▶ オプトレーン テクノロジーズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-12
(54)【発明の名称】スイッチングペプチド及びそれを用いた免疫分析方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/532 20060101AFI20240104BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20240104BHJP
C07K 1/13 20060101ALI20240104BHJP
【ＦＩ】
G01N33/532 Z
C07K7/08 ZNA
C07K1/13
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540594
(86)(22)【出願日】2022-01-18
(85)【翻訳文提出日】2023-06-30
(86)【国際出願番号】 KR2022000864
(87)【国際公開番号】W WO2022154632
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】10-2021-0006850
(32)【優先日】2021-01-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519122725
【氏名又は名称】オプトレーン テクノロジーズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＯＰＴＯＬＡＮＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】ピョン，ジェ‐チョル
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA70
4H045EA50
(57)【要約】
電気化学的免疫分析方法に適用可能なスイッチングペプチドが開示される。スイッチングペプチドは、結合抗体に可逆的に結合することができるペプチド化合物；及びペプチド化合物に結合された化学的標識物質；を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
結合抗体に可逆的に結合することができるペプチド化合物と、前記ペプチド化合物に結合された化学的標識物質と、を含む、スイッチングペプチド。
【請求項2】
前記ペプチド化合物は、前記結合抗体のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することを特徴とする、請求項１に記載のスイッチングペプチド。
【請求項3】
前記ペプチド化合物は、前記結合抗体の軽鎖または重鎖の第１ないし第４フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうち１つ以上と特異的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のスイッチングペプチド。
【請求項4】
前記ペプチド化合物は、前記軽鎖の第２フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性を有する第１アミノ酸配列を有する第１ペプチド化合物と、前記軽鎖の第３または第４フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第２アミノ酸配列を有する第２ペプチド化合物と、
前記重鎖の第２フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性を有する第３アミノ酸配列を有する第３ペプチド化合物と、
前記重鎖の第３または第４フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第４アミノ酸配列を有する第４ペプチド化合物と、からなるグループから選択された１つ以上を含むことを特徴とする、請求項３に記載のスイッチングペプチド。
【請求項5】
前記ペプチド化合物は、１４～２０個のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項４に記載のスイッチングペプチド。
【請求項6】
前記ペプチド化合物は、１６５０～２５００Ｄａの分子量を有することを特徴とする、請求項５に記載のスイッチングペプチド。
【請求項7】
前記化学的標識物質は、試料溶液内で可逆的に酸化または還元される物質を含むことを特徴とする、請求項１に記載のスイッチングペプチド。
【請求項8】
前記化学的標識物質は、フェロセン、フェロセンメタノール、フェロセンジメタノール、α－メチルフェロセンメタノール、フェロシアン化イオン、フェリシアン化イオン、六アミン化ルテニウム（Ｒｕ）イオン、ヒドロキノン、アスコルビン酸、ドーパミン、フェロセンカルボン酸、フェロセンジカルボン酸、及びフェロセンアルデヒドからなるグループから選択された１つ以上を含むことを特徴とする、請求項７に記載のスイッチングペプチド。
【請求項9】
基板にスイッチングペプチドが結合された結合抗体を固定させるか、前記基板に結合抗体を固定した後、前記スイッチングペプチドを結合抗体に結合させる第１段階と、前記結合抗体を検出試料溶液で処理する第２段階と、
前記処理後の検出試料溶液に対して電気化学的分析を行って、前記検出試料溶液内の前記結合抗体と特異的に反応するターゲット抗原を定量的に分析する第３段階と、を含み、
前記スイッチングペプチドは、前記結合抗体のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有するペプチド化合物及びこれに結合され、前記検出試料溶液内で酸化還元が可能な化学的標識物質を含むことを特徴とする、免疫分析方法。
【請求項10】
前記第２段階で、前記検出試料溶液内に前記ターゲット抗原が存在する場合、前記ターゲット抗原が前記結合抗体に結合されれば、前記スイッチングペプチドは、前記結合抗体と反応した前記ターゲット抗原の量に依存して定量的に前記結合抗体から遊離されることを特徴とする、請求項９に記載の免疫分析方法。
【請求項11】
前記電気化学的分析は、アンペロメトリー、クロノアンペロメトリー、ボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、ディファレンシャルポテンシャルボルタンメトリー、クロノポテンショメトリー、及びポーラログラフィーからなるグループから選択された１つの方法で行われることを特徴とする、請求項１０に記載の免疫分析方法。
【請求項12】
前記第３段階で、前記結合抗体から遊離されたスイッチングペプチドの化学的標識物質とアンペロメトリーまたはボルタンメトリーのための作動電極との間に酸化還元反応が起こることを特徴とする、請求項１１に記載の免疫分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫反応を用いてターゲット抗原物質の分析に使われるスイッチングペプチド及びそれを用いた免疫分析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
バイオ技術分野において、多様な免疫診断検査または環境モニタリングのようなバイオ検査のために、イムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が使われている。前記イムノアッセイは、抗原－抗体反応の特異性を用いて特定ターゲット物質の定量的分析が可能であり、他の分析方法に比べて高い感度を有するという利点がある。
【0003】
前記イムノアッセイは、癌マーカー、感染性疾患、甲状腺機能、貧血、アレルギー、妊娠、薬物乱用、痛風の診断のような多様な診断に用いられる。前記イムノアッセイを多種の抗原の診断または分析に利用するためには、前記抗原のそれぞれに対して特異的な反応性を有する抗体を調製しなければならない。
【0004】
しかし、このような方法は、最近、急速に多様化されている現代化された疾病または多数の突然変異種を有するウイルスの感知に限界点がある。特に、前記ウイルスの場合、前記ウイルスと特異的結合性を有する抗体を確保することが不可能な場合も多数ある。
【0005】
また、前記抗原－抗体反応を用いる場合、前記抗体を標識物質と結合させる追加的な段階が要求される。前記標識物質と前記抗体との結合性が低下する場合、イムノアッセイ分析の精度または信頼度が低下する。
【0006】
前述したような問題点によって、多様な抗体に対して結合することができる多種の標識物質をそれぞれ開発しなければならないという問題もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の一目的は、結合抗体のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができるペプチド化合物と検出試料溶液内で酸化還元が可能な化学的標識物質とを備えて電気化学的免疫分析方法に適用可能なスイッチングペプチドを提供することである。
【0008】
本発明の他の目的は、前記スイッチングペプチドを利用した免疫分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の実施例によるスイッチングペプチドは、結合抗体に可逆的に結合することができるペプチド化合物；及び前記ペプチド化合物に結合された化学的標識物質；を含む。
【0010】
一実施例において、前記ペプチド化合物は、前記結合抗体のＦａｂ（フラグメント抗原結合：Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができる。
【0011】
一実施例において、前記ペプチド化合物は、前記結合抗体の軽鎖または重鎖の第１ないし第４フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうち１つ以上と特異的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有しうる。
【0012】
一実施例において、前記ペプチド化合物は、前記軽鎖の第２フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有する第１アミノ酸配列を有する第１ペプチド化合物；前記軽鎖の第３または第４フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第２アミノ酸配列を有する第２ペプチド化合物；前記重鎖の第２フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性を有する第３アミノ酸配列を有する第３ペプチド化合物；及び前記重鎖の第３または第４フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第４アミノ酸配列を有する第４ペプチド化合物；からなるグループから選択された１つ以上を含みうる。
【0013】
一実施例において、前記ペプチド化合物は、１４～２０個のアミノ酸を含みうる。
【0014】
一実施例において、前記ペプチド化合物は、１６５０～２５００Ｄａの分子量を有しうる。
【0015】
一実施例において、前記化学的標識物質は、試料溶液内で可逆的に酸化または還元される物質を含みうる。
【0016】
一実施例において、前記化学的標識物質は、フェロセン（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ）、フェロセンメタノール（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅｍｅｔｈａｎｏｌ）、フェロセンジメタノール（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅｄｉｍｅｔｈａｎｏｌ）、α－メチルフェロセンメタノール、フェロシアン化（ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ）イオン、フェリシアン化（ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ）イオン、六アミン化ルテニウム（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ、Ｒｕ）イオン、ヒドロキノン（ｈｙｄｒｏｎｑｕｉｎｏｎｅ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）、フェロセンカルボン酸（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、フェロセンジカルボン酸（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、及びフェロセンアルデヒド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ）からなるグループから選択された１つ以上を含みうる。
【0017】
本発明の実施例による免疫分析方法は、基板にスイッチングペプチドが結合された結合抗体を固定させるか、前記基板に結合抗体を固定した後、前記スイッチングペプチドを結合抗体に結合させる第１段階；前記結合抗体を検出試料溶液で処理する第２段階；及び前記処理後の検出試料溶液に対して電気化学的分析を行って、前記検出試料溶液内の前記結合抗体と特異的に反応するターゲット抗原を定量的に分析する第３段階；を含み、前記スイッチングペプチドは、前記結合抗体のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有するペプチド化合物及びこれに結合され、前記検出試料溶液内で酸化還元が可能な化学的標識物質を含む。
【0018】
一実施例において、前記第２段階で、前記検出試料溶液内に前記ターゲット抗原が存在する場合、前記ターゲット抗原が前記結合抗体に結合されれば、前記スイッチングペプチドは、前記結合抗体と反応した前記ターゲット抗原の量に依存して定量的に前記結合抗体から遊離される。
【0019】
一実施例において、前記電気化学的分析は、アンペロメトリー（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）、クロノアンペロメトリー（ｃｈｒｏｎｏａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）、ボルタンメトリー（ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）、サイクリックボルタンメトリー（ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）、ディファレンシャルポテンシャルボルタンメトリー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｖｏｌｔａｍｍｍｅｔｒｙ）、クロノポテンショメトリー（ｃｈｒｏｎｏｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｙ）、及びポーラログラフィー（ｐｏｌａｒｏｇｒａｐｈｙ）からなるグループから選択された１つの方法で行われる。
【0020】
一実施例において、前記第３段階で、前記結合抗体から遊離されたスイッチングペプチドの化学的標識物質とアンペロメトリーまたはボルタンメトリーのための作動電極（ｗｏｒｋｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）との間に酸化還元反応が起こりうる。
【発明の効果】
【0021】
本発明のスイッチングペプチド及びそれを用いた免疫分析方法によれば、結合抗体のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合し、化学的標識物質を備えるスイッチングペプチドを用いて、光学系が要求されない電気化学的分析方法を通じてターゲット抗原を定量分析することができるので、分析機器の小型化及び低価格化を可能にし、これにより、臨床現場での診断用機器に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】本発明の実施例によるスイッチングペプチドを説明する図面である。
【図2】結合抗体を説明する図面である。
【図3A】本発明の実施例による免疫分析方法を説明するフローチャートである。
【図4A】Ｌ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を確認する方法及び測定結果を示す図面である。
【図4B】ＰｙＭＯＬソフトウェアを使用して分析されたＬ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を説明する図面である。
【図5】マイクロプレート上にそれぞれ分離固定されたヒト、ウサギ、ヤギ及びラットからのＩｇＧ、そして、これらと異なるタンパク質（ヒトＢ型肝炎抗原、Ｃ反応性タンパク質、プロテインＡ、ＢＳＡ）を蛍光ラベルされた実施例１から合成された４種のペプチド化合物（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）と反応させた後、マイクロプレートの底面から測定された蛍光強度を示すグラフである。
【図6A】実施例１の４種のペプチドがそれぞれ結合された抗体をタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）であるパパイン（ｐａｐａｉｎ）で処理前及び後の状態を示す模式図である。
【図6B】前記パパイン処理後、マイクロプレートの底面（Ｂ）及び溶液内（Ｓ）から測定された蛍光強度を示すグラフである。
【図7A】蛍光ラベルされた実施例１のペプチド化合物を利用した免疫分析方法を説明する模式図である。
【図8A】フェロセンで標識されたスイッチングペプチドを分析した結果である。
【図8B】フェロセンで標識されたスイッチングペプチドを分析した結果である。
【図8C】フェロセンで標識されたスイッチングペプチドを分析した結果である。
【図9A】Ｌ１スイッチングペプチドを含有する試料溶液に対してＤＰＡ（ディファレンシャルパルスボルタンメトリー：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｕｌｓｅｄ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）方法で測定されたＬ１スイッチングペプチドの濃度による電流値の変化を示すグラフである。
【図9B】Ｈ２スイッチングペプチドを含有する試料溶液に対してＤＰＡ方法で測定されたＨ２スイッチングペプチドの濃度による電流値の変化を示すグラフである。
【図10】本発明のＬ１及びＨ２スイッチングペプチドと結合した結合抗体のヒトＢ型肝炎抗原（ｈＨＢｓＡｇ）に対するワンステップイムノアッセイ分析を行った結果である。
【図11A】ＨＢｓＡｇ抗原を含有する検出試料溶液に対して第１ Ｌ１スイッチングペプチド（フェロセンが末端に結合されたＬ１ペプチド化合物）を利用した電気化学的免疫分析方法、第２スイッチングペプチド（蛍光ラベルされたＬ１ペプチド化合物）を利用した光学的免疫分析方法、従来のＥＬＩＳＡキットを利用した化学発光基盤の免疫分析方法及び従来のＥＬＩＳＡキットを利用したクロモジェニック免疫分析方法を通じて測定された抗原の濃度による分析結果を示すグラフである。
【図11B】ＨＢｓＡｇ抗原を含有する検出試料溶液に対して第１ Ｌ１スイッチングペプチド（フェロセンが末端に結合されたＬ１ペプチド化合物）を利用した電気化学的免疫分析方法、第２スイッチングペプチド（蛍光ラベルされたＬ１ペプチド化合物）を利用した光学的免疫分析方法、従来のＥＬＩＳＡキットを利用した化学発光基盤の免疫分析方法及び従来のＥＬＩＳＡキットを利用したクロモジェニック免疫分析方法を通じて測定された抗原の濃度による分析結果を示すグラフである。
【図12A】実施例２のペプチド化合物を使用した免疫分析の従来の方法との比較のためのブランド－アルトマン（Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ）テスト及びパッシング－バブロック（Ｐａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ）回帰分析を行ったグラフである。
【図12B】実施例２のペプチド化合物を使用した免疫分析の従来の方法との比較のためのブランド－アルトマン（Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ）テスト及びパッシング－バブロック（Ｐａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ）回帰分析を行ったグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下、添付した図面を参照して、本発明の実施例について詳しく説明する。本発明は、多様な変更を加え、さまざまな形態を有しうるので、特定実施例を図面に例示し、本明細書で詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の開示形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる、あらゆる変更、均等物または代替物を含むものと理解しなければならない。各図面を説明しながら類似の参照符号を類似の構成要素に対して使用した。添付図面において、構造物の寸法は、本発明の明確性を期するために実際よりも拡大して図示したものである。
【0024】
本明細書で使用した用語は、単に特定の実施例を説明するために使われたものであって、本発明を限定しようとする意図ではない。単数の表現は、文脈上、取り立てて明示しない限り、複数の表現を含む。本明細書において、「含む」または「有する」などの用語は、明細書上に記載の特徴、数字、段階、動作、構成要素またはこれらを組み合わせたものが存在するということを指定しようとするものであって、１つまたはそれ以上の他の特徴や数字、段階、動作、構成要素またはこれらを組み合わせたものの存在、または付加可能性をあらかじめ排除しないものと理解しなければならない。
【0025】
取り立てての定義がない限り、技術的や科学的な用語を含んで、ここで使われるあらゆる用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有している。一般的に使われる辞書に定義されているような用語は、関連技術の文脈上の意味と一致する意味を有すると解釈されなければならず、本明細書で明白に定義しない限り、理想的であるか、過度に形式的な意味として解釈されない。
【0026】
【0027】
図１及び図２を参照すれば、本発明の実施例によるスイッチングペプチド１００は、結合抗体１０に可逆的に結合することができるペプチド化合物１１０及び前記ペプチド化合物１１０に結合された化学的標識物質１２０を含みうる。前記スイッチングペプチド１００は、ターゲット抗原と特異的に結合する前記結合抗体１０に可逆的に結合することができて、前記ターゲット抗原が前記結合抗体に特異的に結合する場合、定量的に前記結合抗体１０から遊離され、その結果、前記結合抗体１０から遊離された前記スイッチングペプチド１００の化学的標識物質１２０を介した酸化還元反応によって、前記ターゲット抗原を含む検査試料の電気化学的特性が変化することができる。
【0028】
前記結合抗体１０は、前記ターゲット抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）のような特異的な抗原決定基に結合されるか、前記抗原決定基と反応することにより、免疫学的エフェクターメカニズムを誘導することができる化合物である。前記結合抗体は、単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）を有しても、多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）を有しても良い。
【0029】
一実施例において、前記結合抗体１０は、抗体、抗体誘導体またはその断片を含みうる。前記結合抗体１０は、完全な（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリン分子でもあり、これとは異なって、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｃ、Ｆ（ｖ）、Ｎ－グリカン構造、パラトープのような完全な抗体の構成部分または前記構成部分のうち少なくとも一部を含むこともある。
【0030】
一実施例において、前記結合抗体は、ヒト抗体、非ヒト抗体またはヒト化された非ヒト抗体である。
【0031】
前記ヒト抗体は、ヒトによって生産された抗体または任意の技術を用いて合成されたアミノ酸配列を保有する合成抗体を含みうる。ヒト抗体のこのような定義は、特に、非ヒト抗原－結合残基を含むヒト化抗体を排除する。前記ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術に公知の多様な技術を用いて生成されうる。前記非ヒト抗体は、多様な種の供給源、例えば、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ヒトを除いた哺乳動物または鳥類から獲得された抗体である。前記非ヒト抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施例において、前記ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が目的特異性、親和度及び／または能力を有する前述した非ヒト抗体（ドナー抗体）の超可変領域に置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合に、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク残基は、相応する非ヒト残基によって置き換えられる。また、前記ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体から見つけられない残基を含みうる。これらの変形は、抗体の性能、例えば、結合親和度を追加精錬するために製造可能である。
【0032】
一実施例において、前記結合抗体１０は、前記抗体分子、免疫グロブリン分子、その断片またはこれらのうち１つ以上の集合体である。前記結合抗体１０は、前記ターゲット抗原に対する特異的な結合を可能にする独特な構造を有することができ、それぞれの結合抗体１０は、２個の同じ構造の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）及び２個の同じ構造の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含みうる。前記重鎖及び軽鎖は、それぞれ可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）及び不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）を含みうる。前記重鎖と軽鎖との可変領域が結合して抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を形成しうる。前記結合抗体１０は、パパインのようなタンパク質分解酵素によってターゲット抗原が結合する部分は、Ｆａｂ（抗体結合フラグメント：ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）領域及び結晶化された支柱部分であるＦｃ（フラグメント結晶化可能：Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域に分離され、前記抗原結合部位は、前記抗体のＦａｂ領域に含まれる。
【0033】
一方、前記重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれは、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；ＨＶＲ）である３個の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲｓ）及び前記相補性決定領域を構造的に支持する４個のフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＦＲｓ）領域が交互に配列された構造を有しうる。前記相補性決定領域は、抗体ごとに異なるアミノ酸配列を有して、それぞれの抗原と特異的に結合することができる一方、前記フレームワーク領域は、生物のサブファミリー（Ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ）によって保存されたアミノ酸配列を有しており、同じサブファミリーに属する生物の抗体は、同一または類似したアミノ酸配列を有する。
【0034】
以下、説明の便宜上、前記結合抗体１０の軽鎖の可変領域において、Ｎ末端から順次に離隔して配された４個のフレームワーク領域をそれぞれ第１ないし第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ１、ＶＬ－ＦＲ２、ＶＬ－ＦＲ３及びＶＬ－ＦＲ４）とし、前記第１ないし第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ１、ＶＬ－ＦＲ２、ＶＬ－ＦＲ３及びＶＬ－ＦＲ４）の間にそれぞれ位置し、前記Ｎ末端から順次に配された３個の相補性決定領域をそれぞれ第１ないし第３軽鎖相補性決定領域（ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ＶＬ－ＣＤＲ３）と称する。そして、前記結合抗体１０の重鎖の可変領域において、Ｎ末端から順次に離隔して配された４個のフレームワーク領域をそれぞれ第１ないし第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ１、ＶＨ－ＦＲ２、ＶＨ－ＦＲ３及びＶＨ－ＦＲ４）とし、前記第１ないし第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ１、ＶＨ－ＦＲ２、ＶＨ－ＦＲ３及びＶＨ－ＦＲ４）の間にそれぞれ位置し、前記Ｎ末端から順次に配された３個の相補性決定領域をそれぞれ第１ないし第３重鎖相補性決定領域（ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３）と称する。
【0035】
前記ペプチド化合物１１０は、前記結合抗体１０のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有しうる。
【0036】
一実施例において、前記ペプチド化合物１１０は、前記結合抗体１０の軽鎖または重鎖の第１ないし第４フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうち１つ以上と特異的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有しうる。例えば、前記ペプチド化合物１１０は、前記結合抗体１０の軽鎖または重鎖の第１ないし第４フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうち１つ以上と相同性を有するアミノ酸配列を含み、この場合、前記ペプチド化合物１１０は、前記軽鎖または重鎖の第１ないし第４フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）のうち１つ以上と可逆的に結合することができ、これにより、ターゲット抗原が前記結合抗体１０に結合する場合、前記結合抗体１０に結合された前記ペプチド化合物１０は、前記結合抗体１０に結合される抗原の量によって定量的に前記結合抗体１０から遊離される。
【0037】
一実施例として、前記ペプチド化合物１１０は、前記第２軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性を有する第１アミノ酸配列を有する第１ペプチド化合物（Ｌ１）、前記第３または第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第２アミノ酸配列を有する第２ペプチド化合物（Ｌ２）、前記第２重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）のアミノ酸配列と相同性を有する第３アミノ酸配列を有する第３ペプチド化合物（Ｈ１）及び前記第３または第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）のアミノ酸配列と相同性を有する第４アミノ酸配列を有する第４ペプチド化合物（Ｈ２）の中から選択された１つ以上を含みうる。
【0038】
前記結合抗体１０の前記第２軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）と前記第３または第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）は、互いに隣接して位置して相互作用し、前記第３または第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）と前記第２重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）は、互いに隣接して位置して相互作用するので、前記結合抗体１０の第２軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）と相同性がある第１アミノ酸配列を有する前記第１ペプチド化合物（Ｌ１）は、前記結合抗体１０の第３または第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）と選択的に相互作用することができ、前記結合抗体１０の第３または第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）と相同性を有する第２アミノ酸配列を有する前記第２ペプチド化合物（Ｌ２）は、前記結合抗体１０の第２重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）と選択的に相互作用することができ、前記結合抗体１０の第２重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ２）と相同性を有する第３アミノ酸配列を有する前記第３ペプチド化合物（Ｈ１）は、前記結合抗体１０の第３または第４軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ３、ＶＬ－ＦＲ４）と選択的に相互作用することができ、前記結合抗体１０の第３または第４重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４）と相同性を有する第４アミノ酸配列を有する前記第４ペプチド化合物（Ｈ２）は、前記結合抗体１０の第２軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ２）と選択的に相互作用することができる。
【0039】
一実施例において、前記結合抗体１０がヒトを含む動物のサブファミリーに属する生物から由来した場合、前記ペプチド化合物１１０は、約１０～２５個のアミノ酸を含み、約１６００～３０００Ｄａの分子量を有しうる。例えば、前記ペプチド化合物１１０は、約１４～２０個のアミノ酸を含み、約１６５０～２５００Ｄａの分子量を有しうる。一実施例として、前記第１ないし第４ペプチド化合物（Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、Ｈ２）は、下記表１に記載のようなアミノ酸配列を含みうる。
【0040】
【表1】
【0041】
一方、抗体の軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）は、生物のサブファミリーによって保存されたアミノ酸配列を有するので、前記ペプチド化合物１１０は、同じサブファミリーに属する他の種の生物から由来した抗体に対して共通して適用されるので、前記ペプチド化合物１１０がヤギ、ラット、ウサギなどの抗体から合成された場合であっても、ヒトの抗体に対しても前述したものと同じ作用及び効果を示すことができる。
【0042】
前記化学的標識物質１２０は、前記ペプチド化合物１１０に結合され、検出試料内で可逆的に酸化及び還元される。一実施例として、前記化学的標識物質１２０は、フェロセン、フェロセンメタノール、フェロセンジメタノール、α－メチルフェロセンメタノール、フェロシアン化イオン、フェリシアン化イオン、六アミン化ルテニウム（Ｒｕ）イオン、ヒドロキノン、アスコルビン酸、ドーパミン、フェロセンカルボン酸、フェロセンジカルボン酸、フェロセンアルデヒドなどからなるグループから選択された１つ以上を含みうる。
【0043】
【0044】
図３Ａないし図３Ｃを参照すれば、本発明の実施例による免疫分析方法は、基板にスイッチングペプチドが結合された結合抗体を固定させるか、前記基板に結合抗体を固定した後、前記スイッチングペプチドを結合抗体に結合させる第１段階（ステップＳ１１０）；前記結合抗体を検出試料溶液で処理する第２段階（ステップＳ１２０）；及び前記処理後の検出試料溶液に対して電気化学的分析を行って、前記検出試料溶液内のターゲット抗原を定量的に分析する第３段階（ステップＳ１３０）；を含む。
【0045】
前記第１段階（ステップＳ１１０）において、前記スイッチングペプチドは、前記結合抗体のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合することができるアミノ酸配列を有するペプチド化合物及びこれに結合され、前記検出試料溶液内で酸化還元が可能な化学的標識物質を含みうる。一実施例として、前記スイッチングペプチドとしては、図１及び図２を参照して説明したスイッチングペプチド１００が使われるので、これについての重複された詳細な説明は省略する。
【0046】
一実施例において、前記結合抗体と前記スイッチングペプチドとの場合、まず、前記基板に結合抗体を固定した後、固定された前記結合抗体に前記スイッチングペプチドが結合されても、これとは異なって、前記スイッチングペプチドを前記結合抗体に結合させた後、前記結合抗体を前記基板に固定させることもできる。
【0047】
前記結合抗体を前記基板に固定させる方法は、特に制限されない。例えば、前記結合抗体は、前記基板に直接結合されても、リンカー化合物を通じて前記基板に結合されて固定されてもよい。
【0048】
前記スイッチングペプチドは、前述したように、前記結合抗体のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合されうる。
【0049】
前記第２段階（ステップＳ１２０）において、前記基板に固定された結合抗体上に検出試料溶液を塗布することができる。
【0050】
一実施例において、前記検出試料溶液内に前記結合抗体と特異的に反応するターゲット抗原が存在する場合、前記検出試料溶液を前記結合抗体上に塗布すれば、前記ターゲット抗原が前記結合抗体に結合され、この場合、前記スイッチングペプチドは、前記結合抗体と反応した前記ターゲット抗原の量に依存して定量的に前記結合抗体から遊離される。
【0051】
前記第３段階（ステップＳ１３０）において、前記結合抗体上に前記検出試料溶液を塗布し、一定時間経過後、前記検出試料溶液に対する電気化学的分析を行って、前記検出試料溶液内の前記ターゲット抗原を定量的に分析することができる。
【0052】
一実施例として、前述したように、前記ターゲット抗原が前記結合抗体と反応する場合、前記ペプチド化合物は、前記結合抗体と反応したターゲット抗原の量に依存して定量的に前記結合抗体から遊離され、この場合、前記処理後の検出試料溶液内の前記スイッチングペプチドの濃度が増加し、前記スイッチングペプチドの化学的標識物質の酸化または還元によって、前記検出試料溶液の電気化学的特性が変化することができる。
【0053】
一実施例において、前記処理後の検出試料溶液に対する電気化学的分析は、特に制限されない。例えば、前記電気化学的分析は、アンペロメトリー、クロノアンペロメトリー、ボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、ディファレンシャルポテンシャルボルタンメトリー、クロノポテンショメトリー、ポーラログラフィーなどの方法で行われる。
【0054】
一実施例において、図３Ａ及び図３Ｂに示したように、前記スイッチングペプチドの化学的標識物質がフェロセンであり、ディファレンシャルポテンシャルボルタンメトリーの方法で前記電気化学的分析を行う場合、前記スイッチングペプチドのフェロセンは、作動電極に電子を伝達することにより、フェロセンイオンに酸化され、これにより、前記検出試料溶液の電気化学的特性が変化することができ、その結果、基準電極（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）とカウンター電極（Ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）との間に流れる電流値が変化することができる。前記処理後の検出試料溶液に含まれた前記スイッチングペプチドの濃度は、結合抗体と結合するターゲット抗原の量によって変化するので、本発明では、前記電流値の変化を測定して、前記ターゲット抗原を定量的に分析することができる。一方、前記フェロセンイオンは、前記作動電極から電子を供給されてフェロセンに還元される。
【0055】
本発明のスイッチングペプチド及びそれを用いた免疫分析方法によれば、結合抗体のＦａｂ領域に選択的に、そして、可逆的に結合し、化学的標識物質を備えるスイッチングペプチドを用いて、光学系が要求されない電気化学的分析方法を通じてターゲット抗原を定量分析することができるので、分析機器の小型化及び低価化を可能にし、これにより、臨床現場での診断用機器に適用可能である。
【0056】
以下、本発明の具体的な実施例について詳述する。但し、下記の実施例は、本発明の一部の実施形態に過ぎないものであって、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0057】
［実施例１］
表１に記載のような４種のペプチド（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）を合成した。具体的に、Ｈ１ペプチドは、重鎖のＦＲ２領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｈ２ペプチドは、重鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｌ１ペプチドは、軽鎖のＦＲ２領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｌ２ペプチドは、軽鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成された。
表１に記載のような４種のペプチド（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）を合成した。具体的に、Ｈ１ペプチドは、重鎖のＦＲ２領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｈ２ペプチドは、重鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｌ１ペプチドは、軽鎖のＦＲ２領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成され、Ｌ２ペプチドは、軽鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域と相同性があるアミノ酸配列を有するように合成された。
【0058】
ギブス自由エネルギーの変化（△Ｇ）は、Ｈ１ペプチド化合物に対しては－１７．９１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｈ２ペプチドに対しては－１７．１９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｌ１ペプチドに対しては１５．３７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｌ２ペプチドに対しては－１３．０５ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。
【0059】
［実験例１］
図４Ａは、Ｌ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を確認する方法及び測定結果を示す図面であり、図４Ｂは、ＰｙＭＯＬソフトウェアを使用して分析されたＬ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を説明する図面である。この際、Ｌ１及びＬ２ペプチドの末端には、第１蛍光標識物質であるＦＡＭ（λｅｘ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５３２ｎｍ）が修飾され、Ｈ１及びＨ２ペプチドの末端には、第２蛍光標識物質であるＴＡＭＲＡ（λｅｘ＝５３２ｎｍ、λｅｍ＝５７０ｎｍ）が修飾された。一方、第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）は、パリレン－Ｈのホルミル基とペプチドとのうち、リジン残基（ｌｙｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）の１次アミン基の間の共有結合を通じてパリレン－Ｈコーティングされたマイクロプレートに固定され、第２ペプチド（Ｈ２またはＨ１）は、固定された第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）と共に培養されて、これらの間の特異的相互作用が許容された。一方、固定された第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）とこれと共に培養された第２ペプチド（Ｈ２またはＨ１）との間の特異的相互作用は、第２ペプチドに修飾されたＴＡＭＲＡ（λｅｍ＝５７０ｎｍ）からの緑色蛍光発光を有したＦＲＥＴ効果がマイクロプレートの底面から観察されるか否かによって判別されるというが分かり、第１及び第２ペプチドの間の特異的相互作用が発生する場合、ＦＲＥＴ効果がマイクロプレートの底面から観察される。
図４Ａは、Ｌ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を確認する方法及び測定結果を示す図面であり、図４Ｂは、ＰｙＭＯＬソフトウェアを使用して分析されたＬ１及びＨ２ペプチドの間の特異的相互作用、そして、Ｌ２及びＨ１ペプチドの間の特異的相互作用を説明する図面である。この際、Ｌ１及びＬ２ペプチドの末端には、第１蛍光標識物質であるＦＡＭ（λｅｘ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５３２ｎｍ）が修飾され、Ｈ１及びＨ２ペプチドの末端には、第２蛍光標識物質であるＴＡＭＲＡ（λｅｘ＝５３２ｎｍ、λｅｍ＝５７０ｎｍ）が修飾された。一方、第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）は、パリレン－Ｈのホルミル基とペプチドとのうち、リジン残基（ｌｙｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）の１次アミン基の間の共有結合を通じてパリレン－Ｈコーティングされたマイクロプレートに固定され、第２ペプチド（Ｈ２またはＨ１）は、固定された第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）と共に培養されて、これらの間の特異的相互作用が許容された。一方、固定された第１ペプチド（Ｌ１またはＬ２）とこれと共に培養された第２ペプチド（Ｈ２またはＨ１）との間の特異的相互作用は、第２ペプチドに修飾されたＴＡＭＲＡ（λｅｍ＝５７０ｎｍ）からの緑色蛍光発光を有したＦＲＥＴ効果がマイクロプレートの底面から観察されるか否かによって判別されるというが分かり、第１及び第２ペプチドの間の特異的相互作用が発生する場合、ＦＲＥＴ効果がマイクロプレートの底面から観察される。
【0060】
図４Ａを参照すれば、Ｌ１及びＨ２ペプチドの間の相互作用は、Ｌ１ペプチドの濃度を変化させることによって観察され、ＦＲＥＴ強度は、Ｌ１ペプチドの濃度の増加と共に増加した。このような結果は、Ｌ１とＨ２ペプチドとの間の特異的相互作用が発生したことを示す。
【0061】
そして、Ｈ１とＬ２ペプチドとの間の相互作用は、Ｈ１ペプチドの濃度を変化させることによって観察され、ＦＲＥＴ強度は、Ｈ１ペプチドの濃度が増加するにつれて増加すると観察された。このような結果も、Ｈ１とＬ２ペプチドとの間の特異的相互作用が発生したことを示す。
【0062】
以上の結果から、Ｌ１ペプチドは、重鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域（Ｈ２ペプチドに対応）に選択的に、そして、可逆的に結合し、Ｌ２ペプチドは、重鎖のＦＲ２領域（Ｈ１ペプチドに対応）に選択的に、そして、可逆的に結合し、Ｈ１ペプチドは、軽鎖のＦＲ３またはＦＲ４領域（Ｌ２ペプチドに対応）に選択的に、そして、可逆的に結合し、Ｈ２ペプチドは、軽鎖のＦＲ２領域（Ｌ１ペプチドに対応）に選択的に、そして、可逆的に結合することが分かる。
【0063】
図４Ｂを参照すれば、ＰｙＭＯＬを通じてＨ１－Ｌ２ペプチドの間の水素結合及びＨ２－Ｌ１の間の水素結合を分析した結果、Ｈ１－Ｌ２ペプチドの間の場合、（１）グルタミン（Ｈ１ペプチドの残留数９）とチロシン（Ｌ２ペプチドの残留数３）との間で３．３４Åの長さを有する水素結合及び（２）Ｌ２ペプチドからのペプチド結合のカルボニル基とＨ１ペプチドからのペプチド結合の電子不足水素との間で３．３９Åの長さを有する水素結合が見つけら、Ｈ２－Ｌ１ペプチドの間の場合、（１）アミノ酸の間（相互作用Ｉ）、（２）ペプチド結合の間（相互作用ＩＩ、ＩＩＩ）、（３）アミノ酸とペプチド結合との間（相互作用ＩＶ）で２．４９～３．９３Åの長さを有する４個の水素結合が見つけられた。水素結合の数は、Ｈ１－Ｌ２ペプチドの間の相互作用がＨ２－Ｌ１ペプチドの間の相互作用よりもさらに強いということを示すことに対して、ギブス自由エネルギー変化の類似した値は、ＩｇＧに対するペプチド化合物の類似した結合親和度を暗示する。
【0064】
図５は、マイクロプレート上にそれぞれ分離固定されたヒト、ウサギ、ヤギ及びラットからのＩｇＧ、そして、これらと異なるタンパク質（ヒトＢ型肝炎抗原、Ｃ反応性タンパク質、プロテインＡ、ＢＳＡ）を蛍光ラベルされた実施例１から合成された４種のペプチド化合物（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）と反応させた後、マイクロプレートの底面から測定された蛍光強度を示すグラフである。
【0065】
図５を参照すれば、ヒト、ウサギ、ヤギ及びラットからのＩｇＧのみが著しく高い蛍光強度を示し、他の抗原性タンパク質は、ベースラインレベルの蛍光を示した。このような結果は、実施例１のペプチドが抗体に選択的に結合されることを示す。
【0066】
図６Ａは、実施例１の４種のペプチドがそれぞれ結合された抗体をタンパク質分解酵素であるパパインで処理前及び後の状態を示す模式図であり、図６Ｂは、前記パパイン処理後、マイクロプレートの底面（Ｂ）及び溶液内（Ｓ）から測定された蛍光強度を示すグラフである。本実験の場合、抗体（ウサギ抗ＨＲＰ抗体）をマイクロプレート上に固定した後、蛍光ラベルされたスイッチングペプチドで処理して抗体とスイッチングペプチドとの間の結合を誘導し、引き続き、非結合スイッチングペプチドを除去した後、タンパク質分解酵素であるパパインを添加して、前記固定された抗体からＦａｂ領域を加水分解した。
図６Ａを参照すれば、蛍光ラベルされたスイッチングペプチドは、抗体のＦａｂ領域に結合されるために、マイクロプレートの底面（Ｂ）での蛍光は、パパイン反応後、減少し、スイッチングペプチドが結合されたＦａｂ領域が加水分解されて溶液内部に溶解されるので、溶液内の蛍光は増加すると予想され、このような予想は、図６Ｂのグラフによって事実であることが立証された。
図６Ａを参照すれば、蛍光ラベルされたスイッチングペプチドは、抗体のＦａｂ領域に結合されるために、マイクロプレートの底面（Ｂ）での蛍光は、パパイン反応後、減少し、スイッチングペプチドが結合されたＦａｂ領域が加水分解されて溶液内部に溶解されるので、溶液内の蛍光は増加すると予想され、このような予想は、図６Ｂのグラフによって事実であることが立証された。
【0067】
図６Ｂを参照すれば、４種のスイッチングペプチド（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）いずれもパパイン処理前に比べてパパイン処理後に、マイクロプレートの底面（Ｂ）での蛍光は減少し、溶液内（Ｓ）での蛍光は増加した。具体的に、マイクロプレートの底面での蛍光強度の場合、Ｈ１ペプチドは８４．３％、Ｈ２ペプチドは５８．７％、Ｌ１ペプチドは８４．８％、Ｌ２ペプチドは７２．５％減少したと評価された。そして、溶液内での蛍光強度の場合、Ｈ１ペプチドは２１８４％、Ｈ２ペプチドは２３５６％、Ｌ１ペプチドは１０３２％、Ｌ２ペプチドは２４５２％増加したと評価された。
【0068】
以上の結果から、実施例１の４種のスイッチングペプチドは、抗体のＦａｂ領域に結合されることが分かる。
【0069】
下記表２は、互いに異なる動物（ウサギ、ラット及びヤギ）からの抗体に対する実施例１の４種のペプチド化合物（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）の結合特性を評価した結果である。このような結果は、マイクロプレートに固定された抗体に蛍光ラベルされたスイッチングペプチドを結合させた後、未反応スイッチングペプチドを除去し、引き続き、ターゲット抗原（ＣＲＰ ｆｏｒ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、ｈＣＧ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、ＨＲＰ ｆｏｒ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、ＨＢｓＡｇ ｆｏｒ ｇｏａｔ ＩｇＧ）をそれぞれ反応させた後に測定された蛍光強度値である。
【0070】
【表2】
【0071】
表２を参照すれば、それぞれの固定された抗体（ＩｇＧ）は、対応する抗原の処理後、プレートの底面での蛍光強度は減少し、溶液内での蛍光強度は増加すると測定された。具体的に、ウサギからの抗ＨＲＰ抗体の場合、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２ペプチドに対してプレートの底面での蛍光強度は、１２．３％、１２．７％、１４．８％及び２５．５％ほどそれぞれ減少し、溶液内での蛍光強度は、７４６％、３５７％、６９８％及び５９７％ほどそれぞれ増加した。ヤギからの抗ＨＢｓＡｇ抗体の場合、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２ペプチドに対してプレートの底面での蛍光強度は、４１．１％、４８．７％、６３．９％、及び３５．２％ほどそれぞれ減少し、溶液内での蛍光強度は、４１０％、６３８％、４１２％、及び５７４％ほどそれぞれ増加した。
【0072】
このような結果は、実施例１から合成された４種のペプチド化合物は、ソース動物の種と無関係に固定された抗体（ＩｇＧ）に結合できるだけではなく、実施例１の４種のペプチド化合物のそれぞれと抗体の可逆的な結合によって抗原が抗体の結合ポケットに結合された時、抗体から定量的に遊離されることを示す。
【0073】
図７Ａは、蛍光ラベルされた実施例１のペプチド化合物を利用した免疫分析方法を説明する模式図であり、図７Ｂ及び図７Ｃは、図７Ａに示された免疫分析方法で測定された抗原の濃度による溶液内及びマイクロプレートの底面での蛍光強度を示すグラフである。本実験で、結合抗体としてはマイクロプレートに固定されたウサギからの抗ＨＲＰ抗体が使われ、抗原としてはＨＲＰが使われた。
【0074】
図７Ａないし図７Ｃを参照すれば、抗原ＨＲＰの濃度を０．３から１００μＭまで変化さながら免疫分析を行った結果、４種のスイッチングペプチド（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２）に対して、抗原（ＨＲＰ）の濃度と依存して溶液内での蛍光強度が増加することが観察された。
【0075】
Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、及びＬ２ペプチドの平衡遊離定数は、１．６５、３．１１、３．２９、１．４８μＭであると評価されたが、各スイッチングペプチドに対する遊離定数の差は、各スイッチングペプチドが各抗原に対して他の検出領域を有することを意味する。ＨＲＰ抗原の場合、Ｈ１ペプチドがＨＲＰ濃度領域で最も線形的に反応した。このような結果は、スイッチングペプチドが抗原の結合量によって固定された抗体から遊離され、スイッチングペプチドを使用したワンステップイムノアッセイで溶液内の蛍光強度に基づいて抗原の定量分析が可能であることを示す。
【0076】
一方、図７Ｃに示したように、４種のスイッチングペプチドいずれもで、マイクロプレートの底面での蛍光強度は、抗原の濃度に依存して減少すると表われた。このような結果は、スイッチングペプチドが抗原の量によって抗体から定量的に遊離され、溶液内だけではなく、マイクロプレートの底面での蛍光強度の変化を通じて抗原の定量分析が可能であることを示す。
【0077】
［実施例２］
Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、Ｈ２ペプチド化合物のそれぞれの末端にフェロセンを結合させて、スイッチングペプチドを合成した。この際、前記フェロセンは、カルボキシル基を通じて下記表３に記載のように、前記ペプチド化合物のそれぞれの末端に結合された。
Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、Ｈ２ペプチド化合物のそれぞれの末端にフェロセンを結合させて、スイッチングペプチドを合成した。この際、前記フェロセンは、カルボキシル基を通じて下記表３に記載のように、前記ペプチド化合物のそれぞれの末端に結合された。
【0078】
【表3】
【0079】
【0080】
図８Ａは、本発明のスイッチングペプチドの流体力学的半径（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｒａｄｉｕｓ）を比較するために、動的レーザ散乱（ＤＬＳ）を行った結果である。図８Ａを参照すれば、単色レーザ光下で散乱光の強度測定を用いてＤＬＳを行い、Ｌ１またはＨ２ペプチドと結合された結合抗体がＬ２またはＨ１ペプチドと結合された結合抗体よりも流体力学的半径がさらに小さいことを確認することができる。このようなスイッチングペプチドの流体力学的半径の差は、スイッチングペプチドの結合関係によって標識されたフェロセンと電極表面の接触を立体的に妨害することもできるということを示す。
【0081】
したがって、４種のスイッチングペプチドの幾何学的構造の差を分析するために、スイッチングペプチドの３次元構造をシミュレーションし、この結果を図８Ｂに示した。図８Ｂを参照すれば、Ｌ１及びＨ２ペプチドは、Ｌ２及びＨ１ペプチドに比べてさらに多くの水素結合を有し、双極子モーメント方向がフェロセンがさらに近いことを確認することができる。したがって、Ｌ１及びＨ２ペプチドは、分子内水素結合がさらに多い稠密な３次元構造を有しうる。
【0082】
図８Ｃは、ＣＶ分析で、本発明のスイッチングペプチドの拡散係数（Ｄｏｘ）を測定したグラフである。図８Ｃを参照すれば、Ｌ１及びＨ２ペプチドがＨ１及びＬ２ペプチドよりも拡散係数が相対的に高いと表われた。したがって、フェロセンで標識されたＬ１及びＨ２ペプチドが電気化学的免疫分析のための最適のプローブである。
【0083】
図９Ａ及び図９Ｂは、Ｌ１スイッチングペプチドを含有する試料溶液に対してＤＰＡ方法で測定されたＬ１スイッチングペプチドの濃度による電流値の変化を示すグラフとＨ２スイッチングペプチドを含有する試料溶液に対してＤＰＡ方法で測定されたＨ２スイッチングペプチドの濃度による電流値の変化を示すグラフとである。この際、作動電極として熱分解された炭素電極（Ｐｙｒｏｌｙｚｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）が使われた。
【0084】
図９Ａを参照すれば、ＤＰＡ方法で測定された電流値は、Ｌ１スイッチングペプチドの濃度に依存して変化すると表われた。これは、Ｌ１スイッチングペプチドを利用したＤＰＡ基盤の免疫分析方法で抗原を定量的に分析することができるということを示す。図９Ｂを参照すれば、ＤＰＡ方法で測定された電流値も、Ｈ２スイッチングペプチドの濃度に依存して変化すると表われた。これは、Ｈ２スイッチングペプチドを利用したＤＰＡ基盤の免疫分析方法で抗原を定量的に分析することができるということを示す。
【0085】
また、Ｌ１スイッチングペプチドの検出限界（ＬＯＤ）は、５．９ｎＭであり、Ｈ２スイッチングペプチドの検出限界は、１０ｎＭであることを確認することができる。したがって、Ｌ１及びＨ２スイッチングペプチドは、電気化学的免疫分析の定量的分析に使われる。
【0086】
図１０は、本発明のＬ１及びＨ２スイッチングペプチドと結合した結合抗体のヒトＢ型肝炎抗原（ｈＨＢｓＡｇ）に対するワンステップイムノアッセイ分析を行った結果である。
【0087】
図１０を参照すれば、Ｈ２スイッチングペプチドを利用した場合には、ｈＨＢｓＡｇに対する免疫分析が不可能であり、Ｌ１スイッチングペプチドを利用する場合、可能であると確認された。このような結果は、Ｌ１スイッチングペプチドが抗原結合部位付近で密接に結合し、Ｈ２スイッチングペプチドの結合部位は、抗原結合部位から相対的に遠く位置するためである。したがって、ｈＨＢｓＡｇの免疫分析のためには、Ｌ１スイッチングペプチドを選択することが望ましい。
【0088】
図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＨＢｓＡｇ抗原を含有する検出試料溶液に対して第１ Ｌ１スイッチングペプチド（フェロセンが末端に結合されたＬ１ペプチド化合物）を利用した電気化学的免疫分析方法、第２スイッチングペプチド（蛍光ラベルされたＬ１ペプチド化合物）を利用した光学的免疫分析方法、従来のＥＬＩＳＡキットを利用した化学発光基盤の免疫分析方法及び従来のＥＬＩＳＡキットを利用したクロモジェニック免疫分析方法を通じて測定された抗原の濃度による分析結果を示すグラフである。前記第１ Ｌ１スイッチングペプチドを利用した電気化学的免疫分析方法の結果は、基板に固定され、Ｌ１スイッチングペプチドが結合された抗ＨＢｓＡｇ抗体にＨＢｓＡｇ抗原を含有する検出試料溶液を処理した後、前記検出試料溶液に対してＤＰＡ方法で測定されたものである。
【0089】
図１１Ａ及び図１１Ｂを参照すれば、前記第１ Ｌ１スイッチングペプチドを利用した電気化学的免疫分析方法は、従来に商用化されたＥＬＩＳＡキット基盤の免疫分析方法と類似している範囲で測定が可能であると表われ、ＬＯＤ（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）の場合、前記第１ Ｌ１スイッチングペプチドを利用した電気化学的免疫分析方法が、他の方法よりもさらに敏感であると表われた。
【0090】
【0091】
図１２Ａを参照すれば、ブランド－アルトマンテストでは、本発明のワンステップイムノアッセイとＥＬＩＳＡとの結果が同一であり、９５％（±１．９６σ）の信頼範囲内で分布することを示した。図１２Ｂで示すように、Ｐａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ回帰分析結果、２つの方法の結果が９５％の信頼レベル内で分布し、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関係数（ρ）は、０．９７５（Ｐ＜０．０００１）と計算された。０．５以上のＳｐｅａｒｍａｎ相関係数（ρ）は、２つの方法の高い関連性を示すために、２種の統計分析の結果は、ＥＬＩＳＡと本発明のスイッチングペプチドに基づいた免疫分析の結果が類似していることを示す。したがって、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）検出に基づいたヒトのＢ型肝炎診断が、本発明のスイッチングペプチドを用いて可能であることを示す。
【0092】
以上、本発明の望ましい実施例を参照して説明したが、当業者は、下記の特許請求の範囲に記載の本発明の思想及び領域から外れない範囲内で本発明を多様に修正及び変更させることができるということを理解できるであろう。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】