知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-15
(54)【発明の名称】修飾核酸コンジュゲート
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20240105BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240105BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240105BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20240105BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20240105BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240105BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240105BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240105BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 Z
A61P35/00
A61K31/713
A61K31/712
A61K31/7115
A61K47/26
A61K47/54
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023538868
(86)(22)【出願日】2021-12-30
(85)【翻訳文提出日】2023-07-21
(86)【国際出願番号】 EP2021087859
(87)【国際公開番号】W WO2022144422
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】20217894.3
(32)【優先日】2020-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523232665
【氏名又は名称】プラモモレキュラー ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100113376
【弁理士】
【氏名又は名称】南条 雅裕
(74)【代理人】
【識別番号】100179394
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬田 あや子
(74)【代理人】
【識別番号】100185384
【弁理士】
【氏名又は名称】伊波 興一朗
(74)【代理人】
【識別番号】100137811
【弁理士】
【氏名又は名称】原 秀貢人
(72)【発明者】
【氏名】フックス メルレ
(72)【発明者】
【氏名】シャエフ イーダ
(72)【発明者】
【氏名】ヒラー トーマス
(72)【発明者】
【氏名】クレック イエンス
(72)【発明者】
【氏名】フェチェラー ビッテティ モナ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB21
4C076CC27
4C076CC41
4C076DD34
4C076EE59
4C076FF31
4C076FF68
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA10
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、少なくとも１の２′，３′－Ｏケタール部分を含む、核酸コンジュゲートに関連する。このコンジュゲートは、ヒト細胞を含む哺乳類細胞などの細胞内へ、核酸分子を標的特異的にまたは標的選択的に送達するために、高い有効性で適している。従って、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、またはそのような分子の前駆物質を含む、治療用核酸分子のための新たな送達媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）が、提供される。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１の２′，３′－Ｏ－ケタール部分を含む、式（Ｉ）の核酸コンジュゲートであって：
Ｘは核酸分子であり、
Ｂは核酸塩基であり、
および
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｃ５－２１炭化水素基、具体的にはＣ５－１１炭化水素基、より具体的にはＣ９炭化水素基であり；
前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい；
核酸コンジュゲート。
【請求項2】
請求項１に記載されたコンジュゲートであって、Ｒ１およびＲ２は、直鎖または分岐Ｃ９アルキル基である
コンジュゲート。
【請求項3】
請求項１～２のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、前記核酸塩基Ｂは、複素環塩基、例えば、プリンまたはピリミジン塩基であって、具体的にはウラシル、チミン、またはそれらのアナログから選択され、
および／または
前記核酸塩基Ｂは、修飾塩基、例えば、疎水性部分で置換された塩基、炭水化物部分で置換された塩基、または官能基部分で置換された塩基であり；
前記疎水性部分は、具体的にはテルペン部分、具体的にはＣ５－Ｃ３０テルペン部分、より具体的にはＣ５－Ｃ２０テルペン部分、さらに具体的にはＣ１５テルペン部分である、またはステロール部分、例えば、コレステロール部分である；
コンジュゲート。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、Ｂは、式（ＩＩａ）の核酸塩基であり：
または
Ｂは、式（ＩＩｂ）の核酸塩基であり：
ここでＺはＣＨまたはＮであり、Ｒ３はテルペン部分、具体的にはＣ５－Ｃ３０テルペン部分、より具体的にはＣ５－Ｃ２０テルペン部分、さらに具体的にはＣ１５テルペン部分、例えば、式（ＩＩＩ）のテルペン部分である：
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、前記核酸分子Ｘは、少なくとも約５のヌクレオチドブロックから１０００以上までのヌクレオチド構成ブロック、５～１００の間のヌクレオチド構成ブロック、１０～５０の間のヌクレオチド構成ブロック、１２～４０の間のヌクレオチド構成ブロック、具体的には１５～３０の間のヌクレオチド構成ブロックの鎖長を有する
コンジュゲート。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、前記核酸分子Ｘは、少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックを含み、前記修飾ヌクレオチド構成ブロックは、具体的には以下から選択される：
（ａ）核酸塩基修飾ヌクレオチド構成ブロック；
（ｂ）糖修飾ヌクレオチド構成ブロック；
（ｃ）骨格修飾ヌクレオチド構成ブロック
および
（ｄ）それらの任意の組み合わせ；
コンジュゲート。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、前記核酸分子Ｘは、
（ｉ）少なくとも１のデオキシリボヌクレオチド構成ブロックおよび／または少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックを含んでもよい、ＲＮＡ分子、
または
（ｉｉ）少なくとも１のリボヌクレオチド構成ブロックおよび／または少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックを含んでもよい、ＤＮＡ分子、
または
（ｉｉｉ）核酸アナログ分子である
コンジュゲート。
【請求項8】
請求項７に記載されたコンジュゲートであって、前記核酸分子Ｘは、（ｉ）少なくとも１のデオキシリボヌクレオチド構成ブロックおよび／または少なくとも１の修飾構成ブロックを含んでもよく、および少なくとも１の３′－オーバーハング、具体的にはｓｉＲＮＡ分子を有してもよい、二本鎖ＲＮＡ分子である、
または
前記核酸分子Ｘは、（ｉｉ）少なくとも１のリボヌクレオチド構成ブロックおよび／または少なくとも１の修飾構成ブロック、具体的にはアンチセンス分子を含んでもよい、一本鎖ＤＮＡ分子である、
コンジュゲート。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、前記核酸分子Ｘの鎖の５′末端に、および／または３′末端に結合され、
および／または
前記２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、前記核酸分子Ｘの鎖内の塩基に結合され、
および
前記２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、具体的には二本鎖ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５′末端に、またはアンチセンス分子の５′末端に結合される
コンジュゲート。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、医薬における使用のための、例えばヒト医薬または獣医薬における使用のための、具体的にはヒト医薬における使用のための
コンジュゲート。
【請求項11】
請求項１０に記載の使用のための請求項１～９のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、前記コンジュゲートは、それを必要とする対象に、具体的にはヒトの対象に投与され、
または
前記コンジュゲートは、エクスビボで標的細胞または標的器官に投与され、および前記標的細胞または標的器官は、その後それを必要とする対象内に、具体的にはヒトの対象内に導入され、
または
前記コンジュゲートは、卵母細胞または胚に投与され；
ここで産業商業目的でのヒト幹細胞またはヒト胚の使用は、除外される；
コンジュゲート。
【請求項12】
請求項１０～１１のいずれか一項に記載の使用のための請求項１～９のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、前記投与は、標的細胞および／または標的器官特異的な送達を含み；
前記標的細胞は、具体的には肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、筋肉細胞、神経細胞、胃細胞、小腸細胞、大腸細胞、直腸細胞、膀胱細胞、骨細胞、副腎細胞、眼の細胞、皮膚細胞、または脳細胞である；
コンジュゲート。
【請求項13】
請求項１～９のいずれか一項に記載されたコンジュゲートの、核酸分子を標的細胞内へ送達するための、インビトロでの使用。
【請求項14】
請求項１３に記載された使用であって、前記使用は、標的細胞特異的な送達を含み；
前記標的細胞は、具体的には肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、筋肉細胞、神経細胞、胃細胞、小腸細胞、大腸細胞、直腸細胞、膀胱細胞、骨細胞、副腎細胞、眼の細胞、皮膚細胞、または脳細胞である；
使用。
【請求項15】
２′，３′－Ｏ－ケタール部分（ＩＶ）の使用であって：
Ｙは反応性官能基部分、例えばホスホロアミダート基であり、
Ｂは核酸塩基であり、
および
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、炭化水素基であり；
前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよく；
核酸分子に結合させるための
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、少なくとも１の２′，３′－Ｏケタール部分を含む、核酸コンジュゲートに関連する。このコンジュゲートは、ヒト細胞を含む哺乳類細胞などの細胞内へ、核酸分子を標的特異的にまたは標的選択的に送達するために、高い有効性で適している。従って、アンチセンス分子、およびｓｉＲＮＡ分子、またはそのような分子の前駆物質または修飾を含む、治療用核酸分子のための新たな送達媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）が、提供される。
【背景技術】
【0002】
ＷＯ ２０１４／０４８９６９は、核脂質および核脂質の調製のための工程を記載する。特に、脂質２′，３′－Ｏケタール部分を含むヌクレオチドが、記載される。これらのヌクレオチドは、ある癌細胞において医薬活性を有することが見出された。しかしながら、２′，３′－Ｏ－ケタール部分を含む核酸分子の標的細胞内への送達は、開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明の目的は、標的細胞内へ高い有効性で送達されうる核酸分子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明者らは、２′，３′－Ｏケタール部分を核酸分子に、具体的には核酸鎖の３′末端におよび／または５′末端に結合させることにより、標的細胞内への送達、具体的には標的細胞または標的生物体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）内へのインビボ送達を増加させうることを見出した。従って、改善された特性を有する治療用または診断用の核酸コンジュゲートが、提供される。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】Ａ．ホスホロアミダイトとしての２′，３′－Ｏ－ケタール部分ＰＲＡＭＯ０１およびＰＲＡＭＯ０２の、構造およびモル質量。Ｂ．裸のＲＮＡ分子としての、またはＰＲＡＭＯ０１またはＰＲＡＭＯ０２とのコンジュゲートとしての、オリゴヌクレオチドＧＡＰＤＨアンチセンスおよびＧＡＰＤＨセンス（合わせて標的二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、ｓｉＧＡＰＤＨを形成する）、および、ＳｃｒアンチセンスおよびＳｃｒセンス（合わせて非標的二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、スクランブルｓｉＲＮＡを形成する）の、配列および分子量。＊は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を意味する。ｄＴは、２′－デオキシリボヌクレオチドＴ構成ブロックを意味する。
【図2】裸のｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＡＰＤＨ）、ＰＲＡＭＯ０１コンジュゲートｓｉＲＮＡ、ＰＲＡＭＯ０２コンジュゲートｓｉＲＮＡまたはＰＢＳ／グルコースを、３．７５、１０、または２５ｍｇ／Ｋｇ静脈内注射したＢａｌｂ／ｃマウス（６～８週）の、肺（Ａ）、肝臓（Ｂ）、心臓（Ｃ）、膵臓（Ｄ）および腎臓（Ｅ）におけるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルの測定（各群ｎ＝３）。注射後７２時間後に、組織が採取された。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルは、ハウスキーピング遺伝子（アクチンＢ）で正規化されたΔΔＣＴを使用して測定され、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）／グルコースに対するパーセントで示された（平均±標準偏差）。
【図3】裸のｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＡＰＤＨ）、ＰＲＡＭＯ０１コンジュゲートｓｉＲＮＡ、ＰＲＡＭＯ０２コンジュゲートｓｉＲＮＡ、非標的対照ｓｉＲＮＡ（スクランブルｓｉＲＮＡ）を、３．７５、１０、または２５ｍｇ／Ｋｇ静脈内注射したＢａｌｂ／ｃマウス（６～８週）の、肺（Ａ）、肝臓（Ｂ）、心臓（Ｃ）、膵臓（Ｄ）および腎臓（Ｅ）におけるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルの測定（各群ｎ＝３）。注射後７２時間後に、組織が採取された。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルは、ハウスキーピング遺伝子（アクチンＢ）で正規化されたΔΔＣＴを使用して測定され、非標的ｓｉＲＮＡに対するパーセントで示された（平均±標準偏差）。
【図4】ＰＢＳで４８時間処理し、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃに対してＰＲＡＭＯ０１コンジュゲートｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、トランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸ（１０μＭ ｓｉＲＮＡ）を使用した後の、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ肺がん細胞を有する肺３Ｄ臓器モデルにおける、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルの測定。ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルは、ハウスキーピング遺伝子（アクチンＢ）で正規化されたΔΔＣＴを使用して測定され、陰性対照ＰＢＳに対するパーセントで示された（ｎ＝２）、（平均±標準偏差）。
【発明を実施するための形態】
【0006】
本発明の第１の態様は、少なくとも１の２′，３′－Ｏ－ケタール部分を含む、式（Ｉ）の核酸コンジュゲートであって：
ここで
Ｘは核酸分子であり、
Ｂは核酸塩基であり、および
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、炭化水素基であり、前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい。
Ｘは核酸分子であり、
Ｂは核酸塩基であり、および
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、炭化水素基であり、前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい。
【0007】
本発明はまた、式（Ｉ）および本明細書の任意の他の式で描かれる化合物の、任意の立体異性体、塩および溶媒和物をも含むことが理解される。
【0008】
式（Ｉ）の核酸コンジュゲートは、少なくとも１の２′，３′－Ｏ－ケタール部分が結合された核酸分子Ｘを含む。
【0009】
「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、少なくとも２つのヌクレオチド構成ブロックを含む、任意のタイプのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関連する。核酸分子は、リボヌクレオチド構成ブロック、２′－デオキシリボヌクレオチド構成ブロック、修飾ヌクレオチド構成ブロックまたはそれらの任意の組み合わせを含みうる。ある実施形態において、核酸分子は、少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックおよび／または少なくとも１の２′－デオキシリボヌクレオチド構成ブロックを含んでもよいＲＮＡ分子、少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックおよび／または少なくとも１のリボヌクレオチド構成ブロックを含んでもよいＤＮＡ分子、または修飾ヌクレオチド構成ブロックからなる核酸アナログ分子である。
【0010】
本明細書で使用される「核酸アナログ分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語、具体的にはＤＮＡまたはＲＮＡ分子アナログは、天然起源のＲＮＡまたはＤＮＡ分子に類似する、すなわち構造的に同様である分子を指す。一般に、天然起源の核酸は、ヌクレオチドの鎖であり、それらは３つの要素：骨格部分（具体的にはリン酸骨格）、五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）、および４つの核酸塩基のうちの１つ、からなる。アナログは、修飾核酸塩基またはロック核酸（ＬＮＡ）のように、これらの要素のいずれかが変更されていてもよい。対応するアナログは、当業者に知られている。アナログはとりわけ、異なる塩基対形成特性および塩基スタッキング特性を与えうる。
【0011】
２′，３′－Ｏケタール部分は、核酸塩基Ｂを含む。「核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」という用語は、少なくとも１のＮ原子を含む、例えば単環または二環の環状、飽和、不飽和、芳香族または複素芳香族塩基に典型的には関連し、ここで核酸塩基は、相補核酸塩基と、具体的には天然起源の核酸塩基と、水素結合を介して塩基対を形成可能である。核酸塩基は、任意の天然起源または非天然起源の核酸塩基であってもよく、例えば任意の天然起源または非天然起源のプリンまたはピリミジン塩基、例えばアデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシルなど、または修飾核酸塩基、例えば修飾アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシル塩基であってもよい。
【0012】
２′，３′－Ｏケタール部分の核酸塩基は、「修飾核酸塩基（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」でありうる。この用語は、任意のタイプの修飾核酸塩基、例えば疎水性部分で置換された核酸塩基、炭水化物部分で置換された核酸塩基、および／または官能基部分で置換された核酸塩基を含む。
【0013】
疎水性部分は、少なくとも５個のＣ原子、具体的には少なくとも１０個のＣ原子を有する部分から選択されうる。
【0014】
ある実施形態において、疎水性部分は、置換または非置換の非環状または環状テルペン部分から選択される。例えば、疎水性部分は、Ｃ５－Ｃ３０テルペン部分、具体的にはＣ５－Ｃ２０テルペン部分、さらに具体的にはＣ１５テルペン部分であってもよく、それらは環状または非環状であってもよく、飽和または不飽和であってもよく、および／またはヘテロ原子（複数可）または官能基（複数可）で置換または中断されてもよく、またはステロール部分、例えばコレステロール部分であってもよい。
【0015】
さらに疎水性部分は、置換または非置換、環状または非環状、飽和、不飽和、または多価不飽和カルボン酸部分から選択されてもよく、エステルまたはアミドなどそれらの塩または誘導体を含む。例えば疎水性部分は、Ｃ５－Ｃ３０カルボン酸部分であってもよく、例えばドコサヘキサエン酸部分、エイコサペンタエン酸部分、ドコサン酸部分、リトコール酸部分、またはレチノイン酸またはレチノイン酸エステル部分であってもよい。
【0016】
さらに疎水性部分は、置換または非置換、環状または非環状、飽和、不飽和、または多価不飽和アルコール、ケトン、アルデヒド、またはアミンから選択されてもよい。例えば疎水性部分は、Ｃ５－Ｃ３０アルコール、ケトン、またはアミド部分であってもよく、例えばトコフェロール部分、コハク酸トコフェロール部分、レチノール部分、レチナール部分、スペルミン部分、またはスペルミジン部分であってもよい。
【0017】
ある実施形態において、疎水性部分は、以下から選択され、
および／または
ここで
ＲおよびＲ′は、独立して、Ｃ１－Ｃ３０アルキル、好ましくはＣ５－Ｃ２５アルキルから選択され、ｎは１～６の範囲の整数、好ましくはｎは１または２であり、およびａは１～２０、好ましくは２～１８、より好ましくは６～１６の範囲の整数である。
ＲおよびＲ′は、独立して、Ｃ１－Ｃ３０アルキル、好ましくはＣ５－Ｃ２５アルキルから選択され、ｎは１～６の範囲の整数、好ましくはｎは１または２であり、およびａは１～２０、好ましくは２～１８、より好ましくは６～１６の範囲の整数である。
【0018】
炭水化物部分は、単糖、オリゴ糖または多糖部分であってもよく、修飾炭水化物、例えばアセチル化炭水化物部分を含む。例えば炭水化物部分は、ＧａｌＮＡｃ部分であってもよい。
【0019】
官能基部分は、アルキン基またはアジド基などのクリック官能基部分であってもよく、またはエーテル基、エステル基、アミド基、カルボン酸基、チオエステル基、チオアミド基、またはチオエーテル基であってもよい。
【0020】
式（Ｉ）のコンジュゲートは、２′，３′－Ｏ－ケタール部分を含み、リボース部分の２′－ＯＨ基および３′－ＯＨ基が、置換基Ｒ１およびＲ２を含むケタール基に変換されている。
【0021】
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、炭化水素基であり、前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい。
【0022】
Ｒ１およびＲ２は、飽和、一価または多価不飽和の非環式直鎖または分岐炭化水素基、または飽和、一価または多価不飽和、芳香族または複素芳香族環式炭化水素基であってもよく、それらは1または複数のヘテロ原子によって中断または置換されてもよい。
【0023】
ある実施形態において、Ｒ１および／またはＲ２は、互いに独立して、Ｃ５－２１炭化水素基、具体的にはＣ５－１１炭化水素基、より具体的にはＣ９炭化水素基であり、前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロ（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）などの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい。
【0024】
さらなる実施形態において、Ｒ１および／またはＲ２は、互いに独立して、直鎖または分岐アルキル基、直鎖または分岐アルケニル基、および直鎖または分岐アルキニル基であり、前記アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓまたはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい。
【0025】
なおさらなる実施形態において、Ｒ１および／またはＲ２は、互いに独立して、環状部分、すなわち、少なくとも１の環状構造、例えば単環、二環または三環構造を含む部分である。環状部分は、炭素環式または複素環式部分、例えば５～１８の環原子であってもよく、少なくとも１のＣ原子が、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１のヘテロ原子によって置換されてもよい。
【0026】
なおさらなる実施形態において、Ｒ１および／またはＲ２は、互いに独立して、官能基、例えばエーテル基、エステル基、アミド基、カルボン酸基、チオエステル基、チオアミド基、またはチオエーテル基から選択される官能基を含む。
【0027】
なおさらなる実施形態において、Ｒ１および／またはＲ２は、互いに独立して、マーカー基、例えば蛍光、ルミネセンス、または放射性マーカー基を含む。
【0028】
なおさらなる実施形態において、Ｒ１および／またはＲ２は、互いに独立して、本明細書で定義される核酸分子、例えば５０までの、具体的には５～２５のヌクレオチド構成ブロックを有する核酸分子を含む。
【0029】
具体的な実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、直鎖または分岐Ｃ９アルキル基であり、より具体的には直鎖Ｃ９アルキル基である。
【0030】
具体的な実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩａ）のウラシル塩基である核酸塩基Ｂを含み：
ここでＺはＣＨまたはＮであり、Ｒ３はＨである。
【0031】
この実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、好ましくは直鎖Ｃ９アルキル基である。
【0032】
さらなる具体的な実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩｂ）のウラシル塩基である核酸塩基Ｂを含み：
ここでＺはＣＨまたはＮであり、Ｒ３は疎水性部分、例えばテルペン部分、具体的にはＣ５－Ｃ３０テルペン部分、より具体的にはＣ５－Ｃ２０テルペン部分、さらに具体的にはＣ１５テルペン部分、例えば式（ＩＩＩ）のテルペン部分である：
【0033】
この実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、好ましくは直鎖Ｃ９アルキル基である。
【0034】
ある実施形態において、核酸分子Ｘは、少なくとも約５のヌクレオチド構成ブロックから１０００以上までのヌクレオチド構成ブロックの鎖長を有する。さらなる実施形態において、核酸分子Ｘは、約５～約１００の間のヌクレオチド構成ブロック、約１０～約５０の間のヌクレオチド構成ブロック、約１２～約４０の間のヌクレオチド構成ブロック、具体的には約１５～約３０の間のヌクレオチド構成ブロックの鎖長を有する。
【0035】
「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、および四本鎖核酸分子、例えばＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子およびそれらのアナログを包含する。さらに核酸分子は、後述の少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックを含みうる。
【0036】
一実施形態において、核酸分子はＤＮＡ分子であり、少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックを含みうる。「ＤＮＡ分子（ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、一本鎖、および多鎖、例えば二本鎖、三本鎖、または四本鎖ＤＮＡ分子、具体的には一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子を包含する。多鎖、例えば二本鎖ＤＮＡ分子は、同じ長さを有する鎖または異なる長さを有する鎖を含みうる。多鎖、例えば二本鎖ＤＮＡ分子において、個々の鎖は、別々の分子として存在してもよく、または一本鎖ループを介してまたは異種リンカーを介して共有結合的に結合されてもよい。
【0037】
「ＤＮＡ分子」という用語は、天然ＤＮＡ構成ブロック、すなわち２′－デオキシリボヌクレオチド構成ブロックからなる分子、および、少なくとも１の２′－デオキシリボヌクレオチド構成ブロック、および少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロック、および／または少なくとも１のリボヌクレオチド構成ブロックを含む分子を包含する。
【0038】
さらなる実施形態において、核酸分子はＲＮＡ分子であり、少なくとも１の修飾構成ブロックおよび／または少なくとも１の２′－デオキシリボヌクレオシド構成ブロックを含みうる。「ＲＮＡ分子（ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、一本鎖、または多鎖、例えば二本鎖、三本鎖、および四本鎖ＲＮＡ分子、具体的には一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子を包含する。多鎖ＲＮＡ分子は、同じ長さを有する鎖または異なる長さを有する鎖を含みうる。例えば、二本鎖ＲＮＡ分子は、平滑末端であってもよく、または少なくとも１のオーバーハング、例えば少なくとも１の３′－オーバーハングを有してもよい。多鎖、例えば二本鎖ＲＮＡ分子において、個々の鎖は、別々の分子として存在してもよく、または一本鎖ループを介してまたは異種リンカーを介して共有結合的に結合されてもよい。
【0039】
「ＲＮＡ分子」という用語は、天然ＲＮＡ構成ブロック、すなわちリボヌクレオチド構成ブロックからなる分子、および、天然ＲＮＡ構成ブロック、および少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロック、および／または少なくとも１の２′－デオキシリボヌクレオシド構成ブロックを含む分子を包含する。
【0040】
「ヌクレオチド構成ブロック（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）」という用語は、本明細書に記載される核酸分子内に組み込まれ、前記核酸分子の一部を形成することができる、部分に関連する。典型的には、ヌクレオチド構成ブロックは、核酸塩基部分、糖部分および骨格部分を含む。「核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」という用語は、式（Ｉ）の核酸塩基Ｂについて本明細書で上述したような任意のタイプの核酸塩基を包含しうる。糖部分は、リボース部分または２′－デオキシリボース部分を包含してもよく、それらの任意の修飾を含む。骨格部分は、２つのヌクレオチド構成ブロック間のヌクレオシド間結合を形成するホスホエステル基を包含してもよく、それらの任意の修飾を含む。核酸分子Ｘは、核酸塩基修飾、糖修飾および／または骨格修飾を含む、修飾ヌクレオチドアナログブロックを含みうる。
【0041】
ある実施形態において、核酸分子Ｘは、少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックを含み、具体的には以下から選択される：
（ａ）核酸塩基修飾構成ブロック；
（ｂ）糖修飾構成ブロック；
（ｃ）骨格修飾構成ブロック；および
（ｄ）それらの任意の組み合わせ。
（ａ）核酸塩基修飾構成ブロック；
（ｂ）糖修飾構成ブロック；
（ｃ）骨格修飾構成ブロック；および
（ｄ）それらの任意の組み合わせ。
【0042】
「核酸塩基修飾構成ブロック（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）」という用語は、修飾核酸塩基を含むヌクレオチド構成に関連する。「修飾核酸塩基（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」という用語は、式（Ｉ）の核酸塩基Ｂについて本明細書で上述したような任意のタイプの修飾核酸塩基を包含しうる。
【0043】
「糖修飾構成ブロック（ｓｕｇａｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）」という用語は、修飾糖を含むヌクレオチド構成に関連する。「糖（ｓｕｇａｒ）」という用語は、典型的にはリボースまたは２′－デオキシリボース部分に関連し、任意のタイプの修飾糖部分を含む。ある実施形態において、糖修飾ヌクレオチド構成ブロックは、リボース部分の環および／または環上の置換基が修飾されている、ヌクレオチド構成ブロックから選択される。
【0044】
ある実施形態において、修飾ヌクレオチド構成ブロックは、２′－修飾ヌクレオチド構成ブロックであり、リボース部分の２′－ＯＨ置換基が２′－Ｒ４で置換されており、ここでＲ４は、ハロ（例えば、フルオロ）、Ｃ１－Ｃ５アルキル、Ｏ－Ｃ１－Ｃ５アルキル、Ｓ－Ｃ１－Ｃ５アルキル、Ｃ２－Ｃ５アルケニル、Ｏ－Ｃ２－Ｃ５アルケニル、Ｓ－Ｃ２－Ｃ５アルケニル、Ｃ２－Ｃ５アルキニル、Ｏ－Ｃ２－Ｃ５アルキニル、Ｓ－Ｃ２－Ｃ５アルキニル、一置換または二置換アミノを含むアミノ（例えば、Ｃ１－Ｃ５アルキル、Ｃ２－Ｃ５アルケニルまたはＣ２－Ｃ５アルキニル置換アミノ）であり、ここで各アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、ＯＨ、ハロ、シクロアルキル、シクロアルケニル、（ヘテロ）アリール（例えばフェニル）、Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、および／またはアミノで置換されてもよい。
【0045】
ある実施形態において、修飾ヌクレオチド構成ブロックは、架橋された、例えば２′－４′架橋された修飾ヌクレオチド構成ブロックであり、ここで架橋は、典型的には２～５原子、具体的には２～３原子の長さを有し、Ｃ原子を含み、Ｏ、ＮまたはＳなどのヘテロ原子を含んでもよい。具体的な実施形態において、修飾構成ブロックは、２′－Ｏ－ＣＨ２－４′架橋を有するロック核酸構成ブロックである。
【0046】
ある実施形態において、修飾ヌクレオチド構成ブロックは、リボース部分の環が修飾された構成ブロックであり、例えばモルフォリノ構成ブロック、チオリボース構成ブロック、６員ピラノース構成ブロック、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）構成ブロックである。
【0047】
「骨格修飾構成ブロック（ｂａｃｋｂｏｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）」という用語は、修飾ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチド構成に関連する。骨格修飾ヌクレオチド構成ブロックにおいて、隣接する構成ブロックを結合するホスホエステル基が、修飾ヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエート結合、アルキルホスホネート結合（例えば、メチルホスホネート結合）、およびボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合によって置換される。
【0048】
核酸分子は、医薬用途に適した核酸分子から好ましくは選択される。好ましい核酸分子には、以下のものが含まれる：コード配列を含むｍＲＮＡ分子、具体的にはタンパク質コード配列を含むｍＲＮＡ分子；ＲＮＡ干渉が可能なＲＮＡ分子、例えば１６～２７－ｍｅｒのｓｉＲＮＡ、具体的には２１－ｍｅｒのｓｉＲＮＡ、ｂｌｕｎｔ ｓｉＲＮＡ、ｓｉｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、Ｆｏｒｋ ｓｉＲＮＡ、２７－ｍｅｒのｓｉＲＮＡ、Ｄｕｍｂｂｅｌｌ ｓｉＲＮＡ、１６－ｍｅｒのｓｉＲＮＡ、ｓｓ－ｓｉＲＮＡなど；マイクロＲＮＡ分子およびそのアンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、例えばｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ；遺伝子編集が可能なＲＮＡ分子、例えばｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の構成要素；アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ；三重鎖または四重鎖を形成する核酸分子；ＣｐＧ－オリゴヌクレオチド、ＴＴＡＧＧＧ－オリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、またはＤＮＡ酵素（ＤＮＡｚｙｍｅ）、または、これらの分子の前駆物質または修飾。
【0049】
ある実施形態において、核酸分子Ｘは、少なくとも１の修飾構成ブロックおよび／または少なくとも１のＤＮＡ構成ブロックを含んでもよいＲＮＡ分子、少なくとも１の修飾構成ブロックおよび／または少なくとも１のＲＮＡ構成ブロックを含んでもよいＤＮＡ分子、または、修飾構成ブロックからなる核酸アナログ分子である。
【0050】
さらなる実施形態において、核酸分子Ｘは、少なくとも１の修飾構成ブロックを含んでもよく、および少なくとも１のオーバーハング、例えば５′－オーバーハングおよび／または３′－オーバーハング、例えば１、２または３つのヌクレオチド構成ブロックのオーバーハングを有してもよい、二本鎖ＲＮＡ分子である。具体的な実施形態において、ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子である。
【0051】
さらなる実施形態において、核酸分子Ｘは、少なくとも１の修飾構成ブロックおよび／または少なくとも１のリボース構成ブロック、具体的にはアンチセンス分子を含んでもよい、一本鎖ＤＮＡ分子である。
【0052】
式（Ｉ）の核酸コンジュゲートは、２′－３′－Ｏ－ケタール部分（ＩＶ）を核酸分子Ｘに結合させることにより調製されてもよく、２′－３′－Ｏ－ケタール部分は、式（ＩＶ）であり：
ここで
Ｙは反応性官能基部分、例えばホスホロアミダート基、または核酸分子の、具体的には核酸分子骨格の化学合成に適する他の基であり、
Ｂは核酸塩基であり、および
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、炭化水素基であり、
前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい。
Ｙは反応性官能基部分、例えばホスホロアミダート基、または核酸分子の、具体的には核酸分子骨格の化学合成に適する他の基であり、
Ｂは核酸塩基であり、および
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、炭化水素基であり、
前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい。
【0053】
本明細書で使用される「ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）」という用語はまた、核酸分子合成のために当業者に使用され知られている「ホスホロアミダート変種（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）」をも含みうる。
【0054】
２′，３′－Ｏ－ケタール部分（ＩＶ）の合成は、ＷＯ２０１４／０４８９６９に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。核酸分子Ｘへの２′，３′－Ｏ－ケタール部分（ＩＶ）の結合は、核酸分子Ｘの合成中または合成後に、例えば固相核酸合成における標準的な方法に従って、行われうる。
【0055】
ある実施形態において、２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、核酸分子Ｘの少なくとも１の鎖の５′末端に、および／または３′末端に結合される。
【0056】
具体的な実施形態において、２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５′末端に、またはアンチセンス分子の５′末端に結合される。
【0057】
さらなる実施形態において、２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、核酸分子Ｘの鎖内の核酸塩基に結合される。
【0058】
さらなる実施形態において、核酸分子Ｘに結合される２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、複数、例えば２つである。
【0059】
本発明のさらなる態様は、医薬における、例えばヒト医薬または獣医薬における使用のための、具体的にはヒト医薬およびインビボ動物研究における使用のための、式（Ｉ）のコンジュゲートの使用に関連する。ある実施形態において、医薬使用は、コンジュゲートを、それを必要とする対象に、具体的にはヒトの対象に、投与することを含む。さらなる実施形態において、コンジュゲートは、標的細胞または標的器官にエクスビボで投与され、標的細胞または標的器官は、その後それを必要とする対象内に、具体的にはヒトの対象内に導入される。なおさらなる実施形態において、コンジュゲートは、卵母細胞または胚に投与され、ここで産業商業目的でのヒト幹細胞またはヒト胚の使用は、除外される。本発明のコンジュゲートが卵母細胞または胚に投与される場合、卵母細胞のまたは胚の生殖細胞系列は遺伝的に修飾されず、遺伝病などの疾患のみが治療されることが好ましい。好ましい実施形態によれば、本発明のコンジュゲートは、非ヒト卵母細胞または非ヒト胚に投与される。
【0060】
本発明は、細胞、組織、器官、または生物体における標的特異的な核酸修飾を媒介する効率的な方法を提供し、以下の各ステップを含む：
（ａ）細胞、組織、器官、または生物体に、本発明のコンジュゲートを接触させるステップ、および
（ｂ）コンジュゲートのヌクレオシド成分によって生じる、標的核酸に対する標的特異的な核酸修飾を、媒介するステップ。
接触させるステップ（ａ）は、細胞培養物、単細胞微生物、または標的細胞内に存在しうる標的細胞、例えば単離された標的細胞に、または、標的組織および／または標的器官などの多細胞生物内の複数の標的細胞に、コンジュゲートを導入するステップを含みうる。標的細胞、標的組織および／または標的器官は、好ましくはヒトを含む哺乳類である。標的生物体は、好ましくは哺乳類生物体、例えばヒト生物体である。標的細胞は、好ましくはヒト細胞を含む哺乳類細胞である。標的組織は、好ましくはヒト組織を含む哺乳類組織である。標的器官は、好ましくはヒト器官を含む哺乳類器官である。
（ａ）細胞、組織、器官、または生物体に、本発明のコンジュゲートを接触させるステップ、および
（ｂ）コンジュゲートのヌクレオシド成分によって生じる、標的核酸に対する標的特異的な核酸修飾を、媒介するステップ。
接触させるステップ（ａ）は、細胞培養物、単細胞微生物、または標的細胞内に存在しうる標的細胞、例えば単離された標的細胞に、または、標的組織および／または標的器官などの多細胞生物内の複数の標的細胞に、コンジュゲートを導入するステップを含みうる。標的細胞、標的組織および／または標的器官は、好ましくはヒトを含む哺乳類である。標的生物体は、好ましくは哺乳類生物体、例えばヒト生物体である。標的細胞は、好ましくはヒト細胞を含む哺乳類細胞である。標的組織は、好ましくはヒト組織を含む哺乳類組織である。標的器官は、好ましくはヒト器官を含む哺乳類器官である。
【0061】
生物体内への導入は、全身投与または局所投与を含む任意のタイプの投与、例えば注射または注入による投与を含みうる。例示的なタイプの投与には、耳、頬、気管支内、経腸、硬膜外、吸入、膀胱への注入、動脈内、関節内、胃内、殿筋内、心臓内、皮内、腰椎内、リンパ内、乳腺内、筋肉内、鼻内、神経内、眼内、骨内、腹腔内、胸膜内、肺内、ルーメン内、髄腔内、気管内、尿道内、子宮内、静脈内、脳室内、硝子体内、口腔、経口、非経口、硬膜外、神経周囲、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、直腸、球後、結膜下、皮下、舌下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、および／または膣内投与を含む。
【0062】
媒介するステップ（ｂ）は、好ましくは標的核酸の修飾を含み、例えばｓｉＲＮＡコンジュゲートを使用する場合はＲＮＡ干渉により、またはアンチセンス分子コンジュゲートを使用する場合はｍＲＮＡ転写の阻害による。
【0063】
本発明はまた、上述のコンジュゲートを活性薬剤として適切な担体と共に含む医薬組成物を提供する。診断または治療用外用薬のために、医薬組成物は、溶液（例えば注入または注射のための溶液）、クリーム、軟膏、錠剤、懸濁液、粉末などの形態でありうる。組成物は、任意の適切な方法で、例えば非経口投与（例えば注射または注入）によって、経粘膜外用薬によって、または経皮外用薬によって、または経口、局所、鼻腔、直腸外用薬などによって投与されうる。例えば手術中の腹腔内または腹膜内へなど、局所外用薬が具体的には好ましい。さらに好ましくは、腫瘍の近傍または眼球内への外用薬、具体的には本発明に従ったｓｉＲＮＡコンジュゲートについてである。
【0064】
医薬組成物は、生物体内への、具体的にはヒト生物体内への送達に適した任意の形態の活性薬剤またはプロドラッグとして、コンジュゲートを含みうる。例えば組成物は、カプセル化された形態または非カプセル化された形態の活性薬剤を、リポソームなどの送達媒体と共に、および／またはトランスフェクション試薬と共に、または、送達媒体無しで、および／またはトランスフェクション試薬無しで、含みうる。
【0065】
ある実施形態において、本発明のコンジュゲートは、調節において、例えば標的細胞、標的組織、標的器官または標的生物体における関心遺伝子のダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションにおいて、使用されうる。関心遺伝子は、内因性遺伝子または外因性病原体からの遺伝子であってもよく、具体的にはウイルスまたは細菌遺伝子、または、癌遺伝子または自己免疫疾患またはアレルギー疾患関連遺伝子などの内因性疾患関連遺伝子であってもよい。
【0066】
さらなる実施形態において、本発明のコンジュゲートは、例えば標的細胞または標的生物体におけるｍＲＮＡ分子のようなタンパク質コード核酸分子などの、コードの導入および任意の発現において、使用されうる。
【0067】
本発明の具体的な態様は、核酸分子の、具体的には本明細書に記載された治療用核酸分子の、標的細胞、標的組織および／または標的器官特異的な送達のための、コンジュゲートの使用に関連する。本発明の特に好ましい実施形態は、標的細胞、標的組織および／または標的器官特異的な送達のために、具体的にはインビボ送達のために、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５′末端に、またはアンチセンス分子の５′末端に結合されている、本明細書に記載された２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックの使用に関連する。従って、ｓｉＲＮＡ分子の、具体的には治療用ｓｉＲＮＡ分子の、標的細胞、標的組織および／または標的器官特異的な送達のための、ｓｉＲＮＡコンジュゲートの使用は、特に好ましい。
【0068】
例えば、標的細胞は、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、筋肉細胞、神経細胞、胃細胞、小腸細胞、大腸細胞、直腸細胞、膀胱細胞、骨細胞、副腎細胞、眼の細胞、皮膚細胞、または脳細胞でありうる。本明細書で使用される「組織（ｔｉｓｓｕｅ）」は、共通の機能または構造を有する標的細胞などの、同種または異種に分化した細胞群からなる有機物を指す。
【0069】
本発明のなおさらなる態様は、標的細胞、標的組織または標的器官内への核酸分子の送達のための、コンジュゲートのインビトロ使用に関連する。標的細胞は、核酸分子が送達されうる任意のタイプの細胞から、例えば哺乳類細胞、鳥類細胞または昆虫細胞などの動物細胞、植物細胞、真菌細胞、原生生物細胞、細菌細胞および古細菌細胞から、選択されうる。具体的な実施形態において、標的細胞はヒト細胞である。
【0070】
この態様の具体的な実施形態は、標的細胞、標的組織および／または標的器官における遺伝子のダウンレギュレーションにおける、コンジュゲートの使用に関連する。
【0071】
具体的には、本発明は、インビトロでの核酸分子の標的細胞特異的な送達、標的組織特異的な送達、および／または標的器官特異的な送達を提供する。例えば、標的細胞は、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、筋肉細胞、神経細胞、胃細胞、小腸細胞、大腸細胞、直腸細胞、膀胱細胞、骨細胞、副腎細胞、眼の細胞、皮膚細胞、または脳細胞でありうる。
【0072】
本発明のなおさらなる態様は、核酸分子に結合させるための、本明細書に記載された２′，３′－Ｏ－ケタール部分（ＩＶ）の使用に関連する。
【0073】
本発明のさらなる態様は、本明細書の以下の項目に記載されている通りである。
【0074】
［項目］
１． 少なくとも１の２′，３′－Ｏ－ケタール部分を含む、式（Ｉ）の核酸コンジュゲートであって：
ここで
Ｘは核酸分子であり、
Ｂは核酸塩基であり、
および
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、炭化水素基であり；
前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい；
核酸コンジュゲート。
１． 少なくとも１の２′，３′－Ｏ－ケタール部分を含む、式（Ｉ）の核酸コンジュゲートであって：
Ｘは核酸分子であり、
Ｂは核酸塩基であり、
および
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、炭化水素基であり；
前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい；
核酸コンジュゲート。
【0075】
２． 項目１に記載されたコンジュゲートであって、
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｃ５－２１炭化水素基、具体的にはＣ５－１１炭化水素基、より具体的にはＣ９炭化水素基であり；
前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい；
核酸コンジュゲート。
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｃ５－２１炭化水素基、具体的にはＣ５－１１炭化水素基、より具体的にはＣ９炭化水素基であり；
前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい；
核酸コンジュゲート。
【0076】
３． 項目１または２に記載されたコンジュゲートであって、
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、直鎖または分岐アルキル基、直鎖または分岐アルケニル基、および直鎖または分岐アルキニル基であり；
前記アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓまたはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい；
コンジュゲート。
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、直鎖または分岐アルキル基、直鎖または分岐アルケニル基、および直鎖または分岐アルキニル基であり；
前記アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓまたはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよい；
コンジュゲート。
【0077】
４． 項目１～３のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
Ｒ１およびＲ２は、直鎖または分岐Ｃ９アルキル基である
コンジュゲート。
Ｒ１およびＲ２は、直鎖または分岐Ｃ９アルキル基である
コンジュゲート。
【0078】
５． 項目１～４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記核酸塩基Ｂは、少なくとも１のＮ原子を含む単環または二環の芳香族または複素芳香族塩基である
コンジュゲート。
前記核酸塩基Ｂは、少なくとも１のＮ原子を含む単環または二環の芳香族または複素芳香族塩基である
コンジュゲート。
【0079】
６． 項目１～５のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記核酸塩基Ｂは、複素環塩基、例えば、プリンまたはピリミジン塩基であって、具体的にはウラシル、チミン、またはそれらのアナログから選択される
コンジュゲート。
前記核酸塩基Ｂは、複素環塩基、例えば、プリンまたはピリミジン塩基であって、具体的にはウラシル、チミン、またはそれらのアナログから選択される
コンジュゲート。
【0080】
７． 項目１～６のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記核酸塩基Ｂは、修飾塩基、例えば、疎水性部分で置換された塩基、炭水化物部分で置換された塩基、または官能基部分で置換された塩基である
コンジュゲート。
前記核酸塩基Ｂは、修飾塩基、例えば、疎水性部分で置換された塩基、炭水化物部分で置換された塩基、または官能基部分で置換された塩基である
コンジュゲート。
【0081】
８． 項目７に記載されたコンジュゲートであって、
前記疎水性部分は、テルペン部分、具体的にはＣ５－Ｃ３０テルペン部分、より具体的にはＣ５－Ｃ２０テルペン部分、さらに具体的にはＣ１５テルペン部分である、またはステロール部分、例えば、コレステロール部分である
コンジュゲート。
前記疎水性部分は、テルペン部分、具体的にはＣ５－Ｃ３０テルペン部分、より具体的にはＣ５－Ｃ２０テルペン部分、さらに具体的にはＣ１５テルペン部分である、またはステロール部分、例えば、コレステロール部分である
コンジュゲート。
【0082】
９． 項目７に記載されたコンジュゲートであって、
前記炭水化物部分は、ＧａｌＮＡｃ基である
コンジュゲート。
前記炭水化物部分は、ＧａｌＮＡｃ基である
コンジュゲート。
【0083】
１０． 項目７に記載されたコンジュゲートであって、
前記官能基部分は、アルキン基またはアジド基などのクリック官能基部分である、またはアルキン基またはアジド基などである、またはエーテル基、エステル基、アミド基、カルボン酸基、チオエステル基、チオアミド基、またはチオエーテル基である
コンジュゲート。
前記官能基部分は、アルキン基またはアジド基などのクリック官能基部分である、またはアルキン基またはアジド基などである、またはエーテル基、エステル基、アミド基、カルボン酸基、チオエステル基、チオアミド基、またはチオエーテル基である
コンジュゲート。
【0084】
１１． 項目１～６のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
Ｂは、式（ＩＩａ）の核酸塩基であり：
ここでＺはＣＨまたはＮであり、Ｒ３はＨである；
コンジュゲート。
Ｂは、式（ＩＩａ）の核酸塩基であり：
コンジュゲート。
【0085】
１２． 項目１～８のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
Ｂは、式（ＩＩｂ）の核酸塩基であり：
ここでＺはＣＨまたはＮであり、Ｒ３はテルペン部分、具体的にはＣ５－Ｃ３０テルペン部分、より具体的にはＣ５－Ｃ２０テルペン部分、さらに具体的にはＣ１５テルペン部分、例えば、式（ＩＩＩ）のテルペン部分である：
コンジュゲート。
Ｂは、式（ＩＩｂ）の核酸塩基であり：
【0086】
１３． 項目１～１２のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記核酸分子Ｘは、少なくとも５のヌクレオチド構成ブロックから１０００以上までのヌクレオチド構成ブロック、５～１００の間のヌクレオチド構成ブロック、１０～５０の間のヌクレオチド構成ブロック、１２～４０の間のヌクレオチド構成ブロック、具体的には１５～３０の間のヌクレオチド構成ブロックの鎖長を有する
コンジュゲート。
前記核酸分子Ｘは、少なくとも５のヌクレオチド構成ブロックから１０００以上までのヌクレオチド構成ブロック、５～１００の間のヌクレオチド構成ブロック、１０～５０の間のヌクレオチド構成ブロック、１２～４０の間のヌクレオチド構成ブロック、具体的には１５～３０の間のヌクレオチド構成ブロックの鎖長を有する
コンジュゲート。
【0087】
１４． 項目１～１３のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記核酸分子Ｘは、少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックを含み、前記修飾ヌクレオチド構成ブロックは、具体的には以下から選択される：
（ａ）塩基修飾ヌクレオチド構成ブロック；
（ｂ）糖修飾ヌクレオチド構成ブロック；
（ｃ）骨格修飾ヌクレオチド構成ブロック
および
（ｄ）それらの任意の組み合わせ；
コンジュゲート。
前記核酸分子Ｘは、少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックを含み、前記修飾ヌクレオチド構成ブロックは、具体的には以下から選択される：
（ａ）塩基修飾ヌクレオチド構成ブロック；
（ｂ）糖修飾ヌクレオチド構成ブロック；
（ｃ）骨格修飾ヌクレオチド構成ブロック
および
（ｄ）それらの任意の組み合わせ；
コンジュゲート。
【0088】
１５． 項目１４に記載されたコンジュゲートであって、
前記塩基修飾ヌクレオチド構成ブロックは、疎水性部分で置換された塩基を含む構成ブロック、炭水化物部分で置換された塩基を含むヌクレオチド構成ブロック、および官能基部分で置換された塩基を含むヌクレオチド構成ブロックから選択される
コンジュゲート。
前記塩基修飾ヌクレオチド構成ブロックは、疎水性部分で置換された塩基を含む構成ブロック、炭水化物部分で置換された塩基を含むヌクレオチド構成ブロック、および官能基部分で置換された塩基を含むヌクレオチド構成ブロックから選択される
コンジュゲート。
【0089】
１６． 項目１４に記載されたコンジュゲートであって、
前記糖修飾ヌクレオチド構成ブロックは、２′－修飾リボース構成ブロック、２′－４′架橋修飾リボース構成ブロック、例えばロックヌクレオチド（ＬＮＡ）構成ブロック、モルフォリノ構成ブロック、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）構成ブロックから選択される
コンジュゲート。
前記糖修飾ヌクレオチド構成ブロックは、２′－修飾リボース構成ブロック、２′－４′架橋修飾リボース構成ブロック、例えばロックヌクレオチド（ＬＮＡ）構成ブロック、モルフォリノ構成ブロック、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）構成ブロックから選択される
コンジュゲート。
【0090】
１７． 項目１４に記載されたコンジュゲートであって、
前記骨格修飾ヌクレオチド構成ブロックは、修飾ヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエート結合、アルキルホスホネート結合（例えば、メチルホスホネート結合）、およびボラノホスフェート結合を含む
コンジュゲート。
前記骨格修飾ヌクレオチド構成ブロックは、修飾ヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエート結合、アルキルホスホネート結合（例えば、メチルホスホネート結合）、およびボラノホスフェート結合を含む
コンジュゲート。
【0091】
１８． 項目１～１７のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記核酸分子Ｘは、一本鎖核酸分子または二本鎖核酸分子である
コンジュゲート。
前記核酸分子Ｘは、一本鎖核酸分子または二本鎖核酸分子である
コンジュゲート。
【0092】
１９． 項目１～１８のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記核酸分子Ｘは、
（ｉ）少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックおよび／または少なくとも１のＤＮＡ構成ブロックを含んでもよい、ＲＮＡ分子、
または
（ｉｉ）少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックおよび／または少なくとも１のＲＮＡ構成ブロックを含んでもよい、ＤＮＡ分子、
または
（ｉｉｉ）核酸アナログ分子である
コンジュゲート。
前記核酸分子Ｘは、
（ｉ）少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックおよび／または少なくとも１のＤＮＡ構成ブロックを含んでもよい、ＲＮＡ分子、
または
（ｉｉ）少なくとも１の修飾ヌクレオチド構成ブロックおよび／または少なくとも１のＲＮＡ構成ブロックを含んでもよい、ＤＮＡ分子、
または
（ｉｉｉ）核酸アナログ分子である
コンジュゲート。
【0093】
２０． 項目１９に記載されたコンジュゲートであって、
前記核酸分子Ｘは、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖ＲＮＡ分子、具体的には一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子であり；
前記ＲＮＡ分子は、少なくとも１のデオキシリボヌクレオチド構成ブロック、少なくとも１の修飾構成ブロック含んでもよく、および少なくとも１の３′－オーバーハング、具体的にはｓｉＲＮＡ分子を有してもよい；
コンジュゲート。
前記核酸分子Ｘは、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖ＲＮＡ分子、具体的には一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子であり；
前記ＲＮＡ分子は、少なくとも１のデオキシリボヌクレオチド構成ブロック、少なくとも１の修飾構成ブロック含んでもよく、および少なくとも１の３′－オーバーハング、具体的にはｓｉＲＮＡ分子を有してもよい；
コンジュゲート。
【0094】
２１． 項目１９に記載されたコンジュゲートであって、
前記核酸分子Ｘは、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖ＲＮＡ分子、具体的には一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であり；
前記ＤＮＡ分子は、少なくとも１のリボヌクレオチド構成ブロック、少なくとも１の修飾構成ブロック、具体的にはアンチセンス分子を含んでもよい；
コンジュゲート。
前記核酸分子Ｘは、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖ＲＮＡ分子、具体的には一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であり；
前記ＤＮＡ分子は、少なくとも１のリボヌクレオチド構成ブロック、少なくとも１の修飾構成ブロック、具体的にはアンチセンス分子を含んでもよい；
コンジュゲート。
【0095】
２２． 項目１～２１のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、前記核酸分子Ｘの鎖の５′末端に、および／または３′末端に結合される
コンジュゲート。
２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、前記核酸分子Ｘの鎖の５′末端に、および／または３′末端に結合される
コンジュゲート。
【0096】
２３． 項目２２に記載されたコンジュゲートであって、
前記２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５′末端に、またはアンチセンス分子の５′末端に結合される
コンジュゲート。
前記２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５′末端に、またはアンチセンス分子の５′末端に結合される
コンジュゲート。
【0097】
２４． 項目１～２３のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、前記核酸分子Ｘの鎖内の塩基に結合される
コンジュゲート。
前記２′，３′－Ｏ－ケタール構成ブロックは、前記核酸分子Ｘの鎖内の塩基に結合される
コンジュゲート。
【0098】
２５． 項目１～２４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
医薬における使用のための、例えばヒト医薬または獣医薬における使用のための、具体的にはヒト医薬における使用のための
コンジュゲート。
医薬における使用のための、例えばヒト医薬または獣医薬における使用のための、具体的にはヒト医薬における使用のための
コンジュゲート。
【0099】
２６． 項目２５に記載の使用のための項目１～２４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記コンジュゲートは、それを必要とする対象に、具体的にはヒトの対象に投与される
コンジュゲート。
前記コンジュゲートは、それを必要とする対象に、具体的にはヒトの対象に投与される
コンジュゲート。
【0100】
２７． 項目２５に記載の使用のための項目１～２４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記コンジュゲートは、エクスビボで標的細胞または標的器官に投与され、および前記標的細胞または標的器官は、その後それを必要とする対象内に、具体的にはヒトの対象内に導入される
コンジュゲート。
前記コンジュゲートは、エクスビボで標的細胞または標的器官に投与され、および前記標的細胞または標的器官は、その後それを必要とする対象内に、具体的にはヒトの対象内に導入される
コンジュゲート。
【0101】
２８． 項目２５に記載の使用のための項目１～２４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記コンジュゲートは、卵母細胞または胚に投与され；
ここで産業商業目的でのヒト幹細胞またはヒト胚の使用は、除外される；
コンジュゲート。
前記コンジュゲートは、卵母細胞または胚に投与され；
ここで産業商業目的でのヒト幹細胞またはヒト胚の使用は、除外される；
コンジュゲート。
【0102】
２９． 項目２５～２８のいずれか一項に記載の使用のための項目１～２４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記投与は、標的細胞および／または標的器官特異的な送達を含む
コンジュゲート。
前記投与は、標的細胞および／または標的器官特異的な送達を含む
コンジュゲート。
【0103】
３０． 項目２５～２９のいずれか一項に記載の使用のための項目１～２４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
標的細胞または標的生物体における遺伝子の、例えば内因性遺伝子または外因性病原体からの遺伝子、具体的にはウイルスまたは細菌遺伝子、または、癌遺伝子または自己免疫疾患またはアレルギー疾患関連遺伝子などの内因性疾患関連遺伝子の、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションにおける使用のための
コンジュゲート。
標的細胞または標的生物体における遺伝子の、例えば内因性遺伝子または外因性病原体からの遺伝子、具体的にはウイルスまたは細菌遺伝子、または、癌遺伝子または自己免疫疾患またはアレルギー疾患関連遺伝子などの内因性疾患関連遺伝子の、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションにおける使用のための
コンジュゲート。
【0104】
３１． 項目２５～２９のいずれか一項に記載の使用のための項目１～２４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
標的細胞または標的生物体におけるコード核酸分子遺伝子の導入および任意の発現における使用のための
コンジュゲート。
標的細胞または標的生物体におけるコード核酸分子遺伝子の導入および任意の発現における使用のための
コンジュゲート。
【0105】
３２． 項目２５～３１のいずれか一項に記載の使用のための項目１～２４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートであって、
前記標的細胞は、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、筋肉細胞、神経細胞、胃細胞、小腸細胞、大腸細胞、直腸細胞、膀胱細胞、骨細胞、副腎細胞、眼の細胞、皮膚細胞、または脳細胞である
コンジュゲート。
前記標的細胞は、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、筋肉細胞、神経細胞、胃細胞、小腸細胞、大腸細胞、直腸細胞、膀胱細胞、骨細胞、副腎細胞、眼の細胞、皮膚細胞、または脳細胞である
コンジュゲート。
【0106】
３３． 項目１～２４のいずれか一項に記載されたコンジュゲートの、核酸分子を標的細胞内へ送達するための、インビトロでの使用。
【0107】
３４． 項目３３に記載された使用であって、
前記標的細胞は、哺乳類細胞、鳥類細胞または昆虫細胞などの動物細胞、植物細胞、真菌細胞、原生動物細胞、細菌細胞、および古細菌細胞から選択される
使用。
前記標的細胞は、哺乳類細胞、鳥類細胞または昆虫細胞などの動物細胞、植物細胞、真菌細胞、原生動物細胞、細菌細胞、および古細菌細胞から選択される
使用。
【0108】
３５． 項目３３または３４に記載された使用であって、
前記標的細胞はヒト細胞である
使用。
前記標的細胞はヒト細胞である
使用。
【0109】
３６． 項目３３～３５のいずれか一項に記載された使用であって、
前記標的細胞における遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのための
使用。
前記標的細胞における遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのための
使用。
【0110】
３７． 項目３３～３５のいずれか一項に記載された使用であって、
標的細胞または標的生物体におけるコード核酸分子遺伝子の導入および任意の発現のための
使用。
標的細胞または標的生物体におけるコード核酸分子遺伝子の導入および任意の発現のための
使用。
【0111】
３８． 項目３３～３７のいずれか一項に記載された使用であって、
標的細胞特異的な送達を含む
使用。
標的細胞特異的な送達を含む
使用。
【0112】
３９． 項目３３～３８のいずれか一項に記載された使用であって、
前記標的細胞は、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、筋肉細胞、神経細胞、胃細胞、小腸細胞、大腸細胞、直腸細胞、膀胱細胞、骨細胞、副腎細胞、眼の細胞、皮膚細胞、または脳細胞である
使用。
前記標的細胞は、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、筋肉細胞、神経細胞、胃細胞、小腸細胞、大腸細胞、直腸細胞、膀胱細胞、骨細胞、副腎細胞、眼の細胞、皮膚細胞、または脳細胞である
使用。
【0113】
４０． ２′，３′－Ｏ－ケタール部分（ＩＶ）の使用であって：
ここで
Ｙは反応性官能基部分であり、
Ｂは核酸塩基であり、
および
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、炭化水素基であり；
前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよく；
核酸分子に結合させるための
使用。
Ｙは反応性官能基部分であり、
Ｂは核酸塩基であり、
および
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、炭化水素基であり；
前記炭化水素基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはハロなどの１または複数のヘテロ原子を含んでもよく；
核酸分子に結合させるための
使用。
【0114】
４１． 項目４０に記載された使用であって、
前記２′，３′－Ｏ－ケタール部分（ＩＶ）は、項目２～１２のいずれか一項に記載された少なくとも１の特徴を備える
使用。
前記２′，３′－Ｏ－ケタール部分（ＩＶ）は、項目２～１２のいずれか一項に記載された少なくとも１の特徴を備える
使用。
【0115】
４２． 項目４０または４１に記載された使用であって、
前記核酸分子は、項目１３～２１のいずれか一項に記載された少なくとも１の特徴を備える
使用。
前記核酸分子は、項目１３～２１のいずれか一項に記載された少なくとも１の特徴を備える
使用。
【0116】
４３． 項目４０～４２のいずれか一項に記載された使用であって、
前記２′，３′－Ｏ－ケタール部分（ＩＶ）の前記核酸分子への結合は、項目２２～２４のいずれか一項に記載された少なくとも１の特徴を備える
使用。
前記２′，３′－Ｏ－ケタール部分（ＩＶ）の前記核酸分子への結合は、項目２２～２４のいずれか一項に記載された少なくとも１の特徴を備える
使用。
【0117】
４４． 項目４０～４３のいずれか一項に記載された使用であって、
前記反応性官能基部分Ｙは、ホスホロアミダート基である
使用。
前記反応性官能基部分Ｙは、ホスホロアミダート基である
使用。
【0118】
以下の図および実施例により、本発明をより具体的に概説する。
【実施例】
【0119】
［結果］
２つの異なる脂質ベースの担体分子ＰＲＡＭＯ０１およびＰＲＡＭＯ０２（図１）が、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子に対する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、ｓｉＧＡＰＤＨのセンス鎖に結合された。修飾ｓｉＲＮＡ分子は、様々な器官内にインビボで移植され、ＧＡＰＤＨ遺伝子のダウンレギュレーションが分析された。
２つの異なる脂質ベースの担体分子ＰＲＡＭＯ０１およびＰＲＡＭＯ０２（図１）が、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子に対する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、ｓｉＧＡＰＤＨのセンス鎖に結合された。修飾ｓｉＲＮＡ分子は、様々な器官内にインビボで移植され、ＧＡＰＤＨ遺伝子のダウンレギュレーションが分析された。
【0120】
ＰＲＡＭＯ０１およびＰＲＡＭＯ０２は、修飾ホスホロアミダイトとして合成され、センスＲＮＡ鎖の５′末端に共有結合的に結合された。
【0121】
図２～３は、脂質修飾オリゴヌクレオチドをＢａｌｂ／Ｃマウスの尾静脈内に静脈注射した結果を示す。実験動物の標的器官におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現が、明確に変化した。動物は注射の７２時間後に犠牲にされ、５つの異なる組織が調べられた。肺においてＰＲＡＭ０１修飾ｓｉＲＮＡを使用した場合、ＧＡＰＤＨ遺伝子の５８％までのダウンレギュレーション（遺伝子抑制）が検出された（ｎ＝３）。肝臓、心臓、および膵臓においてＰＲＡＭ０２修飾ｓｉＲＮＡを使用した場合もまた、ダウンレギュレーションが検出された（ｎ＝３）。
【0122】
ＰＲＡＭＯ０１の送達効率は、３Ｄ肺臓器チップ（ｏｒｇａｎ ｃｈｉｐ）（変異ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを有するヒト肺癌細胞を有する）において、さらに試験された。この実験において、２つの追加のチップが、それぞれ陰性および陽性対照として、ＰＢＳで、および変異ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃに対してＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬とともにＰＲＡＭＯ０１コンジュゲートｓｉＲＮＡで、処理された。各チップは２つの別々の区画を含むため、２つの生理学的に独立した複製が作成された。３Ｄモデルは、１０μＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、トランスフェクトの４８時間後に分析された。ＰＲＡＭＯ０１コンジュゲートｓｉＲＮＡで処理された３Ｄモデルにおいて、トランスフェクション試薬を使用した場合および使用しない場合で、ＫＲＡＳ遺伝子のダウンレギュレーションが見られた（それぞれ７０％および７８％まで減少）。
【0123】
使用されたｓｉＲＮＡ配列：
５′ ＧＵＧＧＵＡＧＵＵＧＧＡＧＣＵＵＧＵＧ ｄｔｄｔ ３′ センス
５′ ＣＡＣＡＡＧＣＵＣＣＡＡＣＵＡＣＣＡＣ ｄｔｄｔ ３′ アンチセンス
５′ ＧＵＧＧＵＡＧＵＵＧＧＡＧＣＵＵＧＵＧ ｄｔｄｔ ３′ センス
５′ ＣＡＣＡＡＧＣＵＣＣＡＡＣＵＡＣＣＡＣ ｄｔｄｔ ３′ アンチセンス
【0124】
［材料および方法］
［脂質およびオリゴヌクレオチドの合成］
脂質の合成は、標準的な方法に従って行われた。オリゴヌクレオチドの合成およびオリゴヌクレオチドの脂質へのコンジュゲートは、標準的な方法に従って行われた。
［脂質およびオリゴヌクレオチドの合成］
脂質の合成は、標準的な方法に従って行われた。オリゴヌクレオチドの合成およびオリゴヌクレオチドの脂質へのコンジュゲートは、標準的な方法に従って行われた。
【0125】
［裸のｓｉＲＮＡおよび脂質コンジュゲートｓｉＲＮＡのマウスへの注射］
６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスが、グルコース、または、３．７５、１０、または２５ｍｇ／Ｋｇの（注射用水に溶解された裸のまたは脂質コンジュゲート）ｓｉＲＮＡを、静脈注射された。一般に、１物質あたり３匹のマウスが注射された（ｎ＝３３、対照を含む）。動物は、注射の３日後に犠牲にされた。
６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスが、グルコース、または、３．７５、１０、または２５ｍｇ／Ｋｇの（注射用水に溶解された裸のまたは脂質コンジュゲート）ｓｉＲＮＡを、静脈注射された。一般に、１物質あたり３匹のマウスが注射された（ｎ＝３３、対照を含む）。動物は、注射の３日後に犠牲にされた。
【0126】
［インビボでのｍＲＮＡ抑制の測定］
組織は、採取され、急速凍結され、－８０℃で保存された。ＲＮＡ抽出は、ＴＲＩｚｏｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）において、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒおよびＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行われた。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔおよびｒａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔｓ、ザンクト・レオン＝ロート（Ｓｔ．Ｌｅｏｎ－Ｒｏｔ）、ドイツ）を使用して、ｃＤＮＡが転写された。ｑＰＣＲのために、ＴａｑＭａｎ ＧＡＰＤＨ Ａｓｓａｙ、ＴａｑＭａｎ ＡＣＴＩＮＢ Ａｓｓａｙ、およびＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）が、製造者の説明書に従って、使用された。相対的なＧＡＰＤＨ発現は、アクチンＢで正規化され、ΔΔＣｔ法により決定された。
組織は、採取され、急速凍結され、－８０℃で保存された。ＲＮＡ抽出は、ＴＲＩｚｏｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）において、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒおよびＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行われた。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔおよびｒａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔｓ、ザンクト・レオン＝ロート（Ｓｔ．Ｌｅｏｎ－Ｒｏｔ）、ドイツ）を使用して、ｃＤＮＡが転写された。ｑＰＣＲのために、ＴａｑＭａｎ ＧＡＰＤＨ Ａｓｓａｙ、ＴａｑＭａｎ ＡＣＴＩＮＢ Ａｓｓａｙ、およびＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）が、製造者の説明書に従って、使用された。相対的なＧＡＰＤＨ発現は、アクチンＢで正規化され、ΔΔＣｔ法により決定された。
【0127】
［３Ｄ臓器モデルにおけるｍＲＮＡ抑制の測定］
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異を有するヒト肺癌細胞株を含む３Ｄ臓器モデルが、トランスフェクトの４８時間後に採取され、ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡが単離された。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔおよびｒａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔｓ、ザンクト・レオン＝ロート、ドイツ）を使用して、ｃＤＮＡが転写された。ｑＰＣＲのために、ＴａｑＭａｎ ＫＲＡＳ Ａｓｓａｙ、ＴａｑＭａｎ ＡＣＴＩＮＢ Ａｓｓａｙ、およびＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）が、製造者の説明書に従って、使用された。相対的なＫＲＡＳ発現は、アクチンＢで正規化され、ΔΔＣｔ法により決定された。
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異を有するヒト肺癌細胞株を含む３Ｄ臓器モデルが、トランスフェクトの４８時間後に採取され、ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡが単離された。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔおよびｒａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔｓ、ザンクト・レオン＝ロート、ドイツ）を使用して、ｃＤＮＡが転写された。ｑＰＣＲのために、ＴａｑＭａｎ ＫＲＡＳ Ａｓｓａｙ、ＴａｑＭａｎ ＡＣＴＩＮＢ Ａｓｓａｙ、およびＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）が、製造者の説明書に従って、使用された。相対的なＫＲＡＳ発現は、アクチンＢで正規化され、ΔΔＣｔ法により決定された。
【0128】
［ステムループＰＣＲ］
ｓｉＲＮＡを増幅するために、単離されたＲＮＡは、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）を使用して、ｃＤＮＡに転写された。ｓｉＲＮＡの定量化のために、ＣｙｂｅｒｇｒｅｅｎベースのｑＰＣＲアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）が使用された。すべての手順は、製造者の説明書に従って行われた。
ｓｉＲＮＡを増幅するために、単離されたＲＮＡは、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）を使用して、ｃＤＮＡに転写された。ｓｉＲＮＡの定量化のために、ＣｙｂｅｒｇｒｅｅｎベースのｑＰＣＲアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）が使用された。すべての手順は、製造者の説明書に従って行われた。
【0129】
［統計分析］
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して、分析された。３つの独立したインビボ実験の各々において、抑制のレベルは、非標的対照（対応するスクランブルｓｉＲＮＡ）の平均値で正規化された。データは、ｔ検定および複数比較のための分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、分析された。
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して、分析された。３つの独立したインビボ実験の各々において、抑制のレベルは、非標的対照（対応するスクランブルｓｉＲＮＡ）の平均値で正規化された。データは、ｔ検定および複数比較のための分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、分析された。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】