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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-12
(54)【発明の名称】キシラナーゼ変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 9/24 20060101AFI20240104BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240104BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240104BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240104BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240104BHJP
C12P 19/14 20060101ALI20240104BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240104BHJP
C12N 15/56 20060101ALN20240104BHJP
【ＦＩ】
C12N9/24 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P19/14 A
C07K19/00
C12N15/56
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023538842
(86)(22)【出願日】2021-12-23
(85)【翻訳文提出日】2023-08-21
(86)【国際出願番号】 FI2021050911
(87)【国際公開番号】W WO2022144500
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】20217335.7
(32)【優先日】2020-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521443106
【氏名又は名称】アーベー エンジュメス オサケ ユキチュア
(74)【代理人】
【識別番号】110001896
【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パロヘイモ、マルヤ
(72)【発明者】
【氏名】ユントゥネン、カリ
(72)【発明者】
【氏名】トゥルネン、オッシ
(72)【発明者】
【氏名】アホラ、ピヒラ
(72)【発明者】
【氏名】タイパルス、パシ
(72)【発明者】
【氏名】ミューラー、エウゲン
(72)【発明者】
【氏名】サヴォライネン、ユッカ
(72)【発明者】
【氏名】ラングフェルダー、キム
(72)【発明者】
【氏名】プラネン、テルヒ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AF02
4B064AF04
4B064CA19
4B064CB07
4B064CC24
4B064CD22
4B064DA10
4B065AA05Y
4B065AA70X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC15
4B065BA01
4B065BC01
4B065BD15
4B065CA31
4B065CA41
4B065CA43
4B065CA55
4H045AA10
4H045BA41
4H045CA10
4H045DA89
4H045EA01
4H045EA07
4H045FA74
(57)【要約】
キシラナーゼの変異体ポリペプチド、ならびにその変異体ポリペプチドを含む融合タンパク質および酵素組成物、その変異体ポリペプチドの産生のための組換え宿主細胞、それを使用するための方法およびその使用が開示され、その変異体ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１９１と７９％以上１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、１～１９１のアミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間に少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、を有する、変異体ポリペプチド。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸１～１９１と７９％以上１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、
前記１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、および
２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、
を有する、変異体ポリペプチド。
【請求項2】
前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸１～１９１と８４％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８６％以上、より好ましくは８７％以上、より好ましくは８８％以上、さらにより好ましくは８９％以上、最も好ましくは９０％以上１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項3】
前記変異体ポリペプチドが、配列番号１の３位および３０位に対応する位置である残基３Ｃおよび３０Ｃを含み、前記変異体ポリペプチドの前記ジスルフィド架橋が、前記残基３Ｃと３０Ｃとの間に形成されている、請求項１または２に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項4】
Ａ２３、Ｓ２３もしくはＳ２８、またはＡ２３もしくはＳ２３およびＳ２８に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項5】
Ｈ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、ＷまたはＹへの２３位のアミノ酸の置換；またはＩ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹへの２８位のアミノ酸の置換；または
それらの任意の組み合わせ
を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項6】
前記変異体ポリペプチドが、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較して改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項7】
請求項１～６に記載の変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と、分泌シグナル配列を提供するアミノ酸配列；
精製を容易にするアミノ酸配列、例えば、アフィニティタグまたはＨｉｓタグ；
前記組換えポリペプチドの産生を制御および増強するアミノ酸配列、例えば、キャリアポリペプチド；
プロテアーゼ切断部位をコードするアミノ酸配列；
酵素活性を有するアミノ酸配列；および／または
結合親和性を有する融合タンパク質を提供するアミノ酸配列、例えば、糖質結合部分
のうちの少なくとも１つと
を含む、融合タンパク質。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチドまたは請求項７に記載の融合タンパク質を含む、酵素組成物。
【請求項9】
ａ．ポリオール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセロール、糖、糖アルコール、多糖、乳酸、ペプチド、界面活性剤またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの安定剤；あるいは有機酸、クエン酸、アスコルビン酸、安息香酸ならびにそれらの塩および誘導体、安息香酸ナトリウム、ベンゾエート、ヒドロキシベンゾエートおよび誘導体、ホスフェート、ソルビン酸、ソルビン酸ナトリウム、ソルベート、塩、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、１，２－ベンゾイソチアゾリン－３－オン（ＢＩＴ）またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの保存剤または緩衝剤；ｂ．必要に応じて、ホウ酸、ホウ酸誘導体、芳香族ホウ酸エステル、４－ホルミルフェニルボロン酸、フェニルボロン酸誘導体、阻害活性を有するペプチド化合物またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの阻害剤；
ｃ．必要に応じて、メディエーターを伴うかもしくは伴わない、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ、ヌクレアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン分解酵素、ペクチン酸リアーゼ、カルボヒドラーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キサンタナーゼ、キシログルカナーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素；および
ｄ．必要に応じて、マルトデキストリン、穀粉、塩化ナトリウム、スルフェート、硫酸ナトリウムまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの充填剤
をさらに含む、請求項８に記載の酵素組成物。
【請求項10】
液体組成物または固体組成物、例えば、溶液、分散液、ペースト、粉末、細粒、顆粒、コーティングされた顆粒、錠剤、ケーク、結晶、結晶スラリー、ゲルまたはペレットの形態の、請求項８または９に記載の酵素組成物。
【請求項11】
請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチドまたは請求項７に記載の融合タンパク質を含む少なくとも１つの組換えポリペプチドを産生することを可能にする遺伝子エレメントを含む、組換え宿主細胞。
【請求項12】
前記宿主細胞が、ａ．子嚢菌門、Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の糸状菌細胞；好ましくは、Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ綱またはＥｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ綱、Ｈｙｐｏｃｒｅｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ亜綱またはＳｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ亜綱またはＥｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ亜綱、Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ目またはＳｏｒｄａｒｉａｌｅｓ目またはＥｕｒｏｔｉａｌｅｓ目、Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａ科またはＮｅｃｔｒｉａｃｅａ科またはＣｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ科またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌａｃｅａｅ科、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属（Ｈｙｐｏｃｒｅａの無性世代）またはＦｕｓａｒｉｕｍ属またはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属またはＨｕｍｉｃｏｌａ属またはＴｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ属またはＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のメンバーからなる群の糸状菌細胞；
より好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）、Ｔ．ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｐａｒａｒｅｅｓｅｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｎｕｍ、Ｆ．ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ種からなる群の糸状菌細胞；
ｂ．細菌細胞、好ましくは、グラム陽性桿菌、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、グラム陰性細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、放線菌目、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．；および
ｃ．酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
からなる群より選択され；
好ましくは、前記宿主細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａなどの糸状菌細胞またはバチルスなどのグラム陽性桿菌；最も好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢ．ｐｕｍｉｌｕｓもしくはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから選択される、
請求項１１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項13】
請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチドまたは請求項７に記載の融合タンパク質を作製するための方法であって、ａ．請求項１１～１２のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞を、前記組換えポリペプチドの産生を可能にする条件において培養すること；および必要に応じて
ｂ．前記組換えポリペプチドを回収すること
を含む、方法。
【請求項14】
キシラン含有材料を分解または改変するための方法であって、有効量の請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチド、請求項７に記載の融合タンパク質または請求項８～１０のいずれか１項に記載の酵素組成物で前記キシラン含有材料を処理することを含む、方法。
【請求項15】
パルプまたはサイレージの加工などの工業プロセスまたは商業用途における、請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチドまたは請求項６に記載の融合タンパク質または請求項８～１０のいずれか１項に記載の酵素組成物の使用。
【請求項16】
飼料または食料品の調製における、請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチドまたは請求項６に記載の融合タンパク質または請求項８～１０のいずれか１項に記載の酵素組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一般に、酵素技術の分野に関する。本開示は、もっぱらではないが特に、様々な化学的環境および熱的環境における改善されたキシラン分解能および安定性を示すキシラナーゼ変異体であって、それによりパルプまたはサイレージの加工、および飼料または食料品の製造などのキシランの分解が望まれる様々な用途において有用となるキシラナーゼ変異体に関する。
【背景技術】
【0002】
この項は、本明細書中に記載されるいかなる手法も技術水準を代表するものであることを自認することなく、有用な背景情報を説明する。
【0003】
植物細胞壁は、主として多糖類、主にセルロース、リグニンおよびヘミセルロースの複雑な混合物からなる。キシランは、植物に由来するほとんどの材料において主要なヘミセルロース成分であり、β－１，４結合型キシロース残基の多糖骨格からなり、アセチル、アラビノシルおよびグルクロノシル置換基を有することが多い。エンド－β－１，４－キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）は、直鎖状多糖を分解することによってキシランおよびキシロ－オリゴ糖に作用する酵素であり、より小さなキシロオリゴ糖とキシロース（単糖）との混合物を生じる。
【0004】
キシランを加水分解する工業的に適用可能なキシラナーゼの需要は著しく増加しており、特性が改善された酵素が絶えず必要とされている。高温ならびにアルカリ性ｐＨにおいても高活性かつ安定なキシラナーゼが、多くの工業プロセスにおいて特に望ましい。そのようなプロセスとしては、例えば、パルプの酵素触媒漂白が挙げられ、そこではキシラナーゼが有毒な塩素含有化学物質に代わる単純かつ費用効果の高い代替物として使用される。
【0005】
キシラナーゼは、飼料栄養物利用を改善するのに有益な効果を有するので、動物用飼料の添加物としても有用である。植物ベースの動物用飼料はキシランを含むが、キシランが大量にあると、栄養分の消化、微生物のコロニー形成および家畜の成長を損なう恐れがある。動物用飼料へのキシラナーゼ酵素の添加は、家畜の成長速度の上昇、飼料転換率の上昇および飼料効率の上昇などの有益な効果がある。キシラナーゼによってキシランを可溶化および分解すると、家畜の腸内の粘性が低下し、穀物の胚乳および糊粉層からの栄養分の放出が増加する。また、キシロース単位で構成されている糖オリゴマーであるキシロオリゴ糖（ＸＯＳ）が、プレバイオティクスとして作用し、家畜動物に種々の健康上の利益を与えることが示唆されている。
【0006】
キシラナーゼが利用される他の工業用途または商業用途は、例えば、サイレージの加工、バイオ燃料生産のためのバイオマス変換、ならびにデンプン、食品、ベーキング（例えば、パンの製造）および飲料（例えば、果汁およびワインの清澄化、またはアルコール発酵）産業である。
【0007】
放線菌は、キシラナーゼを産生することが知られており、その一部は、非常に耐熱性でアルカリ耐性のキシラナーゼ酵素を産生する。好熱性放線菌株は、工業プロセス用のキシラナーゼの有用な供給源である。キシラナーゼポリペプチドは、触媒モジュール（コア）を含み、その多くは、リンカー領域によってコアから隔てられた糖質結合モジュール（ＣＢＭ）も含む。上記で定義されたモジュール構造を有するキシラン分解酵素は、真菌や細菌、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ）ｆｌｅｘｕｏｓａを含む放線菌の株などによって産生される（例えば、Ｎ．ｆｌｅｘｕｏｓａ Ｘｙｎ１１ＡおよびＸｙｎ１０Ａは、コア、リンカーおよびＣＢＭからなる）。
【0008】
本開示は、放線菌キシラナーゼの変異体、およびＡＭ２４と命名された切断型Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ）ｆｌｅｘｕｏｓａ Ｘｙｎ１１キシラナーゼ（ＡＭ３５とも命名されたＮｆ Ｘｙｎ１１Ａ）の変異体を記載する。ＡＭ２４キシラナーゼおよびその生成方法は、特許文献１に記載された。ＡＭ２４は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ）ｆｌｅｘｕｏｓａ由来の完全長キシラナーゼＡＭ３５の切断型キシラナーゼである。ＡＭ２４は、糖質結合ドメイン（ＣＢＭ）およびコアとＣＢＭとの間のリンカーの一部が遺伝的に除去されているという点で、完全長キシラナーゼＡＭ３５とは異なる。完全長Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ）ｆｌｅｘｕｏｓａ Ｘｙｎ１１Ａ（Ｎｆ Ｘｙｎ１１Ａ、ＡＭ３５）キシラナーゼタンパク質も以前に記載されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】欧州特許第１７３７９５１号明細書
【発明の概要】
【0010】
本開示の目的は、キシラナーゼ活性を示すキシラナーゼの変異体であって、工業プロセスでの使用を可能にする性能および安定性を有するキシラナーゼの変異体を提供することである。本開示の別の目的は、工業プロセスで使用される場合に改善された特性を有するキシラナーゼの変異体を提供することである。本開示のさらに別の目的は、キシランの分解または改変のための酵素組成物において使用され得る変異体を提供することである。
【0011】
本願は、添付の独立請求項において定義される発明および下記に開示されるそれらの実施形態に関する。
【0012】
本発明は、親キシラナーゼポリペプチドＡＭ２４、またはＡＭ２４に相同な別の放線菌キシラナーゼポリペプチドを改変することによるキシラナーゼ変異体の開発に基づく。本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに親キシラナーゼ変異体ポリペプチドの２３位もしくは２８位に対応する位置または２３位および２８位の両方に対応する位置にアミノ酸置換を組み込むことによって、親キシラナーゼＡＭ２４または親ＡＭ２４キシラナーゼホモログと比較して、キシラン分解の性能が改善された、すなわち向上した変異体、ならびに安定性が改善された変異体を得ることが可能であることを見出し、そのことを下記の実施例において示す。その性能および安定性は、特に、反応条件が高温を必要とするとき、改善される。キシラナーゼの新規変異体ポリペプチドは、広範囲の工業プロセスにおいて高い性能および安定性を有するので、それらのプロセスにおけるキシランの分解および改変のための酵素組成物に対して改善された特性を提供する。
【0013】
第１の態様によれば、配列番号１のアミノ酸１～１９１と７９％以上１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、
キシラナーゼ活性、
その１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、および
２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、
を有する、変異体ポリペプチドが提供される。
キシラナーゼ活性、
その１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、および
２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、
を有する、変異体ポリペプチドが提供される。
【0014】
本変異体ポリペプチドは、改善された熱安定性、ｐＨ安定性および性能、すなわちキシラン分解活性を有するという点で有利であり、これらの特徴は、実施例４および５に記載されているように計測可能である。
【0015】
ある実施形態では、キシラナーゼの本変異体ポリペプチドの機能的フラグメントが提供される。
【0016】
第２の態様によれば、第１の態様の変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と、
分泌シグナル配列を提供するアミノ酸配列；
精製を容易にするアミノ酸配列、例えば、アフィニティタグまたはＨｉｓタグ；
組換えポリペプチドの産生を制御および増強するアミノ酸配列、例えば、キャリアポリペプチド；
プロテアーゼ切断部位をコードするアミノ酸配列；
酵素活性を有するアミノ酸配列；および／または
結合親和性を有する融合タンパク質を提供するアミノ酸配列、例えば、糖質結合部分
のうちの少なくとも１つと
を含む、融合タンパク質が提供される。
分泌シグナル配列を提供するアミノ酸配列；
精製を容易にするアミノ酸配列、例えば、アフィニティタグまたはＨｉｓタグ；
組換えポリペプチドの産生を制御および増強するアミノ酸配列、例えば、キャリアポリペプチド；
プロテアーゼ切断部位をコードするアミノ酸配列；
酵素活性を有するアミノ酸配列；および／または
結合親和性を有する融合タンパク質を提供するアミノ酸配列、例えば、糖質結合部分
のうちの少なくとも１つと
を含む、融合タンパク質が提供される。
【0017】
第３の態様によれば、第１の態様の変異体ポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質を含む酵素組成物が提供される。
【0018】
上記キシラナーゼの変異体は、パルプの漂白プロセスの増進や精製効率の向上などのパルプ処理、ならびに工業的な飼料または食料品製造などのプロセスにおいてキシランを分解するために使用される場合に良好な安定性および比活性を有するため、上記酵素組成物は、そのようなプロセスに特に効果的である。
【0019】
第４の態様によれば、第１の態様の変異体ポリペプチドを含む少なくとも１つの組換えポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質を産生することを可能にする遺伝子エレメントを含む組換え宿主細胞が提供される。
【0020】
本開示に係る変異体ポリペプチドは、その変異体ポリペプチドを、工業用途のための酵素組成物において有用なものとする特性を有する。
【0021】
ある実施形態では、キシラナーゼ活性を有し、本宿主細胞を用いることによって入手可能な、変異体ポリペプチドを含む酵素調製物が提供される。
【0022】
第５の態様によれば、第１の態様の変異体ポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質を作製するための方法が提供され、その方法は、
ａ．第４の態様の組換え宿主細胞を、組換えポリペプチドの産生を可能にする条件において培養すること；および必要に応じて
ｂ．その組換えポリペプチドを回収すること
を含む。
ａ．第４の態様の組換え宿主細胞を、組換えポリペプチドの産生を可能にする条件において培養すること；および必要に応じて
ｂ．その組換えポリペプチドを回収すること
を含む。
【0023】
上記の方法は、キシラナーゼの変異体ポリペプチド、またはキシラナーゼの変異体ポリペプチドと第２の態様に係る少なくとも１つのアミノ酸配列とを含む融合タンパク質を作製する効率的な方法を提供する。その変異体ポリペプチドは、組換え宿主細胞において産生されるので、所望の様式で最適化、調整および制御できる産生系が提供される。本方法によって産生される変異体ポリペプチドは、構造レベルおよび機能レベルで親キシラナーゼと異なる。
【0024】
第６の態様によれば、キシラン含有材料を分解または改変するための方法が提供され、その方法は、有効量の第１の態様の変異体ポリペプチド、第２の態様の融合タンパク質または第３の態様の酵素組成物で前記キシラン含有材料を処理することを含む。ある実施形態では、その処理は、キシラン含有材料を水性媒質中で変異体ポリペプチド、融合タンパク質または酵素組成物と接触させることを含む。
【0025】
第７の態様によれば、パルプまたはサイレージの加工などの工業プロセスまたは商業用途における、第１の態様の変異体ポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質または第３の態様の酵素組成物の使用が提供される。
【0026】
第８の態様によれば、飼料または食料品の調製における、第１の態様の変異体ポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質または第３の態様の酵素組成物の使用が提供される。
【0027】
ある実施形態では、パルプの加工における、第１の態様の変異体ポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質または第３の態様の酵素組成物の使用、例えば、リグニン除去および／またはセルロース加水分解を促進すること、ならびに精製に対するパルプの感受性を高めることが提供される。
【0028】
ある実施形態では、動物用飼料における第１の態様の変異体ポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質または第３の態様の酵素組成物の使用が提供され、その飼料は、必要に応じて、動物に飼料を与えるため、動物の体重増加および飼料効率を改善するために使用される。
【0029】
ある実施形態では、食料品の調製における第１の態様の変異体ポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質または第３の態様の酵素組成物の使用が提供される。変異体ポリペプチドは、コーヒーの抽出、植物油またはデンプンの加工、植物繊維源からのゴムの除去、ベーキング、生地のコンディショニング、パンの製造および飲料産業（例えば、果汁およびワインの清澄化またはアルコール発酵）において使用され得る。
【0030】
本キシラナーゼの変異体は、安定性の向上を必要とするプロセス条件において、キシランの分解性能が改善されている点で有利である。下記に提供される実施例に示されるように、特許請求されるキシラナーゼの変異体ポリペプチドは、その変異体の起源に応じて、親ＡＭ２４キシラナーゼまたは親ＡＭ２４キシラナーゼホモログと比較したとき、改善された性能および安定性を有する。
【0031】
種々の拘束力のない例示的な態様および実施形態を上記で説明してきた。前述の実施形態は、種々の実施態様において利用され得る選択された態様または工程を説明するためにのみ用いられる。いくつかの実施形態は、ある特定の例示的な態様を参照して単に提示され得る。対応する実施形態は、他の例示的な態様にも適用され得ることが認識されるべきである。
【0032】
いくつかの例示的な実施形態が、添付の図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1A】図１Ａは、ＡＭ２４コア配列およびそのホモログの系統樹を示している。この系統樹は、図１Ａおよび１Ｂの２つに分割されており、矢印が、２つの図面間の接続を表している。ｂｌａｓｔｐ検索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins）およびＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ多重配列アラインメントプログラム（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）の系統樹オプションを使用して設計された、ＡＭ２４コアに最も近い１００個のホモログからの系譜。ＡＭ２４のアミノ酸配列（Ｎｆ＿Ｘｙｎ１１Ａコア、配列番号１のアミノ酸１～１９１、Ｌｅｓｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５に従ったコア領域）をクエリー配列として用いた。使用されるアルゴリズムパラメータは、実施例２においてより詳細に説明される。
【図1B】図１Ｂは、ＡＭ２４コア配列およびそのホモログの系統樹を示している。この系統樹は、図１Ａおよび１Ｂの２つに分割されており、矢印が、２つの図面間の接続を表している。ｂｌａｓｔｐ検索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins）およびＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ多重配列アラインメントプログラム（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）の系統樹オプションを使用して設計された、ＡＭ２４コアに最も近い１００個のホモログからの系譜。ＡＭ２４のアミノ酸配列（Ｎｆ＿Ｘｙｎ１１Ａコア、配列番号１のアミノ酸１～１９１、Ｌｅｓｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５に従ったコア領域）をクエリー配列として用いた。使用されるアルゴリズムパラメータは、実施例２においてより詳細に説明される。
【図2】図２は、ＡＭ２４のアミノ酸配列と、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉでの産生のために選択された近いホモログの成熟推定コア領域とのアラインメントを示している。これらの配列のアラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（１．２．４）多重配列アラインメントを使用して行われた。ＡＭ２４の成熟コア領域は、Ｌｅｓｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）において公開された情報に基づいて、配列番号１のアミノ酸１～１９１からなる。図２のアラインメントは、各縦列において観察された保存の程度を表す以下の記号を表示している：＊（アスタリスク）は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示している。：（コロン）は、非常に類似した特性の群間で保存を有する位置を示している。．（ピリオド）は、弱く類似した特性の群間で保存を有する位置を示している。
【図3A】図３Ａは、ｐＨ７でのＡＭ２４およびその変異体の相対的な熱安定性を示している。キシラナーゼ活性の解析を、５分および６０分の反応時間を用いて、７０、８０、９０および９６℃の温度で行った。図３Ａ：５分の反応時間のアッセイの結果。活性値は、５分の反応時間を用いて８０℃において解析された対応するキシラナーゼの活性に関するものだった。この活性を１００とした。提示されている値は、２つの並行反応からの平均である。ＡＭ２４は、親キシラナーゼを表し、他のサンプルは、種々のＡＭ２４変異体を表している。
【図3B】図３Ｂは、ｐＨ７でのＡＭ２４およびその変異体の相対的な熱安定性を示している。キシラナーゼ活性の解析を、５分および６０分の反応時間を用いて、７０、８０、９０および９６℃の温度で行った。図３Ｂ：６０分の反応時間のアッセイの結果。活性値は、５分の反応時間を用いて８０℃において解析された対応するキシラナーゼの活性に関するものだった。この活性を１００とした。提示されている値は、２つの並行反応からの平均である。ＡＭ２４は、親キシラナーゼを表し、他のサンプルは、種々のＡＭ２４変異体を表している。
【図4A】図４Ａは、ｐＨ８および９でのＡＭ２４およびその変異体Ｃ３１－４の相対的な熱安定性を示している。キシラナーゼ活性の解析は、５分の反応時間で７０、８０、９０および９６℃において、ならびに６０分の反応時間で７０および８０℃において行われた。図４Ａ：反応条件ｐＨ８、５分の反応。活性値は、５分の反応時間を用いてｐＨ７、８０℃において解析された対応するキシラナーゼの活性に関するものだった。この値を１００とした。これらの値は、２つの並行反応からの平均である。
【図4B】図４Ｂは、ｐＨ８および９でのＡＭ２４およびその変異体Ｃ３１－４の相対的な熱安定性を示している。キシラナーゼ活性の解析は、５分の反応時間で７０、８０、９０および９６℃において、ならびに６０分の反応時間で７０および８０℃において行われた。図４Ｂ：反応条件ｐＨ８、６０分の反応。活性値は、５分の反応時間を用いてｐＨ７、８０℃において解析された対応するキシラナーゼの活性に関するものだった。この値を１００とした。これらの値は、２つの並行反応からの平均である。
【図4C】図４Ｃは、ｐＨ８および９でのＡＭ２４およびその変異体Ｃ３１－４の相対的な熱安定性を示している。キシラナーゼ活性の解析は、５分の反応時間で７０、８０、９０および９６℃において、ならびに６０分の反応時間で７０および８０℃において行われた。図４Ｃ：反応条件ｐＨ９、５分の反応。活性値は、５分の反応時間を用いてｐＨ７、８０℃において解析された対応するキシラナーゼの活性に関するものだった。この値を１００とした。これらの値は、２つの並行反応からの平均である。
【図4D】図４Ｄは、ｐＨ８および９でのＡＭ２４およびその変異体Ｃ３１－４の相対的な熱安定性を示している。キシラナーゼ活性の解析は、５分の反応時間で７０、８０、９０および９６℃において、ならびに６０分の反応時間で７０および８０℃において行われた。図４Ｄ：反応条件ｐＨ９、６０分の反応。活性値は、５分の反応時間を用いてｐＨ７、８０℃において解析された対応するキシラナーゼの活性に関するものだった。この値を１００とした。これらの値は、２つの並行反応からの平均である。
【図5】ｐＨ１１、９０℃において６０分間インキュベートした後のＡＭ２４およびその変異体Ｃ３１－４の残留キシラナーゼ活性。サンプル中の元の活性のパーセンテージとしての残留キシラナーゼ活性を、５分の反応時間を用いてｐＨ７、７０℃において解析した。結果は、２つの異なる解析、それぞれにおいて２つの並行反応からの結果である。ＢＲ、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液；ＮａＰ、リン酸ナトリウム緩衝液。ｐＨ７、７０℃において５分間の反応時間を用いてインキュベートする前に解析されたキシラナーゼ活性を１００とした。
【0034】
配列表
【発明を実施するための形態】
【0035】
本発明は、アミノ酸配列に置換が導入されたことにより、改善された特性（例えば、改善された熱安定性およびｐＨ安定性）がもたらされた、キシラナーゼの変異体ポリペプチドに関する。
【0036】
本明細書中で使用されるとき、用語「ホモログ」または「キシラナーゼホモログ」とは、ある特定のレベルの生物学的相同性、すなわち、別のＤＮＡ、ＲＮＡまたはアミノ酸のキシラナーゼ配列と類似性を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはアミノ酸のキシラナーゼ配列のことを指し、その類似性は、その配列と一致する残基の％として、または配列同一性／類似性の％として表現される。ある実施形態において、キシラナーゼホモログは、ＡＭ２４キシラナーゼホモログである。
【0037】
用語「キシラン」とは、様々な側鎖を有する繰り返しβ－１，４結合型キシロース残基骨格から構成されるマトリックス多糖類またはヘテロポリマーのことを指す。キシラン多糖類は、置換側鎖に基づいて、Ｏ－アセチルグルクロノキシラン（ＡｃＧＸ）、Ｏ－アセチルアラビノキシラン（ＡｃＡＸ）、Ｏ－アセチルグルクロノアラビノキシラン（ＡｃＧＡＸ）およびアラビノグルクロノキシラン（ＡＧＸ）のクラスに大別され得る。キシラン含有材料は、植物系または植物由来の材料を含む。
【0038】
本明細書中で使用されるとき、用語「キシラナーゼ」は、キシラン内の（１→４）－β－Ｄ－キシロシド結合の内部加水分解を触媒することが知られているエンド－１，４－β－キシラナーゼまたは４－β－Ｄ－キシランキシラノヒドロラーゼとして当該分野で公知のものに従って定義されるキシラナーゼ酵素を表す。キシランは、エンド－（１→４）－β－キシラン４－キシラノヒドロラーゼ、エンド－１，４－キシラナーゼ、キシラナーゼ、β－１，４－キシラナーゼ、エンド－１，４－キシラナーゼ、エンド－β－１，４－キシラナーゼ、エンド－１，４－β－Ｄ－キシラナーゼ、１，４－β－キシランキシラノヒドロラーゼ、β－キシラナーゼ、β－１，４－キシランキシラノヒドロラーゼ、エンド－１，４－β－キシラナーゼおよびβ－Ｄ－キシラナーゼという代替名を有する。キシラナーゼは、酵素命名法に従ってＥＣ ３．２．１．８と分類される。
【0039】
本明細書中で使用されるとき、Ｎｆ ｘｙｎ１１Ａは、ＡＭ３５とも命名されている、ファミリー１１のキシラナーゼＮｆ Ｘｙｎ１１ＡをコードするＮｏｎｏｍｕｒａｅａ ｆｌｅｘｕｏｓａキシラナーゼ遺伝子を表す。
【0040】
本明細書中で使用されるとき、ＡＭ３５は、ＡＭ２４ポリペプチドに使用される親ポリペプチドである野生型成熟キシラナーゼを表す。成熟ＡＭ３５タンパク質のアミノ酸は、配列番号９７のアミノ酸配列に対応する。
【0041】
本明細書中で使用されるとき、ＡＭ２４（本明細書中、ＡＭ２４タンパク質とも呼ばれる）は、本開示に係るＡＭ２４変異体ポリペプチドの親ポリペプチドである。ＡＭ２４は、キシラナーゼＡＭ３５（Ｎｆ Ｘｙｎ１１Ａ）の切断型をコードする短縮型ＤＮＡ配列によってコードされる。ＡＭ２４タンパク質は、触媒モジュール（コア）を含み、糖質結合モジュール（ＣＢＭ）およびコアとＣＢＭとの間のリンカー領域の部分を欠く。ＡＭ２４の成熟ポリペプチドのアミノ酸は、アミノ酸Ｄ１～Ｌ２２０を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するのに対して、ＡＭ２４の「成熟コアポリペプチド」は、配列番号１のアミノ酸Ｄ１～Ｇ１９１を含む。
【0042】
本明細書中で使用されるとき、用語「変異体」は、１つ以上のヌクレオチド／アミノ酸によって挿入、置換もしくは欠失された、または化学的に修飾された、配列または配列のフラグメント（ヌクレオチドまたはアミノ酸）を意味する。変異体という用語は、いくつかの実施形態では、キシラナーゼの変異体ポリペプチド、キシラナーゼの変異体ポリペプチドを含む融合タンパク質、または組換えキシラナーゼ酵素も含み得る。
【0043】
用語「キシラナーゼ変異体」および「変異体キシラナーゼ」および「キシラナーゼの変異体」は、部位特異的突然変異誘発もしくはランダム突然変異誘発、挿入、置換、欠失、組換えおよび／または親キシラナーゼとアミノ酸配列が異なるキシラナーゼをもたらす他の任意のタンパク質工学法によって得られる任意のキシラナーゼ分子を意味し、その親キシラナーゼは、野生型キシラナーゼまたはキシラナーゼ変異体自体である。本開示に係る用語「野生型キシラナーゼ」、「野生型酵素」、「野生型」または「ｗｔ」は、天然に見出されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するキシラナーゼ酵素を説明する。変異体をコードする遺伝子は、合成され得るか、または遺伝的方法を用いて、例えば、親ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド内の１つ以上の定義された部位に１つもしくは１つより多い変異を導入する技術である部位特異的突然変異誘発によって親遺伝子が改変され得る。
【0044】
第１の態様に係るキシラナーゼの「変異体ポリペプチド」という用語は、変異体に与えられた名称、例えば、Ｃ３１－４または変異体Ｃ３１－４を使用して呼ばれることもある。
【0045】
本明細書中で使用されるとき、用語「ホモログ変異体」または「ホモログの変異体」とは、対応する遺伝子を合成することによって得られるか、または部位特異的突然変異誘発もしくはランダム突然変異誘発、挿入、置換、欠失、組換えおよび／または親キシラナーゼとアミノ酸配列が異なるＡＭ２４キシラナーゼホモログ変異体をもたらす他の任意のタンパク質工学法によって親遺伝子を改変することによって得られる、ＡＭ２４キシラナーゼホモログ由来の任意の変異体分子のことを指し、その親キシラナーゼホモログは、野生型キシラナーゼまたはキシラナーゼ変異体自体である。ある実施形態において、「ＸＢ１のキシラナーゼホモログ変異体」などの表現は、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体のことを指し、そのホモログは、ＸＢ１である。
【0046】
本明細書中で使用されるとき、用語「成熟ポリペプチド」は、少なくとも１つのシグナル配列またはシグナルペプチドまたはシグナルペプチドおよび推定されるプロペプチドが切除されている任意のポリペプチドを意味する。例えば、ＡＭ２４の「成熟ポリペプチド」は、配列番号１のアミノ酸Ｄ１～Ｌ２２０を含み、ＡＭ２４の「成熟コアポリペプチド」は、配列番号１のアミノ酸Ｄ１～Ｇ１９１を含む。
【0047】
本明細書中で使用されるとき、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、複数の連続した重合アミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。本開示の目的のために、ペプチドは、最大２０個のアミノ酸残基を含む分子であり、ポリペプチドは、２０個を超えるアミノ酸残基を含む。ペプチドまたはポリペプチドは、修飾アミノ酸残基、コドンによってコードされない天然に存在するアミノ酸残基および天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る。本明細書中で使用されるとき、「タンパク質」とは、任意のサイズのペプチドまたはポリペプチドのことを指し得る。タンパク質は、酵素、タンパク質、抗体、膜タンパク質、ペプチドホルモン、制御因子または他の任意のタンパク質であり得る。
【0048】
本明細書中で使用されるとき、「配列同一性」は、最適にアラインメントされた２つの配列の両方に残基が存在する位置の数にわたる、それら２つの配列間のアミノ酸残基の正確な一致のパーセンテージを意味する。一方の配列が、他方の配列の中に対応する残基を有しない残基を有するとき、アライメントプログラムは、アライメント内にギャップを許容し、その位置は、同一性の計算の分母にカウントされない。
【0049】
本明細書中で使用されるとき、アミノ酸配列の「配列アラインメント」は、Ｓｉｅｖｅｒｓら２０１１によって記載されているようにＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（１．２．４）多重配列アラインメントプログラム（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）を使用し、デフォルトの設定を使用して配列をアラインメントすることを意味する。
【0050】
別段特定されない限り、ある特定のアミノ酸位置に対するすべての言及は、前記位置における配列番号１のアミノ酸、または配列番号１とアラインメントされたアミノ酸配列の対応する位置に存在するもしくは欠落しているアミノ酸のことを指す。
【0051】
本明細書中で使用されるとき、用語「ジスルフィド架橋」または「ジスルフィド結合」または「ＳＳ架橋」は、ポリペプチド内またはタンパク質内のシステイン残基の硫黄原子間に形成される結合のことを指す。ジスルフィド架橋は、天然に存在していてもよいし、天然に存在していなくてもよく、例えば、アミノ酸置換によって導入されてもよい。
【0052】
本明細書中で使用されるとき、用語「対応する位置」または「対応するアミノ酸位置」は、ペアワイズアライメントまたはマルチプルシーケンスアライメントとして類似または同一である特定された領域に従って少なくとも２つのアミノ酸配列をアライメントし、それによって対応するアミノ酸を対にすることを意味する。対応する位置の例が図２に示されており、同じ縦列に示されているアミノ酸が、対応するアミノ酸である。例えば、１位は、ＡＭ２４のアミノ酸Ｄ１とＸＢ１のＱ１とが、対応するアミノ酸である。
【0053】
本明細書中で使用されるとき、「アミノ酸置換」は、その特定の置換位置において元のアミノ酸とは異なるアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。用語「アミノ酸置換」は、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との両方のことを指すことができ、これは、アミノ酸残基が、その場所の元のアミノ酸残基と類似の側鎖（保存的）または異なる側鎖（非保存的）を有するアミノ酸残基で置き換えられることを意味する。
【0054】
用語「機能的フラグメント」は、ほぼ同じ酵素機能または効果を保持する、キシラナーゼの現在の変異体ポリペプチドのフラグメントまたは一部を意味する。
【0055】
本明細書中で使用される「キシラナーゼ活性」とは、キシラン分解活性のことを指す。本明細書中で使用される分解または改変は、キシラン多糖が、キシラナーゼによってキシロースオリゴ糖またはキシロース二糖に加水分解されることを意味する。本開示に係るポリペプチドのキシラン分解活性は、当該分野で公知の試験手順に従って試験され得る。実施例４および５には、キシラナーゼ活性を測定するための方法の例が提供されている。「キシラナーゼ活性保持」という用語は、特定のプロセス条件に曝露されたとき、キシラナーゼ活性を保持する酵素の能力を意味する。ある実施形態では、キシラナーゼ酵素の活性保持の増加は、同じ条件の親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、キシラナーゼ酵素が特定のプロセス条件においてそのキシラナーゼ活性をより良好に保持することを意味する。
【0056】
ある実施形態において、用語「酵素組成物」は、単一種の微生物から場合によっては単離および精製された酵素発酵産物を意味する。酵素組成物は、通常、微生物によって産生されるいくつかの異なる酵素活性を含む。別の実施形態において、酵素組成物は、単一成分酵素の混合物、好ましくは、従来の組換え手法を用いて細菌種または真菌種から得られる酵素の混合物である。それらの酵素は、微生物の発酵から得られ、場合によっては単離および精製される。混合物中の酵素は、異なる種、好ましくは、真菌種もしくは細菌種に由来し得るか、または微生物が組換えキシラナーゼに加えて他の酵素を同時に産生するとき、それらの産生（例えば組換えキシラナーゼの産生）のために宿主細胞として作用する微生物の発酵産物中に存在する。
【0057】
酵素またはキシラナーゼの安定性の文脈における用語「安定性」は、問題の酵素の活性および機能にとって最適ではないプロセス条件に耐えるおよび／またはそのプロセス条件において機能する酵素の特性を説明するものであり、そのようなプロセス条件は、例えば、高温、高ｐＨもしくは高放射線照射、ある特定の濃度の無機塩もしくは有機溶媒、または例えばプロテアーゼ、安定剤、ビルダー、界面活性剤などを含む特定の反応混合物組成物である。
【0058】
用語「安定性」は、時間に応じた本開示に係るキシラナーゼの安定性、例えば、問題の酵素の活性および機能にとって最適ではないプロセス条件にキシラナーゼを曝露したとき、どの程度の活性が保持されるかを反映する。種々の方法を用いて、キシラナーゼ変異体の安定性が解析される。実施例５に記載されているように、キシラナーゼのアンフォールディング温度を計測することにより、キシラナーゼの熱安定性を評価することができる。また、キシラナーゼの安定性および残留活性は、実施例４および５に記載されているようにパラメータを調整した「活性アッセイ」を用いて計測することができる。用語「安定性」は、高温条件を有するプロセスでの使用中の安定性を含む。
【0059】
本明細書中で使用されるとき、「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトまたは発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入、接合、交差などを受けやすい任意の細胞型を意味する。用語「宿主細胞」は、複製中に生じる変異に起因して同一ではない任意の子孫を包含する。宿主細胞の非限定的な例は、真菌細胞、好ましくは、糸状菌細胞（例えば、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、ＴｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓまたはＴｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａあるいはＨｕｍｉｃｏｌａまたはＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓあるいはＦｕｓａｒｉｕｍまたはＦｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、細菌細胞、好ましくは、グラム陽性桿菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、グラム陰性菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、放線菌目（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｆｌｅｘｕｏｓａ）および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【0060】
用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部を表す。プロモーター配列は、必ずしもではないが、一般に、遺伝子の５’非コード領域に見られる。
【0061】
用語「分泌シグナル配列」または「シグナル配列」または「分泌ペプチド」は、より大きなポリペプチドの構成要素または一部であるアミノ酸配列であって、それが産生される宿主細胞の分泌経路を通じてそのより大きなポリペプチドを導くアミノ酸配列のことを指す。分泌シグナル配列は、天然のものであり得るか、または別の供給源から得ることができる。宿主細胞に応じて、より大きなポリペプチドは、分泌経路を通過する間に分泌ペプチドから切断され、それによって分泌ペプチドを欠く成熟ポリペプチドが形成され得る。
【0062】
用語「プロペプチド（propeptide）」または「プロペプチド（pro-peptide）」は、成熟または活性化の間に切断されるタンパク質の一部である。プロペプチドは、一旦切断されると、一般に、独立した生物学的機能を有さなくなる。
【0063】
本明細書中で使用されるとき、用語「ドメイン」および「領域」は、用語「モジュール」と交換可能に使用され得る。
【0064】
用語「触媒ドメイン」または「触媒モジュール」または「コア」は、改変または変更されていてもされていなくてもよいが、その元の活性の少なくとも一部を保持している酵素のドメインを表す。本開示に係るキシラナーゼの変異体ポリペプチドの触媒モジュール領域は、配列番号１のアミノ酸１～１９１とアラインメントされるアミノ酸に対応する。
【0065】
用語「リンカー」または「スペーサー」は、マルチドメインタンパク質、例えば、触媒ドメインと糖質結合モジュール（ＣＢＭ）などの結合ドメインとを含む酵素、もしくは他の任意の酵素ハイブリッドのドメイン間、または融合ポリペプチド、例えば、２つのコア酵素を含む融合タンパク質として産生された２つのタンパク質間もしくはポリペプチド間に存在し得る少なくとも２つのアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。例えば、触媒ドメインとＣＢＭとの融合タンパク質は、触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列、リンカーをコードするＤＮＡ配列およびＣＢＭをコードするＤＮＡ配列を連続的に融合して１つのオープンリーディングフレームにし、このコンストラクトを発現させることによって提供される。
【0066】
以下の略語をアミノ酸に対して使用する。
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｃ Ｃｙｓ システイン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｋ Ｌｙｓ リジン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｔ Ｔｈｒ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｃ Ｃｙｓ システイン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｋ Ｌｙｓ リジン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｔ Ｔｈｒ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
【0067】
置換は、以下の命名法を用いて記載される：タンパク質骨格内のアミノ酸残基；位置；置換アミノ酸残基。この命名法によれば、例えば、２３位におけるアラニンからチロシン残基への単一残基の置換は、Ａｌａ２３ＴｙｒまたはＡ２３Ｙと示される。
【0068】
本明細書中で使用されるとき、用語「～を含む（comprising）」は、「～を含む（including）」、「～を含む（containing）」および「～を包含する（comprehending）」というより広い意味、ならびに「～からなる」および「～のみからなる」というより狭い表現を含む。
【0069】
本明細書中で使用されるとき、「発現」は、転写、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含むがこれらに限定されない、宿主細胞におけるポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含む。発現に続いて、宿主細胞または発現産物の収集、すなわち回収が行われてもよい。
【0070】
本明細書中で使用されるとき、用語「サイレージ」は、保存されている植物系材料から作製された、かいばまたは動物用飼料の一種である。
【0071】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、キシラナーゼ活性、および配列番号１のアミノ酸１～１９１と７９％以上、８１％以上、８２％以上、８４％以上、８７％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１９１と１００％の配列同一性を有しない。ある実施形態において、変異体ポリペプチドのアミノ酸ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸ナンバリングに対応する。代替の実施形態において、変異体ポリペプチドのアミノ酸ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸ナンバリングに部分的に対応する。
【0072】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１～１９１と８４％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８６％以上、より好ましくは８７％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは８９％以上、最も好ましくは９０％以上であるが、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する。
【0073】
ある実施形態において、配列番号１のアミノ酸１～１９１と８４％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドが開示され、そのアミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、その１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、を有する。
【0074】
ある実施形態において、配列番号１のアミノ酸１～１９１と８５％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドが開示され、そのアミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、その１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、を有する。
【0075】
ある実施形態において、配列番号１のアミノ酸１～１９１と８６％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドが開示され、そのアミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、その１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、を有する。
【0076】
ある実施形態において、配列番号１のアミノ酸１～１９１と８７％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドが開示され、そのアミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、その１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、を有する。
【0077】
ある実施形態において、配列番号１のアミノ酸１～１９１と８８％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドが開示され、そのアミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、その１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、を有する。
【0078】
ある実施形態において、配列番号１のアミノ酸１～１９１と８９％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドが開示され、そのアミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、その１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、を有する。
【0079】
ある実施形態において、配列番号１のアミノ酸１～１９１と９０％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドが開示され、そのアミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、その１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、を有する。
【0080】
ある実施形態において、配列番号１のアミノ酸１～１９１と９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドが開示され、そのアミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、その１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに２３位もしくは２８位、または２３位および２８位にアミノ酸置換、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、を有する。
【0081】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１９１とも７９％以上、好ましくは８２％以上、より好ましくは８４％以上、さらに好ましくは８７％以上、最も好ましくは９０％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸３１～１９１に対応する変異体ポリペプチドのアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸３１～１９１と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％以上の配列同一性を有する。
【0082】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、キシラナーゼ活性；配列番号１の２３位もしくは２８位、または２３位および２８位、２３位および２８位に対応する位置のアミノ酸が置換されている配列番号１のアミノ酸１～１９１；ならびに
１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間にジスルフィド架橋をもたらす少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有する。
１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間にジスルフィド架橋をもたらす少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有する。
【0083】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、キシラナーゼ活性、および親ＡＭ２４キシラナーゼポリペプチドの配列番号１のアミノ酸Ｄ１～Ｌ２２０と７９％以上、８１％以上、８２％以上、８４％以上、８７％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、も９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、キシラナーゼ活性、および親ＡＭ２４キシラナーゼポリペプチドの配列番号１のアミノ酸Ｄ１～Ｌ２２０と７９％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【0084】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１の３位および３０位に対応する位置である残基３Ｃおよび３０Ｃを含み、変異体ポリペプチドのジスルフィド架橋は、残基３Ｃと残基３０Ｃとの間に形成される。
【0085】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１の３位および３０位に対応する位置であるアミノ酸置換Ｔ３ＣまたはＴ３０Ｃを含み、変異体ポリペプチドの少なくとも１つのジスルフィド架橋は、前記置換残基間に形成される。
【0086】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換の組み合わせ：
Ｔ３ＣとＴ３０ＣまたはＴ３ＣとＮ３０ＣまたはＴ３ＣとＥ３０ＣまたはＴ３ＣとＹ３０ＣまたはＴ３ＣとＤ３０ＣまたはＶ３ＣとＴ３０ＣまたはＶ３ＣとＮ３０ＣまたはＶ３ＣとＥ３０ＣまたはＶ３ＣとＹ３０ＣまたはＶ３ＣとＤ３０ＣまたはＡ３ＣとＴ３０ＣまたはＡ３ＣとＮ３０ＣまたはＡ３ＣとＥ３０ＣまたはＡ３ＣとＹ３０ＣまたはＡ３ＣとＤ３０ＣまたはＰ３ＣとＴ３０ＣまたはＰ３ＣとＮ３０ＣまたはＰ３ＣとＥ３０ＣまたはＰ３ＣとＹ３０ＣまたはＰ３ＣとＤ３０Ｃを含み、その置換位置は、配列番号１の３位および３０位に対応し、その変異体ポリペプチドの少なくとも１つのジスルフィド架橋は、前記２つの置換残基間に形成される。
Ｔ３ＣとＴ３０ＣまたはＴ３ＣとＮ３０ＣまたはＴ３ＣとＥ３０ＣまたはＴ３ＣとＹ３０ＣまたはＴ３ＣとＤ３０ＣまたはＶ３ＣとＴ３０ＣまたはＶ３ＣとＮ３０ＣまたはＶ３ＣとＥ３０ＣまたはＶ３ＣとＹ３０ＣまたはＶ３ＣとＤ３０ＣまたはＡ３ＣとＴ３０ＣまたはＡ３ＣとＮ３０ＣまたはＡ３ＣとＥ３０ＣまたはＡ３ＣとＹ３０ＣまたはＡ３ＣとＤ３０ＣまたはＰ３ＣとＴ３０ＣまたはＰ３ＣとＮ３０ＣまたはＰ３ＣとＥ３０ＣまたはＰ３ＣとＹ３０ＣまたはＰ３ＣとＤ３０Ｃを含み、その置換位置は、配列番号１の３位および３０位に対応し、その変異体ポリペプチドの少なくとも１つのジスルフィド架橋は、前記２つの置換残基間に形成される。
【0087】
別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、その変異体ポリペプチドの１～１９１アミノ酸領域内のＣｙｓ残基間にジスルフィド架橋を含み、それらのＣｙｓ残基の位置は、配列番号１の３位および３０位に対応する位置とは異なる。
【0088】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、その変異体ポリペプチドの１～３０アミノ酸領域内のＣｙｓ残基間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を含み、そのアミノ酸領域の位置は、配列番号１の１位および３０位に対応する。
【0089】
ある実施形態において、配列番号１のアミノ酸１～１９１と７９％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する変異体ポリペプチドのアミノ酸領域内のシステイン残基は、例えば変異体遺伝子合成によって得られ、それによって前記システイン残基間に得られるジスルフィド架橋は、天然に存在しない。ある実施形態において、システイン残基は、親遺伝子の遺伝子改変、例えば、部位特異的突然変異誘発によって得られ、それにより前記システイン残基間に得られるジスルフィド架橋も天然には存在しない。多くのタンパク質工学アプローチあるいは遺伝子合成を用いることにより、アミノ酸鎖の特定の位置にアミノ酸置換を作製して、特定の位置の天然または野生型のアミノ酸を別のアミノ酸残基で置換することが可能になり得る。ある実施形態では、変異体ポリペプチドの１～１９１アミノ酸領域の少なくとも２つのアミノ酸残基が、システインで置換され、それにより置換基システイン残基の硫黄原子間にジスルフィド結合の形成が可能になる。別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも２つの代替位置において、変異体ポリペプチドの１～１９１アミノ酸領域内にジスルフィド架橋の形成を可能にするシステイン残基を含む。さらに別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドの１～１９１アミノ酸領域に１つより多いジスルフィド架橋の形成を可能にするシステイン残基を含む。
【0090】
ある実施形態において、１～１９１アミノ酸領域内の少なくとも１つのジスルフィド架橋は、変異体ポリペプチドを安定化し、それにより、ジスルフィド架橋のない変異体ＡＭ２４と比較して、変異体ポリペプチドのｐＨ安定性および熱安定性を増大させる。
【0091】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、２３位もしくは２８位、または２３位および２８位に１以上のアミノ酸置換を含む。
【0092】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドの１～３０アミノ酸領域内のＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに２３位もしくは２８位、または２３位および２８位、その位置は配列番号１の１～３０位に対応する、に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0093】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、Ａ２３、Ｓ２３もしくはＳ２８、または、Ａ２３もしくはＳ２３およびＳ２８に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0094】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、１～１９１領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに、Ａ２３もしくはＳ２８の位置、またはＡ２３およびＳ２８の位置、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0095】
代替の実施形態において、変異体ポリペプチドは、１～１９１領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに、Ｓ２３もしくはＳ２８、またはＳ２３およびＳ２８、その位置は配列番号１の２３位および２８位に対応する、に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0096】
ある実施形態において、２３位もしくは２８位、または２３位および２８位の置換アミノ酸残基は、これらの位置の元のアミノ酸残基と異なる。ある実施形態では、アミノ酸置換基は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹからなる群より選択されるが、但し、その置換基のアミノ酸残基は、その位置における天然に存在するアミノ酸残基とは異なる。
【0097】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、
Ｈ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、ＷもしくはＹへの２３位のアミノ酸の置換；または
Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹへの２８位のアミノ酸の置換；またはそれらの任意の組み合わせを含む。
Ｈ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、ＷもしくはＹへの２３位のアミノ酸の置換；または
Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹへの２８位のアミノ酸の置換；またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0098】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、
Ｈ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、ＷもしくはＹへの２３位のアミノ酸の置換；または
Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹへの２８位のアミノ酸の置換；またはそれらの任意の組み合わせを含む。
Ｈ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、ＷもしくはＹへの２３位のアミノ酸の置換；または
Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹへの２８位のアミノ酸の置換；またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0099】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ａ２３Ｈ、Ａ２３Ｍ、Ａ２３Ｐ、Ａ２３Ｓ、Ａ２３Ｔ、Ａ２３Ｒ、Ａ２３ＷまたはＡ２３Ｙを含む。
【0100】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｓ２３Ｈ、Ｓ２３Ｍ、Ｓ２３Ｐ、Ｓ２３Ｔ、Ｓ２３Ｒ、Ｓ２３ＷまたはＳ２３Ｙを含む。
【0101】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｓ２８Ｉ、Ｓ２８Ｌ、Ｓ２８Ｍ、Ｓ２８Ｎ、Ｓ２８Ｐ、Ｓ２８Ｑ、Ｓ２８Ｒ、Ｓ２８Ｔ、Ｓ２８Ｖ、Ｓ２８ＷまたはＳ２８Ｙを含む。
【0102】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換の組み合わせ：
Ａ２３ＨとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＭとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＰとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＳとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＴとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＲとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＷとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＹとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＨとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＭとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＰとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＴとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＲとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＷとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＹとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＹとＳ２８ＷまたはＳ２３ＹとＳ２８Ｙを含む。
Ａ２３ＨとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＨとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＭとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＭとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＰとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＰとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＳとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＳとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＴとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＴとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＲとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＲとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＷとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＷとＳ２８Ｙ、
Ａ２３ＹとＳ２８Ｉ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｌ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｍ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｎ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｐ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｑ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｒ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｔ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｖ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｗ、Ａ２３ＹとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＨとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＨとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＭとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＭとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＰとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＰとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＴとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＴとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＲとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＲとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＷとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｗ、Ｓ２３ＷとＳ２８Ｙ、
Ｓ２３ＹとＳ２８Ｉ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｌ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｍ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｎ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｐ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｑ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｒ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｔ、Ｓ２３ＹとＳ２８Ｖ、Ｓ２３ＹとＳ２８ＷまたはＳ２３ＹとＳ２８Ｙを含む。
【0103】
好ましい実施形態において、変異体ポリペプチドは、改善された安定性を高温において有する。
【0104】
好ましい実施形態において、変異体ポリペプチドは、改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を高温において有する。
【0105】
好ましい実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ａ２３ＳおよびＳ２８Ｉを、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して改善された安定性および／または活性を有する。
【0106】
好ましい実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ａ２３ＳおよびＳ２８Ｉを、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ａ２３ＳおよびＳ２８Ｉを、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上の高温においてより高いキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ａ２３ＳおよびＳ２８Ｉを、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、ｐＨ７以上および７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上の温度において、改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。
【0107】
好ましい実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ａ２３ＳおよびＳ２８Ｉを、１～３０アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して、改善された安定性および／または活性を有する。好ましい実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ａ２３ＳおよびＳ２８Ｉを、１～３０アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して、改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する。好ましい実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ａ２３ＳおよびＳ２８Ｉを、１～３０アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上の高温においてより高いキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換Ａ２３ＳおよびＳ２８Ｉを、１～３０アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、ｐＨ７以上、および７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上の温度において、改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。
【0108】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、ただ１つのアミノ酸置換Ａ２３ＳまたはＳ２８Ｉを、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して、改善された安定性および／または活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、ただ１つのアミノ酸置換Ａ２３ＳまたはＳ２８Ｉを、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して、改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、ただ１つのアミノ酸置換Ａ２３ＳまたはＳ２８Ｉを、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上の高温においてより高いキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、ただ１つのアミノ酸置換Ａ２３ＳまたはＳ２８Ｉを、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋とともに含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、ｐＨ７以上および７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上の温度において、改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。
【0109】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、２３位および／または２８位にアミノ酸置換を含み、１～１９１アミノ酸領域内にジスルフィド架橋を欠き、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して、改善された安定性および／または活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、２３位および／または２８位にアミノ酸置換を含み、１～１９１アミノ酸領域内にジスルフィド架橋を欠き、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して、改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、２３位および／または２８位にアミノ酸置換を含み、１～１９１アミノ酸領域内にジスルフィド架橋を欠き、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上の高温においてより高いキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、２３位および／または２８位にアミノ酸置換を含み、１～１９１アミノ酸領域内にジスルフィド架橋を欠き、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、ｐＨ７以上および７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上の温度において、改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。
【0110】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸鎖にさらなる置換なしに１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して、改善された安定性および／または活性を有する。そのような変異体は、２３位もしくは２８位または２３位および２８位に追加の置換を含む変異体ポリペプチドよりも低い安定性および／または活性を有し得る。ある実施形態において、その変異体は、置換残基Ｔ３Ｃ、Ｔ３０Ｃの間にジスルフィド架橋を含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して、改善された安定性および／または活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸鎖にさらなる置換なしに１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較して、改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸鎖にさらなる置換なしに１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上の高温においてより高いキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸鎖にさらなる置換なしに１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を含み、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、少なくとも７のｐＨおよび少なくとも７０℃、好ましくは少なくとも８０℃、より好ましくは少なくとも９０℃の温度において、改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。
【0111】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有し、２３位または２８位以外の位置に少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、その少なくとも１つのさらなる置換は、変異体ポリペプチドの安定性および／または活性をさらに改善する。したがって、アミノ酸鎖の２３位および／または２８位における特許請求される置換は、１～１９１領域内の２つのＣｙｓ残基間のジスルフィド架橋とともに、そのまま、または親キシラナーゼＡＭ２４の性能および安定性を改善するための追加の置換位置を伴って、使用され得る。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有し、２３位または２８位以外の位置に少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含み、その少なくとも１つのさらなる置換は、変異体ポリペプチドの熱安定性および／またはｐＨ安定性および／またはキシラナーゼ活性保持をさらに改善する。したがって、アミノ酸鎖の２３位および／または２８位における特許請求される置換は、１～１９１領域内の２つのＣｙｓ残基間のジスルフィド架橋とともに、そのまま、または親キシラナーゼＡＭ２４の性能ならびに熱安定性および／またはｐＨ安定性を改善するための追加の置換位置とともに、使用され得る。
【0112】
ある実施形態において、配列番号１と比較したときの変異体ポリペプチド内の置換の総数は、３～１０または４～１０である。ある実施形態において、変異体は、３つの置換を有するか、または変異体は、４つの置換を有するか、または変異体は、５つの置換を有するか、または変異体は、６つの置換を有するか、または変異体は、７つの置換を有するか、または変異体は、８つの置換を有するか、または変異体は、９つの置換を有するか、または変異体は、１０個の置換を有する。
【0113】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドまたは機能的フラグメントは、１９ｋＤａ～２６ｋＤａ、好ましくは、２０ｋＤａ～２５ｋＤａの予測分子量を有し、それは、変異体ポリペプチドのコア領域を構成するアミノ酸を含み、分泌変異体ポリペプチドから切除されるシグナル配列および変異体ポリペプチドの成熟中に切除される推定プロ配列を含まない。予測分子量は、変異体ポリペプチドまたはその機能的フラグメント内の個々のアミノ酸の分子量の合計を計算することによって決定され得る。
【0114】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較して、改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、改善された熱安定性およびｐＨ安定性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、改善された熱安定性または改善されたｐＨ安定性を有する。
【0115】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、より高いキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、改善されたｐＨ依存性キシラナーゼ活性保持および温度依存性キシラナーゼ活性保持を有する。
【0116】
ある実施形態において、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、および変異体ポリペプチドの２３位もしくは２８位または２３位および２８位のアミノ酸置換により、変異体ポリペプチドの熱安定性および／またはｐＨ安定性が改善される。ある実施形態において、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、変異体ポリペプチドの１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋により、変異体ポリペプチドの熱安定性および／またはｐＨ安定性が改善される。
【0117】
ある実施形態において、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、変異体ポリペプチドの２３位もしくは２８位、または２３位および２８位のアミノ酸置換により、変異体ポリペプチドの熱安定性および／またはｐＨ安定性が改善される。
【0118】
ある実施形態において、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、および変異体ポリペプチドの２３位もしくは２８位、または２３位および２８位のアミノ酸置換により、変異体ポリペプチドのキシラナーゼ活性保持が改善される。
【0119】
ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、温度が７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上、最も好ましくは９６℃以上である反応条件において、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較して、改善された安定性および／または活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、温度が７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上、最も好ましくは９６℃以上である反応条件において、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、温度が７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上、最も好ましくは９６℃以上である反応条件において、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、ｐＨが２以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上または１１以上である反応条件において、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較して、改善された安定性および／または活性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、ｐＨが２以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上または１１以上である反応条件において、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、ｐＨが２以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上または１１以上である反応条件において、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。ある実施形態において、変異体ポリペプチドは、親キシラナーゼＡＭ２４と比較したとき、９０℃以上の温度および／または７以上のｐＨにおいて、改善された熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する。
【0120】
外界温度を超える温度において活性を保持するキシラナーゼの提供は、そのような反応条件においてキシラン分解が必要とされる用途にとって有利である。キシラナーゼの高温耐性は、高い比活性および酵素安定性という利点を有する。また、高い反応温度を使用することにより、例えば、コンタミネーションが防止され、基質濃度が高いとき、流体粘度が低下するので物質移動速度が高まる。安定性の高いキシラナーゼを使用することにより、通常使用されるプロセス条件を変更する必要性が低減または回避される。
【0121】
さらに、本開示に係るキシラナーゼは、酸性および／または中性および／またはアルカリ性の条件において、改善された安定性およびキシラナーゼ活性を有し、これは、例えば、アルカリ性または酸性のプロセス条件でのパルプの漂白において有利である。ある実施形態において、本開示に係るキシラナーゼは、酸性および／または中性および／またはアルカリ性の条件において、改善された熱安定性および／もしくはｐＨ安定性ならびに／または改善されたキシラナーゼ活性保持を有し、これは、例えば、アルカリ性または酸性のプロセス条件でのパルプの漂白において有利である。
【0122】
ある実施形態において、キシランの分解または修飾は、キシラナーゼが活性を示す水性環境において行われる。
【0123】
ある実施形態において、キシラナーゼの変異体ポリペプチドは、接近可能なβ－１，４－Ｄ－キシロシド結合をランダムに加水分解する。
【0124】
ある実施形態において、第１の態様に係る変異体ポリペプチドの親キシラナーゼは、図１Ａおよび１ＢのＡＭ２４キシラナーゼホモログの１つである。ある実施形態において、配列番号１のアミノ酸１～１９１と７９％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するキシラナーゼの変異体ポリペプチドの親は、図１Ａおよび１ＢのキシラナーゼＡＭ２４のホモログのいずれかである。
【0125】
ある実施形態において、第１の態様に係る変異体ポリペプチドは、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体も含み、そのＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体は、配列番号１のアミノ酸１～１９１と７９％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する。
【0126】
ある実施形態において、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体は、配列番号１のアミノ酸１～１９１と７９％以上であるが１００％未満のアミノ酸配列同一性を有し、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体のアミノ酸配列は、キシラナーゼ活性、１～１９１アミノ酸領域内の２つのＣｙｓ残基の間の少なくとも１つのジスルフィド架橋、ならびに配列番号１の２３位もしくは２８位、または２３位および２８位、２３位および２８位に対応する位置におけるアミノ酸置換を有する。
【0127】
ある実施形態において、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体は、親ＡＭ２４キシラナーゼホモログと比較して、改善された安定性および／またはキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較して、改善された安定性および／またはキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体は、親ＡＭ２４キシラナーゼホモログと比較したとき、改善された熱安定性および／もしくはｐＨ安定性ならびに／または改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。ある実施形態において、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したとき、改善された熱安定性および／もしくはｐＨ安定性ならびに／または改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。
【0128】
ある実施形態において、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較して、および／または親ＡＭ２４キシラナーゼホモログと比較して、温度が７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上、最も好ましくは９６℃以上である反応条件において、改善された安定性および／またはキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較して、および／または親ＡＭ２４キシラナーゼホモログと比較して、ｐＨが２以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上または１１以上である反応条件において、改善された安定性および／またはキシラナーゼ活性を有する。ある実施形態において、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したときおよび／または親ＡＭ２４キシラナーゼホモログと比較したとき、温度が７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上、最も好ましくは少なくとも９６℃以上である反応条件において、改善された熱安定性および／もしくはｐＨ安定性ならびに／または改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。ある実施形態において、ＡＭ２４キシラナーゼホモログの変異体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドと比較したときおよび／または親ＡＭ２４キシラナーゼホモログと比較したとき、ｐＨが２以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上または１１以上である反応条件において、改善された熱安定性および／もしくはｐＨ安定性ならびに／または改善されたキシラナーゼ活性保持を有する。
【0129】
本開示の第２の態様のある実施形態において、キシラナーゼの本変異体ポリペプチドは、融合タンパク質である組換えポリペプチドの一部である。融合タンパク質は、キシラナーゼの活性に加えて、他の触媒活性または結合活性を有し得る。ある実施形態において、キシラナーゼの変異体ポリペプチドは、リンカーを用いてさらなるペプチドおよび／またはポリペプチドに接続される。
【0130】
ある実施形態において、融合タンパク質は、宿主細胞内外への組換えポリペプチドの移行において有利なシグナル配列を含む。ある実施形態において、シグナル配列は、キャリアポリペプチド配列を含むかまたは含まない。ある実施形態において、融合タンパク質は、糖質結合部分（ＣＢＭ）をキャリアポリペプチドとして含み、これは必要に応じて、キシラナーゼの変異体ポリペプチドと同じまたは異なる生物に由来する別のタンパク質または酵素のフラグメントである。シグナル配列およびキャリアポリペプチドは、同じ宿主に由来してもよいし、あるいは異なる宿主に由来してもよい。ある実施形態において、融合タンパク質は、同じ宿主細胞に由来するシグナル配列を含み、キシラナーゼ変異体ポリペプチドを含む融合タンパク質が、産生される。ある実施形態において、シグナル配列は、同じ糸状菌宿主に由来し、キシラナーゼ変異体ポリペプチドを含む融合タンパク質が産生される。別の実施形態では、シグナル配列は別の生物に由来する。
【0131】
ある実施形態において、融合タンパク質は、精製を容易にするアミノ酸配列、例えばＨｉｓタグまたはポリヒスチジンタグを含み、そのタグは、一続きのヒスチジン残基を含む。
【0132】
ある実施形態において、融合タンパク質は、酵素活性を有するアミノ酸配列を含み、酵素活性を有する前記配列は、キシラナーゼ活性を有する変異体ポリペプチドをコードするアミノ酸配列と同じ配列ではない。
【0133】
ある実施形態において、融合タンパク質は、その融合タンパク質に結合親和性を提供する糖質結合部分のアミノ酸配列を含む。
【0134】
ある実施形態において、酵素組成物は、
ａ．ポリオール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセロール、糖、糖アルコール、多糖、乳酸、ペプチド、界面活性剤またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの安定剤；あるいは有機酸、クエン酸、アスコルビン酸、安息香酸ならびにそれらの塩および誘導体、安息香酸ナトリウム、ベンゾエート、ヒドロキシベンゾエートおよび誘導体、リン酸塩、ソルビン酸、ソルビン酸ナトリウム、ソルベート、塩、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、１，２－ベンゾイソチアゾリン－３－オン（ＢＩＴ）またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの保存剤または緩衝剤；
ｂ．必要に応じて、ホウ酸、ホウ酸誘導体、芳香族ホウ酸エステル、４－ホルミルフェニルボロン酸、フェニルボロン酸誘導体、阻害活性を有するペプチド化合物またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの阻害剤；
ｃ．必要に応じて、メディエーターを伴うかもしくは伴わない、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ、ヌクレアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン分解酵素、ペクチン酸リアーゼ、カルボヒドラーゼ、アラビナーゼ（ａｒａｂｉｎａｓｅ）、ガラクタナーゼ、キサンタナーゼ（ｘａｎｔｈａｎａｓｅ）、キシログルカナーゼ（ｘｙｌｏｇｌｕｃａｎａｓｅ）、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素；および
ｄ．必要に応じて、マルトデキストリン、穀粉、塩化ナトリウム、スルフェート、硫酸ナトリウムまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの充填剤
をさらに含む。
ａ．ポリオール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセロール、糖、糖アルコール、多糖、乳酸、ペプチド、界面活性剤またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの安定剤；あるいは有機酸、クエン酸、アスコルビン酸、安息香酸ならびにそれらの塩および誘導体、安息香酸ナトリウム、ベンゾエート、ヒドロキシベンゾエートおよび誘導体、リン酸塩、ソルビン酸、ソルビン酸ナトリウム、ソルベート、塩、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、１，２－ベンゾイソチアゾリン－３－オン（ＢＩＴ）またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの保存剤または緩衝剤；
ｂ．必要に応じて、ホウ酸、ホウ酸誘導体、芳香族ホウ酸エステル、４－ホルミルフェニルボロン酸、フェニルボロン酸誘導体、阻害活性を有するペプチド化合物またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの阻害剤；
ｃ．必要に応じて、メディエーターを伴うかもしくは伴わない、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ、ヌクレアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン分解酵素、ペクチン酸リアーゼ、カルボヒドラーゼ、アラビナーゼ（ａｒａｂｉｎａｓｅ）、ガラクタナーゼ、キサンタナーゼ（ｘａｎｔｈａｎａｓｅ）、キシログルカナーゼ（ｘｙｌｏｇｌｕｃａｎａｓｅ）、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素；および
ｄ．必要に応じて、マルトデキストリン、穀粉、塩化ナトリウム、スルフェート、硫酸ナトリウムまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの充填剤
をさらに含む。
【0135】
成分ａ～ｄは、本酵素組成物に改善された特性を提供する。酵素組成物は、成分ａ～ｄと適合しており、様々な用途における酵素組成物の適用性を改善する。塩化ナトリウムおよび硫酸ナトリウムなどの塩が、乾燥助剤として機能する。
【0136】
ある実施形態において、キシラナーゼの変異体ポリペプチドおよび追加の酵素を含む酵素組成物は、相乗効果を提供するのに有利である。そのような追加の酵素は、キシラナーゼの変異体ポリペプチドを含む本酵素組成物が、例えば、パルプまたはサイレージの加工および飼料または食料品の調製において使用されるとき、望ましい。パルプまたはサイレージの加工においてキシラナーゼとともに働く特に有利な相乗的酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、フィターゼおよびアミラーゼである。飼料または食料品の調製で働く特に有利な相乗的酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、フィターゼおよびアミラーゼである。
【0137】
ある実施形態において、酵素組成物は、液体組成物または固体組成物、例えば、溶液、分散液、ペースト、粉末、細粒、顆粒、コーティングされた顆粒、錠剤、ケーク、結晶、結晶スラリー、ゲルまたはペレットの形態で提供される。
【0138】
ある実施形態において、酵素調製物または酵素組成物は、漂白剤、防食剤、ビルダー、再汚染防止剤、蛍光増白剤、染料、色素、香料、腐食剤、研磨剤および保存剤からなる群より選択される他の好適な添加剤をさらに含む。
【0139】
本開示はさらに、キシランを分解するための、本明細書中に開示されるような酵素組成物の使用および使用方法に関する。
【0140】
ある実施形態では、組換え宿主細胞が提供され、その宿主細胞は、
ａ．子嚢菌門、Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の糸状菌細胞；好ましくは、Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ綱またはＥｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ綱、Ｈｙｐｏｃｒｅｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ亜綱またはＳｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ亜綱またはＥｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ亜綱、Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ目またはＳｏｒｄａｒｉａｌｅｓ目またはＥｕｒｏｔｉａｌｅｓ目、Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａ科またはＮｅｃｔｒｉａｃｅａ科またはＣｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ科またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌａｃｅａｅ科、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属（Ｈｙｐｏｃｒｅａの無性世代）またはＦｕｓａｒｉｕｍ属またはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属またはＨｕｍｉｃｏｌａ属またはＴｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ属またはＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のメンバーからなる群の糸状菌細胞；
より好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）、Ｔ．ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｐａｒａｒｅｅｓｅｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｎｕｍ、Ｆ．ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ種からなる群の糸状菌細胞；
ｂ．細菌細胞、好ましくは、グラム陽性桿菌、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、グラム陰性細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、放線菌目、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．；および
ｃ．ｃ．酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
からなる群より選択され；
好ましくは、その宿主細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａなどの糸状菌細胞またはバチルスなどのグラム陽性桿菌；最も好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢ．ｐｕｍｉｌｕｓもしくはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから選択される。
ａ．子嚢菌門、Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の糸状菌細胞；好ましくは、Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ綱またはＥｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ綱、Ｈｙｐｏｃｒｅｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ亜綱またはＳｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ亜綱またはＥｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ亜綱、Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ目またはＳｏｒｄａｒｉａｌｅｓ目またはＥｕｒｏｔｉａｌｅｓ目、Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａ科またはＮｅｃｔｒｉａｃｅａ科またはＣｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ科またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌａｃｅａｅ科、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属（Ｈｙｐｏｃｒｅａの無性世代）またはＦｕｓａｒｉｕｍ属またはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属またはＨｕｍｉｃｏｌａ属またはＴｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ属またはＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のメンバーからなる群の糸状菌細胞；
より好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）、Ｔ．ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｐａｒａｒｅｅｓｅｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｎｕｍ、Ｆ．ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ種からなる群の糸状菌細胞；
ｂ．細菌細胞、好ましくは、グラム陽性桿菌、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、グラム陰性細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、放線菌目、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．；および
ｃ．ｃ．酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
からなる群より選択され；
好ましくは、その宿主細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａなどの糸状菌細胞またはバチルスなどのグラム陽性桿菌；最も好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢ．ｐｕｍｉｌｕｓもしくはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから選択される。
【0141】
ある実施形態において、組換え宿主細胞は、糸状菌細胞（例えば、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、ＴｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓまたはＴｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａあるいはＨｕｍｉｃｏｌａまたはＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓあるいはＦｕｓａｒｉｕｍまたはＦｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、細菌細胞、好ましくは、グラム陽性桿菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、グラム陰性菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、放線菌目（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｆｌｅｘｕｏｓａ）または酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群より選択される。
【0142】
組換え宿主細胞を用いることにより、キシラナーゼの変異体ポリペプチドを産生すること、およびそれをコードするポリヌクレオチドを含めることができる。組換え宿主細胞は、キシラナーゼの変異体ポリペプチドの産生を指示する１つ以上の調節配列に作動可能に連結され得る。組換え宿主細胞は、種々の特性を有するキシラナーゼの変異体の調製においても有用である。例えば、安定性または活性に有益な翻訳後修飾を提供する宿主細胞、または宿主細胞において産生されたキシラナーゼの変異体ポリペプチドの後処理を容易にする宿主細胞を選択することができる。
【0143】
ある実施形態において、宿主細胞は、非病原性である。これは、宿主細胞またはその産物を動物用飼料に使用する場合に特に有利である。
【0144】
第６の態様のある実施形態において、キシラン含有材料は、植物系材料または部分的に植物系の材料である。別の実施形態において、キシラン含有材料は、再生古紙；機械パルプ、ケミカルパルプ、セミケミカルパルプ、クラフトパルプもしくは他の製紙パルプ、木材パルプもしくは非木材パルプ、または発酵精練プロセスに供される繊維；あるいはグアーガムまたはローカストビーンガムを含む材料である。
【0145】
ある実施形態において、キシラナーゼの本変異体ポリペプチドまたは本酵素組成物は、パルプ漂白のようなパルプ加工に使用されて、セルロースの加水分解を促進し、パルプの精製効率を高める。キシラナーゼの本変異体ポリペプチドは、紙パルプからのリグニン放出を促進する際、ならびに塩素系化学物質およびヒドロ亜硫酸ナトリウムなどの有害な漂白剤の使用を低減する際に有用である。
【0146】
ある実施形態において、本開示に係るキシラナーゼの変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質または酵素組成物は、バイオマスの処理およびバイオマスの加水分解、ならびに排水の改善において使用される。キシラナーゼの本変異体ポリペプチドの使用は、リグノセルロース原料をリグノセルロース系バイオマスからエタノールなどのバイオ燃料に変換するためにキシラナーゼを使用することができる生物学的燃料の生成において有用である。
【0147】
キシラナーゼの本変異体ポリペプチドまたは本酵素が動物用飼料において使用される実施形態において、動物は、単胃動物または反芻動物である。別の実施形態において、動物は、ブロイラーチキン、産卵用ニワトリ、ブタ、仔ブタ、シチメンチョウ、または魚類などの水産養殖生物である。
【0148】
ある実施形態において、飼料は、動物用飼料であり、穀物および穀類、例えばトウモロコシおよびダイズミール、またはコムギ、オートムギ、オオムギおよび／もしくはイネを含むかまたはそれらからなる。キシラナーゼの本変異体ポリペプチドまたは本酵素が動物用飼料において使用される実施形態において、少なくとも１つのキシラン含有産物または副産物が、その飼料に提供される。キシラナーゼの本変異体ポリペプチドまたは本酵素が使用される飼料は、キシラナーゼの変異体ポリペプチドを含まない飼料と比較して改善された栄養価を有する。本酵素組成物およびキシラナーゼの本変異体ポリペプチドは、飼料中に存在するキシランを分解し、それにより、その飼料を動物にとってより消化しやすくする。特に、本酵素組成物およびキシラナーゼの本変異体ポリペプチドは、飼料中、例えばトウモロコシダイズ含有飼料中に存在するキシランを消化することができ、これは腸内微生物、ひいては動物の能力に対して有益な効果を有する。キシラナーゼの本変異体ポリペプチドまたは本酵素が使用される動物用飼料は、湿潤組成物または乾燥組成物の形態で製剤化され得る。
【0149】
本開示に係る変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質または酵素組成物が食品工業プロセスまたは商業用途において使用される実施形態において、前記プロセスまたは用途には、例えば、コーヒー、植物油、キシロース（キシリトールへの変換用）およびデンプンの抽出、植物繊維源からのゴムの除去、ベーキングおよび生地のコンディショナー産業（例えば、パンの製造）、ならびに飲料産業（アルコール発酵）が含まれる。
【0150】
本変異体ポリペプチド、本融合タンパク質および本酵素組成物の使用は、例えば、水不溶性キシランを可溶型に変換して、水の結合性を高めて、生地の硬さを低下させ、体積を増加させるベーキングにおいて有利である。また、本融合タンパク質および本酵素組成物は、豆乳製品の生産量、色、タンパク質含有量および味を改善するので、例えば、豆乳製品の加工および製造において有利である。本変異体ポリペプチド、本融合タンパク質および本酵素組成物を使用することは、果汁およびワインなどの飲料の清澄化プロセスを改善するので、飲料産業において有利である。
【実施例】
【0151】
実施例１．ＡＭ２４（切断型Ｎｆ＿Ｘｙｎ１１Ａ）変異体の設計
安定性をさらに改善することを目的として、好熱性ＡＭ２４キシラナーゼ（配列番号１）から変異体を設計した。ＡＭ２４は、Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｆｌｅｘｕｏｓａ Ｘｙｎ１１ＡであるＮｆ＿Ｘｙｎ１１Ａの切断型に対して用いられる名称である。ＡＭ２４は、完全長野生型Ｎｆ＿Ｘｙｎ１１Ａのアミノ酸Ｄ４４～Ｌ２６３を含んでおり、ゆえに完全長野生型Ｎｆ＿Ｘｙｎ１１Ａの糖質結合ドメイン（ＣＢＭ）およびリンカー領域のほとんどが欠失している（Ｌｅｓｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
安定性をさらに改善することを目的として、好熱性ＡＭ２４キシラナーゼ（配列番号１）から変異体を設計した。ＡＭ２４は、Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｆｌｅｘｕｏｓａ Ｘｙｎ１１ＡであるＮｆ＿Ｘｙｎ１１Ａの切断型に対して用いられる名称である。ＡＭ２４は、完全長野生型Ｎｆ＿Ｘｙｎ１１Ａのアミノ酸Ｄ４４～Ｌ２６３を含んでおり、ゆえに完全長野生型Ｎｆ＿Ｘｙｎ１１Ａの糖質結合ドメイン（ＣＢＭ）およびリンカー領域のほとんどが欠失している（Ｌｅｓｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【0152】
上記変異体では、ＡＭ２４の３位および３０位の天然のアミノ酸をシステイン（Ｃ）に変更することにより、Ｎ末端へのジスルフィド（ＳＳ）架橋を構築した。その分子のＮ末端部分における２つの追加の位置であるアミノ酸位置２３および／または２８にも変異が入るように設計された。
【0153】
【表1】
【0154】
実施例２．近いＮｆ Ｘｙｎ１１Ａホモログからの変異体の設計
Ｎｆ Ｘｙｎ１１Ａ（ＡＭ２４）コア領域に最も近い相同性を有する配列のｂｌａｓｔｐ（タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ）検索を、非冗長タンパク質配列のＮＣＢＩタンパク質データベース（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins）から行った。Ｎｆ＿Ｘｙｎ１１Ａコアのアミノ酸配列（Ｌｅｓｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５に従って成熟コア領域を表す、配列番号１からのアミノ酸１～１９１）をクエリー配列として用いた。アルゴリズムパラメータは、以下のとおりだった：最大標的配列：１００；期待閾値：１０；ワードサイズ：６；行列ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：あり：１１、伸長：１；組成調整：条件付き組成スコアマトリクス調整。１００個のホモログの配列をダウンロードし、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ多重配列アラインメント（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）をデフォルト設定で用いてアラインメントした。ＡＭ２４コア配列に対する配列の最も低い同一性は、７９．０％だった。
Ｎｆ Ｘｙｎ１１Ａ（ＡＭ２４）コア領域に最も近い相同性を有する配列のｂｌａｓｔｐ（タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ）検索を、非冗長タンパク質配列のＮＣＢＩタンパク質データベース（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins）から行った。Ｎｆ＿Ｘｙｎ１１Ａコアのアミノ酸配列（Ｌｅｓｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５に従って成熟コア領域を表す、配列番号１からのアミノ酸１～１９１）をクエリー配列として用いた。アルゴリズムパラメータは、以下のとおりだった：最大標的配列：１００；期待閾値：１０；ワードサイズ：６；行列ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：あり：１１、伸長：１；組成調整：条件付き組成スコアマトリクス調整。１００個のホモログの配列をダウンロードし、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ多重配列アラインメント（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）をデフォルト設定で用いてアラインメントした。ＡＭ２４コア配列に対する配列の最も低い同一性は、７９．０％だった。
【0155】
同一性マトリックス（系統樹）を、ＡＭ２４コアおよびＡＭ２４の最も近い１００個のホモログから作成した。その系統樹は、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａウェブサイト（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）のＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒｅｅプログラムを用いて、アラインメントされた配列から作成され、図１Ａおよび図１Ｂに示されている。各キシラナーゼ配列に対するデータベースコードが含まれている。アライメントにはデフォルト設定を使用した。
【0156】
１００個のＡＭ２４キシラナーゼホモログから、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉにおいて産生される６つのキシラナーゼを選択した。さらに、それら６つのＡＭ２４ホモログの各々から２つの変異体を設計した。作製のために選択したキシラナーゼを表２に示す。上記の６つのアミノ酸配列とＡＭ２４配列（配列番号１）とのアラインメントに基づいて、６つのＡＭ２４ホモログのアミノ酸配列をＮ末端および／またはＣ末端からトリミングして、各キシラナーゼの推定コア領域を表した。産生されるように選択された６つのＡＭ２４キシラナーゼホモログのＡＭ２４配列とトリミングされた（コア）配列とのアラインメントを図２に示す。ＡＭ２４コア配列は、配列番号１のアミノ酸１～１９１を含む。
【0157】
上述の６つのキシラナーゼの各々のコア配列から、２タイプのＡＭ２４キシラナーゼホモログ変異体を設計した。第１のタイプの変異体では、３位および３０位の天然のアミノ酸をシステインに変更することによって、キシラナーゼのＮ末端にＳＳ架橋を付加した。ＡＭ２４変異体Ｃ３１－４（実施例１、表１）の設計に使用したのと同じストラテジーを用いて、第２のタイプの変異体を設計した。これらのＡＭ２４ホモログ変異体は、ＳＳ架橋（３位および３０位のＣ）を含み、さらに、２３位および２８位のアミノ酸が元々、天然のアミノ酸ではないとき、２３位のアミノ酸をセリンに、２８位のアミノ酸をイソロイシンに変更した。設計された変異体および作製された変異の詳細を表２に列挙する。
【0158】
【表2】
【0159】
上記アミノ酸配列（配列番号３０、３３、３６、３９、４２および４５）とＡＭ２４コア領域（配列番号１のアミノ酸１～１９１）との同一性パーセンテージは、７９．０～９６．３％だった。ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラム（https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）をデフォルト設定（行列ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン１０、ギャップ伸長０．５、エンドギャップペナルティ偽、エンドギャップオープン１０、エンドギャップ伸長０．５）で用いて同一性マトリックスを作成した。同一性パーセントマトリックスを表３に示す。
【0160】
【表3】
【0161】
実施例３．キシラナーゼおよびキシラナーゼ変異体を産生するための発現カセットおよびプラスミドの構築
ＡＭ２４は、２つの構築物から発現された。配列番号４８の塩基配列は、発現カセットｐＡＬＫ１５０２（Ｐａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）に含まれているものに対応する。配列番号５６では、ＡＭ２４をコードする遺伝子の内部ＮｒｕＩ部位が、サイレンシングされており、また、それらのコドンには他の修飾がほとんどない（さらなる詳細については、配列表を参照のこと）。しかしながら、配列番号４８および配列番号５６は、同一のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする。ＡＭ２４変異体は、ｐＡＬＫ１５０２を鋳型として使用するＰＣＲおよび制限／ライゲーション法を用いて合成されたか、または合成遺伝子として発注された。ＡＭ２４ホモログおよびそれらの変異体をコードするすべての遺伝子を合成遺伝子として発注した。発注された合成ＡＭ２４変異体のアミノ酸置換（すなわち変異）において使用されるコドンは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのコドン使用頻度に基づいて選択された。ＡＭ２４ホモログをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのコドン使用頻度に従ってコドン最適化した。細菌キシラナーゼの収率を改善するために、成熟キシラナーゼをコードする配列を、発現構築物内のキャリアポリペプチドをコードする配列に融合した。使用されたキャリアは、Ｐａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）においてｐＡＬＫ１５０２について記載されているように、天然ＣＢＨＩＩ由来のＴ．ｒｅｅｓｅｉセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩＩ）ＣＢＤ（Ａ）およびヒンジ（Ｂ）領域だった。Ｋｅｘ２プロテアーゼ切断部位（ＲＤＫＲ）をコードする配列を、キャリアとキシラナーゼをコードする配列との間に挿入した。発現カセットに含まれるキシラナーゼヌクレオチド配列の配列番号を表１および２に列挙する。それらの遺伝子構築物を、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼ１）プロモーターを使用して発現させた。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｃｂｈ１またはｃｂｈ２ターミネーターのいずれかを使用して、転写を終結させた。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼをコードする天然遺伝子または合成遺伝子のいずれかを、形質転換マーカーとして発現構築物に含めた。
ＡＭ２４は、２つの構築物から発現された。配列番号４８の塩基配列は、発現カセットｐＡＬＫ１５０２（Ｐａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）に含まれているものに対応する。配列番号５６では、ＡＭ２４をコードする遺伝子の内部ＮｒｕＩ部位が、サイレンシングされており、また、それらのコドンには他の修飾がほとんどない（さらなる詳細については、配列表を参照のこと）。しかしながら、配列番号４８および配列番号５６は、同一のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする。ＡＭ２４変異体は、ｐＡＬＫ１５０２を鋳型として使用するＰＣＲおよび制限／ライゲーション法を用いて合成されたか、または合成遺伝子として発注された。ＡＭ２４ホモログおよびそれらの変異体をコードするすべての遺伝子を合成遺伝子として発注した。発注された合成ＡＭ２４変異体のアミノ酸置換（すなわち変異）において使用されるコドンは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのコドン使用頻度に基づいて選択された。ＡＭ２４ホモログをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのコドン使用頻度に従ってコドン最適化した。細菌キシラナーゼの収率を改善するために、成熟キシラナーゼをコードする配列を、発現構築物内のキャリアポリペプチドをコードする配列に融合した。使用されたキャリアは、Ｐａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）においてｐＡＬＫ１５０２について記載されているように、天然ＣＢＨＩＩ由来のＴ．ｒｅｅｓｅｉセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩＩ）ＣＢＤ（Ａ）およびヒンジ（Ｂ）領域だった。Ｋｅｘ２プロテアーゼ切断部位（ＲＤＫＲ）をコードする配列を、キャリアとキシラナーゼをコードする配列との間に挿入した。発現カセットに含まれるキシラナーゼヌクレオチド配列の配列番号を表１および２に列挙する。それらの遺伝子構築物を、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼ１）プロモーターを使用して発現させた。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｃｂｈ１またはｃｂｈ２ターミネーターのいずれかを使用して、転写を終結させた。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼをコードする天然遺伝子または合成遺伝子のいずれかを、形質転換マーカーとして発現構築物に含めた。
【0162】
実施例４．Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉにおけるキシラナーゼおよびキシラナーゼ変異体の産生
上記キシラナーゼ発現構築物を、発現プラスミドから単離された発現カセットまたは発現プラスミドのいずれかとして、Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）およびＫａｒｈｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）に記載されているようにＴ．ｒｅｅｓｅｉプロトプラストに形質転換した。各形質転換から３～２０個の形質転換体を拾って、ポテトデキストロース（ＰＤ）斜面において胞子形成させた。ＰＤ斜面由来の胞子を使用して、振盪フラスコ培養物（５０ｍＬ体積）に接種した。培養をセルラーゼ誘導培地において７日間行った（３０℃、２５０ｒｐｍ）。培養を終了した後、サンプルを採取し、真菌の菌糸体を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）により除去し、培養上清を解析のために収集した。
上記キシラナーゼ発現構築物を、発現プラスミドから単離された発現カセットまたは発現プラスミドのいずれかとして、Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）およびＫａｒｈｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）に記載されているようにＴ．ｒｅｅｓｅｉプロトプラストに形質転換した。各形質転換から３～２０個の形質転換体を拾って、ポテトデキストロース（ＰＤ）斜面において胞子形成させた。ＰＤ斜面由来の胞子を使用して、振盪フラスコ培養物（５０ｍＬ体積）に接種した。培養をセルラーゼ誘導培地において７日間行った（３０℃、２５０ｒｐｍ）。培養を終了した後、サンプルを採取し、真菌の菌糸体を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）により除去し、培養上清を解析のために収集した。
【0163】
キシラナーゼの産生を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析および活性アッセイを用いて解析した。Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）に従ったが反応条件としてｐＨ７（５．３の代わりに）および７０℃（５０℃の代わりに）を用いて、キシラナーゼ活性を計測した。
【0164】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでは、すべてのサンプルにおいて、対応するキシラナーゼおよびキシラナーゼ変異体の予想分子量のタンパク質バンドが認められた。また、すべてのキシラナーゼから、それらのゲルにおいてグリコシル化型も認められた。
【0165】
使用した解析方法を用いて、ＸＢ６およびその変異体を除く産生されたすべてのキシラナーゼおよびキシラナーゼ変異体の培養上清からキシラナーゼ活性を計測することができた。ＸＢ６およびその変異体の培養上清から計測したとき、キシラナーゼ活性が得られなかったか、または活性が検出レベル未満だった。
【0166】
実施例５．キシラナーゼおよびキシラナーゼ変異体の解析
３つの異なる解析方法を用いて、培養上清中のキシラナーゼおよびキシラナーゼ変異体の安定性を調べた：
１）すべてのキシラナーゼのアンフォールディング温度を、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ）を用いて解析した。ＡＭ２４およびＡＭ２４変異体の解析を、ｐＨを１０に調整した０．２Ｍグリシン－ＮａＯＨ緩衝液中に精製キシラナーゼを含むサンプルから行った。サンプルを含む緩衝液のｐＨは、９．９２だった（サンプルのｐＨは、４．３２～４．３８の範囲だった）。ＡＭ２４ホモログおよびそれらの変異体のアンフォールディング温度を培養上清から直接解析した。解析に使用された温度範囲は、２０～１１０℃（加熱速度＋１℃／分）だった。さらに、ＡＭ２４およびＡＭ２４変異体のアンフォールディング温度も、２００ｍＭ酢酸Ｎａ緩衝液中、低ｐＨ（３．５および４．５）において解析した。
２）Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）の活性アッセイの変法を以下の通り用いることによって、選択されたサンプルから熱安定性を解析した：使用した反応時間は、５分および６０分であり、反応ｐＨは７であり、反応温度は７０、８０、９０および９６℃だった。さらに、ＡＭ２４およびＡＭ２４変異体サンプルから、７０、８０、９０および９６℃で５分間の反応時間ならびに７０および８０℃で６０分間の反応時間を使用して、ｐＨ ８および９において熱安定性を解析した。
３）ＡＭ２４およびＡＭ２４変異体サンプルをｐＨ１１、９０℃で６０分間インキュベートした後、５分間の反応時間を用いて、ｐＨ７、７０℃においてそれらのサンプルから残留キシラナーゼ活性を計測した。
３つの異なる解析方法を用いて、培養上清中のキシラナーゼおよびキシラナーゼ変異体の安定性を調べた：
１）すべてのキシラナーゼのアンフォールディング温度を、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ）を用いて解析した。ＡＭ２４およびＡＭ２４変異体の解析を、ｐＨを１０に調整した０．２Ｍグリシン－ＮａＯＨ緩衝液中に精製キシラナーゼを含むサンプルから行った。サンプルを含む緩衝液のｐＨは、９．９２だった（サンプルのｐＨは、４．３２～４．３８の範囲だった）。ＡＭ２４ホモログおよびそれらの変異体のアンフォールディング温度を培養上清から直接解析した。解析に使用された温度範囲は、２０～１１０℃（加熱速度＋１℃／分）だった。さらに、ＡＭ２４およびＡＭ２４変異体のアンフォールディング温度も、２００ｍＭ酢酸Ｎａ緩衝液中、低ｐＨ（３．５および４．５）において解析した。
２）Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）の活性アッセイの変法を以下の通り用いることによって、選択されたサンプルから熱安定性を解析した：使用した反応時間は、５分および６０分であり、反応ｐＨは７であり、反応温度は７０、８０、９０および９６℃だった。さらに、ＡＭ２４およびＡＭ２４変異体サンプルから、７０、８０、９０および９６℃で５分間の反応時間ならびに７０および８０℃で６０分間の反応時間を使用して、ｐＨ ８および９において熱安定性を解析した。
３）ＡＭ２４およびＡＭ２４変異体サンプルをｐＨ１１、９０℃で６０分間インキュベートした後、５分間の反応時間を用いて、ｐＨ７、７０℃においてそれらのサンプルから残留キシラナーゼ活性を計測した。
【0167】
高ｐＨ（緩衝液のｐＨを１０に調整した）でのＡＭ２４キシラナーゼのアンフォールディング温度は、８４．８℃だった（表４）。ＮＦＸ２３を除くすべてのＡＭ２４変異体が、ＡＭ２４よりも高いアンフォールディング温度を有した。高ｐＨでのＡＭ２４変異体のアンフォールディング温度は、８７．６ ～１０４．３℃だった（ＮＦＸ２３の場合、６７．５℃）。
【0168】
【表4】
【0169】
ｐＨ３．５において、ＡＭ２４のアンフォールディング温度は、６１．４℃であり、ｐＨ ４．５では７５．２℃だった。ＡＭ２４変異体Ｃ３１－４のアンフォールディング温度は、低ｐＨにおいてＡＭ２４のそれよりも明らかに良好であり、ｐＨ３．５で８４．１℃およびｐＨ４．５で１０５．２℃だった。この結果は、記載された変異が、広いｐＨ範囲において親キシラナーゼの安定性を改善することを示している。
【0170】
高ｐＨ（緩衝液ｐＨを１０に調整した）でのＡＭ２４ホモログのアンフォールディング温度は、６３．６～７８．１℃だった（表５）。ＡＭ２４ホモログの変異体のアンフォールディング温度は、ＳＳ架橋を付加したとき、改善された。しかしながら、ＳＳ架橋と、２３位および／または２８位における追加の変異との両方を含めたとき、アンフォールディング温度のさらに高い改善が得られた。対応する親キシラナーゼと比較して、アンフォールディング温度の最も高い上昇は、ＸＢ３Ｍ２で＋２６．８℃、ＸＢ５Ｍ２で＋３３．５℃だった（表５）。
【0171】
【表5】
【0172】
ＡＭ２４およびその変異体の選択されたセット：ＳＳ架橋形成変異のみを有する変異体（Ｔ３ＣおよびＴ３０Ｃ；ＡＭ２４－ＣＣ）、ＳＳ架橋形成変異を有さず、２３位および／または２８位に変異を有する変異体（ＡＭ２４－ＡＳ、ＡＭ２４－ＳＩ、ＡＭ２４－ＡＳ＋ＳＩ）、ならびにＳＳ架橋形成システイン変異と組み合わされた２３位および／または２８位に変異を有する変異体（ＡＭ２４－ＣＣ＋ＡＳ、ＡＭ２４－ＣＣ＋ＳＩ、Ｃ３１－４）の培養上清から熱安定性を解析した。ｐＨ７において５分および６０分の反応時間を用いて行った解析の結果を、それぞれ図３Ａおよび図３Ｂに示す。最高温度（９０および／または９６℃）では、ＡＭ２４の熱安定性とその変異体の熱安定性との間に明確な差が検出され、ＡＭ２４変異体は、ＡＭ２４よりも熱安定性が高かった。２３位または２８位の変異は、ＡＭ２４の熱安定性を改善した。これらの２つの変異を組み合わせると、熱安定性のさらなる改善が得られた。Ｎ末端にＳＳ架橋を含めると、ＡＭ２４の熱安定性の明らかな改善が得られた。しかしながら、２３位または２８位の変異とＳＳ架橋とを１つの分子において組み合わせると、熱安定性のさらなる改善が検出された。２３位と２８位の変異の両方をＳＳ架橋と組み合わせたとき、最善の熱安定性が達成された。
【0173】
ＡＭ２４および変異体Ｃ３１－４の熱安定性を、５分および６０分の反応時間を用いてｐＨ８および９というより高いｐＨ値でさらに解析した。反応温度は、５分のアッセイでは７０、８０、９０および９６℃（図４Ａおよび図４Ｃ）であり、６０分のアッセイでは７０および８０℃（図４Ｂおよび図４Ｄ）だった。ｐＨ８で行われた解析では、５分のアッセイにおけるＣ３１－４の熱安定性は、９０および９６℃の最高試験温度（図４Ａ）ならびに８０℃での６０分のアッセイ（図４Ｂ）におけるＡＭ２４の熱安定性よりも明らかに良好だった。ｐＨ ９の解析では、５分のアッセイにおけるＣ３１－４の熱安定性は、すべての試験温度（図４Ｃ）および８０℃での６０分のアッセイ（図４Ｄ）において明らかにより良好だった。
【0174】
行われた第３の熱安定性試験では、サンプルをｐＨ１１、９０℃で６０分間インキュベートした後、ＡＭ２４およびＣ３１－４培養上清から残留キシラナーゼ活性を計測した。解析は、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎおよびリン酸Ｎａの２つの緩衝系を用いて行われた。残留キシラナーゼ活性は、ｐＨ７、７０℃、５分の反応時間を用いて計測された。Ｃ３１－４は、ＡＭ２４よりも良好に、過酷な条件に耐えた。Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液では、元の活性のおよそ２０％（サンプルＢＲ／１およびＢＲ／２）およびリン酸Ｎａ緩衝液では、およそ２６％（サンプルＮａＰ／１およびＮａＰ／２）がＣ３１－４サンプルに残っていたのに対して、ＡＭ２４サンプルでは元の活性の２～３％しか残っていなかった（図５）。
【0175】
実施例６．応用研究のためのＡＭ２４およびＣ３１－４キシラナーゼの産生
ＡＭ２４またはＣ３１－４を産生するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株を３０Ｌバイオリアクターにおいて培養して、応用試験用の材料を産生した。発酵は、セルラーゼ誘導培地中でのフェドバッチ培養として行われた。発酵が終了した後、菌糸体を濾過工程によって除去し、培養上清を収集し、濃縮した。得られた酵素調製物を漂白試験において使用した。
ＡＭ２４またはＣ３１－４を産生するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株を３０Ｌバイオリアクターにおいて培養して、応用試験用の材料を産生した。発酵は、セルラーゼ誘導培地中でのフェドバッチ培養として行われた。発酵が終了した後、菌糸体を濾過工程によって除去し、培養上清を収集し、濃縮した。得られた酵素調製物を漂白試験において使用した。
【0176】
ＡＭ２４およびＣ３１－４の産生された酵素調製物は、等量の対応するキシラナーゼ酵素を含み、前記酵素調製物中の総タンパク質の半分超が、それぞれのキシラナーゼからなっていた。等量のＡＭ２４およびＣ３１－４キシラナーゼを漂白試験において使用した。
【0177】
実施例７．高ｐＨおよび高温でのキシラナーゼ前処理を用いたユーカリクラフトパルプの漂白
短い漂白シーケンスＸＤ0Ｅ（Ｘ、酵素；Ｄ0（Ｄゼロ）、二酸化塩素（ＣｌＯ2）；Ｅ、水酸化ナトリウムでの抽出）を使用して、高温（９０℃）でのＡＭ２４およびＣ３１－４キシラナーゼによる前処理の漂白効率を比較した。前処理は、ｐＨ約８およびｐＨ約１０の２つのｐＨ値で行われた。使用したパルプは、カッパー価１５．５および白色度３８．０ＩＳＯ％を有するアジアミルからの酸素脱リグニンユーカリクラフトパルプだった。一定のＣｌＯ2適用量（０．２×カッパー価）を使用した。漂白試験を漂白反応器において行った。アンカー型Ｋｅｍｕ反応容器（バッチサイズ０．１５～１．０ｋｇ、Ｔｍａｘ ９０℃、粘稠度２５％）をＸ段階およびＥ段階で使用し、空気加熱したＨｅｌｌｓｔｅｎ反応容器（バッチサイズ０．３～０．８ｋｇ、Ｔｍａｘ ８５℃、粘稠度１２％）をＤ0段階において使用した。
短い漂白シーケンスＸＤ0Ｅ（Ｘ、酵素；Ｄ0（Ｄゼロ）、二酸化塩素（ＣｌＯ2）；Ｅ、水酸化ナトリウムでの抽出）を使用して、高温（９０℃）でのＡＭ２４およびＣ３１－４キシラナーゼによる前処理の漂白効率を比較した。前処理は、ｐＨ約８およびｐＨ約１０の２つのｐＨ値で行われた。使用したパルプは、カッパー価１５．５および白色度３８．０ＩＳＯ％を有するアジアミルからの酸素脱リグニンユーカリクラフトパルプだった。一定のＣｌＯ2適用量（０．２×カッパー価）を使用した。漂白試験を漂白反応器において行った。アンカー型Ｋｅｍｕ反応容器（バッチサイズ０．１５～１．０ｋｇ、Ｔｍａｘ ９０℃、粘稠度２５％）をＸ段階およびＥ段階で使用し、空気加熱したＨｅｌｌｓｔｅｎ反応容器（バッチサイズ０．３～０．８ｋｇ、Ｔｍａｘ ８５℃、粘稠度１２％）をＤ0段階において使用した。
【0178】
パルプ１トンあたりおよそ２ｇの総タンパク質を使用した。両方のキシラナーゼ産物が、類似の相対量のキシラナーゼタンパク質を含んでいた（実施例６）。酵素処理時間は、６０分だった。
【0179】
酵素段階の後、熱水を添加し、直ちにパルプ懸濁液のｐＨをｐＨ値２．５～３に調整することによって、酵素を失活させた。Ｅ段階後に白色度およびカッパー価を解析した。
【0180】
【表6】
【0181】
キシラナーゼＡＭ２４とＣ３１－４との両方による前処理は、ユーカリパルプの白色度を改善した。ｐＨ８においてＣ３１－４で前処理されたパルプは、参照パルプよりも２．８単位高い白色度を有し、ＡＭ２４で処理されたパルプよりも１．０単位高い白色度を有した。Ｃ３１－４処理パルプにおけるｐＨ８でのΔカッパーあたりの活性塩素（ａＣｌ）の使用量は、ＡＭ２４処理パルプよりも０．２ｋｇ／ｔ低く、ΔＢｒあたりの活性塩素の使用量は０．０７ｋｇ／ｔ低く、参照パルプよりもそれぞれ０．２８ｋｇ／ｔおよび０．１９ｋｇ／ｔ低かった（表６）。
【0182】
キシラナーゼ前処理をｐＨ１１で行ったとき、ＡＭ２４処理は、参照パルプと比較して利益をもたらさなかった。しかしながら、Ｃ３１－４処理パルプは、参照パルプよりも、２．７単位高い白色度を有し、Δカッパーあたりの活性塩素（ａＣｌ）使用量は０．０９ｋｇ／ｔ低く、ΔＢｒあたりの活性塩素使用量は、０．１８ｋｇ／ｔ低かった（表６）。
【0183】
検出された白色度（％）の上昇は、有意であり、ＡＭ２４キシラナーゼ変異体Ｃ３１－４を、高ｐＨおよび高温におけるパルプおよび他の材料の前処理または処理に使用できることを示している。
【0184】
実施例８．高ｐＨおよび高温でのＣ３１－４を用いた軟材（ＳＷ）クラフトパルプの漂白
高温および高ｐＨでの軟材パルプの漂白におけるＣ３１－４の効率を、一定のＣｌＯ2投入量（０．２×カッパー価）で短い漂白シーケンスＸＤ0Ｅ（Ｘ、酵素；Ｄ0（Ｄゼロ）、ＣｌＯ2、二酸化塩素；Ｅ、水酸化ナトリウムでの抽出）を使用することによって試験した。漂白試験を、漂白反応容器において全シーケンスで実施した。アンカー型Ｋｅｍｕ反応容器（バッチサイズ０．１５～１．０ｋｇ、Ｔｍａｘ ９０℃、粘稠度２５％）をＸ段階およびＥ段階で使用し、空気加熱したＨｅｌｌｓｔｅｎ反応容器（バッチサイズ０．３～０．８ｋｇ、Ｔｍａｘ ８５℃、粘稠度１２％）をＤ0段階において使用した。
高温および高ｐＨでの軟材パルプの漂白におけるＣ３１－４の効率を、一定のＣｌＯ2投入量（０．２×カッパー価）で短い漂白シーケンスＸＤ0Ｅ（Ｘ、酵素；Ｄ0（Ｄゼロ）、ＣｌＯ2、二酸化塩素；Ｅ、水酸化ナトリウムでの抽出）を使用することによって試験した。漂白試験を、漂白反応容器において全シーケンスで実施した。アンカー型Ｋｅｍｕ反応容器（バッチサイズ０．１５～１．０ｋｇ、Ｔｍａｘ ９０℃、粘稠度２５％）をＸ段階およびＥ段階で使用し、空気加熱したＨｅｌｌｓｔｅｎ反応容器（バッチサイズ０．３～０．８ｋｇ、Ｔｍａｘ ８５℃、粘稠度１２％）をＤ0段階において使用した。
【0185】
試験で使用されたパルプは、以下の特性を有するスカンジナビアミルからの酸素脱リグニンＳＷクラフトだった：カッパー価２５．６、粘度１１４０ｍｌ／ｇおよび白色度２６．８ＩＳＯ％。Ｃ３１－４酵素調製物の投与量は、パルプ１トンあたりおよそ２ｇの総タンパク質だった。種々の漂白段階において使用された条件を、表７～９に記載している。
【0186】
Ｘ段階の後、パルプを３回洗浄した。最初の洗浄は、反応温度（９０℃）の水を用いて行い、続いて冷水（４℃）で２回洗浄した。洗浄工程の後、遠心分離処理（２６００ｒｐｍ、１０秒）を行って水を除去し、約１０～１５ｇ（オーブン乾燥で計測）のパルプサンプルを解析のために収集した。さらに、パルプ量をよりうまく調整するためにＩＲ乾燥機を使用して、Ｃ３１－４処理サンプルの乾物分析を行った。パルプサンプルのカッパー価および白色度を解析した。
【0187】
試験の結果を表１０に詳細に示す。
【0188】
【表7】
【0189】
【表8】
【0190】
【表9】
【0191】
【表10】
【0192】
ｐＨ１０．５においてＣ３１－４で前処理された軟材クラフトパルプは、参照パルプ（酵素を使用しない）と比較して、同じ５．４％の活性塩素消費量で２．７単位高い補正済み最終白色度を有した。
【0193】
実施例９．中性ｐＨおよび低温でのＡＭ２４キシラナーゼと比較したときの、高ｐＨおよび高温でＣ３１－４を使用した軟材（ＳＷ）クラフトパルプの漂白
軟材パルプおよび実施例８のような条件を用いた漂白試験を、ＡＭ２４およびＣ３１－４キシラナーゼを用いて繰り返した。パルプをｐＨ１１および６０℃で約３０分間洗浄した後、その特徴付けおよび実験を行った。洗浄工程の後、パルプのカッパー価は１６．７、粘度は１０５０ｍｌ／ｇ、白色度は３２．６ＩＳＯ％だった。両方の酵素（Ｃ３１－４およびＡＭ２４）の投与量は、パルプ１トンあたり２ｇの総タンパク質だった。キシラナーゼ処理、漂白および抽出の段階において使用した条件を表１１～１３に記載する。ＡＭ２４キシラナーゼは、このようなパルプミル条件では不活性であることが知られているが、Ｃ３１－４変異体は、以前に行われた実験に基づいて、これらの条件（ｐＨ１０．５／９０℃）において機能することができると予想されたので、キシラナーゼ処理段階（Ｘ段階）において、これら２つの酵素を、異なるｐＨおよび温度において適用した。
軟材パルプおよび実施例８のような条件を用いた漂白試験を、ＡＭ２４およびＣ３１－４キシラナーゼを用いて繰り返した。パルプをｐＨ１１および６０℃で約３０分間洗浄した後、その特徴付けおよび実験を行った。洗浄工程の後、パルプのカッパー価は１６．７、粘度は１０５０ｍｌ／ｇ、白色度は３２．６ＩＳＯ％だった。両方の酵素（Ｃ３１－４およびＡＭ２４）の投与量は、パルプ１トンあたり２ｇの総タンパク質だった。キシラナーゼ処理、漂白および抽出の段階において使用した条件を表１１～１３に記載する。ＡＭ２４キシラナーゼは、このようなパルプミル条件では不活性であることが知られているが、Ｃ３１－４変異体は、以前に行われた実験に基づいて、これらの条件（ｐＨ１０．５／９０℃）において機能することができると予想されたので、キシラナーゼ処理段階（Ｘ段階）において、これら２つの酵素を、異なるｐＨおよび温度において適用した。
【0194】
【表11】
【0195】
【表12】
【0196】
【表13】
【0197】
実験の結果を表１４に含める。
【0198】
【表14】
【0199】
ｐＨ１０．５／９０℃においてＣ３１－４で前処理されたスカンジナビア軟材クラフトパルプは、ＸＤ0Ｅ漂白シーケンス全体を通して同一の条件で、参照パルプ（酵素を使用しない）と比較して２．８単位高い白色度を有した。結果から、Ｃ３１－４が高ｐＨおよび高温の条件において白色度を改善することが確認された。ＡＭ２４キシラナーゼは、Ｘ段階（ｐＨ７／８０℃）において、調整された条件ならびにＤ0段階およびＥ段階においてＣ３１－４に対して使用されたのと同一条件において、１．２単位の白色度上昇を示した。
【0200】
実施例１０．飼料用途における好熱性キシラナーゼ変異体の使用
記載される好熱性キシラナーゼ変異体は、動物、例えば、ブタおよびブロイラーの給餌に使用され得る。それらは、単独で、または他の酵素、例えば、フィターゼおよび／もしくはマンナナーゼと組み合わせて使用され得る。
記載される好熱性キシラナーゼ変異体は、動物、例えば、ブタおよびブロイラーの給餌に使用され得る。それらは、単独で、または他の酵素、例えば、フィターゼおよび／もしくはマンナナーゼと組み合わせて使用され得る。
【0201】
ブロイラーの成長に対する本発明の組換えキシラナーゼ変異体の効果を調べる。組換えキシラナーゼを含む発酵ブロスの限外濾過液を乾燥させ、目標レベルを、単独でまたは商業的に入手可能な他の酵素と組み合わせてペレット化ブロイラー食餌に適用する。キシラナーゼ酵素を含まないコントロール食を与える。食餌は、穀類として、ライムギおよびコムギまたはトウモロコシに基づく。
【0202】
ブロイラーの初期体重は、３８～４２ｇである。試験は、５～６週間継続する。各処理は、それぞれ１０羽のブロイラーを用いた最低６回の反復からなる。いずれの場合も、食餌を、水分、粗タンパク質、粗繊維、脂肪、灰分および酵素タンパク質について解析する。
【0203】
以下に記載されるように、選択された各キシラナーゼ変異体を用いて試験するために５種の食餌を調製する。処理の基準として、親キシラナーゼを投与する。
１）無補充コントロール（ＢＤ）
２）ＢＤ＋選択されたキシラナーゼ親酵素１～１０ｍｇ／ｋｇ
３）ＢＤ＋上記の親キシラナーゼの変異体、上記と同じ投与量
３）ＢＤ＋選択されたキシラナーゼ親酵素１～１０ｍｇ／ｋｇ、１）と比較して異なる投与量
４）ＢＤ＋上記の親キシラナーゼの変異体、上記と同じ投与量
１）無補充コントロール（ＢＤ）
２）ＢＤ＋選択されたキシラナーゼ親酵素１～１０ｍｇ／ｋｇ
３）ＢＤ＋上記の親キシラナーゼの変異体、上記と同じ投与量
３）ＢＤ＋選択されたキシラナーゼ親酵素１～１０ｍｇ／ｋｇ、１）と比較して異なる投与量
４）ＢＤ＋上記の親キシラナーゼの変異体、上記と同じ投与量
【0204】
動物の健康状態および死亡を、目視検査によって毎日チェックする。０、１４、２１および３５日目に、体重増加（ＢＷ）、飼料摂取量（ＦＩ）および飼料転換比（ＦＣＲ）を計測する。ＦＣＲは、同じ期間中の、消費された総飼料を体重増加量で除算したものとして計算される。組換えキシラナーゼ変異体の効果の判定は、対応する野生型キシラナーゼおよび無補充コントロール飼料を与えた動物との比較に基づく。
【0205】
アンフォールディング温度が高いことに起因して、本明細書中に開示されるのと同じ原理を用いて設計されたＣ３１－４キシラナーゼおよび他の好熱性キシラナーゼ変異体は、高い熱安定性が必要とされるすべての用途、例えば、木材パルプおよび非木材パルプの用途ならびにペレット化段階で高温が使用される飼料用途において適している。本明細書中に開示されるキシラナーゼ変異体はまた、問題の酵素の活性および機能にとって最適ではないプロセス条件、例えば、アルカリ性または酸性のｐＨに耐えるおよび／またはそのプロセス条件において機能するのにも適している。
【0206】
前述の説明は、特定の実施態様および実施形態の非限定的な例として、本発明を実施するために本発明者らによって現在企図されている最良の形式の完全かつ情報価値のある説明を提供してきた。しかしながら、本発明が、前述において提示された実施形態の詳細に限定されず、本発明の特色から逸脱することなく、同等の手段を使用して他の実施形態において、または種々の実施形態の組み合わせで、実施され得ることは、当業者には明らかである。
【0207】
さらに、上記で開示された例示的な実施形態の特徴のいくつかは、他の特徴を対応して使用することなく有利に使用することができる。その結果として、実施形態および態様の任意の適切な組み合わせを形成することができる。本明細書中に開示されるような態様または実施形態の任意の組み合わせは、態様または実施形態に開示されている少なくとも１つの必須でない特徴なしに行うこともできる。
【0208】
添付の特許請求の範囲は、保護の範囲を規定する。明細書または図面に開示されているが特許請求の範囲によって網羅されない任意の方法、プロセス、生成物または装置は、特許請求される発明の実施形態として理解されるべきではないが特許請求される発明を理解するのに有用な例として提供されている。
【0209】
参考文献
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】