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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-15
(54)【発明の名称】塩基配列決定用の核酸サンプルの調製
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240105BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20240105BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240105BHJP
C40B 40/06 20060101ALN20240105BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z ZNA
C12N15/10 Z
C12N15/11 Z
C40B40/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023536459
(86)(22)【出願日】2021-12-18
(85)【翻訳文提出日】2023-07-19
(86)【国際出願番号】 US2021064248
(87)【国際公開番号】W WO2022133335
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】63/127,566
(32)【優先日】2020-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522105894
【氏名又は名称】グレイル エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100174001
【弁理士】
【氏名又は名称】結城 仁美
(72)【発明者】
【氏名】マシュー ラーソン
(72)【発明者】
【氏名】カーティス トム
(72)【発明者】
【氏名】サラ スチュアート
(72)【発明者】
【氏名】イーチィ チョウ
(57)【要約】
塩基配列決定のための調製において、無細胞核酸断片を含む核酸を増幅する組成物および方法が提供される。構造［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］または［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［Ｔ’］を有する環状化核酸鋳型を作製する方法が提供され、ここで、(ａ)Ｔは標的核酸であり、Ｔ’は標的核酸に対する相補体であり、（ｂ）ＰＳ１およびＰＳ２は、それぞれ、核酸プライマー領域であり、(ｃ)Ｌはプライマー伸長反応を終端させる有機分子を有するリンカーであり、構造はその５’末端をその３’末端に結合することによって環状化される。ＰＳ１に相補的なプライマーをＰＳ１に結合させ、ＰＳ２に相補的なプライマーをＰＳ２に結合させ、プライマー伸長反応によって標的配列をコピーすることによって、環状化鋳型中の標的配列を増幅する。ライゲーションステップ数を減少させることができるという利点があり、これによって、クリーンアップステップ数を減少させ、また、全体的なライブラリー変換効率の改善をもたらすことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］を有する環状化核酸鋳型であって、(ａ)Ｔは、標的核酸配列であり、（ｂ）ＰＳ１およびＰＳ２の各々は、核酸プライマー領域であり、(ｃ)Ｌは、プライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーであり、（ｄ）前記構造は、当該構造の５’末端を当該構造の３’末端に結合させることによって環状化されている、環状化核酸鋳型。
【請求項2】
構造［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［Ｔ’］を有する環状化核酸鋳型であって、(ａ)Ｔ’は、標的核酸配列の相補体であり、（ｂ）ＰＳ１およびＰＳ２の各々は、核酸プライマー領域であり、(ｃ)Ｌは、プライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーであり、（ｄ）前記構造は、当該構造の５’末端を当該構造の３’末端に結合させることによって環状化されている、環状化核酸鋳型。
【請求項3】
標的配列を増幅する方法であって、（ａ）請求項１または２のいずれかに記載の環状化鋳型を提供することと、（ｂ）ＰＳ１に対して相補的なプライマーを、ＰＳ１に結合させ、ＰＳ２に対して相補的なプライマーを、ＰＳ２に結合させることと、（ｃ）ポリメラ－ゼを使用するプライマー伸長反応によって前記標的配列をコピーすることとを含む、方法。
【請求項4】
環状化鋳型を作製する方法であって、（ａ）一本鎖標的核酸断片のサンプルを提供することと、(ｂ)構造[ＰＳ]－[Ｌ]－[ＰＳ](ＰＳは核酸プライマー領域であり、Ｌはプライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーである）を有する断片を前記標的核酸断片の各々にライゲーションまたはコピーすることと、（ｃ）環状化することとを含む、方法。
【請求項5】
構造［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］を有する環状化鋳型を作製する方法であって、（ａ）ＰＳ１およびＰＳ２の各々が核酸プライマー領域であり、Ｌがプライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーである、［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を提供することと、（ｂ）［Ｔ］核酸を提供することと、（ｃ）［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を［Ｔ］鎖にライゲーションして、［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を作製することと、（ｄ）［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を環状化して、環状化［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］を作製することとを含む、方法。
【請求項6】
構造［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［Ｔ’］を有する環状化鋳型を作製する方法であって、（ａ）［Ｔ］鎖を提供することと、（ｂ）ＰＳ１およびＰＳ２の各々が核酸プライマー領域であり、Ｌがプライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーである、［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を提供することと、（ｃ）［Ｔ］鎖の３’末端に、［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖の［ＰＳ２］に対して相補的なプライマー領域［ＰＳ２’］鎖をライゲーションすることと、（ｄ）［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖をライゲーションされた［Ｔ］－［ＰＳ２’］にアニーリングすることと、（ｄ）［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖をポリメラ－ゼを用いたプライマー伸長反応により伸長して、［Ｔ’］は［Ｔ］鎖の相補体である［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［ＰＳ２]－[Ｔ’]鎖を生成することと、（ｅ）［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［Ｔ’］鎖を環状化して、環状化［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［Ｔ’］を生成することとを含む、方法。
【請求項7】
構造［ＰＳ１]－[Ｌ]－[ＰＳ２］を有する一本鎖核酸であって、ＰＳＩおよびＰＳ２は、それぞれ、核酸プライマー領域であり、Ｌが、プライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーである、一本鎖核酸。
【請求項8】
(ａ)ブロックされた３’末端を有する、５’リン酸化一本鎖プライマー領域オリゴヌクレオチド、および(ｂ)構造［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］を有する一本鎖核酸において、ＰＳ１およびＰＳ２は、それぞれ、核酸プライマー領域であり、Ｌは、プライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーであり、［ＰＳ２］は、ブロックされた３’末端を有する前記プライマー領域オリゴヌクレオチドに相補的である、一本鎖核酸
を含む、キット。
【請求項9】
Ｌが、ポリアルキレングリコールを含む、請求項１～８のいずれかに記載の環状化鋳型、方法、核酸、またはキット。
【請求項10】
Ｌが、ポリエチレングリコールを含む、請求項１～８のいずれかに記載の環状化鋳型、方法、核酸、またはキット。
【請求項11】
Ｌが、リン酸基で終端されたポリアルキレングリコールを含む、請求項１～８のいずれかに記載の環状化鋳型、方法、核酸、またはキット。
【請求項12】
Ｌが、リン酸基で終端されたポリエチレングリコールを含む、請求項１～８のいずれかに記載の環状化鋳型、方法、核酸、またはキット。
【請求項13】
Ｌには、ポリアルキレングリコール、リン酸基で終端されたポリアルキレングリコール、ポリエチレングリコール、リン酸基で終端されたポリエチレングリコール、ホスホンアミダイト、グリコール、１’，２’－ジデオキシリボース、またはリン酸基で終端されたトリエチレングリコール、またはそれらの任意の組み合わせのうち、１つまたは複数が挿入されている、請求項１～８のいずれかに記載の環状化鋳型、方法、核酸、またはキット。
【請求項14】
前記複数の挿入の部位が、１つまたは複数の介在オリゴヌクレオチドを介して接続される、請求項１３に記載の環状化鋳型、方法、核酸、またはキット。
【請求項15】
前記１つまたは複数の介在オリゴヌクレオチドの長さが、２ヌクレオチド長～１００ヌクレオチド長の範囲である、請求項１４に記載の環状鋳型、方法、核酸、またはキット。
【請求項16】
Ｌが、介在オリゴヌクレオチドを介してライゲーションされたリン酸基で終端された前記ポリエチレングリコールの挿入部位を２つ含む、請求項１４に記載の環状鋳型、方法、核酸、またはキット。
【請求項17】
前記介在オリゴヌクレオチドの長さが、６ヌクレオチド長以上である、請求項１６に記載の環状化鋳型、方法、核酸、またはキット。
【請求項18】
前記標的が、シトシンが修飾または変換された一本鎖ＤＮＡ分子を含む、請求項１～６および請求項９～１７のいずれか一項に記載の環状化鋳型または方法。
【請求項19】
前記シトシンが、ウラシルに変換されている、請求項１８に記載の環状鋳型または方法。
【請求項20】
ＰＳ１に対して相補的な前記プライマーが、５’～３’［ＡＤＡＰＴ］－［ＩＮＤ］－［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］－［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］を含み、［ＡＤＡＰＴ］は、アダプターであり、［ＩＮＤ］は、一意のサンプル識別子配列であり、［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］は、塩基配列決定プライマーであり、［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］は、環状化［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］または［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鋳型中の標的核酸配列に相補的な標的プライマーであり、およびＰＳ２に相補的な前記プライマーが、５’～３’［ＡＤＡＰＴ］－［ＩＮＤ］－［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］－［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］を含み、［ＡＤＡＰＴ］は、アダプターであり、［ＩＮＤ］は、一意のサンプル識別子配列であり、［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］は、塩基配列決定プライマーであり、［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］は、環状化［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］または［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鋳型中の標的核酸配列に相補的な標的プライマーである、請求項３の方法。
【請求項21】
前記標的が、断片化ＤＮＡを含む、請求項１～２０のいずれかに記載の方法。
【請求項22】
前記断片化ＤＮＡが、無細胞核酸（ｃｆＮＡ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記無細胞核酸が、無細胞ＤＮＡ(ｃｆＤＮＡ)である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記無細胞核酸が、体液または他の体物質から得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記無細胞核酸が、健康細胞に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項26】
前記無細胞核酸が、疾患細胞に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項27】
前記疾患細胞が、癌細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記断片化ＤＮＡが、ゲノムの１つまたは複数のサブセット、全ゲノム、複数のゲノム、または複数のゲノムの１つまたは複数のサブセットを表す、請求項２１に記載の方法。
【請求項29】
前記標的核酸または前記標的鎖の供給源が、生物有機体由来のサンプルまたは環境サンプル由来のサンプルである、請求項１～２８のいずれかに記載の方法。
【請求項30】
前記サンプルが、複数の供給源、複数の対象、または複数の供給源と複数の対象とからプールされた複数のサンプルを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記生物有機体が、ヒトまたは他の動物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項32】
前記生物有機体由来のサンプルが、組織、細胞、体液、または細胞外体物質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記体液または前記細胞外体物質が、全血、血液画分、血清、血漿、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記体液または前記細胞外体物質が、房水、腹水、胆汁、脳脊髄液、乳糜、胃液、腸液、リンパ液、膵液、心嚢液、腹膜液、胸膜液、唾液、脊髄液、痰、便もしくは他の腸排液、汗、涙、尿、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
前記生物有機体が、疾患を有することが既知であるか、または疾患を有することが疑われる対象である、請求項３１に記載の方法。
【請求項36】
前記疾患が癌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記生物有機体が、疾患を有することが既知でないか、または疾患を有することが疑われない対象である、請求項３１に記載の方法。
【請求項38】
前記疾患が癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記生物有機体由来のサンプルが、腫瘍由来のサンプルまたは疑わしい腫瘍由来のサンプルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項40】
前記生物有機体由来のサンプルが、癌組織であるか、または癌組織であると疑われる組織サンプルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項41】
前記組織サンプルが、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、またはＩＶ期の癌である、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、２０２０年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１２７，５６６号の優先権の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本開示の主題は、塩基配列決定用の核酸サンプルを調製するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ＤＮＡ中のシトシンのメチル化は、様々な疾患および状態についてのますます重要な診断マーカーである。例えば、ＤＮＡメチル化プロファイリングは、癌の検出、診断、および／または特性評価のための診断ツールとして使用されている。これらの分析は、多くの場合、体液からの断片化ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を使用する。メチル化塩基を同定するための塩基配列決定は、典型的には、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、続いて塩基配列決定アダプターが添加される変換ステップを含む。塩基配列決定アダプターの添加は、典型的には２つのライゲーションステップを含み、これは、変換効率を低下させ、さらなるクリーンアップステップを追加する。そのようなアプローチは、全体的なライブラリー変換効率を低下させる。
【0004】
したがって、当技術分野において、ＤＮＡライブラリーの調製を単純化し、効率を改善するプロセスが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本開示の主題は、様々な実施形態における環状化された鋳型を作製する方法を対象とし、方法は（ａ）一本鎖核酸断片のサンプルを提供することと、(ｂ)構造［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］（ＰＳはプライマー領域であり、Ｌはリンカーである）を有する断片を核酸断片の各々にライゲーションまたはコピーすることと、(ｃ)環状化すること、および／またはそのような態様もしくは本明細書に開示される他の態様の任意の１つもしくは組み合わせを含む。
【0006】
いくつかの態様において、開示される主題は、構造［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］を有する環状化核酸鋳型を含み、(ａ)Ｔは、標的核酸配列であり、（ｂ）ＰＳ１およびＰＳ２の各々は、核酸プライマー領域であり、(ｃ)Ｌは、プライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーであり、例えば、リンカーＬは、ＰＳ１およびＰＳ２をライゲーションし、プライマー伸長反応において重合を終端させる有機分子を含み、ならびに（ｄ）構造は、当該構造の５’末端を当該構造の３’末端に結合させることによって環状化されている、および／またはそのような態様もしくは本明細書において開示される他の態様の任意の１つもしくは組み合わせである。
【0007】
様々な実施形態において、開示される主題は、構造［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［Ｔ’］を有する環状化核酸鋳型を含み、ここで、(ａ)Ｔ’は、標的核酸配列の相補体であり、（ｂ）ＰＳ１およびＰＳ２の各々は、核酸プライマー領域であり、(ｃ)Ｌは、プライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーであり、（ｄ）構造は、当該構造の５’末端を当該構造の３’末端に結合させることによって環状化されている、および／またはそのような態様もしくは本明細書に開示される他の態様の任意の１つもしくは組み合わせである。
【0008】
いくつかの態様において、本開示は、標的配列を増幅する方法に関し、方法は、（ａ）環状化鋳型を提供することと、（ｂ）ＰＳ１に対して相補的なプライマーを、ＰＳ１に結合させ、ＰＳ２に対して相補的なプライマーを、ＰＳ２に結合させることと、(ｃ)ポリメラーゼを使用するプライマー伸長反応によって標的配列をコピーすること、および／または本明細書に開示されるそのようなステップもしくは他の態様の任意の１つもしくは組み合わせを含む。
【0009】
様々な例において、本開示は、構造［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］を有する環状化鋳型を作製する方法に関し、方法は、（ａ）［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を提供することと、（ｂ）［Ｔ］鎖を提供することと、（ｃ）［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を［Ｔ］鎖にライゲーションして、［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を作製することと、（ｄ）［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を環状化して、環状化［Ｔ］－［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］を作製すること、および／または本明細書に開示されるそのようなステップもしくは他の態様の任意の１つもしくは組合せを含む方法（方法、環状化鋳型アプローチ＃１－Ｎｅｗ)を含む。いくつかの例において、本開示は、構造［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［Ｔ’］を有する環状化鋳型を作製する方法に関し、方法は、(ａ)[Ｔ]鎖を提供することと、（ｂ）［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を提供することと、（ｃ）［Ｔ］鎖の３’末端に、［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖の［ＰＳ２］に対して相補的な［ＰＳ２’］鎖をライゲーションすることと、（ｄ）［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖をライゲーションされた［Ｔ］－［ＰＳ２’］にアニーリングすることと、（ｄ）［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖をポリメラ－ゼを用いたプライマー伸長反応により伸長して、［Ｔ’］は［Ｔ］鎖の相補体である［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［Ｔ’］鎖を生成することと、（ｅ）［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［Ｔ’］鎖を環状化して、環状化［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］－［Ｔ’］を生成することとを含む方法を含む。
【0010】
いくつかの実施形態において、本開示は、構造［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］を有する一本鎖核酸に関し、ＰＳ１およびＰＳ２の各々は、核酸プライマー領域であり、Ｌは、プライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーである。
【0011】
いくつかの態様において、本開示は、（ａ）ブロックされた３’末端を有する、５’リン酸化一本鎖プライマー領域オリゴヌクレオチド、および（ｂ）構造［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］を有する一本鎖核酸において、ＰＳ１およびＰＳ２は、それぞれ、核酸プライマー領域であり、Ｌは、［ＰＳ１］および［ＰＳ２］をライゲーションし、プライマー伸長反応を終端させる有機分子を含むリンカーであり、［ＰＳ２］は、ブロックされた３’末端を有するプライマー領域オリゴヌクレオチドに相補的である、一本鎖核酸を含むキットに関する。
【0012】
いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリアルキレングリコールリンカー、ポリエチレングリコールリンカー、リン酸基で終端されたポリアルキレングリコールリンカー、またはリン酸基で終端されたポリエチレングリコールリンカーを含む。
【0013】
様々な実施形態において、標的核酸配列［Ｔ］は、シトシンが修飾または変換された一本鎖ＤＮＡ分子を含む。他の実施形態において、標的核酸配列［Ｔ］は、シトシンがウラシルに変換されている一本鎖ＤＮＡ分子を含む。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1A】構造[Ｔ]－[ＰＳ]－[Ｌ]－[ＰＳ]または［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］であって、リンカー［Ｌ］は２つのプライマー領域［ＰＳ］成分を結合し、プライマー伸長反応を終端させる有機分子を含み、［ＰＳ］成分は、標的配列［Ｔ］または標的配列［Ｔ’］の相補体にライゲーションされる、構造を有する、環状化された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を示す図である。
【図1B】開示された主題の［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖であって、第１のアダプター［ＰＳ１］、第２のアダプター［ＰＳ２］、およびリンカー［Ｌ］を含み、当該リンカー［Ｌ］が、プライマー伸長反応を終端させる有機分子を含み、第１のアダプターの３’末端を第２のアダプターの５’末端にリンクしている、［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖を示す図である。
【図3】図２ＡのステップＣ、ステップＤ、およびステップＥにおけるプライマー領域ライゲーションおよびプライマー伸長反応を、図１Ｂの［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］１０２の標的鎖への直接ライゲーションに置き換えた、代替的な実施形態を示す図である。
【図4】［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖１０２伸長プライマー（「Ｃｉｒｃ伸長プライマー」として示す）またはｃｆＤＮＡが環状化されていない従来の伸長プライマー（「ＧｒａｉｌＭｅｔｈｙｌＳｅｑ」として示す）およびｃｆＤＮＡが２つのクリ－ンアップステップのうちの１つのみを受けている、いずれかを使用する増幅法において調製されるｃｆＤＮＡの比較を示す、高感度ＮＧＳ断片アナライザーによるランチャートのグラフである。
【図5】Ｃｉｒｃ伸長プライマーを使用する環状化アプローチによって調製されたメチル化ライブラリーの高感度ＮＧＳ断片アナライザーによるランチャートのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本明細書において、以下の用語は次のような意味で用いられる。
【0016】
「増幅」は、ＤＮＡ鎖をコピーして相補鎖を生成することを意味する。増幅は、熱的に媒介されてもよく、または等温であってもよい。増幅は、例えば、プライマー伸長反応においてポリメラーゼを使用して標的鎖をコピーすることにより行ってもよい。
【0017】
「体液」は、全血、循環血液、血液画分、血清、または血漿、房水、腹水、胆汁、脳脊髄液、乳糜、胃液、腸液、リンパ液、膵液、心膜液、腹膜液、胸膜液、唾液、髄液、痰、便もしくは他の腸排液、汗、涙、および／または尿を含むがこれらに限定されない、ＤＮＡを含む任意の体液を意味する。
【0018】
「ｃｆＮＡ」は、細胞外核酸を意味し、「ｃｆＤＮＡ」は、体液中に見出される細胞外ＤＮＡを意味する。
【0019】
「インプットサンプル」は、断片化ＤＮＡの処理済みサンプルを指す。「インプットサンプル」という用語を使用して、対象から得られた生物学的サンプルを指す「サンプル」と区別する。生物学的対象からのサンプルは、例えば、サンプルからｃｆＤＮＡを精製すること、および／または必要に応じてサンプルを断片化することによって、インプットサンプルを処理して調製される。断片化ＤＮＡおよびｃｆＤＮＡは、本明細書において、「標的核酸」、「標的ＤＮＡ」、「標的鎖」、または「標的」と称する。しかしながら、開示される主題の一態様において、インプットサンプルおよびサンプルは同じであってもよく、すなわち、本方法は「汚れたサンプル」または「精製されていないサンプル」とともに使用されてもよいことに留意されたい。
【0020】
「標的疾患」は、アッセイまたは試験が実施される疾患、状態、または標的を意味し、例えば、標的疾患は、一般に、癌、特定の種類の癌、特定の癌の種類、特定の癌の病期、上記の組み合わせ、またはメチル化解析が有益な情報を生じ得る任意の他の疾患もしくは状態、または疾患の状態の組み合わせであり得る。
【0021】
本明細書を通して、出願人は、式［Ｘ］－［ｙ］－［ｚ］－［…］を用いて、様々な構造、例えば、プライマー領域［ＰＳ］、標的核酸［Ｔ］、標的核酸に対する相補体［Ｔ’］、リンカー［Ｌ］、およびアダプター［Ａ］を含む［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］および［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］を説明する。これらの式は、記載された構造の構成要素を限定することを意図していないこと、例えば、１つまたは複数の追加の構成要素を含むことができることが理解されるであろう。例えば、［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］または［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］において、当該構造のいずれかの端部に、または［ＰＳ］と［Ｔ／Ｔ’］との間に、［ＰＳ］と［Ｌ］との間に、またはこれらの任意の組合せにおいて、１つまたは複数の追加の成分を含めることができる。
【0022】
説明
様々な態様において、開示される主題は、塩基配列決定のための断片化ＤＮＡライブラリーを調製する方法、組成物、試薬およびキットを提供する。この方法は、増幅反応において使用することができる環状化ｓｓＤＮＡ鋳型を利用して、線状コピーを生成する。線状コピーは、ライブラリー調製ワークフローにおける他のステップに、および／または分析ステップ、例えば、標的の配列を決定するプロセスに進んでもよい。開示される主題は、ライゲーションステップ数を減少させることができるという利点を有し、これによって、クリーンアップステップ数を減少させ、また、全体的なライブラリー変換効率の改善をもたらすことができる。
様々な態様において、開示される主題は、塩基配列決定のための断片化ＤＮＡライブラリーを調製する方法、組成物、試薬およびキットを提供する。この方法は、増幅反応において使用することができる環状化ｓｓＤＮＡ鋳型を利用して、線状コピーを生成する。線状コピーは、ライブラリー調製ワークフローにおける他のステップに、および／または分析ステップ、例えば、標的の配列を決定するプロセスに進んでもよい。開示される主題は、ライゲーションステップ数を減少させることができるという利点を有し、これによって、クリーンアップステップ数を減少させ、また、全体的なライブラリー変換効率の改善をもたらすことができる。
【0023】
図１Ａは、構造[Ｔ]－[ＰＳ]－[Ｌ]－[ＰＳ]または［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］を有する環状化ｓｓＤＮＡ１００を示す。当該構造において、標的配列［Ｔ］にライゲーションされるか、または標的配列［Ｔ’］に対する相補体にライゲーションされる２つの［ＰＳ］成分に伸長反応を終端させる有機分子プライマーを含むリンカー１２０がライゲーションする。環状化ｓｓＤＮＡ１００は、標的１０５に対する標的／相補体、標的の３’末端または５’末端における第１のプライマー領域１１０、標的１０５の他端における第２のプライマー領域１１５、およびリンカー１２０を含む。
【0024】
リンカー１２０は、核酸鎖の３’末端を別の核酸鎖の５’末端に結合する様々なプライマー伸長反応を終端させる有機分子のいずれかを含み得る。リンカー１２０は、プライマー伸長反応において重合を終了させる。例えば、一態様において、リンカーがリン酸基で終端されたポリアルキレングリコ－ル分子を含む。一実施形態において、リンカーは、リン酸基で終端されたポリエチレングリコ－ル分子を含む。ポリエチレングリコール部分は、例えば、２～２０個のポリエチレングリコ－ル単位を有し得る。一例において、リンカーは、Integrated DNA Technologies社（アイオワ州コーラルビル）から入手可能なヘキサエチレングリコールリンカーであるInt Spacer 18(ISpl8)を含む。
【化1】
【0025】
一実施形態において、リンカーは、ホスホンアミダイト分子を含む。ホスホンアミダイト分子は、例えば、２～２０個の炭素原子を有し得る。一態様において、リンカーは、Integrated DNA Technologies社（アイオワ州コーラルビル）から入手可能な３炭素ホスホンアミダイト分子を含む。
【化2】
【0026】
実施形態の一バージョンにおいて、リンカーは、グリコール分子を含む。グリコール分子は例えば、２～２０個の炭素原子を有し得る。一例において、リンカーは、Integrated DNA Technologies社（アイオワ州コーラルビル）から入手可能な６炭素グリコール分子を含む。
【化3】
【0027】
いくつかのバージョンにおいて、リンカーは、１つまたは複数の１’、２’－ジデオキシリボース分子または類似の脱塩基分子を含む。１’，２’－ジデオキシリボース分子は例えば、２～２０個の１’，２’－ジデオキシリボ－ス単位を有し得る。一態様において、リンカーは、Integrated DNA Technologies社（アイオワ州コーラルビル）から入手可能な１’、２’－ジデオキシリボース分子を含む。
【化4】
【0028】
様々な実施形態において、リンカーは、リン酸基で終端されたトリエチレングリコ－ル分子を含む。一例において、リンカーがIntegrated DNA Technologies社（アイオワ州コーラルビル）から入手可能なトリエチレングリコール分子を含む。
【化5】
【0029】
一態様において、リンカー１２０は、プライマー伸長反応を終端させる複数の有機分子の挿入を含む。一例において、リンカー１２０は、異なる有機分子であって、核酸鎖の３’末端を別の核酸鎖の５’末端にライゲーションし、プライマー伸長反応において重合を終了させる、異なる有機分子の組み合わせの複数の挿入を含む。非限定的な例において、リンカー１２０は、ポリアルキレングリコール分子、リン酸基で終端されたポリアルキレングリコール分子、ポリエチレングリコール分子、リン酸基で終端されたポリエチレングリコール分子、ホスホンアミダイト分子、グリコール分子、１’、２’－ジデオキシリボース分子、またはリン酸基で終端されたトリエチレングリコール分子の１つまたは組み合わせの複数の挿入を含んでもよい。
【0030】
いくつかの変形例において、リンカー１２０は、１つまたは複数の介在オリゴヌクレオチドであって、核酸鎖の３’末端を別の核酸鎖の５’末端にライゲーションし、プライマー伸長反応において重合を終了させる有機分子の複数の挿入を接続する、１つまたは複数の介在オリゴヌクレオチドをさらに含む。非限定的な例として、一態様において、リンカー１２０は、介在オリゴヌクレオチドの５’末端にその３’末端で接合したInt Spacer 18(ISpl8)分子である。当該介在オリゴヌクレオチドは、第２のInt Spacer 18(ISpl8)分子の５’末端にその３’末端で結合している。１つまたは複数の介在オリゴヌクレオチドの長さは、２ヌクレオチド長～１００ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長～２０ヌクレオチド長、または４ヌクレオチド長～１０ヌクレオチド長の範囲であり得る。一例において、介在オリゴヌクレオチドの長さは６ヌクレオチド以上である。
【0031】
図１Ｂは、開示された主題の［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０２を示す図であり、これは、第１のアダプター１１０、第２のアダプター１１５、およびリンカー１２０を含み、当該リンカー１２０が、アダプター１１０の３’末端をアダプター１１５の５’末端にリンクしている。鎖１０２は、本明細書において、Ｃｉｒｃ伸長プライマーまたは伸長プライマーとも称され得る。本明細書で使用される場合、アダプターという用語は、他のＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、またはＲＮＡ分子の端部にライゲーションされ得る一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを指す。アダプターは、塩基配列決定においてプライマー領域を提供することができる。
【0032】
開示される主題の［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０２は、当業者に既知の任意の方法を用いて生成することができる。１つの非限定的な例において、関心の５’ＤＭＴ(ジメトキシトリチル）保護オリゴヌクレオチド（Ｎ１）は、３’位で、５ミクロンの制御された細孔ガラスビ－ズ（ＣＰＧ）またはポリスチレン（ＰＳ）ビーズに結合され得る。そのようなＮ１オリゴヌクレオチドの非限定的な例としては、DMT-dT-CPG(Sigma-Aldrich,Inc.、ミズーリ州、セントルイス)が挙げられる。次いで、ジメトキシトリチル基は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて脱保護され、５’反応性ヒドロキシル基を残すことができる。次に、ＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを、極性非プロトン性溶媒、例えばアセトニトリルで３０秒間洗浄することができる。
【0033】
次に、５’－ＤＭＴ保護Int Spacer 18分子を、Ｎ１の５’露出水酸基と反応させることができる。この反応において、Ｎ１の露出した５’－ヒドロキシルとInt Spacer 18の３’－リン酸基との間で縮合を起こすことができ、これは共有結合を形成し得る。続いて、生成物を、極性非プロトン性溶媒、例えばアセトニトリルを用いて３０秒間洗浄することができる。次に、標準的なＴＣＡ方法を用いて、Int Spacer 18の５’末端から５’－ＤＭＴ基を除去することができ、反応性の５’－ヒドロキシル基を残すことができる。
【0034】
次いで、５’－ＤＭＴ保護ヌクレオチド（Ｎ２）をＣＰＧ－３’ｄＴ５’－３’Ｉｎt Sｐaceｒ 18－ＯＨ５’鎖と反応させることができ、ここで「ＯＨ」は露出した反応性５’－ヒドロキシル基であり得る。Int Spacer 18の５’－ヒドロキシル基は、縮合反応においてＮ２ ５’－ＤＭＴ－保護ヌクレオチドの３’－ヒドロキシル基と反応することができ、Ｎ２ヌクレオチドの３’炭素でリンカーと共有結合を形成することができる。この縮合反応により、ＣＰＧ－３’Ｎ１５’－３’Ｌｉｎｋｅｒ５’－Ｎ２鎖を生成することができる。続いて、上記のステップをＮ２ヌクレオチドの５’－ＤＭＴ脱保護から開始し、所望の［ＰＳ］－Ｌ－［ＰＳ］鎖１０２が達成されるまで、繰り返すことができる。
【0035】
開示された主題の方法は、［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０２を利用して、環状化された［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］を生成する。［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０２は、５’プライマー領域１１０および３’プライマー領域１１５の両方を標的核酸１０５に導入する。［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０２は、［ＰＳ］成分をライゲーションするリンカー分子を含む。［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０２は、標的核酸１０５の３’または５’末端にライゲーションされ得る。例えば、［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０２は、ライゲーションによって、またはポリメラ－ゼを使用するプライマー鎖伸長によって、標的１０５にライゲーションされ得る。
【0036】
図１Ｃは、５’末端で標的１０５の３’末端に結合された、開示された主題の［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０２を含む、開示された主題の線状［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０３を示す図である。［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０３は、環状化されて、図１Ａに示される環状化ｓｓＤＮＡ１００を形成することができる。
【0037】
３’末端で標的１０５［Ｔ’］に対する相補体の５’末端に結合した、開示された主題の［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０２を含む図１Ｄは、開示された主題の線状［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鎖１０４を示す図である。［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鎖１０４は、環状化されて、図１Ａに示される環状化ｓｓＤＮＡ１００を形成することができる。
【0038】
【0039】
ステップＡにおいて、二鎖インプット核酸断片２０５は、変換を受け、鎖は変性され、未修飾シトシンはウラシルに変換される。ステップＡは、変性され、変換された一本鎖ＤＮＡ断片２１０を生じる。
【0040】
ステップＢにおいて、断片２１０の末端は、ライゲーション用に調製される。例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ－ゼ（Ｔ４ＰＮＫ）を用いて、ＡＴＰのγ－リン酸の５’末端への転移を触媒し、一本鎖断片２１０から３’リン酸を除去して、断片２１５を得る。
【0041】
ステップＣにおいて、プライマー領域鎖２２０を断片２１５の３’末端にライゲーションして、［Ｔ］－［ＰＳ］鎖２２５を得る。プライマー領域鎖２２０を、ブロックされた３’末端を有する５’リン酸化一本鎖として導入してもよい。プライマー領域鎖２２０の３’末端をブロックして、様々な修飾因子を利用することができる。いくつかのそのような修飾因子は、Integrated DNA Technologies社、アイオワ州コーラルビルから入手可能である。一態様において、ブロッカーは、以下の構造を有し、Integrated DNA Technologies社（アイオワ州コーラルビル）から入手可能な３’アミノ修飾因子である、３ＡｍＭ０である。
【化6】
【0042】
ライゲーションは、特定の実施形態において、例えば、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ(以下でより詳細に論じる）を使用して、酵素的に媒介され得る。ステップＤのための［Ｔ］－［ＰＳ］鎖２２５を調製して、クリ－ンアップすることが含まれてもよい。
【0043】
ステップＤにおいて、［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖１０２（図２Ａにおいて２３０として示される）が導入される。［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖２３０は、リンカー１２０によって分離されたプライマー領域２３２ａおよび２３２ｂを含む。プライマー領域２３２ａはこのことにおいてプライマーとして作用し、［Ｔ］－［ＰＳ］鎖２２５上の相補的プライマー領域にアニーリングする。アニーリングされると、［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖２３０は、ポリメラーゼを使用するプライマー伸長反応を介して伸長され、［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鎖２３５を生じ得る（図２Ｂを参照）。
【0044】
ステップＥにおいて、クリーンアップステップは、任意に、亜硫酸水素処理鋳型の減成を含み、ここで、亜硫酸水素変換法が例えば、ＵＳＥＲ(ウラシル特異的切除試薬）酵素(ニュー・イングランド・バイオラボ社（New England Biolabs,Inc.）、マサチューセッツ州イプスウィッチから入手可能）を用いて、非メチル化シトシンをウラシルに変換するために利用される。開示される主題の一態様において、ステップＥにおけるプライマー伸長は、線形増幅を使用して行われ、元の鋳型を希釈して元の鋳型の減成を不要にすることが期待され得る。
【0045】
ステップＦにおいて、［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鎖２３５を環状化し、環状化［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鋳型２４０を得る。環状化は、様々な技術を使用して達成することができる。一態様において、環状化は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガ－ゼまたはＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼ（以下でより詳細に論じる）などのｓｓＤＮＡリガ－ゼを使用して達成される。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼまたはＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼを用いる環状化反応は、ｓｓＤＮＡ５’－リン酸基および３’－水酸基を利用して、ＤＮＡを環状化する。
【0046】
ステップＧにおいて、フォワードプライマー２４５およびリバースプライマー２５０をアニーリングして環状化［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鋳型２４０にし、プライマー伸長反応を用いて線状化［Ａ］－［Ｔ］－［Ａ］アンプリコン２５５を生成する。フォーワードプライマー２４５およびリバースプライマー２５０は、塩基配列決定ステップなどの下流側ワークフローステップに有用な各種アダプター要素を含むことができる。
【0047】
プライマーは、好ましくはＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーと共に使用するためのプライマーなどの、塩基配列決定プライマーである。
【0048】
一例において、フォワ－ドプライマー２４５が以下の構造、５’～３’を有する。
［ＡＤＡＰＴ］－［ＩＮＤ］－［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］－［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］
［ＡＤＡＰＴ］は、ＩｌｌｕｍｉｎａＰ５アダプター、５’ ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＡ ３’（配列番号１）などのアダプターであり、
［ＩＮＤ］は、Ｉｌｌｕｍｉｎａｉ７インデックスなどの一意のサンプル識別子配列であり、
［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＳＢＳ１２プライマーＡＣＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＴ ＣＣＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＧＡ ＴＣＴ(配列番号２）などの塩基配列決定プライマーであり、
［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］は、環状化［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鋳型２４０中の標的核酸配列に対して相補的な標的プライマーである。
［ＡＤＡＰＴ］－［ＩＮＤ］－［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］－［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］
［ＡＤＡＰＴ］は、ＩｌｌｕｍｉｎａＰ５アダプター、５’ ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＡ ３’（配列番号１）などのアダプターであり、
［ＩＮＤ］は、Ｉｌｌｕｍｉｎａｉ７インデックスなどの一意のサンプル識別子配列であり、
［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＳＢＳ１２プライマーＡＣＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＴ ＣＣＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＧＡ ＴＣＴ(配列番号２）などの塩基配列決定プライマーであり、
［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］は、環状化［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鋳型２４０中の標的核酸配列に対して相補的な標的プライマーである。
【0049】
一例において、リバ－スプライマー２５０が以下の構造、５’～３’を有する。
［ＡＤＡＰＴ］－［ＩＮＤ］－［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］－［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］
［ＡＤＡＰＴ］は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７アダプター、５’ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧＡ ３（配列番号３）などのアダプターであり、
［ＩＮＤ］は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉ５インデックスなどの一意のサンプル識別子配列であり、
［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＳＢＳ３プライマー、ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＴＴ ＣＡＧ ＡＣＧ ＴＧＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＣＧ ＡＴＣ Ｔ(配列番号４）などの塩基配列決定プライマーであり、
［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］は、環状化［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鋳型２４０中の標的配列に相補的な標的プライマーである。
［ＡＤＡＰＴ］－［ＩＮＤ］－［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］－［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］
［ＡＤＡＰＴ］は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７アダプター、５’ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧＡ ３（配列番号３）などのアダプターであり、
［ＩＮＤ］は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉ５インデックスなどの一意のサンプル識別子配列であり、
［ＳＥＱ－ＰＲＩＭＥＲ］は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＳＢＳ３プライマー、ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＴＴ ＣＡＧ ＡＣＧ ＴＧＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＣＧ ＡＴＣ Ｔ(配列番号４）などの塩基配列決定プライマーであり、
［ＴＡＲＧ－ＰＲＩＭＥＲ］は、環状化［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］鋳型２４０中の標的配列に相補的な標的プライマーである。
【0050】
ステップＨにおいて、線状化された［Ａ］－［Ｔ］－［Ａ］アンプリコン２５５はクリ－ンアップされ、例えば、塩基配列決定のための分析のために調製される。
【0051】
図３は、ステップＣ、ステップＤおよびステップＥにおけるプライマー領域ライゲーションおよびプライマー伸長反応を、［ＰＳ１］－Ｌ－［ＰＳ２］鎖１０２のステップＣ’およびステップＤ’として図３に示される標的鎖へ直接ライゲーションされるライゲーション処理に置き換えた、代替の実施形態を図示する。したがって、図３に記載される方法は、一態様において、以下の順序：ステップＡ、Ｂ、Ｃ’、Ｄ’、Ｆ、Ｇ、Ｈ、で行うことができ、ここで、ステップＡ、Ｂ、Ｆ、Ｇ、およびＨは上記の通りであり、ステップＣ’およびＤ’は以下の通りである。
【0052】
ステップＣ’において、［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］１０２（図３において３１０として示される）を導入し、標的断片２１５の３’末端にライゲーションさせて、［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖３１５を得る。一本鎖ライゲーションは、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ酵素（以下でより詳細に論じる）などの酵素によって媒介され得る。
【0053】
ステップＤ’において、［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖３１５のアダプター部分は例えば、ＴＰ４ ＰＮＫ(ニュー・イングランド・バイオラボ社（New England Biolabs,Inc.）マサチューセッツ州イプスウィッチ）などの酵素を用いて脱リン酸化することができ、脱リン酸化された鎖３２０を生成する。Ｔ４ ＰＮＫは、亜硫酸水素塩で変換されたｓｓＤＮＡ断片の３’－ＯＨ末端を残すことによって、ステップＦにおけるライゲーションによって環状化のための断片末端を調製する。ステップＤ’はまた、ステップＦにおける環状化に移る前の脱リン酸化酵素の熱不活性化を含み得る。ステップＦにおける［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］２３５鎖の環状化について上述したように、［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖３１５は、ステップＦにおいて同様に環状化され、環状化［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鋳型２４０を生じる。鋳型２４０は、環状化［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］－［Ｔ’］２３５鎖および［Ｔ］－［ＰＳ］－［Ｌ］－［ＰＳ］鎖３１５の両方を表す。
【0054】
開示される主題の様々な実施形態の実験結果は実施例１に記載され、図４および図５に示される。図４は、図２Ａおよび図２Ｂによる増幅方法で調製されたｃｆＤＮＡの比較を示す高感度ＮＧＳ断片アナライザーによるランチャートのグラフであり、［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖１０２を伸長プライマー（「Ｃｉｒｃ伸長プライマー」と称される）またはｃｆＤＮＡが２つのクリ－ンアップステップのうちの１つのみを受けたｃｆＤＮＡが環状化されていない従来の伸長プライマー（「ＧｒａｉｌＭｅｔｈｙｌＳｅｑ」と称される）のいずれかとして使用した。図５は、Ｃｉｒｃ伸長プライマー［ＰＳ１］－［Ｌ］－［ＰＳ２］鎖１０２を使用する、図２Ａおよび図２Ｂによる環状化アプロ－チによって調製されたメチル化ライブラリーの高感度ＮＧＳ断片アナライザーによるランチャートのグラフである。
【0055】
インプットサンプル
開示される主題の方法において、インプットサンプルは断片化ＤＮＡを含む。断片化ＤＮＡは、各種実験室技術を用いて断片化され得る。断片化ＤＮＡは天然に断片化されていてもよく、例えば、ｃｆＤＮＡである。断片化ＤＮＡは、全ゲノム、または複数のゲノムもしくは複数のゲノムのサブセットさえも含む、ゲノムの任意のサブセットを表すことができる。
開示される主題の方法において、インプットサンプルは断片化ＤＮＡを含む。断片化ＤＮＡは、各種実験室技術を用いて断片化され得る。断片化ＤＮＡは天然に断片化されていてもよく、例えば、ｃｆＤＮＡである。断片化ＤＮＡは、全ゲノム、または複数のゲノムもしくは複数のゲノムのサブセットさえも含む、ゲノムの任意のサブセットを表すことができる。
【0056】
サンプルの供給源は、ＤＮＡの任意の供給源であり得る。例えば、サンプル源は、生物有機体または環境サンプルであってもよい。供給源が生物有機体である場合、供給源は、組織、細胞、流体、または他の物質であり得る。サンプルは、新鮮であってもよく、または保存されてもよい。好ましくは、対象がヒトまたは他の動物である。サンプルまたはインプットサンプルは、開示される主題の一態様において複数の供給源および／または複数の対象からプールされ得る。
【0057】
開示される主題の一態様において、サンプルは、特定の疾患を有することがわかっているか、または有することが疑われる対象に由来する。開示される主題の一態様において、サンプルは、特定の疾患を有することが知られていないか、または有することが疑われる対象（例えば、研究における対照群または疾患のスクリーニングを受けている対象）に由来する。
【0058】
開示される主題の１つのバージョンにおいて、サンプルは、癌を有することが知られているか、または癌を有することが疑われる対象に由来する。開示される主題の一態様において、サンプルは、癌を有することが知られていないか、または癌を有することが疑われる対象（例えば、研究における対照群または癌のスクリーニングを受けている対象）に由来する。
【0059】
開示される主題のいくつかの実施形態において、サンプルが腫瘍または疑わしい腫瘍に由来する。開示される主題の一態様において、サンプルは、癌組織であり得るか、または癌組織であることが疑われる組織サンプルである。開示される主題の一態様において、サンプルはＩ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、またはＩＶ期の癌であり得る組織サンプルである。
【0060】
開示される主題の一態様において、サンプルは、体液または細胞外体物質である。開示される主題のいくつかのバ－ジョンにおいて、体液または細胞外体物質が全血、血液画分、血清、および血漿からなる群から選択される。開示される主題の一態様において、体液または細胞外体物質が房水、腹水、胆汁、脳脊髄液、乳糜、胃液、腸液、リンパ液、膵液、心嚢液、腹水、胸膜液、唾液、脊髄液、痰、便または他の腸排液、汗、涙、および／または尿から選択される。
【0061】
開示される主題の一変形例によれば、インプットサンプルは、体液または他の体物質から得られるｃｆＮＡまたはｃｆＤＮＡである。開示される主題の一態様において、ｃｆＮＡまたはｃｆＤＮＡは、健康細胞に由来する。開示される主題の一態様において、ｃｆＮＡまたはｃｆＤＮＡは、癌細胞などの疾患細胞に由来する。
【0062】
環状化とｓｓＤＮＡライゲーション
上記のように、開示される主題の方法の特定のステップにおいて、核酸鎖が環状化される（図２Ｂに示されるステップＦを参照）。開示される主題の方法の特定のステップにおいて、一本鎖核酸鎖が環状化される。他のステップにおいて、ｓｓＤＮＡ分子をライゲーションする。
上記のように、開示される主題の方法の特定のステップにおいて、核酸鎖が環状化される（図２Ｂに示されるステップＦを参照）。開示される主題の方法の特定のステップにおいて、一本鎖核酸鎖が環状化される。他のステップにおいて、ｓｓＤＮＡ分子をライゲーションする。
【0063】
一実施形態において、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、一本鎖ＤＮＡを環状化することができる。ライゲーション反応は例えば、「標準」Ｔ４ ＤＮＡリガ－ゼ反応、またはAn,R.ら,Nucleic Acids Research(2017年)45(15):el39によって記載されているように分子間重合を防止し、分子内環状化を促進するように設計された標準反応の修飾バージョンであることができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ライゲーション反応は例えば、Thermo Scientific(ペンシルベニア州ピッツバーグ)から入手可能なＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼバッファーを用いて実施することができる。
【0064】
一例において、１μＭ線状一本鎖ＤＮＡ、ＩＸ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（１０ｍＭ Ｍｇ２＋、５００μＭ ＡＴＰ、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および４０ｍＭ ＴＲＩｓ－ＨＣＬ)、「スプリント」ＤＮＡ（２μＭ、長さ１２ヌクレオチド）、および５Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、標準的なＴ４ ＤＮＡリガーゼ反応（２０ μＬ）を実施することができる。ライゲーション反応は２０℃で１２時間行うことができ、反応混合物を６５℃で１０分間加熱することによって反応を終了させる。
【0065】
一例において、０．０５Ｘ（０．５ｍＭ Ｍｇ２＋、２５μＭ ＡＴＰ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、および２ｍＭ ＴＲＩｓ－ＨＣＬ)に希釈されたＴ４ ＤＮＡリガーゼバッファーを使用して、標準反応の修飾を実施することができる。
【0066】
別の実施例において、０．０５Ｘに希釈したＴ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（０．５ｍＭ Ｍｇ２＋、２５ μＭ ＡＴＰ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、および２ｍＭ ＴＲＩｓ－ＨＣＬ)を用いて標準反応の修飾を行い、所定の時間隔でライゲーション反応に線状一本鎖ＤＮＡを段階的に添加してもよい。
【0067】
１つの態様において、ＤＮＡは、ＤＮＡ鎖の５’末端をリン酸基で修飾して、それを同じ鎖の３’末端に環状化できるようにすることによって環状化され得る。足場鎖は例えば、９５℃～２５℃で４時間アニーリングし、続いて、６６ｍＭ ＴＲＩｓ－ＨＣＬ(ＰＨ ７.６）、６.６ｍＭ ＭｇＣ１２、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０.１ｍＭ ＡＴＰおよび３.３μＭ Ｎａ４３２Ｐ２Ｏ７を有するＴＥバッファー中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１０μＬ、３５０Ｕ／μＬ）を使用して２つの末端をライゲーションし、続いてアルコール浴装置中で１６℃で１６時間インキュベ－ションすることによって、両端を一緒にライゲーションするスプリント鎖によって、その２つの末端を一緒にライゲーションするように折り畳まれ得る。Ｔ４－ＤＮＡ／リガーゼは、６５℃で１０分間熱変性させた後、氷浴中で５分間めっき浴することができる。
【0068】
一実施形態において、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用して、一本鎖ＤＮＡを環状化することができる。一例において、一本鎖ＤＮＡはＴ４ ＲＮＡリガーゼ、反応バッファー、およびThermo Scientific(Thermo Fisher Scientific,マサチューセッツ州、ウォルサム)から入手可能なウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用するライゲーション反応において、製造業者の推奨プロトコルに従って環状化することができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0069】
別の実施例において、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ１はBlondalら、Nucleic Acids Res.(2005年)33(1):135-142に記載されているように、ＡＴＰ依存的な方法で、分子内一本鎖ＤＮＡライゲーション（環状化）を触媒するために使用することができ、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0070】
ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼは、５’－リン酸基および３’－水酸基の両方を有する一本鎖ＤＮＡ(ｓｓＤＮＡ)基質の分子内ライゲーション（すなわち、環状化）を触媒する熱安定性ＡＴＰ依存性リガーゼである。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼはｓｓＤＮＡ鋳型の分子内ライゲーション（すなわち、環状化）を触媒するＡＴＰ非依存性の非触媒性熱安定性リガーゼである。両方の酵素は、Lucigen Corp.(ウィスコンシン州、ミドルトン)から入手可能である。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼキットまたはＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼキット(EPICENTRE Biotechnologies,ウィスコンシン州、マディソン、Lucigen Corp.、ウィスコンシン州、ミドルトンから入手可能）を使用して、製造業者の推奨プロトコルに従って一本鎖ＤＮＡを環状化することができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＬＵｃＩＧｅＮ ＣＯＲＰ、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＭＡ２２２Ｅ－ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼ、２０１９年３月）およびＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＭＡ２９８Ｅ－ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼ、２０１９年７月）のマニュアルは、その全体が本明細書に組み込まれる。
【0071】
一実施形態において、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを使用して、一本鎖ＤＮＡを環状化することができる。一例において、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼキット(EPICENTRE Biotechnologies,ウィスコンシン州、マディソン、Lucigen Corp.,ウィスコンシン州、ミドルトンから入手可能）を使用して、製造業者の推奨プロトコルに従って一本鎖ＤＮＡを環状化することができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一例において、ライゲーション反応が１０ｐｍoｌの一本鎖ＤＮＡ、２μＬのＣＩＲｃＬＩＧａｓｅ １０Ｘ反応バッファー、１μＬの１ｍＭ ＡＴＰ、１μＬの５０ｍＭ ＭＮＣ１２、１μＬのＣＩＲｃＬＩＧａｓｅ ｓｓＤＮＡ ＬＩＧａｓｅ(１００Ｕ）を用いて実施して、２０μＬの全反応体積を得ることができる。ライゲーション反応を６０℃で１時間インキュベートし、反応混合物を８０℃で１０分間加熱することによって反応を停止させて、リガーゼを不活性化することができる。
【0072】
別の実施例において、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガ－ゼキット(EPICENTRE Biotechnologies,ウィスコンシン州、マディソン、Lucigen Corp.,ウィスコンシン州、ミドルトンから入手可能）を使用して、製造業者の推奨プロトコルに従って一本鎖ＤＮＡを環状化することができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一例において、ライゲーション反応が１０ｐｍoｌの一本鎖ＤＮＡ、２μＬのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ＩＩ １０Ｘ反応バッファー、１μＬの５０ＭＭ ＭＮＣ１２、４μＬの５Ｍベタイン（任意選択）、１μＬのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼ（１００Ｕ）を用いて実施して、２０μＬの全反応体積を得ることができる。ライゲーション反応を６０℃で１時間インキュベートし、反応混合物を８０℃で１０分間加熱することによって反応を停止させて、リガーゼを不活性化することができる。
【0073】
別の実施例において、ＤＮＡを４．５μＬの環状化混合物（５μＬ中の最終堆積:１Ｘ ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥバッファー、５０μＭ ＡＴＰ、および２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２)に再懸濁し、０．５μＬ ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを添加することによって、ＤＮＡを環状化することができる。環状化は６０℃で１時間、１時間行うことができ、反応混合物を８０℃で１０分間加熱することによって反応を終了させ、リガーゼを不活性化する。
【0074】
ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼおよびＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガ－ゼも、例えば、図２ＡのことＣおよび図３のことＣ’に関して示されるように、線状ｓｓＤＮＡ分子をライゲーションするために有用である。任意の公知のプロトコルを使用することができる。例示的な実施例は、Gansauge,ら、Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase,Nucleic Acids Res.2017 Jun 2;45(10):e79により提供され、開示は、ｓｓＤＮＡライゲーションの方法に関するその教示のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0075】
ウラシルの変換
上記のように、開示される主題の方法の特定のステップにおいて、非メチル化シトシンは、ウラシルに変換され得る。
上記のように、開示される主題の方法の特定のステップにおいて、非メチル化シトシンは、ウラシルに変換され得る。
【0076】
この目的のために、様々なキットが市販されている。例としては、ＥＰＩＭＡＲＫ亜硫酸水素塩変換キット(ニュー・イングランド・バイオラボ社（New England Biolabs,Inc.）マサチューセッツ州イプスウィッチ)、ＡＣＴＩＶＥＭＯＴＩＦ亜硫酸水素塩変換キット(Active Motif,Inc.,カリフォルニア州、カールスバッド)、ＥＰＩＴＥＣＴ亜硫酸水素塩キット(QIAGEN Ltd.,ドイツ、ヒルデン)ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ(Zymo Research Corp.,カリフォルニア州、アーバイン)、NEBNEXT Enzymatic Methyl-seq(EM-SEQ)(ニュー・イングランド・バイオラボ社（New England Biolabs,Inc.）マサチューセッツ州イプスウィッチ)が挙げられる。これらのキットの製品文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0077】
一態様において、ＤＮＡ断片を変性させ、亜硫酸水素塩で処理する。変性および亜硫酸水素塩処理ことは、単一の反応であってもよく、または連続反応で行われてもよい。亜硫酸水素塩処理は、非メチル化シトシンを亜硫酸塩で修飾する。変換後、ＤＮＡを脱アミノ化してウラシルに変換することができる。例えば、ＤＮＡを脱塩し、アルカリ性ＰＨでインキュベートして、脱アミノ化し、ウラシルに変換することができる。
【0078】
開示される主題の一態様において、ＤＮＡ断片は、約０.３Ｍの最終濃度のＮａＯＨを使用して変性され、約２Ｍ（約５～６の間のＰＨ）の最終濃度の亜硫酸水素ナトリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムで、５５℃で４～１６時間処理され得る。変換後、ＤＮＡを脱塩し、その後、ＤＮＡをアルカリ性ＰＨで室温でインキュベートすることにより脱スルホン化することができる。
【0079】
開示される主題の別の態様において、非メチル化シトシンのウラシルへの変換が酵素技術を利用する。例えば、ある種のシトシンデアミナーゼは、一本鎖ＤＮＡにおいてシトシン塩基をウラシルに脱アミノ化することが知られている。
【0080】
開示される主題の別の態様において、シトシンデアミナ－ゼはＡＰＯＢＥＣである。ＡＰＯＢＥＣはまた、５ｍＣおよび５ｈｍＣを脱アミノ化するので、５ｍＣおよび５ｈｍＣを検出するために、これらの方法は、５ｍＣおよび／または５ｈｍＣの脱アミノ化をブロックするための技術を使用する。例えば、ＥＭ－ＳＥＱ(ニュー・イングランド・バイオラボ社（New England Biolabs,Inc.）マサチューセッツ州イプスウィッチ)ＴＥＴ２および酸化促進剤を使用して、５ｍＣおよび５ｈｍＣを修飾して、ＡＰＯＢＥＣの基質ではない形成にすることができる。ＴＥＴ２酵素は５ｍＣを５ｃａＣに変換し、酸化エンハンサ－は５ｈｍＣを５ｇｈｍＣに変換する。NEBNEXT Enzymatic Methyl-seq(EM-SEQ)製品の文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0081】
開示される主題の別の態様において、５ｈｍＣが５ｍＣとは別に識別され得るように選択的に変換される。例えば、ＡＰＯＢＥＣ共役エピジェネティックシークエンシング（ＡＣＥ－ｓｅｑ）は、５ｈｍＣを検出するために酵素変換に依存する。この方法において、Ｔ４－ＢＧＴは５ｈｍＣを５ｇｈｍＣにグルコシル化し、ＡＰＯＢＥＣ３Ａによる脱アミノ化から保護する。シトシンおよび５ｍＣはＡＰＯＢＥＣ３Ａによって脱アミノ化され、チミンとして塩基配列決定される。
【0082】
開示される主題の別の態様において、５ｍＣと５ｈｍＣとを区別するために、酸化的亜硫酸水素塩シークエンシング（ｏｘＢＳ）が使用される。酸化試薬過ルテニウム酸カリウムは５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換し、その後の亜硫酸水素ナトリウム処理は、５ｆＣをウラシルに脱アミノ化する。５ｍＣは変化しないままであり、したがってこの方法を用いて同定することができる。
【0083】
開示される主題の別の態様において、断片化ＤＮＡがグルコシル化によって５ｈｍＣを保護するＴ４－ＢＧＴで処理される。次いで、酵素ｍＴＥＴ１を使用して、５ｍＣを５ｈｍＣに酸化し、Ｔ４－ＢＧＴは、修飾グルコース部分（６－Ｎ３－グルコース）を使用して、新たに形成された５ＨＭＣを標識する。
【0084】
鎖変性
開示される主題の一態様において、鎖が変換反応を行う前に変性される。変性は例えば、高温、例えば、約９８℃でのインキュベーション、および／または水酸化ナトリウムなどの塩基への曝露によって達成され得る。
開示される主題の一態様において、鎖が変換反応を行う前に変性される。変性は例えば、高温、例えば、約９８℃でのインキュベーション、および／または水酸化ナトリウムなどの塩基への曝露によって達成され得る。
【0085】
クリーンアップ
開示される主題の方法は、後続のステップのための反応物を調製するための様々な段階でのクリーンアップステップから利益を得ることができる。一例において、ビーズベースのクリーンアッププロトコル、例えば、ＳＰＲＩクリーンアッププロトコルが実行される。
開示される主題の方法は、後続のステップのための反応物を調製するための様々な段階でのクリーンアップステップから利益を得ることができる。一例において、ビーズベースのクリーンアッププロトコル、例えば、ＳＰＲＩクリーンアッププロトコルが実行される。
【0086】
以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提示するものである。
【実施例】
【0087】
実施例１
有機リンカー（「Ｃｉｒｃ伸長プライマー」とも呼ばれる）を含有する一本鎖核酸分子を設計し、メチル化ライブラリーを調製するための環状化および伸長アプローチにおける使用のために試験した。以下の実験手順は、増幅前にＤＮＡが環状化されるｃｆＤＮＡから次世代シーケンシング（ＮＧＳ）標的化メチル化ライブラリーを作製するためのアプローチを記載する。この環状化メチル－ｓｅｑライブラリー調製ワークフロー設計を図２Ａおよび図２Ｂに示す。
有機リンカー（「Ｃｉｒｃ伸長プライマー」とも呼ばれる）を含有する一本鎖核酸分子を設計し、メチル化ライブラリーを調製するための環状化および伸長アプローチにおける使用のために試験した。以下の実験手順は、増幅前にＤＮＡが環状化されるｃｆＤＮＡから次世代シーケンシング（ＮＧＳ）標的化メチル化ライブラリーを作製するためのアプローチを記載する。この環状化メチル－ｓｅｑライブラリー調製ワークフロー設計を図２Ａおよび図２Ｂに示す。
【0088】
Ｃｉｒｃ＿伸長プライマー設計
以下のＣｉｒｃ＿伸長プライマー（図１Ｂの鎖１０２）は、／５Ｐｈｏｓ/ＣＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＣＣＴＡＣＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＡＴＣ/ｉＳｐ１８/ＣＡＣＴＣＡ/ｉＳｐ１８/ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’ＯＨを使用した。この伸長プライマーにおいて、分子ｉＳｐ１８／ＣＡＣＴＣＡ／ｉＳｐ１８部分は、図１Ｂに示すリンカー１２０である。用語「ｉＳｐ１８」は、Integrated DNA Technologies社（アイオワ州コーラルビル）から入手可能なヘキサ－エチレングリコール分子であるＩｎｔ Ｓｐａｃｅｒ１８を示す。
以下のＣｉｒｃ＿伸長プライマー（図１Ｂの鎖１０２）は、／５Ｐｈｏｓ/ＣＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＣＣＴＡＣＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＡＴＣ/ｉＳｐ１８/ＣＡＣＴＣＡ/ｉＳｐ１８/ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’ＯＨを使用した。この伸長プライマーにおいて、分子ｉＳｐ１８／ＣＡＣＴＣＡ／ｉＳｐ１８部分は、図１Ｂに示すリンカー１２０である。用語「ｉＳｐ１８」は、Integrated DNA Technologies社（アイオワ州コーラルビル）から入手可能なヘキサ－エチレングリコール分子であるＩｎｔ Ｓｐａｃｅｒ１８を示す。
【0089】
インプットサンプル
無細胞ＤＮＡ(ｃｆＤＮＡ)が、全血の血漿画分内に存在する。
無細胞ＤＮＡ(ｃｆＤＮＡ)が、全血の血漿画分内に存在する。
【0090】
ウラシルの変換
EZ DNA METHYLATION-LIGHTNING Kit Manual Version 1.0.4(Zymo Research Corp.、カリフォルニア州、アーバイン)を使用して、ｃｆＤＮＡ中の非メチル化シトシンをウラシルに変換した。Advanced Analytical Technologies High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit(1bp-6000bp)User Guide for DNF-474-0500 and DNF-474-1000を用いて、キャピラリー電気泳動により断片を分析した。
EZ DNA METHYLATION-LIGHTNING Kit Manual Version 1.0.4(Zymo Research Corp.、カリフォルニア州、アーバイン)を使用して、ｃｆＤＮＡ中の非メチル化シトシンをウラシルに変換した。Advanced Analytical Technologies High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit(1bp-6000bp)User Guide for DNF-474-0500 and DNF-474-1000を用いて、キャピラリー電気泳動により断片を分析した。
【0091】
ＮＧＳライブラリーの精製
ＮＧＳライブラリーを、ライブラリー構築中および塩基配列決定前に、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）を用いて精製した。この方法は、ポリエチレングリコ－ル（ＰＥＧ）および塩の存在下でＤＮＡに可逆的に結合するカルボキシル被覆磁性粒子／ビーズに依存する。
ＮＧＳライブラリーを、ライブラリー構築中および塩基配列決定前に、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）を用いて精製した。この方法は、ポリエチレングリコ－ル（ＰＥＧ）および塩の存在下でＤＮＡに可逆的に結合するカルボキシル被覆磁性粒子／ビーズに依存する。
【0092】
試薬・材料
使用した試薬および材料を以下の表に示す。
使用した試薬および材料を以下の表に示す。
【0093】
【表1】
【0094】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）調製
ＰＥＧの４２％（最終濃度）調製物を、１０００μＬのＰＥＧ(５０％）を１９０．５μＬのＵＬＴＲＡＰＵＲＥ ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒと組み合わせることによって調製した。
ＰＥＧの４２％（最終濃度）調製物を、１０００μＬのＰＥＧ(５０％）を１９０．５μＬのＵＬＴＲＡＰＵＲＥ ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒと組み合わせることによって調製した。
【0095】
ライブラリー調製オリゴヌクレオチド試薬
実験に使用したオリゴヌクレオチドを低ＥＤＴＡ ＴＥバッファーに溶解し、以下の表に示す。
実験に使用したオリゴヌクレオチドを低ＥＤＴＡ ＴＥバッファーに溶解し、以下の表に示す。
【0096】
【表2】
【0097】
一般的手順
全ての反応混合物は、酵素を添加する前にパルスボルテックスによって混合した。酵素添加後の混合は第一アダプターのライゲーションのセクション（反応が２０％のＰＥＧ－４０００を含有し、適切な混合のためにボルテックスが必要である場合）を除いて、チュ－ブの穏やかなフリックと、その後のクイックスピンによってのみ行った。低結合ピペットチップを、プロトコル全体を通して使用した。
全ての反応混合物は、酵素を添加する前にパルスボルテックスによって混合した。酵素添加後の混合は第一アダプターのライゲーションのセクション（反応が２０％のＰＥＧ－４０００を含有し、適切な混合のためにボルテックスが必要である場合）を除いて、チュ－ブの穏やかなフリックと、その後のクイックスピンによってのみ行った。低結合ピペットチップを、プロトコル全体を通して使用した。
【0098】
亜硫酸水素塩変換調製
使用前に９６ｍＬの１００％エタノールを２４ｍＬのＭ－Ｗａｓｈバッファー濃縮物（Ｄ５０３１）に加えた。ＺＹＭＯＳＰＩＮ ＩＣカラムをチェックして、使用前にカラムまたはマトリックスに目に見える損傷がないことを確認した。Lightning Conversion Reagentをボルテックスにより混合し、急速に遠心分離した。
使用前に９６ｍＬの１００％エタノールを２４ｍＬのＭ－Ｗａｓｈバッファー濃縮物（Ｄ５０３１）に加えた。ＺＹＭＯＳＰＩＮ ＩＣカラムをチェックして、使用前にカラムまたはマトリックスに目に見える損傷がないことを確認した。Lightning Conversion Reagentをボルテックスにより混合し、急速に遠心分離した。
【0099】
亜硫酸水素塩変換
合計２５ｎｇのインプットｃｆＤＮＡを０．２ｍＬのＰＣＲストリップチューブに入れた。必要に応じて、ヌクレアーゼを含まない水でサンプル容量を２０μＬに調製した。１３０μＬのLightning Conversion ReagentをＤＮＡサンプルに添加した。ボルテックスによって混合し、次いで、チューブのキャップまたは側面に液滴が存在しないことを確実にするために短時間遠心分離する。サーモサイクラー上でＥＺライトニングプログラムを開始した。温度が９０℃に達したら、チューブを慎重にサーモサイクラーに入れた。サイクルプログラムは、９８℃８分、５４℃６０分、４℃保持とした。
合計２５ｎｇのインプットｃｆＤＮＡを０．２ｍＬのＰＣＲストリップチューブに入れた。必要に応じて、ヌクレアーゼを含まない水でサンプル容量を２０μＬに調製した。１３０μＬのLightning Conversion ReagentをＤＮＡサンプルに添加した。ボルテックスによって混合し、次いで、チューブのキャップまたは側面に液滴が存在しないことを確実にするために短時間遠心分離する。サーモサイクラー上でＥＺライトニングプログラムを開始した。温度が９０℃に達したら、チューブを慎重にサーモサイクラーに入れた。サイクルプログラムは、９８℃８分、５４℃６０分、４℃保持とした。
【0100】
カラムクリーンアップ
ＺＹＭＯ－ＳＰＩＮ ＩＣカラムを、提供された収集チューブにセットアップした。６００μＬのＭ結合バッファーをカラムに加えた。ＤＮＡチューブをサーモサイクラーから慎重に取り出した。サンプルを、Ｍ－結合バッファーを含有するＺＹＭＯ－ＳＰＩＮ ＩＣカラムにロードした。上下にピペットで混ぜる。フルスピード（＞１０，０００ｘｇ)で３０秒間遠心分離する。フロースルーを廃棄した。１００μＬのＭ－洗浄バッファーをカラムに添加し、３０秒間全速で遠心分離した。フロースルーを廃棄した。２００μＬのＬ－脱スルホン化バッファーをカラムに添加し、室温で２０分間静置した。その後、３０秒間、全速力で遠心分離した。フロースルーを廃棄し、新しい回収チューブに変更した。２００μＬのＭ－洗浄バッファーをカラムに添加した。カラムを全速で３０秒間遠心分離した。別の２００μＬのＭ－洗浄バッファーをカラムに添加し、３０秒間、全速力で遠心分離した。カラムを新しい収集チューブに入れ、３０秒間全速力で遠心分離した。カラムを１．５ｍＬのEppendorf Lo-結合チューブに入れ、２μＬのＭ－溶出バッファーをカラムマトリックスに直接添加し、次いで室温で５分間インキュベートした。ＤＮＡを溶出するために、３０秒間、フルスピ－ドで遠心分離した。
ＺＹＭＯ－ＳＰＩＮ ＩＣカラムを、提供された収集チューブにセットアップした。６００μＬのＭ結合バッファーをカラムに加えた。ＤＮＡチューブをサーモサイクラーから慎重に取り出した。サンプルを、Ｍ－結合バッファーを含有するＺＹＭＯ－ＳＰＩＮ ＩＣカラムにロードした。上下にピペットで混ぜる。フルスピード（＞１０，０００ｘｇ)で３０秒間遠心分離する。フロースルーを廃棄した。１００μＬのＭ－洗浄バッファーをカラムに添加し、３０秒間全速で遠心分離した。フロースルーを廃棄した。２００μＬのＬ－脱スルホン化バッファーをカラムに添加し、室温で２０分間静置した。その後、３０秒間、全速力で遠心分離した。フロースルーを廃棄し、新しい回収チューブに変更した。２００μＬのＭ－洗浄バッファーをカラムに添加した。カラムを全速で３０秒間遠心分離した。別の２００μＬのＭ－洗浄バッファーをカラムに添加し、３０秒間、全速力で遠心分離した。カラムを新しい収集チューブに入れ、３０秒間全速力で遠心分離した。カラムを１．５ｍＬのEppendorf Lo-結合チューブに入れ、２μＬのＭ－溶出バッファーをカラムマトリックスに直接添加し、次いで室温で５分間インキュベートした。ＤＮＡを溶出するために、３０秒間、フルスピ－ドで遠心分離した。
【0101】
脱リン・熱変性
１１μＬの亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを０．２ＭＬのストリップチューブに移し、氷上のチューブに次反応試薬混合物をセットアップした。
１１μＬの亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを０．２ＭＬのストリップチューブに移し、氷上のチューブに次反応試薬混合物をセットアップした。
【0102】
【表3】
【0103】
６μＬのマスターミックスを亜硫酸水素塩処理ＤＮＡに添加し、穏やかにフリックすることによって混合し、次いで、クイックスピンした。チューブを、予め加熱した蓋（１０５℃）を備えたサーモサイクラー中で、３７℃で１０分間、９５℃で２分間インキュベートし、次いで、速やかに氷水浴に移し、１分間静置した。クイックスピン後、第１アダプターのライゲーションに進む。
【0104】
第１アダプターのライゲーション
精製したＧＭＳアダプター１を氷上で解凍した。以下の反応試薬を設定し、ボルテックスで混合した。
精製したＧＭＳアダプター１を氷上で解凍した。以下の反応試薬を設定し、ボルテックスで混合した。
【0105】
【表4】
【0106】
２３μＬのマスタ－ミックスを１７μＬの脱リン酸化ＤＮＡに加えた。短時間のボルテックスと速いスピンで混合する。チューブを、予め加熱した蓋（１０５℃）を備えたサーモサイクラー中、５８℃で１時間インキュベートした。
【0107】
ｓｓＤＮＡ ＳＰＲＩ精製:(ＳＰＲＩ １）
以下の手順を実施した。
１．希釈ＳＰＲＩ調製：
以下の手順を実施した。
１．希釈ＳＰＲＩ調製：
【0108】
【表5】
２.８３μＬの希釈したＳＰＲＩビーズを４０μＬのライゲーションしたＤＮＡに加える。上下にピペットで混合する。
３.室温で２０分間インキュベートする。
４.速やかにスピンさせた後、チューブを磁気スタンド上に５分間置く。ビーズに触れることなく上清を廃棄する。
５.８０％の新鮮なエタノール２００μＬで２回洗浄する。
６.クイックスピン後、２０μＬピペットを用いて残留エタノールを除去する。磁気スタンド上のペレットを３分間空気乾燥させる。
７.磁気スタンドからチューブを取り外す。２４μＬのＲＳＢを加え、混合し、次いでＲＴで２分間インキュベートする。速やかにスピンさせた後、チューブを磁気スタンド上に５分間置く。
８.２４μＬを「線形増幅」反応に移す。
【0109】
線形増幅
線状増幅反応を設定し、以下のように行った。
線状増幅反応を設定し、以下のように行った。
【0110】
【表6】
【0111】
予め加熱した蓋（１０５℃）を付けたサーモサイクラーでチューブをインキュベートする。
１サイクル：９８℃×３０秒
２０サイクル：
９８℃、１０秒間
６２℃、３０秒間
７２℃、３０秒間
１サイクル：７２℃、１０分間
２ ４℃保持
１サイクル：９８℃×３０秒
２０サイクル：
９８℃、１０秒間
６２℃、３０秒間
７２℃、３０秒間
１サイクル：７２℃、１０分間
２ ４℃保持
【0112】
ｓｓＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ ＳＰＲＩ精製:(ＳＰＲＩ２）
以下のプロトコ－ルに従った。
１.ＩＸ ＳＰＲＩ精製のためのＳＰＲＩ ＰＥＧ混合物を調製する。
以下のプロトコ－ルに従った。
１.ＩＸ ＳＰＲＩ精製のためのＳＰＲＩ ＰＥＧ混合物を調製する。
【0113】
【表7】
２.増幅したＤＮＡ５０μＬに７７μＬを加える。上下にピペットで混合する。室温で２０分間インキュベートする。
３.速やかにスピンさせた後、チューブを磁気スタンド上に５分間置く。上清を捨てる。
４.８０％のエタノ－ル２００μＬで２回洗浄する。
５.クイックスピン後、２０μＬピペットを用いて残留エタノールを除去する。磁気スタンド上のペレットを３分間空気乾燥させる。
６.磁気スタンドからチューブを取り外す。５０μＬのＲＳＢ混合を加える。室温で２分間インキュベートする。
７.速やかにスピンさせた後、チューブを磁気スタンド上に５分間置く。
８.５０μＬを０．９Ｘ ＳＰＲＩ精製用の新しいチュ－ブに移す。
９.０．９Ｘ ＳＰＲＩ精製のためのＳＰＲＩ ＰＥＧ混合物を調製する。
【0114】
【表8】
１０.増幅したＤＮＡ ５０μＬに７０μＬを加える。上下にピペットで混合する。室温で２０分間インキュベートする。
１１.速やかにスピンさせた後、チュ－ブを磁気スタンド上に５分間置く。上清を捨てる。
１２.８０％のエタノール２００μＬで２回洗浄する。
１３.クイックスピン後、ピペット２０μＬを用いて残留エタノールを除去する。磁気スタンド上のペレットを３分間空気乾燥させる。
１４.磁気スタンドからチューブを取り外す。２６μＬのＲＳＢ混合を加える。室温で２分間インキュベートする。
１５.速やかにスピンさせた後、チューブを磁気スタンド上に５分間置く。
１６.２５μＬを「変性および環状化」反応に移す。
【0115】
変性および環状化
以下の手順に従った。
１.９５℃で２分間予熱した蓋（１０５℃）を備えたサーモサイクラーで加熱することにより、ｓｓＤＮＡを脱色する。
２.すぐに氷水浴に移し、１分間静置する。
３.氷上での次の反応を設定する。
以下の手順に従った。
１.９５℃で２分間予熱した蓋（１０５℃）を備えたサーモサイクラーで加熱することにより、ｓｓＤＮＡを脱色する。
２.すぐに氷水浴に移し、１分間静置する。
３.氷上での次の反応を設定する。
【0116】
【表9】
４.静かに混合した後、急速にスピンさせる。最終容量は３１μＬである。
５.予め加熱した蓋（１０５℃）を付けたサーモサイクラーでチューブをインキュベートする。
６０℃、６０分間。
８０℃、１０分間。
４°Ｃ
【0117】
ライブラリーの増幅とインデックス作成
以下の手順に従った。氷上で以下の反応を設定した。
以下の手順に従った。氷上で以下の反応を設定した。
【0118】
【表10】
１.静かに混合した後、急速にスピンさせる。最終容量は８１μＬである。
２.予め加熱した蓋（１０５℃）でサーモサイクラー中でインキュベートする。
１サイクル：９８℃、４５秒。
１４サイクル：
９８℃、１５秒間。
６０℃３０秒。
７２℃、３０秒。
１サイクル：７２℃、１分間。
４°Ｃ
【0119】
増幅ライブラリーＳＰＲＩビーズのクリーンアップ（ＳＰＲＩ４）
以下の手順に従った。
１.１１４μＬのＳＰＲＩビーズを加える。(１．４Ｘ)上下にピペットで混合する。
２.室温で１０分間インキュベートする。速やかにスピンさせた後、チューブを磁気スタンド上に５分間置く。上清を除去し、廃棄する。
３.８０％のエタノール２００μＬで２回洗浄する。
４.クイックスピン後、２０μＬピペットを用いて残留エタノールを除去する。磁気スタンド上のペレットを３分間空気乾燥させる。
５.試験管に２３μＬのＲＳＢを加える。混合し、室温で２分間インキュベートする。
素早くスピンさせ、チューブを磁気スタンド上に５分間、６分間置く。２０μＬを新しい試験管に移す。これはメチル化ライブラリーである。
以下の手順に従った。
１.１１４μＬのＳＰＲＩビーズを加える。(１．４Ｘ)上下にピペットで混合する。
２.室温で１０分間インキュベートする。速やかにスピンさせた後、チューブを磁気スタンド上に５分間置く。上清を除去し、廃棄する。
３.８０％のエタノール２００μＬで２回洗浄する。
４.クイックスピン後、２０μＬピペットを用いて残留エタノールを除去する。磁気スタンド上のペレットを３分間空気乾燥させる。
５.試験管に２３μＬのＲＳＢを加える。混合し、室温で２分間インキュベートする。
素早くスピンさせ、チューブを磁気スタンド上に５分間、６分間置く。２０μＬを新しい試験管に移す。これはメチル化ライブラリーである。
【0120】
ライブラリーＱＣ
以下の手順に従った。
１.１：１００ライブラリー希釈液を調製し、高感度ＮＧＳキットを用いて断片アナライザー上に２μＬのライブラリーを加える。
２.ライブラリーの量を定量するには、１７５～５，０００ｂｐの範囲を選択する。
以下の手順に従った。
１.１：１００ライブラリー希釈液を調製し、高感度ＮＧＳキットを用いて断片アナライザー上に２μＬのライブラリーを加える。
２.ライブラリーの量を定量するには、１７５～５，０００ｂｐの範囲を選択する。
【0121】
結果
図４は、上述した増幅実験においてＣｉｒｃ伸長プライマーを用いた結果を示すグラフである。増幅方法においてＤＮＡが環状化されていない従来の伸長プライマー（「GrailMethylSeq」と称される）の代わりに、環状化伸長プライマーを使用した。最初の１Ｘ ＳＰＲＩクリーンアップの後、GrailMethylSeq伸長プライマーを用いて調製したＤＮＡと比較するために、ＤＮＡを高感度ＮＧＳ断片アナライザーで実行した。
図４は、上述した増幅実験においてＣｉｒｃ伸長プライマーを用いた結果を示すグラフである。増幅方法においてＤＮＡが環状化されていない従来の伸長プライマー（「GrailMethylSeq」と称される）の代わりに、環状化伸長プライマーを使用した。最初の１Ｘ ＳＰＲＩクリーンアップの後、GrailMethylSeq伸長プライマーを用いて調製したＤＮＡと比較するために、ＤＮＡを高感度ＮＧＳ断片アナライザーで実行した。
【0122】
図５は、Ｃｉｒｃ伸長プライマーを用いて本明細書に記載の環状化アプローチによって調製されたメチル化ライブラリーＤＮＡを示すグラフである。ライブラリーＤＮＡを１：１００に希釈し、高感度ＮＧＳ断片アナライザーで実行し、結果を図５に示す。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】