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特表2024-501660系譜限定多能性幹細胞から得られるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-15
(54)【発明の名称】系譜限定多能性幹細胞から得られるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240105BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240105BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240105BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240105BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20240105BHJP
C12N 5/0797 20100101ALN20240105BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240105BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240105BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
A61P25/00
A61P25/16
A61P43/00 111
A61K35/545
C12N5/0797
C12N15/09 110
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023538001
(86)(22)【出願日】2021-12-20
(85)【翻訳文提出日】2023-08-14
(86)【国際出願番号】 EP2021086866
(87)【国際公開番号】W WO2022136306
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】20215929.9
(32)【優先日】2020-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21198825.8
(32)【優先日】2021-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514318301
【氏名又は名称】オーフス ユニバーシテット
【氏名又は名称原語表記】ＡＡＲＨＵＳ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＴ
(74)【代理人】
【識別番号】110000279
【氏名又は名称】弁理士法人ウィルフォート国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】デンハム， マーク
(72)【発明者】
【氏名】ムイシエ， マイマイティリ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZA02
(57)【要約】
本発明は、特定の遺伝子ノックアウトによって、ドーパミン作動性神経前駆細胞及びその誘導体とは異なる細胞系譜に分化する能力が限られている多能性幹細胞に関する。具体的には、本発明は、それらの系譜限定多能性幹細胞から得られるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体、及びその使用に関する。
【選択図】 図５Ｂ
【選択図】 図５Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４が不活性化されていることを特徴とする多能性幹細胞。
【請求項2】
ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１からなる群より選択される１つ又は複数の遺伝子が、さらに不活性化されている請求項１に記載の多能性幹細胞。
【請求項3】
ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１が、さらに不活性化されている請求項１又は２に記載の多能性幹細胞。
【請求項4】
前記遺伝子が、遺伝子ノックアウト若しくは未成熟終止コドンの導入によって、例えばＣＲＩＳＰＲによって、又は前記遺伝子の転写若しくは翻訳を阻止することによる遺伝子サイレンシングによって、例えばｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ阻害によって、又は前記遺伝子のドミナントネガティブ型の導入によって、好ましくはＣＲＩＳＰＲを使用して不活性化されている請求項１～３のいずれかに記載の多能性幹細胞。
【請求項5】
ＮＡＮＯＧ＋、ＰＯＵ５Ｆ１＋及び／又はＳＯＸ２＋、好ましくはＮＡＮＯＧ＋、ＰＯＵ５Ｆ１＋及びＳＯＸ２＋である請求項１～４のいずれかに記載の多能性幹細胞。
【請求項6】
前記多能性幹細胞の細胞系譜限定細胞分化のための、且つ／又はドーパミン作動性神経前駆細胞若しくはその細胞誘導体の生成のための請求項１～５のいずれかに記載の前記多能性幹細胞の使用。
【請求項7】
請求項１～５のいずれかに記載の多能性幹細胞から分化させたドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項8】
ＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４が不活性化されていることを特徴とするドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項9】
ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２、ＥＮ１、及び／又はＴＨを発現する請求項７～８のいずれかに記載のドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項10】
ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２、ＥＮ１、ＳＰＲＹ１、ＷＮＴ１、ＣＮＰＹ１、ＰＡＸ８、ＥＴＶ５、ＰＡＸ５、ＳＰ５、及び／又はＴＬＥ４陽性細胞を発現する請求項７～９のいずれかに記載のドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項11】
中脳ドーパミン作動性神経細胞などのドーパミン作動性神経細胞、中脳ドーパミン作動性前駆神経細胞、中脳底板前駆細胞、及び尾側中脳前駆細胞からなる群より選択される請求項７～１０のいずれかに記載のドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項12】
前記その細胞誘導体が、中脳ドーパミン作動性神経細胞などのドーパミン作動性神経細胞である請求項７～１１のいずれかに記載のドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項13】
前記神経細胞が凍結保存される請求項７～１２のいずれかに記載のドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項14】
医薬品として使用するための請求項７～１３のいずれかに記載のドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項15】
幹細胞治療に使用するための請求項７～１４のいずれかに記載のドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項16】
神経変性疾患、好ましくはパーキンソン病の治療、予防又は緩和に使用するための請求項７～１５のいずれかに記載のドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項17】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、レビー小体病からなる群より選択され、好ましくはパーキンソン病である請求項１６に記載のドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項18】
前記神経変性疾患がパーキンソン病である請求項１６～１７のいずれかに記載のドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体。
【請求項19】
インビトロ薬物スクリーニングアッセイにおける請求項７～１３のいずれかに記載の前記ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体の使用。
【請求項20】
請求項１～５のいずれかに記載の多能性幹細胞を提供する方法であって、多能性幹細胞においてＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４を不活性化させることを含む方法。
【請求項21】
前記不活性化遺伝子が、遺伝子ノックアウト若しくは未成熟終止コドンの導入によって、例えばＣＲＩＳＰＲによって、又は前記遺伝子の転写若しくは翻訳を中断させることによって、例えば遺伝子サイレンシングによって、ｓｉＲＮＡによって、若しくはＣＲＩＳＰＲ阻害によって、又は前記遺伝子のドミナントネガティブ型の発現によって、好ましくはＣＲＩＳＰＲを使用して不活性化されている請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
請求項２０又は２１に記載の方法によって得られる／得ることができる多能性幹細胞。
【請求項23】
ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体を提供する方法であって、－ 請求項１～５又は２２のいずれかに記載の多能性幹細胞を提供すること；及び
－ 前記提供された多能性幹細胞を、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に分化させること
を含む方法。
【請求項24】
前記提供されたドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体が凍結保存される請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体が、中脳ドーパミン作動性神経細胞などのドーパミン作動性神経細胞、中脳ドーパミン作動性前駆神経細胞、中脳底板前駆細胞、及び尾側中脳前駆細胞からなる群より選択される請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項26】
前記その細胞誘導体が、中脳ドーパミン作動性神経細胞などのドーパミン作動性神経細胞である請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
インビトロ及び／又は生体外で行われる請求項２３～２６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特定の遺伝子ノックアウトによって、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体とは異なる細胞系譜に分化する能力が限られている多能性幹細胞に関する。具体的には、本発明は、それらの系譜限定多能性幹細胞から得られるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体、及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）神経細胞の発生は、近年研究が盛んな領域である。部分的にはこれは、再生医療への関心が高まっていること、及びｍＤＡ神経細胞が生体内でどのように特化され、分化し、維持されるかをより良く理解することによってそれらの神経細胞に影響を与えるパーキンソン病（ＰＤ）などの疾患の治療が容易になるかもしれないという期待による。その知見は、インビトロでｍＤＡ神経細胞を作り出す取り組みを指導する（instruct efforts）のに役立つ可能性があり、これは細胞補充療法だけでなく、疾患モデリングや創薬にも有望である。
【0003】
ヒト多能性幹細胞は、からだのあらゆる細胞種に分化することができる。そのため、多能性幹細胞は、細胞補充療法のため、又はインビトロでの疾患をモデル化するために、特定の細胞種を生成する方法として活発に研究されている。したがって、この分野のアンメットニーズは、多能性幹細胞を、確実に且つ効率的に、目的の細胞種に誘導できるようにすることである。現在までに、多能性幹細胞を様々な細胞種に分化させるための多数のプロトコールが論文報告されてきているが、それらのいずれも、１つの細胞種の純粋な集団を確実に作り出す生じさせることはできない。
【0004】
中脳ドーパミン作動性（ｍｅｓＤＡ）神経細胞は、神経管の腹側中脳から発生する。モルフォゲンＳＨＨ及びＷＮＴファミリーのメンバーは、特化に重要な役割を果たし、胚の背腹軸及び前後軸をそれぞれ確立するのに不可欠である（Castelo-Branco et al., 2003; Hynes et al., 1995）。中脳ドーパミン作動性神経細胞では、神経板の腹側神経上皮細胞を底板アイデンティティに特化するには、脊索からの高いＳＨＨシグナル伝達が必要であり、胚の後方領域から発せられる段階的なＷＮＴシグナル伝達は後神経前駆体を生成する。中脳領域の神経前駆体は、中脳アイデンティティへの細胞のパターン形成に関与するＷＮＴ１及びＦＧＦ８を峡部オーガナイザーからから受け取る。峡部オーガナイザーは、腹側中脳及び前菱脳の尾側領域に細胞のアイデンティティを精緻化及び誘導する上で不可欠である。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を用いてこれらの発生段階をインビトロで再現することは、パーキンソン病の細胞移植治療の焦点となっている。
【0005】
幹細胞分化プロトコールにおいて、早期及び高濃度のＳＨＨは、神経前駆細胞を底板のアイデンティティに特化するのに十分である（Fasano et al., 2010）。しかし、Ａ－Ｐ（吻側－尾側とも呼ばれる）軸の場合、正確な濃度範囲内で調整されたＷＮＴ濃度が、細胞を尾側中脳に特化するのに必要である（Kirkeby et al., 2012）。濃度が高すぎると菱脳細胞種になり、低い濃度では前中脳が結果として生じる。また、ＦＧＦ８のタイミングのよい送達が、尾側中脳への特化を向上させることが示されている（Kirkeby et al., 2017）。幹細胞分化プロトコールのこれらの進歩にもかかわらず、細胞株のばらつき、及びｍｅｓＤＡ神経細胞の全収率は、これらの細胞の臨床での使用を今なお妨げている（Nolbrant et al., 2017）。
【0006】
多能性からｍｅｓＤＡ神経細胞に至る複雑な発生の間、細胞が成熟するにつれて変化する転写因子が次々と発現し、特徴的なトランスクリプトームプロファイルが特定の成熟段階を規定する（La Manno et al., 2016）。
【0007】
国際公開２０１６／１６２７４７（Ａ１）号には、神経変性疾患の治療に使用するための幹細胞由来ドーパミン作動性細胞を作製する方法が開示されている。ラミニン－１１１／１２１／５２１／４２１又は５１１でコーティングされた基質にプレーティングすることによって、細胞は所望の系譜に向けられる。
【0008】
したがって、幹細胞由来ドーパミン作動性細胞を作製するための改良された方法は有利であり、特に、大量又はより純粋な集団の幹細胞由来のドーパミン作動性細胞を作製するためのより効率的で且つ／又は信頼できる方法は有利であることになる。
【発明の概要】
【0009】
代わりの（alternate）系譜点（lineage points）における転写因子発現の制御により、細胞運命の選択を操作することができる。
【0010】
本研究では、中脳ドーパミン作動性（ｍｅｓＤＡ）の運命への分化を高めることを目的として、細胞の運命を限定し、非ドーパミン作動性細胞系譜を阻止する方法として、遺伝子ノックアウトアプローチの効果を利用することを選択した。具体的には、発生の初期段階で代わりの（alternate）細胞運命選択が行われる主要なポイントを調べ、どの転写因子決定因子がそれらの系譜にとって重要であるが、ｍｅｓＤＡ運命には必要ではないかを探った。代わりの（alternate）系譜に発現される系譜決定因子の遺伝子を欠失させることによって、多能性幹細胞の分化をドーパミン作動性アイデンティティに偏らせることができた。多能性状態では増殖することができるが、分化するときにはその能力が限られている多能性幹細胞を作製した。これらを「系譜限定多能性幹細胞」（ＬＲ－ＰＳＣ）と名付けた。具体的には、中脳ドーパミン作動性前駆体が漸増発現を必要とすることから、発生中の神経管のＡ－Ｐ軸に注目し、菱脳及び脊髄の細胞運命を調節する転写因子を調べた。前菱脳はＧｂｘ２を必要とすることが示されており、脊髄はＣｄｘファミリーメンバーに依存している。それらの遺伝子を除去することによって、中脳アイデンティティを取る細胞の割合を増加させ、脊髄運命への特化を阻んだ。結果は、そのアプローチが、特定濃度の外因性因子を厳密に必要とせずに、機能的ｍｅｓＤＡ神経細胞を確実に生成できることを示している。図７～１０は、細胞から特定の遺伝子を欠失させることでどのようにして系譜限定幹細胞が生成できるかを示す。
【0011】
まとめると、本発明は、特定の遺伝子ノックアウトによってドーパミン作動性神経前駆細胞及びその誘導体とは異なる細胞系譜に分化する能力が限られている多能性幹細胞に関する。具体的には、本発明は、それらの系譜限定多能性幹細胞から得られるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体、及びその使用に関する。
【0012】
したがって、本発明の目的は、その分化能が限定された幹細胞を提供することに関する。
【0013】
具体的には、医療用途のある中脳ドーパミン作動性（ｍｅｓＤＡ）神経細胞を提供することが、本発明の目的である。
【0014】
したがって、本発明の最も広い態様では、本発明は、「系譜限定」多能性幹細胞だけでなく、系譜限定多能性幹細胞から得られるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体及びその使用に関する。一実施形態では、系譜限定は、多能性幹細胞における１つ又は複数のマスターレギュレーター遺伝子を不活性化させることによって得られる。マスターレギュレーター遺伝子の例は、本発明の様々な態様及び実施形態で示されている。
【0015】
さらに、１つ又は複数のマスターレギュレーター遺伝子の不活性化により、１つ又は複数のマスターレギュレーター遺伝子が不活性化されていない類似の細胞種と比較して、多能性幹細胞は、多くの細胞種（（ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体とは異なる））にもはや分化できない（又は少なくとも分化が阻害される）結果となる。
【0016】
要するに、１つ又は複数の「マスターレギュレーター」遺伝子が不活性化された細胞株が「系譜限定」となる。
【0017】
したがって、本発明の一態様は、ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１からなる群より選択される１つ又は複数の遺伝子が不活性化されていることを特徴とする多能性幹細胞に関する。
【0018】
本発明の別の態様は、多能性幹細胞の細胞系譜限定細胞分化のための、本発明による多能性幹細胞の使用に関する。
【0019】
さらに別の態様は、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体の生成のための本発明による多能性幹細胞の使用に関する。
【0020】
さらに本発明の別の態様は、本発明による多能性幹細胞から分化させたドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体を提供することである。
【0021】
さらに別の態様では、本発明は、ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１からなる群より選択される１つ又は複数の遺伝子が、不活性化されていることを特徴とするドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に関する。
【0022】
本発明のさらに別の態様は、幹細胞治療においてなど、医薬品として使用するための本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体を提供することである。
【0023】
別の態様では、本発明は、神経変性疾患の治療、予防又は緩和に使用するための、本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に関する。
【0024】
一態様では、本発明は、薬物スクリーニングアッセイにおける本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体の使用に関する。
【0025】
さらに本発明の一態様は、本発明による多能性幹細胞を提供方法であって、多能性幹細胞において、ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を不活性化させることを含む方法に関する。
【0026】
さらに、本発明のさらなる態様は、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体を提供するための方法であって、
－ 本発明による多能性幹細胞を提供すること；及び
－ 提供された多能性幹細胞をドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に分化させること
を含む方法に関する。
－ 本発明による多能性幹細胞を提供すること；及び
－ 提供された多能性幹細胞をドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に分化させること
を含む方法に関する。
【0027】
本発明による細胞の利点は、少なくとも以下の通りである：
－ 限定された分化は正しい（神経）細胞の量を増加させる（例えば実施例２～５を参照）。
－ 限定された分化は、患者の移植後の危険な望ましくない分化のリスクを限定する。
－ 限定された分化は、最適濃度以下の成長因子若しくは小分子が使用された場合又はそれらが存在しない場合、正しい神経細胞の細胞種を得ることができる（例えば実施例３～４を参照）。
－ 限定された分化は、電気生理学的に成熟した神経細胞の発生を可能にする（例えば実施例８を参照）。
－ 限定された分化は、生体内パーキンソン病ラットモデルにおけるｍｅｓＤＡ神経細胞の強固な（robust）集団を可能にし、急速な運動回復をもたらす（例えば実施例９を参照）。
－ 限定された分化は正しい（神経）細胞の量を増加させる（例えば実施例２～５を参照）。
－ 限定された分化は、患者の移植後の危険な望ましくない分化のリスクを限定する。
－ 限定された分化は、最適濃度以下の成長因子若しくは小分子が使用された場合又はそれらが存在しない場合、正しい神経細胞の細胞種を得ることができる（例えば実施例３～４を参照）。
－ 限定された分化は、電気生理学的に成熟した神経細胞の発生を可能にする（例えば実施例８を参照）。
－ 限定された分化は、生体内パーキンソン病ラットモデルにおけるｍｅｓＤＡ神経細胞の強固な（robust）集団を可能にし、急速な運動回復をもたらす（例えば実施例９を参照）。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】図１ ４日目の尾側神経前駆体への分化。Ａ）４日目のＣＮＰ分化プロトコール概略図。Ｂ）４日目のＣＮＰのＨ９、ＧＢＸ２及び４ｘＫＯ条件におけるＯＴＸ２のＱＰＣＲ解析。Ｃ）Ｈ９、ＧＢＸ２及び４ｘＫＯ条件におけるＣＤＸ２のＱＰＣＲ解析。Ｄ）４日目のＣＮＰにおけるＨ９ ＧＢＸ２株及び４ｘＫＯ株の前方、中脳、菱脳及び脊髄領域を表す多能性遺伝子と神経遺伝子のヒートマップ。Ｅ）ＣＲＩＳＰＲ改変ｈＥＳＣの単一細胞クローン選択を含む４ｘＫＯ細胞株の生成の概略図。Ｆ）４ｘＫＯ細胞株からの８ｘＫＯノックアウト細胞株の生成。４ＸＫＯ細胞株は、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ１を標的とするガイド鎖を含有するレンチウイルスを形質導入された。
【図2A】図２ １１日目の尾側神経前駆体への分化。Ａ～Ｐ）中脳遺伝子ＯＴＸ２、ＰＡＸ２、ＰＡＸ５、ＰＡＸ８及びＥＮ１；菱脳遺伝子ＩＲＸ３、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ１、ＫＲＯＸ２０、ＭＡＦＢ、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ４；並びに脊髄遺伝子ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＢ８及びＨＯＸＣ１０のＲＮＡ発現解析。Ｑ）１１日目のＣＮＰ分化プロトコールの概略図。
【図3A】図３ 腹側中脳前駆体への分化。Ａ）尾側中脳分化プロトコールの概略図。Ｂ～Ｇ）ＧＳＫ３ｉ（ＣＨＩＲ９９０２１）濃度の範囲にわたる、１６日目のＨ９及び４ｘＫＯ細胞におけるＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、ＥＮ１、ＣＮＰＹ１及びＨＯＸＡ２の発現。
【図5A】図５ ８ｘＫＯ細胞株の生成。Ａ）４日目のＣＮＰ分化プロトコール。Ｂ）３μＭのＧＳＫ３ｉ下で分化させた４日目のＣＮＰのＨ９、４ｘＫＯ、８ｘＫＯにおけるＯＴＸ２発現。Ｃ）３μＭのＧＳＫ３ｉ下で分化させた４日目のＣＮＰにおけるＯＴＸ２を発現する細胞の割合。Ｄ～Ｅ）Ｈ９ ｈＥＳＣ、４日目のＨ９、４日目の４ｘＫＯ及び４日目の８ｘＫＯにわたる、選択した遺伝子のｌｏｇ２中心（log2 centered）発現を示すヒートマップ。
【図6A】図６ Ａ：ドーパミン作動性神経細胞分化プロトコールの１６日目における、対照（Ｈ９）細胞株と比較した、４ｘＫＯ細胞株の単一細胞解析。背腹軸に沿った細胞種を示す遺伝子を発現する細胞の割合が示されている。ＦＯＸＡ２は底板の細胞に発現している。外側底板及び基板は、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．２、ＰＨＯＸ２Ａ及びＰＨＯＸ２Ｂのいずれかの発現で示される。 Ｂ：ドーパミン作動性神経細胞分化プロトコールの２８日目における、４ｘＫＯ細胞株及び対照（Ｈ９）の単一細胞解析。４Ｘ細胞とＨ９細胞を合わせたドーパミン系分化の２８日目の単一細胞解析では、１５個の細胞クラスターが見られた。前腹側マーカーＮＫＸ２．１及び背腹側軸の内側マーカーＰＡＸ６の発現を調べた。
【図10】図１０ ｈＥＳＣのドーパミン作動性神経細胞への分化を示す図式的な概要。図９と比較して、追加の特定の転写因子を欠失させることにより、さらに一層限定された分化能がいかに達成されるかを例示している。
【図11A】図１１ ６２ＤＩＶにおける単一細胞解析。Ａ）クラスターのアイデンティティを示す選択された遺伝子の発現のヒートマップ。Ｂ）６２ＤＩＶのクラスターにおけるＬＭＸ１Ａ、ＴＨ、ＦＯＸＡ２及びＥＮ１のバイオリンプロット。Ｃ）６２ＤｉｖのクラスターにおけるＰＤＬＩＭ１及びＳＥＭＡ３Ｃのバイオリンプロット。Ｄ）６２ＤＩＶにおけるＴＨサブクラスターのＮＲ４Ａ２、ＥＮ１、ＫＣＮＪ６、ＣＡＬＢ１及びＦＯＸＡ２のバイオリンプロット。
【図12A】図１２ インビトロでの機能的な腹側中脳ＤＡ神経細胞の生成。Ａ）長期（６２ＤＩＶ）神経細胞分化プロトコールの概略図。Ｂ）反復活動電位の発火を示す脱分極電流注入（下のトレース）に対する代表的な応答（上のトレース）。Ｃ）静止膜電位－４５ｍＶでバースト様（burst-like）事象を示す自発発火の例。閾値以下の膜振動の周期が散在する群では、オーバーシュートしたスパイクが発生した。Ｄ）１Ｈｚ～５Ｈｚの範囲の発火頻度を示す自発細胞発火の頻度分布（ｎ＝１６細胞）。Ｅ）ＨＰＬＣで測定した、７９ＤＩＶにおける４Ｘ及びＨ９細胞のドーパミン含量（タンパク質濃度に対して正規化（normatilized））。データは平均値±ＳＤ；ｎ＝３で示されている。対応のないｔ検定を使用して群間を比較した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図13A】図１３ パーキンソン病モデルラットに移植した細胞の生体内での解析。Ａ）生体内研究の概要。片側性の６－ＯＨＤＡ誘発ＭＦＢ病変を生じさせ（－４週目）、３週後にシリンダー試験及びアンフェタミン誘発回転試験で確認した。回転試験の平均スコアが類似する３つの群に動物を細分した。病変形成の４週間後（０週目）に、それらのサブ群のうち２つに２５万個の細胞（Ｈ９又は４Ｘ細胞）を移植し、第３の群（６－ＯＨＤＡ病変群）には移植を行わなかった。移植後８週目及び１８週目に回転試験を再度行い、１８週目にシリンダー試験を再度行った。移植後１９週目（病変発生から２３週目）に動物を死亡させ、組織学的解析を行った。Ｂ～Ｃ）６－ＯＨＤＡ病変形成ラットの病変形成後３週間目のアンフェタミン誘発回転（Ｂ）とシリンダー試験（Ｃ）。移植前に細分した６－ＯＨＤＡ、Ｈ９及び４Ｘ群の間で同等の行動を示している。Ｂ～Ｃ）では、６－ＯＨＤＡについてはＮ＝８、Ｈ９についてはＮ＝９、４ＸについてはＮ＝１０。Ｄ）アンフェタミン誘発回転非対称性。二元配置反復測定分散分析及びそれに続くシダックの多重比較検定；時間：Ｆ（１．６８９、３５．４６）＝１９．５０、Ｐ＜０．０００１；投与：Ｆ（２、２１）＝１５．２３、Ｐ＜０．０００１。同じ時点での４Ｘ細胞移植群に対して＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。－１週目の同じ群に対して§§Ｐ＜０．０１及び§§§§Ｐ＜０．０００１。Ｅ）シリンダー試験における各前肢（対側又は同側）及び両前肢の使用は、時間及び群を変数とする二元配置反復測定分散分析及びそれに続くシダックの多重比較検定で分析がなされた。時間×群：両方：Ｆ（２、２２）＝５．７８５、Ｐ＝０．００９；同側：Ｆ（２、２２）＝８．８００、Ｐ＝０．００１；対側：Ｆ（２、２２）＝４．６４２、Ｐ＝０．０２１。－１週目の同じ群に対して＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。同じ時点での６－ＯＨＤＡ病変群に対して＄Ｐ＜０．０５及び＄＄Ｐ＜０．０１。同じ時点でのＨ９細胞移植群に対して￡Ｐ＜０．０５及び￡￡Ｐ＜０．０１。Ｄ）及びＥ）のデータは平均値±ＳＥＭで示されている。６－ＯＨＤＡ病変群にはｎ＝７のラット、４Ｘ細胞移植群にはｎ＝９のラット、及びＨ９細胞移植群にはｎ＝８のラット）。Ｆ）ＴＨについて免疫染色された３群すべての冠状切片の代表的な写真。フレーム内の領域の高倍率画像は右側に表示されている。スケールバー、列（column）内の３枚の写真すべてについて５０μｍ。Ｇ）は、移植片内のＴＨ陽性細胞の推定数を示す。Ｈ）は、１０万個の移植細胞あたりのＴＨ陽性神経細胞の収量を示す。Ｉ）はＴＨ移植片の体積を示す。Ｊ）４Ｘ細胞移植片内のＧＩＲＫ２／ＴＨとＣＡＬＢ１／ＴＨの二重陽性細胞の割合を示す免疫蛍光データの定量解析。データは平均パーセンテージ±ＳＤ（ｎ＝９のラット）で示されている。
【0029】
以下、本発明をより詳細に説明していく。
【発明を実施するための形態】
【0030】
定義
本発明をさらに詳細に説明する前に、まず以下の用語及び慣例を明確にする。
本発明をさらに詳細に説明する前に、まず以下の用語及び慣例を明確にする。
【0031】
ドーパミン作動性神経前駆細胞
本発明に文脈において、「ドーパミン作動性神経前駆細胞」は、中脳前駆体ドーパミン作動性神経細胞、尾側中脳前駆体、中脳底板前駆体などを含む、ドーパミン作動性神経細胞になりうる細胞として理解されるべきである。
本発明に文脈において、「ドーパミン作動性神経前駆細胞」は、中脳前駆体ドーパミン作動性神経細胞、尾側中脳前駆体、中脳底板前駆体などを含む、ドーパミン作動性神経細胞になりうる細胞として理解されるべきである。
【0032】
ドーパミン作動性神経細胞は他の種類の細胞を含む細胞集団であることもある。細胞集団は、好ましくは、セロトニン神経細胞を含まない細胞集団である。ドーパミン作動性神経細胞は、好ましくは、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１及びＴＨ陽性細胞を含む細胞集団である。
【0033】
一実施形態では、ドーパミン作動性神経前駆細胞は、好ましくは、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２、ＥＮ１、ＳＰＲＹ１、ＷＮＴ１、ＣＮＰＹ１、ＰＡＸ８、ＥＴＶ５、ＰＡＸ５、ＳＰ５、及び／又はＴＬＥ４陽性細胞を含む細胞集団である。
【0034】
ドーパミン作動性神経前駆細胞の誘導体
本発明に文脈において、「ドーパミン作動性神経前駆細胞の誘導体」は、ドーパミン作動性神経細胞、中脳ドーパミン作動性神経細胞など、「ドーパミン作動性神経前駆細胞」がなりうる細胞として理解されるべきである。
本発明に文脈において、「ドーパミン作動性神経前駆細胞の誘導体」は、ドーパミン作動性神経細胞、中脳ドーパミン作動性神経細胞など、「ドーパミン作動性神経前駆細胞」がなりうる細胞として理解されるべきである。
【0035】
中脳ドーパミン作動性神経細胞
本発明に文脈において「中脳ドーパミン作動性神経細胞」という用語は、発生中の脳の中脳領域に由来する細胞を意味する。したがって、中脳ドーパミン作動性神経細胞は、ドーパミン作動性神経細胞のサブセットである。
本発明に文脈において「中脳ドーパミン作動性神経細胞」という用語は、発生中の脳の中脳領域に由来する細胞を意味する。したがって、中脳ドーパミン作動性神経細胞は、ドーパミン作動性神経細胞のサブセットである。
【0036】
系譜限定
本発明に文脈において、「系譜限定」という用語は、多能性幹細胞などの、「系譜限定」されていない類似の細胞種と比較して、もはや多くの細胞種に分化できない（又は分化することが少なくとも抑制されている）細胞を意味する。
本発明に文脈において、「系譜限定」という用語は、多能性幹細胞などの、「系譜限定」されていない類似の細胞種と比較して、もはや多くの細胞種に分化できない（又は分化することが少なくとも抑制されている）細胞を意味する。
【0037】
本発明に文脈において、「系譜限定」は、特許請求の範囲で画定されるように、細胞株の１つ又は複数の遺伝子を不活性化させること（遺伝子ノックアウトによるなど）によって達成される。
【0038】
幹細胞
幹細胞は、その後に、特化した細胞がそれから生じる未分化の細胞である。
幹細胞は、その後に、特化した細胞がそれから生じる未分化の細胞である。
【0039】
本発明で使用できる多能性幹細胞は、生体に存在するあらゆる細胞に分化することができる多能性を有する幹細胞であり、多能性幹細胞は増殖能も有する。多能性幹細胞の例としては、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植によって得られたクローン胚に由来する胚性幹細胞（「ｎｔＥＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＧＳ細胞」）、胚芽細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、並びに培養線維芽細胞及び骨髄幹細胞に由来する多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。多能性幹細胞は、好ましくは、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。
【0040】
本発明で使用される多能性幹細胞は、その過程において、ヒトのクローンを作らず、ヒト胚を工業的又は商業的に使用しないという条件付きで生成される。
【0041】
胚性幹細胞は、広範な自己再生能及び多能性をもつ、３つの胚葉のすべてに分化する能力をもつ。それらは治療目的に有用であり、組織代替療法、薬物スクリーニング、機能ゲノミクス及びプロテオミクスに無限の細胞源をもたらす可能性がある。
【0042】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣとも呼ばれる）は、体細胞から直接生成することができる多能性幹細胞の一種である。
【0043】
なお、本発明の代替的な態様では、多能性幹細胞は、アストロサイト又はリプログラミングされた／リプログラミング可能なアストロサイトも含むと考えられることに留意されたい。アストロサイトは、神経細胞などの他の細胞種に分化するようにリプログラミングできることは周知である。
【0044】
マスターレギュレーター
遺伝学において、「マスターレギュレーター」は、特に細胞運命及び分化に関連する調節経路における、遺伝子制御階層の頂点にある遺伝子である。マスターレギュレーター遺伝子は、「細胞アイデンティティ決定因子」又は「細胞種決定因子」とも呼ばれうる。したがって、本発明に従って不活性化される可能性のある遺伝子は、マスターレギュレーター遺伝子を包含すると考えることが可能である。
遺伝学において、「マスターレギュレーター」は、特に細胞運命及び分化に関連する調節経路における、遺伝子制御階層の頂点にある遺伝子である。マスターレギュレーター遺伝子は、「細胞アイデンティティ決定因子」又は「細胞種決定因子」とも呼ばれうる。したがって、本発明に従って不活性化される可能性のある遺伝子は、マスターレギュレーター遺伝子を包含すると考えることが可能である。
【0045】
神経変性疾患
変性神経疾患は、バランスや、動作、会話、呼吸、心臓の機能など、体の多くの活動に影響を及ぼす。これらの疾患の多くは遺伝的なものである。原因が、アルコール依存症、腫瘍、脳卒中などの病態であることもある。その他の原因として、毒素、化学物質、及びウイルスなどが挙げられうる。原因がわからないこともある。
変性神経疾患は、バランスや、動作、会話、呼吸、心臓の機能など、体の多くの活動に影響を及ぼす。これらの疾患の多くは遺伝的なものである。原因が、アルコール依存症、腫瘍、脳卒中などの病態であることもある。その他の原因として、毒素、化学物質、及びウイルスなどが挙げられうる。原因がわからないこともある。
【0046】
本発明に文脈において、「神経変性疾患」という用語は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病及び脊髄性筋萎縮症を含む。
【0047】
神経変性は、神経細胞の死滅を含む、神経細胞の構造又は機能が進行性に失われることである。筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びプリオン病を含む、多くの神経変性疾患が神経変性過程の結果として発症する。
【0048】
パーキンソン病（ＰＤ）は、中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）神経細胞の減少に起因する神経変性疾患である。パーキンソン病は、特定の種類の中脳ドーパミン（ｍｅｓＤＡ）神経細胞の比較的局所的な変性起因しており、幹細胞に基づく治療の標的として特に注目されている。パーキンソン病に対する細胞補充療法の概念的な証明が、数多くの治験で得られてきている。パーキンソン病（ＰＤ）は、中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）神経細胞の減少に起因する神経変性疾患である。
【0049】
好ましい実施形態では、本発明による生成されたドーパミン作動性神経前駆細胞は、パーキンソン病の治療又は緩和に使用するためのものである。
【0050】
系譜限定多能性幹細胞
上記で概説されたように、本発明の一部は、特定の遺伝子ノックアウトによって、ドーパミン作動性神経前駆細胞及びその誘導体とは異なる細胞系譜に分化するその能力が限られている多能性幹細胞（複数可）に関する。具体的には、本発明は、それらの系譜限定多能性幹細胞から得られるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体及びその使用に関する。したがって、本発明の一態様は、ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１からなる群より選択される１つ又は複数の遺伝子が不活性化されていることを特徴とする多能性幹細胞に関する。
上記で概説されたように、本発明の一部は、特定の遺伝子ノックアウトによって、ドーパミン作動性神経前駆細胞及びその誘導体とは異なる細胞系譜に分化するその能力が限られている多能性幹細胞（複数可）に関する。具体的には、本発明は、それらの系譜限定多能性幹細胞から得られるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体及びその使用に関する。したがって、本発明の一態様は、ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１からなる群より選択される１つ又は複数の遺伝子が不活性化されていることを特徴とする多能性幹細胞に関する。
【0051】
好ましい実施形態では、ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ１からなる群より選択される１つ又は複数の遺伝子は不活性化されている。実施例の項で概説されるように、１、４又は８個の遺伝子がノックアウトされた細胞株が作製された。それらの細胞種は、ドーパミン作動性神経前駆細胞及びその誘導体以外の系譜への分化が抑えられていた。
【0052】
一実施形態では、列挙した遺伝子の１つ又は複数の両方のアレルは不活性化されている。両方のアレルが不活性化されている場合が最も効率的と考えられる。
【0053】
さらなる一実施形態では、ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１及びＨＯＸＢ２からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子は不活性化されている、例えば少なくとも３つの遺伝子、好ましくは例えば少なくとも４つの遺伝子、例えば少なくとも５つの遺伝子、例えば少なくとも６つの遺伝子、例えば少なくとも７つの遺伝子、又はより好ましくは例えば少なくとも８つの遺伝子は不活性化されている。
【0054】
別の好ましい実施形態では、少なくともＧＢＸ２及びＣＤＸ２は不活性化されている。それらの遺伝子を不活性化することによって、尾側神経上皮系分化が阻止される。ＧＢＸ２のデータは、例えば図１及び図２に示されている。さらに、ＣＤＸ２は脊髄の大部分で発現しており、３つのＣＤＸ遺伝子のなかでおそらく最も重要であると考えられている。
【0055】
さらなる一実施形態では、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４の少なくとも１つは不活性化されている、例えばＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４の少なくとも２つは不活性化されている、例えばＣＤＸ１及びＣＤＸ２は不活性化されている、例えばＣＤＸ２及びＣＤＸ４は不活性化されている、又はＣＤＸ１及びＣＤＸ４は不活性化されている、又は好ましくは、例えば少なくともＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４は不活性化されている。それらの遺伝子のうちの１つ又は複数を不活性化させることによって、尾側神経前駆細胞の分化は阻止される。
【0056】
さらに別の実施形態では、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１及びＨＯＸＢ２の少なくとも１つは不活性化されている、例えばＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ１の少なくとも２つは不活性化されている、例えばＨＯＸＡ１及びＨＯＸＡ２は不活性化されている、例えばＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ１は不活性化されている、又は例えばＨＯＸＡ１及びＨＯＸＢ１は不活性化されている、又は好ましくは、例えば少なくともＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ１は不活性化されている。それらの遺伝子のうちの１つ又は複数を不活性化させることによって、菱脳細胞の分化は阻止される。
【0057】
さらに別の実施形態では、少なくともＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２、及びＣＤＸ４は不活性化されている。実施例２～４では、そのような細胞株に関するデータが示されている（４ｘＫＯ細胞株）。
【0058】
別の実施形態では、少なくともＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ１は不活性化されている。実施例５では、そのような細胞株に関するデータが示されている（８ｘＫＯ細胞株）。
【0059】
さらなる一実施形態では、少なくとも以下の遺伝子は不活性化されている：
－ ＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４；又は
－ ＧＢＸ２、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ１；又は
－ ＧＢＸ２、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１及びＨＯＸＢ２；又は
－ ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１及びＨＯＸＢ２。
－ ＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４；又は
－ ＧＢＸ２、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ１；又は
－ ＧＢＸ２、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１及びＨＯＸＢ２；又は
－ ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１及びＨＯＸＢ２。
【0060】
さらに別の実施形態では、以下の遺伝子のうちの１つ又は複数は不活性化されている：
－ ＰＡＸ６、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１。
－ ＰＡＸ６、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１。
【0061】
実施例６では、それらの遺伝子を不活性化する根拠をさらに詳しく説明する。要するに、列挙した遺伝子は背腹軸に沿った細胞種を表している。
【0062】
様々な遺伝子が様々な方法によって不活性化される。したがって、一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、遺伝子ノックアウト若しくは未成熟終止コドンの導入によって、例えばＣＲＩＳＰＲによって、又は遺伝子の転写若しくは翻訳を阻止することによる遺伝子サイレンシングによって、例えばｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ阻害によって、又は遺伝子のドミナントネガティブ型（version）の導入によって、好ましくはＣＲＩＳＰＲを使用して不活性化されている。実施例の項では、不活性化はＣＲＩＳＰＲによって行われており、インデル変異を遺伝子（複数可）に導入し、フレームシフト変異又は配列の一部の欠失のいずれかがもたらされ、結果として１つ又は複数のアミノ酸が失われるものである。
【0063】
様々な多能性幹細胞が本発明に使用されうる。したがって、一実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択され、好ましくは哺乳動物由来、さらにより好ましくはヒト由来である。
【0064】
多能性幹細胞は、様々な遺伝子の発現パターンによって明らかにすることができる。したがって、一実施形態では、本発明による多能性幹細胞は、ＮＡＮＯＧ＋、ＰＯＵ５Ｆ１＋（ＯＣＴ４＋）及び／又はＳＯＸ２＋、好ましくはＮＡＮＯＧ＋、ＰＯＵ５Ｆ１＋（ＯＣＴ４＋）及びＳＯＸ２＋である。当業者は、当該技術分野で公知の他の発現パターンを特定してもよい。
【0065】
上記でも概説したように、本発明の代替的な態様では、多能性幹細胞はアストロサイト又はプログラミングされた／プログラミング可能なアストロサイトも含むと考えられることに留意されたい。アストロサイトはプログラミングされて、神経細胞などの他の細胞種に分化できることがよく知られている。例えば、アストロサイトは特定の遺伝子の過剰発現によって中脳ドーパミン作動性神経細胞に変換できることが示されている（Rivetti et al., 2017）。また、Ｃｏｒｔｉら（Corti et al 2012）は、神経運命をもつ前駆細胞及び成熟細胞を得るための、ヒト皮質アストロサイトの神経幹／前駆体表現型への脱分化を示した。
【0066】
したがって、ヒトのアストロサイトからの多分化能の回復は、神経障害における内在性中枢神経系細胞の細胞リプログラミングにおいて潜在的な可能性がある。本発明と組み合わせることで、この可能性をさらに探究することができる。
【0067】
したがって、遺伝子をノックアウトしてその能力を限定することによってドーパミン作動性神経細胞の生成を増強する方法は、（リプログラミングされた／リプログラミング可能な）アストロサイトの中脳ドーパミン作動性神経細胞への変換にも適用できる可能性がある。
【0068】
この態様は、本発明の他の態様と組み合わせできることも理解されるべきである。
【0069】
多能性幹細胞の使用
本発明による多能性幹細胞は様々な目的に使用することができる。したがって、本発明の一態様は、多能性幹細胞の細胞系譜限定細胞分化のための、本発明による多能性幹細胞の使用に関する。
本発明による多能性幹細胞は様々な目的に使用することができる。したがって、本発明の一態様は、多能性幹細胞の細胞系譜限定細胞分化のための、本発明による多能性幹細胞の使用に関する。
【0070】
別の態様は、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体の生成のための、本発明による多能性幹細胞の使用に関する。
【0071】
一実施形態では、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体は、中脳ドーパミン作動性神経細胞などのドーパミン作動性神経細胞、中脳ドーパミン作動性前駆神経細胞、尾側中脳前駆細胞、及び中脳底板前駆細胞からなる群より選択される。
【0072】
別の実施形態では、前記（said）その細胞誘導体は、中脳ドーパミン作動性神経細胞などのドーパミン作動性神経細胞である。
【0073】
ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体
具体的には、本発明は、本発明による系譜限定多能性幹細胞から得られるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に関する。したがって、一態様はさらに、本発明による多能性幹細胞から分化させたドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に関する。ここでもやはり、実施例の項で概説されるように、本発明の系統限定幹細胞は、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に効率よく分化することができる。
具体的には、本発明は、本発明による系譜限定多能性幹細胞から得られるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に関する。したがって、一態様はさらに、本発明による多能性幹細胞から分化させたドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に関する。ここでもやはり、実施例の項で概説されるように、本発明の系統限定幹細胞は、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に効率よく分化することができる。
【0074】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１からなる群より選択される１つ又は複数の遺伝子が不活性化されていることを特徴とするドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に関する。
【0075】
一実施形態では、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体は、ＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ１からなる群より選択される１つ又は複数の遺伝子は不活性化されている。
【0076】
別の実施形態では、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体は、中脳ドーパミン作動性神経細胞などのドーパミン作動性神経細胞、中脳ドーパミン作動性前駆神経細胞、中脳底板前駆細胞、及び尾側中脳前駆細胞からなる群より選択される。
【0077】
関連する実施形態では、前記その細胞誘導体は、中脳ドーパミン作動性神経細胞などのドーパミン作動性神経細胞である。
【0078】
多能性幹細胞に関する態様のために示した不活性化遺伝子のリストはこの態様にも適用されることが理解されるべきである。
【0079】
ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体は、特有の発現パターンによって明らかにすることができる。一実施形態では、神経細胞（ドーパミン作動性神経前駆細胞）は、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１及び／又はＴＨを発現する。
【0080】
関連する実施形態では、ドーパミン作動性神経前駆細胞は、（高いレベルの）ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２、ＥＮ１、ＳＰＲＹ１、ＷＮＴ１、ＣＮＰＹ１、ＰＡＸ８、ＥＴＶ５、ＰＡＸ５、ＳＰ５、及び／又はＴＬＥ４を発現する。
【0081】
生成された細胞が使用前に保存できれば、有利である可能性がある。したがって、一実施形態では、神経細胞は凍結保存される。
【0082】
医療用途
本発明による生成された神経細胞には、様々な医療用途がありうる。したがって、本発明の一態様は、幹細胞治療においてなど、医薬品として使用するための本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に関する。
本発明による生成された神経細胞には、様々な医療用途がありうる。したがって、本発明の一態様は、幹細胞治療においてなど、医薬品として使用するための本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に関する。
【0083】
別の態様では、本発明は、神経変性疾患の治療、予防又は緩和に使用するための、本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に関する。
【0084】
一実施形態では、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体は、対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象の脳に移植される。
【0085】
別の実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病、レビー小体病からなる群より選択され、好ましくはパーキンソン病である。好ましい実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病である。
【0086】
ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体は、様々な形態の移植片に使用することができる。したがって、一実施形態では、その使用は、自家移植、異種移植又は同種移植としてである。
【0087】
インビトロでの使用
本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体は、インビトロで使用することもできる。したがって、本発明の一態様は、薬物スクリーニングアッセイにおける本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体の使用に関する。酸化ストレスを防ぐ薬物や、ミトコンドリアの損傷を防ぐ薬物、ミスフォールドしたタンパク質の分解を促進する薬物、ミスフォールドしたタンパク質の分泌を防ぐ薬物、神経を保護する薬物など。
本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体は、インビトロで使用することもできる。したがって、本発明の一態様は、薬物スクリーニングアッセイにおける本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体の使用に関する。酸化ストレスを防ぐ薬物や、ミトコンドリアの損傷を防ぐ薬物、ミスフォールドしたタンパク質の分解を促進する薬物、ミスフォールドしたタンパク質の分泌を防ぐ薬物、神経を保護する薬物など。
【0088】
系譜限定多能性幹細胞を提供するための方法
さらに、本発明の一態様は、本発明による多能性幹細胞を提供するための方法であって、多能性幹細胞においてＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を不活性化させることを含む方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、本発明による多能性幹細胞を提供するための方法であって、多能性幹細胞においてＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＡ３、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＤＢＸ１、及びＳＩＭ１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を不活性化させることを含む方法に関する。
【0089】
一実施形態では、多能性幹細胞においてＧＢＸ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ４、ＧＢＸ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ１からなる群より選択される１つ又は複数の遺伝子は不活性化されている。
【0090】
ここでもやはり、多能性幹細胞に関する態様で示した不活性化遺伝子のリストはこの態様にも適用されることが理解されるべきである。
【0091】
さらなる一実施形態では、少なくとも１つの不活性化遺伝子を含む提供された多能性幹細胞（複数可）は、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体とは異なる細胞系譜に分化するその能力が限られている。
【0092】
関連する実施形態では、少なくとも１つの不活性化遺伝子を含む提供された多能性幹細胞は、尾側神経前駆細胞、脊髄前駆細胞、菱脳前駆細胞、後脳前駆細胞、及び髄脳前駆細胞からなる群より選択される細胞系譜に分化するその能力が限られている。
【0093】
一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、遺伝子ノックアウト若しくは未成熟終止コドンの導入によって、例えばＣＲＩＳＰＲによって、又は遺伝子の転写若しくは翻訳を中断させることによって、例えば遺伝子サイレンシングによって、ｓｉＲＮＡによって、若しくはＣＲＩＳＰＲ阻害によって、又は遺伝子のドミナントネガティブ型（version）の発現によって、好ましくはＣＲＩＳＰＲを使用して不活性化されている。
【0094】
本発明のさらなる態様は、本発明による方法によって得られる／得ることができる多能性幹細胞に関する。
【0095】
ドーパミン作動性神経前駆細胞を提供するための方法
さらに、本発明のさらなる態様は、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体を提供するための方法であって、
－ 本発明による多能性幹細胞を提供すること；及び
－ 提供された多能性幹細胞を、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に分化させること
を含む方法に関する。
さらに、本発明のさらなる態様は、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体を提供するための方法であって、
－ 本発明による多能性幹細胞を提供すること；及び
－ 提供された多能性幹細胞を、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体に分化させること
を含む方法に関する。
【0096】
本発明による方法の利点は、細胞分化培地中の様々な成分の量があまり制限されない可能性があることである。例えば、実施例３に示されるように、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度はあまり制限されない。したがって、最適でない濃度の成長因子又は小分子が使用された場合でも、所望の細胞種を生成することができる。
【0097】
さらなる一実施形態では、提供されたドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体は凍結保存される。
【0098】
別の実施形態では、ドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体は、中脳ドーパミン作動性神経細胞などのドーパミン作動性神経細胞、中脳ドーパミン作動性前駆神経細胞、中脳底板前駆細胞、及び尾側中脳前駆細胞からなる群より選択される。
【0099】
さらなる実施形態では、前記その細胞誘導体は、中脳ドーパミン作動性神経細胞などのドーパミン作動性神経細胞である。
【0100】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、インビトロ及び／又は生体外（ex vivo）で行われる。
【0101】
本発明の他の態様
本発明のさらなる態様は、神経変性疾患に罹患した対象を治療又は緩和するための方法であって、本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体を対象の脳に移植することを含む方法に関する。
本発明のさらなる態様は、神経変性疾患に罹患した対象を治療又は緩和するための方法であって、本発明によるドーパミン作動性神経前駆細胞又はその細胞誘導体を対象の脳に移植することを含む方法に関する。
【0102】
本発明の１つの態様の文脈で記載された実施形態及び特徴は、本発明の他の態様にも適用されることに留意すべきである。
【0103】
本願で引用されている特許及び非特許の参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0104】
以下、本発明を次の非限定的な例においてさらに詳細に説明していく。
【実施例】
【0105】
実施例１ － 材料と方法
ヒト多能性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ；Ｈ９細胞株、ＷｉＣｅｌｌ）を、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭβ－メルカプトエタノール、０．５％ペン／ストレップ及び２０％ノックアウト血清代替を補充したＤＭＥＭ／栄養混合Ｆ－１２からなるＫＳＲ培地中の照射ヒト線維芽細胞上で維持した。ＫＳＲ培地に、ＦＧＦ２（１５ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びアクチビンＡ（１５ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄシステムズ）を補充した。７日ごとに細胞を手動で継代し、照射線維芽細胞が入った、新しく調製したゼラチンコーティングディシュに断片を移した。
ヒト多能性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ；Ｈ９細胞株、ＷｉＣｅｌｌ）を、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭβ－メルカプトエタノール、０．５％ペン／ストレップ及び２０％ノックアウト血清代替を補充したＤＭＥＭ／栄養混合Ｆ－１２からなるＫＳＲ培地中の照射ヒト線維芽細胞上で維持した。ＫＳＲ培地に、ＦＧＦ２（１５ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びアクチビンＡ（１５ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄシステムズ）を補充した。７日ごとに細胞を手動で継代し、照射線維芽細胞が入った、新しく調製したゼラチンコーティングディシュに断片を移した。
【0106】
４日目及び１１日目の尾側神経前駆体への分化
以前に記載されたように（Denham et al., 2015）、ｈＥＳＣを尾側神経前駆体に分化させた。簡潔に言うと、フィーダー（ＣＣＤ－１０７９ Ｓｋ、ＡＴＣＣ）で増殖しているコロニーからｈＥＳＣ断片を切り出し、Ｎ２サプリメント１％、Ｂ２７サプリメント－ビタミンＡ１％、インスリン／トランスフェリン／セレニウム－Ａ（ＩＴＳ－Ａ）１％、グルコース０．３％、グルタマックスサプリメント１％、ペニシリン／ストレプトマイシン０．５％を補充した１：１のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＮＢＭ）及びＤＭＥＭ／Ｆ－１２を含むＮ２Ｂ２７培地中でビトロネクチンコーティングプレートにプレーティングした（すべてライフテクノロジーズ製）。培地に、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ；１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ；１００ｎＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）及びＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；３μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）で４日間補充した。１１日目の尾側神経前駆体の場合、細胞を上記のように４日目まで培養し、次いでコロニーを０．５ｍｍ片に切断し、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び４００ｎＭのＳＡＧ（ミリポア）を補充したＮ２Ｂ２７培地で低接着９６ウェルプレート（コーニング、コーニング、ニューヨーク州、米国、ｗｗｗ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ）で浮遊培養した。
以前に記載されたように（Denham et al., 2015）、ｈＥＳＣを尾側神経前駆体に分化させた。簡潔に言うと、フィーダー（ＣＣＤ－１０７９ Ｓｋ、ＡＴＣＣ）で増殖しているコロニーからｈＥＳＣ断片を切り出し、Ｎ２サプリメント１％、Ｂ２７サプリメント－ビタミンＡ１％、インスリン／トランスフェリン／セレニウム－Ａ（ＩＴＳ－Ａ）１％、グルコース０．３％、グルタマックスサプリメント１％、ペニシリン／ストレプトマイシン０．５％を補充した１：１のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＮＢＭ）及びＤＭＥＭ／Ｆ－１２を含むＮ２Ｂ２７培地中でビトロネクチンコーティングプレートにプレーティングした（すべてライフテクノロジーズ製）。培地に、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ；１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ；１００ｎＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）及びＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；３μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）で４日間補充した。１１日目の尾側神経前駆体の場合、細胞を上記のように４日目まで培養し、次いでコロニーを０．５ｍｍ片に切断し、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び４００ｎＭのＳＡＧ（ミリポア）を補充したＮ２Ｂ２７培地で低接着９６ウェルプレート（コーニング、コーニング、ニューヨーク州、米国、ｗｗｗ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ）で浮遊培養した。
【0107】
中脳ドーパミン作動性神経細胞への分化
ｍｅｓＤＡ神経細胞の生成は、以前に報告されたプロトコールを若干の修正を加えて（Nolbrant et al., 2017）、実施することによって達成した。簡潔に言うと、０日目から９日目まで、１０μＭのＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１（０．５～１μＭ）、０．１μＭのＬＤＮ－１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、及び４００ｎＭのＳＡＧ（ミリポア）を補充したＮ２Ｂ２７培地で細胞を増殖させた。４日目にコロニーを断片に切り、浮遊培養した。９～１１日目に、培地のサプリメントをＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄシステムズ）に変更した。１１日目から培地に、ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＭ２２Ａ４（２μＭ）、及びアスコルビン酸（２００μＭの場合；シグマ）を補充した。１６日目以降、細胞をアキュターゼで分離させ、ポリオルニチン、フィブロネクチン及びラミニン（すべてシグマ製）でコーティングされた培養プレート上で培養した。神経分化培地はＢ２７ １％、ペン／ストレップ２５Ｕ／ｍＬ、グルタマックス０．５％からなる。ＮＤＭに、２００μＭのアスコルビン酸、ＬＭ２２Ａ４（２μＭ）、１μＭのＤＡＰＴ（Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｄｃＡＭＰ（５００μＭ）を補充した。実験終了まで１日おきに培地を交換した。あるいは、１６日目に、浮遊培養を保ってオルガノイドを生成させた。
ｍｅｓＤＡ神経細胞の生成は、以前に報告されたプロトコールを若干の修正を加えて（Nolbrant et al., 2017）、実施することによって達成した。簡潔に言うと、０日目から９日目まで、１０μＭのＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１（０．５～１μＭ）、０．１μＭのＬＤＮ－１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、及び４００ｎＭのＳＡＧ（ミリポア）を補充したＮ２Ｂ２７培地で細胞を増殖させた。４日目にコロニーを断片に切り、浮遊培養した。９～１１日目に、培地のサプリメントをＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄシステムズ）に変更した。１１日目から培地に、ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＭ２２Ａ４（２μＭ）、及びアスコルビン酸（２００μＭの場合；シグマ）を補充した。１６日目以降、細胞をアキュターゼで分離させ、ポリオルニチン、フィブロネクチン及びラミニン（すべてシグマ製）でコーティングされた培養プレート上で培養した。神経分化培地はＢ２７ １％、ペン／ストレップ２５Ｕ／ｍＬ、グルタマックス０．５％からなる。ＮＤＭに、２００μＭのアスコルビン酸、ＬＭ２２Ａ４（２μＭ）、１μＭのＤＡＰＴ（Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｄｃＡＭＰ（５００μＭ）を補充した。実験終了まで１日おきに培地を交換した。あるいは、１６日目に、浮遊培養を保ってオルガノイドを生成させた。
【0108】
レンチウイルスの作製
第３世代レンチウイルスは、以前に報告されたように生成した（Gill and Denham, 2020）。手短に言えば、５つのレンチウイルスプラスミド、ｐＬＶ－４ｇＲＮＡ－ＧＢＸ２－ＲＦＰ、ｐＬＶ－ｈＵｂＣ－ＧＢＸ２－ＣＤＸ１２４－Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＬＶ－ＨＯＸＡ１＋２－ＨＯＸＢ１－ｈＵｂＣ－ｄｓＲＥＤ、ｐＬＶ－Ｐｕｒｏ－Ｕ６－ＧＢＸ１－Ｇ３－Ｕ６－ＧＢＸ１－Ｇ１及びｌｅｎｔｉＣａｓ９－Ｂｌａｓｔ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃５２９６２）を使用してレンチウイルスを作製した。
第３世代レンチウイルスは、以前に報告されたように生成した（Gill and Denham, 2020）。手短に言えば、５つのレンチウイルスプラスミド、ｐＬＶ－４ｇＲＮＡ－ＧＢＸ２－ＲＦＰ、ｐＬＶ－ｈＵｂＣ－ＧＢＸ２－ＣＤＸ１２４－Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＬＶ－ＨＯＸＡ１＋２－ＨＯＸＢ１－ｈＵｂＣ－ｄｓＲＥＤ、ｐＬＶ－Ｐｕｒｏ－Ｕ６－ＧＢＸ１－Ｇ３－Ｕ６－ＧＢＸ１－Ｇ１及びｌｅｎｔｉＣａｓ９－Ｂｌａｓｔ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃５２９６２）を使用してレンチウイルスを作製した。
【0109】
ノックアウト細胞株の生成
遺伝子ノックアウト細胞株を生成するために、多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースとするシングルレンチウイルスベクター系を使用した（Kabadi et al., 2014）。ガイド配列を含有するレンチウイルスプラスミドの構築には、ゴールデンゲート（Golden Gate）クローニング法を使用する必要があった。具体的には、次のドナープラスミドｐｈ７ＳＫ－ｇＲＮＡ、ｐｈＵ６－ｇＲＮＡ、ｐｍＵ６－ｇＲＮＡ、ｐｈＨ１－ｇＲＮＡ及びデスティネーションベクターｐＬＶ ｈＵｂＣ－Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＬＶ ＧＧ ｈＵｂＣ－ｄｓＲＥＤ（Ａｄｄｇｅｎｅ；５３１８９、５３１８８、５３１８７、５３１８６、５３１９０、８４０３４）を使用した。ドナープラスミドをＢｂｓＩで消化し、遺伝子のゲノム標的配列を含有する一対の一本鎖オリゴを一緒にアニールして、プラスミドにクローニングした。次いで、４つのゴールデンゲート互換ドナーベクターのセットを選択、使用して最終的なデスティネーションベクターを生成した。簡潔に言うと、選択したドナーベクター及びデスティネーションベクターをすべてＢｓｍＢＩで消化し、Ｔ４リガーゼと共に断片をライゲーションし、形質転換し、アンピシリンを用いてコロニーを選択した。生成された最終的なデスティネーションベクターは、ｐＬＶ－ＧＢＸ２－ＣＤＸ１＋２＋４－ｈＵｂＣ－Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ及びｐＬＶ－ＨＯＸＡ１＋２－ＨＯＸＢ１－ｈＵｂＣ－ｄｓＲＥＤであった。ＧＢＸ１の場合、レンチウイルスデュアルガイドピューロマイシンベクターであるｐＬＶ－Ｐｕｒｏ－Ｕ６－ＧＢＸ１－Ｇ３－Ｕ６－ＧＢＸ１－Ｇ１を設計し、Ｖｅｃｔｏｒｂｕｉｌｄｅｒ（ベクターＩＤ：ＶＢ１９０３２２－１０７８ｇｃｖ）から購入し、表１のガイド配列とした。
遺伝子ノックアウト細胞株を生成するために、多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースとするシングルレンチウイルスベクター系を使用した（Kabadi et al., 2014）。ガイド配列を含有するレンチウイルスプラスミドの構築には、ゴールデンゲート（Golden Gate）クローニング法を使用する必要があった。具体的には、次のドナープラスミドｐｈ７ＳＫ－ｇＲＮＡ、ｐｈＵ６－ｇＲＮＡ、ｐｍＵ６－ｇＲＮＡ、ｐｈＨ１－ｇＲＮＡ及びデスティネーションベクターｐＬＶ ｈＵｂＣ－Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＬＶ ＧＧ ｈＵｂＣ－ｄｓＲＥＤ（Ａｄｄｇｅｎｅ；５３１８９、５３１８８、５３１８７、５３１８６、５３１９０、８４０３４）を使用した。ドナープラスミドをＢｂｓＩで消化し、遺伝子のゲノム標的配列を含有する一対の一本鎖オリゴを一緒にアニールして、プラスミドにクローニングした。次いで、４つのゴールデンゲート互換ドナーベクターのセットを選択、使用して最終的なデスティネーションベクターを生成した。簡潔に言うと、選択したドナーベクター及びデスティネーションベクターをすべてＢｓｍＢＩで消化し、Ｔ４リガーゼと共に断片をライゲーションし、形質転換し、アンピシリンを用いてコロニーを選択した。生成された最終的なデスティネーションベクターは、ｐＬＶ－ＧＢＸ２－ＣＤＸ１＋２＋４－ｈＵｂＣ－Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ及びｐＬＶ－ＨＯＸＡ１＋２－ＨＯＸＢ１－ｈＵｂＣ－ｄｓＲＥＤであった。ＧＢＸ１の場合、レンチウイルスデュアルガイドピューロマイシンベクターであるｐＬＶ－Ｐｕｒｏ－Ｕ６－ＧＢＸ１－Ｇ３－Ｕ６－ＧＢＸ１－Ｇ１を設計し、Ｖｅｃｔｏｒｂｕｉｌｄｅｒ（ベクターＩＤ：ＶＢ１９０３２２－１０７８ｇｃｖ）から購入し、表１のガイド配列とした。
【0110】
手短に言えば、ＧＢＸ２ノックアウト細胞株であるＨ９細胞に、ＬＶ－４ｇＲＮＡ－ＧＢＸ２－ＲＦＰ及びｌｅｎｔｉＣａｓ９－Ｂｌａｓｔを形質導入し、３日後に１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを使用して形質導入細胞を６日間選択した。次いで、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）の５６１ｎｍレーザーを用いて、ＦＡＣＳを使用して単一のＲＦＰ陽性細胞を９６ウェルプレートで分離した。クローン中の対応する標的部位のインデルは、ゲノムＰＣＲで解析した。４Ｘノックアウト細胞株を生成するため、Ｈ９細胞にＬＶ－ｈＵｂＣ－ＧＢＸ２－ＣＤＸ１２４－Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＧＦＰを感染させ、７日後、ＦＡＣＳにより単一ＧＦＰ陽性細胞を選別した。８Ｘノックアウト細胞株を同様の方法で生成した。アレル特異的変異を、全エクソーム解析を使用して確認した。全エクソーム解析及びマッピングは、ＢＧＩ（ＢＧＩ、コペンハーゲン）によって行われた。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ Ｖ２．１０．０を使用して、アレル特異的変異を明らかにした。アライメントツールでマッピングできなかった大きな欠失を明らかにするために、Ｇｒｅｐを使用してＦａｓｔＱファイルから個々のシーケンシングリードを抽出し、手動で解析した。
【0111】
上記に基づいて、当業者であれば、リストにはあるが、本明細書（here）では試験されていない他の関連遺伝子のノックアウト細胞株を設計することができるであろう。
【0112】
【表1】
【0113】
ＱＰＣＲ及びナノストリング
ＱＰＣＲ及びナノストリングの実験は当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、キアゲンＲＮｅａｓｙミニキットを使用してＲＮＡを抽出し、標準的なプロトコールに従ってＤＮａｓｅ Ｉで処理した。ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩとランダムプライマーを使用して、５００ｎｇのト－タルＲＮＡから製造業者の説明書に従って生成した。ＱＰＣＲでは、ＵＮＧを含まないＴａｑＭａｎ ＵｎｉｖｅｒｓａｌマスターミックスＩＩ及びＴａｑＭａｎプローブを使用した。ナノストリング実験は、ナノストリングｎＣｏｕｎｔｅｒ ＳＰＲＩＮＴ（ナノストリングテクノロジーズ）を使用して、製造業者の説明書に従って行った。簡潔に言うと、２００ｎｇのト－タルＲＮＡを使用した。レポータープローブを６５℃で２０時間ハイブリダイゼーションした。目的遺伝子の１００個のヌクレオチドを標的とするよう設計されたキャプチャープローブ及びレポータープローブのパネル並びにハウスキーピング遺伝子のパネルからなるカスタムデザインのナノストリングＣｏｄｅＳｅｔを使用した。ＲＮＡ発現データはハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化した。
ＱＰＣＲ及びナノストリングの実験は当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、キアゲンＲＮｅａｓｙミニキットを使用してＲＮＡを抽出し、標準的なプロトコールに従ってＤＮａｓｅ Ｉで処理した。ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩとランダムプライマーを使用して、５００ｎｇのト－タルＲＮＡから製造業者の説明書に従って生成した。ＱＰＣＲでは、ＵＮＧを含まないＴａｑＭａｎ ＵｎｉｖｅｒｓａｌマスターミックスＩＩ及びＴａｑＭａｎプローブを使用した。ナノストリング実験は、ナノストリングｎＣｏｕｎｔｅｒ ＳＰＲＩＮＴ（ナノストリングテクノロジーズ）を使用して、製造業者の説明書に従って行った。簡潔に言うと、２００ｎｇのト－タルＲＮＡを使用した。レポータープローブを６５℃で２０時間ハイブリダイゼーションした。目的遺伝子の１００個のヌクレオチドを標的とするよう設計されたキャプチャープローブ及びレポータープローブのパネル並びにハウスキーピング遺伝子のパネルからなるカスタムデザインのナノストリングＣｏｄｅＳｅｔを使用した。ＲＮＡ発現データはハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化した。
【0114】
免疫蛍光法
免疫蛍光法を、当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、ガラスカバーリップ上で培養した細胞、又はスフェロイドとして培養プレートに懸濁した細胞を集めた。試料をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて４℃で１５分間（ガラスカバースリップ）又は２時間（スフェロイド）固定し、ＰＢＳで３回、各１０分間洗浄した。スフェロイドをＰＢＳ中の２０％スクロースに移し、４℃で一晩インキュベートし、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）に包埋した。－２０℃でクライオスタット（Ｃｒｏｓｔａｒ ＮＸ７０）を使用して、切片を１０μｍの厚さに切った。カバースリップ及び切片をＰＢＳ中の０．２５％トリトンＸ（ＰＢＳＴ）で１０分間インキュベートし、ＰＢＳＴ中の５％ロバ血清（Ａｌｍｅｃｏ）で室温にて１時間ブロッキングした。次の一次抗体を４℃で一晩適用した：ヤギ抗ＯＴＸ２（１：５００、Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＡＦ１９７９）、マウス抗ＣＤＸ２（１：２００、ＢｉｏＧｅｎｅｘ、カタログ番号ＭＵ３９２－ＵＣ）、マウス抗エングレイルド１（ＥＮ１、１：４０、ＤＳＨＢ、カタログ番号４Ｇ１１－ｓ）、ウサギ抗ＥＮ１（１：５０、メルク、カタログ番号ＨＰＡ０７３１４１）、ウサギ抗ＦＯＸＡ２（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号８１８６）、ヤギ抗ＦＯＸＡ２（１：２００、Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＡＦ２４００）、ウサギ抗ＬＭＸ１Ａ（１：５０００、ミリポア、カタログ番号ＡＢ１０５３３）、マウス抗ＴＨ（１：２０００、ミリポア、カタログ番号ＭＡＢ３１８）、ウサギ抗ＴＨ（１：１０００、Ｐｅｌ Ｆｒｅｅｚ、カタログ番号Ｐ４０１０１－１５０）、ウサギ抗ＧＩＲＫ２（１：５００、アルモン、カタログ番号ＡＰＣ－００６）、マウス抗ＣＡＬＢ１（１：５０００、ＳＷＡＮＴ、カタログ番号３００）、ウサギ抗コラーゲン３Ａ１（１：１０００、ＮｏｖｕｓＢｉｏ、カタログ番号ＮＢ１２０－６５８０）、ヒツジ抗ｈＣＯＬ１Ａ１（１：２００、Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＡＦ６２２０）、及びマウス抗ＨＮＡ（１：２００、アブカム、カタログ番号ａｂ１９１１８１）。細胞をＰＢＳＴで３回、各１０分間洗浄した後、対応する二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ又は１：１０００、インビトロジェン）を室温で１時間適用した。二次抗体を除去した後、細胞を暗所にてＰＢＳＴで３回、各１０分間洗浄した。核をＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）でカウンターステインし、ＰＢＳで３回、各５分間洗い流した。スライド又はカバースリップをＰＶＡ－ＤＡＢＣＯでマウントした。画像は共焦点顕微鏡（ツァイスＬＳＭ７８０）及びＺｅｎソフトウェアで撮影した。
免疫蛍光法を、当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、ガラスカバーリップ上で培養した細胞、又はスフェロイドとして培養プレートに懸濁した細胞を集めた。試料をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて４℃で１５分間（ガラスカバースリップ）又は２時間（スフェロイド）固定し、ＰＢＳで３回、各１０分間洗浄した。スフェロイドをＰＢＳ中の２０％スクロースに移し、４℃で一晩インキュベートし、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）に包埋した。－２０℃でクライオスタット（Ｃｒｏｓｔａｒ ＮＸ７０）を使用して、切片を１０μｍの厚さに切った。カバースリップ及び切片をＰＢＳ中の０．２５％トリトンＸ（ＰＢＳＴ）で１０分間インキュベートし、ＰＢＳＴ中の５％ロバ血清（Ａｌｍｅｃｏ）で室温にて１時間ブロッキングした。次の一次抗体を４℃で一晩適用した：ヤギ抗ＯＴＸ２（１：５００、Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＡＦ１９７９）、マウス抗ＣＤＸ２（１：２００、ＢｉｏＧｅｎｅｘ、カタログ番号ＭＵ３９２－ＵＣ）、マウス抗エングレイルド１（ＥＮ１、１：４０、ＤＳＨＢ、カタログ番号４Ｇ１１－ｓ）、ウサギ抗ＥＮ１（１：５０、メルク、カタログ番号ＨＰＡ０７３１４１）、ウサギ抗ＦＯＸＡ２（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号８１８６）、ヤギ抗ＦＯＸＡ２（１：２００、Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＡＦ２４００）、ウサギ抗ＬＭＸ１Ａ（１：５０００、ミリポア、カタログ番号ＡＢ１０５３３）、マウス抗ＴＨ（１：２０００、ミリポア、カタログ番号ＭＡＢ３１８）、ウサギ抗ＴＨ（１：１０００、Ｐｅｌ Ｆｒｅｅｚ、カタログ番号Ｐ４０１０１－１５０）、ウサギ抗ＧＩＲＫ２（１：５００、アルモン、カタログ番号ＡＰＣ－００６）、マウス抗ＣＡＬＢ１（１：５０００、ＳＷＡＮＴ、カタログ番号３００）、ウサギ抗コラーゲン３Ａ１（１：１０００、ＮｏｖｕｓＢｉｏ、カタログ番号ＮＢ１２０－６５８０）、ヒツジ抗ｈＣＯＬ１Ａ１（１：２００、Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＡＦ６２２０）、及びマウス抗ＨＮＡ（１：２００、アブカム、カタログ番号ａｂ１９１１８１）。細胞をＰＢＳＴで３回、各１０分間洗浄した後、対応する二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ又は１：１０００、インビトロジェン）を室温で１時間適用した。二次抗体を除去した後、細胞を暗所にてＰＢＳＴで３回、各１０分間洗浄した。核をＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）でカウンターステインし、ＰＢＳで３回、各５分間洗い流した。スライド又はカバースリップをＰＶＡ－ＤＡＢＣＯでマウントした。画像は共焦点顕微鏡（ツァイスＬＳＭ７８０）及びＺｅｎソフトウェアで撮影した。
【0115】
フローサイトメトリー解析
フローサイトメトリー解析を、当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、細胞をＰＢＳ－で２回洗浄し、アキュターゼで分離させて単一細胞を得た。３００×ｇで４分間遠心分離し、４％ＰＦＡに室温で１０分間再懸濁した。次いで、細胞をＰＢＳ－で洗浄し、遠心分離し、ＰＢＳＴに再懸濁し、再度遠心分離し、５％ロバ血清で室温にて３０分間ブロッキングした。ブロッキング液中の一次抗体を細胞に添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング液中の二次抗体に再懸濁し、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳＴで４℃にて一晩洗浄し、ＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｑｕａｎｔｅｏｎ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、サンタクララ、カリフォルニア州）を使用したフローサイトメトリーに向けてＰＢＳに再懸濁した。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ．１０、アシュランド、オレゴン州）を用いて解析した。
フローサイトメトリー解析を、当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、細胞をＰＢＳ－で２回洗浄し、アキュターゼで分離させて単一細胞を得た。３００×ｇで４分間遠心分離し、４％ＰＦＡに室温で１０分間再懸濁した。次いで、細胞をＰＢＳ－で洗浄し、遠心分離し、ＰＢＳＴに再懸濁し、再度遠心分離し、５％ロバ血清で室温にて３０分間ブロッキングした。ブロッキング液中の一次抗体を細胞に添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング液中の二次抗体に再懸濁し、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳＴで４℃にて一晩洗浄し、ＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｑｕａｎｔｅｏｎ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、サンタクララ、カリフォルニア州）を使用したフローサイトメトリーに向けてＰＢＳに再懸濁した。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ．１０、アシュランド、オレゴン州）を用いて解析した。
【0116】
免疫蛍光画像の定量
免疫蛍光画像の定量を、当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、培養中又は移植片内のいずれかのＯＴＸ２／ＤＡＰＩ二重陽性、ＧＩＲＫ２／ＴＨ二重陽性及びＣＡＬＢ１／ＴＨ二重陽性細胞の割合を、半自動オブジェクトベース共局在解析（Lunde et al., 2020）によってＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ（１．５３）を用いて定量した。Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｃｒｅａｔｏｒ Ｐｌｕｇｉｎを使用して、マルチチャンネル免疫蛍光画像をマルチチャンネル２値出力画像及びグレースケール出力画像に処理した。自動局所強度閾値、半径外れ値除去（radius outlier removal）、流域分割（watershed segmentation）、浸食（eroding）、穴埋め（hole filling）、ガウスぼかし、最大アルゴリズムを適用したＩｍａｇｅＪのフィルターの入力チャンネルを処理することによって２値出力画像を生成した。さらに、不適切に小さいサイズの２値化オブジェクトを、定義された最小エリアサイズによって出力画像から除去した。共局在シグナルの可視化を向上させるため、オブジェクトの重なりを細胞の核に限定した。２値化オブジェクトのセグメンテーションの精度を、グレースケールの出力画像を介して視覚的に検証した。検証した後、個々に標識した細胞又は共標識した細胞を表す２値化オブジェクトを、Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｏｂｊｅｃｔ Ｃｏｕｎｔｅｒプラグインを使用して自動的に定量した。すべての免疫蛍光画像を、保存した２値化オブジェクトのセグメンテーション設定で解析した。培養中のＯＴＸ２陽性細胞の定量には、２０倍及び６３倍で撮影した最低４つの無作為に選んだ視野（random fields）を使用した。動物１頭につき移植片２つの切片から２０倍で撮った４枚の非重複画像を解析することによって、移植片内のＧＩＲＫ２／ＴＨ二重陽性細胞及びＣＡＬＢ１／ＴＨ二重陽性細胞の定量を盲検的に（blindly）行った。
免疫蛍光画像の定量を、当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、培養中又は移植片内のいずれかのＯＴＸ２／ＤＡＰＩ二重陽性、ＧＩＲＫ２／ＴＨ二重陽性及びＣＡＬＢ１／ＴＨ二重陽性細胞の割合を、半自動オブジェクトベース共局在解析（Lunde et al., 2020）によってＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ（１．５３）を用いて定量した。Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｃｒｅａｔｏｒ Ｐｌｕｇｉｎを使用して、マルチチャンネル免疫蛍光画像をマルチチャンネル２値出力画像及びグレースケール出力画像に処理した。自動局所強度閾値、半径外れ値除去（radius outlier removal）、流域分割（watershed segmentation）、浸食（eroding）、穴埋め（hole filling）、ガウスぼかし、最大アルゴリズムを適用したＩｍａｇｅＪのフィルターの入力チャンネルを処理することによって２値出力画像を生成した。さらに、不適切に小さいサイズの２値化オブジェクトを、定義された最小エリアサイズによって出力画像から除去した。共局在シグナルの可視化を向上させるため、オブジェクトの重なりを細胞の核に限定した。２値化オブジェクトのセグメンテーションの精度を、グレースケールの出力画像を介して視覚的に検証した。検証した後、個々に標識した細胞又は共標識した細胞を表す２値化オブジェクトを、Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｏｂｊｅｃｔ Ｃｏｕｎｔｅｒプラグインを使用して自動的に定量した。すべての免疫蛍光画像を、保存した２値化オブジェクトのセグメンテーション設定で解析した。培養中のＯＴＸ２陽性細胞の定量には、２０倍及び６３倍で撮影した最低４つの無作為に選んだ視野（random fields）を使用した。動物１頭につき移植片２つの切片から２０倍で撮った４枚の非重複画像を解析することによって、移植片内のＧＩＲＫ２／ＴＨ二重陽性細胞及びＣＡＬＢ１／ＴＨ二重陽性細胞の定量を盲検的に（blindly）行った。
【0117】
ＲＮＡシークエンシング及びデータ解析
ＲＮＡシークエンシング及びデータ解析を、当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、ライブラリーの構築、シーケンシング、アダプター除去を含む初期データのフィルタリングは、ＢＧＩヨーロッパゲノムセンター（BGI Europe Genome Center）によって行われた。ト－タルＲＮＡをオリゴｄＴベースのｍＲＮＡ濃縮に供した。１００ｂｐペアエンドリードのシーケンシングをＤＮＢｓｅｑプラットフォームで実施した。１試料あたり２，０００万回より多くのクリーンリードが得られた。ＨＩＳＡＴ２アライナー（ｖ２．１．０）を使用して、ヒトゲノムビルドｈｇ３８（アンサンブルリリース９２）にアライメントしました。転写物の定量を、ＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔ（ｖ１．６．４）を使用して行い、リードカウントを有効遺伝子長及びシーケンス深度で正規化し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）を得た。ｅｄｇｅＲ（ｖ３．３２）を使用してカウントテーブルから発現変動遺伝子を同定した。ＴＰＭ値にセンタリングと単位分散スケーリング（univ variance scaling）を適用してヒートマップを構築し、インピュテーションを伴うＳＶＤを使用したＣｌｕｓｔｖｉｓによる主成分分析（ＰＣＡ）を行った（Metsalu et al., 2015）。
ＲＮＡシークエンシング及びデータ解析を、当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、ライブラリーの構築、シーケンシング、アダプター除去を含む初期データのフィルタリングは、ＢＧＩヨーロッパゲノムセンター（BGI Europe Genome Center）によって行われた。ト－タルＲＮＡをオリゴｄＴベースのｍＲＮＡ濃縮に供した。１００ｂｐペアエンドリードのシーケンシングをＤＮＢｓｅｑプラットフォームで実施した。１試料あたり２，０００万回より多くのクリーンリードが得られた。ＨＩＳＡＴ２アライナー（ｖ２．１．０）を使用して、ヒトゲノムビルドｈｇ３８（アンサンブルリリース９２）にアライメントしました。転写物の定量を、ＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔ（ｖ１．６．４）を使用して行い、リードカウントを有効遺伝子長及びシーケンス深度で正規化し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）を得た。ｅｄｇｅＲ（ｖ３．３２）を使用してカウントテーブルから発現変動遺伝子を同定した。ＴＰＭ値にセンタリングと単位分散スケーリング（univ variance scaling）を適用してヒートマップを構築し、インピュテーションを伴うＳＶＤを使用したＣｌｕｓｔｖｉｓによる主成分分析（ＰＣＡ）を行った（Metsalu et al., 2015）。
【0118】
単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ及びデータ解析
単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ及びデータ解析を、当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、１６、２８及び６２日目に、アキュターゼを使用して培養細胞を単一細胞に分離させた。１６日目にニューロスフィア（細胞株あたりｎ＝１０の生物学的反復）を一緒にプールし、２８日目に細胞株あたり４つの生物学的反復を一緒にプールし、６２日目に細胞株あたり４つの生物学的反復を一緒にプールした。ライブラリーを構築するために、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’キットｖ３．１を標準的なプロトコールに従って使用した。６つの群（１６日目のＨ９細胞、１６日目の４Ｘ細胞、２８日目のＨ９細胞、２８日目の４Ｘ細胞、６２日のＨ９細胞及び６２日の４Ｘ細胞）のそれぞれをＣｈｒｏｍｉｕｍコントローラーの別々のレーンで実行し、１レーン当たり合計８０００個の細胞を載せた。次世代シーケンシングをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ装置で行った。デマルチプレックス、バーコード処理及び単一細胞３′遺伝子カウントには、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（ｖ３．１．０）を使用した。リードをヒトＧＲＣｈ３８参照ゲノムにアライメントした。クオリティフィルタリング、次元圧縮、標準的な教師なしクラスタリングアルゴリズムの適用を含むさらなる解析を、Ｓｅｕｒａｔ Ｒパッケージ（ｖ３．２．１）を使用して行った。外れ値細胞を除外するために、各細胞で発現した遺伝子の数を試料ごとにプロットして、細胞１つあたりの最適な許容最小遺伝子数を選択した。細胞１つあたりの最小遺伝子数を、１６日目のＨ９細胞については３０００、１６日目の４Ｘ細胞については２０００、６２日のＨ９細胞については３０００、６２日の４Ｘ細胞については３０００に設定した。また、ミトコンドリア遺伝子にマッピングされたリードの割合が高い細胞も除去した。１６及び２８日目の試料については、１０％より多いミトコンドリアＲＮＡをもつすべての細胞を除去し、６２日目については、１５％を限度とした。ＲパッケージＤｏｕｂｌｅｔＦｉｎｄｅｒ（ｖ．２．０．３）を使用して、単一細胞トランスクリプトームデータから細胞のダブレットを除去し、ダブレット細胞の予想割合を７．５％に設定した。各細胞の遺伝子カウントをその細胞の総数で割り、スケーリング係数１０，０００を乗じ、自然対数変換することによって単一細胞データを正規化した。ＵＭＡＰ法を使用して次元圧縮を行った。ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ関数を用いたＳｅｕｒａｔのグラフベースクラスタリング法によって、解像度を０．６に設定してクラスタリングを行った。ＲのＳｅｕｒａｔを使用して様々な単一細胞のプロットを作成した。
単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ及びデータ解析を、当業者に一般的に知られているように行った。手短に言えば、１６、２８及び６２日目に、アキュターゼを使用して培養細胞を単一細胞に分離させた。１６日目にニューロスフィア（細胞株あたりｎ＝１０の生物学的反復）を一緒にプールし、２８日目に細胞株あたり４つの生物学的反復を一緒にプールし、６２日目に細胞株あたり４つの生物学的反復を一緒にプールした。ライブラリーを構築するために、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’キットｖ３．１を標準的なプロトコールに従って使用した。６つの群（１６日目のＨ９細胞、１６日目の４Ｘ細胞、２８日目のＨ９細胞、２８日目の４Ｘ細胞、６２日のＨ９細胞及び６２日の４Ｘ細胞）のそれぞれをＣｈｒｏｍｉｕｍコントローラーの別々のレーンで実行し、１レーン当たり合計８０００個の細胞を載せた。次世代シーケンシングをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ装置で行った。デマルチプレックス、バーコード処理及び単一細胞３′遺伝子カウントには、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（ｖ３．１．０）を使用した。リードをヒトＧＲＣｈ３８参照ゲノムにアライメントした。クオリティフィルタリング、次元圧縮、標準的な教師なしクラスタリングアルゴリズムの適用を含むさらなる解析を、Ｓｅｕｒａｔ Ｒパッケージ（ｖ３．２．１）を使用して行った。外れ値細胞を除外するために、各細胞で発現した遺伝子の数を試料ごとにプロットして、細胞１つあたりの最適な許容最小遺伝子数を選択した。細胞１つあたりの最小遺伝子数を、１６日目のＨ９細胞については３０００、１６日目の４Ｘ細胞については２０００、６２日のＨ９細胞については３０００、６２日の４Ｘ細胞については３０００に設定した。また、ミトコンドリア遺伝子にマッピングされたリードの割合が高い細胞も除去した。１６及び２８日目の試料については、１０％より多いミトコンドリアＲＮＡをもつすべての細胞を除去し、６２日目については、１５％を限度とした。ＲパッケージＤｏｕｂｌｅｔＦｉｎｄｅｒ（ｖ．２．０．３）を使用して、単一細胞トランスクリプトームデータから細胞のダブレットを除去し、ダブレット細胞の予想割合を７．５％に設定した。各細胞の遺伝子カウントをその細胞の総数で割り、スケーリング係数１０，０００を乗じ、自然対数変換することによって単一細胞データを正規化した。ＵＭＡＰ法を使用して次元圧縮を行った。ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ関数を用いたＳｅｕｒａｔのグラフベースクラスタリング法によって、解像度を０．６に設定してクラスタリングを行った。ＲのＳｅｕｒａｔを使用して様々な単一細胞のプロットを作成した。
【0119】
電気生理学
４Ｘ細胞の電気生理学的記録を８０～８４ＤＩＶで行った。１３ｍｍφのカバースリップ上でアストロサイトと共培養した４Ｘ細胞を、培養培地から人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）に段階的に移行した後、培養培地に５滴（各２００μＬ）のａＣＳＦを２０秒かけて添加することによって記録チャンバーに移した。記録チャンバーに移した後、カバースリップを、ＮａＣｌを１１９、ＫＣｌを２．５、ＮａＨＣＯ３を２６、ＮａＨ２ＰＯ４を１、Ｄ－グルコースを１１、ＣａＣｌ２を２、及びＭｇＣｌ２を２（ｐＨ７．４に調整）含有するａＣＳＦで室温にて連続灌流した。
４Ｘ細胞の電気生理学的記録を８０～８４ＤＩＶで行った。１３ｍｍφのカバースリップ上でアストロサイトと共培養した４Ｘ細胞を、培養培地から人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）に段階的に移行した後、培養培地に５滴（各２００μＬ）のａＣＳＦを２０秒かけて添加することによって記録チャンバーに移した。記録チャンバーに移した後、カバースリップを、ＮａＣｌを１１９、ＫＣｌを２．５、ＮａＨＣＯ３を２６、ＮａＨ２ＰＯ４を１、Ｄ－グルコースを１１、ＣａＣｌ２を２、及びＭｇＣｌ２を２（ｐＨ７．４に調整）含有するａＣＳＦで室温にて連続灌流した。
【0120】
記録チャンバーを、デジタルカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ Ｅｘｉ Ａｑｕａ）に連結した正立顕微鏡（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ）に取り付けた。６３倍の水浸対物レンズ（オリンパス、ＬｕｍｉＰｌａｎ）を用いて４Ｘ細胞を見えるようにした。電気生理学的記録に選択した細胞は、細かく枝分かれした神経突起をもつ神経細胞様の形態を呈した。集合した細胞のクラスターは避けた。Ｄｉｇｉｄａｔａ１５５０Ａデジタイザー（モレキュラーデバイス）を介してＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ｂ増幅器に接続したＣｌａｍｐｅｘ１０．６ソフトウェアを使用して、電流クランプモードにてホールセル構成で取得（Acquisitions）を行った。データは２００Ｈｚでローパスフィルターをかけ、１０ｋＨｚでデジタル化し、ホールセル電気容量を補正した。パッチピペット（５～１０ＭＯｈｍの抵抗）に、グルコン酸カリウムを１５３、ＨＥＰＥＳを１０、ＮａＣｌを４．５、ＫＣｌを９、ＥＧＴＡを０．６、ＭｇＡＴＰを２、及びＮａＧＴＰを０．３（単位ｍＭ）含有する内液を充填した。内液のｐＨ及び浸透圧は、生理的条件に近かった（ｐＨ７．４、浸透圧２９７ｍＯｓｍ）。試料における細胞のアクセス抵抗は、～３０ＭＯｈｍであった。得られた３０個の神経細胞の記録のうち、１６個を解析用に保持した。残りの記録は、脱分極ステップに反応しない神経細胞（推定アストロサイト）、不安定な神経細胞、又は自発活動を示さない神経細胞にいずれかからであり、したがってそれらの記録を解析から除外した。
【0121】
自発興奮性シナプス後電位（ｓＥＰＳＰ）を、電流クランプギャップフリーモード（－４５ｍＶでクランプ）で記録した。誘発活動電位の電流クランプ記録（－６０ｍＶ）を、振幅（２０ｐＡ）を増加させながら電流パルス（８００ｍｓ）を繰り返し印加することによって行った。
【0122】
Ｃｌａｍｐｆｉｔ １０．６ソフトウェア（モレキュラーデバイス）を使用してデータ解析を行った。発火頻度の分布を可視化するために、電流クランプモードでの１秒当たりの自発スパイクの数を、Ｃｌａｍｐｆｉｔソフトウェアの閾値ツールを使用して１分間にわたってカウントし、幅が１に等しい（１Ｈｚに相当）ビン（bins）に分類した。データは、グラフパッドプリズムＶ９ソフトウェアの度数分布モードを使用して可視化した。
【0123】
ドーパミン含量のＨＰＬＣ分析
８０ＤＩＶで、試料あたり１～２つのオルガノイドを集め、１００μｌの０．２Ｍ ＨＣｌＯ４でホモジナイズした。次いで、試料を遠心分離し、上清を集め、０．２μｍのスピンフィルター（Ｃｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ－Ｘ、メルク）を通して１４０００×ｇ、４℃で１分間スピンし、ＨＰＬＣシステム（サーモサイエンティフィックＵｌｔｉｍａｔｅ３０００）に載せた。移動相は、１２．５％アセトニトリルバッファー（ｐＨ３．０、８６ｍＭリン酸二水素ナトリウム、０．０１％トリエチルアミン、２．０８ｍＭ １－オクタンスルホン酸ナトリウム塩、及び０．０２ｍＭＥＤＴＡ）であった。移動相の流速を１．５ｍｌ／分に調整した。外部ＤＡ標準を使用して作成した標準曲線を用いてドーパミンのレベルを算出した（標準曲線決定係数は０．９９９４６）。次いで、ドーパミン含量をタンパク質濃度で正規化し、ｎｍｏｌ／ｇで表した。
８０ＤＩＶで、試料あたり１～２つのオルガノイドを集め、１００μｌの０．２Ｍ ＨＣｌＯ４でホモジナイズした。次いで、試料を遠心分離し、上清を集め、０．２μｍのスピンフィルター（Ｃｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ－Ｘ、メルク）を通して１４０００×ｇ、４℃で１分間スピンし、ＨＰＬＣシステム（サーモサイエンティフィックＵｌｔｉｍａｔｅ３０００）に載せた。移動相は、１２．５％アセトニトリルバッファー（ｐＨ３．０、８６ｍＭリン酸二水素ナトリウム、０．０１％トリエチルアミン、２．０８ｍＭ １－オクタンスルホン酸ナトリウム塩、及び０．０２ｍＭＥＤＴＡ）であった。移動相の流速を１．５ｍｌ／分に調整した。外部ＤＡ標準を使用して作成した標準曲線を用いてドーパミンのレベルを算出した（標準曲線決定係数は０．９９９４６）。次いで、ドーパミン含量をタンパク質濃度で正規化し、ｎｍｏｌ／ｇで表した。
【0124】
生体内移植用の細胞の調製
単一細胞のバッチごとに、それぞれの細胞株（Ｈ９及び４Ｘ）に由来する１６ＤＩＶで１０個のニューロスフェアを集め、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、５００μｌのアキュターゼ（１００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅを補充）を加え、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。ニューロスフェアを、まず１ｍｌピペットで、続いて２００μｌピペットでピペッティングし、単一細胞の溶液を得た。５００マイクロリットルの洗浄培地（１％ヒト血清アルブミン補充ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を加え、細胞を４００×ｇで室温にて５分間スピンダウンした。細胞ペレットをＨＢＳＳ（１００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅを補充）に１０万個／μｌの濃度で再懸濁し、氷上で保った。細胞懸濁液を氷上で最大３時間保ち、その後新しいバッチの細胞を調製した。
単一細胞のバッチごとに、それぞれの細胞株（Ｈ９及び４Ｘ）に由来する１６ＤＩＶで１０個のニューロスフェアを集め、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、５００μｌのアキュターゼ（１００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅを補充）を加え、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。ニューロスフェアを、まず１ｍｌピペットで、続いて２００μｌピペットでピペッティングし、単一細胞の溶液を得た。５００マイクロリットルの洗浄培地（１％ヒト血清アルブミン補充ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を加え、細胞を４００×ｇで室温にて５分間スピンダウンした。細胞ペレットをＨＢＳＳ（１００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅを補充）に１０万個／μｌの濃度で再懸濁し、氷上で保った。細胞懸濁液を氷上で最大３時間保ち、その後新しいバッチの細胞を調製した。
【0125】
生体内移植
タコニックバイオサイエンシズＡ／Ｓから購入した成体（９週齢）雄（２２５～３００ｇ）（ｎ＝３０）ＮＩＨ（ＮＴａｃ：ＮＩＨ－Ｆｏｘｎ１ｒｎｕ）ヌードラットを、クリーンルーム内の換気ケージで１２時間の明暗サイクル下において集団で飼育し（grouped-housed）、自由に無菌飼料及び水にアクセスさせた。ラットの標準的な飼料にくわえ、ピーナッツを与えてカロリー摂取量を増やした。
タコニックバイオサイエンシズＡ／Ｓから購入した成体（９週齢）雄（２２５～３００ｇ）（ｎ＝３０）ＮＩＨ（ＮＴａｃ：ＮＩＨ－Ｆｏｘｎ１ｒｎｕ）ヌードラットを、クリーンルーム内の換気ケージで１２時間の明暗サイクル下において集団で飼育し（grouped-housed）、自由に無菌飼料及び水にアクセスさせた。ラットの標準的な飼料にくわえ、ピーナッツを与えてカロリー摂取量を増やした。
【0126】
イソフルラン（導入には５％、維持には２～３％）、１．２Ｌ／分のＯ２、及び０．６Ｌ／分の大気でラットに麻酔をかけ、定位固定フレーム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）に置き、ガラスカニューレが取り付けられたハミルトンシリンジを使用して、６－ＯＨＤＡ（シグマアルドリッチＡ／Ｓ）（０．０２％アスコルビン酸を含有する生理食塩水中の７μｇ／μｌ遊離塩基の２μｌ）（Tentilier et al., 2016）を、右ＭＦＢ（前後（ＡＰ）、－４．４；内外方向（ＭＬ）－１．１；背腹（ＤＶ）、－７．６；切歯バー（tooth bar）、３．３）に片側注射した。注入後、カニューレを５分間そのまま置いてから、ゆっくりと引き戻した。切開部を縫合し、鎮痛剤としてブプレノルフィン（０．３６ｍｇ／ｋｇ）を動物に注射した。動物が完全に目を覚ますと、ウェット飼料及び水中０．００９ｍｇ／ｍｌのＴｅｍｇｅｓｉｃを入れたケージに戻した。
【0127】
手術後３週間目にアンフェタミン誘発回転試験を使用して病変形成効率を評価し、＞５回転／分を示した動物をさらなる実験に使用した。選択したラットを、アンフェタミン誘発回転数の平均値が近い次の３群に分けた：６－ＯＨＤＡ病変（移植なし）群（ｎ＝８）、Ｈ９細胞移植群（ｎ＝９）、４Ｘ細胞移植群（ｎ＝９）（図１３Ｂ～Ｃ）。病変形成の４週間後、Ｈ９細胞移植群及び４Ｘ細胞移植群の動物に、上記のものと同様のプロトコールを用いて、各細胞種の２５万個の細胞を２．５μｌの量で線条体（ＡＰ、＋０．５；ＭＬ、－３；ＤＶ、－４．６／４．８）に、定位的に注入した。これらの３群はすべて、病変形成後２２週目（すなわち移植の１８週間後）に犠牲にした（sacrificed）。２頭の移植ラットは試験を完了せず、健康上の問題により安楽死させた：４Ｘ細胞移植群の１頭は尾の骨折により（移植後８週目）、Ｈ９細胞移植群の１頭は後肢麻痺による（移植後１７週目）。
【0128】
アンフェタミン誘発回転試験
移植の１週間前並びに移植後８週目及び１８週目に、以前に報告されたように（Bjorklund et al., 2019）アンフェタミン誘発回転試験を行って病変の影響を評価した。動物に腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で５ｍｇ／ｋｇのＤ－アンフェタミンを注射し、ＬＥ３８０６マルチカウンター（ＰａｎＬａｂ、ハーバードアパレイタス）に連結したロータメーター（ＬＥ９０２、ＰａｎＬａｂ、ハーバードアパレイタス）を接続した。９０分間にわたって体回転の数を記録した。
移植の１週間前並びに移植後８週目及び１８週目に、以前に報告されたように（Bjorklund et al., 2019）アンフェタミン誘発回転試験を行って病変の影響を評価した。動物に腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で５ｍｇ／ｋｇのＤ－アンフェタミンを注射し、ＬＥ３８０６マルチカウンター（ＰａｎＬａｂ、ハーバードアパレイタス）に連結したロータメーター（ＬＥ９０２、ＰａｎＬａｂ、ハーバードアパレイタス）を接続した。９０分間にわたって体回転の数を記録した。
【0129】
データは１分間の全身回転の最終的な数として表し、同側回転は正の値、対側回転は負の値を有する。＞５回転／分を示す動物を病変形成が成功したとみなした。１頭のラットは回転試験の１つで技術的な問題があり、その行動テストから除外した。
【0130】
シリンダー試験
病変形成の３週間後（移植の１週間前）及び移植の１８週間後に、シリンダー試験を用いて肢使用非対称性を評価した。動物を透明なプレキシグラスのシリンダー（高さ３０ｃｍ、直径２０ｃｍ）に入れ、シリンダーの表面が完全に見えるようにシリンダーの後ろに２つの鏡を置いた。
病変形成の３週間後（移植の１週間前）及び移植の１８週間後に、シリンダー試験を用いて肢使用非対称性を評価した。動物を透明なプレキシグラスのシリンダー（高さ３０ｃｍ、直径２０ｃｍ）に入れ、シリンダーの表面が完全に見えるようにシリンダーの後ろに２つの鏡を置いた。
【0131】
自発活動を合計５分間ビデオで記録した。以前に報告されたように（Schallert et al, 2000）、スローモーションでＶＣＬ Ｍｅｄｉａ Ｐｌａｙｅｒソフトウェアを使用して、群について知らされていない（blinded to the groups）研究者が、データ解析を行った。動物の探索的運動活動の大部分は最初の２分間に限られ、この時点以降はほとんど動きがなかったため、最初の２分間の活動を解析し、この時点以降の活動は動物が１０回未満の動き（壁接触及び後肢立ち）を示した場合にのみ解析した。
【0132】
前肢使用の非対称性の程度を判定するために以下の行動をスコア化した（Schallert et al., 2009）：ａ）完全に後肢立ちをしている間の壁への接触時又は後肢立ち後の床への着地時に左前肢又は右前肢を単独で使用、並びにｂ）完全に後肢立ちをしている間のシリンダーの壁への接触、壁に沿った横方向の動き（ウォールステッピング（wall stepping））、及び後肢立ち後の床への着地に左前肢と右前肢の両方を同時に使用。データは、すべての動き（壁と床）に対する各前肢（左若しくは右）又は両方の前肢が使用された時間の割合として表す。
【0133】
脳切片の免疫組織化学的解析
ラットを、６－ＯＨＤＡ誘発病変形成の２３週間後にペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）の過量投与によって死亡させた。呼吸停止中に、上行大動脈から氷冷生理食塩水、続いて４％冷ＰＦＡ（０．１Ｍ ＮａＰＢ、ｐＨ７．４中）で灌流した。脳を抽出し、ＰＦＡで２時間ポストフィックスし（postfixed）、２５％スクロース溶液（０．０２Ｍ ＮａＰＢ中）に一晩移した。脳を凍結ミクロトーム（Microm HM 450、Brock and Michelsen）で厚さ３５μｍの冠状切片に切り出し、連続冠状切片（線条体及び黒質では８連（series of 8））に分け、－２０℃で保存した。
ラットを、６－ＯＨＤＡ誘発病変形成の２３週間後にペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）の過量投与によって死亡させた。呼吸停止中に、上行大動脈から氷冷生理食塩水、続いて４％冷ＰＦＡ（０．１Ｍ ＮａＰＢ、ｐＨ７．４中）で灌流した。脳を抽出し、ＰＦＡで２時間ポストフィックスし（postfixed）、２５％スクロース溶液（０．０２Ｍ ＮａＰＢ中）に一晩移した。脳を凍結ミクロトーム（Microm HM 450、Brock and Michelsen）で厚さ３５μｍの冠状切片に切り出し、連続冠状切片（線条体及び黒質では８連（series of 8））に分け、－２０℃で保存した。
【0134】
免疫組織化学的染色を、次の一次抗体を使用してフリーフローティング脳切片で行った：マウス抗ラットＴＨ（１：４０００、ＭＡＢ３１８、メルクミリポア）、ウサギ抗Ｇｉｒｋ２（１：５００、ＡＰＣ－００６、アルモン）、ウサギ抗ＴＨ（１：１０００、ＰｅｌＦｒｅｅｚｅ）、マウスＩｇＧ１抗ＣＡＬＢ１（１：５０００、２８ｋ、ＳＷＡＮＴ）、マウスＩｇＧ１抗ＨＮＡ（１：２００、１５１１８１、アブカム）、ヤギ抗ＦＯＸＡ２（１：２００、ＡＦ２４００）、ヒツジ抗ｈＣＯＬ１Ａ１（１：２００、Ｒ＆Ｄシステムズ）、ウサギ抗ｈＣＯＬ３Ａ１（１：１０００）、ウサギ抗ＥＮ１（１：５０）、及びウサギ抗ＬＭＸ１Ａ（１：５０００）。
【0135】
アビジン－ビオチン－ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＳ Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び３，３－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を発色体として用いて、以前に報告されたように（Tentilier et al, 2016）免疫組織化学を行ってシグナルを可視化した。クロムミョウバンゼラチンをコーティングしたスライドに切片をマウントし、脱水後、カバースリップで覆った。スライドをオリンパスＶＳ１２０Ｓｌｉｄｅ Ｓｃａｎｎｅｒ（正立広視野蛍光）を使用して２０倍の対物レンズで解析した。
【0136】
免疫蛍光法では、フリーフローティング切片を、ＫＢＰＳ中の０．２５％トリトンＸ－１００中の５％正常ロバ血清でブロッキングし、次いでＫＢＰＳ中の２．５％ロバ血清及び０．２５％トリトンＸ－１００中の選択した一次抗体と室温で一晩インキュベートした。切片をＫＰＢＳで洗浄し、ＫＰＢＳ中の１％ロバ血清及び０．２５％トリトンＸ－１００で１０分間プレブロッキングし（preblocked）、ロバで作られた次の種特異的フルオロクロム標識二次抗体と２時間インキュベートした：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８標識抗ヤギＩｇＧ（１：１０００、Ａ１１０５７、インビトロジェン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ウサギＩｇＧ（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８標識抗ウサギＩｇＧ（１：１０００、Ａ１００４２、インビトロジェン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗マウスＩｇＧ（１：１０００、Ａ－３１５７１、インビトロジェン）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８標識抗マウスＩｇＧ１（１：１０００、Ａ１００３７、インビトロジェン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８標識抗ヒツジＩｇＧ（１：１０００、インビトロジェン）。ＤＡＰＩ（１：２０００、シグマアルドリッチＡ／Ｓ）を核染色に使用した。切片を、ダコ蛍光封入剤を用いて、クロムミョウバンゼラチンをコーティングしたスライドにマウントした。
【0137】
顕微鏡による分析（ＴＨ陽性細胞の数及び収量及び移植片体積）
各動物の冠状切片（１：８）をＴＨについて免疫染色し、移植片のＤＡ神経細胞を分析した。オリンパスＶＳ１２０ Ｓｌｉｄｅ Ｓｃａｎｎｅｒ（正立広視野蛍光）を使用して、２０倍の対物レンズを用いてスライドの画像を取得した。移植片が視認できるすべての切片を選択した：Ｈ９細胞移植動物１頭当たり３～５つの切片及び４Ｘ細胞移植動物１頭当たり４～８つの切片。ＴＨ陽性細胞の数を定量した領域は、線条体及び淡蒼球を含み、皮質及び脳梁のＴＨ陽性細胞は含まなかった。画像は、ＱｕＰａｔｈソフトウェアを使用して対象領域（ＲＯＩ）内の細胞を特定することによって分析した（Bankhead et al, 2017）。設定を染色に応じて各切片に合わせて変え、次の設定を使用した：検出画像＝光学密度和（optical density sum）、要ピクセルサイズ＝０．５μｍ、背景半径＝１５～３０μｍ、閾値＝０．１５～０．３、フィルター半径中央値＝０～３μｍ、シグマ＝０．７～２μｍ、最小面積＝８５～１３０μｍ２、最大面積＝５００～１２００μｍ２、最大背景強度＝２、セル拡張（cell expansion）＝２μｍ。細胞を、細胞核の形状含む形状によって分類し、境界を平滑化した。
各動物の冠状切片（１：８）をＴＨについて免疫染色し、移植片のＤＡ神経細胞を分析した。オリンパスＶＳ１２０ Ｓｌｉｄｅ Ｓｃａｎｎｅｒ（正立広視野蛍光）を使用して、２０倍の対物レンズを用いてスライドの画像を取得した。移植片が視認できるすべての切片を選択した：Ｈ９細胞移植動物１頭当たり３～５つの切片及び４Ｘ細胞移植動物１頭当たり４～８つの切片。ＴＨ陽性細胞の数を定量した領域は、線条体及び淡蒼球を含み、皮質及び脳梁のＴＨ陽性細胞は含まなかった。画像は、ＱｕＰａｔｈソフトウェアを使用して対象領域（ＲＯＩ）内の細胞を特定することによって分析した（Bankhead et al, 2017）。設定を染色に応じて各切片に合わせて変え、次の設定を使用した：検出画像＝光学密度和（optical density sum）、要ピクセルサイズ＝０．５μｍ、背景半径＝１５～３０μｍ、閾値＝０．１５～０．３、フィルター半径中央値＝０～３μｍ、シグマ＝０．７～２μｍ、最小面積＝８５～１３０μｍ２、最大面積＝５００～１２００μｍ２、最大背景強度＝２、セル拡張（cell expansion）＝２μｍ。細胞を、細胞核の形状含む形状によって分類し、境界を平滑化した。
【0138】
全移植片中の細胞の数を推定するために、動物当たりのＴＨ陽性細胞の総数をＱｕＰａｔｈソフトウェアで求め、８倍し、アバクロンビー（Abercrombie）法（Abercrombie, 1946）を使用して２つ以上の切片にまたがる細胞の二重カウントを補正した。各群のアバクロンビー係数（factor）は、切片あたりの平均厚さを（平均厚さ＋平均ＴＨ陽性細胞サイズ）で割って算出した。これらの数は、各群につき３頭の異なる動物から、１頭あたり３つの切片、１８個の細胞をサンプリングして算出した。移植片の細胞の総数は、アバクロンビー係数×ＴＨ陽性細胞の総数×８として計算した。移植細胞１０万個当たりの生存細胞の数（収量）を推定した。各移植片の体積は、Ｖ＝Ａ１Ｔ１＋Ａ２Ｔ１＋…＋ＡｎＴ１として推定し、式中、Ｖは推定体積、Ｔ１は１／８連（series）（８×３５μｍ）のサンプリング間隔、及びＡ（ｎ）は切片（ｎ）のＴＨ陽性領域の面積である（Piao et al., 2021）。
【0139】
統計解析
統計解析はすべて、グラフパッドプリズムｖ９．１．１．２２５を使用して行った。一元配置分散分析又は二元配置分散分析を行い、適切な場合にはシダックのテストを事後解析に使用した。移植群のみを比較する場合、対応のない両側ｔ検定を使用した。データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）又は±標準偏差（ＳＤ）（表示通り）で表す。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
統計解析はすべて、グラフパッドプリズムｖ９．１．１．２２５を使用して行った。一元配置分散分析又は二元配置分散分析を行い、適切な場合にはシダックのテストを事後解析に使用した。移植群のみを比較する場合、対応のない両側ｔ検定を使用した。データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）又は±標準偏差（ＳＤ）（表示通り）で表す。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【0140】
実施例２ － ＧＢＸ２及びＣＤＸ１／２／４を欠失させることは中脳アイデンティティの増加をもたらす
研究の目的
ＧＢＸ２及びＣＤＸ１／２／４を欠失させることが中脳アイデンティティの増加をもたらすかどうかを明らかにすること。
研究の目的
ＧＢＸ２及びＣＤＸ１／２／４を欠失させることが中脳アイデンティティの増加をもたらすかどうかを明らかにすること。
【0141】
材料と方法
実施例１を参照されたい。
実施例１を参照されたい。
【0142】
結果
ｈＥＳＣのドーパミン作動性神経細胞への分化を増強するために、Ａ－Ｐ軸に沿って細胞運命を制御する転写因子をノックアウトすることに着目した。最初に、ｈＥＳＣ（Ｈ９細胞系）でＧＢＸ２－／－をノックアウトすることで、菱脳及び脊髄の細胞種を生じることが知られている条件下で分化させたときに、中脳の細胞種が増加することになるかどうかを調べた。ＧＢＸ２－／－ヒト胚性幹細胞株を生成した。未分化の状態では、その細胞株は対照ｈＥＳＣと転写的に区別不能であり、神経前駆体に分化することが可能であった。
ｈＥＳＣのドーパミン作動性神経細胞への分化を増強するために、Ａ－Ｐ軸に沿って細胞運命を制御する転写因子をノックアウトすることに着目した。最初に、ｈＥＳＣ（Ｈ９細胞系）でＧＢＸ２－／－をノックアウトすることで、菱脳及び脊髄の細胞種を生じることが知られている条件下で分化させたときに、中脳の細胞種が増加することになるかどうかを調べた。ＧＢＸ２－／－ヒト胚性幹細胞株を生成した。未分化の状態では、その細胞株は対照ｈＥＳＣと転写的に区別不能であり、神経前駆体に分化することが可能であった。
【0143】
ＧＢＸ２－／－
以前に論文報告した、尾側神経前駆体（ＣＮＰ；（Denham et al., 2015））を作製する本発明の発明者らのプロトコールを使用して、ＧＢＸ２－／－細胞を４日間ＣＮＰに分化させ、それらをｈＥＳＣ由来のＣＮＰと比較した（図１Ａ）。４日目のＨ９ ＣＮＰの免疫染色は、ＯＴＸ２の発現を示さず、ＣＤＸ２陽性染色を示した。４日目のＧＢＸ２－／－ＣＮＰは、ＯＴＸ２陽性細胞が少なく、ＣＤＸ２陽性染色を示した。４ｘＫＯ ＣＮＰは、少数の細胞がＯＴＸ２に陽性であり、ＣＤＸ２が陽性な細胞はなかった（細胞の写真は示されていない）。実際、菱脳及び脊髄を生じることが知られている濃度（３μＭ）のＧＳＫ３Ｂ阻害剤（ＧＳＫ３ｉ；ＣＨＩＲ９９０２１）の存在下で分化させると、ＧＢＸ２－／－株は、Ｈ９と比較して前脳／中脳マーカーＯＴＸ２のわずかではあるが有意な増加（図１Ｂ）及びＣＤＸ２転写物の有意な減少（図１Ｃ）を示した。ＯＴＸ２の増加にもかかわらず、ＧＢＸ２－／－ＣＮＰは菱脳及び脊髄の細胞種に関連するＨＯＸ遺伝子を依然として発現していた（図１Ｄ）。さらに、ＦＡＣＳ解析からは、ＯＴＸ２陽性細胞の数のわずかな増加及びＣＤＸ２陽性細胞の割合のわずかな減少が見られたのみであった（データは示されていない）。
以前に論文報告した、尾側神経前駆体（ＣＮＰ；（Denham et al., 2015））を作製する本発明の発明者らのプロトコールを使用して、ＧＢＸ２－／－細胞を４日間ＣＮＰに分化させ、それらをｈＥＳＣ由来のＣＮＰと比較した（図１Ａ）。４日目のＨ９ ＣＮＰの免疫染色は、ＯＴＸ２の発現を示さず、ＣＤＸ２陽性染色を示した。４日目のＧＢＸ２－／－ＣＮＰは、ＯＴＸ２陽性細胞が少なく、ＣＤＸ２陽性染色を示した。４ｘＫＯ ＣＮＰは、少数の細胞がＯＴＸ２に陽性であり、ＣＤＸ２が陽性な細胞はなかった（細胞の写真は示されていない）。実際、菱脳及び脊髄を生じることが知られている濃度（３μＭ）のＧＳＫ３Ｂ阻害剤（ＧＳＫ３ｉ；ＣＨＩＲ９９０２１）の存在下で分化させると、ＧＢＸ２－／－株は、Ｈ９と比較して前脳／中脳マーカーＯＴＸ２のわずかではあるが有意な増加（図１Ｂ）及びＣＤＸ２転写物の有意な減少（図１Ｃ）を示した。ＯＴＸ２の増加にもかかわらず、ＧＢＸ２－／－ＣＮＰは菱脳及び脊髄の細胞種に関連するＨＯＸ遺伝子を依然として発現していた（図１Ｄ）。さらに、ＦＡＣＳ解析からは、ＯＴＸ２陽性細胞の数のわずかな増加及びＣＤＸ２陽性細胞の割合のわずかな減少が見られたのみであった（データは示されていない）。
【0144】
ＧＢＸ２－／－ＣＤＸ１，２，４－／－
ＧＢＸ２－／－株からの結果に基づいて、ＣＤＸ遺伝子ファミリーをノックアウトすることによって、Ａ－Ｐ軸に沿った細胞の可能性をさらに限定しようと試みた。Ｃｄｘ２は後方Ｈｏｘ遺伝子の上流制御因子であり、脊髄の重要な決定因子である（Skromne et al., 2007）。他のＣＤＸファミリーメンバーからの発現も補償もないことを確かめるために、３つのＣＤＸファミリーメンバーＣＤＸ１／２／４すべてのホモノックアウトを、ＣＲＩＳＰＲを使用してそれらのＤＮＡ結合ドメインを標的とすることによって生成した（図１Ｅ）。結果として得られたｈＥＳＣ株ＧＢＸ２－／－ＣＤＸ１，２，４－／－（以下、４ｘＫＯと呼ぶ）を、同じＣＮＰプロトコールを使用して４日間分化させた（図１Ａ）。予想通り、４ｘＫＯ ＣＮＰでは、ＣＤＸ２転写物もＣＤＸ２陽性細胞も検出することができなかった（図１Ｃ）。際だったことに、４ｘＫＯの４日目の神経前駆体は、Ｈ９及びＧＢＸ２－／－由来のＣＮＰと比較して、ＯＴＸ２転写物の有意な増加を示した（図１Ｂ）。
ＧＢＸ２－／－株からの結果に基づいて、ＣＤＸ遺伝子ファミリーをノックアウトすることによって、Ａ－Ｐ軸に沿った細胞の可能性をさらに限定しようと試みた。Ｃｄｘ２は後方Ｈｏｘ遺伝子の上流制御因子であり、脊髄の重要な決定因子である（Skromne et al., 2007）。他のＣＤＸファミリーメンバーからの発現も補償もないことを確かめるために、３つのＣＤＸファミリーメンバーＣＤＸ１／２／４すべてのホモノックアウトを、ＣＲＩＳＰＲを使用してそれらのＤＮＡ結合ドメインを標的とすることによって生成した（図１Ｅ）。結果として得られたｈＥＳＣ株ＧＢＸ２－／－ＣＤＸ１，２，４－／－（以下、４ｘＫＯと呼ぶ）を、同じＣＮＰプロトコールを使用して４日間分化させた（図１Ａ）。予想通り、４ｘＫＯ ＣＮＰでは、ＣＤＸ２転写物もＣＤＸ２陽性細胞も検出することができなかった（図１Ｃ）。際だったことに、４ｘＫＯの４日目の神経前駆体は、Ｈ９及びＧＢＸ２－／－由来のＣＮＰと比較して、ＯＴＸ２転写物の有意な増加を示した（図１Ｂ）。
【0145】
遺伝子発現に対する影響をさらに理解するために、３つの細胞株（Ｈ９、ＧＢＸ２－／－及び４ｘＫＯ）のすべてのＣＮＰのＲＮＡシーケンシングを行った。ＨＯＸ遺伝子プロファイルを検討したところ、４ｘＫＯ ＣＮＰは、尾側ＨＯＸ遺伝子の発現に大きな制限を有し、ＨＯＸＡ１３よりも後方ではＨＯＸＡ４遺伝子もＨＯＸ遺伝子も発現しなかった（図１Ｄ）。これらの結果は、４ｘＫＯ細胞系が、ロンボメアＲ４に関連し、それに対して尾側の前駆体細胞種を生成できなかったことを示す。
【0146】
次に、前方遺伝子にどの程度の変化があるのかを知りたいと考えた。まず、４ｘＫＯ ＣＮＰの前脳遺伝子の発現を調べ、ＳＩＸ３、ＤＬＸ２及びＦＯＸＧ１の発現に有意な変化はないことがわかった。しかし、前脳／中脳遺伝子ＯＴＸ２の転写物は、Ｈ９及びＧＢＸ２－／－と比較して有意に増加した。中脳遺伝子ＰＡＸ２、ＰＡＸ５、ＥＮ１／２も、Ｈ９及びＧＢＸ２－／－と比較して有意に増加した（図１Ｃ）。興味深いことに、ＧＢＸ２－／－細胞では、ＥＧＲ２やＭＡＦＢなどの前菱脳遺伝子の減少が見られたが、４ｘＫＯでは、後方ＨＯＸ遺伝子の減少と一致してこれらの遺伝子は増加した。全体として、４ｘＫＯ細胞株は、ロンボメアＲ４と同等の後方限界（posterior limit）を示し、中脳及び前菱脳遺伝子の有意に高い発現を示した（図１Ｃ）。
【0147】
４ｘＫＯ株の能力をさらに探るため、４ｘＫＯ細胞及びＧＢＸ２－／－株を腹側化条件下で１１日目ＣＮＰに分化させた（図２Ｑ）。４日目の時点と同様に、４ｘＫＯ株ではＨ９又はＧＢＸ２－／－と比較して、ＯＴＸ２の転写物が多いことがわかった（図２Ａ）。さらに、４ｘＫＯでは、Ｈ９及びＧＢＸ２－／－と比較して、中脳遺伝子ＰＡＸ２、ＰＡＸ５、ＰＡＸ８がすべてアップレギュレートしたことがわかった（図２Ｂ、Ｃ、Ｅ）。また、発生過程において尾側中脳及びロンボメアＲ１にまたがるＥＮ１も、Ｈ９及びＧＢＸ２と比較して（それぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５；図２Ｄ）、４ｘＫＯでは有意にアップレギュレートした。ロンボメアＲ３及びＲ５に発現する菱脳遺伝子ＫＲＯＸ２０の場合、そえは有意にアップレギュレートし（ｐ＜０．０１；図２Ｊ）、ロンボメアＲ５及びＲ６のマーカーであるＭＡＦＢは有意に変化しなかった（図２Ｋ）。ＩＲＸ３は依然として存在したが、Ｈ９及びＧＢＸ２－／－と比較して、４ｘＫＯでは転写物が有意に少なかった（図２Ｆ）。これらの結果は、ＨＯＸプロファイルがやはり４ｘＫＯにおいてＨＯＸＡ３までの後方限界に限られることを示したが、ＨＯＸＡ３の転写物は少なく、より後方のＨＯＸ遺伝子は検出されなかった（図２Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ）。興味深いことに、前方のＨＯＸ遺伝子であるＨＯＸＡ２（図２Ｇ）は４ｘＫＯの１１日目ＣＮＰにおいてその発現を維持し、ＨＯＸＢ２（図２Ｈ）及びＨＯＸＢ１（図２Ｉ）はＨ９と比較して有意にアップレギュレートしていた。これらの結果は、細胞が中脳又は前菱脳のアイデンティティを優先的に得る、集団の前方へのシフトがあったことを示す。
【0148】
免疫蛍光染色により、中脳のイデンティティに向けた集団の変化が裏付けられた。１１日目の４ｘＫＯ細胞でＯＴＸ２＋／ＥＮ１＋陽性の尾側中脳前駆体の存在が見られたが、Ｈ９対照細胞では検出されなかった（データは示されていない）。
【0149】
これらの結果は、ＣＮＰを生成することが知られている分化条件下において、４ｘＫＯ株は脊髄運命を生成することができず、ロンボメアＲ４までの限られたＨＯＸプロファイルを有することを示す。さらに、細胞種の分布は、ＯＴＸ２＋／ＥＮ１＋細胞の存在によって前方にシフトしたことが示され、それはＣＮＰ分化条件下の対照細胞株では検出されなかった。
【0150】
結論
得られたデータは、単独でノックアウトすること（ＧＢＸ２－／－細胞株を生成）又は４つの遺伝子ＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４ノックアウトすること（ＧＢＸ２－／－ＣＤＸ１、２、４－／－細胞株を生成）によって、より効率的に中脳ドーパミン作動性神経細胞前駆体又は中脳ドーパミン作動性神経細胞を生成できる、分化能が限られた細胞株が生成されたことを示す。
得られたデータは、単独でノックアウトすること（ＧＢＸ２－／－細胞株を生成）又は４つの遺伝子ＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４ノックアウトすること（ＧＢＸ２－／－ＣＤＸ１、２、４－／－細胞株を生成）によって、より効率的に中脳ドーパミン作動性神経細胞前駆体又は中脳ドーパミン作動性神経細胞を生成できる、分化能が限られた細胞株が生成されたことを示す。
【0151】
実施例３ － 系譜限定ＰＳＣは尾部中脳前駆体を効率的に生成する
研究の目的
ドーパミン作動性神経細胞プロトコールを使用して分化させたとき、４ｘＫＯ株が、より効率的にｍｅｓＤＡ神経細胞を生成しうるかどうかを明らかにすること。
研究の目的
ドーパミン作動性神経細胞プロトコールを使用して分化させたとき、４ｘＫＯ株が、より効率的にｍｅｓＤＡ神経細胞を生成しうるかどうかを明らかにすること。
【0152】
材料と方法
再度実施例１及び２を参照されたい。
再度実施例１及び２を参照されたい。
【0153】
結果
Ｈ９と４ｘＫＯを比較し、最新のｍｅｓＤＡプロトコールの１つ（Nolbrant et al, 2017）を使用してそれらを分化させた（図３Ａ）。まず、ＧＳＫ３ｉの濃度を０．５μＭから１μＭまで調整し、Ｈ９を用いてｍｅｓＤＡ前駆体を生成するのに最適な濃度を決定することから始めた。Ｈ９及び４ｘＫＯ細胞を１６日目まで分化させた（細胞の図は示されていない）。
Ｈ９と４ｘＫＯを比較し、最新のｍｅｓＤＡプロトコールの１つ（Nolbrant et al, 2017）を使用してそれらを分化させた（図３Ａ）。まず、ＧＳＫ３ｉの濃度を０．５μＭから１μＭまで調整し、Ｈ９を用いてｍｅｓＤＡ前駆体を生成するのに最適な濃度を決定することから始めた。Ｈ９及び４ｘＫＯ細胞を１６日目まで分化させた（細胞の図は示されていない）。
【0154】
本発明の発明者らの研究室において、Ｈ９の最適濃度は０．６μＭであることが明らかになり、この濃度で１６日目に評価すると、ＯＴＸ２転写物のレベルは０．６μＭで最大であり、より高いＧＳＫ３ｉの濃度では減少した（図３Ｂ）。さらに、ＨＯＸＡ２の転写物レベルは、０．５～０．６μＭのＧＳＫ３ｉで最も低かった（図３Ｇ）。尾側中脳マーカーＣＮＰＹ１の濃度は、０．５μＭ～０．６μＭで最も高く、１ｕＭに達すると有意に低下した（図３Ｆ）。ＥＮ１も０．５～０．６μＭで有意により高く、０．７μＭ及び１μＭから有意に低下した（図３Ｅ）。これらの結果は、ＧＳＫ３ｉの１ｕＭ未満の濃度が中脳の特化に必要であり、濃度が１μＭ以上に近づくと菱脳アイデンティティへの劇的なシフトがもたらされることを示した過去の報告（Kirkeby et al., 2012）と一致した。
【0155】
同じＧＳＫ３ｉ濃度で４ｘＫＯ細胞を比較したところ、Ｈ９に対する際だった違いが見られた。４ｘＫＯ株は、Ｈ９と比較して、０．５μＭから最大で１μＭを含むすべての濃度にわたって、ＯＴＸ２及びＥＮ１及びＬＭＸ１Ａの転写物が有意に多かった（図３Ｂ、３Ｅ及び３Ｃ）。尾側中脳マーカーＣＮＰＹ１は、Ｈ９と比較して、０．６５μＭから最大で１μＭを含む範囲で有意に高かった（図３Ｆ）。これらの結果は、４ｘＫＯ株の能力の限定は、結果としてＧＳＫ３ｉのより広い濃度にわたって中脳前駆体の生成をもたらすことを示した。さらに、４ｘＫＯ株はまた、最適濃度で、Ｈ９が生成できるよりも有意に多くの中脳転写物を生成することができた（細胞の図は示されていない）。
【0156】
最適条件下においてでさえも４ｘＫＯがＨ９より効率的である理由をさらに探るために、最も最適な（the most optimal）条件下でも生成される細胞種を制御するＡ－Ｐ軸に沿った細胞種の範囲を調べた。対照細胞が、菱脳に対応するＨＯＸＡ２の転写物を依然として発現し（図３Ｇ）、最適化されたプロトコールを用いても、Ｈ９株は菱脳細胞種を含む、Ａ－Ｐ軸に沿った細胞種の大きい分布を生じたことがわかった。これらの結果は、最適濃度でも細胞株の菱脳細胞種の発現を示す既報と一致した（Kirkeby et al., 2012）。しかし、４ｘＫＯ細胞は、Ｈ９と比較して、有意に低い濃度のＨＯＸＡ２を発現した。さらに、Ｈ９のＨＯＸＡ２レベルは、より高い濃度のＧＳＫ３ｉを使用したとき有意に増加したが、４ｘＫＯ株では、全濃度を通してＨＯＸＡ２のレベルは不変のままであった（図３Ｇ）。
【0157】
免疫蛍光染色により上記の結果が裏付けられ、４ｘＫＯ株ではＧＳＫ３ｉの濃度が０．６μＭから１μＭにおいてＥＮ１陽性細胞が豊富に存在したことが示された（データは示されていない）。しかし、Ｈ９株ではＥＮ１陽性細胞は０．６μＭという限られた濃度にとどまり、Ｈ９細胞ではＡ－Ｐ軸に沿った細胞のより広い分布が生じることが示された。
【0158】
結論
これらの結果から、４ｘＫＯは脊髄細胞種が生じることができず、細胞の大部分は中脳及び前菱脳アイデンティティに限定され、結果としてＧＳＫ３ｉの最適濃度以下であっても、ｍｅｓＤＡ前駆体の割合がより高くなることが示された。
これらの結果から、４ｘＫＯは脊髄細胞種が生じることができず、細胞の大部分は中脳及び前菱脳アイデンティティに限定され、結果としてＧＳＫ３ｉの最適濃度以下であっても、ｍｅｓＤＡ前駆体の割合がより高くなることが示された。
【0159】
実施例４ － 菱脳条件で分化させた系譜限定ＰＳＣは、中脳前駆体及びｍｅｓＤＡ神経細胞を生成する
研究の目的
通常菱脳細胞種を主に生じさせる条件下において４ｘＫＯ株で作られる細胞種を明らかにすること。
研究の目的
通常菱脳細胞種を主に生じさせる条件下において４ｘＫＯ株で作られる細胞種を明らかにすること。
【0160】
材料と方法
再度実施例１～３を参照されたい。
再度実施例１～３を参照されたい。
【0161】
結果
ＧＳＫ３ｉ阻害剤の濃度１μＭでのＨ９細胞及び４ｘＫＯ細胞を、１６日目に単一細胞解析で比較した。予想された通り、どちらの条件でも、有意な割合の細胞が底板に対して腹側にあることが明らかになった（Ｈ９ ４８％、４ｘＫＯ ７３％）。しかし、２つの細胞株間で、Ａ－Ｐ軸に沿った細胞の分布に有意に大きな違いが見られた（ｐ＜０．００００１；図４）。４ｘＫＯ細胞では、前方遺伝子ＯＴＸ２を発現する細胞が有意に多かった（Ｈ９ １％；４ｘＫＯ ４３％）。さらに、４ｘＫＯ条件では、尾側中脳細胞が非常に豊富に存在した（ＯＴＸ２＋／Ｅｎ１＋；Ｈ９ ０％；４ｘＫＯ ３５％）。ロンボメアＲ１に対応する細胞（Ｏｔｘ２－／Ｅｎ１＋）もまた、４ｘＫＯ細胞に豊富に存在した（Ｈ９ ３％；４ｘＫＯ ３９％）。ＨＯＸ遺伝子の発現によって示される菱脳及びより尾側の細胞種は、４ｘＫＯ細胞と比較して、Ｈ９において有意に高く（Ｈ９ ８５％；４ｘＫＯ ２％）、Ｈ９の細胞の大部分が菱脳のアイデンティティに対応するのに対し、４ｘＫＯ細胞の分布は尾側中脳及び前菱脳に対応することを示している（図４）。
ＧＳＫ３ｉ阻害剤の濃度１μＭでのＨ９細胞及び４ｘＫＯ細胞を、１６日目に単一細胞解析で比較した。予想された通り、どちらの条件でも、有意な割合の細胞が底板に対して腹側にあることが明らかになった（Ｈ９ ４８％、４ｘＫＯ ７３％）。しかし、２つの細胞株間で、Ａ－Ｐ軸に沿った細胞の分布に有意に大きな違いが見られた（ｐ＜０．００００１；図４）。４ｘＫＯ細胞では、前方遺伝子ＯＴＸ２を発現する細胞が有意に多かった（Ｈ９ １％；４ｘＫＯ ４３％）。さらに、４ｘＫＯ条件では、尾側中脳細胞が非常に豊富に存在した（ＯＴＸ２＋／Ｅｎ１＋；Ｈ９ ０％；４ｘＫＯ ３５％）。ロンボメアＲ１に対応する細胞（Ｏｔｘ２－／Ｅｎ１＋）もまた、４ｘＫＯ細胞に豊富に存在した（Ｈ９ ３％；４ｘＫＯ ３９％）。ＨＯＸ遺伝子の発現によって示される菱脳及びより尾側の細胞種は、４ｘＫＯ細胞と比較して、Ｈ９において有意に高く（Ｈ９ ８５％；４ｘＫＯ ２％）、Ｈ９の細胞の大部分が菱脳のアイデンティティに対応するのに対し、４ｘＫＯ細胞の分布は尾側中脳及び前菱脳に対応することを示している（図４）。
【0162】
次に、４ｘＫＯ細胞株が、これらの尾側化条件下でｍｅｓＤＡ神経細胞を産生できるかどうかを知りたいと考えた。単一細胞解析によって、１μＭのＧＳＫ３ｉにおいて、対象の２．８％に対し、４ｘＫＯ株では約１１．６％のドーパミン作動性神経細胞を生成できたことがわかった。また、Ｈ９及び４ｘＫＯの１００日目のオルガノイドの免疫蛍光分析では、ドーパミン作動性神経細胞の大部分は腹側マーカーＦＯＸＡ２も発現し、ｍｅｓＤＡ神経細胞の生成が成功していることを示している。４ｘＫＯオルガノイドには、ドーパミン作動性神経細胞ＴＨ及びＦＯＸＡ２陽性が含まれる。Ｈ９オルガノイドでは、ＦＯＸＡ２とＴＨの二重陽性の細胞は検出することができなかった（データは示されていない）。１μＭのＧＳＫ３ｉ、４ｘＫＯオルガノイドを使用して、４ｘＫＯ及びＨ９から分化させた１００日目の中脳オルガノイドは、ドーパミン作動性神経細胞ＴＨ及びＦＯＸＡ２陽性が含まれる。Ｈ９オルガノイドでは、ＦＯＸＡ２とＴＨの二重陽性の細胞は検出することができなかった。
【0163】
結論
これらのデータにより、ＧＢＸ２－／－ＣＤＸ１、２、４－／－細胞株から出発すると、対照細胞株と比較して、より効率的にｍｅｓＤＡ神経細胞を生成することが可能であることがさらに裏付けられている。
これらのデータにより、ＧＢＸ２－／－ＣＤＸ１、２、４－／－細胞株から出発すると、対照細胞株と比較して、より効率的にｍｅｓＤＡ神経細胞を生成することが可能であることがさらに裏付けられている。
【0164】
実施例５ － 前方ＨＯＸ遺伝子のノックアウトは、ＰＳＣの能力をさらに限定し、中脳細胞種を増加させる － ８ｘＫＯ
研究の目的
前方ＨＯＸ遺伝子のノックアウトが、ＰＳＣの能力をさらに限定することになり、中脳細胞種を増加させるかどうかを明らかにすること。
研究の目的
前方ＨＯＸ遺伝子のノックアウトが、ＰＳＣの能力をさらに限定することになり、中脳細胞種を増加させるかどうかを明らかにすること。
【0165】
材料と方法
再度実施例１～４を参照されたい。
再度実施例１～４を参照されたい。
【0166】
結果
単一細胞データに基づくと、４ｘＫＯ細胞のｍｅｓＤＡ前駆細胞への分化は、わずか１％のＨＯＸ遺伝子発現細胞を生じさせた。しかし、高度な尾側化条件下においてその細胞株は依然として菱脳ＨＯＸ遺伝子を発現することができた（図１Ｃ）。ＣＤＸ遺伝子ファミリーは、ロンボメアＲ２～Ｒ４の前方ＨＯＸ遺伝子を制御しない。したがって、ＨＯＸＡ１／２及びＨＯＸＢ１／２及びＧＢＸ１を、ノックアウトする追加遺伝子として選択した。ＨＯＸＡ１／２及びＨＯＸＢ１及びＧＢＸ１を標的にすることに成功した（図１Ｆ）。それにもかかわらず、新しい４ｘＫＯとＨＯＸを組み合わせたノックアウト細胞株（以下、８ｘＫＯと呼ぶ）を継続し、それらを４日目のＣＮＰに分化させた（図５Ａ）。４日目の８ｘＫＯ細胞では、ＯＴＸ２の転写物レベルが有意に増加し、４ｘＫＯ細胞の２％と比較したＯＴＸ２陽性細胞の大幅な増加（３０％）から裏付けられた（図５Ｂ～Ｃ）。さらに、ＲＮＡシークエンシングによる解析は、４ｘＫＯ株と比較して、中脳遺伝子の発現が有意に増加したことを示した（図５Ｄ～Ｅ）。
単一細胞データに基づくと、４ｘＫＯ細胞のｍｅｓＤＡ前駆細胞への分化は、わずか１％のＨＯＸ遺伝子発現細胞を生じさせた。しかし、高度な尾側化条件下においてその細胞株は依然として菱脳ＨＯＸ遺伝子を発現することができた（図１Ｃ）。ＣＤＸ遺伝子ファミリーは、ロンボメアＲ２～Ｒ４の前方ＨＯＸ遺伝子を制御しない。したがって、ＨＯＸＡ１／２及びＨＯＸＢ１／２及びＧＢＸ１を、ノックアウトする追加遺伝子として選択した。ＨＯＸＡ１／２及びＨＯＸＢ１及びＧＢＸ１を標的にすることに成功した（図１Ｆ）。それにもかかわらず、新しい４ｘＫＯとＨＯＸを組み合わせたノックアウト細胞株（以下、８ｘＫＯと呼ぶ）を継続し、それらを４日目のＣＮＰに分化させた（図５Ａ）。４日目の８ｘＫＯ細胞では、ＯＴＸ２の転写物レベルが有意に増加し、４ｘＫＯ細胞の２％と比較したＯＴＸ２陽性細胞の大幅な増加（３０％）から裏付けられた（図５Ｂ～Ｃ）。さらに、ＲＮＡシークエンシングによる解析は、４ｘＫＯ株と比較して、中脳遺伝子の発現が有意に増加したことを示した（図５Ｄ～Ｅ）。
【0167】
結論
ＨＯＸＡ１／２、ＨＯＸＢ１及びＧＢＸ１をさらにノックアウトし、それによりＧＢＸ２－／－ＣＤＸ１、２、４－／－ＨＯＸＡ１、２－／－ＨＯＸＢ１－／－及びＧＢＸ１－／－である細胞株を生成することにより、４ｘＫＯ株と比較して、中脳遺伝子の発現の有意な増加がもたらされる。
ＨＯＸＡ１／２、ＨＯＸＢ１及びＧＢＸ１をさらにノックアウトし、それによりＧＢＸ２－／－ＣＤＸ１、２、４－／－ＨＯＸＡ１、２－／－ＨＯＸＢ１－／－及びＧＢＸ１－／－である細胞株を生成することにより、４ｘＫＯ株と比較して、中脳遺伝子の発現の有意な増加がもたらされる。
【0168】
実施例６ － 背腹軸に沿った細胞種を表す遺伝子
研究の目的
背腹軸に沿った細胞種を表す遺伝子の発現の影響を評価すること。
研究の目的
背腹軸に沿った細胞種を表す遺伝子の発現の影響を評価すること。
【0169】
材料及び方法
前述の実施例を参照されたい。
前述の実施例を参照されたい。
【0170】
結果
４ｘＫＯ細胞株（ＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４のノックアウト）の解析から、前後軸に沿った細胞の特化が妨げられ、より多くの中脳細胞種を産生する細胞が結果として得られた。背腹軸に沿った細胞種を表す遺伝子の発現を解析したところ、対照及び４ｘＫＯ細胞株は、生成される細胞の割合に大きな変化を示さなかった（図３Ｄ）。特に、ＮＫＸ遺伝子ファミリーメンバー及びＰＨＯＸ２Ａ／Ｂの発現によって示されるように、両細胞株が基底板細胞を生成きることがわかった（図６Ａ）。
４ｘＫＯ細胞株（ＧＢＸ２、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２及びＣＤＸ４のノックアウト）の解析から、前後軸に沿った細胞の特化が妨げられ、より多くの中脳細胞種を産生する細胞が結果として得られた。背腹軸に沿った細胞種を表す遺伝子の発現を解析したところ、対照及び４ｘＫＯ細胞株は、生成される細胞の割合に大きな変化を示さなかった（図３Ｄ）。特に、ＮＫＸ遺伝子ファミリーメンバー及びＰＨＯＸ２Ａ／Ｂの発現によって示されるように、両細胞株が基底板細胞を生成きることがわかった（図６Ａ）。
【0171】
ドーパミン作動系分化の２８日目の単一細胞解析では、４Ｘ細胞とＨ９細胞を合わせて１５の細胞クラスターが見られた。前腹側マーカーＮＫＸ２．１がクラスター１１及び６で主に発現し、背腹軸の内側マーカーＰＡＸ６がクラスター１２で発現していた（図６Ｂ）。
【0172】
結論
中脳ドーパミン作動性神経細胞は、神経管で最も腹側の集団である底板から生じる。ＮＫＸファミリーメンバーは、神経管の外側（基板）集団に特化するのに重要である。
中脳ドーパミン作動性神経細胞は、神経管で最も腹側の集団である底板から生じる。ＮＫＸファミリーメンバーは、神経管の外側（基板）集団に特化するのに重要である。
【0173】
提示のデータに基づいて、同じノックアウトアプローチをＮＫＸファミリーメンバー及び他の基板マーカーに拡張して、それらの細胞種を抑え、中脳ドーパミン作動性神経前駆体への特化を強めることができると結論づけられる。
【0174】
実施例７ － ＬＲ－ＰＳＣは、菱脳のアイデンティティに好ましいい条件下でｍｅｓＤＡ神経細胞を効率的に生成する
研究の目的
中脳底板前駆体がどの程度ｍｅｓＤＡ神経細胞を産生できるかを検討すること。
研究の目的
中脳底板前駆体がどの程度ｍｅｓＤＡ神経細胞を産生できるかを検討すること。
【0175】
材料及び方法
前述の実施例を参照されたい。
前述の実施例を参照されたい。
【0176】
結果
１μＭ ＧＳＫ３ｉプロトコールを６２ＤＩＶに拡張した。６２ＤＩＶにおいて、２つの細胞株はほぼ完全に別々のクラスターを占めた（カイ二乗、Ｐ＜０．０００１）（データは示されていない）。４Ｘ細胞は大きく次の２つの主要な細胞種に分けられた：ＦＯＸＡ２、ＳＨＨ、ＮＥＴＲＩＮ１、ＳＰＯＮ１及びＥＮ１を発現する菱脳ｒ１床板クラスター（クラスター４、５及び６）と、神経細胞クラスター（クラスター０及び８；図１１Ａ）。この神経細胞集団には、ＴＨ、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ及びＥＮ１の発現によって同定されるｍｅｓＤＡ神経細胞が含まれていた（図１１Ａ～Ｂ）。クラスター０及び８は、ほぼ完全に４Ｘ細胞で構成されていた（４Ｘ：８２％及び７７％、Ｈ９：１８％及び２３％）（データは示されていない）。クラスター０と８の違いを詳しく調べると、視床下部神経細胞のマーカーであるＮＫＸ２．１を発現する、クラスター８内の細胞のサブセットが特定された。
１μＭ ＧＳＫ３ｉプロトコールを６２ＤＩＶに拡張した。６２ＤＩＶにおいて、２つの細胞株はほぼ完全に別々のクラスターを占めた（カイ二乗、Ｐ＜０．０００１）（データは示されていない）。４Ｘ細胞は大きく次の２つの主要な細胞種に分けられた：ＦＯＸＡ２、ＳＨＨ、ＮＥＴＲＩＮ１、ＳＰＯＮ１及びＥＮ１を発現する菱脳ｒ１床板クラスター（クラスター４、５及び６）と、神経細胞クラスター（クラスター０及び８；図１１Ａ）。この神経細胞集団には、ＴＨ、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ及びＥＮ１の発現によって同定されるｍｅｓＤＡ神経細胞が含まれていた（図１１Ａ～Ｂ）。クラスター０及び８は、ほぼ完全に４Ｘ細胞で構成されていた（４Ｘ：８２％及び７７％、Ｈ９：１８％及び２３％）（データは示されていない）。クラスター０と８の違いを詳しく調べると、視床下部神経細胞のマーカーであるＮＫＸ２．１を発現する、クラスター８内の細胞のサブセットが特定された。
【0177】
４Ｘ細胞とは対照的に、Ｈ９細胞は１つの主要な連結したクラスター（クラスター１、２、３、及び７）並びに２つの小さな孤立したクラスター（クラスター９及び１０）を形成した（データは示されていない）。６つのクラスターはすべて、血管軟髄膜軟胞（ＶＬＭＣ）を示すマーカー、すなわちＣＯＬ３Ａ１、ＩＦＩＴＭ２及びＳ１００Ａ１１を発現する細胞によって主に占められていた（図１１Ａ）。興味深いことに、ＥＮ１はＶＬＭＣクラスターにほとんど存在しなかった（データは示されていない）。また、クラスター７には、ＳＴＭＮ２、ＳＥＭＡ３Ｃ及びＰＤＬＩＭ１を発現する細胞の集団（４１％）も含まれ（図１１Ａ及び１１Ｃ）、単一細胞脳アトラス（atlas）によると、末梢性感覚神経細胞のサブタイプに対応した。
【0178】
次に、ＴＨ陽性ニューロンのサブクラスタリング（subclustering）を行うことによって、ｍｅｓＤＡ神経細胞のサブタイプを調べたいと考えた（データ示さず）。黒質と腹側被蓋領域（ＶＴＡ）ＤＡ神経細胞を区別するために、ＧＩＲＫ２（ＫＣＮＪ６としても知られている）及びカルビンジンＤ（ＣＡＬＢ１）の発現を評価した。ＧＩＲＫ２はサブクラスター１及び３で高発現し、ＴＨ集団の３８％を占め、わずかな割合のＴＨ神経細胞のみがＣＡＬＢ１を発現した（１３．６％；図１１Ｄ）。
【0179】
単一細胞シーケンシングの結果をさらに裏付けるために、組織学的解析を行った。同じ成長因子パラダイムを使用したが、分化プロトコールを適応してオルガノイドを生成し、神経細胞の生存に最適な環境を与えた（図１２Ａ）。８３ＤＩＶにおいて、４Ｘ細胞から作製したオルガノイド内にＦＯＸＡ２／ＴＨ二重陽性のＤＡ神経細胞の大きな集団が観察された（データは示されていない）。対照的に、ＴＨ陽性細胞は、Ｈ９細胞で作られたオルガノイド全体に時に散在した。しかし、ＦＯＸＡ２を共発現するＴＨ陽性細胞はほとんど検出されなかった（データは示されていない）。これらの結果は、６２ＤＩＶでの２次元培養の組織学的解析と一致した（データは示されていない）。ＴＨ陽性神経細胞のさらなる検討は、単一細胞のデータと一致して、４Ｘ細胞由来のＴＨ神経細胞の最も豊富な集団はＧＩＲＫ２を共発現すること（データは示されていない）及びＣＡＬＢ１／ＴＨ二重陽性神経細胞の小さい集団が存在することを示した（データは示されていない）。
【0180】
単一細胞シーケンシングデータによると、Ｈ９細胞の大部分はＶＬＭＣ（クラスター１、２、３、７、９、１０；Ｈ９細胞の９３％）であった。この結果を確認するために、８３ＤＩＶでオルガノイドのＶＬＭＣマーカーの発現を調べ、Ｈ９細胞の中に非神経細胞形態をもつＣＯＬ３Ａ１／ＣＯＬ１Ａ１二重陽性細胞の大きな集団が同定された（データは示されていない）。ＣＯＬ３Ａ１又はＣＯＬ１Ａ１が陽性な細胞は、４Ｘ細胞のなかでは見られなかった（データは示されていない）。
【0181】
結論
ｍｅｓＤＡ神経細胞は、尾側化条件下で４ｘ細胞から生成することができる。
ｍｅｓＤＡ神経細胞は、尾側化条件下で４ｘ細胞から生成することができる。
【0182】
実施例８ － 背腹軸に沿った細胞種を表す遺伝子 ＬＲ－ＰＳＣ由来のＤＡ神経細胞はペースメーカー活性を示す
研究の目的
ＤＡ神経細胞の電気生理学的特性を検討すること。
研究の目的
ＤＡ神経細胞の電気生理学的特性を検討すること。
【0183】
材料及び方法
前述の実施例を参照されたい。
前述の実施例を参照されたい。
【0184】
結果
ＤＩＶ８０～ＤＩＶ８４で、ホールセルパッチクランプ構成でインビトロ電気生理学的記録を行った（データは示されていない）。体電流注入に際し反復活動電位を生じさせる能力で測定して、細胞が電気生理学的に成熟した神経細胞になったことが観察された（図１２Ｂ）。電流クランプモードでの記録から、単一スパイクと相動性（phasic）バーストが混在するＤＡ神経細胞アイデンティティに特徴的な自発ペースメーカー活性が明らかになった（図１２Ｃ）。膜振動は－５０ｍＶ未満の電位で減衰した（データは示されていない）。試料の発火頻度は１～５Ｈｚの範囲であった（図１２Ｄ）。さらに、細胞抽出物のＨＰＬＣ分析は、４Ｘ細胞のＤＡ含量はＨ９細胞のそれよりも有意に高かったことを示した（４Ｘ細胞の２８７．４ｎｍｏｌ／ｇ対Ｈ９細胞の６５．１ｎｍｏｌ／ｇ、Ｐ＝０．００２；図１２Ｅ）。
ＤＩＶ８０～ＤＩＶ８４で、ホールセルパッチクランプ構成でインビトロ電気生理学的記録を行った（データは示されていない）。体電流注入に際し反復活動電位を生じさせる能力で測定して、細胞が電気生理学的に成熟した神経細胞になったことが観察された（図１２Ｂ）。電流クランプモードでの記録から、単一スパイクと相動性（phasic）バーストが混在するＤＡ神経細胞アイデンティティに特徴的な自発ペースメーカー活性が明らかになった（図１２Ｃ）。膜振動は－５０ｍＶ未満の電位で減衰した（データは示されていない）。試料の発火頻度は１～５Ｈｚの範囲であった（図１２Ｄ）。さらに、細胞抽出物のＨＰＬＣ分析は、４Ｘ細胞のＤＡ含量はＨ９細胞のそれよりも有意に高かったことを示した（４Ｘ細胞の２８７．４ｎｍｏｌ／ｇ対Ｈ９細胞の６５．１ｎｍｏｌ／ｇ、Ｐ＝０．００２；図１２Ｅ）。
【0185】
結論
本データに基づいて、４Ｘ細胞から調製したドーパミン作動性神経細胞は、電気生理学的に成熟した神経細胞に発達することができると結論づけられた。
本データに基づいて、４Ｘ細胞から調製したドーパミン作動性神経細胞は、電気生理学的に成熟した神経細胞に発達することができると結論づけられた。
【0186】
実施例９ － 背腹軸に沿った細胞種を表す遺伝子 パーキンソン病ラットモデルにおける生体内での４Ｘ細胞の解析
研究の目的
現在のＤＡ神経細胞分化プロトコールを使用した場合、ｍｅｓＤＡ前駆体の生体内移植時にＤＡ神経細胞は移植片全体の細胞の数パーセントを占めるに過ぎない。パーキンソン病の齧歯類動物モデルに移植したとき、４Ｘ ＬＲ－ＰＳＣが生体内でどのような挙動を示すかを調べた。
研究の目的
現在のＤＡ神経細胞分化プロトコールを使用した場合、ｍｅｓＤＡ前駆体の生体内移植時にＤＡ神経細胞は移植片全体の細胞の数パーセントを占めるに過ぎない。パーキンソン病の齧歯類動物モデルに移植したとき、４Ｘ ＬＲ－ＰＳＣが生体内でどのような挙動を示すかを調べた。
【0187】
材料及び方法
前述の実施例を参照されたい。
前述の実施例を参照されたい。
【0188】
結果
単一細胞解析の結果を確認するため、ＧＳＫ３ｉの好ましくない尾側化濃度（１μＭ）を用いて、同じ中脳分化プロトコールを使用した。
単一細胞解析の結果を確認するため、ＧＳＫ３ｉの好ましくない尾側化濃度（１μＭ）を用いて、同じ中脳分化プロトコールを使用した。
【0189】
病変形成の４週間後に、合計２５万個の４Ｘ細胞又はＨ９細胞を、６－ＯＨＤＡ誘発内側前脳束（ＭＦＢ）病変をもつヌードラットの線条体に移植した。移植を受けなかった病変形成ラットの第３の群を病変対照として使用した（６－ＯＨＤＡ、試験デザインについては図１３Ａを参照）。移植時、３群のラットはすべて、同じアンフェタミン誘発同側回転数／分（組み入れの限界（limit for inclusion）：５回転／分、図１３Ｂ）を示し、ＤＡ線条体神経支配の有意な減少を裏付けた。３群はすべて、シリンダー試験で前肢非対称性を示し、ラットはたいてい、同側の前肢を使って（６－ＯＨＤＡ 全体の５２．４％；Ｈ９ ７０．４％及び４Ｘ ６７．４％）、対側の前肢をほとんど使わずに（６－ＯＨＤＡ 全体の１．３％；Ｈ９ １．３％及び４Ｘ ０％）、後肢立ち後に壁に触れたる、又は床に着地し、６－ＯＨＤＡによるＤＡ欠欠乏の誘発をさらに裏付けた（図１３Ｃ）。
【0190】
移植後８週目に、４Ｘ細胞を投与されたラットは、アンフェタミン誘発同側回転の完全な修正（complete correction）を示し（移植前：１０．６回転／分 対８週目：０．３５回転／分）、移植後１８週目に観察された対側回転の数（－３．１２回転／分）によって示唆されるように、十分量のドーパミンが線条体に放出されて、その行動を正常化した（図１３Ｄ）、さらには過剰補償したことを示唆した。しかし、Ｈ９細胞移植ラットは、実験全体を通して、対照の６－ＯＨＤＡ病変群と統計的に同じ同側回転数を示し（移植前：９．８；８週目：９．７及び１８週目：９．２回転／分）、１８週目では移植前の値と比較して回転数の有意な減少を示しただけであった（Ｈ９移植前：１１．５；８週目：１２．６及び１８週目：５．６回転／分、図１３Ｄ）。シリンダー試験における自発運動行動の解析において、４Ｘ細胞移植ラットが１８週目に試験中に対側の前肢を単独で（全体の９．７％）又は同側の前肢と一緒に（両方で４６．３％）使用したことから、それらのラットにおける有意な改善が裏付けられた（図１３Ｅ）。しかし、Ｈ９細胞移植ラットと６－ＯＨＤＡ病変ラットはともに、移植前に観察されたようにたいていの場合同側の前肢を使用し（それぞれ全体の７６．１％及び７９．３％）、両前肢を使用した時間が３０％未満であったが、シリンダー内で飼育したとき障害を受けた対側の前肢はほとんど使用しなかった（図１３Ｅ）。したがって、４Ｘ細胞移植は、ＭＦＢの６－ＯＨＤＡ誘発病変形成後の薬物誘発運動行動と自発運動行動の両方を有意に改善した。
【0191】
死後の脳の組織学的解析から、４Ｘ細胞を移植したラットは、移植片由来のＴＨ陽性細胞を、注入領域、すなわち線条体、並びに淡蒼球、脳梁、及び線条体の上の皮質の領域に有したことが示された（図１３Ｆ）。しかし、Ｈ９由来ＴＨ陽性細胞はほとんど線条体にとどまり、少数の動物では淡蒼球にも見られた。移植片由来ＴＨ陽性細胞の（線条体及び淡蒼球における）定量は、４Ｘ細胞移植ラット（移植片当たり平均２３，５２０個のＴＨ陽性細胞）は、Ｈ９細胞移植ラット（移植片当たり１，８９８個のＴＨ陽性細胞）よりも移植片当たりのＴＨ陽性細胞が有意に多く、その結果より高い収量が得られたこと（１００，０００個の移植４Ｘ細胞当たり９，４０８個のＴＨ陽性細胞 対１００，０００個の移植Ｈ９細胞当たり７５９個のＴＨ陽性細胞）を示した（図１３Ｇ～Ｈ）。ＴＨ陽性４Ｘ細胞移植片は、６～８つの冠状Ａ－Ｐ線条体切片にわたって（８連で（in a series of 8））広がり、一方でＨ９細胞移植片は４～５つの切片を占有した。したがって、推定移植片体積は、４Ｘ細胞移植ラット（２０．４６ｍｍ３）において、Ｈ９細胞移植ラット（１２．６９ｍｍ３）よりも６１％大きかった（図１３Ｉ）。ＴＨ陽性細胞数の増加は、４Ｘ細胞移植群において移植片中のＴＨ細胞の有意により高い密度をもたらし（１，０９０±４６４個の細胞／ｍｍ３対Ｈ９細胞移植群における１４３±４９個の細胞／ｍｍ３；Ｐ＜０．０００１）、４Ｘ細胞移植群で観察された急速且つ強固な（robust）行動回復と一致する。
【0192】
さらに移植片を調べたところ、４Ｘ及びＨ９細胞移植片内で見られたすべてのＴＨ陽性神経細胞が、ヒト核マーカーであるヒト核抗原（ＨＮＡ）を共発現することが示された（データは示されていない）。４Ｘ細胞移植ラットの移植片では、ＴＨ陽性ニューロンがＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ及びＥＮ１を共発現し、それらがｍｅｓＤＡ神経細胞であることが示された（データは示されていない）。Ａ９神経細胞とＡ１０神経細胞とを区別するために、ＧＩＲＫ２とＣＡＬＢ１を発現するＴＨ陽性神経細胞の割合を計算し、７５．４％±４．９９のＴＨ陽性神経細胞がＧＩＲＫ２陽性であることがわかった（図１３Ｊ）。
【0193】
興味深いことに、Ｈ９細胞由来のＴＨ陽性神経細胞は、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ及びＥＮ１が陽性であることもわかった（データは示されていない）。これは、Ｈ９細胞由来のＴＨ陽性神経細胞が、ＦＯＸＡ２をほとんど発現しなかったインビトロの実験とは対照的であり（データは示されていない）、インビトロ環境よりも生体内環境の方が、ＴＨ陽性神経細胞の発生及び生存により寛容（more permissive）であることを示唆している。インビトロのデータはＨ９細胞が多数のＶＬＭＣを生成したことを示したので、４Ｘ細胞移植ラットとＨ９細胞移植ラットの両方の移植片で血管マーカーの発現を調べた。Ｈ９細胞移植片では、ＣＯＬ３Ａ１／ＣＯＬ１Ａ１／ＨＮＡの三重陽性細胞の大きな集団が見られたが、４Ｘ細胞移植片は、マーカーＨＮＡを共発現するＣＯＬ１Ａ１陽性細胞をほとんど検出されなかった（データは示されていない）。
【0194】
結論
全体として、生体内の組織学的データは、４Ｘ細胞がｍｅｓＤＡニューロンの強固な集団を作り出すことができることを示し、８週目に見られた急速な運動回復と一致した。
全体として、生体内の組織学的データは、４Ｘ細胞がｍｅｓＤＡニューロンの強固な集団を作り出すことができることを示し、８週目に見られた急速な運動回復と一致した。
【0195】
参考文献
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図2K】
【図2L】
【図2M】
【図2N】
【図2O】
【図2P】
【図2Q】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図13G】
【図13H】
【図13I】
【図13J】
【国際調査報告】