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特表2024-501570スイッチングペプチド及びそれを用いたマルチプレックス免疫分析方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-12
(54)【発明の名称】スイッチングペプチド及びそれを用いたマルチプレックス免疫分析方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/532 20060101AFI20240104BHJP
C07K 7/00 20060101ALI20240104BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240104BHJP
【ＦＩ】
G01N33/532 Z
C07K7/00 ZNA
G01N27/62 V
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540591
(86)(22)【出願日】2022-01-14
(85)【翻訳文提出日】2023-06-30
(86)【国際出願番号】 KR2022000692
(87)【国際公開番号】W WO2022154547
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】10-2021-0005036
(32)【優先日】2021-01-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519122725
【氏名又は名称】オプトレーン テクノロジーズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＯＰＴＯＬＡＮＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】ピョン，ジェ‐チョル
【テーマコード（参考）】
2G041
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA03
2G041EA04
2G041FA12
2G041JA04
2G041JA06
2G041LA08
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA50
4H045DA86
4H045FA20
(57)【要約】
マルチプレックス免疫分析方法に適用可能なスイッチングペプチドが開示される。スイッチングペプチドは、結合抗体に可逆的に結合することができるペプチド化合物；及びペプチド化合物に結合された質量標識物質；を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
結合抗体に可逆的に結合することができるペプチド化合物と、前記ペプチド化合物に結合された質量標識物質と、を含む、スイッチングペプチド。
【請求項2】
前記ペプチド化合物は、前記結合抗体のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することを特徴とする、請求項１に記載のスイッチングペプチド。
【請求項3】
前記ペプチド化合物は、前記結合抗体の軽鎖または重鎖の第１ないし第４フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうち１つ以上と特異的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のスイッチングペプチド。
【請求項4】
前記ペプチド化合物は、前記軽鎖の第２フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性を有する第１アミノ酸配列を有する第１ペプチド化合物と、前記軽鎖の第３または第４フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第２アミノ酸配列を有する第２ペプチド化合物と、
前記重鎖の第２フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性を有する第３アミノ酸配列を有する第３ペプチド化合物と、
前記重鎖の第３または第４フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第４アミノ酸配列を有する第４ペプチド化合物と、からなるグループから選択された１つ以上を含むことを特徴とする、請求項３に記載のスイッチングペプチド。
【請求項5】
前記ペプチド化合物は、１４～２０個のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項４に記載のスイッチングペプチド。
【請求項6】
前記ペプチド化合物は、１６５０～２５００Ｄａの分子量を有することを特徴とする、請求項５に記載のスイッチングペプチド。
【請求項7】
前記質量標識物質は、アミノ酸化合物を含むことを特徴とする、請求項１に記載のスイッチングペプチド。
【請求項8】
互いに異なるＮ個のスイッチングペプチドがそれぞれ結合されたＮ個の互いに異なる結合抗体を基板に固定する第１段階と、前記Ｎ個の結合抗体を１つ以上のターゲット抗原を含む検出試料溶液で処理する第２段階と、
ターゲット抗原の結合によって前記結合抗体から遊離されたスイッチングペプチドを質量分析の方法で同定及び定量分析して、前記検出試料溶液に含まれた前記ターゲット抗原に対する定量分析を行う第３段階と、を含み、
前記スイッチングペプチドのそれぞれは、前記結合抗体に可逆的に結合するペプチド化合物及び前記ペプチド化合物に結合された質量標識物質を含み、
前記スイッチングペプチドの質量標識物質は、互いに異なる分子量を有するアミノ酸化合物をそれぞれ含むことを特徴とする、マルチプレックス免疫分析方法。
【請求項9】
前記結合抗体は、互いに異なる第１及び第２結合抗体を含み、前記スイッチングペプチドは、前記第１結合抗体のＦａｂ領域に可逆的に結合する第１ペプチド化合物及びこれに結合され、第１分子量を有する第１質量標識物質を備える第１スイッチングペプチド及び前記第２結合抗体のＦａｂ領域に可逆的に結合する第２ペプチド化合物及びこれに結合され、前記第１分子量と異なる第２分子量を有する第２質量標識物質を備える第２スイッチングペプチドを含み、
前記第１ペプチド化合物と前記第２ペプチド化合物は、互いに同一であることを特徴とする、請求項８に記載のマルチプレックス免疫分析方法。
【請求項10】
前記第２段階で、前記第１及び第２結合抗体と特異的に反応する第１及び第２ターゲット抗原を含む検出試料溶液を前記第１及び第２結合抗体上に塗布して、前記第１及び第２ターゲット抗原を前記第１及び第２結合抗体にそれぞれ特異的に反応させ、前記第２段階の間に、前記第１ターゲット抗原の量に依存して、前記第１スイッチングペプチドが前記第１結合抗体から定量的に遊離され、前記第２ターゲット抗原の量に依存して、前記第２スイッチングペプチドが前記第２結合抗体から定量的に遊離されることを特徴とする、請求項９に記載のマルチプレックス免疫分析方法。
【請求項11】
前記第３段階の間に、質量分析の方法で前記第１及び第２結合抗体からそれぞれ遊離された前記第１及び第２スイッチングペプチドを同定及び定量分析して、前記検出試料溶液に含まれた前記第１及び第２ターゲット抗原のそれぞれに対する定量分析を行うことを特徴とする、請求項９に記載のマルチプレックス免疫分析方法。
【請求項12】
前記第１及び第２スイッチングペプチドに対する質量分析は、レーザ脱着及びイオン化質量分析または液体クロマトグラフィー質量分析の方法で行われることを特徴とする、請求項１１に記載のマルチプレックス免疫分析方法。
【請求項13】
前記第１及び第２スイッチングペプチドに対する質量分析は、無機マトリックスを利用したレーザ脱着及びイオン化質量分析の方法で行われ、前記無機マトリックスは、半導体ナノ線及び前記半導体ナノ線の表面に結合された多孔性金属ナノ粒子を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のマルチプレックス免疫分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫反応を用いてターゲット抗原物質の分析に使われるスイッチングペプチド及びそれを用いたマルチプレックス免疫分析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
バイオ技術分野において、多様な免疫診断検査または環境モニタリングのようなバイオ検査のために、イムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が使われている。前記イムノアッセイは、抗原－抗体反応の特異性を用いて特定ターゲット物質の定量分析が可能であり、他の分析方法に比べて高い感度を有するという利点がある。
【0003】
前記イムノアッセイは、癌マーカー、感染性疾患、甲状腺機能、貧血、アレルギー、妊娠、薬物乱用、痛風の診断のような多様な診断に用いられる。前記イムノアッセイを多種の抗原の診断または分析に利用するためには、前記抗原のそれぞれに対して特異的な反応性を有する抗体を調製しなければならない。
【0004】
しかし、このような方法は、最近、急速に多様化されている現代化された疾病または多数の突然変異種を有するウイルスの感知に限界点がある。特に、前記ウイルスの場合、前記ウイルスと特異的結合特性を有する抗体を確保することが不可能な場合も多数ある。
【0005】
また、前記抗原－抗体反応を用いる場合、前記抗体を標識物質と結合させる追加的な段階が要求される。前記標識物質と前記抗体との結合特性が低下する場合、イムノアッセイ分析の精度または信頼度が低下する。
【0006】
前述したような問題点によって、多様な抗体に対して結合することができる多種の標識物質をそれぞれ開発しなければならないという問題もある。
【0007】
また、迅速な医療診断及び環境モニタリングのために、同時に複数の分析対象物に対する分析が可能なマルチプレックスイムノアッセイについての多くの研究が行われている。従来のマルチプレックスイムノアッセイとしては、ビーズのような固体支持体に抗体を結合して進行する方法が主に使われた。この場合、アッセイの種類によって蛍光量が調節されて、それぞれ他のビーズにそれぞれの抗体を結合して反応の同定のために使われ、ビーズ上でサンドイッチ型蛍光イムノアッセイを進行して結合された抗原の量を定量した。そして、一般的に、ビーズの蛍光量の測定及びビーズ上で発生するイムノアッセイによる蛍光量を測定する方法でフローサイトメトリーを利用した順次的な分析方法が使われた。しかし、このような従来のマルチプレックスイムノアッセイは、複数の分析対象物に対する分析時間が長時間かかるという問題点があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の一目的は、結合抗体のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができるペプチド化合物と互いに異なる分子量を有する質量標識物質とを備える複数のスイッチングペプチドを提供することである。
【0009】
本発明の他の目的は、前記スイッチングペプチドを用いて複数の抗原に対する同時分析が可能なマルチプレックス免疫分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の実施例によるスイッチングペプチドは、結合抗体に可逆的に結合することができるペプチド化合物；及び前記ペプチド化合物に結合された質量標識物質；を含む。
【0011】
一実施例において、前記ペプチド化合物は、前記結合抗体のＦａｂ（フラグメント抗原結合：Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができる。
【0012】
一実施例において、前記ペプチド化合物は、前記結合抗体の軽鎖または重鎖の第１ないし第４フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうち１つ以上と特異的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有しうる。
【0013】
一実施例において、前記ペプチド化合物は、前記軽鎖の第２フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有する第１アミノ酸配列を有する第１ペプチド化合物；前記軽鎖の第３または第４フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第２アミノ酸配列を有する第２ペプチド化合物；前記重鎖の第２フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性を有する第３アミノ酸配列を有する第３ペプチド化合物；及び前記重鎖の第３または第４フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第４アミノ酸配列を有する第４ペプチド化合物；からなるグループから選択された１つ以上を含みうる。
【0014】
一実施例において、前記ペプチド化合物は、１４～２０個のアミノ酸を含みうる。
【0015】
一実施例において、前記ペプチド化合物は、１６５０～２５００Ｄａの分子量を有しうる。
【0016】
一実施例において、前記質量標識物質は、アミノ酸化合物を含みうる。
【0017】
互いに異なるＮ個のスイッチングペプチドがそれぞれ結合されたＮ個の互いに異なる結合抗体を基板に固定する第１段階；前記Ｎ個の結合抗体を１つ以上のターゲット抗原を含む検出試料溶液で処理する第２段階；及び本発明の実施例によるマルチプレックス免疫分析方法は、ターゲット抗原の結合によって前記結合抗体から遊離されたスイッチングペプチドを質量分析の方法で同定及び定量分析して、前記検出試料溶液に含まれた前記ターゲット抗原に対する定量分析を行う第３段階；を含み、前記スイッチングペプチドのそれぞれは、前記結合抗体に可逆的に結合するペプチド化合物及び前記ペプチド化合物に結合された質量標識物質を含み、前記スイッチングペプチドの質量標識物質は、互いに異なる分子量を有するアミノ酸化合物をそれぞれ含みうる。
【0018】
一実施例において、前記結合抗体は、互いに異なる第１及び第２結合抗体を含み、前記スイッチングペプチドは、前記第１結合抗体のＦａｂ領域に可逆的に結合する第１ペプチド化合物及びこれに結合され、第１分子量を有する第１質量標識物質を備える第１スイッチングペプチド及び前記第２結合抗体のＦａｂ領域に可逆的に結合する第２ペプチド化合物及びこれに結合され、前記第１分子量と異なる第２分子量を有する第２質量標識物質を備える第２スイッチングペプチドを含み、前記第１ペプチド化合物と前記第２ペプチド化合物は、互いに同一である。
【0019】
一実施例において、前記第２段階で、前記第１及び第２結合抗体と特異的に反応する第１及び第２ターゲット抗原を含む検出試料溶液を前記第１及び第２結合抗体上に塗布して、前記第１及び第２ターゲット抗原を前記第１及び第２結合抗体にそれぞれ特異的に反応させ、前記第２段階の間に、前記第１ターゲット抗原の量に依存して、前記第１スイッチングペプチドが前記第１結合抗体から定量的に遊離され、前記第２ターゲット抗原の量に依存して、前記第２スイッチングペプチドが前記第２結合抗体から定量的に遊離される。
【0020】
一実施例において、前記第３段階の間に、質量分析の方法で前記第１及び第２結合抗体からそれぞれ遊離された前記第１及び第２スイッチングペプチドを同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び定量分析して、前記検出試料溶液に含まれた前記第１及び第２ターゲット抗原のそれぞれに対する定量分析を行うことができる。
【0021】
一実施例において、前記第１及び第２スイッチングペプチドに対する質量分析は、レーザ脱着及びイオン化質量分析または液体クロマトグラフィー質量分析の方法で行われる。
【0022】
一実施例において、前記第１及び第２スイッチングペプチドに対する質量分析は、無機マトリックスを利用したレーザ脱着及びイオン化質量分析の方法で行われ、前記無機マトリックスは、半導体ナノ線及び前記半導体ナノ線の表面に結合された多孔性金属ナノ粒子を含みうる。
【発明の効果】
【0023】
本発明のスイッチングペプチド及びそれを用いる免疫分析方法によれば、互いに異なる抗原が対応する結合抗体にそれぞれ特異的に反応する場合、前記結合抗体から互いに異なる分子量を有する質量標識物質でそれぞれ修飾されたスイッチングペプチドが定量的に遊離され、該遊離されたスイッチングペプチドを質量分析の方法で同定及び定量分析することにより、複数の抗原に対する同時分析が可能であって、前記抗原に対する分析時間を著しく短縮させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】本発明の実施例によるスイッチングペプチドを説明する図面である。
【図2】結合抗体を説明する図面である。
【図3A】本発明の実施例による免疫分析方法を説明するフローチャート及び模式図である。
【図3B】本発明の実施例による免疫分析方法を説明するフローチャート及び模式図である。
【図3C】スイッチングペプチドに対するレーザ脱着及びイオン化質量分析に適用されるマトリックスの一実施例を説明する図面である。
【図4A】Ｌ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を確認する方法及び測定結果を示す図面である。
【図4B】ＰｙＭＯＬソフトウェアを使用して分析されたＬ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を説明する図面である。
【図5】マイクロプレート上にそれぞれ分離固定されたヒト、ウサギ、ヤギ及びラットからのＩｇＧ、そして、これらと異なるタンパク質（ヒトＢ型肝炎抗原、Ｃ反応性タンパク質、プロテインＡ、ＢＳＡ）を蛍光ラベルされた実施例１から合成された４種のペプチド化合物（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）と反応させた後、マイクロプレートの底面から測定された蛍光強度を示すグラフである。
【図6A】実施例１の４種のペプチドがそれぞれ結合された抗体をタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）であるパパイン（ｐａｐａｉｎ）で処理前及び後の状態を示す模式図である。
【図6B】前記パパイン処理後、マイクロプレートの底面（Ｂ）及び溶液内（Ｓ）から測定された蛍光強度を示すグラフである。
【図7A】蛍光ラベルされた実施例１のペプチド化合物を利用した免疫分析方法を説明する模式図である。
【図8A】実施例１のペプチド化合物を使用した免疫分析を用いて検出されたＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する実験結果を示すグラフである。
【図8B】実施例１のペプチド化合物を使用した免疫分析を用いて検出されたＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する実験結果を示すグラフである。
【図8C】実施例１のペプチド化合物を使用した免疫分析を用いて検出されたＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する実験結果を示すグラフである。
【図8D】実施例１のペプチド化合物を使用した免疫分析を用いて検出されたＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する実験結果を示すグラフである。
【図9A】本発明のスイッチングペプチドを利用したワンステップイムノアッセイでの検出限界（ＬＯＤ）を示すグラフ及び免疫分析基準線を示すグラフである。
【図9B】本発明のスイッチングペプチドを利用したワンステップイムノアッセイでの検出限界（ＬＯＤ）を示すグラフ及び免疫分析基準線を示すグラフである。
【図9C】本発明のスイッチングペプチドを利用したワンステップイムノアッセイでの検出限界（ＬＯＤ）を示すグラフ及び免疫分析基準線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、添付した図面を参照して、本発明の実施例について詳しく説明する。本発明は、多様な変更を加え、さまざまな形態を有しうるので、特定実施例を図面に例示し、本明細書で詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の開示形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる、あらゆる変更、均等物または代替物を含むものと理解しなければならない。各図面を説明しながら類似の参照符号を類似の構成要素に対して使用した。添付図面において、構造物の寸法は、本発明の明確性を期するために実際よりも拡大して図示したものである。
【0026】
本明細書で使用した用語は、単に特定の実施例を説明するために使われたものであって、本発明を限定しようとする意図ではない。単数の表現は、文脈上、取り立てて明示しない限り、複数の表現を含む。本明細書において、「含む」または「有する」などの用語は、明細書上に記載の特徴、数字、段階、動作、構成要素またはこれらを組み合わせたものが存在するということを指定しようとするものであって、１つまたはそれ以上の他の特徴や数字、段階、動作、構成要素またはこれらを組み合わせたものの存在、または付加可能性をあらかじめ排除しないものと理解しなければならない。
【0027】
取り立てての定義がない限り、技術的や科学的な用語を含んで、ここで使われるあらゆる用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有している。一般的に使われる辞書に定義されているような用語は、関連技術の文脈上の意味と一致する意味を有すると解釈されなければならず、本明細書で明白に定義しない限り、理想的であるか、過度に形式的な意味として解釈されない。
【0028】
【0029】
図１及び図２を参照すれば、本発明の実施例によるスイッチングペプチド１００は、結合抗体１０に可逆的に結合することができるペプチド化合物１１０及び前記ペプチド化合物１１０に結合された質量標識物質１２０を含みうる。前記スイッチングペプチド１００は、ターゲット抗原と特異的に結合する前記結合抗体１０に可逆的に結合することができて、前記ターゲット抗原が前記結合抗体に特異的に結合する場合、定量的に前記結合抗体１０から遊離され、その結果、前記結合抗体１０から遊離された前記スイッチングペプチド１００の蛍光標識物質１２０を介した酸化還元反応によって、前記ターゲット抗原を含む検査試料の電気化学的特性が変化することができる。
【0030】
前記結合抗体１０は、前記ターゲット抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）のような特異的な抗原決定基に結合されるか、前記抗原決定基と反応することにより、免疫学的エフェクターメカニズムを誘導することができる化合物である。前記結合抗体は、単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）を有しても、多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）を有しても良い。
【0031】
一実施例において、前記結合抗体１０は、抗体、抗体誘導体またはその断片を含みうる。前記結合抗体１０は、完全な（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリン分子でもあり、これとは異なって、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｃ、Ｆ（ｖ）、Ｎ－グリカン構造、パラトープのような完全な抗体の構成部分または前記構成部分のうち少なくとも一部を含むこともある。
【0032】
一実施例において、前記結合抗体は、ヒト抗体、非ヒト抗体またはヒト化された非ヒト抗体である。
【0033】
前記ヒト抗体は、ヒトによって生産された抗体または任意の技術を用いて合成されたアミノ酸配列を保有する合成抗体を含みうる。ヒト抗体のこのような定義は、特に、非ヒト抗原－結合残基を含むヒト化抗体を排除する。前記ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術に公知の多様な技術を用いて生成されうる。前記非ヒト抗体は、多様な種の供給源、例えば、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ヒトを除いた哺乳動物または鳥類から獲得された抗体である。前記非ヒト抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施例において、前記ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が目的特異性、親和度及び／または能力を有する前述した非ヒト抗体（ドナー抗体）の超可変領域に置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合に、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク残基は、相応する非ヒト残基によって置き換えられる。また、前記ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体から見つけられない残基を含みうる。これらの変形は、抗体の性能、例えば、結合親和度を追加精錬するために製造可能である。
【0034】
一実施例において、前記結合抗体１０は、前記抗体分子、免疫グロブリン分子、その断片またはこれらのうち１つ以上の集合体である。前記結合抗体１０は、前記ターゲット抗原に対する特異的な結合を可能にする独特な構造を有することができ、それぞれの結合抗体１０は、２個の同じ構造の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）及び２個の同じ構造の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含みうる。前記重鎖及び軽鎖は、それぞれ可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）及び不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）を含みうる。前記重鎖と軽鎖との可変領域が結合して抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を形成しうる。前記結合抗体１０は、パパインのようなタンパク質分解酵素によってターゲット抗原が結合する部分は、Ｆａｂ（抗原結合フラグメント：ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）領域及び結晶化された支柱部分であるＦｃ（フラグメント結晶化能：Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域に分離され、前記抗原結合部位は、前記抗体のＦａｂ領域に含まれる。
【0035】
一方、前記重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれは、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；ＨＶＲ）である３個の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲｓ）及び前記相補性決定領域を構造的に支持する４個のフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＦＲｓ）が交互に配列された構造を有しうる。前記相補性決定領域は、抗体ごとに異なるアミノ酸配列を有して、それぞれの抗原と特異的に結合することができる一方、前記フレームワーク領域は、生物のサブファミリー（Ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ）によって保存されたアミノ酸配列を有しており、同じサブファミリーに属する生物の抗体は、同一または類似したアミノ酸配列を有する。
【0036】
以下、説明の便宜上、前記結合抗体１０の軽鎖の可変領域において、Ｎ末端から順次に離隔して配された４個のフレームワーク領域をそれぞれ第１ないし第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ１、ＶＬ－ＦＲ２、ＶＬ－ＦＲ３及びＶＬ－ＦＲ４）とし、前記第１ないし第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ１、ＶＬ－ＦＲ２、ＶＬ－ＦＲ３及びＶＬ－ＦＲ４）の間にそれぞれ位置し、前記Ｎ末端から順次に配された３個の相補性決定領域をそれぞれ第１ないし第３軽鎖相補性決定領域（ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ＶＬ－ＣＤＲ３）と称する。そして、前記結合抗体１０の重鎖の可変領域において、Ｎ末端から順次に離隔して配された４個のフレームワーク領域をそれぞれ第１ないし第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ１、ＶＨ－ＦＲ２、ＶＨ－ＦＲ３及びＶＨ－ＦＲ４）とし、前記第１ないし第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ１、ＶＨ－ＦＲ２、ＶＨ－ＦＲ３及びＶＨ－ＦＲ４）の間にそれぞれ位置し、前記Ｎ末端から順次に配された３個の相補性決定領域をそれぞれ第１ないし第３重鎖相補性決定領域（ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３）と称する。
【0037】
前記ペプチド化合物１１０は、前記結合抗体１０のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有しうる。
【0038】
一実施例において、前記ペプチド化合物１１０は、前記結合抗体１０の軽鎖または重鎖の第１ないし第４フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうち１つ以上と特異的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有しうる。例えば、前記ペプチド化合物１１０は、前記結合抗体１０の軽鎖または重鎖の第１ないし第４フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうち１つ以上と相同性を有するアミノ酸配列を含み、この場合、前記ペプチド化合物１１０は、前記軽鎖または重鎖の第１ないし第４フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうち１つ以上と可逆的に結合することができ、これにより、ターゲット抗原が前記結合抗体１０に結合する場合、前記結合抗体１０に結合された前記ペプチド化合物１０は、前記結合抗体１０に結合される抗原の量によって定量的に前記結合抗体１０から遊離される。
【0039】
一実施例として、前記ペプチド化合物１１０は、前記第２軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性を有する第１アミノ酸配列を有する第１ペプチド化合物（Ｌ１）、前記第３または第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第２アミノ酸配列を有する第２ペプチド化合物（Ｌ２）、前記第２重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性を有する第３アミノ酸配列を有する第３ペプチド化合物（Ｈ１）及び前記第３または第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第４アミノ酸配列を有する第４ペプチド化合物（Ｈ２）の中から選択された１つ以上を含みうる。
【0040】
前記結合抗体１０の前記第２軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）と前記第３または第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）は、互いに隣接して位置して相互作用し、前記第３または第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）と前記第２重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）は、互いに隣接して位置して相互作用するので、前記結合抗体１０の第２軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）と相同性がある第１アミノ酸配列を有する前記第１ペプチド化合物（Ｌ１）は、前記結合抗体１０の第３または第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）と選択的に相互作用することができ、前記結合抗体１０の第３または第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）と相同性を有する第２アミノ酸配列を有する前記第２ペプチド化合物（Ｌ２）は、前記結合抗体１０の第２重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）と選択的に相互作用することができ、前記結合抗体１０の第２重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）と相同性を有する第３アミノ酸配列を有する前記第３ペプチド化合物（Ｈ１）は、前記結合抗体１０の第３または第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）と選択的に相互作用することができ、前記結合抗体１０の第３または第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）と相同性を有する第４アミノ酸配列を有する前記第４ペプチド化合物（Ｈ２）は、前記結合抗体１０の第２軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）と選択的に相互作用することができる。
【0041】
一実施例において、前記結合抗体１０がヒトを含む動物のサブファミリーに属する生物から由来した場合、前記ペプチド化合物１１０は、約１０～２５個のアミノ酸を含み、約１６００～３０００Ｄａの分子量を有しうる。例えば、前記ペプチド化合物１１０は、約１４～２０個のアミノ酸を含み、約１６５０～２５００Ｄａの分子量を有しうる。一実施例として、前記第１ないし第４ペプチド化合物（Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、Ｈ２）は、下記表１に記載のようなアミノ酸配列を含みうる。
【0042】
【表1】
【0043】
一方、抗体の軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）は、生物のサブファミリーによって保存されたアミノ酸配列を有するので、前記ペプチド化合物１１０は、同じサブファミリーに属する他の種の生物から由来した抗体に対して共通して適用されるので、前記ペプチド化合物１１０がヤギ、ラット、ウサギなどの抗体から合成された場合であっても、ヒトの抗体に対しても前述したものと同じ作用及び効果を示すことができる。前記質量分析標識物質１２０は、前記ペプチド化合物１１０の末端に結合されうる。一実施例として、前記質量分析標識物質１２０は、１つ以上のアミノ酸化合物を含みうる。この場合、前記質量分析標識物質１２０は、前記ペプチド化合物１１０を合成する時、前記ペプチド化合物１１０の末端に修飾される。
【0044】
＜マルチプレックス免疫分析方法＞
図３Ａ及び図３Ｂは、本発明の実施例による免疫分析方法を説明するフローチャート及び模式図であり、図３Ｃは、スイッチングペプチドに対するレーザ脱着及びイオン化質量分析に適用されるマトリックスの一実施例を説明する図面である。
図３Ａ及び図３Ｂは、本発明の実施例による免疫分析方法を説明するフローチャート及び模式図であり、図３Ｃは、スイッチングペプチドに対するレーザ脱着及びイオン化質量分析に適用されるマトリックスの一実施例を説明する図面である。
【0045】
図３Ａ及び図３Ｂを参照すれば、本発明の一実施例による免疫分析方法は、互いに異なるＮ個のスイッチングペプチドがそれぞれ結合されたＮ個の互いに異なる結合抗体を基板に固定する第１段階（ステップＳ１１０）；前記Ｎ個の結合抗体を検出試料溶液で処理する第２段階（ステップＳ１２０）；及びターゲット抗原の結合によって前記結合抗体から遊離されたスイッチングペプチドを質量分析の方法で同定及び定量分析して、前記検出試料溶液に含まれたターゲット抗原に対する定量分析を行う第３段階（ステップＳ１３０）；を含む。Ｎは、２以上の自然数であり、以下、説明の便宜上、図３Ｂに示したように、Ｎが２である場合を例として説明する。
【0046】
前記第１段階（ステップＳ１１０）において、第１スイッチングペプチド１１００が結合された第１結合抗体１２００及び第２スイッチングペプチド２１００が結合された第２結合抗体２２００が基板に固定される。
【0047】
前記第１スイッチングペプチド１１００は、第１ペプチド化合物１１１０及びこれに結合された第１質量標識物質１１２０を含み、前記第２スイッチングペプチド２１００は、第２ペプチド化合物２１１０及びこれに結合された第２質量標識物質２１２０を含みうる。前記第１及び第２スイッチングペプチド１１００、２１００のそれぞれは、図１を参照して説明したスイッチングペプチド１００と実質的に同じ構造を有しうるので、以下、重複された詳細な説明は省略する。
【0048】
一実施例として、前記第１ペプチド化合物１１１０と前記第２ペプチド化合物２１１０は、互いに同一であり、前記第１質量標識物質１１２０と前記第２質量標識物質２１２０は、互いに異なる。例えば、前記第１質量標識物質１１２０は、第１分子量を有する第１アミノ酸化合物であり、前記第２質量標識物質２１２０は、前記第１分子量と異なる第２分子量を有する第２アミノ酸化合物である。一方、前記第１及び第２アミノ酸化合物は、単一アミノ酸からなり、２以上のアミノ酸からなることもある。
【0049】
前記第１スイッチングペプチド１１００の第１ペプチド化合物１１１０は、前記第１結合抗体１２００のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有しうる。これにより、前記第１スイッチングペプチド１１００は、前記第１結合抗体１２００と特異的に反応する第１ターゲット抗原１０が前記第１結合抗体１２００に結合される場合、前記第１結合抗体１２００に結合された前記第１ターゲット抗原１０の量に依存して、前記第１結合抗体１２００から定量的に遊離される。
【0050】
前記第２スイッチングペプチド２１００の第２ペプチド化合物２１１０は、前記第２結合抗体２２００のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有しうる。これにより、前記第２スイッチングペプチド２１００は、前記第２結合抗体２２００と特異的に反応する第２ターゲット抗原２０が前記第２結合抗体２２００に結合される場合、前記第２結合抗体２２００に結合された前記第２ターゲット抗原２０の量に依存して、前記第２結合抗体２２００から定量的に遊離される。
【0051】
前記第１及び第２結合抗体１２００、２２００を前記基板に固定させる方法は、特に制限されない。例えば、前記第１及び第２結合抗体１２００、２２００のそれぞれは、前記基板に直接結合されても、リンカー化合物を通じて前記基板に結合されてもよい。
【0052】
前記第２段階（ステップＳ１２０）において、前記第１及び第２結合抗体１２００、２２００上に前記第１及び第２ターゲット抗原１０、２０を含む検出試料溶液を塗布して、前記第１及び第２ターゲット抗原１０、２０を前記第１及び第２結合抗体１２００、２２００にそれぞれ特異的に反応させることができる。
【0053】
この場合、前述したように、前記第１結合抗体１２００に結合された前記第１ターゲット抗原１０の量に依存して、前記第１スイッチングペプチド１１００は、前記第１結合抗体１２００から定量的に遊離され、前記第２結合抗体２２００に結合された前記第２ターゲット抗原２０の量に依存して、前記第２スイッチングペプチド２１００は、前記第２結合抗体２２００から定量的に遊離される。すなわち、反応後の前記検出試料溶液内には、前記第１及び第２結合抗体１２００、２２００から遊離された前記第１及び第２スイッチングペプチド１１００、１２００が存在することができ、前記検出試料溶液内に遊離状態で存在する前記第１及び第２スイッチングペプチド１１００、１２００の量は、前記第１及び第２抗原１０、２０の濃度によって変化することができる。
【0054】
前記第３段階（ステップＳ１３０）において、前記反応後の前記検出試料溶液内に存在する遊離状態の前記第１及び第２スイッチングペプチド１１００、１２００を質量分析の方法で同定及び定量分析して、前記検出試料溶液に含まれた前記第１及び第２ターゲット抗原１０、２０のそれぞれに対する定量分析を行うことができる。前記第１及び第２スイッチングペプチド１１００、１２００に対する質量分析の方法は、特に制限されない。例えば、前記第１及び第２スイッチングペプチド１１００、１２００に対する質量分析は、レーザ脱着及びイオン化質量分析（Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＬＤＩ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＬＣ－ＭＳ）などの方法で行われる。
【0055】
一実施例として、前記第１及び第２スイッチングペプチド１１００、１２００に対する質量分析は、無機マトリックスを利用したレーザ脱着及びイオン化質量分析法（ＬＤＩ－ＭＳ）を通じて行われる。この場合、図３Ｃに示したように、前記無機マトリックス５０は、半導体ナノ線５１及び前記半導体ナノ線５１の表面に結合された多孔性金属ナノ粒子５２を含みうる。
【0056】
前記半導体ナノ線５１は、光触媒活性を有する半導体材料で形成されうる。例えば、前記半導体ナノ線５１は、二酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）、三酸化タングステン（ＷＯ３）などから選択された１つ以上の半導体材料で形成されうる。
【0057】
一実施例において、前記半導体ナノ線５１は、二酸化チタンで形成されうる。前記二酸化チタンナノ線は、約３．２ｅＶのバンドギャップエネルギーを有する半導体であって、レーザ脱着及びイオン化質量分析（ＬＤＩ－ＭＳ）で主に使われている約３３７ｎｍの波長の紫外線レーザを吸収できるだけではなく、光触媒活性を有するので、レーザエネルギーを吸収して分析対象物の光化学反応を促進することにより、分析対象物のイオン化を促進することができる。
【0058】
前記多孔性金属ナノ粒子５２は、前記半導体ナノ線５１の表面に結合されうる。前記多孔性金属ナノ粒子５２は、低い比熱（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｅａｔ）、高い熱伝導度（ｈｅａｔ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を有する金属材料で形成され、表面または内部に形成された気孔を備えることができる。例えば、前記多孔性金属ナノ粒子５２は、バイオ分子に対する親和性に優れた金属材料、例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、チタン（Ｔｉ）、ロジウム（Ｒｈ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、タンタル（Ｔａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、タングステン（Ｗ）、錫（Ｓｎ）などで形成されうる。
【0059】
一実施例において、前記多孔性金属ナノ粒子５２は、その熱拡散距離（ｈｅａｔ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｌｅｎｇｔｈ）と同一か、これよりも小さなサイズを有しうる。この場合、レーザ照射によって前記多孔性金属ナノ粒子５２の均一な加熱が可能であり、これにより、前記分析対象物の脱着のために要求されるレーザ強度の臨界値を減少させることができる。例えば、前記多孔性金属ナノ粒子５２は、約２０～２００ｎｍのサイズを有しうる。
【0060】
一実施例において、前記無機複合マトリックス５０は、前記半導体ナノ線５１と前記多孔性金属ナノ粒子５２とを約１：０．０１～１：０．０５の重量比率で含みうる。例えば、前記無機複合マトリックス５０は、前記半導体ナノ線５１と前記多孔性金属ナノ粒子５２とを約１：０．０２～１：０．０３、望ましくは、１：０．０２０８～１：０．０２１１の重量比率で含みうる。
【0061】
前記無機マトリックス５０は、多孔性金属ナノ粒子５２の高い光熱変換効率及び低い比熱によって向上した枝葉的な熱放出能力を有しうるだけではなく、半導体ナノ線５１と多孔性金属ナノ粒子５２との界面に形成されたショートキー電位障壁（Ｓｃｈｏｔｔｋｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂａｒｒｉｅｒ）によって電荷キャリアの分離能力を向上させ、その結果、分析対象物の脱着及びイオン化能力が向上する。
【0062】
そして、前記多孔性金属ナノ粒子５２の光熱変換から引き起こされるレーザによって誘導された前記多孔性金属ナノ粒子５２の表面再構造化（ｒｅｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ）及び溶融（ｍｅｌｔｉｎｇ）現象は、前記多孔性金属ナノ粒子５２でのストレーンの変化を引き起こし、これは、隣接して位置した前記半導体ナノ線５１のストレーン変化及び酸素空孔を生成し、このように生成された前記半導体ナノ線５１内の酸素空孔は、電子に対する浅いトラップ準位を生成することができる。前記酸素空孔によるトラップ準位は、ショートキー障壁と共に光誘導電荷の再結合速度をさらに下げることができる。
【0063】
また、前記多孔性金属ナノ粒子５２の表面に存在するダングリング結合（ｄａｎｇｌｉｎｇ ｂｏｎｄｓ）は、熱的な電子の動きを遅延させ、その結果、前記多孔性金属ナノ粒子５２の内部への熱拘束の効果を向上させうる。したがって、非多孔性金属ナノ粒子に比べて、前記多孔性金属ナノ粒子５２は、レーザ照射時に、増加した表面空間率（ｓｕｒｆａｃｅ ｖｏｉｄａｇｅ）によってさらに高い表面温度を誘導することができる。
【0064】
本発明のスイッチングペプチド及びそれを用いる免疫分析方法によれば、互いに異なる抗原が対応する結合抗体にそれぞれ特異的に反応する場合、前記結合抗体から互いに異なる分子量を有する質量標識物質でそれぞれ修飾されたスイッチングペプチドが定量的に遊離され、該遊離されたスイッチングペプチドを質量分析の方法で同定及び定量分析することにより、複数の抗原に対する同時分析が可能であって、前記抗原に対する分析時間を著しく短縮させることができる。
【0065】
以下、本発明の具体的な実施例について詳述する。但し、下記の実施例は、本発明の一部の実施形態に過ぎないものであって、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0066】
［実施例１］
表１に記載のような４種のペプチド（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）を合成した。具体的に、Ｈ１ペプチドは、重鎖のＦＲ２領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｈ２ペプチドは、重鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｌ１ペプチドは、軽鎖のＦＲ２領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｌ２ペプチドは、軽鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成された。
表１に記載のような４種のペプチド（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）を合成した。具体的に、Ｈ１ペプチドは、重鎖のＦＲ２領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｈ２ペプチドは、重鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｌ１ペプチドは、軽鎖のＦＲ２領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｌ２ペプチドは、軽鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成された。
【0067】
ギブス自由エネルギーの変化（△Ｇ）は、Ｈ１ペプチド化合物に対しては－１７．９１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｈ２ペプチドに対しては－１７．１９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｌ１ペプチドに対しては１５．３７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｌ２ペプチドに対しては－１３．０５ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。
【0068】
［実験例１］
図４Ａは、Ｌ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を確認する方法及び測定結果を示す図面であり、図４Ｂは、ＰｙＭＯＬソフトウェアを使用して分析されたＬ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を説明する図面である。この際、Ｌ１及びＬ２ペプチドの末端には、第１蛍光標識物質であるＦＡＭ（λｅｘ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５３２ｎｍ）が修飾され、Ｈ１及びＨ２ペプチドの末端には、第２蛍光標識物質であるＴＡＭＲＡ（λｅｘ＝５３２ｎｍ、λｅｍ＝５７０ｎｍ）が修飾された。一方、第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）は、パリレン－Ｈのホルミル基とペプチドとのうち、リジン残基（ｌｙｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）の１次アミン基の間の共有結合を通じてパリレン－Ｈコーティングされたマイクロプレートに固定され、第２ペプチド（Ｈ２またはＨ１）は、固定された第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）と共に培養されて、これらの間の特異的相互作用が許容された。一方、固定された第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）とこれと共に培養された第２ペプチド（Ｈ２またはＨ１）との間の特異的相互作用は、第２ペプチドに修飾されたＴＡＭＲＡ（λｅｍ＝５７０ｎｍ）からの緑色蛍光発光を有したＦＲＥＴ効果がマイクロプレートの底面から観察されるか否かによって判別されるというが分かり、第１及び第２ペプチドの間の特異的相互作用が発生する場合、ＦＲＥＴ効果がマイクロプレートの底面から観察される。
図４Ａは、Ｌ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を確認する方法及び測定結果を示す図面であり、図４Ｂは、ＰｙＭＯＬソフトウェアを使用して分析されたＬ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を説明する図面である。この際、Ｌ１及びＬ２ペプチドの末端には、第１蛍光標識物質であるＦＡＭ（λｅｘ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５３２ｎｍ）が修飾され、Ｈ１及びＨ２ペプチドの末端には、第２蛍光標識物質であるＴＡＭＲＡ（λｅｘ＝５３２ｎｍ、λｅｍ＝５７０ｎｍ）が修飾された。一方、第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）は、パリレン－Ｈのホルミル基とペプチドとのうち、リジン残基（ｌｙｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）の１次アミン基の間の共有結合を通じてパリレン－Ｈコーティングされたマイクロプレートに固定され、第２ペプチド（Ｈ２またはＨ１）は、固定された第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）と共に培養されて、これらの間の特異的相互作用が許容された。一方、固定された第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）とこれと共に培養された第２ペプチド（Ｈ２またはＨ１）との間の特異的相互作用は、第２ペプチドに修飾されたＴＡＭＲＡ（λｅｍ＝５７０ｎｍ）からの緑色蛍光発光を有したＦＲＥＴ効果がマイクロプレートの底面から観察されるか否かによって判別されるというが分かり、第１及び第２ペプチドの間の特異的相互作用が発生する場合、ＦＲＥＴ効果がマイクロプレートの底面から観察される。
【0069】
図４Ａを参照すれば、Ｌ１及びＨ２ペプチドの間の相互作用は、Ｌ１ペプチドの濃度を変化させることによって観察され、ＦＲＥＴ強度は、Ｌ１ペプチドの濃度の増加と共に増加した。このような結果は、Ｌ１とＨ２ペプチドとの間の特異的相互作用が発生したことを示す。
【0070】
そして、Ｈ１とＬ２ペプチドとの間の相互作用は、Ｈ１ペプチドの濃度を変化させることによって観察され、ＦＲＥＴ強度は、Ｈ１ペプチドの濃度が増加するにつれて増加すると観察された。このような結果も、Ｈ１とＬ２ペプチドとの間の特異的相互作用が発生したことを示す。
【0071】
以上の結果から、Ｌ１ペプチドは、重鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域（Ｈ２ペプチドに対応）に選択的に、そして、可逆的に結合し、Ｌ２ペプチドは、重鎖のＦＲ２領域（Ｈ１ペプチドに対応）に選択的に、そして、可逆的に結合し、Ｈ１ペプチドは、軽鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域（Ｌ２ペプチドに対応）に選択的に、そして、可逆的に結合し、Ｈ２ペプチドは、軽鎖のＦＲ２領域（Ｌ１ペプチドに対応）に選択的に、そして、可逆的に結合することが分かる。
【0072】
図４Ｂを参照すれば、ＰｙＭＯＬを通じてＨ１－Ｌ２ペプチドの間の水素結合及びＨ２－Ｌ１の間の水素結合を分析した結果、Ｈ１－Ｌ２ペプチドの間の場合、（１）グルタミン（Ｈ１ペプチドの残留数９）とチロシン（Ｌ２ペプチドの残留数３）との間で３．３４Åの長さを有する水素結合及び（２）Ｌ２ペプチドからのペプチド結合のカルボニル基とＨ１ペプチドからのペプチド結合の電子不足水素との間で３．３９Åの長さを有する水素結合が見つけら、Ｈ２－Ｌ１ペプチドの間の場合、（１）アミノ酸の間（相互作用Ｉ）、（２）ペプチド結合の間（相互作用ＩＩ、ＩＩＩ）、（３）アミノ酸とペプチド結合との間（相互作用ＩＶ）で２．４９～３．９３Åの長さを有する４個の水素結合が見つけられた。水素結合の数は、Ｈ１－Ｌ２ペプチドの間の相互作用がＨ２－Ｌ１ペプチドの間の相互作用よりもさらに強いということを示すことに対して、ギブス自由エネルギー変化の類似した値は、ＩｇＧに対するペプチド化合物の類似した結合親和度を暗示する。
【0073】
図５は、マイクロプレート上にそれぞれ分離固定されたヒト、ウサギ、ヤギ及びラットからのＩｇＧ、そして、これらと異なるタンパク質（ヒトＢ型肝炎抗原、Ｃ反応性タンパク質、プロテインＡ、ＢＳＡ）を蛍光ラベルされた実施例１から合成された４種のペプチド化合物（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）と反応させた後、マイクロプレートの底面から測定された蛍光強度を示すグラフである。
【0074】
図５を参照すれば、ヒト、ウサギ、ヤギ及びラットからのＩｇＧのみが著しく高い蛍光強度を示し、他の抗原性タンパク質は、ベースラインレベルの蛍光を示した。このような結果は、実施例１のペプチドが抗体に選択的に結合されることを示す。
【0075】
図６Ａは、実施例１の４種のペプチドがそれぞれ結合された抗体をタンパク質分解酵素であるパパインで処理前及び後の状態を示す模式図であり、図６Ｂは、前記パパイン処理後、マイクロプレートの底面（Ｂ）及び溶液内（Ｓ）から測定された蛍光強度を示すグラフである。本実験の場合、抗体（ウサギ抗ＨＲＰ抗体）をマイクロプレート上に固定した後、蛍光ラベルされたスイッチングペプチドで処理して抗体とスイッチングペプチドとの間の結合を誘導し、引き続き、非結合スイッチングペプチドを除去した後、タンパク質分解酵素であるパパインを添加して、前記固定された抗体からＦａｂ領域を加水分解した。
【0076】
図６Ａを参照すれば、蛍光ラベルされたスイッチングペプチドは、抗体のＦａｂ領域に結合されるために、マイクロプレートの底面（Ｂ）での蛍光は、パパイン反応以後、減少し、スイッチングペプチドが結合されたＦａｂ領域が加水分解されて溶液内部に溶解されるので、溶液内の蛍光は増加すると予想され、このような予想は、図６Ｂのグラフによって事実であることが立証された。
【0077】
図６Ｂを参照すれば、４種のスイッチングペプチド（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）いずれもで、パパイン処理前に比べてパパイン処理後に、マイクロプレートの底面（Ｂ）での蛍光は減少し、溶液内（Ｓ）での蛍光は増加した。具体的に、マイクロプレートの底面での蛍光強度の場合、Ｈ１ペプチドは８４．３％、Ｈ２ペプチドは５８．７％、Ｌ１ペプチドは８４．８％、Ｌ２ペプチドは７２．５％減少したと評価された。そして、溶液内での蛍光強度の場合、Ｈ１ペプチドは２１８４％、Ｈ２ペプチドは２３５６％、Ｌ１ペプチドは１０３２％、Ｌ２ペプチドは２４５２％増加したと評価された。
【0078】
以上の結果から、実施例１の４種のスイッチングペプチドは、抗体のＦａｂ領域に結合されることが分かる。
【0079】
下記表２は、互いに異なる動物（ウサギ、ラット及びヤギ）からの抗体に対する実施例１の４種のペプチド化合物（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）の結合特性を評価した結果である。このような結果は、マイクロプレートに固定された抗体に蛍光ラベルされたスイッチングペプチドを結合させた後、未反応スイッチングペプチドを除去し、引き続き、ターゲット抗原（ウサギＩｇＧに対するＣＲＰ：ＣＲＰ ｆｏｒ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、マウスＩｇＧに対するｈＣＧ：ｈＣＧ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、ウサギＩｇＧに対するＨＲＰ：ＨＲＰ ｆｏｒ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、ヤギＩｇＧに対するＨＢｓＡｇ：ＨＢｓＡｇ ｆｏｒ ｇｏａｔ ＩｇＧ）をそれぞれ反応させた後に測定された蛍光強度値である。
【0080】
【表2】
【0081】
表２を参照すれば、それぞれの固定された抗体（ＩｇＧ）は、対応する抗原の処理後、プレートの底面での蛍光強度は減少し、溶液内での蛍光強度は増加すると測定された。具体的に、ウサギからの抗ＨＲＰ抗体の場合、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２ペプチドに対してプレートの底面での蛍光強度は、１２．３％、１２．７％、１４．８％及び２５．５％ほどそれぞれ減少し、溶液内での蛍光強度は、７４６％、３５７％、６９８％及び５９７％ほどそれぞれ増加した。ヤギからの抗ＨＢｓＡｇ抗体の場合、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２ペプチドに対してプレートの底面での蛍光強度は、４１．１％、４８．７％、６３．９％、及び３５．２％ほどそれぞれ減少し、溶液内での蛍光強度は、４１０％、６３８％、４１２％、及び５７４％ほどそれぞれ増加した。このような結果は、実施例１から合成された４種のペプチド化合物は、ソース動物の種と無関係に固定された抗体（ＩｇＧ）に結合できるだけではなく、実施例１の４種のペプチド化合物のそれぞれと抗体の可逆的な結合によって抗原が抗体の結合ポケットに結合された時、抗体から定量的に遊離されることを示す。
【0082】
図７Ａは、蛍光ラベルされた実施例１のペプチド化合物を利用した免疫分析方法を説明する模式図であり、図７Ｂ及び図７Ｃは、図７Ａに示された免疫分析方法で測定された抗原の濃度による溶液内及びマイクロプレートの底面での蛍光強度を示すグラフである。本実験で、結合抗体としてはマイクロプレートに固定されたウサギからの抗ＨＲＰ抗体が使われ、抗原としてはＨＲＰが使われた。
【0083】
図７Ａないし図７Ｃを参照すれば、抗原ＨＲＰの濃度を０．３から１００μＭまで変化さながら免疫分析を行った結果、４種のスイッチングペプチド（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）に対して、抗原（ＨＲＰ）の濃度と依存して溶液内での蛍光強度が増加することが観察された。
【0084】
Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、及びＬ２ペプチドの平衡遊離定数は、１．６５、３．１１、３．２９、１．４８μＭであると評価されたが、各スイッチングペプチドに対する遊離定数の差は、各スイッチングペプチドが各抗原に対して他の検出領域を有することを意味する。ＨＲＰ抗原の場合、Ｈ１ペプチドがＨＲＰ濃度領域で最も線形的に反応した。このような結果は、スイッチングペプチドが抗原の結合量によって固定された抗体から遊離され、スイッチングペプチドを使用したワンステップイムノアッセイで溶液内の蛍光強度に基づいて抗原の定量分析が可能であることを示す。
【0085】
一方、図７Ｃに示したように、４種のスイッチングペプチドいずれもでマイクロプレートの底面での蛍光強度は、抗原の濃度に依存して減少すると表われた。このような結果は、スイッチングペプチドが抗原の量によって抗体から定量的に遊離され、溶液内だけではなく、マイクロプレートの底面での蛍光強度の変化を通じて抗原の定量分析が可能であることを示す。
【0086】
図８Ａないし図８Ｄは、実施例１のペプチド化合物を使用した免疫分析を用いて検出されたＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する実験結果であり、図８Ａは、Ｂ型肝炎表面抗原の濃度による蛍光強度を示すグラフであり、図８Ｂは、マイクロプレートの底面でのＢ型肝炎表面抗原の蛍光強度を示すグラフである。また、図８Ｃは、ワンステップイムノアッセイのブランド－アルトマン（Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ）テストでの信頼度を示すグラフであり、図８Ｄは、パッシング－バブロック（Ｐａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ）回帰分析での信頼度を示すグラフである。
【0087】
実施例１のペプチド化合物を免疫分析を用いて検出された前記Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）－抗体をマイクロプレート上に固定させた後、Ｌ１ペプチドを添加し、０．０４～３０μｇ／ｍＬの前記Ｂ型肝炎表面抗原を処理した。前記Ｌ１ペプチドは、前記免疫分析のために選択され、これは、前述したように、ＨＲＰ、ＣＲＰ、ＨＢｓＡｇ、及びｈＣＧの４種の抗原のうち、Ｌ１ペプチドが最も高い選択性を示すことで選択された。
【0088】
ｐＨ６．０～ｐＨ８．０でのスイッチングペプチドの抗体結合特性と関連して、Ｈ１及びＬ２ペプチドは、ｐＫａ値が６．０２であるヒスチジン残基によってｐＨ６．０～ｐＨ７．０で純電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）は０．５に減少した。また、Ｈ２及びＬ２ペプチドは、ｐＫａ値が８．１８であるシステイン残基によってｐＨ７．０～ｐＨ８．０で純電荷が０．５に減少した。しかし、Ｌ１ペプチドは、ヒト血清でＢ型肝炎表面抗原の免疫分析に必要なｐＨ範囲でほとんど同じ蛍光信号を示した。したがって、Ｂ型肝炎表面抗原－抗体結合からの特異的な解離及びヒト血清免疫分析のｐＨ範囲内での安定性を有したＬ１ペプチドを選択して前記免疫分析を実施した。
【0089】
図８Ａで示すように、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の濃度を０．３から１０５ｎｇ／ｍＬまで変化させながら免疫分析を行った結果、抗原（ＨＢｓＡｇ）の濃度に依存して溶液内での蛍光強度が増加することが観察された。この場合、ＬＯＤは、５６ｎｇ／ｍＬであり、動的範囲は、１３６ｎｇ／ｍＬ～３３μｇ／ｍＬである。また、図８Ｂで示すように、マイクロプレートの底面での蛍光強度は、抗原（ＨＢｓＡｇ）の濃度によって減少し、ＬＯＤは、５８７ｎｇ／ｍＬと観察された。したがって、抗原（ＨＢｓＡｇ）は、Ｌ１ペプチドと結合し、抗原の濃度が増加するにつれてＬ１ペプチドとの結合程度も増加することを確認することができる。
【0090】
以後、ＥＬＩＳＡとワンステップイムノアッセイとの統計的比較のために、常用ソフトウェア（ＭｅｄＣａｌｃ）を使用してブランド－アルトマンテストとＰａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ回帰分析とを行った。図８Ｃで示すように、ブランド－アルトマンテストでは、ワンステップイムノアッセイとＥＬＩＳＡとの結果が同一であり、９５％（±１．９６σ）の信頼範囲内で分布することを示した。図８Ｄで示すように、Ｐａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ回帰分析の結果、２つの方法の結果が９５％の信頼レベル内で分布し、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関係数（ρ）は、０．９４７（Ｐ＜０．０００１）と計算された。０．５以上のＳｐｅａｒｍａｎ相関係数（ρ）は、２つの方法の高い関連性を示すために、２種の統計分析の結果は、ＥＬＩＳＡとスイッチングペプチドに基づいた免疫分析の結果が類似していることを示す。したがって、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）検出に基づいたヒトのＢ型肝炎診断が、本発明のスイッチングペプチドを用いて可能であることを示す。
【0091】
【0092】
まず、ワンステップイムノアッセイで癌胎児性抗原（ＣＥＡ）をマイクロプレートに固定させ、Ｌ１ペプチドを固定された抗体として処理した。図９Ａで示すように、蛍光信号は、マイクロプレートウェル状態で測定され、この場合、検出限界（ＬＯＤ）は、約３３．６ｎｇ／ｍＬと推定された。また、トランスファーされた溶液で蛍光信号を測定した場合は、図９Ｂで示すように、検出限界（ＬＯＤ）が３４．７ｎｇ／ｍＬと推定された。したがって、本発明のスイッチングペプチドを用いて免疫分析方法を通じた癌胚芽性抗原（ＣＥＡ）の定量的な分析が可能である。
【0093】
図９Ｃで示すように、免疫分析の基準線は、２．１×１０４Ａ．Ｕ．と推定された。これは、イン・サイチュ現場測定（図９Ａ）及びトランスファー溶液（図９Ｂ）で有意な差がなく、微細な差は、蛍光信号が距離に比例して減少することで起因するものと見られる。したがって、ワンステップイムノアッセイで、本発明のスイッチングペプチドを利用した抗原に対する定量分析は、溶液への移動なしにマイクロプレートウェル状態でも可能であることを示す。
【0094】
以上、本発明の望ましい実施例を参照して説明したが、当業者は、下記の特許請求の範囲に記載の本発明の思想及び領域から外れない範囲内で本発明を多様に修正及び変更させることができるということを理解できるであろう。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】