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特表2024-501449ヒトキメラ抗原受容体好中球、組成物、キット、および使用の方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-12
(54)【発明の名称】ヒトキメラ抗原受容体好中球、組成物、キット、および使用の方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0787 20100101AFI20240104BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20240104BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240104BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240104BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20240104BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0787
A61K35/15
A61P35/00
C12N15/09 110
C12N15/864 100Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023535301
(86)(22)【出願日】2021-12-10
(85)【翻訳文提出日】2023-08-02
(86)【国際出願番号】 US2021062734
(87)【国際公開番号】W WO2022125850
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】63/124,125
(32)【優先日】2020-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】598063203
【氏名又は名称】パーデュー・リサーチ・ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】バオ，シャオピン
(72)【発明者】
【氏名】デン，キン
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ユン
(72)【発明者】
【氏名】モード サブリ，リミザ シャヒラ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065BB12
4B065CA43
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB64
4C087BB65
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB26
(57)【要約】
本開示は、定義の培地および関連する組成物を使用して、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から好中球、例えば、キメラ抗原受容体発現（ＣＡＲ発現）好中球（例えば、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）の集団を製造するための段階特異的プロセス、キット、ならびに使用の方法（例えば、標的がん免疫療法）に関する。化学的に定義されたフィーダーフリーのプラットフォームおよび段階特異的モルフォゲン、細胞株、医薬組成物、がんを治療する方法、ならびにキットを使用して、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から好中球およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）好中球を生成するための段階特異的プロセスは、本開示の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ｈＰＳＣを調製するステップと、（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害物質で前記ｈＰＳＣを刺激して、ＣＤ３４＋造血内皮細胞の集団を生成するステップと、
（ｃ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質で前記ＣＤ３４＋造血内皮細胞を刺激して、ＣＤ４５＋造血細胞の集団を生成するステップと、
（ｄ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸受容体アゴニストで前記ＣＤ４５＋造血細胞を刺激して、ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１６＋好中球の集団を得るステップと
を含む、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から好中球の集団を製造するための段階特異的プロセス。
【請求項2】
前記ｈＰＳＣが、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、請求項１に記載の段階特異的プロセス。
【請求項3】
前記ＧＳＫ３β阻害物質が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４または類似の化学物質である、請求項１に記載の段階特異的プロセス。
【請求項4】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１または類似の化学物質である、請求項１に記載の段階特異的プロセス。
【請求項5】
前記レチノイン酸受容体アゴニストが、ＡＭ８０、ＡＭ５０または類似の化学物質である、請求項１に記載の段階特異的プロセス。
【請求項6】
ステップｂを血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の存在下で実行する、請求項１に記載の段階特異的プロセス。
【請求項7】
ステップｃを幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の存在下で実行する、請求項１に記載の段階特異的プロセス。
【請求項8】
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換えにより、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）においてアデノ随伴ウイルスＳ１（ＡＡＶＳ１）プラスミドのＡＡＶＳ１セーフハーバー部位に、ＣＡＲ発現遺伝子構築物をノックインするステップと、（ｂ）標的化に成功した単一細胞由来ｈＰＳＣコロニーまたはｈＰＳＣ細胞混合物を単離して、安定なＣＡＲ発現ｈＰＳＣ細胞株を得るステップと、
（ｃ）前記安定なＣＡＲ発現ｈＰＳＣ細胞株からｈＰＳＣを調製するステップと、
（ｄ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害物質で前記ｈＰＳＣを刺激して、ＣＤ３４＋造血内皮細胞の集団を生成するステップと、
（ｅ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質で前記ＣＤ３４＋造血内皮細胞を刺激して、ＣＤ４５＋造血細胞の集団を生成するステップと、
（ｆ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸受容体アゴニストで前記ＣＤ４５＋造血細胞を刺激して、ＣＡＲ好中球の集団を得るステップと
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）好中球の集団を製造するための段階特異的プロセス。
【請求項9】
（ａ’）ＣＡＲ発現遺伝子構築物を調製するステップと、（ａ’’）ＡＡＶＳ１プラスミドを構築するステップとの初期ステップをさらに含む、請求項８に記載の段階特異的プロセス。
【請求項10】
前記ＣＡＲが、クロロトキシンもしくはＩＬ１３、または他の細胞外シグナル伝達ドメイン、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａもしくはＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン２Ｂ４、およびＣＤ３ζもしくはＦｃγＲドメインの細胞内ドメインを含む、請求項８に記載の段階特異的プロセス。
【請求項11】
前記ＣＡＲが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の段階特異的プロセス。
【請求項12】
前記ＣＡＲが、配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の段階特異的プロセス。
【請求項13】
前記ｈＰＳＣが、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、請求項８に記載の段階特異的プロセス。
【請求項14】
前記ｈＥＳＣが、Ｈ９、Ｈ１または他のヒト胚性幹細胞を含む、請求項１３に記載の段階特異的プロセス。
【請求項15】
前記ｉＰＳＣが、６－９－９、１９－９－１１または他の誘導多能性幹細胞を含む、請求項１３に記載の段階特異的プロセス。
【請求項16】
前記ＧＳＫ３β阻害物質が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４または類似の化学物質である、請求項８に記載の段階特異的プロセス。
【請求項17】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、ＳＢ４３１５４２もしくはＡ８３－０１または類似の化学物質である、請求項８に記載の段階特異的プロセス。
【請求項18】
前記レチノイン酸受容体アゴニストが、ＡＭ８０もしくはＡＭ５０または類似の化学物質である、請求項８に記載の段階特異的プロセス。
【請求項19】
ステップｂを血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の存在下で実行する、請求項８に記載の段階特異的プロセス。
【請求項20】
ステップｃを幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の存在下で実行する、請求項８に記載の段階特異的プロセス。
【請求項21】
（ａ）ＣＡＲ発現遺伝子を含むＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドを構築するステップと、（ｂ）ヌクレオフェクション／エレクトロポレーションによりヒト多能性幹細胞内にＰｉｇｇｙＢａｃプラスミドを送達するステップと、
（ｃ）標的化に成功した単一細胞由来ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）コロニーまたはｈＰＳＣ細胞混合物を単離して、安定なＣＡＲ発現ｈＰＳＣ株を得るステップと、
（ｄ）請求項１に記載のプロセスに従ってＣＡＲ発現好中球を生成するステップと
を含む、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）好中球の集団を製造するためのプロセス。
【請求項22】
前記ｈＰＳＣが、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項23】
前記ｈＥＳＣが、Ｈ９、Ｈ１または他のヒト胚性幹細胞を含む、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項24】
前記ｉＰＳＣが、６－９－９、１９－９－１１または他の誘導多能性幹細胞を含む、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項25】
前記ＣＡＲが、クロロトキシンもしくはＩＬ１３、または他の細胞外シグナル伝達ドメイン、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａもしくはＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン２Ｂ４、およびＣＤ３ζもしくはＦｃγＲドメインの細胞内ドメインを含む、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項26】
前記ＣＡＲが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項27】
前記ＣＡＲが、配列番号１または３のアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項28】
配列番号１のアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の改変好中球細胞株。
【請求項29】
クロロトキシンもしくはＩＬ１３、または他の細胞外シグナル伝達ドメイン、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａもしくはＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン２Ｂ４、およびＣＤ３ζもしくはＦｃγＲドメインの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の改変好中球細胞株。
【請求項30】
前記ＣＡＲが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の改変好中球細胞株。
【請求項31】
配列番号３のアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の改変好中球細胞株。
【請求項32】
請求項８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６もしくは２７のいずれか一項に記載の方法に従って得られた単離好中球の集団、または請求項２８、２９、３０もしくは３１のいずれか一項に記載の細胞株由来の好中球の集団、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項33】
治療有効量の（ａ）請求項８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６もしくは２７のいずれか一項に記載の方法に従って得られた好中球の集団、またはこれおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、あるいは（ｂ）請求項２８、２９、３０もしくは３１のいずれか一項に記載の細胞株由来の好中球の集団、またはこれおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与し、その上で前記対象のがんを治療するステップを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法。
【請求項34】
前記がんが、脳腫瘍、前立腺がん、または他のがんである、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記脳腫瘍が、神経膠腫である、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記神経膠腫が、神経膠芽腫である、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記がんが、タンパク質マトリックスメタロペプチダーゼ２、ＩＬ－１３受容体、ＰＳＭＡまたは他のがん抗原を発現する、請求項３３に記載の方法。
【請求項38】
好中球の前記集団またはこれを含む前記医薬組成物を全身的または頭蓋内に投与する、請求項３３に記載の方法。
【請求項39】
（ａ）任意選択で、培地の一部として、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害物質、（ｂ）任意選択で、培地の一部として、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、
（ｃ）任意選択で、培地の一部として、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質、
（ｄ）任意選択で、培地の一部として、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）およびインターロイキン６（ＩＬ－６）、ならびに
（ｅ）任意選択で、培地の一部として、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸アゴニスト
を含む、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から好中球を調製するためのキット。
【請求項40】
（ｃ）および（ｄ）において幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦｌｔ３：ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３／胎性肝臓キナーゼ２（Ｆｌｔ３）リガンド、ならびに（ｅ）においてＧｌｕｔａＭＡＸおよびＥｘＣｙｔｅをさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項41】
配列番号１～３、８～１０のタンパク質またはこの機能性断片をコードする、対応するＤＮＡ配列。
【請求項42】
前記ＤＮＡ配列が、配列番号１１～１６を有する、請求項４１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願では、２０２０年１２月１１日出願の米国特許仮出願第６３／１２４，１２５号の優先権を主張する。この特許仮出願および添付の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＧＭ１１９７８７のもと、政府の支援で行った。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本出願では、２０２０年１２月１１日出願の米国特許仮出願第６３／１２４，１２５号の優先権を主張する。この特許仮出願および添付の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＧＭ１１９７８７のもと、政府の支援で行った。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【0002】
配列表の記載
配列表のコンピュータに読込み可能な形式（ＣＲＦ）は、本出願と同時に提出する。２０２１年１２月６日に作成され、３９キロバイトのファイルサイズを有する69243-02_Seq_Listing_ST25_txtのファイルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、コンピュータに読込み可能な形式の内容が同一であり、コンピュータに読込み可能な形式に記録された情報が文書の配列表と同一であると述べている。
配列表のコンピュータに読込み可能な形式（ＣＲＦ）は、本出願と同時に提出する。２０２１年１２月６日に作成され、３９キロバイトのファイルサイズを有する69243-02_Seq_Listing_ST25_txtのファイルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、コンピュータに読込み可能な形式の内容が同一であり、コンピュータに読込み可能な形式に記録された情報が文書の配列表と同一であると述べている。
【0003】
本開示は、定義の培地および関連する組成物を使用して、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から好中球、例えば、キメラ抗原受容体発現（ＣＡＲ発現）好中球（例えば、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）の集団を製造するための段階特異的プロセス、キット、ならびに使用の方法（例えば、標的がん免疫療法）に関する。
【背景技術】
【0004】
本節では、本開示のより良い理解を容易とするのに役立ち得る態様を紹介する。したがって、このような記載は、この観点から解読すべきであり、先行技術であるか否かについての承認として理解されるべきではない。
【0005】
ヒトにおいて最も豊富な循環する白血球である好中球は、多く型の腫瘍に蓄積し、腫瘍浸潤細胞の大部分を占める（Eruslanov et al., 2017；Ilie et al., 2012；Jaillon et al., 2020；Zhao et al., 2020）。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるこれらの不均一性および可塑性のため、好中球は、腫瘍の進展中に、相反する腫瘍促進効果および抗腫瘍効果を示している。例えば、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）は、固形がんに対する直接または抗体依存性細胞毒性を提示するが（Kargl et al., 2019；Matlung et al., 2018）、一方、これらはまた、ＴＭＥにおいて血管新生を容易とし、腫瘍細胞の遊走を促進し、他の免疫細胞の抗腫瘍機能を抑制する（Coffelt et al., 2015, 2016；Huo et al., 2019）。腫瘍促進性好中球の存在によって、新興の免疫療法を含む多くのがん療法の有効性が制限されたことが（Itatani et al., 2020）、前臨床試験および臨床試験の両方において種々のがんを治療するための抑制的好中球標的戦略の開発につながった（Zhao et al., 2020）。しかし、複雑なＴＭＥにおける好中球の高い不均一性を考慮すると（Lecot et al., 2019；Sagiv et al., 2015）、小分子または抗体に基づく手法による全身的抑制により、腫瘍促進性好中球および抗腫瘍性好中球の両方が除去され、好中球標的療法の有効性が低下し得る。その上、がん患者において好中球減少症（McDermott et al., 2010）のような有害作用を発症し、感染症のリスクが上昇し得る（Xie et al., 2020）。したがって、代替的な好中球標的手法が、がん治療におけるこれらの十分な可能性を実現するのに必要とされている。
【0006】
過去１０年では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が開発され、種々の血液系悪性腫瘍および固形腫瘍に対するこれらの抗腫瘍作用を強化するためにＴおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞において広く使用され（Feins et al., 2019；June and Sadelain, 2018；June et al., 2018；Mehta and Rezvani, 2018；Zhu et al., 2018）、がん免疫療法の分野が改革された。さらに最近では、ＣＡＲを含む初代マクロファージの遺伝子改変により、それらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において抗腫瘍エフェクター細胞としてプログラムされ、維持されている（Klichinsky et al., 2020）。マクロファージに対するこれらの類似性および先天的抗腫瘍応答の共有を考慮すると（Yan et al., 2014）、我々は、ヒト好中球が、ＣＡＲ改変後に種々の方法で殺腫瘍活性の増強を提示し得ると仮定した。このような手法は主に、これらの半減期が短く、ゲノム編集が困難であるため、好中球には未だ適用されていない。このような満たされていない医学的必要性に対する解決策を提供するために、我々は、ＣＡＲ好中球の代替的細胞源の探索に迫られている。
【0007】
前述を考えると、標的がん免疫療法、例えば、脳腫瘍の治療のための新たな材料および方法の必要性が残存している。このような材料（例えば、ＣＡＲ好中球）および方法を提供することが、本開示の目的である。このおよび他の目的ならびに利点だけでなく本発明の特徴は、本明細書において提供する記載および図面から明らかとなる。
【発明の概要】
【0008】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から好中球の集団を製造するための段階特異的プロセスを提供する。方法は、（ａ）ｈＰＳＣを調製するステップと、（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害物質でこのｈＰＳＣを刺激して、ＣＤ３４＋造血内皮細胞の集団を生成するステップと、（ｃ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質でこのＣＤ３４＋造血内皮細胞を刺激して、ＣＤ４５＋造血細胞の集団を生成するステップと、（ｄ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸受容体アゴニストでこのＣＤ４５＋造血細胞を刺激して、ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１６＋好中球の集団を得るステップとを含む。ｈＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含み得る。ＧＳＫ３β阻害物質は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４または類似の化学物質であり得る。ＴＧＦβ阻害物質は、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１または類似の化学物質であり得る。レチノイン酸受容体アゴニストは、ＡＭ８０、ＡＭ５０または類似の化学物質であり得る。ステップ（ｂ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の存在下で実行することができる。ステップ（ｃ）は、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の存在下で実行することができる。
【0009】
また、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）好中球の集団を製造するための段階特異的プロセスを提供する。方法は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換えにより、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）においてアデノ随伴ウイルスＳ１（ＡＡＶＳ１）プラスミドのＡＡＶＳ１セーフハーバー部位に、ＣＡＲ発現遺伝子構築物をノックインするステップと、（ｂ）標的化に成功した単一細胞由来ｈＰＳＣコロニーまたはｈＰＳＣ細胞混合物を単離して、安定なＣＡＲ発現ｈＰＳＣ細胞株を得るステップと、（ｃ）この安定なＣＡＲ発現ｈＰＳＣ細胞株からｈＰＳＣを調製するステップと、（ｄ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害物質でこのｈＰＳＣを刺激して、ＣＤ３４＋造血内皮細胞の集団を生成するステップと、（ｅ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質でこのＣＤ３４＋造血内皮細胞を刺激して、ＣＤ４５＋造血細胞の集団を生成するステップと、（ｆ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸受容体アゴニストでこのＣＤ４５＋造血細胞を刺激して、ＣＡＲ好中球の集団を得るステップとを含む。プロセスは、（ａ’）ＣＡＲ発現遺伝子構築物を調製するステップと、（ａ’’）ＡＡＶＳ１プラスミドを構築するステップとの初期ステップをさらに含み得る。ＣＡＲは、クロロトキシン、ＣＤ４の膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζの細胞内ドメインを含み得る。ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。ＣＣＡＲは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有し得る。ｈＰＳＣは、ｈＥＳＣ、例えば、Ｈ９またはＨ１、およびｉＰＳＣ、例えば、６－９－９または１９－９－１１を含み得る。ＧＳＫ３β阻害物質は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４または類似の化学物質であり得る。ＴＧＦβ阻害物質は、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１または類似の化学物質であり得る。レチノイン酸受容体アゴニストは、ＡＭ８０、ＡＭ５０または類似の化学物質であり得る。ステップ（ｂ）は、ＶＥＧＦの存在下で実行することができる。ステップ（ｃ）は、ＳＣＦおよびＦＬＴ３Ｌの存在下で実行することができる。
【0010】
（ａ）ＣＡＲ発現遺伝子を含むＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドを構築するステップと、（ｂ）ヌクレオフェクション／エレクトロポレーションによりヒト多能性幹細胞内にＰｉｇｇｙＢａｃプラスミドを送達するステップと、（ｃ）標的化に成功した単一細胞由来ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）コロニーまたはｈＰＳＣ細胞混合物を単離して、安定なＣＡＲ発現ｈＰＳＣ株を得るステップと、（ｄ）ｈＰＳＣから好中球の集団を製造するための上記の段階特異的プロセスに従ってＣＡＲ発現好中球を生成するステップとを含む、ｈＰＳＣからＣＡＲ好中球の集団を製造するためのプロセスをさらに提供する。ｈＰＳＣは、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを含み得る。ｈＥＳＣは、Ｈ９、Ｈ１または他のヒト胚性幹細胞を含み得る。ｉＰＳＣは、６－９－９、１９－９－１１または他の誘導多能性幹細胞を含み得る。ＣＡＲは、クロロトキシン、ＣＤ４の膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζの細胞内ドメインを含み得る。ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。ＣＡＲは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有する。
【0011】
ｈＰＳＣ由来の改変好中球細胞株をなおさらに提供する。実施形態では、改変好中球細胞株は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＡＲを含む。別の実施形態では、改変好中球細胞株は、クロロトキシン、ＣＤ４の膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζの細胞内ドメインを含むＣＡＲ、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＡＲを含む。また別の実施形態では、改変好中球細胞株は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＡＲを含む。
【0012】
医薬組成物をまたなおさらに提供する。医薬組成物は、上記の方法に従って得られた単離ＣＡＲ好中球の集団または上記の細胞株由来の好中球の集団を含む。医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【0013】
また、それを必要とする対象における、がんを治療する方法を提供する。方法は、治療有効量の（ａ）上記の方法に従って得られた好中球の集団、もしくはこれおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、または（ｂ）上記の細胞株由来の好中球の集団、もしくはこれおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む。がんは、脳腫瘍であり得る。脳腫瘍は、神経膠腫であり得る。神経膠腫は、神経膠芽腫であり得る。がんは、タンパク質マトリックスメタロペプチダーゼ２を発現し得る。好中球の集団またはこれを含む医薬組成物は、全身的または頭蓋内に投与することができる。
【0014】
最終的には、ｈＰＳＣから好中球を調製するためのキットを提供する。キットは、（ａ）任意選択で、培地の一部として、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害物質、（ｂ）任意選択で、培地の一部として、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、（ｃ）任意選択で、培地の一部として、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質、（ｄ）任意選択で、培地の一部として、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）およびインターロイキン６（ＩＬ－６）、ならびに（ｅ）任意選択で、培地の一部として、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸アゴニストを含む。キットは、（ｃ）および（ｄ）においてＳＣＦおよびＦｌｔ３：ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３／胎性肝臓キナーゼ２（Ｆｌｔ３）リガンド、ならびに（ｅ）においてＧｌｕｔａＭＡＸおよびＥｘＣｙｔｅをさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1-1】ｈＰＳＣ由来好中球が、初代好中球に類似の分子および機能性表現型を取ることを示す図である。（図１Ａ）化学的に定義された条件下でのｈＰＳＣからの好中球分化の最適化の模式図である。（図１Ｂ）指示日数における細胞形態の代表的明視野画像である：Ｄ０ ｈＰＳＣ、Ｄ３中胚葉、Ｄ６造血内皮細胞、Ｄ１２造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、Ｄ１５ミエロイド前駆細胞、ならびにＤ２１好中球。スケールバーは１００μｍである。
【図1-2】ｈＰＳＣ由来好中球が、初代好中球に類似の分子および機能性表現型を取ることを示す図である。（図１Ｃ）生成好中球のフローサイトメトリー解析を示す。プロットは、非染色対照（青色）および特異的抗体（赤色）のヒストグラムを示す。初代末梢血（ＰＢ）好中球を陽性対照として使用した。
【図1-3】ｈＰＳＣ由来好中球が、初代好中球に類似の分子および機能性表現型を取ることを示す図である。（図１Ｄ）ｈＰＳＣ由来好中球によるｐＨｒｏｄｏＧｒｅｅｎ大腸菌（E. coli）粒子の食作用を示す。（図１Ｅ）化学誘引物質（１０ｎＭおよび１００ｎＭのｆＭＬＰ）の非存在または存在下でのｈＰＳＣ由来好中球のトランズウェル（transwell）遊走解析を示す。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。＊ｐ＜０．０５。
【図1-4】ｈＰＳＣ由来好中球が、初代好中球に類似の分子および機能性表現型を取ることを示す図である。（図１Ｆ）化学遊走におけるヒトＰＢおよびｈＰＳＣ由来好中球の代表的追跡、平均速度および化学遊走指数を示す。（図１Ｇ）ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（phorbol 12-myristate 13-acetate、ＰＭＡ）処理有りまたは無しのｈＰＳＣ由来および初代ＰＢ好中球の反応性酸素種（ＲＯＳ）産生を示す。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。＊ｐ＜０．０５。
【図2-1】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ノックインｈＰＳＣに由来する好中球が、抗腫瘍細胞毒性の増強を呈することを示す図である。（図２Ａ～２Ｂ）ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ構築物の模式図およびＡＡＶＳ１セーフハーバー部位における標的ノックイン戦略を（図２Ａ）に示す。ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲは、シグナルペプチド（ＳＰ）、神経膠芽腫標的細胞外ドメインクロロトキシン（ＣＬＴＸ）、ＦｃドメインＩｇＧ４（ＳｍＰ）、膜貫通ドメインＣＤ４－ｔｍおよび細胞内シグナル伝達ドメインＣＤ３ζからなる。垂直矢印は、ＡＡＶＳ１標的ｓｇＲＮＡを示す。赤色および青色の水平矢印は、標的効率およびホモ接合性を定量するためのプライマーをそれぞれ示す。（図２Ｂ）ピューロマイシン選択後のｈＰＳＣクローンのＰＣＲ遺伝子型決定を示す。ＡＡＶＳ１部位の正確な標的化のために予想されたＰＣＲ産物は、９９１ｂｐであり（赤色の矢印）、合計５種のうちの４種のクローンの効率を有する。ホモ接合性アッセイは、ノックインしたクローンに対して実施し、約２４０ｂｐのＰＣＲ産物を有しないクローンは、ホモ接合性であった（青色の矢印）。
【図2-2】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ノックインｈＰＳＣに由来する好中球が、抗腫瘍細胞毒性の増強を呈することを示す図である。（図２Ｃ～２Ｄ）ＩＬ－１３－Ｔ－ＣＡＲ構築物の模式図およびＡＡＶＳ１セーフハーバー部位における標的ノックイン戦略を（図２Ｃ）に示す。ＩＬ－１３－Ｔ－ＣＡＲは、シグナルペプチド（ＳＰ）、細胞外ドメインＴＱＭ－１３、ＦｃドメインＩｇＧ４（ＳｍＰ）、膜貫通ドメインＣＤ４－ｔｍおよび細胞内シグナル伝達ドメインＣＤ３ζからなる。（図２Ｄ）ピューロマイシン選択後のｈＰＳＣクローンのＰＣＲ遺伝子型決定を示す。ＡＡＶＳ１部位の正確な標的化のために予想されたＰＣＲ産物は、９９１ｂｐであり（赤色の矢印）、合計２４種のうちの１５種のクローンの効率を有する。ホモ接合性アッセイは、ノックインしたクローンに対して実施し、約２４０ｂｐのＰＣＲ産物を有しないクローンは、ホモ接合性であった（青色の矢印）。
【図2-3】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ノックインｈＰＳＣに由来する好中球が、抗腫瘍細胞毒性の増強を呈することを示す図である。（図２Ｅ）野生型およびＣＡＲノックインｈＰＳＣ上でのＩＬ－１３およびＣＬＴＸ－ＩｇＧ４発現の代表的ＲＴ－ＰＣＲ解析を示す。（図２Ｆ）Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫に対する細胞毒性アッセイを、指示する好中球を使用して種々の好中球対腫瘍標的比で実施した。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。＊ｐ＜０．０５。
【図2-4】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ノックインｈＰＳＣに由来する好中球が、抗腫瘍細胞毒性の増強を呈することを示す図である。（図２Ｇ）Ｕ８７ＭＧ細胞有り無しで同時培養した種々の好中球の反応性酸素種（ＲＯＳ）産生を測定した。（図２Ｈ）１０：１の比率による、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球の種々の腫瘍細胞に対する細胞毒性能を示す。神経膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞株、初代成人ＧＢＭ４３および小児ＳＪ－ＧＢＭ２細胞を利用した。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。＊ｐ＜０．０５。神経膠芽腫対非神経膠芽腫。
【図3-1】ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球がトロゴトーシスにより神経膠芽腫細胞を殺傷することを示す図である。（図３Ａ～３Ｃ）ＣＡＲ好中球と腫瘍細胞との間の界面における極性化Ｆアクチンの蓄積により示す免疫シナプスの代表的画像を（Ａ）に示し、指示する好中球と腫瘍細胞との間に形成された免疫シナプスの数を（図３Ｂ）に定量した。Ｎｅｕ：好中球、Ｔｕ：腫瘍細胞。スケールバーは１０μｍである。（図３Ｃ）ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球と指示細胞との間に形成された免疫シナプスの数を定量した。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。
【図3-2】ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球がトロゴトーシスにより神経膠芽腫細胞を殺傷することを示す図である。（図３Ｄ～３Ｅ）好中球による神経膠芽腫細胞のトロゴサイトーシスにより、がん細胞細胞質標識の減少が経時的に引き起こされた。カルセインＡＭ標識腫瘍細胞のトロゴトーシスによる破壊の代表的明視野（ｂｒｉｇｈｔ）および蛍光画像（図３Ｄ）、ならびに腫瘍トロゴサイトーシスにおけるＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球のフローサイトメトリー解析（図３Ｅ）を示した。スケールバーは１０μｍである。
【図3-3】ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球がトロゴトーシスにより神経膠芽腫細胞を殺傷することを示す図である。（図３Ｆ）ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ由来好中球による腫瘍細胞のトロゴトーシスによる破壊における反応性酸素種（ＲＯＳ）産生も定量した。（図３Ｇ）ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ由来好中球による腫瘍細胞のトロゴトーシスによる破壊の模式図である。
【図4-1】ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球が膜タンパク質ＭＭＰ２により神経膠芽腫に特異的に結合することを示す図である。（図４Ａ）腫瘍細胞における標的化遺伝子の誘導性ノックダウンのための一体型Ｃａｓ１３ｄＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラットフォームの模式図である。
【図4-2】ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球が膜タンパク質ＭＭＰ２により神経膠芽腫に特異的に結合することを示す図である。ＣＬＣＮ３（図４Ｂ）、ＡＮＸＡ２（図４Ｃ）標的Ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡをトランスフェクトした腫瘍細胞をドキシサイクリン（ＤＯＸ）処理有りまたは無しでＲＴ－ＰＣＲ解析に供した。このような修飾腫瘍細胞に対するＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球の抗腫瘍細胞毒性および相対ＲＯＳ産生を１０：１の好中球対標的比によりＤＯＸ処理有りまたは無しで定量した。野生型腫瘍細胞を陽性対照として使用した。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。
【図4-3】ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球が膜タンパク質ＭＭＰ２により神経膠芽腫に特異的に結合することを示す図である。ＭＭＰ２（図４Ｄ）標的Ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡをトランスフェクトした腫瘍細胞をドキシサイクリン（ＤＯＸ）処理有りまたは無しでＲＴ－ＰＣＲ解析に供した。このような修飾腫瘍細胞に対するＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球の抗腫瘍細胞毒性および相対ＲＯＳ産生を１０：１の好中球対標的比によりＤＯＸ処理有りまたは無しで定量した。野生型腫瘍細胞を陽性対照として使用した。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。
【図4-4】ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球が膜タンパク質ＭＭＰ２により神経膠芽腫に特異的に結合することを示す図である。（図４Ｅ）ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲおよびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球の細胞溶解物におけるＳｙｋ－Ｅｒｋシグナル伝達経路の全体的およびリンタンパク質解析を、ウエスタンブロットにより腫瘍細胞の同時インキュベーション有り無しで実施した。（図４Ｆ）ＭＭＰ２に結合後のＣＡＲ好中球における活性化細胞Ｓｙｋ－Ｅｒｋシグナル伝達経路の模式図である。
【図5-1】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経膠芽腫（ＧＢＭ）微小環境模倣モデルを使用したＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球の機能性評価を示す図である。（図５Ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血液脳関門（ＢＢＢ）モデルの模式図である。１００ｎＭのｆＭＬＰ処理有りまたは無しの野生型およびＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球のトランズウェル遊走解析（図５Ｂ）ならびにこれらの抗ＧＢＭ細胞毒性（図５Ｃ）をＢＢＢモデルにより評価した。ＢＢＢを通じた種々のｈＰＳＣ好中球の第２の遊走の模式図（図５Ｄ）および定量（図５Ｅ）を示した。
【図5-2】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経膠芽腫（ＧＢＭ）微小環境模倣モデルを使用したＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球の機能性評価を示す図である。（図５Ｆ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの好中球浸潤３次元（３Ｄ）腫瘍モデルの模式図である。
【図5-3】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経膠芽腫（ＧＢＭ）微小環境模倣モデルを使用したＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球の機能性評価を示す図である。（図５Ｇ）３Ｄ腫瘍モデルにおける浸潤野生型およびＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球の代表的蛍光画像および定量を示した。ＤＡＰＩを使用して細胞核を染色し、ＣＤ４５を使用して好中球を染色した。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。＊ｐ＜０．０５。（図５Ｈ）３Ｄ腫瘍モデルの生／死染色を好中球浸潤から２４時間後に実施し、対応する腫瘍殺傷効率を定量した。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。＊ｐ＜０．０５。スケールバーは２００μｍである。
【図6-1】腫瘍内注射により評価したＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球およびＣＬＴＸナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの抗腫瘍活性を示す図である。（図６Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍細胞毒性試験のための指示するｈＰＳＣ好中球またはＮＫ細胞の腫瘍内注射の模式図である。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉ）発現Ｕ８７ＭＧ細胞５×１０５細胞をＮＳＧマウスの右前脳内に定位的に移植した。３時間後、ＰＢＳ、野生型またはＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球５×１０６細胞、野生型またはＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲｈＰＳＣ－ＮＫ細胞５×１０６細胞を同一の位置に注射した。
【図6-2】腫瘍内注射により評価したＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球およびＣＬＴＸナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの抗腫瘍活性を示す図である。指示日数において生物発光イメージング（ＢＬＩ）により経時的腫瘍量を決定して（図６Ｂ）定量した（図６Ｃ）。（ｓＢ）のマウスについてのデータは、平均値±ｓ．ｄ．である。＊ｎ＝３。
【図6-3】腫瘍内注射により評価したＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球およびＣＬＴＸナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの抗腫瘍活性を示す図である。指示日数において生物発光イメージング（ＢＬＩ）により経時的腫瘍量を決定して（図６Ｂ）定量した（図６Ｃ）。（ｓＢ）のマウスについてのデータは、平均値±ｓ．ｄ．である。＊ｎ＝３。（図６Ｄ）指示する実験マウスの体重を毎週測定して記録した。（図６Ｅ）実験群の生存を実証するＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を示した。
【図7-1】ｈＰＳＣ由来ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を、静脈内注射により評価したことを示す図である。（図７Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍細胞毒性試験のためのＣＡＲ好中球および／またはＣＡＲ－ＮＫ細胞の静脈内注射の模式図である。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉ）発現Ｕ８７ＭＧ細胞５×１０５細胞をＮＳＧマウスの右前脳内に定位的に移植した。４日後、マウスにＰＢＳ、野生型好中球、ＣＡＲ好中球、野生型ＮＫ細胞および／またはＣＡＲ－ＮＫ細胞５×１０６細胞を毎週約１か月間静脈内に処置した。
【図7-2】ｈＰＳＣ由来ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を、静脈内注射により評価したことを示す図である。指示日数において生物発光イメージング（ＢＬＩ）により経時的腫瘍量を決定して（図７Ｂ）定量した（図７Ｃ）。（Ｂ）のマウスについてのデータは、平均値±ｓ．ｄ．である（ｎ＝６）。
【図7-3】ｈＰＳＣ由来ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を、静脈内注射により評価したことを示す図である。指示日数において生物発光イメージング（ＢＬＩ）により経時的腫瘍量を決定して（図７Ｂ）定量した（図７Ｃ）。（Ｂ）のマウスについてのデータは、平均値±ｓ．ｄ．である（ｎ＝６）。（図７Ｄ）実験群の生存を実証するＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を示した。死んだマウスから回収した臓器を生物発光イメージングに供し（図７Ｅ）、（図７Ｆ）において定量した。
【図7-4】ｈＰＳＣ由来ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を、静脈内注射により評価したことを示す図である。（図７Ｅ）のマウスについてのデータは、平均値±ｓ．ｄ．である（ｎ＝６）。
【図7-5】ｈＰＳＣ由来ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を、静脈内注射により評価したことを示す図である。（図７Ｇ）マウス末梢血中のヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびＩＬ－６のレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。
【図7-6】ｈＰＳＣ由来ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を、静脈内注射により評価したことを示す図である。（図７Ｈ）野生型およびＣＡＲ好中球を、全身注射後２４時間にマウス血液から単離し、抗腫瘍Ｎ１および腫瘍促進Ｎ２マーカーのＲＴ－ＰＣＲ解析に供した。
【図8-1】大動脈様ＣＤ３４＋ＳＯＸ１７＋造血内皮細胞（ＨＥ）ならびに造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の生成を示す図である。（図８Ａ）ｈＰＳＣからのＨＥおよびＨＳＰＣ生成の模式図である。（図８Ｂ～８Ｃ）ｈＰＳＣ由来の５日目培養物を、ＣＤ３４／ＳＯＸ１７についてフローサイトメトリー解析に供し、（図８Ｃ）において定量した。（図８Ｄ）５日目のＳＯＸ１７およびＶＥｃａｄについての免疫染色の代表的画像である。スケールバーは５０μｍである。
【図8-2】大動脈様ＣＤ３４＋ＳＯＸ１７＋造血内皮細胞（ＨＥ）ならびに造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の生成を示す図である。（図８Ｅ～８Ｈ）ｈＰＳＣを（図８Ａ）に例示するように分化させた。種々の時点のＨ９ｈＰＳＣにおけるＣＤ４５／ＣＤ４３発現の代表的フロープロットを（図８Ｅ）に示し、（図８Ｆ）に定量した。指示日数のＨ９培養物におけるＣＤ４４／ＣＤ４３（図８Ｇ）およびＨ９ＲＵＮＸ１ｃ－ＧＦＰ（Ng et al., 2016）培養物におけるＣＤ３４／ＲＵＮＣ１ｃ（図８Ｈ）の代表的フロープロットを示した。
【図8-3】大動脈様ＣＤ３４＋ＳＯＸ１７＋造血内皮細胞（ＨＥ）ならびに造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の生成を示す図である。（図８Ｉ～８Ｊ）凍結前後の細胞生存率を、カルセインＡＭ染色によるフローサイトメトリーによって評価した。
【図9-1】ｈＰＳＣ由来ミエロイド前駆細胞の多能性評価を示す図である。（図９Ａ～９Ｃ）指示日数における分化中のマクロファージ（ＣＦＵ－Ｍ）および顆粒球－マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ－ＧＭ）解析の模式図を（図９Ａ）に示した。指示日数に採取したｈＰＳＣ由来ミエロイド前駆細胞により形成されたＧおよびＧＭコロニーの代表的画像を（図９Ｂ）に示し、（図９Ｃ）に定量した。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。スケールバーは１００μｍである。
【図9-2】ｈＰＳＣ由来ミエロイド前駆細胞の多能性評価を示す図である。（図９Ｄ～９Ｅ）ｈＰＳＣ由来ミエロイド前駆細胞の単球／マクロファージ分化能を、ＧＭ－ＣＳＦ処理を適用することにより評価した。種々の培養条件下でのＣＤ１４およびＣＤ４５の代表的フロープロットを（図９Ｄ）に示し、（図９Ｅ）に定量した。
【図9-3】ｈＰＳＣ由来ミエロイド前駆細胞の多能性評価を示す図である。（図９Ｆ～９Ｈ）Ｇ－ＣＳＦおよびＡＭ５８０処理による指示日数のｈＰＳＣ由来ミエロイド前駆細胞の好中球分化能評価の模式図を（図９Ｆ）に示した。指示日数に採取した細胞培養物におけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ１６の発現をフローサイトメトリーにより評価し（図９Ｇ）、（図９Ｈ）において定量した。ｈＰＳＣ由来および初代末梢血（ＰＢ）好中球の代表的ライトギムザ（Wright-Giemsa）染色を（図９Ｉ）に示した。スケールバーは１０μｍである。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。
【図9-4】ｈＰＳＣ由来ミエロイド前駆細胞の多能性評価を示す図である。（図９Ｆ～９Ｈ）Ｇ－ＣＳＦおよびＡＭ５８０処理による指示日数のｈＰＳＣ由来ミエロイド前駆細胞の好中球分化能評価の模式図を（図９Ｆ）に示した。指示日数に採取した細胞培養物におけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ１６の発現をフローサイトメトリーにより評価し（図９Ｇ）、（図９Ｈ）において定量した。ｈＰＳＣ由来および初代末梢血（ＰＢ）好中球の代表的ライトギムザ（Wright-Giemsa）染色を（図９Ｉ）に示した。スケールバーは１０μｍである。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。
【図10-1】ＣＡＲノックインｈＰＳＣの構築および特性決定を示す図である。（図１０Ａ～１０Ｂ）ＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ構築物の模式図およびＡＡＶＳ１セーフハーバー部位における標的ノックイン戦略（図１０Ａ）である。ＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲは、シグナルペプチド（ＳＰ）、神経膠芽腫標的細胞外ドメインクロロトキシン（ＣＬＴＸ）、ＦｃドメインＩｇＧ４（ＳｍＰ）、膜貫通ドメインＮＫＧ２Ｄ－ｔｍ、共刺激ドメイン２Ｂ４および細胞内シグナル伝達ドメインＣＤ３ζからなる。垂直矢印は、ＡＡＶＳ１標的ｓｇＲＮＡを示す。赤色および青色の水平矢印は、標的効率およびホモ接合性を定量するためのプライマーをそれぞれ示す。（図１０Ｂ）ピューロマイシン選択後のｈＰＳＣクローンのＰＣＲ遺伝子型決定を示す。ＡＡＶＳ１部位の正確な標的化のために予想されたＰＣＲ産物は、９９１ｂｐであり（赤色の矢印）、合計１３種のうちの４種のクローンの効率を有する。ホモ接合性アッセイは、ノックインしたクローンに対して実施し、約２４０ｂｐのＰＣＲ産物を有しないクローンは、ホモ接合性であった（青色の矢印）。
【図10-2】ＣＡＲノックインｈＰＳＣの構築および特性決定を示す図である。（図１０Ｃ～１０Ｆ）ＣＡＲｈＰＳＣの表現型および機能性評価を実施した。ＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４発現の代表的蛍光画像（図１０Ｃ）およびフロープロット（図１０Ｄ）を示した。スケールバーは５０μｍである。
【図10-3】ＣＡＲノックインｈＰＳＣの構築および特性決定を示す図である。（図１０Ｅ～１０Ｆ）野生型ｈＰＳＣを３つの胚葉系列：中胚葉、内胚葉および外胚葉に分化させた。ｃＴｎＴ、ＨＮＦ４Ａおよびβ－ＩＩＩチューブリンの代表的免疫染色画像を（図１０Ｅ）に示した。スケールバーは１００μｍである。（図１０Ｆ）ＣＡＲ好中球をＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣから得、野生型Ｈ９ｈＰＳＣ、ｈＰＳＣ由来中胚葉、内胚葉および外胚葉とともに指示する好中球対標的比でインキュベートした。生細胞の数を定量した。データは、３つの独立的再現の平均値±ｓ．ｄ．として表す。
【図11-1】ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンに基づくＣａｓ１３ｄ系を使用した腫瘍細胞における誘導性遺伝子ノックダウンを示す図である。神経膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞に指示する一体型Ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡ構築物をｈｙＰＢａｓｅプラスミドとともにトランスフェクトした。ドキシサイクリン（ＤＯＸ）処理後のｅＧＦＰシグナルの代表的明視野および蛍光画像（図１１Ａ）ならびにフロープロット（図１１Ｂ）を示した。スケールバーは１００μｍである。
【図11-2】ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンに基づくＣａｓ１３ｄ系を使用した腫瘍細胞における誘導性遺伝子ノックダウンを示す図である。（図１１Ｃ）ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ由来好中球を、ＤＯＸの存在または非存在下で、指示する遺伝子ノックダウン神経膠芽腫細胞とともにインキュベートした。好中球と指示腫瘍細胞との間の免疫シナプス形成を定量し、（図１１Ｃ）に示した。野生型Ｕ８７ＭＧ細胞を陰性対照として使用した。
【図12-1】ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を、静脈内注射により評価したことを示す図である。（図１２Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞追跡試験のためのＣｙ５標識ｈＰＳＣ好中球の静脈内注射の模式図である。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉ）発現Ｕ８７ＭＧ細胞５×１０５細胞をＮＳＧマウスの右前脳内に定位的に移植した。４日後、マウスにＰＢＳ、Ｃｙ５標識野生型またはＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球５×１０６細胞を静脈内に処置した。全身（図１２Ｂ）、脳（図１２Ｃ）および他の臓器（図１２Ｄ）におけるＣｙ５＋好中球の経時的体内分布を、指示時間に蛍光イメージングにより決定して定量した。
【図12-2】ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を、静脈内注射により評価したことを示す図である。（図１２Ｅ）実験マウスの体重を毎週測定した。（図１２Ｆ）指示マウスから単離した神経膠芽腫異種移植片の代表的明視野およびＨ＆Ｅ染色画像を示した。腫瘍領域は、破線で囲んだ。
【図12-3】ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を、静脈内注射により評価したことを示す図である。（図１２Ｇ）全身注射後２４時間にマウス血液から単離した野生型およびＣＡＲ好中球を、抗腫瘍Ｎ１および腫瘍促進Ｎ２マーカーのＲＴＰＣＲ解析に供して定量した。
【図13-1】ｈＰＳＣに由来する抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ好中球により、癌性株が特異的に認識され、殺傷されることを示す図である。（図１３Ａ）ＰＳＭＡ－ＣＡＲ設計の模式図、および内因性ＡＡＶＳ１セーフハーバー部位におけるＣａｓ９媒介相同性特異的修復（ＨＤＲ）によるノックイン戦略である。ＰＳＭＡ－ＣＡＲは、シグナルペプチド、抗ＰＳＭＡ Ｊ５９１ｓｃＦＶまたはナノボディ、ＩｇＧ４－Ｆｃ（ＥＱ）、ＣＤ４膜貫通（ｔｍ）およびＣＤ３ζ（ＣＤ３ｚ）からなる。（図１３Ｂ）計１３種のうち１２種のクローンおよび計１５種のうち１３種のクローンの標的効率をそれぞれ有するｈＰＳＣにおけるＣＡＲノックインの遺伝子型決定を示す。
【図13-2】ｈＰＳＣに由来する抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ好中球により、癌性株が特異的に認識され、殺傷されることを示す図である。（図１３Ｃ）ＣＡＲ好中球を、Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫（ＧＢＭ）およびＬＮＣａＰ前立腺がん細胞とともに指示細胞比により１６時間同時培養し、好中球の細胞毒性を算出した。
【図14】ＣＬＴＸ ＮＫ－ＣＡＲプラスミドマップを示す図である。
【図15】ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲプラスミドマップを示す図である。
【図16】ＩＬ－１３ Ｔ－ＣＡＲプラスミドマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本開示の原理の理解を促進する目的では、図において例示する実施形態に、ここで言及し、特定の言語を使用してこれを記載する。本明細書によって本開示の範囲を制限することは意図しないことが、やはり理解される。
【0017】
本開示では、好中球のさらに有効かつ迅速な生成のための材料および方法を提供しようと努める。革新的プラットフォームでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで種々の腫瘍細胞に対する優れた特異的細胞毒性を提示し得る、「ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ（容易に入手可能な）」機能性好中球の大規模生成が可能となる、堅牢な段階特異的分化プロセスを利用する。重要なことには、このような好中球により、脳腫瘍細胞殺傷能の増強が実証される。その上、クロロトキシン（ＣＬＴＸ）Ｔ－ＣＡＲ修飾好中球により、正常細胞に対する最小限の細胞毒性が実証され、これにより、神経膠芽腫療法における将来の臨床適用に対する大きな可能性がもたらされる。好中球は、限定されないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）による腫瘍細胞へのナノ医薬の送達および固形がん（例えば、腫瘍）の標的免疫療法を含む、種々の臨床的治療適用において利用することができる。
【0018】
定義
次の用語および句は、以下に記載の意味を有するものとする。他に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。
次の用語および句は、以下に記載の意味を有するものとする。他に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【0019】
「約」の用語では、値または範囲、例えば、２０％以内、１０％以内、５％以内または１％以内の表示の値または表示の制限範囲における、ある程度の可変性を考慮することができる。
【0020】
「実質的」の用語では、値または範囲、例えば、８０％以内、９０％以内、９５％以内または９９％以内の表示の値または表示の制限範囲における、ある程度の可変性を考慮することができる。
【0021】
「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」の用語は、文脈上明らかに他に指示しない限り、１つまたは２つ以上を含むように使用する。「または」の用語は、他に指示しない限り、非排他的な「または」を指すために使用する。加えて、本明細書において利用し、他に定義しない表現または用語法は、単なる記載目的のためであり、制限のためではないことが理解されるべきである。節の見出しの任意の使用は、本文書の解読を助けることを意図し、所与の節の見出しの下に記載する開示に制限するものとして解釈されるべきではない。したがって、節の見出しに関連する情報は、この特定の節の内または外に存在し得る。その上、本文献において言及するすべての公表文献、特許および特許文書は、参照により個々に組み込むことと同様に、それらの全体を本明細書に参照により組み込む。本文書と、このように参照により組み込む文書との間で矛盾して使用する場合では、組み込んだ参照における使用は、本文書の使用の捕捉であると考えるべきであり、相容れない矛盾（例えば、本文書に記載の配列と配列表に記載の配列との間で）においては、本文書における使用により規制する。
【0022】
好中球の集団を製造する方法
ｈＰＳＣから好中球の集団を製造するための段階特異的プロセスを提供する。方法は、（ａ）ｈＰＳＣを調製するステップと、（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害物質でこのｈＰＳＣを刺激して、ＣＤ３４＋造血内皮細胞の集団を生成するステップと、（ｃ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質でこのＣＤ３４＋造血内皮細胞を刺激して、ＣＤ４５＋造血細胞の集団を生成するステップと、（ｄ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸受容体アゴニストでこのＣＤ４５＋造血細胞を刺激して、ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１６＋好中球の集団を得るステップとを含む。ｈＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含み得る。ＧＳＫ３β阻害物質は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４または類似の化学物質であり得る。ＴＧＦβ阻害物質は、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１または類似の化学物質であり得る。レチノイン酸受容体アゴニストは、ＡＭ８０、ＡＭ５０または類似の化学物質であり得る。ステップ（ｂ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の存在下で実行することができる。ステップ（ｃ）は、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の存在下で実行することができる。
ｈＰＳＣから好中球の集団を製造するための段階特異的プロセスを提供する。方法は、（ａ）ｈＰＳＣを調製するステップと、（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害物質でこのｈＰＳＣを刺激して、ＣＤ３４＋造血内皮細胞の集団を生成するステップと、（ｃ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質でこのＣＤ３４＋造血内皮細胞を刺激して、ＣＤ４５＋造血細胞の集団を生成するステップと、（ｄ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸受容体アゴニストでこのＣＤ４５＋造血細胞を刺激して、ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１６＋好中球の集団を得るステップとを含む。ｈＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含み得る。ＧＳＫ３β阻害物質は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４または類似の化学物質であり得る。ＴＧＦβ阻害物質は、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１または類似の化学物質であり得る。レチノイン酸受容体アゴニストは、ＡＭ８０、ＡＭ５０または類似の化学物質であり得る。ステップ（ｂ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の存在下で実行することができる。ステップ（ｃ）は、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の存在下で実行することができる。
【0023】
また、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）好中球の集団を製造するための段階特異的プロセスを提供する。「ＣＡＲ好中球」は、好中球の表面上にＣＡＲを発現するように分子生物学的方法により修飾した好中球である。ＣＡＲは、所望の標的、例えば、マトリックスメタロペプチダーゼ２（ＭＭＰ２）、例えば、神経膠腫、例えば、神経膠芽腫上のＭＭＰ２に対する所定の結合特異性を有するポリペプチドである。ＣＡＲは、他のドメイン、例えば、種々のシグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、スペーサーおよび／またはヒンジを含み得る。
【0024】
ＣＡＲ結合特異性に関する用語および句、例えば、「特異性により結合する」、「高い親和性で結合する」、または「特異的に」もしくは「選択的に」結合する、の使用は、好中球上のＣＡＲ、例えば、ＣＬＴＸを含むＣＡＲと、標的細胞、例えば、がん細胞、例えば、腫瘍が含まれる細胞または他の異常細胞上に存在する標的分子、例えば、タンパク質、例えば、受容体、酵素（例えば、ＭＭＰ２）または細胞表面マーカーとの間の結合反応を示す。したがって、標的細胞、例えば、がん細胞または他の異常細胞上に存在する標的分子とのＣＡＲ好中球の結合に貢献するか、容易とするか、または促進する結合条件下では、ＣＡＲ好中球は、著しくは結合しないとしても、正常な健常細胞上に存在する他の分子、例えば、タンパク質、例えば、受容体、酵素および細胞表面マーカーに対してである。特異的結合または高親和性による結合は、他の任意の非標的分子の結合よりも少なくとも２５％高く、より頻繁には、少なくとも５０％高く、最も頻繁には、少なくとも１００％（２倍）高く、正常には、少なくとも１０倍高く、より正常には、少なくとも２０倍高く、最も正常には、少なくとも１００倍高くなり得る。
【0025】
ＣＡＲは、好ましくは、組換えＤＮＡ技術を使用して生成するが、当技術分野において公知の任意の手段により生成することができる。ＣＡＲのいくつかの領域をコードする核酸配列は、分子クローニングの標準技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助ライゲーション、部位特異的変異誘発、および遺伝子編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ等）により調製して、完全コード配列に構築することができる。このような技術は、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)およびGreen and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012)に詳細に記載されており、これらはともに、その全体（集合的に、「プロトコール」）を参照により本明細書に組み込む。
【0026】
生じたコード領域は、発現ベクターに挿入した後、レシピエント細胞、例えば、ｈＰＳＣに導入することができる。「ベクター」の用語は、目的の核酸を保有、内包または発現するように機能する任意の核酸を意味する。核酸ベクターは、特殊機能、例えば、発現、パッケージング、シュードタイピングまたは形質導入を有し得る。また、ベクターは、クローニングまたはシャトルベクターとしての使用のために構成する場合、操作機能を有し得る。ベクターの構造は、生成するのに実現可能かつ特定の使用に望ましい、任意の所望の形態を含み得る。このような形態は、例えば、環状形態、例えば、プラスミドおよびファージミド、ならびに直鎖状または分枝鎖状形態を含み得る。核酸ベクターは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡからなるだけでなく、ヌクレオチド誘導体、類似体または模倣体を部分的または完全に含み得る。このようなベクターは、天然源から得るか、組換えまたは化学合成により生成することができる。
【0027】
ＣＡＲ発現は、任意の適するプロモーター、例えば、本明細書において例示するものを使用して駆動することができる。プロモーターの例としては、種々の構成的および誘導性プロモーター、例えば、構成的ＣＡＧプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＵＢＣ構成的プロモーターまたはＴｅｔｏｎ－３Ｇ誘導性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0028】
融合タンパク質における認識領域の配置は一般に、細胞外部領域の呈示が達成されるように配置する。望ましい場合は、ＣＡＲは、さらなるエレメント、例えば、融合タンパク質を細胞表面へ適切に輸送することを確実とするシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）、融合タンパク質を内在性膜タンパク質（例えば、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン）として維持することを確実とする膜貫通ドメイン、ならびに認識領域に可動性を付与し、標的部位への強力な結合が可能となるヒンジおよび／またはスペーサードメインをも含み得る。
【0029】
当技術分野において公知であり、本明細書において例示する任意の適する方法、例えば、プラスミドを使用して、ｈＰＳＣ内に、ＣＡＲコード核酸を送達することができる。方法の例としては、ヌクレオフェクション／エレクトロポレーション、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＳｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、ＳＴＥＭ００００１）もしくは類似のトランスフェクション試薬によるトランスフェクション、またはレンチウイルス、レトロウイルス、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、ｐｉｇｇｙｂａｃｋ（非ウイルス媒介ＣＡＲ遺伝子送達系を含むトランスポゾン／トランスポゼース系）もしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達が挙げられるが、これらに限定されない。プラスミドおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用する方法を例示し、トランスポゾン、リボヌクレオタンパク質および二本鎖ＤＮＡをも使用して、ｈＰＳＣゲノム内の、例えば、ＡＡＶＳ１セーフハーバー部位またはＣＬＹＢＬ部位にＣＡＲを組み込むことができる。
【0030】
核酸は、別の核酸配列と機能的に関連するように配置される場合、「動作可能に結合」する。例えば、プレ配列または分泌性リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に結合し、プロモーターまたはエンハンサーは、翻訳を容易とするように配置する場合、コード配列に動作可能に結合する。一般には、「動作可能に結合」は、結合するＤＮＡ配列が近接していることを意味し、リーダーの場合では、近接し、リーディング相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、必ずしも近接していなくてはならないとは限らない。結合は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成し得る。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の慣例に従って使用し得る。
【0031】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）好中球の集団を製造するための段階特異的プロセスは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換えにより、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）においてアデノ随伴ウイルスＳ１（ＡＡＶＳ１）プラスミドのＡＡＶＳ１セーフハーバー部位に、ＣＡＲ発現遺伝子構築物をノックインするステップと、（ｂ）標的化に成功した単一細胞由来ｈＰＳＣコロニーまたはｈＰＳＣ細胞混合物を単離して、安定なＣＡＲ発現ｈＰＳＣ細胞株を得るステップと、（ｃ）この安定なＣＡＲ発現ｈＰＳＣ細胞株からｈＰＳＣを調製するステップと、（ｄ）ＧＳＫ３β阻害物質でこのｈＰＳＣを刺激して、ＣＤ３４＋造血内皮細胞の集団を生成するステップと、（ｅ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質でこのＣＤ３４＋造血内皮細胞を刺激して、ＣＤ４５＋造血細胞の集団を生成するステップと、（ｆ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸受容体アゴニストでこのＣＤ４５＋造血細胞を刺激して、ＣＡＲ好中球の集団を得るステップとを含む。プロセスは、（ａ’）ＣＡＲ発現遺伝子構築物を調製するステップと、（ａ’’）ＡＡＶＳ１プラスミドを構築するステップとの初期ステップをさらに含み得る。ＣＡＲは、ＣＬＴＸ、ＣＤ４の膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζの細胞内ドメインを含み得る。ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。ＣＣＡＲは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有し得る。ｈＰＳＣは、ｈＥＳＣ、例えば、Ｈ９またはＨ１、およびｉＰＳＣ、例えば、６－９－９または１９－９－１１を含み得る。ＧＳＫ３β阻害物質は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４または類似の化学物質であり得る。ＴＧＦβ阻害物質は、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１または類似の化学物質であり得る。レチノイン酸受容体アゴニストは、ＡＭ８０、ＡＭ５０または類似の化学物質であり得る。ステップ（ｂ）は、ＶＥＧＦの存在下で実行することができる。ステップ（ｃ）は、ＳＣＦおよびＦＬＴ３Ｌの存在下で実行することができる。
【0032】
（ａ）ＣＡＲ発現遺伝子を含むＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドを構築するステップと、（ｂ）ヌクレオフェクション／エレクトロポレーションによりヒト多能性幹細胞内にＰｉｇｇｙＢａｃプラスミドを送達するステップと、（ｃ）標的化に成功した単一細胞由来ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）コロニーまたはｈＰＳＣ細胞混合物を単離して、安定なＣＡＲ発現ｈＰＳＣ株を得るステップと、（ｄ）ｈＰＳＣから好中球の集団を製造するための上記の段階特異的プロセスに従ってＣＡＲ発現好中球を生成するステップとを含む、ｈＰＳＣからＣＡＲ好中球の集団を製造するためのプロセスをさらに提供する。ｈＰＳＣは、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを含み得る。ｈＥＳＣは、Ｈ９、Ｈ１または他のヒト胚性幹細胞を含み得る。ｉＰＳＣは、６－９－９、１９－９－１１または他の誘導多能性幹細胞を含み得る。ＣＡＲは、ＣＬＴＸ、ＣＤ４の膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζの細胞内ドメインを含み得る。ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。ＣＡＲは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有し得る。
【0033】
配列番号１は、ＣＬＴＸ ＮＫ－ＣＡＲアミノ酸配列である。
【0034】
【化1】
【0035】
配列番号２は、ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲアミノ酸配列である。
【0036】
【化2】
【0037】
配列番号３は、ＩＬ－１３ Ｔ－ＣＡＲアミノ酸配列である。
【0038】
【化3】
【0039】
配列番号８は、ＣＬＴＸ ＣＤ３２ＦｃγＲ－ＣＡＲアミノ酸配列である。
【0040】
【化4】
【0041】
配列番号９は、抗ＰＳＭＡナノボディＴ－ＣＡＲアミノ酸配列である。
【0042】
【化5】
【0043】
配列番号１０は、抗ＰＳＭＡ Ｊ－５９１－ｓｃＦＶ Ｔ－ＣＡＲアミノ酸配列である。
【0044】
【化6】
【0045】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ならびに一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のこのポリマーおよびこの補体を指す。この用語は、公知のヌクレオチド類似体もしくは修飾骨格残基、または合成、天然、非天然であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の方法で代謝される結合を含む核酸を包含する。
【0046】
配列番号１～３および８～１０の対応するタンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号１１～１６）は、主張するものであり、本開示の範囲内に含まれる。
【0047】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」の用語は、アミノ酸残基のポリマー、ポリペプチド、もしくはポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドを指すために（他に明示的に示さない限り）本明細書において互換的に使用する。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用する。
【0048】
さらに、本開示では、ｈＰＳＣへのＣＡＲの導入の後、好中球への分化を例示するが、ｈＰＳＣ由来造血内皮、造血前駆細胞および好中球、例えば、本明細書に記載の方法に従って生成されたものは、直接標的化してＣＡＲ好中球を生成することが可能であることが当業者により理解および認識される。
【0049】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、生物医学的研究の多くの分野において、単球を駆動するために日常的に使用する。しかし、顆粒球採取のロジスティックは複雑である。例えば、ドナーは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）またはステロイドで前処置する必要を有する（Gea-Banacloche, Granulocyte transfusions: A concise review for practitioners. Cytotherapy (2017). doi:10.1016/j.jcyt.2017.08.012；Adrover et al., Immunity 50: 390-402.e10 (2019)；およびGurlek Gokcebay et al., Granulocyte transfusions in the management of neutropenic fever: A pediatric perspective. Transfusion and Apheresis Science (2018). doi:10.1016/j.transci.2018.02.009）。加えて、十分な数の良質な細胞を採取することは困難であり、保存時間は、およそ２４時間に制限される（Ginhoux et al., Developmental pathways and tissue homeostasis, Nature Reviews Immunology (2014). doi:10.1038/nri3671）。このような因子により、好中球減少症の治療に対する顆粒球輸注の有用性が妨げられ、臨床試験において不確定な結果が観察される一因となることが多い（Brok-Volchanskaya et al., Stem Cell Reports 13: 1099-1110 (2019)；およびCao et al., Stem Cell Reports 12: 1281-1297 (2019)）。
【0050】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、代替的かつ拡張可能な顆粒球源として作用する可能性をもたらす（Seaki et al., A feeder-free and efficient production of functional neutrophils from human embryonic stem cells, Stem Cells (2009). doi:10.1634/stemcells.2007-0980）。これまでの研究によってｈＰＳＣによる好中球生成の実現可能性が実証されたが、血清およびフィーダーまたは胚様体形成の利用により、これらの広範な適用が制限されている（Trump et al., Stem Cells Transl Med 8: 557-567 (2019)）。
【0051】
これまでの研究では、血管内皮カドヘリン＋（ＶＥＣａｄ＋）により標識された造血内皮細胞（ＨＥ）ならびに造血マーカーＣＤ４３およびＣＤ４５を発現するＣＤ３４＋細胞および初期造血前駆細胞にｈＰＳＣが分化可能であることが示された。このような造血細胞により、広範な赤血球およびミエロイド分化能を有する赤血球ミエロイド前駆細胞（ＥＭＰ）様細胞が生じ得る（Ivanovs et al., Development 144: 2323-2337 (2017)；Dou et al., Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development, Nat Cell Biol (2016). doi:10.1038/ncb3354；およびHwang et al., Controlled differentiation of stem cells. Adv Drug Deliv Rev (2008). doi:10.1016/j.addr.2007.08.036）。その後、ミエロイド前駆細胞は、Ｇ－ＣＳＦおよびレチノイン酸アゴニストＡｍ５８０の存在下で成熟好中球に分化し得る。
【0052】
改変好中球細胞株
ｈＰＳＣ由来の改変好中球細胞株をなおさらに提供する。実施形態では、改変好中球細胞株は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＡＲを含む。別の実施形態では、改変好中球細胞株は、ＣＬＴＸ、ＣＤ４の膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζの細胞内ドメインを含むＣＡＲ、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＡＲを含む。また別の実施形態では、改変好中球細胞株は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＡＲを含む。
ｈＰＳＣ由来の改変好中球細胞株をなおさらに提供する。実施形態では、改変好中球細胞株は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＡＲを含む。別の実施形態では、改変好中球細胞株は、ＣＬＴＸ、ＣＤ４の膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζの細胞内ドメインを含むＣＡＲ、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＡＲを含む。また別の実施形態では、改変好中球細胞株は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＡＲを含む。
【0053】
配列番号１～３は、参照ポリペプチド配列と考えることができる。換言すれば、アミノ酸配列における一部の差異（例えば、最大１０％、例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）（例えば、保存的および中性のアミノ酸置換）が、許容され、これにより類似の結果が達成され得る。一部の場合では、アミノ酸配列における一部の差異により、より良い結果が達成され得る。参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインメントし、ギャップを導入して、必要に応じて、配列同一性の一部としていかなる保存的置換をも考慮せずに最大のパーセント配列同一性を達成した後、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一の候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義する。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的におけるアラインメントは、当分野の技術の範囲内の種々の方法、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較する完全長配列にわたって最大アラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントに適切なパラメータを決定することができる。
【0054】
医薬組成物
医薬組成物をまたなおさらに提供する。医薬組成物は、上記の方法に従って得られた単離ＣＡＲ好中球の集団または上記の細胞株由来の好中球の集団を含む。医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
医薬組成物をまたなおさらに提供する。医薬組成物は、上記の方法に従って得られた単離ＣＡＲ好中球の集団または上記の細胞株由来の好中球の集団を含む。医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【0055】
「単離」の用語は、その元来の環境、例えば、それが天然である場合、天然環境から物質を除去することを意味する。例えば、生体内に存在する天然好中球は、単離されたものではないが、天然系に共存する物質の一部または全部から分離した同一の好中球は、単離されたものである。
【0056】
「薬学的に許容される」の用語およびこの文法的異型は、これらが組成物、担体、希釈剤、試薬等を指す場合、互換的に使用し、合理的なリスク対効果比に釣り合うように、過度の毒性、刺激作用、アレルギー応答および／または望ましくない生理学的作用の生成、例えば、悪心、眩暈、急性胃蠕動等を生じずに、物質を哺乳動物にまたは哺乳動物に対して投与可能であることを示す。換言すれば、これは、生物学的またはその他により不適当ではない物質である。すなわち、物質は、例えば、望ましくないいかなる生物学的作用をも生じることなく、または医薬組成物の他の成分のいずれかと著しく有害に相互作用することなく、ＣＡＲ好中球とともに個体に投与し得る。
【0057】
「薬学的に許容される担体」の用語は、当技術分野において認識されており、組成物またはこの成分の保有または輸送に関与する薬学的に許容される物質、組成物または媒体、例えば、液体または固体のフィラー、希釈剤、賦形剤、ソルベントまたは封入物質を指す。各担体は、対象組成物およびこの成分と適合し、患者に対して非傷害性であるという意味において「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として作用し得る物質の一部の例としては、（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース、（２）デンプン、例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン、（３）セルロースおよびこの誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース、（４）トラガント粉末、（５）モルト、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス、（９）油、例えば、ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油、（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール、（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール、（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、（１３）アガー、（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質不含水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エタノール、（２０）リン酸緩衝液、ならびに（２１）医薬製剤に利用する非毒性の適合する他の物質が挙げられる。
【0058】
利用する特定の製剤は、特定の投与経路に少なくとも部分的に依存する。例えば、全身的、例えば、静脈内投与に適する製剤は、頭蓋内投与に適する製剤とは異なり得る。このような修飾形態は、当業者の技術の範囲内である。
【0059】
治療の方法
また、それを必要とする対象における、がんを治療する方法を提供する。方法は、治療有効量の（ａ）上記の方法に従って得られた好中球の集団、もしくはこれおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、または（ｂ）上記の細胞株由来の好中球の集団、もしくはこれおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む。
また、それを必要とする対象における、がんを治療する方法を提供する。方法は、治療有効量の（ａ）上記の方法に従って得られた好中球の集団、もしくはこれおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、または（ｂ）上記の細胞株由来の好中球の集団、もしくはこれおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む。
【0060】
がんは、任意のがんであり得る。「がん」は、体の他の部分に浸潤または拡散（すなわち、転移）する可能性を有する細胞増殖の異常に関与する疾患群を含み得るが、これらに限定されない。例としては、脳、甲状腺、肺、膵臓、腎臓、胃のがん、消化管間質腫瘍、子宮内膜、乳房、子宮頚部、卵巣、結腸、前立腺のがん、白血病、リンパ腫、他の血液関連がん、または頭頸部がんが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、治療するがんは、腫瘍である。特定の実施形態では、がんは、悪性である。がんは、脳腫瘍であり得る。脳腫瘍は、神経膠腫であり得る。神経膠腫は、神経膠芽腫であり得る。がんは、タンパク質マトリックスメタロペプチダーゼ２を発現し得る。好中球の集団またはこれを含む医薬組成物は、全身的または頭蓋内に投与することができる。
【0061】
方法により、全身的およびオフターゲットの毒性を低下、さらに実質的に低下させることができる。「オフターゲット毒性」は、臓器もしくは組織の損傷、または医師もしくは対象を治療する他の個人にとって望ましくない、対象の体重の減少、あるいは治療する医師に対する潜在的有害指標である、対象に対する他の任意の作用を意味する（例えば、Ｂ細胞形成不全、発熱、血圧の低下または肺水腫）。
【0062】
「治療（treat、treating、treatedおよびtreatment）」の用語（疾患または症状、例えば、がんに関する）は、有益または所望の結果、例えば、臨床結果を得るための方法を記載するために使用し、この結果は、疾患と関連する症状の改善、疾患の治癒、疾患の重症度の低減、疾患に罹患しているヒトの生活の質の向上、生存の延長および／または予防的治療の１つまたは複数を含み得るが、これらに限定されない。加えて、がんに言及する場合、特に、「治療（treat、treating、treatedまたはtreatment）」の用語は、腫瘍サイズの低下、腫瘍の完全もしくは部分的除去（例えば、完全もしくは部分的奏効）、疾患の安定、がんの増悪の予防（例えば、無増悪生存）、または医師によってがんの治療的または予防的処置であるとされる、がんに対する他の任意の作用を意味し得る。より詳細には、治癒的治療は、徴候／症候の軽減、回復および／または除去、低減および／または安定（例えば、さらなる進行期に増悪しないこと）ならびに特定の障害の徴候／症候の増悪における遅延のいずれかを指す。予防的治療は、次：発病の停止、発症リスクの低下、発症率の低下、発病の遅延、発症の減少および特定の障害の症候の発病時間の延長のいずれかを指す。治療の望ましい作用としては、疾患の発生または再発の予防、症候の軽減、疾患の直接または間接的な任意の病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患増悪率の低下、病状の回復または緩和、および寛解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、組成物は、疾患および／もしくは腫瘍の発症を遅延させるか、または疾患の増悪および／もしくは腫瘍の増殖を遅延（もしくはさらに停止）させるために使用する。
【0063】
「患者」または「対象」の用語は、ヒトおよび非ヒト動物、例えば、ペット（イヌおよびネコ等）ならびに家畜を含む。家畜は、食物生産のために飼育した動物である。治療する対象は、好ましくは、哺乳動物、特に、ヒトである。
【0064】
本明細書において使用する場合、「投与」の用語は、好中球およびこれを含む医薬組成物を患者に導入するすべての手段を含む。例としては、経口（ｐｏ）、非経口、全身／静脈内（ｉｖ）、筋肉内（ｉｍ）、皮下（ｓｃ）、経皮、胸骨内、動脈内、腹腔内、硬膜外、尿道内、鼻腔内、頬側、眼内、舌下、膣内、直腸内等が挙げられるが、これらに限定されない。脳への投与経路は、実質内、脳室内、頭蓋内等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0065】
非経口投与の例示的手段は、針（マイクロニードルを含む）注射器、針なし注射器および注入技術、ならびに当技術分野において認識される他の任意の非経口投与手段を含む。非経口製剤は、典型的には、賦形剤、例えば、塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくは、約３～約９の範囲のｐＨ）を含み得る水溶液である。無菌条件下の非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技術を使用して容易に達成し得る。
【0066】
「治療有効量」の用語は、本明細書において使用する場合、研究者、獣医師、医学博士または他の臨床医により探求される、組織系、動物またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘発する改変好中球の量を指し、この反応は、治療する疾患または障害の症候の軽減を含む。一態様では、治療有効量は、任意の医学的治療に適用可能な合理的リスク対効果比により疾患または疾患の症候を治療または軽減し得る量である。しかし、改変好中球の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内において主治医により決定し得ることが理解されるべきである。任意の特定の患者のための特定の治療有効用量レベルは、治療する障害および障害の重症度；利用する特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的健康、性別および食事；投与時間および経路；治療期間；改変好中球と組み合わせてまたは同時に使用する薬物；ならびに通常の研究者、獣医師、医学博士または他の臨床医に周知の類似の因子を含む、多様な因子に依存する。したがって、所与の単位剤形に含まれる改変好中球の絶対量は、広く変動し、対象の年齢、体重および健康状態、ならびに投与方法のような因子に依存し得る。
【0067】
投与経路に応じて、広範な許容できる投薬量を本明細書において検討する。投薬量は、単一または分割であってもよく、ｑ．ｄ．（１日１回）、ｂ．ｉ．ｄ．（１日２回）、ｔ．ｉ．ｄ．（１日３回）またはさらに１日置き、週１回、月１回、四半期に１回等を含む多種多様なプロトコールに従って投与し得る。このような場合のそれぞれでは、本明細書に記載の治療有効量は、投与プロトコールの決定に応じて、投与の都度、あるいは１日、１週、１月または１四半期の総用量に対応することが理解される。
【0068】
がん、例えば、脳腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、もしくはマトリックスメタロペプチダーゼ２（ＭＭＰ２）を発現するがん、または他の疾患もしくは障害を治療するための改変好中球の投与した投薬量は、当業者により実行される投薬量およびスケジュールした治療計画による。典型的には、用量＞１０９細胞／患者を、養子細胞移入療法を受ける患者に投与する。特に、本明細書に提供する開示の詳細を考慮すれば、有効量または用量の決定は十分、当業者の能力の範囲内である。
【0069】
対象に投与する改変好中球は、形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞を約１×１０５～約１×１０１５または１×１０６～約１×１０１５細胞を含み得る。種々の実施形態では、約１×１０５～約１×１０１０、約１×１０６～約１×１０１０、約１×１０６～約１×１０９、約１×１０６～約１×１０８、約１×１０６～約２×１０７、約１×１０６～約３×１０７、約１×１０６～約１．５×１０７、約１×１０６～約１×１０７、約１×１０６～約９×１０６、約１×１０６～約８×１０６、約１×１０６～約７×１０６、約１×１０６～約６×１０６、約１×１０６～約５×１０６、約１×１０６～約４×１０６、約１×１０６～約３×１０６、約１×１０６～約２×１０６、約２×１０６～約６×１０６、約２×１０６～約５×１０６、約３×１０６～約６×１０６、約４×１０６～約６×１０６、約４×１０６～約１×１０７、約１×１０６～約１×１０７、約１×１０６～約１．５×１０７、約１×１０６～約２×１０７、約０．２×１０６～約１×１０７、約０．２×１０６～約１．５×１０７、約０．２×１０６～約２×１０７または約５×１０６細胞。
【0070】
対象に投与する改変好中球は、約１００万、約２００万、約３００万、約４００万、約５００万、約６００万、約７００万、約８００万、約９００万、約１千万、約１千１００万、約１千２００万、約１千２５０万、約１千３００万、約１千４００万または約１千５００万細胞を含み得る。細胞は、単回用量または複数回用量として投与することができる。改変好中球は、対象体重１ｋｇあたりのＣＡＲ発現好中球数で投与することができる。
【0071】
キット
最終的には、ｈＰＳＣから好中球を調製するためのキットを提供する。キットは、（ａ）任意選択で、培地の一部として、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害物質、（ｂ）任意選択で、培地の一部として、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、（ｃ）任意選択で、培地の一部として、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質、（ｄ）任意選択で、培地の一部として、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）およびインターロイキン６（ＩＬ－６）、ならびに（ｅ）任意選択で、培地の一部として、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸アゴニストを含む。キットは、（ｃ）および（ｄ）においてＳＣＦおよびＦｌｔ３：ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３／胎性肝臓キナーゼ２（Ｆｌｔ３）リガンド、ならびに（ｅ）においてＧｌｕｔａＭＡＸおよびＥｘＣｙｔｅをさらに含み得る。
最終的には、ｈＰＳＣから好中球を調製するためのキットを提供する。キットは、（ａ）任意選択で、培地の一部として、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害物質、（ｂ）任意選択で、培地の一部として、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、（ｃ）任意選択で、培地の一部として、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害物質、（ｄ）任意選択で、培地の一部として、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）およびインターロイキン６（ＩＬ－６）、ならびに（ｅ）任意選択で、培地の一部として、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）およびレチノイン酸アゴニストを含む。キットは、（ｃ）および（ｄ）においてＳＣＦおよびＦｌｔ３：ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３／胎性肝臓キナーゼ２（Ｆｌｔ３）リガンド、ならびに（ｅ）においてＧｌｕｔａＭＡＸおよびＥｘＣｙｔｅをさらに含み得る。
【0072】
ＧＳＫ３β阻害物質含有培地の例としては、ＤＭＥＭおよびＬａＳＲ基礎培地が挙げられるが、これらに限定されない。ＶＥＧＦ含有培地の例としては、ＬａＳＲ基礎培地およびＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＧＦβ阻害物質含有培地の例としては、ＬａＳＲ基礎培地およびＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３およびＩＬ－６を含む培地の例としては、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩおよびＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００が挙げられるが、これらに限定されない。Ｇ－ＣＳＦおよびＡＭ５８０を含む培地の例としては、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩおよびＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００が挙げられるが、これらに限定されない。キットは、ＳＣＦおよびＦＬＴ３Ｌ（例えば、上記のステップ（ｃ）および（ｄ）における使用のため）ならびに／またはＧｌｕｔａＭＡＸおよびＥｘＣｙｔｅ（例えば、上記のステップ（ｅ）における使用のため）をさらに含み得る。
【0073】
結果
化学的に定義した条件により機能性好中球の堅牢な生成が可能となる
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの造血前駆細胞誘導は、ｈＰＳＣから好中球を生成する第１のステップである（Brok-Volchanskaya et al., 2019a；Lachmann et al., 2015；Saeki et al., 2009；Sweeney et al., 2016；Trump et al., 2019）。多能性造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、内皮造血転換（ＥＨＴ）により大動脈－性腺－中腎（ＡＧＭ）領域の動脈脈管構造から生じる（Bertrand et al., 2010；Boisset et al., 2010；Kissa and Herbomel, 2010）。我々は、Ｗｎｔシグナル伝達の小分子活性化によりｈＰＳＣから同種ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋造血内皮細胞（ＨＥ）をこれまでに誘導した（図８Ａ～８Ｂ）（Bao et al., 2015；Lian et al., 2014）。重要なことには、生じたＨＥは、ＡＧＭの血管構造において発現し、ＡＧＭによるＨＳＣ生成に必要とされる転写因子であるＳＯＸ１７をも発現した（図８Ｂ～８Ｄ）（Clarke et al., 2013；Kim et al., 2007；Ng et al., 2016）。ＴＧＦβ阻害物質ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）の利用により（Bertrand et al., 2010；Boisset et al., 2010；Kissa and Herbomel, 2010）、ＥＨＴプロセスが促進されて、最終的造血マーカーＣＤ４４（Fidanza et al., 2019；Oatley et al., 2020）（図８Ｇ）およびＲＵＮＸ１ｃ（Ng et al., 2016）（図８Ｈ）を同時発現するＣＤ４５＋ＣＤ４３＋ＨＳＰＣが生成された（図８Ｅ～８Ｆ）。また、生じた１５日目のｈＰＳＣ由来ＨＳＰＣは、凍結融解後に高い生存率を維持した（図８Ｉ～８Ｊ）。
化学的に定義した条件により機能性好中球の堅牢な生成が可能となる
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの造血前駆細胞誘導は、ｈＰＳＣから好中球を生成する第１のステップである（Brok-Volchanskaya et al., 2019a；Lachmann et al., 2015；Saeki et al., 2009；Sweeney et al., 2016；Trump et al., 2019）。多能性造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、内皮造血転換（ＥＨＴ）により大動脈－性腺－中腎（ＡＧＭ）領域の動脈脈管構造から生じる（Bertrand et al., 2010；Boisset et al., 2010；Kissa and Herbomel, 2010）。我々は、Ｗｎｔシグナル伝達の小分子活性化によりｈＰＳＣから同種ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋造血内皮細胞（ＨＥ）をこれまでに誘導した（図８Ａ～８Ｂ）（Bao et al., 2015；Lian et al., 2014）。重要なことには、生じたＨＥは、ＡＧＭの血管構造において発現し、ＡＧＭによるＨＳＣ生成に必要とされる転写因子であるＳＯＸ１７をも発現した（図８Ｂ～８Ｄ）（Clarke et al., 2013；Kim et al., 2007；Ng et al., 2016）。ＴＧＦβ阻害物質ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）の利用により（Bertrand et al., 2010；Boisset et al., 2010；Kissa and Herbomel, 2010）、ＥＨＴプロセスが促進されて、最終的造血マーカーＣＤ４４（Fidanza et al., 2019；Oatley et al., 2020）（図８Ｇ）およびＲＵＮＸ１ｃ（Ng et al., 2016）（図８Ｈ）を同時発現するＣＤ４５＋ＣＤ４３＋ＨＳＰＣが生成された（図８Ｅ～８Ｆ）。また、生じた１５日目のｈＰＳＣ由来ＨＳＰＣは、凍結融解後に高い生存率を維持した（図８Ｉ～８Ｊ）。
【0074】
ミエロイド前駆細胞および好中球の分化を誘導するために、９日目からｈＰＳＣ由来ＨＳＰＣ培養物を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－３およびＩＬ－６で処理した（Cao et al., 2019）（図９Ａ）。種々の日に採取した浮遊ミエロイド前駆細胞は、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）およびマクロファージ（Ｍ）の両コロニー形成能を提示し（図９Ｂ～９Ｃ）、これらは、１２日目から１８日目に増加して、後に減少した。好中球の特異化を促進するために、１５日目のミエロイド前駆細胞を顆粒球ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）で処理した。予想どおり、Ｇ－ＣＳＦでは、ＧＭ－ＣＳＦと比較してＣＤ１４＋単球／マクロファージの数が有意に減少した（図９Ｄ～９Ｅ）。好中球分化に最適なミエロイド前駆細胞を同定するために、１２、１５および１８日目に採取した浮遊細胞を、ヒトＣＤ３４＋細胞による好中球生成を促進するレチノイン酸アゴニストであるＡＭ５８０とともにＧ－ＣＳＦ処理に供した（図９Ｆ）（Brok-Volchanskaya et al., 2019b；Li et al., 2016）。好中球分化の効率は、１５日目から２１日目に向上して、後に有意に減少し、これは、好中球の寿命が短いためであり得る（図９Ｇ～９Ｈ）。また、我々は、１５日目のミエロイド前駆細胞を、好中球分化のための最適条件としてＧ－ＣＳＦおよびＡＭ５８０による６日の処理によって同定し、このためこれを、その後の我々の実験に利用した（図１Ａ）。１２日目から動的形態学的変化が、造血系クラスターの出現とともに観察された（図１Ｂ）。生じた２１日目の好中球は、典型的な好中球形態を呈し（図９Ｉ）、ヒト末梢血（ＰＢ）から単離したこれらの対応物と比較して高発現レベルの、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１８およびＭＰＯを含む好中球特異的マーカーを示した（図１Ｃ）。
【0075】
ｈＰＳＣ由来好中球の機能を評価するために、我々は、食作用および化学遊走アッセイを実施した。初代のＰＢ好中球と同様に、ｈＰＳＣ由来好中球は、ｐＨｒｏｄｏ大腸菌（E. coli）生体粒子を効率的に貪食し（図１Ｄ）、トランズウェル（図１Ｅ）およびマイクロ流体技術（図１Ｆ）（Afonso et al., 2013）を使用する化学遊走モデルにおいて優れた遊出能を呈した。また、我々は、ｈＰＳＣ由来好中球による反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生を測定した。ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（phorbol 12-myristate 13-acetate、ＰＭＡ）に応答して、ｈＰＳＣ由来好中球は、ＰＢ好中球と匹敵するＲＯＳを生成した（図１Ｇ）。まとめると、我々は、１ｈＰＳＣあたり約２０好中球の収率を有する、ｈＰＳＣによる機能性好中球の堅牢な生成のための新規の化学的に定義されたフィーダーフリーのプラットフォームを確立し、これにより、好中球生物学の研究および好中球減少症の治療におけるこの適用可能性が強調された。
【0076】
ＡＡＶＳ１標的ＣＡＲノックインによってｈＰＳＣ由来好中球の抗腫瘍細胞毒性が向上する
健常ドナー由来の初代好中球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで種々のヒトがん細胞株に対する強力ながん殺傷活性を提示する（Yan et al., 2014）。したがって、我々は、ｈＰＳＣに由来する新規の好中球が、腫瘍細胞を直接殺傷することが可能であるかどうか、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現によって、標的免疫療法に対するこれらの抗腫瘍細胞毒性が増強可能かどうかを判定しようと探求した。好中球上でのＣＡＲの安定かつ均一な発現を達成するために、我々は、ヒト細胞における構成的導入遺伝子発現に広く使用される部位である、Ｈ９ｈＰＳＣの内因性ＡＡＶＳ１セーフハーバー部位内に（Smith et al., 2008）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換えによりＣＡＲ構築物を直接ノックインした（図２Ａ～２Ｈ、図１０Ａ～１０Ｆ）。３つの異なるＣＡＲ構築物：ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ（図２Ａ～Ｂ）、ＩＬ－１３－Ｔ－ＣＡＲ（図２Ｃ～２Ｄ）およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ（図１０Ａ～１０Ｂ）を、Ｔまたはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的膜貫通および細胞内ドメインを使用して設計した。ヌクレオフェクション後、ピューロマイシン耐性（ＰｕｒｏＲ）単一細胞由来ｈＰＳＣクローンを単離し、ＰＣＲにより遺伝子型決定を行った。ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ（図２Ａ～Ｂ）、ＩＬ－１３－Ｔ－ＣＡＲ（図２Ｃ～２Ｄ）およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ（図１０Ａ～１０Ｂ）について、一方のアレル（ヘテロ接合性）では、クローンのおよそ６０％（５つのうち３つ）、５８．３％（２４個のうち１４個）および７．７％（１３個のうち１つ）が、両アレル（ホモ接合性）では、およそ２０％（５つのうち１つ）、４．２％（２４個のうち１つ）および２３．１％（１３個のうち３つ）が、それぞれ標的化された。遺伝子修飾ｈＰＳＣ上での合成ＣＡＲの安定な発現が、ＣＬＴＸ－ＩｇＧ４およびＩＬ－１３断片のＲＴ－ＰＣＲ解析により確認された（図２Ｅ）。重要なことには、ＣＡＲ発現ｈＰＳＣでは、高発現レベルの多能性マーカーＳＳＥＡ－４およびＯＣＴ－４が保持された（図１０Ｃ～１０Ｄ）。
健常ドナー由来の初代好中球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで種々のヒトがん細胞株に対する強力ながん殺傷活性を提示する（Yan et al., 2014）。したがって、我々は、ｈＰＳＣに由来する新規の好中球が、腫瘍細胞を直接殺傷することが可能であるかどうか、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現によって、標的免疫療法に対するこれらの抗腫瘍細胞毒性が増強可能かどうかを判定しようと探求した。好中球上でのＣＡＲの安定かつ均一な発現を達成するために、我々は、ヒト細胞における構成的導入遺伝子発現に広く使用される部位である、Ｈ９ｈＰＳＣの内因性ＡＡＶＳ１セーフハーバー部位内に（Smith et al., 2008）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換えによりＣＡＲ構築物を直接ノックインした（図２Ａ～２Ｈ、図１０Ａ～１０Ｆ）。３つの異なるＣＡＲ構築物：ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ（図２Ａ～Ｂ）、ＩＬ－１３－Ｔ－ＣＡＲ（図２Ｃ～２Ｄ）およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ（図１０Ａ～１０Ｂ）を、Ｔまたはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的膜貫通および細胞内ドメインを使用して設計した。ヌクレオフェクション後、ピューロマイシン耐性（ＰｕｒｏＲ）単一細胞由来ｈＰＳＣクローンを単離し、ＰＣＲにより遺伝子型決定を行った。ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ（図２Ａ～Ｂ）、ＩＬ－１３－Ｔ－ＣＡＲ（図２Ｃ～２Ｄ）およびＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ（図１０Ａ～１０Ｂ）について、一方のアレル（ヘテロ接合性）では、クローンのおよそ６０％（５つのうち３つ）、５８．３％（２４個のうち１４個）および７．７％（１３個のうち１つ）が、両アレル（ホモ接合性）では、およそ２０％（５つのうち１つ）、４．２％（２４個のうち１つ）および２３．１％（１３個のうち３つ）が、それぞれ標的化された。遺伝子修飾ｈＰＳＣ上での合成ＣＡＲの安定な発現が、ＣＬＴＸ－ＩｇＧ４およびＩＬ－１３断片のＲＴ－ＰＣＲ解析により確認された（図２Ｅ）。重要なことには、ＣＡＲ発現ｈＰＳＣでは、高発現レベルの多能性マーカーＳＳＥＡ－４およびＯＣＴ－４が保持された（図１０Ｃ～１０Ｄ）。
【0077】
好中球の抗腫瘍細胞毒性に対するＣＡＲ発現の作用を決定するために、ＣＡＲ発現ｈＰＳＣをＣＡＲ好中球に分化させ（図１Ａ）、次いでこれを、神経膠芽腫（ＧＢＭ）Ｕ８７ＭＧ細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで種々のエフェクター対標的比により同時培養した。野生型または他のＣＡＲ発現好中球と比較すると、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、優れた腫瘍殺傷活性を呈した（図２Ｆ）。また、好中球は、細胞毒性ＲＯＳを放出して、標的細胞を殺傷する可能性があり（Yan et al., 2014）、種々の好中球におけるＲＯＳ産生の動態は、これらの腫瘍殺傷能の上昇と非常に一致し（図２Ｇ）、ＧＢＭ細胞に対する好中球媒介細胞毒性におけるＲＯＳの潜在的関与を示した。加えて、抗腫瘍細胞毒性の増強は、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球と、Ｕ８７ＭＧ細胞株、初代成人ＧＢＭ４３および小児ＳＪ－ＧＢＭ２細胞を含むＧＢＭ細胞との同時インキュベーションにおいてのみ観察され（図２Ｈ）、ＧＢＭに対するこれらの高特異性を示唆した。重要なことには、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球は、正常ｈＰＳＣまたはｈＰＳＣ由来細胞を殺傷せず（図１０Ｅ～１０Ｆ）、初代好中球が健常上皮細胞を殺傷しないというこれまでの報告と一致した（Yan et al., 2014）。まとめると、ｈＰＳＣ由来ＣＡＲ好中球は、標的がん細胞に対する抗腫瘍細胞毒性の増強およびさらなるＲＯＳの産生をｉｎ ｖｉｔｒｏで示し、標的免疫療法におけるこれらの可能性が強調された。
【0078】
ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、トロゴトーシスによって神経膠芽腫細胞を殺傷する
好中球による細胞毒性に、密接な好中球－腫瘍コンジュゲート形成が必要とされるため（Matlung et al., 2018）、ＣＡＲ好中球媒介抗腫瘍細胞毒性の根底にある機構を調査するために、直接的エフェクター標的相互作用を調べた。好中球と標的腫瘍細胞との間の免疫シナプスが、３０分の同時培養後に形成され、インキュベーション時間に比例して増加した（図３Ａ～３Ｂ）。予想どおり、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球と腫瘍細胞との間で、初代ＰＢおよびｈＰＳＣ好中球と比較してさらなるエフェクター標的相互作用が観察されたが（図３Ｂ）、ＣＡＲ好中球と正常ｈＰＳＣまたはｈＰＳＣ由来細胞との間で免疫シナプスは形成されず（図３Ｃ）、腫瘍細胞に対するこれらの特異性が強調された。生細胞イメージングによって、ＣＡＲ好中球が腫瘍細胞に活発に遊走し、標的細胞の細胞膜が破壊されることが明らかとなり、これは、同時インキュベーション後早くて３０分の破壊された細胞の出現、および予め添加した細胞質色素カルセインＡＭによる好中球取込みにより示された（図３Ｄ～３Ｅ）。これまでに報告された好中球トロゴトーシス、好中球の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するトロゴサイトーシス関連腫瘍壊死と一致して（Matlung et al., 2018）、好中球は、標的細胞とのコンジュゲート後に腫瘍細胞膜断片を貪食し、腫瘍細胞死を誘導した（図３Ｄ～３Ｅ）。その上、ＲＯＳ放出の動力学は、好中球トロゴサイトーシスの動態と十分に一致し（図３Ｆ）、ＲＯＳおよびトロゴサイトーシスの好中球媒介腫瘍細胞殺傷における顕著な役割を示唆した。まとめると、これまでの報告と一致して（Matlung et al., 2018；Yan et al., 2014）、我々の結果によって、ｈＰＳＣ由来好中球が、標的細胞による免疫シナプス形成後にトロゴトーシスおよびＲＯＳ放出により腫瘍細胞を殺傷可能であることが実証された（図３Ｇ）。
好中球による細胞毒性に、密接な好中球－腫瘍コンジュゲート形成が必要とされるため（Matlung et al., 2018）、ＣＡＲ好中球媒介抗腫瘍細胞毒性の根底にある機構を調査するために、直接的エフェクター標的相互作用を調べた。好中球と標的腫瘍細胞との間の免疫シナプスが、３０分の同時培養後に形成され、インキュベーション時間に比例して増加した（図３Ａ～３Ｂ）。予想どおり、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球と腫瘍細胞との間で、初代ＰＢおよびｈＰＳＣ好中球と比較してさらなるエフェクター標的相互作用が観察されたが（図３Ｂ）、ＣＡＲ好中球と正常ｈＰＳＣまたはｈＰＳＣ由来細胞との間で免疫シナプスは形成されず（図３Ｃ）、腫瘍細胞に対するこれらの特異性が強調された。生細胞イメージングによって、ＣＡＲ好中球が腫瘍細胞に活発に遊走し、標的細胞の細胞膜が破壊されることが明らかとなり、これは、同時インキュベーション後早くて３０分の破壊された細胞の出現、および予め添加した細胞質色素カルセインＡＭによる好中球取込みにより示された（図３Ｄ～３Ｅ）。これまでに報告された好中球トロゴトーシス、好中球の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するトロゴサイトーシス関連腫瘍壊死と一致して（Matlung et al., 2018）、好中球は、標的細胞とのコンジュゲート後に腫瘍細胞膜断片を貪食し、腫瘍細胞死を誘導した（図３Ｄ～３Ｅ）。その上、ＲＯＳ放出の動力学は、好中球トロゴサイトーシスの動態と十分に一致し（図３Ｆ）、ＲＯＳおよびトロゴサイトーシスの好中球媒介腫瘍細胞殺傷における顕著な役割を示唆した。まとめると、これまでの報告と一致して（Matlung et al., 2018；Yan et al., 2014）、我々の結果によって、ｈＰＳＣ由来好中球が、標的細胞による免疫シナプス形成後にトロゴトーシスおよびＲＯＳ放出により腫瘍細胞を殺傷可能であることが実証された（図３Ｇ）。
【0079】
ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、ＭＭＰ２により神経膠芽腫に特異的に結合する
腫瘍細胞に対するＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ増強細胞毒性の根底にある分子機構をさらに調査するために、我々は、一体型の誘導性Ｃａｓ１３ｄ媒介遺伝子ノックダウンプラットフォームを実行して（図４Ａ）、塩素イオンチャネル（ＣＬＣＮ３）、リン脂質タンパク質アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）を含む（Wang et al., 2020a）、ＣＬＴＸ結合と関連する膜タンパク質を決定した。ピューロマイシン選択の後、トランスフェクトした神経膠芽腫細胞のおよそ７８％が、ｅＧＦＰ発現により示すように、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）の存在下でＣａｓ１３ｄを発現した（図１１Ａ～１１Ｂ）。ＲＴ－ＰＣＲ解析では、Ｕ８７ＭＧ ＧＢＭ細胞におけるＣＬＣＮ３（図４Ｂ）、ＡＮＸＡ２（図４Ｃ）およびＭＭＰ２（図４Ｄ）のノックダウンの成功が確認された。注目すべきことには、ＣＬＣＮ３またはＡＮＸＡ２ではなく、ＭＭＰ２のノックダウンにより、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球媒介腫瘍細胞殺傷およびＲＯＳ生成が有意に減少した（図４Ｂ～４Ｄ）。ＣＡＲ好中球とＭＭＰ２欠損腫瘍細胞との間の免疫シナプス形成の実質的減少も観察された（図１１Ｃ）。このような知見により、膜タンパク質ＭＭＰ２が、腫瘍細胞を殺傷するための好中球のＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ認識および活性化に必要とされることが実証される。ヒト正常組織上でのＭＭＰ２発現がごくわずかであることを考慮すると（Itoh, 2015）、これは、将来的臨床適用におけるＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球の安全性を示唆する。
腫瘍細胞に対するＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ増強細胞毒性の根底にある分子機構をさらに調査するために、我々は、一体型の誘導性Ｃａｓ１３ｄ媒介遺伝子ノックダウンプラットフォームを実行して（図４Ａ）、塩素イオンチャネル（ＣＬＣＮ３）、リン脂質タンパク質アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）を含む（Wang et al., 2020a）、ＣＬＴＸ結合と関連する膜タンパク質を決定した。ピューロマイシン選択の後、トランスフェクトした神経膠芽腫細胞のおよそ７８％が、ｅＧＦＰ発現により示すように、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）の存在下でＣａｓ１３ｄを発現した（図１１Ａ～１１Ｂ）。ＲＴ－ＰＣＲ解析では、Ｕ８７ＭＧ ＧＢＭ細胞におけるＣＬＣＮ３（図４Ｂ）、ＡＮＸＡ２（図４Ｃ）およびＭＭＰ２（図４Ｄ）のノックダウンの成功が確認された。注目すべきことには、ＣＬＣＮ３またはＡＮＸＡ２ではなく、ＭＭＰ２のノックダウンにより、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球媒介腫瘍細胞殺傷およびＲＯＳ生成が有意に減少した（図４Ｂ～４Ｄ）。ＣＡＲ好中球とＭＭＰ２欠損腫瘍細胞との間の免疫シナプス形成の実質的減少も観察された（図１１Ｃ）。このような知見により、膜タンパク質ＭＭＰ２が、腫瘍細胞を殺傷するための好中球のＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ認識および活性化に必要とされることが実証される。ヒト正常組織上でのＭＭＰ２発現がごくわずかであることを考慮すると（Itoh, 2015）、これは、将来的臨床適用におけるＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球の安全性を示唆する。
【0080】
次いで、我々は、ＭＭＰ２発現腫瘍細胞に結合後の活性化好中球における下流の細胞内シグナル伝達を調べた。初代好中球は、トロゴトーシスにより腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を呈し、このトロゴトーシスは、Ｆｃγ受容体およびこの下流のシグナル伝達経路により媒介され、チロシンキナーゼＳｙｋを含む（Matlung et al., 2018）。ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、ＧＢＭ刺激時に、ＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲを有するこれらの対応物と比較して、Ｓｙｋのより強力なリン酸化活性化（ｐ－Ｓｙｋ）を呈した（図４Ｅ）。注目すべきことには、リンパ球媒介細胞毒性に関与する鍵となるシグナル伝達媒介因子である（Li et al., 2018）細胞外シグナル制御キナーゼ（Ｅｒｋ）１／２（ｐ－Ｅｒｋ１／２）の比率の有意な上昇も、我々のＧＢＭ刺激ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球において観察された。これは、ＣＡＲｈＰＳＣ－ＮＫ細胞における細胞内シグナル伝達を暗示する（Li et al., 2018）、活性化好中球におけるＳｙｋ－ｖａｖ１－Ｅｒｋ経路の潜在的活性化を示す（図４Ｆ）。
【0081】
ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球はｉｎ ｖｉｔｒｏでの生体模倣腫瘍モデルにおいて高い遊出および抗腫瘍細胞毒性活性を呈する
ＣＡＲ好中球の活性をさらに評価するために、我々は、ヒト脳微小血管内皮細胞を使用してトランズウェルに基づく血液脳関門（ＢＢＢ）モデルを実行した（図５Ａ）。ＣＡＲ発現および野生型ｈＰＳＣ好中球が、Ｎ－ホルミルメチオニン－ロイシル－フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）に応答してＢＢＢを越える類似の遊出活性を呈する一方で（図５Ｂ）、ＣＡＲ好中球により、遊走後により高い腫瘍殺傷能が実証された（図５Ｃ）。その上、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、炎症性腫瘍細胞に応答してＢＢＢを越えるこれらの第２の輸送中に高い遊出能を保持し（図５Ｄ～５Ｅ）、これによりｉｎ ｖｉｖｏでの炎症およびがんの多くの態様が再現された。また、単純な３次元（３Ｄ）ＧＢＭモデルを実行して、高密度細胞外マトリックスネットワークおよび多様性腫瘍細胞亜型を含むｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍適所様微小環境を構築した（図５Ｆ）。野生型対照と比較した場合、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、３Ｄ腫瘍モデルにおいてより高い腫瘍浸潤（図５Ｇ）および腫瘍殺傷（図５Ｈ）活性を示した。まとめると、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、腫瘍適所模倣条件下で高い遊出能および抗腫瘍細胞毒性を保持し、標的免疫療法におけるこれらの適用可能性が強調された。
ＣＡＲ好中球の活性をさらに評価するために、我々は、ヒト脳微小血管内皮細胞を使用してトランズウェルに基づく血液脳関門（ＢＢＢ）モデルを実行した（図５Ａ）。ＣＡＲ発現および野生型ｈＰＳＣ好中球が、Ｎ－ホルミルメチオニン－ロイシル－フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）に応答してＢＢＢを越える類似の遊出活性を呈する一方で（図５Ｂ）、ＣＡＲ好中球により、遊走後により高い腫瘍殺傷能が実証された（図５Ｃ）。その上、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、炎症性腫瘍細胞に応答してＢＢＢを越えるこれらの第２の輸送中に高い遊出能を保持し（図５Ｄ～５Ｅ）、これによりｉｎ ｖｉｖｏでの炎症およびがんの多くの態様が再現された。また、単純な３次元（３Ｄ）ＧＢＭモデルを実行して、高密度細胞外マトリックスネットワークおよび多様性腫瘍細胞亜型を含むｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍適所様微小環境を構築した（図５Ｆ）。野生型対照と比較した場合、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、３Ｄ腫瘍モデルにおいてより高い腫瘍浸潤（図５Ｇ）および腫瘍殺傷（図５Ｈ）活性を示した。まとめると、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、腫瘍適所模倣条件下で高い遊出能および抗腫瘍細胞毒性を保持し、標的免疫療法におけるこれらの適用可能性が強調された。
【0082】
ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球はｉｎ ｖｉｖｏで神経膠芽腫に対する活性の増強を呈する
ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球のｉｎ ｖｉｖｏでの機能を決定するために、我々は、免疫不全マウスの脳へのルシフェラーゼ発現ＧＢＭ細胞５×１０５細胞の頭蓋内注射によりｉｎ ｓｉｔｕでの異種移植モデルを実行した（Wang et al., 2020b）。好中球は、腫瘍内（図６Ａ～６Ｅ）または静脈内（図７Ａ～７Ｈ）に投与して、これらのｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍殺傷活性を調べた。腫瘍内注射実験では、腫瘍細胞接種後３時間に腫瘍担持マウスに単回用量のＰＢＳ、野生型もしくはＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球またはｈＰＳＣ－ＮＫ細胞５×１０６細胞を腫瘍内投与した（図６Ａ）。生物発光イメージング（ＢＬＩ）を実施して、３日目の最初のイメージング後に毎週、腫瘍増殖を監視した（図６Ｂ）。ＰＢＳ処置マウスと比較した場合、好中球またはＮＫ細胞による処置によって、腫瘍量が有意に減少した（図６Ｂ～６Ｃ）。予想どおり、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ－ＮＫ細胞および好中球は、マウスにおいて野生型対照よりも高い抗腫瘍細胞毒性を呈し、これらのマウスは、安定な体重を維持した（図６Ｄ）。注目すべきことには、ＰＢＳ処置腫瘍担持マウスのうちの１匹は、レシピエント脳における腫瘍の異常増殖のため３０日目に死んだ（図６Ｂ、６Ｅ）。
ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球のｉｎ ｖｉｖｏでの機能を決定するために、我々は、免疫不全マウスの脳へのルシフェラーゼ発現ＧＢＭ細胞５×１０５細胞の頭蓋内注射によりｉｎ ｓｉｔｕでの異種移植モデルを実行した（Wang et al., 2020b）。好中球は、腫瘍内（図６Ａ～６Ｅ）または静脈内（図７Ａ～７Ｈ）に投与して、これらのｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍殺傷活性を調べた。腫瘍内注射実験では、腫瘍細胞接種後３時間に腫瘍担持マウスに単回用量のＰＢＳ、野生型もしくはＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球またはｈＰＳＣ－ＮＫ細胞５×１０６細胞を腫瘍内投与した（図６Ａ）。生物発光イメージング（ＢＬＩ）を実施して、３日目の最初のイメージング後に毎週、腫瘍増殖を監視した（図６Ｂ）。ＰＢＳ処置マウスと比較した場合、好中球またはＮＫ細胞による処置によって、腫瘍量が有意に減少した（図６Ｂ～６Ｃ）。予想どおり、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ－ＮＫ細胞および好中球は、マウスにおいて野生型対照よりも高い抗腫瘍細胞毒性を呈し、これらのマウスは、安定な体重を維持した（図６Ｄ）。注目すべきことには、ＰＢＳ処置腫瘍担持マウスのうちの１匹は、レシピエント脳における腫瘍の異常増殖のため３０日目に死んだ（図６Ｂ、６Ｅ）。
【0083】
次いで我々は、腫瘍担持マウスへの好中球５×１０６細胞の毎週の静脈内投与によるＣＡＲ好中球のｉｎ ｖｉｖｏでの活性を調べた（図７Ａ）。ＣＡＲ好中球のｉｎ ｖｉｖｏでの体内分布および輸送を追跡するために、我々は、Ｃｙ５で好中球を標識した後、全身的注射を行い、全身投与後１、５および２４時間に蛍光イメージングを実施した（図１２Ａ）。好中球は、１時間以内にマウスの全身を通行し、好中球注射後５時間以内に類似の体内分布を保持した（図１２Ｂ）。野生型好中球と比較して、ＣＡＲ好中球は、ＢＢＢを効率的に通過し、２４時間後にマウス脳のＧＢＭ異種移植片を通行した（図１２Ｃ～１２Ｄ）。静脈内投与試験中の実験マウス群にわたって、体重の有意な変化は観察されなかった（図１２Ｅ）。腫瘍内投与試験と一致して、ＣＡＲ好中球は、ＧＢＭ異種移植片のＢＬＩ解析（図７Ｂ～７Ｃ）ならびに明視野およびＨ＆Ｅ染色画像（図１２Ｆ）によるマウスにおいてＰＢＳおよび野生型対照よりも高い抗腫瘍細胞毒性を呈した。
【0084】
注目すべきことには、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球で処置した腫瘍担持マウスにより、ＣＡＲ－ＮＫ細胞で処置したマウスと比較して腫瘍量の有意な減少が実証され、マウスにおけるＢＢＢ通過およびＧＢＭ異種移植片浸透において好中球の優れた能力が示唆された。ＣＡＲ好中球とは対照的に、野生型ｈＰＳＣ好中球または末梢血（ＰＢ）好中球の毎週の投与により、ＣＡＲＮＫ細胞有り無しの脳における腫瘍の増殖が有意に促進されて、早くて２１日目に腫瘍担持マウスが死んだ（図７Ｄ）。ＧＢＭの神経外転移が珍しく（約２００の報告例（Rosen et al., 2018））、病態形成が未知である（Seo et al., 2012）にもかかわらず、ｅｘ ｖｉｖｏによる種々の臓器および／または組織のＢＬＩ画像により決定した場合、野生型ｈＰＳＣ由来またはＰＢ好中球で処置した腫瘍担持マウスにおいて全身的転移が生じ（図７Ｅ～７Ｆ）、ヒト患者ＧＢＭの頭蓋外転移における好中球の潜在的役割が示唆された（Liang et al., 2014；Wang et al., 2020c）。
【0085】
次いで我々は、ＴＮＦαおよびＩＬ－６を含む、種々の実験マウス群の血漿中ヒトサイトカイン産生放出を測定した。すべての非ＰＢＳ実験群において、５日目から２６日目に血漿中に検出可能なＴＮＦαおよびＩＬ－６が産生され、ＣＡＲ好中球は、最も高いレベルの両サイトカインを維持した（図７Ｇ）。好中球媒介転移の根底にある機構をさらに調査するために、我々は、マウス血液からヒト好中球を回収し、抗腫瘍（Ｎ１）または腫瘍促進（Ｎ２）表現型解析に供した（Fridlender et al., 2009；Shaul et al., 2016）。野生型ｈＰＳＣまたはＰＢ好中球において、腫瘍異種移植により、ｉＮＯＳおよびＴＮＦαを含むＮ１特異的マーカーの発現が有意に減少し、ＶＥＧＦおよびアルギナーゼを含む（Shaul et al., 2016）Ｎ２特異的マーカーが増加した（図７Ｈ、図１２Ｇ）。反対に、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、高い発現レベルのＮ１マーカーを保持し、これは、腫瘍担持マウスにおける、これらの強力な抗腫瘍細胞毒性およびサイトカイン放出と一致する。まとめると、我々の知見により、ｈＰＳＣ由来ＣＡＲ好中球が、抗腫瘍表現型を維持し、この試験において検査した種々の腫瘍適所様条件下で腫瘍細胞を効率的に殺傷可能であることが明らかに実証され、標的免疫療法におけるこれらの適用可能性が強調された。
【0086】
ｈＰＳＣの維持および分化
Ｈ９をＷｉＣｅｌｌ社から得、これまでに公表された方法に従ってマトリゲルまたはｉＭａｔｒｉｘ５１１でコーティングしたプレート上のｍＴｅＳＲｐｌｕｓ培地に維持した。分化では、ｈＰＳＣを１ｍＭのＥＤＴＡで解離させ、１０，０００～８０，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、ｉＭａｔｒｉｘ５１１でコーティングした２４ウェルプレート上の５μＭのＹ２７６３２を加えたｍＴｅＳＲｐｌｕｓ培地に２４時間播種した（－１日目）。０日目に、１００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｖｃ）中の６μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）で細胞を処理した後、１日目、２日目および３日目に培地をＬａｓＲ基礎培地と交換し、２日目から４日目に５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを培地に加えた。４日目に、１０μＭのＳＢ４３１５４２を添加したＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地（Ｓｉｇｍａ社）と培地を交換した。２日後、ＳＢ４３１５４２を含む培地を吸引し、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦおよびＦＬＴ３Ｌを加えたＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中に細胞を維持した。９日目および１２日目に、培地を吸引し、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦおよびＦＬＴ３Ｌならびに２５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地に交換した。１５日目に、浮遊細胞を穏やかに回収し、好中球の最終分化に使用した。浮遊細胞は、ＧｌｕｔａＭＡＸ１００×、ＥｘＣｙｔｅ（０．２％）、ヒトＧ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍＬ）およびＡｍ５８０レチノイン酸アゴニスト（２．５μＭ）を添加したＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中で培養した。３日後、すべての成分およびサイトカインを加えた同一の培地を、既存の培養物の上に加えた。培養から５日後に上清から成熟した好中球を穏やかに回収した。
Ｈ９をＷｉＣｅｌｌ社から得、これまでに公表された方法に従ってマトリゲルまたはｉＭａｔｒｉｘ５１１でコーティングしたプレート上のｍＴｅＳＲｐｌｕｓ培地に維持した。分化では、ｈＰＳＣを１ｍＭのＥＤＴＡで解離させ、１０，０００～８０，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、ｉＭａｔｒｉｘ５１１でコーティングした２４ウェルプレート上の５μＭのＹ２７６３２を加えたｍＴｅＳＲｐｌｕｓ培地に２４時間播種した（－１日目）。０日目に、１００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｖｃ）中の６μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）で細胞を処理した後、１日目、２日目および３日目に培地をＬａｓＲ基礎培地と交換し、２日目から４日目に５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを培地に加えた。４日目に、１０μＭのＳＢ４３１５４２を添加したＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地（Ｓｉｇｍａ社）と培地を交換した。２日後、ＳＢ４３１５４２を含む培地を吸引し、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦおよびＦＬＴ３Ｌを加えたＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中に細胞を維持した。９日目および１２日目に、培地を吸引し、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦおよびＦＬＴ３Ｌならびに２５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地に交換した。１５日目に、浮遊細胞を穏やかに回収し、好中球の最終分化に使用した。浮遊細胞は、ＧｌｕｔａＭＡＸ１００×、ＥｘＣｙｔｅ（０．２％）、ヒトＧ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍＬ）およびＡｍ５８０レチノイン酸アゴニスト（２．５μＭ）を添加したＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中で培養した。３日後、すべての成分およびサイトカインを加えた同一の培地を、既存の培養物の上に加えた。培養から５日後に上清から成熟した好中球を穏やかに回収した。
【0087】
これとは別に、同種のＣＤ３４＋ＣＤ３１＋造血内皮細胞を、図８Ａ～８Ｃに示すように、Ｗｎｔシグナル伝達の小分子分子活性化によりｈＰＳＣから誘導した。図８Ａは、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの好中球の分化の概要を示す模式図である。図８Ｂは、ＣＤ３４／ＳＯＸ８発現についてのｈＰＳＣ由来の５日目の培養物のフローサイトメトリー解析を示す。生じた造血内皮細胞は、ＳＯＸ１７を発現し、これは、ＡＧＭの血管構造において発現し、ＡＧＭからのヒト幹細胞の生成に必要とされる転写因子である。図８Ｃは、Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、Ｈ１ｈＥＳＣ、１９－９－１１誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および６－９－９誘導ｉＰＳＣ対ＣＤ３４＋ＳＯＸ１７＋（％）の棒グラフである。
【0088】
図８Ｄ～８Ｈに示すように、ＴＧＦβ阻害物質ＳＢ４３１５４２の追加によって内皮造血転換が促進されて、ＣＤ４５＋ＣＤ４３＋ＨＳＰＣの生成が生じ、これは、最終的造血マーカーＣＤ４４およびＲＵＮＸ１ｃを同時発現した。図８Ａは、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの好中球の分化の概要を示す模式図である。図８Ｂは、ＣＤ３４／ＳＯＸ１７発現についてのｈＰＳＣ由来の５日目の培養物のフローサイトメトリー解析を示す。図８Ｃは、Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、Ｈ１ｈＥＳＣ、１９－９－１１誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および６－９－９誘導ｉＰＳＣ対ＣＤ３４＋ＳＯＸ１７＋（％）の棒グラフである。図８Ｄは、種々の日数（Ｄ）のＨ９ｈＰＳＣ（図８Ａに従って分化）におけるＣＤ４５／ＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリープロットを示す。図８Ｅは、Ｈ９ｈＥＳＣ、Ｈ１ｈＥＳＣ、１９－９－１１ｉＰＳＣおよび６－９－９ｉＰＳＣについての％ＣＤ４５＋ＣＤ４３＋の定量の棒グラフを示す。図８Ｆは、指示日数（Ｄ）のＨ９細胞培養物におけるＣＤ４４／ＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリープロットを示す。図８Ｇは、指示日数（Ｄ）のＨ９ＲＵＮＸ１ｃ－ＧＦＰ細胞培養物におけるＣＤ３４／ＲＵＮＸ１ｃ発現の代表的フローサイトメトリープロットを示す。
【0089】
生じた１５日目のｈＰＳＣ由来ＨＳＰＣも、図８Ｉおよび８Ｊに示すように、凍結融解後に高い生存率を維持した。図８Ｈは、カルセインＡＭ染色により評価した場合の凍結前（新鮮）および後（凍結）の細胞生存率の代表的フローサイトメトリープロットを示す。図８Ｉは、新鮮および凍結Ｈ９ｈＰＳＣについての細胞生存率（％）の棒グラフである。
【0090】
ミエロイド前駆細胞および好中球分化を、図９Ａに示すように、９日目からＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３およびＩＬ－６でｈＰＳＣ由来ＨＳＰＣ培養物を処理することにより誘導した。図９Ａは、分化中の指示日数におけるマクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ－Ｍ）および顆粒球マクロファージＣＦＵ（ＣＦＵ－ＧＭ）解析の模式図である。
【0091】
浮遊ミエロイド前駆細胞は、種々の日数で採取した。浮遊ミエロイド前駆細胞は、顆粒球マクロファージおよびマクロファージコロニー形成能を提示し、この形成能は、１２日目から１８日目に上昇し、後に低下した。好中球特異化は、１５日目のＧ－ＣＳＦによるミエロイド前駆細胞の処理により促進された。図９Ｂ～９Ｃに示すように、Ｇ－ＣＳＦ処理によってＧＭ－ＣＳＦと比較してＣＤ１４＋単球／マクロファージの数が有意に減少した。図９Ｂは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）で処理した細胞におけるＣＤ１４／ＣＤ４５発現の代表的フローサイトメトリープロットを示す。図９Ｃは、Ｇ－ＣＳＦまたはＧＭ－ＣＳＦで処理した１８日目（Ｄ１８）および２１日目（Ｄ２１）の培養物についての％ＣＤ１４＋ＣＤ４５＋発現の定量の棒グラフである。
【0092】
好中球分化に最適なミエロイド前駆細胞は、図９Ｄに示すように、１２、１５および１８日目に浮遊細胞を採取し、Ｇ－ＣＳＦ、およびヒトＣＤ３４＋細胞からの好中球生成を促進するレチノイン酸アゴニストＡＭ５８０でこれらを処理することにより同定した。図９Ｄは、Ｇ－ＣＳＦおよびＡＭ５８０処理による指示日数（Ｄ）のｈＰＳＣ由来ミエロイド前駆細胞の好中球分化能評価の模式図である。
【0093】
好中球分化の効率は、図９Ｅ～９Ｆに示すように、１５日目から２１日目に上昇し、おそらく好中球の寿命が短いため、後に有意に低下した。図９Ｅは、３、６または９日間Ｇ－ＣＳＦおよびＡＭ５８０で処理し、１２、１５または１８日目に採取したミエロイド細胞培養物におけるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１６発現の代表的フローサイトメトリープロットを示す。図９Ｆは、１２、１５または１８日目に採取し、１５、１８、２１、２４または２７日目（Ｄ）に解析したミエロイド細胞についての％ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１６＋発現の定量の棒グラフである。
【0094】
６日間Ｇ－ＣＳＦおよびＡＭ５８０で処理した１５日目のミエロイド前駆細胞を、好中球分化に最適であると同定した。図９Ｈに示すように、好中球分化培養における選別したＣＤ１６－細胞の表現型（選別前後の好中球上のＣＤ１６の代表的フローサイトメトリー画像を示す、図９Ｇを参照）を評価して、約２０％のＦｃεＲ１α＋好塩基球および約７４％のＥＰＸ＋好酸球から主になることを決定した。この図９Ｈは、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＦｃεＲ１αおよびＥＰＸの発現について選別したＣＤ１６－細胞のフローサイトメトリー解析を示す。１２日目から動的形態学的変化が、造血系クラスターの出現とともに観察された。
【0095】
生じた２１日目の好中球は、典型的な好中球形態を呈し（図９Ｉ～９Ｊ）、ヒト末梢血から単離したこれらの対応物と比較して高発現レベルの、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１８およびＭＰＯを含む好中球特異的マーカーを示した。図９Ｉは、ｈＰＳＣ由来および初代末梢血好中球の代表的ライトギムザ染色を示す。スケールバー＝５μｍ。図９Ｊは、ｈＰＳＣ由来および初代末梢血好中球のＤＡＰＩおよびＣＤ１６の代表的蛍光染色を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【0096】
図１３Ａ～１３Ｃ：ｈＰＳＣに由来する抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ好中球により、癌性株が特異的に認識され、殺傷されることを示す図である。（図１３Ａ）ＰＳＭＡ－ＣＡＲ設計の模式図、および内因性ＡＡＶＳ１セーフハーバー部位におけるＣａｓ９媒介相同性特異的修復（ＨＤＲ）によるノックイン戦略である。ＰＳＭＡ－ＣＡＲは、シグナルペプチド、抗ＰＳＭＡ Ｊ５９１ｓｃＦＶまたはナノボディ、ＩｇＧ４－Ｆｃ（ＥＱ）、ＣＤ４膜貫通（ｔｍ）およびＣＤ３ζ（ＣＤ３ｚ）からなる。（図１３Ｂ）計１３種のうち１２種のクローンおよび計１５種のうち１３種のクローンの標的効率をそれぞれ有するｈＰＳＣにおけるＣＡＲノックインの遺伝子型決定を示す。（図１３Ｃ）ＣＡＲ好中球を、Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫（ＧＢＭ）およびＬＮＣａＰ前立腺がん細胞とともに指示細胞比により１６時間同時培養し、好中球の細胞毒性を算出した。
【0097】
その上、説明のために、図１４は、例示的実施形態として示すＣＬＴＸ ＮＫ－ＣＡＲプラスミドマップを表す。
【0098】
図１５は、ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲプラスミドマップを表す。ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲは、ＣＬＴＸ、ＣＤＲの膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζの細胞内ドメインをコードする。この構築物は、ｈＰＳＣ由来好中球の抗腫瘍細胞毒性の増強において他の２つよりも良好であった。生じたＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲ好中球は、典型的な好中球表現型を提示し、ＭＭＰ２を介する神経膠芽腫への特異的結合により標的腫瘍細胞を殺傷した。
【0099】
図１６は、説明のための例示的実施形態として示すＩＬ－１３Ｔ－ＣＡＲプラスミドマップを表す。
【0100】
血液系腫瘍を治癒させる免疫療法が開発されているが、標的がん療法に対する新規かつ後天的耐性が、好中球が鍵となる中心的存在である腫瘍微小環境（ＴＭＥ）が複雑かつ動的であるため、固形腫瘍において一般に観察されている（Devlin et al., 2020；Kalafati et al., 2020；Ponzetta et al., 2019）。ＴＭＥへの好中球の寄与の理解の向上により、がんを治療する代替的手法としての腫瘍促進好中球の再プログラミングおよび／または枯渇に対する関心が高まっている（Kalafati et al., 2020）。概念実証として、我々は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方における抗腫瘍エフェクター細胞として好中球を計画および維持し、現在のがん治療を補完し、これらの有効性を強化し得る新規の好中球標的免疫療法を代表する、合成ＣＡＲの使用の実現可能性をここで実証する。
【0101】
初代好中球の寿命が短く、これらがゲノム編集に抵抗性であるため、合成ＣＡＲによるｈＰＳＣの改変は、容易に入手可能なＣＡＲ好中球を生成する理想的手法である。この目標を達成するために、ここで我々は、シグナル伝達経路調節因子を段階特異的に利用する、革新的で化学的に定義されたフィーダーフリーのプラットフォームを第１に実行してｈＰＳＣによる好中球の堅牢な生成を行った。次いで我々は、好中球媒介腫瘍殺傷活性の増強におけるＮＫまたはＴ細胞特異的膜貫通および細胞内活性化ドメインを有する３つの異なるＣＡＲ構築物を設計して評価した。ＧＢＭ結合ペプチドであるクロロトキシン（Qin et al., 2014）およびＴ細胞特異的シグナル伝達ドメインを含むＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方においてｈＰＳＣ好中球の抗原特異的腫瘍細胞毒性が著明に上昇した。将来の研究において、好中球特異的膜貫通および活性化ドメインを、好中球特異的ＣＡＲ構築物を確立するのに利用可能であるかどうかを調査することは興味深い。誘導性遺伝子ノックダウン系を使用して、我々は、好中球においてＣＡＲ活性化を引き起こすＣＬＴＸ結合および認識の標的としてＧＢＭ細胞上に膜タンパク質ＭＭＰ２を同定した。分子機構調査により、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲにより、公知の下流細胞内シグナル伝達経路が引き起こされ、遺伝子発現により、腫瘍細胞に対するトロゴトーシス活性を媒介し、腫瘍適所様条件下でこれらの抗腫瘍Ｎ１表現型を維持する、好中球の特性が明らかとなることが明らかとなった。
【0102】
要約すれば、この試験において記載するＣＡＲ好中球改変プラットフォームは、がんおよび好中球減少症の治療における臨床適用のための潜在的標準化細胞生成物として容易に入手可能な好中球を生成する拡張可能な戦略として作用し得る。ｈＰＳＣにおけるゲノム編集の相対的容易さを考慮すると、他の遺伝子修飾、例えば、多重ＣＡＲ発現および／または阻害性受容体欠失をも実施して、ＣＡＲ好中球における最適な治療作用を達成することができる。重要なことには、安定なＣＡＲ発現ｈＰＳＣ株をも使用して、臨床試験において現在使用する、容易に入手可能なＣＡＲ－ＴおよびＮＫ細胞（Li et al., 2018）を生成することができる。
【実施例】
【0103】
次の実施例は、本開示を例示するように作用する。この実施例は、主張する本発明の範囲を制限することは決して意図しない。
【0104】
略称
ＨＳＰＣ：造血幹および前駆細胞
ＡＧＭ：大動脈－性腺－中腎
ＮＫ細胞：ナチュラルキラー細胞
ＨＳＣ：造血幹細胞
ＥＨＴ：内皮造血転換
ＨＥ：造血内皮細胞
ｈＥＳＣ：ヒト胚性幹細胞
ｈＰＳＣ：ヒト多能性幹細胞
ＢＭＰ４：骨形成タンパク質４
ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子
ＥＰＯ：エリスロポエチン
ＦＧＦ２：線維芽細胞増殖因子２
ＣＳＦ３：コロニー刺激因子３
ＩＬ－６：インターロイキン６
ＴＰＯ：トロンボポエチン
ＰＶＡ：ポリビニルアルコール
ＳＣＦ：幹細胞因子
Ｆｌｔ３：ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３／胎性肝臓キナーゼ２
ＨＥＰ：造血内皮前駆細胞
ＶＥカドヘリン：血管内皮カドヘリン
ＯＰ９－ＤＬＬ４：ＯＰ９－Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ様タンパク質４
ＣＦＵ－Ｅ：赤血球コロニー形成単位
ＣＦＵ－ＧＭ：顆粒球／マクロファージコロニー形成単位
ＣＦＵ－Ｍ：マクロファージコロニー形成単位
ＣＦＵ－ＧＥＭＭ：多能性前駆細胞コロニー形成単位
ＧＳＫ３：グリコーゲン合成酵素キナーゼ３
ＤＭＥＭ：ダルベッコ修飾イーグル培地
ＴＧＦβ：形質転換増殖因子β
Ｇ－ＣＳＦ：顆粒球コロニー刺激因子
ＧＭ－ＣＳＦ：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＩＬ－３：インターロイキン３
ＩＬ－６：インターロイキン６
ＩＬ－１３：インターロイキン１３
ＣＡＲ：キメラ抗原受容体
ＣＬＴＸ：クロロトキシン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ｆＭＬＰ：ホルミルメチオニル－ロイシル－フェニルアラニン
ＣＦＣ：コロニー形成細胞
ＧＢＭ：神経膠芽腫
ＭＭＰ２：マトリックスメタロペプチダーゼ２
ＳＯＸ１７：ＳＲＹボックス転写因子１７
ＨＳＰＣ：造血幹および前駆細胞
ＡＧＭ：大動脈－性腺－中腎
ＮＫ細胞：ナチュラルキラー細胞
ＨＳＣ：造血幹細胞
ＥＨＴ：内皮造血転換
ＨＥ：造血内皮細胞
ｈＥＳＣ：ヒト胚性幹細胞
ｈＰＳＣ：ヒト多能性幹細胞
ＢＭＰ４：骨形成タンパク質４
ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子
ＥＰＯ：エリスロポエチン
ＦＧＦ２：線維芽細胞増殖因子２
ＣＳＦ３：コロニー刺激因子３
ＩＬ－６：インターロイキン６
ＴＰＯ：トロンボポエチン
ＰＶＡ：ポリビニルアルコール
ＳＣＦ：幹細胞因子
Ｆｌｔ３：ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３／胎性肝臓キナーゼ２
ＨＥＰ：造血内皮前駆細胞
ＶＥカドヘリン：血管内皮カドヘリン
ＯＰ９－ＤＬＬ４：ＯＰ９－Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ様タンパク質４
ＣＦＵ－Ｅ：赤血球コロニー形成単位
ＣＦＵ－ＧＭ：顆粒球／マクロファージコロニー形成単位
ＣＦＵ－Ｍ：マクロファージコロニー形成単位
ＣＦＵ－ＧＥＭＭ：多能性前駆細胞コロニー形成単位
ＧＳＫ３：グリコーゲン合成酵素キナーゼ３
ＤＭＥＭ：ダルベッコ修飾イーグル培地
ＴＧＦβ：形質転換増殖因子β
Ｇ－ＣＳＦ：顆粒球コロニー刺激因子
ＧＭ－ＣＳＦ：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＩＬ－３：インターロイキン３
ＩＬ－６：インターロイキン６
ＩＬ－１３：インターロイキン１３
ＣＡＲ：キメラ抗原受容体
ＣＬＴＸ：クロロトキシン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ｆＭＬＰ：ホルミルメチオニル－ロイシル－フェニルアラニン
ＣＦＣ：コロニー形成細胞
ＧＢＭ：神経膠芽腫
ＭＭＰ２：マトリックスメタロペプチダーゼ２
ＳＯＸ１７：ＳＲＹボックス転写因子１７
【0105】
統計学的解析。データは、平均値±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）として提示する。統計学的有意性は、２群間のＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（両側）により判定し、３群以上は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により解析した。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であると考えた。
【0106】
[実施例１]細胞培養培地
次の培地を使用して、幹細胞を培養および維持した。
（ａ）幹細胞培養および維持培地。ｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０５８２５）、ｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、８５８５０）、Ｅ８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ａ１５１７００１）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ａ３３４９４０１）等。
（ｂ）ＤＭＥＭ＋アスコルビン酸（０日目～１日目に使用）。ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、１１９６５またはＣｏｒｎｉｎｇ社、１０－０１７－ＣＭ）に５０～１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社、Ａ８９６０）を添加した。
（ｃ）ＬａＳＲ基礎培地または類似の培地（０日目～４日目、０日目～６日目、０日目～１５日目、１日目～４日目、１日目～６日目または１日目～１５日目に使用）。ＬａＳＲ基礎培地は、ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、１２６３４）、２．５ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、３５０５００６１）および５０～１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社、Ａ８９６０）からなる。
（ｄ）Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（Ｓｉｇｍａ社、Ｓ０１９２）、ＳｔｅｍＳｐａｎ－ＸＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、＃１００－００７３）または類似の培地（０日目～２０日目、２日目～２０日目、３日目～２０日目または４日目～２０日目に使用）。
次の培地を使用して、幹細胞を培養および維持した。
（ａ）幹細胞培養および維持培地。ｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０５８２５）、ｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、８５８５０）、Ｅ８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ａ１５１７００１）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ａ３３４９４０１）等。
（ｂ）ＤＭＥＭ＋アスコルビン酸（０日目～１日目に使用）。ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、１１９６５またはＣｏｒｎｉｎｇ社、１０－０１７－ＣＭ）に５０～１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社、Ａ８９６０）を添加した。
（ｃ）ＬａＳＲ基礎培地または類似の培地（０日目～４日目、０日目～６日目、０日目～１５日目、１日目～４日目、１日目～６日目または１日目～１５日目に使用）。ＬａＳＲ基礎培地は、ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、１２６３４）、２．５ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、３５０５００６１）および５０～１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社、Ａ８９６０）からなる。
（ｄ）Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（Ｓｉｇｍａ社、Ｓ０１９２）、ＳｔｅｍＳｐａｎ－ＸＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、＃１００－００７３）または類似の培地（０日目～２０日目、２日目～２０日目、３日目～２０日目または４日目～２０日目に使用）。
【0107】
次の小分子および増殖因子を使用した。
（ａ）Ｙ２７６３２（５～１０μＭ）：ヒト多能性幹細胞培養物
ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ社、１０００５５８３；Ｓｉｇｍａ社、Ｙ０５０３；Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社、Ｓ１０４９
（ａ）Ｙ２７６３２（５～１０μＭ）：ヒト多能性幹細胞培養物
ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ社、１０００５５８３；Ｓｉｇｍａ社、Ｙ０５０３；Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社、Ｓ１０４９
【0108】
【化7】
ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ社、１３１２２；Ｓｉｇｍａ社、ＳＭＬ１０４６；Ｔｏｃｒｉｓ社、４４２３
【0109】
【化8】
ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ社、１３０３１；Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社、Ｓ１０６７；Ｔｏｃｒｉｓ社、１６１４
【0110】
【化9】
ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ社、９００１７９９；Ｓｉｇｍａ社、ＳＭＬ０７８８；Ｔｏｃｒｉｓ社、２９３９
【0111】
【化10】
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社＃１００－２０；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社、２９３－ＶＥ；Ｓｉｇｍａ社、Ｈ９１６６
（ｆ）造血系特異化のための組換えヒトＳＣＦ（１～１００ｎｇ／ｍＬ）
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社＃３００－０７；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社、２５５－ＳＣ；Ｓｉｇｍａ社、Ｓ７９０１
（ｇ）造血系特異化のための組換えヒトＦｌｔ３リガンド（１～１００ｎｇ／ｍＬ）
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社＃３００－１９；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社、３０８－ＦＫ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、ＰＨＣ９４１５
（ｈ）好中球特異化のための組換えヒトＧ－ＣＳＦ（１～２００ｎｇ／ｍｌ）
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社＃３００－２３；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社、２１４－ＣＳ；Ｓｉｇｍａ社、Ｇ０４０７
（ｉ）ＡＭ５８０またはＡＭ８０（１～１０μＭ）：好中球特異化のためのレチノイン酸受容体アゴニスト
ＡＭ５８０：ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ社、１５２６１；Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社、Ｓ２９３３；Ｔｏｃｒｉｓ社、０７６０
ＡＭ８０：ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ社、７１７７０；Ｔｏｃｒｉｓ社、３５０７
【0112】
【化11】
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社＃３００－０３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、５７２９０２；Ｓｉｇｍａ社、Ｇ５０３５
（ｋ）造血系および好中球特異化のための組換えヒトＩＬ－３（１～１００ｎｇ／ｍＬ）
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社＃２００－０３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、５７８００２；Ｓｉｇｍａ社、ＳＲＰ４１３４
（ｌ）造血系および好中球特異化のための組換えヒトＩＬ－６（１～１００ｎｇ／ｍＬ）
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社＃２００－０６；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、７１５１０４；Ｓｉｇｍａ社、ＧＦ４３０－Ｍ
【0113】
[実施例２]種々のＣＡＲ構築物によるｈＰＳＣの生成、維持および分化
３６個のアミノ酸および４つのジスルフィド結合を含み、３，９９６の相対分子量を有するペプチドであるＣＬＴＸを、オブトサソリ（Leiurus quinquestriatus）のサソリ毒から最初に単離した（Qin et al., Inhibition of metastatic tumor growth and metastasis via targeting metastatic breast cancer by chlorotoxin-modified liposomes. Mol Pharm (2014). doi:10.1021/mp40069lz）。ＣＬＴＸは、神経膠芽腫および他の腫瘍に選択的に結合する（DeBin et al., Purification and characterization of chlorotoxin, a chloride channel ligand from the venom of the scorpion, Am J. Physiol-Cell Physiol 264 (1993)）。ＣＬＴＸは、無脊椎動物に対して高度に毒性であるが、哺乳動物に対しては非毒性である。ＣＬＴＸは、この特異的結合および他の天然特性のため、腫瘍標的療法に対して有望なツールである。ＣＬＴＸは、細胞毒性物質の腫瘍特異的送達について報告されており、ＣＬＴＸは、前臨床適用における化学療法剤および小分子干渉ＲＮＡの送達のための多様な媒体のコーティングに使用されている。最近、Brown et al.は、ＣＬＴＸ特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞によって神経膠芽腫が特異的かつ効率的に標的とされたことを報告した。上の調査に基づいて、ＣＬＴＸ特異的ＣＡＲ好中球によって、炎症性腫瘍領域への遊走後の腫瘍を標的とすることが可能であることが考えられる（Wang et al. (2020)、上記参照）。
３６個のアミノ酸および４つのジスルフィド結合を含み、３，９９６の相対分子量を有するペプチドであるＣＬＴＸを、オブトサソリ（Leiurus quinquestriatus）のサソリ毒から最初に単離した（Qin et al., Inhibition of metastatic tumor growth and metastasis via targeting metastatic breast cancer by chlorotoxin-modified liposomes. Mol Pharm (2014). doi:10.1021/mp40069lz）。ＣＬＴＸは、神経膠芽腫および他の腫瘍に選択的に結合する（DeBin et al., Purification and characterization of chlorotoxin, a chloride channel ligand from the venom of the scorpion, Am J. Physiol-Cell Physiol 264 (1993)）。ＣＬＴＸは、無脊椎動物に対して高度に毒性であるが、哺乳動物に対しては非毒性である。ＣＬＴＸは、この特異的結合および他の天然特性のため、腫瘍標的療法に対して有望なツールである。ＣＬＴＸは、細胞毒性物質の腫瘍特異的送達について報告されており、ＣＬＴＸは、前臨床適用における化学療法剤および小分子干渉ＲＮＡの送達のための多様な媒体のコーティングに使用されている。最近、Brown et al.は、ＣＬＴＸ特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞によって神経膠芽腫が特異的かつ効率的に標的とされたことを報告した。上の調査に基づいて、ＣＬＴＸ特異的ＣＡＲ好中球によって、炎症性腫瘍領域への遊走後の腫瘍を標的とすることが可能であることが考えられる（Wang et al. (2020)、上記参照）。
【0114】
Ｃａｓ９を使用して、３つの異なるＣＡＲ構築物（ＩＬ－１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）標的四重変異体ＩＬ－１３（ＴＱＭ１３）Ｔ－ＣＡＲであるＩＬ－１３Ｔ－ＣＡＲ（Kim et al., Bioact Mater 5: 624-635 (2020)）、ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲ（Wang et al. (2020)、上記参照）およびＣＬＴＸ ＮＫ－ＣＡＲ）によりｈＰＳＣを改変し、改良免疫療法のためのＣＡＲ好中球にこれらを分化させた。遺伝子サイレンシングを回避するために、細胞周期レポーターを発現させるためにこれまでに行ったように（Chang et al., Fluorescent indicators for continuous and lineage-specific reporting of cell-cycle phases in human pluripotent stem cells. Biotechnol Bioeng bit.27352 (2020). doi:10.1002/bit.27352）、ＣＡＲ構築物を、ｈＰＳＣのアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）セーフハーバー部位にノックインした。
【0115】
ドナープラスミド構築
ＡＡＶＳ１部位を標的とするドナープラスミドを、これまでに記載のように構築した（Chang et al. (2020)、上記参照）。簡潔には、ＣＡＧ－ＩＬ１３Ｔ－ＣＡＲプラスミドを生成するために、ＴＱＭ－ＩＬ１３ＣＡＲ断片（Kim et al. (2020)、上記参照）を、Ａｄｄｇｅｎｅ社のプラスミド＃１５４０５４から増幅し、次いで、ＡＡＶＳ１－ＰｕｒｏＣＡＧ－ＦＵＣＣＩドナープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社；＃１３６９３４）にクローニングし、ＦＵＣＣＩを置換した。ＣＡＧ－ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲプラスミドでは、シグナルペプチドを含むＣＬＴＸ配列を直接合成し（ＧｅｎｅＷｉｚ社）、ＣＡＧ－ＩＬ１３Ｔ－ＣＡＲにおけるＩＬ－１３配列の置換に使用した。ＣＡＧ－ＣＬＴＸ ＮＫ－ＣＡＲプラスミドでは、コンジュゲートしたＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４およびＣＤ３－ζ配列を直接合成し、ＣＡＧ－ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲにおけるＣＤ４ｔｍおよびＣＤ３－ζ配列の置換に使用した。すべてのＣＡＲ構築物は、シーケンシングし、Ａｄｄｇｅｎｅ社に提出した（＃１５７７４２、＃１５７７４３および＃１５７７４４）。
ＡＡＶＳ１部位を標的とするドナープラスミドを、これまでに記載のように構築した（Chang et al. (2020)、上記参照）。簡潔には、ＣＡＧ－ＩＬ１３Ｔ－ＣＡＲプラスミドを生成するために、ＴＱＭ－ＩＬ１３ＣＡＲ断片（Kim et al. (2020)、上記参照）を、Ａｄｄｇｅｎｅ社のプラスミド＃１５４０５４から増幅し、次いで、ＡＡＶＳ１－ＰｕｒｏＣＡＧ－ＦＵＣＣＩドナープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社；＃１３６９３４）にクローニングし、ＦＵＣＣＩを置換した。ＣＡＧ－ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲプラスミドでは、シグナルペプチドを含むＣＬＴＸ配列を直接合成し（ＧｅｎｅＷｉｚ社）、ＣＡＧ－ＩＬ１３Ｔ－ＣＡＲにおけるＩＬ－１３配列の置換に使用した。ＣＡＧ－ＣＬＴＸ ＮＫ－ＣＡＲプラスミドでは、コンジュゲートしたＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４およびＣＤ３－ζ配列を直接合成し、ＣＡＧ－ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲにおけるＣＤ４ｔｍおよびＣＤ３－ζ配列の置換に使用した。すべてのＣＡＲ構築物は、シーケンシングし、Ａｄｄｇｅｎｅ社に提出した（＃１５７７４２、＃１５７７４３および＃１５７７４４）。
【0116】
[実施例３]ｉｎ ｖｉｔｒｏでの解析
ｈＰＳＣのヌクレオフェクションおよび遺伝子型決定
細胞生存率を上昇させるために、１０μＭのＹ２７６３２を使用して、ｈＰＳＣを３～４時間処理した後ヌクレオフェクションを行うか、またはｈＰＳＣを一晩処理した。次いで、細胞をアキュターゼ（Accutase）により８～１０分間剥離し、ｈＰＳＣ１～２．５×１０６細胞に、ヒト幹細胞ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ社；＃ＶＡＰＨ－５０１２）１００μｌまたは室温のＰＢＳ－／－２００μｌ中のＡＡＶＳ１ｇＲＮＡ Ｔ２（Ａｄｄｇｅｎｅ社；＃４１８１８）３μｇ、ｐＣａｓ９ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ社；＃４４７１９）４．５μｇおよびＣＡＲドナープラスミド６μｇを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ２ｂのｐｒｏｇｒａｍＢ－０１６を使用してヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションした細胞は、マトリゲルでコーティングした６ウェルプレートのあるウェル内の、１０μＭのＹ２７６３２を有する予熱したｍＴｅＳＲｐｌｕｓまたはｍＴｅＳＲ１ ３ｍｌに播種した。２４時間後、５μＭのＹ２７６３２を含む新鮮なｍＴｅＳＲｐｌｕｓまたはｍＴｅＳＲ１と培地を交換した後、毎日の培地交換を行った。細胞が８０％を超えてコンフルエントとなると、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）により、およそ１週間、薬物選択を実施し、組織培養フード内で顕微鏡を使用して個々のクローンを選び、マトリゲルで予めコーティングした９６ウェルプレートの各ウェルで２～５日間増殖させた後、ＰＣＲによる遺伝子型決定を行った。単一クローン由来ｈＰＳＣのゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社；＃ＱＥ０９０５０）４０μｌに細胞を掻き入れることにより抽出した。２×ＧｏＴａｑＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社；＃７１２３）を使用して、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲを実施した。陽性遺伝子型決定では、次のプライマー対：ＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣ［配列番号４］およびＴＣＧＴＣＧＣＧＧＧＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧ［配列番号５］を６５℃のアニーリング温度（Ｔｍ）で使用した。ホモ接合性スクリーニングでは、プライマー配列の次のセット：ＣＧＧＴＴＡＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴ［配列番号６］およびＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡ［配列番号７］を６０℃のＴｍで使用した。
ｈＰＳＣのヌクレオフェクションおよび遺伝子型決定
細胞生存率を上昇させるために、１０μＭのＹ２７６３２を使用して、ｈＰＳＣを３～４時間処理した後ヌクレオフェクションを行うか、またはｈＰＳＣを一晩処理した。次いで、細胞をアキュターゼ（Accutase）により８～１０分間剥離し、ｈＰＳＣ１～２．５×１０６細胞に、ヒト幹細胞ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ社；＃ＶＡＰＨ－５０１２）１００μｌまたは室温のＰＢＳ－／－２００μｌ中のＡＡＶＳ１ｇＲＮＡ Ｔ２（Ａｄｄｇｅｎｅ社；＃４１８１８）３μｇ、ｐＣａｓ９ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ社；＃４４７１９）４．５μｇおよびＣＡＲドナープラスミド６μｇを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ２ｂのｐｒｏｇｒａｍＢ－０１６を使用してヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションした細胞は、マトリゲルでコーティングした６ウェルプレートのあるウェル内の、１０μＭのＹ２７６３２を有する予熱したｍＴｅＳＲｐｌｕｓまたはｍＴｅＳＲ１ ３ｍｌに播種した。２４時間後、５μＭのＹ２７６３２を含む新鮮なｍＴｅＳＲｐｌｕｓまたはｍＴｅＳＲ１と培地を交換した後、毎日の培地交換を行った。細胞が８０％を超えてコンフルエントとなると、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）により、およそ１週間、薬物選択を実施し、組織培養フード内で顕微鏡を使用して個々のクローンを選び、マトリゲルで予めコーティングした９６ウェルプレートの各ウェルで２～５日間増殖させた後、ＰＣＲによる遺伝子型決定を行った。単一クローン由来ｈＰＳＣのゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社；＃ＱＥ０９０５０）４０μｌに細胞を掻き入れることにより抽出した。２×ＧｏＴａｑＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社；＃７１２３）を使用して、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲを実施した。陽性遺伝子型決定では、次のプライマー対：ＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣ［配列番号４］およびＴＣＧＴＣＧＣＧＧＧＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧ［配列番号５］を６５℃のアニーリング温度（Ｔｍ）で使用した。ホモ接合性スクリーニングでは、プライマー配列の次のセット：ＣＧＧＴＴＡＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴ［配列番号６］およびＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡ［配列番号７］を６０℃のＴｍで使用した。
【0117】
ｈＰＳＣおよび健常初代好中球のトランスクリプトームによるｈＰＳＣ由来好中球のバルクＲＮＡシーケンシング解析の比較では（Perez et al., Blood 136: 199-209 (2020)）、鍵となる表面マーカーのほとんどの発現パターンが示され、ｈＰＳＣ由来好中球および初代好中球では、転写因子は、未分化ｈＰＳＣと比較して同一であった。フローサイトメトリー解析と一致して、ＲＮＡシーケンシングでは、ｈＰＳＣ由来および初代好中球においてＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１８およびＭＰＯの発現が確認された。成熟および未熟初代好中球における発現レベルと同様に、ｈＰＳＣ由来好中球により、相対的に低発現レベルのＣＥＡＣＡＭ８および高発現レベルのＭＰＯがそれぞれ実証された。同様に、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を含む他の表面受容体、接着分子、例えば、ＳＥＬＬおよびＩＴＧＡＸ、鍵となる転写因子、例えば、ＳＰＩ１、ＣＥＢＰＡおよびＣＥＢＰＥ、機能性遺伝子、例えば、ＰＲＴＮ３およびＭＰＯ、ならびにＲＯＳ産生に関与する遺伝子、例えば、ＮＣＦ２およびＮＣＦ４は、初代未熟または成熟好中球に見出されるレベルと同様のレベルで発現した。
【0118】
類似性にもかかわらず、ｈＰＳＣ由来および初代好中球間の著しい差も明らかであった。例えば、初期ミエロイドまたは顆粒球前駆細胞と関連する転写因子、例えば、ＲＵＮＸ１およびＧＦＩ１は、ｈＰＳＣ由来好中球において高い発現レベルを維持し、好中球分化培養物の未熟な表現型および／または高い多様性を示した。Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）およびホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）を含むケモカインおよび化学誘引物質は、中間および成熟好中球よりも低い発現レベルを呈し、ｈＰＳＣ由来好中球が、初代好中球ほど化学誘引物質に対して感受性ではない可能性を示唆した。新鮮なｈＰＳＣ好中球は、Ｎ１およびＮ２マーカーに関して成熟、初代好中球に類似の発現パターンを呈したが、これらがＮ１およびＮ２遺伝子のサブセットを高および低の両レベルで発現したため、Ｎ１またはＮ２のユニークな転写プロファイルは、すべての好中球において観察されず、Ｎ１またはＮ２ヒト好中球の追跡が可能となるさらに信頼できるマーカーの必要性が強調された。また、転写多様性が、未熟、中間および成熟初代好中球において観察され、好中球の動力学および柔軟性が示された。
【0119】
造血系コロニー形成アッセイおよびライトギムザ染色
採取した細胞をサイトカイン含有ＭｅｔｈｏＣｕｌｔＨ４４３４培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー）１．５ｍＬ中３７℃で増殖させた。１４日後、造血系コロニーをＣＦＵについて細胞形態に従って点数化した。細胞形態を評価するために、細胞をスライドガラス上に固定し、ライトギムザ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で染色した。
採取した細胞をサイトカイン含有ＭｅｔｈｏＣｕｌｔＨ４４３４培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー）１．５ｍＬ中３７℃で増殖させた。１４日後、造血系コロニーをＣＦＵについて細胞形態に従って点数化した。細胞形態を評価するために、細胞をスライドガラス上に固定し、ライトギムザ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で染色した。
【0120】
フローサイトメトリー解析
分化細胞を穏やかにピペットで滴下し、５０ｍＬのチューブ上に配置した７０または１００μｍの濾過器により濾過した。次いで、細胞を遠心分離により沈殿させ、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ－／－溶液で３回洗浄した。細胞を適切にコンジュゲートした抗体により室温の暗室で２５分間染色し、ＢＳＡ含有ＰＢＳ－／－溶液による洗浄後にＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって解析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して収集したフローデータを処理した。
分化細胞を穏やかにピペットで滴下し、５０ｍＬのチューブ上に配置した７０または１００μｍの濾過器により濾過した。次いで、細胞を遠心分離により沈殿させ、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ－／－溶液で３回洗浄した。細胞を適切にコンジュゲートした抗体により室温の暗室で２５分間染色し、ＢＳＡ含有ＰＢＳ－／－溶液による洗浄後にＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって解析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して収集したフローデータを処理した。
【0121】
好中球分化培養物中の選別したＣＤ１６細胞は、約２０％のＦｃεＲ１α＋好塩基球および約７４％のＥＰＸ＋好酸球から主になった。
【0122】
種々の好中球分化段階における抗ＩｇＧ４（ＳｍＰ）－ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ＝フルオレセインイソチオシアネート）およびＩＬ１３Ｒα２－ＦＩＴＣのフローサイトメトリー解析により、ｈＰＳＣにおけるＣＡＲの安定な発現がさらに確認された。
【0123】
トランズウェル遊走アッセイ
簡潔には、分化細胞をＨＢＳＳ緩衝液に再懸濁し、ｆＭＬＰ（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）に対して２時間遊走させた。下チャンバーに遊走した細胞を０．５ＭのＥＤＴＡにより放出し、ＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用して計数した。数は、各ウェルに加えた細胞の総数により正規化した。次いで、データを生細胞についてゲーティングし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。
簡潔には、分化細胞をＨＢＳＳ緩衝液に再懸濁し、ｆＭＬＰ（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）に対して２時間遊走させた。下チャンバーに遊走した細胞を０．５ＭのＥＤＴＡにより放出し、ＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用して計数した。数は、各ウェルに加えた細胞の総数により正規化した。次いで、データを生細胞についてゲーティングし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。
【0124】
ヒト脳微小血管内皮細胞の使用を含むトランズウェルに基づく血液脳関門（ＢＢＢ）モデルを使用して、ＣＡＲ好中球の活性をさらに評価した。ＣＡＲ発現および野生型ｈＰＳＣ好中球が、ｆＭＬＰに応答してＢＢＢを越える類似の遊出活性を呈する一方で、ＣＡＲ好中球により、野生型好中球よりも高い腫瘍殺傷能が実証された。その上、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、炎症性腫瘍細胞に応答してＢＢＢを越える第２の輸送中に高い遊出能を保持し、これによりｉｎ ｖｉｖｏでの炎症およびがんの多くの態様が再現された。
【0125】
２－Ｄ化学遊走アッセイ
２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．５％のＦＢＳを加えたＨＢＢＳに分化細胞を再懸濁し、コラーゲンコーティングＩＢＩＤＩ化学遊走μスライドに添加し、３７℃で３０分間インキュベートして細胞を接着させた。ｆＭＬＰ（１，０００ｎＭを１５μＬ）を右リザーバー内に添加し、１８７ｎＭの最終ｆＭＬＰ濃度を得た。細胞遊走は、ＬＳＭ７１０（Ｚｉｅｓｓ社ＥＣ Ｐｌａｎ－ＮＥＯＦＬＵＡＲ１０×／０．３対物レンズとともに）を使用して３７℃で６０秒毎に１２０分間記録した。細胞をＩｍａｇｅＪプラグインのＭＴｒａｃｋＪにより追跡した。
２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．５％のＦＢＳを加えたＨＢＢＳに分化細胞を再懸濁し、コラーゲンコーティングＩＢＩＤＩ化学遊走μスライドに添加し、３７℃で３０分間インキュベートして細胞を接着させた。ｆＭＬＰ（１，０００ｎＭを１５μＬ）を右リザーバー内に添加し、１８７ｎＭの最終ｆＭＬＰ濃度を得た。細胞遊走は、ＬＳＭ７１０（Ｚｉｅｓｓ社ＥＣ Ｐｌａｎ－ＮＥＯＦＬＵＡＲ１０×／０．３対物レンズとともに）を使用して３７℃で６０秒毎に１２０分間記録した。細胞をＩｍａｇｅＪプラグインのＭＴｒａｃｋＪにより追跡した。
【0126】
食作用
製造者のプロトコールに従ってｐＨｒｏｄｏＧｒｅｅｎ大腸菌（E. coli）ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓコンジュゲートを使用して食作用を評価した。簡潔には、ｐＨｒｏｄｏＧｒｅｅｎ大腸菌（E. coli）ビーズをＰＢＳ ２ｍＬに再懸濁し、超音波処理器で３回超音波処理した。アッセイ毎のビーズ（１００ｍＬ）を、オプソニン化試薬と１：１の比率で混合することによりオプソニン化し、３７℃で１時間インキュベートした。ビーズをｍＨＢＳＳ緩衝液により４℃の１，５００ＲＣＦで１５分間遠心分離することによって３回洗浄し、次いで最終的に、ｍＨＢＳＳ緩衝液に再懸濁した。分化細胞をオプソニン化基礎液１００μＬに再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ＮＪ）で解析した。
製造者のプロトコールに従ってｐＨｒｏｄｏＧｒｅｅｎ大腸菌（E. coli）ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓコンジュゲートを使用して食作用を評価した。簡潔には、ｐＨｒｏｄｏＧｒｅｅｎ大腸菌（E. coli）ビーズをＰＢＳ ２ｍＬに再懸濁し、超音波処理器で３回超音波処理した。アッセイ毎のビーズ（１００ｍＬ）を、オプソニン化試薬と１：１の比率で混合することによりオプソニン化し、３７℃で１時間インキュベートした。ビーズをｍＨＢＳＳ緩衝液により４℃の１，５００ＲＣＦで１５分間遠心分離することによって３回洗浄し、次いで最終的に、ｍＨＢＳＳ緩衝液に再懸濁した。分化細胞をオプソニン化基礎液１００μＬに再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ＮＪ）で解析した。
【0127】
好中球による腫瘍細胞の食作用は、食作用および好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）形成を阻害する化学物質であるサイトカラシンＤ（ＣｙｔｏＤ）５μＭによる処理後に有意に減少した。ＮＥＴ阻害物質プロポフォールの非存在または存在下での好中球および腫瘍同時インキュベーション中のＮＥＴ形成のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ染色により、３μｇ／ｍｌ以上のプロポフォールで処理した好中球におけるＮＥＴ形成の有意な減少が実証された。ＣｙｔｏＤ、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）およびプロポフォールによって、ＣＡＲ好中球による腫瘍溶解が有意に遮断される一方で、神経膠芽腫によって、ＣｙｔｏＤおよびＮＡＣ条件下でのより高い生存率が実証された。
【0128】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの好中球媒介細胞毒性アッセイ
細胞生存率をフローサイトメトリーにより解析した。簡潔には、好中球細胞（９０，０００細胞／ｍＬ、１５０，０００細胞／ｍＬ、３００，０００細胞／ｍＬ）１００μＬと混合した腫瘍細胞（３０，０００細胞／ｍＬ）１００μＬを９６ウェルプレートに配置した。プレートは、５％ＣＯ２のインキュベーターで３７℃に１６時間維持した。懸濁培地を新たな丸底の９６ウェルプレート内に移し、トリプシンＥＤＴＡを５０μＬウェルに加え、プレートを５分間３７℃でインキュベートした後、分離した細胞を丸底の９６ウェルプレートに移した。丸底の９６ウェルプレートを３００×ｇ、４℃で４分間、遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿物をフローＢＳＡ含有ＰＢＳ－／－溶液２００μＬで洗浄し、ＣＤ４５抗体およびカルセインＡＭを含むＢＳＡ含有ＰＢＳ－／－溶液１００μＬに３０分間室温で細胞を再懸濁した。次いで、試料をＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により解析した。
細胞生存率をフローサイトメトリーにより解析した。簡潔には、好中球細胞（９０，０００細胞／ｍＬ、１５０，０００細胞／ｍＬ、３００，０００細胞／ｍＬ）１００μＬと混合した腫瘍細胞（３０，０００細胞／ｍＬ）１００μＬを９６ウェルプレートに配置した。プレートは、５％ＣＯ２のインキュベーターで３７℃に１６時間維持した。懸濁培地を新たな丸底の９６ウェルプレート内に移し、トリプシンＥＤＴＡを５０μＬウェルに加え、プレートを５分間３７℃でインキュベートした後、分離した細胞を丸底の９６ウェルプレートに移した。丸底の９６ウェルプレートを３００×ｇ、４℃で４分間、遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿物をフローＢＳＡ含有ＰＢＳ－／－溶液２００μＬで洗浄し、ＣＤ４５抗体およびカルセインＡＭを含むＢＳＡ含有ＰＢＳ－／－溶液１００μＬに３０分間室温で細胞を再懸濁した。次いで、試料をＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により解析した。
【0129】
[実施例４]ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球の結合特異性の解析
ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲにより増強される、腫瘍細胞に対する細胞毒性の根底にある分子機構をさらに調査するために、塩素イオンチャネル（ＣＬＣＮ３）、リン脂質タンパク質アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）およびマトリックスメタロペプチダーゼ２（ＭＭＰ２）を含む潜在的ＣＬＴＸリガンドの生物学的機能を調べた。誘導性Ｃａｓ１３ｄ媒介遺伝子ノックダウンプラットフォームを使用して、候補遺伝子発現を抑制した。ピューロマイシン選択後、トランスフェクトした神経膠芽腫細胞のおよそ７８％が、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）存在下のｅＧＦＰ発現により示すようにＣａｓ１３ｄを発現した。ＲＴ－ＰＣＲ解析では、Ｕ８７ＭＧ ＧＢＭ細胞におけるＣＬＣＮ３、ＡＮＸＡ２およびＭＭＰ２のノックダウンの成功が確認された。非標的Ｃａｓ１３ｄシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を陰性対照として使用したところ（例えば、ＣＬＣＮ３およびＡＸＡＮ２ｓｇＲＮＡをＭＭＰ２ｓｇＲＮＡの陰性対照として使用した）、明らかな交差遺伝子ノックダウン作用は観察されなかった。注目すべきことには、ＣＬＣＮ３またはＡＮＸＡ２ではなく、ＭＭＰ２のノックダウンにより、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球媒介腫瘍細胞殺傷が有意に減少した。
ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲにより増強される、腫瘍細胞に対する細胞毒性の根底にある分子機構をさらに調査するために、塩素イオンチャネル（ＣＬＣＮ３）、リン脂質タンパク質アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）およびマトリックスメタロペプチダーゼ２（ＭＭＰ２）を含む潜在的ＣＬＴＸリガンドの生物学的機能を調べた。誘導性Ｃａｓ１３ｄ媒介遺伝子ノックダウンプラットフォームを使用して、候補遺伝子発現を抑制した。ピューロマイシン選択後、トランスフェクトした神経膠芽腫細胞のおよそ７８％が、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）存在下のｅＧＦＰ発現により示すようにＣａｓ１３ｄを発現した。ＲＴ－ＰＣＲ解析では、Ｕ８７ＭＧ ＧＢＭ細胞におけるＣＬＣＮ３、ＡＮＸＡ２およびＭＭＰ２のノックダウンの成功が確認された。非標的Ｃａｓ１３ｄシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を陰性対照として使用したところ（例えば、ＣＬＣＮ３およびＡＸＡＮ２ｓｇＲＮＡをＭＭＰ２ｓｇＲＮＡの陰性対照として使用した）、明らかな交差遺伝子ノックダウン作用は観察されなかった。注目すべきことには、ＣＬＣＮ３またはＡＮＸＡ２ではなく、ＭＭＰ２のノックダウンにより、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球媒介腫瘍細胞殺傷が有意に減少した。
【0130】
ＣＡＲ好中球活性とＭＭＰ２との間の関連性をさらに決定するために、種々の腫瘍細胞におけるＡＮＸＡ２、ＣＬＣＮ３およびＭＭＰ２の遺伝子発現レベルを評価した。予想どおり、Ｕ８７ＭＧ、ＧＢＭ４３およびＳＪ－ＧＢＭ細胞は、最も高いＭＭＰ２発現レベルを呈した。直線回帰解析により、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球の腫瘍溶解が、ＭＭＰ２発現に依存する可能性が最も高いことが実証された。ＧＢＭ細胞と比較して、ＭＭＰ２は、ＣＡＲ好中球により媒介される溶解においてこれらのアポトーシスが最小限であることと一致して、正常ＳＶＧｐ１２グリア細胞およびｈＰＳＣ由来体細胞において低からごくわずかなレベルで発現する。このような知見により、膜タンパク質ＭＭＰ２が、腫瘍細胞を殺傷するためのＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲの認識およびＣＡＲ好中球の活性化に必要とされることがさらに実証される。これは、ヒト正常組織上でのＭＭＰ２発現がＧＢＭと比較して低いかまたはごくわずかであることを考慮すると、将来の臨床適用におけるＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球の安全性をも示唆する。
【0131】
[実施例５]ＭＭＰ２発現腫瘍細胞に結合するＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球における細胞内シグナル伝達の解析
ＧＢＭ刺激時に、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、ＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲｈＰＳＣ好中球よりも強力なＳｙｋのリン酸化活性化（ｐ－Ｓｙｋ）を呈した。注目すべきことには、リンパ球媒介細胞毒性に関与する鍵となるシグナル伝達媒介因子である、細胞外シグナル制御キナーゼ（Ｅｒｋ）１／２（ｐ－Ｅｒｋ１／２）の比率の有意な上昇も観察された。これは、活性化好中球におけるＳｙｋ－ｖａｖ１－Ｅｒｋ経路の潜在的活性化を示す。
ＧＢＭ刺激時に、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、ＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲｈＰＳＣ好中球よりも強力なＳｙｋのリン酸化活性化（ｐ－Ｓｙｋ）を呈した。注目すべきことには、リンパ球媒介細胞毒性に関与する鍵となるシグナル伝達媒介因子である、細胞外シグナル制御キナーゼ（Ｅｒｋ）１／２（ｐ－Ｅｒｋ１／２）の比率の有意な上昇も観察された。これは、活性化好中球におけるＳｙｋ－ｖａｖ１－Ｅｒｋ経路の潜在的活性化を示す。
【0132】
[実施例６]ｉｎ ｖｉｖｏでの解析
３次元（３－Ｄ）生体模倣ＧＢＭモデル
３－Ｄ生体模倣ＧＢＭモデルを構築して、高密度細胞外マトリックスおよび多様性腫瘍細胞亜型によりｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍適所様微小環境を模倣した。野生型対照と比較した場合、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、低酸素（３％Ｏ２）および正常酸素圧（２１％Ｏ２）の条件下でより高い腫瘍浸潤および腫瘍殺傷活性を示した。単層細胞培養物における知見と一致して、可溶性ＭＭＰ２およびサイトカラシンＤ（ＣｙｔｏＤ）による好中球の前処理よって、ＣＡＲ好中球の腫瘍浸潤活性および腫瘍細胞毒性が有意に低下した。
３次元（３－Ｄ）生体模倣ＧＢＭモデル
３－Ｄ生体模倣ＧＢＭモデルを構築して、高密度細胞外マトリックスおよび多様性腫瘍細胞亜型によりｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍適所様微小環境を模倣した。野生型対照と比較した場合、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、低酸素（３％Ｏ２）および正常酸素圧（２１％Ｏ２）の条件下でより高い腫瘍浸潤および腫瘍殺傷活性を示した。単層細胞培養物における知見と一致して、可溶性ＭＭＰ２およびサイトカラシンＤ（ＣｙｔｏＤ）による好中球の前処理よって、ＣＡＲ好中球の腫瘍浸潤活性および腫瘍細胞毒性が有意に低下した。
【0133】
低酸素下の野生型およびＣＡＲ好中球の抗腫瘍および腫瘍促進活性の根底にある分子機構をさらに調査するために、Ｎ１およびＮ２表現型解析を、単離した好中球に対して実施した。正常酸素圧と比較して、低酸素では、ＩＣＡＭ－１、ｉＮＯＳ、ＴＮＦαおよびＣＣＬ３を含むＮ１特異的マーカーの発現が有意に減少し、ＣＣＬ２、ＶＥＧＦ、ＣＣＬ５およびアルギナーゼを含むＮ２特異的マーカーが、野生型ｈＰＳＣ好中球において上昇した。反対に、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、低酸素下で高い発現レベルのＮ１マーカーを保持した。
【0134】
ＥＬＩＳＡを使用して、好中球－腫瘍同時培養後の培地において、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびＩＬ－６を含むヒトサイトカイン産生放出を検出した。野生型およびＣＡＲ好中球の両方は、腫瘍刺激後にＴＮＦαおよびＩＬ－６を産生し、ＣＡＲ好中球は、低酸素および正常酸素圧下で、最も高レベルの両サイトカインを維持した。注目すべきことには、低酸素により、野生型好中球においてサイトカイン放出が有意に減少した。まとめると、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、腫瘍適所を模倣する低酸素条件下で、抗腫瘍表現型を維持し、高い遊出能および抗腫瘍細胞毒性を保持した。詳細な結果は、図３および４に示す。
【0135】
ＧＢＭ異種移植マウスモデル
ｉｎ ｓｉｔｕでのＧＢＭ異種移植マウスモデルでは、ルシフェラーゼ発現ＧＢＭ細胞５×１０５細胞を免疫不全マウスの脳に頭蓋内注射した。好中球を腫瘍内または静脈内に投与して、これらのｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍殺傷活性を、ｈＰＳＣ由来ＣＡＲ－ＮＫ細胞と比較して調べた。注目すべきことには、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球は、ＧＢＭ細胞の殺傷が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞よりも有効であり、ＣＡＲ好中球とＣＡＲ－ＮＫ細胞との間の組合せによる作用は、観察されなかった。結果の詳細は、図５Ａ～５Ｈに示す。
ｉｎ ｓｉｔｕでのＧＢＭ異種移植マウスモデルでは、ルシフェラーゼ発現ＧＢＭ細胞５×１０５細胞を免疫不全マウスの脳に頭蓋内注射した。好中球を腫瘍内または静脈内に投与して、これらのｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍殺傷活性を、ｈＰＳＣ由来ＣＡＲ－ＮＫ細胞と比較して調べた。注目すべきことには、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球は、ＧＢＭ細胞の殺傷が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞よりも有効であり、ＣＡＲ好中球とＣＡＲ－ＮＫ細胞との間の組合せによる作用は、観察されなかった。結果の詳細は、図５Ａ～５Ｈに示す。
【0136】
腫瘍内注射実験では、腫瘍細胞接種後３時間に腫瘍担持マウスに単回用量のＰＢＳ、５×１０６細胞のＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球、ＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲｈＰＳＣ－ＮＫ細胞または対応する野生型対照を投与した。生物発光イメージング（ＢＬＩ）を実施して、３日目の最初のイメージング後に毎週、腫瘍増殖を監視した。ＰＢＳ処置マウスと比較した場合、ｈＰＳＣ由来好中球またはＮＫ細胞による処置によって、腫瘍量が有意に減少した。ｈＰＳＣ由来ＣＬＴＸ－ＮＫ－ＣＡＲ ＮＫ細胞およびＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ好中球は、マウスにおいて野生型対照よりも高い抗腫瘍細胞毒性を呈し、これらのマウスは、安定な体重を維持した。注目すべきことには、ＰＢＳ処置腫瘍担持マウスのうちの１匹は、レシピエント脳における腫瘍の異常増殖のため３０日目に死んだ。結果は、図６Ａ～６Ｅに示す。
【0137】
静脈内注射実験では、ＣＡＲ好中球５×１０６細胞を毎週、腫瘍担持マウスに投与した。ＣＡＲ好中球のｉｎ ｖｉｖｏでの体内分布および輸送を追跡するために、Ｃｙ５で好中球を標識した後、全身的注射を行い、全身投与後１、５および２４時間に蛍光イメージングを実施した。好中球は、１時間以内にマウスの全身を通行し、好中球注射後５時間に類似の体内分布を保持した。野生型好中球と比較して、ＣＡＲ好中球は、ＢＢＢを効率的に通過し、２４時間後にマウス脳のＧＢＭ異種移植片を通行した。静脈内投与試験中の実験マウス群にわたって、体重の有意な変化は観察されなかった。腫瘍内投与試験と一致して、ＣＡＲ好中球は、ＧＢＭ異種移植片のＢＬＩ解析ならびに明視野およびＨ＆Ｅ染色画像によるマウスにおいてＰＢＳおよび野生型対照よりも高い抗腫瘍細胞毒性を呈した。注目すべきことには、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球で処置した腫瘍担持マウスにより、ＣＡＲ－ＮＫ細胞で処置したマウスと比較して腫瘍量の有意な減少が実証され、マウスにおけるＢＢＢ通過およびＧＢＭ異種移植片浸透において好中球の優れた能力が示唆された。
【0138】
ＣＡＲ好中球とは対照的に、野生型ｈＰＳＣ好中球または末梢血（ＰＢ）好中球の毎週の投与により、ＣＡＲ－ＮＫ細胞有り無しの脳における腫瘍の増殖が有意に促進されて、早くて２１日目に腫瘍担持マウスが死んだ。ＧＢＭの神経外転移が珍しく、病態形成が未知であるにもかかわらず、ｅｘ ｖｉｖｏによる種々の臓器および／または組織のＢＬＩ画像により決定した場合、野生型ｈＰＳＣ由来またはＰＢ好中球で処置した腫瘍担持マウスにおいて全身的転移が生じ、ヒトＧＢＭの頭蓋外転移における好中球の潜在的役割が示唆された。実験結果は、図７Ａ～７Ｈおよび図１２Ａ～１２Ｇに詳細に示す。
【0139】
ＴＮＦαおよびＩＬ－６を含むヒトサイトカイン放出を、種々の実験マウス群の血漿において測定した。すべての非ＰＢＳ実験群において、５日目から２６日目に血漿中に検出可能なＴＮＦαおよびＩＬ－６が産生され、ＣＡＲ好中球は、最も高いレベルの両サイトカインを維持した。
【0140】
好中球媒介転移の根底にある機構をさらに調査する努力において、マウス血液からヒト好中球を回収し、抗腫瘍（Ｎ１）または腫瘍促進（Ｎ２）表現型解析に供した。野生型ｈＰＳＣまたはＰＢ好中球において、腫瘍異種移植により、ｉＮＯＳおよびＴＮＦαを含むＮ１特異的マーカーの発現が有意に減少し、ＶＥＧＦおよびアルギナーゼを含むＮ２特異的マーカーが増加した。反対に、ＣＬＴＸ－Ｔ－ＣＡＲ ｈＰＳＣ好中球は、高い発現レベルのＮ１マーカーを保持し、これは、腫瘍担持マウスにおける、これらの強力な抗腫瘍細胞毒性およびサイトカイン放出と一致する。まとめると、データにより、ｈＰＳＣ由来ＣＡＲ好中球が、種々の腫瘍適所様条件下で抗腫瘍活性を維持し、腫瘍細胞を効率的に殺傷し、末梢血好中球、ｈＰＳＣ好中球およびＣＬＴＸ－ＮＫ ＣＡＲ細胞と比較して動物の生存を延長することが可能であることが実証される。
【0141】
実験モデルおよび対象の詳細
ドナープラスミド構築。ＡＡＶＳ１部位を標的とするドナープラスミドを、これまでに記載のように構築した（Chang et al., 2020）。簡潔には、ＣＡＧ－ＩＬ１３Ｔ－ＣＡＲプラスミドを生成するために、ＴＱＭ－ＩＬ１３ＣＡＲ断片（Kim et al., 2020）を、Ａｄｄｇｅｎｅ社のプラスミド＃１５４０５４から増幅し、次いで、ＡＡＶＳ１－ＰｕｒｏＣＡＧ－ＦＵＣＣＩドナープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社；＃１３６９３４）にクローニングし、ＦＵＣＣＩを置換した。ＣＡＧ－ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲプラスミドでは、シグナルペプチドを含むクロロトキシン配列を直接合成し（ＧｅｎｅＷｉｚ社）、ＣＡＧ－ＩＬ１３Ｔ－ＣＡＲにおけるＩＬ－１３配列の置換に使用した。ＣＡＧ－ＣＬＴＸ ＮＫ－ＣＡＲプラスミドでは、コンジュゲートしたＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４およびＣＤ３－ζ配列を直接合成し、ＣＡＧ－ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲにおけるＣＤ４ｔｍおよびＣＤ３－ζ配列の置換に使用した。すべてのＣＡＲ構築物は、シーケンシングし、Ａｄｄｇｅｎｅ社に提出した（＃１５７７４２、＃１５７７４３および＃１５７７４４）。
ドナープラスミド構築。ＡＡＶＳ１部位を標的とするドナープラスミドを、これまでに記載のように構築した（Chang et al., 2020）。簡潔には、ＣＡＧ－ＩＬ１３Ｔ－ＣＡＲプラスミドを生成するために、ＴＱＭ－ＩＬ１３ＣＡＲ断片（Kim et al., 2020）を、Ａｄｄｇｅｎｅ社のプラスミド＃１５４０５４から増幅し、次いで、ＡＡＶＳ１－ＰｕｒｏＣＡＧ－ＦＵＣＣＩドナープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社；＃１３６９３４）にクローニングし、ＦＵＣＣＩを置換した。ＣＡＧ－ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲプラスミドでは、シグナルペプチドを含むクロロトキシン配列を直接合成し（ＧｅｎｅＷｉｚ社）、ＣＡＧ－ＩＬ１３Ｔ－ＣＡＲにおけるＩＬ－１３配列の置換に使用した。ＣＡＧ－ＣＬＴＸ ＮＫ－ＣＡＲプラスミドでは、コンジュゲートしたＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４およびＣＤ３－ζ配列を直接合成し、ＣＡＧ－ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲにおけるＣＤ４ｔｍおよびＣＤ３－ζ配列の置換に使用した。すべてのＣＡＲ構築物は、シーケンシングし、Ａｄｄｇｅｎｅ社に提出した（＃１５７７４２、＃１５７７４３および＃１５７７４４）。
【0142】
ｈＰＳＣの維持および分化。Ｈ９、Ｈ１、６－９－９および１９－９－１１ｈＰＳＣ株をＷｉＣｅｌｌ社から得、マトリゲルまたはｉＭａｔｒｉｘ５１１でコーティングしたプレート上のｍＴｅＳＲｐｌｕｓ培地に維持した。好中球分化では、ｈＰＳＣを０．５ｍＭのＥＤＴＡで解離させ、１０，０００～８０，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、ｉＭａｔｒｉｘ５１１でコーティングした２４ウェルプレート上の５μＭのＹ２７６３２を加えたｍＴｅＳＲｐｌｕｓ培地に２４時間播種した（－１日目）。０日目に、１００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｖｃ）中の６μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）で細胞を処理した後、１日目から４日目に培地をＬａｓＲ基礎培地と交換した。２日目から４日目に５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを培地に加えた。４日目に、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦおよびＦＬＴ３Ｌを添加したＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地（Ｓｉｇｍａ社）と培地を交換した。６日目に、ＳＢ４３１５４２を含む培地を吸引し、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦおよびＦＬＴ３Ｌを加えたＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中に細胞を維持した。９日目および１２日目に、上半分の培地を吸引し、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３Ｌおよび２５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含む新鮮なＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地０．５ｍｌと交換した。１５日目の浮遊細胞を穏やかに回収し、濾過して、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１５０ｎｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦおよび２．５μＭのレチノイン酸アゴニストＡＭ５８０を添加したＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中で好中球の最終分化を行った。培地半分の交換を３日毎に実施し、成熟好中球を回収して、２１日目から解析することができた。
【0143】
ｈＰＳＣのヌクレオフェクションおよび遺伝子型決定。細胞生存率を上昇させるために、１０μＭのＹ２７６３２を使用して、ｈＰＳＣを３～４時間処理した後ヌクレオフェクションを行うか、またはｈＰＳＣを一晩処理した。次いで、細胞をアキュターゼにより８～１０分間剥離し、ｈＰＳＣ１～２．５×１０６細胞に、ヒト幹細胞ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ社；＃ＶＡＰＨ－５０１２）１００μｌまたは室温のＰＢＳ－／－２００μｌ中のＳｐＣａｓ９ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡ Ｔ２（Ａｄｄｇｅｎｅ社；＃７９８８８）６μｇおよびＣＡＲドナープラスミド６μｇを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ２ｂのｐｒｏｇｒａｍＢ－０１６を使用してヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションした細胞は、マトリゲルでコーティングした６ウェルプレートのあるウェル内の、１０μＭのＹ２７６３２を有する予熱したｍＴｅＳＲｐｌｕｓまたはｍＴｅＳＲ１ ３ｍｌに播種した。２４時間後、５μＭのＹ２７６３２を含む新鮮なｍＴｅＳＲｐｌｕｓまたはｍＴｅＳＲ１と培地を交換した後、毎日の培地交換を行った。細胞が８０％を超えてコンフルエントとなると、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）により、２４時間、薬物選択を実施した。細胞を回収すると、１μｇ／ｍｌのＰｕｒｏを約１週間持続的に適用した。次いで、組織培養フード内で顕微鏡を使用して個々のクローンを選び、マトリゲルで予めコーティングした９６ウェルプレートの各ウェルで２～５日間増殖させた後、ＰＣＲによる遺伝子型決定を行った。単一クローン由来ｈＰＳＣのゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社；＃ＱＥ０９０５０）４０μｌに細胞を掻き入れることにより抽出した。２×ＧｏＴａｑＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社；＃７１２３）を使用して、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲを実施した。
【0144】
陽性遺伝子型決定では、次のプライマー対：ＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣ［配列番号４］およびＴＣＧＴＣＧＣＧＧＧＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧ［配列番号５］を６５℃のアニーリング温度Ｔｍで使用した。ホモ接合性スクリーニングでは、我々はプライマー配列の次のセット：ＣＧＧＴＴＡＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴ［配列番号６］およびＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡ［配列番号７］を６０℃のアニーリング温度Ｔｍで使用した。
【0145】
造血系コロニー形成アッセイおよびライトギムザ染色。採取した細胞をサイトカイン含有ＭｅｔｈｏＣｕｌｔＨ４４３４培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー）１．５ｍＬ中３７℃で増殖させた。造血系コロニーをコロニー形成単位（ＣＦＵ）について細胞形態に従って点数化した。細胞形態を評価するために、好中球をスライドガラス上に固定し、ライトギムザ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で染色した。
【0146】
フローサイトメトリー解析。分化細胞を穏やかにピペットで滴下し、５０ｍＬのチューブ上に配置した７０または１００μｍの濾過器により濾過した。次いで、細胞を遠心分離により沈殿させ、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ－／－溶液で２回洗浄した。細胞を適切にコンジュゲートした抗体により室温の暗室で２５分間染色し、ＢＳＡ含有ＰＢＳ－／－溶液による洗浄後にＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって解析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して収集したフローデータを処理した。
【0147】
トランズウェル遊走アッセイ。分化好中球をＨＢＳＳ緩衝液に再懸濁し、ｆＭＬＰ（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）に対して２時間遊走させた。下チャンバーに遊走した細胞を０．５ＭのＥＤＴＡにより放出し、ＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用して計数した。生きた好中球をゲーティングし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより解析した。次いで、好中球数は、各ウェルに加えた細胞の総数により正規化した。
【0148】
２Ｄ化学遊走アッセイ。２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．５％のＦＢＳを加えたＨＢＢＳに分化好中球を再懸濁し、コラーゲンコーティングＩＢＩＤＩ化学遊走μスライドに添加し、次いで、これを３７℃で３０分間インキュベートして細胞を接着させた。１０００ｎＭのｆＭＬＰを１５μＬ右リザーバー内に添加し、１８７ｎＭの最終ｆＭＬＰ濃度を得た。細胞遊走は、ＬＳＭ７１０（Ｚｉｅｓｓ社ＥＣ Ｐｌａｎ－ＮＥＯＦＬＵＡＲ１０×／０．３対物レンズとともに）を使用して３７℃で６０秒毎に計１２０分間記録した。細胞をＩｍａｇｅＪプラグインのＭＴｒａｃｋＪにより追跡した。
【0149】
食作用。製造者のプロトコールに従ってｐＨｒｏｄｏＧｒｅｅｎ大腸菌（E. coli）ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓコンジュゲートを使用して食作用を評価した。簡潔には、ｐＨｒｏｄｏＧｒｅｅｎ大腸菌（E. coli）ビーズをＰＢＳ ２ｍＬに再懸濁し、超音波処理器で３回超音波処理した。アッセイ毎のビーズ（１００ｍＬ）を、オプソニン化試薬と１：１の比率で混合することによりオプソニン化し、３７℃で１時間インキュベートした。ビーズをｍＨＢＳＳ緩衝液により４℃の１，５００ＲＣＦで１５分間遠心分離することによって３回洗浄し、ｍＨＢＳＳ緩衝液に再懸濁した。分化好中球をオプソニン化基礎液１００μＬに再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした後、ＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用してフローサイトメトリー解析を行った。
【0150】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの好中球媒介細胞毒性アッセイ。細胞生存率をフローサイトメトリーにより解析した。簡潔には、腫瘍細胞（５００００細胞／ｍＬ）１００μＬを、９６ウェルプレート内で１５０，０００、２５０，０００および５００，０００細胞／ｍＬの好中球１００μＬと混合し、次いで、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。すべての細胞を回収するために、第１に、細胞含有培地を新たな丸底の９６ウェルプレート内に移し、トリプシンＥＤＴＡを５０μＬ空のウェルに加えた。５分間３７℃のインキュベーション後、接着した細胞を解離させ、懸濁培養物を有する丸底の９６ウェルプレートの同一のウェル内に移した。細胞はすべて、９６ウェルプレートを３００×ｇ、４℃で４分間遠心分離することにより沈殿させ、０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ－／－溶液２００μＬで洗浄した。次いで、沈殿させた細胞混合物をＣＤ４５抗体およびカルセインＡＭにより３０分間室温で染色し、ＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって解析した。
【0151】
神経膠芽腫細胞における誘導性遺伝子ノックダウン。神経膠芽腫細胞における誘導性遺伝子ノックダウンを達成するために、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）に基づく一体型誘導性Ｃａｓ１３ｄプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社＃１５５１８４）を実行した。ＣＬＣＮ３、ＡＮＸＡ２およびＭＭＰ２標的ｓｇＲＮＡを、オンラインツール（https://cas13design.nygenome.org/）を使用して設計し、Ｃａｓ１３ｄ骨格にクローニングして一体型ＣＬＣＮ３、ＡＮＸＡ２およびＭＭＰ２標的プラスミドを生成した。次いで、生じたＣａｓ１３ｄプラスミドをｈｙＰＢａｓｅプラスミド（Dr. Pentao Liuにより寄贈）とともに、ＰＥＩトランスフェクションによりＵ８７ＭＧ細胞内に導入した。２～４日後、トランスフェクトした細胞を５μｇ／ｍＬのピューロマイシンで１または２日間処理して、薬物耐性腫瘍細胞を選択した。回収後、生存腫瘍細胞をピューロマイシン条件下で維持して、組み込んだ導入遺伝子の潜在的サイレンシングを回避した。
【0152】
コンジュゲート形成アッセイ。免疫シナプスを可視化するために、Ｕ８７ＭＧ細胞（５０，０００細胞／ｍＬ）１００μＬを９６ウェルプレートのウェル上に播種し、３７℃で１２時間インキュベートして、これらを接着させた。次いで、好中球（５００，０００細胞／ｍＬ）１００μＬを標的Ｕ８７ＭＧ細胞上に加え、６時間インキュベートした後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で固定した。次いで、Ｆ－アクチンＶｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎＢｉｏｃｈｅｍＫｉｔ（ＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎＩｎｃ．社）を使用して細胞骨格染色を実施した。
【0153】
トロゴサイトーシスアッセイ。腫瘍細胞から好中球への膜移入および細胞内含量を、顕微鏡およびフローサイトメトリー解析の両方を使用して調べた。標的腫瘍細胞は、カルセインＡＭ（１μＭ）により３０分間３７℃で標識した。ＰＢＳによる洗浄後、カルセインＡＭ標識腫瘍細胞を好中球とともに好中球対腫瘍細胞比１０：１でインキュベートした。種々の時点で（０～６時間）、生じた同時培養試料をＬｅｉｃａＤＭｉ－８蛍光顕微鏡により画像化した。浮遊する好中球を採取してＣＤ４５染色し、０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ－／－溶液で洗浄後、ＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓフローサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により解析した。
【0154】
好中球における反応性酸素種（ＲＯＳ）産生の測定。Ｕ８７ＭＧ細胞（３０，０００細胞／ｍＬ）１００μＬを９６ウェルプレートのウェル内に播種して１２時間後、好中球対腫瘍細胞比１０：１で好中球を加えた。１２時間の同時インキュベーション後、生じた細胞混合物を１０μＭのＨ２ＤＣＦＤＡにより３７℃で５０分間処理し、次いで、蛍光放射シグナル（４８０～６００ｎｍ）をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により励起波長４７５ｎｍで収集した。
【0155】
血液脳関門（ＢＢＢ）遊出アッセイ。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢＢＢモデルをＨＢＥＣ－５ｉ細胞によりトランズウェル細胞培養プレートにおいて構築した。簡潔には、ＨＢＥＣ－５ｉ細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、２４ウェルトランズウェルプレート（孔径８μｍ、直径６．５ｍｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）内のゼラチン（１％ｗ：ｖ）を予めコーティングしたトランズウェルの上チャンバー上に播種し、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に維持した。次いで、好中球２×１０５細胞を上チャンバーに加え、ｆＭＬＰ（１０ｎＭ）有り無しのＦＢＳ不含培地を下チャンバーに加えた。３時間のインキュベーション後、上または下チャンバーから細胞培養物を採取して、好中球数を算出した。細胞毒性解析では、Ｕ８７ＭＧ細胞２×１０４細胞を下チャンバーに播種して１２時間後、好中球（２×１０５細胞）を上チャンバーに加え、次いで、ｆＭＬＰ（１０ｎＭ）を有するＦＢＳ不含培地を下チャンバーに加えた。１２時間のインキュベーション後、腫瘍細胞生存率をフローサイトメトリー解析により決定した。第２の遊走解析では、第１の遊走の下部チャンバーの好中球２×１０５細胞を、第２のトランズウェルＢＢＢモデルの上チャンバー上に播種し、下部チャンバーの標的腫瘍細胞に遊走した好中球を定量した。
【0156】
３Ｄ腫瘍球状体の好中球浸潤。懸滴方法を使用して３Ｄ腫瘍球状体を得た。簡潔には、２×１０６細胞／ｍＬのＵ８７ＭＧ細胞を、１０％のＦＢＳおよび０．３％のメチルセルロースを加えたＭＥＭ培地に懸濁し、２０μＬのピペッターを使用して逆蓋の９６ウェルプレート上に個々の液滴として沈着させた。次いで、ＰＢＳで満たした下部チャンバー上に覆蓋を戻し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞凝集物が形成されるまで約５～７日の間、懸滴を毎日監視した。各細胞凝集物を２４ウェルプレートの単一ウェルに移してサブストリーム解析を行った。ＣＬＴＸ Ｔ－ＣＡＲ好中球の腫瘍浸透能を評価するために、好中球２×１０５細胞／ウェルを２４ウェルプレートのウェルに加え、腫瘍球状体とともにインキュベートした。２４時間の同時インキュベーション後、腫瘍球状体を固定し、ＣＤ４５およびＤＡＰＩについて染色した。細胞毒性解析では、好中球および腫瘍球状体の混合物を、１μＭのカルセインＡＭおよび１μＭのプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で染色した。次いで、染色した細胞を、ＬｅｉｃａＤＭｉ－８蛍光顕微鏡を使用して画像化した。
【0157】
ＧＢＭ異種移植試験。すべてのマウス実験は、パデュー動物実験委員会（Purdue Animal Care and Use Committee、ＰＡＣＵＣ）により認可された。免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－ＲＡＧ１ｔｍ１ＭｏｍＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＲＧ）マウスを繁殖させ、パデュー大学がん研究センター（Purdue University Center for Cancer Research）のＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｖａｌｕａｔｉｏｎＣｏｒｅにより維持した。ｉｎ ｓｉｔｕでの異種移植マウスモデルを、免疫不全マウスの脳へのルシフェラーゼ発現ＧＢＭ細胞５×１０５細胞の頭蓋内注射により構築した。好中球５×１０６細胞を、腫瘍内または静脈内注射のいずれかにより投与して、これらのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を評価した。腫瘍量は、生物発光イメージング（ＢＬＩ）により監視し、１週間に約１回、実験マウスの体重を測定した。
【0158】
統計学的解析。データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計学的有意性は、２群間のＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（両側）により判定し、３群以上は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により解析した。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であると考えた。
【0159】
当業者は、上記の特定の実行に多数の修飾を加えることが可能であることを認識する。実行は、記載する特定の制限に限定されるべきではない。他の実行も可能であり得る。
【0160】
本発明は、図面および前述の記載により詳細に例示および記載しているが、これは、特性の制限ではなく例示として考えるべきであり、特定の実施形態のみを指示および記載しており、本発明の趣旨に含まれるすべての変更および修飾を保護することが望ましいことが理解される。本発明の方法および装置の範囲が、次の特許請求の範囲により定義されることを意図する。ただし、本開示が、この趣旨または範囲から逸脱することなく、詳細に説明および例示されるだけでなく、実行され得ることが理解されなければならない。本明細書に記載の実施形態の種々の代替物が、次の特許請求の範囲に定義する趣旨および範囲から逸脱することなく、本特許請求の範囲の実行において利用され得ることが当業者には理解されるはずである。
【0161】
参考文献
【0162】
【表1-1】
【0163】
【表1-2】
【0164】
【表1-3】
【0165】
【表1-4】
【0166】
【表1-5】
【0167】
【表1-6】
【0168】
【表1-7】
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図7-5】
【図7-6】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】