦαを発現させるために、それを必要とする対象（例えば、ＩＢＤまたは他の炎症性疾患に罹患している対象）にｉｎ ｖｉｖｏで送達させ得る。あるいは、自己細胞または同種異系細胞のいずれかに、分泌可溶型の膜タンパク質をコードする遺伝子を含むそのようなビリオンをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで形質導入することができ、細胞を、それを必要とする対象に移入して、対象を治療することができる。同様の戦略を任意の膜結合タンパク質に使用できる。

【0277】

特定の態様では、以下をコードする核酸を含む少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が本明細書に提供される：（ａ）可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、及び／または可溶型のＩＬ－１β受容体；（ｂ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【0278】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物は、（ａ）形質導入細胞中において、可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、または可溶型のＩＬ－１β受容体の発現を増加させる；及び／または（ｂ）形質導入細胞中において、ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、またはＩＬ－１β受容体の発現を減少させる。

【0279】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、乾癬、及び／または強直性脊椎炎を予防または治療する。

【0280】

したがって、当該治療用遺伝子及び／または剤を含む本開示の組換えビリオンは、対象における慢性炎症を調節し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び他のエフェクター免疫細胞の活性化を減少させることによって治療効果をもたらし、その後損傷した上皮バリアの修復が可能になる。治療効果は、本明細書で提供される併用戦略によってさらに増強され得る。

【0281】

オートファジー関連疾患
本開示の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、オートファジー－リソソーム経路の重要なコンポーネントを調節するために使用することができる。オートファジーは、分化及び発生、細胞及び組織の恒常性、タンパク質及び細胞小器官の品質管理、代謝、免疫、加齢及び様々な疾患に対する防御において重要な役割を果たす。オートファジーのマクロオートファジー型（以下、オートファジーと称する）は、細胞の生体エネルギー（細胞質成分のリサイクルによる）及び細胞質の品質（タンパク質凝集体、損傷した細胞小器官、脂肪滴、及び細胞内病原体の除去による）を制御する、進化的に保存されたリソソーム分解経路である（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５）。さらに、リソソーム分解とは独立して、オートファジー機構は、食作用、アポトーシスによる死骸の除去、分泌、エキソサイトーシス、抗原提示、及び炎症性シグナル伝達の調節のプロセス中で展開され得る。幅広い細胞機能の結果として、オートファジー経路は、加齢及び特定のがん、感染症、神経変性疾患、代謝性疾患、炎症性疾患、及び筋肉疾患に対する防御において重要な役割を果たす（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５）。

【0282】

多くの疾患は、ミスフォールドしたタンパク質凝集体、核酸、及び／またはミトコンドリアなどの損傷した細胞小器官の小片など、望ましくない潜在的に細胞傷害性のある細胞破片の蓄積に関連する。オートファジーは脂質も分解し、脂肪酸の異化利用を可能にし、ガングリオドーシス（ｇａｎｇｌｉｏｄｏｓｉｓ）、例えばＧＭ１、テイ＝サックス病などの脂肪酸代謝性疾患に重大な影響を及ぼす。リソソーム蓄積障害など、いくつかのまれな常染色体疾患は、蓄積された「細胞のゴミ」の分解の失敗と関連しており、これにより、一般に低レベルではあるが、慢性的な炎症プログラムが開始され、組織損傷及びがんなどの複数の壊滅的な結果がもたらされる。

【0283】

蓄積された細胞質物質は、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）として知られ、インフラマソームタンパク質のＴＬＲ１～１０、ｃＧＡＳ、ＩＦＩ１６、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＮＬＲＰファミリーを含む無数のパターン認識受容体（ＰＲＲ）のリガンドであると考えられている。外来分子及び自己分子を感知すると、ＰＲＲは、自己分泌及び傍分泌能力を備えた複数のシグナル伝達カスケードを誘導し、ＮＦｋＢシグナル伝達経路、ＩＦＮ－Ｉ経路、ＩＦＮ－ＩＩ経路、ＩＦＮ－ＩＩＩ経路、及びＡＭＰＫ、Ｂｅｃｌｉｎ－Ｉ、ＰＩ３Ｋ経路を含むオートファジー経路の活性化などの基本的な細胞プロセスを実行する。オートファジープログラムを開始するには、栄養飢餓状態または運動など、様々なイベントが提唱されている。血糖調節薬メトホルミンなどのＡＭＰＫ活性化剤は、オートファジーを活性化し、実験動物の寿命を延長させることが知られている。オートファジーの活性化における最初の分子イベントは、Ａｔｇタンパク質ファミリーなどのタンパク質の集合を引き起こす様々なカスケードイベントによる細胞内、サイトゾルの二重膜構造（オートファゴソーム）の形成である。オートファゴソームは、細胞内に存在するＤＡＭＰ及び／またはＰＡＭＰを包み込み、この現象は膜核形成段階として知られている。オートファジー経路の次のステップは、オートファゴソームの伸長及び閉鎖である。最後に、この成熟して完全に形成されたオートファゴソームは、低ｐＨ環境で広範囲に作用するヌクレアーゼ及びプロテアーゼを含むリソソームと融合し、カーゴが可溶性で非毒性構成成分に分解されるオートリソソームを形成し、これにより、ＤＡＭＰの細胞質存在量が減少する。

【0284】

肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、または腸などの特定の組織におけるオートファジーの誘導は、無数の異なる慢性疾患に罹患している患者に大きな利益をもたらす。したがって、本明細書では、ＩＲＧＭ、ＮＯＤ２、ＡＴＧ２Ｂ、ＡＴＧ９、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＢＥＣＮ１、ＥＩ２４／ＰＩＧ８、ＴＥＣＰＲ２、ＷＤＲ４５／ＷＩＰ１４、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ダイニン、ＥＰＧ５、ＨｓｐＢ８、ＬＡＭＰ２、ＬＣ３ｂ ＵＶＲＡＧ、ＶＣＰ／ｐ９７、ＺＦＹＶＥ２６、ＰＡＲＫ２／パーキン、ＰＡＲＫ６／ＰＩＮＫ１、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２、ＳＭＵＲＦ、ＡＭＰＫ、及びＵＬＫ１から選択されるタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物または形質導入細胞が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物は、形質導入細胞中で当該タンパク質またはそのフラグメントの発現を増加させる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞は、オートファジーを調節する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞は、オートファジー関連疾患を予防または治療する。

【0285】

いくつかの実施形態では、オートファジー関連疾患は、がん、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調）、炎症性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ、肺線維症、嚢胞性線維症、シェーグレン病、高血糖障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、ウェルナー症候群、妖精症、及び脂肪萎縮性糖尿病）、脂質異常症、高脂血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下、トリグリセリドの上昇、メタボリックシンドローム、肝疾患、腎疾患、心血管疾患、虚血、脳卒中、再灌流中の合併症、筋肉変性、萎縮、老化の症状（例えば、筋萎縮、虚弱、代謝障害、軽度の炎症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、加齢に伴う認知症及び散発性アルツハイマー病、前癌状態、及びうつ病を含む精神状態）、脊髄損傷、動脈硬化、感染症（例えば、細菌性、真菌性、ウイルス性など）、ＡＩＤＳ、結核、胚子発生異常、不妊症、リソソーム蓄積症、活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、（アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、（乳児、後期乳児／若年、成人／慢性）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｓｃｈｅｉｅ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオＡ型及びＢ型、マロトー・ラミー、Ｓｌｙ病、ムコリピドーシス、マルチプルスルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ６病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、テイ＝サックス病、及びウォルマン病から選択される。

【0286】

本明細書で使用する場合、「オートファジー関連疾患」という用語は、オートファジーまたは細胞自己消化の破壊に起因する疾患を指す。オートファジー機能不全は、他の多くの病態及び／または状態の中でも特に、がん、神経変性、微生物感染、及び加齢と関連している。オートファジーは、細胞の保護プロセスとして主要な役割を果たすが、細胞死にも関与する。オートファジーを介して媒介される病状及び／または状態（病状または状態が、患者または治療対象のオートファジーの増加または減少に対応して現れる可能性があり、治療または予防には、患者または対象におけるオートファジーの阻害剤またはアゴニストの投与が必要であることを指す）としては、以下が挙げられる：例えば、がん、例えば、がんの転移、リソソーム蓄積症（以下に論じる）、神経変性（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病；他の運動失調）、免疫応答（Ｔ細胞の成熟、Ｂ細胞及びＴ細胞の恒常性、有害な炎症に対抗する）、及び慢性炎症性疾患（オートファジーに欠陥がある場合に過剰なサイトカインを促進し得る）、例えば、炎症性腸疾患、例えば、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ、肺線維症、嚢胞性線維症、シェーグレン病；高血糖障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、脂質代謝膵島の機能及び／または構造に影響を与える、過剰なオートファジーは、膵臓ｂ細胞死及び関連する高血糖障害を引き起こし得る、例えば、重度のインスリン抵抗性、高インスリン血症、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、ウェルナー症候群、妖精症、及び脂肪萎縮性糖尿病）及び脂質異常症（例えば、肥満対象に現れる高脂血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下、及びトリグリセリドの上昇）及びメタボリックシンドローム、肝疾患（細胞エンティティの過剰オートファジーによる除去－小胞体）、腎疾患（プラークのアポトーシス、糸球体疾患）、心血管疾患（特に虚血、脳卒中、圧力過負荷及び再灌流中の合併症）、筋肉変性及び萎縮、老化の症状（加齢関連症状及び以下の慢性疾患の発症、重症度、または頻度の改善または遅延など：筋萎縮、虚弱、代謝障害、軽度の炎症、アテローム性動脈硬化症、及び関連症状、例えば、中枢及び末梢症状の両方の心臓及び神経症状などの関連症状、例えば、脳卒中、加齢に伴う認知症及び散発性アルツハイマー病、前癌状態、うつ病などの精神状態）、脳卒中及び脊髄損傷、動脈硬化、細菌、真菌、細胞及びウイルスなどの感染症（微生物感染、微生物を除去する、微生物産物に対する防御炎症反応を提供する、微生物の成長を増強するために微生物により宿主のオートファジーの適応を制限する、自然免疫を調節する）（感染症に関連する二次的病態または症状を含む）、例えば、ＡＩＤＳ及び結核、発生（赤血球分化など）、胚発生／生殖能力／不妊症（経胎盤での栄養素の供給停止後の胚の着床及び新生児の生存、プログラムされた細胞死中の死んだ細胞の除去）及び加齢（オートファジーの増加は、損傷した細胞小器官または凝集した巨大分子の除去につながり、健康を増進し寿命を延長するが、小児／若年でのオートファジーレベルの増加は、筋肉及び臓器の消耗を引き起こし、加齢／早老症となり得る）。

【0287】

「リソソーム蓄積障害」という用語は、リソソーム蓄積の欠陥から生じる病態または状態を指す。これらの病態または状態は、通常、リソソームが機能不全になったときに生じる。リソソーム蓄積障害は、通常、脂質、糖タンパク質、またはムコ多糖の代謝に必要な酵素の欠乏の結果としてのリソソームの機能不全によって引き起こされる。リソソーム蓄積障害の発生率は、（まとめて）約１：５，０００～１：１０，０００の発生率で生じる。リソソームは、不要な物質を細胞が利用できる物質にプロセシングするため、一般に細胞のリサイクルセンターと呼ばれる。リソソームは、高度に特殊化された酵素を介してこの不要な物質を分解する。リソソーム障害は一般に、特定の酵素が非常に少ない量で存在する場合、またはまとめて欠如している場合に引き起こされる。これが生じると、細胞内に物質が蓄積する。換言すれば、リソソームが正常に機能しない場合、分解及びリサイクルされることが決定している過剰な生成物が細胞内に貯蔵される。リソソーム蓄積障害は、遺伝性疾患であるが、これらは本明細書に記載のオートファジーモジュレーター（オートスタチン）を使用して治療され得る。これらの疾患は、すべて共通の生化学的特徴を共有する。すなわち、すべてのリソソーム疾患は、リソソーム内の物質の異常な蓄積に起因する。リソソーム蓄積症は、主に小児が罹患し、多くの場合、結果として人生の早い段階、その多くは生後数ヶ月または数年以内に死亡する。他の多くの小児が、特定の障害の様々な症状に何年も罹患後、この疾患で死亡する。

【0288】

リソソーム蓄積症の例としては、例えば、活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（乳児期、乳児期後期／若年期、及び成人／慢性を含む）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、シャイエ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオＡ型及びＢ型、マロトー・ラミー、Ｓｌｙ病、ムコリピドーシス、マルチプルスルファターゼ欠損症、ニーマン－ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ６病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、テイ＝サックス病、及びウォルマン病などが挙げられる。

【0289】

炎症性疾患
本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、自己免疫疾患、例えば、慢性炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、乾癬、マックルウェルズ症候群、関節リウマチ、多発性硬化症、または橋本病；アレルギー疾患、例えば、食物アレルギー、花粉症、または喘息；感染症、例えば、クロストリジウム・ディフィシルによる感染；炎症性疾患、例えば、ＴＮＦ媒介炎症性疾患（例えば、胃腸管の炎症性疾患、例えば、回腸嚢炎、心臓血管の炎症状態、例えば、アテローム性動脈硬化症、または慢性閉塞性肺疾患などの炎症性肺疾患）；を予防または治療する（副作用を部分的または完全に軽減する）ために使用され得；臓器移植または組織拒絶反応が起こり得る他の状況における拒絶反応を抑制するために医薬組成物が使用され得；免疫機能を改善するために医薬組成物が使用され得；または免疫細胞の増殖もしくは機能を抑制するために医薬組成物が使用され得る。

【0290】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、炎症の治療または予防に有用である。特定の実施形態では、身体の任意の組織及び臓器の炎症としては、筋骨格系炎症、血管系炎症、神経炎症、消化器系炎症、眼炎症、生殖系の炎症、及び以下に論じる他の炎症が挙げられる。

【0291】

筋骨格系の免疫障害としては、これらに限定されないが、手、手首、肘、肩、顎、脊椎、首、股関節、膝、足首、及び足の関節などの骨格関節に影響を与える状態、ならびに腱など、筋肉と骨を接続する組織に影響を与える状態が挙げられる。本明細書に記載の方法及び組成物で治療できるそのような免疫障害の例としては、これらに限定されないが、関節炎（例えば、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、急性及び慢性の感染性関節炎、痛風及び偽痛風に関連する関節炎、及び若年性特発性関節炎）、腱炎、滑膜炎、腱滑膜炎、滑液包炎、線維炎（線維筋痛症）、上顆炎、筋炎、及び骨炎（例えば、パジェット病、恥骨骨炎、及び嚢胞性線維性骨炎を含む）が挙げられる。

【0292】

眼免疫障害とは、眼瞼を含む目のあらゆる構造に影響を与える免疫障害を指す。本明細書に記載の方法及び組成物で治療され得る眼免疫障害の例としては、眼瞼炎、眼瞼皮膚弛緩症、結膜炎、涙腺炎、角膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、強膜炎、睫毛炎、及びぶどう膜炎が挙げられるが、これらに限定されない。

【0293】

本明細書に記載の方法及び組成物で治療され得る神経系免疫障害の例としては、脳炎、ギラン・バレー症候群、髄膜炎、神経性筋強直症、ナルコレプシー、多発性硬化症、脊髄炎、及び統合失調症が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法及び組成物で治療され得る血管系またはリンパ系の炎症の例としては、関節硬化症、関節炎、静脈炎、血管炎、及びリンパ管炎が挙げられるが、これらに限定されない。

【0294】

本明細書に記載される方法及び医薬組成物を用いて治療され得る消化器系免疫障害の例としては、胆管炎、胆嚢炎、腸炎、全腸炎、胃炎、胃腸炎、炎症性腸疾患、回腸炎、及び直腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。炎症性腸疾患としては、例えば、当技術分野で認められた一群の関連症状の特定の形態が挙げられる。炎症性腸疾患のいくつかの主要な形態が知られており、クローン病（局所性腸疾患、例えば、不活性型及び活性型）及び潰瘍性大腸炎（例えば、不活性型及び活性型）がこれらの疾患の中で最も一般的である。さらに、炎症性腸疾患としては、過敏性腸症候群、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性形質細胞性腸炎（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ－ｐｌａｓｍｏｃｙｔｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、セリアック病、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、及び好酸球性腸炎が含まれる。その他のあまり一般的ではない形態のＩＢＤとしては、分類不能大腸炎、偽膜性大腸炎（壊死性大腸炎）、虚血性炎症性腸疾患、ベーチェット病、サルコイドーシス、強皮症、ＩＢＤ関連異形成、異形成関連の腫瘤または病変、及び原発性硬化性胆管炎などがある。

【0295】

本明細書に記載の方法及び医薬組成物で治療され得る生殖系免疫障害の例としては、子宮頸管炎、絨毛膜羊膜炎、子宮内膜炎、精巣上体炎、臍炎、卵巣炎、睾丸炎、卵管炎、卵管卵巣膿瘍、尿道炎、膣炎、外陰炎、及び外陰部痛が挙げられるが、これらに限定されない。

【0296】

本明細書に記載の方法及び組成物は、炎症性要素を有する自己免疫状態を予防または治療するために使用することができる。このような症状としては、急性散在性汎発性脱毛（ａｃｕｔｅ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ａｌｏｐｅｃｉａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｓｅ）、ベーチェット病、シャーガス病、慢性疲労症候群、自律神経失調症、脳脊髄炎、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、化膿性汗腺炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、セリアック病、クローン病、１型糖尿病、２型糖尿病、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、ヘノッホ・シェーライン紫斑病、川崎病、エリテマトーデス、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発性動脈炎、混合性結合組織病、マックルウェルズ症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、オルド甲状腺炎（ｏｒｄ’ｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、天疱瘡、結節性多発動脈炎、多発筋痛、関節リウマチ、ライター症候群、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、温式自己免疫性溶血性貧血、間質性膀胱炎、ライム病、限局性強皮症、乾癬、サルコイドーシス、強皮症、潰瘍性大腸炎、及び白斑が挙げられるが、これらに限定されない。

【0297】

本明細書に記載の方法及び組成物は、炎症性要素を有するＴ細胞媒介性過敏症疾患を予防または治療するために使用することができる。このような症状としては、接触過敏症、接触皮膚炎（ウルシによるものなど）、蕁麻疹、皮膚アレルギー、呼吸器アレルギー（花粉症、アレルギー性鼻炎、イエダニアレルギー）、及びグルテン過敏性腸症（セリアック病）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0298】

本方法及び医薬組成物で治療され得る他の免疫障害としては、例えば、虫垂炎、皮膚炎、皮膚筋炎、心内膜炎、結合組織炎、歯肉炎、舌炎、肝炎、化膿性汗腺炎、虹彩炎、喉頭炎、乳腺炎、心筋炎、腎炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、肺炎、前立腺炎、腎盂腎炎、及び口内炎、移植拒絶反応（腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓（例、島細胞）、骨髄、角膜、小腸などの臓器に関わる）、皮膚自家移植、皮膚同種移植、及び心臓弁異種移植、血清病、及び移植片対宿主病）、急性膵炎、慢性膵炎、急性呼吸窮迫症候群、Ｓｅｘａｒｙ症候群、先天性副腎過形成、非化膿性甲状腺炎、癌に伴う高カルシウム血症、天疱瘡、疱疹状水疱性皮膚炎、重症多形紅斑、剥離性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、季節性または通年性アレルギー性鼻炎、気管支喘息、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、薬物過敏症、アレルギー性結膜炎、角膜炎、眼部帯状疱疹、虹彩炎及び虹彩毛様体炎、脈絡網膜炎、視神経炎、症候性サルコイドーシス、劇症または播種性肺結核の化学療法、成人の特発性血小板減少性紫斑病、成人の続発性血小板減少症、後天性（自己免疫性）溶血性貧血、局所性腸炎、自己免疫性血管炎、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、固形臓器移植拒絶反応、敗血症が挙げられる。好ましい治療としては、移植拒絶、関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、１型糖尿病、喘息、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、及び感染症に伴う炎症（例えば、敗血症）の治療が挙げられる。

【0299】

神経変性疾患及び神経炎症性疾患
本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、神経変性疾患及び神経疾患を予防または治療するために使用することができる。特定の実施形態では、神経変性疾患及び／または神経疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、脊髄小脳性運動失調、脊髄性筋萎縮症、ジストニア、特発性頭蓋内圧亢進症、てんかん、神経系疾患、中枢性神経系疾患、運動障害、多発性硬化症、脳症、末梢神経障害、術後認知機能障害、前頭側頭型認知症、脳卒中、一過性脳虚血発作、血管性認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、プリオン病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、拳闘家認知症（慢性外傷性脳症）、前頭側頭型認知症、１７番染色体に関連するパーキンソン病、Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ病、神経原線維変化型老年期認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、鉛脳症、結節性硬化症、ハラーフォルデン・シュパッツ病、リポフスチン症、嗜銀性顆粒病、及び前頭側頭葉変性症である。

【0300】

本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、神経炎症及び／または神経炎症性疾患を予防または治療するために使用することができ、例えば、炎症を緩和する１つ以上のサイトカインをコードする遺伝子を含む核酸を送達するために、本開示の組換えビリオンを使用する。神経炎症性疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、神経筋疾患、または精神疾患が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、脳炎症、末梢神経炎症、神経炎症、脊髄炎症、眼炎症、及び／または他の炎症など、中枢神経系の炎症の治療または予防に有用である。

【0301】

本明細書に記載の方法及び組成物で治療され得る神経炎症に関連する障害または神経炎症性障害の例としては、脳炎（脳の炎症）、脳脊髄炎（脳及び脊髄の炎症）、髄膜炎（脳及び脊髄を取り囲む膜の炎症）、ギラン・バレー症候群、神経性筋強直症、ナルコレプシー、多発性硬化症、脊髄炎、統合失調症、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性視神経炎（ＡＯＮ）、横断性脊髄炎、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉認知症、視神経炎、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）、自己免疫性脳炎、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎、ラスムッセン脳炎、小児急性壊死性脳症（ＡＮＥＣ）、オプソクローヌス－ミオクローヌス運動失調症候群、外傷性脳損傷、ハンチントン病、うつ病、不安、片頭痛、重症筋無力症、急性虚血性脳卒中、てんかん、シヌクレイノパチー、前頭側頭型認知症、進行性非流暢性失語症、意味性認知症、うなずき症候群、脳虚血、神経障害性疼痛、自閉症スペクトラム症、線維筋痛症候群、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性、全身性エリテマトーデス、プリオン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、脊髄小脳変性症、脊髄性筋萎縮症、ジストニア、特発性頭蓋内圧亢進症、神経系疾患、中枢神経系疾患、運動障害、脳症、末梢神経障害、または術後認知機能障害が挙げられるが、これらに限定されない。

【0302】

がん
がん、腫瘍、または過剰増殖性疾患は、制御されない増殖、不死性、転移能、急速な成長及び増殖速度、ならびにある特定の特質的な形態学的特徴など、がんを引き起こす細胞の典型的な特質を保有する細胞の存在を指す。がん細胞は、多くの場合、腫瘍の形態であるが、このような細胞は、動物内に単独で存在し得るか、または非腫瘍化がん細胞、例えば、白血病細胞などであり得る。がんとしては、Ｂ細胞癌（例えば、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ヘアリー細胞白血病、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性眼内リンパ腫、重鎖疾患（例えば、α鎖疾患、γ鎖疾患、及びミュー鎖疾患、良性モノクローナルガンマグロビン症、及び免疫細胞性アミロイドーシス）、Ｔ細胞癌（例えば、Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、非ホジキンリンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（例えば、菌状息肉症、セザリー症候群など））、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸疾患関連腸管Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ホジキンリンパ腫）、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、大腸癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系の癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝癌、腎癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織の癌などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に包含される方法に適用可能ながんの種類の他の非限定的な例としては、ヒトの肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、大腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、肝癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、骨癌、脳腫瘍、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌腫（ＳＣＬＣ）、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）；真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び重鎖疾患が挙げられる。いくつかの実施形態では、がんは、本質的に上皮性であり、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦人科癌、腎癌、喉頭癌、肺癌、口腔癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、または皮膚癌を含むがこれらに限定されない。他の実施形態では、がんは、乳癌、前立腺癌、肺癌、または結腸癌である。さらに他の実施形態では、上皮癌は、非小細胞肺癌、非乳頭腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、または乳癌である。上皮癌は、漿液性癌、類内膜癌、粘液性癌、明細胞癌、ブレンナー癌、または未分化癌を含むがこれらに限定されない他の様々な方法で特徴付けられ得る。

【0303】

家族性肝内胆汁うっ滞
本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）（ＡＴＰＢ１、ＡＴＰＢ１１、及びＡＢＣＢ４遺伝子中の変異に関連し、それぞれＰＦＩＣ１型、２型、及び３型を引き起こす遺伝性疾患）を予防または治療するために使用することができる。このまれな常染色体劣性遺伝病は、胆汁分泌経路の破壊を生じさせ、肝臓における管状増殖とガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の活性の上昇を伴う進行性肝内胆汁うっ滞を特徴とする。ＡＢＣＢ４変異は、この疾患の最も一般的な形態である。ＡＢＣＢ４遺伝子は、染色体７ｑ２１．１に位置し、ＰＦＩＣ３の原因に関与する脂質フロッパーゼＭＤＲ３タンパク質をコードする。ＭＤＲ３は、主に肝臓の小管膜において発現し、リン脂質トランスロケーター、すなわちホスファチジルコリン（ＰＣ）として機能する。ＭＤＲ３は、胆汁酸塩の洗浄活性から肝細胞膜を保護する。ＰＦＩＣ３欠損は、胆汁へのホスファチジルコリン（ＰＣ）の分泌の減少を特徴とし、胆汁分泌輸送システムが損なわれる（Ｄａｖｉｔ－Ｓｐｒａｕｌ，ｅｔ ａｌ．，ＰＭＩＤ：２０４２２４９６）。ＰＣ分泌の減少は、肝臓内で毒性を引き起こし、その結果、炎症促進プログラムの活性化及びそれに伴う肝細胞の破壊が生じ、さらに肝内肝硬変に進行する。他の有病率の低い形態の疾患は、ＡＴＰＢ１及びＡＴＰＢ１１遺伝子中での変異によって引き起こされ、同様の結果をもたらす。様々な実施形態において、本明細書に記載の組換えビリオンは、遺伝子療法を必要とする対象の細胞、組織、または臓器への直接注射によって、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される。

【0304】

ウィルソン病
本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、ウィルソン病（ＷＤ）を予防または治療するために使用することができる。ＷＤは、銅を輸送するＰ型ＡＴＰａｓｅをコードするＡＴＰ７Ｂ遺伝子中の変異に関連する、単一遺伝子性の常染色体劣性遺伝の疾患である。ＡＴＰ７Ｂは、６００を超える病原性バリアントが同定されており、一塩基ミスセンス変異及びナンセンス変異が最も一般的であり、次に挿入／欠失であり、まれにスプライス部位変異である。ＡＴＰ７Ｂは、肝臓で最も多く発現するが、腎臓、胎盤、乳腺、脳、及び肺でも見られる。ＡＴＰＢ７の破壊は、細胞内の銅レベルの増加につながる。ヒトの食事による銅の摂取量は、１日あたり約１．５～２．５ｍｇで、銅は、胃及び十二指腸中で吸収され、循環アルブミンに結合して、調節及び排泄のために肝臓に輸送される。抗酸化タンパク質１（ＡＴＯＸ１）は、銅依存性タンパク質間相互作用によって銅をＡＴＰＢ７に送達させる。肝細胞内では、ＡＴＰ７Ｂは、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）または細胞質小胞中のいずれかにおいて、２つの重要な機能を果たす。ＴＧＮ中では、ＡＴＰ７Ｂは、６つの銅分子をアポセルロプラスミンにパッケージングすることによってセルロプラスミンを活性化させ、アポセルロプラスミンが血漿中に分泌される。細胞質中では、ＡＴＰ７Ｂは、過剰な銅を小胞に隔離し、エキソサイトーシスを介して頂端小管膜を越えて胆汁中に排出する（Ｂｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｔａｎｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｃａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＡＴＰ７Ｂトランスポーターは、銅の合成及び排出の両方において二元的な役割を果たしているため、その機能の欠陥により、銅の蓄積が生じ、酸化ストレス及びフリーラジカルの形成の引き金となり、酸化ストレスとは関係なく、ミトコンドリア機能不全が引き起こされる。複合的効果により、炎症促進状態が誘導され、その後肝臓及び脳組織、さらには他の臓器でも細胞死が引き起こされる。様々な実施形態において、本明細書に記載の組換えビリオンは、遺伝子療法を必要とする対象の細胞、組織、または臓器への直接注射によって、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される。

【0305】

リソソーム蓄積障害
本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を予防または治療するために使用することができる。これらは、酵素欠乏の結果として身体の細胞内に様々な有毒物質が異常に集積することを特徴とする遺伝性代謝性疾患である。本明細書に記載の方法及び組成物は、任意により脳の白質の変化など、複数の臓器に影響を与える重度の高アンモニア血症を主因とする破壊的代謝疾患を特徴とする希少常染色体劣性疾患であるカルバモイルリン酸合成酵素１欠損症（ＣＰＳ１Ｄ）を予防または治療するために使用することができる。ＣＰＳ１は、ヒトにおける窒素処理の主要な経路である尿素サイクルの最初の律速段階を触媒するため、肝臓の尿素生成において最も重要な役割を果たす。ＣＰＳ１欠損は、尿素サイクル障害及びアンモニアの蓄積を引き起こす。したがって、ＣＰＳ１欠損症患者では、顕著な高アンモニア血症及び尿素サイクルの下流での産生の減少が観察され得る。存在量が過剰なアンモニアは、中枢神経系に入り、脳に毒性作用を与え得る。アンモニアの蓄積により、毒性が誘導され、細胞死につながる。様々な実施形態において、本明細書に記載の組換えビリオンは、遺伝子療法を必要とする対象の細胞、組織、または臓器への直接注射によって、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される。

【0306】

表皮水疱症
本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、皮膚の遺伝性疾患を予防または治療するために使用することができる。ヒトの表皮は主に、異なる層状細胞層に組織化されたケラチノサイトで構成されている。表皮基底膜への基底ケラチノサイトの接着は、上皮中間フィラメントネットワークを真皮固定原線維に連結する多タンパク質複合体であるヘミデスモソーム（ＨＤ）によって媒介される。ヘミデスモソームは、いくつかの細胞質及び膜貫通タンパク質のクラスター化によって形成される。ＨＤ１／プレクチン及び水疱性類天疱瘡抗原１（ＢＰ２３０）を含む細胞質ＨＤプラーク成分は、原形質膜の細胞質表面において細胞骨格のエレメントのリンカーとして機能する。α６β４インテグリン及び水疱性類天疱瘡抗原２（ＢＰ１８０）を含むＨＤの膜貫通構成要素は、細胞内部を細胞外マトリックスタンパク質に接続する細胞受容体として機能する。ヘミデスモソーム媒介接着は、α６β４インテグリンがラミニン－５へ結合することに依存し、ラミニン５は、それぞれＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２として知られる３つの異なる遺伝子によってコードされる、異なるポリペプチド、α３、β３、及びγ２によって形成される主要な基底層成分である。ラミニン－５は、表皮ケラチノサイトの基底表面上のα６β４インテグリンと物理的に相互作用してＨＤ形成を促進するのみでなく、真皮アンカー原線維中のＶＩＩ型コラーゲンのアミノ末端ＮＣ－１ドメインとも相互作用して、基底膜ゾーンの完全性を増強する。皮膚の完全性の維持におけるこれらのタンパク質の関連性は、表皮水疱症（ＥＢ）患者中に存在する体細胞変異を同定することによって示されている。様々な遺伝子（例えば、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣ１、Ｃｏｌ７Ａ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＡ６、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、及びＫＩＮＤ１）中での少なくとも１６の遺伝子変異が、様々なタイプのＥＢに関連している。ケラチノサイトは、真皮－表皮接合部の維持に関与するタンパク質の合成を担うため、この疾患を予防または治療するための遺伝子療法介入には、これらの細胞の遺伝子改変が必要である。

【0307】

特定の態様では、本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物を使用して、ＥＢなどの様々な皮膚障害のために皮膚の幹細胞を特異的に改変することができる。例えば、クタウイルス由来組換えビリオン（例えば、クタウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオン）を使用して、治療用導入遺伝子を表皮幹細胞に送達することができる。いくつかの実施形態では、表皮幹細胞は、ホロクローン形成細胞である。いくつかの実施形態では、ホロクローン形成細胞は、最大の増殖能力を有するＰ６３陽性ケラチノサイト由来幹細胞であり、したがって上皮幹細胞とみなされる。いくつかの実施形態では、治療用導入遺伝子は、相同組換えによる既知のゲノム位置への安定した組み込みを促進するＧＳＨ配列をさらに含む。ＧＳＨの使用により、皮膚細胞の分化全体での安定かつ持続的な導入遺伝子の発現が可能になる。いくつかの実施形態では、表皮幹細胞、Ｐ６３陽性ケラチノサイト由来幹細胞、またはケラチノサイトは、本開示の組換えビリオン及び医薬組成物によってｅｘ ｖｉｖｏで改変される。いくつかのそのような実施形態では、改変された表皮幹細胞、Ｐ６３陽性ケラチノサイト由来幹細胞、またはケラチノサイトが、皮膚移植片として皮膚表面に適用される。

【0308】

したがって、特定の態様では、表皮水疱症を予防または治療する方法が本明細書に提供され、少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣ１、Ｃｏｌ７Ａ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＡ６、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、及び／またはＫＩＮＤ１をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、プロトパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、組換えビリオンは、クタウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えビリオンは、表皮幹細胞、Ｐ６３陽性ケラチノサイト由来幹細胞、またはケラチノサイトに形質導入する。いくつかの実施形態では、形質導入された表皮細胞は、幹細胞、Ｐ６３陽性ケラチノサイト由来幹細胞、またはケラチノサイトである。いくつかの実施形態では、方法は、形質導入細胞を対象の皮膚に移植することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞は、表皮水疱症を予防または治療する。

【0309】

血液疾患
特定の態様では、下記の血液疾患に加えて、本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、内皮機能不全、嚢胞性線維症、心血管疾患、末梢血管疾患、脳卒中、心臓疾患（例えば、先天性心臓疾患を含む）、糖尿病、インスリン抵抗性、慢性腎不全、アテローム性動脈硬化症、腫瘍成長（例えば、内皮細胞の成長など）、転移、高血圧（例えば、肺動脈高血圧症、他の形態の肺高血圧症）、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、Ｃ型肝炎、肝硬変、高脂血症、高コレステロール血症、メタボリックシンドローム、腎疾患、炎症、及び静脈血栓症などの疾患の治療または予防に使用することができる。

【0310】

特定の態様では、血液疾患には、以下のいずれか１つが含まれる：ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症、サラセミア、メトヘモグロビン血症）、貧血（鉄欠乏性貧血、巨赤芽球性貧血、溶血性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、好中球減少症、無顆粒球症、グランツマン血小板無力症、血小板減少症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、骨髄増殖性障害（例えば、真性赤血球増加症、赤血球増加症、白血球増加症、血小板増加症）、凝固障害、血液癌、ヘモクロマトーシス、無脾症、脾機能亢進症（例えば、ゴーシェ病）、血球貪食性リンパ組織球症、ｔｅｍｐｉ症候群、及びＡＩＤＳ。

【0311】

いくつかの実施形態では、例示的な溶血性貧血としては以下が挙げられる：遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円球症、先天性赤血球生成異常性貧血、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症（Ｇ６ＰＤ）、ピルビン酸キナーゼ欠損症、自己免疫性溶血性貧血（例えば、特発性貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、エバンス症候群、寒冷凝集素症、発作性の風邪ヘモグロビン尿症、伝染性単核球症）、同種免疫性溶血性貧血（例えば、Ｒｈ疾患などの新生児溶血性疾患、新生児ＡＢＯ溶血性疾患、新生児の抗ケル溶血性疾患、新生児Ｒｈ ｃ溶血性疾患、新生児Ｒｈ ｅ溶血性疾患）、発作性夜間ヘモグロビン尿症、微小血管障害性溶血性貧血、ファンコニ貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、及び後天性純赤血球形成不全。

【0312】

いくつかの実施形態では、例示的な凝固障害としては、血小板増加症、播種性血管内凝固症候群、血友病（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ）、フォン・ウィルブラント病、及び抗リン脂質症候群が挙げられる。

【0313】

いくつかの実施形態では、例示的な血液癌としては、以下が挙げられる：ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫（例えば、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、形質細胞腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性巨核芽球性白血病、慢性特発性骨髄線維症、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、慢性好中球性白血病、ヘアリー細胞白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球白血病、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、慢性骨髄増殖性新生物、ランゲルハンス細胞組織球症、骨髄異形成症候群、及び進行性ＮＫ細胞白血病。

【0314】

本明細書で使用される場合、ヘモグロビン症には、血液中の異常なヘモグロビン分子の存在を伴うあらゆる障害が含まれる。異常ヘモグロビン症の例としては、ヘモグロビンＣ疾患、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、及びサラセミアが含まれるが、これらに限定されない。異常なヘモグロビンの組み合わせが血液中に存在する異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球／Ｈｂ－Ｃ疾患）も含まれる。

【0315】

本明細書で使用される場合、サラセミアは、ヘモグロビンの産生欠陥を特徴とする遺伝性疾患を指す。サラセミアの例としては、α－サラセミア及びβ－サラセミアが挙げられる。β－サラセミアは、ベータグロビン鎖中での変異によって引き起こされ、主要な形態またはマイナーな形態で発生し得る。β－サラセミアの主な形態では、小児は、出生時には正常であるが、生後１年以内に貧血を発症する。軽度のβ－サラセミアは、小さい赤血球を産生し、サラセミアは、グロビン鎖からの遺伝子（複数可）の欠失によって引き起こされ、α－サラセミアは、典型的には、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子が関与する欠失によって生じる。これらの遺伝子は両方とも、ヘモグロビンの構成要素（サブユニット）であるα－グロビンをコードする。各細胞ゲノムには、ＨＢＡ１遺伝子の２つコピー、及びＨＢＡ２遺伝子の２つコピーが存在する。その結果、α－グロビンを産生する４つの対立遺伝子が存在する。様々なタイプのサラセミアは、これらの対立遺伝子の一部またはすべてが喪失することにより生じる。Ｈｂ Ｂａｒｔ症候群は、サラセミアの最も重篤な形態であり、４つすべてのα－グロビン対立遺伝子の喪失によって生じる。ＨｂＨ疾患は、４つのα－グロビン対立遺伝子のうち３つの喪失によって引き起こされる。これら２つの状態では、αグロビンの不足により、細胞が正常なヘモグロビンを生成できなくなる。代わりに、細胞は、ヘモグロビンＢａｒｔ（Ｈｂ Ｂａｒｔ）またはヘモグロビンＨ（ＨｂＨ）と呼ばれる異常形態のヘモグロビンを産生する。これらの異常なヘモグロビン分子は、身体の組織に酸素を効率よく運ぶことができない。正常なヘモグロビンがＨｂ ＢａｒｔまたはＨｂＨに置換されることにより、貧血及びサラセミアに関連する他の深刻な健康問題が引き起こされる。

【0316】

本明細書で使用される鎌状赤血球症とは、グロビン遺伝子の変異に起因し、低酸素条件下で、典型的な両凹型から異常な硬くて鎌状に変化する赤血球を特徴とする常染色体劣性遺伝性血液疾患の一群を指し、これにより、毛細血管を通過できないため、低酸素状態が悪化する。それらは、ペプチドのアミノ酸６位で、グルタミン酸がバリンに置換されているβ－グロビン鎖バリアントをコードするβｓ遺伝子の存在によって定義され、変異マットを有する第２のβ遺伝子により、臨床表現型を引き起こすＨｂＳが結晶化され得る。鎌状赤血球貧血は、ＨｂＳを引き起こす変異がホモ接合性である患者における特定の形態の鎌状赤血球症を指す。鎌状赤血球症の他の一般的形態としては、ＨｂＳ／β－サラセミア、ＨｂＳ／ＨｂＣ、及びＨｂＳ／ＨｂＤが挙げられる。

【0317】

特定の実施形態では、ヘモグロビンＣ疾患、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β－サラセミア、メジャーサラセミア、中間サラセミア、α－サラセミア、及びヘモグロビンＨ疾患からなる群から選択されるヘモグロビン症を治療、予防、または改善するための方法及び組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ヘモグロビン症は、β－サラセミアである。いくつかの実施形態では、ヘモグロビン症は、鎌状赤血球貧血である。様々な実施形態において、本明細書に記載の組換えビリオンは、遺伝子療法を必要とする対象の細胞、組織、または器官への直接注射によって、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される。他の様々な実施形態において、細胞には、本明細書に記載される組換えビリオンが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて形質導入される。次いで、形質導入された細胞を、例えば本明細書に開示される医薬製剤内で、遺伝子療法を必要とする対象に投与する。

【0318】

上述のとおり、本明細書では、対象におけるヘモグロビン症を予防または治療する方法が提供される。様々な実施形態では、本方法は、有効量の、本明細書に記載の組換えビリオンが形質導入された細胞、または当該形質導入された細胞の集団（例えば、ＨＳＣ、ＣＤ３４＋もしくはＣＤ３６細胞、赤血球系列細胞、胚性幹細胞、またはｉＰＳＣ）を対象に投与することを含む。治療または予防の場合、投与される量は、所望の臨床効果を生み出すのに有効な量であり得る。有効量は、１回のまたは一連の投与で行われ得る。有効量は、ボーラスまたは連続灌流によって提供され得る。有効量は、１回以上の用量で対象に投与され得る。治療または予防に関して、有効量とは、疾患の進行を緩和する、改善する、安定化する、逆転させるもしくは遅延させる、または他の方法で疾患の病理学的結果を軽減するのに十分な量である。有効量は、一般に、医師によってケースバイケースで決定され、当業者の通常の技術の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定する場合には、典型的には、いくつかの要因が考慮される。これらの要因としては、対象の年齢、性別、及び体重、治療対象の状態、状態の重症度が挙げられる。

【0319】

Ｉ型糖尿病
特定の態様では、本明細書に記載の方法、組換えビリオン、及び／または医薬組成物は、Ｉ型糖尿病の治療または予防に使用することができる。小腸、特に十二指腸及び空腸中の腸内分泌細胞は、１型糖尿病患者の予防または治療のためのインスリン遺伝子導入戦略の有望な標的である。腸のＫ細胞及びＬ細胞は、内腔内の栄養素、特にグルコースに応答するように生来特殊化されている。それらは、血液中にＧＩＰ及びＧＬＰ－１を分泌することによって応答し、グルコース誘導インスリン応答を増強する。正常な個体では、食事後のＧＩＰ、ＧＬＰ－１、及びインスリンについて得られた動態及び血漿中濃度は、非常に類似しており、１型糖尿病患者におけるＧＩＰ及びＧＬＰ－１の動態及び血漿濃度も同様である（Ｖｉｌｓｂｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。Ｋ細胞及びＬ細胞は、プロインスリンの成熟インスリンへのプロセシングを可能にするＰＣ１／３ペプチダーゼ及びＰＣ２ペプチダーゼを合成する。重要なことに、Ｋ細胞及びＬ細胞は、１型糖尿病患者の免疫系によって、膵臓β細胞と共に破壊されない（Ｖｉｌｓｂｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。共通の発生起源であることより、膵臓β細胞、Ｋ細胞、及びＬ細胞は、次の顕著な類似点を示す：（ｉ）プロインスリンからインスリンへの変換に必要なＰＣ１／３及びＰＣ２ペプチダーゼの発現、（ｉｉ）ＧＬＵＴ－２グルコーストランスポーターの存在、（ｉｉｉ）ホルモン分泌のグルコース依存性機構（顆粒が、それぞれのホルモンを貯蔵し、容易に分泌できる）（Ｓｐｏｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｂａｇｇｉｏ＆Ｄｒｕｃｋｅｒ ２００７）。したがって、１型糖尿病患者の消化管腸内分泌細胞に、（例えば、プレプロインスリンタンパク質またはその転写バリアント、例えばＮＰ＿０００１９８．１、ＮＰ＿００１１７２０２６．１、ＮＰ＿００１１７２０２７．１、及び／またはＮＰ＿００１２７８８２６．１をコードするインスリン遺伝子ＩＮＳを導入することによって）プレプロインスリン遺伝子を発現する能力が備わっている場合には、食後血糖値の正常化に寄与することが予測される。腸幹細胞は、腸上皮陰窩（ｇｕｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｋｒｙｐｔ）に存在する。これらの細胞は、細胞膜上にトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を発現するため、イヌまたはネコのパルボウイルス由来ベクターによる形質導入を受けやすくなっている。したがって、本明細書に提示される組換えビリオン及び／または医薬組成物は、ＧＩＰ調節エレメントによって駆動されるプレプロインスリン遺伝子を組み込むための有望なツールを提供する。さらに、記載されたゲノムのセーフハーバーへの部位特異的組み込みにより、幹細胞をインスリン産生Ｋ細胞及びＬ細胞に安全に分化させ得る。

【0320】

血友病Ａ
血友病Ａは、血液が正常に凝固しない遺伝性出血障害である。血友病Ａ型のヒトは、創傷、手術、または歯科処置の後、通常よりも多く出血する。この障害は、重度、中等度、または軽度であり得る。重度の場合は、軽度の創傷後、または創傷がない場合（自然出血）であっても、大量の出血が生じる。関節、筋肉、脳、または臓器への出血は、疼痛及びの他の重篤な合併症を引き起こし得る。軽度の場合は、自然出血はなく、手術または重傷後にのみ診断され得る。血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子と呼ばれるタンパク質が低レベルであることによって引き起こされる。第ＶＩＩＩ因子は、血栓の形成に必要である。この障害は、Ｘ連鎖劣性遺伝形式で遺伝し、Ｆ８遺伝子中の変化（変異）によって引き起こされる。血友病Ａの診断は、臨床症状及び血液中の凝固因子の量を測定するための特定の臨床検査によって行われる。主な予防または治療は、補充療法であり、療法中に凝固第ＶＩＩＩ因子を静脈に緩徐に点滴または注射する。血友病Ａは、主に男性に発症する。予防または治療により、この障害を有するほとんどのヒトは良好になる。重度の血友病Ａ患者の中には、他の健康状態及びこの疾患の希少な合併症の存在により、寿命が短くなり得る。

【0321】

血友病Ａに罹患している患者は、全長第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）またはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（例えば、ＦＶＩＩＩ－ＳＱ、ｐ－ＶＩＩＩ、ｐ－ＶＩＩＩ－ＬＭＷ；Ｓａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８５：９３－１００）をコードし、ヒトにおいて治療効果をもたらすのに必要な活性を保持している（Ｒａｎｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：２５１９－３０）Ｆ８導入遺伝子を導入する遺伝子療法の恩恵を受け得る。本開示の組換えビリオン、医薬組成物、及び方法は、部分的には、ＡＡＶと比較してより大きな遺伝子をパッケージングする組換えビリオンの能力、低免疫原性、及び周期的遺伝子制御（実施例９及び「周期的遺伝子発現または誘導性遺伝子発現」のセクションを参照）により、血友病Ａ罹患患者において、改善されたウイルスベクター及び予防／治療方法となる。

【0322】

いくつかの実施形態では、治療対象の疾患としては、表５に示されるものから選択される疾患が挙げられる。

【表5】

【0323】

いくつかの実施形態では、本開示の形質導入細胞の１つ以上の投与後、対象の末梢血が採取され、ヘモグロビンレベルが測定される。組換えビリオンまたは組換えビリオンが形質導入された細胞の投与後に、治療上適切なレベルのヘモグロビンが産生される。治療上関連するヘモグロビンレベルは、以下にとって十分なヘモグロビンのレベルである：（１）貧血を改善する、（２）正常なヘモグロビンを含む赤血球を産生する対象の能力を改善または回復させる、（３）対象において、効率的でない赤血球生成を改善または修正する、（４）髄外造血（例えば、脾臓及び肝臓の髄外造血）を改善または修正する、及び／または（Ｓ）例えば末梢組織及び臓器中での鉄蓄積を減少させる。ヘモグロビンの治療上関連するレベルは、少なくとも約７ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約７．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約８ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約８．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約９ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約９．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約１０ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約１０．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約１１ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約１１．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約１２ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約１２．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約１３ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約１３．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約１４ｇ／ｄＬ Ｈｂ、少なくとも約１４．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、または少なくとも約１５ｇ／ｄＬ Ｈｂであり得る。追加的または代替的に、ヘモグロビンの治療上関連するレベルは、約７ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約７．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約７．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約８ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約８ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約８．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約８．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約９ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約９ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約９．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約９．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１０ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１０ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１０．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１０．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１ １ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１ １ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１ １．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１１．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１２ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１２ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１２．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１２．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１３ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１３ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１３．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１３．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１４ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１４ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１４．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１４．５ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約７ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約８ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約８ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約９ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約９ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１０ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１０ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１１ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１１ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１２ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１２ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１３ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１３ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１４ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１４ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１５ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約７ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約９ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約９ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１１ｇ／ｄＬ Ｈｂ、約１ １ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１３ｇ／ｄＬ Ｈｂ、または約１３ｇ／ｄＬ Ｈｂ～約１５ｇ／ｄＬ Ｈｂであり得る。特定の実施形態では、ヘモグロビンの治療上関連するレベルは、対象において少なくとも３日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月（または１年）、少なくとも約２４ヶ月（または２年）維持される。特定の実施形態では、ヘモグロビンの治療上関連するレベルは、対象において、最長約６ヶ月間、最長約１２ヶ月（または１年）、最長約２４ヶ月（または２年間）維持される。特定の実施形態では、ヘモグロビンの治療上関連したレベルは、対象において約３日間、約１週間、約２週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約４ヶ月、約６ヶ月、約１２ヶ月（または１年）、約２４ヶ月（または２年）維持される。特定の実施形態では、ヘモグロビンの治療上関連するレベルは、対象において、約６ヶ月～約１２ヶ月（例えば、約６ヶ月～約８ヶ月、約８ヶ月～約１０ヶ月、約１０ヶ月～約１２ヶ月）、約１２ヶ月～約１８ヶ月（例えば、約１２ヶ月～約１４ヶ月、約１４ヶ月～約１６ヶ月、または約１６ヶ月～約１８ヶ月）、または約１８ヶ月～約２４ヶ月（例えば、約１８ヶ月～約２０ヶ月、約２０ヶ月～約２２ヶ月、または約２２ヶ月～約２４ヶ月）維持される。

【0324】

特定の実施形態では、形質導入された細胞は、細胞が投与される対象にとって自家由来である。いくつかの実施形態では、形質導入された細胞は、細胞が投与される対象にとって自家の骨髄または末梢循環中の動員された細胞に由来する。いくつかの実施形態では、形質導入された細胞は、細胞が投与される対象に対して同種他家である。いくつかの実施形態では、形質導入された細胞は、細胞が投与される対象にとって自家である骨髄由来のものである。

【0325】

本開示はまた、対象における白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌまたはｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）と比較して、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌまたはｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）の割合を増加させる方法を提供する。様々な実施形態において、方法は、有効量の本明細書に記載の組換えビリオン、または組換えビリオンにより形質導入された細胞（例えば、ＨＳＣ、ＣＤ３４＋もしくはＣＤ３６細胞、赤血球系列細胞、胚性幹細胞、またはｉＰＳＣ）を対象に投与することを含み、ここで、対象における造血幹細胞の赤血球子孫細胞の割合が、造血幹細胞の白血球子孫細胞と比較して増加する。

【0326】

投与される形質導入細胞の量は、対象及び／または予防または治療される疾患によって異なるであろう。いくつかの実施形態では、約１ｘ１０^４～約１ｘ１０^５細胞／ｋｇ、約１ｘ１０^５～約１ｘ１０^６細胞／ｋｇ、約１ｘ１０^６～約１ｘ１０^７細胞／ｋｇ、約１ｘ１０^７～約１ｘ１０^８細胞／ｋｇ、約１ｘ１０^８～約１ｘ１０^９細胞／ｋｇ、または約１ｘ１０^９～約１ｘ１０^１０細胞／ｋｇの本明細書で開示される形質導入細胞が対象に投与される。必要に応じて、対象は、形質導入細胞を複数回投与する必要があり得る。有効量とみなされる量の正確な決定は、特定の対象の体格、年齢、性別、体重、及び状態など、各対象の個別の要因に基づき得る。投与量は、当業者であれば、本開示及び当技術分野の知識から容易に確認することができる。

【0327】

特定の理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載の組成物及び方法によってもたらされる重要な利点は、任意の疾患（例えば、ヘモグロビン症、嚢胞性線維症、ヘモクロマトーシス）に罹患している対象を治療する、または対象、例えば、そのような疾患を発症するリスクのある対象における任意の疾患を予防する効率的な方法である。このようなリスクにある対象は、それらが保有する特定の遺伝子変異、及び／または環境的要因もしくは物理的要因（例えば、対象の性別、年齢）によって識別することができる。非常に効率的で安全な遺伝子療法は、本明細書に記載の組成物及び方法（例えば、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む組換えビリオン）を使用することによって達成される。例えば、ＧＳＨへの核酸（例えば、治療用核酸）の標的組み込みにより、形質導入細胞中での細胞遺伝子の有害な変異、形質転換、またはがん遺伝子活性化の機会を減少させる。さらに、組換えビリオンの特異的向性により、特定の細胞型への標的化が可能になる。

【0328】

組換えビリオンを産生するための組成物及び方法
特定の態様では、本明細書に記載の組換えビリオンを産生する方法が本明細書に提供される。以下に記載するベクターの数は、構造遺伝子及び／または非構造遺伝子を１つ以上のベクターに組み込むことによって統合することができる。特定のプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスのゲノム配列は、構造遺伝子（例えば、ＶＰタンパク質（複数可）をコードする）及び／または非構造遺伝子を含むようにバキュロウイルスゲノムに組み込まれてもよい。

【0329】

特定の態様では、組換えビリオンを産生する方法は、以下を含む：（１）以下を含む少なくとも１つのベクターを提供することと；（ｉ）少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列を含み、任意により標的細胞における発現のためにプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含むヌクレオチド配列、（ｉｉ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１及び／またはＶＰ２をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）ヌクレオチド配列であって、（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、複製タンパク質、または（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、を含む、ヌクレオチド配列、（２）当該少なくとも１つのベクターを昆虫細胞に導入することと；（３）本明細書に記載の組換えビリオンが産生されるような条件下で当該昆虫細胞を維持すること。好ましい実施形態では、ベクターは、昆虫細胞における核酸の発現を促進するプロモーターを含む昆虫細胞適合性ベクターである。

【0330】

いくつかの実施形態では、２つのベクターが提供される：（ａ）第１のベクターは、少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列、任意により標的細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含むヌクレオチド配列を含み、（ｂ）第２のベクターは、（ｉ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１及び／またはＶＰ２をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、複製タンパク質、または（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、を含む。

【0331】

いくつかの実施形態では、３つのベクターが提供される：（ａ）第１のベクターは、少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列、任意により標的細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含むヌクレオチド配列を含み、（ｂ）第２のベクターは、昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１及び／またはＶＰ２をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び（ｃ）第３のベクターは、以下を含むヌクレオチド配列を含む：（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、複製タンパク質、または（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ。

【0332】

いくつかの実施形態では、昆虫細胞において本明細書に記載の組換えビリオンを産生する方法が本明細書に提供され、この方法は、以下を含む：（１）以下を含む昆虫細胞を提供することと：（ｉ）少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列を含み、任意により標的細胞における発現のためにプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含むヌクレオチド配列、（ｉｉ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１及び／またはＶＰ２をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、複製タンパク質、または（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、任意により、少なくとも１つのベクター、ここで、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（Ａ）、（ｉｉｉ）（Ｂ）、及び（ｉｉｉ）（Ｃ）のうちの少なくとも１つは、昆虫細胞ゲノムに安定に組み込まれており、少なくとも１つのベクターが、存在する場合、昆虫細胞のゲノムに安定に組み込まれていない（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（Ａ）、（ｉｉｉ）（Ｂ）、及び（ｉｉｉ）（Ｃ）のヌクレオチド配列の残りの部分を含む、提供することと、（２）組換えビリオンが産生されるような条件下で、昆虫細胞を維持すること。

【0333】

いくつかの実施形態では、プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を有する組換えビリオンを産生する方法が提供され、プロトパルボウイルスは、肉食動物プロトパルボウイルス、肉食動物プロトパルボウイルス１、翼手目プロトパルボウイルス１、真無盲腸目プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス２、霊長類プロトパルボウイルス３、霊長類プロトパルボウイルス４、げっ歯類プロトパルボウイルス１、げっ歯類プロトパルボウイルス２、げっ歯類プロトパルボウイルス３、有蹄動物プロトパルボウイルス１、及び有蹄動物プロトパルボウイルス２から選択される種のものである。いくつかの実施形態では、プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される。

【0334】

いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を有する組換えビリオンを産生する方法が本明細書に提供され、テトラパルボウイルスが、翼手目テトラパルボウイルス１、霊長類テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス２、有蹄動物テトラパルボウイルス３、及び有蹄動物テトラパルボウイルス４から選択される種のものである。いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びその遺伝子型バリアントから選択される。いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される。

【0335】

いくつかの実施形態では、プロトパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質は、イヌパルボウイルス、ブファウイルス、クタウイルス、またはそれらの遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である。

【0336】

いくつかの実施形態では、テトラウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質は、ヒトパルボウイルス４またはその遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である。

【0337】

いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、鱗翅目の種、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉに由来する。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｆ９である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのベクターは、バキュロウイルスベクター、ウイルスベクター、またはプラスミドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのベクターは、バキュロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、細胞あたりまたは体積あたりベースでのベクター収量の増加を示す鱗翅目細胞株のサブクローンが使用される。いくつかの実施形態では、ＮＳ１、Ｒｅｐ、ＶＰ、及び／またはベクターゲノムのコピーが組み込まれた改変鱗翅目細胞株が、単独でまたは組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、昆虫細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓなどの内因性または汚染性または外来性の昆虫ウイルスを「治癒」させる。

【0338】

いくつかの実施形態では、ＶＰ１は、配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２から選択される配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＰ２は、配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、及び２３から選択される配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、構造タンパク質ＶＰ１及びＶＰ２を含む。ＶＰ２は、ＶＰ１より多く存在し得る。

【0339】

いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、（ａ）ディペンドパルボウイルスＩＴＲ、（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲ、任意によりＡＡＶ２ ＩＴＲ、（ｃ）プロトパルボウイルスＩＴＲ、及び／またはテトラパルボウイルスＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ＩＴＲは、野生型ＩＴＲと構造的に類似したＲｅｐ結合エレメント及びｔｒｓを有する末端パリンドロームである。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、２、３などに由来する。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＲＢＥ及びｔｒｓを有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、異なるＡＡＶのキメラである。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ及びＲｅｐタンパク質は、ＡＡＶ５に由来する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、合成であり、ＲＢＥモチーフ及びｔｒｓ ＧＧＴＴＧＧ、ＡＧＴＴＧＧ、ＡＧＴＴＧＡ、ＲＲＴＴＲＲから構成される。Ｂ／Ｂ’及びＣ／Ｃ’ステムからなる末端パリンドロームの典型的なＴ字型構造は、折り畳み予測に基づいて全体の二次構造を維持する置換及び挿入によって合成的に修飾することもできる（ＵＲＬ（ｈｔｔｐ）ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ／ＤＮＡ－Ｆｏｌｄｉｎｇ－Ｆｏｒｍにて入手可能）。ＩＴＲ二次構造の安定性は、ギブスの自由エネルギー、デルタＧで表され、値が低いほど、すなわち負の値が大きいほど、安定性が高いことを示す。全長１４５ｎｔ ＩＴＲの計算値ΔＧ＝－６９．９１ｋｃａｌ／ｍｏｌ。Ｂ及びＣステム：ＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧは、ΔＧ＝－２２．４４ｋｃａｌ／ｍｏｌを有する。ΔＧ＝－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ～－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌの構造をもたらす置換及び挿入は、機能的に同等であり、野生型ディペンドパルボウイルスＩＴＲと区別されない。

【0340】

いくつかの実施形態では、昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列は、（ａ）プロモーター、及び／または（ｂ）Ｋｏｚａｋ様発現制御配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、（ａ）動物ＤＮＡウイルスの最初期プロモーター、（ｂ）昆虫ウイルスの最初期プロモーター、または（ｃ）昆虫細胞プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、動物ＤＮＡウイルスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、プロトパルボウイルス、テトラパルボウイルス、またはＡＡＶである。いくつかの実施形態では、昆虫ウイルスは、鱗翅目ウイルスまたはバキュロウイルスであり、任意によりバキュロウイルスが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチキャプシド核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）または最初期１遺伝子（ＩＥ－１）プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）の少なくとも１つの複製タンパク質を含むヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２及び／またはＲｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0341】

特定の態様では、以下を含む少なくとも１つのベクターを含む昆虫細胞が本明細書に提供される：（ｉ）少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、（ｉｉ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１及び／またはＶＰ２をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、複製タンパク質、または（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ。いくつかの実施形態では、ベクターは、昆虫細胞における核酸の発現を促進するプロモーターを含む昆虫細胞適合性ベクターである。いくつかの実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（Ａ）、（ｉｉｉ）（Ｂ）、及び（ｉｉｉ）（Ｃ）のうちの少なくとも１つは、昆虫細胞ゲノムに安定して組み込まれる。

【0342】

いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、プロトパルボウイルスキャプシドタンパク質（複数可）をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、肉食動物プロトパルボウイルス、肉食動物プロトパルボウイルス１、翼手目プロトパルボウイルス１、真無盲腸目プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス２、霊長類プロトパルボウイルス３、霊長類プロトパルボウイルス４、げっ歯類プロトパルボウイルス１、げっ歯類プロトパルボウイルス２、げっ歯類プロトパルボウイルス３、有蹄動物プロトパルボウイルス１、及び有蹄動物プロトパルボウイルス２から選択される種のものである。いくつかの実施形態では、プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、テトラパルボウイルスキャプシドタンパク質（複数可）をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、翼手目テトラパルボウイルス１、霊長類テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス２、有蹄動物テトラパルボウイルス３、及び有蹄動物テトラパルボウイルス４から選択される種のものである。いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントは、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される。いくつかの実施形態では、テトラパルボウイルスは、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、またはそれらの遺伝子型バリアントである。

【0343】

いくつかの実施形態では、プロトパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質は、イヌパルボウイルス、ブファウイルス、クタウイルス、またはそれらの遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である。

【0344】

いくつかの実施形態では、テトラウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質は、ヒトパルボウイルス４またはその遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である。

【0345】

いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、鱗翅目の種、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉに由来する。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｆ９である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのベクターは、バキュロウイルスベクター、ウイルスベクター、またはプラスミドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのベクターは、バキュロウイルスベクターである。

【0346】

いくつかの実施形態では、ＶＰ１は、配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２から選択される配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＰ２は、配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、及び２３から選択される配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、構造タンパク質ＶＰ１及びＶＰ２を含む。ＶＰ２は、ＶＰ１より多く存在し得る。

【0347】

いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、（ａ）ディペンドパルボウイルスＩＴＲ、（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲ、任意によりＡＡＶ２ ＩＴＲ、（ｃ）プロトパルボウイルスＩＴＲ、及び／または（ｄ）テトラパルボウイルスＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列は、（ａ）プロモーター、及び／または（ｂ）Ｋｏｚａｋ様発現制御配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、（ａ）動物ＤＮＡウイルスの最初期プロモーター、（ｂ）昆虫ウイルスの最初期プロモーター、または（ｃ）昆虫細胞プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、動物ＤＮＡウイルスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、プロトパルボウイルス、テトラパルボウイルス、またはＡＡＶである。いくつかの実施形態では、昆虫ウイルスは、鱗翅目ウイルスまたはバキュロウイルスであり、任意によりバキュロウイルスが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチキャプシド核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）または最初期１遺伝子（ＩＥ－１）プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）の少なくとも１つの複製タンパク質を含むヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２及び／またはＲｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0348】

本明細書に記載の方法よりも低効率であるが、組換えビリオンは、哺乳動物細胞を使用して産生され得る、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２４：２８７－２９７）。

【0349】

例示的な実施形態
本開示の態様はまた、以下のとおり説明することができる：
１．（１）プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントと；（２）核酸と、を含む、組換えビリオンであって、前記核酸が、異種核酸を含む、前記組換えビリオン。

【0350】

２．（１）テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントと；（２）核酸と、を含む、組換えビリオンであって、前記核酸が、異種核酸を含む、前記組換えビリオン。

【0351】

３．前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、肉食動物プロトパルボウイルス、肉食動物プロトパルボウイルス１、翼手目プロトパルボウイルス１、真無盲腸目プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス２、霊長類プロトパルボウイルス３、霊長類プロトパルボウイルス４、げっ歯類プロトパルボウイルス１、げっ歯類プロトパルボウイルス２、げっ歯類プロトパルボウイルス３、有蹄動物プロトパルボウイルス１、及び有蹄動物プロトパルボウイルス２から選択される種のものである、１に記載の組換えビリオン。

【0352】

４．前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、１または３に記載の組換えビリオン。

【0353】

５．前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、翼手目テトラパルボウイルス１、霊長類テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス２、有蹄動物テトラパルボウイルス３、及び有蹄動物テトラパルボウイルス４から選択される種のものである、２に記載の組換えビリオン。

【0354】

６．前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、２または５に記載の組換えビリオン。

【0355】

７．前記テトラパルボウイルスが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、またはそれらの遺伝子型バリアントである、６に記載の組換えビリオン。

【0356】

８．前記ビリオンが、正二十面体である、１～７のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0357】

９．前記キャプシドタンパク質またはそのバリアントが、構造タンパク質ＶＰ１及び／またはＶＰ２を含む、１～８のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0358】

１０．ＶＰ２がＶＰ１よりも多く存在する、９に記載の組換えビリオン。

【0359】

１１．ＶＰ１が、配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２から選択される配列と、少なくとも約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、９または１０に記載の組換えビリオン。

【0360】

１２．ＶＰ２が、配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、及び２３から選択される配列と、少なくとも約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、９～１１のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0361】

１３．前記異種核酸が、標的細胞の核酸配列と少なくとも約６０％同一である核酸配列を含む、１～１２のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0362】

１４．前記異種核酸が、哺乳動物の前記核酸と少なくとも約６０％同一であり、前記哺乳動物が、好ましくはヒトである、１～１３のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0363】

１５．前記異種核酸が、プロトパルボウイルスプロモーターまたはテトラパルボウイルスプロモーターに作動可能に連結されていない、１～１４のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0364】

１６．前記核酸が、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、１～１５のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0365】

１７．前記少なくとも１つのＩＴＲが、以下を含む、１６に記載の組換えビリオン：
（ａ）ディペンドパルボウイルスＩＴＲ、
（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲ、任意によりＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｃ）プロトパルボウイルスＩＴＲ、または
（ｄ）テトラパルボウイルスＩＴＲ。

【0366】

１７ａ．前記少なくとも１つのＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、前記ＡＡＶ２ ＩＴＲが、「フリップ」配座異性体、「フロップ」配座異性体、またはそれらの組み合わせである、１６に記載の組換えビリオン。

【0367】

１７ｂ．前記少なくとも１つのＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、前記ＡＡＶ２ ＩＴＲが、配列番号１～３及び配列番号２８～３１のいずれか１つに表される核酸配列；またはそれらの相補的、逆方向、または逆相補配列、任意により配列番号２８～３１のいずれか１つ、またはそれらの相補的、逆方向、または逆相補配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である核酸配列を含む、１６に記載の組換えビリオン。

【0368】

１７ｃ．前記少なくとも１つのＩＴＲが、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、前記ＡＡＶ２ ＩＴＲが、配列番号２８～３１、例えば、以下の任意の組み合わせで表される核酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である核酸配列を含む、１６に記載の組換えビリオン：
（ａ）配列番号２８（例えば、２つのフリップ配座異性体；またはそれらの相補配列もしくは逆相補配列）；
（ｂ）配列番号２９（例えば、２つのフリップ配座異性体、またはそれらの相補的配列、または逆相補配列）；
（ｃ）配列番号３０（例えば、２つのフロップ配座異性体、またはそれらの相補的配列、または逆相補配列）；
（ｄ）配列番号３１（例えば、２つのフロップ配座異性体、またはそれらの相補的配列、または逆相補配列）；
（ｅ）配列番号２８及び配列番号２９（例えば、２つのフリップ配座異性体、またはそれらの相補的配列、または逆相補配列）；
（ｆ）配列番号３０及び配列番号３１（例えば、２つのフロップ配座異性体、またはそれらの相補的配列、または逆相補配列）；
（ｇ）配列番号２８及び配列番号３０（例えば、フリップ配座異性体及びフロップ配座異性体、またはそれらの相補的配列、または逆相補配列）；
（ｈ）配列番号２８及び配列番号３１（例えば、フリップ配座異性体及びフロップ配座異性体、またはそれらの相補的配列、または逆相補配列）；
（ｉ）配列番号２９及び配列番号３０（例えば、フリップ配座異性体及びフロップ配座異性体、またはそれらの相補的配列、または逆相補配列）；
（ｊ）配列番号２９及び配列番号３１（例えば、フリップ配座異性体及びフロップ配座異性体、またはそれらの相補的配列、逆配列、または逆相補配列）。

【0369】

１８．前記プロトパルボウイルスＩＴＲが、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントのＩＴＲから選択される、１７に記載の組換えビリオン。

【0370】

１９．前記テトラパルボウイルスＩＴＲが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントのＩＴＲから選択される、１７に記載の組換えビリオン。

【0371】

２０．前記テトラパルボウイルスＩＴＲが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、及びそれらの遺伝子型バリアントのＩＴＲから選択される、１７または１９に記載の組換えビリオン。

【0372】

２１．前記核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、１～２０のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0373】

２２．前記ＤＮＡが、一本鎖または自己相補的二本鎖である、２１に記載の組換えビリオン。

【0374】

２３．前記核酸が、Ｒｅｐタンパク質依存性複製起点（ｏｒｉ）を含む、１～２２のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0375】

２４．前記核酸が、任意により２つのＩＴＲ間に配置される、プロモーターに作動可能に連結された核酸を含む、１～２３のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0376】

２５．前記プロモーターが、以下から選択される、２４に記載の組換えビリオン：
（ａ）作動可能に連結している前記核酸に対して異種のプロモーター；
（ｂ）前記核酸の組織特異的発現を促進するプロモーター、好ましくは、前記プロモーターが、造血細胞特異的発現または赤血球系統特異的発現を促進する；
（ｃ）前記核酸の構成的発現を促進するプロモーター；及び
（ｄ）任意により、代謝産物、低分子、または化学エンティティに応答して、誘導的に発現されるプロモーター。

【0377】

２６．前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、β－グロビンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＡＨＳＰプロモーター、ＭＮＤプロモーター、Ｗｉｓｋｏｔｔ－Ａｌｄｒｉｃｈプロモーター、及びＰＫＬＲプロモーターから選択される、２４または２５に記載の組換えビリオン。

【0378】

２７．前記異種核酸が、コーディングＲＮＡ及び／またはノンコーディングＲＮＡをコードする、１～２６のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0379】

２８．コーディングＲＮＡをコードする前記異種核酸が以下を含む、２５に記載の組換えビリオン：
（ａ）タンパク質またはそのフラグメント、好ましくはヒトタンパク質またはそのフラグメントをコードする遺伝子；
（ｂ）ヌクレアーゼ、任意により転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアント）；
（ｃ）レポーター、例えばルシフェラーゼまたはＧＦＰをコードする核酸；及び／または
（ｄ）薬剤耐性タンパク質、例えばネオマイシン耐性をコードする核酸。

【0380】

２９．コーディングＲＮＡをコードする前記異種核酸が、標的細胞中での発現のためにコドン最適化される、２７または２８に記載の組換えビリオン。

【0381】

３０．前記異種核酸が、（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、及び／またはＨＢＺ）、アルファヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、フォン・ヴィレブランド因子、ジストロフィンまたは短縮型ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィンまたは短縮型ユートロフィン、マイクロユートロフィン、ウシェリン（ＵＳＨ２Ａ）、ＣＥＰ２９０、ＡＴＰＢ１、ＡＴＰＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＣＰＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣ１、Ｃｏｌ７Ａ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＡ６、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、ＫＩＮＤ１、ＩＮＳ、Ｆ８またはそれらのフラグメント（例えば、Ｂドメイン欠失ポリペプチド（例えば、ＶＩＩＩ ＳＱ、ｐ－ＶＩＩＩ）をコードするフラグメント）、及び嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）から選択されるポリペプチドまたはそれらのフラグメントをコードする遺伝子を含む異種核酸を含む、２７～２９のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【0382】

３１．前記ノンコーディングＲＮＡが、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及び／またはガイドＲＮＡを含む、２７に記載の組換えビリオン。

【0383】

３２．前記コーディングＲＮＡ、前記タンパク質、または前記ノンコーディングＲＮＡが、標的細胞の内因性遺伝子の発現を増加または回復させる、２７～３１のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【0384】

３３．前記コーディングＲＮＡ、前記タンパク質、または前記ノンコーディングＲＮＡが、標的細胞の内因性遺伝子の発現を減少させるまたは消失させる、２７～３１のいずれか１項に記載の組換えビリオン。

【0385】

３４．前記組換えビリオンが、以下をコードする核酸を含む、２７～３３のいずれか１つに記載の組換えビリオン：（ａ）ヘプシジンまたはそのフラグメント、及び／または恒常性鉄調節因子（ＨＦＥ）またはそのフラグメント；（ｂ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【0386】

３５．前記組換えビリオンが、（ａ）前記形質導入細胞中でのＨＦＥ及び／またはヘプシジンの発現を増加させる；及び／または（ｂ）前記形質導入細胞中でのＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態の発現を減少させる、３４に記載の組換えビリオン。

【0387】

３６．前記組換えビリオンが、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、及び／またはウィルソン病を予防または治療する、３４または３５に記載の組換えビリオン。

【0388】

３７．前記組換えビリオンが、（ａ）可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、及び／または可溶型のＩＬ－１β受容体；（ｂ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせを含む、２７～３３のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0389】

３８．前記組換えビリオンが、（ａ）前記形質導入細胞中において、可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、または可溶型のＩＬ－１β受容体の発現を増加させる；及び／または（ｂ）前記形質導入細胞中において、ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、またはＩＬ－１β受容体の発現を減少させる、３７に記載の組換えビリオン。

【0390】

３９．前記組換えビリオンが、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、乾癬、及び／または強直性脊椎炎を予防または治療する、３７または３８に記載の組換えビリオン。

【0391】

４０．前記組換えビリオンが、ＩＲＧＭ、ＮＯＤ２、ＡＴＧ２Ｂ、ＡＴＧ９、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＢＥＣＮ１、ＥＩ２４／ＰＩＧ８、ＴＥＣＰＲ２、ＷＤＲ４５／ＷＩＰ１４、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ダイニン、ＥＰＧ５、ＨｓｐＢ８、ＬＡＭＰ２、ＬＣ３ｂ ＵＶＲＡＧ、ＶＣＰ／ｐ９７、ＺＦＹＶＥ２６、ＰＡＲＫ２／パーキン、ＰＡＲＫ６／ＰＩＮＫ１、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２、ＳＭＵＲＦ、ＡＭＰＫ、及びＵＬＫ１から選択されるタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、２７～３３のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0392】

４１．前記組換えビリオンが、前記形質導入細胞中での前記タンパク質またはそのフラグメントの発現を増加させる、４０に記載の組換えビリオン。

【0393】

４２．オートファジーを調節する、４０または４１に記載の組換えビリオン。

【0394】

４３．オートファジー関連疾患を予防または治療する、４０～４２のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0395】

４４．前記オートファジー関連疾患が、がん、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調）、炎症性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ、肺線維症、嚢胞性線維症、シェーグレン病、高血糖障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、ウェルナー症候群、妖精症、及び脂肪萎縮性糖尿病）、脂質異常症、高脂血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下、トリグリセリドの上昇、メタボリックシンドローム、肝疾患、腎疾患、心血管疾患、虚血、脳卒中、再灌流中の合併症、筋肉変性、萎縮、老化の症状（例えば、筋萎縮、虚弱、代謝障害、軽度の炎症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、加齢に伴う認知症及び散発性アルツハイマー病、前癌状態、及びうつ病を含む精神状態）、脊髄損傷、動脈硬化、感染症（例えば、細菌性、真菌性、ウイルス性など）、ＡＩＤＳ、結核、胚子発生異常、不妊症、リソソーム蓄積症、活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、（アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、（乳児、後期乳児／若年、成人／慢性）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｓｃｈｅｉｅ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオＡ型及びＢ型、マロトー・ラミー、Ｓｌｙ病、ムコリピドーシス、マルチプルスルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ６病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、テイ＝サックス病、及びウォルマン病から選択される、４３に記載の組換えビリオン。

【0396】

４５．前記組換えビリオンが、以下をコードする核酸を含む、２７～３３のいずれか１項に記載の組換えビリオン：（ａ）ＣＦＴＲまたはそのフラグメント；（ｂ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【0397】

４６．前記組換えビリオンが、（ａ）前記形質導入細胞中でのＣＦＴＲまたはそのフラグメントの発現を増加させる；及び／または（ｂ）前記形質導入細胞中でのＣＦＴＲの内因性変異形態の発現を減少させる、４５に記載の組換えビリオン。

【0398】

４７．嚢胞性線維症を予防または治療する、４５または４６に記載の組換えビリオン。

【0399】

４８．前記核酸が、ノンコーディングＤＮＡを含む、１～４７のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0400】

４９．前記ノンコーディングＤＮＡが以下を含む、４８に記載の組換えビリオン：
（ａ）転写調節エレメント（例えば、エンハンサー、転写終結配列、非翻訳領域（５’または３’ＵＴＲ）、近位プロモーターエレメント、遺伝子座制御領域、ポリアデニル化シグナル配列）、及び／または
（ｂ）翻訳調節エレメント（例えば、Ｋｏｚａｋ配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）。

【0401】

５０．前記転写調節エレメントが、遺伝子座制御領域であり、任意によりβ－グロビンＬＣＲまたはβ－グロビンＬＣＲのＤＮａｓｅ過敏部位（ＨＳ）である、４９に記載の組換えビリオン。

【0402】

５１．前記核酸が、前記標的細胞のゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）の前記核酸配列と少なくとも約８０％同一である核酸配列を含む、１～５０のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0403】

５２．ＧＳＨと少なくとも約８０％同一である前記核酸配列が、組み込まれる前記核酸の５’及び３’に配置され、それにより相同組換えによる前記標的ゲノム内の特定の遺伝子座への組み込みが可能になる、５１に記載の組換えビリオン。

【0404】

５３．前記ＧＳＨが、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、ＮＵＰＬ２の遺伝子間領域、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １（ＨＩ １遺伝子座のチミジンキナーゼをコードする核酸）、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、またはＲＮＦ３８である、５１または５２に記載の組換えビリオン。

【0405】

５４．前記ＧＳＨが、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、またはＮＵＰＬ２の遺伝子間領域である、５３に記載の組換えビリオン。

【0406】

５５．前記核酸が、形質導入の際に標的細胞のゲノムに組み込まれる、１～５４のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0407】

５６．前記核酸が、形質導入の際に標的細胞のゲノムのＧＳＨに組み込まれる、５５に記載の組換えビリオン。

【0408】

５７．前記核酸が、少なくとも１つの複製タンパク質及びキャプシドタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸配列を含む、１～５６のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0409】

５８．前記ビリオンが、自律的に複製している、１～５７のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0410】

５９．前記ビリオンが、がん細胞もしくは非がん細胞に結合する及び／または形質導入される、１～５８のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0411】

６０．前記ビリオンが、幹細胞（例えば、造血幹細胞、ＣＤ３４＋幹細胞、ＣＤ３６＋幹細胞、間葉系幹細胞、がん幹細胞）に結合する及び／または形質導入される、１～５９のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0412】

６１．前記ビリオンが、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）を発現する細胞に結合する及び／または形質導入される、１、３、４、８～１８、または２１～６０のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0413】

６２．前記組換えビリオンが、造血細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞、赤血球系列細胞、巨核球、赤血球前駆細胞（ＥＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３６＋細胞、間葉系幹細胞、神経細胞、腸細胞、腸幹細胞、腸上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、エンテロサイト、肝臓細胞（例えば、肝細胞、肝星細胞（ＨＳＣ）、クッパー細胞（ＫＣ）、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ））、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）、赤血球前駆細胞、リンパ前駆細胞、Ｂリンパ芽球細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好塩基性風土性バーキットリンパ腫（ＥＢＬ）、多染性赤芽球、表皮幹細胞、Ｐ６３陽性ケラチノサイト由来幹細胞、ケラチノサイト、膵β細胞、Ｋ細胞、Ｌ細胞及び／または正染性赤芽球に結合する及び／または形質導入される、１～６１のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0414】

６３．前記少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントが、イヌパルボウイルス株Ｎ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１２９３０）または配列番号２７のアミノ酸配列に関して１つ以上の変異を有するＶＰ２配列を含む、１～６２のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0415】

６４．前記１つ以上の変異が、アミノ酸残基（ｉ）９１～９５、（ｉｉ）２９７～３０１、及び／または（ｉｉｉ）３２０～３２４を有するＶＰ２の領域にある、６３に記載の組換えビリオン。

【0416】

６５．前記１つ以上の変異が、置換、欠失、及び／または挿入を含む、６３または６４に記載の組換えビリオン。

【0417】

６６．前記１つ以上の変異が、前記組換えビリオンの内在化に関与する少なくとも１つの細胞受容体に対する前記組換えビリオンの親和性及び／または特異性を改変させ、任意により、前記少なくとも１つの細胞受容体が、トランスフェリン受容体である、６３～６５のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0418】

６７．前記１つ以上の変異が、以下を改変する、６３～６６のいずれか１項に記載の組換えビリオン：
ａ）細胞に対する前記組換えビリオンの向性または親和性；
ｂ）細胞に形質導入する前記組換えビリオンの能力；及び／または
ｃ）前記組換えビリオンが前記細胞を通過してトランスサイトーシスする能力。

【0419】

６８．前記少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントが、異種ペプチドタグを含む、１～６７のいずれか１つに記載の組換えビリオン。

【0420】

６９．前記異種ペプチドタグにより、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、またはナノボディを使用したアフィニティー精製が可能になる、６８に記載の組換えビリオン。

【0421】

７０．前記異種ペプチドタグが、ヘマグルチニン、Ｈｉｓ（例えば、６Ｘ－Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、Ｅタグ、ＴＫ１５、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｍｙｃ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＫＴ３、及びＩＲＳから選択されるエピトープ／タグを含む、６８または６９に記載の組換えビリオン。

【0422】

７１．１～７０のいずれか１つに記載の組換えビリオン、ならびに担体及び／または希釈剤を含む医薬組成物。

【0423】

７２．疾患を予防または治療する方法であって、有効量の１～７１のいずれか１つに記載の少なくとも１つの組換えビリオン、または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。

【0424】

７３．疾患を予防または治療する方法であって、
（ａ）複数の細胞を得ることと、
（ｂ）１～７１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物を前記細胞に形質導入し、任意により前記形質導入細胞をさらに選択またはスクリーニングすることと；
（ｃ）有効量の前記形質導入細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含む、前記方法。

【0425】

７４．前記細胞が、前記対象にとって自家または同種他家である、７３に記載の方法。

【0426】

７５．７２～７４のいずれか１つに記載の方法であって、
（ａ）前記核酸が、タンパク質をコードするか；または
（ｂ）前記核酸が、内因性遺伝子の発現を減少させるか、または消失させる、前記方法。

【0427】

７６．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、血管内、脳内、非経口、腹腔内、静脈内、硬膜外、脊髄内、胸骨内、関節内、滑膜内、髄腔内、動脈内、心臓内、筋肉内、鼻腔内、肺内、皮膚移植、または経口投与を介して投与される、７２～７５のいずれか１つに記載の方法。

【0428】

７７．前記疾患が、内皮機能不全、嚢胞性線維症、心血管疾患、腎疾患、がん、ヘモグロビン症、貧血、血友病（例えば、血友病Ａ）、骨髄増殖性障害、凝固障害、鎌状赤血球症、アルファ－サラセミア、ベータ－サラセミア、ファンコニ貧血、家族性肝内胆汁うっ滞、表皮水疱症、ファブリー、ゴーシェ、ニーマンピックＡ、ニーマンピックＢ、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ムコ多糖症（ＭＰＳ）Ｉ（Ｈｕｒｌｅｒ、Ｓｃｈｅｉｅ、Ｈｕｒｌｅｒ／Ｓｃｈｅｉｅ）、ＭＰＳ ＩＩ（Ｈｕｎｔｅｒ）、ＭＰＳ ＶＩ（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ－Ｌａｍｙ）、血液癌、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、肝硬変、肝細胞癌、膵炎、糖尿病、心筋症、関節炎、性腺機能低下症、心臓疾患、心臓発作、甲状腺機能低下症、耐糖能異常、関節症、肝線維症、ウィルソン病、潰瘍性大腸炎、クローン病、テイ＝サックス病、神経変性疾患、脊髄性筋萎縮症１型、ハンチントン病、カナバン病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、乾癬、及び強直性脊椎炎、ならびに自己免疫疾患、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調）、炎症性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ、肺線維症、シェーグレン病、高血糖障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、ウェルナー症候群、妖精症、及び脂肪萎縮性糖尿病）、脂質異常症、高脂血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下、トリグリセリドの上昇、メタボリックシンドローム、肝疾患、腎疾患、心血管疾患、虚血、脳卒中、再灌流中の合併症、筋肉変性、萎縮、老化の症状（例えば、筋萎縮、虚弱、代謝障害、軽度の炎症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、加齢に伴う認知症及び散発性アルツハイマー病、前癌状態、及びうつ病を含む精神状態）、脊髄損傷、動脈硬化、感染症（例えば、細菌性、真菌性、ウイルス性など）、ＡＩＤＳ、結核、胚子発生異常、不妊症、リソソーム蓄積症、活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、（乳児、後期乳児／若年、成人／慢性）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｓｃｈｅｉｅ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオＡ型及びＢ型、マロトー・ラミー、Ｓｌｙ病、ムコリピドーシス、マルチプルスルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ６病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、及びウォルマン病から選択される、７２～７６のいずれか１つに記載の方法。

【0429】

７８．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、プロトパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントまたはその遺伝子型バリアントを含む、７２～７７のいずれか１つに記載の方法。

【0430】

７９．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、以下をコードする核酸を含む、７８に記載の方法：（ａ）ヘプシジンまたはそのフラグメント、及び／または恒常性鉄調節因子（ＨＦＥ）またはそのフラグメント；（ｂ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【0431】

８０．前記対象には、以下をコードする核酸を含む前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が投与される、７８または７９に記載の方法：
ａ）ヘプシジンまたはそのフラグメントであって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に静脈内投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝細胞に形質導入される、前記ヘプシジンまたはそのフラグメント；
ｂ）ＨＦＥまたはそのフラグメントであって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に静脈内投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝細胞に形質導入される、前記ＨＦＥまたはそのフラグメント；
ｃ）ＨＦＥまたはそのフラグメントであって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に経口投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される、前記ＨＦＥまたはそのフラグメント；
ｄ）ＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）であって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に静脈内投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝細胞に形質導入される、前記少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ；
ｅ）ＨＦＥの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）であって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に経口投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される、前記少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ；
ｆ）ＤＭＴ－１を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）であって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に経口投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される、前記少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ；
ｇ）フェロポーチンを標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）であって、前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が前記対象に経口投与され、任意により、（ｉ）前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、及び／または（ｉｉ）前記組換えビリオンまたは医薬組成物が、エンテロサイトに形質導入される、前記少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ；または
ｈ）ａ）～ｇ）のいずれか２つ以上の組み合わせ。

【0432】

８１．前記組み合わせが、ｂ）～ｅ）のいずれか１つのうちの２つ以上を含む、８０に記載の方法。

【0433】

８２．前記組換えビリオンまたは医薬組成物が、ａ）前記形質導入細胞中におけるＨＦＥまたはそのフラグメント、及び／またはヘプシジンまたはそのフラグメントの発現を増加させる；及び／またはｂ）前記形質導入細胞中におけるＤＭＴ－１、フェロポーチン、及び／またはＨＦＥの内因性変異形態の発現を減少させる、７８～８１のいずれか１つに記載の方法。

【0434】

８３．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、及び／またはウィルソン病を予防または治療する、７８～８２のいずれか１つに記載の方法。

【0435】

８４．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、以下をコードする核酸を含む、７８に記載の方法：（ａ）可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、及び／または可溶型のＩＬ－１β受容体；（ｂ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、及び／またはＩＬ－１β受容体を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせ。

【0436】

８５．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、（ａ）前記形質導入細胞中において、可溶型のＴＮＦα受容体、可溶型のＩＬ－６受容体、可溶型のＩＬ－１２受容体、または可溶型のＩＬ－１β受容体の発現を増加させる；及び／または（ｂ）前記形質導入細胞中において、ＴＮＦα受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、またはＩＬ－１β受容体の発現を減少させる、８４に記載の方法。

【0437】

８６．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、乾癬、及び／または強直性脊椎炎を予防または治療する、７８、８４、及び８５のいずれか１つに記載の方法。

【0438】

８７．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物または形質導入細胞が、ＩＲＧＭ、ＮＯＤ２、ＡＴＧ２Ｂ、ＡＴＧ９、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＢＥＣＮ１、ＥＩ２４／ＰＩＧ８、ＴＥＣＰＲ２、ＷＤＲ４５／ＷＩＰ１４、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ダイニン、ＥＰＧ５、ＨｓｐＢ８、ＬＡＭＰ２、ＬＣ３ｂ ＵＶＲＡＧ、ＶＣＰ／ｐ９７、ＺＦＹＶＥ２６、ＰＡＲＫ２／パーキン、ＰＡＲＫ６／ＰＩＮＫ１、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２、ＳＭＵＲＦ、ＡＭＰＫ、及びＵＬＫ１から選択されるタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、７８に記載の方法。

【0439】

８８．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、前記形質導入細胞中で前記タンパク質またはそのフラグメントの発現を増加させる、８７に記載の方法。

【0440】

８９．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、オートファジーを調節する、７８、８７、及び８８のいずれか１つに記載の方法。

【0441】

９０．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、オートファジー関連疾患を予防または治療する、７８及び８７～８９のいずれか１つに記載の方法。

【0442】

９１．前記オートファジー関連疾患が、がん、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調）、炎症性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ、肺線維症、嚢胞性線維症、シェーグレン病、高血糖障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、ウェルナー症候群、妖精症、及び脂肪萎縮性糖尿病）、脂質異常症、高脂血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下、トリグリセリドの上昇、メタボリックシンドローム、肝疾患、腎疾患、心血管疾患、虚血、脳卒中、再灌流中の合併症、筋肉変性、萎縮、老化の症状（例えば、筋萎縮、虚弱、代謝障害、軽度の炎症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、加齢に伴う認知症及び散発性アルツハイマー病、前癌状態、及びうつ病を含む精神状態）、脊髄損傷、動脈硬化、感染症（例えば、細菌性、真菌性、ウイルス性など）、ＡＩＤＳ、結核、胚子発生異常、不妊症、リソソーム蓄積症、活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、（アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、（乳児、後期乳児／若年、成人／慢性）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、Ｓｃｈｅｉｅ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオＡ型及びＢ型、マロトー・ラミー、Ｓｌｙ病、ムコリピドーシス、マルチプルスルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ６病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、テイ＝サックス病、及びウォルマン病から選択される、９０に記載の方法。

【0443】

９２．前記プロトパルボウイルスが、クタウイルスである、７８に記載の方法。

【0444】

９３．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／またはリンパ前駆細胞を標的とする、９２に記載の方法。

【0445】

９４．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、がんを予防するまたは治療する、７８、９２、及び９３のいずれか１つに記載の方法。

【0446】

９５．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣ１、Ｃｏｌ７Ａ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＡ６、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、及び／またはＫＩＮＤ１をコードする核酸を含む、７８または９２に記載の方法。

【0447】

９６．前記形質導入細胞が、表皮幹細胞、Ｐ６３陽性ケラチノサイト由来幹細胞、またはケラチノサイトである、９５に記載の方法。

【0448】

９７．前記形質導入細胞を前記対象の皮膚に移植することをさらに含む、９５または９６に記載の方法。

【0449】

９８．前記少なくとも１つの組換えビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞が、表皮水疱症を予防するまたは治療する、９５～９７のいずれか１つに記載の方法。

【0450】

９９．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、テトラパルボウイルスの少なくとも１つのキャプシドタンパク質またはそのバリアントまたはその遺伝子型バリアントを含む、７２～７７のいずれか１つに記載の方法。

【0451】

１００．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、ヘモグロビン遺伝子（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、及び／またはＨＢＺ）、アルファヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、フォン・ヴィレブランド因子、ジストロフィンまたは短縮型ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィンまたは短縮型ユートロフィン、マイクロユートロフィン、ウシェリン（ＵＳＨ２Ａ）、ＣＥＰ２９０、ＡＴＰＢ１、ＡＴＰＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＣＰＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣ１、Ｃｏｌ７Ａ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＡ６、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、ＫＩＮＤ１、ＩＮＳ、Ｆ８またはそれらのフラグメント（例えば、Ｂドメイン欠失ポリペプチド（例えば、ＶＩＩＩ ＳＱ、ｐ－ＶＩＩＩ）をコードするフラグメント）、及び嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）から選択されるタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、９９に記載の方法。

【0452】

１０１．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、以下に形質導入される、９９または１００に記載の方法：（ａ）ＣＤ３４＋幹細胞、任意によりｅｘ ｖｉｖｏで形質導入される；（ｂ）間葉系幹細胞、任意によりｅｘ ｖｉｖｏで形質導入される；（ｃ）肝臓細胞（例えば、肝細胞）、（ｄ）小腸細胞、及び／または（ｅ）肺細胞。

【0453】

１０２．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、肝動脈、門脈、または静脈内投与を介して肝臓に送達される、９９～１０１のいずれか１つに記載の方法。

【0454】

１０３．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、経口投与によって小腸に送達される、９９～１０１のいずれか１項に記載の方法。

【0455】

１０４．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、（ａ）ＣＦＴＲまたはそのフラグメント；（ｂ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とする少なくとも１つのノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）；（ｃ）ＣＦＴＲの内因性変異形態を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム；及び／または（ｄ）（ａ）～（ｃ）に列挙された核酸のいずれか１つの任意の組み合わせをコードする核酸を含む、９９～１０１のいずれか１つに記載の方法。

【0456】

１０５．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、鼻腔内または肺内投与を介して肺に送達される、１０４に記載の方法。

【0457】

１０６．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、（ａ）前記形質導入細胞中でＣＦＴＲまたはそのフラグメントの発現を増加させる；及び／または（ｂ）前記形質導入細胞中でＣＦＴＲの内因性変異形態の発現を減少させる、９９～１０１、１０４及び１０５のいずれか１項に記載の方法。

【0458】

１０７．前記少なくとも１つの組換えビリオンまたは医薬組成物が、嚢胞性線維症を予防または治療する、９９～１０１、及び１０４～１０６のいずれか１つに記載の方法。

【0459】

１０８．少なくとも１つの追加量の前記ビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞を再投与することをさらに含む、７２～１０７のいずれか１つに記載の方法。

【0460】

１０９．前記少なくとも１つの追加量の前記再投与が、前記有効量の前記ビリオン、医薬組成物、または形質導入細胞の前記投与後の治療の減弱後に行われる、１０８に記載の方法。

【0461】

１１０．前記少なくとも１つの追加量が、前記有効量と同じである、１０８または１０９に記載の方法。

【0462】

１１１．前記有効量と比較して、前記少なくとも１つの追加量を増加または減少させることをさらに含む、１０８または１０９に記載の方法。

【0463】

１１２．前記少なくとも１つの追加の量を、内因性遺伝子及び／または前記組換えビリオンの前記核酸の発現に基づいて増加または減少させる、１１１に記載の方法。

【0464】

１１３．前記核酸の前記発現を調節する剤を前記対象に投与すること、または前記細胞を剤に接触させることをさらに含む、７２～１１２のいずれか１つに記載の方法。

【0465】

１１４．前記剤が、低分子、代謝産物、オリゴヌクレオチド、リボスイッチ、ペプチド、ペプチド模倣体、ホルモン、ホルモン類似体、及び光から選択される、１１３に記載の方法。

【0466】

１１５．前記剤が、テトラサイクリン、キュメート（ｃｕｍａｔｅ）、タモキシフェン、エストロゲン、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ラパマイシン、ＦＫＣｓＡ、青色光、アブシジン酸（ＡＢＡ）、及びリボスイッチから選択される、１１３または１１４に記載の方法。

【0467】

１１６．間隔をおいて、前記剤を１回以上再投与することをさらに含む、７２～１１５のいずれか１つに記載の方法。

【0468】

１１７．前記剤の前記再投与が、前記核酸の周期的発現をもたらす、１１６に記載の方法。

【0469】

１１８．前記間隔間の時間及び／または前記剤の量を、前記核酸から発現した前記タンパク質の血清濃度及び／または半減期に基づいて増加または減少させる、１１６または１１７に記載の方法。

【0470】

１１９．細胞内の（ｉ）遺伝子発現、または（ｉｉ）タンパク質の機能及び／または構造を調節する方法であって、前記方法が、前記細胞内の前記遺伝子発現または前記タンパク質の前記機能及び／または構造を調節する核酸を含む、１～７１のいずれか１項に記載のビリオンまたは医薬組成物を前記細胞に形質導入することを含む、前記方法。

【0471】

１２０．前記核酸が、ＣＲＩＳＰＲｉまたはＣＲＩＳＰＲａ剤をコードする配列を含む、１１９に記載の方法。

【0472】

１２１．前記遺伝子発現、または前記タンパク質の前記機能及び／または構造が増加するかまたは回復される、１１９または１２０に記載の方法。

【0473】

１２２．前記遺伝子発現、または前記タンパク質の前記機能及び／または構造が減少するかまたは消失する、１１９または１２０に記載の方法。

【0474】

１２３．異種核酸を細胞内のＧＳＨに組み込む方法であって、
（ａ）前記標的ＧＳＨ核酸と少なくとも約８０％同一であるドナー核酸配列が５’末端及び３’末端で隣接する異種核酸を含む、１～７１のいずれか１つに記載の１つ以上のビリオンまたは医薬組成物を前記細胞に形質導入すること、または
（ｂ）１～７１のいずれか１つに記載の１つ以上のビリオンまたは医薬組成物を前記細胞に形質導入することであって、前記ビリオンまたは医薬組成物が、（ｉ）前記標的ＧＳＨ核酸と少なくとも約８０％同一であるドナー核酸配列が５’末端及び３’末端で隣接する異種核酸と、（ｉｉ）ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアント、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ）及び／またはガイドＲＮＡをコードする核酸と、を含み、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ複合体が、前記ＧＳＨにおいてＤＮＡを切断し、これは、前記ドナー核酸を使用して修復され、それによって異種核酸がＧＳＨにおいて組み込まれる、前記方法。

【0475】

１２４．（ｉ）前記標的ＧＳＨ核酸と少なくとも約８０％同一であるドナー核酸が隣接する前記異種核酸が、１つのビリオン内に形質導入され、かつ（ｉｉ）前記核酸がヌクレアーゼをコードする、及び／または前記ｇＲＮＡが別のビリオンに形質導入される、１２３に記載の方法。

【0476】

１２５．前記ＧＳＨが、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、ＮＵＰＬ２の遺伝子間領域、コラーゲン、ＨＴＲＰ、ＨＩ １（ＨＩ １遺伝子座のチミジンキナーゼをコードする核酸）、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＲＵＮＸ１、ＫＬＨＬ７、ｍｉｒ６８４、ＫＣＮＨ２、ＧＰＮＭＢ、ＭＩＲ４５４０、ＭＩＲ４４７５、ＭＩＲ４４７６、ＰＲＬ３２Ｐ２１、ＬＯＣ１０５３７６０３１、ＬＯＣ１０５３７６０３２、ＬＯＣ１０５３７６０３０、ＭＥＬＫ、ＥＢＬＮ３Ｐ、ＺＣＣＨＣ７、またはＲＮＦ３８である、１２３または１２４に記載の方法。

【0477】

１２６．前記ＧＳＨが、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＣＲ５、Ｋｉｆ６、Ｐａｘ５、またはＮＵＰＬ２の遺伝子間領域である、１２３～１２５のいずれか１つに記載の方法。

【0478】

１２７．１～７０のいずれか１項に記載の組換えビリオンを産生する方法であって、
（１）以下を含む少なくとも１つのベクターを提供することと；
（ｉ）少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列であって、任意により標的細胞における発現のためにプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含む、前記ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）前記プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはそのバリアントをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列であって、昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、前記ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：
（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、
（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの前記少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、前記複製タンパク質、または
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、
（２）前記少なくとも１つのベクターを昆虫細胞に導入することと；
（３）１～７０のいずれか１つに記載の組換えビリオンが産生されるような条件下で、前記昆虫細胞を維持することと、を含む、前記方法。

【0479】

１２８．２つのベクターが提供される、１２７に記載の方法であって、
（ａ）第１のベクターは、少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列、任意により標的細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含むヌクレオチド配列を含み、
（ｂ）第２のベクターは、
（ｉ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、前記プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはそのバリアントをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び
（ｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：
（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、
（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの前記少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、前記複製タンパク質、または
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、を含む、前記方法。

【0480】

１２９．３つのベクターが提供される、１２７に記載の方法であって、
（ａ）第１のベクターは、少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列、任意により標的細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含むヌクレオチド配列を含み、
（ｂ）第２のベクターは、昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、前記プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはそのバリアントをコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含み、及び
（ｃ）第３のベクターは、以下を含むヌクレオチド配列：
（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、
（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの前記少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、前記複製タンパク質、または
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、を含む、前記方法。

【0481】

１３０．昆虫細胞において、１～７０のいずれか１つに記載の組換えビリオンを産生する方法であって、前記方法が、
（１）昆虫細胞を提供することであって、前記昆虫細胞は、
（ｉ）少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列、任意により標的細胞における発現のためにプロモーターに作動可能に連結された異種核酸をさらに含む、ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、前記プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはそのバリアントをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：
（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、
（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの前記少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、前記複製タンパク質、または
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、を含み、
ここで、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（Ａ）、（ｉｉｉ）（Ｂ）、及び（ｉｉｉ）（Ｃ）のうちの少なくとも１つは、前記昆虫細胞ゲノムに安定に組み込まれており、少なくとも１つのベクターが、存在する場合、前記昆虫細胞のゲノムに安定に組み込まれていない（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（Ａ）、（ｉｉｉ）（Ｂ）、及び（ｉｉｉ）（Ｃ）のヌクレオチド配列の残りの部分を含む、前記提供することと、
（２）前記組換えビリオンが産生されるような条件下で、前記昆虫細胞を維持することと、を含む、前記方法。

【0482】

１３１．前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、肉食動物プロトパルボウイルス、肉食動物プロトパルボウイルス１、翼手目プロトパルボウイルス１、真無盲腸目プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス２、霊長類プロトパルボウイルス３、霊長類プロトパルボウイルス４、げっ歯類プロトパルボウイルス１、げっ歯類プロトパルボウイルス２、げっ歯類プロトパルボウイルス３、有蹄動物プロトパルボウイルス１、及び有蹄動物プロトパルボウイルス２から選択される種のものである、１２７～１３０のいずれか１つに記載の方法。

【0483】

１３２．前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、１２７～１３１のいずれか１つに記載の方法。

【0484】

１３３．前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、翼手目テトラパルボウイルス１、霊長類テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス２、有蹄動物テトラパルボウイルス３、及び有蹄動物テトラパルボウイルス４から選択される種のものである、１２７～１３０のいずれか１つに記載の方法。

【0485】

１３４．前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、１２７～１３０、及び１３３のいずれか１つに記載の方法。

【0486】

１３５．前記テトラパルボウイルスが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、またはそれらの遺伝子型バリアントである、１２７～１３０、１３３、及び１３４のいずれか１つに記載の方法。

【0487】

１３６．プロトパルボウイルスの前記少なくとも１つの複製タンパク質が、イヌパルボウイルス、ブファウイルス、クタウイルス、またはそれらの遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である、１２７～１３５のいずれか１つに記載の方法。

【0488】

１３７．テトラウイルスの前記少なくとも１つの複製タンパク質が、ヒトパルボウイルス４またはその遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である、１２７～１３５のいずれか１つに記載の方法。

【0489】

１３８．前記昆虫細胞が、鱗翅目の種に由来する、１２７～１３７のいずれか１つに記載の方法。

【0490】

１３９．前記鱗翅目の種が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉである、１３８に記載の方法。

【0491】

１４０．前記昆虫細胞が、Ｓｆ９である、１２７～１３９のいずれか１つに記載の方法。

【0492】

１４１．前記少なくとも１つのベクターが、バキュロウイルスベクター、ウイルスベクター、またはプラスミドである、１２７～１４０のいずれか１つに記載の方法。

【0493】

１４２．前記少なくとも１つのベクターが、バキュロウイルスベクターである、１２７～１４１のいずれか１つに記載の方法。

【0494】

１４３．ＶＰ１が、配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２から選択される配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む、１２７～１４２のいずれか１つに記載の方法。

【0495】

１４４．ＶＰ２が、配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、及び２３から選択される配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む、１２７～１４３のいずれか１つに記載の方法。

【0496】

１４５．前記少なくとも１つのＩＴＲが、
（ａ）ディペンドパルボウイルスＩＴＲ、
（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲ、任意によりＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｃ）プロトパルボウイルスＩＴＲ、及び／または
（ｄ）テトラパルボウイルスＩＴＲ、を含む、１２７～１４４のいずれか１つに記載の方法。

【0497】

１４６．昆虫細胞における発現のための前記少なくとも１つの発現制御配列が、
（ａ）プロモーター、及び／または
（ｂ）Ｋｏｚａｋ様発現制御配列を含む、１２７～１４５のいずれか１つに記載の方法。

【0498】

１４７．前記プロモーターが、
（ａ）動物ＤＮＡウイルスの最初期プロモーター、
（ｂ）昆虫ウイルスの最初期プロモーター、または
（ｃ）昆虫細胞プロモーターを含む、１４６に記載の方法。

【0499】

１４８．前記動物ＤＮＡウイルスが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、プロトパルボウイルス、テトラパルボウイルス、またはＡＡＶである、１４７に記載の方法。

【0500】

１４９．前記昆虫ウイルスが、鱗翅目ウイルスまたはバキュロウイルスであり、任意により前記バキュロウイルスが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチキャプシド核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）である、１４７に記載の方法。

【0501】

１５０．前記プロモーターが、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーターまたは最初期１遺伝子（ＩＥ－１）プロモーターである、１４６～１４９のいずれか１つに記載の方法。

【0502】

１５１．ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質を含む前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ５２及び／またはＲｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列を含む、１２７～１５０のいずれか１つに記載の方法。

【0503】

１５２．前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２である、１２７～１５１のいずれか１つに記載の方法。

【0504】

１５３．少なくとも１つのベクターを含む昆虫細胞であって、
（ｉ）少なくとも１つのＩＴＲヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（ｉｉ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、前記プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはそのバリアントをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）以下を含むヌクレオチド配列：
（Ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたプロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスの少なくとも１つの複製タンパク質、
（Ｂ）ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質であって、任意により、ＡＡＶの前記少なくとも１つの複製タンパク質は、（ａ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０コード配列、及び／または（ｂ）昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８コード配列を含む、前記複製タンパク質、または
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせ、を含む、前記昆虫細胞。

【0505】

１５４．（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（Ａ）、（ｉｉｉ）（Ｂ）、及び（ｉｉｉ）（Ｃ）のうちの少なくとも１つが、前記昆虫細胞ゲノムに安定して組み込まれる、１５３に記載の昆虫細胞。

【0506】

１５５．前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、肉食動物プロトパルボウイルス、肉食動物プロトパルボウイルス１、翼手目プロトパルボウイルス１、真無盲腸目プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス１、霊長類プロトパルボウイルス２、霊長類プロトパルボウイルス３、霊長類プロトパルボウイルス４、げっ歯類プロトパルボウイルス１、げっ歯類プロトパルボウイルス２、げっ歯類プロトパルボウイルス３、有蹄動物プロトパルボウイルス１、及び有蹄動物プロトパルボウイルス２から選択される種のものである、１５３または１５４に記載の昆虫細胞。

【0507】

１５６．前記プロトパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ヒトブファウイルス１、ヒトブファウイルス２、ヒトブファウイルス３、ヒトｔｕｓａｖｉｒｕｓ、ヒトクタウイルス、Ｗｕｈａｒｖパルボウイルス、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、オオコウモリブファウイルス、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、１５３～１５５のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0508】

１５７．前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、翼手目テトラパルボウイルス１、霊長類テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス１、有蹄動物テトラパルボウイルス２、有蹄動物テトラパルボウイルス３、及び有蹄動物テトラパルボウイルス４から選択される種のものである、１５３または１５４に記載の昆虫細胞。

【0509】

１５８．前記テトラパルボウイルスまたはその遺伝子型バリアントが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、チンパンジーパルボウイルス４、ストローオオコウモリパルボウイルス、ウシホコウイルス１、ウシホコウイルス２、ブタホコウイルス、ブタｃｎｖｉｒｕｓ、ヤクパルボウイルス、ヒツジホコウイルス１、フクロネズミテトラパルボウイルス、げっ歯類テトラパルボウイルス、テトラパルボウイルス種、及びそれらの遺伝子型バリアントから選択される、１５３、１５４、及び１５７のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0510】

１５９．前記テトラパルボウイルスが、ヒトパルボウイルス４、ヒトパルボウイルス４遺伝子型１、ヒトパルボウイルス４遺伝子型２、ヒトパルボウイルス４遺伝子型３、またはそれらの遺伝子型バリアントである、１５３、１５４、１５７、及び１５８のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0511】

１６０．プロトパルボウイルスの前記少なくとも１つの複製タンパク質が、イヌパルボウイルス、ブファウイルス、クタウイルス、またはそれらの遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である、１５３～１５９のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0512】

１６１．テトラウイルスの前記少なくとも１つの複製タンパク質が、ヒトパルボウイルス４またはその遺伝子型バリアントのＮＳ－１タンパク質である、１５３～１５９のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0513】

１６２．前記昆虫細胞が、鱗翅目の種に由来する、１５３～１６１のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0514】

１６３．前記鱗翅目の種が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉである、１６２に記載の昆虫細胞。

【0515】

１６４．前記昆虫細胞が、Ｓｆ９である、１５３～１６３のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0516】

１６５．前記少なくとも１つのベクターが、バキュロウイルスベクター、ウイルスベクター、またはプラスミドである、１５３～１６４のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0517】

１６６．前記少なくとも１つのベクターが、バキュロウイルスベクターである、１５３～１６５のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0518】

１６７．ＶＰ１が、配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２から選択される配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む、１５３～１６６のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0519】

１６８．ＶＰ２が、配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、及び２３から選択される配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む、１５３～１６７のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0520】

１６９．前記少なくとも１つのＩＴＲが、
（ａ）ディペンドパルボウイルスＩＴＲ、
（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲ、任意によりＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｃ）プロトパルボウイルスＩＴＲ、及び／または
（ｄ）テトラパルボウイルスＩＴＲ、を含む、１５３～１６８のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0521】

１７０．昆虫細胞における発現のための前記少なくとも１つの発現制御配列が、
（ａ）プロモーター、及び／または
（ｂ）Ｋｏｚａｋ様発現制御配列を含む、１５３～１６９のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0522】

１７１．前記プロモーターが、
（ａ）動物ＤＮＡウイルスの最初期プロモーター、
（ｂ）昆虫ウイルスの最初期プロモーター、または
（ｃ）昆虫細胞プロモーターを含む、１７０に記載の昆虫細胞。

【0523】

１７２．前記動物ＤＮＡウイルスが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、プロトパルボウイルス、テトラパルボウイルス、またはＡＡＶである、１７１に記載の昆虫細胞。

【0524】

１７３．前記昆虫ウイルスが、鱗翅目ウイルスまたはバキュロウイルスであり、任意により前記バキュロウイルスが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチキャプシド核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）である、１７１に記載の昆虫細胞。

【0525】

１７４．前記プロモーターが、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーターまたは最初期１遺伝子（ＩＥ－１）プロモーターである、１７０～１７３のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0526】

１７５．ＡＡＶの少なくとも１つの複製タンパク質を含む前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ５２及び／またはＲｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列を含む、１５３～１７４のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【0527】

１７６．前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２である、１５３～１７５のいずれか１つに記載の昆虫細胞。

【実施例】

【0528】

実施例１：イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４キャプシドタンパク質を含む組換えビリオンの構築
組換えビリオンの核酸
ベクターゲノム設計は、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、例えば、ＡＡＶ末端パリンドロームのＩＴＲ配座異性体及び発現カセットまたは転写カセットから構成される。一般的な発現カセットは、典型的には、エンハンサーエレメント及びプロモーターエレメントとして特徴付けられる調節エレメントからなる。ＲＮＡポリメラーゼ複合体によって転写される領域は、シス作用性調節エレメント、例えばＴＡＴＡボックス、及び５’非翻訳エクソン配列、イントロン配列、翻訳エクソン配列、３’非翻訳領域、ポリアデニル化シグナル配列からなる。転写後エレメントには、翻訳開始のためのＫｏｚａｋモチーフ及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントが含まれる。特定のベクターは、商用サービスプロバイダーを使用して化学的に合成され、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で伝播させるためにプラスミドにライゲート連結させる。プラスミドには、複数のクローニング部位、少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子、プラスミド複製起点、及びバキュロウイルスゲノムへの組換えを促進する配列が最低限含まれている。一般的に使用されるアプローチは次の２つである：１．細菌系、この系では、Ｅ．ｃｏｌｉが、バキュロウイルスゲノム（バクミド）を保有しており、トランスポザーゼ媒介組換えを使用して、プラスミド遺伝子をバクミドに導入する。組換えバクミドを有するＥ．ｃｏｌｉは、選択培地で調製した寒天プレート上で成長することにより検出可能である。「陽性」コロニーを懸濁培地中で拡大させ、接種後約３日後にバクミドを回収する。次に、Ｓｆ９細胞にバクミドをトランスフェクトし、許容昆虫細胞内で感染性の組換えバキュロウイルス粒子を産生する。２．あるいは、ベクターＤＮＡを、インサートに隣接する数百塩基対のバキュロウイルスＤＮＡを有するシャトルプラスミドに挿入する。Ｓｆ９細胞にシャトルプラスミド及び線状化バキュロウイルスサブゲノムＤＮＡを同時トランスフェクションすることにより、欠失したバキュロウイルスエレメントが回復され、感染性の組換えバキュロウイルスが産生される。６ｋｂ以下のベクターＤＮＡは、バキュロウイルスのゲノム（約１３５ｋｂ）中に存在し、Ｓｆ９細胞がパルボウイルスの非構造タンパク質またはＲｅｐタンパク質を発現しない限り、バキュロウイルスとして伝播する。次に、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに作用し、ベクターとバキュロウイルスのゲノムを分解し、そこでベクターのゲノムがバキュロウイルスのゲノムを自律的に複製する（図１Ｂ）。

【0529】

ＤＮＡを構成する核酸
ＤＮＡは、一本鎖または自己相補的（すなわち、分子内二本鎖）のいずれであってもよい。図１Ｂに示すとおり、ベクターＤＮＡのＲｅｐ媒介複製は、いくつかの中間体を経て進行する。これらの複製中間体は、プロセシングを受けて一本鎖ビリオンゲノムとなるが、産生物の生産力が一本鎖ビリオンゲノムへのプロセシングを上回り得る。この場合、ＲＦｍ（図１Ｂ）として表される分子内二本鎖分子からなる複製中間体が、パルボウイルスのキャプシドにパッケージングされる。自己相補的ベクターゲノムのパッケージングは、機能的なＩＴＲの存在にもかかわらず生じる。

【0530】

ＤＮＡは、Ｒｅｐタンパク質依存の複製起点（ｏｒｉ）を有し得る。ｏｒｉは、末端パリンドローム内にあるＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）からなる。逆方向末端反復（ＩＴＲ）と呼ばれる末端パリンドロームは、２つの内部パリンドロームを有する全パリンドローム配列からなり得る。ＩＴＲは、キャプシド内の複製及びキャプシド形成に必要なシス作用モチーフを有し得る。

【0531】

ＲＢＥは、標準ＧＣＴＣのＲｅｐ結合エレメントを表す。ＲＢＥ’は、非標準ＲＢＥ、ＩＴＲクロスアームの先端にある対になっていないＴＴＴを表す。ｔｒｓは、末端分解部位５’ＡＧＴＴＧＧ、ＧＧＴＴＧＧなどを表す。Ｒｅｐ（Ｙ１５６）の触媒チロシンは、ｔｒｓを切断し、切れやすい５’チミジンと共有結合による連結を形成する。ｔｒｓの変異により、切断効率の低下または喪失となり、結果として自己相補的ＤＮＡが生じる。あるいは、自己相補的ビリオンゲノムは、ＲＦｍの不完全なプロセシングのキャプシド形成の結果生じる。

【0532】

イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４キャプシドタンパク質を含む組換えビリオンのＤＮＡ複製
ＡＡＶ ＩＴＲを利用した複製－パルボウイルスＤＮＡ複製は、「ローリングヘアピン」複製と呼ばれる。一本鎖ビリオンＤＮＡとして、ＩＴＲは、エネルギー的に安定したＴ字型構造を形成し（図１Ａ）、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体によるＤＮＡ伸長のプライマーとして作用する（図１Ｂ）。ＤＮＡ合成は、リード鎖であり、相補鎖が、ＩＴＲを介して共有結合により連結する二本鎖中間体をもたらす進行的プロセスである（図１Ｂ）。ｐ５ Ｒｅｐタンパク質の結合は、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）タンパク質に構造的に関連しており、ＩＴＲに結合してマルチサブユニット複合体を形成する。Ｒｅｐタンパク質のヘリカーゼ活性によりＩＴＲがほどかれ、末端分離部位（５’－ＧＧＴ｜ＴＧＡ－３’）を有する一本鎖バブルが創出される。チミジン間のホスホジエステル結合は、Ｒｅｐタンパク質触媒チロシン（ＡＡＶ２＝Ｙ１５６）のヒドロキシル基によって攻撃され、５’－チミジンとチロシン－チミジンジエステルを形成する。細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体は、末端分離部位において新たに創出された３－ＯＨを伸長し、末端配列を鋳型鎖に復元する（図１Ｂ）。核タンパク質複合体の分解は、未知のプロセスを介して生じる。

【0533】

ＡＡＶ ＩＴＲまたは同族ＩＴＲ（例えば、パルボウイルスＩＴＲ）は、パルボウイルスキャプシドタンパク質（複数可）を含む組換えビリオンを構築するために使用される。

【0534】

イヌパルボウイルス（プロトパルボウイルスの例）またはヒトパルボウイルス４（テトラパルボウイルスの例）の末端リピート及び非構造（ＮＳ）タンパク質（複数可）－プロトパルボウイルスまたはテトラパルボウイルスを利用した複製は、ＡＡＶ ＤＮＡ複製に類似しているが、末端パリンドロームは、独特であり、複製中間体をプロセシングするための特定のＮＳタンパク質を必要とする。組換えイヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４ベクターゲノムは、導入遺伝子カセットに隣接するイヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４末端から構成され得る。ＮＳ１依存性ローリングヘアピン複製プロセスは、ＡＡＶ Ｒｅｐ依存性複製と類似しており、キャプシドにはいずれかの極性の一本鎖ゲノムが含まれている。

【0535】

キャプシド形成
正二十面体ウイルスキャプシドへのＤＮＡのキャプシド形成またはパッケージングは、ＤＮＡを限られた容積に圧縮する際の背圧によって生じる反発力に打ち勝つためのエネルギー源を必要とする能動的プロセスである。ＮＳ／Ｒｅｐタンパク質のＡＴＰａｓｅ活性は、ガンマリン酸を加水分解することにより、トリヌクレオチドの保存された化学エネルギーを変換する。生成される背圧によって、キャプシドに収容できるＤＮＡ長が決定する。すなわち、ＡＴＰａｓｅ／ヘリカーゼの原動力は、例えば１２ｐＮまで「押し出す」ことができ、これは４，８００個のヌクレオチドがパッケージングされたときに到達され得る。ＡＡＶ ｐ１９ Ｒｅｐタンパク質は、効率的なキャプシド形成に必要な単量体の非進行性ヘリカーゼである。Ｒｅｐとキャプシドとの間の物理的相互作用を裏付けるデータはわずかであるが、背圧を克服するにはパッケージングヘリカーゼ（複数可）とキャプシドの間に安定した相互作用が形成される必要がある。これらの相互作用の性質は不明であるが、核因子が非構造タンパク質とキャプシドとの間の相互作用を安定化させ得るかまたは媒介し得る。系統発生的に関連するプロトパルボウイルス／テトラパルボウイルス及びディペンドパルボウイルスのキャプシドは、配列レベルで分岐しているため、ＮＳタンパク質と異種属のキャプシドと間の相互作用では、効率的なキャプシド形成とならない可能性がある。

【0536】

ＡＡＶ２遺伝子を含むゲノムのイヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４キャプシドへのパッケージングを改善するために、許容細胞内で同族ＮＳタンパク質をＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質と共発現させる：ＡＡＶ Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２は、ベクターＤＮＡ複製に必要であり、イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４ＮＳタンパク質は、パッケージングに関与する。

【0537】

実施例２：イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）キャプシドタンパク質を含む組換えビリオンの製造に必要なコンポーネントの産生
ＣＰＶキャプシドタンパク質を含む組換えビリオンの製造に必要なコンポーネントは、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）系及びＳｆ９細胞を使用して産生した。

【0538】

組換えＣＰＶキャプシドタンパク質は、図７に示すようにＢＥＶを使用して発現させた。過剰発現されたＣＰＶキャプシドタンパク質（ＶＰ１及びＶＰ２）は、クマシーブルー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図８Ａ）及び抗ＣＰＶ ＶＰ２抗体を使用したウエスタンブロット分析（図８Ｂ）によって確認した。約８０ｋＤａ及び６２ｋＤａの見かけの分子量を有するバンドが観察され、これは、キャプシドタンパク質、ＶＰ１（８０．５ｋＤａ）及びＶＰ２（６４．７ｋＤａ）の予測分子量と一致した。６４．７ｋＤａバンドのわずかなシフトは、ポリペプチドの電荷特性または疎水性特性、または他の要因によるものであり得る。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ設計を利用して、ＶＰタンパク質の開始コドンを同定した。ＣＰＶキャプシドタンパク質の発現は、ＢＥＶ発現系に首尾よく適応された。この発現により、ＶＰ２がＶＰ１を上回る所望の範囲のＣＰＶ ＶＰ１／ＶＰ２比が達成された。

【0539】

ＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接するＧＦＰレポーター遺伝子を有する導入遺伝子構築物を生成した（ＡＡＶ２ ＩＴＲ－ＧＦＰ導入遺伝子；図９Ｂ）。ＢＥＶ系を使用して、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質を過剰発現させ、それらの同一性及び量をウエスタンブロット分析によって確認した（図９Ａ）。ＡＡＶ２ ＩＴＲ－ＧＦＰ導入遺伝子は、精製されたＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質を使用して増幅に成功し、これにより、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＲｅｐ系コンポーネントの機能性が実証された。図９Ｃは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ－ＧＦＰ導入遺伝子の増幅の成功を示し、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＲｅｐ系コンポーネントの機能性を示す。

【0540】

実施例３：イヌパルボウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えビリオンのトランスサイトーシスを減少させるためのキャプシドの修飾
受容体媒介トランスサイトーシスは、細胞の内部全体でのカーゴ巨大分子の輸送を媒介する経細胞輸送の一種である。この細胞機構は、脳実質など、他の方法ではアクセスできない組織への生体分子の輸送を媒介するために広く研究されてきた。細胞のトランスサイトーシスを媒介する既知の分子のうちの１つは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。ＴｆＲは、脳血液関門（ＢＢＢ）及び腸のＭ細胞で高度に発現する。イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）は、イヌ科トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を使用して内在化し、標的細胞を感染させる（ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２８６３７９８）。ＣＰＶは、マウス及びヒトのＴｆＲ対応物を認識し、ヒトＴｆＲを発現する宿主細胞内に内在化できることも報告された（ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ１１４８８０）。

【0541】

カーゴタンパク質またはウイルス粒子がトランスサイトーシスするか、最初に内在化した細胞内に留まる能力は、タンパク質カーゴ／ウイルス粒子とＴｆＲとの相互作用の親和性に依存する（ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６１７５４４３、ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３９２０５６３）。ＣＰＶキャプシドのＴｆＲに対して親和性が高いことにより、ウイルス粒子が初期エンドサイトーシス小胞から、酸性化が上昇した後期エンドソームに導かれ、エンドソーム脱出及びその後ゴルジ体を介して、ウイルスＤＮＡゲノムが送達される核への逆行性輸送が促進され、これにより、細胞間輸送が優先的に回避される。対照的に、ＣＰＶ粒子とＴｆＲとの相互作用が弱い場合には、トランスサイトーシスが促進され、反対側にカーゴが分泌される。ＣＰＶ及びＦＰＶ ＶＰ２タンパク質内の個別のアミノ酸の変化は、キャプシドトランスサイトーシスを調節し、したがって、明確な組織向性を有する新規遺伝子療法ツールがもたらされる。配列番号４または配列番号２７中の下線を引いたアミノ酸残基は、内在化及びトランスサイトーシスに影響を与えるＶＰ２の受容体結合ドメインを示す。これらの残基の変異は、受容体の相互作用を変化させ、トランスサイトーシスを調節する。例えば、配列番号４のアミノ酸９３及び隣接残基は、ＴｆＲ相互作用及び宿主範囲に関与する。ＣＰＶ ＶＰ２のアミノ酸３００及び隣接残基（配列番号４）は、宿主範囲（ＴｆＲとの相互作用）に影響を与える。さらに、配列番号４のアミノ酸３２３及び隣接残基は、ＴｆＲ相互作用及び宿主範囲に関与する。

【0542】

実施例４：推定上の細胞受容体に対するウイルスベクターの親和性及び特異性を高めるためのキャプシド修飾
ＣＰＶ及びＦＰＶ ＶＰ２タンパク質内の個別のアミノ酸変化は、細胞受容体であるＴｆＲに対するキャプシド親和性を調節し、それにより、操作された組織向性を有する新規遺伝子療法ツールがもたらされる。配列番号４または配列番号２７中の下線を引いたアミノ酸残基は、内在化及びトランスサイトーシスに影響を与える受容体結合ドメインを示す。これらの残基の変異は、受容体の相互作用を変化させ、トランスサイトーシスを調節する。例えば、配列番号４のアミノ酸９３及び隣接残基は、ＴｆＲ相互作用及び宿主範囲に関与する。ＣＰＶ ＶＰ２のアミノ酸３００及び隣接残基（配列番号４）は、宿主範囲（ＴｆＲとの相互作用）に影響を与える。さらに、配列番号４のアミノ酸３２３及び隣接残基は、ＴｆＲ相互作用及び宿主範囲に関与する。

【0543】

実施例５：イヌパルボウイルスＶＰ２の例示的変異
例示的組換えイヌパルボウイルスＶＰ２が構築され、これは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する。配列番号４または配列番号２７中の下線を引いたアミノ酸残基は、内在化及びトランスサイトーシスに影響を与える受容体結合ドメインを画定する。下線で示す残基中の複数の変異は、受容体相互作用を変化させ、トランスサイトーシスを調節するために作られる（以下の配列番号２７、及び表４の配列番号４）。例えば、配列番号２７のアミノ酸９３及び隣接残基（アミノ酸残基９１～９５）は、ＴｆＲ相互作用及び宿主範囲に関与する。ＣＰＶ ＶＰ２のアミノ酸３００及び隣接残基（アミノ酸残基２９７～３０１）（配列番号２７）は、宿主範囲（ＴｆＲとの相互作用）に影響を与える。さらに、配列番号４のアミノ酸３２３及び隣接残基（アミノ酸残基３２０～３２４）は、ＴｆＲ相互作用及び宿主範囲に関与する。
配列番号２７ イヌパルボウイルス株Ｎ ＶＰ２

【化11】

【0544】

実施例６：昆虫細胞を使用したイヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４組換えビリオンの産生
Ｓｆ９細胞を無血清昆虫細胞培養培地（ＨｙＣｌｏｎｅＳＦＸ－昆虫細胞培養培地）で成長させ、振盪三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）からＷａｖｅシングルユースバイオリアクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移す。細胞密度及び生存率は、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏｒ ２０００（Ｎｅｘｅｌｃｏｍ）を使用して、毎日測定する。容量は、細胞密度２００万～５００万細胞／ｍｌを維持するように調整する。最終容量（１０Ｌ）及び細胞２５０万個／ｍｌの密度で、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を１：１０，０００（ｖ：ｖ）で添加する（凍結保存、１００倍濃縮細胞「プラグ」）。高度に希釈されたＢＩＩＣは、非常に低い感染多重度（ＭＯＩ）で、Ｒｅｐ－ＶＰ－Ｂａｃ、ＮＳ－Ｂａｃ、及びｖｇ－Ｂａｃを放出し、一次感染中に共感染する細胞は事実上ない。しかし、その後の感染サイクルでは、必要なバキュロウイルスがそれぞれ大量に放出され、非常に高いＭＯＩが達成され、これにより、各細胞が多数のウイルス粒子に確実に感染する。細胞は、４日間、または生存率が３０％以下に低下するまで培養を維持する。

【0545】

実施例７：イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４組換えビリオンの精製
組換えイヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４粒子は、細胞画分及び細胞外画分の両方に分画する。最大数の粒子を回収するために、細胞培養培地を含むバイオマス全体を処理する。細胞内のイヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４粒子を放出するには、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ １００をバイオリアクターに添加し、１時間撹拌を継続する。温度を２７℃から３７℃に上昇させ、その後、撹拌を続けながら、ベンゾナーゼ（ＥＭＤ Ｍｅｒｃｋ）またはターボヌクレアーゼ（Ａｃｃｅｌａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をバイオリアクターに添加する（２μ／ｍｌ）。バイオマスは、段階的デプスフィルターを使用して清澄化させ、フィルター滅菌（０．２μｍ）し、滅菌バイオプロセスバッグに収集する。組換えイヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４粒子は、免疫アフィニティークロマトグラフィー媒体及びＱ－セファロース陰イオン交換を使用した連続カラムクロマトグラフィーを使用して回収される。ＵＶ吸収、ｐＨ、及び導電率を表示し、記録するクロマトグラムを使用して、洗浄及び溶出ステップの完了を判断する。各ステップの相対効率は、ウエスタンブロット分析によって決定され、入力材料（「ロード」）、フロースルー、洗浄、及び溶出のｄｄＰＣＲまたはｑＰＣＲ分析アリコートによって定量的に決定する。

【0546】

免疫アフィニティークロマトグラフィーでは、ラマ及び他のラクダ科動物種で産生される単一ドメイン免疫グロブリンのＶｈＨ領域である「ナノボディ」を使用する。ナノボディを産生するために、抗体プロバイダーは、イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４ウイルス様粒子、すなわちビリオンゲノムを含まずに組み立てられたキャプシドでラマを免疫化する。イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４ＶＬＰは、ＶＰ－Ｂａｃに感染したＳｆ９細胞中で調製され、塩化セシウム等密度勾配を使用して精製され、その後サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）を行う。初回免疫（１×）／追加免疫（２×）プロトコールに従って、抗体サービスプロバイダーは、ラマから採血し、末梢血単核球または有核血球から抽出されたｍＲＮＡを単離する。保存されたＶｈＨ ＣＤＲ隣接領域（ＦＲ１及びＦＲ４）に特異的なプライマーを使用した逆転写により、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ １０－３ｂファージディスプレイライブラリー（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の生成に使用されるプラスミドにクローン化されるｃＤＮＡが産生される。イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４キャプシドと相互作用するファージを濃縮するために数回のパニング後、ファージクローンをプラークから単離させる。組換えファージを感染させたＥ．ｃｏｌｉをアガロースに混合し、オーバーレイとしてＬＢ寒天プレートに適用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、コンフルエントまで成長させ、溶解した細菌がプレート上にプラークとして現れる「ローン（ｌａｗｎ）」を形成する。イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４に結合するファージを同定するには、寒天プレートの表面にニトロセルロースフィルターを置き、タンパク質をプラークからフィルターに移す。フィルターは、共有結合により連結した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＥＺＬｉｎｋ Ｐｌｕｓ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｋｉｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で修飾されたイヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４キャプシドと共にインキュベートされ、リン酸緩衝生理食塩水により洗浄する。ＨＲＰ活性は、発色基質（Ｎｏｖｅｘ ＨＲＰ発色基質、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）または化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のいずれかを使用して検出できる。ファージ内のｃＤＮＡの配列を決定し、細菌発現プラスミドにライゲート連結させ、精製のために６ｘＨｉｓタグと共に発現させる。キレートカラムで精製されたナノボディは、クロマトグラフィー媒体であるＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合により連結させる。

【0547】

イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４粒子は、結合、洗浄、及びナノボディセファロースカラムからの溶出によって、清澄化されたＳｆ９細胞溶解物から回収される。結合効率は、カラムのロード及びフロースルーのウエスタンブロット法によって決定する。洗浄ステップは、ＵＶ２８０ｎｍ吸光度がベースライン（すなわち、ロード前）値に戻ったときに完了したとみなす。ｐＨが酸性になると、ウイルス粒子が放出され、ナノボディセファロース媒体から溶出される。溶出液を５０ｎＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．２に集めて、溶出媒体を中和させる。

【0548】

イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４ベクター粒子の濃度は、イヌパルボウイルスまたはヒトパルボウイルス４特異的ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲ（充填粒子、すなわちベクターゲノム含有のパーセンテージを推定するために使用できる）を使用して決定する。

【0549】

実施例８：ＣＤ３４＋細胞の精製
開示された方法において使用するためのＣＤ３４＋細胞は、以下の記事に記載されているような好適な方法に従って精製することができる：Ｈａｙａｋａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｓｕｌｆａｎ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｉｎ ＮＯＤ／ＬｔＳｚ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγ ｎｕｌｌ ｍｉｃｅ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７（１）：１７５－１８２（２００９）；Ｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ Ｇｌｏｂｉｎ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｇｌｏｂｉｎ Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ Ｄｕｒｉｎｇ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：７９２－８００（２０１４）；及びＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ＮＯＤ，Ｂ６．ＳＣＩＤ Ｉｌ２ｒγ^－ｌ－ Ｋｉｔ^{Ｗ４ｌ／Ｗ４ｌ}（ＮＢＳＧＷ）Ｍｉｃｅ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ４：１７１－１８０（２０１５）。

【0550】

実施例９：イヌパルボウイルス組換えビリオンを使用した赤血球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ形質導入
イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の容量は、野生型ビリオン５．３ｋｂゲノムの約１１０％であり、長さは、約５，８５５ｎｔで、そのうち約３００ｎｔがＩＴＲに必要で、５，５５５ｎｔが「カーゴ」となる。これは、従来のアデノ随伴ウイルスベクターよりも容量が１ｋｂ大きいことを表す。

【0551】

組換えＣＰＶ（ｒＣＰＶ）は、赤血球前駆細胞に形質導入させるために使用される。ＣＤ７１（ＴｆＲ）に対するＣＰＶの親和性は、治療用導入遺伝子を赤血球前駆細胞に送達するための改善された方法を提供し、その遺伝子置換は、ゲノム編集によって達成され得る。遺伝子型修正細胞における導入遺伝子の発現は、分化した細胞の表現型の救援を促進し、臨床的改善をもたらす。

【0552】

機能獲得突然変異によって引き起こされるヘマグロビン異常症は、常染色体劣性形質として遺伝する。ヘテロ接合性個体は、無症候性であるか、軽度の疾患である傾向があるが、両方の対立遺伝子中に変異を有する個体は、重度の疾患となる。したがって、１つの対立遺伝子を修正または置換することは臨床的に有益である。

【0553】

ベータ－サラセミア及び鎌状赤血球症（ＳＣＤ）は両方とも、ヘモグロビンベータ（ＨｂＢ）を発現する遺伝子中の異なる変異によって引き起こされるため、遺伝子置換戦略は、いずれの疾患の患者にとっても有益である。ＨｂＢ発現カセットを送達するレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用したＳＣＤの臨床研究がある。ｂ－グロビンオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、グロビン対立遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）及びｂ－グロビンプロモーターによって調節される。ＬＶに適合させるために、最小のＬＣＲは、ＤＮＡメチル化及びヘテロクロマチンの形成を阻害する３つのＤＮＡｓｅ高感受性部位（ＨＳ）にマッピングされている。ランダムに組み込まれたＬＶは、ヘテロクロマチンに組み込まれ、その結果、赤血球前駆細胞（例えば、赤芽球）中でのｂ－グロビン発現が遮断され、したがって表現型が修正されない可能性がある。

【0554】

ＬＣＲエレメントであるＨＳは、組み込み部位に関係なく、ＬＶ ＤＮＡの開いたユークロマチン構造を維持する。しかし、最小化のＬＣＲは、ｂ－グロビンＯＲＦ（４４１ｂｐ及び１４７コドン）と比較して比較的大きいため、ウイルスベクター送達の選択肢が制限される。

【0555】

ＨｂＢカセットをゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）遺伝子座に挿入する。哺乳動物ゲノムの約４５％を構成する移動可能エレメントとは対照的に、遺伝性組み込みパルボウイルスゲノム（または内因性ウイルスエレメント、ＥＶＥ）は、数百種全体で非常に少数の遺伝子座中に存在する。ＥＶＥは、短い時間軸では胚発生、発生、成熟など、地質学的時間軸では進化／種分化に影響を与えることなく、外来ＤＮＡの挿入を許容する部位のゲノムマーカーである。おそらく外来ＤＮＡ挿入の破壊的効果により、１億年にわたって多くの多様な種中に蓄積されたＥＶＥ遺伝子座はほとんど存在しない。ＥＶＥを保有する非常に多様な系統分類群には多くの種があるにもかかわらず、マウスなどのモデル系におけるＧＳＨとしてのＥＶＥの経験的分析を容易にする、影響を受けるゲノム遺伝子座の数は限られていると考えられる。哺乳動物種間でのＥＶＥ遺伝子座の保存により、ヒト及びマウスのゲノム内の相同部位を決定することができる。しかし、すべてのＧＳＨがすべての組織型で長期の安定した発現を支援するとは限らない。ＲＮＡｓｅｑデータベース及びＡＴＡＣｓｅｑデータベースなどのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析を使用することにより、ＧＳＨ遺伝子座を標的組織中で活発に発現しているサブゲノム領域にマッピングできる。したがって、ベータグロビン症の場合、赤芽球が特に興味深い。

【0556】

赤芽球中でクロマチンを活発に発現する活性クロマチン領域であるＧＳＨ遺伝子座を利用することにより、ＬＶが組み込まれたユークロマチン化を確実にするために、ＬＣＲエレメントを使用する必要性が回避される。

【0557】

ターゲティングヌクレアーゼによる相同性指向修復（ＨＤＲ）のプロセスにより、組換えの効率及び特異性が改善される。治療用遺伝子に隣接する「相同性アーム」は、ベクターＤＮＡを標的遺伝子座に向ける。細胞ＤＮＡ修復経路酵素、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどの人工プロセスによる組換えにより、導入遺伝子がＧＳＨに組み込まれる。

【0558】

ｂ－グロビンプロモーターに加えて、他のプロモーターも、多くの細胞型、またトランスジェニックマウス株での長期の高レベル発現のために使用されている。

【0559】

例えば、ヘモグロビンは、２× ＨｂＡ鎖及び２× ＨｂＢ鎖で構成されるヘテロ四量体である。ＨｂＢが存在しない場合、ＨｂＡ鎖は自己会合し、細胞傷害性凝集体を形成する。アルファ－ヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）は、ａ－グロビンサブユニットの凝集を防ぐために前赤血球中で共発現される。ＡＨＳＰプロモーターは、赤血球前駆体中非常に活性が高く、十分に特徴付けられている。

【0560】

別の例として、ＣＡＧプロモーターエンハンサーは、ニワトリベータグロビンプロモーター、エクソン１、イントロン１、及びエクソン２のスプライスアクセプターに融合されたサイトメガロウイルスエンハンサーから操作された合成プロモーターである。

【0561】

別の例として、ＭＮＤプロモーターは、活性造血細胞である。

【0562】

別の例として、Ｗｉｓｋｏｔｔ－Ａｌｄｒｉｃｈプロモーターは、造血細胞中で活性である。

【0563】

別の例として、ＰＫＬＲプロモーターは、造血細胞中で活性である。

【0564】

末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）は、白血球分離によって単離される。

【0565】

Ｈｅｍｏｆｒｅｅｚｅバッグ内の凍結保存された末梢血細胞は、３７℃の水浴で急速解凍することにより回収される。これらの解凍した細胞を４℃で４％ＨＳＡに懸濁させ、４℃、４５０ｇで５分間の遠心分離により２回洗浄する。血小板を、１０％ＨＳＡ上に重層し、４℃、４５０ｇで１５分間遠心分離することによって２回除去する。赤血球を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（ＦＨ；１．０７７ｇ／ｃｍ３；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）上に重層し、４℃、４００ｇで２５分間遠心分離することによって除去する。界面の単核細胞（Ｐ１－、ＦＨ細胞）を収集し、洗浄溶液で２回洗浄し、４℃で４％ＨＳＡに再懸濁させる（ＭＮ細胞）。ナイロンファイバーシリンジ（ＮＦ－Ｓ）を使用して、付着細胞を除去する。５グラムのＮＦを５０ｍｌの使い捨てシリンジに詰める。単核細胞を追加の５０ｍｌシリンジに移し、ＮＦ－Ｓに静かに注入し、４℃で５分間インキュベートした。次いで、ＭＮ細胞を、ＮＦ－Ｓのプランジャーを通して５０ｍｌシリンジに収集し、細胞を５０ｍｌのコニカルチューブにプールする。これらのプールされた細胞を、４℃、４００ｇで５分間遠心分離し、４℃で４％ＨＳＡに再懸濁させる（ＮＦ細胞）。次いで、細胞懸濁液を、製造業者の指示に従って、ＣＤ３４＋選択のために、Ｉｓｏｌｅｘ磁気細胞分離システム（Ｉｓｏｌｅｘ ５０；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎｅｗｂｕｒｙ，ＵＫ）上で直ちにプロセシングする。簡潔に説明すると、細胞を９Ｃ５マウス免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）抗ヒトＣＤ３４抗体（１０ｍｇ／１×１０８ＮＦ細胞）と共に４℃で１５分間、ゆっくりとエンドオーバーエンド回転させながらインキュベートする。感作後、細胞を４％ＨＳＡで４℃で洗浄し、あらゆる過剰な／未結合の抗体を除去する。次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を、最終ビーズ／細胞比１：１０で洗浄し、感作細胞に添加する。４℃で３０分間混合後、細胞結合ミクロスフェア及び遊離ミクロスフェアは、磁石（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ－１，Ｄｙｎａｌ，Ｆｏｒｔ Ｌｅｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）を介して壁に付着させ、ミクロスフェアに結合しない遊離細胞はいずれも除去させる。この洗浄手順を、４％ＨＳＡを使用して４℃で２回繰り返す。ＤｙｎａｂｅａｄｓとＣＤ３４＋細胞との連結は、ＰＲ３４＋幹細胞解放剤によって４℃で３０分間切断させる。遊離Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、磁石を介してＣＤ３４＋細胞から除去される。細胞の回収には、１％ＡＣＤ－Ａ及び１％ＨＳＡを含むＤ－ＰＢＳを２５℃で使用する。得られた細胞産物は、フローサイトメトリーによって制御される。

【0566】

実施例１０：イヌパルボウイルス組換えビリオンまたはヒトパルボウイルス４組換えビリオンを使用した周期的遺伝子発現
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、Ｆ８、またはＢドメイン欠失ポリペプチドをコードするフラグメントをコードする核酸を含むイヌパルボウイルス組換えビリオンまたはヒトパルボウイルス４は、血友病Ａの治療法として肝細胞に形質導入するために使用される。ＦＶＩＩＩは、必須の血液凝固タンパク質であり、抗血友病因子（ＡＨＦ）としても知られる。ヒトでは、第ＶＩＩＩ因子は、Ｆ８遺伝子によってコードされている。この遺伝子中の欠陥は、劣性Ｘ連鎖凝固障害である血友病Ａを引き起こす。第ＶＩＩＩ因子は、全身の肝臓の類洞細胞及び肝臓の外側の内皮細胞中で産生される。

【0567】

血友病Ａを治療するために、Ｆ８遺伝子の発現を増加させる試みがこれまでに行われてきた。例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子のアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ５）ベクター媒介遺伝子導入であるバロクトコジーンロクサパルボベク（ＢＭＮ２７０または としても知られる）が、重度の血友病Ａ患者において試験された（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０２５７６７９５；ＮＣＴ０３３７０９１３；ＮＣＴ０３３９２９７４；ＮＣＴ０３５２０７１２）。しかし、ＦＤＡは、長期的安全性及び有効性のデータを要求し、２０２０年に承認を拒否した。投与量の増加に関する懸念を和らげるために、導入遺伝子の徐々に遺伝子発現が生じ得る長期データが必要になり得る。

【0568】

ＦＶＩＩＩは、微生物または真核生物のいずれかの発現系での産生が困難である組換えタンパク質である。「Ｂドメイン」の欠失の開発により、発現レベルが改善され、オープンリーディングフレームのサイズが減少したが、ＦＶＩＩＩの発現レベルは、他のタンパク質よりも大幅に低かった。これらの低レベルを克服するために、バロクトコジーンロクサパルボベクウイルスベクターの臨床用量を増加させた。患者は、１ｋｇあたり６Ｅ＋１３個のベクター粒子（ベクターゲノム、またはｖｇと呼ばれる）により治療された。大型動物モデルに基づいて、少数の肝細胞にｒＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩを形質導入させた。細胞あたりのｖｇの数が多いため、形質導入された細胞は比較的大量のＦＶＩＩＩを発現する。ＦＶＩＩＩ発現に対する代謝要求は、肝細胞タンパク質の発現に対する通常の要求を破壊させる可能性がある。ＦＶＩＩＩは、タンパク質の折り畳み及び分泌に通常関与する肝細胞の細胞コンパートメントに集積され得る。ＦＶＩＩＩの産生を生じさせる内皮細胞は、この活性に特化している可能性が高く、高度に調節されたネイティブＦＶＩＩＩプロモーターの転写制御下で１つのＸ染色体上の対立遺伝子からＦＶＩＩＩを産生する。

【0569】

したがって、本明細書では、肝細胞の恒常性の乱れが細胞ストレスを引き起こし、炎症状態を誘導するという仮説が立てられる。代謝及びタンパク質の折り畳み／排出の負荷は、ｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクターで使用される高活性な構成プロモーターを使用することによって悪化する。炎症及びサイトカインの産生は、細胞の代謝回転または細胞死を引き起こし得る。

【0570】

この問題を回避し、血友病Ａの治療法に対する長年の必要性に取り組むために、イヌパルボウイルス組換えビリオンまたはヒトパルボウイルス４ベクターは、（ａ）遺伝子Ｆ８、または（ｂ）Ｂ－ドメインの欠失を有する遺伝子Ｆ８を含むように操作させる。イヌパルボウイルス組換えビリオンまたはヒトパルボウイルス４ウイルスベクターが、より大きなゲノムサイズをパッケージングできることにより、臨床試験で現在使用されているｒＡＡＶ５を上回る利点がもたらされ、ＡＡＶベクターでは不可能である全長Ｆ８遺伝子のパッケージングが可能になる。さらに、バロクトコジーンロクサパルボベクの臨床試験で使用される高活性な構成プロモーターとは対照的に、イヌパルボウイルス組換えビリオンまたはヒトパルボウイルス４組換えベクターは、誘導性発現系で調製される。

【0571】

誘導性発現系は、試薬が発現をオンにするか発現の阻害を解除するまで、Ｆ８遺伝子をデフォルトの転写オフ状態に維持する（例えば、図６を参照）。周期的発現により、肝細胞は、過剰発現ストレスから解放される。周期のタイミング（すなわち、遺伝子発現をオンにするタイミング）は、ＦＶＩＩＩの初期血清レベル（ｔ０）及び半減期（ｔ１／２）から決定できる。ｔ１／２は、９～１４日であると推定されるため、１４日（２週間）のｔ１／２が使用され、軽度の血友病は、ＦＶＩＩＩレベルが正常５％以上であると定義される。

【0572】

導入遺伝子発現＝１５０％
５％まで低下するまで６８日
ここでは、発現が毎月誘導され、治療レベルのＦＶＩＩＩが得られる。

【0573】

細胞内のｔ１／２を延長させる幅広いＡＳＯ化学反応（アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳＯまたはＡＯＮ）が開発されている。ここでは、比較的短いｔ１／２のＡＳＯ化学反応を使用して、ＡＳＯが細胞から除去されるにしたがって減少するＦＶＩＩＩ発現の周期が得られる。最適なｔ１／２は、特に、形質導入された細胞数、プロモーター活性、及び転写産物成熟の動態に基づいて経験的に決定される。

【0574】

参照による組み込み
本明細書で述べられるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書におけるいかなる定義をも含む本出願が優先する。

【0575】

均等物
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または定型的な実験のみを使用してそれらを確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって網羅されることが意図される。
参考文献
Ａｌｌｉｓｏｎ，Ａ．Ｂ．，Ｌ．Ｊ．Ｏｒｇａｎｔｉｎｉ，Ｓ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｌ．Ｈａｆｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｃ．Ｒ．Ｐａｒｒｉｓｈ（２０１６）．“Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＶＰ２ ３００ Ｌｏｏｐ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅ－Ｆｏｌｄ Ｓｐｉｋｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｒｎｉｖｏｒｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｃａｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ Ｈｏｓｔ Ｒａｎｇｅ．”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９０（２）：７５３－７６７．
Ｂａｃｏｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｌ．Ｗ．Ｐｏｗｅｌｌ，Ｐ．Ｃ．Ａｄａｍｓ，Ｔ．Ｆ．Ｋｒｅｓｉｎａ ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ（１９９９）．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ：ａｔ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ．”Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１６（１）：１９３－２０７．
Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（２０１３）．“Ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｒｙｐｔ，ａ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ．”Ｃｅｌｌ １５４（２）：２７４－２８４．
ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ，Ｓ．Ｆ．ａｎｄ Ｍ．ｄｅ Ｓｏｕｓａ（２００８）．“Ｔｈｅ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．”Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １２（２）：４２１－４３４．
Ｅｚｑｕｅｒ，Ｆ．，Ｍ．Ｔ．Ｎｕｎｅｚ，Ａ．Ｒｏｊａｓ，Ｊ．Ａｓｅｎｊｏ ａｎｄ Ｙ．Ｉｓｒａｅｌ（２００６）．“Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ：ａｎ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ ３９（１）：１１３－１２４．
Ｆｅｄｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ａ．Ｇｎｉｒｋｅ，Ｗ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｚ．Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｄ．Ａ．Ｒｕｄｄｙ，Ａ．Ｂａｓａｖａ，Ｆ．Ｄｏｒｍｉｓｈｉａｎ，Ｒ．Ｄｏｍｉｎｇｏ，Ｊｒ．，Ｍ．Ｃ．Ｅｌｌｉｓ，Ａ．Ｆｕｌｌａｎ，Ｌ．Ｍ．Ｈｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｌ．Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．Ｅ．Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇ．Ｓ．Ｋｒｏｎｍａｌ，Ｐ．Ｌａｕｅｒ，Ｖ．Ｋ．Ｌｅｅ，Ｄ．Ｂ．Ｌｏｅｂ，Ｆ．Ａ．Ｍａｐａ，Ｅ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ｎ．Ｃ．Ｍｅｙｅｒ，Ｇ．Ａ．Ｍｉｎｔｉｅｒ，Ｎ．Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｔ．Ｍｏｏｒｅ，Ｅ．Ｍｏｒｉｋａｎｇ，Ｃ．Ｅ．Ｐｒａｓｓ，Ｌ．Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｓ．Ｍ．Ｓｔａｒｎｅｓ，Ｒ．Ｃ．Ｓｃｈａｔｚｍａｎ，Ｋ．Ｊ．Ｂｒｕｎｋｅ，Ｄ．Ｔ．Ｄｒａｙｎａ，Ｎ．Ｊ．Ｒｉｓｃｈ，Ｂ．Ｒ．Ｂａｃｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｋ．Ｗｏｌｆｆ（１９９６）．“Ａ ｎｏｖｅｌ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｉｓ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．”Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １３（４）：３９９－４０８．
Ｆｅｄｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ｚ．Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ａ．Ｉｒｒｉｎｋｉ，Ｖ．Ｋ．Ｌｅｅ，Ｆ．Ａ．Ｍａｐａ，Ｅ．Ｍｏｒｉｋａｎｇ，Ｃ．Ｅ．Ｐｒａｓｓ，Ｓ．Ｍ．Ｓｔａｒｎｅｓ，Ｒ．Ｋ．Ｗｏｌｆｆ，Ｓ．Ｐａｒｋｋｉｌａ，Ｗ．Ｓ．Ｓｌｙ ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｓｃｈａｔｚｍａｎ（１９９７）．“Ｔｈｅ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ ｆｏｕｎｄｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＬＡ－Ｈ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ｂｅｔａ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２（２２）：１４０２５－１４０２８．
Ｇｏｃｈｅｅ，Ｐ．Ａ．，Ｌ．Ｗ．Ｐｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｄｕ Ｓａｒｔ，Ｅ．Ｒｏｓｓｉ ａｎｄ Ｊ．Ｋ．Ｏｌｙｎｙｋ（２００２）．“Ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ６３Ｄ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ．”Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２２（３）：６４６－６５１．
Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｓ．Ｍ．Ｌｙｉ，Ｎ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｏ．Ｃｉｆｕｅｎｔｅ，Ｓ．Ｌ．Ｈａｆｅｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃ．Ｒ．Ｐａｒｒｉｓｈ（２０１０）．“Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｔｅｒｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｎ ｃｅｌｌ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４（１０）：４９６９－４９７８．
Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｂ．Ａ．，Ｒ．Ｇｏｋｈａｌｅ ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｃｈｏ（２００２）．“Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １５（１）：７９－９４．
Ｈｕｅｆｆｅｒ，Ｋ．，Ｌ．Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ，Ｍ．Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ ａｎｄ Ｃ．Ｒ．Ｐａｒｒｉｓｈ（２００３）．“Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｗｏ ｃａｐｓｉｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｃａｎｉｎｅ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｃａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｃａｎｉｎｅ ａｎｄ ｆｅｌｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ．”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７（１８）：１００９９－１０１０５．
Ｈｕｅｆｆｅｒ，Ｋ．，Ｊ．Ｓ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｗ．Ｓ．Ｗｅｉｃｈｅｒｔ，Ｒ．Ｅ．Ｇｅｉｓｅｌ，Ｊ．Ｙ．Ｓｇｒｏ ａｎｄ Ｃ．Ｒ．Ｐａｒｒｉｓｈ（２００３）．“Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｓｈｉｆｔ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｆｒｏｍ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７（３）：１７１８－１７２６．
Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｓ．，Ａ．Ｋａｐｏｏｒ，Ｖ．Ｖ．Ｌｕｋａｓｈｏｖ，Ｐ．Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｆ．Ｈｅｃｈｔ ａｎｄ Ｅ．Ｄｅｌｗａｒｔ（２００５）．“Ｎｅｗ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９（１３）：８２３０－８２３６．
Ｌｅｖｉｎｅ，Ｂ．，Ｍ．Ｐａｃｋｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｃｏｄｏｇｎｏ（２０１５）．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２５（１）：１４－２４．
Ｌｉｍａｎｓｋｉｙ，Ｖ．，Ａ．Ｖｙａｓ，Ｌ．Ｓ．Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ ａｎｄ Ｄ．Ｖｙａｓ（２０１９）．“Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２５（１８）：２１７７－２１８７．
Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｓ．Ｙ．Ｌｅｅ，Ｅ．Ｎｅｅｌｙ，Ｗ．Ｎａｎｄａｒ，Ｍ．Ｍｏｙｏ，Ｚ．Ｓｉｍｍｏｎｓ ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｃｏｎｎｏｒ（２０１１）．“Ｍｕｔａｎｔ ＨＦＥ Ｈ６３Ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ．”Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６（１５）：１３１６１－１３１７０．
Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｃ．Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ａｎｄ Ｐ．Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ（２０１７）．“Ｈｕｍａｎ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ４ ‘ＰＡＲＶ４’ ｒｅｍａｉｎｓ ｅｌｕｓｉｖｅ ｄｅｓｐｉｔｅ ａ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｓｔｕｄｙ．”Ｆ１０００Ｒｅｓ ６：８２．
Ｎａｖｏｎｅ，Ｓ．Ｅ．，Ｇ．Ｍａｒｆｉａ，Ｓ．Ｎａｖａ，Ｇ．Ｉｎｖｅｒｎｉｃｉ，Ｓ．Ｃｒｉｓｔｉｎｉ，Ｓ．Ｂａｌｂｉ，Ｓ．Ｓａｎｇｉｏｒｇｉ，Ｅ．Ｃｉｕｓａｎｉ，Ａ．Ｂｏｓｕｔｔｉ，Ｇ．Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉ，Ｍ．Ｓｌｅｖｉｎ ａｎｄ Ｅ．Ａ．Ｐａｒａｔｉ（２０１３）．“Ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｒｅｑｕｉｒｅ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ．”Ｖａｓｃ Ｃｅｌｌ ５（１）：１０．
Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ａ．Ｒｏｅｔｔｏ，Ｇ．Ｇａｒｏｚｚｏ，Ｔ．Ｇａｎｚ ａｎｄ Ｃ．Ｃａｍａｓｃｈｅｌｌａ（２００５）．“Ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｉｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ＴＦＲ２ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．”Ｂｌｏｏｄ １０５（４）：１８０３－１８０６．
Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｍ．Ｓ．Ｔｕｔｔｌｅ，Ｊ．Ｐｏｗｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｂ．Ｖａｕｇｈｎ，Ａ．Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｄ．Ｍ．Ｗａｒｄ，Ｔ．Ｇａｎｚ ａｎｄ Ｊ．Ｋａｐｌａｎ （２００４）．“Ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｒｏｎ ｅｆｆｌｕｘ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６（５７０４）：２０９０－２０９３．
Ｒｉｖｅｒａ，Ｓ．，Ｌ．Ｌｉｕ，Ｅ．Ｎｅｍｅｔｈ，Ｖ．Ｇａｂａｙａｎ，Ｏ．Ｅ．Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｔ．Ｇａｎｚ（２００５）．“Ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｅｘｃｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｒｏｎ ａｎｄ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｅｍｉａ．”Ｂｌｏｏｄ １０５（４）：１７９７－１８０２．
Ｒｏｅｔｔｏ，Ａ．，Ｇ．Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ，Ｍ．Ｐｏｌｉｔｏｕ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｄ．Ｇｉｒｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃｈｒｉｓｔａｋｉｓ，Ｄ．Ｌｏｕｋｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｃ．Ｃａｍａｓｃｈｅｌｌａ（２００３）．“Ｍｕｔａｎｔ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．”Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３３（１）：２１－２２．
Ｓｈａｒｐ，Ｃ．Ｐ．，Ａ．Ｌａｉｌ，Ｓ．Ｄｏｎｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｃ．Ｌｅｅｎ，Ｐ．Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，Ｅ．Ｄｅｌｗａｒｔ，Ｅ．Ｄ．Ｇｏｍｐｅｒｔｓ ａｎｄ Ｐ． Ｓｉｍｍｏｎｄｓ（２００９）．“Ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ＰＡＲＶ４ ｉｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃｓ ａｎｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｄｒｕｇ ｕｓｅｒｓ，ａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＰＡＲＶ４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２００（７）：１１１９－１１２５．
Ｖａｉｓａｎｅｎ，Ｅ．，Ｕ．Ｍｏｈａｎｒａｊ，Ｐ．Ｍ．Ｋｉｎｎｕｎｅｎ，Ｐ．Ｊｏｋｅｌａｉｎｅｎ，Ｈ．Ａｌ－Ｈｅｌｌｏ，Ａ．Ｍ．Ｂａｒａｋａｔ，Ｍ．Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｆ．Ａ．Ｊａｌｉｌｉａｎ，Ａ．Ｍａｊｌｅｓｉ，Ｍ．Ｍａｓｉｋａ，Ｄ．Ｍｗａｅｎｇｏ，Ｏ．Ａｎｚａｌａ，Ｅ．Ｄｅｌｗａｒｔ，Ｏ．Ｖａｐａｌａｈｔｉ，Ｋ．Ｈｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｍ． Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄ－Ｖｅｎｅｒｍｏ（２０１８）．“Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ．”Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２４（７）：１２９２－１２９９．
Ｗａｈｅｅｄ，Ａ．，Ｓ．Ｐａｒｋｋｉｌａ，Ｘ．Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｓ．Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｚ．Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｊ．Ｎ．Ｆｅｄｅｒ，Ｒ．Ｃ．Ｓｃｈａｔｚｍａｎ，Ｒ．Ｓ．Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｂ．Ｒ．Ｂａｃｏｎ ａｎｄ Ｗ．Ｓ．Ｓｌｙ（１９９７）．“Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃ２８２Ｙ ａｎｄ Ｈ６３Ｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＦＥ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＣＯＳ－７ ｃｅｌｌｓ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９４（２３）：１２３８４－１２３８９．
Ｗｏｊｃｉｋ，Ｊ．Ｐ．，Ｍ．Ｒ．Ｓｐｅｅｃｈｌｅｙ，Ａ．Ｅ．Ｋｅｒｔｅｓｚ，Ｓ．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ａｎｄ Ｐ．Ｃ．Ａｄａｍｓ（２００２）．“Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｃ２８２Ｙ ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅｓ ｆｏｒ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．”Ｃａｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １６（５）：２９７－３０２．

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A-1】

【図5A-2】

【図5B-1】

【図5B-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【手続補正書】

【提出日】2023-08-23

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024501385000001.app

【国際調査報告】