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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-15
(54)【発明の名称】ＩＬ－４Ｒに結合する抗体可変ドメイン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240105BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240105BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240105BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240105BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240105BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240105BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240105BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240105BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240105BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240105BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240105BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240105BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240105BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240105BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
C07K16/46
C12N15/62 Z
A61P37/08
A61P29/00
A61P37/02
A61K39/395 N
A61K39/395 U
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537534
(86)(22)【出願日】2021-12-23
(85)【翻訳文提出日】2023-08-16
(86)【国際出願番号】 EP2021087576
(87)【国際公開番号】W WO2022136675
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】20216928.0
(32)【優先日】2020-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20216938.9
(32)【優先日】2020-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20216957.9
(32)【優先日】2020-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515310984
【氏名又は名称】ヌマブ セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ユリア ティーツ
(72)【発明者】
【氏名】テア グンデ
(72)【発明者】
【氏名】マリア ヨハンソン
(72)【発明者】
【氏名】シュテファン バルムート
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンドル シモナン
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアン ヘス
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB31
4C085BB36
4C085BB41
4C085BB44
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG03
4C085GG04
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する抗体可変ドメインと多重特異性抗体とに関し、前記多重特異性抗体は、１つ又は２つの前記抗体可変ドメインと、ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる結合ドメインとを含む。本発明はさらに、前記抗体可変ドメイン又は前記多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸と、前記核酸若しくは前記複数の核酸を含むベクターと、前記核酸若しくは複数の核酸又は前記１つ又は複数のベクターとを含む１つ又は複数の宿主細胞と、及び前記抗体可変ドメイン又は前記多重特異性抗体を産生する方法とに関する。さらに本発明は、前記抗体可変ドメイン又は前記多重特異性抗体を含む医薬組成物と、その使用方法とに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する、以下：ａ）配列番号４、５、６、７、８、及び９から選択される配列を有するＶＨ鎖、及び
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、及び１８から選択される配列を有するＶＬ鎖、
を含む、抗体可変ドメイン。
【請求項2】
前記抗体可変ドメインは、以下：ａ）配列番号４の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１４の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｂ）配列番号４の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１７の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｃ）配列番号４の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１８の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｄ）配列番号５の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１５の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｅ）配列番号６の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１６の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｆ）配列番号７の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１４の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｇ）配列番号８の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１８の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｈ）配列番号９の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１４の配列を有するＶＬ鎖、
を含む、請求項１に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項3】
ＦＡＢ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びｄｓＦｖから選択される、請求項１又は２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項4】
配列番号３３～３９から選択される配列を有するｓｃＦｖである、請求項３に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項5】
以下：ａ）請求項１～４のいずれか１項に記載の１つ又は２つの抗体可変ドメイン；
ｂ）ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、
を含む多重特異性抗体。
【請求項6】
免疫グロブリンＦｃ領域を含まない、請求項５に記載の多重特異性抗体。
【請求項7】
タンデム型ｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖ダイマーｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状ダイマーｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、タンデム型トリ－ｓｃＦｖ、トリボディ（Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２）、Ｆａｂ－Ｆｖ２、トリアボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、テトラボディ、ジ－ダイアボディ、タンデム－ジ－ｓｃＦｖ、及びＭＡＴＣＨからなる群から選択されるフォーマットである、請求項６に記載の多重特異性抗体。
【請求項8】
ＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１及びＩｇＧ４から、特にＩｇＧ４から選択される免疫グロブリンＦｃ領域を含む、請求項５に記載の多重特異性抗体。
【請求項9】
前記多重特異性抗体のフォーマットが、ＫｉＨベースのＩｇＧ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣＯＤＶ－ＩｇＧ及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））から、特にモリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌから選択される。請求項８に記載の多重特異性抗体。
【請求項10】
ＩＬ－４Ｒとは異なる第２の標的に特異的に結合する、請求項１～４のいずれか１項に記載の２つの抗体可変ドメインと、２つの結合ドメインとを含む、請求項５～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項11】
請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体可変ドメイン、又は請求項５～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体をコードする、１つの核酸又は２つの核酸。
【請求項12】
請求項１１に記載の前記１つの核酸又は前記２つの核酸を含む１つのベクター又は２つのベクター。
【請求項13】
請求項１２に記載の前記１つのベクター又は前記２つのベクターを含む１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞。
【請求項14】
請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体可変ドメイン又は請求項５～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体と、医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項15】
医薬として使用するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体可変ドメイン又は請求項５～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項16】
疾患、特にヒト疾患、より特にアレルギー疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から、特に炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に使用するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体可変ドメイン又は請求項５～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する抗体可変ドメインと多重特異性抗体とに関し、前記多重特異性抗体は、１つ又は２つの前記抗体可変ドメインと、ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる結合ドメインとを含む。本発明はさらに、前記抗体可変ドメイン又は前記多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸と、前記核酸若しくは前記複数の核酸を含むベクターと、前記核酸若しくは複数の核酸又は前記１つ又は複数のベクターとを含む１つ又は複数の宿主細胞と、及び前記抗体可変ドメイン又は前記多重特異性抗体を産生する方法あとに関する。さらに本発明は、前記抗体可変ドメイン又は前記多重特異性抗体を含む医薬組成物と、その使用方法とに関する。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン－４受容体ＩＬ－４Ｒα（本明細書ではＩＬ－４Ｒ又はＩＬ４Ｒとも呼ばれる）は、Ｉ型受容体である。これは、共通サイトカイン受容体のガンマ鎖（γｃ）との直接相互作用により、又はＩＩ型受容体、特にＩＩ型受容体ＩＬ－１３Ｒα１と受容体複合体を形成することにより、インターロイキン４（ＩＬ－４）に結合する。このＩＬ－４Ｒ／ＩＬ－１３Ｒα１受容体複合体は、インターロイキン４（ＩＬ－４）並びにインターロイキン１３（ＩＬ－１３）に結合して、Ｂ細胞におけるＩｇＥ抗体産生を調節する。ＩＬ－４ＲへのＩＬ－４の結合はマクロファージを活性化し、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）の分化を促進し、Ｔｈ２による炎症を引き起こすことがさらに知られている。ＩＬ－４及び／又はＩＬ－１３がＩＬ－４Ｒα／γｃ及び／又はＩＬ－４Ｒ／ＩＬ－１３Ｒα１に結合すると、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）１、ＪＡＫ２、シグナル伝達物質、及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ）１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、及びＳＴＡＴダイマー化が活性化され、これにより、特定の遺伝子の転写が誘導される。
【0003】
ＩＬ－４Ｒシグナル伝達は、多くのヒト疾患、例えばアトピー性皮膚炎、結節性痒疹、鼻ポリープ症、慢性蕁麻疹、喘息、慢性閉塞性肺疾患などの炎症性疾患や自己免疫疾患と関連していることが示されている。
【0004】
サイトカインＩＬ－４及び／又はＩＬ－１３又はＩＬ－４Ｒに結合することによってＩＬ４Ｒ媒介シグナル伝達を低減又は遮断するいくつかのモノクローナル抗体が、そのような疾患の治療に関する先行技術に記載されている。
【0005】
例えば、Regeneron Pharmaceuticals及びSanofi Genzymeによって開発されたデュピルマブ（Dupixent（登録商標））は、ＩＬ－４Ｒのアルファサブユニットに結合することによってＩＬ－４Ｒに拮抗し、中等度から重度のアトピー性皮膚炎について２０１７年に、そして鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）の治療について、米国食品医薬品局から承認を受けている。さらに、これは、成人及び青年の持続性喘息の治療についても評価されている。２０１８年には、デュピルマブは喘息についても米国食品医薬品局の承認を得た。
【0006】
さらに、国際公開第２０１４／０３９４６１号は、アトピー性皮膚炎の治療に使用するための抗ＩＬ４Ｒ拮抗抗体を記載している。
【0007】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、強い掻痒（すなわち重度のかゆみ）及び鱗状で乾燥した湿疹性病変を特徴とする慢性炎症性皮膚疾患である。重度の疾患は、重大な心理的問題、顕著な睡眠不足、生活の質の低下などにより、非常に困難な状態に陥り、高い社会経済的コストをもたらす可能性がある。ＡＤは多くの場合、５歳未満の小児期に始まり、成人期まで持続する場合がある。
【0008】
ＡＤの病態生理学は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介感作、免疫系、及び環境因子の間の複雑な相互作用により影響される。主要な皮膚欠陥は、ＩｇＥ媒介感作を引き起こす免疫障害となる場合があり、遺伝的突然変異と局所炎症の両方の結果である上皮バリア機能不全を伴う可能性がある。
【0009】
しかしながら、上述した抗ＩＬ－４Ｒ療法には重大な限界がある。多くのアレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患では、ＩＬ－４Ｒシグナル伝達の不均衡に関連する疾患であっても、その有効性は限定的であり、及び／又はその応答率は低～中等度である。現在利用可能な抗ＩＬ－４Ｒ療法のパフォーマンスが最適ではないことの１つの説明は、不均衡なＩＬ－４Ｒシグナル伝達がこれらの疾患の唯一の原因ではないということである可能性がある。従って、これらの治療法の応答率及び／又は有効性を高めるためには、他のシグナル伝達経路にも対処する必要がある。これとは別に、これらの種類の疾患の多くは、かゆみなどの同様に治療する必要がある破壊的な症状を伴う。抗ＩＬ－４Ｒ療法はかゆみに直接対処するものではない。しかし、かゆみは、皮膚に関連する炎症性疾患や自己免疫疾患、例えばＡＤの場合などの一般的な症状である。かゆみを伴う掻き傷は、一般に炎症を促進し、疾患に関連した症状を悪化させる。従って、そのようなアレルギー性、炎症性、及び自己免疫疾患を抱えている患者のための、さらなるＩＬ－４Ｒに基づく治療選択肢が決定的に必要とされている。
【0010】
より具体的には、他のシグナル伝達経路をさらに妨害する多重特異性抗体フォーマットに容易に組み込むことができる、安定かつ強力な抗ＩＬ－４Ｒ抗体構成要素を手元に有することが望ましい。前記抗ＩＬ－４Ｒ構成要素は、ＩＬ－４及び／又はＩＬ－１３媒介シグナル伝達を阻害する高い効力を有しなければならない。さらに、前記構成要素は、医薬品開発に適した多重特異性抗体へのそれらの効率的な組み込みを促進するために、特に高い安定性などの優れた生物物理学的特性を有していなければならない。
【0011】
特に、前記抗ＩＬ－４Ｒ構成要素、すなわち抗体結合ドメインは、以下の最小限の特徴を示さなければならない：
－ これは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合、２００ｐＭ以下の一価の解離定数（ＫＤ）でヒトＩＬ－４Ｒに結合しなければならない、
－ これは、カニクイザル（Macaca fascicularis (Cynomolgus) ）ＩＬ－４Ｒと交差反応性であり、特に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合、５ｎＭ以下の一価ＫＤでカニクイザルＩＬ－４Ｒに結合しなければならない、
－ 特に、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液で調製したとき、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）で測定される融解温度（Ｔｍ）が６３℃以上でなければならない。
－ これは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合、２００ｐＭ以下の一価の解離定数（ＫＤ）でヒトＩＬ－４Ｒに結合しなければならない、
－ これは、カニクイザル（Macaca fascicularis (Cynomolgus) ）ＩＬ－４Ｒと交差反応性であり、特に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合、５ｎＭ以下の一価ＫＤでカニクイザルＩＬ－４Ｒに結合しなければならない、
－ 特に、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液で調製したとき、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）で測定される融解温度（Ｔｍ）が６３℃以上でなければならない。
【0012】
さらに、前記抗ＩＬ－４Ｒ構成要素は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定した場合、５ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０でヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を中和し、及び１０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０でヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を中和する能力を有することが望ましい。さらに望ましい特徴は、以下の項目７に列挙されている。
【0013】
上述の基準のうちの１つ又は２つを満たす抗ＩＬ－４Ｒ抗体可変ドメインを同定する方法は従来技術において知られているが、これらの基準のすべてを満たすそのような抗体可変ドメインの同定は言うまでもなく、以下の項目７に言及されている基準のほとんど又はすべては困難であり、結果は予測できない。
【発明の概要】
【0014】
本発明の目的は、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合し、ＩＬ－４及びＩＬ－１３媒介活性を効率的に低減又は除去することができ、かつ同時に、非常に安定していて、多重特異性抗体フォーマットに容易に組み込むことができる、新規抗体可変ドメインを提供することである。
【0015】
本発明者らは驚くべきことに、モノクローナルウサギ抗体クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖが、ヒトＩＬ－４Ｒ並びにカニクイザルＩＬ－４Ｒに高い親和性で結合し、ＩＬ－４Ｒシグナル伝達を強力に遮断できる一方、優れた安定性を発揮することを発見した。この抗体クローンは、高い親和性でＩＬ４Ｒに結合することが確認されている広範な免疫キャンペーンから得られた限られた数のモノクローナルウサギ抗体クローンの１つである。特に、クローン４４－３４－Ｃ１０に由来するｓｃＦｖは、より低いｐＭ範囲の解離定数（ＫＤ）でヒトＩＬ－４Ｒに結合し、１ｎＭをはるかに下回るＫＤでカニクイザルＩＬ－４Ｒに結合し、ＩＣ５０がそれぞれ１．５ｎｇ／ｍｌ未満及び２．５ｎｇ／ｍｌ未満でＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を中和することができ、ＤＳＦによって測定される融解温度（Ｔｍ）が６３℃以上であり、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で４週間にわたって４℃で保存しても、タンパク質含有量とモノマー含有量が大幅に減少することがない。これは、他のクローンから産生されたｓｃＦｖのいずれも良好な薬理学的活性を示さず、同時に高い安定性を示さないという事実を考慮すると、特に驚くべきことである。これらのｓｃＦｖの薬理学的活性の最適化は、ほぼ例外なく安定性の悪化をもたらし、その逆も同様である。
【0016】
従って、クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖは、モリソンフォーマットなどの多重特異性抗体フォーマットに容易に組み込むことができる適切な構成要素である。
【0017】
従って、第１の態様において本発明は、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する、以下を含む抗体可変ドメインに関する：
ａ）配列番号４、５、６、７、８、及び９から選択される配列を有するＶＨ鎖、及び
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、及び１８から選択される配列を有するＶＬ鎖。
ａ）配列番号４、５、６、７、８、及び９から選択される配列を有するＶＨ鎖、及び
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、及び１８から選択される配列を有するＶＬ鎖。
【0018】
第２の態様において、本発明は、
ａ）本明細書で定義される１つ又は２つの抗体可変ドメイン、
ｂ）ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、を含む多重特異性抗体に関する。
ａ）本明細書で定義される１つ又は２つの抗体可変ドメイン、
ｂ）ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、を含む多重特異性抗体に関する。
【0019】
第３の態様において、本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸に関する。
【0020】
第４の態様において、本発明は、本発明の前記核酸又は２つの核酸を含む１つのベクター又は２つのベクターに関する。
【0021】
第５の態様において、本発明は、本発明の前記ベクター又は２つのベクターを含む１つの宿主細胞若しくは複数の宿主細胞に関する。
【0022】
第６の態様において、本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体を産生する方法であって、（ｉ）本発明の核酸若しくは２つの核酸、又は本発明のベクター若しくは２つのベクターを提供し、前記核酸若しくは前記２つの核酸、又は前記ベクター若しくは複数のベクターを発現させ、及び発現系から前記抗体可変ドメイン又は前記多重特異性抗体を収集する工程、又は（ｉｉ）本発明の１つの宿主細胞若しくは複数の宿主細胞を提供し、前記宿主細胞若しくは前記複数の宿主細胞を培養し、及び細胞培養物から前記抗体可変ドメイン又は前記多重特異性抗体を収集する工程を含む、上記方法に関する。
【0023】
第７の態様において、本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。
【0024】
第８の態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体に関する。
【0025】
第９の態様において、本発明は、疾患、特にヒトの疾患、より詳しくはアレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患、特に炎症性疾患、及び自己免疫性疾患の治療に使用するための本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体に関する。
【0026】
第１０の態様において、本発明は、疾患、特にヒトの疾患、より詳しくはアレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患、特に炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患の治療方法であって、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体をそれを必要とする患者に提供する工程を含む上記方法に関する。
【0027】
以下の項目に要約される本発明の態様、有利な特徴、及び好ましい実施態様は、それぞれ単独で又は組み合わせて、本発明の目的の解決にさらに貢献する。
１．ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する、以下を含む抗体可変ドメイン：
ａ）可変重鎖（ＶＨ）、
ここで可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＨＦＷ１－ＨＣＤＲ１－ＨＦＷ２－ＨＣＤＲ２－ＨＦＷ３－ＨＣＤＲ３－ＨＦＷ４を含み、ここで各ＨＦＷは重鎖フレームワーク領域を示し、各ＨＣＤＲは重鎖相補性決定領域を示し、及びここで
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１の配列を有し、
前記ＨＣＤＲ２は配列番号２の配列を有し、及び
前記ＨＣＤＲ３は配列番号３の配列を有する、
ｂ）可変軽鎖（ＶＬ）、
ここで可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＬＦＷ１－ＬＣＤＲ１－ＬＦＷ２－ＬＣＤＲ２－ＬＦＷ３－ＬＣＤＲ３－ＬＦＷ４を含み、ここで各ＬＦＷは軽鎖フレームワーク領域を示し、各ＬＣＤＲは軽鎖相補性決定領域を示し、及びここで
前記ＬＣＤＲ１は配列番号１０の配列を有し、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号１１又は１２から選択される配列を有し、及び
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号１３の配列を有する。
２．前記可変重鎖がＶＨ３鎖であり、及び／又は前記可変軽鎖がＶκ１軽鎖である、項目１に記載の抗体可変ドメイン。
３．項目１に記載の抗体可変ドメインであり、ここで
－ 前記可変重鎖はＶＨ３鎖であり、
－ ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、及びＬＦＷ３はＶκ１軽鎖サブタイプに属し、かつ
－ ＬＦＷ４は、配列番号２２～２９から選択されるヒトＶλ配列を有する。
４．項目１～３のいずれか１つに記載の抗体可変ドメインであり、ここで前記抗体可変ドメインは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、及びｓｃＡＢから、好ましくはＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びｄｓＦｖから、特にＦａｂ、ｓｃＦｖ、及びｄｓＦｖから選択される。
５．前記抗体可変ドメインが以下を含む、項目１～４のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン：
ａ）配列番号４、５、６、７、８、及び９から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一の配列を有するＶＨ鎖、及び
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７と１８から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一の配列を有するＶＬ鎖。
６．前記抗体可変ドメインがＩＬ４及びＩＬ１３のＩＬ４Ｒへの結合を遮断する、項目１～５のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン。
７．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、以下の特徴ａ．～ｆ．のうちの少なくとも２つを示す、項目１～５のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定すると、０．１～２００ｐＭの一価の解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤでヒトＩＬ-４Ｒに結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ-４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの一価ＫＤで結合し、
ｃ．マーモセット（Callithrix jacchus）ＩＬ－４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、マーモセットＩＬ－４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの１価ＫＤで結合し、
ｄ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～１．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｅ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｆ．競合ＥＬＩＳＡで測定すると、ヒトＩＬ－４のヒトＩＬ－４Ｒへの結合を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害し、
及び、ここで前記抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合、以下の特徴ｇ．～ｊ．の少なくとも１つをさらに示す：
ｇ．示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、及び、特にここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｈ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃で４週間保存した後のモノマー含有量の損失が５％未満であり、及び特に、ここで特に前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｉ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４０℃で４週間保存した後のタンパク質含量の損失が５％未満、特に４％未満、特に３％未満、特に２％未満、特に１％未満であり、及び、特にここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｊ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、５回の凍結－融解サイクル後のモノマー含有量の損失が２％未満、特に１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
８．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、少なくとも特徴ａ．、ｂ．及びｇ．を示す、項目７に記載の抗体可変ドメイン。
９．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、少なくとも特徴ａ．、ｂ．、ｄ．、ｅ．、ｇ．、及びｈ．を示し、特に少なくとも特徴ａ．、ｂ．、ｄ．、ｅ．、ｆ．、ｇ．、ｈ、及びｉ．を示す、項目７に記載の抗体可変ドメイン。
１０．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、ａ．～ｊ．のすべての特徴を示す、項目７に記載の抗体可変ドメイン。
１１．以下を含む、項目１～１０のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン：
ａ）配列番号４、５、６、７、８、及び９から選択される配列を有するＶＨ鎖、及び
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、及び１８から選択される配列を有するＶＬ鎖。
１２．以下を含む、項目１～１１のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン：
ａ）配列番号４の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１４の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｂ）配列番号４の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１７の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｃ）配列番号４の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１８の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｄ）配列番号５の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１５の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｅ）配列番号６の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１６の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｆ）配列番号７の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１４の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｇ）配列番号８の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１８の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｈ）配列番号９の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１４の配列を有するＶＬ鎖。
１３．配列番号３３～３９から選択される配列を有するｓｃＦｖ抗体である、項目１～１２のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン。
１４．以下を含む多重特異性抗体：
ａ）項目１～１３のいずれか１つに定義される１つ又は２つの抗体可変ドメイン；
ｂ）ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメイン。
１５．免疫グロブリンＦｃ領域を含まない、項目１４に記載の多重特異性抗体。
１６．多重特異性抗体が、タンデム型ｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖ダイマーｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状ダイマーｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、タンデム型トリ－ｓｃＦｖ、トリボディ（Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２）、Ｆａｂ－Ｆｖ２、トリアボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、テトラボディ、ジ－ダイアボディ、タンデム－ジ－ｓｃＦｖ、及びＭＡＴＣＨからなる群から選択されるフォーマットである、項目１５に記載の多重特異性抗体。
１７．ＣＨ１及び／又はＣＬ領域を含まない、項目１５に記載の多重特異性抗体。
１８．前記抗体が、ｓｃＤｂ-ｓｃＦｖ、トリアボディ、テトラボディ、又はＭＡＴＣＨフォーマットであり、特に、ここで前記多重特異性抗体が、ＭＡＴＣＨ又はｓｃＤｂ-ｓｃＦｖフォーマットであり、より具体的には、前記多重特異性抗体が、ＭＡＴＣＨフォーマット、より具体的にはＭＡＴＣＨ３若しくはＭＡＴＣＨ４フォーマットである、項目１７に記載の多重特異性抗体。
１９．免疫グロブリンＦｃ領域を含む、項目１４に記載の多重特異性抗体。
２０．前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧサブクラス、特にＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１及びＩｇＧ４、特にＩｇＧ４から選択される、項目１９に記載の多重特異性抗体。
２１．項目２０に記載の多重特異性抗体であって、前記多重特異性抗体のフォーマットが、二価二重特異性ＩｇＧフォーマット、三価二重特異性ＩｇＧフォーマット、及び四価二重特異性ＩｇＧフォーマットから選択され、
より具体的には、前記多重特異性抗体のフォーマットが、ＫｉＨベースのＩｇＧ；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＣＯＤＶ－ＩｇＧ及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））、さらにより詳しくはＤＶＤ－Ｉｇ及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））から選択される。上記抗体。
２２．前記多重特異性抗体のフォーマットがモリソン－Ｈフォーマット及びモリソン－Ｌフォーマットから選択される、項目２１に記載の多重特異性抗体。
２３．前記多重特異性抗体が、項目１～１３のいずれか１つに定義される２つの抗体可変ドメインと、ＩＬ－４Ｒとは異なる第２の標的に特異的に結合する２つの結合ドメインとを含む、項目１４～２２のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
２４．項目１～１３のいずれか１つの抗体可変ドメイン、又は項目１４～２３のいずれか１つの多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸。
２５．項目２４の前記核酸又は前記２つの核酸を含む１つのベクター又は２つのベクター。
２６．項目２５に記載の前記ベクター又は前記２つのベクターを含む１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞。
２７．項目１～１３のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン又は項目１４～２３の多重特異性抗体を産生する方法であって、（ｉ）項目２４に記載の前記核酸若しくは前記２つの核酸、又は項目２５に記載の前記ベクター若しくは前記２つのベクターを提供し、前記核酸若しくは前記２つの核酸、又は前記ベクター若しくは前記２つのベクターを発現させ、そして発現系から前記抗体可変ドメイン若しくは前記多重特異性抗体を収集すること、又は（ｉｉ）項目２６に記載の１つの宿主細胞若しくは複数の宿主細胞を提供し、前記宿主細胞若しくは前記複数の宿主細胞を培養し、そして前記抗体可変ドメイン若しくは前記多重特異性抗体を細胞培養物から収集することを含む、前記方法。
２８．項目１～１３のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン又は項目１４～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体と、医薬的に許容し得る塩担体とを含む、医薬組成物。
２９．医薬として使用するための、項目１～１３のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン、又は項目１４～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
３０．疾患、特にヒト疾患、より具体的にはアレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から、特に炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に使用するための、項目１～１３に記載の抗体可変ドメイン又は項目１４～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
３１．前記疾患が、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性自然蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から選択され、特に前記疾患がアトピー性皮膚炎である、項目３０に記載の使用のための抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体。
３２．疾患、特にヒトの疾患、より具体的には、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から、特に炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患の治療方法であって、項目１から１３に記載の抗体可変ドメイン、又は項目１４～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、上記方法。
３３．前記疾患が、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性自然蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から選択され、特に前記疾患がアトピー性皮膚炎である、項目３２に記載の方法。
１．ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する、以下を含む抗体可変ドメイン：
ａ）可変重鎖（ＶＨ）、
ここで可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＨＦＷ１－ＨＣＤＲ１－ＨＦＷ２－ＨＣＤＲ２－ＨＦＷ３－ＨＣＤＲ３－ＨＦＷ４を含み、ここで各ＨＦＷは重鎖フレームワーク領域を示し、各ＨＣＤＲは重鎖相補性決定領域を示し、及びここで
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１の配列を有し、
前記ＨＣＤＲ２は配列番号２の配列を有し、及び
前記ＨＣＤＲ３は配列番号３の配列を有する、
ｂ）可変軽鎖（ＶＬ）、
ここで可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＬＦＷ１－ＬＣＤＲ１－ＬＦＷ２－ＬＣＤＲ２－ＬＦＷ３－ＬＣＤＲ３－ＬＦＷ４を含み、ここで各ＬＦＷは軽鎖フレームワーク領域を示し、各ＬＣＤＲは軽鎖相補性決定領域を示し、及びここで
前記ＬＣＤＲ１は配列番号１０の配列を有し、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号１１又は１２から選択される配列を有し、及び
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号１３の配列を有する。
２．前記可変重鎖がＶＨ３鎖であり、及び／又は前記可変軽鎖がＶκ１軽鎖である、項目１に記載の抗体可変ドメイン。
３．項目１に記載の抗体可変ドメインであり、ここで
－ 前記可変重鎖はＶＨ３鎖であり、
－ ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、及びＬＦＷ３はＶκ１軽鎖サブタイプに属し、かつ
－ ＬＦＷ４は、配列番号２２～２９から選択されるヒトＶλ配列を有する。
４．項目１～３のいずれか１つに記載の抗体可変ドメインであり、ここで前記抗体可変ドメインは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、及びｓｃＡＢから、好ましくはＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びｄｓＦｖから、特にＦａｂ、ｓｃＦｖ、及びｄｓＦｖから選択される。
５．前記抗体可変ドメインが以下を含む、項目１～４のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン：
ａ）配列番号４、５、６、７、８、及び９から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一の配列を有するＶＨ鎖、及び
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７と１８から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一の配列を有するＶＬ鎖。
６．前記抗体可変ドメインがＩＬ４及びＩＬ１３のＩＬ４Ｒへの結合を遮断する、項目１～５のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン。
７．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、以下の特徴ａ．～ｆ．のうちの少なくとも２つを示す、項目１～５のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定すると、０．１～２００ｐＭの一価の解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤでヒトＩＬ-４Ｒに結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ-４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの一価ＫＤで結合し、
ｃ．マーモセット（Callithrix jacchus）ＩＬ－４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、マーモセットＩＬ－４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの１価ＫＤで結合し、
ｄ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～１．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｅ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｆ．競合ＥＬＩＳＡで測定すると、ヒトＩＬ－４のヒトＩＬ－４Ｒへの結合を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害し、
及び、ここで前記抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合、以下の特徴ｇ．～ｊ．の少なくとも１つをさらに示す：
ｇ．示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、及び、特にここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｈ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃で４週間保存した後のモノマー含有量の損失が５％未満であり、及び特に、ここで特に前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｉ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４０℃で４週間保存した後のタンパク質含量の損失が５％未満、特に４％未満、特に３％未満、特に２％未満、特に１％未満であり、及び、特にここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｊ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、５回の凍結－融解サイクル後のモノマー含有量の損失が２％未満、特に１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
８．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、少なくとも特徴ａ．、ｂ．及びｇ．を示す、項目７に記載の抗体可変ドメイン。
９．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、少なくとも特徴ａ．、ｂ．、ｄ．、ｅ．、ｇ．、及びｈ．を示し、特に少なくとも特徴ａ．、ｂ．、ｄ．、ｅ．、ｆ．、ｇ．、ｈ、及びｉ．を示す、項目７に記載の抗体可変ドメイン。
１０．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、ａ．～ｊ．のすべての特徴を示す、項目７に記載の抗体可変ドメイン。
１１．以下を含む、項目１～１０のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン：
ａ）配列番号４、５、６、７、８、及び９から選択される配列を有するＶＨ鎖、及び
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、及び１８から選択される配列を有するＶＬ鎖。
１２．以下を含む、項目１～１１のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン：
ａ）配列番号４の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１４の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｂ）配列番号４の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１７の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｃ）配列番号４の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１８の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｄ）配列番号５の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１５の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｅ）配列番号６の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１６の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｆ）配列番号７の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１４の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｇ）配列番号８の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１８の配列を有するＶＬ鎖、又は
ｈ）配列番号９の配列を有するＶＨ鎖と配列番号１４の配列を有するＶＬ鎖。
１３．配列番号３３～３９から選択される配列を有するｓｃＦｖ抗体である、項目１～１２のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン。
１４．以下を含む多重特異性抗体：
ａ）項目１～１３のいずれか１つに定義される１つ又は２つの抗体可変ドメイン；
ｂ）ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメイン。
１５．免疫グロブリンＦｃ領域を含まない、項目１４に記載の多重特異性抗体。
１６．多重特異性抗体が、タンデム型ｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖ダイマーｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状ダイマーｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、タンデム型トリ－ｓｃＦｖ、トリボディ（Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２）、Ｆａｂ－Ｆｖ２、トリアボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、テトラボディ、ジ－ダイアボディ、タンデム－ジ－ｓｃＦｖ、及びＭＡＴＣＨからなる群から選択されるフォーマットである、項目１５に記載の多重特異性抗体。
１７．ＣＨ１及び／又はＣＬ領域を含まない、項目１５に記載の多重特異性抗体。
１８．前記抗体が、ｓｃＤｂ-ｓｃＦｖ、トリアボディ、テトラボディ、又はＭＡＴＣＨフォーマットであり、特に、ここで前記多重特異性抗体が、ＭＡＴＣＨ又はｓｃＤｂ-ｓｃＦｖフォーマットであり、より具体的には、前記多重特異性抗体が、ＭＡＴＣＨフォーマット、より具体的にはＭＡＴＣＨ３若しくはＭＡＴＣＨ４フォーマットである、項目１７に記載の多重特異性抗体。
１９．免疫グロブリンＦｃ領域を含む、項目１４に記載の多重特異性抗体。
２０．前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧサブクラス、特にＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１及びＩｇＧ４、特にＩｇＧ４から選択される、項目１９に記載の多重特異性抗体。
２１．項目２０に記載の多重特異性抗体であって、前記多重特異性抗体のフォーマットが、二価二重特異性ＩｇＧフォーマット、三価二重特異性ＩｇＧフォーマット、及び四価二重特異性ＩｇＧフォーマットから選択され、
より具体的には、前記多重特異性抗体のフォーマットが、ＫｉＨベースのＩｇＧ；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＣＯＤＶ－ＩｇＧ及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））、さらにより詳しくはＤＶＤ－Ｉｇ及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））から選択される。上記抗体。
２２．前記多重特異性抗体のフォーマットがモリソン－Ｈフォーマット及びモリソン－Ｌフォーマットから選択される、項目２１に記載の多重特異性抗体。
２３．前記多重特異性抗体が、項目１～１３のいずれか１つに定義される２つの抗体可変ドメインと、ＩＬ－４Ｒとは異なる第２の標的に特異的に結合する２つの結合ドメインとを含む、項目１４～２２のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
２４．項目１～１３のいずれか１つの抗体可変ドメイン、又は項目１４～２３のいずれか１つの多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸。
２５．項目２４の前記核酸又は前記２つの核酸を含む１つのベクター又は２つのベクター。
２６．項目２５に記載の前記ベクター又は前記２つのベクターを含む１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞。
２７．項目１～１３のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン又は項目１４～２３の多重特異性抗体を産生する方法であって、（ｉ）項目２４に記載の前記核酸若しくは前記２つの核酸、又は項目２５に記載の前記ベクター若しくは前記２つのベクターを提供し、前記核酸若しくは前記２つの核酸、又は前記ベクター若しくは前記２つのベクターを発現させ、そして発現系から前記抗体可変ドメイン若しくは前記多重特異性抗体を収集すること、又は（ｉｉ）項目２６に記載の１つの宿主細胞若しくは複数の宿主細胞を提供し、前記宿主細胞若しくは前記複数の宿主細胞を培養し、そして前記抗体可変ドメイン若しくは前記多重特異性抗体を細胞培養物から収集することを含む、前記方法。
２８．項目１～１３のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン又は項目１４～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体と、医薬的に許容し得る塩担体とを含む、医薬組成物。
２９．医薬として使用するための、項目１～１３のいずれか１つに記載の抗体可変ドメイン、又は項目１４～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
３０．疾患、特にヒト疾患、より具体的にはアレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から、特に炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に使用するための、項目１～１３に記載の抗体可変ドメイン又は項目１４～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
３１．前記疾患が、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性自然蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から選択され、特に前記疾患がアトピー性皮膚炎である、項目３０に記載の使用のための抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体。
３２．疾患、特にヒトの疾患、より具体的には、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から、特に炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患の治療方法であって、項目１から１３に記載の抗体可変ドメイン、又は項目１４～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、上記方法。
３３．前記疾患が、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性自然蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から選択され、特に前記疾患がアトピー性皮膚炎である、項目３２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【発明を実施するための形態】
【0033】
発明の詳細な説明
既知の治療用抗ＩＬ－４Ｒ抗体は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患に罹患している患者においては、たとえこれらの疾患がＩＬ－４Ｒシグナリングの不均衡に関連している場合であっても、有効性の欠如及び低～中等度の応答率によって制限されることが多い。これらの治療法は、これらの疾患に関連することが多い破壊的な症状、例えばかゆみにも直接対処するものではない。従って、前記アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患を抱えて生きている患者にとって、追加のＩＬ－４Ｒベースの治療選択肢が非常に必要とされている。
既知の治療用抗ＩＬ－４Ｒ抗体は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患に罹患している患者においては、たとえこれらの疾患がＩＬ－４Ｒシグナリングの不均衡に関連している場合であっても、有効性の欠如及び低～中等度の応答率によって制限されることが多い。これらの治療法は、これらの疾患に関連することが多い破壊的な症状、例えばかゆみにも直接対処するものではない。従って、前記アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患を抱えて生きている患者にとって、追加のＩＬ－４Ｒベースの治療選択肢が非常に必要とされている。
【0034】
本発明は、特定のＶＬ鎖及びＶＨ鎖を含む新規な抗ＩＬ－４Ｒ抗体可変ドメインを提供する。前記可変ドメインは、モノクローナルウサギ抗体クローン４４－３４－Ｃ１０に基づく。このクローンは、広範な免疫キャンペーンで同定され、高い親和性でＩＬ－４Ｒに結合することが判明した限られた数のウサギモノクローナル抗体から選択された。前記モノクローナルウサギ抗体クローン４４－３４－Ｃ１０由来のｓｃＦｖは、より低いｐＭ範囲の解離定数（ＫＤ）でヒトＩＬ－４Ｒに結合し、１ｎＭ未満のＫＤでカニクイザルＩＬ－４Ｒに結合し、ＩＣ５０がそれぞれ１．５ｎｇ／ｍｌ未満及び２．５ｎｇ／ｍｌ未満で、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を中和することができ、ＤＳＦによって測定される融解温度（Ｔｍ）が６３℃以上であり、及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度、４℃で４週間にわたって、タンパク質含有量やモノマー含有量が大幅に減少することなく、保存することができる。
【0035】
本発明者らの知る限り、従来技術にはそのような有利な特性を有する抗ＩＬ－４Ｒ抗体可変ドメインは存在しない。
【0036】
本発明の抗体可変ドメインは、さらにＩＬ－３１を標的とする多重特異性抗体フォーマットにうまく組み込むことができた。これらの抗ＩＬ－４Ｒ×ＩＬ－３１多重特異性抗体は、高い親和性でＩＬ－４Ｒに結合し、ＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達を強力に阻害する一方、１００ｍｇ／ｍｌをはるかに超える抗体濃度で、非常に有利な生物物理学的特性、特に優れた調製及び保存安定性を示す。これは、本発明の抗体可変ドメインが多重特異性抗体フォーマットに組み込まれた場合に、有利な生物学的及び生物物理学的特性も提供することを証明している。
【0037】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0038】
「含む（comprising）」及び「含む（including）」という用語は、本明細書では、他に明記されない限り、無制限かつ非限定的な意味で使用される。従って、このような後者の実施態様に関して、用語「含む」は、より狭い用語「からなる」を含む。
【0039】
本発明の説明の文脈（特に特許請求の範囲の文脈）における「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、及び同様の言及は、本明細書で別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾していない限り、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈されるべきである。例えば、「細胞」という用語は、複数の細胞を含み、それらの混合物も含む。化合物、塩などに複数形が使用される場合、これは単一の化合物、塩なども意味するものとみなされる。
【0040】
１つの態様において、本発明は
ａ）配列番号４、５、６、７、８、及び９から選択される配列を有するＶＨ鎖、及び
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、及び１８から選択される配列を有するＶＬ鎖を含む、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する抗体可変ドメインに関する。
ａ）配列番号４、５、６、７、８、及び９から選択される配列を有するＶＨ鎖、及び
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、及び１８から選択される配列を有するＶＬ鎖を含む、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する抗体可変ドメインに関する。
【0041】
本明細書で使用される「抗体」などの用語は、抗体全体又はその１本鎖；及び任意の抗原結合可変ドメイン（すなわち「抗原結合部分」）又はその単鎖；及び抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域、又はＶＬ領域を含む分子（特に限定されるものではないが、多重特異性抗体を含む）を含む。天然に存在する「全抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインで構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬで構成されている。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に隣接した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分化できる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成されている。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主の組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【0042】
本明細書で使用される「抗体可変ドメイン」という用語は、所定の抗原（例えばＩＬ－４Ｒ）に特異的に結合する能力を有する無傷の抗体の１部又はそれ以上の部分を指す。これは、無傷の抗体又はその一本鎖の任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）、及び抗体のＣＤＲ、ＶＨ領域又はＶＬ領域を含む分子であり得る。具体的には、本発明の多重特異性抗体の場合、本明細書で使用される「抗体可変ドメイン」という用語は、Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片；抗体の単一アームのＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖ断片（Ｆｖ）；ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）；一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；及びそれに融合された追加の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＡＢ）を指す。好ましくは、本発明の抗体可変ドメインは、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、及びｓｃＦｖ断片から選択される。より好ましくは、本発明の抗体可変ドメインは、Ｆａｂ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、及びｓｃＦｖ断片から選択される。特定の実施態様において、本発明の抗体可変ドメインはＦａｂ断片である。他の特定の実施態様において、本発明の抗体可変ドメインは単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。他の特定の実施態様において、ｓｃＦｖ断片のＶＬドメイン及びＶＨドメインは、ドメイン間ジスルフィド結合によって安定化され、特に前記ＶＨドメインは、位置５１（ＡＨｏナンバリング）に単一のシステイン残基を含み、及び前記ＶＬドメインは、位置１４１（ＡＨｏ番号付け）に単一のシステイン残基を含む。
【0043】
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat” 番号付けスキーム)； Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (“Chothia” 番号付けスキーム); ImMunoGenTics (IMGT) 番号付け (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)) (“IMGT” 番号付けスキーム)；及びHonegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670 (“AHo” 番号付け)によって記載されたスキームを含む多くの周知のスキームのいずれかを使用して決定される境界を有するアミノ酸配列を指す。例えば、古典的なフォーマットの場合、Kabatでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基は、３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Chothiaでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸は、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶＬのアミノ酸残基は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。KabatとChothiaの両方のＣＤＲ定義を組み合わせると、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬのアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）で構成される。ＩＭＧＴでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は、約２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５１～５７（ＨＣＤＲ２）、及び９３～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は、約２７～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）（「Kabat」に基づく番号付け）と番号付けされている。ＩＭＧＴでは、抗体のＣＤＲは、プログラム IMGT/DomainGapAlign を使用してを決定することができる。
【0044】
本発明の文脈では、他に明記されない限り、Honegger&Pluckthunによって提案された番号付けシステム（「ＡＨｏ」）が使用される（Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670）。特に、以下の残基は、ＡＨｏ番号付けスキームに従ってＣＤＲとして定義される：ＬＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１とも呼ばれる）：Ｌ２４～Ｌ４２；ＬＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２とも呼ばれる）：Ｌ５８～Ｌ７２；ＬＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３とも呼ばれる）：Ｌ１０７～Ｌ１３８；ＨＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１とも呼ばれる）：Ｈ２７～Ｈ４２；ＨＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２とも呼ばれる）：Ｈ５７～Ｈ７６；ＨＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３とも呼ばれる）：Ｈ１０８～Ｈ１３８。明確にするために、Honegger & Pluckthunによる番号付けシステムでは、異なるＶＨサブファミリーとＶＬサブファミリーの両方、特にＣＤＲにある天然に存在する抗体に見られる長さの多様性が考慮されており、配列中のギャップが提供されている。従って、特定の抗体可変ドメインでは、通常１位～１４９位までの必ずしもすべてがアミノ酸残基によって占められるわけではない。
【0045】
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、個々の抗体が１つの抗原決定基と反応するが、異なる抗原決定基とは反応しない能力を指す。本明細書で使用される「に特異的に結合する」又は「に特異的である」という用語は、標的と抗体との結合などの測定可能でかつ再現可能な相互作用を指し、これは、生体分子を含む分子の不均一な集団の存在下での標的の存在を決定するものである。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも高い親和性、結合力で、より容易に、及び／又はより長い持続時間で、この標的に結合する抗体である。最も一般的なフォーマットでは（定義された参照が言及されていない場合）、「特異的結合」とは、例えば当技術分野で公知の特異性アッセイ方法に従って測定される、目的の標的と無関係の分子とを区別する抗体の能力を指す。このような方法には、特に限定されるものではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）試験、及びペプチドスキャンが含まれる。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。スコア付けは、標準的な発色（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼを用いた２次抗体、及び過酸化水素を用いたテトラメチルベンジジン）によって実施することができる。特定のウェル内の反応は、例えば４５０ｎｍでの光学密度によってスコア化される。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は約０．１ＯＤである。典型的な陽性反応は約１ＯＤである。これは、正のスコアと負のスコアの比率が１０倍以上になる可能性があることを意味する。さらなる例では、バックグラウンドとシグナルとの少なくとも１０倍、特に少なくとも１００倍の差が特異的結合を示すＳＰＲアッセイを実施することができる。通常、結合特異性の決定は、単一の参照分子ではなく、粉乳、トランスフェリンなどの約３～５個の無関係な分子のセットを使用して実施される。
【0046】
さらなる態様において、本発明は、以下を含む多重特異性抗体に関する：
ａ）本明細書で定義される１つ又は２つの抗体可変ドメイン；
ｂ）ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、特に、ここで前記少なくとも１つの結合ドメインは、ｈＳＡ－ＢＤ及び／又はＩＬ３１－ＢＤである。
ａ）本明細書で定義される１つ又は２つの抗体可変ドメイン；
ｂ）ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、特に、ここで前記少なくとも１つの結合ドメインは、ｈＳＡ－ＢＤ及び／又はＩＬ３１－ＢＤである。
【0047】
特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は免疫グロブリンＦｃ領域を含まない。
【0048】
これらの特定の実施態様において、前記多重特異性抗体は、好ましくは、タンデム型ｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖ダイマーｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状ダイマーｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、タンデム型トリ－ｓｃＦｖ、トリボディ（Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２）、Ｆａｂ－Ｆｖ２、トリアボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、テトラボディ、ジ－ダイアボディ、タンデム－ジ－ｓｃＦｖ、及びＭＡＴＣＨからなる群から選択されるフォーマットである（国際公開第２０１６／０２０２４５７号；Egan T., et al., MABS 9 (2017) 68-84に記載されている）。特に、本発明の多重特異性抗体はＭＡＴＣＨフォーマットである。より具体的には、本発明の多重特異性抗体は、ＭＡＴＣＨ３又はＭＡＴＣＨ４フォーマットである。
【0049】
本明細書中で使用される「免疫グロブリンＦｃ領域」又は「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域、すなわち重鎖定常領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを定義するために使用される。「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変種Ｆｃ領域、すなわち、特定の所望の特性を示すように工学操作されたＦｃ領域、例えば改変されたＦｃ受容体結合機能及び／又は低減又は抑制されたＦａｂアーム交換などを含む。このような工学操作されたＦｃ領域の例は、ノブイントゥホール（ＫｉＨ）技術である（例えば、Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-21 (1996) and Spiess et al., J Biol Chem. 288(37):26583-93 (2013)Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-21 (1996) and Spiess et al., J Biol Chem. 288(37):26583-93 (2013)を参照）。天然配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。特に、ＦｃＲは天然配列のヒトＦｃＲであり、これはＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体のアレレ変種及び選択的スプライス形態を含む）、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含むＦｃγＲＩＩ受容体を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 5:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capet et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)で概説されている。将来同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語には、胎児への母親のＩｇＧの輸送を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる。Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)．ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ghetie and Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. TJI (8): 6213-6 (2004); 国際公開第２００４／９２２１９ 号(Hinton et al)）。インビボでのＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばトランスジェニックマウス、又はヒトＦｃＲｎを発現するトランスフェクトされたヒト細胞株、又は変種Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与される霊長類でアッセイすることができる。国際公開第２００４／４２０７２号（Presta）は、ＦｃＲへの結合を改善又は減少させる抗体変種を記載している。例えば、Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 参照。
【0050】
他の特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は免疫グロブリンＦｃ領域を含む。
【0051】
さらに特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体はＩｇＧ領域を含む。
【0052】
本明細書で使用される「ＩｇＧ領域」という用語は、免疫グロブリンＧの重鎖及び軽鎖、すなわち上記で定義したＦｃ領域、並びにＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ領域を指す。「ＩｇＧ領域」という用語は、天然配列ＩｇＧ領域、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、並びに、例えばＦｃ領域について上記で定義した特性などの特定の所望の特性を示す工学作成されたＩｇＧ領域を含む。
【0053】
特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体に含まれる免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧサブクラスのＦｃ領域から、特にＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１及びＩｇＧ４のＦｃ領域から、特にＩｇＧ４のＦｃ領域から選択される。
【0054】
本明細書で使用される抗体の「結合ドメイン」、「その抗原結合断片」、「抗原結合部分」などの用語は、特定の抗原に特異的に結合する能力を保持する無傷の抗体の１つ又はそれ以上の部分を指す。抗体の抗原結合機能は、無傷の抗体の断片によって行われる。具体的には、本発明の多重特異性抗体の場合、本明細書で使用される「結合ドメイン」、「その抗原結合断片」、「抗原結合部分」などの用語は、Ｆａｂ断片、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる１価の断片；抗体の単一アームのＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖ断片；ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）；及び１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦＶ）を指す。好ましくは、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、互いに独立して、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）から選択される。特定の実施態様において、本発明の抗体の結合ドメインは、互いに独立して、Ｆａｂ断片及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）から選択される。他の特定の実施態様において、ｓｃＦｖ断片のＶＬドメイン及びＶＨドメインは、ドメイン間ジスルフィド結合によって安定化され、特に、前記ＶＨドメインは、位置５１（ＡＨｏ番号付け）に単一のシステイン残基を含み、及び前記ＶＬドメインは、位置１４１（ＡＨｏ番号付け）に単一のシステイン残基を含む。
【0055】
適切には、本発明の抗体可変ドメインは単離された可変ドメインである。同様に、本発明の多重特異性抗体は単離された抗体である。本明細書で使用される「単離された可変ドメイン」又は「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の可変ドメイン又は他の抗体を実質的に含まない可変ドメイン又は抗体を指す（例えば、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する単離された抗体可変ドメインは、ＩＬ－４Ｒ以外の抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインを実質的に含まない）。さらに、単離された抗体可変ドメイン又は単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない可能性がある。
【0056】
適切には、本発明の抗体可変ドメイン及び多重特異性抗体はモノクローナル抗体可変ドメイン及び抗体である。本明細書で使用される「モノクローナル抗体可変ドメイン」又は「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか又は同じ遺伝子源に由来する可変ドメイン又は抗体を指す。モノクローナル可変ドメイン又は抗体は、特定のエピトープに対する結合特異性及び親和性、又は複数の特定のエピトープに対する複数の結合特異性及び複数の親和性を示す。
【0057】
本発明の抗体可変ドメイン及び多重特異性抗体には、特に限定されるものではないが、キメラ抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体可変ドメイン及び抗体が含まれる。
【0058】
本明細書で使用される「キメラ抗体可変ドメイン」という用語は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なるか又は改変されたクラス、エフェクター機能、及び／又は種の定常領域に連結されるように、定常領域又はその一部が改変、置換、又は交換されており、又は（ｂ）可変領域又はその一部が、異なる又は改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換、又は交換されている、抗体分子又は抗体可変ドメインを指す。例えばマウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンの定常領域で置き換えることによって修飾することができる。ヒト定常領域による置換のために、キメラ抗体は、抗原を認識する特異性を保持することができる一方、元のマウス抗体と比較してヒトにおける抗原性が低下している。
【0059】
本明細書で使用される「ヒト抗体」又は「ヒト抗体可変ドメイン」という用語は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体又は抗体可変ドメインを含むことを意図する。さらに、抗体又は抗体可変ドメインが定常領域を含む場合、その定常領域もそのようなヒト配列、例えばヒト生殖系列配列又はヒト生殖系列配列の変異バージョンに由来する。本発明のヒト抗体及び抗体可変ドメインは、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの部位特異的突然変異誘発又はインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。ヒト抗体又は抗体可変ドメインのこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体又は抗体可変ドメインを特に除外する。ヒト抗体及び抗体可変ドメインは、当該分野で公知の様々な技術、例えばファージ表示ライブラリー（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1992); Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581 (1991)）を使用して生成することができる。またヒトモノクローナル抗体及びヒトモノクローナル抗体可変ドメインの調製には、Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al, J. Immunol, 147(l):86-95 (1991)に記載の方法も利用することができる。また、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)も参照されたい。ヒト抗体及びヒト抗体可変ドメインは、抗原攻撃に応答してそのような抗体及び抗体可変ドメインを産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物、例えば免疫化されたゼノマウスに、抗原を投与することによって調製することができる（例えば、XENOMOUSE（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号を参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体については、例えば Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557- 3562 (2006) を参照されたい。
【0060】
本明細書で使用される「ヒト化」抗体又は「ヒト化」抗体可変ドメインという用語は、非ヒト抗体又は抗体可変ドメインの反応性を保持するが、ヒトにおいて免疫原性が低い抗体又は抗体可変ドメインを指す。これは、例えば非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体又は抗体可変ドメインの残りの部分をヒト対応物（すなわち、定常領域、並びに可変領域のフレームワーク部分）で置き換えることによって達成できる。さらなるフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列内で、並びに別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列内で行うことができる。本発明のヒト化抗体及び抗体可変ドメインは、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異、あるいは安定性若しくは製造を促進するための保存的置換によって導入された突然変異）を含み得る。例えば、モリソン et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; モリソン and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 及び Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994を参照。人間工学技術の他の例としては、特に限定されるものではないが、米国特許第５，７６６，８８６号に開示されているＸｏｍａ技術が挙げられる。
【0061】
本明細書で使用される「組換えヒト化抗体」又は「組換えヒト化抗体可変ドメイン」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されたすべてのヒト抗体及びヒト抗体可変ドメイン、例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体可変ドメインを例えばトランスフェクトーマ（transfectoma）から発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体及びヒト抗体可変ドメイン、及びヒト免疫グロブリン遺伝子、配列のすべて又は一部を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含むその他の手段によって調製、発現、作成、又は単離された抗体及びヒト抗体可変ドメインを含む。
【0062】
好ましくは、本発明の抗体可変ドメイン及び多重特異性抗体はヒト化されている。より好ましくは、本発明の抗体可変ドメイン及び多重特異性抗体はヒト化されており、ウサギ由来のＣＤＲを含む。
【0063】
本明細書で使用される「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つ又はそれ以上の異なる標的（例えばＩＬ－４ＲとＩＬ－３１）上の２つ又はそれ以上の異なるエピトープに結合する抗体を指す。好ましくは、本発明の多重特異性抗体は二重特異性である。本明細書で使用される「二重特異性抗体」という用語は、２つの異なる標的（例えば、ＩＬ－４ＲとＩＬ－３１）上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。
【0064】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸や糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループで構成され、通常、特定の３次元構造特性並びに特定の電荷特性を有する。「立体構造」エピトープと「線状」エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
【0065】
本明細書で使用される「立体構造エピトープ」という用語は、ポリペプチド鎖が折りたたまれて天然タンパク質を形成するときに、表面で集合する抗原のアミノ酸残基を指す。
【0066】
「線状エピトープ」という用語は、タンパク質と相互作用分子（抗体など）とのすべての相互作用点がタンパク質の１次アミノ酸配列に沿って直線的に（連続的に）存在するエピトープを指す。
【0067】
本明細書で使用される「認識する」という用語は、その立体構造エピトープを見つけてそれと相互作用する（例えば、結合する）抗体又は抗体可変ドメインを指す。
【0068】
適切には、本発明の多重特異性抗体は、本明細書で定義される、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つ又は２つの抗体可変ドメインを含む。特に、本発明の多重特異性抗体は、明細書で定義される、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する２つの抗体可変ドメインを含む。
【0069】
「ＩＬ－４Ｒ」という用語は、特にＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ２４３９４を有するヒトＩＬ－４Ｒを指す。本発明の抗体可変ドメインはヒトＩＬ－４Ｒを標的とする。特に本発明の抗体可変ドメインは、ヒト及びカニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ－４Ｒを標的とする。より詳しくは、本発明の抗体可変ドメインは、ヒト、カニクイザル（Macaca fascicularis）、及びマーモセット（Callithrix jacchus）ＩＬ－４Ｒを標的とする。
【0070】
本発明の抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合、以下のパラメータによって特徴付けられる：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定すると、ヒトＩＬ－４Ｒに、０．１～２００ｐＭの１価の解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤで結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ－４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの１価ＫＤで結合し、
ｃ．示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定すると、ヒトＩＬ－４Ｒに、０．１～２００ｐＭの１価の解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤで結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ－４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの１価ＫＤで結合し、
ｃ．示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
【0071】
具体的な実施態様において、本発明の抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合、以下のパラメータによって特徴付けられる：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定すると、ヒトＩＬ-４Ｒに、０．１～２００ｐＭの一価解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤで結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ-４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの一価ＫＤで結合し、
ｃ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～１．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｄ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｅ．示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｆ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃で４週間保存した後のモノマー含有量の損失が５％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定すると、ヒトＩＬ-４Ｒに、０．１～２００ｐＭの一価解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤで結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ-４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの一価ＫＤで結合し、
ｃ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～１．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｄ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｅ．示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｆ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃で４週間保存した後のモノマー含有量の損失が５％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
【0072】
より具体的なな実施態様において、本発明の抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合、以下のパラメータによって特徴付けられる：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定すると、ヒトＩＬ-４Ｒに、０．１～２００ｐＭの一価の解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤで結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ-４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの一価ＫＤで結合し、
ｃ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～１．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｄ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｅ．競合ＥＬＩＳＡで測定すると、ヒトＩＬ－４のヒトＩＬ－４Ｒへの結合を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害し、
ｆ．示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｇ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃で４週間保存した後のモノマー含有量の損失が５％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｈ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４０℃で４週間保存した後のタンパク質含量の損失が５％未満、特に４％未満、特に３％未満、特に２％未満、特に１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定すると、ヒトＩＬ-４Ｒに、０．１～２００ｐＭの一価の解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤで結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ-４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの一価ＫＤで結合し、
ｃ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～１．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｄ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｅ．競合ＥＬＩＳＡで測定すると、ヒトＩＬ－４のヒトＩＬ－４Ｒへの結合を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害し、
ｆ．示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｇ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃で４週間保存した後のモノマー含有量の損失が５％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｈ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４０℃で４週間保存した後のタンパク質含量の損失が５％未満、特に４％未満、特に３％未満、特に２％未満、特に１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
【0073】
より具体的なな実施態様において、本発明の抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合、以下のパラメータによって特徴付けられる：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定すると、ヒトＩＬ-４Ｒに、０．１～２００ｐＭの一価の解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤで結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ-４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの一価ＫＤで結合し、
ｃ．マーモセット（Callithrix jacchus）ＩＬ－４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、マーモセットＩＬ－４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの１価ＫＤで結合し、
ｄ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～１．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｅ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｆ．競合ＥＬＩＳＡで測定すると、ヒトＩＬ－４のヒトＩＬ－４Ｒへの結合を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害し、
ｇ．示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｈ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃で４週間保存した後のモノマー含有量の損失が５％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｉ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４０℃で４週間保存した後のタンパク質含量の損失が５％未満、特に４％未満、特に３％未満、特に２％未満、特に１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｊ．５回の凍結融解サイクル後、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、モノマー含有量の損失が２％未満、特に１％未満であり、及び特に、前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定すると、ヒトＩＬ-４Ｒに、０．１～２００ｐＭの一価の解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤで結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ-４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの一価ＫＤで結合し、
ｃ．マーモセット（Callithrix jacchus）ＩＬ－４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、マーモセットＩＬ－４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの１価ＫＤで結合し、
ｄ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～１．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｅ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、
ｆ．競合ＥＬＩＳＡで測定すると、ヒトＩＬ－４のヒトＩＬ－４Ｒへの結合を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害し、
ｇ．示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｈ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃で４週間保存した後のモノマー含有量の損失が５％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｉ．前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４０℃で４週間保存した後のタンパク質含量の損失が５％未満、特に４％未満、特に３％未満、特に２％未満、特に１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｊ．５回の凍結融解サイクル後、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、モノマー含有量の損失が２％未満、特に１％未満であり、及び特に、前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
【0074】
本明細書で使用される「ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞」又は「ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ」という用語は、ＮＦ－κＢ転写因子によって誘導されるプロモーターの制御下で、最適化された分泌型胎児性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子でトランスフェクトされかつ安定して発現される、市販のヒト胎児性腎細胞を指す。培地中に放出されたＳＥＡＰタンパク質のレベルは、通常、ＮＦ－κＢ活性化の尺度として使用される。
【0075】
本明細書で使用される「親和性」という用語は、単一の抗原性部位における抗体又は抗体可変ドメインと抗原との相互作用の強さを指す。各抗原性部位内では、抗体又は抗体可変ドメイン「アーム」の可変領域が、弱い非共有結合力を介して多くの部位で抗原と相互作用する。相互作用が多ければ多いほど、親和性は強くなる。
【0076】
「結合親和性」は、一般に分子（例えば、抗体又は抗体可変ドメイン）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原、又はより詳しくは抗原上のエピトープ又は抗原）との非共有結合性相互作用の総和の強さを指す。他に明記されない限り、本明細書で使用される「結合親和性」、「に結合する（bind to）」、「に結合する（binds to）」、又は「に結合する（binding to）」は、結合対のメンバー（例えば、抗体可変ドメインと抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体及び抗体可変ドメインは一般に抗原との結合が遅く、容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般に抗原とより速く結合し、結合状態が長く続く傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で知られており、そのいずれも本発明の目的に使用することができる。結合親和性、すなわち結合強度を測定するための具体的な例示的な実施態様を以下に記載する。
【0077】
本明細書中で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」、「Ｋａ」又は「Ｋｏｎ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことを意図しており、一方、本明細書中で使用される「Ｋｄｉｓ」、「Ｋｄ」又は「Ｋｏｆｆ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。１つの実施態様において、本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）数で表される解離定数を指すことを意図している。本発明による「ＫＤ」又は「ＫＤ値」又は「ＫＤ」又は「ＫＤ値」は、１つの実施態様において、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。
【0078】
組換えヒトＩＬ－４Ｒ、組換えカニクイザルＩＬ－４Ｒ、及び組換えマーモセットＩＬ－４Ｒに対する親和性は、段落[0197]～[0199]（ｓｃＦｖ）及び[238]（多重特異性分子）に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定によって測定された。
【0079】
本発明の抗体可変ドメインは、ＩＬ－４Ｒの拮抗剤として作用する。言い換えれば、本発明の抗体可変ドメインは、ＩＬ－４Ｒシグナル伝達の阻害剤である。本明細書で使用される「遮断剤」又は「阻害剤」又は「拮抗剤」という用語は、結合する抗原の生物学的活性を阻害又は低下させる抗体又は抗体可変ドメインを指す。本発明の抗体可変ドメインはＩＬ－４Ｒに結合し、それによってＩＬ－４のＩＬ－４Ｒへの結合、特にＩＬ－４及びＩＬ－１３の両方のＩＬ－４Ｒへの結合を遮断し、これによりＩＬ－４Ｒ機能が低下する。
【0080】
ＤＳＦは既に記載されている（Egan, et al., MAbs, 9(1) (2017), 68-84; Niesen, et al., Nature Protocols, 2(9) (2007) 2212-2221）。ｓｃＦｖ構築物の熱アンフォールディングの遷移の中点は、蛍光色素SYPRO（登録商標）オレンジを使用する示差走査蛍光法によって決定される（Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840を参照）。リン酸－クエン酸緩衝液（ｐＨ６．４）中の試料は、最終タンパク質濃度５０μｇ／ｍｌで調製され、総量１００μｌ中に最終濃度５ｘSYPRO（登録商標）オレンジが含まれる。調製した試料２５μlを、白壁のＡＢ遺伝子ＰＣＲプレートに三重で加える。このアッセイは、サーマルサイクラーとして使用されるｑＰＣＲマシンで実施され、ソフトウェアのカスタム色素較正ルーチンを使用して蛍光発光が検出される。試験試料を含むＰＣＲプレートを２５℃から９６℃まで１℃ずつ昇温し、各温度上昇後に３０秒の一時停止を行う。総アッセイ時間は約２時間である。Ｔｍは、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍによって、曲線の変曲点を計算する数学的２次導関数法を使用して計算される。報告されるＴｍは３回の測定の平均である。
【0081】
モノマー含有量の損失は、ＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムの曲線下面積計算によって決定される。ＳＥ－ＨＰＬＣは、米国薬局方（ＵＳＰ）、第６２１章に概要が記載されている固体固定相と液体移動相に基づく分離技術である。この方法は、疎水性固定相と水性移動相を利用して、分子のサイズと形状に基づいて分子を分離する。分子の分離は、特定のカラムの空隙容積（Ｖ０）と総浸透容積（ＶＴ）の間で起きる。ＳＥ－ＨＰＬＣによる測定は、自動試料注入と２８０ｎｍの検出波長に設定されたＵＶ検出器とを備えたChromaster ＨＰＬＣシステム（Hitachi High-Technologies Corporation）で行われる。この装置は、結果のクロマトグラムの分析もサポートするソフトウェアEZChrom Elite（Agilent Technologies、バージョン３．３．２ＳＰ２）によって制御される。タンパク質試料は遠心分離によって清澄にされ、オートサンプラー内で４～６℃の温度に保たれた後、注入される。ｓｃＦｖ試料の分析には、カラムShodex KW403-4F（Showa Denko Inc.、＃Ｆ６９８９２０２）を標準化緩衝化生理食塩水移動相（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、３００ｍＭ塩化ナトリウム）を用いて推奨流量０．３５ｍｌ／分で使用される。１注入あたりの標的試料の量は５μｇであった。試料は２８０ｎｍの波長でＵＶ検出器によって検出され、データは適切なソフトウェアスイートによって記録される。得られたクロマトグラムは、Ｖ０～ＶＴの範囲で分析され、それにより、溶出時間が１０分を超えるマトリックス関連ピークが除外される。
【0082】
適切には、本発明の抗体可変ドメインは、本開示で提供される結合ドメインである。これらは、ウサギ抗体クローン４４－３４－Ｃ１０に由来し、特に限定されるものではないが、その配列が表１に列挙されているヒト化抗体可変ドメインが含まれる。
【0083】
「多価抗体」という用語は、複数の価数を有する単一の結合分子を指し、「価数」は、標的分子上のエピトープに結合する抗原結合部分の数として記載される。従って、単一の結合分子は、対応する抗原結合部分の複数のコピーの存在により、標的分子上の複数の結合部位及び／又は複数の標的分子に結合することができる。多価抗体の例としては、特に限定されるものではないが、２価抗体、３価抗体、４価抗体、５価抗体、６価抗体などが挙げられる。
【0084】
本明細書で使用される「１価抗体」という用語は、単一の標的分子、より詳しくは標的分子上の単一のエピトープに結合する抗体を指す。また、本明細書で使用される「結合ドメイン」又は「１価の結合ドメイン」という用語は、標的分子上の単一のエピトープに結合する結合ドメインを指す。
【0085】
特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、本明細書で定義される、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つの抗体可変ドメイン、及びＩＬ－４Ｒとは異なる標的に結合する１つの結合ドメインを含み、すなわち本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－４Ｒとは異なる標的の両方に関して１価である。
【0086】
さらに特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、本明細書で定義される、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つの抗体可変ドメイン、及び同じ結合特異性を有し、ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に結合する１つの結合ドメインを含み、すなわち本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ－４Ｒ特異性については１価であり、ＩＬ－４Ｒとは異なる標的については２価である。
【0087】
さらに特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、本明細書で定義される、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つの抗体可変ドメイン、及びＩＬ－４Ｒとは異なる標的に結合する１つの結合ドメインを含み、すなわち本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ－４Ｒ特異性については２価であり、ＩＬ－４Ｒとは異なる標的については１価である。
【0088】
好適な実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、本明細書で定義される、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する２つの抗体可変ドメイン、及び同じ結合特異性を有し、ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する２つの結合ドメインを含み、すなわち本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ－４Ｒ特異性については２価であり、ＩＬ－４Ｒとは異なる標的については２価である。
【0089】
本発明の多重特異性抗体が２つの結合ドメインを含み、これらが同じ結合特異性を有し、ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する場合、前記２つの結合ドメインは、前記標的分子上の同じエピトープ若しくは異なるエピトープに結合する。好ましくは、前記２つの結合ドメインは、標的分子の同じエピトープに結合する。
【0090】
本明細書で使用される「同じエピトープ」という用語は、複数の抗体に特異的に結合することができるタンパク質上の個々のタンパク質決定基を指し、ここで、その個々のタンパク質決定基は同一であり、すなわち前記抗体のそれぞれについて同一の３次元構造特性並びに同一の電荷特性を有するアミノ酸又は糖側鎖のような分子の、同一の化学的に活性な表面グループからなる。
【0091】
特定のタンパク質標的に関連して本明細書で使用される「異なるエピトープ」という用語は、それぞれが異なる抗体に特異的に結合することができるタンパク質上の個々のタンパク質決定基を指し、ここでこれらの個々のタンパク質決定基は、異なる抗体に対して同一ではなく、すなわち異なる３次元構造特性並びに異なる電荷特性を有するアミノ酸又は糖側鎖のような分子の、同一でない化学的に活性な表面グループから構成される。これらの異なるエピトープは、重複している場合もあれば、重複していない場合もある。
【0092】
特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は二重特異性及び２価である。
【0093】
さらに特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は二重特異性及び３価である。
【0094】
好ましくは、本発明の多重特異性抗体は二重特異性及び４価であり、すなわちＩＬ－４Ｒについては２価、及びＩＬ－４Ｒと異なる標的については２価である。
【0095】
特定の態様において、本発明は、以下を含む多重特異性抗体に関する：
ａ）本明細書に記載の２つの抗体可変ドメイン；
ｂ）ＩＬ－４Ｒと異なる標的に対して同じ結合特異性を有し、特異的に結合する２つの結合ドメインであり、特に、ここで前記結合ドメインはｈＳＡ－ＢＤ又はＩＬ４Ｒ－ＢＤであり、
ここで、前記多重特異性抗体はＩｇＧ領域を含む。
ａ）本明細書に記載の２つの抗体可変ドメイン；
ｂ）ＩＬ－４Ｒと異なる標的に対して同じ結合特異性を有し、特異的に結合する２つの結合ドメインであり、特に、ここで前記結合ドメインはｈＳＡ－ＢＤ又はＩＬ４Ｒ－ＢＤであり、
ここで、前記多重特異性抗体はＩｇＧ領域を含む。
【0096】
本発明で使用される他の可変ドメインは、変異しているが、ＣＤＲ領域において、表１に記載の配列に示されるＣＤＲ領域と、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むが、ただし、そのような他の可変ドメインは段落[0070]、及び任意選択的に段落[0071]～[0073]の機能的特徴を示す。本発明で使用される他の可変ドメインは、変異アミノ酸配列を含み、ここで、表１に記載の配列に示されているＣＤＲ領域と比較すると、１、２、３、４、又は５個以下のアミノ酸はＣＤＲ領域内で変異しているが、ただし、そのような他の可変ドメインは段落[0070]、及び任意選択的に段落[0071]～[0073]の機能的特徴を示す。
【0097】
適切には、本発明の結合ドメインのＶＨドメインは、ＶＨ３又はＶＨ４ファミリーに属する。１つの実施態様において、本発明で使用される結合ドメインは、ＶＨ３ファミリーに属するＶＨドメインを含む。本発明の文脈において、「ＶＨｘファミリー（又はＶＬｘファミリー）に属する」という用語は、フレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ３が前記ＶＨｘファミリー（又はそれぞれＶＬｘ）に対して最も高い相同性を示すことを意味する。ＶＨ及びＶＬファミリーの例は、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86、又は国際公開第２０１９／０５７７８７号に記載されている。ＶＨ３ファミリーに属するＶＨドメインの具体例は配列番号１９で示され、ＶＨ４ファミリーに属するＶＨドメインの具体例は配列番号２０に示される。特に、配列番号１９からのフレームワーク領域ＦＲ１～ＦＲ３は、ＶＨ３ファミリーに属する（表２、非太字でマークされた領域）。適切には、本明細書で使用されるＶＨ３ファミリーに属するＶＨは、配列番号１９のＦＲ１～ＦＲ３と、少なくとも９０％、より詳しくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するＦＲ１～ＦＲ３を含むＶＨである。ＶＨ３及びＶＨ４配列の代替例、及び他のＶＨｘ配列の例は、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86、又は国際公開第２０１９／０５７７８７号に見いだされる。
【0098】
適切には、本発明で使用される結合ドメインのＶＬドメインは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３フレームワーク、特にＶκ１フレームワークＦＲ１～ＦＲ３、及びＶκ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４を含む。前記結合ドメインがｓｃＦｖフォーマットである場合、前記結合ドメインは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３フレームワーク、特にＶκ１フレームワークＦＲ１～ＦＲ３、及びＶκ ＦＲ４及びＶλ ＦＲ４、特にＶλ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４を含む。
【0099】
適切なＶκ１フレームワークＦＲ１～ＦＲ３並びに例示的なＶλ ＦＲ４を配列番号２１に示す（表２、ＦＲ領域は非太字でマークされている）。Ｖκ１配列の代替例、及びＶκ２、Ｖκ３、又はＶκ４配列の例は、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86中に見いだされる。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１～ＦＲ３は、ＦＲ１～ＦＲ３に対応し配列番号２１から得られるアミノ酸配列に対して少なくとも８０、９０、９５パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む（表２、ＦＲ領域は非太字でマークされている）。適切なＶλ ＦＲ４は配列番号２２～配列番号２８、及び配列番号２９に記載され、及び特に、ドメイン間ジスルフィド結合の形成のために、第２の単一システインが、対応するＶＨ鎖の特にＶＨの５１位（ＡＨｏ番号付け）に存在する場合、単一のシステイン残基を含む。１つの実施態様において、本発明の結合ドメインのＶＬドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合、配列番号２２～配列番号２９のいずれか、特に配列番号２２又は２９のいずれかから選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０、９０、９５パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４を含む。
【0100】
本発明の抗体可変ドメインは、表１に列挙されるＶＨドメインを含む。適切には、本発明の抗体可変ドメインは、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（すなわち、ＣＤＲ配列ではない配列）内の５個以下のアミノ酸、特に４個以下のアミノ酸、特に３個以下のアミノ酸、特に２個以下のアミノ酸、特に１個以下のアミノ酸は変異している（ここで、変異とは、様々な非限定的な例として、付加、置換、又は欠失である）。本発明で使用される他の結合ドメインには、変異しているが、ＶＨ領域において、表１に記載される対応する配列に示されるＶＨ領域と、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含み、表１に示される配列の１つの少なくとも位置５～１４０（ＡＨｏ番号付け）、特に少なくとも位置３～１４５を含むＶＬドメインを含むが、ただし、そのような他の可変ドメインは段落[0070]及び任意選択的、追加的に段落[0071]～[0073]の機能的特徴を示す。
【0101】
特に、本発明の抗体可変ドメインは、表１の１つに列挙されるＶＬドメインを含む。適切には、本発明の抗体可変ドメインは、表１の１つに列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（すなわち、ＣＤＲ配列ではない配列）内の５個以下のアミノ酸、特に４個以下のアミノ酸、特に３個以下のアミノ酸、特に２個以下のアミノ酸、特に１個以下のアミノ酸が変異している（ここで、変異とは、様々な非限定的な例として、付加、置換、又は変異である）。本発明で使用される他の結合ドメインには、変異しているが、ＶＬ領域において、表１に記載される配列に示されるＶＬ領域と、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含み、表１に示される配列の１つの少なくとも位置５～１４０（ＡＨｏ番号付け）、特に少なくとも位置３～１４５を含むＶＬドメインを含むが、ただし、そのような他の可変ドメインは段落[0071]～[0073]の、及び任意選択的、追加的に段落の機能的特徴を示す。
【0102】
本発明の抗体可変ドメインの特異的であるが非限定的な例は、ｓｃＦｖ ＰＲＯ１５１７、ＰＲＯ１５３５、ＰＲＯ１７４７、ＰＲＯ１８９６、ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９であり、これらの配列は表３に列挙されている。
【0103】
適切には、本発明の多重特異性抗体の少なくとも1つの結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される。
【0104】
適切には、本発明の多重特異性抗体に含まれる抗体可変ドメイン及び結合ドメインは、それぞれの抗原又は受容体に同時に結合することができる。この関連で使用される「同時に」という用語は、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する抗体可変ドメインの少なくとも１つと、ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に対する特異性を有する結合ドメインの少なくとも１つとの同時結合を指す。
【0105】
適切には、本発明の多重特異性抗体に含まれる抗体可変ドメイン及び結合ドメインは、作動可能に連結されている。
【0106】
本明細書で使用される「作動可能に連結される」という用語は、２つの分子（例えば、ポリペプチド、ドメイン、結合ドメイン）が、各分子が機能的活性を保持する方法で結合されていることを示す。２つの分子は、それらが直接的でも間接的でも（例えば、リンカーを介して、部分を介して、部分へのリンカーを介して）「機能的に結合」することができる。「リンカー」という用語は、本発明で使用される結合ドメイン又は抗体可変ドメイン間に任意選択的に位置するペプチド又は他の部分を指す。分子を共有結合させるために、多くの戦略が使用することができる。これらには、特に限定されるものではないが、タンパク質又はタンパク質ドメインのＮ末端とＣ末端とのポリペプチド結合、ジスルフィド結合を介する結合、及び化学架橋試薬を介する結合が含まれる。この実施態様の１つの態様において、リンカーは、組換え技術又はペプチド合成によって生成されるペプチド結合である。２つのポリペプチド鎖が接続される特定の場合に適したリンカーの選択は、特に限定されるものではないが、２つのポリペプチド鎖の性質（例えば、自然にオリゴマー化するかどうか）、既知の場合は接続されるＮ末端とＣ末端との距離、及び／又はタンパク質分解及び酸化に対するリンカーの安定性を含むさまざまなパラメータに依存する。さらにリンカーは、柔軟性を提供するアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【0107】
本発明の文脈において、「ポリペプチドリンカー」という用語は、それぞれがリンカーの一端に結合している２つのドメインを接続しているペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖からなるリンカーを指す。ポリペプチドリンカーは、２つの分子が相互に正しい立体構造をとり、所望の活性を保持するような方法で２つの分子を結合するのに十分な長さを有していなければならない。特定の実施態様において、ポリペプチドリンカーは、２～３０個のアミノ酸残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０アミノ酸残基）の連続した鎖を有する。さらに、ポリペプチドリンカーに含めるために選択されるアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性を著しく妨げない特性を示さなければならない。従って、リンカーペプチドは全体として、ポリペプチドの活性と矛盾する電荷を示したり、内部折り畳みを妨げたり、又は受容体モノマードメインの結合をひどく妨げるような１つ以上のモノマーのアミノ酸残基と結合や他の相互作用を形成したりしてはならない。特定の実施態様において、ポリペプチドリンカーは非構造化ポリペプチドである。有用なリンカーには、グリシン－セリン、又はＧＳリンカーが含まれる。「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」又は「ＧＳ」リンカーは、連続したグリシンとセリンのポリマー（例えば、（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含み、ここで、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当業者に理解されている他の柔軟なリンカー（例えば、シェーカーカリウムチャネル用のテザー、及び他の多種多様な柔軟なリンカー）を意味する。グリシン－セリンポリマーは、これらのアミノ酸を含むオリゴペプチドが比較的構造化されていないため、従って成分間の中性のテザーとして機能する可能性があるため、好ましい。第２に、セリンは親水性であるため、球状のグリシン鎖である可能性のあるものを可溶化することができる。第３に、同様の鎖は、単鎖抗体などの組換えタンパク質のサブユニットを結合するのに効果的であることが示されている。
【0108】
実施態様の１つの群では、本発明の多重特異性抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域を含み、及び（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ－（ｓｃＦｖ）２融合体（ＡＤＡＰＴＩＲ）、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＤＡＲＴ（商標）、及びＴＲＩＤＥＮＴ（商標）から選択されるフォーマットである。「ＤＡＲＴ（商標）」という用語は、MacroGenicsによって開発された抗体フォーマットを指し、これは、免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドと、Ｆｃ領域の１つの重鎖のＮ末端に、又はＦｃ領域の両方のＮ末端に、融合された１つ又は２つの二重特異性Ｆｖ結合ドメインとを含む。「ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）」という用語は、MacroGenicsによって開発された抗体フォーマットを指し、これは、免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチド、１つの二重特異性Ｆｖ結合ドメイン、及び１つのＦａｂ断片を含む。二重特異性Ｆｖ結合ドメインとＦａｂ断片の両方が、Ｆｃ領域ポリペプチドの２つの重鎖のそれぞれのＮ末端に融合されている。
【0109】
別の実施態様の群では、本発明の多重特異性抗体のフォーマットは、２価二重特異性ＩｇＧフォーマット、３価二重特異性ＩｇＧフォーマット、及び４価二重特異性ＩｇＧフォーマットから選択される。特に、前記多重特異性抗体のフォーマットは、ＫｉＨベースのＩｇＧ、例えばＤｕｏＢｏｄｉｅｓ（Ｄｕｏｂｏｄｙ技術によって調製された二重特異性ＩｇＧ）（MAbs. 2017 Feb/Mar;9(2):182-212. doi: 10.1080/19420862.2016.1268307）；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、例えばＣＯＤＶ－ＩｇＧ、モリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）、又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））、ｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖と軽鎖の両方のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、及びＴｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｄｓｓｃＦｖ）から選択される。より詳しくは、前記多重特異性抗体のフォーマットは、ＫｉＨベースのＩｇＧ、例えばＤｕｏＢｏｄｉｅｓ；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＣＯＤＶ－ＩｇＧ、及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））、さらに詳しくはＤＶＤ－Ｉｇとモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）、又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））から選択される。
【0110】
本発明の特定の実施態様において、前記多重特異性抗体のフォーマットはモリソンフォーマット、すなわちモリソン－Ｌフォーマット及びモリソン－Ｈフォーマットから選択される。本発明で使用されるモリソン－Ｌ及びモリソン－Ｈフォーマットは、ＩｇＧＦｃ領域、特にＩｇＧ４ Ｆｃ領域を有する４価の二重特異性分子フォーマットである。２つの非常に安定なｓｃＦｖ結合ドメイン（軽鎖は、Ｖλ ＦＲ４（λｃａｐ）と組み合わせてＶκ ＦＲ１～ＦＲ３を含み、ここではλｃａｐ ｓｃＦｖとも呼ばれる）は、リンカーＬ１を介して、重鎖（モリソン－Ｈ）又は軽鎖（モリソン－Ｌ）Ｃ末端に融合される（図２を参照）。
【0111】
リンカーＬ１は、２～３０アミノ酸、より詳しくは５～２５アミノ酸、最も詳しくは１０～２０アミノ酸のペプチドである。特定の実施態様において、前記リンカーＬ１は、１つ又はそれ以上の単位の４つのグリシンアミノ酸残基と１つのセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎ＝１、２、３、４、又は５、特にｎ＝２である。
【0112】
本発明の特別な実施態様において、多重特異性抗体は、上で定義したモリソン－Ｌフォーマットを有する。本発明の別の特別な実施態様において、多重特異性抗体は、上で定義したモリソン－Ｈフォーマットを有する。
【0113】
本発明の多重特異性抗体に含まれる抗体可変ドメインがｓｃＦｖ断片の形態である場合、これらのｓｃＦｖ断片は、リンカーＬ２によって接続された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）とを含む。
【0114】
リンカーＬ２は、１０～４０アミノ酸、より詳しくは１５～３０アミノ酸、及び最も詳しくは２０～２５アミノ酸のペプチドである。特定の実施態様において、前記リンカーＬ２は、４つのグリシンアミノ酸残基と１つのセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ここで、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、又は８、特にｎ＝４である）との１つ又はそれ以上の単位を含む。
【0115】
そこに含まれる抗体可変ドメインがＦａｂ断片である本発明の多重特異性抗体の具体的であるが非限定的な例は、モリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９であり、その配列を表４に列挙する。
【0116】
本発明の抗体可変ドメイン及び多重特異性抗体は、当技術分野で公知の任意の便利な抗体製造法を使用して産生することができる（二重特異性構築物の産生に関しては、例えば Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14；二重特異性ダイアボディ及びタンデムｓｃＦｖに関しては、Hornig, N. & Farber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012)713-727 及び国際公開第ＷＯ９９／５７１５０号を参照されたい）。二重特異性構築物の適切な調製方法の具体例としてはさらに、特に、Ｇｅｎｍａｂ技術（Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150を参照）及びＭｅｒｕｓ技術（de Kruif et al., Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750を参照）が含まれる。機能性抗体Ｆｃ部分を含む二重特異性抗体の産生方法も当技術分野で公知である（例えば、Zhu et al., Cancer Lett. 86 (1994) 127-134、及びSuresh et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228を参照）。
【0117】
これらの方法は典型的には、例えばハイブリドーマ技術を使用して、骨髄腫細胞を所望の抗原で免疫化されたマウスからの脾臓細胞と融合させる（例えば、Yokoyama et al., Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2, Unit 2.5, 2006を参照）ことによる、又は組換え抗体工学（レパートリークローニング又はファージディスプレイ／酵母ディスプレイ）（例えば、Chames & Baty, FEMS Microbiol. Letters 189 (2000) 1-8を参照）による、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体可変ドメインの生成と、２種以上の異なるモノクローナル抗体の抗原結合ドメイン又は断片又はその一部を組み合わせて、公知の分子クローニング技術を使用して二重特異性又は多重特異性構築物を得ることを含む。
【0118】
本発明の多重特異性抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素の結合特異性を結合させることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別々に生成し、次に互いに結合させることができる。結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、共有結合にはさまざまなカップリング剤又は架橋剤を使用することができる。架橋剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－５－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が含まれる（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照）。他の方法には、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83, 及び Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375 に記載されたものが含まれる。結合剤はＳＡＴＡ及びスルホ－ＳＭＣＣであり、両方ともPierce Chemical Co. (Rockford, Ill, USA) から入手可能である。
【0119】
あるいは、２つ以上の結合特異性を同じベクター内にコード化して、同じ宿主細胞内で発現及び構築することができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ× Ｆａｂ、ｍＡｂ×ｓｃＦｖ、ｍＡｂ×ｄｓＦｖ、又はｍＡｂ×Ｆｖ融合タンパク質である場合に特に有用である。多重特異性抗体及び分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許５，４５５，０３０号；米国特許４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許５，０９１，５１３号；米国特許５，４７６，７８６号；米国特許５，０１３，６５３号；米国５，２５８，４９８号；及び米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。
【0120】
抗体可変ドメイン及び多重特異性抗体のこれらの特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、又はウェスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイはそれぞれ、一般に、目的の複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することによって、特に目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。
【0121】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸を提供する。このような核酸は、哺乳動物細胞での発現のために最適化することができる。
【0122】
本明細書中で使用される「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、１本鎖又は２本鎖型の１つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。この用語は、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された主鎖残基又は結合を含む核酸を包含し、これらは、合成、天然、及び非天然であり、参照核酸と比較した場合に同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。このような類似体の例には、特に限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルリン酸、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。他に明示されない限り、特定の核酸はまた、その保存的に修飾されたその変種（例えば、縮重コドン置換体）及び相補配列、並びに明示的に示された配列も暗示的に包含する。具体的には、以下に詳述するように、縮重コドン置換は、１つ又はそれ以上の選択された（又はすべての）コドンの３位が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 及び Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
【0123】
本発明は、上記の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体のセグメント又はドメインを含むポリペプチドをコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。適切な発現ベクターから発現される場合、これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドは、本発明の多重特異性抗体の抗原結合能力を示すことができる。
【0124】
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成によって、又は本発明の多重特異性抗体又はその可変ドメイン若しくは結合ドメインをコードする既存の配列（例えば、以下の実施例に記載の配列）のＰＣＲ突然変異誘発によって生成することができる。核酸の直接化学合成は、当該分野で公知の方法、例えば、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90 のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109, 1979 のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859, 1981 のジエチルホスホルアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法によって達成され得る。ＰＣＲによりポリヌクレオチド配列に変異を導入する方法は、例えば PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 及び Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991 に記載されたように実施することができる。
【0125】
また、本発明では、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体を産生するための発現ベクター及び宿主細胞も提供される。
【0126】
「ベクター」という用語は、それが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチド分子を指すことを意図している。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントが連結される環状２本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここで追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結される場合がある。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。
【0127】
さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることがよくある。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるため、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用される場合がある。しかし本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。この特定の文脈において、「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。通常、それは転写調節配列と転写された配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーター又はエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接しており、すなわちそれらはシス作用性である。しかし、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、それらが転写を増強するコード配列に物理的に隣接していたり、近接して配置されている必要はない。
【0128】
抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを発現させるために、様々な発現ベクターを使用することができる。ウイルスベースの発現ベクターと非ウイルス発現ベクターの両方を使用して、哺乳類宿主細胞内で抗体又は抗体可変ドメインを産生することができる。非ウイルスベクター及びシステムには、プラスミド、典型的にはタンパク質又はＲＮＡを発現するための発現カセットを有するエピソームベクター、及びヒト人工染色体が含まれる（例えば、Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997を参照）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞におけるＩＬ－４Ｒ結合性ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターには、ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ、Ｂ、及びＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓＡ、Ｂ、及びＣ（Invitrogen, San Diego, CA, USA）、ＭＰＳＶベクター、及び他のタンパク質を発現するための当技術分野で公知の他の多数のベクターが含まれる。有用なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が含まれる。Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; and Rosenfeld et al., Cell 68: 143, 1992を参照。
【0129】
発現ベクターの選択は、ベクターが発現される予定の宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、多重特異性抗体鎖又は可変ドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター及び他の調節配列（例えばエンハンサー）を含む。１つの実施態様において、誘導性プロモーターを使用して、誘導条件下を除いて、挿入配列の発現を防止する。誘導性プロモーターには、例えばアラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、又は熱ショックプロモーターが含まれる。形質転換された生物の培養物は、その発現産物が宿主細胞によりよく許容されるコード配列について集団に偏りを与えることなく、非誘導条件下で増殖させることができる。プロモーターに加えて、多重特異性抗体鎖又は可変ドメインの効率的な発現には他の調節要素も必要又は望ましい場合がある。これらの要素には通常、ＡＴＧ開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位又はその他の配列が含まれる。さらに、発現効率は、使用する細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって増強することができる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; and Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987 を参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を上昇させることができる。
【0130】
使用されるベクターは、典型的には、存在する場合は、定常領域又はその一部を含む抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体の軽鎖及び重鎖をコードする。このようなベクターは、可変領域を定常領域との融合タンパク質として発現させることを可能にし、それによって無傷の抗体及びその抗体可変ドメインの産生をもたらす。通常、そのような定常領域はヒトのものである。
【0131】
「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫をも指すことを意図していることを理解されたい。突然変異又は環境の影響により、後続の世代で特定の修飾が生じる可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【0132】
本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体を保有及び発現するための宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び発現に有用な原核宿主の１つである。使用に適した他の微生物宿主には、枯草菌などの桿菌、及び他の腸内細菌科、例えばサルモネラ菌、セラチア菌、及び様々なシュードモナス種が含まれる。これらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製開始点）を含む発現ベクターを作製することもできる。さらに、任意の数の様々な周知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータラクタマーゼプロモーター系、又はラムダファージ由来のプロモーター系が存在するであろう。プロモーターは典型的には、任意選択的にオペレーター配列とともに、発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了するためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物も、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体を発現するために使用することができる。昆虫細胞をバキュロウイルスベクターと組み合わせて使用することもできる。
【0133】
１つの実施態様において、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体を発現及び産生するために、哺乳動物宿主細胞が使用される。例えばこれらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、又は外因性発現ベクターを有する哺乳動物細胞株のいずれかであり得る。これらには、任意の正常な死すべき細胞、又は正常若しくは異常な不死の動物若しくはヒトの細胞が含まれる。例えば、無傷の免疫グロブリンを分泌できる多くの適切な宿主細胞株が開発されており、これには、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞、及びハイブリドーマが含まれる。ポリペプチドを発現するための哺乳類組織細胞培養物の使用は、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987で概説されている。哺乳類宿主細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（例えば、Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照）、並びに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列を含み得る。これらの発現ベクターには、通常、哺乳動物の遺伝子又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが含まれている。適切なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、及び／又は調節可能若しくは制御可能であり得る。有用なプロモーターには、特に限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳ Ｖプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えば、ヒト前初期ＣＭＶプロモーター）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当技術分野で公知のプロモーター－エンハンサーの組み合わせが含まれる。
【0134】
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類に応じて異なる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般に原核細胞に利用されるが、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは他の細胞宿主に使用される場合がある（一般に、Green, M. R., and Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012) を参照）。他の方法には、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、注射及びマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン－核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）への融合、薬剤により増強されたＤＮＡの取り込み、及びエクスビボ形質導入が含まれる。組換えタンパク質を長期にわたって高収率で生産するには、多くの場合、安定した発現が望まれる。例えば、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体を安定して発現する細胞株は、ウイルス複製開始点又は内在性発現要素及び選択マーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターの導入後、細胞を富化培地で１～２日間増殖させた後、選択培地に切り替える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、その存在により、選択培地中で導入された配列をうまく発現する細胞の増殖が可能になる。耐性があり、安定してトランスフェクトされた細胞は、細胞の種類に適した組織培養技術を使用して増殖させ得る。従って、本発明は、本発明の可変ドメイン又は多重特異性抗体を産生する方法を提供し、ここで前記方法は、本発明の抗体抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体をコードする核酸又はベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含み、それにより、本開示の前記抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体又はその断片が発現される。
【0135】
１つの態様において、本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体を産生する方法に関し、この方法は、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体をコードする核酸を発現する宿主細胞を培養する工程を含む。特に本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体を産生する方法に関し、この方法は、（ｉ）本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸、又は本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体をコードする１つ又は２つのベクターを提供し、前記１つ若しくは複数の核酸又は前記１つ若しくは複数のベクターを発現させ、及び前記抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体を発現系から収集する工程、又は（ｉｉ）本発明の抗体可変ドメイン又は多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸を発現する１つの宿主細胞若しくは複数の宿主細胞を提供し、前記１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞を培養し、及び前記細胞培養物から前記抗体可変ドメイン又は前記多重特異性抗体を収集する工程を含む。
【0136】
さらなる態様において、本発明は、本発明の多重特異性抗体と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。「医薬的に許容し得る担体」とは、抗体の構造を妨げない媒体又は希釈剤を意味する。医薬的に許容し得る担体は、組成物を増強又は安定化し、又は組成物の調製を容易にする。医薬的に許容し得る担体には、生理学的に適合する溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。
【0137】
このような担体のいくつかは、医薬組成物を、例えば、被験体による経口摂取用の錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、及びトローチとして製剤化することを可能にする。このような担体のいくつかは、医薬組成物を注射、注入、又は局所投与用に製剤化することを可能にする。例えば、医薬的に許容し得る担体は、滅菌水溶液であり得る。
【0138】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与することができる。投与経路及び／又は投与方法は、所望の結果に応じて変化する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下であってもよく、あるいは標的部位の近傍に投与されてもよい。特定の実施態様において、投与は筋肉内、又は皮下、特に皮下である。医薬的に許容し得る担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）、特に筋肉内又は皮下投与に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち本発明の多重特異性抗体は、化合物を不活性化し得る酸の作用及び他の自然条件から化合物を保護する材料でコーティングされ得る。
【0139】
本発明の医薬組成物は、当技術分野でよく知られ日常的に実施されている方法に従って調製することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 及び Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、本発明の多重特異性抗体の治療有効用量又は有効用量が、本発明の医薬組成物に使用される。本発明の多重特異性抗体は、当業者に公知の従来の方法によっ、て医薬的に許容し得る剤形に調製される。投薬計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、時間をかけて数回に分けて投与してもよいし、治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少又は増加させてもよい。投与の容易さ及び用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で調製することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位剤形とは、治療される被験体に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位には、必要な医薬担体と組み合わせて、所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物が含まれる。
【0140】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者に毒性を与えることなく、特定の患者、組成物、及び投与方法に対して所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量を得るために、変更することができる。選択される用量レベルは、様々な薬物動態学的因子、例えば使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩、若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物、及び／又は材料、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態と過去の病歴、及び同様の要因に依存する。
【0141】
本発明の多重特異性抗体は、通常、複数回投与される。単回投与の間隔は、毎週、毎月、又は毎年にすることができる。患者における本発明の多重特異性抗体の血中レベルの測定によって示されるように、間隔は不規則でもよい。あるいは、本発明の多重特異性抗体は、徐放性製剤として投与することができ、この場合、必要な投与頻度は少なくなる。投与量と投与頻度は、患者における抗体の半減期に応じて異なる。一般にヒト化抗体は、キメラ抗体や非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与量と投与頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかによって異なる。予防的用途では、比較的低用量が比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与される。患者の中には生涯治療を受け続ける人もいる。治療用途では、疾患の進行が軽減又は停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量の投与が必要となる場合がある。その後、患者に予防療法を施すことができる。
【0142】
１つの態様において、本発明は、薬剤として使用するための本発明の多重特異性抗体又は本発明の医薬組成物に関する。適切な実施態様において、本発明は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患、特に炎症性疾患と自己免疫疾患から選択される疾患の治療に使用するための多重特異性抗体又は医薬組成物を提供する。
【0143】
別の態様において、本発明は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、又は自己免疫疾患、特に炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療用の薬剤の製造に使用するための医薬組成物を提供する。
【0144】
別の態様において、本発明は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、又は自己免疫疾患を治療するための、特に、治療を必要とする被験体における炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療するための、多重特異性抗体又は医薬組成物の使用に関する。
【0145】
別の態様において、本発明は、治療有効量の本発明の多重特異性抗体を被験体に投与することを含む、被験体を治療する方法に関する。適切な実施態様において、本発明は、被験体におけるアレルギー性疾患、炎症性疾患、又は自己免疫疾患の治療方法、特に炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療方法であって、治療有効量の本発明の多重特異性抗体を被験体に投与することを含む方法に関する。
【0146】
「被験体」という用語には、ヒト及びヒト以外の動物が含まれる。
【0147】
「動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えば非ヒト哺乳動物、及び非ヒト哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類が含まれる。他に明記されない限り、「患者」又は「被験体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【0148】
本明細書で使用される「治療（treatment）」、「治療している（treating）」、「治療する（treat）」、「治療された（treated）」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患及び／又は疾患に起因する副作用の部分的又は完全な治癒、又は疾患の進行の遅延という点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、以下を含む：（ａ）疾患を阻害する、すなわち、その発症を阻止する、及び（ｂ）疾患を軽減する、すなわち疾患を退行させる。
【0149】
「治療有効量」又は「有効量」という用語は、疾患を治療するために哺乳動物又は他の被験体に投与された場合、そのような疾患の治療に影響を与えるのに十分な薬剤の量を指す。「治療有効量」は、薬剤、疾患及びその重症度、並びに治療を受ける被験体の年齢、体重などによって異なる。
【0150】
１つの実施態様において、アレルギー疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患は、掻痒を引き起こすアレルギー疾患、掻痒を引き起こす炎症性疾患、及び掻痒を引き起こす自己免疫疾患から、特に掻痒を引き起こす炎症性疾患及び掻痒を引き起こす自己免疫疾患から選択される。「掻痒」及び「かゆみ」という用語は、本明細書では同義的に使用され、掻きたいという欲求又は反射を引き起こす感覚を指す。アトピー性皮膚炎、皮膚真菌症、乾癬、蕁麻疹などのかゆみを引き起こす慢性皮膚疾患の場合、掻きむしることは特に問題となる可能性があり、これは、永続的なかゆみの刺激により、患者は患部の皮膚領域を絶えず及び／又は過剰に掻くことになり、皮損の怪我や皮膚表面のさらなる悪化につながるためである。
【0151】
本明細書で使用される「アレルギー疾患」又は「アレルギー」という用語は、環境中の通常は無害な物質に対する免疫系の過敏性によって引き起こされる多数の状態を指す。
【0152】
本明細書で使用される「炎症性疾患」という用語は、膨大な数の炎症性障害、すなわち、慢性炎症として知られる長期にわたる炎症を特徴とする炎症性異常を指すことが多い。「炎症」という用語は、病原体、損傷した細胞、又は刺激物などの有害な刺激に対する身体組織の複雑な生物学的応答を指す。これは、免疫細胞、血管、分子メディエーターが関与する防御応答である。定期的な炎症反応は、細胞傷害の最初の原因を除去し、最初の傷害や炎症過程で損傷した壊死細胞や組織を除去し、そして組織修復を開始するために身体にとって不可欠であるが、炎症性疾患は一般に、有害な刺激がなくても炎症が続くことを特徴とする。
【0153】
本明細書で使用される「自己免疫疾患」という用語は、機能している体の部分に対する異常な免疫応答から生じる状態を指す。それは自己免疫、すなわち自己反応性免疫応答（例えば、自己抗体、自己反応性Ｔ細胞）の存在の結果であり、それに起因する損傷又は病状の有無にかかわらず、通常は特定の器官に限定されるか、さまざまな場所の特定の組織が関与する。
【0154】
特定の実施態様において、掻痒症を引き起こす炎症性疾患又は自己免疫疾患は、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性自然発生性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から、特にアトピー性皮膚炎から選択される。
【0155】
別の態様において、アレルギー性、炎症性、及び自己免疫性疾患は、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性自然発生性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から、特にアトピー性皮膚炎から選択される。
【0156】
別の実施態様において、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏症、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、慢性非ヒスタミン関連蕁麻疹、抗ヒスタミン非応答性肥満細胞症、慢性単純苔癬、脂漏性皮膚炎、乾皮症、疱疹状皮膚炎、扁平苔癬、及び潰瘍性大腸炎から選択される。
【0157】
別の実施態様において、本発明は、帯状疱疹後神経痛、帯状疱疹後かゆみ、感覚異常痛、多発性硬化症、及び腕橈骨掻痒症から選択される神経障害性掻痒症である疾患の治療に使用するための、本明細書で定義される多重特異性抗体又は医薬組成物を提供する。
【0158】
別の実施態様において、本発明は、かゆみを伴う全身性疾患の治療のための鎮痒剤に使用するための多重特異性抗体又は医薬組成物を提供し、前記疾患は、胆汁うっ滞、慢性腎臓病、ホジキン病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫及び慢性かゆみを伴う他のリンパ腫又は白血病、真性赤血球増加症、甲状腺機能亢進症、慢性節足動物後かゆみ（Ｉｄ反応）、妊娠誘発性慢性かゆみ（例えばＰＵＰＰＰ）、好酸球性膿疱性毛包炎、薬物過敏反応、高齢者の慢性掻痒症又は乾燥性皮膚かゆみ（局所的、全身性）、及び火傷後の瘢痕部分のかゆみ（火傷後かゆみ）、遺伝性又は母斑性慢性かゆみ（例えば、ネザートン症候群、ダリエ病（モルバス・ダリエ）、ヘイリー・ヘイリー病、炎症性線状疣状表皮母斑（ＩＬＶＥＮ）、家族性原発性皮膚アミロイドーシス、オルムステッド症候群）、水原性掻痒症、グラスファイバー皮膚炎、粘液性慢性かゆみ、化学療法誘発性かゆみ、及びＨＩＶから選択される、
配列表（ＡＨｏ番号付けスキームに従って指定された変異；他に明記されない限り、ＮｕｍａｂＣＤＲ定義に従って定義されたＣＤＲ）
配列表（ＡＨｏ番号付けスキームに従って指定された変異；他に明記されない限り、ＮｕｍａｂＣＤＲ定義に従って定義されたＣＤＲ）
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【0159】
本出願の本文全体を通して、明細書の本文（例えば、表１～４）と配列表との間に矛盾がある場合には、明細書の本文が優先するものとする。
【0160】
明確にするために、別個の実施態様に関連して説明される本発明のいくつかの特徴は、単一の実施態様において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施態様に関連して説明される本発明の様々な特徴は、個別に、又は任意の適切な部分組合わせで提供することもできる。本発明に係る実施態様のすべての組み合わせは、本発明に具体的に包含され、あたかもあらゆる組み合わせが個別に明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。さらに、様々な実施態様及びその要素のすべての部分組合わせも本発明に具体的に包含され、あたかもそのような部分組合わせのそれぞれが本明細書に個別かつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。
【0161】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な変更が、上記の説明から当業者には明らかとなるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【0162】
それぞれの特許法に基づいて可能な範囲で、本明細書で引用したすべての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、及びその他の資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0163】
以下の実施例は、上述の本発明を説明するものであるが、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者にそれ自体知られている他の試験モデルも、請求された発明の有益な効果を判定することができる。
【実施例1】
【0164】
実施例
実施例１：抗ＩＬ－４Ｒ分子の生成と試験：
プロジェクトの目的
このプロジェクトの目標は、ヒトＩＬ－４Ｒに特異的に結合し、その生物学的作用を中和するヒト化モノクローナル抗体可変ドメインを生成することであった。さらなる目標は、多重特異性抗体フォーマットに組み込むのに十分強力で安定な抗ＩＬ－４Ｒ抗体可変ドメインを特定することであった。
実施例１：抗ＩＬ－４Ｒ分子の生成と試験：
プロジェクトの目的
このプロジェクトの目標は、ヒトＩＬ－４Ｒに特異的に結合し、その生物学的作用を中和するヒト化モノクローナル抗体可変ドメインを生成することであった。さらなる目標は、多重特異性抗体フォーマットに組み込むのに十分強力で安定な抗ＩＬ－４Ｒ抗体可変ドメインを特定することであった。
【0165】
１．１．免疫
ヒトＩＬ－４Ｒに対する最適な免疫応答を得るために、２つの異なる免疫化プロトコールを合計６匹のウサギに適用した。ウサギを、組換え産生され精製されたＩＬ－４Ｒ（Sino Biological、カタログ番号１０４０２－Ｈ０８Ｈ）で免疫した。免疫の前に、製造業者により組換えヒトＩＬ－４Ｒの品質が、１）ＳＤＳ－ｐａｇｅによる純度について、及び２）機能的ＥＬＩＳＡでＩＬ－４への結合能力を測定することにより、生物活性について分析された。３匹のウサギからなる第１の群（プロトコール１）には、７０日間を通してそれぞれ２００μｇを４回注射した。３匹のウサギからなる第２の群（プロトコール２）には、１１２日間を通してそれぞれ２００μｇを５回注射した。免疫の過程で、抗原に対するポリクローナル血清抗体の検出可能な結合を依然としてもたらす各ウサギの血清の最大希釈（力価）を決定することによって、抗原に対する体液性免疫応答の強度を定性的に評価した。固定化抗原（組換えヒトＩＬ－４Ｒ）に対する血清抗体力価は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価された。精製ヒトＩＬ－４Ｒで免疫された６匹のウサギすべてが、最大３×１０７のＥＣ５という高い力価を示した。
ヒトＩＬ－４Ｒに対する最適な免疫応答を得るために、２つの異なる免疫化プロトコールを合計６匹のウサギに適用した。ウサギを、組換え産生され精製されたＩＬ－４Ｒ（Sino Biological、カタログ番号１０４０２－Ｈ０８Ｈ）で免疫した。免疫の前に、製造業者により組換えヒトＩＬ－４Ｒの品質が、１）ＳＤＳ－ｐａｇｅによる純度について、及び２）機能的ＥＬＩＳＡでＩＬ－４への結合能力を測定することにより、生物活性について分析された。３匹のウサギからなる第１の群（プロトコール１）には、７０日間を通してそれぞれ２００μｇを４回注射した。３匹のウサギからなる第２の群（プロトコール２）には、１１２日間を通してそれぞれ２００μｇを５回注射した。免疫の過程で、抗原に対するポリクローナル血清抗体の検出可能な結合を依然としてもたらす各ウサギの血清の最大希釈（力価）を決定することによって、抗原に対する体液性免疫応答の強度を定性的に評価した。固定化抗原（組換えヒトＩＬ－４Ｒ）に対する血清抗体力価は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価された。精製ヒトＩＬ－４Ｒで免疫された６匹のウサギすべてが、最大３×１０７のＥＣ５という高い力価を示した。
【0166】
１．２．選別
ヒット特定手順の前に、プロテインＧビーズを用いるフローサイトメトリーに基づく選別手順を、Ｒ－フィコエリトリン（ＲＰＥ）標識ＩＬ－４Ｒの存在下で実施した。これにより、高親和性ＩＬ－４Ｒ結合Ｂ細胞の特異的検出及び単離が可能となる。この選別キャンペーンでは、４匹のウサギに由来する合計１．０５×１０７個のリンパ球が分析された。これらのうち、ＩＬ－４Ｒ特異的抗体（ＩｇＧ）を発現する合計３，５２０個のＢ細胞が単離され、単一クローンとして３～４週間、個別に培養された。
ヒット特定手順の前に、プロテインＧビーズを用いるフローサイトメトリーに基づく選別手順を、Ｒ－フィコエリトリン（ＲＰＥ）標識ＩＬ－４Ｒの存在下で実施した。これにより、高親和性ＩＬ－４Ｒ結合Ｂ細胞の特異的検出及び単離が可能となる。この選別キャンペーンでは、４匹のウサギに由来する合計１．０５×１０７個のリンパ球が分析された。これらのうち、ＩＬ－４Ｒ特異的抗体（ＩｇＧ）を発現する合計３，５２０個のＢ細胞が単離され、単一クローンとして３～４週間、個別に培養された。
【0167】
１．３．ヒットの特定
総論
ヒットの特定のために、直接ＥＬＩＳＡスクリーニングを行ってヒト及びマウスのＩＬ－４Ｒへの結合を評価したが、カニクイザルＩＬ－４Ｒへの結合はＳＰＲのみによって評価した。直接ＥＬＩＳＡでは、４８３個のクローンがヒトＩＬ－４Ｒに結合することが判明し、１６４個のクローンがマウスＩＬ－４Ｒとの交差反応性を示した。
総論
ヒットの特定のために、直接ＥＬＩＳＡスクリーニングを行ってヒト及びマウスのＩＬ－４Ｒへの結合を評価したが、カニクイザルＩＬ－４Ｒへの結合はＳＰＲのみによって評価した。直接ＥＬＩＳＡでは、４８３個のクローンがヒトＩＬ－４Ｒに結合することが判明し、１６４個のクローンがマウスＩＬ－４Ｒとの交差反応性を示した。
【0168】
ＥＬＩＳＡによるヒトＩＬ－４Ｒへの結合
ヒットの特定、すなわちＩＬ－４Ｒに結合する抗体を産生するＢ細胞クローンの特定については、上記３，５２０個のＢ細胞クローンの細胞培養上清を、ＥＬＩＳＡによってヒトＩＬ－４Ｒに結合する抗体の存在についてスクリーニングした。高処理能力培養のスケールでは個々のウサギ抗体の精製ができないため、この１次ヒット特定手順は、細胞培養上清からの非精製抗体を使用して実行された。細胞上清を使用すると、多数の抗体のランク付けが可能になる。使用されるＥＬＩＳＡ法は、組換えヒトＩＬ－４Ｒに結合したウサギＩｇＧの「量」を評価するが、抗体の親和性や濃度に関する情報は提供されない。このアッセイでは、４８３個のＢ細胞クローンの上清が、バックグラウンドを超えるシグナルを生成した。
ヒットの特定、すなわちＩＬ－４Ｒに結合する抗体を産生するＢ細胞クローンの特定については、上記３，５２０個のＢ細胞クローンの細胞培養上清を、ＥＬＩＳＡによってヒトＩＬ－４Ｒに結合する抗体の存在についてスクリーニングした。高処理能力培養のスケールでは個々のウサギ抗体の精製ができないため、この１次ヒット特定手順は、細胞培養上清からの非精製抗体を使用して実行された。細胞上清を使用すると、多数の抗体のランク付けが可能になる。使用されるＥＬＩＳＡ法は、組換えヒトＩＬ－４Ｒに結合したウサギＩｇＧの「量」を評価するが、抗体の親和性や濃度に関する情報は提供されない。このアッセイでは、４８３個のＢ細胞クローンの上清が、バックグラウンドを超えるシグナルを生成した。
【0169】
ヒトＩＬ－４Ｒに対する結合親和性の測定
２次ヒット特定手順では、１次スクリーニング中に陽性と認定された４８３個のモノクローナルウサギ抗体のヒトＩＬ－４Ｒに対する結合親和性に関する情報を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって判定した。
２次ヒット特定手順では、１次スクリーニング中に陽性と認定された４８３個のモノクローナルウサギ抗体のヒトＩＬ－４Ｒに対する結合親和性に関する情報を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって判定した。
【0170】
ＳＰＲによるこれらの親和性スクリーニングのために、ウサギＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体を、標準的なアミンカップリング手順を使用してセンサーチップ（ＳＰＲ－２親和性センサー、高容量アミン、Sierra Sensors）上に固定化した。Ｂ細胞上清中のウサギモノクローナル抗体は、固定化抗ウサギＩｇＧ抗体によって捕捉された。十分な捕捉を可能にするためには、Ｂ細胞上清中のＩｇＧ濃度を最小限にする必要がある。モノクローナル抗体を捕捉した後、ヒトＩＬ－４Ｒ ＥＣＤ（細胞外ドメイン）を９０ｎＭの濃度でフローセルに３分間注入し、センサーチップ上に捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の解離を５分間進行させた。見かけの解離（ｋｄ）速度定数及び会合（ｋａ）速度定数、並びに見かけの解離平衡定数（ＫＤ）は、１：１ラングミュア結合モデルを使用してＭＡＳＳ－２分析ソフトウェア（Analyzer、Sierra Sensors）で算出された。
【0171】
４７５個の抗ＩＬ－４Ｒ抗体について、ヒトＩＬ－４Ｒに対する結合親和性を測定することができた。これらは、２．０７×１０－１２Ｍ未満～２．９５×１０－８Ｍの範囲の解離定数（ＫＤ）を示した。分析した抗体の３２％は０．５ｎＭ未満のＫＤを有し、１７％はデュピルマブより高い親和性を示した。
【0172】
ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子細胞アッセイ及び競合ＥＬＩＳＡにおけるヒトＩＬ－４Ｒの中和
４８３個のヒトＩＬ－４Ｒ結合上清すべてを、細胞ベースのｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイにおけるＩＬ－４Ｒの生物学的活性を中和する可能性について、及び競合ＥＬＩＳＡにおけるヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用の遮断について、さらに分析した。
４８３個のヒトＩＬ－４Ｒ結合上清すべてを、細胞ベースのｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイにおけるＩＬ－４Ｒの生物学的活性を中和する可能性について、及び競合ＥＬＩＳＡにおけるヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用の遮断について、さらに分析した。
【0173】
この目的のために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞を使用する細胞ベースのｓｔａｔ－６依存性レポーター遺伝子アッセイ及び受容体リガンド競合ＥＬＩＳＡが開発され、Ｂ細胞上清での使用に適応された。細胞ベースのアッセイは、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の遮断の評価を可能にするが、競合ＥＬＩＳＡでは、ＩＬ－４とＩＬ－４Ｒの相互作用のみが評価される。これらのアッセイは、Ｂ細胞上清をマトリックスとして使用して実施でき、感度が高く正確であるため、両方のアッセイがスクリーニングに使用された。Ｂ細胞上清に存在するマウスＩＬ－１３は市販の抗マウスＩＬ－１３抗体によって遮断されて、細胞ベースのアッセイにおいてのみヒトＩＬ－１３によってシグナル伝達が誘導されることが保証された。各Ｂ細胞上清の阻害活性は、単一ウェル分析を使用して試験された（用量応答は行われなかった）。従って、観察された阻害の程度は、ＩｇＧの特性だけでなく、Ｂ細胞上清中のウサギＩｇＧの濃度にも依存する。
【0174】
４８３個のクローンのうち１２２個がヒトＩＬ－４ＲとヒトＩＬ－４との相互作用を９０％を超えて遮断し、１７８個のクローンが８０％を超えて阻害した。＞３０％阻害の閾値に基づいて、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイでは、１１９個と１３２個のクローンがそれぞれＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を阻害し、８６個のヒットがＩＬ－４誘導性シグナル伝達とＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の両方を阻害した。
【0175】
種交差反応性（ＳＰＲによるカニクイザル及びマウスＩＬ－４Ｒへの結合）
１次スクリーニングで特定された４８３個のヒットすべてを、カニクイザル及びマウスＩＬ－４Ｒに対する種交差反応性についてＳＰＲによって分析した。結合親和性は、ヒトＩＬ－４Ｒの代わりに９０ｎＭカニクイザル又はマウスＩＬ－４Ｒを使用したことを除いて、ヒトＩＬ－４Ｒについて上記したのと同様に、ＭＡＳＳ－２ ＳＰＲデバイス（Sierra Sensors）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。
１次スクリーニングで特定された４８３個のヒットすべてを、カニクイザル及びマウスＩＬ－４Ｒに対する種交差反応性についてＳＰＲによって分析した。結合親和性は、ヒトＩＬ－４Ｒの代わりに９０ｎＭカニクイザル又はマウスＩＬ－４Ｒを使用したことを除いて、ヒトＩＬ－４Ｒについて上記したのと同様に、ＭＡＳＳ－２ ＳＰＲデバイス（Sierra Sensors）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。
【0176】
４２３個のクローン（８７．５％）及び２６６個のクローン（５５％）が、それぞれカニクイザル及びマウスＩＬ－４Ｒへの結合を示した。直接ＥＬＩＳＡと比較して、ＳＰＲで見つかったマウスＩＬ－４Ｒ交差反応性クローンの数が多い（２６６対１６４）のは、ＥＬＩＳＡでより厳密なカットオフを使用しているためである。抗カニクイザルＩＬ－４Ｒ抗体は、１．１４×１０－１２Ｍ～９．３６×１０－６Ｍの範囲の平衡解離定数（ＫＤ）を示した。分析したすべての抗体の１１％が５００ｐＭ未満のＫＤを有した。抗マウスＩＬ－４Ｒ抗体について全体的にかなり低い親和性が決定され、ＫＤ値は１．６３×１０－１１Ｍ～４．５７×１０－５Ｍの範囲であった。全体として、種のＫＤ値間に良好な相関関係はなく、ヒト及びカニクイザルの両方のＩＬ－４Ｒに対して高い親和性を示すヒットはわずか約２０件であった。
【0177】
１．４．ヒット選択とヒット確認
ヒット選択とＲＴ－ＰＣＲ
ウサギ抗体のヒット確認、遺伝子配列解析、及びその後のヒト化の前提条件として、ウサギ抗体可変ドメインをコードする遺伝情報を検索する必要がある。これは、それぞれのメッセンジャーＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写（ＲＴ）し、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって二本鎖ＤＮＡを増幅することによって達成された。ＲＴ－ＰＣＲに供したＢ細胞クローンの選択は、主に５００ｐＭ未満のヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性及びｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイにおける中和活性に基づいていた。追加の基準として、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する交差反応性を考慮した。
ヒット選択とＲＴ－ＰＣＲ
ウサギ抗体のヒット確認、遺伝子配列解析、及びその後のヒト化の前提条件として、ウサギ抗体可変ドメインをコードする遺伝情報を検索する必要がある。これは、それぞれのメッセンジャーＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写（ＲＴ）し、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって二本鎖ＤＮＡを増幅することによって達成された。ＲＴ－ＰＣＲに供したＢ細胞クローンの選択は、主に５００ｐＭ未満のヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性及びｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイにおける中和活性に基づいていた。追加の基準として、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する交差反応性を考慮した。
【0178】
９４個の独立したクローンに対応する９４セットのウサギＣＤＲを選択し、同定した。配列決定された９４個のクローンすべてのウサギＣＤＲ配列が系統樹にクラスター化された。７５個の配列はＣＤＲ領域に基づく非重複配列であり、２６個の配列は遊離システイン（開発の責任（liability for development）と考えられる）を含有していた。同一の配列及び４未満のアミノ酸が異なる配列を有するすべてのクローンが除外された。ヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性が４００～５００ｐＭで、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対して親和性が低い（ＫＤ＞３ｎＭ）２つのクローンも選択から除外されたが、遊離システインを有する８つの追加クローンは含まれた。遊離システインを有するクローンは再フォーマット後に凝集する傾向があるが、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する高い親和性を考慮して、これらのクローンはこの段階では廃棄されなかった。その結果、合計６０クローンが組換えＩｇＧとして発現のために選択された。
【0179】
モノクローナル抗体のクローニングと製造
ヒット確認のためのクローンの選択に続いて、さらなる特性解析のためにウサギ抗体をクローン化し、発現させ、精製した。対応する軽鎖及び重鎖可変ドメインのクローニングには、適切な哺乳類発現ベクターへのＤＮＡ断片のインビトロ連結が必要であった。ウサギ抗体重鎖及び軽鎖の発現ベクターを、一過性の異種発現のために哺乳類懸濁細胞株にトランスフェクトした。続いて、分泌されたウサギＩｇＧを親和性精製し、最終生成物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度、及びサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によって分析して、同一性、含有量、及び純度を確認した。６０個のクローンのうち５８個をクローン化することができ、高いモノマー含量（９５．９～９９．６％）で中程度から非常に良好な力価（２～３６μｇタンパク質／ｍｌ）で製造することができた。
ヒット確認のためのクローンの選択に続いて、さらなる特性解析のためにウサギ抗体をクローン化し、発現させ、精製した。対応する軽鎖及び重鎖可変ドメインのクローニングには、適切な哺乳類発現ベクターへのＤＮＡ断片のインビトロ連結が必要であった。ウサギ抗体重鎖及び軽鎖の発現ベクターを、一過性の異種発現のために哺乳類懸濁細胞株にトランスフェクトした。続いて、分泌されたウサギＩｇＧを親和性精製し、最終生成物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度、及びサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によって分析して、同一性、含有量、及び純度を確認した。６０個のクローンのうち５８個をクローン化することができ、高いモノマー含量（９５．９～９９．６％）で中程度から非常に良好な力価（２～３６μｇタンパク質／ｍｌ）で製造することができた。
【0180】
１．５．モノクローナル抗体の薬理学的特性解析
ヒト、カニクイザル、マーモセット、及びマウスＩＬ－４Ｒに対する親和性
５８個の精製モノクローナルウサギ抗体のヒトＩＬ－４Ｒに対する結合動態を、ＳＰＲ（ＭＡＳＳ－２）分析によって決定した。各ＩｇＧは、カルボキシルメチル化デキストラン表面に結合した抗ウサギＩｇＧを介して捕捉され、分析物の用量反応が測定された。ヒトＩＬ－４Ｒへの高親和性結合は、ナノモルの親和性を有する２つのＩｇＧを除き、ピコモルからピコモル未満の親和性の範囲のＫＤ値を有するすべての抗体で確認された。５７個の標的結合抗体のうち４個は、ピコモル未満のＫＤ値を示した。
ヒト、カニクイザル、マーモセット、及びマウスＩＬ－４Ｒに対する親和性
５８個の精製モノクローナルウサギ抗体のヒトＩＬ－４Ｒに対する結合動態を、ＳＰＲ（ＭＡＳＳ－２）分析によって決定した。各ＩｇＧは、カルボキシルメチル化デキストラン表面に結合した抗ウサギＩｇＧを介して捕捉され、分析物の用量反応が測定された。ヒトＩＬ－４Ｒへの高親和性結合は、ナノモルの親和性を有する２つのＩｇＧを除き、ピコモルからピコモル未満の親和性の範囲のＫＤ値を有するすべての抗体で確認された。５７個の標的結合抗体のうち４個は、ピコモル未満のＫＤ値を示した。
【0181】
カニクイザル及びマーモセットサルＩＬ－４Ｒに対する結合動態を、上記と同様に決定した。マーモセットＩＬ－４Ｒ ＥＣＤは市販されていなかったため、Sino Biologicalによってオンデマンドで製造された。５８個のＩｇＧのうち４４個と４８個がそれぞれカニクイザルとマーモセットＩＬ－４Ｒに結合した。３５個のＩｇＧは両方のサル種に対して交差反応性を示した。マーモセットＩＬ－４Ｒでは、ヒト及びカニクイザルＩＬ－４Ｒと比較して、より高い全体的な親和性が測定された。
【0182】
マウスＩＬ－４Ｒへの結合を、ＳＰＲの代わりに直接ＥＬＩＳＡを使用して評価した。どのＩｇＧも強い結合を示さず、ほとんどの曲線が最大シグナルに達しなかったため（曲線の頂点は定義されていない）、ＥＣ５０値は決定されなかった。
【0183】
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるＳｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイ（ヒトＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の遮断）
さらに、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞を使用するｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＬ－４Ｒを介するＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達に対する５８個のウサギモノクローナル抗体の効果を評価した。０．０２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４又は０．３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１３によって誘導されるシグナル伝達を中和する効力（ＩＣ５０）を、すべての抗体の段階希釈物について分析し、デュピルマブの効力と比較した。異なるアッセイプレートからのＩｇＧを比較するために、相対的なＩＣ５０値を使用した。これらの値は、各アッセイプレートに含まれる参照分子デュピルマブに対するＩｇＧのＩＣ５０値を較正することによって決定された（相対ＩＣ５０：ＩＣ５０、デュピルマブ／ＩＣ５０、試験抗体）。
さらに、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞を使用するｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＬ－４Ｒを介するＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達に対する５８個のウサギモノクローナル抗体の効果を評価した。０．０２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４又は０．３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１３によって誘導されるシグナル伝達を中和する効力（ＩＣ５０）を、すべての抗体の段階希釈物について分析し、デュピルマブの効力と比較した。異なるアッセイプレートからのＩｇＧを比較するために、相対的なＩＣ５０値を使用した。これらの値は、各アッセイプレートに含まれる参照分子デュピルマブに対するＩｇＧのＩＣ５０値を較正することによって決定された（相対ＩＣ５０：ＩＣ５０、デュピルマブ／ＩＣ５０、試験抗体）。
【0184】
ＩｇＧは、デュピルマブよりも高い効力又は５倍以下の効力で、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を阻害した。ＩＬ－４誘導性シグナル伝達の遮断に関して、７つのＩｇＧが優れた効力を示し、４つのＩｇＧがデュピルマブよりも強力に、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の両方を遮断した。
【0185】
競合ＥＬＩＳＡ（ｈＩＬ－４ＲへのｈＩＬ－４結合の阻害）
ヒトＩＬ－４ＲへのヒトＩＬ－４の結合の阻害を、競合ＥＬＩＳＡによって評価した。この目的のために、ＩＬ－４をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ビオチン化ＩＬ－４Ｒをウサギモノクローナル抗体とプレインキュベートし、混合物をＥＬＩＳＡプレートに添加して、固定化ＩＬ－４に結合させた。次に、結合したビオチン化ＩＬ－４Ｒはストレプトアビジン－ＨＲＰを使用して検出された。
ヒトＩＬ－４ＲへのヒトＩＬ－４の結合の阻害を、競合ＥＬＩＳＡによって評価した。この目的のために、ＩＬ－４をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ビオチン化ＩＬ－４Ｒをウサギモノクローナル抗体とプレインキュベートし、混合物をＥＬＩＳＡプレートに添加して、固定化ＩＬ－４に結合させた。次に、結合したビオチン化ＩＬ－４Ｒはストレプトアビジン－ＨＲＰを使用して検出された。
【0186】
アッセイで使用したビオチン化ＩＬ－４Ｒの濃度が低いことを考慮すると、競合ＥＬＩＳＡは、効力に関してウサギ抗体を区別するのに十分な感度を有していた。デュピルマブと比較して、１２個のウサギ抗体はヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用をより強力に阻害し、２５個の抗体は、同様の効力又は最大２．５倍低いＩＣ５０値を示した。６つの抗体については、阻害の欠如又は相互作用の不完全な遮断のための、相対的なＩＣ５０は測定されなかった。
【0187】
ヒト化ｓｃＦｖの生成のためのウサギＩｇＧの選択
５８個の特性解析されたウサギモノクローナル抗体の薬力学的特性に基づいて、最も優れた性能を示すクローンが、ヒト化及びリード候補生成のために選択された。クローンの選択基準は、ｉ）ＨＥＫ－ＢｌｕｅアッセイにおけるＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の完全な遮断、ｉｉ）ヒトＩＬ－４Ｒに対する高い親和性、ｉｉｉ）競合ＥＬＩＳＡにおけるヒトＩＬ－４ＲのヒトＩＬ－４との相互作用の中和、ｉｖ）ＳＰＲによるカニクイザル及び／又はマーモセットＩＬ－４Ｒに対する交差反応性、及びｖ）配列多様性であった。これらの基準に加えて、５８個のクローンすべての１次配列を、相補性決定領域（ＣＤＲ）における不対システインの存在についてスクリーニングした。不対のシステインの同定では、ＣＤＲ－Ｈ１とＣＤＲ－Ｈ２に一般的に存在するシステインの対は除外された。システインの対は、ウサギの生殖系列レパートリーにコードされており、ジスルフィド架橋を形成すると考えられている。
５８個の特性解析されたウサギモノクローナル抗体の薬力学的特性に基づいて、最も優れた性能を示すクローンが、ヒト化及びリード候補生成のために選択された。クローンの選択基準は、ｉ）ＨＥＫ－ＢｌｕｅアッセイにおけるＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の完全な遮断、ｉｉ）ヒトＩＬ－４Ｒに対する高い親和性、ｉｉｉ）競合ＥＬＩＳＡにおけるヒトＩＬ－４ＲのヒトＩＬ－４との相互作用の中和、ｉｖ）ＳＰＲによるカニクイザル及び／又はマーモセットＩＬ－４Ｒに対する交差反応性、及びｖ）配列多様性であった。これらの基準に加えて、５８個のクローンすべての１次配列を、相補性決定領域（ＣＤＲ）における不対システインの存在についてスクリーニングした。不対のシステインの同定では、ＣＤＲ－Ｈ１とＣＤＲ－Ｈ２に一般的に存在するシステインの対は除外された。システインの対は、ウサギの生殖系列レパートリーにコードされており、ジスルフィド架橋を形成すると考えられている。
【0188】
ほとんどのウサギＩｇＧの親和性は装置の検出限界に近いか、又は検出限界を超えていたため、ＳＰＲによって得られたデータは慎重に処理された。その結果、ヒト化のためのウサギ抗体の選択において、ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイが注目された。ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を中和するより強力な抗体、又は最大３．３倍以下低い効力の抗体をヒト化用に選択した。合計１８個の有望なクローンが再フォーマット及びヒト化のために選択された。
【0189】
１．６．ｓｃＦｖのヒト化
リード候補世代については、１８個のウサギモノクローナル抗体クローンを選択した。これらのクローンのヒト化には、Ｎｕｍａｂ独自のヒト可変ドメインアクセプター足場の１つにウサギＣＤＲを転移することが含まれていた。このプロセスでは、６つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列が、Ｎｕｍａｂ ＣＤＲ定義（表５）を使用して同定され、Ｎｕｍａｂ独自の非常に安定した完全ヒトＶｋ１／ＶＨ３ラムダキャップアクセプターフレームワークに移植され、「ＣＤＲグラフト」と呼ばれる構築物が得られた。
リード候補世代については、１８個のウサギモノクローナル抗体クローンを選択した。これらのクローンのヒト化には、Ｎｕｍａｂ独自のヒト可変ドメインアクセプター足場の１つにウサギＣＤＲを転移することが含まれていた。このプロセスでは、６つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列が、Ｎｕｍａｂ ＣＤＲ定義（表５）を使用して同定され、Ｎｕｍａｂ独自の非常に安定した完全ヒトＶｋ１／ＶＨ３ラムダキャップアクセプターフレームワークに移植され、「ＣＤＲグラフト」と呼ばれる構築物が得られた。
【表5】
【0190】
ヒトアクセプターフレームワークへのウサギＣＤＲの排他的生着は、最も基本的な移植戦略である。しかし場合によっては、特定のＣＤＲセットが、その完全な機能を維持するために、特定のウサギフレームワーク残基の変異を必要とする。従って、「ＣＤＲグラフト」に加えて、ウサギフレームワーク残基の定義されたパターンを含む追加のグラフティング変種が設計された。
【0191】
ヒト化ｓｃＦｖ構築物を設計し、哺乳動物（ＣＨＯ－Ｓ、ｐｃＤＮＡ３．１）発現ベクターとして１ｍｇスケールで、GeneUniversal（旧General Biosystems）に注文した。以下に記載するように、ＣＨＯ－Ｓ細胞の一過性トランスフェクション用にプラスミドを使用した。
【0192】
１．７．ヒト化ｓｃＦｖの製造
哺乳類構築物の発現は、ＣＨＯｇｒｏ一過性トランスフェクションキット（Mirus）を使用してＣＨＯ－Ｓ細胞で実施した。３７℃で発現の５～７日後（細胞生存率が７０％未満に達したとき）、遠心分離とそれに続く濾過によって培養物を採取した。タンパク質を、清澄化された培養上清から、プロテインＬ親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＳＥ－ＨＰＬＣ分析による評価で、すべての分子が捕捉後のモノマー含有量＞９５％の少なくとも１つの親和性クロマトグラフィー画分を示したため、サイズ排除クロマトグラフィーによる仕上げを必要とする分子はなかった。試料を透析により最終緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸－クエン酸緩衝液、ｐＨ６．４）に再緩衝化した。製造された物質の品質管理には、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ２８０、ＳＤＳ－ＰＡＧＥなどの標準的分析方法が適用された。多重特異性抗体フォーマットへの組み込みに適していると考えられた５つのクローンに由来する１０個のｓｃＦｖ分子の製造特性が表６に要約される。クローン４４－１８－Ｃ１１（ＰＲＯ１５１０）及びその変種（ＰＲＯ１５４９～ＰＲＯ１５５４）のＣＤＲグラフト（ｓｃ０１）及び完全グラフト（ｓｃ０４）の製造特性とその変種が表７に要約される。
哺乳類構築物の発現は、ＣＨＯｇｒｏ一過性トランスフェクションキット（Mirus）を使用してＣＨＯ－Ｓ細胞で実施した。３７℃で発現の５～７日後（細胞生存率が７０％未満に達したとき）、遠心分離とそれに続く濾過によって培養物を採取した。タンパク質を、清澄化された培養上清から、プロテインＬ親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＳＥ－ＨＰＬＣ分析による評価で、すべての分子が捕捉後のモノマー含有量＞９５％の少なくとも１つの親和性クロマトグラフィー画分を示したため、サイズ排除クロマトグラフィーによる仕上げを必要とする分子はなかった。試料を透析により最終緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸－クエン酸緩衝液、ｐＨ６．４）に再緩衝化した。製造された物質の品質管理には、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ２８０、ＳＤＳ－ＰＡＧＥなどの標準的分析方法が適用された。多重特異性抗体フォーマットへの組み込みに適していると考えられた５つのクローンに由来する１０個のｓｃＦｖ分子の製造特性が表６に要約される。クローン４４－１８－Ｃ１１（ＰＲＯ１５１０）及びその変種（ＰＲＯ１５４９～ＰＲＯ１５５４）のＣＤＲグラフト（ｓｃ０１）及び完全グラフト（ｓｃ０４）の製造特性とその変種が表７に要約される。
【表6】
【表7】
【0193】
１．８．適切な抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメイン（ｓｃＦｖフォーマット）の薬力学的特性解析
適切であると評価されたヒト化ｓｃＦｖ抗体は、１次薬力学特性について解析された。
適切であると評価されたヒト化ｓｃＦｖ抗体は、１次薬力学特性について解析された。
【0194】
ヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性
ヒトＩＬ－４Ｒに対する１６個のヒト化ｓｃＦｖ（５つののウサギモノクローナル抗体から得られる）の親和性を、Ｔ２００装置（Biacore、GEHealthcare）でＳＰＲ分析によって測定した。ヒトＩＬ－４Ｒ－Ｆｃは、カルボキシルメチル化デキストラン表面に結合した抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃを介して捕捉され、ｓｃＦｖが分析物として注入された。各分析物の注入サイクル後にセンサーチップが再生され、新しい抗原が捕捉された。ｓｃＦｖは、ランニング緩衝液で希釈した０．１２～９０ｎＭの範囲の７つの分析物濃度を用いる用量応答マルチサイクル動態アッセイを使用して測定された。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用してフィッティングされた。結果は表８に要約される。
ヒトＩＬ－４Ｒに対する１６個のヒト化ｓｃＦｖ（５つののウサギモノクローナル抗体から得られる）の親和性を、Ｔ２００装置（Biacore、GEHealthcare）でＳＰＲ分析によって測定した。ヒトＩＬ－４Ｒ－Ｆｃは、カルボキシルメチル化デキストラン表面に結合した抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃを介して捕捉され、ｓｃＦｖが分析物として注入された。各分析物の注入サイクル後にセンサーチップが再生され、新しい抗原が捕捉された。ｓｃＦｖは、ランニング緩衝液で希釈した０．１２～９０ｎＭの範囲の７つの分析物濃度を用いる用量応答マルチサイクル動態アッセイを使用して測定された。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用してフィッティングされた。結果は表８に要約される。
【表8】
【0195】
表８から分かるように、クローン４４３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖ抗体可変ドメインは、ヒトＩＬ－４Ｒに対して最も優れた全体的な結合親和性を示し、それに僅差でクローン４４－３２－Ｆ０４に基づくｓｃＦｖ抗体可変ドメインが続く。
【0196】
カニクイザル、マーモセットサル、及びマウスＩＬ－４Ｒに対する親和性
カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する交差反応性を、ヒトＩＬ－４Ｒ親和性の分析と同じ設定を使用して測定したが、ヒトＩＬ－４Ｒ－Ｆｃの代わりにカニクイザルＩＬ－４Ｒ－Ｆｃが捕捉された点が異なる。マーモセットＩＬ－４Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のみが利用可能であったため、マーモセットＩＬ－４Ｒに対する親和性を測定するために、直接設定を使用した。マーモセットＥＣＤはセンサーチップ上に直接固定化され、滴定シリーズのｓｃＦｖが分析物として注入された。カニクイザル及びマーモセットＩＬ－４Ｒについて得られたＫＤ値間の比較を可能にするために、直接設定を使用してカニクイザルＩＬ－４Ｒ ＥＣＤに対する親和性も決定された。
カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する交差反応性を、ヒトＩＬ－４Ｒ親和性の分析と同じ設定を使用して測定したが、ヒトＩＬ－４Ｒ－Ｆｃの代わりにカニクイザルＩＬ－４Ｒ－Ｆｃが捕捉された点が異なる。マーモセットＩＬ－４Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のみが利用可能であったため、マーモセットＩＬ－４Ｒに対する親和性を測定するために、直接設定を使用した。マーモセットＥＣＤはセンサーチップ上に直接固定化され、滴定シリーズのｓｃＦｖが分析物として注入された。カニクイザル及びマーモセットＩＬ－４Ｒについて得られたＫＤ値間の比較を可能にするために、直接設定を使用してカニクイザルＩＬ－４Ｒ ＥＣＤに対する親和性も決定された。
【0197】
ほんのわずかのｓｃＦｖが、カニクイザルＩＬ－４Ｒ ＥＣＤに結合した。直接設定での２つのｓｃＦｖと比較して、４つのｓｃＦｖは捕捉設定で交差反応性を示し、これは、２つのｓｃＦｖの結合が直接設定ではもはや測定できなかったことを意味する。これはおそらく、直接設定で測定されたＫＤ値が低くなった結果であると考えられる。違いはオンレートによるもので、これはおそらくアクセシビリティの低下により、オンレートが遅くなったのであろう。オフレートはすべてのｓｃＦｖで同等であった。さらに、マーモセットＩＬ－４Ｒ ＥＣＤに対する交差反応性が測定された。結果は表９に要約される。表９から分かるように、クローン４４－３４－Ｃ１０及び４４－３２－Ｆ０４に基づくｓｃＦｖ抗体可変ドメインは、カニクイザルＩＬ－４Ｒ ＥＣＤ及びマーモセットＩＬ－４Ｒ ＥＣＤに対して優れた交差反応性を示す。
【0198】
マウスＩＬ－４Ｒへの結合は、ｓｃＦｖ ＰＲＯ１５１７、ＰＲＯ１５３５、及びＰＲＯ１５３８についても評価されたが、いずれも交差反応性を示さなかった。
【0199】
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイ（ヒトＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の遮断）
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイでは、ＩＬ－４Ｒを介してＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を阻害するヒト化ｓｃＦｖの能力を試験した。ウェルあたり５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種した。ｓｃＦｖ及び対照抗体デュピルマブの連続希釈物を、０．０２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４又は０．３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１３のいずれかの存在下でプレートに添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、上清を新しいプレートに移し、分泌された胎児アルカリホスファターゼをQuanti-Blue基質を使用して定量した。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイでは、ＩＬ－４Ｒを介してＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を阻害するヒト化ｓｃＦｖの能力を試験した。ウェルあたり５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種した。ｓｃＦｖ及び対照抗体デュピルマブの連続希釈物を、０．０２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４又は０．３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１３のいずれかの存在下でプレートに添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、上清を新しいプレートに移し、分泌された胎児アルカリホスファターゼをQuanti-Blue基質を使用して定量した。
【0200】
ｓｃＦｖは、このＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイで、ＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達を遮断する能力について分析された。分析された分子の効力がデュピルマブと比較された。すべての効力データは表１０に要約される。ＩＬ－４誘導性シグナル伝達及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の遮断に関するＰＲＯ１５１５、ＰＲＯ１５１７、ＰＲＯ１５２４、ＰＲＯ１５３５、及びＰＲＯ１５５２の代表的な用量反応曲線をそれぞれ図１及び２に示す。相対ＩＣ５０値は、デュピルマブ及びｓｃＦｖの質量単位（ｎｇ／ｍｌ）で計算した。１０個のｓｃＦｖは、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を高い効力で遮断した。クローン４４－３４－Ｃ１０及び４４－３２－Ｆ０４に基づくｓｃＦｖ、並びにＰＲＯ１５５２は、全体として最高の遮断効力を示した。ＰＲＯ１５１５、ＰＲＯ１５１７、ＰＲＯ１５２４、ＰＲＯ１５３３、ＰＲＯ１５３５、ＰＲＯ１５３８、及びＰＲＯ１５５２は、デュピルマブと同様の効力でＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を遮断する可能性がある。
【0201】
競合ＥＬＩＳＡ（ｈＩＬ－４ＲへのｈＩＬ－４結合の阻害）
ヒト化ｓｃＦｖの効力は、競合ＥＬＩＳＡを使用してさらに決定された。ヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用を阻害する各ｓｃＦｖの効力を、上述したものと同じ手順を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。同様に、ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイに対して、各プレート上の個々のＩＣ５０値を、参照分子デュピルマブのＩＣ５０に対して較正した。
ヒト化ｓｃＦｖの効力は、競合ＥＬＩＳＡを使用してさらに決定された。ヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用を阻害する各ｓｃＦｖの効力を、上述したものと同じ手順を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。同様に、ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイに対して、各プレート上の個々のＩＣ５０値を、参照分子デュピルマブのＩＣ５０に対して較正した。
【0202】
遮断データは表１１に要約される。ＰＲＯ１５１５、ＰＲＯ１５１７、ＰＲＯ１５３３、ＰＲＯ１５３５、及びＰＲＯ１５３８の代表的な用量反応曲線は図４に示される。６つのｓｃＦｖは、ヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用を良好な効力～高い効力で阻害した。クローン４４－３４－Ｃ１０及び４４－３２－Ｆ０４に基づくｓｃＦｖ及びＰＲＯ１５５２は、全体として最高の遮断能力を示した。ＰＲＯ１５１５、ＰＲＯ１５１７、及びＰＲＯ１５５２の遮断能力はデュピルマブと同様であった。一方、ＰＲＯ１５３８は中程度の阻害のみを示した。５つのｓｃＦｖ分子は阻害を示さなかった。
【0203】
ｓｃＦｖの薬理学的特性解析と開発可能性評価のための分子選択の概要
５つの異なるＢ細胞クローンに由来する１６個のｓｃＦｖの薬理学的特性解析は、拡張された生物物理学的特性解析のための分子選択の基礎を提供した。ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイ及びＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒ遮断ＥＬＩＳＡにおける、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の中和に関する全体的に優れた性能に基づいて、さらに拡張された特性解析のために、７つの分子、すなわちＰＲＯ１５１５、ＰＲＯ１５１７、ＰＲＯ１５３３、ＰＲＯ１５３５、ＰＲＯ１５２４、ＰＲＯ１５０６、及びＰＲＯ１５３８が選択された。７つの分子すべてが５００ｐＭより優れた親和性を示した。カニクイザルＩＬ－４Ｒに対して非常に低い親和性を示すか結合を示さなかった３分子を除いて、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する親和性は、ヒトＩＬ－４Ｒと比較して４～２０倍低かった。特に、クローン４４－１８－Ｃ１１に基づくｓｃＦｖ、すなわちＰＲＯ１５１０、ＰＲＯ１５２８、及びＰＲＯ１５４９～ＰＲＯ１５５４は、カニクイザルＩＬ－４Ｒへの結合を示さなかった。一般に、マーモセットサルＩＬ－４Ｒに対するこれらのｓｃＦｖの親和性も、ヒトＩＬ－４Ｒと比較して低かった。
５つの異なるＢ細胞クローンに由来する１６個のｓｃＦｖの薬理学的特性解析は、拡張された生物物理学的特性解析のための分子選択の基礎を提供した。ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイ及びＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒ遮断ＥＬＩＳＡにおける、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の中和に関する全体的に優れた性能に基づいて、さらに拡張された特性解析のために、７つの分子、すなわちＰＲＯ１５１５、ＰＲＯ１５１７、ＰＲＯ１５３３、ＰＲＯ１５３５、ＰＲＯ１５２４、ＰＲＯ１５０６、及びＰＲＯ１５３８が選択された。７つの分子すべてが５００ｐＭより優れた親和性を示した。カニクイザルＩＬ－４Ｒに対して非常に低い親和性を示すか結合を示さなかった３分子を除いて、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する親和性は、ヒトＩＬ－４Ｒと比較して４～２０倍低かった。特に、クローン４４－１８－Ｃ１１に基づくｓｃＦｖ、すなわちＰＲＯ１５１０、ＰＲＯ１５２８、及びＰＲＯ１５４９～ＰＲＯ１５５４は、カニクイザルＩＬ－４Ｒへの結合を示さなかった。一般に、マーモセットサルＩＬ－４Ｒに対するこれらのｓｃＦｖの親和性も、ヒトＩＬ－４Ｒと比較して低かった。
【0204】
前記親和性試験の結果、クローン４４－１８－Ｃ１１に基づくｓｃＦｖ、すなわちＰＲＯ１５１０、ＰＲＯ１５２８、及びＰＲＯ１５４９～ＰＲＯ１５５４は、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する交差反応性がないため、さらなる評価から除外されたが、ＰＲＯ１５５２は非常に優れた阻害効力を示した。同じ理由で、ＰＲＯ１５２０も除外された。しかし、同じクローン４４－３９－Ｂ０７に基づくＰＲＯ１５３８は、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する結合親和性が弱いにもかかわらず、除外されなかった。
【表9】
【表10】
【表11】
【0205】
１．９．適切な抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメイン（ｓｃＦｖフォーマット）の生物物理学的特性解析
安定性測定用材料の製造
ＰＲＯ１５１５、ＰＲＯ１５１７、及びＰＲＯ１５３８は、安定性評価に十分な材料を生成するために、上記と同じ製造プロセスを使用して、わずかに大きなスケール（発現量０．２５ｌ）で再度生成された。安定性評価のために選択された他のタンパク質については、以前に生成された材料の量が安定性評価を行うのに十分であった。試料は、精製後、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸－クエン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｉＰ、ｐＨ６．４）中で調製された。精製と透析後、５ＭＷＣＯの遠心濃縮チューブを使用してタンパク質試料を１０ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮したが、これは保存安定性評価を行うための望ましい濃度であるためである。
安定性測定用材料の製造
ＰＲＯ１５１５、ＰＲＯ１５１７、及びＰＲＯ１５３８は、安定性評価に十分な材料を生成するために、上記と同じ製造プロセスを使用して、わずかに大きなスケール（発現量０．２５ｌ）で再度生成された。安定性評価のために選択された他のタンパク質については、以前に生成された材料の量が安定性評価を行うのに十分であった。試料は、精製後、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸－クエン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｉＰ、ｐＨ６．４）中で調製された。精製と透析後、５ＭＷＣＯの遠心濃縮チューブを使用してタンパク質試料を１０ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮したが、これは保存安定性評価を行うための望ましい濃度であるためである。
【0206】
表１２に示されるように、１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮したときのモノマー損失は、分子に応じて０～１２％であった。ＰＲＯ１５０６、ＰＲＯ１５１５、ＰＲＯ１５２４、及びＰＲＯ１５３３のモノマー含有量は、保存安定性評価に入る分子の臨界値である９５％を下回り、このため、これらを試験から除外した。しかし材料は既に調製され、試験用にすべてが準備されていたため、これらの分子の安定性を、濃縮後に９５％を超えるモノマー含有量を示した残りの分子と共に評価した。クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖ、すなわちＰＲＯ１５１７とＰＲＯ１５３５、並びにＰＲＯ１５３８は、濃縮しても実質的にモノマー含有量の損失を示さなかった。
【表12】
【0207】
保存安定性試験
ヒト化ｓｃＦｖは、４週間の安定性試験などの安定性試験に供され、ここでｓｃＦｖは、水性緩衝液（５０ｍＭＮａＣｉＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４）中で１０ｍｇ／ｍｌで調製され、＜－８０℃、４℃、及び４０℃で４週間保存された。少なくとも、調製物中のモノマー及びオリゴマーの割合は、各試験の１週間後、２週間後、及び終了時のＳＥ－ＨＰＬＣピーク面積の積分によって評価された。ほとんどの分子について追加の時点が記録された。表１３は、試験のｄ１４（１４日目）とｄ２８（２８日目）に得られたエンドポイント測定値を比較している。
ヒト化ｓｃＦｖは、４週間の安定性試験などの安定性試験に供され、ここでｓｃＦｖは、水性緩衝液（５０ｍＭＮａＣｉＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４）中で１０ｍｇ／ｍｌで調製され、＜－８０℃、４℃、及び４０℃で４週間保存された。少なくとも、調製物中のモノマー及びオリゴマーの割合は、各試験の１週間後、２週間後、及び終了時のＳＥ－ＨＰＬＣピーク面積の積分によって評価された。ほとんどの分子について追加の時点が記録された。表１３は、試験のｄ１４（１４日目）とｄ２８（２８日目）に得られたエンドポイント測定値を比較している。
【0208】
表１３から分かるように、クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖ、すなわちＰＲＯ１５１７とＰＲＯ１５３５は、４℃で良好な保存安定性を示した。４℃で２８日間保存した後のモノマー含有量の損失は５％未満であった。また、ＰＲＯ１５３８は少なくとも１４日間は良好な保存安定性を示した。一方、ＰＲＯ１５１５は、４℃の保存で＞１０％のモノマー含有量の損失を示し、これが除外の明確な理由である。しかし、安定な分子はどれも、どの温度でもタンパク質含有量の大幅な損失を示さなかった。
【0209】
凍結－融解安定性
上記の保存安定性試験に加えて、凍結－融解（Ｆ／Ｔ）サイクルに関する最高性能のｓｃＦｖ分子の適合性（コロイド安定性）を評価した。開発の初期段階では、原薬は通常冷凍保存されるため、調製及び充填／仕上げ処理には、ある程度の凍結と融解操作が必要になる。
上記の保存安定性試験に加えて、凍結－融解（Ｆ／Ｔ）サイクルに関する最高性能のｓｃＦｖ分子の適合性（コロイド安定性）を評価した。開発の初期段階では、原薬は通常冷凍保存されるため、調製及び充填／仕上げ処理には、ある程度の凍結と融解操作が必要になる。
【0210】
Ｆ／Ｔ安定性評価では、保存安定性試験と同じ分析方法（ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びパラメータ（モノマー含有率％とモノマー損失％）を適用して、５回のＦ／Ｔサイクルにわたって分子の品質を追跡した。表１４は、５回のＦ／Ｔサイクルにわたるモノマー含有量損失％の経過を示す。専用の凍結－融解試験は実施されていないため、２８日間にわたって取得された保存安定性試験の－８０℃試料で得られた凍結－融解データが示される。一部のタンパク質では４つの時点しか記録できなかったため、これらのタンパク質ではＦ／Ｔサイクルも４回だけ実施された。表１４からわかるように、ＰＲＯ１５１５やＰＲＯ１５３３とは別に、他の試験したｓｃＦｖのいずれも、モノマー含有量の顕著な損失を示さなかった。
【0211】
熱アンフォールディング
選択した５つのｓｃＦｖ構築物の熱アンフォールディング測定を、示差走査蛍光法（ＤＳＦ）を使用して実施した。得られた熱アンフォールディングの中点（Ｔｍ）及び最大シグナルの１０％で計算されたアンフォールディングの開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ １０％）値を、データをボルツマン方程式に当てはめることによって決定した。表１５は、ＤＳＦによって測定された計算された融解温度をまとめたものである。表１５から推測できるように、クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖは、６３℃を超える高い融解温度を示す。また、ＰＲＯ１５３８も高い融解温度を示した。
選択した５つのｓｃＦｖ構築物の熱アンフォールディング測定を、示差走査蛍光法（ＤＳＦ）を使用して実施した。得られた熱アンフォールディングの中点（Ｔｍ）及び最大シグナルの１０％で計算されたアンフォールディングの開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ １０％）値を、データをボルツマン方程式に当てはめることによって決定した。表１５は、ＤＳＦによって測定された計算された融解温度をまとめたものである。表１５から推測できるように、クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖは、６３℃を超える高い融解温度を示す。また、ＰＲＯ１５３８も高い融解温度を示した。
【表13】
【表14】
【表15】
【0212】
実施例２：多重特異性フォーマットのための抗ＩＬ－４Ｒ分子の選択と最適化：
２．１．最適化のための抗ＩＬ－４Ｒドメインの選択に関する一般的な説明
抗ＩＬ－４ＲドメインＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）及びＰＲＯ１５３５（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０４）は、非常に良好な薬力学的特性と許容可能～良好な安定性を示すため、最初に選択された。ＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０４）は、改善余地のある薬理学的特性を有したが、最高の安定性を示したため、同様に選択された。以下の２．２に示されるように、ＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）は安定性の最適化を受け、及びＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０４）はｐＩバランスの最適化を受けた。
２．１．最適化のための抗ＩＬ－４Ｒドメインの選択に関する一般的な説明
抗ＩＬ－４ＲドメインＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）及びＰＲＯ１５３５（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０４）は、非常に良好な薬力学的特性と許容可能～良好な安定性を示すため、最初に選択された。ＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０４）は、改善余地のある薬理学的特性を有したが、最高の安定性を示したため、同様に選択された。以下の２．２に示されるように、ＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）は安定性の最適化を受け、及びＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０４）はｐＩバランスの最適化を受けた。
【0213】
最終的な多重特異性抗体に適用された抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメインは、カニクイザル及びマーモセットサルに対して排他的な交差反応性を示した。
【0214】
２．２．抗ＩＬ－４Ｒドメインの最適化
抗ＩＬ－４ＲドメインＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０３）及びＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）は、多重特異性フォーマットへの組み立てのためにさらに最適化された。
抗ＩＬ－４ＲドメインＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０３）及びＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）は、多重特異性フォーマットへの組み立てのためにさらに最適化された。
【0215】
抗ＩＬ－４Ｒドメイン４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０４（ＰＲＯ１５３８）の最適化
ＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０３）は、ＶＬとＶＨの間にｐＩの不均衡がある（ｐＩＶＬ＝８．２及びｐＩＶＨ＝５．０）。ｐＩの不均衡は高粘度と相関しており、安定性に悪影響を与える可能性がある。従って、この分子の２つの新しい変種が設計された。これらの変種は以下で説明される。簡単に説明すると、ｐＩ不均衡が除去され、結合親和性を損なうことのない、及び重大な配列欠陥（化学修飾及び翻訳後修飾）、Ｔ細胞エピトープなどを導入することのない分子を設計することを目的として、ＶＨのすべての残基が詳細に分析された。
ＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０３）は、ＶＬとＶＨの間にｐＩの不均衡がある（ｐＩＶＬ＝８．２及びｐＩＶＨ＝５．０）。ｐＩの不均衡は高粘度と相関しており、安定性に悪影響を与える可能性がある。従って、この分子の２つの新しい変種が設計された。これらの変種は以下で説明される。簡単に説明すると、ｐＩ不均衡が除去され、結合親和性を損なうことのない、及び重大な配列欠陥（化学修飾及び翻訳後修飾）、Ｔ細胞エピトープなどを導入することのない分子を設計することを目的として、ＶＨのすべての残基が詳細に分析された。
【0216】
２つの変種が設計され、これらは表１６に要約される。
【表16】
【0217】
しかしながら、ＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０３）のこれらの変種は、望ましい安定性の改善を示さなかった。ＰＲＯ１５３８は、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を阻害する効力が著しく低く、ＩＬ－４とＩＬ－４Ｒの相互作用を遮断する能力がＰＲＯ１５１７よりも１０倍以上低いため、ＰＲＯ１５３８及びその変種はさらなる検討から除外され、ＲＰＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）の改善に努力が集中された。
【0218】
抗ＩＬ－４Ｒドメイン４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１（ＰＲＯ１５１７）の最適化
ＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）は、良好な結合特性を備えた抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖである。生物物理学的特性解析中、ｓｃＦｖ ＰＲＯ１５１７は良好ではあるが、まだ改善余地のある溶解度特性を示した。溶解度、長期安定性、濃度挙動に関して、ＰＲＯ１５１７をさらに改善する試みが行われた。従って、この分子の４つの新しい変種が設計された。これらの変種は以下で説明される。簡単に説明すると、ＣＤＲ又は以前のＶＨ－ＣＨ界面中の疎水性パッチが詳細に分析され、結合親和性を損なうことなく、重大な配列欠陥（化学修飾及び翻訳後修飾）、Ｔ細胞エピトープなどを導入することなく、疎水性パッチが除去された分子を設計することを目的として、ｐＩ不均衡が低減されている。
ＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）は、良好な結合特性を備えた抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖである。生物物理学的特性解析中、ｓｃＦｖ ＰＲＯ１５１７は良好ではあるが、まだ改善余地のある溶解度特性を示した。溶解度、長期安定性、濃度挙動に関して、ＰＲＯ１５１７をさらに改善する試みが行われた。従って、この分子の４つの新しい変種が設計された。これらの変種は以下で説明される。簡単に説明すると、ＣＤＲ又は以前のＶＨ－ＣＨ界面中の疎水性パッチが詳細に分析され、結合親和性を損なうことなく、重大な配列欠陥（化学修飾及び翻訳後修飾）、Ｔ細胞エピトープなどを導入することなく、疎水性パッチが除去された分子を設計することを目的として、ｐＩ不均衡が低減されている。
【0219】
４つの変種が設計され、これらは表１７に要約される。
【表17】
【0220】
２．３．最適化された抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメイン（ｓｃＦｖフォーマット）の生物物理学的特性解析
保存安定性試験
ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９は、セクション１．９で上述した保存安定性試験に供された。結果は表１８に要約される。
保存安定性試験
ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９は、セクション１．９で上述した保存安定性試験に供された。結果は表１８に要約される。
【0221】
表１９に示されているように、ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９は優れた保存安定性を示す。４℃で２８日間保存した後のモノマー含有量の損失は５％未満であった。また、これらの分子はいずれの温度でもタンパク質含有量の大幅な損失を示さなかった。
【0222】
熱アンフォールディング
ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９の熱安定性は、NanoTemperを使用するナノダイナミック走査蛍光分析（ｎＤＳＦ）によって分析され、アンフォールディングの開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ）、アンフォールディングの中点（Ｔｍ１）、及び散乱開始温度を決定することができた。二重／三重測定のＴｍ１及びＴｏｎｓｅｔ結果は表１９に要約される。表１９から推測できるように、ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９は高い融解温度を示す。
ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９の熱安定性は、NanoTemperを使用するナノダイナミック走査蛍光分析（ｎＤＳＦ）によって分析され、アンフォールディングの開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ）、アンフォールディングの中点（Ｔｍ１）、及び散乱開始温度を決定することができた。二重／三重測定のＴｍ１及びＴｏｎｓｅｔ結果は表１９に要約される。表１９から推測できるように、ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９は高い融解温度を示す。
【0223】
２．４．最適化された抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメイン（ｓｃＦｖフォーマット）の薬力学的特性解析
ヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性
セクション１．５又は１．８で上述したように、最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９のヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性を、Ｔ２００装置（Biacore、GEHealthcare）でＳＰＲ分析によって測定した。ｓｃＦｖは、ランニング緩衝液で希釈した０．１２～９０ｎＭの範囲の７つの分析物濃度を用いて、用量応答マルチサイクル動態アッセイを使用して測定した。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用してフィッティングされた。
ヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性
セクション１．５又は１．８で上述したように、最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９のヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性を、Ｔ２００装置（Biacore、GEHealthcare）でＳＰＲ分析によって測定した。ｓｃＦｖは、ランニング緩衝液で希釈した０．１２～９０ｎＭの範囲の７つの分析物濃度を用いて、用量応答マルチサイクル動態アッセイを使用して測定した。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用してフィッティングされた。
【0224】
表２０に示されるように、すべての最適化されたｓｃＦｖについて、ヒトＩＬ－４Ｒ及びカニクイザルＩＬ－４Ｒへの結合が確認された。
【表18】
【表19】
【表20】
【0225】
カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する親和性
最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９のカニクイザルＩＬ－４Ｒに対する親和性を、ヒトＩＬ－４Ｒ親和性の分析と同じ設定を使用して測定したが、セクション１．５又は１．８で上述されたように、ヒトＩＬ－４Ｒ－Ｆｃの代わりにカニクイザルＩＬ－４Ｒ－Ｆｃが捕捉された点が異なる。この分析の結果は表２１に要約される。
最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９のカニクイザルＩＬ－４Ｒに対する親和性を、ヒトＩＬ－４Ｒ親和性の分析と同じ設定を使用して測定したが、セクション１．５又は１．８で上述されたように、ヒトＩＬ－４Ｒ－Ｆｃの代わりにカニクイザルＩＬ－４Ｒ－Ｆｃが捕捉された点が異なる。この分析の結果は表２１に要約される。
【表21】
【0226】
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイ（ヒトＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の遮断）
最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９は、セクション１．５又は１．８で上述されたように、ＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達を遮断する能力について、このＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイで分析された。分析された分子の効力を、デュピルマブと比較した。すべての効力データが表２２に要約される。相対ＩＣ５０値を、デュピルマブ及びｓｃＦｖの質量単位（ｎｇ／ｍｌ）で計算した。最適化されたｓｃＦｖは、デュピルマブと同様の高い効力でＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を遮断した（図３を参照）。
最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９は、セクション１．５又は１．８で上述されたように、ＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達を遮断する能力について、このＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイで分析された。分析された分子の効力を、デュピルマブと比較した。すべての効力データが表２２に要約される。相対ＩＣ５０値を、デュピルマブ及びｓｃＦｖの質量単位（ｎｇ／ｍｌ）で計算した。最適化されたｓｃＦｖは、デュピルマブと同様の高い効力でＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を遮断した（図３を参照）。
【表22】
【0227】
競合ＥＬＩＳＡ（ｈＩＬ－４ＲへのｈＩＬ－４結合の阻害）
最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９ｓｃＦｖの効力は、競合ＥＬＩＳＡを使用して測定された。ヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用を阻害する各ｓｃＦｖの効力を、セクション１．５又は１．８に記載されているようにＥＬＩＳＡによって評価した。同様に、ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイに対して、各プレート上の個々のＩＣ５０値を、参照分子デュピルマブのＩＣ５０に対して較正した。
最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９ｓｃＦｖの効力は、競合ＥＬＩＳＡを使用して測定された。ヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用を阻害する各ｓｃＦｖの効力を、セクション１．５又は１．８に記載されているようにＥＬＩＳＡによって評価した。同様に、ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイに対して、各プレート上の個々のＩＣ５０値を、参照分子デュピルマブのＩＣ５０に対して較正した。
【0228】
【0229】
実施例３：モリソン－Ｈ ＩｇＧ４に基づく抗ＩＬ－４Ｒ×ＩＬ－３１二重特異性抗体
次に、本発明の抗ＩＬ－４Ｒ抗体可変ドメインが、多重特異性抗体フォーマットに組み込まれた場合に、有利な生物学的及び生物物理学的特性も提供するかどうかをさらに試験した。従って、多重特異性抗体は、本明細書で定義されるように、２つの抗ＩＬ－４Ｒ抗体可変ドメインを含むモリソン－Ｈ ＩｇＧ４フォーマットに基づいて設計された。ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する結合ドメインとして、２つのＩＬ－３１結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）が選択された。
次に、本発明の抗ＩＬ－４Ｒ抗体可変ドメインが、多重特異性抗体フォーマットに組み込まれた場合に、有利な生物学的及び生物物理学的特性も提供するかどうかをさらに試験した。従って、多重特異性抗体は、本明細書で定義されるように、２つの抗ＩＬ－４Ｒ抗体可変ドメインを含むモリソン－Ｈ ＩｇＧ４フォーマットに基づいて設計された。ＩＬ－４Ｒとは異なる標的に特異的に結合する結合ドメインとして、２つのＩＬ－３１結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）が選択された。
【0230】
３．１．モリソンフォーマットの設計
モリソン－Ｈフォーマットを有する一連の抗ＩＬ－４Ｒ×ＩＬ－３１二重特異性抗体が設計され、ここでＦｃ領域はＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ４に由来した。
モリソン－Ｈフォーマットを有する一連の抗ＩＬ－４Ｒ×ＩＬ－３１二重特異性抗体が設計され、ここでＦｃ領域はＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ４に由来した。
【0231】
カニクイザルＩＬ－４Ｒに対するこれらの交差反応性、ＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達を遮断するこれらの優れた効力、及び優れた生物物理学的特性により、抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ可変ドメイン４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０８及び４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０９が、モリソン－Ｈ構築物のＦａｂアーム結合ドメインとして選択された。同様に、これらの優れた生物学的特性及び生物物理学的特性により、抗ＩＬ３１ ｓｃＦｖ５０－０９－Ｄ０７－ｓｃ０４が、モリソン－Ｈ抗体の重鎖のＣ末端に融合されたｓｃＦｖドメインとして選択された。
【0232】
ヒト化抗ＩＬ－３１結合ドメイン５０－０９－Ｄ０７－ｓｃ０４の同定、ヒト化、産生、及び最終的選択は、抗ＩＬ－４Ｒ抗体可変ドメインについて上記したのと同じ方法を用いて実施した。
【0233】
２つのＩｇＧ４－（ｓｃＦｖ）２モリソン－Ｈ分子、すなわち表２４に示されるＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９が設計された（モリソン－Ｈ）。
【表24】
【0234】
多重特異性抗体ＰＲＯ２１９８とＰＲＯ２１９９の発現は、一過性ＣＨＯｇｒｏ発現システム（Mirus）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ－Ｓ細胞で実施された。目的の遺伝子は哺乳類での発現用に最適化され、合成され、標準的なｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローン化された。発現培養物を、振盪フラスコを使用してバッチで３７℃で６～７日間培養した（細胞生存率＜７０％）。遠心分離とその後の０．２２μｍ滅菌濾過により、培養上清を細胞から分離した。標的タンパク質は、プロテインＬ又はＡ親和性クロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーの仕上げ工程（捕捉後に既に、ＳＥ－ＨＰＬＣによって評価された適切なモノマー含有量を含む画分が利用可能でなかった場合）によって、清澄化した培養上清から捕捉された。製造された材料の品質管理には、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＵＶ２８０などの標準的な分析方法が使用された。
【0235】
３．２．ヒト及びカニクイザルＩＬ－４Ｒに対する親和性
二重特異性モリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９の組換えヒトＩＬ－４Ｒタンパク質（Ｈｉｓタグ付きＥＣＤ、Sino Biological）への結合動態（親和性を含む）は、Ｔ２００装置（Biacore, Cytiva）でＳＰＲ分析によって測定された。このＳＰＲ実験では、モリソン分子は、カルボキシルメチル化デキストラン表面（ＣＭ５センサーチップ；Biacore, Cytiva）に共有結合的に固定化された抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体（Human Antibody Capture キット；Biacore, Cytiva）を介して捕捉され、及び力価測定シリーズのヒトＩＬ－４Ｒ ＥＣＤを分析物として注入した。各分析物の注入サイクル後、センサーチップが再生され（ＭｇＣｌ２）、その後新しいモリソン抗体が再捕捉された。ヒトＩＬ－４Ｒへの結合動態は、マルチサイクル動態アッセイで、ランニング緩衝液（ヘペス緩衝化生理食塩水、０．０５％ツイーン－２０、ｐＨ７．５）で希釈した０．１７５～４５ｎＭの範囲の９つの分析物濃度を使用して測定された。見かけの解離定数（ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数、及び見かけの解離平衡定数（ＫＤ）は、Biacore解析ソフトウェア（Biacore Evaluation ソフトウェアバージョン３．２、Cytiva）で、１対１のラングミュア結合モデルを使用して計算され、そして、適合の品質は、曲線フィッティングの品質の尺度であるＣｈｉ２とＵ値に基づいて追跡された。結合レベルは、理論上のＲｍａｘに対して正規化された、達成された最大安定結合として計算された。カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する交差反応性は、ヒトＩＬ－４Ｒ動態の分析と同じ設定を使用して測定したが、組換えカニクイザルＩＬ－４Ｒ（Ｈｉｓタグ付きＥＣＤ、Acro Biosystems）タンパク質をヒトＩＬ－４Ｒの代わりの分析物を使用した点が異なる。
二重特異性モリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９の組換えヒトＩＬ－４Ｒタンパク質（Ｈｉｓタグ付きＥＣＤ、Sino Biological）への結合動態（親和性を含む）は、Ｔ２００装置（Biacore, Cytiva）でＳＰＲ分析によって測定された。このＳＰＲ実験では、モリソン分子は、カルボキシルメチル化デキストラン表面（ＣＭ５センサーチップ；Biacore, Cytiva）に共有結合的に固定化された抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体（Human Antibody Capture キット；Biacore, Cytiva）を介して捕捉され、及び力価測定シリーズのヒトＩＬ－４Ｒ ＥＣＤを分析物として注入した。各分析物の注入サイクル後、センサーチップが再生され（ＭｇＣｌ２）、その後新しいモリソン抗体が再捕捉された。ヒトＩＬ－４Ｒへの結合動態は、マルチサイクル動態アッセイで、ランニング緩衝液（ヘペス緩衝化生理食塩水、０．０５％ツイーン－２０、ｐＨ７．５）で希釈した０．１７５～４５ｎＭの範囲の９つの分析物濃度を使用して測定された。見かけの解離定数（ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数、及び見かけの解離平衡定数（ＫＤ）は、Biacore解析ソフトウェア（Biacore Evaluation ソフトウェアバージョン３．２、Cytiva）で、１対１のラングミュア結合モデルを使用して計算され、そして、適合の品質は、曲線フィッティングの品質の尺度であるＣｈｉ２とＵ値に基づいて追跡された。結合レベルは、理論上のＲｍａｘに対して正規化された、達成された最大安定結合として計算された。カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する交差反応性は、ヒトＩＬ－４Ｒ動態の分析と同じ設定を使用して測定したが、組換えカニクイザルＩＬ－４Ｒ（Ｈｉｓタグ付きＥＣＤ、Acro Biosystems）タンパク質をヒトＩＬ－４Ｒの代わりの分析物を使用した点が異なる。
【0236】
表２５に示されるように、モリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９について、ヒトＩＬ－４Ｒ及びカニクイザルＩＬ－４Ｒへの高親和性結合が証明された。
【表25】
【表26】
【表27】
【0237】
３．３．ヒトＩＬ－４及びＩＬ－１３シグナル伝達を阻害する効力の評価（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイ）
モリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９が、ＩＬ－４Ｒを介してＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を阻害する能力を試験するために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイが使用された。ウェルあたり５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種した。１００～０．００２ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のモリソン分子及び参照抗体デュピルマブの３倍連続希釈物を、０．０５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４又は０．３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１３のいずれかの存在下でプレートに添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、上清を新しいプレートに移し、分泌された胎児アルカリホスファターゼをQuanti-Blue基質を使用して定量した。モリソン－ＨＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９も、アッセイ培地中の過剰なＩＬ－３１（１０ｎＭ）によるＩＬ－４誘導性シグナル伝達の阻害について試験した。
モリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９が、ＩＬ－４Ｒを介してＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を阻害する能力を試験するために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイが使用された。ウェルあたり５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種した。１００～０．００２ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のモリソン分子及び参照抗体デュピルマブの３倍連続希釈物を、０．０５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４又は０．３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１３のいずれかの存在下でプレートに添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、上清を新しいプレートに移し、分泌された胎児アルカリホスファターゼをQuanti-Blue基質を使用して定量した。モリソン－ＨＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９も、アッセイ培地中の過剰なＩＬ－３１（１０ｎＭ）によるＩＬ－４誘導性シグナル伝達の阻害について試験した。
【0238】
すべての効力データが表２６（ＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒ阻害）及び表２７（ＩＬ－１３／ＩＬ－４Ｒ阻害）に要約される。反復分析からの平均相対ＩＣ５０値（ｐＭ）も示される。モリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９は、デュピルマブと同等の効力で、ＩＬ－４又はＩＬ－１３とＩＬ４Ｒとの相互作用を効率的に遮断した。
【0239】
３．４．ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９の生物物理学的特性解析：
３．４．１．熱安定性
ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９を、ｐＨ５とｐＨ８．５の間での熱安定性について分析した。熱的アンフォールディングと熱的凝集の開始の両方が測定された。熱的アンフォールディング中、分子のマルチドメイン構造により、すべての分子が複数の遷移を示した。簡単にするために、最初の融解中間点のみを示す。結果は表２８に要約される。
３．４．１．熱安定性
ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９を、ｐＨ５とｐＨ８．５の間での熱安定性について分析した。熱的アンフォールディングと熱的凝集の開始の両方が測定された。熱的アンフォールディング中、分子のマルチドメイン構造により、すべての分子が複数の遷移を示した。簡単にするために、最初の融解中間点のみを示す。結果は表２８に要約される。
【表28】
【0240】
アンフォールディングの開始（Ｔｏｎｓｅｔ）及び最初の融点（Ｔｍ１）は、すべての分子についてｐＨ７で最も高かった。ｐＨ８．５に変更しても、熱安定性はわずかに低下するだけであった。ｐＨが酸性になると、熱安定性が低下した。しかし、ｐＨ５では、アンフォールディングの開始はすべて５５℃超であった。
【0241】
熱凝集は、ｐＨ７及びｐＨ８．５でのみ観察された。ｐＨ５．０では、両方のモリソン抗体は、アンフォールディングされた状態であっても、より大きな凝集体を形成しなかった。中性及び塩基性ｐＨでは、凝集の開始は最初の融点を超えており、非天然の凝集メカニズムを示唆している。
【0242】
３．４．２．高濃度安定性試験
高濃度安定性試験では、ＰＲＯ２１９８を２つの調製緩衝液で調製した。
調製緩衝液Ｆ１：２０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．５；
調製緩衝液Ｆ２：２０ｍＭクエン酸塩、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５。
高濃度安定性試験では、ＰＲＯ２１９８を２つの調製緩衝液で調製した。
調製緩衝液Ｆ１：２０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．５；
調製緩衝液Ｆ２：２０ｍＭクエン酸塩、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５。
【0243】
溶解度－タンパク質濃度
ＰＲＯ２１９８は、沈殿の兆候や溶解度の限界に達することなく、１００ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮できた。さらに、ＰＲＯ２１９８はタンパク質濃度の検出可能な減少を示さず、すなわちＰＲＯ２１９８は、十分に可溶性であり、４℃及び２５℃で少なくとも４週間、１００ｍｇ／ｍｌを超える目標濃度に達し、その濃度を維持した。
ＰＲＯ２１９８は、沈殿の兆候や溶解度の限界に達することなく、１００ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮できた。さらに、ＰＲＯ２１９８はタンパク質濃度の検出可能な減少を示さず、すなわちＰＲＯ２１９８は、十分に可溶性であり、４℃及び２５℃で少なくとも４週間、１００ｍｇ／ｍｌを超える目標濃度に達し、その濃度を維持した。
【0244】
さまざまな温度でのモノマーの安定性
ＰＲＯ２１９８をＦ１及びＦ２で調製し、１００ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮した。濃縮試料は４℃、２５℃、及び４０℃で最長４週間保存された。異なる時点で、モノマー含有量をＳＥ－ＨＰＬＣによって分析した。結果は表２９に要約される。
ＰＲＯ２１９８をＦ１及びＦ２で調製し、１００ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮した。濃縮試料は４℃、２５℃、及び４０℃で最長４週間保存された。異なる時点で、モノマー含有量をＳＥ－ＨＰＬＣによって分析した。結果は表２９に要約される。
【表29】
【0245】
３．５．ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９の生物物理学的特性解析に使用される一般的方法
緩衝液交換
緩衝液交換は透析によって行った。抗体は、少なくとも２００倍過剰の透析緩衝液を用いてSpectra Pro３透析膜（Spectrum Laboratories）中で透析した。
緩衝液交換
緩衝液交換は透析によって行った。抗体は、少なくとも２００倍過剰の透析緩衝液を用いてSpectra Pro３透析膜（Spectrum Laboratories）中で透析した。
【0246】
抗体の濃縮
抗体は、１０ｋＤａ又は３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を備えた遠心濃縮機を使用して濃縮された。試料は、目標濃度に達するまで、２２℃で５分ずつの工程で遠心分離された。工程間で試料は再懸濁される。
抗体は、１０ｋＤａ又は３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を備えた遠心濃縮機を使用して濃縮された。試料は、目標濃度に達するまで、２２℃で５分ずつの工程で遠心分離された。工程間で試料は再懸濁される。
【0247】
タンパク質濃度の決定
タンパク質試料の濃度は、TecanプレートリーダーとNanoQuantプレートを使用して決定された。緩衝液は、２８０ｎｍで測定された吸光度から差し引かれるブランクとして使用された。各測定値は、３１０ｎｍで測定された可視粒子によって引き起こされる散乱について補正された。補正値は１ｃｍの光路長に対して標準化され、対応するタンパク質の理論的吸光係数を使用して、タンパク質濃度が算出された。濃度が１０ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質試料の場合、試料を対応する緩衝液で少なくとも１０倍、又は１ｍｇ／ｍｌの公称濃度まで希釈した。
タンパク質試料の濃度は、TecanプレートリーダーとNanoQuantプレートを使用して決定された。緩衝液は、２８０ｎｍで測定された吸光度から差し引かれるブランクとして使用された。各測定値は、３１０ｎｍで測定された可視粒子によって引き起こされる散乱について補正された。補正値は１ｃｍの光路長に対して標準化され、対応するタンパク質の理論的吸光係数を使用して、タンパク質濃度が算出された。濃度が１０ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質試料の場合、試料を対応する緩衝液で少なくとも１０倍、又は１ｍｇ／ｍｌの公称濃度まで希釈した。
【0248】
保存
さまざまな温度でのタンパク質の安定性を評価するために、試料を４℃、２５℃、及び４０℃でインキュベートした。４℃保存は、公称温度４℃の冷蔵庫内で実施された。２５℃及び４０℃での保存では、試料をそれぞれ６５％ｒＨ及び７５％ｒＨの湿度に制御されたキャビネットに置いた。
さまざまな温度でのタンパク質の安定性を評価するために、試料を４℃、２５℃、及び４０℃でインキュベートした。４℃保存は、公称温度４℃の冷蔵庫内で実施された。２５℃及び４０℃での保存では、試料をそれぞれ６５％ｒＨ及び７５％ｒＨの湿度に制御されたキャビネットに置いた。
【0249】
動的光散乱
溶液中の分子及び粒子の拡散係数を決定するために、動的光散乱が使用される。 これは、溶液中の分子の流体力学半径 (Ｒｈ) の計算を可能にするほか、高次のオリゴマーの形成を検出する高感度な方法を提供する。
溶液中の分子及び粒子の拡散係数を決定するために、動的光散乱が使用される。 これは、溶液中の分子の流体力学半径 (Ｒｈ) の計算を可能にするほか、高次のオリゴマーの形成を検出する高感度な方法を提供する。
【0250】
高濃度安定性研究において、Ｒｈ及び多分散性が目標濃度で決定された。 これにより、自己会合、オリゴマー化、及び粘度の潜在的な増加に関する情報が得られた。 測定値は緩衝液又は試料の粘度について補正されず、代わりに水の粘度を使用して試料の Rh が計算された。
【0251】
ｎａｎｏＤＳＦによる熱アンフォールディング
ＴＳＡを使用した熱アンフォールディングは、Ｓｙｐｒｏオレンジの蛍光強度の変化によって決定された。色素の蛍光は疎水性相互作用に対して感受性である。タンパク質がアンフォールディングされると、疎水性アミノ酸が溶媒に曝露され、Ｓｙｐｒｏオレンジの蛍光が増加する。熱アンフォールディングの中点（Ｔｍ）及び最大シグナルの１０％で算出された開始温度（Ｔｏｎｓｅｔは、最小シグナルでの温度＋０．１＊（最大シグナル－最小シグナル））は、データをボルツマン方程式にフィッティングすることによって決定された。
ＴＳＡを使用した熱アンフォールディングは、Ｓｙｐｒｏオレンジの蛍光強度の変化によって決定された。色素の蛍光は疎水性相互作用に対して感受性である。タンパク質がアンフォールディングされると、疎水性アミノ酸が溶媒に曝露され、Ｓｙｐｒｏオレンジの蛍光が増加する。熱アンフォールディングの中点（Ｔｍ）及び最大シグナルの１０％で算出された開始温度（Ｔｏｎｓｅｔは、最小シグナルでの温度＋０．１＊（最大シグナル－最小シグナル））は、データをボルツマン方程式にフィッティングすることによって決定された。
【0252】
ＳＥ－ＨＰＬＣによるモノマー含有量
モノマー含有量は、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ４０３－４Ｆカラムを使用して、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５を流して、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。分析のために、５μｇの試料を注入し、２８０ｎｍで吸光度を記録した。試料の品質は、モノマーの相対的パーセント、ＨＭＷＳ、及びＬＭＷＳとして示される。
モノマー含有量は、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ４０３－４Ｆカラムを使用して、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５を流して、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。分析のために、５μｇの試料を注入し、２８０ｎｍで吸光度を記録した。試料の品質は、モノマーの相対的パーセント、ＨＭＷＳ、及びＬＭＷＳとして示される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】