(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-15
(54)【発明の名称】基板厚誤差を補償するための方法およびシステム
(51)【国際特許分類】
G02B 21/36 20060101AFI20240105BHJP
G02B 21/26 20060101ALI20240105BHJP
G02B 21/06 20060101ALI20240105BHJP
G02B 21/34 20060101ALI20240105BHJP
G06T 5/70 20240101ALI20240105BHJP
G01N 21/64 20060101ALN20240105BHJP
【ＦＩ】
G02B21/36
G02B21/26
G02B21/06
G02B21/34
G06T5/00 705
G01N21/64 E
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540731
(86)(22)【出願日】2022-01-05
(85)【翻訳文提出日】2023-08-21
(86)【国際出願番号】 US2022011324
(87)【国際公開番号】W WO2022150396
(87)【国際公開日】2022-07-14
(31)【優先権主張番号】63/134,033
(32)【優先日】2021-01-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511227336
【氏名又は名称】モレキュラー デバイシーズ， エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】チャン， マシュー
【テーマコード（参考）】
2G043
2H052
5B057
【Ｆターム（参考）】
2G043AA03
2G043EA01
2G043FA02
2G043HA01
2G043JA01
2G043KA09
2G043LA03
2G043NA05
2H052AC28
2H052AD09
2H052AD18
2H052AE06
2H052AF14
2H052AF25
5B057CA08
5B057CA12
5B057CA16
5B057CB08
5B057CB12
5B057CB16
5B057CC01
5B057CE02
5B057CE06
(57)【要約】
サンプルカバースリップの真下に配置される対物レンズを使用して、サンプルカバースリップの上部表面上のサンプルのサンプル画像を捕捉する、サンプルカバースリップの上部表面のサンプルを撮像するためのシステムおよび方法。これらは、較正カバースリップの上部表面から反射される光から取得される、基準画像データを捕捉し、サンプルカバースリップの上部表面から反射される光から取得される、検査画像データを捕捉し、基準画像データおよび検査画像データを処理し、対物レンズおよび使用中のカバースリップと関連付けられる、計算された点広がり関数を生成し、計算された点広がり関数を使用してサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減させる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
光学撮像システムであって、サンプルカバースリップの上部表面上で撮像されるべきサンプルを保持するように構成されるサンプルステージと、
前記サンプルステージの真下に配置され、前記サンプルカバースリップの前記上部表面上で前記サンプルを撮像するように構成される対物レンズと、
前記サンプルカバースリップ上で少なくとも前記サンプルのサンプル画像を捕捉するように構成される光学検出器と、
プロセッサであって、前記プロセッサは、
較正カバースリップから捕捉された基準画像から基準画像データを取り出すことと、
前記対物レンズの焦点面において前記サンプルカバースリップの上部表面から反射された光から捕捉された検査画像から検査画像データを取り出すことと、
前記基準画像データおよび前記検査画像データを処理し、前記検査画像データの逆畳み込みを介して、前記対物レンズおよび使用中の他の光学コンポーネントと関連付けられる計算された点広がり関数を生成することと、
前記計算された点広がり関数を使用して前記サンプル画像を逆畳み込みし、それによって、前記サンプル画像からのアーチファクトを低減させることと
を行うようにプログラムされる、プロセッサと
を備える、光学撮像システム。
【請求項2】
前記プロセッサは、前記検査画像データのブラインド逆畳み込みを実施し、前記計算された点広がり関数を決定するようにプログラムされる、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記プロセッサは、前記計算された点広がり関数に関して、前記逆畳み込みされた画像内の改良が漸進的改良になるまで、前記検査画像の繰り返される逆畳み込み、およびａ）前記検査画像の逆畳み込みされた画像とｂ）前記基準画像との繰り返される比較によって、前記サンプル画像の画質を改良するための最適化された点広がり関数を決定するようにプログラムされる、請求項１－２のいずれかに記載のシステム。
【請求項4】
前記プロセッサは、前記検査画像の連続する逆畳み込みの後に漸進的にのみ改良されて取得されるスポットサイズ、スポット形状、スポット強度、およびスポット場所のうちの少なくとも１つの基準に基づいて、前記最適化された点広がり関数を決定するようにプログラムされる、請求項３に記載のシステム。
【請求項5】
前記プロセッサは、連続する逆畳み込みされた画像内の改良が、漸進的改良になるまで、前記検査画像の繰り返される逆畳み込み、およびａ）前記検査画像の逆畳み込みされた画像とｂ）較正された基準画像との繰り返される比較によって、前記最適化された点広がり関数を決定するようにプログラムされる、請求項３に記載のシステム。
【請求項6】
光源をさらに備え、前記光源は、前記検査画像のための、または前記基準画像のための前記焦点面に集束されるべき光の投影点を提供する、請求項１－５のいずれかに記載のシステム。
【請求項7】
コントローラをさらに備え、前記コントローラは、ａ）前記カバースリップに対する前記対物レンズの垂直変位、ｂ）前記カバースリップに対する前記対物レンズの側方変位、ｃ）前記光学検出器の露光持続時間、ｄ）前記サンプルを照明する前記光源の強度、ｅ）光学経路の中への光学フィルタの挿入、ｆ）前記光学経路内での軸外開口の位置付け、およびｇ）自動焦点調節のうちの少なくとも１つを制御するように構成される、請求項６に記載のシステム。
【請求項8】
前記コントローラは、前記光源からの光を前記対物レンズの前記焦点面に集束させるために、前記対物レンズの位置および前記サンプルステージの位置のうちの少なくとも一方を制御するように構成される、請求項７に記載のシステム。
【請求項9】
前記コントローラの制御下で、前記光学検出器は、前記サンプルカバースリップからの複数のサンプル画像を異なる側方位置において捕捉し、前記コントローラの制御下で、前記光学検出器は、前記較正カバースリップからの複数の較正された基準画像を異なる側方位置において捕捉し、
前記コントローラの制御下で、前記光学検出器は、前記対物レンズの前記焦点面から前記サンプルカバースリップを通して後方反射される光からの複数の検査画像を、前記異なる側方位置において捕捉し、
前記プロセッサは、側方位置毎に、個別の計算された点広がり関数と関連付けられる個別の逆畳み込みされた検査画像を生成し、
前記プロセッサは、側方位置毎に、前記個別の計算された点広がり関数を使用して、前記複数のサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、前記複数のサンプル画像からのアーチファクトを低減させる、
請求項８に記載のシステム。
【請求項10】
前記コントローラの制御下で、前記光学検出器は、異なるサンプルカバースリップから、複数のサンプル画像を捕捉し、前記コントローラの制御下で、前記光学検出器は、複数の較正カバースリップから、それぞれ、前記異なるサンプルカバースリップと関連付けられる複数の較正された基準画像を捕捉し、
前記コントローラの制御下で、前記光学検出器は、前記異なるサンプルカバースリップから、前記異なるサンプルカバースリップを通して後方反射される光から複数の検査画像を捕捉し、
前記プロセッサは、サンプルカバースリップ毎に、個別の計算された点広がり関数と関連付けられる個別の逆畳み込みされた検査画像を生成し、
前記プロセッサは、カバースリップ毎に、前記個別の計算された点広がり関数を使用して、前記複数のサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、前記複数のサンプル画像からのアーチファクトを低減させる、
請求項８に記載のシステム。
【請求項11】
前記サンプルカバースリップに起因する光学収差を補償する補正カラーをさらに備える、請求項１－１０のいずれかに記載のシステム。
【請求項12】
前記プロセッサは、個別の標準的厚さを有する複数のカバースリップの個別の最適化された点広がり関数をメモリ内に記憶するように構成される、請求項１－１１のいずれかに記載のシステム。
【請求項13】
前記プロセッサは、異なる光学厚を有する異なる種類のカバースリップと関連付けられる個別の最適化された点広がり関数をメモリ内に記憶する、請求項１－１２のいずれかに記載のシステム。
【請求項14】
前記プロセッサはさらに、前記サンプル画像に関して、前記サンプルカバースリップから変位された位置ｚ１から撮影された画像を取り出すことと、
前記位置ｚ１と関連付けられる球面収差を確認することと、
それぞれが前記位置ｚ１と関連付けられる異なる球面収差を有する選択可能な点広がり関数のセットを取り出すことと、
前記選択可能な点広がり関数のセットから前記確認された球面収差と関連付けられる始点広がり関数を選択することと、
前記始点広がり関数を使用して、位置ｚ１において前記サンプル画像を逆畳み込みすることと
を行うように構成される、請求項１－１３のいずれかに記載のシステム。
【請求項15】
前記プロセッサはさらに、前記サンプルカバースリップから変位された第１の位置ｚ１において撮影された第１のサンプル画像を取り出すことと、
第１の位置ｚ１において前記第１のサンプル画像からのアーチファクトを低減させるための第１の計算された点広がり関数を決定することと、
前記第１の位置ｚ１よりも前記サンプルカバースリップから遠くに除去された第２の位置ｚ２において撮影された、第２の画像を取り出すことと、
逆畳み込みにおける始点広がり関数として、前記第１の計算された点広がり関数を使用し、前記第２の位置ｚ２において撮影された前記第２のサンプル画像からのアーチファクトを低減させるための第２の計算された点広がり関数を決定することと
を行うように構成される、請求項１－１４のいずれかに記載のシステム。
【請求項16】
前記光学検出器への光学経路内に軸外開口をさらに備える、請求項１－１５のいずれかに記載のシステム。
【請求項17】
光源から前記対物レンズを通して前記サンプルカバースリップまたは前記較正カバースリップ上に光を指向するための前記対物レンズの真下に配置されるビーム分割器をさらに備える、請求項１－１６のいずれかに記載のシステム。
【請求項18】
光学撮像システムであって、対物レンズと、
サンプルステージであって、前記サンプルステージは、ａ）サンプルを保持するためのサンプルカバースリップまたはｂ）較正カバースリップの上部表面を前記対物レンズの焦点面に位置付けるように構成される、サンプルステージと、
光学検出器であって、前記光学検出器は、少なくともａ）前記サンプルカバースリップ上の前記サンプルのサンプル画像、ｂ）前記対物レンズの前記焦点面から前記較正カバースリップを通して後方反射される光からの基準画像、およびｃ）前記対物レンズの前記焦点面から前記サンプルカバースリップを通して後方反射される光からの検査画像を捕捉するように構成される、光学検出器と、
プロセッサであって、前記プロセッサは、
前記基準画像から基準画像データを取り出すことと、
前記検査画像から検査画像データを取り出すことと、
前記対物レンズおよび前記カバースリップに関する初期の点広がり関数として、前記基準画像データを使用して、前記検査画像データを逆畳み込みすることと、
前記検査画像データの少なくとも１つの逆畳み込みを通して、前記対物レンズと、前記サンプルカバースリップを含む使用中の他の光学コンポーネントとのための計算された点広がり関数を生成することと、
前記検査画像データの前記逆畳み込みから前記計算された点広がり関数を使用して、前記サンプル画像を逆畳み込みし、それによって、前記サンプル画像からのアーチファクトを低減させることと
を行うようにプログラムされる、プロセッサと
を備える、光学撮像システム。
【請求項19】
前記プロセッサは、前記サンプルカバースリップと関連付けられる最適化された点広がり関数を生成するための前記初期の点広がり関数として、前記基準画像データを利用する、請求項１８に記載のシステム。
【請求項20】
サンプルを撮像するためのコンピュータ化された方法であって、前記サンプルを保持するサンプルカバースリップの真下に配置される対物レンズを使用して、前記サンプルのサンプル画像を捕捉することと、
較正カバースリップから取得される基準画像データを取得することと、
前記対物レンズの焦点面において前記サンプルカバースリップの上部表面から反射される光から取得される検査画像データを捕捉することと、
前記基準画像データおよび前記検査画像データを処理し、前記検査画像データの逆畳み込みを介して、前記対物レンズおよび使用中の他の光学コンポーネントと関連付けられる計算された点広がり関数を生成することと、
前記計算された点広がり関数を使用して前記サンプル画像を逆畳み込みし、それによって、前記サンプル画像からのアーチファクトを低減させることと
を含む、コンピュータ化された方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０２２年１月５日にＰＣＴ国際特許出願として出願されており、その開示が参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、２０２１年１月５日に出願された、米国仮出願第６３／１３４，０３３号の優先権および利益を主張する。
本願は、２０２２年１月５日にＰＣＴ国際特許出願として出願されており、その開示が参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、２０２１年１月５日に出願された、米国仮出願第６３／１３４，０３３号の優先権および利益を主張する。
【0002】
技師は、多くの場合、顕微鏡検査サンプルの画質を取得するために、ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）の間に光学顕微鏡検査撮像システムを使用する。サンプル保持器、例えば、マイクロタイタプレート、スライド、皿等は、スクリーニングプロセスの間に顕微鏡検査サンプルを支持し得る。自動化された顕微鏡検査撮像システムは、顕微鏡検査サンプルの画像を生成するために、電荷結合素子（ＣＣＤ）または相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）チップ等の電子撮像デバイスに結合される、対物レンズを含み得る。サンプル保持器に対する対物レンズの位置が、顕微鏡検査サンプルを撮像デバイス上で集束した状態にもたらすように調節され得る。
【0003】
撮像の効率を向上させるために、複数の撮像デバイスが、並行して（すなわち、同時に）複数のウェルを撮像するために使用され得る。しかしながら、複数の撮像デバイスのそれぞれの対物レンズを集束させるために要求される時間は、並行撮像から獲得され得るいかなる効率も排除し得る。さらに、各対物レンズを個々に集束させることはまた、撮像システムの複雑性を増大させ得る。倒立顕微鏡または落射蛍光顕微鏡等の種々の撮像構成では、サンプルは、ガラスカバースリップ、スライドガラス、およびサンプル保持器の底部プレート（例えば、ペトリ皿、マイクロタイタプレート）を通して視認される。しかしながら、サンプル保持器の基部の厚さおよび／または曲率の変動が、測定場所のある範囲にわたって正確な焦点を妨げ得る。結果として、対物レンズの焦点位置が、全ての測定場所に関する個別の合焦画像を取得するために、厚さおよび／または曲率変動を有する、各測定場所において補正される必要がある。ハイコンテントスクリーニングは、数百または数千もの測定サンプルを撮像し得るため、いくつかの顕微鏡検査撮像システムが、各測定場所において自動的に焦点維持を実施するように構成され得る。
【0004】
自動焦点機器を用いた場合でも、光学システム内の他の誤差が、測定場所のある範囲にわたって正確な焦点を妨げ得る。概して、高倍率対物レンズは、その厚さおよび屈折率が事前決定されている、カバーガラス片を使用して、固定された試料を観察するときに明確な画像を取得するような方法において設計される。その厚さおよび屈折率が標準から逸脱し得るカバーガラス片を使用して観察すると、明確な画像を不明瞭にし得る、収差が、生じる。より大きい開口数を伴うレンズが、より小さい開口数を伴うレンズより微細な詳細を可視化することができる。さらに、より大きい開口数を伴うレンズは、より多くの光を収光し、概して、より明るい画像を提供するが、より浅い被写界深度を犠牲にするであろう。しかしながら、対物レンズの開口数が大きくなるほど、画像内の歪曲（球面収差等）が、より顕著なものになるであろう。
【0005】
典型的には、商業的に利用可能な対物レンズは、そのようなサンプル保持器またはカバーの具体的な厚さのために設計されるであろう。異なる厚さの底部プレートを伴うサンプル保持器が、使用されると、規定される厚さからの逸脱が、サンプル保持器によってもたらされる球面収差に起因する画質の有意な劣化を引き起こし得る。球面収差の補償を可能にする、補正カラーが、提供されてもよい。一般的な検査室慣行では、技師は、顕微鏡を使用して、（１）コンピュータ画面上でライブ画像を観察しながらのカラーの手動の回転および／または（２）顕微鏡対物レンズ上に設置されるスケールを使用して、カラーを既知のサンプル保持器厚に設定することによって、球面収差補正設定を調節する。
【0006】
したがって、いくつかの対物レンズ撮像システムでは、対物レンズを成すレンズシステムの一部が、光軸に対して移動されることができる。そのような対物レンズは、当技術分野では、補正カラーを伴う対物レンズとして公知である。補正カラーを使用するとき、サンプル保持器の厚さおよび／または曲率の変動または逸脱にもかかわらず、明確な画像が、取得され得る。しかしながら、補正カラーを用いて収差を補正することは、簡単ではなく、通常、熟練した技師のみが、画像が最も明確である位置を見出すことができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
全体または一部を問わず、概して本明細書に説明されるいくつかの問題、および／または当業者によって観察され得る他の問題に対処するために、本開示は、下記に述べられる実装において実施例として説明されるような方法、プロセス、システム、装置、器具、および／またはデバイスを提供する。
【0008】
ある実施形態によると、光学撮像システムであって、サンプルカバースリップの上部表面上で撮像されるべきサンプルを保持するように構成される、サンプルステージと、サンプルステージの真下に配置され、サンプルカバースリップの上部表面上でサンプルを撮像するように構成される、対物レンズと、サンプルカバースリップ上で少なくともサンプルのサンプル画像を捕捉するように構成される、光学検出器と、較正カバースリップから捕捉された基準画像から基準画像データを取り出し、対物レンズの焦点面においてサンプルカバースリップの上部表面から反射された光から捕捉された検査画像から検査画像データを取り出し、基準画像データおよび検査画像データを処理し、（検査画像データの逆畳み込みを介して）対物レンズおよび使用中の他の光学コンポーネントと関連付けられる、計算された点広がり関数を生成し、計算された点広がり関数を使用してサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減させるようにプログラムされる、プロセッサとを備える、光学撮像システムが、提供される。
【0009】
別の実施形態によると、光学撮像システムであって、対物レンズと、ａ）サンプルを保持するためのサンプルカバースリップまたはｂ）較正カバースリップの上部表面を対物レンズの焦点面に位置付けるように構成される、サンプルステージと、少なくともａ）サンプルカバースリップ上のサンプルのサンプル画像、ｂ）対物レンズの焦点面から較正カバースリップを通して後方反射される光からの基準画像、およびｃ）対物レンズの焦点面からサンプルカバースリップを通して後方反射される光からの検査画像を捕捉するように構成される、光学検出器と、基準画像から基準画像データを取り出し、検査画像から検査画像データを取り出し、対物レンズおよびカバースリップに関する初期の点広がり関数として、基準画像データを使用して、検査画像データを逆畳み込みし、検査画像データの少なくとも１つの逆畳み込みを通して、対物レンズと、サンプルカバースリップを含む、使用中の他の光学コンポーネントとのための計算された点広がり関数と関連付けられる、逆畳み込みされた試験画像を生成し、検査画像データの逆畳み込みから計算された点広がり関数を使用して、サンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減させるようにプログラムされる、プロセッサとを備える、光学撮像システムが、提供される。
【0010】
別の実施形態によると、サンプルを撮像するためのコンピュータ化された方法であって、サンプルを保持するサンプルカバースリップの真下に配置される対物レンズを使用して、サンプルのサンプル画像を捕捉するステップと、較正カバースリップから取得される、基準画像データを取得するステップと、対物レンズの焦点面においてサンプルカバースリップの上部表面から反射される光から取得される、検査画像データを捕捉するステップと、基準画像データおよび検査画像データを処理し、（検査画像データの逆畳み込みを介して）対物レンズおよび使用中の他の光学コンポーネントと関連付けられる、計算された点広がり関数を生成するステップと、計算された点広がり関数を使用してサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減させるステップとを含む、コンピュータ化された方法が、提供される。
【0011】
本技術の他のデバイス、装置、システム、方法、特徴、および利点が、以下の図および詳細な説明の精査の結果、当業者にとって明白になる、または明白な状態になるであろう。そのような付加的なシステム、方法、特徴、および利点の全てが、本説明内に含まれ、本技術の範囲内であり、添付の請求項によって保護されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
本技術は、以下の図を参照することによって、より深く理解されることができる。図内のコンポーネントは、必ずしも縮尺通りではなく、代わりに、本技術の原理を例証することに重点が置かれている。図では、同様の参照番号は、異なる図の全体を通して対応する部分を指定する。
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【発明を実施するための形態】
【0024】
詳細な説明
全ての数値が、本明細書では、明示的に示されているかどうかにかかわらず、用語「約」または「おおよそ」によって修飾されると仮定され、用語「約」および「おおよそ」は、概して、当業者が、列挙される値と同等である（すなわち、同一の機能または結果を有する）と見なすであろう、ある範囲の数を指す。いくつかの事例では、用語「約」および「おおよそ」は、最近傍の有効数字に丸められた数を含み得る。終点による数値範囲の列挙は、その範囲内の全ての数値を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、および５を含む）。
全ての数値が、本明細書では、明示的に示されているかどうかにかかわらず、用語「約」または「おおよそ」によって修飾されると仮定され、用語「約」および「おおよそ」は、概して、当業者が、列挙される値と同等である（すなわち、同一の機能または結果を有する）と見なすであろう、ある範囲の数を指す。いくつかの事例では、用語「約」および「おおよそ」は、最近傍の有効数字に丸められた数を含み得る。終点による数値範囲の列挙は、その範囲内の全ての数値を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、および５を含む）。
【0025】
本明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、コンテンツが別様に明確に指示しない限り、複数の指示物を含む。本明細書および添付の請求項において使用されるように、用語「または」は、概して、コンテンツが別様に明確に指示しない限り、「および／または」を含む、その意味において採用される。付随の図に図示される、開示される技術の描写される実施形態を説明するステップでは、具体的な専門用語が、説明の明確性および容易性のために採用される。しかしながら、本特許明細書の開示は、そのように選択された具体的な専門用語に限定されることを意図しておらず、各具体的な要素が、類似の様式において動作する全ての技術的均等物を含むことを理解されたい。さらに、異なる例証的実施形態の種々の要素および／または特徴が、本開示および添付の請求項の範囲内において可能性として考えられる場合には、相互と組み合わせられる、および／または相互に代用され得ることを理解されたい。
【0026】
開示される技術の種々の実施形態が、以降において、図を参照して説明される。図が、縮尺通りに描かれていないこと、および類似構造または機能の要素が、図の全体を通して同様の参照番号によって表されることに留意されたい。また、図が、実施形態の説明を促進することのみを意図することにも留意されたい。それらは、本技術の包括的説明として、または添付の請求項およびそれらの均等物のみによって定義される、開示される技術の範囲に関する限定として意図されていない。加えて、開示される技術の例証される実施形態は、示される側面または利点の全てを有する必要はない。例えば、開示される技術の特定の実施形態と併せて説明される、ある側面またはある利点が、必ずしもその実施形態に限定されるわけではなく、そのように例証されていない場合でも、任意の他の実施形態において実践されることができる。
【0027】
下記の説明において使用されるように、用語「撮像」、「画像捕捉」、「画像の捕捉」、または「画像を検出するステップ」は、画像捕捉デバイスから光学データを収集するための任意のプロセスを指すものとする。画像は、記憶のため、すなわち、強度、色、または他のタイプのデータ等の光学特性を測定するための、デジタル画像として捕捉されてもよい。
【0028】
下記の説明において使用されるように、用語「カバースリップ」は、サンプルが堆積され得るコンテナを支持するように構成される、任意のサンプル保持構造を指すものとする。特に、用語「カバースリップ」は、「マイクロウェル」、「消耗品」、「マイクロタイタ」、および「マイクロプレート」を含む用語によって当技術分野において公知である、そのようなサンプル保持構造を含む、トレイまたは類似構造を含み得る。代替として、「プレート」は、単一のサンプルウェルまたは複数のサンプルウェルを保持することが可能である、構造を指すように理解されるものとする。
【0029】
本明細書で使用されるように、用語「サンプル」は、概して、検体を含有することが既知である、またはそのように疑われる材料を指す。サンプルタイプは、限定ではないが、オルガノイドおよび同等物の実験のための増殖された細胞培養物を含む、細胞または組織のものであることができる。細胞印刷からのサンプルもまた、使用され得る。他の実施例では、サンプルは、源から取得された状態で直接、またはサンプルの特性を修正するための事前処理に続いて使用されてもよい。サンプルは、血液、間質液、唾液、眼球水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、母乳、腹水液、粘液、関節液、腹水、膣液、羊水、または同等物を含む、生理液等の任意の生物源から導出され得る。サンプルは、血液から血漿を調製すること、粘性流体を希釈すること、および同等物等、使用に先立って前処理されてもよい。事前処理の方法は、濾過、沈殿、希釈、蒸留、濃縮、干渉成分の不活性化、クロマトグラフィ、分離ステップ、および試薬の添加を伴うことができる。環境または食料生成アッセイの実施のために、生理液以外に、水、食料品、および同等物等の他の液体サンプルも、使用され得る。加えて、検体を含有することが既知である、またはそのように疑われる固体材料も、サンプルとして使用され得る。いくつかの事例では、検体を解放するために、固体サンプルを修正し、液体媒体を形成することも、有益であり得る。
【0030】
本明細書で使用されるように、用語「光」は、概して、光子として量子化可能である、電磁放射線を指す。本開示に関連するように、光は、紫外線（ＵＶ）から赤外線（ＩＲ）の範囲に及ぶ波長において伝搬し得る。本開示では、用語「光」は、可視領域内の電磁放射線に限定されることを意図していない。本開示では、用語「光」、「光子」、および「放射線」は、同義的に使用される。
【0031】
本明細書で使用されるように、「最適化された」は、「元の状態を超えて改良された」を意味し、（別様に記載されない限り）必ずしも、改良が最大限化されていることを意味するわけではない。
【0032】
本明細書で使用されるように、「漸進的改良」は、開始値とその改良との間の差異が、開始値の３０％以内である、開始値の２０％以内である、開始値の１０％以内である、または、好ましくは、開始値の５％以内である、より好ましくは、開始値の１％以内であることを意味する。
【0033】
上記において識別された課題のうちのいくつかに対する解決策が、試行されている。例えば、米国特許第７，８２５，３６０号（その全内容は、参照することによって組み込まれる）は、対物レンズとサンプルとの間の距離を変更するための集束機構と、カバーガラスの光学厚を検出するための光学厚検出ユニットと、光学厚検出ユニットによって検出されたカバーガラスの光学厚に基づいて、収差補正の量を計算するための動作ユニットと、動作ユニットによって計算された収差補正の量に基づいて、補正カラーを駆動するための駆動部ユニットと、対物レンズを通して通過するサンプルの画像を形成するための撮像センサとを含む、光学装置に関わる上記の課題のうちのあるものに対処した。
【0034】
（第‘３６０号特許から複製された）図１では、対物レンズ５が、ステージ１６上に搭載されたサンプルＳを観察するために、サンプルの下方に配置される。本対物レンズ５を保持するための、対物レンズ保持部材が、存在する。対物レンズ５は、駆動部ユニット１７によって、持ち上げられ、降下される。励起光源１２が、光源１２からの励起光を蛍光立方体１４を介して対物レンズ５および試料Ｓに指向するための、照明光学システム１３を具備する。蛍光立方体１４は、ダイクロイックミラーと、励起フィルタと、その内側における、蛍光フィルタとを備える。対物レンズ５を通して通過する、試料Ｓの観察光が、集光され、レンズ鏡筒６によって、ＣＣＤおよび同等物等の撮像デバイス１５上に画像を形成する。代替として、試料Ｓは、図１に示されていない、試料Ｓ上に光源の照明光を集光するための、透過性照明光源および透過性照明システムを使用して、上部から照明されることができる。
【0035】
サンプル保持部材、集束、および同等物を測定するために使用されるべき光源２から放出されるビームが、コリメートレンズ３を介してハーフミラー８上に、および対物レンズ５と蛍光立方体１４との間に配置されるダイクロイックミラー９上に反射され、対物レンズ５を介して試料Ｓを照明する。図１に示されるように、コリメートレンズ３とハーフミラー８との間に、対物レンズ５の瞳とほぼ共役して位置付けられる、遮蔽プレート４が、存在する。遮蔽プレート４は、光源２の光束を半分に制限するための境界として、コリメートレンズ３の光束の光軸を使用して、ビームの半分を遮蔽する。
【0036】
試料Ｓから戻された光源２の照明光が、対物レンズ５、ダイクロイックミラー９、およびハーフミラー８を介して、レンズ鏡筒６によって、２分割センサ７上に画像を形成するように集光される。光束の半分が、遮蔽プレート４によって遮蔽されるため、試料Ｓから戻された光は、光軸を中心として使用する、照明光と対称的な光学経路を通して通過し、２分割センサ７上に投影される。本場合には、２分割センサ７の分割方向および遮蔽プレート４の分割方向が、相互に関連して配置される。
【0037】
対物レンズ５は、補正カラー５Ａと、補正カラー５Ａを駆動するための補正カラー駆動部ユニット２５とを備える。対物レンズ識別ユニット、補正カラー駆動部ユニット２５、駆動部ユニット１７、撮像デバイス１５、および２分割センサ７が、動作デバイス２７に電気的に接続される。対物レンズ５は、（１）種々の収差が、カバーガラスの非均一な厚さに起因して際立って生じる、大きい開口数を伴う乾燥対物レンズ（補正の量は、０．１１ｍｍ～０．２３ｍｍである）、（２）その厚さが、最大で２ｍｍの非常に広い範囲内で広く異なる、ガラスペトリ皿または同等物を使用することが予測される、厚肉ガラスのための対物レンズ、または（３）その厚さが、最大で２ｍｍの非常に広い範囲内で広く異なる、プラスチックコンテナを使用することが予期される、プラスチックのための対物レンズであることができる。
【0038】
第‘３６０号特許内の一実施例において説明されるように、基準としてのカバーガラスの機械的厚さが、０．１７ｍｍに設定された。試料Ｓのカバーガラスの実際の機械的厚さが、０．１３ｍｍであった場合、これは、カバーガラスの屈折率（ｎｅ＝１．５２５５）によって０．１１１６６ｍｍの光学厚に転換された。基準厚０．１７ｍｍは、それぞれ、０．０８５３９ｍｍに転換された。本場合には、その光学差は、０．０２６２７になる（その機械的厚さは、０．０４４ｍｍになる）。光学厚を検出するためのサブフローにおいて、実際の試料Ｓの光学厚（機械的厚さ０．１３ｍｍ）が、計算され、補正カラーの駆動の量が、基準カバーガラス（Ｓ１－７）に対する光学厚の差異（機械的差異０．０４ｍｍ）に基づいて計算された。
【0039】
次いで、第‘３６０号特許において説明されているように、補正カラーが、厚さ差異０．０２６２７ｍｍ（機械的差異０．０４ｍｍ）に起因して引き起こされた収差を可能な限り多く補正するように補正カラーを駆動することによって、カバーガラスの実際の厚さと合致された。本瞬間に、サンプル１８と対物レンズ５との間の空間は、サンプル１８が集束された状態から逸脱している。補正カラーの駆動の量の計算は、対物レンズのタイプに応じて変動し、補正カラーの駆動の量は、対物レンズに対して特徴的である、補正カラー駆動計算データテーブルまたは関数によって計算される。対物レンズに対して特徴的である、補正カラー駆動計算データテーブルまたは関数は、動作デバイス２７内に記憶され、補正カラーの厚さ差異（機械的差異０．０４ｍｍ）および補正カラーの駆動の量は、特徴的な補正カラー駆動計算データテーブルまたは関数によって計算される。
【0040】
第‘３６０号特許において説明されているように、対物レンズ５の収差が、補正カラーを移動させることによって変更され、移動量が、使用されている対物レンズに対して特徴的であろう、収差補正計算データテーブルまたは関数によって計算された。本収差補正計算データテーブルまたは関数は、動作デバイス２７内に記憶され、焦点位置の補正の量が、補正カラーの厚さ差異（機械的差異０．０４ｍｍ）および収差補正計算データテーブルまたは関数によって計算された。
【0041】
別の提示済みの解決策として、米国特許第１０，３１７，６５８号（その全内容は、参照することによって組み込まれる）は、それぞれが少なくとも、試料から観察光を集光するように構成される、光学システムを有する、１つまたはそれを上回る対物レンズと、１つまたはそれを上回る対物レンズのそれぞれの上に提供され、１つまたはそれを上回る対物レンズのそれぞれを中心として回転させることによって光学システムの光軸の方向において光学システムを移動させ、収差を補正するように構成される、補正カラーと、１つまたはそれを上回る対物レンズの位置を切り替えるための切替ユニットと、集束ユニットとを含む、顕微鏡を説明する。第‘３６０号特許と同様に、第‘６５８号特許における補正カラーの動作も、試料Ｓが設置または格納されたスライドガラスまたは培養物コンテナの厚さに従って、収差（または球面収差）を補正する。
【0042】
さらに別の提案済みの解決策では、米国特許第９，３８３，５６７号（その全内容は、参照することによって組み込まれる）は、回転可能な補正カラーを具備する、対物レンズユニットを説明する。第‘５６７号特許では、対物レンズ４１は、対物レンズの側面の円周方向に沿って、非均一な形状を具備していた。補正カラーは、回転に応じて、レンズ群（光学システム）を光軸の方向に移動させる。第‘５６７号特許内の補正カラーの本動作によって、収差（球面収差）は、試料Ｓをその上に搭載させるように、スライドガラスの厚さに従って、または試料Ｓをその中に格納させるように、栽培容器の厚さに従って補正されることができる。
【0043】
なおも別の提案済みの解決策では、米国特許第８，０５３，７１１号（その全内容は、参照することによって組み込まれる）は、複数の対物レンズのうちの少なくとも１つが球面収差カラーを有する、複数の対物レンズを含む、球面収差調節システムを説明する。対物レンズは、対物レンズ保持器上に搭載され、対物レンズ保持器は、複数の対物レンズのうちの１つを撮像位置に設置した。第‘７１１号特許における駆動機構が、機械的リンクによって１つの対物レンズに結合され、機械的リンクは、運動を駆動機構から球面収差カラーに伝達するように構成された。第‘７１１号特許における制御システムは、撮像位置にある１つの対物レンズの球面収差カラーを具体的な球面収差調節設定に移動させるように駆動機構を操作するように構成された。第‘７１１号特許では、駆動機構は、サンプル保持器の厚さに基づいて、複数の対物レンズの球面収差カラーを移動させた。
【0044】
第‘７１１号特許において説明されているように、球面収差補正システムが、２つのモード、すなわち、プロトコル駆動および手動のうちの一方において動作した。プロトコル駆動モードにおいて、個別の対物レンズの球面収差カラーが、サンプル保持器の厚さまたはサンプル保持器の結果として生じる厚さおよびプロトコル内に記録されたサンプルの媒体の深度に関連する、球面収差ソフトウェアプログラム内のプロトコルに基づいて、球面収差補正システムによって自動的に調節された。例えば、試料保持器が、０．２ｍｍの厚さを有していた場合、対物レンズの球面収差カラーのうちの少なくとも１つが、０．２ｍｍの球面収差設定に調節された。動作の手動モードでは、対物レンズの球面収差補正カラーが、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）を介して選択される、ユーザ定義設定に調節された。例えば、ユーザは、コンピュータ上に記憶された球面収差グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）を使用し、球面収差カラーのうちの少なくとも１つを、０．２ｍｍであるサンプル保持器１２１の厚さに基づく、０．２ｍｍ等の球面収差調節設定値に調節するであろう。
【0045】
故に、基板厚変動の変動に起因する収差補正のためのあるタイプの補償機構が、当技術分野において提案されているが、これらの補償機構は、多くの場合、補償を提供するために、複雑な光学系、ユーザ相互作用、および光学コンポーネントの平行移動を要求する。したがって、本明細書に説明される技術は、概して、光学顕微鏡検査撮像における誤差を補償するための改良された方法、装置、およびシステムに関する。
【0046】
一実施形態では、本技術は、図２に示されるシステム等の反転された顕微鏡構成である、光学システムを対象とする。しかしながら、本技術の一般的教示は、（下記に説明されるように）反転されていない顕微鏡構成にも同様に適用可能である。反転された顕微鏡構成に関して、画質が、顕微鏡対物レンズの意図された設計とのカバースリップ厚の不整合に起因して劣化することが公知である。より具体的には、カバースリップの厚さ（または異なる側方位置におけるカバースリップの厚さの変動）のため、取得される画像は、カバースリップ材料と撮像されるべきサンプル（またはサンプルを保持する媒体）との間の屈折率の差によって歪曲され得る。背景技術において記載されるように、カバースリップ材料とサンプルとの間のこれらの屈折率の差に起因する画質の歪曲は、多くの場合、より多くの光を集光し、より明るい画像を提供するために使用され、多くの場合、側方および軸方向の両方におけるより高い空間分解能のために使用される、より高い開口数（ＮＡ）システムに関して、より顕著である。上記に議論されるように、顕微鏡対物レンズ補正カラーは、従来、光学経路内のカバースリップの存在に起因する、画像内の球面収差を変化させ、可能性として補正するために使用されている。しかしながら、本プロセスは、冗漫であり、多くの場合、ユーザ相互作用を伴い、ある場合には、サンプル画像を満足の行くようには補正しない。実際には、顕微鏡対物レンズの意図された計画と比較したカバースリップに関する厚さの変動不整合は、多くの場合、利用可能なサンプル消耗品および対物レンズの組み合わせを制限し、これは、分解能および信号の満足の行かない損失をもたらし得る。
【0047】
本技術は、非最適な条件から撮影された画像が、画像分析のために十分な光学品質の回復を伴って処理され、それによって、捕捉されている全ての画像のためのユーザ相互作用および補正カラー調節の必要性（およびそれと関連付けられる時間損失）を回避することを可能にする、以下の例証的実施形態を通して、これらの問題に対処する。実際には、本技術の一実施形態では、（投影される点光源が、サンプル画像の逆畳み込みのための許容可能な点広がり関数を取得するために使用される、下記により詳細に説明される）本発明の手順は、特に、開口数値が０．６５～０．９５またはより高い値の範囲に及ぶ、高開口数システムに適用可能であり、ユーザ相互作用および補正カラー調節の必要性を伴うことなく、画像分析のための十分な光学品質が取得されることを可能にする。
【0048】
図２は、本技術の光学システム２００の種々の実施形態を描写する、図である。システム２００は、顕微鏡システムのための対物レンズ２０２と、光学検出器２０４と、光源２０６と、第１の撮像レンズ２０８と、ビーム分割器２１０と、第２の撮像レンズ２４０と、開口２３０（例えば、光軸Ｚからオフセットされた開口）とを含む。対物レンズ２０２は、サンプルウェル２１４の中に堆積され得るサンプルに対する撮像および／または光学測定を実施するように構成される。顕微鏡システムの他のコンポーネントは、基準表面２１２ａ、２１２ｂを伴うサンプルカバースリップ２１２を支持する、サンプルステージ２１６等の任意のサンプル保持構造を含む。（図２上でステージ２１６の下方の二重矢印によって示されるような）サンプルステージ２１６は、撮像のための定位置に、サンプルカバースリップ２１２または較正カバースリップ２５０のいずれも移動させることができる。
【0049】
図２のシステム２００は、顕微鏡システムのモジュールまたはサブシステムとして実装されることができる。例えば、励起光源、フィルタ、ビーム分割器、およびサンプル画像捕捉デバイス等、顕微鏡システム２００がサンプルを撮像するために使用する他のコンポーネントが、図２に、サンプル撮像コンポーネント２２１として表される。サンプル撮像コンポーネント２２１は、例えば、顕微鏡システムがサンプルを撮像するために使用されるときの、対物レンズ２０２と、サンプルカバースリップ２１２とを含む、光学経路を形成する、レンズ、フィルタ、または他の光学デバイスを含んでもよい。顕微鏡システム２００はまた、実施されている撮像または測定のタイプに基づいて、異なる光源または異なるサンプル画像捕捉デバイスを使用してもよい。光学デバイスは、図２の対物レンズの下方に、ビーム分割器２１０の上方の２２１ａにおいて、または偏心開口２３０の上方の２２１ｂにおいて挿入されてもよい。図２Ａに示される実施例内のサンプルウェル２１４は、自動焦点手順のための底部基準表面２１２ａと、上部基準表面２１２ｂとを提供する、サンプルカバースリップ２１２上に形成される。
【0050】
最良焦点位置の自己較正が、所与の対物レンズ２０２に関して実施されることができる。その後、後続の撮像または光学測定においてその対物レンズ２０２を集束させるプロセスが、最小限のさらなる撮像を用いて実施されてもよい。最良焦点位置の較正は、基準較正勾配として記憶されてもよく、これは、システムデータ記憶システム２２３内に、対物レンズ２０２を特性評価するデータとともに記憶される、または含まれてもよい。
【0051】
第１の撮像レンズ２０８は、光源２０６から、光学経路２０１に沿って光をコリメートし、コリメート光をビーム分割器２１０に渡す。ビーム分割器２１０は、光の一部を、光学経路２０３に沿って対物レンズ２０２に向かって、かつ光学経路２０５上のサンプルカバースリップ２１２に向かって反射する。サンプルカバースリップ２１２は、光を、対物レンズ２０２に戻るように、かつ光学経路２０７上のビーム分割器２１０に向かって反射する。ビーム分割器２１０は、光の一部を、光学経路２０９に沿って、偏心開口２３０に向かって渡す。開口２３０上の心外開口部を通して通過する光は、開口２３０上に衝突する全光ビームより小さい。開口２３０の残りの部分が、開口を通して通過されていない光ビームの一部を遮る。開口２３０を通して通過する光は、第２の撮像レンズ２４０および光学検出器２０４に指向される。偏心開口２３０は、対物レンズ２０２から波面の一部をサンプリングすることによって動作する。光のサンプリングされた部分は、第２の撮像レンズ２４０によって集束され、検出器に向かって指向されるが、偏心開口によって、非対称的な周辺光線として拘束される。これは、コンポーネント設定のいかなるものも変更することなく、光および最良焦点の位置を視認することを可能にする。異なるサイズおよび／または位置を有する、異なる偏心開口が、感受性の調節または対物レンズ２０２の異なるサイズの瞳直径を可能にするために使用され得ることを理解されたい。また、偏心開口がまた、第１の撮像レンズ２０８とビーム分割器２１０との間に設置され得ることも理解されたい。本構成では、検出側は、偏心開口２３０を必要としない。ここでは、同一の原理が、作用し、すなわち、偏心開口によって対物レンズ２０２の瞳の縁において非対称にサンプリングされている、軸上ビームが、存在し、対物レンズが最良焦点から離れるように移動しているときに、投影された源の画像を平行移動させ、ぼかすことによって顕微鏡対物レンズの脱集束に対して応答する、より小さい撮像レンズ２４０に当たる、軸外ビームを形成する。一実施形態では、偏心開口は、（機械的または光学的に）切替可能であり、これは、精度を向上させることができる。一実施形態では、開口は、投影される源撮像システムを通した結合効率の向上に起因して、より多くの光を用いたビームプロファイリングを可能にするように移動されることができる。
【0052】
図２に示される光学経路２０１、２０３、２０５、２０７、および２０９が、光学検出器２０４上に衝突する光ビームを形成する、光学経路に沿った光のみを示すことに留意されたい。示されていない光の部分が、開口２３０の遮断部分によって遮られる、光の部分である。
【0053】
対物レンズ２０２は、それに沿ってサンプルカバースリップ２１２が延在するｘ－ｙ平面に対して直角である、（図２に示される）ｚ軸上の光学経路２０３および２０５に沿って移動するように構成される。下記の説明は、明確性を提供する方法として、対物レンズの位置をｚ軸上にあるものとして参照し、基準画像の位置、または側方位置を、ｘ－ｙ平面上にあるものとして参照する。空間呼称を提供するための「ｘ軸」、「ｚ軸」、または「ｙ軸」の使用が、限定的であることを意図していないことを理解されたい。任意の好適な座標系が、使用されてもよい。さらに、例示的実装が、非垂直方向において進行する、対物レンズ２０２を伴い得ることに留意されたい。
【0054】
サンプルカバースリップ２１２は、図２に示されるように、顕微鏡システムの正常な機能および動作に従ってその中に堆積され得るサンプルを撮像するために位置付けられ得る、サンプルウェル２１４を含んでもよい。図２に示される例示的システムでは、サンプルカバースリップ２１２は、第１の表面２１２ａと、第２の表面２１２ｂとを有し、これは、サンプルウェルの底部表面として見なされることができる。第１の表面２１２ａおよび／または第２の表面２１２ｂは、少なくとも部分反射性であり、それによって、自動焦点手順の間に使用するため、または（下記に詳細に説明される）対物レンズ２０２の焦点面におけるサンプルの表面２１２ｂを用いた検査画像のために使用するための反射性表面を提供してもよい。反射性表面はまた、カバースリップ上、またはスライドの表面、またはサンプルウェル２１４の底部表面に近接する光学経路内に配置される他の平面状材料の上に提供されてもよい。
【0055】
対物レンズ２０２は、コントローラ２２０によって制御される線形作動モータを使用して、ｚ軸に沿って移動されてもよい。対物レンズ２０２は、図２に、対物レンズ２０２を移動させる線形作動モータを含むものとして、図式的に表される。対物レンズ２０２は、光源２０６からの光をサンプルステージ２１６によって保持される、サンプルカバースリップ２１２上のサンプルＳの上に集束させるように構成される、選択された光学系を含み、それによって、顕微鏡システム２００が、サンプルＳの画像を撮影することができる。自動焦点手順の間に、対物レンズ２０２は、表面２１２ａまたは２１２ｂ上に集束するように制御される。いくつかの実装では、対物レンズ２０２を移動させるモータは、線形アクチュエータを伴うステッパモータまたはサーボモータであってもよい。
【0056】
偏心開口２３０を通して通過する光学経路に沿った光は、第２の撮像レンズ２４０を通して、投影された源が検出器平面上で撮像される、光学検出器２０４まで進行する。脱集束されると、光学検出器２０４上の光ビームは、サイズが広がり、その位置を光学検出器２０４上で平行移動させ、より低い強度および／または低コントラストを有する。対物レンズ２０２が、集束されているとき、画像は、最大強度、最小サイズ、およびその最高コントラストにおいて捕捉される。対物レンズ２０２を集束させるプロセスは、対物レンズ２０２を移動させ、ｚ軸上の最良焦点位置を見出すステップを伴う。各対物レンズ２０２のｚ位置において捕捉される各画像内の各ビームスポットは、前の画像上のスポット位置からオフセットされる、画像面内のある位置上に出現する。
【0057】
例示的実装では、自動集束システム２００内の光学検出器２０４は、対物レンズ２０２が、一連のｚ位置に移動するように制御されるにつれて、基準画像の画像を捕捉するようにコントローラ２２０によって制御され得る、線形アレイ検出器、電荷結合素子、位置感受性ダイオード、画像捕捉デバイスのような２Ｄセンサアレイ、または任意の好適なデバイスであってもよい。自動集束システム２００内の光源２０６は、レーザ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、またはＬＥＤアレイ、白色光、蛍光光源、赤外光、または同等物等の任意の好適な発光デバイスであってもよい。
【0058】
コントローラ２２０は、少なくとも、光学検出器２０４、および対物レンズ２０２を移動させるように構成されるモータに接続される、ハードウェアインターフェースを有する、任意のコンピュータプログラマブルシステムを使用して実装されてもよい。いくつかの実装では、コントローラ２２０はまた、対物レンズが自動集束されている顕微鏡システム２２１のコンポーネントであってもよい。自動集束手順は、コントローラ２２０がアクセスを有するデータ記憶媒体２２３内にソフトウェアとして記憶される、機能であってもよい。
【0059】
図２に図示されるように、サンプルカバースリップ２１２の下方に配置された対物レンズ２０２は、透明なカバースリップを通してサンプルＳを撮像する。サンプルＳは、サンプルカバースリップ２１２の上／上方に配置される。対物レンズ２０２のための画像焦点面２０２ａが、図２に、サンプルＳが常駐する上部基準表面２１２ｂと一致した状態で示される。サンプルカバースリップ２１２は、消耗品基板（例えば、マイクロタイタプレート上の透明なプラスチック底部）であることができる。図２に示されるサンプルウェル２１４は、示されるような単一のウェルであることができる、または、それぞれが撮像されるべきサンプルを保持する底部を有する、複数のウェルを表すことができる。光学システムはまた、サンプルカバースリップ２１２に代わるように移動され得る、較正カバースリップ２５０も利用する。
【0060】
一実施形態では、図２に図示されるように、光源２０６は、例えば、（検査画像を生成するために）狭小光ビームをサンプルカバースリップ２１２の上に投影するために使用される、レーザ、または発光ダイオードまたは白色光または蛍光灯またはタングステンハロゲンランプ等の他の光源であることができ、（基準画像を生成するために）定位置にあるとき、狭小光ビームを較正カバースリップ２５０の上に投影するために使用されることができる。第１の撮像レンズ２０８は、レーザビームをビーム分割器２１０上に指向し、これは、そのレーザビームを対物レンズ２０２を通してサンプルカバースリップ２１２上に指向し、そのレーザ光は、表面２１２ａを通して通過し、次いで、サンプルカバースリップ２１２の内部（ウェル）側において表面２１２ｂに遭遇する。表面２１２ｂに到達しているレーザ光は、サンプルカバースリップ２１２を通して後方に反射され、対物レンズ２０２および第２の撮像レンズ２４０を通して光学検出器２０４の結像面２０４ａ上に結像される。光源２０６は、図２において単一の器具として示されるが、これは、必要とされる特定の結像のために、それぞれ、コントローラ２２０によって必要に応じて制御されている、上記に説明されるもの等の複数の発光デバイスを備えることができる。
【0061】
一実施形態では、検査画像および基準画像を捕捉するときに、レーザまたはＬＥＤ（または別の狭小光ビーム源）が、露光のために使用され得る。一実施形態では、サンプル画像を捕捉するときに、白色光、蛍光光源、赤外光、または同等物が、露光のために使用され得る。一実施形態では、レーザまたはＬＥＤ等の狭スペクトル波長光が、サンプルの蛍光発光を励起するために使用され得る、またはサンプルから後方散乱された光を捕捉するために使用され得る。
【0062】
本技術の一実施形態では、開口２３０が、第２の撮像レンズ２４０を通して光学検出器２０４の結像面２０４ａまで通過する、画像光の部分を選択する。本技術の一実施形態では、開口２３０は、選択される光が、球面収差が最も重度である対物レンズ２０２の周（または縁）領域を通して通過している光であるように、光軸からオフセットされて配置される。本技術の一実施形態では、自動焦点が、対物レンズ２０２、または第１の撮像レンズ２０８、または第２の撮像レンズ２４０、またはサンプルカバースリップ２１２、または較正カバースリップ２５０のいずれかを位置付けるステップにおいて使用され、定位置にあるサンプルカバースリップ２１２を用いて撮影される検査画像の代わりに、またはそのために較正カバースリップ２５０を用いて撮影される基準画像のための最も鮮明な画像を生成する。取得された画像は、例えば、コントローラ２２０のプロセッサ２２０ａまたはコントローラ２２０と通信する任意の他のプロセッサにおいて行われる後続の処理のために、コントローラ２２０の記憶装置２２３内に記憶されることができる。プロセッサ２２０ａおよび記憶装置２２３は、図２においてコントローラ２２０のモジュールとして示されるが、プロセッサ２２０ａおよび記憶装置２２３のうちのいずれも、コントローラ２２０から遠隔に位置し、必要に応じてコントローラ２２０と通信し、それらの間でデータおよび処理結果および命令を交換することができる。（図２に示されるような）補正カラー２５２が、画質の改良を補助するために使用されてもよい。
【0063】
サンプルカバースリップ２１２が、光学経路内に存在するとき、一実施形態では、集束レーザビーム（または他の集束光）が、サンプル基板の上部表面から（例えば、サンプルカバースリップ２１２の表面２１２ｂから）反射され、結像面２０４ａ上に結像され、使用中の特定のカバースリップと関連付けられる検査画像を取得する。本実施形態では、対物レンズ２０２のための画像焦点面２０２ａは、サンプルカバースリップ２１２の上部基準表面２１２ｂと一致している。サンプル基板の表面からの自動集束された反射光は、単点の反射光と見なされることができる。
【0064】
同様に、較正カバースリップ２５０が、（サンプルカバースリップ２１２の代わりに）光学経路内に存在するとき、一実施形態では、集束レーザビーム（または他の集束光）が、較正カバースリップ２５０の上部表面から（例えば、必ずしもサンプルを保持しているわけではない、均一な厚さのスライドガラスの上部から）反射され、光学検出器２０４の結像面２０４ａ上に結像され、基準画像を取得する。本実施形態では、対物レンズ２０２のための画像焦点面２０２ａは、較正カバースリップ２５０の上部表面と一致している。
【0065】
図２に図示される構成を用いると、サンプルカバースリップ２１２を用いて撮影された検査画像および較正カバースリップ２５０を用いて撮影された基準画像は両方とも、例えば、プロセッサ２２０ａ内での後続の処理のために、コントローラ２２０の記憶装置２２３内に取得および記憶されることができる。本技術の一実施形態では、サンプルカバースリップ２１２から後方反射された光を用いて撮影された検査画像および較正カバースリップ２５０を通して後方反射された光を用いて撮影された画像は、（上記に詳述されるように）単点の反射光のみを用いて作製される必要はない。複数の画像点が、サンプルカバースリップ２１２および／または較正カバースリップ２５０に指向され得る。言い換えると、画像点のアレイが、使用され得、これは、事実上、対物レンズ２０２から伝搬する光の光波面を光学検出器２０４の結像面に向かってマップするであろう。
【0066】
さらに、一実施形態では、サンプルカバースリップ２１２および／または較正カバースリップ２５０の上部表面から反射する光は、線画像（または他の明確に定義される形状）であり得る。そのような線画像は、（事実上）サンプルカバースリップ２１２および／または較正カバースリップ２５０の側方向を横断したＰＳＦの査定を可能にするであろう。
【0067】
本技術の一実施形態では、上記に記載されるように、開口２３０が、サンプルカバースリップ２１２および／または較正カバースリップ２５０のための焦点に及ぼす球面収差の影響をより良好に査定するために軸外に設定され、球面収差の影響は、典型的には、光がレンズシステム内の瞳の縁に近接して通過するほど、より大きくなる。それにもかかわらず、本技術の一実施形態では、開口２３０は、光路２０１、２０３、２０５、２０７、および２０９内で軸上または他の位置に設定され得る。本技術の一実施形態では、開口２３０の軸外位置を変更することは、対物レンズ２０２から光学検出器２０４の結像面に向かって伝搬する光の光波面の照会を可能にする。開口の位置、サイズ、および形状は、逆畳み込みのための撮像システムおよびＰＳＦの特殊性に固有であり得る。最も単純な開口は、十分な光レベルにおいて対物レンズから周辺光線束を透過するために十分に大きい単一の偏心円であり得る。しかしながら、単一の非対称的な開口は、光レベルを減少させ得、測定された検査またはサンプル画像に偏りをもたらし得るが、必要とされるときに、光ビームの反対側の開口、一連の開口、環状リング、または同等物を追加することによって、補償され得る。
【0068】
理論的には、球面収差および／または脱集束等のいかなる誤差もない場合、（定位置にあるときに）較正カバースリップ２５０の上部表面から後方反射された光の画像は、理想的な点広がり関数に類似しているはずである。理想的な点広がり関数からのいかなる逸脱も、光学画像をぼかすであろう、光学システム内の誤差を表すであろう。
【0069】
一実施形態では、コントローラ２２０のプロセッサ２２０ａは、サンプルカバースリップ２１２の表面２１２ｂから反射された光から撮影された検査画像の画像を改良するために必要とされる計算された点広がり関数（ＰＳＦｃ）を決定するために、初期の点広がり関数（ＰＳＦｉ）として較正カバースリップ２５０から撮影された基準画像を使用して、逆畳み込み（例えば、ブラインド逆畳み込み）を実施するように構成される。一般に、ブラインド逆畳み込みは、単一の「ぼけた」画像またはそのセットからの「オリジナル画像」の回復を可能にする、逆畳み込み技法であり、これは、必ずしも画像またはＰＳＦのいかなる先行知識も前提としているわけではない。通常の線形逆畳み込み技法および非線形逆畳み込み技法は、オリジナル（ぼけていない）画像を回復させるために、公知のＰＳＦを利用し得るが、ブラインド逆畳み込みに関して、ＰＳＦは、画像から推定され、逆畳み込みが実施されることを可能にする。ここでは、本技術では、上記に記載されるように、較正カバースリップ２５０から反射された光を用いて撮影された基準画像が、サンプルＳから光学検出器２０４の結像面２０４ａまでの光路内に対物レンズ２０２と、サンプルカバースリップ２１２と、他の光学コンポーネントとを含む、光学システムの初期の（または推定された）点広がり関数（ＰＳＦｉ）として使用される。一実施形態では、本技術の逆畳み込み技法は、反復的に実施されることができ、それによって、逆畳み込みのために使用されるアルゴリズムの各反復が、光学システムの計算されるＰＳＦｃの推定値を改良する。代替として、本技術において使用される逆畳み込み技法は、非反復的に実施されてもよく、その場合、逆畳み込みのために使用されるアルゴリズムの１つのアプリケーションは、光学システムの計算されるＰＳＦｃの良好な推定値を正常に提供する。
【0070】
１つの逆畳み込みプロセスが、以下の方程式（１）によって図示される。
式中、ｆは、オリジナルの歪曲されていない画像であり、ｇは、歪曲されたノイズの多い画像であり、ｈは、本システムのＰＳＦであり、
は、畳み込み演算子であり、ｎは、任意の破損ノイズである。
【化1】
【化2】
【0071】
ＰＳＦを回復させるための双方向Ｌｕｃｙ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ復元アルゴリズムが、下記に方程式（２）において示される。
【化3】
【0072】
式中、
は、ｋ回の反復の後のｆ（オリジナル画像）の推定値であり、＊は、相関演算子であり、
は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ－Ｌｕｃｙ（Ｒ－Ｌ）関数と呼ばれる。画像
は、ぼかし除去された画像と称される。本技術における逆畳み込みのためのこれらおよび他の好適な画像処理技法は、Ｄａｖｉｄ Ｓ． Ｃ． Ｂｉｇｇｓ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ａｎｄｒｅｗｓによって、ＡＰＰＬＩＥＤ ＯＰＴＩＣＳ， ｖｏｌ． ３６， ｎｏ． ８， Ｍａｒｃｈ １０， １９９７， ｐｐ． １７６６－１７５５内の「Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｉｍａｇｅ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ」（その全内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる）において説明されており、Ｓａｇｅ ｅｔ ａｌ．によって、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌ． １１５， Ｆｅｂｒｕａｒｙ １５， ２０１７， ｐｐ． ２８－４１内の「ＤｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎＬａｂ２： Ａｎ ｏｐｅｎ－ｓｏｕｒｃｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」（その全内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる）において説明されている。本技術のために使用され得る商業用画像逆畳み込みソフトウェアは、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（１７００ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｐｉｋｅ， Ｓｕｉｔｅ ２４０ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡ ２０８５２）、Ｍａｔｌａｂ（登録商標）（１ Ａｐｐｌｅ Ｈｉｌｌ Ｄｒｉｖｅ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ ０１７６０－２０９８）製のＲ２０１８ａ（バージョン９．４．８１３６５４）、および他のもの等の企業から入手可能である。
【化4】
【化5】
【化6】
【0073】
ここで、一実施形態では、コントローラ２２０のプロセッサ２２０ａが、方程式（１）および（２）において、光源２０６から投影および集束され、較正カバースリップ２５０の上部表面から反射された光を用いて撮影された、基準画像をｈ（光学システムの初期のＰＳＦｉ）として使用するように構成され、光源２０６から投影および集束され、サンプルカバースリップ２１２の上部表面から反射された光を用いて撮影された検査画像をｇ（歪曲されたノイズの多い画像）として使用するように構成される。方程式（２）を使用した反復が、光学的不完全性によってぼかされていない場合には、オリジナル画像の推定値
を生成するために、必要に応じて継続するであろう。本逆畳み込みプロセスの反復の間に、検査画像の品質は、例えば、そのスポットの形状、サイズ、強度、および／または場所が、最適になる（および／または基準画像に類似する）まで、または逆畳み込み
の差異が、実質的なものにならなくなるまで改善するはずである。いったん畳み込みのための許容可能な基準が、充足されると、例えば、方程式（２）のものによる逆畳み込みのためのパラメータおよび算出設定が、記憶装置２２３内に記憶され、プロセッサ２２０ａが、ここで、サンプルカバースリップ２１２上のサンプルＳから撮影されたサンプル画像の全てのピクセルを処理し、逆畳み込みを通して到達された、計算されたＰＳＦｃを用いて最適な画像を生成することができる。
【化7】
【化8】
【0074】
故に、図２に図示される構成を用いると、光学撮像システムであって、（本実施形態では）対物レンズ２０２と、ａ）サンプルＳを保持するためのサンプルカバースリップ２１２またはｂ）較正カバースリップ２５０の上部表面を対物レンズ２０２の焦点面２０２ａに位置付けるように構成される、サンプルステージ２１６と、少なくともａ）サンプルカバースリップ２１２上のサンプルのサンプル画像、ｂ）対物レンズ２０２の焦点面２０２ａから較正カバースリップ２５０を通して後方反射される光からの基準画像、およびｃ）対物レンズ２０２の焦点面２０２ａからサンプルカバースリップ２１２を通して後方反射される光からの検査画像を捕捉するように構成される、光学検出器２０４と、基準画像から基準画像データを取り出し、検査画像から検査画像データを取り出し、対物レンズおよびカバースリップに関する初期の点広がり関数として、基準画像データを使用して、検査画像データを逆畳み込みし、検査画像データの少なくとも１つの逆畳み込みを通して、対物レンズと、サンプルカバースリップを含む、使用中の他の光学コンポーネントとのための計算された点広がり関数と関連付けられる、逆畳み込みされた試験画像を生成し、検査画像データの逆畳み込みから計算された点広がり関数を使用して、サンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減させる（または排除する）ようにプログラムされる、プロセッサ２２０ａとを備える、光学撮像システムが、提供される。
【0075】
本技術の一実施形態では、ブラインド逆畳み込みによる計算されたＰＳＦｃの決定が、各ウェルからサンプル画像データを撮影する工程の間に行われてもよい。同様に、計算されたＰＳＦｃの決定はまた、画像（サンプル画像データ）が記憶された後に行われてもよい。
【0076】
本技術の一実施形態では、検査画像は、事前決定された数の使用中のウェルまたはプレートにわたって収集され、ウェル毎の個別のブラインド逆畳み込みのための設定が、各ウェルからのサンプル画像の後の処理のために記憶される。ウェル毎の計算されたＰＳＦｃの決定は、各ウェルからの基準画像を初期のＰＳＦｉとして使用し、サンプル画像データの後続の逆畳み込みのための各ウェルの計算されたＰＳＦｃに到達するために、ブラインド逆畳み込み等の逆畳み込みを実施してもよい。
【0077】
故に、本技術の一実施形態では、コントローラ２２０の制御下で、光学検出器２０４が、サンプルカバースリップからの複数のサンプル画像を（異なる側方位置において）捕捉する。コントローラ２２０の制御下で、光学検出器２０４は、較正カバースリップからの複数の較正された基準画像を（異なる側方位置において）捕捉する。コントローラ２２０の制御下で、光学検出器２０４は、対物レンズの焦点面からサンプルカバースリップを通して後方反射される光からの複数の検査画像を（異なる側方位置において）捕捉する。プロセッサ２２０ａは、側方位置毎に、個別の計算された点広がり関数と関連付けられる、個別の逆畳み込みされた検査画像を生成し、次いで、側方位置毎に、個別の計算された点広がり関数を使用して、複数のサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、複数のサンプル画像からのアーチファクトを低減または除去する。
【0078】
本技術の一実施形態では、プロセッサ２２０ａは、計算されたＰＳＦｃが、所与の数のウェルに関して、ウェル間の分散が計算されたＰＳＦｃ内にあることを示すことを決定し得るが、ありとあらゆるウェルに関して検査画像のブラインド逆畳み込みを実施することを保証しない。代わりに、マルチウェルサンプル保持器に関する単一の推定された点広がり関数（ＰＳＦｅ）が、ウェル毎にサンプル画像データを処理するための、計算されたＰＳＦｃとして使用されることができる。故に、本技術の一実施形態では、撮像されているウェル毎に、方程式（１）および（２）を参照して上記に説明される反復的な分析を厳密に使用することは、必要ではない場合がある。さらに、本技術の逆畳み込み技法は、サンプル画像内の各ピクセルに適用され得るため、処理された画像は、Ｘ－Ｚ平面内の強度を描写するために提示されることができる。
【0079】
本技術の一実施形態では、コントローラ２２０の制御下で、光学検出器２０４が、（異なるサンプルカバースリップから）複数のサンプル画像を捕捉する。コントローラ２２０の制御下で、光学検出器２０４は、（複数の較正カバースリップから）複数の較正された基準画像を捕捉する。コントローラ２２０の制御下で、光学検出器２０４は、（異なるサンプルカバースリップから）異なるサンプルカバースリップを通して後方反射される光から、複数の検査画像を捕捉する。プロセッサ２２０ａは、サンプルカバースリップ毎に、個別の計算された点広がり関数と関連付けられる、個別の逆畳み込みされた検査画像を生成し、次いで、カバースリップ毎に、個別の計算された点広がり関数を使用して、複数のサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、複数のサンプル画像からのアーチファクトを低減または除去する。
【0080】
また、上記に議論される逆畳み込みは、本技術のために好適であるが、他の画像処理技法もまた、本技術において使用されることができる。一実施形態では、プロセッサ２２０ａが、サンプルカバースリップの特定のセットと関連付けられる、記憶された点広がり関数（ＰＳＦｓ）を使用して逆畳み込みを実施するように構成され、ここでは、サンプルカバースリップのその特定のセット（および使用中の光学系）のためのＰＳＦｓが、すでに決定されている。別の実施形態では、サンプルウェルセット（および使用中の光学系）毎の個々のＰＳＦｓが、プロセッサ２２０ａが、ウェル（および使用中の光学系）毎に、記憶されたＰＳＦｓを使用して逆畳み込みを実施することを可能にすることがすでに決定されている場合がある。これらの記憶されたＰＳＦｓを用いると、線形逆畳み込み技法および非線形逆畳み込み技法が、次いで、ブラインド逆畳み込み反復の必要性を伴うことなく、サンプル画像データからオリジナル画像を回復することが可能になり得る。
【0081】
利用される逆畳み込み技法にかかわらず、一実施形態では、プロセッサ２２０ａは、逆畳み込みの後に達成される逆畳み込みされた画像の向上を示す、品質メトリックを計算するように構成される。品質メトリックは、回復された画像内のピクセルの分解能の全幅半値（ＦＷＨＭ）改良の尺度であることができる。品質メトリックは、回復された画像内のピクセルの信号対ノイズ比改良の尺度であることができる。品質メトリックは、回復された画像内のピクセルの信号強度改良の尺度であることができる。一実施形態では、プロセッサは、計算された点広がり関数に関して、逆畳み込みされた画像内の改良が漸進的改良になるまで、検査画像の繰り返される逆畳み込み、およびａ）検査画像の逆畳み込みされた画像とｂ）較正された基準画像の繰り返される比較によって、サンプル画像の画質を改良するための最適化された点広がり関数を決定するようにプログラムされる。
【0082】
本技術の一実施形態では、１つまたは複数のメトリックが、逆畳み込みされた画像と関連付けられる、単一のメリット値を発生させるために使用され得る。メトリックはそれぞれ、許容可能な特徴のサイズ、形状、位置、強度勾配、ピーク強度値、または相互相関に関する基準セットを有するであろう。
【0083】
本技術の一実施形態では、光源２０６から投影および集束され、較正カバースリップ２５０の上部表面から反射された光が、基準画像を表す単一のスポット画像として撮像され得るため、較正カバースリップ２５０からの反射光が、初期の点広がり関数ＰＳＦｉを取得するために利用される。ＰＳＦｉは、検査画像の逆畳み込みを用いて、検査画像のためのサンプル表面カバースリップ２１２の上部表面２１２ｂに集束された、反射光に適用され、次いで、一実施形態では、発散メトリックにペナルティを課すように加重を割り当てられている各メトリックを用いて、上記に記載されるもの等の複数の方法において、基準画像と比較されることができる。
【0084】
言い換えると、メリット関数の品質スコアは、較正カバースリップ２５０から撮影された基準画像と逆畳み込みされた検査画像を比較するための、スポットサイズ、スポット形態、スポット強度、スポット場所、スポット勾配、および相互相関等の種々のメトリックの加重和であり、より良好な品質スコアが、次いで、サンプル画像を逆畳み込みするために使用されるべき、最適化された、計算されたＰＳＦｃと関連付けられることができる。連続する逆畳み込みが、理想的には、較正された基準画像から事前設定された割合差内またはメリット関数の事前設定された割合差変化内である、最終計算されたＰＳＦｃを形成するために使用されることができる。
【0085】
一実施形態では、プロセッサ２２０ａは、検査画像の連続する逆畳み込みの後に、漸進的にのみ改良されている（上記に記載される基準のうちの１つまたはそれを上回るものの変化の３０％以内、２０％以内、１０％以内、または好ましくは、５％以内、またはより好ましくは、１％以内）、取得されたスポットサイズ、スポット形状、スポット強度、およびスポット場所のうちの少なくとも１つの基準に基づいて、最適化された点広がり関数を決定するようにプログラムされる。別の実施形態では、プロセッサ２２０ａは、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または好ましくは、５％未満、またはより好ましくは、１％未満の品質スコアの変化である、後続の逆畳み込みの後のメリット関数の品質スコアの基準に基づいて、最適化された点広がり関数を決定するようにプログラムされる。
【0086】
一実施形態では、プロセッサ２２０ａは、連続する逆畳み込みされた画像内の改良が漸進的改良（上記に記載される基準のうちの１つまたはそれを上回るものの変化の３０％以内、または２０％以内、または１０％以内、または好ましくは、５％以内、およびより好ましくは、１％以内）になるまで、検査画像の繰り返されるブラインド逆畳み込み、およびａ）検査画像の逆畳み込みされた画像とｂ）較正された基準画像の繰り返される比較によって、サンプル画像の画質を改良するための最適化された点広がり関数を決定するようにプログラムされる。
【0087】
本技術の一実施形態では、いったん許容可能なＰＳＦ（以降ＰＳＦ０）が、較正カバースリップ２５０およびサンプルカバースリップ２１２の個別の上部表面から反射された光にわたって撮影された基準画像および検査画像を使用して決定されると、対物レンズ２０２は、カバースリップの上部表面の上方の領域、例えば、カバースリップの上方の距離ｚ１において集束するように調節されることができる。ｚ１において撮影されたサンプル画像が、次いで、例えば、上記に説明されたＬｕｃｙ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ方法（または他の逆畳み込み技法）を使用して処理され、許容可能な品質メトリックが取得されるまで、（おそらく、反復的なブラインド畳み込みを通して）ｚ１においてサンプル画像を逆畳み込みすることができる。その時点において、プロセッサ２２０ａは、ｚ１と関連付けられる、新しいＰＳＦ（以降ＰＳＦ１）を記憶することができる。その後、対物レンズ２０２は、ｚ１よりカバースリップの上方の遠くにある、距離ｚ２に集束するように調節されることができる。再び、ｚ２において撮影されたサンプル画像は、次いで、例えば、上記に説明されるＬｕｃｙ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ方法（または他の逆畳み込み技法）を使用して処理され、許容可能な品質メトリックが、例えば、上記に記載される基準に基づいて取得されるまで、（おそらく、反復的なブラインド畳み込みを通して）ｚ２において画像を逆畳み込みすることができ、プロセッサ２２０ａは、続いて、ｚ２と関連付けられる、取得されたＰＳＦ（以降ＰＳＦ２）を記憶することができる。このように、測定されるべきサンプルを保持するウェルの深度を通して撮像するステップは、各深度における画質の回復とともに行われことができる。
【0088】
別の実施形態では、プロセッサ２２０ａは、異なるレベルの球面収差と関連付けられる、選択可能な点広がり関数ＰＳＦｓのセットを画像処理するために利用可能である。プロセッサ２２０ａは、次いで、そのセットから選択可能な点広がり関数ＰＳＦｓのうちの１つまたはそれを上回るものを選択し、選択されたものを使用し、画像を逆畳み込みすることができる。一実施形態では、上記に記載される品質スコアは、より良好な逆畳み込みされた画像を生成した選択可能な点広がり関数ＰＳＦｓを決定し、したがって、サンプルウェル２１４内の特定のレベルまたは高さにおけるサンプル画像の逆畳み込みのために使用するためのものとして１つのＰＳＦを選択するために使用されることができる。一実施形態では、プロセッサ２２０ａは、既知の摂動から予期される球面収差のレベルに基づいて、選択可能な点広がり関数のセットからの選択を行う。例えば、点広がり関数ＰＳＦｓのセットは、球面収差の増分に従って、（例えば、球面収差の波０．２だけ）相互と異なる点広がり関数を有してもよい。一実施形態では、上記に記載される品質スコアは、より良好な逆畳み込みされた画像を生成し、したがって、最適化されたＰＳＦと見なされる、選択可能な点広がり関数ＰＳＦｓを決定するために使用され得る。
【0089】
一実施形態では、モデル（またはプロセッサ内のデータベース）が、例えば、使用されているサンプルカバースリップ２１２の厚さの既知または予期される側方変動と関連付けられる、記憶された点広がり関数に基づいて、サンプルウェル２１４を横断して撮影された各側方画像を選択可能なＰＳＦｓと関連付ける。
【0090】
一般に、大部分のサンプルカバースリップが、深度に伴う球面収差の増加を示すであろうが、サンプルおよびサンプル培地が有意に異なる屈折率になく、したがって、球面収差があまり顕著ではない場合がある、いくつかのサンプルカバースリップが、存在し得る。それにもかかわらず、一実施形態では、球面収差の量が、サンプル内の脱集束に伴って増加し得るため、モデルが、いかなる脱集束およびいかなる球面収差も存在しない場合と同様の理想的な焦点位置からの所与の脱集束に関する、球面収差の波の数を予測するために使用されることができる。一実施形態では、サンプル底部の上方において、モデル（またはプロセッサ２２０ｂ内のデータベース）は、異なる選択可能な点広がり関数と、例えば、サンプルウェル２１４内の既知の深度、またはサンプルカバースリップ２１２の上部側２１２ｂの上方の既知の高さｚ１、およびこれらの位置における予期される球面収差を関連付けるであろう。プロセッサ２２０ａ等のプロセッサが、測定または予期される球面収差に基づいて、選択可能な点広がり関数のうちの１つを選択するであろう。
【0091】
ある実施例では、逆畳み込みのためにプロセッサ２２０ａにとって利用可能な選択可能な点広がり関数は、初期の製造プロセスの間にデータベース内に記憶される。本プロセスの間に、点広がり関数は、光学レンズ、各サンプルウェル２１４を横断した深度、および／または本システム内に球面収差または脱集束を生成し得る、サンプルカバースリップ２１２の厚さの既知または予測される側方変動を含む、製造業者によって配設されたシステムコンポーネントを参照して計算される。選択可能な点広がり関数は、公知のシステムコンポーネントを利用するときに、画像の迅速な逆畳み込みを可能にするために利用可能である。
【0092】
本技術の一実施形態では、物体が、高さｚ２にある場合、撮像処理は、逆畳み込みを介した画像ぼけまたは物体の画像をぼかしている収差を補正する前に、最初に、球面収差モデルが、その高さｚ２において正しいことを確実にし得る。言い換えると、脱集束は、高さｚ２において決定され得るが、一実施形態では、プロセッサは、高さｚ２の周囲で複数のｚ平面を使用し、高い（または別様に許容可能な）コントラスト（例えば、２を上回る許容可能な信号対ノイズ比、または２を上回る許容可能な信号対背景比、または一貫してノイズを上回って上昇する、信号の勾配）を有し、ＰＳＦをその画像に適用する、複数の平面から特定の高さを選別するであろう。故に、一実施形態では、プロセッサは、サンプルカバースリップの上方の異なる高さにわたって、それらの高さにおける予期される球面収差を用いた畳み込みのための適切なレベルを評価し、次いで、許容可能なコントラストが見出される、それらの深度にわたって、補正カラー２５２の使用等によって、焦点をデジタル的または機械的に改良することによって、画質をさらに向上させるであろう。本実施形態は、基準画像が、例えば、球面収差または脱集束または他の撮像アーチファクトに起因する光学システム誤差と関連付けられるＰＳＦを決定しており、撮像されるべきサンプルＳが、単に、サンプルカバースリップの上部表面２１２ｂ上にあるのではなく、代わりに、例えば、サンプルカバースリップ２１２の１００ミクロン上方の深度にある場合において、特に有用であろう。その場合には、対物レンズ２０２または基板ステージ２１６は、サンプルＳをカバースリップとサンプルＳとの間で１００ミクロンの位置において撮像するために移動されるため、サンプルが合焦した状態になり始めるまで、光学検出器に対して光を後方反射させるためのいかなる要素も、存在しないであろう。その時点において、プロセッサは、例えば、９６ミクロン、９８ミクロン、１００ミクロン、１０２ミクロン、および１０４ミクロンの高さと関連付けられる、記憶装置２２３内でＰＳＦを選択し（または別様にプロセッサ２２０ａにアクセス可能であり）、これらの位置において撮影されたサンプル画像の逆畳み込みを実施し、最良なコントラスト、品質スコア、またはメリット関数を用いて逆畳み込みされた画像を生成する、選択可能なＰＳＦのうちの１つを決定するであろう。本技術の一実施形態では、異なる深度における物体が、異なる深度のそれぞれに関して識別された、最適化されたＰＳＦを用いて撮像されるため、深度に伴う球面収差を予測するためのモデルが、築かれ、改良されることができる。
【0093】
実施例
下記の実施例では、Ｌｕｃｙ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ方法およびブラインド逆畳み込みが、上記に説明された逆畳み込みのための手順を使用して、下記の実施例において、画像を逆畳み込みするために使用された。下記に与えられる実施例では、Ｔｈｏｒｌａｂｓ（Ｎｅｗｔｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳ）製の高精度カバースリップが、Ｎｏｒｌａｎｄ ６１光学接着剤（Ｃｒａｎｂｕｒｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳ）を使用して顕微鏡スライド上に糊着され、較正カバースリップとしての役割を果たした。Ｔｈｏｒｌａｂｓ製の高精度カバースリップは、５μｍの厚さ公差を有し、高精度カバースリップが光源２０６に向かって下向きに面した状態で顕微鏡側に位置付けられた。
下記の実施例では、Ｌｕｃｙ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ方法およびブラインド逆畳み込みが、上記に説明された逆畳み込みのための手順を使用して、下記の実施例において、画像を逆畳み込みするために使用された。下記に与えられる実施例では、Ｔｈｏｒｌａｂｓ（Ｎｅｗｔｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳ）製の高精度カバースリップが、Ｎｏｒｌａｎｄ ６１光学接着剤（Ｃｒａｎｂｕｒｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳ）を使用して顕微鏡スライド上に糊着され、較正カバースリップとしての役割を果たした。Ｔｈｏｒｌａｂｓ製の高精度カバースリップは、５μｍの厚さ公差を有し、高精度カバースリップが光源２０６に向かって下向きに面した状態で顕微鏡側に位置付けられた。
【0094】
図３は、最良焦点にあり、最適な補正カラー設定を伴う、個々の０．５μｍビーズから撮影された、光学画像の強度分布を描写する。後の比較目的のために、図３の強度分布は、０．５μｍビーズのための「理想的」な画像強度分布を表す。
【0095】
図４は、最良焦点にあるが、非最適な補正カラー設定を伴う、個々の０．５μｍビーズから撮影された、光学画像の強度分布を描写する。予期されるように、図４に示される画像分解能および信号強度は、図３に描写される理想的な画像強度分布と比較して、劣化している。
【0096】
図５は、図４の非最適な光学画像を処理するために、本技術の逆畳み込み技法を使用して数学的に処理された画像の強度分布を描写する。明白であるように、数学的に処理された画像に関する画像分解能および信号強度は両方とも、本技術の数学的逆畳み込みを用いて改良される。
【0097】
図６Ａは、最良焦点にあるが、非最適な補正カラー設定を有する非最適な撮像条件下で４．０μｍビーズから撮影された、別の光学画像を描写する。図６Ｂは、本技術の逆畳み込みプロセスを使用して処理された、図６Ａの画像データを描写する。図６Ｃは、図６Ａの同一の４．０μｍビーズから最良焦点において撮影されたが、ここでは最適な撮像条件下で撮影された、光学画像を描写する。図６Ｂの処理された画像データが図６Ｃの光学画像データに近接して合致するほど、本技術の逆畳み込みが、非最適な画像から、物体の実際の画像があるべき、より良好に回復した状態になる。
【0098】
図６Ｄは、図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃの強度プロファイルのグラフ比較である。本比較は、本技術の逆畳み込みプロセスが、非最適な条件下で撮影された画像が、ピーク強度およびＦＷＨＭ等、最適な撮像条件下で撮影された画像内に認められる属性のうちの多くのものを「回復」させることを可能にし、それによって、補正カラーまたは他の手段等による実際の光学調節を行う、ユーザの時間および労力を伴うことなく、有用な画像データが取得されることを可能にすることを示す。異なる見方をすると、図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄは、例えば、球面収差または脱集束または他の撮像アーチファクトに起因する光学システム誤差のために、そうでなければぼけている画像から有用な画像データを回復するための本技術の有効性を示す。
コンピュータ制御
コンピュータ制御
【0099】
図２に図式的に図示されるコントローラ２２０が、例えば、ユーザ入力デバイス（例えば、キーパッド、タッチスクリーン、マウス、および同等物）、ユーザ出力デバイス（例えば、ディスプレイ画面、プリンタ、視覚インジケータまたはアラート、可聴インジケータまたはアラート、および同等物）、および算出デバイス等の、１つまたはそれを上回るタイプのユーザデバイスを含む、様々なコンピューティングデバイスを表すにすぎないことを理解されたい。コントローラ２２０（またはプロセッサ２２０ａ）は、出力デバイスによる表示のための、ソフトウェアによって制御されるグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）と、媒体可読物（例えば、ソフトウェア、データ、および同等物内で具現化される論理命令）をロードするための１つまたはそれを上回るデバイスとを有してもよい。コントローラ２２０（またはプロセッサ２２０ａ）は、その種々の機能を制御および管理するためのオペレーティングシステム（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ソフトウェア）を含み、したがって、プロセッサを備える。
【0100】
図７は、コントローラ２２０内に、またはプロセッサ２２０ａとともに実装され得る、サンプルを撮像するための、本技術のコンピュータ化された方法を詳述する、フローチャートである。ステップを標識するために、番号の数値セットが、続くが、本技術は、必ずしも所与の数値順序において発生するステップに限定されるものではない。
【0101】
ステップ７０１において、較正カバースリップ（または他の標準的基準スライド）の上部表面から反射されたスポットの基準画像が、（プロセッサ２２０における後続の画像処理のために）記録される。好ましい選択肢では、開口２３０が、光軸からオフセットされ、反射され、球面収差が４乗だけ変化する、対物レンズ２０２の周領域を通して通過する、スポットの波面の一部のみをサンプリング（選択）する。
【0102】
ステップ７０３において、サンプルカバースリップ上のサンプルの生体画像が、（プロセッサ２２０ａにおける後続の画像処理のために）記録される。
【0103】
ステップ７０５において、サンプルカバースリップの上部表面から反射されたスポットの検査画像が、（プロセッサ２２０ａにおける後続の画像処理のために）記録される（ステップ７０３および７０５は、逆の順序で生じてもよい）。
【0104】
ステップ７０７において、検査画像が、（プロセッサ２２０ａによって）逆畳み込みされ、これによって、サンプルカバースリップを含む光学撮像システムの計算された点広がり関数が、取得される。好ましい選択肢では、（限定ではないが、ブラインド逆畳み込みおよびＬｕｃｙ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎアルゴリズムを含め、上記に説明される）逆畳み込み撮像プロセスは、点広がり関数を回復するために光学システムの点広がり関数の第１の近似値としての役割を果たす、検査画像と併用される。好ましい選択肢では、オフセットされた開口を用いて撮影された検査画像を用いると、回復されたＰＳＦが、球面収差を低減させるであろう。
【0105】
ステップ７０９において、計算された点広がり関数が、（例えば、プロセッサ２２０ａによって）生体画像を逆畳み込みするために使用される。サンプルカバースリップ厚の変動が、殆ど存在しない場合、計算されたＰＳＦは、ウェル間から撮像するときに、それほど多くの場合において再算出される必要はない。本技術の別の実施形態では、検査画像内に認められる脱集束の量に基づいて、脱集束のための検査画像ライブラリが、ａ）対物レンズのための焦点位置を設定し、ｂ）使用中の光学コンポーネントの適切な計算されたＰＳＦを取得するステップにおいて使用されるべき、適切な検査画像を決定するために使用されることができる。
【0106】
上記に記載されるように、一実施形態では、本技術は、図２に示されるシステム等の反転された顕微鏡構成を対象とするが、本技術は、反転されていない顕微鏡構成にも適用されることができる。その場合には、較正カバースリップから反射されたレーザビームまたは他の光が、対物レンズ２０２（すなわち、対物レンズ２０２）に面する較正カバースリップ（または他の基準プレート）の側における焦点面から反射され、結像光学系は、撮像されるべきサンプルを支持する、サンプルカバースリップ２１２の上方にあるだろう。同一のステップが、次いで、検査画像および基準画像が、対物レンズ２０２に面する較正カバースリップまたは較正カバースリップの側における焦点面に反射される、レーザビームまたは他の光から撮影されているステップに伴って、続くであろう。基準画像は、検査画像の逆畳み込みのための初期のＰＳＦとして使用され、そこから対物レンズ２０２と、結像光学系とを含む、光学システムのための計算されたＰＳＦが、導出されるであろう。サンプルを支持するサンプルカバースリップから撮影されたサンプル画像が、次いで、最適なＰＳＦを使用して逆畳み込みされるであろう。
【0107】
反転されていない構成における本技術の一実施形態では、基準画像および検査画像のために使用される反射は、サンプルにより近接してカバースリップの内側表面上に位置する、画像焦点面から撮影されるであろう。着目サンプル位置は、厚いサンプルを通して、または（浸漬された対物レンズを用いて下記に説明される場合には）サンプルを保持するウェルの深度の中に進行し得る。
【0108】
反転されていない構成における本技術の一実施形態では、対物レンズが、サンプル培地の中に浸漬される場合、サンプルに関する屈折率および対物レンズの設計の不整合が、球面収差をもたらすであろう。本場合には、サンプルウェルの中での異なる深度における反転された構成撮像に関して上記に説明されるものに類似のプロセスが、適用されることができる。すなわち、（カバースリップの底部に最も近接している）ｚ１において撮影されたサンプル画像が、次いで、例えば、上記に説明されるＬｕｃｙ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ方法（または他の逆畳み込み技法）を使用して処理され、許容可能な品質メトリックが取得されるまで、（おそらく、反復的なブラインド畳み込みを通して）ｚ１においてサンプル画像を逆畳み込みすることができる。その時点において、プロセッサ２２０ａは、ｚ１と関連付けられる、新しいＰＳＦ（以降ＰＳＦ１）を記憶することができる。その後、対物レンズ２０２は、ｚ１よりカバースリップの下方の遠くにある、距離ｚ２に集束するように調節されることができる。再び、ｚ２において撮影されたサンプル画像は、次いで、例えば、上記に説明されるＬｕｃｙ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ方法（または他の逆畳み込み技法）を使用して処理され、許容可能な品質メトリックが、例えば、上記に記載される基準に基づいて取得されるまで、（おそらく、反復的なブラインド畳み込みを通して）ｚ２において画像を逆畳み込みすることができ、プロセッサ２２０ａは、続いて、ｚ２と関連付けられる、取得されたＰＳＦ（以降、ＰＳＦ２）を記憶することができる。このように、反転されていない構成において、測定されるべきサンプルを保持するウェルの深度のより深い部分において撮像するステップは、各深度における画質の回復とともに行われことができる。
【0109】
上記に説明されるものと同様に、反転されていない構成を伴う一実施形態では、球面収差の量が、サンプルの中への深度に伴って増加し得るため、または異なる見方をすると、サンプルカバースリップ２１２の上部表面２１２ｂの上方の高さに伴って増加し得るため、モデルが、サンプルウェル２１４内の所与の深度またはサンプルカバースリップ２１２の上部表面２１２ｂの上方の高さｚ１に関する、球面収差の波の数を予測するために使用されることができる。一実施形態では、モデル（またはプロセッサ２２０ａによってアクセス可能なデータベース）が、異なる選択可能な点広がり関数と予期される球面収差を関連付け得る。プロセッサ２２０ａ等のプロセッサが、（高さｚ１を中心とした異なる変位量と関連付けられる）選択可能な点広がり関数のうちの少なくとも１つを選択し、異なる変位量におけるサンプル画像の逆畳み込みを実施し、例えば、（上記に記載されるように）サンプル画像逆畳み込みに続いて取得される、観察されたコントラストに基づいて、特定のＰＳＦを選択するであろう。
【0110】
反転された顕微鏡構成または反転されていない顕微鏡構成かどうかにかかわらず、図８は、コントローラ２２０内に、またはプロセッサ２２０ａとともに実装され得る、サンプルを撮像するための、本技術の別のコンピュータ化された方法を詳述する、フローチャートである。
【0111】
ステップ８０１において、（例えば、サンプル保持器の上部表面上のサンプルの）サンプル画像が、捕捉される。ステップ８０３において、較正カバースリップ等の標準基準プレートの表面（例えば、上部表面）から反射される集束レーザビームまたは他の光から取得された、基準画像データが、捕捉される。ステップ８０５において、サンプルカバースリップ等のサンプル保持器の表面（例えば、上部表面）から反射される集束レーザビームまたは他の光から取得された、検査画像データが、捕捉される。ステップ８０７において、基準画像データおよび検査画像データが、処理され、使用中の光学コンポーネントと関連付けられる、最適化された点広がり関数を生成する。ステップ８０９において、サンプル画像が、最適化された点広がり関数を使用して逆畳み込みされ、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去する。
【0112】
本明細書に説明されるプロセス、サブプロセス、およびプロセスステップのうちの１つまたはそれを上回るものが、例えば、１つまたはそれを上回る電子的またはデジタル的に制御されるデバイス上で、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、または前述のもののうちの２つまたはそれを上回るものの組み合わせによって実施され得ることを理解されたい。ソフトウェアは、例えば、図２に図式的に描写される、コントローラ２２０および／またはプロセッサ２２０ａ等の好適な電子処理コンポーネントまたはシステム内のソフトウェアメモリ（図示せず）内に常駐してもよい。ソフトウェアメモリは、論理機能（すなわち、デジタル回路網またはソースコード等のデジタル形態において、またはアナログ電気、音、またはビデオ信号等のアナログソース等のアナログ形態において実装され得る、論理）を実装するための実行可能命令の順序付けられる列挙物を含み得る。命令は、例えば、１つまたはそれを上回るマイクロプロセッサ、汎用目的プロセッサ、プロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）の組み合わせを含む、処理モジュール内で実行され得る。さらに、概略図は、機能のアーキテクチャまたは物理的レイアウトによって限定されない、物理的（ハードウェアおよび／またはソフトウェア）実装を有する機能の論理分割を説明する。本明細書において説明されるシステムの実施例は、様々な構成内に実装され、単一のハードウェア／ソフトウェアユニット内、または別個のハードウェア／ソフトウェアユニット内でハードウェア／ソフトウェアコンポーネントとして動作し得る。
【0113】
実行可能命令は、プロセッサ２２０ａおよび／またはコントローラ２２０によって実行されると、電子システムに命令を行うように指示する、その中に記憶される命令を有する、コンピュータプログラム製品として実装されてもよく、記憶装置２２３から、測定または処理されたデータを含有する画像ファイルから、データから読み取ってもよい。一実施形態では、実行可能命令は、例えば、コントローラ２２０またはプロセッサ２２０ａが、例えば、基準画像からの基準画像データおよび／または検査画像（例えば、初期検査画像）からの検査画像データ等の測定または処理された画像データをメモリ２２３（またはプロセッサ２２０ａの内部メモリ）内に記憶することを可能にする。さらに、実行可能命令は、コントローラ２２０またはプロセッサ２２０ａが、ａ）対物レンズおよびカバースリップに関する初期の点広がり関数として、基準画像データを使用して、検査画像データを逆畳み込みし、ｂ）検査画像データの少なくとも１つの逆畳み込みを通して、対物レンズと、サンプルカバースリップを含む、使用中の他の光学コンポーネントとのための計算された点広がり関数を生成し、ｃ）検査画像データの逆畳み込みから計算された点広がり関数を使用して、サンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去することを可能にすることができる。
【0114】
一実施形態では、実行可能命令は、コントローラ２２０が、ａ）カバースリップに対する対物レンズの垂直変位、ｂ）カバースリップに対する対物レンズの側方変位、ｃ）光学検出器の露光持続時間、ｄ）サンプルを照明する光源の強度、ｅ）光学経路の中への光学フィルタの挿入、ｆ）光学経路内での軸外開口の位置付け、ｇ）自動焦点調節、およびｈ）他の光学検出器またはカメラ設定のうちの少なくとも１つを制御することを可能にする。
【0115】
一実施形態では、実行可能命令は、コントローラ２２０が、光源からの光を対物レンズの焦点面に集束させるために、対物レンズの２０２位置または対物レンズ２０２からのサンプルカバースリップ２１２の距離のうちの少なくとも一方を制御することを可能にする。一実施形態では、コントローラ２２０の制御下で、光学検出器２０４は、サンプルカバースリップからの複数のサンプル画像を異なる側方位置において捕捉することができ、較正カバースリップからの複数の較正された基準画像を異なる側方位置において捕捉することができ、対物レンズの焦点面からサンプルカバースリップを通して後方反射される光からの複数の検査画像を、異なる側方位置において捕捉することができ、プロセッサ２２０ａは、側方位置毎に、個別の計算された点広がり関数と関連付けられる、個別の逆畳み込みされた検査画像を生成することができ、側方位置毎に、個別の計算された点広がり関数を使用して、複数のサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、複数のサンプル画像からのアーチファクトを低減および除去することができる。別の実施形態では、コントローラ２２０の制御下で、光学検出器２０４は、異なるサンプルカバースリップから、複数のサンプル画像を捕捉することができ、複数の較正カバースリップから、それぞれ、異なるサンプルカバースリップと関連付けられる、複数の較正された基準画像を捕捉することができ、異なるサンプルカバースリップから、異なるサンプルカバースリップを通して後方反射される光から、複数の検査画像を捕捉することができ、プロセッサ２２０ａは、サンプルカバースリップ毎に、個別の計算された点広がり関数と関連付けられる、個別の逆畳み込みされた検査画像を生成することができ、カバースリップ毎に、個別の計算された点広がり関数を使用して、複数のサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、複数のサンプル画像からのアーチファクトを低減または除去することができる。
【0116】
コンピュータプログラム製品は、命令実行システム、装置、またはデバイスからの命令を選択的にフェッチし、命令を実行し得る、電子コンピュータベースのシステム、プロセッサ含有システム、または他のシステム等の命令実行システム、装置、またはデバイスによる、またはそれに関連する使用のための、任意の非一過性コンピュータ可読記憶媒体内で選択的に具現化され得る。本開示の文脈において、コンピュータ可読記憶媒体は、命令実行システム、装置、またはデバイスによる、またはそれに関連する使用のための、プログラムを記憶し得る、任意の非一過性手段である。非一過性コンピュータ可読記憶媒体は、選択的に、例えば、電子、磁気、光学、電磁気、赤外線、または半導体のシステム、装置、またはデバイスであり得る。非一過性コンピュータ可読媒体のより具体的な実施例の非包括的なリストは、１つまたはそれを上回るワイヤを有する電気接続（電子）、ポータブルコンピュータディスケット（磁気）、ランダムアクセスメモリ（電子）、読取専用メモリ（電子）、例えば、フラッシュメモリ等の消去可能なプログラマブル読取専用メモリ（電子）、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ＣＤ－Ｒ、ＣＤ－ＲＷ等のコンパクトディスクメモリ（光学）、およびデジタル多用途ディスクメモリ、すなわち、ＤＶＤ（光学）を含む。非一過性コンピュータ可読記憶媒体は、プログラムが、例えば、紙または他の媒体の光学走査を介して電子的に捕捉され、次いで、コンパイル、解釈、または必要である場合に好適な様式において別様に処理され、次いで、記憶装置２２３またはプロセッサ２２０ａの内部メモリ等のコンピュータメモリまたは機械メモリ内に記憶され得るため、その上にプログラムが印刷される、紙または別の好適な媒体でさえあり得る。
【0117】
また、本明細書において使用されるような用語「信号通信している」が、２つまたはそれを上回るシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールが、あるタイプの信号経路を経由して進行する信号を介して、相互と通信することが可能であることを意味することも理解されたい。信号は、第１のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールから、第１および第２のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールの間の信号経路に沿って、第２のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールに情報、電力、またはエネルギーを通信し得る、通信、電力、データ、またはエネルギー信号であり得る。信号経路は、物理、電気、磁気、電磁気、電気化学、光学、有線、または無線接続を含んでもよい。信号経路はまた、第１および第２のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールの間に付加的なシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールを含んでもよい。
【0118】
より一般的には、「通信する（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｅ）」および「と．．．通信している（ｉｎ．．．ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）」等の用語（例えば、第１のコンポーネントが、第２のコンポーネントと「通信する」または「通信している」）は、本明細書では、２つまたはそれを上回るコンポーネントまたは要素間での構造的、機能的、機械的、電気的、信号的、光学的、磁気的、電磁気的、イオン的、または流体的関係を示すために使用される。したがって、１つのコンポーネントが、第２のコンポーネントと通信すると述べられるという事実は、付加的なコンポーネントが、第１および第２のコンポーネント間に存在する、および／またはそれらと動作可能に関連付けられる、またはそれらと係合され得る可能性を排除することを意図していない。
【0119】
また、本明細書に使用されるような「データの受信および伝送」は、２つまたはそれを上回るシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールが、あるタイプの信号経路を経由して進行する信号を介して、相互と通信することが可能であることを意味することも理解されたい。信号は、第１および第２のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュール間の信号経路に沿って、第１のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールから第２のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールに、情報、電力、またはエネルギーを通信し得る、通信、電力、データ、またはエネルギー信号であってもよい。信号経路は、物理、電気、磁気、電磁気、電気化学、光学、有線、または無線接続を含んでもよい。信号経路はまた、第１および第２のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールの間に付加的なシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールを含んでもよい。
【0120】
本技術の例示的記述
本技術の以下の付番される記述は、本技術のいくつかの独創的側面を記載する。
本技術の以下の付番される記述は、本技術のいくつかの独創的側面を記載する。
【0121】
記述１．光学撮像システムであって、サンプルカバースリップの上部表面上で撮像されるべきサンプルを保持するように構成される、サンプルステージと、サンプルステージの真下に配置され、サンプルカバースリップの上部表面上でサンプルを撮像するように構成される、対物レンズと、サンプルカバースリップ上で少なくともサンプルのサンプル画像を捕捉するように構成される、光学検出器と、較正カバースリップから捕捉された基準画像から基準画像データを取り出し、対物レンズの焦点面においてサンプルカバースリップの上部表面から反射された光から捕捉された検査画像から検査画像データを取り出し、基準画像データおよび検査画像データを処理し、（検査画像データの逆畳み込みを介して）対物レンズおよび使用中の他の光学コンポーネントと関連付けられる、計算された点広がり関数を生成し、計算された点広がり関数を使用してサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去するようにプログラムされる、プロセッサとを備える、光学撮像システム。
【0122】
記述２．プロセッサは、検査画像データのブラインド逆畳み込みを実施し、計算された点広がり関数を決定するようにプログラムされる、記述１に記載のシステム。
【0123】
記述３．プロセッサは、計算された点広がり関数に関して、逆畳み込みされた画像内の改良が漸進的改良になるまで、検査画像の繰り返される逆畳み込み、およびａ）検査画像の逆畳み込みされた画像とｂ）較正された基準画像の繰り返される比較によって、サンプル画像の画質を改良するための最適化された点広がり関数を決定するようにプログラムされる、記述１または２に記載のシステム。
【0124】
記述４．プロセッサは、検査画像の連続する逆畳み込みの後に漸進的にのみ改良されて取得される、スポットサイズ、スポット形状、スポット強度、およびスポット場所のうちの少なくとも１つの基準に基づいて、最適化された点広がり関数を決定するようにプログラムされる、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0125】
記述５．プロセッサは、連続する逆畳み込みされた画像内の改良が、漸進的改良になるまで、検査画像の繰り返されるブラインド逆畳み込み、およびａ）検査画像の逆畳み込みされた画像とｂ）較正された基準画像の繰り返される比較によって、サンプル画像の画質を改良するための最適化された点広がり関数を決定するようにプログラムされる、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0126】
記述６．焦点面に集束されるべき光を提供する、光源をさらに備える、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0127】
記述７．ａ）カバースリップに対する対物レンズの垂直変位、ｂ）カバースリップに対する対物レンズの側方変位、ｃ）光学検出器の露光持続時間、ｄ）サンプルを照明する光源の強度、ｅ）光学経路の中への光学フィルタ（例えば、スペクトルフィルタおよび／または空間フィルタ）の挿入、ｆ）光学経路内での軸外開口の位置付け、ｇ）自動焦点調節、およびｈ）他の光学検出器またはカメラ設定のうちの少なくとも１つを制御するように構成される、コントローラをさらに備える、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0128】
記述８．コントローラは、光源からの光を対物レンズの焦点面に集束させるために、対物レンズの位置およびサンプルステージの位置のうちの少なくとも一方を制御する、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0129】
記述９．コントローラの制御下で、光学検出器は、サンプルカバースリップからの複数のサンプル画像を異なる側方位置において捕捉し、コントローラの制御下で、光学検出器は、較正カバースリップからの複数の較正された基準画像を異なる側方位置において捕捉し、コントローラの制御下で、光学検出器は、対物レンズの焦点面からサンプルカバースリップを通して後方反射される光からの複数の検査画像を、異なる側方位置において捕捉し、プロセッサは、側方位置毎に、個別の計算された点広がり関数と関連付けられる、個別の逆畳み込みされた検査画像を生成し、プロセッサは、側方位置毎に、個別の計算された点広がり関数を使用して、複数のサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、複数のサンプル画像からのアーチファクトを低減または除去する、請求項８に記載のシステム。
【0130】
記述１０．コントローラの制御下で、光学検出器は、異なるサンプルカバースリップから、複数のサンプル画像を捕捉し、コントローラの制御下で、光学検出器は、複数の較正カバースリップから、それぞれ、異なるサンプルカバースリップと関連付けられる、複数の較正された基準画像を捕捉し、コントローラの制御下で、光学検出器は、異なるサンプルカバースリップから、異なるサンプルカバースリップを通して後方反射される光から、複数の検査画像を捕捉し、プロセッサは、サンプルカバースリップ毎に、個別の計算された点広がり関数と関連付けられる、個別の逆畳み込みされた検査画像を生成し、プロセッサは、カバースリップ毎に、個別の計算された点広がり関数を使用して、複数のサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、複数のサンプル画像からのアーチファクトを低減または除去する、記述８に記載のシステム。
【0131】
記述１１．サンプルカバースリップに起因する光学収差を補償する、補正カラーをさらに備える、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0132】
記述１２．プロセッサは、個別の標準的厚さを有する、複数のカバースリップの個別の最適化された点広がり関数をメモリ内に記憶する、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0133】
記述１３．プロセッサは、異なる光学厚を有する、異なる種類のカバースリップと関連付けられる、個別の最適化された点広がり関数をメモリ内に記憶する、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0134】
記述１４．プロセッサはさらに、サンプル画像に関して、サンプルカバースリップから変位された位置ｚ１から撮影された画像を取り出し、位置ｚ１と関連付けられる球面収差を確認し、それぞれが位置ｚ１から変位された、異なる高さと関連付けられる、異なる球面収差を有する、選択可能な点広がり関数のセットを取り出し、選択可能な点広がり関数のセットから、確認された球面収差と関連付けられる始点広がり関数を選択し、始点広がり関数を使用して、位置ｚ１においてサンプル画像を逆畳み込みするように構成される、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0135】
記述１５．プロセッサはさらに、サンプルカバースリップから変位された第１の位置ｚ１において撮影された第１のサンプル画像を取り出し、第１の位置ｚ１において第１のサンプル画像からのアーチファクトを低減させるための第１の計算された点広がり関数を決定し、第１の位置ｚ１よりもサンプルカバースリップから遠くに除去された第２の位置ｚ２において撮影された、第２の画像を取り出し、逆畳み込みにおける始点広がり関数として、第１の計算された点広がり関数を使用し、第２の位置ｚ２において撮影された、第２のサンプル画像からのアーチファクトを低減させるための第２の計算された点広がり関数を決定するように構成される、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0136】
記述１６．光学検出器への光学経路内に軸外開口をさらに備える、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0137】
記述１７．光源から対物レンズを通してサンプルカバースリップまたは較正カバースリップ上に光を指向するための、対物レンズの真下に配置される、ビーム分割器をさらに備える、上記の記述のいずれかに記載のシステム。
【0138】
記述１８．光学撮像システムであって、対物レンズと、ａ）サンプルを保持するためのサンプルカバースリップまたはｂ）較正カバースリップの上部表面を対物レンズの焦点面に位置付けるように構成される、サンプルステージと、少なくともａ）サンプルカバースリップ上のサンプルのサンプル画像、ｂ）対物レンズの焦点面から較正カバースリップを通して後方反射される光からの基準画像、およびｃ）対物レンズの焦点面からサンプルカバースリップを通して後方反射される光からの検査画像（例えば、初期試験画像）を捕捉するように構成される、光学検出器と、基準画像から基準画像データを取り出し、検査画像から検査画像データを取り出し、対物レンズおよびカバースリップに関する初期の点広がり関数として、基準画像データを使用して、検査画像データを逆畳み込みし、検査画像データの少なくとも１つの逆畳み込みを通して、対物レンズと、サンプルカバースリップを含む、使用中の他の光学コンポーネントとのための計算された点広がり関数と関連付けられる、逆畳み込みされた試験画像を生成し、検査画像データの逆畳み込みから計算された点広がり関数を使用して、サンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去するようにプログラムされる、プロセッサとを備える、光学撮像システム。
【0139】
記述１９．プロセッサは、サンプルカバースリップと関連付けられる最適化された点広がり関数を生成するための初期の点広がり関数として、基準画像データを利用する、記述１８に記載のシステム。
【0140】
記述２０．サンプルを撮像するためのコンピュータ化された方法であって、サンプルを保持するサンプルカバースリップの真下に配置される対物レンズを使用して、サンプルのサンプル画像を捕捉するステップと、較正カバースリップから取得される、基準画像データを取得するステップと、対物レンズの焦点面においてサンプルカバースリップの上部表面から反射される光から取得される、検査画像データを捕捉するステップと、基準画像データおよび検査画像データを処理し、（検査画像データの逆畳み込みを介して）対物レンズおよび使用中の他の光学コンポーネントと関連付けられる、計算された点広がり関数を生成するステップと、計算された点広がり関数を使用してサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去するステップとを含む、コンピュータ化された方法。本方法は、記述１－１９に記載の光学撮像システムのコンポーネントのうちのいずれかを用いて実施されることができる。
【0141】
記述２１．コンピュータ可読媒体であって、コンピュータによって実行されると、これに、サンプルを保持するサンプルカバースリップの真下に配置される対物レンズを使用して、サンプルのサンプル画像を捕捉する方法ステップと、較正カバースリップから取得される、基準画像データを取得する方法ステップと、対物レンズの焦点面においてサンプルカバースリップの上部表面から反射される光から取得される、検査画像データを捕捉する方法ステップと、基準画像データおよび検査画像データを処理し、（検査画像データの逆畳み込みを介して）対物レンズおよび使用中の他の光学コンポーネントと関連付けられる、計算された点広がり関数を生成する方法ステップと、計算された点広がり関数を使用してサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去する方法ステップとを実施させる命令を記憶する、コンピュータ可読媒体。本コンピュータ可読媒体は、例えば、コントローラ２２０および／またはプロセッサ２２０ａまたはコントローラ２２０および／またはプロセッサ２２０ａと通信する他の類似のコンピューティングデバイス内に記憶されることができる。
【0142】
記述２２．サンプルを撮像するための方法であって、サンプル画像を捕捉するステップと、標準基準プレートの表面から反射される光から取得される、基準画像データを捕捉するステップと、サンプル保持器の表面から反射される光から取得される、検査画像データを捕捉するステップと、基準画像データおよび検査画像データを処理し、使用中の光学コンポーネントと関連付けられる、最適化された（または計算された）点広がり関数を生成するステップと、最適化された点広がり関数を使用してサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去するステップとを含む、方法。本方法は、記述１－１９に記載の光学撮像システムのコンポーネントのうちのいずれかを用いて実施されることができる。
【0143】
記述２３．コンピュータ可読媒体であって、コンピュータによって実行されると、これに、サンプル画像を捕捉する方法ステップと、標準基準プレートの表面から反射された光から取得された基準画像データを捕捉する方法ステップと、サンプル保持器の表面から反射される光から取得される、検査画像データを捕捉する方法ステップと、基準画像データおよび検査画像データを処理し、使用中の光学コンポーネントと関連付けられる、最適化された（または計算された）点広がり関数を生成する方法ステップと、最適化された点広がり関数を使用してサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去する方法ステップとを実施させる命令を記憶する、コンピュータ可読媒体。本コンピュータ可読媒体は、例えば、コントローラ２２０および／またはプロセッサ２２０ａまたはコントローラ２２０および／またはプロセッサ２２０ａと通信する他の類似のコンピューティングデバイス内に記憶されることができる。
【0144】
記述２４．光学撮像システムであって、サンプルのサンプル画像を捕捉するための手段と、較正カバースリップから取得される、基準画像データを取得するための手段と、サンプルカバースリップの上部表面から反射された光から取得された検査画像データを捕捉するための手段と、基準画像データおよび検査画像データを処理し、（検査画像データの逆畳み込みを介して）対物レンズおよび使用中の他の光学コンポーネントと関連付けられる、計算された点広がり関数を生成するための手段と、計算された点広がり関数を使用してサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去するための手段とを備える、光学撮像システム。
【0145】
記述２５．光学撮像システムであって、サンプル画像を捕捉するための手段と、標準基準プレートの表面から反射された光から取得される、基準画像データを捕捉するための手段と、サンプル保持器の表面から反射された光から取得される、検査画像データを捕捉するための手段と、基準画像データおよび検査画像データを処理し、使用中の光学コンポーネントと関連付けられる、最適化された（または計算された）点広がり関数を生成するための手段と、最適化された点広がり関数を使用してサンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去するための手段とを備える、光学撮像システム。
【0146】
記述２６．光学撮像システムであって、対物レンズと、ａ）サンプルを保持するためのサンプルカバースリップまたはｂ）較正カバースリップの上部表面を対物レンズの焦点面に位置付けるように構成される、サンプルステージと、少なくともａ）サンプルカバースリップ上のサンプルのサンプル画像、ｂ）対物レンズの焦点面から較正カバースリップを通して後方反射される光からの基準画像、およびｃ）対物レンズの焦点面からサンプルカバースリップを通して後方反射される光からの検査画像（例えば、初期検査画像）を捕捉するための手段と、逆畳み込みのための初期の点広がり関数として基準画像を使用した、検査画像の少なくとも１つの逆畳み込みから取得される計算された点広がり関数を使用して、サンプル画像を逆畳み込みするための手段とを備える、光学撮像システム。
【0147】
記述２７．光学撮像システムであって、サンプルのサンプル画像を捕捉するための手段と、サンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去するための手段とを備え、逆畳み込みするための手段は、サンプル画像に関して、サンプルカバースリップから変位された位置ｚ１から撮影された画像を取り出し、位置ｚ１と関連付けられる球面収差を確認し、それぞれがｚ１から変位された異なる高さと関連付けられる、異なる球面収差を有する、選択可能な点広がり関数のセットを取り出し、選択可能な点広がり関数のセットから、確認された球面収差と関連付けられる始点広がり関数を選択し、始点広がり関数を使用して、位置ｚ１においてサンプル画像を逆畳み込みする、光学撮像システム。
【0148】
記述２８．光学撮像システムであって、サンプルのサンプル画像を捕捉するための手段と、サンプル画像を逆畳み込みし、それによって、サンプル画像からのアーチファクトを低減または除去するための手段とを備え、逆畳み込みするための手段は、サンプルカバースリップから変位された第１の位置ｚ１において撮影された第１のサンプル画像を取り出し、第１の計算された点広がり関数を決定し、ｚ１における第１のサンプル画像からのアーチファクトを低減させ、ｚ１よりもサンプルカバースリップから遠くに除去された第２の位置ｚ２において撮影された、第２の画像を取り出し、逆畳み込みにおける始点広がり関数として第１の計算された点広がり関数を使用して、ｚ２における第２のサンプル画像からのアーチファクトを低減させるための第２の計算された点広がり関数を決定する、光学撮像システム。
【0149】
本技術の種々の側面または詳細が、本技術の範囲から逸脱することなく変更され得ることを理解されたい。さらに、前述の説明は、例証の目的のためにすぎず、限定の目的のためのものではなく、本技術は、請求項によって定義される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】