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特表2024-501497血液からの微生物の濃縮及び同定のためのシステム、方法、及び装置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-12
(54)【発明の名称】血液からの微生物の濃縮及び同定のためのシステム、方法、及び装置
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6888 20180101AFI20240104BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240104BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20240104BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20240104BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240104BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240104BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20240104BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6888 Z
C12Q1/04
C12Q1/689 Z
C12Q1/6844 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6813 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023536804
(86)(22)【出願日】2021-12-14
(85)【翻訳文提出日】2023-08-14
(86)【国際出願番号】 US2021063288
(87)【国際公開番号】W WO2022132754
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】63/126,041
(32)【優先日】2020-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514118217
【氏名又は名称】バイオファイア・ダイアグノスティクス，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー
(71)【出願人】
【識別番号】502073946
【氏名又は名称】ビオメリュー・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】オット クラウザー， エリザベス メアリー
(72)【発明者】
【氏名】シャウブ， マルタ エリザベス
(72)【発明者】
【氏名】リッチ， エドワード プレストン
(72)【発明者】
【氏名】ハッチ， アンドリュー カーター
(72)【発明者】
【氏名】サッチャー， ステファニー アン
(72)【発明者】
【氏名】ヒル， ライアン ティー．
(72)【発明者】
【氏名】ロンシック， クリストファー エス．
(72)【発明者】
【氏名】ウィルソン， マーク エス．
(72)【発明者】
【氏名】ウォルシュ， ジョン ディー．
(72)【発明者】
【氏名】ライリー， カーク エム．
(72)【発明者】
【氏名】ローパー， クラーク エル．
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ06
4B063QQ07
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS24
4B063QX01
(57)【要約】
微生物を含有することが知られる、又は含有し得るサンプルから微生物を単離及び同定するためのシステム、方法、及び装置に関する。
【選択図】図７
【選択図】図７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
微生物を単離及び同定する方法であって、（ａ）前記微生物を含有することが疑われるある体積の血液サンプルを提供するステップと；
（ｂ）前記血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、溶解血液細胞及び非溶解微生物を含むライセートを得ることと；
（ｃ）前記ライセートからの前記微生物を濃縮するステップと；
（ｄ）前記微生物を、前記微生物を同定するのに必要とされる１つ以上の試薬を含む装置に添加することと；
（ｅ）前記血液サンプル中に存在する前記微生物を同定することと、
を含み、
ここで前記微生物が、存在する場合、前記提供された血液サンプルの体積に対して２５～１００倍の範囲内で濃縮され、
ここで前記微生物が、存在する場合、前記提供された血液サンプル中で＜約１ＣＦＵ／ｍｌ～約２０ＣＦＵ／ｍｌの範囲内の濃度を有する、方法。
【請求項2】
ステップ（ａ）～（ｃ）が、約１０～２０分の時間範囲内で完了され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップ（ｄ）及び（ｅ）が、４時間未満、好ましくは、３時間未満、好ましくは、２時間未満、又はより好ましくは、１時間未満の時間範囲内で完了され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記微生物が、血液媒介感染症に関連する細菌又は真菌生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記同定が、分子検査、表現型検査、プロテオミクス検査、光学検査、又は培養に基づく検査の１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記同定が、前記微生物の特徴を有する１つ以上の核酸を前記微生物から単離するステップと、前記１つ以上の核酸を分析し、前記血液サンプル中に存在する前記微生物を同定するステップと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記同定が、１つ以上の核酸を増幅し、次に前記１つ以上の増幅された核酸を検出することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記１つ以上の増幅された核酸の前記検出が、ｄｓＤＮＡ結合色素、リアルタイムＰＣＲ、増幅後核酸融解ステップ、核酸配列決定ステップ、標識ＤＮＡ結合プローブ、又は非標識プローブの１つ以上の使用を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
同定する前記ステップが、約５～７５分の時間範囲内で完了され得る、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
培地中で前記濃縮微生物に対する培養ステップを実施し、前記微生物の濃度を増加させ、次に同定する前記ステップを実施することをさらに含み、ここで前記培養ステップが、４時間以下、３時間以下、又は２時間以下、好ましくは、３時間以下かけて実施される、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ディファレンシャル溶解緩衝液が、前記血液サンプルを前記ディファレンシャル溶解緩衝液と混合する前、緩衝物質、非イオン界面活性剤、塩、及び約１０～１１のｐＨ範囲を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記ディファレンシャル溶解緩衝液が、前記血液サンプル及び前記ディファレンシャル溶解緩衝液の混合後、約７．０～８．０のｐＨを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記緩衝物質が、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、且つ前記緩衝物質が、好ましくは、ＣＡＰＳである、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記血液サンプルと混合された前記ディファレンシャル溶解緩衝液の前記ｐＨが、前記緩衝物質のｐＨ緩衝範囲を下回る、約１．５～２．５のｐＨ単位である、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）エーテル、好ましくは、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００（別名、ポリ（オキシ－１，２－エタンジイル））、ＢｒｉｊＯ１０、及びノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（別名、Ｂｒｉｊ３５）の１つ以上である、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記非イオン界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００、ＢｒｉｊＯ１０（別名、Ｂｒｉｊ９６／９７）、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（別名、Ｂｒｉｊ３５）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項17】
前記ライセートからの前記微生物の濃縮が、遠心分離を含み、且つ前記濃縮が、溶解された血液画分を含む上清画分から、前記微生物を含むペレット画分を回収することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記ディファレンシャル溶解緩衝液と混合された前記血液サンプルを遠心濃縮器内に配置することと、前記遠心濃縮器を遠心分離し、前記微生物を前記チャンバー内に配置された前記血液サンプルから濃縮することと；
前記濃縮微生物を、チャンバーの第２の末端の第２の開放部から生じさせる、好ましくは、前記ペレットを前記遠心濃縮器の前記第２の末端からバイアル又はアッセイ装置に無菌的に生じさせることと、
をさらに含み、ここで前記遠心濃縮器が、
第１の末端に開放部及び前記第２の末端にシール部分を有するチャンバーであって、前記シール部分が、前記チャンバーの前記第２の末端で第２の開放部を密封するために設計される、チャンバー；及び
前記チャンバーの内側に少なくとも部分的に可動的に配置されたプランジャーであって、前記シール部分を開放するように作動させるために設計されるプランジャー
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記遠心濃縮器が、前記微生物を前記ライセートから分離するための高密度クッション又は物理的なセパレータを含まない、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記血液サンプル及び前記ディファレンシャル溶解緩衝液を第１の容器内で混合し、次に前記ライセートを、前記遠心濃縮器内に前記血液サンプル及び前記ディファレンシャル溶解緩衝液以外の成分を含む、前記遠心濃縮器に移すこと、遠心分離後に前記遠心濃縮器を開放し、上清画分をデカントすること、前記血液サンプルを前記ディファレンシャル溶解緩衝液と混合する前の培養ステップ、又は前記ライセート中のゲノムＤＮＡを消化するためのＤＮａｓｅステップの１つ以上を含まない、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記血液サンプルを前記ディファレンシャル溶解緩衝液と混合する前の培養ステップ、又は前記ライセート中のゲノムＤＮＡを消化するためのＤＮａｓｅステップの１つ以上を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記微生物が、濾過技術によって前記ライセートから濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
上に濃縮微生物を有するフィルターを、前記血液サンプル中に存在する前記微生物を同定するために設計された培養装置又はアッセイ装置の１つ以上に加えることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記血液サンプルを前記ディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、前記ライセートを得るステップ、及び前記微生物を前記ライセートから分離するステップが、単一チューブ内で達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
前記ディファレンシャル溶解緩衝液が、前記単一チューブ内に提供される単一緩衝液である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ディファレンシャル溶解緩衝液が、ＤＮａｓｅ又はプロテアーゼを含まず、且つ前記方法が、外因性ＤＮａｓｅ又はプロテアーゼを前記単一チューブに添加するステップを含まない、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
前記ディファレンシャル溶解緩衝液が、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ） ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）、ヘパラン、フッ化／シュウ酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤に適合する、請求項１に記載の方法。
【請求項28】
血液からの微生物を濃縮及び同定する方法であって、（ａ）前記微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプルを提供することと；
（ｂ）前記血液サンプルを、緩衝物質、非イオン界面活性剤、及び塩を含むディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、前記混合により、溶解血液細胞及び非溶解微生物を含むライセートを得ることと；
（ｃ）前記ライセートからの前記微生物を濃縮することと；
（ｄ）前記血液サンプル中に存在する前記微生物を同定することと、
を含み、ここで前記ディファレンシャル溶解緩衝液と混合された前記血液サンプルが、約７．０～８．０のｐＨを有し、且つ前記緩衝物質が、約８．６～１１．４の有用なｐＨ緩衝範囲を有し、ここで前記微生物が、前記提供された血液サンプルの開始体積に対して２５～１００倍の範囲内で濃縮され、ここで前記同定が、４時間以下、３時間以下、２時間以下、又は好ましくは、１時間以下で達成される、方法。
【請求項29】
前記同定が、分子検査、表現型検査、プロテオミクス検査、光学検査、又は培養に基づく検査の１つ以上を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記同定が、前記微生物から前記微生物の特徴を有する１つ以上の核酸を単離するステップと、前記１つ以上の核酸を分析し、前記血液サンプル中に存在する前記微生物を同定するステップと、を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）エーテル、好ましくは、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００（別名、ポリ（オキシ－１，２－エタンジイル））、ＢｒｉｊＯ１０、及びノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（別名、Ｂｒｉｊ３５）の１つ以上である、請求項２８に記載の方法。
【請求項32】
前記非イオン界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００、ＢｒｉｊＯ１０（別名、Ｂｒｉｊ９６／９７）、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（別名、Ｂｒｉｊ３５）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項33】
前記緩衝物質が、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項34】
前記緩衝物質が、ＣＡＰＳであり、且つＣＡＰＳが、約９．７～１１．１のｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約１０．４のｐＫａを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記塩が、塩化ナトリウムである、請求項２８に記載の方法。
【請求項36】
前記濃縮の前の血液培養ステップ及び／又は前記ライセート中のゲノムＤＮＡを消化するためのＤＮａｓｅステップを含まない、請求項２８に記載の方法。
【請求項37】
ステップ（ａ）～（ｃ）が、約１０～２０分の時間範囲内で完了される、請求項２８に記載の方法。
【請求項38】
前記単離及び分析するステップが、約５～７５分の時間範囲内で完了され得る、請求項３０に記載の方法。
【請求項39】
前記ライセートを得るための時間が、約２～１０分の範囲内、好ましくは約５分である、請求項２８に記載の方法。
【請求項40】
前記ライセートを得ることが、前記組み合わせること以外のさらなるステップを含まない、請求項２８に記載の方法。
【請求項41】
微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプル；及び前記血液サンプルと組み合わされるディファレンシャル溶解緩衝液であって、水性媒体、緩衝物質、非イオン界面活性剤、及び塩を含むディファレンシャル溶解緩衝液
を含む組成物であって、約７．０～８．０のｐＨを有するとともに、前記緩衝物質が、約８．６～１１．４の有用なｐＨ緩衝範囲を有し、且つ２５℃で約９．５～約１０．７の範囲内のｐＫａを有する、組成物。
【請求項42】
前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）エーテル、好ましくは、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００（別名、ポリ（オキシ－１，２－エタンジイル））、ＢｒｉｊＯ１０、及びノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（別名、Ｂｒｉｊ３５）の１つ以上である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項43】
前記非イオン界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００、ＢｒｉｊＯ１０（別名、Ｂｒｉｊ９６／９７）、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール（ｐｏｌｉｄｏｃｅｎｏｌ））、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項44】
前記緩衝物質が、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項45】
前記緩衝物質が、約９．７～１１．１の前記ｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約１０．４の前記ｐＫａを有するＣＡＰＳである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項46】
前記緩衝物質が、約７．０～８．０の前記ｐＨで実質的に正に荷電している、請求項４１に記載の組成物。
【請求項47】
ＤＮａｓｅを含まない、請求項４１に記載の組成物。
【請求項48】
微生物を含有することが知られる、又は含有し得る前記血液サンプル；緩衝物質を含む前記ディファレンシャル溶解緩衝液、及び
前記非イオン界面活性剤
から本質的になり、約７．０～８．０の前記ｐＨを有するとともに、前記緩衝物質が、約９．７～１１．１の前記有用なｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約１０．４の前記ｐＫａを有するＣＡＰＳである、請求項４１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０２０年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／１２６，０４１号に対する利益及び優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２０年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／１２６，０４１号に対する利益及び優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
１．技術分野
本開示の実施形態は、一般に、血液からの直接的な敗血症診断のためのシステム、方法、及び装置に関する。
本開示の実施形態は、一般に、血液からの直接的な敗血症診断のためのシステム、方法、及び装置に関する。
【背景技術】
【0003】
２．背景
米国、カナダ、及び西欧では、感染症は、人の死亡率の約７％を占める一方で、発展途上地域では、感染症は、人の死亡率の４０％超を占める。感染症は、種々の臨床症状を引き起こす。一般的な顕性徴候として、発熱、肺炎、髄膜炎、下痢、及び血液を含む下痢が挙げられる。身体的徴候がいくつかの病原体を示唆し、病原体としてそれら以外が除外される一方で、種々の原因物質の可能性が残り、明確な診断は、種々のアッセイの実施を必要とすることが多い。
米国、カナダ、及び西欧では、感染症は、人の死亡率の約７％を占める一方で、発展途上地域では、感染症は、人の死亡率の４０％超を占める。感染症は、種々の臨床症状を引き起こす。一般的な顕性徴候として、発熱、肺炎、髄膜炎、下痢、及び血液を含む下痢が挙げられる。身体的徴候がいくつかの病原体を示唆し、病原体としてそれら以外が除外される一方で、種々の原因物質の可能性が残り、明確な診断は、種々のアッセイの実施を必要とすることが多い。
【0004】
米国では、血流感染（ＢＳＩ）及び結果として生じる敗血症性ショック（敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、菌血症、真菌血症、カンジダ症、カンジダ血症、血液媒介感染症、及び他の関連用語とも称される）は、死亡の主因である。例えば、細菌ＢＳＩは、成人における主な死因の１１番目であり、幼児では７番目である。カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）及び他の真菌もまた、ＢＳＩを引き起こし得る。カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）の血流感染が高い死亡率（４０％）に関連することは、主に血液培養に要求される長い診断時間に寄与する。試験では、適切な抗菌又は抗真菌治療の開始により、死亡率を低下させることができ、そして抗菌薬投与する時間が遅れるごとに、死亡率の有意な増加が認められることが示されている。したがって、早期の検出及び確定診断、並びに適切な抗生物質又は抗真菌薬による迅速な治療が、ＢＳＩが疑われる患者の転帰改善のために望まれる。
【0005】
ＢＳＩの現在の診断ゴールドスタンダードは、培養下での生物の成長とそれに続く顕微鏡観察、継代培養、及び精製単離物の表現型同定を必要とする。この結果、報告時間は、グラム陽性細菌の場合に３６～７２時間、グラム陰性細菌の場合に４８～９６時間、そして真菌感染症の場合に４８～１２０時間に及ぶ。意外にも、真菌ＢＳＩに対する治療を受けている患者の約３分の１が、陽性の血液培養による成長を決して示さず、真菌ＢＳＩの多くの陽性症例が、単に死後分析に基づいて確定診断される。結果として、医師が、ＢＳＩを有することが疑われる患者に対して、培養のための採血直後での広域スペクトル抗生物質又は抗真菌薬のレジメンによって治療を開始することは典型的である。これは理想的でない。試験では、不適切又は無効な抗菌治療薬の投与が、患者の転帰を改善することに役立たず、悩ましいことに、薬剤耐性生物の増加を引き起こすことが見出されており、それと独立に、全体として患者の転帰及び公衆衛生が損なわれることが示されている。
【0006】
診断ゴールドスタンダード（即ち、古典的な微生物学的方法）に対する１つの代替策が、血液からの感染性細菌及び真菌の分子的同定を含む。しかし、ＢＳＩにおける全血中に見出される感染性生物の数は、通常低い（血液１ｍＬあたり約１～１００コロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）であり、培養で確認される敗血症を有するほとんどの個体において、約１～１０ｃｆｕ／ｍｌが典型的である）。さらに、血液は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のいくつかの阻害剤（例えば、ヘモグロビン及び他の血液タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）及びゲノムＤＮＡ：微生物と同時精製し、標的微生物からの核酸回収及び下流ＰＣＲの双方に干渉し得る白血球由来）を含有する。全血中の生物がそのように少ないことやＰＣＲ阻害剤の存在により、より大量の全血（例えば、１～２０ｍＬ）からの濃縮が、臨床的に関連する微生物レベルで感受性を達成するのに望まれるＤＮＡ鋳型の品質及び量を得るために求められる。
【0007】
非感染患者が受ける無効な又は不必要な広域スペクトル抗菌薬の投与回数を減らすため、より迅速で正確な分子ベースの診断が緊急に求められている。迅速な診断は、ＢＳＩを確かに有する患者へのより調整された有効な抗菌治療薬のタイムリーな投与を可能にし得る。これらの多くの潜在的利点にもかかわらず、試みられている迅速なＢＳＩ診断ソリューションの多くは、広く採用されていない。これは、厄介なワークフロー、結果までの時間、及びコストを含む、様々な理由が存在するためである。
【0008】
市販されている１つの製品が、ＭｏｌＹｓｉｓ（商標）と呼ばれ、それは全血中の無傷な生物からの細菌ＤＮＡの選択的単離といった見込みを提供する。ＭｏｌＹｓｉｓ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ５ ＤＮＡ抽出キット（カタログ番号Ｄ－３２１－１００；Ｍｏｌｚｙｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、血液因子（赤血球、白血球など）の選択的溶解のためのカオトロピック溶解緩衝液及びゲノムＤＮＡを分解するためのＤＮａｓｅを含む。微生物細胞は、遠心分離によって回収され、上清は廃棄され、細胞は、異なる緩衝液で数回再懸濁され、再ペレット化され、微生物細胞の化学的溶解が実施され、そして最後に微生物核酸が回収される。全てにおいて、ＭｏｌＹｓｉｓ（商標）キットは、サンプル調製に約４５分、加えて微生物細胞の精製及び溶解にさらに約４５分かかる厄介なワークフローを含む。微生物の同定には、ＭｏｌＹｓｉｓ（商標）キットを用いて回収された核酸を、さらなる時間がかかり、さらなる支出を含むような別のアッセイに入力することが必要である。さらに、ＭｏｌＹｓｉｓ（商標）キットの使用で成功するには、熟練した専門家を必要とする。オペレーターの技能への依存は、結果の収率及び品質がオペレーターごとに異なるというリスクをもたらす。多くの緩衝液及び手作業のピペッティングステップにより、サンプルの相互汚染のリスクが高まる。
【0009】
全血からＢＳＩを同定するための使用が意図される別の製品が、Ｔ２ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＴ２ＭＲ（登録商標）である。Ｔ２ＭＲ（登録商標）システムは、血液因子の選択的溶解、微生物回収、微生物溶解、微生物由来核酸の回収、及びＰＣＲ増幅を含む自動化されたサンプル調製を含む。Ｔ２ＭＲ（登録商標）システムでは、微生物同定のため、核磁気共鳴（ＮＭＲ）が用いられる。溶液中の超常磁性ＮＭＲナノプローブは、微生物に特異的なＤＮＡに結合し、ＮＭＲによって検出可能である凝集体を形成する。微生物核酸の存在によって凝集されるナノプローブは、非凝集ナノプローブからのシグナルと比較してより大きいＮＭＲシグナルを生成する。しかし、Ｔ２ＭＲ（登録商標）システムは、微生物同定に使用可能である十分な品質のデータを得るためのＮＭＲデータ収集に４～６時間を要する。また、Ｔ２ＭＲ（登録商標）システムは、高価であり（装置は約＄１５０，０００の費用がかかる）、装置のスループットは、データ収集に要する時間に起因し、著しく制限される。さらに、ＢＳＩに関連する細菌及び真菌は、別々のＴ２ＭＲ（登録商標）パネルに対して試験される。これは、敗血症の症状を呈している患者であれば、細菌及び真菌の原因を組み入れ／除外するため、細菌及び真菌パネルに対する試験が必要となることを意味する。さらに、細菌及び真菌パネルに対して試験される生物の数は、制限され（それぞれに対して約６匹の生物が試験される）、試験は、薬剤感受性／耐性についての情報を提供しない。
【0010】
本発明は、血液からの直接的なＢＳＩに関連する微生物の同定に関する様々な改善に、簡素化されたワークフロー及びより迅速なサンプル対回答で対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、サンプルからの微生物を濃縮し、特徴づけ及び／又は同定するための方法、システム、及び装置を提供する。一実施形態では、微生物は、細菌である。別の実施形態では、微生物は、真菌生物（例えば、酵母又はカビ）である。さらなる実施形態では、微生物は、寄生虫である。方法、システム、及び装置は、血液又は尿又は脳脊髄液などの複合サンプルからの微生物の分離、濃縮、特徴づけ及び／又は同定の場合に、特に有用であってもよい。好ましい態様では、本発明の方法、システム、及び装置は、患者が敗血症であることを迅速に判定するため、全血からの直接的な微生物を濃縮し、特徴づけ及び／又は同定する場合に、使用されてもよい。典型的な敗血症では、血流中の微生物の濃度は低い。例えば、＜約１～１００ｃｆｕ／ｍｌであり、＜約１～１０ｃｆｕ／ｍｌが典型的である。敗血症であることが疑われる１名又は複数の敗血症患者では、血液中の微生物は、存在する場合、非常に希薄なことから、本明細書に記載の方法を用いずに、血液サンプルから直接的に同定される。さらに、血液は、好適に、全血及び他の複雑なマトリックス（例えば、尿及びＣＳＦ）からの微生物の同定及び分析が常に成功するように除去されてもよい、いくつかのＰＣＲの阻害剤（例えば、ヘモグロビン、ヒト血清アルブミン及びゲノムＤＮＡ）を含有する。本発明は、サンプル中の非微生物細胞の選択的溶解及び比較的大量（例えば、１０～２０ｍｌ）のサンプルからの微生物の濃縮のための方法、システム、及び装置を提供する。好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法、システム、及び装置は、限定はされないが、血液サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を第１の容器内で混合し、次にライセートを、遠心濃縮器内に血液サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液以外の成分を含む遠心濃縮器に移すこと、遠心分離後、遠心濃縮器を開放し、上清画分をデカントすること、高密度クッション若しくは物理的なセパレータを伴う遠心分離による微生物の回収、（血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、本明細書中の方法に記載される濃縮及び同定ステップで処理すること以外に）血液サンプルを前処理すること、予備分析・培養ステップ、サンプルを継代培養し、サンプル中に存在する微生物を同定するステップ、又は非微生物ＤＮＡを選択的に溶解された非微生物細胞から消化するためのＤＮａｓｅステップなどの装置又はステップの使用を含まない。
【0012】
本明細書に記載の発明は、好適に、記載される微生物を単離及び同定する方法を含んでもよい。当該方法は、好適に、（ａ）微生物を含有することが疑われるある体積の血液サンプルを提供するステップと；（ｂ）血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、溶解血球及び非溶解微生物を含むライセートを得るステップと；（ｃ）ライセートからの微生物を濃縮するステップと；（ｄ）微生物を同定するために必要とされる１つ以上の試薬を含む装置に微生物を添加するステップと；（ｅ）血液サンプル中に存在する微生物を同定することと、を含んでもよい。当該方法では、微生物は、存在する場合、提供された血液サンプルの体積と比較して２５～１００倍の範囲内に濃縮され、且つ微生物は、存在する場合、提供された血液サンプル中で、＜約１ＣＦＵ／ｍｌ（但し、０より大きい）～約１００ＣＦＵ／ｍｌの範囲内の濃度を有する（例えば、＜１ＣＦＵ／ｍｌ １０ 約１０ＣＦＵ／ｍｌ）。
【0013】
方法ステップ（ａ）～（ｃ）は、好適に、約１０～２０分の時間範囲内で完了してもよい。方法ステップｄ）及び（ｅ）は、好適に、４時間未満、３時間未満、２時間未満、又は１時間未満の時間範囲内で完了してもよい。
【0014】
当該方法における微生物は、好適に、血液媒介感染症に関連する細菌又は真菌生物の１つ以上を含んでもよい。
【0015】
当該方法における同定は、好適に、分子検査、表現型検査、プロテオミクス検査、光学検査、又は培養に基づく検査の１つ以上を含んでもよい。同定は、好適に、微生物の特徴を有する１つ以上の核酸を微生物から単離するステップと、１つ以上の核酸を分析し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するステップと、を含んでもよい。当該方法の一実施形態では、同定は、１つ以上の核酸を増幅し、次に１つ以上の増幅された核酸を検出することをさらに含む。１つ以上の増幅された核酸の検出は、好適に、ｄｓＤＮＡ結合色素の１つ以上の使用、リアルタイムＰＣＲ、増幅後核酸融解ステップ、核酸配列決定ステップ、標識ＤＮＡ結合プローブ、又は非標識プローブを含んでもよい。同定するステップは、好適に、約５～７５分の時間範囲内で完了してもよい。
【0016】
当該方法は、好適に、培地中の濃縮された微生物に対する培養ステップを実施し、微生物の濃度を増加させ、次に同定するステップを実施することをさらに含んでもよく、ここで培養ステップは、４時間以下、３時間以下、又は２時間以下、１時間以下、３０分以下、２０分以下、又は１０分以下、好ましくは、３時間以下かけて実施される。
【0017】
列挙される方法において使用されるディファレンシャル溶解緩衝液は、好適に、緩衝物質、非イオン界面活性剤、塩、及び血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合する前の約１０～１１のｐＨ範囲を含んでもよい。ディファレンシャル溶解緩衝液は、好適に、血液サンプルとディファレンシャル溶解緩衝液との混合後、約７．０～８．０のｐＨを有し得る。ディファレンシャル溶解緩衝液中で使用される緩衝物質は、好適に、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。ディファレンシャル溶解緩衝液中で使用される緩衝物質は、好適に、ＣＡＰＳであってもよい。血液サンプルと混合されたディファレンシャル溶解緩衝液のｐＨは、好適に、緩衝物質のｐＨ緩衝範囲を下回る、約１．５～２．５のｐＨ単位であってもよい。ディファレンシャル溶解緩衝液中で使用される非イオン界面活性剤は、好適に、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）エーテル、好ましくは、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００（別名、ポリ（オキシ－１，２－エタンジイル））、ＢｒｉｊＯ１０、及びノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（別名、Ｂｒｉｊ３５）の１つ以上であってもよい。ディファレンシャル溶解緩衝液中で使用される非イオン界面活性剤は、好適に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００、ＢｒｉｊＯ１０（別名、Ｂｒｉｊ９６／９７）、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（別名、Ｂｒｉｊ３５）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。血液サンプルと組み合わされるディファレンシャル溶解緩衝液では、（例えば、０．１％～０．５％の範囲内の）洗剤の濃度及び（例えば、７～１１の範囲内の）ｐＨは、好適に、ペレット体積を最小化する一方で、サンプル中の血球のディファレンシャル溶解を最大化するように調整されてもよい。好適に、ペレット体積は、約５００μＬ以下、約４００μＬ以下、約３００μＬ以下、約２００μＬ以下、又は約１００μＬ以下であってもよい。好適に、サンプル中の非微生物細胞に対して最大で５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％が、サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と組み合わせて２～５分以内に溶解され得る。
【0018】
ライセートからの微生物の濃縮は、好適に、遠心分離を含んでもよく、且つ濃縮は、溶解された血液画分を含む上清画分から、微生物を含むペレット画分を回収することをさらに含む。ライセートからの微生物の濃縮は、好適に、ディファレンシャル溶解緩衝液と混合された血液サンプルを遠心濃縮器内に配置することと；遠心濃縮器を遠心分離し、チャンバー内に配置された血液サンプルからの微生物を濃縮することと；濃縮微生物を、チャンバーの第２の末端の第２の開放部から生じさせることと、を含んでもよく、ここで遠心濃縮器は、第１の末端に開放部及び第２の末端にシール部分を有するチャンバーであって、シール部分がチャンバーの第２の末端で第２の開放部を密封するように設計される、チャンバー；及びチャンバーの内側に少なくとも部分的に可動的に配置されたプランジャーであって、シール部分を開放するように作動させるために設計されるプランジャーを含む。チャンバーの第２の末端の第２の開放部からの濃縮微生物の発現は、好適に、ペレットを遠心濃縮器の第２の末端からバイアル又はアッセイ装置に無菌的に生じさせることを含んでもよい。遠心濃縮器は、好適に、微生物をライセートから分離するための高密度クッション又は物理的なセパレータを含まなくてもよい。
【0019】
当該方法は、好適に、血液サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液を第１の容器内で混合し、次にライセートを、遠心濃縮器内に血液サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液以外の成分を含む遠心濃縮器に移すこと、遠心分離後に遠心濃縮器を開放し、上清画分をデカントすること、血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合する前の培養ステップ、又はライセート中のゲノムＤＮＡを消化するためのＤＮａｓｅステップの１つ以上を含まなくてもよい。当該方法は、好適に、血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合する前の培養ステップ、又はライセート中のゲノムＤＮＡを消化するためのＤＮａｓｅステップの１つ以上を含まなくてもよい。
【0020】
微生物は、好適に、濾過技術によってライセートから濃縮されてもよい。当該方法は、好適に、上に濃縮微生物を有するフィルターを、血液サンプル中に存在する微生物を同定するために設計された培養装置又はアッセイ装置の１つ以上に添加することをさらに含んでもよい。
【0021】
好適に、血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、ライセートを得るステップ、及び微生物をライセートから分離するステップの方法は、単一チューブ内で達成されてもよい。好適に、当該方法において使用されるディファレンシャル溶解緩衝液は、単一チューブ内に提供される単一緩衝液であってもよい。好適に、当該方法において使用されるディファレンシャル溶解緩衝液は、ＤＮａｓｅ又はプロテアーゼを含まなくてもよく、当該方法は、好適に、外因性ＤＮａｓｅ又はプロテアーゼを単一チューブに添加するステップを含まなくてもよい。当該方法において使用されるディファレンシャル溶解緩衝液は、好適に、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ） ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）、ヘパラン、フッ化／シュウ酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤に適合し得る。
【0022】
本明細書に記載の発明は、好適に、血液からの微生物を濃縮及び同定する方法を含んでもよい。当該方法は、好適に、（ａ）微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプルを提供するステップと；（ｂ）血液サンプルを、緩衝物質、非イオン界面活性剤、及び塩を含むディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、混合により、溶解血球及び非溶解微生物を含むライセートを得るステップと；（ｃ）ライセートからの微生物を濃縮するステップと；（ｄ）血液サンプル中に存在する微生物を同定するステップと、を含んでもよく、ここでディファレンシャル溶解緩衝液と混合された血液サンプルは、約７．０～８．０のｐＨを有し、且つ緩衝物質は、約８．６～１１．４の有用なｐＨ緩衝範囲を有し、ここで微生物は、提供された血液サンプルの開始体積に対して２５～１００倍の範囲内に濃縮され、ここで同定は、４時間以下、３時間以下、２時間以下、又は１時間以下で達成される。
【0023】
同定は、好適に、分子検査、表現型検査、プロテオミクス検査、光学検査、又は培養に基づく検査の１つ以上を含んでもよい。当該方法の同定するステップは、好適に、微生物から微生物の特徴を有する１つ以上の核酸を単離するステップと、１つ以上の核酸を分析し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するステップと、を含んでもよい。
【0024】
当該方法において列挙される非イオン界面活性剤は、好適に、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）エーテル、好ましくは、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００（別名、ポリ（オキシ－１，２－エタンジイル））、ＢｒｉｊＯ１０、及びノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（別名、Ｂｒｉｊ３５）の１つ以上であってもよい。当該方法において列挙される非イオン界面活性剤は、好適に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００、ＢｒｉｊＯ１０（別名、Ｂｒｉｊ９６／９７）、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（別名、Ｂｒｉｊ３５）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。
【0025】
当該方法において列挙される緩衝物質は、好適に、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。当該方法において列挙される緩衝物質は、好適に、ＣＡＰＳであってもよく、ＣＡＰＳは、約９．７～１１．１のｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約１０．４のｐＫａを有する。
【0026】
（例えば、０．１％～０．５％の範囲内の）洗剤の濃度及び（例えば、７～１１の範囲内の）ｐＨは、好適に、ペレット体積を最小化する一方で、サンプル中の血球のディファレンシャル溶解を最大化するように調整されてもよい。好適に、ペレット体積は、約５００μＬ以下、約４００μＬ以下、約３００μＬ以下、約２００μＬ以下、又は約１００μＬ以下であってもよい。好適に、サンプル中の非微生物細胞に対する最大で５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％が、サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と組み合わせ２～５分以内に溶解され得る。
【0027】
当該方法において列挙される塩は、好適に、塩化ナトリウムであってもよい。
【0028】
当該方法は、好適に、濃縮の前の血液培養ステップ及び／又はライセート中のゲノムＤＮＡを消化するためのＤＮａｓｅステップを含まなくてもよい。
【0029】
当該方法のステップ（ａ）～（ｃ）は、好適に、約１０～２０分の時間範囲内で完了してもよい。当該方法の単離及び分析するステップは、好適に、約５～７５分の時間範囲内で完了してもよい。ライセートを得るための時間は、好適に、約２～１０分、好ましくは、約３～５分の範囲であってもよい。ライセートの生成は、好適に、組み合わせ以外（即ち、血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と組み合わせ、サンプル中の血球を溶解するのに十分な時間（約２～１０分、好ましくは、約３～５分）かけて血液／緩衝液混合物をインキュベートすること以外）の追加的なステップを含まなくてもよい。
【0030】
以下が説明される内容である。
【0031】
Ａ１．微生物を単離及び同定する方法であって、
（ａ）微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプルを提供することと；
（ｂ）血液サンプルを、あるｐＨを有するディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、溶解血球及び非溶解微生物を含むライセートを得ることと；
（ｃ）微生物をライセートから分離することと；
（ｄ）微生物を、微生物を同定するために必要とされる１つ以上の試薬を含むアッセイ装置に添加することと；
（ｅ） 血液サンプル中に存在する微生物を同定することと、
を含み、ここで同定が、微生物から、微生物の特徴を有する１つ以上の核酸を単離するステップと、１つ以上の核酸を分析し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するステップとを含む、方法
（ａ）微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプルを提供することと；
（ｂ）血液サンプルを、あるｐＨを有するディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、溶解血球及び非溶解微生物を含むライセートを得ることと；
（ｃ）微生物をライセートから分離することと；
（ｄ）微生物を、微生物を同定するために必要とされる１つ以上の試薬を含むアッセイ装置に添加することと；
（ｅ） 血液サンプル中に存在する微生物を同定することと、
を含み、ここで同定が、微生物から、微生物の特徴を有する１つ以上の核酸を単離するステップと、１つ以上の核酸を分析し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するステップとを含む、方法
【0032】
Ａ２．微生物が、血液媒介感染症に関連する細菌又は酵母の１つ以上である、条項Ａ１の方法
【0033】
Ａ３．最初に、患者における敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症性感染、敗血症性ショック、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）などの１つ以上の症状を同定し、患者が血液媒介感染症を有することを判定することをさらに含む、条項Ａ１及び／又は条項Ａ２の方法
【0034】
Ａ４．ディファレンシャル溶解緩衝液が、緩衝剤、非イオン界面活性剤、並びに血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合する前の約１０～１１のｐＨ範囲及び血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合後の約７．０～８．０のｐＨを含む、条項Ａ１～Ａ３の１つ以上の方法
【0035】
Ａ５．非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）エーテルである、条項Ａ１～Ａ４の１つ以上の方法
【0036】
Ａ６．非イオン界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００、ＢｒｉｊＯ１０（別名、Ｂｒｉｊ９６／９７）、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール（ｐｏｌｉｄｏｃｅｎｏｌ））、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項Ａ１～Ａ５の１つ以上の方法
【0037】
Ａ７．ライセートからの微生物の分離が、遠心分離ステップを含み、且つ分離が、溶解された血液画分を含む上清画分から、微生物を含むペレット画分を回収することをさらに含む、条項Ａ１～Ａ６の１つ以上の方法
【0038】
Ａ８．
ディファレンシャル溶解緩衝液と混合された血液サンプルを遠心濃縮器内に配置することと、
遠心濃縮器を遠心分離し、チャンバー内に配置された血液サンプルからの微生物をペレット化することと；
プランジャーを押し込み、シール部分を開放し、チャンバーの第２の末端の開放部からペレットを生じさせることと、
をさらに含み、ここで遠心濃縮器が、
第１の末端に開放部及び第２の末端にシール部分を有するチャンバーであって、シール部分がチャンバーの第２の末端で第２の開放部を密封するように設計される、チャンバー；及び
チャンバーの内側に少なくとも部分的に可動的に配置されたプランジャーであって、シールを開放するように作動させるために設計されるプランジャー
を含む、条項Ａ１～Ａ７の１つ以上の方法
ディファレンシャル溶解緩衝液と混合された血液サンプルを遠心濃縮器内に配置することと、
遠心濃縮器を遠心分離し、チャンバー内に配置された血液サンプルからの微生物をペレット化することと；
プランジャーを押し込み、シール部分を開放し、チャンバーの第２の末端の開放部からペレットを生じさせることと、
をさらに含み、ここで遠心濃縮器が、
第１の末端に開放部及び第２の末端にシール部分を有するチャンバーであって、シール部分がチャンバーの第２の末端で第２の開放部を密封するように設計される、チャンバー；及び
チャンバーの内側に少なくとも部分的に可動的に配置されたプランジャーであって、シールを開放するように作動させるために設計されるプランジャー
を含む、条項Ａ１～Ａ７の１つ以上の方法
【0039】
Ａ９．プランジャーを押し込み、シール部分を開放し、ペレットを生じさせることが、プランジャーをボディの一部と密封係合になるまで押し込むことと、加圧下でシールを開放することによって第２の末端からペレットを排出することと、を含む、条項Ａ１～Ａ８の１つ以上の方法
【0040】
Ａ１０．ペレットを、遠心濃縮器の第２の末端からバイアル又は自己完結型アッセイ装置に生じさせることをさらに含む、条項Ａ１～Ａ９の１つ以上の方法
【0041】
Ａ１１．遠心濃縮器及びバイアルのそれぞれが、遠心濃縮器の第２の末端をバイアルと共役させるように設計される、条項Ａ１～Ａ１０の１つ以上の方法
【0042】
Ａ１２．バイアルが、ペレットを自己完結型分子的分析装置に送達するように設計される、条項Ａ１～Ａ１１の１つ以上の方法
【0043】
Ａ１３．バイアルが、遠心濃縮器の第２の末端からバイアルを脱共役させることなく、ペレットを自己完結型分子的分析装置に送達するように設計される、条項Ａ１～Ａ１２の１つ以上の方法
【0044】
Ａ１４．遠心濃縮器の第１の末端の開放部が、ディファレンシャル溶解緩衝液と混合されたサンプルを遠心濃縮器に無菌的に充填するように設計された、隔壁、同様に機能的な構造などを含む、条項Ａ１～Ａ１３の１つ以上の方法
【0045】
Ａ１５．遠心濃縮器が、高密度クッション又は物理的なセパレータを含まない、条項Ａ１～Ａ１４の１つ以上の方法
【0046】
Ａ１６．血液サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液を第１の容器内で混合し、次にライセートを、遠心濃縮器内に血液サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液以外の成分を含む遠心濃縮器に移すこと、遠心分離後に遠心濃縮器を開放し、上清画分をデカントすること、血液サンプルを前処理すること、血液培養ステップ、血液サンプル中に存在する微生物を同定するための血液サンプルを継代培養するステップ、又はライセート中のゲノムＤＮＡを消化するためのＤＮａｓｅステップの１つ以上を含まない、条項Ａ１～Ａ１５の１つ以上の方法
【0047】
Ａ１７．血液サンプルを前処理すること、血液培養ステップ、血液サンプルを継代培養し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するステップ、又はライセート中のゲノムＤＮＡを消化するためのＤＮａｓｅステップの１つ以上を含まない、条項Ａ１～Ａ１６の１つ以上の方法
【0048】
Ａ１８．ステップ（ａ）～（ｃ）が、約１０～２０分の時間範囲内で完了される、条項Ａ１～Ａ１７の１つ以上の方法
【0049】
Ａ１９．ステップ（ｄ）及び（ｅ）が、約１５～７５分の時間範囲内で完了される、条項Ａ１～Ａ１８の１つ以上の方法
【0050】
Ａ２０．ステップ（ａ）～（ｅ）が、約２５～９５分の時間範囲内で完了される．条項Ａ１～Ａ１９の１つ以上の方法
【0051】
Ａ２１．微生物が、ライセートからフィルターによって分離される、条項Ａ１～Ａ２０の１つ以上の方法
【0052】
Ａ２２．フィルターを自己完結型アッセイ装置に添加することをさらに含む、条項Ａ１～Ａ２１の１つ以上の方法
【0053】
Ａ２３．ディファレンシャル溶解緩衝液が、あるｐＨ緩衝範囲を有する緩衝物質を含み、且つ血液サンプルと混合されたディファレンシャル溶解緩衝液のｐＨが、緩衝物質のｐＨ緩衝範囲外である、条項Ａ１～Ａ２２の１つ以上の方法
【0054】
Ａ２３．１ 緩衝物質が、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項Ａ１～Ａ２３の１つ以上の方法
【0055】
Ａ２３．２ 緩衝物質が、ＣＡＰＳである、条項Ａ１～Ａ２３．１の１つ以上の方法
【0056】
Ａ２４．血液サンプルと混合されたディファレンシャル溶解緩衝液のｐＨが、緩衝物質のｐＨ緩衝範囲を下回る、条項Ａ１～Ａ２３．２の１つ以上の方法
【0057】
Ａ２５．血液サンプルと混合されたディファレンシャル溶解緩衝液のｐＨが、緩衝物質のｐＨ緩衝範囲を下回る、約１．５～２．５ｐＨ単位である、条項Ａ１～Ａ２４の１つ以上の方法
【0058】
Ａ２６．ディファレンシャル溶解緩衝液と混合された血液サンプルが、約７．０～８．０のｐＨを有し、且つ緩衝物質が、約８．６～１１．４の有用なｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約９．５～約１０．７の範囲内のｐＫａを有する、条項Ａ１～Ａ２５の１つ以上の方法
【0059】
Ａ２７．同定が、１つ以上の核酸を増幅し、次に１つ以上の増幅された核酸を検出することをさらに含む、条項Ａ１～Ａ２６の１つ以上の方法
【0060】
Ａ２８．１つ以上の増幅された核酸の検出が、核酸融解ステップを含む、条項Ａ１～Ａ２７の１つ以上の方法
【0061】
Ａ２９．１つ以上の核酸に対する第１段階マルチプレックス増幅を実施し、第１段階増幅産物を得ることと、第２段階増幅ウェルであって、それぞれがサンプル中に存在し得る特異的核酸をさらに増幅するように設計された増幅プライマーセットを有する第２段階増幅ウェルのセットの中で希釈された第１段階増幅産物を分離することと、第２段階増幅ウェル内で第２段階増幅を実施することと、増幅後核酸融解及び融解曲線分析を実施し、血液サンプル中に存在する微生物を同定することと、をさらに含む、条項Ａ１～Ａ２８の１つ以上の方法
【0062】
Ａ３０．分析が、血液サンプル中に存在する微生物を同定するのに十分な１つ以上の核酸から得られる配列情報を含む配列決定データを作成するための核酸配列決定ステップを含む、条項Ａ１～Ａ２９の１つ以上の方法
【0063】
Ａ３１．核酸配列決定ステップが、大規模並列又は次世代配列決定技術を含む、条項Ａ１～Ａ３０の１つ以上の方法
【0064】
Ａ３２．血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、ライセートを得るステップ、及びライセートから微生物を分離するステップが、単一チューブ内で達成される、条項Ａ１～Ａ３１の１つ以上の方法
【0065】
Ａ３３．ディファレンシャル溶解緩衝液が、単一チューブ内に提供される単一緩衝液である、条項Ａ１～Ａ３２の１つ以上の方法
【0066】
Ａ３４．ディファレンシャル溶解緩衝液が、ＤＮａｓｅ又はプロテアーゼを含まず、且つ当該方法が、外因性ＤＮａｓｅ又はプロテアーゼを単一チューブに添加するステップを含まない、条項Ａ１～Ａ３３の１つ以上の方法
【0067】
Ａ３５．ディファレンシャル溶解緩衝液が、標準の抗凝固剤、例えば限定はされないが、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）、ヘパラン、フッ化／シュウ酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものに適合する、条項Ａ１～Ａ３４の１つ以上の方法
【0068】
Ｂ１．微生物を単離及び同定する方法であって、
（ａ）微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプルを提供することと；
（ｂ）血液サンプルを、緩衝物質及び非イオン界面活性剤を含むディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、混合により、溶解血球及び非溶解微生物を含むライセートを得ることと；
（ｃ）ライセートからの微生物を分離することと；
（ｄ）微生物を、微生物の特徴を有する１つ以上の核酸の増幅及び増幅された１つ以上の核酸の分析を含むアッセイを実施するように設計された自己完結型アッセイ装置に添加し、血液サンプル中に存在する微生物を同定することと、
を含み、ここでディファレンシャル溶解緩衝液と混合された血液サンプルが約７．０～８．０のｐＨを有し、且つ緩衝物質が約８．６～１１．４の有用なｐＨ緩衝範囲を有する、方法
（ａ）微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプルを提供することと；
（ｂ）血液サンプルを、緩衝物質及び非イオン界面活性剤を含むディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、混合により、溶解血球及び非溶解微生物を含むライセートを得ることと；
（ｃ）ライセートからの微生物を分離することと；
（ｄ）微生物を、微生物の特徴を有する１つ以上の核酸の増幅及び増幅された１つ以上の核酸の分析を含むアッセイを実施するように設計された自己完結型アッセイ装置に添加し、血液サンプル中に存在する微生物を同定することと、
を含み、ここでディファレンシャル溶解緩衝液と混合された血液サンプルが約７．０～８．０のｐＨを有し、且つ緩衝物質が約８．６～１１．４の有用なｐＨ緩衝範囲を有する、方法
【0069】
Ｂ２．増幅前に、アッセイが、微生物の溶解及び微生物からの核酸の回収をさらに含み、ここで回収された核酸が、血液サンプル中に存在する微生物の同定のため、増幅を受ける、条項Ｂ１の方法
【0070】
Ｂ３．非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）エーテルである、条項Ｂ１又はＢ２の１つ以上の方法
【0071】
Ｂ４．非イオン界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００、ＢｒｉｊＯ１０（別名、Ｂｒｉｊ９６／９７）、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項Ｂ１～Ｂ３の１つ以上の方法
【0072】
Ｂ５．緩衝物質が、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項Ｂ１～Ｂ４の１つ以上の方法
【0073】
Ｂ６．緩衝物質がＣＡＰＳであり、且つＣＡＰＳが約９．７～１１．１のｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約１０．４のｐＫａを有する、条項Ｂ１～Ｂ５の１つ以上の方法
【0074】
Ｂ７．
遠心濃縮器内で血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と組み合わせることと、
血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と第１の時間かけて組み合わせ、ライセートを得ることと；
遠心濃縮器を遠心分離し、チャンバー内に配置された血液サンプルからの微生物をペレット化することと；
プランジャーを押し込み、シール部分を開放し、チャンバーの第２の末端の開放部からペレットを生じさせることと、
をさらに含み、ここで遠心濃縮器が、
第１の末端に開放部及び第２の末端にシール部分を有するチャンバーであって、シール部分がチャンバーの第２の末端で第２の開放部を密封するように設計される、チャンバー；及び
チャンバーの内側に少なくとも部分的に可動的に配置されたプランジャーであって、シールを開放するように作動させるために設計されるプランジャー
を含む、条項Ｂ１～Ｂ６の１つ以上の方法
遠心濃縮器内で血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と組み合わせることと、
血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と第１の時間かけて組み合わせ、ライセートを得ることと；
遠心濃縮器を遠心分離し、チャンバー内に配置された血液サンプルからの微生物をペレット化することと；
プランジャーを押し込み、シール部分を開放し、チャンバーの第２の末端の開放部からペレットを生じさせることと、
をさらに含み、ここで遠心濃縮器が、
第１の末端に開放部及び第２の末端にシール部分を有するチャンバーであって、シール部分がチャンバーの第２の末端で第２の開放部を密封するように設計される、チャンバー；及び
チャンバーの内側に少なくとも部分的に可動的に配置されたプランジャーであって、シールを開放するように作動させるために設計されるプランジャー
を含む、条項Ｂ１～Ｂ６の１つ以上の方法
【0075】
Ｂ８．プランジャーを押し込み、シール部分を開放し、ペレットを生じさせることが、プランジャーをボディの一部と密封係合になるまで押し込むことと、加圧下でシールを開放することによって第２の末端からペレットを排出することと、を含む、条項Ｂ１～Ｂ７の１つ以上の方法
【0076】
Ｂ９．ペレットを、任意選択的に、中に配置されたサンプル緩衝液を有する内部体積を有するバイアル体及びバイアル体の底部表面から延伸したカニューレを含むカニューレ処理用バイアルに生じさせることをさらに含み、
バイアル体に延伸しないカニューレが、バイアル体の底部表面に隣接したカニューレの第１の末端と第２の末端とを有し、
バイアル体が、体液をカニューレに入れる前にフィルター処理するように設計されたバイアル体の底部表面の近傍に位置するフィルターをさらに含み、ここでフィルターが、真菌、ウイルス、原虫、及び／又は細菌生物がそこを通過してカニューレに入ることを可能にするのに十分な直径であるが、より大きい微粒子状物質を捕捉するのに十分に小さい孔径を有する、
条項Ｂ１～Ｂ８の１つ以上の方法
バイアル体に延伸しないカニューレが、バイアル体の底部表面に隣接したカニューレの第１の末端と第２の末端とを有し、
バイアル体が、体液をカニューレに入れる前にフィルター処理するように設計されたバイアル体の底部表面の近傍に位置するフィルターをさらに含み、ここでフィルターが、真菌、ウイルス、原虫、及び／又は細菌生物がそこを通過してカニューレに入ることを可能にするのに十分な直径であるが、より大きい微粒子状物質を捕捉するのに十分に小さい孔径を有する、
条項Ｂ１～Ｂ８の１つ以上の方法
【0077】
Ｂ１０．カニューレの第２の末端を自己完結型アッセイ装置の第１ポート内に配置することをさらに含み、ここで自己完結型アッセイ装置の第１ポートが、体液の体積を、バイアル体からカニューレを通って自己完結型アッセイ装置に導くように真空下で提供される、条項Ｂ１～Ｂ９の１つ以上の方法
【0078】
Ｂ１１．自己完結型アッセイ装置が、
第１ポートに流体接続された、微生物を溶解するために設計された細胞溶解ゾーン；
細胞溶解ゾーンに流体接続された、微生物から核酸を精製するために設計された核酸調製ゾーン；
核酸調製ゾーンに流体接続された、微生物から精製された核酸の第１段階増幅のために設計された第１段階反応チャンバーを含む第１段階反応ゾーン；並びに
第１段階反応ゾーンに流体接続された、第２段階反応ゾーンであって、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバーを含み、各第２段階反応チャンバーが、微生物から精製された生物に特異的な核酸のさらなる増幅のために設計されたプライマー対を含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバーの全てで同時発生する熱循環のため、そして増幅後核酸融解及び融解曲線分析を実施し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するために設計された、第２段階反応ゾーン
をさらに含む、条項Ｂ１～Ｂ１０の１つ以上の方法
第１ポートに流体接続された、微生物を溶解するために設計された細胞溶解ゾーン；
細胞溶解ゾーンに流体接続された、微生物から核酸を精製するために設計された核酸調製ゾーン；
核酸調製ゾーンに流体接続された、微生物から精製された核酸の第１段階増幅のために設計された第１段階反応チャンバーを含む第１段階反応ゾーン；並びに
第１段階反応ゾーンに流体接続された、第２段階反応ゾーンであって、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバーを含み、各第２段階反応チャンバーが、微生物から精製された生物に特異的な核酸のさらなる増幅のために設計されたプライマー対を含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバーの全てで同時発生する熱循環のため、そして増幅後核酸融解及び融解曲線分析を実施し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するために設計された、第２段階反応ゾーン
をさらに含む、条項Ｂ１～Ｂ１０の１つ以上の方法
【0079】
Ｂ１２．遠心濃縮器及びカニューレ処理用バイアルのバイアル体が、遠心濃縮器をカニューレ処理用バイアルと共役させるため、互いに係合するように設計され、ここでカニューレ処理用バイアルのバイアル体が、第２の末端を包囲するように設計され、それ故、カニューレ処理用バイアルのバイアル体が、チャンバーの第２の末端から発現されたペレットを収集するように設計される、条項Ｂ１～Ｂ１１の１つ以上の方法
【0080】
Ｂ１３．遠心濃縮器の第２の末端が、第１の係合部分を含み、且つカニューレ処理用バイアルのバイアル体が、遠心濃縮器をカニューレ処理用バイアルと固定的に共役させるための第２の相補的な係合部分を含む、条項Ｂ１～Ｂ１２の１つ以上の方法
【0081】
Ｂ１４．第１の係合部分及び第２の係合部分が、遠心濃縮器をカニューレ処理用バイアルにスレッド可能に共役させるためのスレッドを含む、条項Ｂ１～Ｂ１３の１つ以上の方法
【0082】
Ｂ１５．遠心濃縮器及びカニューレ処理用バイアルを、体液の体積を、バイアル体からカニューレを通って自己完結型アッセイ装置に導くため、互いに係合状態にすることと、カニューレ処理用バイアルのカニューレを自己完結型アッセイ装置の第１ポートから除去することと、遠心濃縮器及びカニューレ処理用バイアルを処分することと、をさらに含む、条項Ｂ１～Ｂ１４の１つ以上の方法
【0083】
Ｂ１６．遠心濃縮器の第１の末端の開放部が、ディファレンシャル溶解緩衝液と混合されたサンプルを遠心濃縮器に無菌的に充填するために設計された隔壁などを含む、条項Ｂ１～Ｂ１５の１つ以上の方法
【0084】
Ｂ１７．遠心濃縮器が、高密度クッションを含まない、条項Ｂ１～Ｂ１６の１つ以上の方法
【0085】
Ｂ１８．血液サンプルを前処理すること、血液培養ステップ、血液サンプル中に存在する微生物を同定するため、血液サンプルを継代培養するステップ、又はライセート中のゲノムＤＮＡを消化するためのＤＮａｓｅステップの１つ以上を含まない、条項Ｂ１～Ｂ１７の１つ以上の方法
【0086】
Ｂ１９．ステップ（ａ）～（ｃ）が、約１０～２０分の時間範囲内で完了される、条項Ｂ１～Ｂ１８の１つ以上の方法
【0087】
Ｂ２０．ステップ（ｄ）及び（ｅ）が、約１５～７５分の時間範囲内で完了される、条項Ｂ１～Ｂ１９の１つ以上の方法
【0088】
Ｂ２１．ステップ（ａ）～（ｅ）が、約２５～９５分の時間範囲内で完了される、条項Ｂ１～Ｂ２０の１つ以上の方法
【0089】
Ｂ２２．ライセートを得るための第１の時間が、約２～１０分の範囲内、好ましくは、約５分である、条項Ｂ１～Ｂ２１の１つ以上の方法
【0090】
Ｂ２３．ライセートを得ることが、組み合わせ以外の追加的なステップを含まない、条項Ｂ１～Ｂ２２の１つ以上の方法
【0091】
Ｃ１．
微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプル；及び
水性媒体、緩衝物質、及び非イオン界面活性剤を含む、血液サンプルと組み合わされるディファレンシャル溶解緩衝液
を含み、約７．０～８．０のｐＨを有し、ここで緩衝物質が、約８．６～１１．４の有用なｐＨ緩衝範囲を有し、且つ２５℃で約９．５～約１０．７の範囲内のｐＫａを有する、組成物
微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプル；及び
水性媒体、緩衝物質、及び非イオン界面活性剤を含む、血液サンプルと組み合わされるディファレンシャル溶解緩衝液
を含み、約７．０～８．０のｐＨを有し、ここで緩衝物質が、約８．６～１１．４の有用なｐＨ緩衝範囲を有し、且つ２５℃で約９．５～約１０．７の範囲内のｐＫａを有する、組成物
【0092】
Ｃ２．非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）エーテルである、条項Ｃ１の組成物
【0093】
Ｃ３．非イオン界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００、ＢｒｉｊＯ１０（別名、Ｂｒｉｊ９６／９７）、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項Ｃ１又はＣ２の１つ以上の組成物
【0094】
Ｃ４．緩衝物質が、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項Ｃ１～Ｃ３の１つ以上の組成物
【0095】
Ｃ５．緩衝物質が、約９．７～１１．１のｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約１０．４のｐＫａを有するＣＡＰＳである、条項Ｃ１～Ｃ４の１つ以上の組成物
【0096】
Ｃ６．緩衝物質が、約７．０～８．０のｐＨで実質的に正に荷電している、条項Ｃ１～Ｃ５の１つ以上の組成物
【0097】
Ｃ７．ＤＮａｓｅを含まない、条項Ｃ１～Ｃ６の１つ以上の組成物
【0098】
Ｃ８．
微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプル；及び
緩衝物質及び非イオン界面活性剤を含むディファレンシャル溶解緩衝液
から本質的になり、約７．０～８．０のｐＨを有し、ここで緩衝物質が、約９．７～１１．１の有用なｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約１０．４のｐＫａを有するＣＡＰＳである、条項Ｃ１～Ｃ７の１つ以上の組成物
微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプル；及び
緩衝物質及び非イオン界面活性剤を含むディファレンシャル溶解緩衝液
から本質的になり、約７．０～８．０のｐＨを有し、ここで緩衝物質が、約９．７～１１．１の有用なｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約１０．４のｐＫａを有するＣＡＰＳである、条項Ｃ１～Ｃ７の１つ以上の組成物
【0099】
Ｄ１．
微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプル；及び
緩衝物質及び非イオン界面活性剤を含むディファレンシャル溶解緩衝液
を含む組成物であって、約７．０～８．０のｐＨを有し、ここで緩衝物質が、約８．６～１１．４の有用なｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約９．５～約１０．７の範囲内のｐＫａを有し、
溶解血球と、存在する場合、非溶解微生物とを含むライセートを含む、組成物；
ライセート中の非溶解微生物をペレット化するために設計された遠心濃縮器であって、
第１の末端に開放部及び第２の末端にシール部分を有するチャンバーであって、シール部分がチャンバーの第２の末端で第２の開放部を密封するように設計される、チャンバー；及び
チャンバーの内側に少なくとも部分的に可動的に配置されたプランジャーであって、シールを開放するように作動させるために設計されるプランジャー
を含む、遠心濃縮器；並びに
遠心濃縮器から微生物ペレットを受けるため、遠心濃縮器の第２の末端と共役させるように設計されたカニューレ処理用バイアルであって、
任意選択的に、その中にサンプル緩衝液を有する内部体積を有するバイアル体、及びバイアル体の底部表面から延伸したカニューレであって、バイアル体の底部表面に隣接するカニューレの第１の末端と、第２の末端とを有し、バイアル体に延伸しない、カニューレを含み；且つ
体液をカニューレに入る前にフィルター処理するように設計されたバイアル体の底部表面の近傍に位置するフィルターをさらに含み、ここでフィルターが、真菌、ウイルス、原虫、及び／又は細菌生物がそこを通過してカニューレに入ることを可能にするのに十分な直径であるが、より大きい微粒子状物質を捕捉するのに十分に小さい孔径を有する、バイアル体
を含むカニューレ処理用バイアル
を含むシステム
微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプル；及び
緩衝物質及び非イオン界面活性剤を含むディファレンシャル溶解緩衝液
を含む組成物であって、約７．０～８．０のｐＨを有し、ここで緩衝物質が、約８．６～１１．４の有用なｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約９．５～約１０．７の範囲内のｐＫａを有し、
溶解血球と、存在する場合、非溶解微生物とを含むライセートを含む、組成物；
ライセート中の非溶解微生物をペレット化するために設計された遠心濃縮器であって、
第１の末端に開放部及び第２の末端にシール部分を有するチャンバーであって、シール部分がチャンバーの第２の末端で第２の開放部を密封するように設計される、チャンバー；及び
チャンバーの内側に少なくとも部分的に可動的に配置されたプランジャーであって、シールを開放するように作動させるために設計されるプランジャー
を含む、遠心濃縮器；並びに
遠心濃縮器から微生物ペレットを受けるため、遠心濃縮器の第２の末端と共役させるように設計されたカニューレ処理用バイアルであって、
任意選択的に、その中にサンプル緩衝液を有する内部体積を有するバイアル体、及びバイアル体の底部表面から延伸したカニューレであって、バイアル体の底部表面に隣接するカニューレの第１の末端と、第２の末端とを有し、バイアル体に延伸しない、カニューレを含み；且つ
体液をカニューレに入る前にフィルター処理するように設計されたバイアル体の底部表面の近傍に位置するフィルターをさらに含み、ここでフィルターが、真菌、ウイルス、原虫、及び／又は細菌生物がそこを通過してカニューレに入ることを可能にするのに十分な直径であるが、より大きい微粒子状物質を捕捉するのに十分に小さい孔径を有する、バイアル体
を含むカニューレ処理用バイアル
を含むシステム
【0100】
Ｄ２．遠心濃縮器が、高密度クッションを含まない、条項Ｄ１のシステム
【0101】
Ｄ３．自己完結型アッセイ装置内へのサンプルの導入のため、カニューレの第２の末端を受けるように設計された第１ポートを有する自己完結型アッセイ装置をさらに含み、ここで自己完結型アッセイ装置の第１ポートが、サンプルの体積を、バイアル体からカニューレを通って自己完結型アッセイ装置に導くように真空下で提供される、条項Ｄ１及びＤ２の１つ以上のシステム
【0102】
Ｄ４．自己完結型アッセイ装置が、
第１ポートに流体接続された細胞溶解ゾーンであって、微生物を溶解するために設計された細胞溶解ゾーン；
細胞溶解ゾーンに流体接続された核酸調製ゾーンであって、微生物から核酸を精製するために設計された核酸調製ゾーン；
核酸調製ゾーンに流体接続された第１段階反応ゾーンであって、微生物から精製された核酸の第１段階増幅のために設計された第１段階反応チャンバーを含む第１段階反応ゾーン；並びに
第１段階反応ゾーンに流体接続された第２段階反応ゾーンであって、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバーを含み、各第２段階反応チャンバーが、微生物から精製された生物に特異的な核酸のさらなる増幅のために設計されたプライマー対を含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバーの全てで同時発生する熱循環のため、そして増幅後核酸融解及び融解曲線分析を実施し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するために設計された、第２段階反応ゾーン
をさらに含む、条項Ｄ１～Ｄ３の１つ以上のシステム
第１ポートに流体接続された細胞溶解ゾーンであって、微生物を溶解するために設計された細胞溶解ゾーン；
細胞溶解ゾーンに流体接続された核酸調製ゾーンであって、微生物から核酸を精製するために設計された核酸調製ゾーン；
核酸調製ゾーンに流体接続された第１段階反応ゾーンであって、微生物から精製された核酸の第１段階増幅のために設計された第１段階反応チャンバーを含む第１段階反応ゾーン；並びに
第１段階反応ゾーンに流体接続された第２段階反応ゾーンであって、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバーを含み、各第２段階反応チャンバーが、微生物から精製された生物に特異的な核酸のさらなる増幅のために設計されたプライマー対を含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバーの全てで同時発生する熱循環のため、そして増幅後核酸融解及び融解曲線分析を実施し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するために設計された、第２段階反応ゾーン
をさらに含む、条項Ｄ１～Ｄ３の１つ以上のシステム
【0103】
Ｄ５．遠心濃縮器及びカニューレ処理用バイアルのバイアル体が、遠心濃縮器をカニューレ処理用バイアルと共役させるため、互いに係合するように設計され、ここでカニューレ処理用バイアルのバイアル体が、第２の末端を包囲するように設計され、それ故、カニューレ処理用バイアルのバイアル体が、チャンバーの第２の末端から発現されたペレットを収集するように設計される、条項Ｄ１～Ｄ４の１つ以上のシステム
【0104】
Ｄ６．遠心濃縮器の第２の末端が、第１の係合部分を含み、且つカニューレ処理用バイアルのバイアル体が、遠心濃縮器をカニューレ処理用バイアルと固定的に共役させるための相補的な第２の係合部分を含む、条項Ｄ１～Ｄ５の１つ以上のシステム
【0105】
Ｄ７．第１の係合部分及び第２の係合部分が、遠心濃縮器をカニューレ処理用バイアルにスレッド可能に共役させるためのスレッドを含む、条項Ｄ１～Ｄ６の１つ以上のシステム
【0106】
Ｄ８．遠心濃縮器の第１の末端の開放部が、ディファレンシャル溶解緩衝液と混合されたサンプルを遠心濃縮器に無菌的に充填するために設計された隔壁などを含む、条項Ｄ１～Ｄ７の１つ以上のシステム
【0107】
Ｄ９．遠心濃縮器が、高密度クッションを含まない、条項Ｄ１～Ｄ８の１つ以上のシステム
【0108】
Ｄ１０．ディファレンシャル溶解緩衝液の非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）エーテルである、条項Ｄ１～Ｄ９の１つ以上のシステム
【0109】
Ｄ１１．ディファレンシャル溶解緩衝液の非イオン界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００、ＢｒｉｊＯ１０（別名、Ｂｒｉｊ９６／９７）、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項Ｄ１～Ｄ１０の１つ以上のシステム
【0110】
Ｄ１２．ディファレンシャル溶解緩衝液の緩衝物質が、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項Ｄ１～Ｄ１１の１つ以上のシステム
【0111】
Ｄ１３．ディファレンシャル溶解緩衝液の緩衝物質が、ＣＡＰＳであり、且つＣＡＰＳが、約９．７～１１．１の有用なｐＨ緩衝範囲及び２５℃で約１０．４のｐＫａを有する、条項Ｄ１～Ｄ１２の１つ以上のシステム
【0112】
Ｄ１４．ディファレンシャル溶解緩衝液の緩衝物質が、約７．０～８．０のｐＨで実質的に正に荷電している、条項Ｄ１～Ｄ１３の１つ以上のシステム
【0113】
Ｄ１５．ディファレンシャル溶解緩衝液が、ＤＮａｓｅを含まない、条項Ｄ１～Ｄ１４の１つ以上のシステム
【0114】
Ｅ１．微生物を単離及び同定する方法であって、
（ａ）微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプルを提供することと；
（ｂ）血液サンプルをあるｐＨを有するディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、溶解血球及び非溶解微生物を含むライセートを得ることと；
（ｃ）ディファレンシャル溶解緩衝液と混合された血液サンプルを遠心濃縮器内に配置することと；
（ｄ）遠心濃縮器を遠心分離し、チャンバー内に配置された血液サンプルからの微生物をペレット化することと；
（ｅ）微生物を同定するために必要とされる１つ以上の試薬を含む自己完結型アッセイ装置に微生物を添加するステップと；
（ｆ）血液サンプル中に存在する微生物を同定することと、
を含み、ここで自己完結型アッセイ装置への微生物の添加が、プランジャーを押し込み、シール部分を開放し、チャンバーの第２の末端の開放部からペレットを生じさせることを含み、ここで同定が、微生物から微生物の特徴を有する１つ以上の核酸を単離するステップと、核酸増幅を実施するステップと、増幅後核酸融解及び融解曲線分析を実施し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するステップと、を含み、
ここで遠心濃縮器が、
第１の末端に開放部及び第２の末端にシール部分を有するチャンバーであって、シール部分がチャンバーの第２の末端で第２の開放部を密封するように設計される、チャンバー；及び
チャンバーの内側に少なくとも部分的に可動的に配置されたプランジャーであって、シールを開放するように作動させるために設計されるプランジャー
を含む、方法
（ａ）微生物を含有することが知られる、又は含有し得る血液サンプルを提供することと；
（ｂ）血液サンプルをあるｐＨを有するディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、溶解血球及び非溶解微生物を含むライセートを得ることと；
（ｃ）ディファレンシャル溶解緩衝液と混合された血液サンプルを遠心濃縮器内に配置することと；
（ｄ）遠心濃縮器を遠心分離し、チャンバー内に配置された血液サンプルからの微生物をペレット化することと；
（ｅ）微生物を同定するために必要とされる１つ以上の試薬を含む自己完結型アッセイ装置に微生物を添加するステップと；
（ｆ）血液サンプル中に存在する微生物を同定することと、
を含み、ここで自己完結型アッセイ装置への微生物の添加が、プランジャーを押し込み、シール部分を開放し、チャンバーの第２の末端の開放部からペレットを生じさせることを含み、ここで同定が、微生物から微生物の特徴を有する１つ以上の核酸を単離するステップと、核酸増幅を実施するステップと、増幅後核酸融解及び融解曲線分析を実施し、血液サンプル中に存在する微生物を同定するステップと、を含み、
ここで遠心濃縮器が、
第１の末端に開放部及び第２の末端にシール部分を有するチャンバーであって、シール部分がチャンバーの第２の末端で第２の開放部を密封するように設計される、チャンバー；及び
チャンバーの内側に少なくとも部分的に可動的に配置されたプランジャーであって、シールを開放するように作動させるために設計されるプランジャー
を含む、方法
【0115】
Ｅ２．自己完結型アッセイ装置が、
ある量のペレットを自己完結型アッセイ装置に導くように、真空下で提供される第１ポート；
第１ポートに流体接続された細胞溶解ゾーンであって、微生物を溶解するために設計された細胞溶解ゾーン；
細胞溶解ゾーンに流体接続された核酸調製ゾーンであって、微生物から核酸を精製するために設計された核酸調製ゾーン；
核酸調製ゾーンに流体接続された第１段階反応ゾーンであって、１つ以上の核酸に対する第１段階マルチプレックス増幅を実施するために設計された第１段階反応チャンバーを含む第１段階反応ゾーン；
第１段階反応ゾーンに流体接続された第２段階反応ゾーンであって、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバーを含み、各第２段階反応チャンバーが、微生物の１つから精製された特異的な核酸のさらなる増幅のために設計されたプライマー対を含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバーの全てで同時発生する熱循環のために設計された、第２段階反応ゾーン
をさらに含み、且つ
第１段階反応ゾーンにおける第１段階マルチプレックス増幅を実施し、第１段階増幅産物を得ることと、第１段階増幅産物を希釈することと、希釈された第１段階増幅産物を複数の第２段階反応チャンバーの中で分離することと、第２段階増幅チャンバー内で第２段階増幅を実施することと、増幅後核酸融解及び第２段階増幅後の融解曲線分析を実施し、血液サンプル中に存在する微生物を同定することと、
をさらに含む、条項Ｅ１の方法
ある量のペレットを自己完結型アッセイ装置に導くように、真空下で提供される第１ポート；
第１ポートに流体接続された細胞溶解ゾーンであって、微生物を溶解するために設計された細胞溶解ゾーン；
細胞溶解ゾーンに流体接続された核酸調製ゾーンであって、微生物から核酸を精製するために設計された核酸調製ゾーン；
核酸調製ゾーンに流体接続された第１段階反応ゾーンであって、１つ以上の核酸に対する第１段階マルチプレックス増幅を実施するために設計された第１段階反応チャンバーを含む第１段階反応ゾーン；
第１段階反応ゾーンに流体接続された第２段階反応ゾーンであって、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバーを含み、各第２段階反応チャンバーが、微生物の１つから精製された特異的な核酸のさらなる増幅のために設計されたプライマー対を含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバーの全てで同時発生する熱循環のために設計された、第２段階反応ゾーン
をさらに含み、且つ
第１段階反応ゾーンにおける第１段階マルチプレックス増幅を実施し、第１段階増幅産物を得ることと、第１段階増幅産物を希釈することと、希釈された第１段階増幅産物を複数の第２段階反応チャンバーの中で分離することと、第２段階増幅チャンバー内で第２段階増幅を実施することと、増幅後核酸融解及び第２段階増幅後の融解曲線分析を実施し、血液サンプル中に存在する微生物を同定することと、
をさらに含む、条項Ｅ１の方法
【0116】
Ｅ３．プランジャーを押し込み、シール部分を開放し、ペレットを生じさせることが、プランジャーをボディの一部と密封係合になるまで押し込むことと、シールを開放することによって加圧下で第２の末端からペレットを排出することと、を含む、条項Ｅ１及びＥ２の１つ以上の方法
【0117】
Ｅ４．ペレットを、任意選択的に、その中にサンプル緩衝液を有するカニューレ処理用バイアルであって、内部体積を有するバイアル体及びバイアル体の底部表面から延伸したカニューレを含むカニューレ処理用バイアルに生じさせることをさらに含み、
バイアル体に延伸しないカニューレが、バイアル体の底部表面に隣接したカニューレの第１の末端と第２の末端とを有し、
バイアル体が、体液をカニューレに入る前にフィルター処理するように設計されたバイアル体の底部表面の近傍に位置するフィルターをさらに含み、ここでフィルターが、真菌、ウイルス、原虫、及び／又は細菌生物がそこを通過してカニューレに入ることを可能にするのに十分な直径であるが、より大きい微粒子状物質を捕捉するのに十分に小さい孔径を有する、
条項Ｅ１～Ｅ３の１つ以上の方法
バイアル体に延伸しないカニューレが、バイアル体の底部表面に隣接したカニューレの第１の末端と第２の末端とを有し、
バイアル体が、体液をカニューレに入る前にフィルター処理するように設計されたバイアル体の底部表面の近傍に位置するフィルターをさらに含み、ここでフィルターが、真菌、ウイルス、原虫、及び／又は細菌生物がそこを通過してカニューレに入ることを可能にするのに十分な直径であるが、より大きい微粒子状物質を捕捉するのに十分に小さい孔径を有する、
条項Ｅ１～Ｅ３の１つ以上の方法
【0118】
Ｅ５．カニューレの第２の末端を自己完結型アッセイ装置の第１ポート内に配置することをさらに含み、ここで自己完結型アッセイ装置の第１ポートが、ある量の体液を、バイアル体からカニューレを通って自己完結型アッセイ装置に導くように真空下で提供される、条項Ｅ１～Ｅ４の１つ以上の方法
【0119】
Ｅ６．ステップ（ｂ）～（ｄ）が、単一チューブ内で実施される、条項Ｅ１～Ｅ５の１つ以上の方法
【0120】
Ｅ７．ディファレンシャル溶解緩衝液が、単一チューブ内に提供される単一緩衝液である、条項Ｅ１～Ｅ６の１つ以上の方法
【0121】
Ｅ８．ディファレンシャル溶解緩衝液が、ＤＮａｓｅ又はプロテアーゼを含まず、且つ当該方法が、外因性ＤＮａｓｅ又はプロテアーゼを単一チューブに添加するステップを含まない、条項Ｅ１～Ｅ７の１つ以上の方法
【0122】
Ｅ９．血液サンプルを前処理すること、血液培養ステップ、血液サンプル中に存在する微生物を同定するため、血液サンプルを継代培養するステップ、又はライセート中のゲノムＤＮＡを消化するためのＤＮａｓｅステップの１つ以上を含まない、条項Ｅ１～Ｅ８の１つ以上の方法
【0123】
Ｅ１０．ステップ（ａ）～（ｄ）が、約１０～２０分の時間範囲内で完了される、条項Ｅ１～Ｅ９の１つ以上の方法
【0124】
Ｅ１１．ステップ（ｅ）及び（ｆ）が、約１５～７５分の時間範囲内で完了される、条項Ｅ１～Ｅ１０の１つ以上の方法
【0125】
Ｅ１２．ステップ（ａ）～（ｆ）が、約２５～９５分の時間範囲内で完了される、条項Ｅ１～Ｅ１１の１つ以上の方法
【0126】
この概要は、概念の選択を、後に詳細な説明においてさらに説明される簡素化された形式で導入するために提供される。この概要は、特許請求される主題の主な特徴又は必須の特徴を明らかにすることが意図されないばかりか、特許請求される主題の範囲を決定することに寄与するものとして用いられることも意図されない。
【0127】
さらなる特徴及び利点が、以下の説明において記載されることになり、また部分的には説明から明白となり、又は本発明の実施によって認知され得る。特徴及び利点は、特に添付の特許請求の範囲において示される装置及び組み合わせを用いて実現及び取得され得る。これらや他の特徴は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより十分に明白となり、又は後に記載される通り、本発明の実施によって認知され得る。
【図面の簡単な説明】
【0128】
【図1】自己完結型ＰＣＲに有用な可動ポーチを示す。
【図5】本明細書に記載のシステム及び装置を用いるディファレンシャル溶解及び遠心分離方法の一実施形態の略図である。
【図6A】本発明の一実施形態に従う、遠心濃縮器のアイソメトリック図である。
【図6D】遠心濃縮器の別のアイソメトリック図である。
【図6E】遠心濃縮器の一末端の詳細図である。
【図7】ディファレンシャル溶解緩衝液を用いるワークフローの例である。
【図8】ディファレンシャル溶解緩衝液をいくつの他のプロトコルと比較する棒グラフである。
【図9】ディファレンシャル溶解緩衝液による細胞回収を図示する棒グラフである。
【図10】例示的なディファレンシャル溶解及び遠心分離方法の場合にヒトゲノムＤＮＡを除去する効果を図示する。
【図11】ディファレンシャル溶解緩衝液が、微生物細胞を無傷のままにしながら、真核生物宿主細胞を選択的に溶解し得ることを示すデータである。
【図12】全血からの微生物の回収率及び検出効率についてのワークフローを図示する。
【図15A-C】動物細胞溶解、培養、及び微生物の濃縮のためのフロースルー方法を図示する。
【図16】微生物の単離及び濃縮のための濾過方法を図示する。
【図17A-C】細胞をサイズによって分離するために使用可能である異なる濾過構造を模式的に図示する。
【図18】（１８Ａ）多角形、（１８Ｂ）Ｕ字形、及び（１８Ｃ）蝶形のマイクロピラー形状といったピラーフィルターの異なるタイプを模式的に図示する。
【図19】緩衝液及び細胞懸濁液の一連のマイクロピラー（ｍｉｃｏｐｉｌｌａｒｓ）及びクロスフローを有する構造内での大細胞及び小細胞の分離を模式的に図示する。
【図20】卵形フィルターユニットに沿った移動による大細胞及び小細胞の濃縮を模式的に図示する。
【図21】様々なディファレンシャル溶解緩衝液製剤による経時的な血液サンプルの溶解を図示する、吸光度対インキュベーション時間のグラフである。
【図22】いくつかのタイプの生物及び血液抗凝固剤に対する生物濃度の増加を図示する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0129】
実施形態の例が、添付の図面を参照し、以下に記載される。多くの形態及び実施形態が本開示の精神及び教示から逸脱することなく可能であることから、本開示は、本明細書に記載される実施形態の例に限定するように解釈されるべきでない。むしろ、これら実施形態の例は、本開示が徹底的且つ完全なものになり、また本開示の範囲を当業者に伝えることになるように提供される。図面では、層及び領域のサイズ及び相対的サイズは、明確化のため、誇張されることがある。類似参照番号は、記述全体を通じた類似要素を指す。
【0130】
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語（技術及び科学用語を含む）は、本開示が関係する当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。一般に使用される辞書で定義されるような用語が、本願及び関連技術と関連したそれらの意味に一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で特に明確に定義されない限り、理想化された又はフォーマルすぎる意味で解釈されるべきでないことはさらに理解されるであろう。本明細書の発明の説明で用いられる用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とし、本発明を限定することが意図されない。本明細書に記載される場合に類似又は相当するいくつかの方法及び材料が本開示の実施において使用することができるが、専ら特定の代表的な材料及び方法が本明細書に記載される。
【0131】
本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許又は他の参考文献が、それら全体が参照により組み込まれる。用語使用において矛盾が生じる場合、本明細書が優先するものとする。
【0132】
装置、システム、方法などを含む、本開示の様々な態様は、１つ以上の代表的な実施に関連して例示されてもよい。本明細書で用いられるとき、「代表的な」及び「例示的な」という用語は、「例、実例、又は例証として役立つこと」を意味し、必ずしも本明細書で開示される他の実施よりも好ましい又は有利であると解釈されるべきでない。さらに、本開示又は本発明の「実施」又は「実施形態」については、その１つ以上の実施形態の具体的参照を含み、逆もまた然りであり、以下の説明よりはむしろ添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定することなく、実例を提供することが意図される。
【0133】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる通り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」が、文脈上他に明示されない限り、複数の参照対象を含むことは認められるであろう。したがって、例えば、「ａ ｔｉｌｅ」については、１つ、２つ、又はそれ以上のタイルを含む。同様に、複数の参照対象については、文脈上他に指示又は明示されない限り、単一の参照対象及び／又は複数の参照対象を含むと解釈されるべきである。したがって、「ｔｉｌｅｓ」については、複数のそのようなタイルを必ずしも必要としない。その代わり、結合と別に、１つ以上のタイルが本明細書で企図されることは理解されるであろう。
【0134】
本願全体を通じて使用される通り、「ｃａｎ」及び「ｍａｙ」という用語は、強制的意味（即ち、ｍｕｓｔを意味する）ではなく、許容的意味（即ち、～する能力を有するを意味する）で使用される。加えて、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「～によって特徴づけられる」という用語、それらの変形（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」など）、及び類似用語は、特許請求の範囲を含む、本明細書で用いられるとき、包括的であり、且つ／又は制限のないこととし、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語及びその変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）と同じ意味を有するものとし、例示的に、追加的な列挙されていない要素又は方法ステップを排除しない。
【0135】
本明細書で用いられるとき、「最上部」、「底部」、「左」、「右」、「上」、「下」、「上部」、「下部」、「内側」、「外側」、「内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）」、「外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）」、「内部（ｉｎｔｅｒｉｏｒ）」、「外部（ｅｘｔｅｒｉｏｒ）」、「近位」、「遠位」、「前方」、「逆向き」などの方向性及び／又は主観性の用語は、相対的方向及び／又は配向性を示すため、単独で使用することができ、明細書、発明、及び／又は特許請求の範囲を含む、本開示の範囲を特に限定することが意図されなくてもよい。
【0136】
ある要素が、もう一方の要素に「共役される」、「接続される」若しくは「応答性である」、又はもう一方の要素「に対して」と言及されるとき、それは、他方の要素に若しくは他方の要素に対して、直接的に、共役され得る、接続され得る、若しくは応答性であり得る、又は介在要素も存在し得る。それに対し、ある要素が、もう一方の要素に「直接的に共役される」、「直接的に接続される」若しくは「直接的に応答性である」、又はもう一方の要素「に対して直接的に」と言及されるとき、介在要素が存在しないことが理解されるであろう。
【0137】
本発明の概念の実施形態の例が、実施形態の例の理想化された実施形態（及び中間段階の構造）の略図である断面図を参照して、本明細書に記載される。そのようなことから、例えば、製造技術及び／又は許容度の結果としての図面の形状からのバリエーションは、予想されることとなる。したがって、本発明の概念の実施形態の例は、本明細書で図示される領域の特定の形状に限定されると解釈されるべきでないが、例えば、製造に起因する形状における逸脱を含むことになる。したがって、図面で図示される領域は、本質的に模式図であり、それらの形状は、装置のある領域の実際の形状を図示することが意図されず、実施形態の例の範囲を限定することが意図されない。
【0138】
「第１」、「第２」などの用語が、様々な要素を説明するために本明細書で用いられることがあるが、これらの要素が、これらの用語によって限定されるべきではないことは理解されるであろう。これらの用語は、単にある要素を別の要素と区別するために使用される。したがって、「第１」要素であれば、本実施形態の教示内容から逸脱することなく、「第２」要素と称することができる。
【0139】
また、本明細書に記載の様々な実施が、本開示の範囲から逸脱することなく、記載又は開示される任意の他の実施と組み合わせて利用できると理解される。したがって、本開示の特定の実施に従う製品、メンバー、要素、デバイス、装置、システム、方法、プロセス、組成物、及び／又はキットは、本開示の範囲から逸脱することなく、本明細書で開示される他の実施（システム、方法、装置などを含む）に記載の特性、特徴、成分、メンバー、要素、ステップなどを含み（ｉｎｃｌｕｄｅ）、包含し、又はそうでなければ含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）得る。したがって、１つの実施に関連する具体的特徴については、その実施の中での適用のみに限定されるように解釈されるべきでない。
【0140】
本明細書で用いられる見出しは、単に構造化することを目的とし、説明又は特許請求の範囲の範囲を限定するために用いられることを意味しない。理解を促進するため、可能であれば、類似の参照番号を用いて、図面に共通する類似要素を指定している。さらに、可能であれば、同様の要素の付番が様々な図面で用いられている。さらに、特定要素の代替的な設計は、それぞれ要素番号に付けられた別々の文字を含んでもよい。
【0141】
「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、大まかに（ｒｏｕｇｈｌｙ）、又はおよそ（ａｒｏｕｎｄ）の範囲内で、ほぼ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）を意味するように本明細書で用いられる。「約（ａｂｏｕｔ）」という用語が数値範囲と組み合わせて用いられるとき、それは、記載される数値の上側の境界及び下側の境界に拡張することによってその範囲を修飾する。一般に、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、規定値の５％の変動分の上側の数値及び下側の数値を修飾するように本明細書で用いられる。そのような範囲が表されるとき、別の実施形態は、一方の特定値から、且つ／又は他方の特定値にかけて含む。同様に、特定値は、値が先行する「約（ａｂｏｕｔ）」の使用によって近似値として表されるとき、別の実施形態を形成することは理解されるであろう。さらに、当該範囲のそれぞれのエンドポイントが、他方のエンドポイントと関連して、また他方のエンドポイントと独立に、いずれにしても有意であることは理解されるであろう。
【0142】
「又は」という用語は、本明細書で用いられるとき、特定リストの任意の一方のメンバーを意味し、さらにそのリストのメンバーの任意の組み合わせを含む。
【0143】
本明細書で用いられるとき、「微生物」という用語は、限定はされないが、グラム陽性又はグラム陰性細菌、酵母、カビ、及び寄生虫を含む、実験室内で繁殖及びハンドリングが可能である、一般に単細胞である生物を包含することが意図される。本発明のグラム陰性細菌の非限定例としては、以下の属の細菌：シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、及びレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）が挙げられる。本発明のグラム陽性細菌の非限定例としては、以下の属の細菌：腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）が挙げられる。本発明の酵母及びカビの非限定例としては、以下の属の酵母及びカビ：カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びトリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）が挙げられる。本発明の寄生虫の非限定例としては、以下の属の寄生虫：トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、ウケリア（Ｗｕｃｈｅｒｉａ）、糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ）、オンコセルカ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）、及びネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）が挙げられる。
【0144】
一態様では、本明細書でさらに詳細に記載される通り、サンプル又は増殖培地からの微生物は、分離し、調査することで、サンプル中に存在する微生物を特徴づけ及び／又は同定することができる。本明細書で用いられるとき、「分離する」という用語は、その元の状態から、又は増殖培地若しくは培地から除去、濃縮又はそうでなければ分離されている微生物の任意のサンプルを包含することが意図される。例えば、本発明に従い、微生物は、通常であれば特徴づけ及び／又は同定に干渉し得る非微生物又は非微生物成分から（例えば、別々のサンプルとして）分離されてもよい。当該用語は、遠心分離、濾過、又は当該技術分野で公知の任意の他の分離技術によって混合物から分離されている微生物を含んでもよい。そのようなものとして、分離された微生物サンプルは、元のサンプルより濃縮された、又はそうでなければ元のサンプルから分離された微生物及び／又はその成分の収集物を含んでもよく、微生物の密に詰まった高密度凝集塊から微生物の拡散層に及び得る。微生物から分離された非微生物成分は、非微生物細胞（例えば、血球及び／又は他の組織細胞）及び／又はそれらのいずれかの成分を含んでもよい。一態様では、微生物は、溶解された非微生物細胞及び実質的に無傷の微生物細胞を含むライセート混合物から分離される。
【0145】
いくつかの実施形態では、微生物のサンプルの、その元の状態から、又は成長若しくは培地からの分離は、不完全である。換言すれば、微生物のその元の状態から逸脱した除去、濃縮、又はそうでなければ設定により、微生物のサンプルは、サンプルの他の成分から、又は成長若しくは培地から完全には分離されない。いくつかの場合、サンプルから、又は成長若しくは培地からのデブリが、最少量存在する。例えば、分離されたサンプル中に存在するデブリ又は成長若しくは培地の量は、微生物の同定若しくは特徴づけ、又は微生物のさらなる成長に干渉するのに不十分であり得る。いくつかの実施形態では、分離されたサンプルは、汚染成分から９９％純粋であるが、それはまた、９５％純粋、９０％純粋、８０％純粋、７０％純粋、６０％純粋、５０％純粋、又は分離されたサンプル中の微生物の下流同定技術による同定を依然として可能にする最小純度であってもよい。
【0146】
本明細書でさらに詳細に記載されるさらなる別の態様では、サンプル又は成長培地からの微生物は、ペレット化し、調査することで、サンプル中に存在する微生物を特徴づけ及び／又は同定することができる。本明細書で用いられるとき、「ペレット」という用語は、微生物の塊に圧縮又は蓄積されている微生物の任意のサンプルを包含することが意図される。例えば、サンプルからの微生物は、遠心分離、又は当該技術分野における他の公知の方法によって、チューブの底部で塊に圧縮又は蓄積することができる。当該用語は、遠心分離後の、容器の底面及び／又は側面上の微生物（及び／又はその成分）の収集物を含む。本発明に従い、微生物は、通常は特徴づけ及び／又は同定に干渉し得る非微生物又は非微生物成分から（例えば、実質的に精製された微生物ペレットとして）ペレット化され得る。
【0147】
「核酸」という語句は、本明細書で用いられるとき、ワトソン・クリック塩基対合による相補的核酸とのハイブリダイゼーションが可能である、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドの一本鎖又は二本鎖のセンス又はアンチセンスのいずれかの、天然に存在する又は合成のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。本発明の核酸は、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ）、及び非リン酸ジエステルヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はチオジエステル結合）も含み得る。特に、核酸は、限定はされないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【0148】
「プローブ」、「プライマー」又は「オリゴヌクレオチド」は、相補的配列を含む第２の核酸分子（「標的」）に塩基対合し得る、規定された配列の一本鎖核酸分子を意味する。得られるハイブリッドの安定性は、長さ、ＧＣ含量、及び発生する塩基対合の範囲に依存する。塩基対合の範囲は、プローブと標的分子との間の相補性の程度及びハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度などのパラメータによって影響を受ける。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの程度は、温度、塩濃度、及びホルムアミドなどの有機分子の濃度などのパラメータによって影響を受け、当業者に公知の方法によって判定される。プローブ、プライマー、及びオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の方法によって、放射活性、蛍光、又は非放射活性のいずれかで検出可能に標識されてもよい。ｄｓＤＮＡ結合色素を用いて、ｄｓＤＮＡを検出してもよい。「プライマー」がポリメラーゼによって伸長されるように特別に設計される一方で、「プローブ」又は「オリゴヌクレオチド」がそのように設計されても又はされなくてもよいことは理解される。
【0149】
「ｄｓＤＮＡ結合色素」は、二本鎖ＤＮＡに結合されるとき、一本鎖ＤＮＡに結合される、又は溶液中で遊離するときと異なって、通常はより強力に蛍光を発することによって、蛍光を発する色素を意味する。ｄｓＤＮＡ結合色素を参照するとき、任意の好適な色素を本明細書で使用してもよく、いくつかの非限定的な例示的色素が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３８７，８８７号明細書に記載されていることは理解される。当該技術分野で公知の通り、他のシグナルを生成する物質、例示的に、酵素、抗体などが、核酸の増幅及び融解を検出するのに使用されてもよい。
【0150】
「特異的にハイブリダイズする」は、プローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチドが、高ストリンジェンシー条件下で、実質的に相補的な核酸（例えば、サンプル核酸）を認識し、それと物理的に相互作用し（即ち、塩基対合し）、且つ他の核酸と実質的に塩基対を形成しないことを意味する。
【0151】
「高ストリンジェンシー条件」は、典型的に、およそ融解温度（Ｔｍ）－５℃（即ち、プローブのＴｍより５°低い）で行われることを意味する。機能的に、高ストリンジェンシー条件を用いて、少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列が同定される。
【0152】
「溶解粒子」は、サンプル中に存在し得る細胞、ウイルス、胞子、及び他の材料の溶解のための様々な粒子又はビーズを意味する。様々な例では、ジルコニウム（「Ｚｒ」）ケイ酸塩又はセラミックビーズが使用されるが、ガラス及び砂溶解粒子を含む、他の溶解粒子が、公知であり、この用語の範囲内に含まれる。「細胞溶解成分」という用語は、当該技術分野で公知の通り、溶解粒子を含んでもよいが、化学溶解のための成分などの他の成分をさらに含んでもよい。
【0153】
ＰＣＲが、本明細書中の例において用いられる増幅方法である一方で、プライマーを使用する任意の増幅方法が好適であり得ることが理解される。そのような好適な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）；カスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ）、ＤＮＡのループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）；核酸の等温及びキメラプライマー開始増幅（ＩＣＡＮ）；標的ベースのヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）；転写介在増幅（ＴＭＡ）などを含む。したがって、ＰＣＲという用語が用いられるとき、他の代替的な増幅方法を含むことが理解されるべきである。分離サイクルを伴わない増幅方法においては、サイクル、倍加時間、又はクロッシングポイント（Ｃｐ）における測定がなされる場合、反応時間が用いられてもよく、追加的なＰＣＲサイクルが本明細書に記載の実施形態において加えられる場合、追加的な反応時間が加えられてもよい。したがって、プロトコルが調節される必要があり得ることが理解される。
【0154】
本明細書中の様々な例がヒト標的及びヒト病原体を参照する一方で、これらの例は単に例示的である。本明細書に記載の方法、キット、及び装置を用いて、ヒト、動物、工業、及び環境を含む多種多様なサンプルから多種多様な核酸配列を検出又は配列決定することができる。
【0155】
本明細書で開示される様々な実施形態では、例示的に、単一の閉じたシステム内で、サンプルを、様々な生物学的物質、例示的に、抗原及び核酸配列の存在についてアッセイするための自己完結型核酸分析ポーチが使用される。ポーチ及びポーチとともに使用するための装置を含むそのようなシステムは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３９４，６０８号明細書；及び米国特許第８，８９５，２９５号明細書；及び米国特許第１０，４６４，０６０号明細書により詳細に開示されている。しかし、そのようなポーチが単に例示的であり、本明細書で考察される核酸調製及び増幅反応が、当該技術分野で公知であるような種々の核酸の精製及び増幅システムを用いて、９６ウェルプレート、他の形状のプレート、アレイ、カルーセルなどを含む、当該技術分野で公知であるような種々の開いた又は閉じたシステムのサンプル容器のいずれかにおいて実施されてもよいことは理解される。「サンプルウェル」、「増幅ウェル」、「増幅容器」などの用語が本明細書で用いられる一方で、これらの用語は、これらの増幅システムで使用されるような、ウェル、チューブ、及び様々な他の反応容器を包含することを意味する。一実施形態では、ポーチを用いて、複数の病原体についてアッセイされる。ポーチは、例示的に、閉じたシステム内に、サンプルウェルとして使用される１つ以上のブリスターを含んでもよい。例示的に、核酸調製、一次大容量マルチプレックスＰＣＲ、一次増幅産物の希釈、及び二次ＰＣＲを含み、任意選択的なリアルタイム検出又は融解曲線分析などの増幅後分析で終わる様々なステップが、任意選択的に、使い捨てポーチ内で実施されてもよい。さらに、様々なステップが本発明のポーチ内で実施されてもよい一方で、ステップの１つ以上が特定使用の場合に省略されてもよく、それに従い、ポーチの配置が改変されてもよいことが理解される。本明細書中の多くの実施形態で、第１段階増幅においてマルチプレックス反応が用いられる一方で、これが単に例示的であり、またいくつかの実施形態において、第１段階増幅がシングルプレックスであってもよいことが理解される。１つの例示的な例では、第１段階シングルプレックス増幅は、ハウスキーピング遺伝子を標的にし、第２段階増幅では、同定のため、ハウスキーピング遺伝子の差異が用いられる。したがって、様々な実施形態では、第１段階マルチプレックス増幅が検討される一方で、これが単に例示的であることが理解される。
【0156】
図１は、様々な実施形態において使用してもよく、又は様々な実施形態において再設計してもよい例示的なポーチ５１０を示す。ポーチ５１０は、米国特許第８，８９５，２９５号明細書の図１５と類似し、類似項目が同様に付番されている。装備品５９０には、エントリチャネル５１５ａ～５１５ｌが提供され、それらはまた、試薬リザーバー又は廃棄物リザーバーとして役立つ。例示的に、試薬は、装備品５９０内で凍結乾燥され、使用前に再水和されてもよい。ブリスター５２２、５４４、５４６、５４８、５６４、及び５６６は、それらの各チャネル５１４、５３８、５４３、５５２、５５３、５６２、及び５６５とともに、米国特許第８，８９５，２９５号明細書の図１５の同じ番号のブリスターと類似する。図１の第２段階反応ゾーン５８０は、米国特許第８，８９５，２９５号明細書の場合と類似するが、高密度アレイ５８１の第２段階ウェル５８２は、やや異なるパターンで配置される。図１の高密度アレイ５８１のより円形のパターンは、端のウェルが除去されることで、より均一な第２段階ウェル５８２の充満をもたらし得る。図示の通り、高密度アレイ５８１は、１０２の第２段階ウェル５８２が提供される。ポーチ５１０は、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）装置（ＢｉｏＦｉｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）における使用に適する。しかし、ポーチの実施形態が単に例示的であることが理解される。
【0157】
他の容器を使用してもよい一方で、例示的に、ポーチ５１０は、押出成形、プラズマ蒸着、及び積層を含む、当該技術分野で公知の任意のプロセスによって作製可能である、柔軟性プラスチックフィルム又は他の柔軟性材料、例えば、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸メチル、それらの混合物、組み合わせ、及び層の２つの層で形成されてもよい。例えば、各層は、一緒に積層される、単一タイプ又は２つ以上のタイプの材料の１つ以上の層から構成され得る。また、アルミニウム積層を有する金属箔又はプラスチックが使用されてもよい。他のバリア材料は、当該技術分野で公知であり、一緒に密封し、ブリスター及びチャネルを形成することができる。プラスチックフィルムが使用される場合、層は、例示的に、ヒートシーリングによって、一緒に結合されてもよい。例示的に、材料は、低い核酸結合及び低いタンパク質結合能力を有する。
【0158】
蛍光モニタリングを用いる実施形態の場合、吸光度が十分に低いプラスチックフィルム及び有効波長での自家蛍光が好ましい。そのような材料であれば、異なるプラスチック、異なる可塑剤、及び複合比率、並びにフィルムの異なる厚みを試験することによって同定することができる。アルミニウム又は他の箔積層を有するプラスチックの場合、蛍光検出装置によって読み取られることになるポーチの部分は、箔を有しない状態にすることができる。例えば、ポーチ５１０の第２段階反応ゾーン５８０の第２段階ウェル５８２内で蛍光が監視される場合、ウェル５８２での一方又は両方の層は、箔を有しない状態にされることになる。ＰＣＲの例では、厚みが約０．００４８インチ（０．１２１９ｍｍ）のポリエステルからなるフィルム積層体（Ｍｙｌａｒ，ＤｕＰｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ）及び厚みが０．００１～０．００３インチ（０．０２５～０．０７６ｍｍ）のポリプロピレンフィルムは奏功する。例示的に、ポーチ５１０は、入射光の約８０％～９０％を透過させる能力がある透明材料から作製されてもよい。
【0159】
例示的な実施形態では、材料は、ブリスター及びチャネルに対する圧力、例示的に空気圧の適用によってブリスター間を移動させられる。したがって、圧力を用いる実施形態では、ポーチ材料は、例示的に、圧力が所望の効果を有することを可能にするため、十分に柔軟性がある。「柔軟性」という用語は、本明細書で、ポーチの材料の物理的特徴を説明するために用いられる。「柔軟性」という用語は、本明細書で、本明細書で用いられる圧力のレベルによって容易に変形可能であり、クラッキング、破壊、ひび割れなどが生じないことと定義される。例えば、サラン（商標）ラップ及びＺｉｐｌｏｃ（登録商標）バッグなどの薄いプラスチックシート、並びにアルミニウム箔などの薄い金属箔は、柔軟性がある。しかし、柔軟性が必要であるのは、たとえ空気圧を用いる実施形態であっても、ブリスター及びチャネルの特定の領域に限られる。さらに、柔軟性が必要であるのは、ブリスター及びチャネルが容易に変形可能である限り、ブリスター及びチャネルの一側面に限られる。ポーチ５１０の他の領域は、強固な材料で作製されてもよく、又は強固な材料で強化されてもよい。したがって、「柔軟性ポーチ」又は「柔軟性サンプル容器」などの用語が用いられるとき、柔軟性が必要であるのは、ポーチ又はサンプル容器のいくつかの部分に限られることは理解される。
【0160】
例示的に、プラスチックフィルムがポーチ５１０に使用されてもよい。金属のシート、例示的にアルミニウム、又は他の好適な材料を、圧延し、又はそうでなければ切断し、ふくらんだ表面のパターンを有する金型を作製してもよい。空気プレス（例示的に、Ａ－５３０２－ＰＤＳ，Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ Ｔｏｏｌ Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｔｏｎ ＷＩ）に適合させ、例示的に、１９５℃の有効温度で調節されるとき、空気プレスは、印刷機のように動作し、金型がフィルムに接触する場所に限り、プラスチックフィルムのシール面を溶解する。同様に、ポーチ５１０に使用されるプラスチックフィルムは、レーザー切断及び溶接装置を用いて、一緒に切断及び溶接されてもよい。（例示的に、フィルム上にスポットされ、乾燥される）ＰＣＲプライマー、抗原結合基質、磁気ビーズ、及びケイ酸ジルコニウムビーズなどの様々な成分は、ポーチ５１０が形成されるときの様々なブリスターの内側に密封されてもよい。サンプル処理のための試薬は、密封前に、まとめて又は別々に、フィルム上にスポットすることができる。一実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）は、ポリメラーゼ及びプライマーと別々にフィルム上にスポットされ、反応物が水性サンプルによって水和され得るまで、ポリメラーゼの活性が本質的に除去される。水性サンプルが水和前に加熱されている場合、これにより、真のホットスタートＰＣＲのための条件が得られ、高価な化学的ホットスタート成分の必要性が低減又は除去される。別の実施形態では、成分は、粉末又はピル形態で提供されてもよく、最終密封前にブリスター内に配置される。
【0161】
ポーチ５１０は、米国特許第８，８９５，２９５号明細書に記載されたものと類似する様式で使用されてもよい。例示的な一実施形では、試験対象のサンプル（１００μｌ）及び溶解緩衝液（２００μｌ）を含む３００μｌの混合物が、エントリチャネル５１５ａ近傍の装備品５９０内の注入ポート（図示されない）に注入されてもよく、サンプル混合物は、エントリチャネル５１５ａに導かれてもよい。また、装備品５９０に隣接したエントリチャネル５１５ｌの第２の注入ポート（図示されない）に水が注入されてもよく、水は装備品５９０内に提供されるチャネル（図示されない）を介して分布され、それにより最大で１１の異なる試薬であって、そのそれぞれがエントリチャネル５１５ｂ～５１５ｌで予め乾燥形態で提供された試薬が水和される。サンプル及び水和液（例えば、水又は緩衝液）を注入するための例示的な方法及び装置は、米国特許出願公開第２０１４－０２８３９４５号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているが、これらの方法及び装置が、単に例示的であり、サンプル及び水和液をポーチ５１０に導入する他の方法が、本開示の範囲内であることが理解される。これらの試薬は、例示的に、凍結乾燥ＰＣＲ試薬、ＤＮＡ抽出試薬、洗浄溶液、イムノアッセイ試薬、又は他の化学的実体を含んでもよい。例示的に、試薬は、核酸抽出、第１段階マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックス反応の希釈、及び第２段階ＰＣＲ試薬の調製、並びに対照反応のためである。図１に示される実施形態では、注入の必要がある全ては、一方の注入ポート内のサンプル溶液及び他方の注入ポート内の水である。注入後、２つの注入ポートは、密封されてもよい。ポーチ５１０及び装備品５９０の様々な立体配置に関するさらなる情報については、既に参照により組み込まれた米国特許第８，８９５，２９５号明細書を参照されたい。
【0162】
注入後、サンプルは、注入チャネル５１５ａからチャネル５１４を介して溶解ブリスター５２２に移されてもよい。溶解ブリスター５２２は、セラミックビーズ又は他の研磨材要素などのビーズ又は粒子５３４が提供され、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）装置内に提供される回転ブレード又はパドルを使用し、嵌入を介してボルテックスするために設計される。ケイ酸ジルコニウム（ＺＳ）ビーズ５３４などの溶解粒子の存在下での、振盪、ボルテックス、超音波処理、及びサンプルの類似処理によるビーズミリングは、ライセートを形成するための有効な方法である。本明細書で用いられるとき、「溶解する」、「溶解すること」及び「ライセート」などの用語が、細胞を破壊することに限定されないが、そのような用語が、ウイルスなどの非細胞性粒子の破壊を含むことが理解される。別の実施形態では、例えば、米国特許出願公開第２０１９－０３４４２６９号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、往復性又は交互性のパドルを使用するパドルビーターが、本実施形態における溶解、及び本明細書に記載の他の実施形態における溶解のため、使用されてもよい。
【0163】
図４は、図２に示される装置８００の、支持メンバー８０２の第１側面８１１上に取り付けることができるブレード８２１を含む、ビーズビーティングモーター８１９を示す。ブレードは、スロット８０４を通じて延伸し、ポーチ５１０に接触してもよい。しかし、モーター８１９が、装置８００の他の構造上に取り付けられてもよいことが理解される。例示的な一実施形態では、モーター８１９は、支持メンバー８０２上に取り付けられたマブチモーターのＲＣ－２８０ＳＡ－２８６５ ＤＣモーター（千葉、日本）である。例示的な一実施形態では、モーターは、５，０００～２５，０００ｒｐｍ、より例示的に、１０，０００～２０，０００ｒｐｍ、またさらにより例示的に、約１５，０００～１８，０００ｒｐｍで回転する。マブチモーターのモーターの場合、７．２Ｖが溶解にとって十分なｒｐｍをもたらすことが見出されている。しかし、実際の速度が、ブレード８２１がポーチ５１０に影響を及ぼしているとき、ややより遅い場合があることが理解される。使用されるモーター及びパドルに応じて、他の電位及び速度が溶解のために使用されてもよい。任意選択的に、制御された少量の空気が、ブラダー８２２に隣接する溶解ブリスター５２２に提供されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の少量の空気を隣接ブラダーに部分的に充填することにより、溶解プロセス中、溶解ブリスターの位置決め及び支持が補助されることが見出されている。或いは、別の構造、例示的に、溶解ブリスター５２２周囲の強固な又はコンプライアントなガスケット又は他の保持構造を用いて、溶解中、ポーチ５１０を制限することができる。モーター８１９が、単に例示的であり、サンプルのミリング、振盪、又はボルテックスのため、他の装置を使用してもよいことも理解される。いくつかの実施形態では、化学物質又は熱は、機械的溶解に加えて、又はその代わりに用いてもよい。
【0164】
一旦サンプル材料が十分に溶解されていると、サンプルは、核酸抽出ゾーンに、例示的に、チャネル５３８、ブリスター５４４、及びチャネル５４３を通じて、ブリスター５４６に移され、そこでサンプルは、シリカコーティング磁気ビーズ５３３などの核酸結合物質と混合される。或いは、磁気ビーズ５３３は、例示的に、エントリチャネル５１５ｃ～５１５ｅの１つから提供される液体を用いて再水和され、次にチャネル５４３を通じて、ブリスター５４４に、次にチャネル５３８を通じて、ブリスター５２２に移されてもよい。混合物は、適切な時間、例示的に、約１０秒～約１０分かけてインキュベートされてもよい。装置に隣接するブリスター５４６内部に位置する格納式磁石が、溶液から磁気ビーズ５３３を捕捉し、ブリスター５４６の内部表面に対してペレットを形成する。ブリスター５２２内でインキュベーションが行われる場合、溶液の複数の部分は、捕捉のため、ブリスター５４６に移される必要があり得る。次に、液体がブリスター５４６から外部に移され、ブリスター５４４を通じて、ブリスター５２２に戻され、そこではそれは廃棄物容器として使用される。注入チャネル５１５ｃ～５１５ｅの１つ以上からの１つ以上の洗浄緩衝液が、ブリスター５４４及びチャネル５４３を介してブリスター５４６に提供される。任意選択的に、磁石は、格納され、磁気ビーズ５３３は、ビーズをブリスター５４４及び５４６からチャネル５４３を介して前後に移動させることによって洗浄される。一旦磁気ビーズ５３３が洗浄されると、磁気ビーズ５３３は、ブリスター５４６内で磁石の活性化によって再捕捉され、次に洗浄溶液は、ブリスター５２２に移される。このプロセスは、必要に応じて反復され、溶解緩衝液及びサンプルの残骸を核酸結合磁気ビーズ５３３から洗浄してもよい。
【0165】
洗浄後、注入チャネル５１５ｆに貯蔵された溶出緩衝液が、ブリスター５４８に移され、磁石は格納される。溶液は、ブリスター５４６及び５４８間で、チャネル５５２を介して循環させることで、ブリスター５４６内の磁気ビーズ５３３のペレットを破壊し、捕捉された核酸をビーズから解離させ、溶液にすることができる。磁石が再び活性化されると、磁気ビーズ５３３がブリスター５４６内に捕捉され、溶出された核酸溶液が、ブリスター５４８に移される。
【0166】
注入チャネル５１５ｇからの第１段階ＰＣＲマスターミックスが、ブリスター５４８内の核酸サンプルと混合される。任意選択的に、混合物は、混合物を５４８と５６４との間にチャネル５５３を介して強制的に入れることによって混合される。数回の混合サイクル後、溶液はブリスター５６４内に含まれ、そこで第１段階ＰＣＲプライマーのペレットが提供され、少なくとも１つのプライマーセットが各標的に提供され、第１段階マルチプレックスＰＣＲが実施される。ＲＮＡ標的が存在する場合、逆転写（ＲＴ）ステップが、第１段階マルチプレックスＰＣＲの前に又はそれと同時に実施されてもよい。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）装置における第１段階マルチプレックスＰＣＲの温度サイクリングは、例示的に、１５～２０サイクルの間に実施されるが、増幅の他のレベルが、特定の適用の要件に応じて望ましいことがある。第１段階ＰＣＲマスターミックスは、当該技術分野で公知である通り、様々なマスターミックスのいずれであってもよい。１つの実例では、第１段階ＰＣＲマスターミックスは、１サイクルあたり２０秒以下かかるＰＣＲプロトコルでの使用の場合、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９３２，６３４号明細書に開示された化学物質のいずれかであってもよい。
【0167】
第１段階ＰＣＲが所望のサイクル数にわたって進行してから、サンプルは、例示的に、サンプルの大部分をブリスター５４８内に強制的に戻し、ブリスター５６４内に少量だけ残し、第２段階ＰＣＲマスターミックスを注入チャネル５１５ｉから添加することによって希釈することができる。或いは、５１５ｉからの希釈緩衝液は、ブリスター５６６に移し、次に液体をブリスター５６４及び５６６の間で前後に移動させることによって、ブリスター５６４内で増幅サンプルと混合することができる。必要に応じて、注入チャネル５１５ｊ及び５１５ｋからの希釈緩衝液を用いて、希釈を数回反復してもよく、又は例示的に配列決定若しくは他のＰＣＲ後分析のため、注入チャネル５１５ｋを準備し、次に第２段階ＰＣＲマスターミックスを、注入チャネル５１５ｈから希釈された増幅サンプルの一部若しくは全部に添加してもよい。希釈のレベルが、希釈ステップの数を変更することによって、又は希釈緩衝液、若しくは増幅のための成分、例示的に、特にポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び好適な緩衝液を含む第２段階ＰＣＲマスターミックスと混合する（但し、非ＰＣＲ増幅方法においては、他の成分が適し得る）前に廃棄されるサンプルの百分率を変更することによって、調節してもよいことが理解される。必要に応じて、サンプル及び第２段階ＰＣＲマスターミックスのこの混合物は、第２段階増幅のため、第２段階ウェル５８２に移す前に、ブリスター５６４内で予熱されてもよい。そのような予熱は、第２段階ＰＣＲ混合物中のホットスタート成分（抗体、化学物質、又はそれ以外）の必要性を取り除くことができる。
【0168】
一実施形態では、例示的な第２段階ＰＣＲマスターミックスは、不完全であり、プライマー対が欠如しており、１０２の第２段階ウェル５８２のそれぞれは、特定のＰＣＲプライマー対が予め充填される。他の実施形態では、当該マスターミックスは、他の成分（例えば、ポリメラーゼ、Ｍｇ２＋など）が欠如することがあり、欠如している成分は、アレイ内で予め充填されてもよい。必要に応じて、第２段階ＰＣＲマスターミックスは、他の反応成分が欠如することがあり、同様に、これらの成分は、第２段階ウェル５８２内で予め充填されてもよい。各プライマー対は、第１段階ＰＣＲプライマー対と類似若しくは同一であってもよく、又は第１段階プライマー対内で入れ子状態であってもよい。サンプルをブリスター５６４から第２段階ウェル５８２に移すことで、ＰＣＲ反応混合物が完全になる。一旦高密度アレイ５８１が充填されると、個々の第２段階反応物は、当該技術分野で公知の通り、いくつもの手段によって、それらの各第２段階ブリスター内で密封される。高密度アレイ５８１を、相互汚染を伴わずに、充填し、密封する例示的な方法は、既に参照により組み込まれた、米国特許第８，８９５，２９５号明細書中で考察されている。例示的に、高密度アレイ５８１のウェル５８２内での様々な反応は、同時に又は個別に、例示的に、１つ以上のペルチェデバイスを用いて熱循環されるが、熱循環のための他の手段が、当該技術分野で公知である。
【0169】
特定の実施形態では、第２段階ＰＣＲマスターミックスは、増幅を意味するシグナルを生成するため、ｄｓＤＮＡ結合色素ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＦｉｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を含む。しかし、この色素が、単に例示的であり、当該技術分野で公知の通り、蛍光、放射活性、化学発光、酵素などで標識される他のｄｓＤＮＡ結合色素及びプローブを含む、他のシグナルが使用されてもよいことが理解される。或いは、アレイ５８１のウェル５８２は、シグナルがない条件で提供され、結果は、その後の処理を通じて報告されてもよい。
【0170】
ポーチ５１０内で材料を移動させるために空気圧が用いられるとき、一実施形態において、「ブラダー」が利用されてもよい。ブラダーアセンブリ８１０であって、その一部が図２～３で示されるものは、例示的に、圧縮気体源により、複数の可膨張性ブラダー８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、及び８６６であって、そのそれぞれが個別に可膨張性であってもよいものを収容するブラダープレート８２４を含む。ブラダーアセンブリ８１０が、圧縮ガスを受け、複数回使用され得ることから、ブラダーアセンブリ８１０は、ポーチより堅い又はより厚い材料から作製されてもよい。或いは、ブラダー８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、及び８６６は、ガスケット、シール、バルブ、及びピストンとともにしっかり固定された一連のプレートから形成されてもよい。その他の配置は、本発明の範囲内である。或いは、アレイ又は機械的なアクチュエータ及びシールを使用し、チャネルを密封し、ブリスター間の液体の移動を誘導することができる。本明細書に記載の装置に適応し得る機械的なシール及びアクチュエータのシステムについては、米国特許出願公開第２０１９－０３４４２６９号明細書（その全体は既に参照により組み込まれている）に詳述されている。
【0171】
二次ＰＣＲ反応の成功は、マルチプレックス第１段階反応によって生成される鋳型に依存している。典型的に、ＰＣＲは、高純度のＤＮＡを用いて実施される。フェノール抽出などの方法又は市販のＤＮＡ抽出キットは、高純度のＤＮＡを提供する。ポーチ５１０を通じて処理されたサンプルは、純度がより低い調製を補償するために調節を行う必要があり得る。ＰＣＲは、潜在的障壁である、生体サンプルの成分によって阻害され得る。例示的に、ホットスタートＰＣＲ、より高い濃度のＴａｑポリメラーゼ酵素、ＭｇＣｌ２濃度の調節、プライマー濃度の調節、阻害剤に対して抵抗性がある改変酵素の添加、及びアジュバント（ＤＭＳＯ、ＴＭＳＯ、又はグリセロールなど）の添加を任意選択的に用いて、より低い核酸純度を補償することができる。純度の課題が、第１段階増幅で一層の懸念である可能性が高い一方で、同様の調節が、第２段階増幅で同様に提供され得ることが理解される。
【0172】
ポーチ５１０が装置８００内に配置されるとき、ブラダーアセンブリ８１０は、ポーチ５１０の一面に対して押圧されることから、特定のブラダーが膨張される場合、ポーチ５１０内の対応するブリスターから液体が加圧されることになる。ブラダーアセンブリ８１０は、ポーチ５１０のブリスターの多くに対応するブラダーに加えて、ポーチ５１０の様々なチャネルに対応する、ブラダー又は空気圧駆動式ピストンなどの追加的な空気圧式アクチュエータを有してもよい。図２～３は、ポーチ５１０のチャネル５３８、５４３、５５３、及び５６５に対応する、例示的な複数のピストン又はハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、及び８６５、並びに装備品５９０への逆流を最小化するシール８７１、８７２、８７３、８７４を示す。ハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、及び８６５は、活性化されると、対応するチャネルをピンチオフ及び閉鎖するためのピンチバルブを形成する。液体をポーチ５１０の特定のブリスター内に拘束するため、ハードシールは、ブリスターにつながるチャネル及びブリスターからのチャネルよりも活性化されることで、アクチュエータは、チャネルをピンチして閉鎖するためのピンチバルブとして機能する。例示的に、異なるブリスター内で２つの体積の液体を混合するため、接続チャネルを密封するピンチバルブアクチュエータが活性化され、ブリスターの上の空気圧式ブラダーが交互に圧縮され、ブリスターを接続するチャネルを通じて液体を前後に加圧し、その中の液体を混合する。ピンチバルブアクチュエータは、様々な形状及びサイズであってもよく、２つ以上のチャネルを同時にピンチオフするように設計されてもよい。空気圧式アクチュエータが本明細書で考察される一方で、線形ステッピングモーター、モーター駆動カム、空気圧力、水力学力又は電磁気力によって駆動される強固なパドル、ローラー、ロッカーアーム、及びいくつかの場合、コックスプリングなどの様々な電気機械的アクチュエータを含む、ポーチに圧力を与える他の方法が企図されることが理解される。さらに、チャネルの軸に正常な圧力を加えることに加えて、チャネルを可逆的又は不可逆的に閉鎖する種々の方法が存在する。これらは、チャネルを通じてバッグをねじること、ヒートシールすること、アクチュエータを回転させること、並びに種々の物理バルブのバタフライバルブ及びボールバルブなどのチャネルへの密封を含む。加えて、小型ペルチェデバイス又は他の温度制御装置を、チャネルに隣接するように配置し、液体を凍結させるのに十分な温度に設定することで、シールを有効に形成することができる。また、図１の設計が、アクチュエータ要素がブリスター及びチャネルのそれぞれの上に配置されることを特徴とする自動化装置に適応する一方で、アクチュエータが定常性を維持することができ、ポーチ５１０を、少数のアクチュエータが、サンプル破壊、核酸捕捉、第１及び第２段階ＰＣＲ、並びにイムノアッセイ及びイムノＰＣＲなどのポーチ５１０の他の適用のための処理ステーションを含む、処理ステーションのいくつかに使用できるように変更可能であることも企図される。チャネル及びブリスターに対して作用するローラーであれば、ポーチ５１０がステーション間で翻訳されるような設計において特に有用であることを立証することができる。したがって、空気圧式アクチュエータが本開示の実施形態において使用される一方で、「空気圧式アクチュエータ」という用語が本明細書で用いられるとき、圧力をもたらす他のアクチュエータ及び他の方法が、ポーチ及び装置の設計に応じて使用されてもよいことが理解される。
【0173】
図２に戻ると、各空気圧式アクチュエータは、バルブ８９９を介して圧縮気体源８９５に接続される。いくつかのホース８７８のみが図２に示される一方で、各空気圧式フィッティングが、ホース８７８を介して圧縮気体源８９５に接続されることが理解される。圧縮気体源８９５は、圧縮機であってもよく、又は代替的に、圧縮気体源８９５は、二酸化炭素シリンダーなどの圧縮ガスシリンダーであってもよい。圧縮ガスシリンダーは、携帯性が所望される場合、特に有用である。他の圧縮気体源は、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のポーチにおける液体移動の制御のため、類似する空気圧式制御が提供されてもよく、又は他のアクチュエータ、サーボなどが提供されてもよい。
【0174】
また、装置のいくつかの他の成分が、圧縮気体源８９５に接続される。支持メンバー８０２の第２の側面８１４上に取り付けられた磁石８５０は、例示的に、ホース８７８を介する圧縮気体源８９５からの気体を用いて配備及び格納されるが、磁石８５０を移動させる他の方法は、当該技術分野で公知である。磁石８５０は、支持メンバー８０２内の陥凹部８５１に位置する。陥凹部８５１が、磁石８５０がポーチ５１０のブリスター５４６に接触し得るように、支持メンバー８０２を通る通路であり得ることが理解される。しかし、支持メンバー８０２の材料に応じて、磁石８５０が配備されるとき、磁石８５０がブリスター５４６で十分な磁場を提供するのに十分に近く、また磁石８５０が十分に格納されるとき、磁石８５０がブリスター５４６内に存在する任意の磁気ビーズ５３３に有意に影響しない限り、陥凹部８５１が支持メンバー８０２を貫通して伸びる必要がないことが理解される。磁石８５０の格納について言及がなされる一方で、電磁石が使用されてもよく、電磁石を通じて電気の流れを制御することによって、電磁石の作動及び非作動がなされてもよいことが理解される。したがって、本明細書で磁石の除去又は格納について考察される一方で、これらの用語が、磁場を取り除く他の方法を包含するのに十分に広義であることが理解される。空気圧式接続が、空気圧式ホース又は空気圧式エアマニホールドであり得、それ故、必要とされるホース又はバルブの数が低減され得ることが理解される。同様の磁石及び磁石を作動させるための方法が他の実施形態において使用されてもよいことが理解される。
【0175】
また、空気圧式ピストンアレイ８６９の様々な空気圧式ピストン８６８は、圧縮気体源８９５にホース８７８を介して接続される。２つのホース８７８のみが空気圧式ピストン８６８を圧縮気体源８９５に接続することが示される一方で、空気圧式ピストン８６８のそれぞれが圧縮気体源８９５に接続されることが理解される。１２の空気圧式ピストン８６８が示される。
【0176】
温度制御要素の対が、支持メンバー８０２の第２の側面８１４上に取り付けられる。本明細書で用いられるとき、「温度制御要素」という用語は、熱をサンプルに加える、又はサンプルから熱を除去する装置を指す。温度制御要素の実例としては、限定はされないが、ヒーター、クーラー、ペルチェデバイス、抵抗ヒーター、誘導ヒーター、電磁ヒーター、薄膜ヒーター、印刷要素ヒーター、正温度係数ヒーター、及びそれらの組み合わせが挙げられる。温度制御要素は、複数のヒーター、クーラー、ペルチェなどを含んでもよい。一態様では、所与の温度制御要素は、ヒーター又はクーラーの２つ以上のタイプを含んでもよい。例えば、温度制御要素の実例としては、別々の抵抗ヒーターがペルチェの上面及び／又は下面に適用されたペルチェデバイスを挙げてもよい。「ヒーター」という用語が本明細書全体を通じて用いられる一方で、他の温度制御要素を用いて、サンプルの温度を調節してもよいことが理解される。
【0177】
上で考察したように、第１段階ヒーター８８６は、第１段階ＰＣＲにおいてブリスター５６４の中身を加熱及び冷却するように配置されてもよい。図２で明らかなように、第２段階ヒーター８８８は、第２段階ＰＣＲにおいてポーチ５１０のアレイ５８１の第２段階ブリスターの中身を加熱及び冷却するように配置されてもよい。しかし、これらのヒーターが他の加熱目的であっても使用でき、且つ他のヒーターを特定用途に適するものとして含めてもよいことが理解される。
【0178】
上で考察したように、２つ以上の温度間で熱循環させるペルチェデバイスがＰＣＲに有効である一方で、いくつかの実施形態において、ヒーターを一定温度に維持することが望ましい場合がある。例示的に、サンプル温度を変化させるのに必要な時間を超える、ヒーター温度を変化させるのに必要な時間を排除することによって、これを用いて実行時間を低減することができる。また、はるかにより大きい（より大きい熱質量の）ペルチェデバイスでなく、単により小さいサンプル及びサンプル容器を熱循環させることが必要であることから、そのような準備により、システムの電気的効率を改善することができる。例えば、装置は、例えば、アニーリング、伸長、変性のために設定された温度で、熱循環を達成するためのポーチに対して配置される、複数のヒーター（即ち、２つ以上）を含んでもよい。２つのヒーターは、多くの用途にとって十分であり得る。様々な実施形態では、熱循環を達成するためのヒーターに対して、ヒーターが移動可能であり、ポーチが移動可能であり、又は液体が移動可能である。例示的に、ヒーターは、線状に、環状配置で、又はそれに類似するように配置されてもよい。好適なヒーターのタイプは、第１段階ＰＣＲを参照して、上で考察されている。
【0179】
蛍光検出が所望されるとき、光学アレイ８９０が提供されてもよい。図２に示される通り、光学アレイ８９０は、光源８９８、例示的に、フィルターＬＥＤ光源、フィルター白色光、又はレーザーイルミネーション、及びカメラ８９６を含む。カメラ８９６は、例示的に、複数の光検出器を有し、それぞれがポーチ５１０内の第２段階ウェル５８２に対応している。或いは、カメラ８９６は、第２段階ウェル５８２の全てを含む画像を取得することができ、画像は、第２段階ウェル５８２のそれぞれに対応する別々の領域に分割され得る。設計に応じて、光学アレイ８９０は、固定的であってもよく、又は光学アレイ８９０は、１つ以上のモーターに取り付けられ、各個別の第２段階ウェル５８２からシグナルを得るように移動するムーバー上に配置されてもよい。他の配置が可能であることが理解される。第２段階ヒーターにおけるいくつかの実施形態は、ヒーターをポーチ５１０の図２に示される側と反対側に提供する。そのような配置は、単に例示的であり、装置内部の空間的制約によって決定されてもよい。第２段階反応ゾーン５８０が光学的に透明な材料で提供されるという条件で、光検出器及びヒーターは、アレイ５８１のいずれかの側面に設けられもよい。
【0180】
図示の通り、コンピュータ８９４は、圧縮気体源８９５のバルブ８９９を制御し、それ故、装置８００の空気圧式システムの全てを制御する。さらに、他の実施形態では、装置内の空気圧式システムの多くが、機械的アクチュエータ、圧力適用手段などと置き換えられてもよい。コンピュータ８９４はまた、ヒーター８８６及び８８８、並びに光学アレイ８９０を制御する。これらの部品のそれぞれは、例示的に、ケーブル８９１を介して、電気的に接続されるが、他の物理又は無線接続は、本発明の範囲内である。コンピュータ８９４が、装置８００内部に収容されてもよく、又は装置８００の外部に設けられてもよいことが理解される。さらに、コンピュータ８９４は、部品の一部又は全部を制御する一体型回路基板を含んでもよく、また、光学アレイからのデータを受信及び表示するため、デスクトップ又はラップトップＰＣなどの外部コンピュータを含んでもよい。インターフェース、例示的に、温度、サイクル時間などの情報及び変数を入力するためのキーを含む、キーボードインターフェースが提供されてもよい。また、例示的に、ディスプレイ８９２が提供される。ディスプレイ８９２は、例えば、ＬＥＤ、ＬＣＤ、又は他のそのようなディスプレイであってもよい。
【0181】
当該技術分野で公知の他の装置が、密封された柔軟性容器内のＰＣＲについて教示している。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６４５，７５８号明細書、米国特許第６，７８０，６１７号明細書、及び米国特許第９，５８６，２０８号明細書を参照されたい。しかし、例えば、密封されたＰＣＲ容器内の細胞溶解は、特に、試験対象のサンプルがバイオハザードを含み得る場合、使いやすさ及び安全性を改善し得る。本明細書で例示される実施形態では、細胞溶解からの廃棄物、並びに全ての他のステップからの廃棄物は、密封ポーチ内に残る。さらに、ポーチの中身をさらなら試験に備えて除去できることが理解される。
【0182】
図２に戻ると、装置８００は、ケーシングの壁を形成し得る、又はケーシング内に取り付けられ得る支持メンバー８０２を含む。装置８００はまた、ポーチ５１０の挿入及び離脱を可能にするため、任意選択的に、支持メンバー８０２に対して可動である第２の支持メンバー（図示されない）を含んでもよい。例示的に、一旦ポーチ５１０が装置８００に挿入されていると、蓋がポーチ５１０をカバーしてもよい。別の実施形態では、両方の支持メンバーが固定され、ポーチ５１０は、他の機械的手段又は空気圧によって定位置に固定されてもよい。
【0183】
実例において、ヒーター８８６及び８８８は、支持メンバー８０２上に取り付けられる。しかし、この配置が単に例示的であり、他の配置が可能であることが理解される。例示的なヒーターは、ブリスター８６４及び第２段階反応ゾーン５８０の中身を熱循環させるため、当該技術分野で公知である通り、ペルチェ及び他のブロックヒーター、抵抗ヒーター、電磁ヒーター、及び薄膜ヒーターを含む。ブラダープレート８１０は、ブラダー８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、８６６、ハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、及びシール８７１、８７２、８７３、８７４とともに、ブラダーアセンブリ８０８を形成し、それは例示的に、ポーチ５１０の方へ移動できる可動性の支持構造上に取り付けられてもよく、そこで空気圧式アクチュエータが、ポーチ５１０と接触状態で配置される。ポーチ５１０が装置８００に挿入され、可能性の支持メンバーが支持メンバー８０２の方へ移動されるとき、ポーチ５１０の様々なブリスターは、ブラダーアセンブリ８１０の様々なブラダー及びアセンブリ８０８の様々なシールに隣接して配置されることで、空気圧式アクチュエータの作動により、ポーチ５１０のブリスターの１つ以上から液体を押圧することができ、又はポーチ５１０の１つ以上のチャネルとともにピンチバルブを形成することができる。ポーチ５１０のブリスター及びチャネルとアセンブリ８０８のブラダー及びシールとの間の関係は、図３により詳細に図示される。
【0184】
サンプル中の微生物の単離、濃縮、特徴づけ、及び／又は同定
本発明は、サンプル中の微生物の単離、濃縮、特徴づけ、及び／又は同定のための方法、システム、及び装置を提供する。一実施形態では、微生物は、細菌である。別の実施形態では、微生物は、真菌生物（例えば、酵母又はカビ）である。さらなる実施形態では、微生物は、寄生虫である。別の実施形態では、微生物は、細菌、酵母、カビ、及び寄生虫からなる群から選択される微生物の組み合わせであってもよい。当該方法、システム、及び装置は、血液、尿、又は脳脊髄液などの複合サンプルからの微生物の分離、特徴づけ及び／又は同定に特に有用であり得る。好ましい態様では、本発明の方法、システム、及び装置は、例えば、患者が敗血性であるか又は敗血症の手前であるかのいずれかを迅速に判定するため、血液から直接得られる微生物を単離、特徴づけ及び／又は同定するために使用されてもよい。
本発明は、サンプル中の微生物の単離、濃縮、特徴づけ、及び／又は同定のための方法、システム、及び装置を提供する。一実施形態では、微生物は、細菌である。別の実施形態では、微生物は、真菌生物（例えば、酵母又はカビ）である。さらなる実施形態では、微生物は、寄生虫である。別の実施形態では、微生物は、細菌、酵母、カビ、及び寄生虫からなる群から選択される微生物の組み合わせであってもよい。当該方法、システム、及び装置は、血液、尿、又は脳脊髄液などの複合サンプルからの微生物の分離、特徴づけ及び／又は同定に特に有用であり得る。好ましい態様では、本発明の方法、システム、及び装置は、例えば、患者が敗血性であるか又は敗血症の手前であるかのいずれかを迅速に判定するため、血液から直接得られる微生物を単離、特徴づけ及び／又は同定するために使用されてもよい。
【0185】
本明細書で用いられるとき、「血液から直接得られる」又は「全血から直接得られる」は、血液サンプル中に存在する微生物の存在を判定することに関連して、全血からの微生物を濃縮及び／又は単離し、次に微生物を同定することによって微生物の存在を判定することを意味する。「全血」は、循環システム内で見出すことになるとき、分離又は除去されたその成分を全く有しない血液（例えば、ヒト血液）である。添加された抗凝固剤を有する血液は、やはり一般に、全血と称される。微生物は、好適に、サンプル中の微生物の数を増加させるための予備濃縮及び／又は予備単離の血液培養ステップを用いずに、全血から濃縮及び／又は単離されてもよい。微生物は、好適に、サンプル中の微生物の数を増加させるための短い（例えば、＜５時間、＜４時間、＜３時間、＜２時間、又は＜１時間）培養ステップ後、血液から濃縮及び／又は単離されてもよい。微生物を濃縮及び／又は単離後、微生物は、好適に、限定はされないが、分子検査（即ち、核酸に基づく検査）、表現型検査、プロテオミクス検査、光学検査、又は培養に基づく検査の１つ以上を含む、いくつかの技術によって同定されてもよい。微生物を濃縮及び／又は単離後、微生物は、好適に、濃縮／単離画分の数を増加させるため、短時間（＜５時間、＜４時間、＜３時間、＜２時間、又は＜１時間（例えば、３時間））培養されてもよい。しかし、培養は、好適に、本明細書に記載の方法及びシステムにおいて必要でないことがある。例えば、本明細書に記載の方法は、好適に、限定はされないが、典型的に、血液培養中で十分に又は急速に成長することがない偏好性生物、異なる培養条件を必要とし得る好気性及び嫌気性生物、並びに成長及び検出のための異なる培地製剤を必要とし得る生物を含む、目的の全ての細菌及び真菌生物に対して機能し得る。
【0186】
微生物の濃縮サンプル（例えば、遠心分離ペレット）中の微生物の特徴づけ及び／又は同定は、好適に、正確な種の同定を含まなくてもよい。特徴づけは、生物学的粒子の広範なカテゴリー化又は分類、並びに単一種の実際の同定を包含する。本明細書で用いられるとき、「同定」は、微生物が属する科、属、種、及び／又は系統を決定することを意味する。例えば、生体サンプル（例えば、血液、尿、又は脳脊髄液）から単離された微生物を科、属、種、及び／又は系統のレベルまで同定することが挙げられる。
【0187】
本明細書に記載の方法、システム、及び装置は、微生物の特徴づけ及び／又は同定を、先行技術より迅速に可能にし、（例えば、敗血症を有する又は有することが疑われる対象における）より迅速な診断をもたらす。本発明の方法に関与するステップは、微生物の特徴づけ／同定のためにサンプルを得ることから、臨床的に関連する利用可能な情報を得るため、非常に短い時間枠以内に実施することができる。特定の実施形態では、本発明の方法は、約１２０分未満、例えば、約１１０分、約１００分、約９５分、約９０分、約８５分、約８０分、約７５分、約７０分、約６５分、約６０分、約５５分、約５０分、約４５分、約４０分、約３５分、約３０分、約２５分、約２０分、約１５分、約１０分、約５分、約４分、約３分、約２分、約１分未満以内、又は前記時点の、若しくはそれらの間の、若しくはそれらを包含する任意の範囲以内に実施することができる。好ましい実施形態では、本発明の方法は、約９０分未満（例えば、約７５分）以内に実施することができる。例えば、全血サンプルが敗血症を有することが疑われる患者から収集される時から感染病原体（存在する場合）の分析及び陽性同定の完了までの経過時間は、多くのシナリオにおいて約９０分未満であり得る。より迅速な分子的分析システムが利用可能であるとき、サンプリング応答時間は、大幅に減少し得る。敗血症及び全血が以前の例において用いられる一方で、低力価生物が大量の血液又は他のサンプルタイプから濃縮される場合の他の複合サンプルタイプにおいて、同様の時間が達成可能であり得る。本発明の方法の驚異的な迅速性は、以前の方法を上回る改善を表す。当該方法を用いて、本明細書に記載のような任意の微生物を特徴づけ及び／又は同定することができる。
【0188】
本明細書に記載の方法、システム、及び装置に関連する例示的なワークフローは、単純であり、サンプル、ライセート、及び微生物の操作を最小化する。例えば、サンプルは、微生物の溶解及び単離のため、単一チューブ内でディファレンシャル溶解緩衝液と混合され得る。一実施形態では、微生物は、微生物ペレットをライセートから隔離する様式で単一チューブから回収し、それにより潜在的に感染性のある材料を操作し、且つ／又はサンプルを汚染させるリスクを低減することができる。加えて、本発明の方法を完全に自動化することができ、それにより感染性材料を操作し、且つ／又はサンプルを汚染させるリスクがさらに低減される。
【0189】
図５は、本明細書に記載の方法、システム、及び装置に有用な部品の一実施形態の略図である。例示的な方法は、限られた数の部品、限られた数のステップを含み、またサンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液の接触から約２０～７５分以内で完了されることで、簡素化されたワークフロー及びより短い結果までの時間を提供することができる。図５の例示的な方法は、サンプル５０００（例えば、全血サンプル、尿サンプル、脳脊髄液サンプル、又は環境サンプル）を得るステップと、ライセートを調製するステップと、ライセートから微生物細胞を回収するステップと、サンプル中の微生物を特徴づけ及び／又は同定するステップと、を含む。一実施形態では、血液サンプルであってもよいサンプル５０００は、標準の採血チューブ（例えば、バキュテナーなど）内に、抗凝固剤の存在下又は不在下で提供されてもよい。一実施形態では、サンプル５０００中の非微生物細胞の実質的に全て（例えば、＞９０％）の溶解のため、サンプル５０００及びディファレンシャル溶解緩衝液は、組み合わされてもよい。例示的な実施形態では、ライセートは、特別に設計された遠心濃縮器５０１０内で調製されてもよい。一実施形態では、ディファレンシャル溶解緩衝液は、遠心濃縮器５０１０において提供されてもよく、サンプル中の非微生物細胞の溶解は、単に、サンプル５０００を遠心濃縮器５０１０に添加し、それにより遠心濃縮器５０１０においてサンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液を組み合わせることによって開始されてもよい。別の実施形態では、サンプル５０００は、ディファレンシャル溶解緩衝液と混合され、次に遠心濃縮器５０１０内に配置される、例えば、混合物として遠心濃縮器にピペッティングされる。組み合わせ後、ディファレンシャル溶解緩衝液及びサンプルは、ある期間（例えば、１～５分間）かけて組み合わせることで、ライセートが得られる。一実施形態では、微生物は、遠心分離、濾過などによって、ライセートから回収されてもよい。遠心分離の場合、微生物細胞は、遠心濃縮器５０１０において、約１，０００×ｇ～約２０，０００×ｇで約４～１０分の範囲内のある期間、遠心濃縮器を遠心分離することによってペレット化されてもよい。例示的な実施形態では、回収された微生物細胞は、遠心濃縮器５０１０から、サンプル中の微生物を臨床的に関連するレベルで特徴づけ及び／又は同定するために設計された分析装置５０２０に添加されてもよい。図示の分析装置５０２０における微生物の特徴づけ及び／又は同定は、迅速に（例えば、約１５～６０分で）実施することができる。しかし、図示の分析装置は、単に例示的である。例えば、いくつかの実施形態では、微生物は、配列決定（例えば、次世代配列決定）によって、特徴づけ及び／又は同定することができる。
【0190】
サンプル
本明細書に記載の方法及びシステムによって試験されてもよいサンプルは、微生物の存在及び／又は成長が疑われるか又は疑われ得る臨床及び非臨床サンプルの双方、並びに微生物の存在についてルーチン的に又は場合によって試験される材料のサンプルを含んでもよい。利用されるサンプルの量は、当該方法の多用途性及び／又は感受性に起因し、大幅に変化し得る。本明細書に記載の方法及びシステムの１つの利点が、例えば、血液、体液、及び／又は他の不透明な物質などの複合サンプルタイプが、ほとんど又は全く広範囲に及ぶ前処理を伴わないシステムを利用して、直接的に試験され得ることである。
本明細書に記載の方法及びシステムによって試験されてもよいサンプルは、微生物の存在及び／又は成長が疑われるか又は疑われ得る臨床及び非臨床サンプルの双方、並びに微生物の存在についてルーチン的に又は場合によって試験される材料のサンプルを含んでもよい。利用されるサンプルの量は、当該方法の多用途性及び／又は感受性に起因し、大幅に変化し得る。本明細書に記載の方法及びシステムの１つの利点が、例えば、血液、体液、及び／又は他の不透明な物質などの複合サンプルタイプが、ほとんど又は全く広範囲に及ぶ前処理を伴わないシステムを利用して、直接的に試験され得ることである。
【0191】
「サンプル」は、動物；限定はされないが、ヒト動物を含む、動物からの組織又は臓器；細胞（対象（例えば、ヒト又は非ヒト動物）から直接的に採取される対象内の細胞、又は培養物中の若しくは培養された細胞株からの維持された細胞のいずれか）；細胞ライセート（又はライセート画分）又は細胞抽出物；細胞、細胞物質、又はウイルス物質に由来する１つ以上の分子（例えば、ポリペプチド又は核酸）を含有する溶液；又は本明細書に記載のようにアッセイされる、天然に存在しない核酸を含有する溶液を意味する。本明細書に記載の方法及びシステムによって試験されてもよいサンプルは、微生物の存在及び／又は成長が疑われるか又は疑われ得る臨床及び非臨床サンプルの双方、並びに微生物の存在についてルーチン的に又は場合によって試験される材料のサンプルを含んでもよい。試験されてもよい臨床サンプルは、限定はされないが、血液、血清、血漿、血液画分、関節液、尿、精液、唾液、便、脳脊髄液、胃内容物、腟分泌物、組織ホモジネート、骨髄吸引液、骨ホモジネート、痰、吸引液、スワブ及びスワブリンセート（ｓｗａｂ ｒｉｎｓａｔｅｓ）、他の体液、血液製剤（例えば、血小板、血清、血漿、白血球画分など）、ドナー臓器又は組織サンプルなどを含む、典型的に、臨床又は研究実験室で試験されるサンプルの任意のタイプを含む。培養され、その後に試験されてもよい、一部の検体サンプルは、血液、血清、血漿、血小板、赤血球、白血球、血液画分、関節液、尿、鼻サンプル、精液、唾液、便、脳脊髄液、胃内容物、腟分泌物、組織ホモジネート、骨髄吸引液、骨ホモジネート、痰、吸引液、スワブ及びスワブリンセート、他の体液などを含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、対象からの血液のようなサンプルに、試験前に、（例えば、１分～４時間の範囲内の）制限された培養ステップを施し、サンプル中の検出可能な微生物のレベルを増加させることは選択肢であってもよい。別の選択肢では、血液のようなサンプルは、微生物の選択的溶解及び回収の前に培養されてもよく、微生物は、溶解及び回収の間に培養されてもよく、又は微生物は、（例えば、生物を液体培地中又は固体プレート上で成長させることによって）選択的に溶解されたサンプルから（例えば、遠心分離によって）回収されたペレットから培養されてもよい。微生物（特に、細菌及び真菌）の培養は、好適に、細胞濃度がより高いとき、より迅速であり得る。回収又は濃縮された微生物からの（例えば、遠心分離ステップから得られたペレットからの）培養は、好適に、血液培養より迅速であり得る。また、好適に、回収又は濃縮された微生物からの培養では、血液中に存在し得る抗生物質及びデフェンシンを除去することができ、またより迅速な成長を促進することができる。
【0192】
本発明は、研究、並びに獣医学及び医学適用における用途が見出される。臨床サンプルを入手可能である好適な対象は、一般に、哺乳動物対象であるが、あらゆる動物であり得る。「哺乳動物」という用語は、本明細書で用いられるとき、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類（例えば、ラット又はマウス）などを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、若年者、成人及び老人対象を含む。サンプルを入手可能である対象は、限定はされないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、及び魚類を含む。
【0193】
試験することができる非臨床サンプルはまた、限定はされないが、食糧、飲料、医薬品、化粧品、水（例えば、飲料水、非飲料水、及び廃水）、海水バラスト、空気、土壌、汚水、植物材料（例えば、種子、葉、茎、根、花、果実）、生物兵器サンプルなどを包含する物質を含む。サンプルはまた、限定はされないが、土壌、大気モニタリングシステムサンプル（例えば、空気フィルター媒体中で捕捉される材料）、表面スワブ、及び媒介動物（例えば、蚊、マダニ、ノミなど）などの環境サンプルを含んでもよい。また、当該方法は、特に、工業的状況における汚染レベル、プロセス制御、品質管理などを監視するためのリアルタイム試験に十分に適する。本発明の好ましい実施形態では、サンプルは、微生物感染を有するか又は有することが疑われる対象（例えば、患者）から得られる。一実施形態では、対象は、敗血症、例えば、菌血症又は真菌血症を有するか又は有することが疑われる。好ましくは、サンプルは、対象から収集された後、直接的に試験される血液サンプルであってもよい。即ち、サンプルは、試験前に、血液培地に添加されておらず、処理又は培養又は希釈されていない全血サンプルである。別の実施形態では、サンプルは、患者の血液のサンプルから成長した血液培養物、例えば、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）血液培養物から得られてもよい。血液培養サンプルは、陽性血液培養物、例えば、微生物の存在を示す血液培養物から得られてもよい。特定の実施形態では、サンプルは、それが陽性に変化後の短時間以内に、例えば、約６時間以内に、例えば、約５時間、約４時間、約３時間、又は約２時間以内に、又は例えば、約５５分、約５０分、約４５分、約４０分、約３５分、約３０分、約２５分、約２０分、約１５分、約１０分、約５分、約４分、約３分、約２分、又は約１分といった約６０分以内に、陽性血液培養物から採取されてもよい。一実施形態では、サンプルは、微生物が対数期成長にある培養物から採取されてもよい。別の実施形態では、サンプルは、微生物が定常期にある培養物から採取されてもよい。いくつかの実施形態では、全血サンプルは、当該方法の一部として、全血サンプルが患者から採取されて１時間以内に提供されてもよい。さらに別の実施形態では、サンプルは、典型的に、陽性血液培養結果を得るのに必要とされる時間より短い時間（例えば、１分～４時間の範囲内）かけて培養されている血液であってもよく、又はそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、当該方法における使用のため、室温で提供される一方で、他の実施形態では、サンプルは、患者から得られた後、当該方法における使用のために提供される前に冷却される。例えば、サンプルは、患者から得られた後、当該方法を実施することができるまで、冷蔵されてもよい。
【0194】
本発明は、微生物の検出及び同定のため、高い感受性を提供する。例示的に、これは、液体培養のステップ、それに続く微生物を単離するステップ及びそれらを固体又は半固形培地上で成長させるステップ、及び成長するコロニーをサンプリングするステップを最初に経る必要がなく、微生物の検出及び同定を可能にする。したがって、本発明の一実施形態では、サンプルは、液体培養物、又は固体若しくは半固体表面上で成長された微生物（例えば、細菌、酵母、又はカビ）コロニーから得られない。有望なＢＳＩの同定を促進するため、いくつかの実施形態において、当該方法は、サンプルを患者から得た後に培養することなく、サンプルを溶解するステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、血液サンプルの収集前に抗菌薬で治療されている患者であっても用いることができる。敗血症に一致する症状で入院している患者は、直ぐに抗菌薬が開始されることが多く、その後、敗血症が確定的に組み入れられ、又は除外され得る。そのような治療プロトコルが標準治療に一致する一方で、抗菌薬は、古典的な敗血症診断において使用される血液培養物に干渉し得る。意外にも、さらに本明細書に記載の方法を用いて、無傷の微生物細胞が血液中にまだ存在する場合、抗菌薬治療中の患者における敗血症を診断することができる。
【0195】
サンプルの体積は、本発明の方法の分離ステップが実施された後に分析可能である微生物のペレットを生成するのに十分に大きい必要がある。適切な体積は、サンプルの供給源、サンプル中の予測される微生物のレベル、及び微生物の特徴づけ及び同定に利用される分析方法に依存することになる。例えば、ＢＳＩを有する患者からの全血は、典型的に、約１～１００ｃｆｕ／ｍｌ（例えば、＜１～１０ｃｆｕ／ｍｌ）の微生物負荷を有する。一般に、サンプルサイズは、約５０ｍｌ、約４０ｍｌ、約３０ｍｌ、約２０ｍｌ、約１５ｍｌ、約１０ｍｌ、約５ｍｌ、約４ｍｌ、約３ｍｌ、又は約２ｍｌ（例えば、約１０ｍｌ）であり得る。特定の実施形態では、サンプルサイズは、約１ｍｌ、例えば、約０．７５ｍｌ、約０．５ｍｌ、又は約０．２５ｍｌであり得る。分離がマイクロスケールで実施されるような特定の実施形態では、サンプルサイズは、約２００μｌ未満、例えば、約１５０μｌ、約１００μｌ、約５０μｌ、約２５μｌ、約２０μｌ、約１５μｌ、約１０μｌ、又は約５μｌ未満であり得る。いくつかの実施形態（例えば、サンプルが少数の微生物を含むことが予想されるとき）では、サンプルサイズは、約１００ｍｌ以上、例えば、約２５０ｍｌ、約５００ｍｌ、約７５０ｍｌ、又は約１０００ｍｌ以上であり得る。陽性血液培養物は、１ｍｌあたりより高レベルの微生物を含有することになり、それ故、全血と比較して、より少ない体積の血液培地が使用されてもよい。
【0196】
本明細書中での考察の多くが特に全血に関連する一方で、本明細書に記載の方法、システム、及び装置は、上の「サンプル」の定義の中で記述された通り、他のサンプルタイプに対して使用されてもよい。さらなるサンプルタイプの２つの具体例が、尿及び脳脊髄液（ＣＳＦ）である。尿及びＣＳＦは、感染の間、白血球（ＷＢＣ）を含有することが多く、細胞内病原体を宿し得る。これらのＷＢＣは、感染と闘う場合に産生されることがあり、又は、ＣＳＦの場合、多数の病原体が、ＷＢＣ又は他の血液細胞の内側に隠れることによって、脳／脊髄カラムに接近し、次に、血液脳関門を通過することができる。病原体を宿す血液細胞（病原体細胞でない）は、本明細書で開示されるディファレンシャル溶解緩衝液で選択的に溶解することによって、細胞内の病原体を放出することができ、汚染している真核生物宿主ＤＮＡを実質的に含まないかもしれない（例えば、汚染している宿主ＤＮＡは＞９５％減少され得る）ペレットに濃縮することができる。加えて、膀胱の上皮細胞は、感染の間、剥離し、病原体を運ぶ細胞を排出し、予防策として感染の拡散を予防することができる。白血球と同様、これらの上皮細胞は、本明細書で開示されるディファレンシャル溶解緩衝液によって溶解することができ、無傷の病原体細胞は、膀胱細胞からの汚染を伴わずに、ペレットに濃縮することができる。
【0197】
本明細書中の他の箇所でより詳細に考察される通り、回収された病原体細胞は、溶解され得て、病原体細胞からの核酸は、分析のため、回収され得る。病原体細胞が、有意な宿主細胞ＤＮＡ汚染を伴わずに単離されることから、回収された病原体核酸は、病原体を特徴づけ及び／又は同定するための下流分子アッセイに適する。いくつかの実施形態では、病原体細胞は、分子的方法による（例えば、病原体ＤＮＡ又はＲＮＡのＰＣＲ増幅及び増幅産物の同定による）、遺伝子配列決定による（例えば、次世代配列決定技術による）、又は質量分析による病原体の下流の特徴づけ及び／又は同定に使用されてもよい。本明細書に記載の装置及び方法では、病原体シグナルがこれらの方法のいずれかによって識別できるように、宿主細胞成分の多く又は全てを除去することができる。
【0198】
溶解ステップ
サンプルを提供又は入手した後の、本発明の例示的方法における次のステップは、サンプル中に存在し得る非微生物細胞、例えば、血液細胞及び／又は組織細胞又は他の真核生物宿主細胞を溶解することである。いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞を選択的に溶解し、微生物のサンプルの他の成分からの分離を可能にすることを含む。微生物の他の成分からの分離により、後の調査ステップの間の干渉が低減される。非微生物細胞がサンプル中に存在することが予想されない、又は調査ステップに干渉することが予想されない場合、溶解ステップは、省略されてもよい。一実施形態では、溶解されるべき細胞は、サンプル中に存在する非微生物細胞であり、サンプル中に存在し得る微生物細胞は、ほとんど又は全く溶解されない。しかし、いくつかの実施形態では、微生物の特定クラスの選択的溶解は、望ましいことがあり、それ故、本明細書に記載の方法に従い、また当該技術分野で周知であるように、実施することができる。例えば、望ましくない微生物のクラスは、選択的に溶解することができ、例えば、酵母が溶解される一方で、細菌は溶解されないか、又はその逆もいえる。別の実施形態では、所望の微生物は、微生物の特定の細胞内成分、例えば、細胞膜又は細胞小器官を分離するため、溶解される。一実施形態では、非微生物細胞の全部が溶解される。他の実施形態では、非微生物細胞の一部、例えば、調査ステップとの干渉を阻止するのに十分な細胞が溶解される。細胞の溶解は、溶解微生物の存在下又は不在下で細胞を選択的に溶解するのに有効であるように、限定はされないが、ディファレンシャル溶解緩衝液の添加、超音波処理、及び／又は浸透圧ショックを含む、当該技術分野で公知の任意の方法によって実施されてもよい。
サンプルを提供又は入手した後の、本発明の例示的方法における次のステップは、サンプル中に存在し得る非微生物細胞、例えば、血液細胞及び／又は組織細胞又は他の真核生物宿主細胞を溶解することである。いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞を選択的に溶解し、微生物のサンプルの他の成分からの分離を可能にすることを含む。微生物の他の成分からの分離により、後の調査ステップの間の干渉が低減される。非微生物細胞がサンプル中に存在することが予想されない、又は調査ステップに干渉することが予想されない場合、溶解ステップは、省略されてもよい。一実施形態では、溶解されるべき細胞は、サンプル中に存在する非微生物細胞であり、サンプル中に存在し得る微生物細胞は、ほとんど又は全く溶解されない。しかし、いくつかの実施形態では、微生物の特定クラスの選択的溶解は、望ましいことがあり、それ故、本明細書に記載の方法に従い、また当該技術分野で周知であるように、実施することができる。例えば、望ましくない微生物のクラスは、選択的に溶解することができ、例えば、酵母が溶解される一方で、細菌は溶解されないか、又はその逆もいえる。別の実施形態では、所望の微生物は、微生物の特定の細胞内成分、例えば、細胞膜又は細胞小器官を分離するため、溶解される。一実施形態では、非微生物細胞の全部が溶解される。他の実施形態では、非微生物細胞の一部、例えば、調査ステップとの干渉を阻止するのに十分な細胞が溶解される。細胞の溶解は、溶解微生物の存在下又は不在下で細胞を選択的に溶解するのに有効であるように、限定はされないが、ディファレンシャル溶解緩衝液の添加、超音波処理、及び／又は浸透圧ショックを含む、当該技術分野で公知の任意の方法によって実施されてもよい。
【0199】
ディファレンシャル溶解緩衝液は、１クラスの細胞、例えば、（例えば、真核細胞膜を可溶化することによって）非微生物細胞及び／又はいくつかの微生物細胞を選択的に溶解でき、且つ別のクラスの細胞、例えば、微生物又は微生物のタイプを溶解できないものである。一実施形態では、ディファレンシャル溶解緩衝液は、水性媒体、１つ以上の洗剤、緩衝物質、１つ以上の塩を含み得て、また追加薬剤をさらに含み得る。一実施形態では、ディファレンシャル溶解緩衝液は、１つ以上の酵素（例えば、プロテアーゼ）をさらに含んでもよい。一実施形態では、洗剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ（商標）２００、ＢｒｉｊＯ１０（Ｏｌｅｔｈ－１０、Ｂｒｉｊ９６Ｖ、Ｂｒｉｊ９７、Ｖｏｌｐｏ １０ＮＦ、Ｖｏｌｐｏ Ｎ１０としても公知）（Ｂｒｉｊの名称は、Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌｃの登録商標である）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、及びノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（別名、Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール、Ｂｒｉｊ３５）などの非変性溶解性洗剤であり得る。一実施形態では、洗剤は、非イオン界面活性剤である。好適な非イオン界面活性剤の例としては、限定はされないが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００、ＢｒｉｊＯ１０、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態では、非イオン界面活性剤は、ポリオキシエチエンエーテル（ＰＯＥエーテル）である。ＰＯＥエーテルは、細胞膜破壊のために使用されてもよい非イオン界面活性剤のクラスである。ＰＯＥエーテルは、アルキル鎖、「ｎ」オキシエチレン単位からなる親水性部分、及び末端－ＯＨ基からなる。ＰＯＥエーテルの好適な例としては、限定はされないが、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ２００（ポリ（オキシ－１，２－エタンジイル））、ＢｒｉｊＯ１０（及び他のＢｒｉｊ洗剤）、及びノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ３５）が挙げられる。任意選択的に、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、及びＣ７ＢｚＯなどの変性溶解性洗剤を含めることができる。任意選択的に、Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６４、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４、非洗剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ２０１）、アンフィポール（ＰＭＡＬ－Ｃ８）、及びメチル－β－シクロデキストリンなどの可溶化剤を含めることもできる。典型的に、非変性洗剤及び可溶化剤は、それらの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より高い濃度で使用される一方で、変性洗剤は、それらのＣＭＣより低い濃度で添加されてもよい。例えば、非変性溶解性洗剤は、約０．０１０％～約１０％、例えば、約０．０１５％～約１．０％、例えば、約０．０５％～約０．５％、例えば、約０．１０％～約０．３０％の濃度（サンプル希釈後の最終濃度）で使用することができる。ディファレンシャル溶解緩衝液中で使用可能な酵素は、限定はされないが、核酸及び他の膜ファウリング材料を消化する酵素（例えば、プロテイナーゼＸＸＩＩＩ、ＤＮａｓｅ、ノイラミニダーゼ、ポリサッカリダーゼ、Ｇｌｕｃａｎｅｘ（登録商標）、及びＰｅｃｔｉｎｅｘ（登録商標））を含む。具体的な実施形態では、ディファレンシャル溶解緩衝液は、ＤＮａｓｅを含まず、ＤＮａｓｅと組み合わせて使用されない。使用可能な他の添加剤は、限定はされないが、２－メルカプトエタノール（２－Ｍｅ）又はジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤、並びにマグネシウム、ピルビン酸、及び保水剤などの安定化剤を含む。
【0200】
ディファレンシャル溶解緩衝液は、所望の細胞を溶解するのに適した任意のｐＨで緩衝することができ、限定はされないが、サンプルのタイプ、溶解対象の細胞、及び使用される洗剤を含む複数の要素に依存することになる。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約２～約１３、例えば、約６～約１０、例えば、約７～約９、例えば、約７～約８の範囲内であり得る。好適なｐＨ緩衝液は、ｐＨを所望の範囲内で維持する能力がある任意の緩衝液を含んでもよい。いくつかの実施形態では、緩衝液は、それらのｐＨ緩衝範囲外で使用されてもよい。緩衝物質の好適な例は、限定はされないが、約０．００５Ｍ～約１．０ＭのＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＢＳ、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。具体的な例では、ディファレンシャル溶解緩衝液は、下の表１に示される組成物を有する。
【0201】
【表1】
【0202】
表１に例示される具体的な例では、サンプルは、約３０ｍｌのディファレンシャル溶解緩衝液と組み合わされた、約１０ｍｌの全血である。
【0203】
ＣＡＰＳは、緩衝物質であり；ＣＡＰＳは、２５℃で約１０．４のｐＫａ及び約９．７～１１．１の典型的な緩衝範囲を有する。ディファレンシャル溶解緩衝液を血液サンプルと組み合わせる前、ＣＡＰＳ緩衝液は、その緩衝範囲内である。しかし、ディファレンシャル溶解緩衝液を血液サンプルと組み合わせた後、この例におけるＣＡＰＳ緩衝液は、（例えば、約７～８のｐＨで）十分にその緩衝範囲外である。意外にも、その緩衝範囲外である、ディファレンシャル溶解緩衝液中のＣＡＰＳ（及び化学的に類似する緩衝液－例えば、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びＣＡＢＳ）を用いることが、溶解を改善する相乗効果を有し得ることが見出されている。１つの理論に拘束されない限り、ＣＡＰＳが、非微生物細胞の透過処理を助け、それを溶解するための第２の洗剤のように作用している可能性が考えられる。例えば、約７～８のｐＨ（例えば、７．６～８のｐＨ）で、ＣＡＰＳ緩衝液は、ほぼ完全にプロトン化され、正に荷電することになる。ヘンダーソン・ハッセルバルヒ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ）式によると、例えば、約７．０～８．０のｐＨ範囲の例で、プロトン化ＣＡＰＳ種対非プロトン化ＣＡＰＳ種の比は、約２５０：１又はそれ以上となる。約７．０～８．０のｐＨでのＣＡＰＳ緩衝液の場合、約２５０：１又はそれ以上のプロトン化対非プロトン化の比は、それが「実質的に正に荷電している」ことを意味することの例である。細胞膜は、一般に、正味の負電荷を有することから、ＣＡＰＳ緩衝液の正電荷がＣＡＰＳ分子を細胞の表面に引き付け得ることが理論化される。ＣＡＰＳは、細胞の透過処理を助けるため、非微生物細胞の疎水膜に挿入し得るフェニル環を有する。ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びＣＡＢＳは、ＣＡＰＳと類似する構造を有し、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びＣＡＢＳ、並びにＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びＣＡＢＳの組み合わせ、並びに類似の緩衝液であれば、類似する結果を提供し得ることが予想される。ＣＡＰＳＯは、２５℃で約９．６のｐＫａ及び約８．９～１０．３の典型的な緩衝範囲を有し、ＣＨＥＳは、２５℃で約９．３のｐＫａ及び約８．６～１０の典型的な緩衝範囲を有し、ＣＡＢＳは、２５℃で約１０．７のｐＫａ及び約１０～１１．４の典型的な緩衝範囲を有する。ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びＣＡＢＳの場合、ヘンダーソン・ハッセルバルヒ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ）式は、約７．０～８．０のｐＨ範囲例で、プロトン化緩衝液種対非プロトン化緩衝液種の比が、約５００：１又はそれ以上（即ち、約７．０～８．０のｐＨでのＣＡＢＳ）、約４０：１又はそれ以上（即ち、約７．０～８．０のｐＨでのＣＡＰＳＯ）、及び２０：１又はそれ以上（即ち、約７．０～８．０のｐＨでのＣＨＥＳ）の範囲内となることを提供する。したがって、約７．０～８．０のｐＨでのＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びＣＡＢＳの場合、約４０：１又はそれ以上のプロトン化ＣＡＰＳＯ対非プロトン化ＣＡＰＳＯの比、約２０：１又はそれ以上のプロトン化ＣＨＥＳ対非プロトン化ＣＨＥＳの比、及び約５００：１又はそれ以上のプロトン化ＣＡＢＳ対非プロトン化ＣＡＢＳの比のそれぞれが、それが「実質的に正に荷電している」ことを意味することのさらなる例である。また、当業者は、ディファレンシャル溶解緩衝液中で使用される緩衝物質が、好適に、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、及びＣＡＢＳの組み合わせを含んでもよいことを理解するであろう。そのような組み合わせの場合、約２０：１又はそれ以上のプロトン化種対非プロトン化種のいずれかの比が、それが「実質的に正に荷電している」ことを意味することのさらなる例である。
【0204】
一実施形態では、サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液は、溶解が生じるのに十分な時間、例えば、約１秒、約２秒、約３秒、約４秒、約５秒、約１０秒、約１５秒、約２０秒、約２５秒、約３０秒、約４０秒、約５０秒、若しくは約６０秒、又は約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１５分、若しくは約２０分若しくはそれ以上、例えば、約１秒～約２０分、約１秒～約５分、又は約１秒～約２分かけて組み合わされる。一実施形態では、サンプル中の非微生物細胞に対する最大５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％は、サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と組み合わせて２～５分以内に溶解され得る。いくつかの実施形態では、サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液は、細胞膜の可溶化が生じるのに十分な時間かけて組み合わされる。血球（即ち、非微生物細胞）の細胞膜の可溶化が、図２１に例示される。室温での血液細胞の溶解の有効性を示すため、いくつかのディファレンシャル溶解緩衝液製剤と組み合わされた全血のＯＤ５００吸光度（５００ｎｍの波長）が、様々な時点で測定された。時間の関数としての吸光度の低下は、溶解の進行を例示する。０．１２５％のＢｒｉｊＯ１０及び５０ｍＭのＣＡＰＳ（○）（即ち、１０ｍｌの全血を３０ｍｌのディファレンシャル溶解緩衝液と組み合わせた後の洗剤及び緩衝液の濃度）を含有する緩衝液／血液の組み合わせは、おそらくは不十分な洗剤濃度が原因で、溶解には無効であった。試験した他の３つの緩衝液（０．１５％ＢｒｉｊＯ１０及び１００ｍＭ ＣＡＰＳ（△）、０．２５％ＢｒｉｊＯ１０及び１０ｍＭ ＣＡＰＳ（□）、並びに０．２５％ＢｒｉｊＯ１０及び５０ｍＭ ＣＡＰＳ（◇））のそれぞれは、血液細胞の溶解に有効であった。これらの緩衝液／血液の組み合わせにおける吸光度の低下は、溶解が、１００ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液及び５０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液において２分以内で、そして１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液において３分以内で完全であったことを例示する。０．２５％ＢｒｉｊＯ１０及び１０ｍＭ ＣＡＰＳを含有する緩衝液は、上の表１で例示された緩衝液である。図２１で図示される通り、溶解時間は、ディファレンシャル溶解緩衝液の強度、例えば、洗剤の濃度及び／又は溶液のｐＨに依存することになる。一般に、より弱い溶解緩衝液が、非微生物細胞を完全に又は部分的に可溶化するため、さらなる時間及びサンプルのより高い希釈度を必要とすることが予想される。ディファレンシャル溶解緩衝液の強度は、サンプル中に存在することが知られる又は存在することが疑われる微生物に基づいて選択され得る。より溶解を受けやすい微生物の場合、弱いディファレンシャル溶解緩衝液を使用することができる。溶解は、約２℃～約４５℃、例えば、約１５℃～約４０℃、例えば、約２０℃～約４０℃の温度で生じ得る。
【0205】
一実施形態では、シリンジ内で組み合わせが生じるように、ディファレンシャル溶解緩衝液は、シリンジに充填することができ、次にサンプルは、シリンジに吸引することができる。一実施形態では、サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液は、別々のチューブで提供することができ、それらは、一方を他方に注ぐことによって組み合わせすることができる。一実施形態では、組み合わせ及び微生物回収が遠心濃縮器内で行われるように、ディファレンシャル溶解緩衝液は、遠心濃縮器内に提供することができ、サンプルは、遠心濃縮器内に吸引することができる。いくつかの実施形態では、混合は、サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液を溶液中で組み合わせることによって行われる。さらなる実施形態では、混合は、組み合わせたサンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液を撹拌することを含む。例えば、サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液は、遠心濃縮器内で組み合わせ、遠心濃縮器を傾ける、又は緩やかに振盪することによって混合することができる。別の例では、ビーズビーター又はソニケーターを使用し、組み合わせたサンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液を撹拌することができる。
【0206】
いくつかの実施形態では、溶解条件（例えば、組み合わせ及び／又は組み合わせ時間）、並びに分離及び／又は調査ステップは、サンプル中の微生物の一部又は全部を殺傷するのに十分であり得る。本発明の方法は、高度に多用途であり、微生物が単離及び同定が行われる場合に生存可能であることを必要としない。特定の実施形態では、微生物の一部又は全部は、死滅していてもよく、当該方法のステップが実施される前、間、及び／又は後に死滅が生じてもよい。他の実施形態では、微生物の一部又は全部は、分離ステップの結果として生存していてもよく、それにより培養温度（例えば、細菌の場合が約３７℃、そして多数の真菌種の場合に約３２℃）、適切な培地（例えば、細菌培地又は真菌培地）中での微生物のさらなる培養が可能である。例えば、微生物は、分離ステップ後に生存していてもよく、次に微生物が１つ以上の抗生物質に対して感受性又は抵抗性のいずれであるかを判定するための分離技術に含まれてもよく、好適に、微生物の成長は、ディファレンシャル溶解緩衝液の使用によって影響されなくてもよい。
【0207】
分離ステップ
サンプルが溶解された後、分離ステップを実施し、微生物をサンプルの他の成分から分離し、微生物を、同定及び特徴づけを目的として調査することができるペレットに濃縮することができる。分離は、完全である必要はない、即ち、１００％の分離がなされることは求められない。例示的に、微生物のサンプルの他の成分からの分離は、微生物の調査を他の成分からの実質的な干渉を伴わずにできれば十分である。例えば、分離により、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％又はそれ以上純粋である微生物ペレットをもたらすことができる。全血からの直接的な微生物同定を潜在的に交絡させる１つの汚染物質が、ヒトゲノムＤＮＡである。一態様例では、本ケースにおける発明者は、本明細書に記載のディファレンシャル溶解緩衝液による全血の処理が、後に微生物がＤＮａｓｅ処理を伴わなくても血液ライセートからペレット化されるとき、ヒトゲノムＤＮＡの９８％又はそれ以上を除去する能力があることを見出している。
サンプルが溶解された後、分離ステップを実施し、微生物をサンプルの他の成分から分離し、微生物を、同定及び特徴づけを目的として調査することができるペレットに濃縮することができる。分離は、完全である必要はない、即ち、１００％の分離がなされることは求められない。例示的に、微生物のサンプルの他の成分からの分離は、微生物の調査を他の成分からの実質的な干渉を伴わずにできれば十分である。例えば、分離により、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％又はそれ以上純粋である微生物ペレットをもたらすことができる。全血からの直接的な微生物同定を潜在的に交絡させる１つの汚染物質が、ヒトゲノムＤＮＡである。一態様例では、本ケースにおける発明者は、本明細書に記載のディファレンシャル溶解緩衝液による全血の処理が、後に微生物がＤＮａｓｅ処理を伴わなくても血液ライセートからペレット化されるとき、ヒトゲノムＤＮＡの９８％又はそれ以上を除去する能力があることを見出している。
【0208】
一実施形態では、分離は、サンプル（例えば、溶解したサンプル）が遠心濃縮器内に配置され、遠心濃縮器容器が、容器の底部及び／又は側面の微生物ペレット及びサンプル培地中のサンプルの他の成分（例えば、溶解した細胞成分）が上清中に留まる条件下で遠心分離されるような遠心分離ステップによって実施される。この分離により、培地、細胞片、ヒトゲノムＤＮＡ、及び／又は（例えば、微生物に特異的な核酸の増幅及び検出による）微生物の調査に干渉し得る他の成分などのサンプル中の材料から微生物が単離される。この分離により、サンプルのバルク体積から微生物が単離され、微生物部分の体積が減少し、微生物が小さい体積（例えば、約２００μｌ）に濃縮される。一実施形態では、ディファレンシャル溶解緩衝液は、遠心濃縮器内で提供され、サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液を溶解に十分な時間かけて組み合わせることによって溶解が開始され、次に遠心分離によって微生物の回収がなされる。一実施形態では、遠心濃縮器は、高密度クッション、物理的なセパレータ、又は当該技術分野で公知の類似培地を含まない。意外にも、高密度クッションが、同定又は特徴づけのための分子的技術とともに使用されるとき、汚染デブリからの微生物の十分な分離及び単離を提供するのに必要でないことが見出されている。
【0209】
本発明の一実施形態では、遠心濃縮器は、微生物がチューブの底部で直接的にペレットを形成するように、スインギングバケットローターで遠心分離される。容器は、微生物がペレット化し、且つ／又はサンプルの他の成分から分離されるのに十分な加速で十分な時間かけて遠心分離される。遠心分離の加速は、例示的に、約１，０００×ｇ～約２０，０００×ｇ、例えば、約２，５００×ｇ～約１５，０００×ｇ、例えば、約７，５００×ｇ～約１２，５００×ｇなどであり得る。遠心分離時間は、例示的に、約３０秒～約３０分、例えば、約１分～約１５分、例えば、約１分～約１０分であり得る。遠心分離は、例示的に、約２℃～約４５℃、例えば、約１５℃～約４０℃、例えば、約２０℃～約３０℃の温度で実施することができる。一実施形態では、遠心濃縮器は、閉鎖部を含み、且つ閉鎖部は、容器に適用され、シールが形成された後、遠心分離される。閉鎖部の存在により、感染性及び／又は有害性であるか又はそのようであり得る微生物をハンドリングすることから生じるリスク、並びにサンプルを汚染するリスクが低減される。本発明の方法の利点の１つが、密封容器（例えば、密閉的に密封された容器）内の微生物を用いて、当該方法のステップ（例えば、溶解、分離、調査、及び／又は同定）のいずれか１つ以上を実施する能力である。本方法は、自動化システムの使用を含んでもよく、それにより、例えば、直接的試験におけるサンプルからの微生物の回収とともに生じる、極めて毒性の高い微生物のハンドリングに関連する健康及び安全上のリスクが回避される。
【0210】
遠心濃縮器は、ディファレンシャル溶解緩衝液及びサンプルを保持するのに十分な体積を有する任意の容器であってもよい。一実施形態では、容器は、遠心ローターに適合し、又はそれに適合され得る。例示的に、容器の体積は、約０．１ｍｌ～約１００ｍｌ、例えば、約５０ｍｌであり得る。分離がマイクロスケールでなされる場合、容器の体積は、約２μｌ～約１００μｌ、例えば、約５μｌ～約５０μｌであり得る。一実施形態では、容器は、サンプルを保持するための上位部分で、より幅広い内部直径、及び微生物のペレットが収集される下位部分で、より狭い内部直径を有する。テーパー状の内部直径部分は、上位部分及び下位部分を接続することができる。例示的に、テーパー状の部分は、約２０°～約７０°、例えば、約３０°～約６０°の角度を有し得る。一実施形態では、下位の狭い部分は、容器の全高の半分未満、例えば、容器の全高の約４０％、約３０％、約２０％、又は約１０％未満である。容器は、取り付けられた閉鎖装置を有し得る、又は閉鎖装置（例えば、キャップ）を受けるように装着することができ、容器を遠心分離前に密封することができる。特定の実施形態では、容器は、微生物ペレットが、手作業又は自動化された様式のいずれかで（技術者が容器内容物に曝露されないように）分離後に容器から容易に回収できるように設計される。例えば、容器は、ペレットを含有し、且つ容器の残りから分離され得る、除去可能な部分又は剥離部分を含み得る。別の実施形態では、容器は、シリンジ若しくは他のサンプリング装置の挿入のため、又はペレットを取り除くための、１つ以上のポート又は透過性表面など、分離後のペレットへの接近を可能にする１つ以上の構造を含む。一実施形態では、容器は、独立型容器、即ち、単一のサンプルを分離するための装置である。他の実施形態では、容器は、複数のサンプルを同時に分離できるように、２つ以上の遠心濃縮器を含む装置の一部である。一実施形態では、装置は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３６、４２、４８、６０、７２、８４、９６、又はそれ以上の遠心濃縮器を含む。
【0211】
別の実施形態では、分離は、サンプル（例えば、溶解サンプル）が、微生物を保持する孔径を有する選択フィルター又はフィルターセットが装着された装置内に配置される場合の濾過ステップによって実施することができる。濾過の他の例としては、限定はされないが、タンジェンシャルフローフィルトレーションが挙げられ、且つ／又は緩衝液交換により、微生物がサンプルから分離され、サンプルの体積が減少し、そして微生物が濃縮される。本明細書に記載の方法において用いられてもよい濾過技術の好適な例が、図１５～２０に図示される。保持された微生物は、好適な緩衝液を、緩やかにフィルターを通過させることによって洗浄されてもよい。次に、洗浄された微生物は、フィルター上で直接的に調査されてもよく、且つ／又はフィルターの表面を直接的にサンプリングすることによって、若しくはフィルターを好適な水性緩衝液で逆流させることによって、調査のために回収されてもよい。
【0212】
一実施形態では、容器は、チューブ、例えば、遠心管であり得る。別の実施形態では、容器は、チップ又はカードであり得る。一実施形態では、発明者は、非微生物細胞の溶解及び微生物細胞の回収を単一チューブ内で実施することを可能にし得る、遠心濃縮器、並びにそれに関連する装置、システム、及び方法を開発している。さらに、微生物ペレットは、上清が単離され、遠心濃縮器の上位部分内に含まれるように、遠心濃縮器から生じさせることができる。具体的に、本明細書に記載の遠心濃縮器、並びにそれに関連する装置、システム、及び方法により、ユーザは、より少ない操作で、単一の遠心分離ステップのみで、微生物をサンプルから分離することができる。また、本明細書に記載の遠心濃縮器、並びにそれに関連する装置、システム、及び方法により、ユーザは、微生物のハンドリングをせずに、サンプルを分離し、試験し、ひいては極めて毒性の高い微生物のハンドリングに関連する健康及び安全上のリスクを回避することができる。
【0213】
図６Ａ～６Ｆを参照すると、遠心濃縮器５０１０及び遠心濃縮器の要素の実施形態が図示される。一実施形態では、遠心濃縮器は、遠心分離によるサンプルからの微生物の濃縮のために設計された遠心管である。遠心濃縮器５０１０は、チューブ体６００２、そしてチューブ体６００２の近位末端６００１に閉鎖キャップ６００６を含む。一実施形態では、遠心分離中にチューブを保護するために設計された保護キャップ６００４は、チューブ体６００２の遠位末端６００５に配置されてもよい。一実施形態では、ディファレンシャル溶解緩衝液及びサンプル（例えば、全血サンプル）は、キャップ６００６を取り外した後、チューブ体６００２に添加されてもよく；内容物は、キャップ６００６を交換することによって、その中に密封されてもよい。例示的に、遠心濃縮器５０１０の遠位６００５末端及び近位６００１末端は、推定上のバイオハザード材料の放出を阻止するため、動作中に密封されるが、以下により詳細に説明される通り、チューブ体６００２の遠位末端６００５は、ペレット化された微生物の濃縮器からの排出を可能にするように、選択的に開放可能であってもよい。
【0214】
例示的な実施形態では、遠心濃縮器５０１０は、プランジャー６００８を含む。プランジャー６００８は、限定はされないが、遠心濃縮器５０１０の遠位末端又はその近傍で濃縮（例えば、ペレット化）された微生物を収集すること、遠心濃縮器５０１０の遠位末端６００５を開口すること、及びペレット化された微生物を遠心濃縮器５０１０の遠位末端６００５から排出することなどのいくつかの機能を果たすように設計されてもよい。濃縮器の遠位末端６００５の開口及び微生物ペレットの排出は、図６Ｄ及び図６Ｅに関連して、以下により詳細に考察されることになる。一実施形態では、プランジャー６００８は、プランジャー６００８の手動操作のために設計された拡大部分６００９を含む近位末端６０２４を有する。例えば、拡大部分６００９は、プランジャー６００８を作動させ、ペレットを排出するため、ユーザの手の親指、手指、若しくは別の部分、又は機械的装置によって操作されてもよい。例えば、プランジャー６００８は、プランジャーを作動させ、ペレットを排出するため、ユーザの親指によって押し込まれてもよい。別の実施形態では、プランジャー６００８は、異なる様式で、例えば、ねじ状のスクリュー部分に沿って回転させ、プランジャー６００８を下げて、遠心濃縮器を貫通させることによって作動される。例示的な実施形態では、プランジャー６００８は、プランジャーを、第１の方向の固定された「上位」位置に保つ、また第２の方向の「プランジ」位置に保つために設計された保持メンバー６０２６の対を含む。一実施形態では、保持メンバー６０２６は、キャップ６００６上の戻り止め６０３０の対応する対と相互作用することで、プランジャーを固定された「上位」位置に保つ。例示的な実施形態では、プランジするため、拡大部分６００９を把持して使用し、キャップに対してプランジャーをねじることで、保持メンバー６０２６を通路６０３２と合わせる。一実施形態では、通路６０３２は、プランジャー６００８を押し込み、微生物ペレットを遠心濃縮器の遠位末端６００５から排出することを可能にするように設計される。
【0215】
一実施形態では、遠心濃縮器５０１０は、本質的に、ディファレンシャル溶解緩衝液及びサンプルを保持するのに十分な任意の体積を有してもよい。一実施形態では、遠心濃縮器５０１０は、遠心ローターに適合し、又はそれに適合され得る。例示的に、遠心濃縮器５０１０の体積は、約０．１ｍｌ～約１００ｍｌであり得る。具体的な実施形態では、遠心濃縮器５０１０は、標準の５０ｍｌのコニカル遠心管に類似する形状及び内部体積を有し、５０ｍｌのコニカル遠心管に適合するように設計された遠心ローター（固定された角度及びスイングバケット）に適合性がある。一実施形態では、ディファレンシャル溶解緩衝液６００３は、遠心濃縮器５０１０内に提供される。例えば、任意選択的に、約２０～４０ｍｌ（例えば、約３０ｍｌ）の本明細書に記載のディファレンシャル溶解緩衝液が、遠心濃縮器５０１０内に提供されてもよい。遠心濃縮器５０１０がディファレンシャル溶解緩衝液６００３を含んでもよい一方で、例示的に、遠心濃縮器は、ディファレンシャル溶解緩衝液が遠心濃縮器５０１０内に提供されるか否かにかかわらず、高密度クッションが提供されなくてもよい。一実施形態では、遠心濃縮器５０１０のキャップ６００６は、任意選択的に、サンプル（例えば、全血サンプル）が、閉鎖キャップ６００６を取り除く必要がなく、遠心濃縮器５０１０に添加されることを可能にし得る隔壁６００７（例えば、ゴム隔壁）又は類似構造を含んでもよい。これは、ディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心濃縮器とともに使用されることが意図されるサンプルの多くが、バイオハザード性及び／又は感染性を有し得ると仮定すれば、特に有用であり得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、ディファレンシャル溶解緩衝液と混合され、遠心濃縮器に隔壁６００７を通じて無菌的に充填される。これにより、分析前のサンプルの潜在的な汚染が低減される。
【0216】
図６Ｂは、遠心濃縮器５０１０の別の図面を示す。図６Ｂを考慮して、ペレット収集リザーバー（図６Ｄ中のペレット収集リザーバー６０１４）をキャップする内部支持キャップ６０１０を示すため、外部保護キャップ６００４は、チューブ体６００２の遠位末端から除かれている。外部保護キャップ６００４に加えて、内部支持キャップ６０１０は、チューブ体６００２の遠位末端６００５を保護し、例えば、特に遠心分離中の貯蔵又は使用におけるチューブからの漏出を阻止することができる。いくつかの実施形態では、支持キャップ６０１０は、除かれてもよい。また、遠位保護キャップ６００４の除去は、特に遠心分離中、チューブ体６００２の遠位末端６００５を補強及び保護するために含めることができる支持リブ６０１２を示す。支持リブ６０１２は、いくつかの実施形態において、取り除かれてもよい。例えば、特別に設計された遠心機バケットインサートは、おそらくは支持リブ６０１２は取り除かれて、チューブ体６００２の遠位部分を支持するように設計されてもよい。
【0217】
図６Ｃは、閉鎖キャップ６００６がチューブ体６００２にいかに取り付けられるかを図示するため、閉鎖キャップ６００６が除かれること以外では、図６Ｂと類似する遠心濃縮器５０１０の図面を示す。例示的な実施形態では、チューブ体６００２の近位末端６００１は、閉鎖キャップ６００６がチューブ体６００２に螺合されることを可能にするスレッド６０１１を含む。しかし、スレッド６０１１は、単に例示的である。スレッド６０１１であれば、同一又は類似機能を果たすため、当該技術分野で知られる任意の構造と交換することができる。例えば、閉鎖キャップ６００６であれば、チューブ体６００２上又はキャップ６００６上のバヨネットマウント、摩擦配置、ｏリングアセンブリなどによって、チューブ体６００２に密封することができる。
【0218】
ここで図６Ｄ～図６Ｆを参照すると、チューブ体６００２の遠位末端６００５の詳細及びプランジャー６００８が微生物ペレットをいかにして排出し得るかが図示される。例示的な実施形態では、チューブ体６００２の遠位末端６００５は、ペレット収集リザーバー６０１４を含む。参考までに、ペレット収集リザーバー６０１４は、図６Ｂ及び図６Ｃ中の支持キャップ６０１０によってカバーされることが示された。本明細書中の他の箇所でより詳細に考察される通り、いくつかの実施形態では、遠心濃縮器５０１０は、微生物が（固定角遠心ローターの場合に典型的である、側壁上と異なり）チューブの底部でペレット化されるようなスイングバケット遠心機で遠心分離されるように設計される。したがって、サンプル中の非溶解微生物の実質的に全てが、ペレット収集リザーバー６０１４内でペレット化できる必要がある。一実施形態では、サンプル中の微生物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％が、ペレット収集リザーバー６０１４内でペレット化可能である。一実施形態では、ペレット収集リザーバー６０１４は、実質的に全ての微生物ペレット（例えば、約５００μｌ、約４００μｌ、約３００μｌ、約２００μｌ、２０～２００μｌ、４０～１５０μｌ、又は約５０～１００μｌ以下）を含むように、サイジング及び設計されてもよい。いくつかの実施形態では、チューブ体６００２は、微生物をペレット収集リザーバー６０１４に注ぐために設計された、傾斜のある内部側壁６０１５を含んでもよい（図６Ｅ及び図６Ｆを参照されたい）。
【0219】
いくつかの実施形態では、ペレット収集リザーバー６０１４は、プランジャー６００８の一部がペレット収集リザーバー６０１４を通じて押し込まれ、微生物ペレットを排出することを可能にするように設計された分離末端６０１６を含んでもよい。分離末端の好適な例としては、限定はされないが、より薄い成形部分、壊れやすい領域を有するより薄い成形部分、箔キャップなどが挙げられる。
【0220】
図６Ｅ及び図６Ｆを具体的に参照すると、いかにプランジャー６００８がペレットリザーバー６０１４を貫通し、微生物ペレットをチューブ体６００２の遠位末端６００５から排出するかの詳細が示される。プランジャー６００８及びペレットリザーバー６０１４は、微生物ペレットが、チューブ体内の使用済みのライセートを単離しながら、ペレットリザーバーから排出され得るように設計される。プランジャー６００８は、微生物ペレットを収集するため、またペレットリザーバー６０１４の末端６０１６（例えば、固定された箔キャップ、又は壊れやすい分離部分）を貫通させるために設計された、チップ６０２２を有する遠位部分６０３０を含む。例示的な実施形態では、チップ６０２２は、ペレットリザーバー６０１４の末端６０１６を貫通できる、鋭いエッジ６０２３の形状をしたシャベルである。チップ６０２２が例示的な実施形態においてシャベル形状で示される一方で、他の好適な形状として、限定はされないが、ブレード形状、平滑末端、スパイク末端などが挙げられる。ペレットリザーバー６０１４の末端が貫通され、微生物ペレットが排出されるとき、使用済みのライセートが漏出し、ペレットを希釈することのないように、使用済みの単離物がチューブ体内に残存することが望ましい。いくつかの実施形態では、使用済みのライセートは、潜在的に感染性又はバイオハザード性の材料を含有することがあり、そういう理由で、使用済みのライセートを含有することは、重要な安全性の特徴である。プランジャー６００８の遠位末端６０３０の近傍に、一実施形態では、ペレットリザーバー６０１４の内部部分６０２０と接続されるようにサイジング及び設計された部分６０１８が存在する。この実施形態では、プランジャー６００８の部分６０１８とペレットリザーバー６０１４の内部部分６０２０との間のインターフェースは、チューブ体６００２において使用済みのライセートを単離するシールを作成する。また、インターフェースは、微生物ペレットが効率的に収集され、排出されることを保証し得る。６０１８と６０２０との間のインターフェースが摩擦適合として示される一方で、部分６０１８又は部分６０２０は、例えば、チューブ体６００２において使用済みのライセートを単離するシールを作成するためのｏリング又は類似構造を含んでもよい。いくつかの実施形態では、プランジャー６００８を作動することにより、加圧下で遠心濃縮器の遠位末端からペレットが、分離末端６０１６を開放することによって排出される。この実施形態では、プランジャーが押し込まれるとき、部分６０１８とペレットリザーバー６０１４の内部部分６０２０との間のインターフェースは、分離末端６０１６が貫通されるまで、空洞内の圧力増加を引き起こし、結果として、微生物ペレットがペレットリザーバー６０１４から排出される。これは、圧力により、微生物がペレットリザーバーの側面上に保持されることになる機会が減少することから、微生物のより大規模な回収の原因になり得る。
【0221】
ここで図６Ｇを参照すると、プランジャー６００８は、単独で示される。プランジャー６００８は、本明細書中の別の箇所で考察される、近位末端６０２４、遠位末端６０３０、保持メンバー６０２６、部分６０１８、及びシャベルチップ６０２２を含む。プランジャー６００８は、一実施形態において、プランジャーが押し込まれるとき、それがチューブ体６００２の末端を貫通し、微生物ペレットを排出し得る程度に十分に長い（例えば、チューブ体６００２と実質的に同じ長さである）ようにサイジングされた、プランジャーシャフト６０２８を含む。さらに、シャフトは、任意選択的に、キャップ６００６と接続し、キャップとプランジャーとの間のインターフェースを密封するように設計されてもよい、ｏリング６０２７又は類似構造を含んでもよい。当然ながら、キャップはまた、ｏリング６０２７の代わりに、又はそれに加えて、シーリングメンバーを含んでもよい。遠心濃縮器５０１０が単に例示的であることが理解される。上で考察された遠心濃縮器５０１０及びその変形、並びに他の容器は、本明細書で開示される様々な方法とともに用いられてもよい。
【0222】
調査ステップ
一旦微生物がペレット化されていると、ペレットを調査し、ペレット中の微生物を同定し、且つ／又は特徴づけることができる。一実施形態では、調査は、非侵襲的様式で、即ち、ペレットが調査される一方で、遠心濃縮器内に残るように行ってもよい。任意選択的に、分離及び同定プロセス全体を通じて容器の密封性を保つことと、手順の一部又は全部を自動化することと連携して、非侵襲的様式で微生物を同定できることは、汚染性及び／又は感染性サンプルの恒常的なハンドリングを回避し、全プロセスの安全性を大幅に増加させる。
一旦微生物がペレット化されていると、ペレットを調査し、ペレット中の微生物を同定し、且つ／又は特徴づけることができる。一実施形態では、調査は、非侵襲的様式で、即ち、ペレットが調査される一方で、遠心濃縮器内に残るように行ってもよい。任意選択的に、分離及び同定プロセス全体を通じて容器の密封性を保つことと、手順の一部又は全部を自動化することと連携して、非侵襲的様式で微生物を同定できることは、汚染性及び／又は感染性サンプルの恒常的なハンドリングを回避し、全プロセスの安全性を大幅に増加させる。
【0223】
別の実施形態では、ペレットは、サンプル中に存在し得る微生物のタイプのそれぞれを個別に同定するために使用可能である、微生物ＲＮＡ又はＤＮＡの配列を増幅するための分子的技術（例えば、ＰＣＲ）を用いて調査することができる。一例では、サンプル中に存在し得る、細菌、真菌などの個別タイプのそれぞれについて特徴的である核酸配列が選択されてもよく、フォワード及びリバースプライマーがそれら配列の増幅用に設計されてもよく、ペレット中の微生物が溶解されてもよく、そしてライセート（又はライセートから精製された核酸）がプライマー及び他のＰＣＲ試薬（緩衝液、ポリメラーゼなど）と組み合わされてもよく、それにより選択された特徴的な核酸配列は、当該技術分野で周知の手順に従って増幅されてもよい。増幅された核酸を検出及び使用し、サンプル中の１つ以上の微生物の存在を、限定はされないが、当該技術分野で公知である通り、リアルタイム検出又は融解曲線分析などの増幅後分析、蛍光標識、放射活性標識、化学発光標識、酵素標識される他のｄｓＤＮＡ結合色素技術及びプローブなどの当該技術分野で周知の手順に従って同定することができる。一実施形態では、ペレットは、本明細書中の他の箇所で詳述されるＦｉｌｍＡｒｒａｙシステムを用いて調査することができる。一実施形態では、ペレットは、特別に適応された血液培養同定（ＢＣＩＤ）パネルポーチ及びプロトコルを用いて調査することができる。ＢＣＩＤパネル及びプロトコルは、米国特許第１０，０５３，７２６号明細書（その全体は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。しかし、ＢＣＩＤは、単にアッセイ装置の一例である。当業者は、好適に、例えば、血液から直接的に得られるサンプル中の生物の濃度に好適に適応した感度及び検出限界値を有する、特別に設計されたアッセイを用いて、ペレットを調査することができることを理解するであろう。
【0224】
別の実施形態では、ペレットは、ペレット中に存在する核酸を配列決定することによって調査することができる。特徴的な微生物配列又は全微生物ゲノムの配列決定を用いて、ペレット中の微生物を同定することができる。そのような配列決定は、当該技術分野で公知の多くの配列決定技術の１つ以上に従って実施されてもよい。一実施形態では、配列決定は、サンガー配列決定である。別の好ましい実施形態では、配列決定は、大規模並列又は「次世代」配列決定（ＮＧＳ）技術を含む。大規模並列／ＮＧＳ技術では、数十万～数百万のＤＮＡ断片が並列に処理され、単一の配列決定の実行における、生成された配列の１塩基あたりの低いコスト、及びギガベース（Ｇｂ）からテラベース（Ｔｂ）の規模に対するスループットがもたらされる。結果として、大規模並列／ＮＧＳ技術を用いて、全ゲノムの特徴を低コスト及びハイスループットで定めることができる。
【実施例】
【0225】
実施例１－全血からの直接的な微生物の検出
本明細書に記載のディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心濃縮器は、全血からの直接的な微生物の検出のため、使用することができる。例えば、これを用いて、敗血症を引き起こす微生物を迅速に同定することができ、検出前に血液サンプルを前培養し、疾患を引き起こす生物を増幅するステップを伴わない。しかし、本明細書中の別の箇所で考察の通り、全血からの直接的なそのような検出及び診断が、いくつかの理由で困難であることが判明している。１つとして、ＢＳＩにおける全血中に見出される感染性生物の数は、通常低く（血液１ｍＬあたり約１～１００コロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）であり、培養で確認された敗血症を有するほとんどの個体において、約１～１０ｃｆｕ／ｍｌが典型的である）、そして血液は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のいくつかの阻害剤（例えば、微生物と同時精製し、標的微生物からの核酸回収及び下流ＰＣＲの双方に干渉し得る、ヘモグロビン及び白血球由来のゲノムＤＮＡ）を含有する。
本明細書に記載のディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心濃縮器は、全血からの直接的な微生物の検出のため、使用することができる。例えば、これを用いて、敗血症を引き起こす微生物を迅速に同定することができ、検出前に血液サンプルを前培養し、疾患を引き起こす生物を増幅するステップを伴わない。しかし、本明細書中の別の箇所で考察の通り、全血からの直接的なそのような検出及び診断が、いくつかの理由で困難であることが判明している。１つとして、ＢＳＩにおける全血中に見出される感染性生物の数は、通常低く（血液１ｍＬあたり約１～１００コロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）であり、培養で確認された敗血症を有するほとんどの個体において、約１～１０ｃｆｕ／ｍｌが典型的である）、そして血液は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のいくつかの阻害剤（例えば、微生物と同時精製し、標的微生物からの核酸回収及び下流ＰＣＲの双方に干渉し得る、ヘモグロビン及び白血球由来のゲノムＤＮＡ）を含有する。
【0226】
全血中の非常に少ない生物及びＰＣＲ阻害剤の存在により、より大量の全血（例えば、１～２０ｍＬ）からの濃縮は、臨床的に関連する微生物レベルでの感度を達成するのに所望されるＤＮＡ鋳型の品質及び量を得ることが所望される。一実施形態では、本明細書に記載のディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心濃縮器は、技術者が、非微生物細胞を約１～２０ｍＬ（例えば、約１０ｍｌ）の全血に溶解し、約５～２０分（例えば、約１５分）以内の遠心分離によって、その中の微生物を濃縮することを可能にする。例示的に、サンプルの溶解は、ＤＮａｓｅステップを含まず、遠心濃縮器では、高密度クッションが使用されない。これにより、サンプルの調製が、より迅速でより容易になり、且つ再現性が高まる。
【0227】
本明細書に記載の遠心濃縮器から得られる微生物ペレットは、サンプルを分子アッセイ装置に注入するために使用可能であるサンプルバイアルに直接的に排出することができる。具体的な例では、遠心濃縮器から得られた微生物ペレットは、（米国特許第１０，４６４，０６０号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の）ＦｉｌｍＡｒｒａｙインジェクションバイアル（ＦＡＩＶ）に、次にＦｉｌｍＡｒｒａｙポーチに直接的に排出することができる。一実施形態では、ＦＡＩＶを用いて、遠心濃縮器から得られた微生物を、サンプル中の微生物の同定のため、血液培養同定（ＢＣＩＤ）パネルポーチに直接的に注入することができる。現在、ＢＣＩＤパネルアッセイは、実施に約６０分かかる。ＢＣＩＤパネルアッセイ及びプロトコルについては、米国特許第１０，０５３，７２６号明細書（上記の通り、その全体が組み込まれた）に記載されている。この場合における発明者は、ディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心濃縮器をＢＣＩＤパネルアッセイ及び特別に改良された装置プロトコルと連携して使用し、約１～１０ｃｆｕ／ｍｌの検出限界、並びに全体で約７５分のサンプル調製及び分析時間を達成している。しかし、化学反応及び装置性能がさらに改善されると、分析時間を有意に減少させることができる可能性は高い。
【0228】
ここで図７を参照すると、サンプル調製ワークフローの例を図示する。第１ステップ７００では、血液サンプル及び遠心濃縮器を提供する。一例では、約１０ｍｌの体積を有し得る血液サンプルを、標準のバキュテナー内に提供する。一例では、遠心濃縮器は、その中にディファレンシャル溶解緩衝液をある体積（例えば、約３０ｍｌ）で提供してもよい。
【0229】
第２ステップ７０２では、表１の血液サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液は、サンプル中の非微生物細胞の実質的に全て（即ち、血液細胞の全て）を溶解し、ライセートを得るのに十分な時間かけて組み合わせた。例えば、血液サンプル及びディファレンシャル溶解緩衝液は、約１～５分間かけて組み合わせてもよいが、より長い時間又はより短い時間を用いてもよい。例示的に、溶解は、約２℃～約４５℃、例えば、約１５℃～約４０℃、例えば、約３０℃～約４０℃の温度で行うことができる。一実施形態では、溶解は、室温で行ってもよい。
【0230】
血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と、ライセートを得るのに十分な時間かけて組み合わせた後、ステップ７０４において、微生物を、存在する場合、遠心分離によってライセートから回収してもよい。本発明の一実施形態では、遠心濃縮器は、微生物がペレットをチューブの側面で直接的に形成するように、スインギングバケットローターで遠心分離してもよい。容器は、微生物がペレット化し、且つ／又はサンプルの他の成分から分離されるように、十分な加速で、そして十分な時間かけて遠心分離する。一実施形態では、遠心分離時間は、約３０秒～約３０分、例えば、約１０～１５分であり得る。例示的に、遠心加速は、約１，０００×ｇ～約２０，０００×ｇ、例えば、約３０００～１０，０００×ｇであり得る。例示的に、遠心分離は、約２℃～約４５℃、例えば、約４～８℃の温度で実施することができる。
【0231】
遠心濃縮器が任意選択的な遠位支持キャップを含む場合、ステップ７０６で例示される通り、支持キャップは、プランジング前に取り除いてもよい。ステップ７０８～７１２は、微生物ペレットを遠心濃縮器から排出するためのプロセス例を図示する。ステップ７０８では、プランジの開始時に、プランジャーの遠位末端は、ペレットリザーバーに移動し、ペレットを上清から単離することができる。このことは、本明細書で既に考察した、図６Ｅに図示した。プランジャーがさらにペレットリザーバーに押し込まれると、ペレットリザーバーの分離末端は、穿刺、分離、破砕などを受け得るとともに、ステップ７１０で図示の通り、ペレットは、排出が開始され得る。ワークフローにおけるステップ７１２は、ペレットが遠心濃縮器から完全に排出されていることを示す。排出されたペレットは、ペレット中の微生物を特徴づけ、同定するため、当該技術分野で公知のいくつかのアッセイにおいて使用することができる。本明細書で既に考察した通り、ＰＣＲ分析及び配列決定は、ペレット中の微生物を特徴づけ、同定するために使用可能であるアッセイの２つの非限定例である。
【0232】
７１４で図示の通り、一実施形態では、遠心濃縮器の遠位末端は、容器に直接的に適合するようにサイジング及び設計してもよい。一実施形態では、容器は、ＦｉｌｍＡｒｒａｙインジェクションバイアル（ＦＡＩＶ）である。そのようなことから、ペレット中の微生物の特徴づけ及び同定のため、ペレットを直接的にＦＡＩＶに排出することができ；次にＦＡＩＶを用いて、サンプルをＦｉｌｍＡｒｒａｙアッセイポーチに注入することができる。一実施形態では、ペレットをＦＡＩＶに直接的に排出してもよく、そしてＦＡＩＶを用いて、微生物をＦｉｌｍＡｒｒａｙポーチに、ＦＡＩＶを遠心濃縮器から離すことなく、注入してもよい。ＦＡＩＶを用いて、サンプルをＦｉｌｍＡｒｒａｙポーチに充填した後、全アセンブリをバイオハザード廃棄物容器内に処分してもよい。これにより、潜在的に感染性のある生物及び潜在的にバイオハザード性の廃棄物のハンドリングが低減され、汚染のリスクが制限される。
【0233】
一実施形態では、一定分量（例えば、約１ｍｌ）の元のサンプルを、ステップ７１２で排出されたペレットに、ペレットとともにステップ７１４のバイアルに、又は直接的にペレットとともに分析装置に添加してもよい。本明細書に記載の溶解及び遠心分離方法（及び関連する方法）は、細菌及び酵母のような微生物の濃縮及び検出に十分に適しているが、特にウイルスの検出に適していない。一定分量の元のサンプルをペレットに、そして分析に添加することによって、ウイルスも単離及び検出することができる。
【0234】
本発明の一態様では、方法ステップの一部又は全部は、自動化することができる。方法のステップを自動化することにより、より多数のサンプルをより効率的に試験することが可能になり、有害微生物及び／又は感染性微生物を含有し得るハンドリングサンプルにおけるヒューマンエラーのリスクが低下する。しかし、より重要なことに、自動化により、決定的結果を、昼夜を問わずいつでも遅延なく得ることができる。いくつかの試験では、敗血症を引き起こす生物のより迅速な同定が、患者ケアの改善、入院の短縮化及びより低い全体コストと相関することを示している。
【0235】
ここで図８を参照すると、ディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心分離を用いる、本明細書に記載の方法におけるサンプル調製時間を他の方法と比較する。図８から明らかであるように、サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と組み合わせる方法とそれに続く遠心分離方法は、専ら２つのステップ及び全体で約１５分の処理時間を含む。これは、この場合に発明者によって試験される他の方法よりも有意に迅速且つ容易である。本文書の導入セクションにおいて考察されるＭｏｌＹｓｉｓの方法は、ＤＮａｓｅステップを含むいくつかの複雑なステップを含み、真核細胞溶解、ＤＮａｓｅ処理、及び微生物細胞回収だけで約４５～５０分かかる。微生物細胞の洗浄及び溶解は、さらなるステップ及び緩衝液を必要とする。ＳｕｃｃｅｓｓｆｕｌｕｓｅｏｆｔｈｅＭｏｌＹｓｉｓシステムの使用の成功には、熟練した専門家が必要である。オペレーターの技能に依存することで、結果の収率及び品質におけるオペレーター間差異のリスクが生じる。多くの緩衝液及びマニュアルピペッティングステップが、サンプルの相互汚染のリスクを増加させる。サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と組み合わせるステップとそれに続く遠心分離は、ＤＮａｓｅステップを含む、それらのステップの多くを必要としないばかりか、洗浄ステップの多くを必要としない。本明細書に記載の方法では、遠心分離後に回収される微生物細胞は、さらなる処理を伴わない、遠心分離後の分子的分析（例えば、ＰＣＲアッセイ、ＤＮＡ配列決定、又は質量分析）に適する。
【0236】
また、図８は、ディファレンシャル溶解及び遠心分離方法のサンプル調製時間を２つの他のプロトコルと比較する。Ｙ２プロトコルは、プロテアーゼ及びＤＮａｓｅ消化ステップと組み合わせたサポニンベースの溶解を用いる手順である。Ｙ２プロトコルは、いくつかの複雑なステップ及びサンプル調製用の約９０分を必要とした。Ｌｙｃｏｌｌ＋ＤＮａｓｅプロトコルは、ＤＮａｓｅ消化及び遠心分離におけるフィコール密度勾配と組み合わせたサポニンベースの溶解を用いる手順である。Ｌｙｃｏｌｌの手順は、良好な生物の収率をもたらし、ゲノムＤＮＡを有効に除去したが、フィコール密度勾配でのライセートの複雑な層形成及び約２時間の処理時間を含んだ。ディファレンシャル溶解緩衝液及びその後の遠心分離を用いる、本明細書で特許請求される方法と比較して、Ｙ２プロトコル及びＬｙｃｏｌｌ＋ＤＮａｓｅの手順は、双方ともに複雑なステップ及び過剰な時間を含む。同じことが、ディファレンシャル溶解及び遠心分離方法とＭｏｌＹｓｉｓの方法との比較にあてはまる。
【0237】
図９は、サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液及びその後の遠心分離で処理することによって達成され得る、１つの実験セットにおける微生物回収を図示する。対照は、添加される緩衝液であり、試験サンプルは、添加される全血である。対照及び試験サンプルは、同じ数の生物とともに添加した。対照では、添加された生物を緩衝液から遠心分離によって回収する能力を試験する一方で、試験サンプルでは、真核細胞（即ち、ＲＢＣ、白血球、血小板など）の溶解及び添加された微生物細胞のライセートからの遠心分離による回収におけるディファレンシャル溶解緩衝液の有効性を実証する。対照と比較して、この実験において、添加された血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液及びその後の遠心分離で処理することを含む方法により、微生物の約８６％が全血サンプルから回収され得る。表２に例示の通り、回収率は、他の実験において、９０％を超え得る。
【0238】
【表2】
【0239】
好ましい実施形態では、ディファレンシャル溶解及びその後の遠心分離による微生物の回収率は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％であり得る。
【0240】
また、血液サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液及びその後の遠心分離で処理することにより、ゲノムＤＮＡが効率的に除去され、全てがＤＮａｓｅステップ又は他の複雑な若しくは時間のかかる処理ステップを含まない。下の表３は、ディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心分離で達成された全血からのゲノムＤＮＡ除去の程度を、Ｌｙｃｏｌｌ及びＬｙｃｏｌｌ＋ＤＮａｓｅの方法に対して比較している。全血対照は、溶解された全血サンプルから回収されたゲノムＤＮＡの量を表す。ＤＮＡをＭａｇｎａＰｕｒｅシステムで精製し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒヒトＤＮＡ定量キットを用いて定量化した。
【0241】
【表3】
【0242】
表３から明らかであるように、ディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心分離処理で回収されるゲノムＤＮＡの量は、Ｌｙｃｏｌｌの方法より有意に良好であり、Ｌｙｃｏｌｌ＋ＤＮａｓｅの方法と同等である。ディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心分離処理は、Ｌｙｃｏｌｌ又はＬｙｃｏｌｌ＋ＤＮａｓｅの方法よりも有意に迅速であり、容易であり、そして再現性が高く、ディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心分離処理では、時間のかかるＤＮａｓｅステップを伴わずに、見事なゲノムＤＮＡの減少が達成される。
【0243】
これは、ディファレンシャル溶解緩衝液での血液の処理後、遠心分離によってペレット化可能な全血材料の存在下での種々の量の酵母対照の増幅におけるクロッシングポイント（Ｃｐ）値を比較する、図１０においてやや異なる形で実証する。この場合、ディファレンシャル溶解緩衝液（●アルカリ性）を、Ｌｙｃｏｌｌの方法（＊Ｌｙｃｏｌｌ）と比較した。ディファレンシャル溶解緩衝液実験の場合、１０ｍＬの全血に、１、１０、又は１００ＣＦＵ／ｍＬの酵母対照を添加し、次に本明細書に記載のように、ディファレンシャル溶解緩衝液及びその後の遠心分離を用いて処理した。得られたペレットをＦＡＩＶに移し、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ ＢＣＩＤポーチでサンプルを実行した。Ｌｙｃｏｌ実験を、１０ｍｌの添加した全血をＬｙｃｏｌｌの方法を用いて処理した点を除いて同様に実行した。ＣＦＵ対照（■）は、種々の量の酵母ＤＮＡにおける任意の全血材料の不在下でのＣｐを表す。異なる酵母のＣＦＵ量を、ＰＢＳで希釈し、ディファレンシャル溶解緩衝液及びＬｙｃｏｌｌの手順に使用される１０ｍＬの添加全血から生物の１００％濃度に等しいレベルで、ＦＡＩＶにピペッティングした（全血中１ＣＦＵ／ｍＬ＝１０ＣＦＵ対照をＦＡＩＶに）。ＷＢ対照（□）は、非濃縮全血である。ＷＢ対照の場合、添加全血の２００μＬを、ディファレンシャル溶解緩衝液及びＬｙｃｏｌｌの手順に使用される１０ｍＬの添加全血から生物の１００％濃度に等しいレベルで、ＦＡＩＶにピペッティングし、生物の初期ＬｏＤ／Ｃｐ値を示した後、濃縮プロトコルを行った。図１０において明らかなように、Ｌｙｃｏｌｌペレットの存在下での酵母ＤＮＡの増幅は、ＣＦＵ及びＷＢ対照と比較して、約３Ｃｐ単位分遅延した。それに対し、ディファレンシャル溶解緩衝液及びその後の遠心分離を用いて得られたペレットから、検出可能な阻害は認められなかった。即ち、ディファレンシャル溶解緩衝液から得られたペレットの存在下での酵母ＤＮＡの増幅は、ＣＦＵ及びＷＢ対照と実質的に区別がつかない。Ｌｙｃｏｌｌペレット中のＣｐの増加が、添加酵母生物とともに、ペレット中に濃縮されている高レベルのｈｇＤＮＡに起因するように思われる。ｈｇＤＮＡは、ＤＮＡ回収における公知の、磁気シリカビーズとの競合的阻害剤及びＰＣＲの非特異的阻害剤である。表３に示されるデータに基づき、またこれらのデータに基づき、ｉｔｉｓｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔディファレンシャル溶解緩衝液から得られたペレットが、ペレット中にそのように多いｈｇＤＮＡを有せず、結果として、全血対照の場合に、又はマトリックスを全く有しないＣＦＵ対照の場合であっても、より類似する酵母ＤＮＡのＣｐを有する。
【0244】
ここで図１１を参照すると、種々の量のＣＡＰＳ及びＢｒｉｊＯ１０を有する異なるディファレンシャル溶解緩衝液製剤（ＬＢ１８－ＬＢ２１）についてのデータを提示する。溶解緩衝液試験の場合、１０ｍｌの全血サンプルに、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、腸内細菌、又は酵母を添加し、本明細書に記載の方法に従い、指定のディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心分離処理を用いてサンプルを処理した。図１０に記載の通り、得られたペレットをＦＡＩＶに移し、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ ＢＣＩＤポーチでサンプルを実行した。ＷＢ対照は、図１０に記載されたものと同じであった。図１１に提示するデータは、ディファレンシャル溶解緩衝液が、宿主細胞（即ち、ＲＢＣ、白血球、血小板など）及び宿主細胞の核を効率的に溶解する一方で、微生物細胞を無傷で遠心分離によってペレット化可能な状態にすることを示す。
【0245】
本明細書で開示されるディファレンシャル溶解緩衝液を用いて、サンプル処理は、２つの単純なステップのみを含み、処理時間は、約１５分まで低減され得る。他の方法において一般的であるＤＮａｓｅステップは、核膜の有効な破壊が理由で、除かれてもよい。ディファレンシャル溶解緩衝液及びその後の遠心分離によって得られるペレットの体積は、好適に、＜２００μＬであってもよい。ＢｒｉｊＯ１０及びＣＡＰＳは、数秒又は数分以内に血球を完全に溶解した。実施例１で示された通り、この緩衝液は、扱いやすく、それ故、結果は、再現性がより高いことが求められる（図８）。微生物細胞を全血から迅速に濃縮することができ（図８）、サンプル中の微生物細胞を高い割合で回収することができ（図９及び表２）、ヒトゲノムＤＮＡを微生物ペレットから減少させることができ（図１０及び表３）、そして宿主細胞及び宿主細胞の核を有効に溶解する一方で、微生物細胞を無傷で遠心分離によって回収可能な状態にすることができる（図１１）。
【0246】
実施例２－低い添加レベル（＜１ＣＦＵ／ｍＬ）での種による微生物回収
先の実施例では、本明細書に記載のディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心濃縮器が、血液因子全部の溶解、微生物細胞の回収、次いで微生物の検出に使用可能であることが示された。本実施例は、実施例１に対して発展させ、添加全血から低いレベル（即ち、＜１ＣＦＵ／ｍＬ）で微生物を回収し、同定する能力について示す。血流感染（即ち、敗血症）の大部分の症例において、全血中の臨床的に関連する微生物レベルは、＜約１ＣＦＵ／ｍＬから最大で約１０ＣＦＵ／ｍＬに及ぶ。本実施例はまた、種ごとを基本に臨床的に関連するレベルで微生物を回収し、同定する能力について示す。
先の実施例では、本明細書に記載のディファレンシャル溶解緩衝液及び遠心濃縮器が、血液因子全部の溶解、微生物細胞の回収、次いで微生物の検出に使用可能であることが示された。本実施例は、実施例１に対して発展させ、添加全血から低いレベル（即ち、＜１ＣＦＵ／ｍＬ）で微生物を回収し、同定する能力について示す。血流感染（即ち、敗血症）の大部分の症例において、全血中の臨床的に関連する微生物レベルは、＜約１ＣＦＵ／ｍＬから最大で約１０ＣＦＵ／ｍＬに及ぶ。本実施例はまた、種ごとを基本に臨床的に関連するレベルで微生物を回収し、同定する能力について示す。
【0247】
本明細書に記載の血液処理方法から直接的に得られるものは、生物をライセートから回収するため、ペレットを溶解するステップ、遠心分離するステップ、及び排出するステップを有する複雑でないワークフローである。本実施例において、全血サンプルをディファレンシャル溶解緩衝液と混合し、溶解を約５分間進行させておき、ライセートを約３０００×ｇで約３０分間遠心分離し、微生物を回収した。本実施例で使用した溶解緩衝液を表４に示す。
【0248】
【表4】
【0249】
包括的試験パネルは、最も一般的に、血流感染物から単離された細菌及び酵母の１２種からの１２０の生物株を含んだ。収集された生物は、生存度を維持するだけでなく、血液デブリ及び汚染宿主ＤＮＡを低下したレベルで有し、成長に基づく分析と分子的分析の双方の様々な下流適用への入力としての潜在的使用を促進する。
【0250】
図１２は、この試験で用いられるワークフローを図示する。ステップ（ａ）及び（ｂ）では、適切な濃度（例えば、約１００ＣＦＵ／ｍｌ）の生物ストックは、生物ストックを所望の濃度が得られるまで連続希釈し、蒔くことによって得ることができる。濃度は、保存液を寒天プレート上に蒔き、個々のコロニーをプレート上で成長させることによって検証することができる。例えば、１００ＣＦＵ／ｍｌのストック５０μＬを蒔く場合、５コロニー／プレートを得る必要がある。ストック生物溶液は、数回希釈して蒔くことで、所望の濃度を得ることができる。ステップ（ｃ）では、ストック生物溶液（例えば、約１００ＣＦＵ／ｍＬ）を全血に添加した。図１２に図示の例では、１５０μＬの生物ストックを、３０ｍＬの全血に添加した。生物を＜１ＣＦＵ／ｍＬの濃度で添加することが望まれた。図１２に示す例では、標的添加濃度は、０．５ＣＦＵ／ｍＬであった。以下により詳細に説明する通り、添加は、グラム陰性生物、グラム陽性生物、及び酵母生物の間で変化した。添加全血を３つの１０ｍＬ画分に分割し、遠心濃縮器内で２０ｍＬのＬＢ１００緩衝液と組み合わせ、室温で５分間溶解させておいた。ステップ（ｄ）～（ｆ）。図１２に図示する具体的な例では、血液及び溶解緩衝液を、遠心濃縮器のチューブ内で１０回反転させ、ＲＴで５分間インキュベートし、約５秒間ボルテックスし、次に３０００×ｇで３０分間、スイングバケット遠心ローターで遠心分離した。
【0251】
遠心分離後、遠心濃縮器からのペレットを、５００μＬのＴＳＢ（トリプトソイブロス）に排出し（ステップ（ｇ））、１００μＬを、５つの寒天プレートのそれぞれに蒔いた（ステップ（ｈ））。プレートを、３７℃で２４時間インキュベートし（ステップ（ｉ））、５つのプレートからのＣＦＵを添加し、全回収率を得た（ステップ（ｊ））。本実施例において、プレーティング及び培養を生物の検出のために用いる一方で、種々の異なるタイプの検出のため、ワークフローを用いることができた。例えば、限定はされないが、ＰＣＲ（例えば、本明細書で詳細に考察される通り、ＦｉｌｍＡｒｒａｙシステムによる）、全ゲノム配列決定、又は分子ＡＳＴなどの分子検出技術を用いることができた。表現型（例えば、Ｖｉｔｅｋ２ ＡＳＴ）、プロテオミクス（例えば、ｍａｌｄｉ－ＴＯＦ、Ｖｉｔｅｋ ＭＳなど）、及び顕微鏡技術を用いて、遠心濃縮器から得られるペレットを調査してもよい。
【0252】
この研究試験の結果を以下にまとめる。
【0253】
グラム陰性、グラム陽性、及び酵母といった全ての生物におけるパーセント回収率を、下の表５に示す。この試験における平均全回収率は、８０％であり、それは＞７０％の標的目標を超えた。
【0254】
【表5】
【0255】
図１３は、生物による回収率の中で、一部可変性が認められたが、全ての生物を回収及び培養できたことを図示する。図１３において明らかなように、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株の回収率が、この試験において低かった。グラム陽性種の回収率は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株が除外されると、９５％に上昇し、全回収率が８４％に上昇する。さらなる方法の最適化、例えば、ｐＨ、接触時間、補充により、この種の回収率が改善され得る。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株が、溶解緩衝液からの回収後、（他の生物と比較して）生存可能性がより低いことや、生存可能生物に依存しない検出技術（例えば、分子的技術）が検出に使用された場合、それらの見かけ上低い相対回収率が上昇したことも考えられる。
【0256】
全ての生物、グラム陰性、グラム陽性、及び酵母におけるＣＦＵによるパーセント回収率を、下の表６に示す。
【0257】
【表6】
【0258】
全ての生物における測定された入力接種レベルは、５ＣＦＵ／１０ｍＬの標的よりやや高かった。にもかかわらず、全血から＜１ＣＦＵ／ｍＬの回収及び検出を達成する目標の全てが満たされた。図１４は、生物ごとに基づく表６のデータを展開したものである。
【0259】
表７（下記）は、汚染宿主ＤＮＡの減少を示す。
【0260】
【表7】
【0261】
宿主ＤＮＡの平均で９９．７％の減少が、排出ペレット中の宿主ＤＮＡに対するライセート中の血液１０ｍＬの入力ＤＮＡ濃度から計算された。示される範囲は、１５の異なる血液ドナー及び試験日にわたる変動を反映する。
【0262】
包括的な生物のパネルの場合、この試験は、全血からの低い添加レベル（即ち、＜１ＣＦＵ／ｍＬ）での回収率を示した。この試験における回収及び検出感度は、従来の血液培養物の感度と同等である（４～８ＣＦＵ／１０ｍＬ）。ＣＡＰＳ－Ｂｒｉｊ溶解緩衝液は、ヒト血球膜、ＲＢＣ及びＷＢＣを溶解及び可溶化する。ＣＡＰＳ－Ｂｒｉｊ溶解緩衝液はまた、排出ペレット中の血球細片及びＤＮＡを減少させた。その処理方法により、生存可能な生物が濃縮及び収集され、血液デブリ及び宿主ＤＮＡのレベルが有意に低下し、複数の迅速な診断経路にとって潜在的に好適なサンプルが提供される。
【0263】
実施例３－全血の溶解及び回収後の微生物細胞の培養
本実施例において、異なるディファレンシャル溶解緩衝液組成物を、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ ＢＣＩＤアッセイポーチ内での検出のため、比較した。この比較において、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、及びＳ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）といった３つの生物のみを使用した。この試験では、ＡＣＤ（抗凝固剤のクエン酸デキストロース）抗凝固剤の血液を使用した。この試験は、（１）本願に記載されるディファレンシャル溶解緩衝液／遠心分離の手順により、細胞を濃縮し、全ての緩衝液組成物及び生物を試験することができること、そして（２）遠心分離後の培養により、血液及び溶解緩衝液から単離された生物の細胞を濃縮し、全ての選択的溶解緩衝液組成物を試験できることを示す。試験される全ての選択的溶解緩衝液は、微生物細胞を無傷及び生存可能な状態にする一方で、血球を溶解することができる。
本実施例において、異なるディファレンシャル溶解緩衝液組成物を、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ ＢＣＩＤアッセイポーチ内での検出のため、比較した。この比較において、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、及びＳ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）といった３つの生物のみを使用した。この試験では、ＡＣＤ（抗凝固剤のクエン酸デキストロース）抗凝固剤の血液を使用した。この試験は、（１）本願に記載されるディファレンシャル溶解緩衝液／遠心分離の手順により、細胞を濃縮し、全ての緩衝液組成物及び生物を試験することができること、そして（２）遠心分離後の培養により、血液及び溶解緩衝液から単離された生物の細胞を濃縮し、全ての選択的溶解緩衝液組成物を試験できることを示す。試験される全ての選択的溶解緩衝液は、微生物細胞を無傷及び生存可能な状態にする一方で、血球を溶解することができる。
【0264】
試験される緩衝液を、下の表８に列記する。
【0265】
【表8】
【0266】
ＬＢ２０は、表１に列記される緩衝液であり、実施例２に記載の試験において使用した緩衝液である。
【0267】
表９中のデータは、アルカリ溶解／遠心分離方法のクロッシングポイント（Ｃｐ）における非濃縮の添加全血に対する改善を示す。Ｃｐの改善は、ＰＣＲに干渉する物質（例えば、ヘモグロビン）の除去及びサンプル中の細胞の濃縮に起因する可能性が高い。
【0268】
【表9】
【0269】
緩衝液ＬＢ１６、ＬＢ１９、及びＬＢ２０の場合、見かけ上の濃縮は、約８倍であり、ＬＢ１００における濃縮は、約２．５倍であった。１サイクルのＣｐの改善は、標的細胞又は鋳型ＤＮＡの入力濃度において、約２倍の増加を表し、２サイクルのＣｐの改善は、約４倍の増加を表し、３サイクルのＣｐの改善は、約８倍の増加を表す、といった具合である（ｎサイクルのＣｐの改善が、標的細胞又は鋳型ＤＮＡの入力濃度において、約２ｎ倍の増加を表すといった一般式による）。
【0270】
表１０中のデータは、遠心濃縮器から収集されたペレットの培地での３時間の培養をもたらすようなＣｐの改善を示す。１５０ｕＬのＢＨＩ培養液を、遠心濃縮器からのペレットと混合し、３７℃で０時間又は３時間インキュベートした。表１０に示されるＣｐの改善は、３時間の培養において認められた、０時間培養されたサンプルに対するＣｐの平均低下（即ち、検出までの時間の短縮）を表す。
【0271】
【表10】
【0272】
細胞の３時間の培養により、ＬＢ１６からの細胞が、ＬＢ１９及びＬＢ２０の場合に約２倍、約１２倍、そしてＬＢ１００の場合に約８倍濃縮された。
【0273】
図２２は、ＡＣＤ抗凝固剤の血液及びＳＰＳ抗凝固剤の血液から回収された生物における溶解及び遠心分離後の培養を比較する別の実験を図示する。この試験は、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して実施した。ＬＢ２０での溶解及び遠心分離による細胞の回収の後、１５０ｕＬのＢＨＩ培養液を、遠心濃縮器からのペレットと混合し、３７℃で０時間又は３時間インキュベートした。図２２に示されるＣｐの改善は、３時間の培養において認められた、０時間培養されたサンプルに対するＣｐの平均低下（即ち、検出までの時間の短縮）を表す。
【0274】
この試験では、ＡＣＤ血液からの細胞が、３時間又は３７℃での培養後に約５．５のＣｐの改善を示し、ＳＰＳ血液から回収された細胞が、３時間又は３７℃での培養後に約３のＣｐの改善を示した。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）における改善は、最も劇的であった。細菌よりも緩徐に成長する、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）は、ＡＣＤ血液において約１のＣｐだけ改善し、実際に、ＳＰＳ血液において性能がややより不良であった。この試験では、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）について、ＡＣＤ性能データは得られなかった。この試験では、特定の抗凝固剤が、いくつかの生物における成長及び培養可能性に影響し得ることが例示される。この試験における全ての生物の場合、ＡＣＤは、ＳＰＳと比較して、成長及び培養可能性に対してあまり有害でないように思われた。
【0275】
実施例３－フロースルー溶解、培養、及び体積減少システム
本明細書で考察される他の装置に加えて、又はそれらと組み合わせて、フロースルーシステムは、細胞溶解、培養、及び体積減少のため、使用することができる。そのようなシステム１５００の一例の模式図を図１５に図示する。フロースルーシステム１５００は、３つの隣接する緩衝液チャンバー１５０２、１５０６、及び１５１０を含み、それぞれが、第１緩衝液１５０４、及び第２緩衝液１５０８、及び第３緩衝液１５１２を含む。システム１５００は、チャネル１５１４（例えば、緩衝液チャンバー１５０２、１５０６、及び１５１０のそれぞれの中の緩衝液１５０４、１５０８、及び１５１２と接触状態である緩衝液交換膜のチューブ又は開放トラフをさらに含む。一実施形態では、第１緩衝液１５０４、第２緩衝液１５０８、及び第３緩衝液１５１２は、微生物細胞を培養するための選択的溶解緩衝液、培地又は栄養ブロス（例えば、細菌生物、真菌生物を培養するための栄養ブロス、又は細菌及び真菌生物の両方を培養するのに適する培養液）、並びにサンプル体積を減少させるための高張液／培地から構成されてもよい。一実施形態では、システム１５００はまた、例えば、選択的溶解、微生物の培養、及び体積減少を増強するため、第１緩衝液１５０４、第２緩衝液１５０８、及び第３緩衝液１５１２の温度を（個別に又はグループとして）調節及び制御することができる温度制御システム（図示されない）を含んでもよい。例えば、選択的溶解は、室温で実施されてもよく、微生物の培養は、３２～３７℃で実施されてもよく、且つ体積減少は、４℃で実施されてもよい。チャネル１５１４内に配置されたサンプル（例えば、全血サンプル）を、緩衝液１５０４、１５０８、及び１５１２のそれぞれに任意の所与の順序で、又は２つ以上の緩衝液チャンバーに同時に選択的に曝露させ、例えば、血球溶解、微生物細胞の培養、及びサンプル体積減少／濃縮を達成することができる。
本明細書で考察される他の装置に加えて、又はそれらと組み合わせて、フロースルーシステムは、細胞溶解、培養、及び体積減少のため、使用することができる。そのようなシステム１５００の一例の模式図を図１５に図示する。フロースルーシステム１５００は、３つの隣接する緩衝液チャンバー１５０２、１５０６、及び１５１０を含み、それぞれが、第１緩衝液１５０４、及び第２緩衝液１５０８、及び第３緩衝液１５１２を含む。システム１５００は、チャネル１５１４（例えば、緩衝液チャンバー１５０２、１５０６、及び１５１０のそれぞれの中の緩衝液１５０４、１５０８、及び１５１２と接触状態である緩衝液交換膜のチューブ又は開放トラフをさらに含む。一実施形態では、第１緩衝液１５０４、第２緩衝液１５０８、及び第３緩衝液１５１２は、微生物細胞を培養するための選択的溶解緩衝液、培地又は栄養ブロス（例えば、細菌生物、真菌生物を培養するための栄養ブロス、又は細菌及び真菌生物の両方を培養するのに適する培養液）、並びにサンプル体積を減少させるための高張液／培地から構成されてもよい。一実施形態では、システム１５００はまた、例えば、選択的溶解、微生物の培養、及び体積減少を増強するため、第１緩衝液１５０４、第２緩衝液１５０８、及び第３緩衝液１５１２の温度を（個別に又はグループとして）調節及び制御することができる温度制御システム（図示されない）を含んでもよい。例えば、選択的溶解は、室温で実施されてもよく、微生物の培養は、３２～３７℃で実施されてもよく、且つ体積減少は、４℃で実施されてもよい。チャネル１５１４内に配置されたサンプル（例えば、全血サンプル）を、緩衝液１５０４、１５０８、及び１５１２のそれぞれに任意の所与の順序で、又は２つ以上の緩衝液チャンバーに同時に選択的に曝露させ、例えば、血球溶解、微生物細胞の培養、及びサンプル体積減少／濃縮を達成することができる。
【0276】
一実施形態では、微生物細胞を含む全血サンプル（例えば、敗血症を有することが疑われる対象からの全血サンプル）を、チャネル１５１４に添加してもよく、それにより血液サンプルを緩衝液１５０４、１５０８、及び１５１２のそれぞれに選択的に曝露させることができる。緩衝液交換膜は、当該技術分野で広く知られている。好適な緩衝液交換膜は、微生物細胞が保持されながら、血球細片、ヘモグロビン、及び血球溶解の他の産物が膜を通じて拡散できるように選択してもよい。例えば、緩衝液交換膜は、透析膜であってもよい。透析膜は、例えば、１キロダルトン（ｋＤａ）～約１ＭＤａ（即ち、１メガダルトン、又は約１０００，０００Ｄａ）の範囲の異なる分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するように、作製し、特徴づける。ＭＷＣＯの決定は、透析膜の作製中に作られる孔の数及び平均サイズの結果である。ＭＷＣＯは、典型的に、拡張透析時に膜を通じて有効に拡散することがない標準分子の最小平均分子量を指す。しかし、膜のＭＷＣＯが、明確に定義された値でないことを認めることは重要である。膜のＭＷＣＯに近い質量を有する分子は、ＭＷＣＯより有意に小さい分子より遅く膜を通じて拡散することになる。分子が膜を通じて急速に拡散するように、典型的に、それは膜のＭＷＣＯの格付けよりも少なくとも２０～５０倍小さい必要がある。実験室使用における透析チューブは、典型的に、再生セルロース又はセルロースエステルのフィルムで製作される。しかし、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、エッチングポリカーボネート、又はコラーゲン製の透析膜も、特定の医療、食品、又は水処理の用途に広範に使用されている。
【0277】
微生物細胞が比較的大きく、細胞片が比較的小さいことから、チャネル１５１４はまた、濾過膜材料から製作してもよい。細菌及びより大きい細胞を溶液から濾過するように設計された膜材料は、当該技術分野で周知である。例えば、０．２５～１μｍ（例えば、０．５μｍ）の名目上の孔径を有する濾過膜を使用し、微生物細胞をチャネル１５１４内に保持することができる一方で、チャネル１５１４内のサンプルを緩衝液１５０４、１５０８、及び１５１２と急速に交換することを可能にする。
【0278】
図１５を参照すると、チャネル１５１４内に配置されたサンプル（例えば、全血サンプル）は、図１５Ａ中の１５１６に示す通り、最初にチャンバー１５０２内の緩衝液１５０４に曝露させてもよい。次に、図１５Ｂ中の１５１８に示す通り、サンプルを、チャンバー１５０６内の緩衝液１５０８に曝露されるように移動させてもよく、次に、図１５Ｃ中の１５２０に示す通り、サンプルを、チャンバー１５１０内の緩衝液１５１２に曝露されるように移動させてもよい。図１５Ａ～１５Ｃが、サンプルが一方の緩衝液チャンバーからもう一方に経時的に移動され、サンプルが各緩衝液に順に曝露されることを示す一方で、サンプルが、例えば、緩衝液に２回以上曝露されるように、２つ以上緩衝液に同時に曝露されるように、前後に移動することができることが理解されるであろう。同様に、緩衝液１５０４、１５０８、及び１５１２は、任意の所与の順序で準備されてもよい。表１１は、その選択肢の一部を例示する。
【0279】
【表11】
【0280】
そして、本実施例では、微生物細胞の培養、及びサンプル体積の減少のそれぞれについて、選択的溶解緩衝液、培地、及び溶解のための高張液を用いて考察する一方で、当業者は、これら緩衝液が単に例示的であり、且つ他の緩衝液をシステム１５００で使用してもよいことは理解するであろう。同様に、システム１５００が３つの緩衝液タンクを含む一方で、これが単に例示的である。システム１５００の代替バージョンは、より多い緩衝液又はより少ない緩衝液を含んでもよい。さらに、チャネル１５１４を線状チャネルとして示す一方で、これは単に例示的である。チャネル１５１４は、例えば、緩衝液に曝露されるサンプルの表面積を最大化するため、当該技術分野で公知の遠回り流路又は他の修飾を含んでもよい。
【0281】
一実施形態では、高張培地は、サンプル中の微生物を濃縮し、（例えば、ＰＣＲ技術、全ゲノム配列決定、又は分子ＡＳＴ、表現型技術、プロテオミクス技術、及び顕微鏡技術による）同定を可能にするのに十分であり得る。他の実施形態では、濾過技術を濃度／体積減少に用いてもよい。濾過は、サンプルの選択的溶解緩衝液、培地、及び高張液への曝露の１つ以上の前又は後に実施してもよい。別の実施形態では、遠心分離技術を用いて、サンプル中の微生物を濃縮してもよい。遠心分離は、サンプルの選択的溶解緩衝液、培地、及び高張液への曝露の１つ以上の前又は後に実施してもよい。
【0282】
実施例４－濾過技術
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、微生物細胞のそれらの環境からの分離（例えば、細菌及び／又は真菌細胞の全血サンプルからの分離）は、濾過によって実施することができる。濾過技術は、選択された細胞又は細胞サイズを保持する又は通過させるように設計してもよい。例えば、血液細胞（例えば、赤血球、白血球、血小板など）を捕捉してもよい一方で、微生物細胞を通過させてもよく、微生物細胞を捕捉してもよく、又は濾過媒体の組み合わせを用いて、濾過装置の異なる段階で大細胞及び小細胞を選択的に捕捉してもよい。また、ディファレンシャル濾過技術を利用し、より大きい細胞及びより小さい細胞を異なる画分に分離してもよい。例えば、異なる名目上の孔径を有する濾過膜は、選択されたサイズ範囲を有する細胞を通過させ、且つ／又は捕捉するため、積層（又は一連の別々の容器内で使用）してもよい。また、フローサイトメトリーは、細胞をサイズによって選別することができる周知の技術である。細胞はまた、活性濾過技術によって捕捉又は濃縮されてもよい。例えば、大部分の細胞型は、当該技術分野で周知の技術による親和性精製において使用可能である特定の表面因子（例えば、タンパク質）を有する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、微生物細胞のそれらの環境からの分離（例えば、細菌及び／又は真菌細胞の全血サンプルからの分離）は、濾過によって実施することができる。濾過技術は、選択された細胞又は細胞サイズを保持する又は通過させるように設計してもよい。例えば、血液細胞（例えば、赤血球、白血球、血小板など）を捕捉してもよい一方で、微生物細胞を通過させてもよく、微生物細胞を捕捉してもよく、又は濾過媒体の組み合わせを用いて、濾過装置の異なる段階で大細胞及び小細胞を選択的に捕捉してもよい。また、ディファレンシャル濾過技術を利用し、より大きい細胞及びより小さい細胞を異なる画分に分離してもよい。例えば、異なる名目上の孔径を有する濾過膜は、選択されたサイズ範囲を有する細胞を通過させ、且つ／又は捕捉するため、積層（又は一連の別々の容器内で使用）してもよい。また、フローサイトメトリーは、細胞をサイズによって選別することができる周知の技術である。細胞はまた、活性濾過技術によって捕捉又は濃縮されてもよい。例えば、大部分の細胞型は、当該技術分野で周知の技術による親和性精製において使用可能である特定の表面因子（例えば、タンパク質）を有する。
【0283】
ディファレンシャル濾過システムの例を、図１６に図示する。敗血症を有することが疑われる対象からの全血サンプルを、微生物細胞のため、最初に全血サンプルを、８～１５μｍ（例えば、１０μｍ）の孔径を有する大きいフィルターを通過させ、白血球（ＷＢＣ）及び一部の赤血球のような大細胞を濾過除去することによって濃縮してもよい。微生物細胞であれば、第１のフィルターをフロースルーすることになる。一実施形態では、Ｂｒｉｊ洗剤の半溶解性レベル（例えば、＜０．１％）を用いるならば、ＷＢＣの外側に付着したあらゆる微生物細胞が放出され、フィルターによって捕捉されるＷＢＣ上の微生物細胞の捕捉が減少することを保証することができる。他の洗剤は、好適に、他の半溶解性濃度レベル、即ち、一般に０．１％～１％を有してもよい。より小さい孔径（例えば、５μｍ）を有する第２のフィルターをタンデムで使用し、より多くのヒト細胞を除去する一方で、濾液中の微生物細胞について濃縮することができる。１μｍ未満（例えば、０．４５μｍ）の孔径を有する最終フィルターを使用し、全ての微生物細胞を捕捉し、サンプルの体積を有意に低減することができる。フィルターで濃縮された微生物細胞を、同定及び診断（例えば、代謝過程、又は代謝消費、伝導度、ｐＨなどのＦｉｌｍＡｒｒａｙ、イメージング、光学的蛍光による分子的同定）のため、直接的に使用することができ、サンプルを培養し（例えば、１～３時間）、サンプル中の微生物細胞の数を増加させることができ、又は本明細書に記載の通り、それらが、動物細胞（例えば、ヒト細胞）をさらに除去するためのアルカリ溶解、遠心分離、及び分子的同定を受けることができる。
【0284】
別の実施形態では、濾過を用いて、ここに記載のアルカリ／Ｂｒｉｊ緩衝液による選択的溶解（即ち、アルカリ溶解）後、細胞を回収することができる。しかし、濾過前にサンプルの粘度を低減するため、プロテイナーゼＫ処理が必要であることが見出された。これに関連して、アルカリ／Ｂｒｉｊ選択的溶解緩衝液を全血に添加し、５分間インキュベートした。５分後、１ｍＬの３０単位／ｍＬのプロテイナーゼＫを添加し、ＲＴで約５分間インキュベートした。次に、ライセートを、０．４５μｍのフィルターを通して濾過することができた。先行する実施例と同様、例えば、フィルターで濃縮された微生物細胞を、同定及び診断のため、直接的に使用することができ、それらを培養し（例えば、１～３時間）、サンプル中の微生物細胞の数を高めることができる。
【0285】
上記の従来の濾過技術に加えて、様々なタイプの構造を用いる濾過技術により、サンプル中の特定の細胞型を選択的に濃縮することを用いてもよい。そのような濾過技術は、目的の微生物細胞を血液細胞から濃縮又は単離し、体積及び阻害剤を減少させるため、従来の濾過の代わりに、又は通常の濾過と組み合わせて用いてもよい。そのような濃縮又は単離された微生物細胞は、培養細胞（ｃｕｌｔｕｒｅ ｃａｌｌｓ）（従来の血液培養と類似するが、サンプル中の微生物細胞が濃縮されることから、より迅速である可能性が高い）、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ同定、又は他の調査技術に従ってもよい。さらなる願望は、細菌細胞が、プロセスを顧客にとってより経済的にすること（例えば、代謝過程、又は代謝消費、伝導度、又はｐＨのイメージング、光学的蛍光のようなより安価な検査）に寄与する可能性が高いことを確認することである。
【0286】
特定の細胞を濃縮するために使用可能である様々な濾過技術を、図１７～２０に図示する。図１７Ａは、ｗｅｉｒフィルターを図示し、図１７Ｂは、マイクロピラーフィルターを図示し、そして図１７Ｃは、クロスフローフィルターを図示する。これらの構造周囲のより大きい細胞及びより小さい細胞のディファレンシャルフローを用いて、より大きい細胞からより小さい細胞を分離することができる。図１８は、ピラーフィルターの異なるタイプ：（１８Ａ）多角形、（１８Ｂ）Ｕ字形、及び（１８Ｃ）蝶形のマイクロピラー形状を模式的に図示する。より大きい細胞は、トラップ構造で固定化される一方、より小さい細胞は、通過する。図１８Ｂはまた、マイクロピラー（ｍｉｃｏｐｉｌｌａｒｓ）が、特定の細胞のマイクロピラー構造の通過を選択的に遅延させるために、構造的特徴（形、ポケットなど）によって形成され得るという概念を模式的に図示する。
【0287】
図１７及び図１８がこれらの構造のそれぞれを１セットのみ示す一方で、そのような構造（及び流れ方向）は、連続的に、そして組み合わせで用いて、高レベルの分離を達成することができる。図１９及び図２０は、この原理を図示する。図１９は、緩衝液及び細胞懸濁液の一連のマイクロピラー（ｍｉｃｏｐｉｌｌａｒｓ）及びクロスフローを有する構造内での大細胞及び小細胞の分離を図示する。図１９の構造は、決定的な側方変位によって大細胞及び小細胞を分離する。大細胞は、流体チャネルにおけるマイクロポストの改変されたサイズ及び間隔に起因し、流線的に小細胞から離れて移動する。図２０は、卵形フィルターユニットに沿った移動による大細胞及び小細胞の濃縮を模式的に図示する。フィルターユニットは、ギャップより大きい大細胞、及びギャップより小さい小細胞の同時分離を達成する。濾液の剪断層によって誘導される、比較的低い速度でのピラーに沿った回転は、大きい粒子の目詰まりを防止することに役立つ。図１９及び図２０におけるシステムは、１つのシステム内でのライセートの除去、緩衝液交換、及び成長用培地の添加に用いてもよいシステムの例である。即ち、分離を開始するためにライセートを流入させてもよく、ライセートを流出させるために緩衝液を添加してもよく、そして培地を添加してもよい。本明細書に記載の遠心濃縮器に加えて、又はそれの代わりに、好適に、濾過濃縮器、マイクロ流体濃縮器、誘電泳動濃縮器、ＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）、又は他の類似装置を使用してもよい。選択的溶解の利益は、好適に、それが濾過濃縮器機構を簡素化でき、又はそれらがファウリング前により多くの量を処理することを可能にすることであってもよい。
【0288】
化学、濾過、遠心分離、及び同定（例えば、限定はされないが、代謝過程、又は代謝消費、伝導度、又はｐＨのイメージング、光学的蛍光などの分子同定又は別の技術）の１つ以上を含んでもよいワークフロー。
経路１：アルカリ／Ｂｒｉｊ緩衝液による選択的溶解、濃縮及び培養のため、ライセートをマイクロ流体チップに移す、検出及び同定のためのＦｉｌｍＡｒｒａｙ
１．ヒト細胞をアルカリ／Ｂｒｉｊ選択的溶解緩衝液によって選択的に溶解する
２．遠心分離、濾過装置、又はマイクロ流体チップ設計の１つ以上による微生物細胞について濃縮する
ａ．選別技術（能動（例えば、フローサイトメトリー）又は受動（ｗｅｉｒ濾過、マイクロピラー（ｍｉｃｏｐｉｌｌｅｒ）濾過、又はそれらの組み合わせ）
ｂ．捕捉技術（能動又は受動）
ｃ．濾過技術（通常は受動であるが、能動の可能性がある）
３．成長用培地で流す
ａ．いくつかの実施形態では、遠心分離、濾過、マイクロ流体分離、又はそれらの組み合わせを、１つのシステム内でのライセートの除去、緩衝液交換、及び成長用培地の添加に用いてもよい
ｂ．いくつかの実施形態では、微生物細胞の陽性検出のためのさらなるセンシング技術が加えられてもよい
ｉ．イメージング
ｉｉ．代謝過程、又は代謝消費の光学的蛍光
ｉｉｉ．伝導度
ｉｖ．ｐＨ
ｖ．マイクロ共振器
ｖｉ．誘電泳動
ｖｉｉ．静電容量センシング
ｖｉｉｉ．ＳＰＲ
ｉｘ．ＦＬＩＲ
４．ＦｉｌｍＡｒｒａｙ分析、培養、又は他の確証的プロセスのため、マイクロ流体装置から細胞を放出する
経路２：選別／濃縮及び培養の双方、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ、又は検出用の他の確証的プロセスのため、マイクロ流体チップ／選択的濾過を使用する
１．ヒト血液細胞から微生物細胞を選択的に選別する
ａ．能動選別
ｉ．フローサイトメトリー（蛍光活性化又は光学的検出）
ｉｉ．誘電泳動（ＤＥＰ）選別
ｉｉｉ．空気圧選別
ｂ．受動選別
ｉ．サイズ選別
ｉｉ．慣性選別
ｉｉｉ．誘電体トラップ
ｉｖ．選択的タンパク質接着プロセス
ｖ．音響トラップ
ｖｉ．剪断勾配における粘弾性（又は細胞硬度）選別
２．成長用培地で流す
ａ．いくつかの実施形態では、遠心分離、濾過、マイクロ流体分離、又はそれらの組み合わせを、１つのシステム内でのライセートの除去、緩衝液交換、及び成長用培地の添加に用いてもよい
ｂ．いくつかの実施形態では、微生物細胞の陽性検出のためのさらなるセンシング技術が加えられてもよい
ｉ．イメージング
ｉｉ．代謝過程、又は代謝消費の光学的蛍光
ｉｉｉ．伝導度
ｉｖ．ｐＨ
ｖ．マイクロ共振器
ｖｉ．誘電泳動
ｖｉｉ．静電容量センシング
ｖｉｉｉ．ＳＰＲ
ｉｘ．ＦＬＩＲ
４．ＦｉｌｍＡｒｒａｙ分析、培養、又は他の確証的プロセスのため、マイクロ流体装置から細胞を放出する
経路１：アルカリ／Ｂｒｉｊ緩衝液による選択的溶解、濃縮及び培養のため、ライセートをマイクロ流体チップに移す、検出及び同定のためのＦｉｌｍＡｒｒａｙ
１．ヒト細胞をアルカリ／Ｂｒｉｊ選択的溶解緩衝液によって選択的に溶解する
２．遠心分離、濾過装置、又はマイクロ流体チップ設計の１つ以上による微生物細胞について濃縮する
ａ．選別技術（能動（例えば、フローサイトメトリー）又は受動（ｗｅｉｒ濾過、マイクロピラー（ｍｉｃｏｐｉｌｌｅｒ）濾過、又はそれらの組み合わせ）
ｂ．捕捉技術（能動又は受動）
ｃ．濾過技術（通常は受動であるが、能動の可能性がある）
３．成長用培地で流す
ａ．いくつかの実施形態では、遠心分離、濾過、マイクロ流体分離、又はそれらの組み合わせを、１つのシステム内でのライセートの除去、緩衝液交換、及び成長用培地の添加に用いてもよい
ｂ．いくつかの実施形態では、微生物細胞の陽性検出のためのさらなるセンシング技術が加えられてもよい
ｉ．イメージング
ｉｉ．代謝過程、又は代謝消費の光学的蛍光
ｉｉｉ．伝導度
ｉｖ．ｐＨ
ｖ．マイクロ共振器
ｖｉ．誘電泳動
ｖｉｉ．静電容量センシング
ｖｉｉｉ．ＳＰＲ
ｉｘ．ＦＬＩＲ
４．ＦｉｌｍＡｒｒａｙ分析、培養、又は他の確証的プロセスのため、マイクロ流体装置から細胞を放出する
経路２：選別／濃縮及び培養の双方、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ、又は検出用の他の確証的プロセスのため、マイクロ流体チップ／選択的濾過を使用する
１．ヒト血液細胞から微生物細胞を選択的に選別する
ａ．能動選別
ｉ．フローサイトメトリー（蛍光活性化又は光学的検出）
ｉｉ．誘電泳動（ＤＥＰ）選別
ｉｉｉ．空気圧選別
ｂ．受動選別
ｉ．サイズ選別
ｉｉ．慣性選別
ｉｉｉ．誘電体トラップ
ｉｖ．選択的タンパク質接着プロセス
ｖ．音響トラップ
ｖｉ．剪断勾配における粘弾性（又は細胞硬度）選別
２．成長用培地で流す
ａ．いくつかの実施形態では、遠心分離、濾過、マイクロ流体分離、又はそれらの組み合わせを、１つのシステム内でのライセートの除去、緩衝液交換、及び成長用培地の添加に用いてもよい
ｂ．いくつかの実施形態では、微生物細胞の陽性検出のためのさらなるセンシング技術が加えられてもよい
ｉ．イメージング
ｉｉ．代謝過程、又は代謝消費の光学的蛍光
ｉｉｉ．伝導度
ｉｖ．ｐＨ
ｖ．マイクロ共振器
ｖｉ．誘電泳動
ｖｉｉ．静電容量センシング
ｖｉｉｉ．ＳＰＲ
ｉｘ．ＦＬＩＲ
４．ＦｉｌｍＡｒｒａｙ分析、培養、又は他の確証的プロセスのため、マイクロ流体装置から細胞を放出する
【0289】
本発明は、他の具体的形態において、その精神又は本質的特徴から逸脱することなく、例示されてもよい。記載される実施形態は、単に例示的であり、限定的でないものとして、あらゆる観点で解釈されるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明でなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特定の実施形態及び詳細が、本発明を例示する目的で、本明細書及び添付の発明開示に含まれている一方で、本明細書で開示される方法及び装置における様々な変更が、添付の特許請求の範囲内で定義される、本発明の範囲から逸脱せずになされてもよいことは、当業者にとって明らかであろう。特許請求の範囲と同等の意味及び範囲内でなされる全ての変更は、その範囲内に包含されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【国際調査報告】