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特表2024-501739ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、その製造方法及び応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-15
(54)【発明の名称】ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、その製造方法及び応用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240105BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240105BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240105BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240105BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240105BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240105BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240105BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240105BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240105BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240105BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240105BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N15/12 ZNA
C12N15/13
C12N15/62
C12N15/85 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K14/705
C07K16/28
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540785
(86)(22)【出願日】2021-12-29
(85)【翻訳文提出日】2023-08-24
(86)【国際出願番号】 CN2021142404
(87)【国際公開番号】W WO2022143743
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】202011619032.1
(32)【優先日】2020-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522493078
【氏名又は名称】諾納生物（蘇州）有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｎｏｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｓｕｚｈｏｕ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ ２０２， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ａ３， ２１８ Ｘｉｎｇｈｕ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ， Ｓｕｚｈｏｕ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１５０００， Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】523249456
【氏名又は名称】南昌億諾科生物医薬有限責任公司
【氏名又は名称原語表記】Ｙｉｎｕｏｋｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３０４， Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｎｏ． ２８， Ｇａｏｘｉｎ ２ｎｄ Ｒｏａｄ， Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｈｉｇｈ－ｔｅｃｈ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ， Ｎａｎｃｈａｎｇ， Ｊｉａｎｇｘｉ ３３００９６， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】叢 艷▲ニ▼
(72)【発明者】
【氏名】張 領兵
(72)【発明者】
【氏名】▲デン▼ 長静
(72)【発明者】
【氏名】朱 広倍
(72)【発明者】
【氏名】周 亮
(72)【発明者】
【氏名】馬 瑞鵬
(72)【発明者】
【氏名】陳 銀
(72)【発明者】
【氏名】劉 礼楽
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA10
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質及びその製造方法と応用を提供する。ヒトＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質を用いてＨ２Ｌ２ヒト抗体トランスジェニックマウスを免疫し、単一Ｂ細胞クローニング技術（ＳＢＣ）及び単一Ｂ細胞シークエンシング分析を利用し、Ｆｃ組換えにより一連の生物学的機能を有するヒトＬＩＦＲ抗体が得られ、該方法は抗体薬物開発の効率及び収率を大幅に向上させ、且つ得られたヒトＬＩＦＲ抗体は良好な親和力を有し、ｈｕＬＩＦタンパク質とｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０細胞との結合を遮断することができ、ＳＴＡＴ３などのシグナル経路を抑制し、腫瘍の成長をさらに抑制し、腫瘍の予防及び治療の目的を達成する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）配列番号１－配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域１ ＨＣＤＲ１、（２）配列番号５－配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域２ ＨＣＤＲ２、
（３）配列番号１６－配列番号２５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域３ ＨＣＤＲ３、
（４）配列番号２６－配列番号３２のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域１ ＬＣＤＲ１、
（５）配列番号３３－配列番号４０のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域２ ＬＣＤＲ２、
（６）配列番号４１－配列番号４５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域３ ＬＣＤＲ３、
という相補性決定領域を含むヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質であり、
前記変異体配列は、その由来のＣＤＲと比較して、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有するＣＤＲ配列である、ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項2】
（１）ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＸ１に示すアミノ酸配列又は配列番号４：ＧＦＴＦＳＮＹＡＭＴに示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１ ＨＣＤＲ１であって、Ｘ１＝Ｈ、Ｄ又はＮ、及び／又は（２）ＶＩＷＹＤＧＸ２ＮＫＹＹＸ３ＤＳＶＫＧに示すアミノ酸配列、ＶＩＷＦＤＧＳＸ４ＫＹＹＡＤＳＶＫＧに示すアミノ酸配列、配列番号７：ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＦＹＡＤＳＶＲＧに示すアミノ酸配列、配列番号１４：ＴＩＳＧＳＧＡＦＴＹＹＡＤＡＶＫＧに示すアミノ酸配列又は配列番号１５：ＶＩＳＧＳＧＦＬＴＹＹＡＤＡＶＫＧに示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２ ＨＣＤＲ２であって、Ｘ２＝Ｎ又はＳ、Ｘ３＝Ｅ、Ａ又はＴ、Ｘ４＝Ｎ、Ｉ、Ｌ又はＶ、
及び／又は（３）配列番号１６：ＤＧＥＳＳＭＶＲＧＬＬＮＷＦＤＰに示すアミノ酸配列、配列番号１７：ＥＬＲＹＦＤＷＬＬＳＰＦＤＹに示すアミノ酸配列、配列番号２１：ＧＥＲＴＬＤＬに示すアミノ酸配列、ＥＬＷＦＧＥＬＬＳＰＸ５ＤＦに示すアミノ酸配列、ＧＱＬＶＸ６ＤＸ７に示すアミノ酸配列又はＧＧＩＬＴＧＦＤＸ８に示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３ ＨＣＤＲ３であって、Ｘ５＝Ｌ又はＦ、Ｘ６＝Ｇ又はＱ、Ｘ７＝Ｙ、Ｆ又はＬ、Ｘ８＝Ｎ又はＹ、
及び／又は（４）ＲＡＳＱＳＸ９ＳＳＳＸ１０ＬＡに示すアミノ酸配列、ＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１１ＬＸ１２に示すアミノ酸配列又は配列番号３２：ＲＡＳＱＮＬＮＳＮＬＡに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１ ＬＣＤＲ１であって、Ｘ９＝Ｖ又はＩ、Ｘ１０＝Ｙ又はＦ、Ｘ１１＝Ｙ、Ｗ又はＮ、Ｘ１２＝Ｎ又はＡ、
及び／又は（５）ＧＸ１３ＳＳＲＡＴに示すアミノ酸配列、ＫＡＳＸ１４ＬＥＸ１５に示すアミノ酸配列、配列番号３５：ＡＡＳＮＲＡＴに示すアミノ酸配列、配列番号３６：ＡＡＳＳＬＱＳに示すアミノ酸配列又は配列番号４０：ＧＡＳＴＲＡＰに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２ ＬＣＤＲ２であって、Ｘ１３＝Ａ又はＴ、Ｘ１４＝Ｓ又はＮ、Ｘ１５＝Ｓ又はＮ、
及び／又は（６）配列番号４１：ＱＱＹＧＳＳＰＦＴに示すアミノ酸配列、配列番号４２：ＱＱＳＹＳＴＰＬＴに示すアミノ酸配列、配列番号４３：ＱＱＹＫＳＦＳＰＧＧＬＴに示すアミノ酸配列、配列番号４４：ＱＱＹＫＳＮＰＬＴに示すアミノ酸配列又は配列番号４５：ＱＱＹＮＮＷＰＲＴに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３ ＬＣＤＲ３、
という相補性決定領域を含む、請求項１に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項3】
（１）、配列番号４６－配列番号５９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び／又は配列番号６０－配列番号６９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は（２）、（１）のいずれかのＶＨと比べて少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び／又は、（１）のいずれかのＶＬと比べて少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ、
又は（３）、（１）のいずれかのＶＨと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はその任意の組み合わせを有するＶＨ、及び／又は、（１）のいずれかのＶＬと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はその任意の組み合わせを有するＶＬ、
を含み、
前記の置換は保存的置換である、請求項２に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項4】
（１）配列番号７０－配列番号８３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖ＨＣ、及び／又は配列番号８４－配列番号９３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む軽鎖ＬＣ、又は（２）重鎖及び軽鎖であって、（１）の重鎖及び軽鎖と比較して、前記重鎖は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び／又は、前記軽鎖は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖及び軽鎖、
を含む、請求項３に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項5】
（１）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号５に示すＨＣＤＲ２、配列番号１６に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、及び／又は（２）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号７に示すＨＣＤＲ２、配列番号１８に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、及び／又は
（３）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号６に示すＨＣＤＲ２、配列番号１７に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２７に示すＬＣＤＲ１、配列番号３４に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、及び／又は
（４）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号７に示すＨＣＤＲ２、配列番号１９に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、及び／又は
（５）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１２に示すＨＣＤＲ２、配列番号２３に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、及び／又は
（６）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１０に示すＨＣＤＲ２、配列番号２０に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２９に示すＬＣＤＲ１、配列番号３６に示すＬＣＤＲ２、配列番号４２に示すＬＣＤＲ３、及び／又は
（７）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１０に示すＨＣＤＲ２、配列番号２１に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３７に示すＬＣＤＲ２、配列番号４３に示すＬＣＤＲ３、及び／又は
（８）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、及び／又は
（９）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３９に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、及び／又は
（１０）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、及び／又は
（１１）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１３に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
を含む、請求項１－４のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項6】
（１）配列番号４６に示すＶＨ、及び／又は配列番号６０に示すＶＬ、（２）配列番号４８に示すＶＨ、及び／又は配列番号６２に示すＶＬ、
（３）配列番号４７に示すＶＨ、及び／又は配列番号６１に示すＶＬ、
（４）配列番号４９に示すＶＨ、及び／又は配列番号６２に示すＶＬ、
（５）配列番号５５に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（６）配列番号５２に示すＶＨ、及び／又は配列番号６５に示すＶＬ、
（７）配列番号５３に示すＶＨ、及び／又は配列番号６６に示すＶＬ、
（８）配列番号５４に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（９）配列番号５４に示すＶＨ、及び／又は配列番号６８に示すＶＬ、
（１０）配列番号５６に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（１１）配列番号５７に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
又は、（１）－（１１）のいずれかのＶＨと比較して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び／又は（１）－（１１）のいずれかのＶＬと比較して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ、
又は、（１）－（１１）のいずれかのＶＨと比較して、１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はそれらの任意の組み合わせを有するＶＨ、及び／又は、（１）－（１１）のいずれかのＶＬと比較して、１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はそれらの任意の組み合わせを有するＶＬ、
を含み、
前記の置換は保存的置換である、請求項５に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項7】
（１）配列番号７０に示すＨＣ、及び／又は配列番号８４に示すＬＣ、（２）配列番号７２に示すＨＣ、及び／又は配列番号８６に示すＬＣ、
（３）配列番号７１に示すＨＣ、及び／又は配列番号８５に示すＬＣ、
（４）配列番号７３に示すＨＣ、及び／又は配列番号８６に示すＬＣ、
（５）配列番号７９に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（６）配列番号７６に示すＨＣ、及び／又は配列番号８９に示すＬＣ、
（７）配列番号７７に示すＨＣ、及び／又は配列番号９０に示すＬＣ、
（８）配列番号７８に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（９）配列番号７８に示すＨＣ、及び／又は配列番号９２に示すＬＣ、
（１０）配列番号８０に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（１１）配列番号８１に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
又は、重鎖及び軽鎖であって、（１）－（１１）の重鎖及び軽鎖と比較して、前記重鎖は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び／又は、前記軽鎖は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖及び軽鎖、
を含む、請求項６に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項8】
キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体を含む、請求項１－７のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項9】
全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体及び／又は単一ドメイン抗体、又は前記抗体から製造されたモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を含む、請求項１－８のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項10】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項11】
請求項１０に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項12】
請求項１０に記載の核酸分子又は請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項13】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項14】
請求項１３に記載のキメラ抗原受容体を含む、免疫細胞。
【請求項15】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質と、酵素、放射性核種、蛍光染料、発光物質又はビオチンである検出可能な標識分子とを含む、抗原結合タンパク質誘導体。
【請求項16】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質と、別の抗体又はその断片又は抗体類似体とを含み、二重特異性抗体、三重特異性抗体又は四重特異性抗体である、多重特異性抗体。
【請求項17】
抗体薬物複合体であって、前記抗体薬物複合体は、抗体部分と複合部分とを含み、
前記抗体部分は、請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を含み、
前記複合部分は、検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されず、
前記抗体部分と複合部分とは、化学結合又はリンカーによって複合される、抗体薬物複合体。
【請求項18】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、請求項１４に記載の免疫細胞、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質誘導体、請求項１６に記載の多重特異性抗体及び／又は請求項１７に記載の抗体薬物複合体、及び任意の薬学的に許容されるベクターを含む、薬物組成物。
【請求項19】
前記薬物組成物は、組み合わせ治療剤をさらに含み、前記組み合わせ治療剤は、化学治療剤、放射線治療剤、免疫抑制剤、細胞毒性薬を含むが、これらに限定されない、請求項１８に記載の薬物組成物。
【請求項20】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質の製造方法であって、請求項１－９のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を発現させた状態で、請求項１２に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項21】
（１）ＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質を抗原としてマウスの免疫を行うステップ、（２）抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞のスクリーニングを行うステップ、
（３）ステップ（２）でスクリーニングされた単一Ｂ細胞から抗体重鎖及び軽鎖の配列を回復するステップ、
（４）ステップ（３）で回復した抗体重鎖と軽鎖を宿主細胞に導入し、細胞培養、精製してヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を得るステップ、
を含む、請求項２０に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質の製造方法。
【請求項22】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体、請求項１４に記載の免疫細胞、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質誘導体、請求項１６に記載の多重特異性抗体、請求項１７に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１８－１９に記載の薬物組成物の、ＬＩＦ及び／又はＬＩＦＲ遮断薬物、キット及び／又は医療装置の製造における応用。
【請求項23】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３に記載の宿主細胞、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体、請求項１５に記載の免疫細胞、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質誘導体、請求項１７に記載の多重特異性抗体、請求項１８に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１９－２０に記載の薬物組成物の、ＬＩＦＲ陽性疾患を予防及び／又は治療するための薬物、キット及び／又は投与装置の製造における応用。
【請求項24】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質誘導体の、ＬＩＦＲ検出試薬又はキットの製造における応用。
【請求項25】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を用いてＬＩＦＲを定性的又は定量的に分析して検出する、ＬＩＦＲ検出方法。
【請求項26】
ＬＩＦＲ陽性関連疾患の治療方法であって、有効量の請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、請求項１４に記載の免疫細胞、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質誘導体、請求項１６に記載の多重特異性抗体、請求項１７に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１８－１９に記載の薬物組成物を必要な被験者に投与する、方法。
【請求項27】
前記ＬＩＦＲ陽性疾患は、腫瘍であり、前記腫瘍は、胆管癌、結腸直腸癌、神経膠腫、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、鼻咽頭癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌及び非小細胞肺癌を含むが、これらに限定されない、請求項２３に記載の応用又は請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
請求項１－９のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体、請求項１４に記載の免疫細胞、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質誘導体、請求項１６に記載の多重特異性抗体、請求項１７に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１８－１９に記載の薬物組成物、並びに任意の説明書を含む、キット。
【請求項29】
（１）必要な被験者に請求項１８又は１９に記載の薬物組成物を投与するための輸液モジュール、及び（２）任意の薬効監視モジュールを含む、投与装置。
【請求項30】
ＬＩＦＲ抗原結合タンパク質の癌治療薬の製造における応用であって、前記癌は、胆管癌、結腸直腸癌、神経膠腫、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、鼻咽頭癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌及び非小細胞肺癌から選択される、応用。
【請求項31】
前記ＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、請求項１－９のいずれか一項に記載のものである、請求項３０に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物薬物分野に属し、具体的には、ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、その製造方法及び応用に関する。
【背景技術】
【0002】
白血病阻止因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ＬＩＦ）は、多種の生物学的機能を有するサイトカインであり、Ｍ１骨髄系白血病細胞の正常細胞への分化を誘導するために命名される。ＬＩＦはインターロイキン－６（ＩＬ－６）ファミリーに属し、後者はさらにＩＬ－１１、ＩＬ－２７、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ－１（ＣＴ－１）及びＯｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ（ＯＳＭ）などを含み、これらのサイトカインはＬＩＦとｇｐ１３０受容体を共有するため、ＬＩＦは他のファミリーメンバーと重なって独特の生物学的作用を有する。
【0003】
哺乳動物におけるＬＩＦタンパク質は、１８０個のアミノ酸残基からなり、高度な保存性を有し、ヒトのＬＩＦ遺伝子は染色体２２ｑ１２にコードされ、マウスＬＩＦ遺伝子は１１番染色体に位置決めされ、マウスとヒトのＬＩＦ遺伝子の相同性は＞７５％である。成熟ＬＩＦタンパク質は、高度なグリコシル化分泌タンパク質であり、卵母細胞とヒト胚の胚外細胞、子宮内膜細胞、線維芽細胞、肝細胞、単核性マクロファージなどの多種の成体細胞から分泌される。異なる組織由来のＬＩＦタンパク質のグリコシル化は異なり、その中で最も多く研究されているのは分泌型の変異可能なグリコシル化タンパク質（３４－６３ｋＤａ）であり、それは自己分泌誘導と広範な傍分泌効果を有し、このような作用は細胞タイプと背景の違いにより互いに矛盾する可能性があり、例えば増殖と分化、生存とアポトーシスなどである。
【0004】
ＬＩＦは、主にその特異的なＬＩＦ受容体（ＬＩＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＩＦＲ）に結合し、次にｇｐ１３０受容体サブユニットを募集して高親和力のヘテロダイマー受容体複合体を形成し、下流のＪＡＫ／ＳＴＡＴ３、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＥＲＫ１／２、ＭＡＰＫなどのシグナル経路の活性化を誘導することにより、様々な細胞機能を発揮し、細胞の増殖と生存を調節する。また、ＬＩＦＲは、中枢神経系、腎臓、肝臓、骨、子宮などの多種の組織器官に豊富に発現される。ＬＩＦとＬＩＦＲの広い分布と数本のＬＩＦシグナル経路は、ＬＩＦ機能の複雑な多様性を決定する。
【0005】
ＬＩＦ経路は、免疫学分野において非常に有望な新しい標的である。ＬＩＦシグナル経路は腫瘍の発生と進展において重要な役割を果たし、腫瘍細胞の転移と浸潤を増強し、腫瘍転移を促進することができ、同時に腫瘍微小環境におけるエフェクターＴ細胞（Ｔ－ｅｆｆ）、制御性Ｔ細胞（Ｔ－ｒｅｇ）、Ｔｈ１７及び骨髄系細胞などを含む複数の免疫細胞を調節することができることが報告されている。研究により、ＬＩＦシグナル経路は、腫瘍開始細胞（ＣＩＣ）の活性を促進し、抗腫瘍治療（化学療法及び放射線療法）の耐性を増強できることが示されている。複数の癌において、ＬＩＦの高発現は予後不良に関連する。
【0006】
特許ＣＮ１１１３７８０３６Ａには、マウスハイブリドーマ細胞技術を採用して抗ヒト白血病阻止因子モノクローナル抗体を製造する、抗ヒト白血病阻止因子（ＬＩＦ）モノクローナル抗体の製造方法及びその応用が開示されているが、当該方法は、抗体スクリーニングの効率及び収率が低い。特許ＣＮ１１１８６８０８６Ａには、一連の抗ＬＩＦ抗体及びその応用が開示されており、そのＬＩＦ抗体はＬＩＦ独特のエピトープに結合してＬＩＦの生物活性を抑制することができる。
【0007】
現在、臨床的にＬＩＦターゲットに対する抗体としてＮｏｒｔｈｅｒｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓのＭＳＣ－１抗体があり、該抗体は２０１９年にＩ期臨床研究を完成し、現在、複数の臨床治療効果試験を行う予定があり、ＭＳＣ－１を膵臓癌及び肺癌などの一連の固形腫瘍の治療に用いる。ＭＳＣ－１抗体は、ヒト化モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）であり、免疫抑制ヒトサイトカインＬＩＦと結合して、成人後期固形腫瘍患者の治療に用いられる。しかしながら、ＭＳＣ－１抗体は、ＬＩＦの特異的エピトープにしか結合できないため、ＬＩＦと受容体との結合を完全に競合することができない。ＥＣ３５９はＬＩＦＲを標的とする小分子阻害剤である（ＥＣ３５９：Ａ Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｃｌａｓｓ Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ＬＩＦＲ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，ＤＯＩ：１０．１１５８／１５３５－７１６３．ＭＣＴ－１８－１２５８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
従来技術においてＬＩＦＲに対する治療性抗体についての報告がないため、ＬＩＦＲ関連疾患の治療に用いられ、ＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）に対する効率的かつ特異的な抗原遮断結合タンパク質が必要である。
【0009】
前記欠点に対して、本発明は初めて完全ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質及びその製造方法と応用を提供する。本発明は、ヒトＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質を用いてＨ２Ｌ２ヒト抗体トランスジェニックマウスを免疫し、単一Ｂ細胞クローニング技術（ＳＢＣ）を利用して、生物学的機能を有する一連のヒトＬＩＦＲ抗体を得て、該方法は、抗体薬物開発の効率及び収率を大幅に向上させ、且つ得られたヒトＬＩＦＲ抗体は良好な親和力を有し、ｈｕＬＩＦタンパク質とｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０細胞との結合を遮断することができ、ＳＴＡＴ３などのシグナル経路を抑制し、腫瘍の成長を抑制し、腫瘍の予防及び治療の目的を達成する。
【0010】
前記発明の目的を達成するために、本発明の技術構成は以下のとおりである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
一様態において、本発明は、ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を提供する。
具体的には、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、
（１）配列番号１－配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域１ ＨＣＤＲ１、
（２）配列番号５－配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域２ ＨＣＤＲ２、
（３）配列番号１６－配列番号２５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域３ ＨＣＤＲ３、
（４）配列番号２６－配列番号３２のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域１ ＬＣＤＲ１、
（５）配列番号３３－配列番号４０のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域２ ＬＣＤＲ２、
（６）配列番号４１－配列番号４５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域３ ＬＣＤＲ３、
という相補性決定領域を含む。
具体的には、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、
（１）配列番号１－配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域１ ＨＣＤＲ１、
（２）配列番号５－配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域２ ＨＣＤＲ２、
（３）配列番号１６－配列番号２５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域３ ＨＣＤＲ３、
（４）配列番号２６－配列番号３２のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域１ ＬＣＤＲ１、
（５）配列番号３３－配列番号４０のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域２ ＬＣＤＲ２、
（６）配列番号４１－配列番号４５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域３ ＬＣＤＲ３、
という相補性決定領域を含む。
【0012】
好ましくは、前記変異体配列は、その由来のＣＤＲと比較して、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有するＣＤＲ配列であり、前記置換は保存的置換である。
【0013】
さらに具体的には、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、
（１）ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＸ１に示すアミノ酸配列又は配列番号４：ＧＦＴＦＳＮＹＡＭＴに示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１ ＨＣＤＲ１であって、Ｘ１＝Ｈ、Ｄ又はＮ、
及び／又は（２）ＶＩＷＹＤＧＸ２ＮＫＹＹＸ３ＤＳＶＫＧに示すアミノ酸配列、ＶＩＷＦＤＧＳＸ４ＫＹＹＡＤＳＶＫＧに示すアミノ酸配列、配列番号７：ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＦＹＡＤＳＶＲＧに示すアミノ酸配列、配列番号１４：ＴＩＳＧＳＧＡＦＴＹＹＡＤＡＶＫＧに示すアミノ酸配列又は配列番号１５：ＶＩＳＧＳＧＦＬＴＹＹＡＤＡＶＫＧに示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２ ＨＣＤＲ２であって、Ｘ２＝Ｎ又はＳ、Ｘ３＝Ｅ、Ａ又はＴ、Ｘ４＝Ｎ、Ｉ、Ｌ又はＶ、
及び／又は（３）配列番号１６：ＤＧＥＳＳＭＶＲＧＬＬＮＷＦＤＰに示すアミノ酸配列、配列番号１７：ＥＬＲＹＦＤＷＬＬＳＰＦＤＹに示すアミノ酸配列、配列番号２１：ＧＥＲＴＬＤＬに示すアミノ酸配列、ＥＬＷＦＧＥＬＬＳＰＸ５ＤＦに示すアミノ酸配列、ＧＱＬＶＸ６ＤＸ７に示すアミノ酸配列又はＧＧＩＬＴＧＦＤＸ８に示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３ ＨＣＤＲ３であって、Ｘ５＝Ｌ又はＦ、Ｘ６＝Ｇ又はＱ、Ｘ７＝Ｙ、Ｆ又はＬ、Ｘ８＝Ｎ又はＹ、
及び／又は（４）ＲＡＳＱＳＸ９ＳＳＳＸ１０ＬＡに示すアミノ酸配列、ＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１１ＬＸ１２に示すアミノ酸配列又は配列番号３２：ＲＡＳＱＮＬＮＳＮＬＡに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１ ＬＣＤＲ１であって、Ｘ９＝Ｖ又はＩ、Ｘ１０＝Ｙ又はＦ、Ｘ１１＝Ｙ、Ｗ又はＮ、Ｘ１２＝Ｎ又はＡ、
及び／又は（５）ＧＸ１３ＳＳＲＡＴに示すアミノ酸配列、ＫＡＳＸ１４ＬＥＸ１５に示すアミノ酸配列、配列番号３５：ＡＡＳＮＲＡＴに示すアミノ酸配列、配列番号３６：ＡＡＳＳＬＱＳに示すアミノ酸配列又は配列番号４０：ＧＡＳＴＲＡＰに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２ ＬＣＤＲ２であって、Ｘ１３＝Ａ又はＴ、Ｘ１４＝Ｓ又はＮ、Ｘ１５＝Ｓ又はＮ、
及び／又は（６）配列番号４１：ＱＱＹＧＳＳＰＦＴに示すアミノ酸配列、配列番号４２：ＱＱＳＹＳＴＰＬＴに示すアミノ酸配列、配列番号４３：ＱＱＹＫＳＦＳＰＧＧＬＴに示すアミノ酸配列、配列番号４４：ＱＱＹＫＳＮＰＬＴに示すアミノ酸配列又は配列番号４５：ＱＱＹＮＮＷＰＲＴに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３ ＬＣＤＲ３、
という相補性決定領域を含む。
（１）ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＸ１に示すアミノ酸配列又は配列番号４：ＧＦＴＦＳＮＹＡＭＴに示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１ ＨＣＤＲ１であって、Ｘ１＝Ｈ、Ｄ又はＮ、
及び／又は（２）ＶＩＷＹＤＧＸ２ＮＫＹＹＸ３ＤＳＶＫＧに示すアミノ酸配列、ＶＩＷＦＤＧＳＸ４ＫＹＹＡＤＳＶＫＧに示すアミノ酸配列、配列番号７：ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＦＹＡＤＳＶＲＧに示すアミノ酸配列、配列番号１４：ＴＩＳＧＳＧＡＦＴＹＹＡＤＡＶＫＧに示すアミノ酸配列又は配列番号１５：ＶＩＳＧＳＧＦＬＴＹＹＡＤＡＶＫＧに示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２ ＨＣＤＲ２であって、Ｘ２＝Ｎ又はＳ、Ｘ３＝Ｅ、Ａ又はＴ、Ｘ４＝Ｎ、Ｉ、Ｌ又はＶ、
及び／又は（３）配列番号１６：ＤＧＥＳＳＭＶＲＧＬＬＮＷＦＤＰに示すアミノ酸配列、配列番号１７：ＥＬＲＹＦＤＷＬＬＳＰＦＤＹに示すアミノ酸配列、配列番号２１：ＧＥＲＴＬＤＬに示すアミノ酸配列、ＥＬＷＦＧＥＬＬＳＰＸ５ＤＦに示すアミノ酸配列、ＧＱＬＶＸ６ＤＸ７に示すアミノ酸配列又はＧＧＩＬＴＧＦＤＸ８に示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３ ＨＣＤＲ３であって、Ｘ５＝Ｌ又はＦ、Ｘ６＝Ｇ又はＱ、Ｘ７＝Ｙ、Ｆ又はＬ、Ｘ８＝Ｎ又はＹ、
及び／又は（４）ＲＡＳＱＳＸ９ＳＳＳＸ１０ＬＡに示すアミノ酸配列、ＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１１ＬＸ１２に示すアミノ酸配列又は配列番号３２：ＲＡＳＱＮＬＮＳＮＬＡに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１ ＬＣＤＲ１であって、Ｘ９＝Ｖ又はＩ、Ｘ１０＝Ｙ又はＦ、Ｘ１１＝Ｙ、Ｗ又はＮ、Ｘ１２＝Ｎ又はＡ、
及び／又は（５）ＧＸ１３ＳＳＲＡＴに示すアミノ酸配列、ＫＡＳＸ１４ＬＥＸ１５に示すアミノ酸配列、配列番号３５：ＡＡＳＮＲＡＴに示すアミノ酸配列、配列番号３６：ＡＡＳＳＬＱＳに示すアミノ酸配列又は配列番号４０：ＧＡＳＴＲＡＰに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２ ＬＣＤＲ２であって、Ｘ１３＝Ａ又はＴ、Ｘ１４＝Ｓ又はＮ、Ｘ１５＝Ｓ又はＮ、
及び／又は（６）配列番号４１：ＱＱＹＧＳＳＰＦＴに示すアミノ酸配列、配列番号４２：ＱＱＳＹＳＴＰＬＴに示すアミノ酸配列、配列番号４３：ＱＱＹＫＳＦＳＰＧＧＬＴに示すアミノ酸配列、配列番号４４：ＱＱＹＫＳＮＰＬＴに示すアミノ酸配列又は配列番号４５：ＱＱＹＮＮＷＰＲＴに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３ ＬＣＤＲ３、
という相補性決定領域を含む。
【0014】
さらに具体的には、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、
（１）、配列番号４６－配列番号５９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び／又は配列番号６０－配列番号６９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
又は（２）、（１）のいずれかのＶＨと比べて少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び／又は、（１）のいずれかのＶＬと比べて少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ、
又は（３）、（１）のいずれかのＶＨと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はその任意の組み合わせを有するＶＨ、及び／又は、（１）のいずれかのＶＬと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はその任意の組み合わせを有するＶＬ、
を含み、
前記の置換は保存的置換である。
（１）、配列番号４６－配列番号５９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び／又は配列番号６０－配列番号６９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
又は（２）、（１）のいずれかのＶＨと比べて少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び／又は、（１）のいずれかのＶＬと比べて少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ、
又は（３）、（１）のいずれかのＶＨと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はその任意の組み合わせを有するＶＨ、及び／又は、（１）のいずれかのＶＬと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はその任意の組み合わせを有するＶＬ、
を含み、
前記の置換は保存的置換である。
【0015】
さらに具体的には、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、
（１）配列番号７０－配列番号８３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖ＨＣ、及び／又は配列番号８４－配列番号９３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む軽鎖ＬＣ、
又は（２）重鎖及び軽鎖であって、（１）の重鎖及び軽鎖と比較して、前記重鎖は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び／又は、前記軽鎖は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖及び軽鎖、
を含む。
（１）配列番号７０－配列番号８３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖ＨＣ、及び／又は配列番号８４－配列番号９３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む軽鎖ＬＣ、
又は（２）重鎖及び軽鎖であって、（１）の重鎖及び軽鎖と比較して、前記重鎖は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び／又は、前記軽鎖は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖及び軽鎖、
を含む。
【0016】
さらに具体的には、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、
（１）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号５に示すＨＣＤＲ２、配列番号１６に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（２）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号６に示すＨＣＤＲ２、配列番号１７に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２７に示すＬＣＤＲ１、配列番号３４に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（３）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号７に示すＨＣＤＲ２、配列番号１８に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（４）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号７に示すＨＣＤＲ２、配列番号１９に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（５）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号８に示すＨＣＤＲ２、配列番号１９に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２８に示すＬＣＤＲ１、配列番号３５に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（６）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号９に示すＨＣＤＲ２、配列番号１９に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３５に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（７）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１０に示すＨＣＤＲ２、配列番号２０に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２９に示すＬＣＤＲ１、配列番号３６に示すＬＣＤＲ２、配列番号４２に示すＬＣＤＲ３、
（８）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１０に示すＨＣＤＲ２、配列番号２１に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３７に示すＬＣＤＲ２、配列番号４３に示すＬＣＤＲ３、
（９）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１０）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３９に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１１）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１２に示すＨＣＤＲ２、配列番号２３に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１２）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１３）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１３に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１４）配列番号４に示すＨＣＤＲ１、配列番号１４に示すＨＣＤＲ２、配列番号２４に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３１に示すＬＣＤＲ１、配列番号３７に示すＬＣＤＲ２、配列番号４３に示すＬＣＤＲ３、
（１５）配列番号４に示すＨＣＤＲ１、配列番号１５に示すＨＣＤＲ２、配列番号２５に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３２に示すＬＣＤＲ１、配列番号４０に示すＬＣＤＲ２、配列番号４５に示すＬＣＤＲ３、
を含む。
（１）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号５に示すＨＣＤＲ２、配列番号１６に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（２）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号６に示すＨＣＤＲ２、配列番号１７に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２７に示すＬＣＤＲ１、配列番号３４に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（３）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号７に示すＨＣＤＲ２、配列番号１８に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（４）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号７に示すＨＣＤＲ２、配列番号１９に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（５）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号８に示すＨＣＤＲ２、配列番号１９に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２８に示すＬＣＤＲ１、配列番号３５に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（６）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号９に示すＨＣＤＲ２、配列番号１９に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３５に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（７）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１０に示すＨＣＤＲ２、配列番号２０に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号２９に示すＬＣＤＲ１、配列番号３６に示すＬＣＤＲ２、配列番号４２に示すＬＣＤＲ３、
（８）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１０に示すＨＣＤＲ２、配列番号２１に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３７に示すＬＣＤＲ２、配列番号４３に示すＬＣＤＲ３、
（９）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１０）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３９に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１１）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１２に示すＨＣＤＲ２、配列番号２３に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１２）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１３）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１３に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１４）配列番号４に示すＨＣＤＲ１、配列番号１４に示すＨＣＤＲ２、配列番号２４に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３１に示すＬＣＤＲ１、配列番号３７に示すＬＣＤＲ２、配列番号４３に示すＬＣＤＲ３、
（１５）配列番号４に示すＨＣＤＲ１、配列番号１５に示すＨＣＤＲ２、配列番号２５に示すＨＣＤＲ３、及び／又は配列番号３２に示すＬＣＤＲ１、配列番号４０に示すＬＣＤＲ２、配列番号４５に示すＬＣＤＲ３、
を含む。
【0017】
好ましくは、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、Ｍｅｇａソフトウェアを用いて配列類似性分析を行い、以下の五つの群を含む。
群１：（１）に記載の抗原結合タンパク質、
群２：（２）、（３）、（４）に記載の抗原結合タンパク質、
群３：（５）、（６）に記載の抗原結合タンパク質、
群４：（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）に記載の抗原結合タンパク質、
群５：（１４）、（１５）に記載の抗原結合タンパク質。
群１：（１）に記載の抗原結合タンパク質、
群２：（２）、（３）、（４）に記載の抗原結合タンパク質、
群３：（５）、（６）に記載の抗原結合タンパク質、
群４：（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）に記載の抗原結合タンパク質、
群５：（１４）、（１５）に記載の抗原結合タンパク質。
【0018】
さらに具体的には、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、
（１）配列番号４６に示すＶＨ、及び／又は配列番号６０に示すＶＬ、
（２）配列番号４７に示すＶＨ、及び／又は配列番号６１に示すＶＬ、
（３）配列番号４８に示すＶＨ、及び／又は配列番号６２に示すＶＬ、
（４）配列番号４９に示すＶＨ、及び／又は配列番号６２に示すＶＬ、
（５）配列番号５０に示すＶＨ、及び／又は配列番号６３に示すＶＬ、
（６）配列番号５１に示すＶＨ、及び／又は配列番号６４に示すＶＬ、
（７）配列番号５２に示すＶＨ、及び／又は配列番号６５に示すＶＬ、
（８）配列番号５３に示すＶＨ、及び／又は配列番号６６に示すＶＬ、
（９）配列番号５４に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（１０）配列番号５４に示すＶＨ、及び／又は配列番号６８に示すＶＬ、
（１１）配列番号５５に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（１２）配列番号５６に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（１３）配列番号５７に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（１４）配列番号５８に示すＶＨ、及び／又は配列番号６６に示すＶＬ、
（１５）配列番号５９に示すＶＨ、及び／又は配列番号６９に示すＶＬ、
又は、（１）－（１５）のいずれかのＶＨと比較して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び／又は（１）－（１５）のいずれかのＶＬと比較して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ、
又は、（１）－（１５）のいずれかのＶＨと比較して、１又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はそれらの任意の組み合わせを有するＶＨ、及び／又は、（１）－（１５）のいずれかのＶＬと比較して、１又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はそれらの任意の組み合わせを有するＶＬ、
を含み、
前記の置換は保存的置換である。
（１）配列番号４６に示すＶＨ、及び／又は配列番号６０に示すＶＬ、
（２）配列番号４７に示すＶＨ、及び／又は配列番号６１に示すＶＬ、
（３）配列番号４８に示すＶＨ、及び／又は配列番号６２に示すＶＬ、
（４）配列番号４９に示すＶＨ、及び／又は配列番号６２に示すＶＬ、
（５）配列番号５０に示すＶＨ、及び／又は配列番号６３に示すＶＬ、
（６）配列番号５１に示すＶＨ、及び／又は配列番号６４に示すＶＬ、
（７）配列番号５２に示すＶＨ、及び／又は配列番号６５に示すＶＬ、
（８）配列番号５３に示すＶＨ、及び／又は配列番号６６に示すＶＬ、
（９）配列番号５４に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（１０）配列番号５４に示すＶＨ、及び／又は配列番号６８に示すＶＬ、
（１１）配列番号５５に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（１２）配列番号５６に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（１３）配列番号５７に示すＶＨ、及び／又は配列番号６７に示すＶＬ、
（１４）配列番号５８に示すＶＨ、及び／又は配列番号６６に示すＶＬ、
（１５）配列番号５９に示すＶＨ、及び／又は配列番号６９に示すＶＬ、
又は、（１）－（１５）のいずれかのＶＨと比較して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び／又は（１）－（１５）のいずれかのＶＬと比較して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ、
又は、（１）－（１５）のいずれかのＶＨと比較して、１又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はそれらの任意の組み合わせを有するＶＨ、及び／又は、（１）－（１５）のいずれかのＶＬと比較して、１又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はそれらの任意の組み合わせを有するＶＬ、
を含み、
前記の置換は保存的置換である。
【0019】
さらに具体的には、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、
（１）配列番号７０に示すＨＣ、及び／又は配列番号８４に示すＬＣ、
（２）配列番号７１に示すＨＣ、及び／又は配列番号８５に示すＬＣ、
（３）配列番号７２に示すＨＣ、及び／又は配列番号８６に示すＬＣ、
（４）配列番号７３に示すＨＣ、及び／又は配列番号８６に示すＬＣ、
（５）配列番号７４に示すＨＣ、及び／又は配列番号８７に示すＬＣ、
（６）配列番号７５に示すＨＣ、及び／又は配列番号８８に示すＬＣ、
（７）配列番号７６に示すＨＣ、及び／又は配列番号８９に示すＬＣ、
（８）配列番号７７に示すＨＣ、及び／又は配列番号９０に示すＬＣ、
（９）配列番号７８に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（１０）配列番号７８に示すＨＣ、及び／又は配列番号９２に示すＬＣ、
（１１）配列番号７９に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（１２）配列番号８０に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（１３）配列番号８１に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（１４）配列番号８２に示すＨＣ、及び／又は配列番号９０に示すＬＣ、
（１５）配列番号８３に示すＨＣ、及び／又は配列番号９３に示すＬＣ、
又は、重鎖及び軽鎖であって、（１）－（１５）の重鎖及び軽鎖と比較して、前記重鎖は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び／又は、前記軽鎖は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖及び軽鎖、
を含む。
（１）配列番号７０に示すＨＣ、及び／又は配列番号８４に示すＬＣ、
（２）配列番号７１に示すＨＣ、及び／又は配列番号８５に示すＬＣ、
（３）配列番号７２に示すＨＣ、及び／又は配列番号８６に示すＬＣ、
（４）配列番号７３に示すＨＣ、及び／又は配列番号８６に示すＬＣ、
（５）配列番号７４に示すＨＣ、及び／又は配列番号８７に示すＬＣ、
（６）配列番号７５に示すＨＣ、及び／又は配列番号８８に示すＬＣ、
（７）配列番号７６に示すＨＣ、及び／又は配列番号８９に示すＬＣ、
（８）配列番号７７に示すＨＣ、及び／又は配列番号９０に示すＬＣ、
（９）配列番号７８に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（１０）配列番号７８に示すＨＣ、及び／又は配列番号９２に示すＬＣ、
（１１）配列番号７９に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（１２）配列番号８０に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（１３）配列番号８１に示すＨＣ、及び／又は配列番号９１に示すＬＣ、
（１４）配列番号８２に示すＨＣ、及び／又は配列番号９０に示すＬＣ、
（１５）配列番号８３に示すＨＣ、及び／又は配列番号９３に示すＬＣ、
又は、重鎖及び軽鎖であって、（１）－（１５）の重鎖及び軽鎖と比較して、前記重鎖は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び／又は、前記軽鎖は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖及び軽鎖、
を含む。
【0020】
さらに具体的には、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体を含む。
【0021】
さらに具体的には、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体及び／又は単一ドメイン抗体、又は前記抗体から製造されたモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を含む。
【0022】
別の様態において、本発明は、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質をコードする一連の核酸分子を提供する。
【0023】
具体的には、前記核酸分子は、コドン最適化された１つ又は複数の核酸分子を含む。
【0024】
別の様態において、本発明は、本発明に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む一連のベクターを提供する。
【0025】
具体的には、前記ベクターは、プラスミド、ウイルス、ファージを含むが、これらに限定されない。
【0026】
別の様態において、本発明は、前記核酸分子又は前記ベクターを含む一連の宿主細胞を提供する。
【0027】
具体的には、前記宿主細胞は、微生物、植物又は動物細胞を含むが、これらに限定されず、当業者に既知の方法、例えばエレクトロポレーション、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅトランスフェクション、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎトランスフェクションなどの方法により、本発明に記載のベクターを前記宿主細胞に導入することができる。
【0028】
別の様態において、本発明は、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を含むキメラ抗原受容体を提供する。
【0029】
別の様態において、本発明は、前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を提供する。
【0030】
別の様態において、本発明は、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質と検出可能な標識分子とを含む抗原結合タンパク質誘導体を提供する。
【0031】
具体的には、前記検出可能な標識分子は、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光染料、発光物質（例えば化学発光物質）又はビオチンである。
【0032】
別の態様では、本発明は、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質と、別の抗体又はその断片又は抗体類似体とを含む多重特異性抗体を提供する。
【0033】
具体的には、前記多重特異性抗体は、二重特異性抗体又は三重特異性抗体又は四重特異性抗体である。
【0034】
別の態様では、本発明は、抗体薬物複合体を提供し、前記抗体薬物複合体は抗体部分と複合体部分を含み、前記抗体部分は前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を含み、前記複合体部分は検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されず、前記抗体部分と複合体部分は化学結合又はリンカーによって複合される。
【0035】
別の態様では、本発明は、前記のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、キメラ抗原受容体、免疫細胞、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体及び／又は抗体薬物複合体を含む、薬物組成物を提供する。
【0036】
具体的には、前記薬物組成物は、任意の薬学的に許容されるベクターをさらに含む。
【0037】
さらに具体的には、前記薬学的に許容されるベクターは、希釈剤、賦形剤、充填剤、湿潤剤、崩壊剤、矯味剤及び結合剤を含むが、これらに限定されない。
【0038】
具体的には、前記薬物組成物は、組み合わせ治療剤をさらに含み、前記組み合わせ治療剤は、化学治療剤、放射線治療剤、免疫抑制剤、細胞毒性薬を含むが、これらに限定されない。
【0039】
さらに別の態様では、本発明は、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質の製造方法を提供し、前記方法は、前記抗原結合タンパク質を発現させた状態で、前記の宿主細胞を培養することを含む。
【0040】
具体的には、前記方法は、
（１）ＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質を抗原としてマウスの免疫を行うステップ、
（２）抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞のスクリーニングを行うステップ、
（３）ステップ（２）でスクリーニングされた単一Ｂ細胞から抗体重鎖及び軽鎖の配列を回復するステップ、
（４）ステップ（３）で回復した抗体重鎖及び軽鎖をヒトＦｃと組換え、宿主細胞に導入し、細胞培養、精製してヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を得るステップ、
を含む。
（１）ＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質を抗原としてマウスの免疫を行うステップ、
（２）抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞のスクリーニングを行うステップ、
（３）ステップ（２）でスクリーニングされた単一Ｂ細胞から抗体重鎖及び軽鎖の配列を回復するステップ、
（４）ステップ（３）で回復した抗体重鎖及び軽鎖をヒトＦｃと組換え、宿主細胞に導入し、細胞培養、精製してヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を得るステップ、
を含む。
【0041】
より具体的には、ステップ（１）に記載のマウスはヒト化マウスである。
【0042】
好ましくは、前記ヒト化マウスはＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２マウスであり、前記ＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２トランスジェニックマウスは、完全ヒト可変領域を有する従来の２重鎖２軽鎖免疫グロブリン抗体を産生することができる。
【0043】
さらに具体的には、ステップ（２）に記載の抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞をスクリーニングする方法は、Ｂｅａｃｏｎ光電システムの形質細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）発見ワークフローを使用してスクリーニングすることである。
【0044】
より具体的には、ステップ（３）に記載の抗体重鎖及び軽鎖の配列を回復する方法は、単一Ｂ細胞シーケンシングである。
【0045】
さらに具体的には、前記単一Ｂ細胞シークエンシングのステップは、単一Ｂ細胞溶解液からＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡの逆転写合成、ｃＤＮＡの増幅精製、重鎖及び軽鎖の増幅、クローン及びトランスフェクション、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングであり、得られた配列に対して唯一性及びクラスタリングを行い、最後にペアとなる重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列に対してプラスミド合成を行う。
【0046】
別の態様では、本発明は、前記のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、キメラ抗原受容体、免疫細胞、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体、及び／又は薬物組成物の、ＬＩＦ及び／又はＬＩＦＲ遮断薬物、キット、及び／又は医療装置の製造における応用を提供する。
【0047】
具体的には、前記のＬＩＦＲ遮断薬物、キット及び／又は装置は、主にＬＩＦ及び／又はＬＩＦＲ発現量が増加する疾患に適用される。
【0048】
別の態様では、本発明は、前記のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、キメラ抗原受容体、免疫細胞、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体、及び／又は薬物組成物の、ＬＩＦＲ陽性疾患を予防及び／又は治療するための薬物、キット、及び／又は投与装置の製造における応用を提供する。
【0049】
別の態様では、本発明は、前記のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質誘導体の、ＬＩＦＲ検出試薬又はキットの製造における応用を提供する。
【0050】
別の様態において、本発明は、前記のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を利用してＬＩＦＲを定性的又は定量的に分析して検出するＬＩＦＲ検出方法を提供し、好ましくは、前記検出方法は非疾患診断又は非治療の目的に用いられる。
【0051】
別の態様では、本発明は、ＬＩＦＲ陽性関連疾患の治療方法を提供し、前記治療方法は、有効量の前記のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、免疫細胞、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体及び／又は薬物組成物を必要な被験者に投与する。
【0052】
具体的には、前記ＬＩＦＲ陽性疾患は腫瘍であり、前記腫瘍は胆管癌、結腸直腸癌、神経膠腫、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、鼻咽頭癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、非小細胞肺癌を含むが、これらに限定されない。
【0053】
別の様態において、本発明は、前記のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、キメラ抗原受容体、免疫細胞、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体及び／又は薬物組成物、並びに任意の説明書を含むキットを提供する。
【0054】
別の態様では、本発明は、（１）必要な被験者に前記薬物組成物を投与するための輸液モジュール、及び（２）任意の薬効監視モジュールを含む投与装置を提供する。
【0055】
別の態様では、本発明は、ＬＩＦＲ抗原結合タンパク質の癌治療薬の製造における応用を提供し、前記癌は、胆管癌、結腸直腸癌、神経膠腫、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、鼻咽頭癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、非小細胞肺癌から選択される。
【0056】
具体的には、前記ＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、前記いずれかのＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を含む。
【発明の効果】
【0057】
従来技術と比較して、本発明は以下のような有利な効果を有する。
（１）本発明は、ヒトＬＩＦＲ抗体を初めて提供し、前記ヒトＬＩＦＲ抗体は、ヒト抗体トランスジェニックマウス（例えば、ＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２マウス）の免疫によって製造され、完全ヒト抗体アミノ酸と遺伝子配列を有することにより、人体使用時の可能性が最も低い免疫原性を確保し、毒性副作用を除去する。
（２）本発明は単一Ｂ細胞クローニング技術（ＳＢＣ）を用いて陽性クローンをスクリーニングし、従来のモノクローナル抗体スクリーニング技術に比べて、抗体発見の効率と収率を大幅に向上させることができる。
（３）本発明で製造されたヒトＬＩＦＲ抗体は、特異性が高く、親和力が高く、抗腫瘍活性が良い。
（４）本発明の抗体は、完全ヒト抗体であるため、免疫原性反応を引き起こすことなく、ヒト被験者に安全に投与することができ、重大な臨床価値を有する。
（１）本発明は、ヒトＬＩＦＲ抗体を初めて提供し、前記ヒトＬＩＦＲ抗体は、ヒト抗体トランスジェニックマウス（例えば、ＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２マウス）の免疫によって製造され、完全ヒト抗体アミノ酸と遺伝子配列を有することにより、人体使用時の可能性が最も低い免疫原性を確保し、毒性副作用を除去する。
（２）本発明は単一Ｂ細胞クローニング技術（ＳＢＣ）を用いて陽性クローンをスクリーニングし、従来のモノクローナル抗体スクリーニング技術に比べて、抗体発見の効率と収率を大幅に向上させることができる。
（３）本発明で製造されたヒトＬＩＦＲ抗体は、特異性が高く、親和力が高く、抗腫瘍活性が良い。
（４）本発明の抗体は、完全ヒト抗体であるため、免疫原性反応を引き起こすことなく、ヒト被験者に安全に投与することができ、重大な臨床価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】本発明に係るヒトＬＩＦＲ抗体のタンパク質レベルでのＬＩＦＲ－ＥＣＤとの結合能検出図であり、そのうち、Ａは本発明に係るヒトＬＩＦＲ抗体とヒトＬＩＦＲ－ＥＣＤとの結合能検出結果であり、Ｂは本発明に係るヒトＬＩＦＲ抗体とサルＬＩＦＲ－ＥＣＤとの結合能検出結果であり、Ｃは本発明に係るヒトＬＩＦＲ抗体とマウスＬＩＦＲ－ＥＣＤとの結合能検出結果である。
【図2】本発明に係る抗体の細胞レベルでのＬＩＦＲ及びＬＩＦＲ／ｇｐ１３０との結合能検出図であり、ここで、Ａは本発明に係る抗体とＬＩＦＲとの結合能検出結果であり、Ｂは本発明に係る抗体とＬＩＦＲ／ｇｐ１３０との結合能検出結果である。
【図3】本発明に係る抗体のＬＩＦとＬＩＦＲ／ｇｐ１３０との結合の遮断能の検出図である。
【図4-1】本発明に係る抗体のＳＴＡＴ３シグナル経路に対する阻害作用の検出図である。
【図4-2】同上。
【図5】本発明に係る抗体のＢａｌｂ／ｃマウス体内におけるＰＫ検出図である。
【図6】本発明に係る抗体のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット体内でのＰＫ検出図であり、ここで、ＡはＰＲ３００５１６抗体のラット体内でのＰＫ検出図であり、ＢはＰＲ３０１１６８抗体のラット体内でのＰＫ検出図であり、ＣはＰＲ３００５１６抗体とＰＲ３０１１６８抗体のラット体内でのＰＫ平均値検出図である。
【図8】本発明に係る抗体のＣａｐａｎ－２マウスモデル体内での薬力学試験検出図である。
【図9-1】本発明に係る抗体のＣａｐａｎ－１マウスモデル体内での薬力学試験検出図である。
【図9-2】同上。
【図10】本発明に係る抗体のＮＣＩ－Ｈ２９２モデルマウスモデル体内での薬力学試験検出図である。
【発明を実施するための形態】
【0059】
以下、具体的な実施例を参照しながら、本発明をさらに詳しく説明し、下記の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明を説明するためのものに過ぎない。以下の実施例において使用される試験方法は、特に説明しない限り、実施例において具体的な条件が明記されていない試験方法は通常の条件であり、下記の実施例において使用される材料、試薬などは、特に説明しない限り、いずれも商業的に入手できる。
【0060】
（用語の定義）
本発明をより容易に理解するために、以下、いくつかの技術用語及び科学用語を具体的に定義する。本明細書において他に明確に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての他の技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解する意味を有する。
本発明をより容易に理解するために、以下、いくつかの技術用語及び科学用語を具体的に定義する。本明細書において他に明確に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての他の技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解する意味を有する。
【0061】
本発明に用いられるアミノ酸３文字コード及び１文字コードは、例えばＪ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ委員会）に記載されている。
【0062】
本発明に記載の「抗原結合タンパク質」とは、通常、抗原に結合する部分を含むタンパク質を指し、任意に抗原に結合する部分が抗原結合タンパク質と抗原との結合を促進する配座のステント又は骨格部分を採用することを可能にする。典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）又はその両方を含み得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷＲ）と呼ばれるより保守的な領域に分散された相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域として区別することができる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗原結合断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ及び／又はｄＡｂ）、免疫複合体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、抗体断片、抗体誘導体、抗体類似体、キメラ抗原受容体又は融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されず、所望の抗原結合活性を示すものであればよい。
【0063】
本発明に記載の「抗体」とは、免疫グロブリンを指し、２本の同じ重鎖と２本の同じ軽鎖が鎖間ジスルフィド結合により連結されたテトラペプチド鎖構造である。免疫グロブリンの重鎖定常領域のアミノ酸組成及び配列順序が異なるため、その抗原性も異なる。これにより、免疫グロブリンを５種類、又は免疫グロブリンのアイソタイプと呼ばれ、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥに分類することができ、その対応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖、ε鎖である。同じ種類のＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成と重鎖ジスルフィド結合の数と位置の差によって、異なるサブクラスに分けることができ、例えばＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けることができる。軽鎖は定常領域の違いによりκ鎖又はλ鎖に分けられる。５種類のＩｇにおいて、各種類のＩｇはκ鎖又はλ鎖を有してもよい。
【0064】
抗体重鎖及び軽鎖のＮ末端に近い約１１０個のアミノ酸の配列は大きく変化し、可変領域（Ｆｖ領域）であり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は相対的に安定し、定常領域である。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、４つの配列が相対的に保守的なフレーム領域（ＦＲ）とを含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。各軽鎖可変領域（ＶＬ又はＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＶＨ又はＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲ領域及び４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシ末端まで順に配列された順序は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４である。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。
【0065】
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗体の可変ドメインのうち、主に抗原結合に寄与する６つの超可変領域の１つを指す。通常、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又は、ＡｂＭ又はＩＭＧＴ番号システムのような、当該分野で既知の様々な番号システムに基づいて決定することができる。本発明では、「Ｋａｂａｔ番号規則」（Ｋａｂａｔら（１９９１）参照）を用いてＣＤＲのアミノ酸配列境界を決定する。
【0066】
「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基という用語とは、抗体可変領域における前記で定義されたＣＤＲ残基以外のアミノ酸残基を指す。
【0067】
「モノクローナル抗体」、「単クローン抗体」、「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均質な抗体の群から得られた抗体を指し、すなわち、可能な変異体抗体を除いて、前記集団を構成する個別の抗体は、同じ、及び／又は同じエピトープに結合する。通常、異なる決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製造物と異なり、モノクローナル抗体製造物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」とは、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特性を意味し、いかなる特定の方法で抗体を製造する必要があると解釈されるべきではない。本発明に記載のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法及びトランスジェニック法などを含むが、これらに限定されない、当業者に公知の様々な技術によって製造することができる。
【0068】
「ヒト化モノクローナル抗体」という用語は、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワーク、すなわち、異なるタイプの人種系抗体フレームワーク配列に移植することによって産生される抗体を指し、キメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分を担持することによって誘導される異種反応を克服することができる。免疫原性の低下とともに、活性の低下を引き起こすことを回避するために、前記ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に対して最小逆突然変異（又は回復突然変異）を行い、活性を保持することができる。ヒト化抗体を製造するために、本分野で既知の方法を用いてマウスＣＤＲ領域をヒト由来フレームワーク配列に挿入することができる（Ｗｉｎｔｅｒの米国特許Ｎｏ．５，２２５，５３９；Ｑｕｅｅｎらの米国特許Ｎｏｓ．５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０；並びにＬｏ，Ｂｅｎｎｙ，Ｋ．Ｃ．，ｅｄｉｔｏｒ，ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌｕｍｅ ２４８，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００４を参照）。又は、トランスジェニック動物を利用することもでき、それは、免疫後に内因性免疫グロブリンを産生せず、かつ完全ヒト抗体ライブラリを産生することができる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７：３３；及びＤｕｃｈｏｓａｌら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８；Ｌｏｎｂｅｒｇら，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６－８５９；ＷＯ０２／４３４７８を参照）。別の抗体のヒト化改変方法は、ファージディスプレイ技術（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１，２２２：５８１－５９７；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３０９）をさらに含む。ここで、「トランスジェニック動物」の例としては、限定されないが、ＨＡＲＢＯＵＲ ＢＩＯＭＥＤのＨ２Ｌ２ヒト化マウスが挙げられる。「特異的結合」、「選択的結合」という用語は、２分子間の非ランダムな結合反応、例えば抗体とそれが対象とする抗原との間の反応を指す。特異的結合の相互作用の強さ又は親和力は、相互作用の解離平衡定数（ＫＤ）で表すことができる。本明細書では、「ＫＤ」という用語は、抗体と抗原との間の結合親和力を説明するための、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。解離平衡定数が小さいほど、抗体－抗原結合が緊密になり、抗体と抗原との親和力が高くなる。通常、抗体は、約１０－８Ｍ未満、例えば、約１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ又はその以下の親和力（ＫＤ）で結合する。
【0069】
「同一性」という用語は、通常、配列を照合した後、クエリ配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドの第２参照ポリペプチド配列又はその部分と同一の残基が占める百分率を指し、必要に応じて、最大の配列同一性百分率を実現するように、空位（ＧＡＰＳ）を導入し、且つ配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない。アミノ酸／ヌクレオチド配列の同一性百分率を確定するためのアライメントは、本分野で既知の様々な方式によって実現することができ、例えば、公開のコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用する。当業者は、比較されるシーケンスの全長にわたって最大比較を実現するために必要な任意のアルゴリズムを含む、比較を測定するための適切なパラメータを決定することができる。同一性百分率は、決定されたポリペプチド／ポリヌクレオチド配列全体の長さで測定することができ、又はより短い長さ、例えばより大きい決定されたポリペプチド／ポリヌクレオチド配列から得られた断片の長さで測定することができる。表、図面又は配列表において、本明細書に示す配列によってサポートされる任意の断片の長さは、測定可能な同一性百分率の長さとして使用され得ることを理解されるべきである。「％同一性」を有する配列は、それの比較又はその由来の配列の重要な生物活性、例えば抗体結合特異性を保持する。１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加又はそれらの任意の組み合わせを有する配列は、それの比較又はその由来の配列の重要な生物活性、例えば抗体結合特異性を保持する。「％同一性」を有するヌクレオチド配列又はその差が３、６、１５、３０又は４５個以下であるヌクレオチド配列は、それの比較又はその由来のヌクレオチド配列に近似する機能を実現することができ、例えば発現されたタンパク質はいずれも同じ抗原又は分子に特異的に結合することができる。
【0070】
「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの所望の性質に悪影響を与えないか又は変化しないアミノ酸置換を指す。例えば、本分野で既知の標準技術、例えば部位特異的変異導入及びＰＣＲ媒介の突然変異誘発により保存的置換を導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の代わりに類似の側鎖を有するアミノ酸残基を用いることを含み、例えば、対応するアミノ酸残基と物理的又は機能的に類似する（例えば、類似の大きさ、形状、電荷、化学的性質を有し、共有結合又は水素結合を形成する能力などを含む）残基による置換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を持たない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、対応するアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置換することが好ましい。アミノ酸保存的置換を同定する方法は当技術分野でよく知られている（例えば，Ｂｒｕｍｍｅｌｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｅｔ ＵＳＡ ９４：４１２－４１７（１９９７）を参照し、参照により本文に組み込む）。
【0071】
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、ポリヌクレオチドをその中に挿入することができる核酸輸送道具を指す。ベクターが挿入されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させる場合、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入又はトランスフェクションにより宿主細胞に導入され、それに担持された遺伝物質要素を宿主細胞に発現させることができる。ベクターは、当業者に周知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）；λファージ又はＭ１３ファージなどのファージ、及び動物ウイルスなどを含むが、これらに限定されない。ベクターとして使用可能な動物ウイルスは、逆転写酵素ウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（ＳＶ４０など）を含むが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子を含むが、これらに限定されない様々な発現制御要素を含むことができる。また、ベクターは複製開始サイトを含んでいてもよい。
【0072】
「宿主細胞」という用語は、通常、本発明に記載の核酸分子を含むプラスミド又はベクターを含んでもよく或いは含んでおり、或いは本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片を発現可能な体細胞、細胞株又は細胞培養物を指す。前記細胞は、単一宿主細胞の子孫を含むことができる。天然、意外又は故意の突然変異により、子孫細胞と元の親細胞は形態的又はゲノム的に必ずしも完全に同じではない可能性があるが、本願に記載の抗体又はその抗原結合断片を発現できればよい。前記細胞は、本開示に記載のベクターを用いて細胞をインビトロでトランスフェクションすることにより得ることができる。前記細胞は原核細胞（例えば大腸菌）であってもよく、真核細胞（例えば酵母細胞、例えばＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＳ０細胞又は骨髄腫細胞）であってもよい。ある場合、前記細胞は哺乳動物細胞であってもよい。例えば、前記哺乳動物細胞はＣＨＯＫ１細胞であってもよい。
【0073】
「薬学的に許容されるベクター」という用語は、薬理学的及び／又は生理学的に被験者及び活性成分と適合するベクターを指し、本分野で公知のものであり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ、１９ ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５を参照）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、希釈剤、浸透圧を維持する試薬、吸収を遅延させる試薬、防腐剤を含むが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤は、リン酸塩緩衝液を含むが、これに限定されない。界面活性剤は、陽イオン、陰イオン又は非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０を含むが、これらに限定されない。イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、これに限定されない。防腐剤としては、特に限定されないが、パラベン、トリクロロターシャリーブタノール、フェノール、ソルビン酸等の各種抗細菌試薬及び抗真菌試薬が挙げられる。浸透圧を維持する試薬は、糖、ＮａＣｌ及びその類似体を含むが、これらに限定されない。吸収を遅延させる試薬は、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含むが、これらに限定されない。希釈剤は、水、水性緩衝液（例えば、緩衝塩水）、アルコール及び多価アルコール（例えば、グリセリン）などを含むが、これらに限定されない。防腐剤としては、チメロサール、２－フェノキシエタノール、パラベン、トリクロロターシャリーブタノール、フェノール、ソルビン酸等の各種抗細菌試薬及び抗真菌試薬が挙げられるが、これらに限定されない。安定化剤は、当業者に通常理解される意味を有し、薬物中の活性成分の所望の活性を安定化することができ、グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、ＳＰＧＡ、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、ラクトース、デキストラン、又はグルコース）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グリシン）、タンパク質（例えば、乾燥ホエー、アルブミン又はカゼイン）又はその分解生成物（例えば、ラクトアルブミン加水分解物）などを含むが、これらに限定されない。
【0074】
「薬物組成物」という用語は、一般に、活性成分の生物学的活性を有効にする形態で存在し、前記組成物を投与する対象に対して許容されない毒性を有する追加の成分を含まない製剤を指す。前記組成物は無菌である。
【0075】
「被験者」という用語は、哺乳動物、例えば霊長類哺乳動物、例えば非ヒト霊長類哺乳動物又はヒトを指す。いくつかの実施形態では、前記被験者（例えば、ヒト）は、癌（胆管癌、結腸直腸癌、神経膠腫、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、鼻咽頭癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、非小細胞肺癌を含むが、これらに限定されない）に罹患しているか、又は前記疾患に罹患するリスクを有する。
【0076】
「有効量」という用語は、所望の効果を得る又は少なくともその一部を得るのに十分な量を意味する。例えば、疾患（例えば、ＬＩＦＲ陽性関連疾患）の予防有効量とは、疾患（例えば、ＬＩＦＲ陽性関連疾患）の発生を予防、阻止又は遅延させるのに十分な量であり、疾患治療有効量とは、疾患に罹患した患者の疾患及びその合併症を治癒又は少なくとも一部阻止するのに十分な量である。このような有効量を測定することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、治療用途に有効な量は、治療しようとする疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体状態、患者の一般的な状況、例えば年齢、体重及び性別、薬物の投与方式、及び同時に投与される他の治療などに依存する。
【0077】
「キメラ抗原受容体」という用語は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞がある腫瘍抗原を認識する抗体の抗原結合部位によってＣＤ３－δ鎖又はＦｃεＲＩγの細胞内部分とインビトロでキメラタンパク質として結合し、遺伝子導入の方法により患者のＴ細胞にトランスフェクションしてキメラ抗原受容体を発現させ、患者のＴ細胞が「再コード」された後、大量の腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成することができることを指す。再コードされたキメラ抗原受容体Ｔ細胞は患者の身体に投与され、このようなキメラ抗原受容体は、ＧＰＳのように特異的にＴ細胞を追跡及び識別して腫瘍細胞を殺傷するように誘導することができる。ほとんどのキメラ抗原受容体は、細胞外抗原結合領域（モノクローナル抗体に由来する軽鎖及び重鎖からなり、中間が強靭性のヒンジ領域で連結されて一本鎖抗体を形成する）、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達領域からなる。ＣＡＲ構造は、腫瘍関連抗原を認識するｓｃＦｖと細胞内シグナルドメイン「免疫受容体チロシン活性化モチーフ」をインビトロで遺伝子組換えすることにより得られる。
【0078】
「免疫細胞」という用語は、造血の起源を有し、免疫応答において作用する細胞、例えばリンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；ミエロイド細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球及び顆粒球を含む。
【0079】
略語
ＣＤＲ：免疫グロブリン可変領域における相補性決定領域。
ＶＨ：抗体重鎖可変領域。
ＶＬ：抗体軽鎖可変領域。
ＨＣ：抗体重鎖。
ＬＣ：抗体軽鎖。
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ。
ＡｂＭ：ＡｂＭ ＣＤＲ定義方式は、Ｍａｒｔｉｎの関連研究（Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ，Ｃｈｅｅｔｈａｍ ＪＣ，Ｒｅｅｓ ＡＲ（１９８９）Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｙｐｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ：Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２）に由来し、この定義方法は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方の部分定義を統合したものである。
Ｋａｂａｔ：Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔによって提案された免疫グロブリン比較及び番号システム（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１を参照）。
Ｃｈｏｔｈｉａ：Ｃｈｏｔｈｉａらによって提案された免疫グロブリン番号システムであり、構造環領域の位置に基づいてＣＤＲ領域境界を同定する古典規則である（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３を参照）。
ＩＭＧＴ：Ｌｅｆｒａｎｃらによって発起された国際免疫遺伝学情報システム（Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍ ＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ））の番号システムに基づいて、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７，２００３を参照することができる。
ｍＡｂ：モノクローナル抗体。
ＥＣ５０：５０％の効果又は結合が発生する濃度。
ＩＣ５０：５０％阻害が発生する濃度。
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定。
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応。
ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ。
ＬＩＦＲ：白血病阻止因子受容体。
ＩＬ７Ｒα：インターロイキン７受容体ａｌｐｈａサブユニット。
ＴＡＲＣ：胸腺活性化調節ケモカイン。
ｈＦｃ：ヒトＩｇＧ抗体Ｆｃ断片。
ＫＤ：解離平衡定数。
ＨＣＤＲ１：免疫グロブリン重鎖可変領域における相補性決定領域１。
ＨＣＤＲ２：免疫グロブリン重鎖可変領域における相補性決定領域２。
ＨＣＤＲ３：免疫グロブリン重鎖可変領域における相補性決定領域３。
ＬＣＤＲ１：免疫グロブリン軽鎖可変領域における相補性決定領域１。
ＬＣＤＲ２：免疫グロブリン軽鎖可変領域における相補性決定領域２。
ＬＣＤＲ３：免疫グロブリン軽鎖可変領域における相補性決定領域３。
ＣＤＲ：免疫グロブリン可変領域における相補性決定領域。
ＶＨ：抗体重鎖可変領域。
ＶＬ：抗体軽鎖可変領域。
ＨＣ：抗体重鎖。
ＬＣ：抗体軽鎖。
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ。
ＡｂＭ：ＡｂＭ ＣＤＲ定義方式は、Ｍａｒｔｉｎの関連研究（Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ，Ｃｈｅｅｔｈａｍ ＪＣ，Ｒｅｅｓ ＡＲ（１９８９）Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｙｐｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ：Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２）に由来し、この定義方法は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方の部分定義を統合したものである。
Ｋａｂａｔ：Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔによって提案された免疫グロブリン比較及び番号システム（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１を参照）。
Ｃｈｏｔｈｉａ：Ｃｈｏｔｈｉａらによって提案された免疫グロブリン番号システムであり、構造環領域の位置に基づいてＣＤＲ領域境界を同定する古典規則である（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３を参照）。
ＩＭＧＴ：Ｌｅｆｒａｎｃらによって発起された国際免疫遺伝学情報システム（Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍ ＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ））の番号システムに基づいて、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７，２００３を参照することができる。
ｍＡｂ：モノクローナル抗体。
ＥＣ５０：５０％の効果又は結合が発生する濃度。
ＩＣ５０：５０％阻害が発生する濃度。
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定。
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応。
ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ。
ＬＩＦＲ：白血病阻止因子受容体。
ＩＬ７Ｒα：インターロイキン７受容体ａｌｐｈａサブユニット。
ＴＡＲＣ：胸腺活性化調節ケモカイン。
ｈＦｃ：ヒトＩｇＧ抗体Ｆｃ断片。
ＫＤ：解離平衡定数。
ＨＣＤＲ１：免疫グロブリン重鎖可変領域における相補性決定領域１。
ＨＣＤＲ２：免疫グロブリン重鎖可変領域における相補性決定領域２。
ＨＣＤＲ３：免疫グロブリン重鎖可変領域における相補性決定領域３。
ＬＣＤＲ１：免疫グロブリン軽鎖可変領域における相補性決定領域１。
ＬＣＤＲ２：免疫グロブリン軽鎖可変領域における相補性決定領域２。
ＬＣＤＲ３：免疫グロブリン軽鎖可変領域における相補性決定領域３。
【0080】
発明の詳細
抗原結合タンパク質
本発明は一連の完全ヒト型モノクローナル抗体を製造した。これらの抗ヒトＬＩＦＲ抗体は、完全ヒト抗体トランスジェニックマウスの免疫、分子生物学及び抗体工学技術によって製造され、完全ヒト抗体アミノ酸及び遺伝子配列を有することにより、人体応用時の最低可能な免疫原性を確保する。ヒト抗体トランスジェニックマウス技術は、最も早くＡｂｇｅｎｉｘ（Ｘｅｎｏ Ｍｏｕｓｅ）及びＭａｄａｒｅｘ（ＨｕＭａｂ ｍｏｕｓｅ）によって開発され、完全ヒト抗体の製造に用いられる（Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ．３６８（６４７４）：８５６－８５９，Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６）。早期のトランスジェニックマウスは、完全なヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）を産生し、すなわち、抗体の可変領域及び定常領域は、完全にヒト由来配列であり、ヒトＩｇＦｃがマウス宿主Ｆｃ受容体とマッチしないため、免疫反応が非常に弱く、抗原免疫後の血清中の抗体価が非常に低く、低いモノクローナル抗体の製造効率を示す。近年、当該技術は、重鎖及び軽鎖可変領域において宿主の免疫グロブリン（Ｉｇ）と同一及び類似の定常領域配列を採用することを主として示す重大な革新及び改良を経ている。本発明では、Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄ社によって研究開発されたトランスジェニックマウス（ＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２）を用いてＬＩＦＲ完全ヒト抗体の製造に成功した。Ｈａｒｂｏｕｒトランスジェニックマウスには、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子とラット免疫グロブリン定常領域遺伝子が導入され、マウス自身のＩｇ発現は不活化された。該トランスジェニックマウスは、抗原免疫を経た後、正常のマウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ）に相当する免疫反応及び抗体価を生じることができる。
抗原結合タンパク質
本発明は一連の完全ヒト型モノクローナル抗体を製造した。これらの抗ヒトＬＩＦＲ抗体は、完全ヒト抗体トランスジェニックマウスの免疫、分子生物学及び抗体工学技術によって製造され、完全ヒト抗体アミノ酸及び遺伝子配列を有することにより、人体応用時の最低可能な免疫原性を確保する。ヒト抗体トランスジェニックマウス技術は、最も早くＡｂｇｅｎｉｘ（Ｘｅｎｏ Ｍｏｕｓｅ）及びＭａｄａｒｅｘ（ＨｕＭａｂ ｍｏｕｓｅ）によって開発され、完全ヒト抗体の製造に用いられる（Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ．３６８（６４７４）：８５６－８５９，Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６）。早期のトランスジェニックマウスは、完全なヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）を産生し、すなわち、抗体の可変領域及び定常領域は、完全にヒト由来配列であり、ヒトＩｇＦｃがマウス宿主Ｆｃ受容体とマッチしないため、免疫反応が非常に弱く、抗原免疫後の血清中の抗体価が非常に低く、低いモノクローナル抗体の製造効率を示す。近年、当該技術は、重鎖及び軽鎖可変領域において宿主の免疫グロブリン（Ｉｇ）と同一及び類似の定常領域配列を採用することを主として示す重大な革新及び改良を経ている。本発明では、Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄ社によって研究開発されたトランスジェニックマウス（ＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２）を用いてＬＩＦＲ完全ヒト抗体の製造に成功した。Ｈａｒｂｏｕｒトランスジェニックマウスには、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子とラット免疫グロブリン定常領域遺伝子が導入され、マウス自身のＩｇ発現は不活化された。該トランスジェニックマウスは、抗原免疫を経た後、正常のマウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ）に相当する免疫反応及び抗体価を生じることができる。
【0081】
いくつかの実施形態では、本発明によって提供される抗原結合タンパク質は、下記の相補性決定領域を含む。
（１）配列番号１－配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域１ ＨＣＤＲ１、
（２）配列番号５－配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域２ ＨＣＤＲ２、
（３）配列番号１６－配列番号２５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域３ ＨＣＤＲ３、
（４）配列番号２６－配列番号３２のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域１ ＬＣＤＲ１、
（５）配列番号３３－配列番号４０のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域２ ＬＣＤＲ２、
（６）配列番号４１－配列番号４５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域３ ＬＣＤＲ３。
（１）配列番号１－配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域１ ＨＣＤＲ１、
（２）配列番号５－配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域２ ＨＣＤＲ２、
（３）配列番号１６－配列番号２５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む重鎖相補性決定領域３ ＨＣＤＲ３、
（４）配列番号２６－配列番号３２のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域１ ＬＣＤＲ１、
（５）配列番号３３－配列番号４０のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域２ ＬＣＤＲ２、
（６）配列番号４１－配列番号４５のいずれかに示すアミノ酸配列又はその変異体配列を含む軽鎖相補性決定領域３ ＬＣＤＲ３。
【0082】
前記変異体配列は、その由来のＣＤＲと比較して、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有するＣＤＲ配列である。
【0083】
いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質は、下記の相補性決定領域を含む。
（１）ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＸ１に示すアミノ酸配列又は配列番号４：ＧＦＴＦＳＮＹＡＭＴに示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１ ＨＣＤＲ１であって、Ｘ１＝Ｈ、Ｄ又はＮ、
及び／又は（２）ＶＩＷＹＤＧＸ２ＮＫＹＹＸ３ＤＳＶＫＧに示すアミノ酸配列、ＶＩＷＦＤＧＳＸ４ＫＹＹＡＤＳＶＫＧに示すアミノ酸配列、配列番号７：ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＦＹＡＤＳＶＲＧに示すアミノ酸配列、配列番号１４：ＴＩＳＧＳＧＡＦＴＹＹＡＤＡＶＫＧに示すアミノ酸配列又は配列番号１５：ＶＩＳＧＳＧＦＬＴＹＹＡＤＡＶＫＧに示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２ ＨＣＤＲ２であって、Ｘ２＝Ｎ又はＳ、Ｘ３＝Ｅ、Ａ又はＴ、Ｘ４＝Ｎ、Ｉ、Ｌ又はＶ、
及び／又は（３）配列番号１６：ＤＧＥＳＳＭＶＲＧＬＬＮＷＦＤＰに示すアミノ酸配列、配列番号１７：ＥＬＲＹＦＤＷＬＬＳＰＦＤＹに示すアミノ酸配列、配列番号２１：ＧＥＲＴＬＤＬに示すアミノ酸配列、ＥＬＷＦＧＥＬＬＳＰＸ５ＤＦに示すアミノ酸配列、ＧＱＬＶＸ６ＤＸ７に示すアミノ酸配列又はＧＧＩＬＴＧＦＤＸ８に示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３ ＨＣＤＲ３であって、Ｘ５＝Ｌ又はＦ、Ｘ６＝Ｇ又はＱ、Ｘ７＝Ｙ、Ｆ又はＬ、Ｘ８＝Ｎ又はＹ、
及び／又は（４）ＲＡＳＱＳＸ９ＳＳＳＸ１０ＬＡに示すアミノ酸配列、ＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１１ＬＸ１２に示すアミノ酸配列又は配列番号３２：ＲＡＳＱＮＬＮＳＮＬＡに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１ ＬＣＤＲ１であって、Ｘ９＝Ｖ又はＩ、Ｘ１０＝Ｙ又はＦ、Ｘ１１＝Ｙ、Ｗ又はＮ、Ｘ１２＝Ｎ又はＡ、
及び／又は（５）ＧＸ１３ＳＳＲＡＴに示すアミノ酸配列、ＫＡＳＸ１４ＬＥＸ１５に示すアミノ酸配列、配列番号３５：ＡＡＳＮＲＡＴに示すアミノ酸配列、配列番号３６：ＡＡＳＳＬＱＳに示すアミノ酸配列又は配列番号４０：ＧＡＳＴＲＡＰに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２ ＬＣＤＲ２であって、Ｘ１３＝Ａ又はＴ、Ｘ１４＝Ｓ又はＮ、Ｘ１５＝Ｓ又はＮ、
及び／又は（６）配列番号４１：ＱＱＹＧＳＳＰＦＴに示すアミノ酸配列、配列番号４２：ＱＱＳＹＳＴＰＬＴに示すアミノ酸配列、配列番号４３：ＱＱＹＫＳＦＳＰＧＧＬＴに示すアミノ酸配列、配列番号４４：ＱＱＹＫＳＮＰＬＴに示すアミノ酸配列又は配列番号４５：ＱＱＹＮＮＷＰＲＴに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３ ＬＣＤＲ３。
（１）ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＸ１に示すアミノ酸配列又は配列番号４：ＧＦＴＦＳＮＹＡＭＴに示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１ ＨＣＤＲ１であって、Ｘ１＝Ｈ、Ｄ又はＮ、
及び／又は（２）ＶＩＷＹＤＧＸ２ＮＫＹＹＸ３ＤＳＶＫＧに示すアミノ酸配列、ＶＩＷＦＤＧＳＸ４ＫＹＹＡＤＳＶＫＧに示すアミノ酸配列、配列番号７：ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＦＹＡＤＳＶＲＧに示すアミノ酸配列、配列番号１４：ＴＩＳＧＳＧＡＦＴＹＹＡＤＡＶＫＧに示すアミノ酸配列又は配列番号１５：ＶＩＳＧＳＧＦＬＴＹＹＡＤＡＶＫＧに示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２ ＨＣＤＲ２であって、Ｘ２＝Ｎ又はＳ、Ｘ３＝Ｅ、Ａ又はＴ、Ｘ４＝Ｎ、Ｉ、Ｌ又はＶ、
及び／又は（３）配列番号１６：ＤＧＥＳＳＭＶＲＧＬＬＮＷＦＤＰに示すアミノ酸配列、配列番号１７：ＥＬＲＹＦＤＷＬＬＳＰＦＤＹに示すアミノ酸配列、配列番号２１：ＧＥＲＴＬＤＬに示すアミノ酸配列、ＥＬＷＦＧＥＬＬＳＰＸ５ＤＦに示すアミノ酸配列、ＧＱＬＶＸ６ＤＸ７に示すアミノ酸配列又はＧＧＩＬＴＧＦＤＸ８に示すアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３ ＨＣＤＲ３であって、Ｘ５＝Ｌ又はＦ、Ｘ６＝Ｇ又はＱ、Ｘ７＝Ｙ、Ｆ又はＬ、Ｘ８＝Ｎ又はＹ、
及び／又は（４）ＲＡＳＱＳＸ９ＳＳＳＸ１０ＬＡに示すアミノ酸配列、ＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１１ＬＸ１２に示すアミノ酸配列又は配列番号３２：ＲＡＳＱＮＬＮＳＮＬＡに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１ ＬＣＤＲ１であって、Ｘ９＝Ｖ又はＩ、Ｘ１０＝Ｙ又はＦ、Ｘ１１＝Ｙ、Ｗ又はＮ、Ｘ１２＝Ｎ又はＡ、
及び／又は（５）ＧＸ１３ＳＳＲＡＴに示すアミノ酸配列、ＫＡＳＸ１４ＬＥＸ１５に示すアミノ酸配列、配列番号３５：ＡＡＳＮＲＡＴに示すアミノ酸配列、配列番号３６：ＡＡＳＳＬＱＳに示すアミノ酸配列又は配列番号４０：ＧＡＳＴＲＡＰに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２ ＬＣＤＲ２であって、Ｘ１３＝Ａ又はＴ、Ｘ１４＝Ｓ又はＮ、Ｘ１５＝Ｓ又はＮ、
及び／又は（６）配列番号４１：ＱＱＹＧＳＳＰＦＴに示すアミノ酸配列、配列番号４２：ＱＱＳＹＳＴＰＬＴに示すアミノ酸配列、配列番号４３：ＱＱＹＫＳＦＳＰＧＧＬＴに示すアミノ酸配列、配列番号４４：ＱＱＹＫＳＮＰＬＴに示すアミノ酸配列又は配列番号４５：ＱＱＹＮＮＷＰＲＴに示すアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３ ＬＣＤＲ３。
【0084】
いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗原結合タンパク質は、以下の重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬを含む。
（１）、配列番号４６－配列番号５９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び／又は配列番号６０－配列番号６９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
又は（２）、（１）のいずれかのＶＨと比べて少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び／又は、（１）のいずれかのＶＬと比べて少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ、
又は（３）、（１）のいずれかのＶＨと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はその任意の組み合わせを有するＶＨ、及び／又は、（１）のいずれかのＶＬと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はその任意の組み合わせを有するＶＬ。
前記の置換は保存的置換である。
（１）、配列番号４６－配列番号５９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び／又は配列番号６０－配列番号６９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
又は（２）、（１）のいずれかのＶＨと比べて少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び／又は、（１）のいずれかのＶＬと比べて少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ、
又は（３）、（１）のいずれかのＶＨと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はその任意の組み合わせを有するＶＨ、及び／又は、（１）のいずれかのＶＬと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加又はその任意の組み合わせを有するＶＬ。
前記の置換は保存的置換である。
【0085】
いくつかの実施形態では、本発明によって提供される抗原結合タンパク質は、以下の重鎖ＨＣ及び軽鎖ＬＣを含む。
（１）配列番号７０－配列番号８３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖ＨＣ、及び／又は配列番号８４－配列番号９３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む軽鎖ＬＣ、
又は（２）重鎖及び軽鎖であって、（１）の重鎖及び軽鎖と比較して、前記重鎖は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び／又は、前記軽鎖は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖及び軽鎖。
（１）配列番号７０－配列番号８３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖ＨＣ、及び／又は配列番号８４－配列番号９３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む軽鎖ＬＣ、
又は（２）重鎖及び軽鎖であって、（１）の重鎖及び軽鎖と比較して、前記重鎖は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び／又は、前記軽鎖は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖及び軽鎖。
【0086】
いくつかの具体的な実施形態において、本発明で製造されたヒトＬＩＦＲ抗体は、下記表１に記載の重鎖及び軽鎖の組み合わせを含む。
【0087】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0088】
表１に示すヒトＬＩＦＲ抗体は、Ｍｅｇａソフトウェアにより配列類似性分析を行い、以下の５つの群に分けることができる。
群１：ＰＲ３００５１６、
群２：ＰＲ３０１１６４、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１１７６、
群３：ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１６０、
群４：ＰＲ３０１１５３、ＰＲ３０１１７７、ＰＲ３０１１９５、ＰＲ３０１１９６、ＰＲ３０１２１１、ＰＲ３０１２１５、ＰＲ３０１２１８、
群５：ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１７２。
群１：ＰＲ３００５１６、
群２：ＰＲ３０１１６４、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１１７６、
群３：ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１６０、
群４：ＰＲ３０１１５３、ＰＲ３０１１７７、ＰＲ３０１１９５、ＰＲ３０１１９６、ＰＲ３０１２１１、ＰＲ３０１２１５、ＰＲ３０１２１８、
群５：ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１７２。
【0089】
いくつかの実施例において、５群のタンパク質抗体からそれぞれＰＲ３００５１６、ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１２１１を選択して試験を行った。
【0090】
抗体誘導体及び多重特異性抗体
前記の部分に記載の本発明によって提供される抗原結合タンパク質は、抗体又は抗原結合断片を含み、それは誘導化され得る（例えば、別の分子、例えば、別のポリペプチド又はタンパク質に結合される）。通常、抗体又はその抗原結合断片の誘導体化（例えば、標識）は、ＬＩＦＲ（特にヒトＬＩＦＲ）との結合に悪影響を与えない。従って、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、このような誘導体化の形態を含むことを意図する。例えば、本発明の抗体又はその抗原結合断片を１つ又は複数の他の分子基に連結して、二重特異性抗体、検出試薬、薬用試薬、及び／又は抗体又は抗原結合断片と他の分子との結合を媒介できるタンパク質又はポリペプチド（例えば、アビジン又はマルチヒスチジンタグ）を形成することができる。
前記の部分に記載の本発明によって提供される抗原結合タンパク質は、抗体又は抗原結合断片を含み、それは誘導化され得る（例えば、別の分子、例えば、別のポリペプチド又はタンパク質に結合される）。通常、抗体又はその抗原結合断片の誘導体化（例えば、標識）は、ＬＩＦＲ（特にヒトＬＩＦＲ）との結合に悪影響を与えない。従って、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、このような誘導体化の形態を含むことを意図する。例えば、本発明の抗体又はその抗原結合断片を１つ又は複数の他の分子基に連結して、二重特異性抗体、検出試薬、薬用試薬、及び／又は抗体又は抗原結合断片と他の分子との結合を媒介できるタンパク質又はポリペプチド（例えば、アビジン又はマルチヒスチジンタグ）を形成することができる。
【0091】
１つのタイプの誘導体化抗体は、標識抗体である。例えば、本発明の抗体又はその抗原結合断片を検出可能な標識に連結することができる。本発明に記載の検出可能な標識は、蛍光、スペクトル、光化学、生化学、免疫学、電気学、光学又は化学的手段によって検出可能な任意の物質であってもよい。このような標識は、当該技術分野において周知であり、その具体例として特に限定されないが、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ等）、放射性核種（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ等）、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッド、ローダミン、量子ドット又はシアニン染料誘導体（例えば、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ７５０））、アクリジンエステル系化合物、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））、金コロイド又は色ガラス又はプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズ等の熱測定マーカー、及び前記マーカーで修飾されたアビジン（例えば、ストレプトアビジン）を結合させるためのビオチンが挙げられる。該マーカーの応用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７；第３，８５０，７５２；第３，９３９，３５０；第３，９９６，３４５；第４，２７７，４３７；第４，２７５，１４９；及び第４，３６６，２４１（全ては参照により本明細書に組み込まれる）を含むが、これらに限定されない。前記のような検出可能なマーカーは、本分野の既知の方法によって検出することができる。例えば、放射性標識は写真フィルムやシンチレーション計算機を用いて検出することができ、蛍光マーカーは光検出器を用いて検出することができ、発光した光を検出することができる。酵素マーカーは、一般的に、酵素に基質を提供し、酵素の基質に対する作用によって生じた反応生成物を検出することによって検出され、熱測定マーカーは、着色マーカーを簡単に可視化することによって検出される。いくつかの実施形態では、このような標識は、免疫学的検出（例えば、酵素結合免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法等）に適用することができる。いくつかの実施形態では、異なる長さのリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって、前記のような検出可能な標識を本発明の抗体又はその抗原結合断片に接続して、潜在的な立体障害を低減することができる。
【0092】
また、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、化学基、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基又はエチル基、又はグリコシル基で誘導することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するために使用でき、例えば、血清半減期を増加させる。
【0093】
別の抗体の誘導体として、本発明は、第１の抗体又はその断片と、別の抗体又はその断片、又は抗体類似体とを含む多重特異性抗体であって、第１の抗体又はその断片、別の抗体又はその断片、又は抗体類似体は、元の結合特異性を保持する、多重特異性抗体を提供する。前記第１の抗体又はその断片は、本発明のいずれかのＴＳＬＰに結合する（モノクローナル）抗体又はその抗原結合断片である。本明細書で使用される場合、「抗体類似体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃ）」は、抗体と同様に抗原に特異的に結合するが、抗体構造を有さないことを意味する。これらは、通常、人工ペプチド又はタンパク質であり、モル質量が約３－２０ｋＤａであり、例えば、アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）及びｆｙｎｏｍｅｒである。設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、ＣＮ１０４３４１５２９Ａに記載されるように、ＩｇＧ抗体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片又はそれらの組み合わせと連結することができる。抗ＩＬ－１７ａのｆｙｎｏｍｅｒは、ＷＯ２０１５１４１８６２Ａ１に記載されているように、抗ＩＬ－６Ｒ抗体と融合して二重特異性融合ポリペプチドを産生することができる。
【0094】
いくつかの実施形態では、前記多重特異性抗体は、第１の抗体又はその抗原結合断片と別の抗体又はその抗原結合断片又は抗体類似体とがカップリングにより形成され、各抗体又はその抗原結合断片又は抗体類似体は、その元の結合特異性を保持し、前記第１の抗体又はその抗原結合断片は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、前記多重特異性抗体は、二重特異性抗体、三重特異性抗体又は四重特異性抗体である。
【0095】
抗体薬物複合体
抗体薬物複合体は、本発明が提供する抗原結合タンパク質部分及び複合体部分を含む。抗原結合タンパク質部分は、前記の「抗原結合タンパク質」と、「抗原結合タンパク質」に基づいて得られる抗原結合断片とを含む。抗原結合断片の実例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ及び／又はｄＡｂなどを含むが、これらに限定されない。複合体部分は、少なくとも１つの負荷薬を含み得る。前記負荷薬は、薬物活性物質成分及び／又は前記標識分子を含むことができる。負荷薬は、薬学的に活性な小分子化合物又は毒素又は他の薬物分子形態であり、小分子化合物、毒素分子、オリゴヌクレオチド、タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）、親和性リガンド、蛍光基、核種基などであってもよいが、これらに限定されない。様々な負荷薬が知られている。例えば、小分子化合物は、通常、強い細胞毒性を有する物質を指す。例示的な小分子化合物は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、ＲＮＡポリメラーゼ阻害、タンパク質合成又はトポイソメラーゼ阻害などのメカニズムを含むことによって、そのような細胞毒性および細胞抑制効果を発揮することができるが、これらに限定されない。例えば、小分子化合物は、チューブリン阻害剤であってもよく、例えば、前記チューブリン阻害剤は、マイタンシン（例えば、ＤＭ１又はＤＭ４）及びオクレスタチン（例えば、ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦ）などであってもよい。例えば、前記小分子化合物は、ＤＮＡ損傷剤であってもよく、例えば、前記ＤＮＡ損傷剤は、カチマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ、ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）などであってもよい。例えば、タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）は、標的タンパク質のポリユビキチン化を誘導することにより標的タンパク質の分解を引き起こすことができる化合物であり、例えば、前記ＰＲＯＴＡＣはＢＥＴタンパク質の分解剤であってもよい。前記薬物複合体は、少なくとも１つのリンカーをさらに含んでもよい。例えば、リンカーは、切断可能なリンカー又は非切断可能なリンカーを含み得る。前記リンカーは、１つ又は複数の負荷薬を抗原結合タンパク質に連結するために用いられる。本出願において、切断可能なリンカーは、薬物を放出しやすい「切断が可能である」リンカーであってもよい。例えば、切断可能なリンカーは、酸感受性リンカー、プロテアーゼ感受性リンカー、光感受性リンカー、又はジスルフィド含有リンカーを含むが、これらに限定されない。リンカーは、１種又は複数種のリンカー部材を含んでもよく、本分野では、複数種のリンカー部材が知られており、例えば、マレイミド基ヘキサノイル（ＭＣ，ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）、マレイミド基プロピオニル（ＭＰ）、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ又はｖｃ，ｖａｌｉｎｅ－ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ，ｐａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）である。
抗体薬物複合体は、本発明が提供する抗原結合タンパク質部分及び複合体部分を含む。抗原結合タンパク質部分は、前記の「抗原結合タンパク質」と、「抗原結合タンパク質」に基づいて得られる抗原結合断片とを含む。抗原結合断片の実例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ及び／又はｄＡｂなどを含むが、これらに限定されない。複合体部分は、少なくとも１つの負荷薬を含み得る。前記負荷薬は、薬物活性物質成分及び／又は前記標識分子を含むことができる。負荷薬は、薬学的に活性な小分子化合物又は毒素又は他の薬物分子形態であり、小分子化合物、毒素分子、オリゴヌクレオチド、タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）、親和性リガンド、蛍光基、核種基などであってもよいが、これらに限定されない。様々な負荷薬が知られている。例えば、小分子化合物は、通常、強い細胞毒性を有する物質を指す。例示的な小分子化合物は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、ＲＮＡポリメラーゼ阻害、タンパク質合成又はトポイソメラーゼ阻害などのメカニズムを含むことによって、そのような細胞毒性および細胞抑制効果を発揮することができるが、これらに限定されない。例えば、小分子化合物は、チューブリン阻害剤であってもよく、例えば、前記チューブリン阻害剤は、マイタンシン（例えば、ＤＭ１又はＤＭ４）及びオクレスタチン（例えば、ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦ）などであってもよい。例えば、前記小分子化合物は、ＤＮＡ損傷剤であってもよく、例えば、前記ＤＮＡ損傷剤は、カチマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ、ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）などであってもよい。例えば、タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）は、標的タンパク質のポリユビキチン化を誘導することにより標的タンパク質の分解を引き起こすことができる化合物であり、例えば、前記ＰＲＯＴＡＣはＢＥＴタンパク質の分解剤であってもよい。前記薬物複合体は、少なくとも１つのリンカーをさらに含んでもよい。例えば、リンカーは、切断可能なリンカー又は非切断可能なリンカーを含み得る。前記リンカーは、１つ又は複数の負荷薬を抗原結合タンパク質に連結するために用いられる。本出願において、切断可能なリンカーは、薬物を放出しやすい「切断が可能である」リンカーであってもよい。例えば、切断可能なリンカーは、酸感受性リンカー、プロテアーゼ感受性リンカー、光感受性リンカー、又はジスルフィド含有リンカーを含むが、これらに限定されない。リンカーは、１種又は複数種のリンカー部材を含んでもよく、本分野では、複数種のリンカー部材が知られており、例えば、マレイミド基ヘキサノイル（ＭＣ，ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）、マレイミド基プロピオニル（ＭＰ）、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ又はｖｃ，ｖａｌｉｎｅ－ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ，ｐａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）である。
【0096】
核酸、ベクター、宿主細胞及び抗体の製造
本発明の抗原結合タンパク質は、当技術分野で既知の様々な方法、例えば遺伝子組換え技術によって製造することができる。例えば、化学合成又はＰＣＲ増幅により、本発明の抗体重鎖及び軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡ分子を取得する。得られたＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入した後、宿主細胞にトランスフェクションした。そして、トランスフェクション後の宿主細胞を特定条件下で培養し、本発明の抗体を発現させる。
本発明の抗原結合タンパク質は、当技術分野で既知の様々な方法、例えば遺伝子組換え技術によって製造することができる。例えば、化学合成又はＰＣＲ増幅により、本発明の抗体重鎖及び軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡ分子を取得する。得られたＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入した後、宿主細胞にトランスフェクションした。そして、トランスフェクション後の宿主細胞を特定条件下で培養し、本発明の抗体を発現させる。
【0097】
いくつかの具体的な実施形態において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片、又はその重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又はその１つ又は複数のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を提供する。当技術分野で知られているコドンの縮退性によれば、いくつかの実施形態では、前記ヌクレオチド配列はコドンの縮退性に従って置換され得る。いくつかの実施形態では、前記ヌクレオチド配列はコドン最適化されている。
【0098】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の単離核酸分子を含むクローニングベクター又は発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、前記ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、レンチウイルスなどである。いくつかの実施形態では、前記ベクターは、本発明の抗体又はその抗原結合断片を被験者（例えば、ヒトなどの哺乳動物）内で発現することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の単離核酸分子又は本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、真核細胞（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞）又は原核細胞（例えば大腸菌）であってもよい。適切な真核細胞は、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、及びＭＤＣＫＩＩ細胞を含むが、これらに限定されない。適切な昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の宿主細胞は、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＤＸＢ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４）などの哺乳動物細胞である。
【0099】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、前記抗体又はその抗原結合断片の発現が許容される条件下で、本発明の宿主細胞を培養することと、培養された宿主細胞培養物から前記抗体又はその抗原結合断片を回収することとを含む、方法を提供する。
【0100】
製薬用途、治療方法、薬物組成物及び投与装置
本発明は、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体、免疫細胞、抗体薬物複合体の、ＬＩＦ及び／又はＬＩＦＲ遮断薬の製造、ＬＩＦ及び／又はＬＩＦＲ陽性疾患の予防及び／又は治療のための薬物の製造における用途を提供する。
本発明は、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体、免疫細胞、抗体薬物複合体の、ＬＩＦ及び／又はＬＩＦＲ遮断薬の製造、ＬＩＦ及び／又はＬＩＦＲ陽性疾患の予防及び／又は治療のための薬物の製造における用途を提供する。
【0101】
相応的に、本発明は、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体、免疫細胞、抗体薬物複合体のＬＩＦ及び／又はＬＩＦＲの遮断、ＬＩＦ及び／又はＬＩＦＲ陽性疾患の予防及び／又は治療方法を提供する。
【0102】
いくつかの実施形態では、本発明は、前記ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、免疫細胞、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体及び／又は抗体薬物複合体、並びに任意の薬学的に許容されるベクターを含む、治療用薬物組成物を提供する。「薬学的に許容されるベクター」は、希釈剤、賦形剤、充填剤、湿潤剤、崩壊剤、矯味剤及び結合剤を含むが、これらに限定されない。
【0103】
いくつかの実施形態では、前記薬物組成物は、組み合わせ治療剤をさらに含み、前記組み合わせ治療剤は、化学治療剤、放射線治療剤、免疫抑制剤、及び細胞毒性薬を含むが、これらに限定されない。
【0104】
いくつかの実施形態では、前記薬物組成物において、本発明の抗原結合タンパク質と前記組み合わせ治療剤は、単離された成分として、又は同一の組成物の成分として提供される。したがって、本発明の抗原結合タンパク質と前記組み合わせ治療剤は、一緒に又は別個に、同時に又は連続的に投与されてもよい。抗ＬＩＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、単独で又は他の治療剤と組み合わせて投与することができる。抗ＬＩＦＲ抗体又はその抗原結合断片と１種又は複数種の他の治療剤は、別個に、同時に又は連続的に投与することができる。
【0105】
薬物組成物は、任意の適切な形態（患者に投与される所望の方法に応じて決定されてもよい）を有してもよく、本発明のヒトＬＩＦＲ抗体は、様々な経路（例えば、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、眼内、局所、鞘内及び脳内）で患者に投与されてもよい。いずれの場合も投与に最適な経路は、特定の抗体、個体及び疾患の性質及び重症度、並びに個体の体調に依存する。
【0106】
いくつかの実施形態において、本発明は、前記抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体、免疫細胞、抗体薬物複合体及び前記成分を含む薬物組成物を投与する、投与装置をさらに提供する。前記投与装置は、下記のものを含む。
（ｉ）被験者に一つの活性成分を有する薬物組成物を投与するための輸液モジュール、
（ｉｉ）一つの活性成分を含む輸液用薬物組成物であって、前記活性成分は、抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体、免疫細胞、抗体薬物複合体又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、輸液用薬物組成物、及び
（ｉｉｉ）任意の薬効監視モジュール。
（ｉ）被験者に一つの活性成分を有する薬物組成物を投与するための輸液モジュール、
（ｉｉ）一つの活性成分を含む輸液用薬物組成物であって、前記活性成分は、抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質誘導体、多重特異性抗体、免疫細胞、抗体薬物複合体又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、輸液用薬物組成物、及び
（ｉｉｉ）任意の薬効監視モジュール。
【0107】
もう一つの好適な例において、前記の投与は、腸管外投与と非腸管外投与を含む。もう一つの好適な例において、前記腸管外投与は、注射投与を含み、使用される注射の経路は、静脈内、筋肉内、動脈内、膜内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊柱内、硬脳膜上及び胸骨内注射及びプッシュ注入を含む。もう一つの好適な例において、前記非腸管外投与は、外用、表皮投与又は粘膜投与を含み、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下、又は局所外用を含む。もう一つの好適な例において、前記の輸液モジュールは、無針皮下注射装置、マイクロ輸液ポンプ、経皮投与装置、注入装置、又は浸透装置である。
【0108】
検出方法、キット
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＬＩＦＲに結合することができ、試料中のＬＩＦＲの存在又はそのレベルの検出に使用することができる。
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＬＩＦＲに結合することができ、試料中のＬＩＦＲの存在又はそのレベルの検出に使用することができる。
【0109】
一態様において、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、検出可能な標識を有する。好ましい実施形態において、前記キットは、本発明の抗体又はその抗原結合断片を特異的に認識する第２の抗体をさらに含む。好ましくは、前記第２の抗体は、検出可能な標識をさらに含む。
【0110】
本発明において、前記検出可能な標識は、蛍光、スペクトル、光化学、生化学、免疫学、電気学、光学又は化学的手段によって検出可能な任意の物質であってもよい。特に好ましくは、このような標識は、免疫学的検出（例えば、酵素結合免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法など）に適用できる。
【0111】
本発明では、１種又は１種以上の本発明のヒトＬＩＦＲ抗体（任意に検出可能な部分に接合されている）を用いて生体試料（体細胞、組織又は体液）に接触させること、及びＬＩＦＲ発現に関して試料が陽性であるか否かを検出すること、又は試料が対照試料と比較して変化（例えば減少又は増加）した発現を有するか否かを検出することを含む、ＬＩＦＲ発現の検出を提供する。いくつかの実施形態では、組織又は体液は、周辺血液、周辺血液白血球、生体組織検査（例えば、肺又は皮膚生体組織検査）、及び組織である。前記方法は、診断目的又は非診断目的（例えば、ＬＩＦ／ＬＩＦＲ経路研究、薬物スクリーニング、組織化学分析など）に用いることができる。いくつかの実施形態では、非診断目的で使用される試料は、細胞系又はインビトロ細胞培養物などの細胞試料である。
【0112】
一実施形態では、本発明は、試料中のＬＩＦＲの存在又はそのレベルを検出する方法であって、本発明の前記抗体又はその抗原結合断片とＬＩＦＲとの間に複合体を形成することができる条件下で、前記試料と前記抗体又はその抗原結合断片とを接触させ、前記複合体の形成を検出することを含む、方法を提供する。
【0113】
別の態様では、本発明は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、多重特異性抗体、又は抗体薬物複合体と、被験者からの試料とを、抗体又はその抗原結合断片とＬＩＦＲとの間に複合体を形成できる条件下で接触させ、前記複合体の形成を検出することを含む、被験者におけるＬＩＦＲ陽性疾患を診断する方法を提供し、ここで、健康対照に比べて、ＬＩＦＲレベルの上昇は癌の存在を示す。
【0114】
好ましくは、前記被験者は哺乳動物であり、非ヒト哺乳動物及びヒトを含む。好ましくは、前記被験者はヒトである。
【0115】
好ましくは、前記癌は、胆管癌、結腸直腸癌、神経膠腫、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、鼻咽頭癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、非小細胞肺癌である。
【0116】
別の態様では、本発明は、本発明に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質誘導体などを含む、検出キットを提供し、好ましい実施例において、前記キットは、その応用方法を説明するための取扱説明書を含む。
【実施例】
【0117】
実施例１ Ｈａｒｂｏｕｒトランスジェニックマウス免疫
１．免疫原：組換えヒトＬＩＦＲタンパク質アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１１２１１４３．１）の細胞外領域１－８３３位を、ｈｉｓタグを含むｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングし、組換え発現プラスミドを製造した。ＨＥＫ２９３細胞を一過性トランスフェクションして拡大培養し、４日後に細胞培養液を収集し、培養上清を精製し、高純度のｈｕＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質（＞９０％）を得て、生物活性を有し、分注後に－８０℃で凍結保存した。
２．ＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２マウス免疫：ｈｕＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質を用いてて６－８週間のＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２トランスジェニックマウスを免疫した。全てのトランスジェニックマウスをＳＰＦ級環境で飼育した。初回免疫において、５０μｇのｈｕＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質とフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｆ５８８１）を乳化した後、マウス体内に腹腔内注射した。後続の強化免疫について、２５μｇのｈｕＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質をＲＩＢＩアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｓ６３２２）と均一に混合した後、マウス体内に腹腔内注射した。各回の免疫間の間隔は２週間である。免疫後の７日間に血液を取ってＥＬＩＳＡで血清抗体価を検出し、血清抗体価の高いマウスを選択して後続の単一Ｂ細胞スクリーニング試験に用いた。
１．免疫原：組換えヒトＬＩＦＲタンパク質アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１１２１１４３．１）の細胞外領域１－８３３位を、ｈｉｓタグを含むｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングし、組換え発現プラスミドを製造した。ＨＥＫ２９３細胞を一過性トランスフェクションして拡大培養し、４日後に細胞培養液を収集し、培養上清を精製し、高純度のｈｕＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質（＞９０％）を得て、生物活性を有し、分注後に－８０℃で凍結保存した。
２．ＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２マウス免疫：ｈｕＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質を用いてて６－８週間のＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２トランスジェニックマウスを免疫した。全てのトランスジェニックマウスをＳＰＦ級環境で飼育した。初回免疫において、５０μｇのｈｕＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質とフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｆ５８８１）を乳化した後、マウス体内に腹腔内注射した。後続の強化免疫について、２５μｇのｈｕＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質をＲＩＢＩアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｓ６３２２）と均一に混合した後、マウス体内に腹腔内注射した。各回の免疫間の間隔は２週間である。免疫後の７日間に血液を取ってＥＬＩＳＡで血清抗体価を検出し、血清抗体価の高いマウスを選択して後続の単一Ｂ細胞スクリーニング試験に用いた。
【0118】
実施例２ Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍに基づく単一Ｂ細胞のスクリーニング
Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍは、ＯｐｔｏＥｌｅｃｔｒｏ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＯＥＰＴＭ）技術を用いて単一細胞の移動を行う。Ｂｅａｃｏｎ光電システムは、自動化された生物機器であり、細胞培養条件下で生物機能試験、試験分析、陽性クローン選別などの様々な操作を同時に行うことができる。Ｂｅａｃｏｎプラットフォームは、これらのタスクを数千個の細胞上で大規模に並行して自動化することができる。
本願は、形質細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）発見ワークフローを使用して、毎回の試験において最大１４ｋ個の単一ｐｌａｓｍａ細胞をスクリーニングすることができ、抗体が分泌する抗原特異的形質細胞を選別するために用いられる。その後、これらの特異的抗体を分泌する形質細胞を、それぞれ細胞溶解液を含む９６ウェルプレートに導出し、後続の単一Ｂ細胞シーケンシングに用いて、単一Ｂ細胞（モノクローナル）が産生する抗体重鎖及び軽鎖の配列を同定した。
Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍは、ＯｐｔｏＥｌｅｃｔｒｏ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＯＥＰＴＭ）技術を用いて単一細胞の移動を行う。Ｂｅａｃｏｎ光電システムは、自動化された生物機器であり、細胞培養条件下で生物機能試験、試験分析、陽性クローン選別などの様々な操作を同時に行うことができる。Ｂｅａｃｏｎプラットフォームは、これらのタスクを数千個の細胞上で大規模に並行して自動化することができる。
本願は、形質細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）発見ワークフローを使用して、毎回の試験において最大１４ｋ個の単一ｐｌａｓｍａ細胞をスクリーニングすることができ、抗体が分泌する抗原特異的形質細胞を選別するために用いられる。その後、これらの特異的抗体を分泌する形質細胞を、それぞれ細胞溶解液を含む９６ウェルプレートに導出し、後続の単一Ｂ細胞シーケンシングに用いて、単一Ｂ細胞（モノクローナル）が産生する抗体重鎖及び軽鎖の配列を同定した。
【0119】
実施例３ 単一Ｂ細胞シーケンシング及び完全ヒト抗体の製造
本発明は、単一Ｂ細胞シーケンシング方法を用いて単一形質細胞から抗体重鎖及び軽鎖の配列を取得する。単一Ｂ細胞シーケンシングは、抗体配列を得る強力なツールとなっている。一般的なプログラムは、単形質細胞溶解液からＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡの逆転写合成、ｃＤＮＡの増幅精製、重鎖及び軽鎖の増幅、クローン及びトランスフェクション、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを含む。得られた配列に対して唯一性及びクラスタリングを行い、その後、ペアとなる重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列に対してプラスミド合成を行う。
具体的には、抗体分子をコードする軽、重鎖可変ドメイン配列を得た後、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて、軽、重鎖可変ドメイン配列と対応するヒトの抗体の軽、重鎖定常ドメイン配列を融合発現させ、組換え抗体分子を得ることができる。本実施例において、抗体重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）は、遺伝子合成によりヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングされ、ＩｇＧ１抗体の全長重鎖をコードし産生する。抗体軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）は、遺伝子合成によりヒト抗体Ｉｇκ軽鎖定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングされ、抗体の全長軽鎖をコードし産生する。本実施例において、免疫したＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２マウスから得られた抗ＬＩＦＲモノクローナル抗体分子の可変ドメインの配列がヒト抗体配列であるため、本実施例も完全ヒト由来の抗ＬＩＦＲ組換えＩｇＧ１抗体を得た。ここで、本発明で得られた前記ヒトＬＩＦＲ抗体重鎖、軽鎖相補領域決定領域（ＣＤＲ）配列、重鎖、軽鎖可変領域（Ｖ）、重鎖、軽鎖の配列は前記表１に示す通りである。
Ｍｅｇａソフトウェアにより表１の１５個の抗体に対して配列類似性分析を行ったところ、前記抗体は、（１）群１：ＰＲ３００５１６、（２）群２：ＰＲ３０１１６４、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１１７６、（３）群３：ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１６０、（４）群４：ＰＲ３０１１５３、ＰＲ３０１１７７、ＰＲ３０１１９５、ＰＲ３０１１９６、ＰＲ３０１２１１、ＰＲ３０１２１５、ＰＲ３０１２１８、（５）群５：ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１７２に分けることができる。いずれの抗体も実施例４．２及び４．４の試験を行った。５群からそれぞれ代表的な抗体ＰＲ３００５１６、ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１２１１、ＰＲ３０１１６８を選択して実施例４．１、４．３、実施例５の試験を行った。代表的な抗体ＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８に対して体内のＰＫ及び薬力学試験を行った。
５つの代表的な抗体において、ＰＲ３００５１６重鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９４で表され、ＰＲ３００５１６軽鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９５で表され、ＰＲ３０１１２７重鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９６で表され、ＰＲ３０１１２７軽鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９７で表され、ＰＲ３０１１５２重鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９８で表され、ＰＲ３０１１５２軽鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９９で表され、ＰＲ３０１１６８重鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号１００で表され、ＰＲ３０１１６８軽鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号１０１で表され、ＰＲ３０１２１１重鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号１０２で表され、ＰＲ３０１２１１軽鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号１０３に示す。
本発明は、単一Ｂ細胞シーケンシング方法を用いて単一形質細胞から抗体重鎖及び軽鎖の配列を取得する。単一Ｂ細胞シーケンシングは、抗体配列を得る強力なツールとなっている。一般的なプログラムは、単形質細胞溶解液からＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡの逆転写合成、ｃＤＮＡの増幅精製、重鎖及び軽鎖の増幅、クローン及びトランスフェクション、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを含む。得られた配列に対して唯一性及びクラスタリングを行い、その後、ペアとなる重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列に対してプラスミド合成を行う。
具体的には、抗体分子をコードする軽、重鎖可変ドメイン配列を得た後、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて、軽、重鎖可変ドメイン配列と対応するヒトの抗体の軽、重鎖定常ドメイン配列を融合発現させ、組換え抗体分子を得ることができる。本実施例において、抗体重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）は、遺伝子合成によりヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングされ、ＩｇＧ１抗体の全長重鎖をコードし産生する。抗体軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）は、遺伝子合成によりヒト抗体Ｉｇκ軽鎖定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングされ、抗体の全長軽鎖をコードし産生する。本実施例において、免疫したＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２マウスから得られた抗ＬＩＦＲモノクローナル抗体分子の可変ドメインの配列がヒト抗体配列であるため、本実施例も完全ヒト由来の抗ＬＩＦＲ組換えＩｇＧ１抗体を得た。ここで、本発明で得られた前記ヒトＬＩＦＲ抗体重鎖、軽鎖相補領域決定領域（ＣＤＲ）配列、重鎖、軽鎖可変領域（Ｖ）、重鎖、軽鎖の配列は前記表１に示す通りである。
Ｍｅｇａソフトウェアにより表１の１５個の抗体に対して配列類似性分析を行ったところ、前記抗体は、（１）群１：ＰＲ３００５１６、（２）群２：ＰＲ３０１１６４、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１１７６、（３）群３：ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１６０、（４）群４：ＰＲ３０１１５３、ＰＲ３０１１７７、ＰＲ３０１１９５、ＰＲ３０１１９６、ＰＲ３０１２１１、ＰＲ３０１２１５、ＰＲ３０１２１８、（５）群５：ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１７２に分けることができる。いずれの抗体も実施例４．２及び４．４の試験を行った。５群からそれぞれ代表的な抗体ＰＲ３００５１６、ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１２１１、ＰＲ３０１１６８を選択して実施例４．１、４．３、実施例５の試験を行った。代表的な抗体ＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８に対して体内のＰＫ及び薬力学試験を行った。
５つの代表的な抗体において、ＰＲ３００５１６重鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９４で表され、ＰＲ３００５１６軽鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９５で表され、ＰＲ３０１１２７重鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９６で表され、ＰＲ３０１１２７軽鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９７で表され、ＰＲ３０１１５２重鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９８で表され、ＰＲ３０１１５２軽鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号９９で表され、ＰＲ３０１１６８重鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号１００で表され、ＰＲ３０１１６８軽鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号１０１で表され、ＰＲ３０１２１１重鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号１０２で表され、ＰＲ３０１２１１軽鎖可変領域のＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号１０３に示す。
【0120】
実施例４ 組換え抗体の発現及び精製
２９３Ｆ細胞は抗体の発現に用いられる。細胞密度を１×１０ｅ６ 細胞／ｍＬに調整した。重鎖と軽鎖抗体のプラスミドを１：１．５の比率でチューブに入れ、次にトランスフェクション試薬ＰＥＩを入れ、ＰＥＩとＤＮＡの比率は４：１であり、均一に混合した後、室温で１５分間インキュベートした。前記混合物を細胞に加え、細胞をトランスフェクションし、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し、１２５ｒｐｍ振とうした。トランスフェクション後の２４時間後に、ＯＰＭ－ＣＨＯ ＰＦＦ０５栄養（ＯＰＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番ＦＢ１２７９－００１）を最終濃度が３％になるまで補充した。細胞培養５日後、細胞生存率が７０％以下に低下すると、上清を収集した。形質転換上清をｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムでタンパク質精製した。
２９３Ｆ細胞は抗体の発現に用いられる。細胞密度を１×１０ｅ６ 細胞／ｍＬに調整した。重鎖と軽鎖抗体のプラスミドを１：１．５の比率でチューブに入れ、次にトランスフェクション試薬ＰＥＩを入れ、ＰＥＩとＤＮＡの比率は４：１であり、均一に混合した後、室温で１５分間インキュベートした。前記混合物を細胞に加え、細胞をトランスフェクションし、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し、１２５ｒｐｍ振とうした。トランスフェクション後の２４時間後に、ＯＰＭ－ＣＨＯ ＰＦＦ０５栄養（ＯＰＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番ＦＢ１２７９－００１）を最終濃度が３％になるまで補充した。細胞培養５日後、細胞生存率が７０％以下に低下すると、上清を収集した。形質転換上清をｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムでタンパク質精製した。
【0121】
４．１ 抗体親和力検出試験
本発明の実施例１－４の方法により製造された５つの抗体ＰＲ３００５１６、ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１２１１をバイオフィルム干渉（Ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）の方法（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ９６ｅ）により、ヒトＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質に対する結合動力学を検出した。
本発明の実施例１－４の方法により製造された５つの抗体ＰＲ３００５１６、ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１２１１をバイオフィルム干渉（Ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）の方法（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ９６ｅ）により、ヒトＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質に対する結合動力学を検出した。
【0122】
被験抗体を最終濃度６μｇ／ｍＬに希釈し、直接ＡＨＣ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒに固定化し、動力学的測定を行い、抗原タンパク質（ヒト ＬＩＦ）を０．０２％ＰＢＳＴ２０でそれぞれ１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭの３つの濃度に希釈し、７０ｓで注入し、結合時間が３００ｓ、解離時間が３００ｓ、１０ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を１５ｓで再生した。単純一対一Ｌａｎｇｕｉｒ結合モデル（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６データ解析ソフトウェア）を用いて、結合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｄｉｓ）を計算し、平衡解離定数（ｋＤ）は比率ｋｄｉｓ／ｋｏｎで計算した。抗体親和力の測定結果を以下の表２に示す。
【0123】
【表2】
【0124】
表２から分かるように、ヒトＬＩＦＲ抗体の親和力はＬＩＦ抗体ＭＳＣ－１の親和力よりも高い。
【0125】
４．２ 抗体のタンパク質レベルでのＬＩＦＲ－ＥＣＤとの結合能力の検出
ＥＬＩＳＡ測定法に基づいて、本発明の実施例１－４で製造された１５個の抗体とＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質との結合能を検出した。異なる抗体とＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質との結合曲線を比較することにより、その結合能を測定した。具体的な試験過程は、まずヒトＬＩＦＲ－ＥＣＤ、サルＬＩＦＲ－ＥＣＤ及びマウスＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質を順に１μｇ／ｍＬ濃度に希釈し、９６ウェルプレートに１００μＬずつ加え、４℃で一晩放置した。９６ウェルプレートをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を加えて３７℃で１時間放置した。測定される抗体を濃度勾配希釈した後（１００ｎＭ、１０倍希釈）、９６ウェルプレートに加え、３７℃で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、抗－ヒト ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ二次抗体（５０００ｘ希釈使用）を加え、３７℃で３０－６０分インキュベートした。ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、ＴＭＢ発色液を５－１５分加え、その後、終了液を加えて発色を終了した。
ＥＬＩＳＡ測定法に基づいて、本発明の実施例１－４で製造された１５個の抗体とＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質との結合能を検出した。異なる抗体とＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質との結合曲線を比較することにより、その結合能を測定した。具体的な試験過程は、まずヒトＬＩＦＲ－ＥＣＤ、サルＬＩＦＲ－ＥＣＤ及びマウスＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質を順に１μｇ／ｍＬ濃度に希釈し、９６ウェルプレートに１００μＬずつ加え、４℃で一晩放置した。９６ウェルプレートをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を加えて３７℃で１時間放置した。測定される抗体を濃度勾配希釈した後（１００ｎＭ、１０倍希釈）、９６ウェルプレートに加え、３７℃で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、抗－ヒト ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ二次抗体（５０００ｘ希釈使用）を加え、３７℃で３０－６０分インキュベートした。ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、ＴＭＢ発色液を５－１５分加え、その後、終了液を加えて発色を終了した。
【0126】
【表3】
【0127】
検出結果は表３及び図１に示すように、ＰＲ３００５１６、ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１７２、ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１５３、ＰＲ３０１１６０、ＰＲ３０１１６４、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１１７６、ＰＲ３０１１７７、ＰＲ３０１１９５、ＰＲ３０１１９６、ＰＲ３０１２１１、ＰＲ３０１２１５及びＰＲ３０１２１８抗体はいずれもヒトＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質とサルＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質に結合する能力を有するが、ＰＲ３０１１２７及びＰＲ３０１１７２抗体のみがマウスＬＩＦＲ－ＥＣＤタンパク質と交差して結合することができる。
【0128】
４．３ 抗体の細胞レベルでのＬＩＦＲ及びＬＩＦＲ／ｇｐ１３０との結合能力の検出
フローサイトメトリー測定法に基づいて、本発明の実施例１－４で製造された５つの抗体ＰＲ３００５１６、ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１２１１と２９３Ｔ細胞表面に発現するヒトＬＩＦＲ受容体又はヒトＬＩＦＲ／ｇｐ１３０受容体ヘテロダイマーとの結合能力を検出した。異なる抗体と２９３Ｔ細胞表面に発現するヒトＬＩＦＲ受容体又はヒトＬＩＦＲ／ｇｐ１３０受容体ヘテロダイマーとの結合曲線を比較することにより、その結合能を測定した。具体的な試験過程は、（１）ｌｅｎｔｉ－ｈｕＬＩＦＲ及びｌｅｎｔｉ－ＬＩＦＲ／ｇｐ１３０レンチウイルスでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させ、ピューロマイシンで感染後の細胞をスクリーニングして安定細胞プール：ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ及びＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０を得て；（２）安定した細胞プールに対してサブクローニングスクリーニングを行い、標的遺伝子を高発現するモノクローナル細胞系を得て；（３）異なる濃度の測定対象抗体とモノクローナル細胞系を用いて４℃で３０分インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識のヒツジ抗ヒト二次抗体を用いて４℃で３０分インキュベートし、ＰＢＳで再度３回洗浄した後、ｌ００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し；（４）フローサイトメーターを用いて一チャネル中位蛍光値を測定した。抗体濃度が１０を底とする対数を横軸とし、一チャネル中央蛍光値を縦軸とし、そのＥＣ５０及び曲線ピーク値を比較する。
フローサイトメトリー測定法に基づいて、本発明の実施例１－４で製造された５つの抗体ＰＲ３００５１６、ＰＲ３０１１２７、ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１２１１と２９３Ｔ細胞表面に発現するヒトＬＩＦＲ受容体又はヒトＬＩＦＲ／ｇｐ１３０受容体ヘテロダイマーとの結合能力を検出した。異なる抗体と２９３Ｔ細胞表面に発現するヒトＬＩＦＲ受容体又はヒトＬＩＦＲ／ｇｐ１３０受容体ヘテロダイマーとの結合曲線を比較することにより、その結合能を測定した。具体的な試験過程は、（１）ｌｅｎｔｉ－ｈｕＬＩＦＲ及びｌｅｎｔｉ－ＬＩＦＲ／ｇｐ１３０レンチウイルスでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させ、ピューロマイシンで感染後の細胞をスクリーニングして安定細胞プール：ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ及びＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０を得て；（２）安定した細胞プールに対してサブクローニングスクリーニングを行い、標的遺伝子を高発現するモノクローナル細胞系を得て；（３）異なる濃度の測定対象抗体とモノクローナル細胞系を用いて４℃で３０分インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識のヒツジ抗ヒト二次抗体を用いて４℃で３０分インキュベートし、ＰＢＳで再度３回洗浄した後、ｌ００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し；（４）フローサイトメーターを用いて一チャネル中位蛍光値を測定した。抗体濃度が１０を底とする対数を横軸とし、一チャネル中央蛍光値を縦軸とし、そのＥＣ５０及び曲線ピーク値を比較する。
【0129】
【表4】
【0130】
検出結果は表４及び図２に示すように、ヒトＬＩＦＲ抗体は、同じ濃度条件下で、ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０細胞との結合能力がＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ細胞との結合能力より強い。
【0131】
４．４ 抗体がＬＩＦとＬＩＦＲ／ｇｐ１３０との結合を遮断する能力の検出
フローサイトメトリー測定法に基づいて、本発明の実施例１－４で製造された１５個の抗体がｈｕＬＩＦタンパク質と２９３Ｔ細胞表面に発現するヒトＬＩＦＲ／ｇｐ１３０受容体ヘテロダイマーとの結合を遮断する能力を検出した。異なる抗体がｈｕＬＩＦタンパク質とＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０細胞との結合を遮断する曲線を比較することにより、その遮断能力を測定した。具体的な試験過程は、（１）まずｈｕＬＩＦタンパク質がＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０細胞に結合したＥＣ８０濃度を確定する。ｈｕＬＩＦタンパク質に対してビオチン標識（ｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ）を行い、ｈｕＬＩＦ－ｂｉｏｔｉｎタンパク質を得て；（２）異なる濃度の測定対象抗体及びｈｕＬＩＦタンパク質（最終濃度はＥＣ８０の値である）とＨＥＫ２９ＥＴ－ｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０細胞を用いて４℃で１ｈインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＡＰＣ標識されたＳｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ二次抗体を用いて４℃で３０分インキュベートし、ＰＢＳで再度３回洗浄した後、ｌ００μＬ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を再懸濁し；（３）フローサイトメーターを用いてその４チャネル中央蛍光値を測定した。抗体濃度が１０を底とする対数を横座標とし、４チャンネル中央蛍光値を縦座標としてプロットし、そのＩＣ５０及び曲線ピークを比較する。
フローサイトメトリー測定法に基づいて、本発明の実施例１－４で製造された１５個の抗体がｈｕＬＩＦタンパク質と２９３Ｔ細胞表面に発現するヒトＬＩＦＲ／ｇｐ１３０受容体ヘテロダイマーとの結合を遮断する能力を検出した。異なる抗体がｈｕＬＩＦタンパク質とＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０細胞との結合を遮断する曲線を比較することにより、その遮断能力を測定した。具体的な試験過程は、（１）まずｈｕＬＩＦタンパク質がＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０細胞に結合したＥＣ８０濃度を確定する。ｈｕＬＩＦタンパク質に対してビオチン標識（ｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ）を行い、ｈｕＬＩＦ－ｂｉｏｔｉｎタンパク質を得て；（２）異なる濃度の測定対象抗体及びｈｕＬＩＦタンパク質（最終濃度はＥＣ８０の値である）とＨＥＫ２９ＥＴ－ｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０細胞を用いて４℃で１ｈインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＡＰＣ標識されたＳｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ二次抗体を用いて４℃で３０分インキュベートし、ＰＢＳで再度３回洗浄した後、ｌ００μＬ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を再懸濁し；（３）フローサイトメーターを用いてその４チャネル中央蛍光値を測定した。抗体濃度が１０を底とする対数を横座標とし、４チャンネル中央蛍光値を縦座標としてプロットし、そのＩＣ５０及び曲線ピークを比較する。
【0132】
【表5】
【0133】
検出結果は表５及び図３に示すように、陰性対照ｈＩｇＧ１に比べて、ＰＲ３００５１６、ＰＲ３０１１５２、ＰＲ３０１１５３、ＰＲ３０１１６０、ＰＲ３０１１６４、ＰＲ３０１１６８、ＰＲ３０１１７６、ＰＲ３０１１７７、ＰＲ３０１１９５、ＰＲ３０１１９６、ＰＲ３０１２１１、ＰＲ３０１２１５及びＰＲ３０１２１８はいずれもｈｕＬＩＦとＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＬＩＦＲ／ｇｐ１３０との結合を明らかに遮断する機能を有する。
【0134】
実施例５ 抗体のＳＴＡＴ３シグナル経路に対する阻害作用の検出
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔに基づいて、Ｃａｐａｎ－２膵臓癌細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞、Ａ５４９及びＮＣＩ－Ｈ２９２非小細胞肺癌細胞を含むＬＩＦ誘導のＳＴＡＴ３チロシン７０５部位のリン酸化の阻害作用を検出した。具体的な試験過程は、まず腫瘍細胞を６ウェルプレートに敷いて、１ウェルあたり１ｘ１０６個の細胞を、２４時間飢餓処理した（培地に血清を加えない）。さらに、一定濃度のｈｕＬＩＦタンパク質と対応する抗体を３７℃のインキュベーターで１ｈ共インキュベートし、ｈｕＬＩＦタンパク質と抗体混合物を腫瘍細胞に加え、３７℃のインキュベーターで３０分処理した。培地を捨て、予冷したＰＢＳで２回洗浄した。各ウェルに２００μＬの予備冷却されたバッファーを加え、一定量のプロテアーゼ阻害剤（１００×希釈）及びホスファターゼ阻害剤（５０×希釈）を加えた。氷上で３０分インキュベートした後、１２０００回転で１０分遠心分離した。上清を新しいＥＰ管に移し、２５μＬの上清タンパク質を取ってＢＣＡ定量を行い、残りに５×ＳＤＳ ｂｕｆｆｅｒを加え、９５℃の金属浴で５分処理した。タンパク質試料に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを通し、膜を転写した後、ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒを加えて室温で１時間インキュベートした。一次抗体Ｓｔａｔ ３（１２４Ｈ６）Ｍｏｕｓｅ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃９１３９）、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃９１３１）は４℃でオーバーナイトした。ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、毎回１０分である。二次抗体Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｆｃ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ０１６８）、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１１－０３５－０４５）を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、Ａ＋Ｂ発色液、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを加えて露光して撮影した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔに基づいて、Ｃａｐａｎ－２膵臓癌細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞、Ａ５４９及びＮＣＩ－Ｈ２９２非小細胞肺癌細胞を含むＬＩＦ誘導のＳＴＡＴ３チロシン７０５部位のリン酸化の阻害作用を検出した。具体的な試験過程は、まず腫瘍細胞を６ウェルプレートに敷いて、１ウェルあたり１ｘ１０６個の細胞を、２４時間飢餓処理した（培地に血清を加えない）。さらに、一定濃度のｈｕＬＩＦタンパク質と対応する抗体を３７℃のインキュベーターで１ｈ共インキュベートし、ｈｕＬＩＦタンパク質と抗体混合物を腫瘍細胞に加え、３７℃のインキュベーターで３０分処理した。培地を捨て、予冷したＰＢＳで２回洗浄した。各ウェルに２００μＬの予備冷却されたバッファーを加え、一定量のプロテアーゼ阻害剤（１００×希釈）及びホスファターゼ阻害剤（５０×希釈）を加えた。氷上で３０分インキュベートした後、１２０００回転で１０分遠心分離した。上清を新しいＥＰ管に移し、２５μＬの上清タンパク質を取ってＢＣＡ定量を行い、残りに５×ＳＤＳ ｂｕｆｆｅｒを加え、９５℃の金属浴で５分処理した。タンパク質試料に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを通し、膜を転写した後、ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒを加えて室温で１時間インキュベートした。一次抗体Ｓｔａｔ ３（１２４Ｈ６）Ｍｏｕｓｅ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃９１３９）、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃９１３１）は４℃でオーバーナイトした。ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、毎回１０分である。二次抗体Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｆｃ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ０１６８）、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１１－０３５－０４５）を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、Ａ＋Ｂ発色液、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを加えて露光して撮影した。
【0135】
検出結果は図４に示すように、ヒトＬＩＦＲ抗体はＣａｐａｎ－２膵臓癌細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞、Ａ５４９及びＮＣＩ－Ｈ２９２非小細胞肺癌細胞の４種の腫瘍細胞のいずれにおいてもＬＩＦにより誘導されたＳＴＡＴ３シグナル経路の活性化を抑制することができる。
【0136】
実施例６ 抗体の体内でのＰＫ検出
６．１．Ｂａｌｂ／ｃマウス体内でのＰＫ
本研究の目的は、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに抗体を静脈注射した後、その薬物動態パラメータを確定することである。具体的な試験過程は、Ｂａｌｂ／ｃマウスに抗体を尾静脈注射する前に、まず予備血液試料を採取した。その後、５ｍｇ／ｋｇ抗体の用量で尾静脈注射した後、１５分後、５時間後、２４時間後、２日目、４日目、７日目、１４日目及び２１日目の時点で採血し、血清中の抗体濃度を検出した。ＰＫ試験設計は、以下の表６の通りである。
６．１．Ｂａｌｂ／ｃマウス体内でのＰＫ
本研究の目的は、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに抗体を静脈注射した後、その薬物動態パラメータを確定することである。具体的な試験過程は、Ｂａｌｂ／ｃマウスに抗体を尾静脈注射する前に、まず予備血液試料を採取した。その後、５ｍｇ／ｋｇ抗体の用量で尾静脈注射した後、１５分後、５時間後、２４時間後、２日目、４日目、７日目、１４日目及び２１日目の時点で採血し、血清中の抗体濃度を検出した。ＰＫ試験設計は、以下の表６の通りである。
【0137】
【表6】
【0138】
【表7】
【0139】
表７及び図５から分かるように、ヒトＬＩＦＲ抗体ＰＲ３００５１６のマウスにおける半減期は１７８．２５時間であった。
【0140】
６．２．Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット体内でのＰＫ
本研究の目的は、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに抗体を静脈注射した後、その薬物動態パラメータを確定することである。具体的な試験過程として、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの尾静脈に抗体を注射する前に、まず、予備血液試料を取った。その後、５ｍｇ／ｋｇ抗体の用量で尾静脈注射した後、投与前、１０分後、２時間後、８時間後、２４時間後、４日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目及び２８日目時点で採血し、血清中の抗体濃度を検出した。ＰＲ３００５１６抗体とＰＲ３０１１６８抗体の各群にそれぞれ３匹のラットを配置して試験を行った。ＰＫ試験設計は、以下の表８の通りである。
本研究の目的は、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに抗体を静脈注射した後、その薬物動態パラメータを確定することである。具体的な試験過程として、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの尾静脈に抗体を注射する前に、まず、予備血液試料を取った。その後、５ｍｇ／ｋｇ抗体の用量で尾静脈注射した後、投与前、１０分後、２時間後、８時間後、２４時間後、４日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目及び２８日目時点で採血し、血清中の抗体濃度を検出した。ＰＲ３００５１６抗体とＰＲ３０１１６８抗体の各群にそれぞれ３匹のラットを配置して試験を行った。ＰＫ試験設計は、以下の表８の通りである。
【0141】
【表8】
【0142】
【表9】
【0143】
表９及び図６から分かるように、ヒトＬＩＦＲ抗体ＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８のラットにおける半減期はそれぞれ２１９時間及び２４２時間であった。
【0144】
６．３．サル体内ＰＫ試験
本研究の目的は、雄及び雌サルに抗体を静脈注射した後、その薬物動態パラメータを確定することである。具体的な試験過程は、雄及び雌サルの尾に抗体を静脈注射する前に、まず、採血して試料とした。その後、低用量１０ｍｇ／ｋｇ及び高用量１００ｍｇ／ｋｇの抗体の用量で尾静脈注射した後、１０ｍｇ／ｋｇの用量群は投与前、１０分後、２時間後、８時間後、２４時間後、４日目、７日目、１０日目、１４日目時点で採血し、１００ｍｇ／ｋｇの用量群は投与前、１０分後、２時間後、８時間後、２４時間後、４日目、７日目時点で採血し、血清中の抗体濃度を検出した。ＰＫ試験設計は、以下の表１０の通りである。
本研究の目的は、雄及び雌サルに抗体を静脈注射した後、その薬物動態パラメータを確定することである。具体的な試験過程は、雄及び雌サルの尾に抗体を静脈注射する前に、まず、採血して試料とした。その後、低用量１０ｍｇ／ｋｇ及び高用量１００ｍｇ／ｋｇの抗体の用量で尾静脈注射した後、１０ｍｇ／ｋｇの用量群は投与前、１０分後、２時間後、８時間後、２４時間後、４日目、７日目、１０日目、１４日目時点で採血し、１００ｍｇ／ｋｇの用量群は投与前、１０分後、２時間後、８時間後、２４時間後、４日目、７日目時点で採血し、血清中の抗体濃度を検出した。ＰＫ試験設計は、以下の表１０の通りである。
【0145】
【表10】
【0146】
【表11】
【0147】
表１１及び図７から分かるように、低用量のヒトＬＩＦＲ抗体ＰＲ３００５１６のサルにおける半減期はそれぞれ１７３．７時間及び１８２．９時間であり、高用量のヒトＬＩＦＲ抗体ＰＲ３００５１６のサルにおける半減期はそれぞれ２３９．３時間及び１２８．２時間である。
【0148】
実施例７ 抗体の体内での薬力学試験
７．１．Ｃａｐａｎ－２モデル
本試験では、Ｃａｐａｎ－２マウス腫瘍モデルを用いて抗ヒトＬＩＦＲ抗体の抗腫瘍活性を研究した。Ｃａｐａｎ－２マウスモデルにおけるＰＲ３００５１６抗体単独投与（５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇ）の薬力学を研究した。ヒト膵臓癌Ｃａｐａｎ－２細胞（ＡＴＣＣ細胞ライブラリー）５ｘ１０ｅ６細胞を雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅマウスに皮下接種した（Ｖｉｔａｌｒｉｖｅｒ）。抗体群の処理方法は、腫瘍細胞接種後の５日目、９日目、１２日目、１６日目、１９日目及び２３日目に、各群のマウスに対応する抗体を腹腔内注射した。小分子阻害剤群の処理方法は、腫瘍細胞接種後の５日目、７日目、９日目、１２日目、１４日目、１６日目、１９日目、２１日目及び２３日目にマウスにＥＣ３５９小分子阻害剤を経口投与した。腫瘍細胞接種後の５日目、９日目、１２日目、１６日目、１９日目及び２３日目に腫瘍の体積を測定した後、マウスを安楽死させた。結果は表１５及び図８に示すように、本願の抗ヒトＬＩＦＲ抗体ＰＲ３００５１６は、陰性対照と比較して、単独で使用する場合に腫瘍成長に対して一定の抑制作用を有する。ＥＣ３５９小分子阻害剤及びＭＳＣ－１陽性対照抗体に比べて、本願に記載の抗ヒトＬＩＦＲ抗体は、腫瘍成長に対する阻害作用がより強い。本研究において、全ての群のマウスは接種後３７日後、マウスの体重はいずれも明らかに変化しなかった。
７．１．Ｃａｐａｎ－２モデル
本試験では、Ｃａｐａｎ－２マウス腫瘍モデルを用いて抗ヒトＬＩＦＲ抗体の抗腫瘍活性を研究した。Ｃａｐａｎ－２マウスモデルにおけるＰＲ３００５１６抗体単独投与（５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇ）の薬力学を研究した。ヒト膵臓癌Ｃａｐａｎ－２細胞（ＡＴＣＣ細胞ライブラリー）５ｘ１０ｅ６細胞を雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅマウスに皮下接種した（Ｖｉｔａｌｒｉｖｅｒ）。抗体群の処理方法は、腫瘍細胞接種後の５日目、９日目、１２日目、１６日目、１９日目及び２３日目に、各群のマウスに対応する抗体を腹腔内注射した。小分子阻害剤群の処理方法は、腫瘍細胞接種後の５日目、７日目、９日目、１２日目、１４日目、１６日目、１９日目、２１日目及び２３日目にマウスにＥＣ３５９小分子阻害剤を経口投与した。腫瘍細胞接種後の５日目、９日目、１２日目、１６日目、１９日目及び２３日目に腫瘍の体積を測定した後、マウスを安楽死させた。結果は表１５及び図８に示すように、本願の抗ヒトＬＩＦＲ抗体ＰＲ３００５１６は、陰性対照と比較して、単独で使用する場合に腫瘍成長に対して一定の抑制作用を有する。ＥＣ３５９小分子阻害剤及びＭＳＣ－１陽性対照抗体に比べて、本願に記載の抗ヒトＬＩＦＲ抗体は、腫瘍成長に対する阻害作用がより強い。本研究において、全ての群のマウスは接種後３７日後、マウスの体重はいずれも明らかに変化しなかった。
【0149】
７．２．Ｃａｐａｎ－１モデル
本試験では、Ｃａｐａｎ－１マウス腫瘍モデルを用いて抗ヒトＬＩＦＲ抗体の抗腫瘍活性を研究した。Ｃａｐａｎ－１マウスモデルにおけるＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８抗体単独投与（１５ｍｇ／ｋｇ）の薬力学を研究した。ヒト膵臓癌Ｃａｐａｎ－１細胞（ＡＴＣＣ細胞ライブラリー）５ｘ１０ｅ６細胞を雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅマウスに皮下接種した（Ｖｉｔａｌｒｉｖｅｒ）。抗体群の処理方法は、腫瘍細胞接種後の５日目、８日目、１２日目、１５日目、１８日目及び２１日目に、各群のマウスに対応する抗体を腹腔内注射した。腫瘍細胞接種後の５日目、８日目、１２日目、１５日目、１８日目、２１日目に腫瘍の体積を測定して、その後マウスを安楽死させた。結果は表１６及び図９に示すように、本出願の抗ヒトＬＩＦＲ抗体ＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８は、陰性対照に比べて、単独で使用する場合に腫瘍成長に対して一定の抑制作用を有する。ＭＳＣ－１陽性対照抗体に比べて、本願に記載の抗ヒトＬＩＦＲ抗体は、腫瘍成長に対する阻害作用がより強い。本研究において、全ての群のマウスは、接種後２５日で、マウスの体重に明らかな変化がなかった。
本試験では、Ｃａｐａｎ－１マウス腫瘍モデルを用いて抗ヒトＬＩＦＲ抗体の抗腫瘍活性を研究した。Ｃａｐａｎ－１マウスモデルにおけるＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８抗体単独投与（１５ｍｇ／ｋｇ）の薬力学を研究した。ヒト膵臓癌Ｃａｐａｎ－１細胞（ＡＴＣＣ細胞ライブラリー）５ｘ１０ｅ６細胞を雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅマウスに皮下接種した（Ｖｉｔａｌｒｉｖｅｒ）。抗体群の処理方法は、腫瘍細胞接種後の５日目、８日目、１２日目、１５日目、１８日目及び２１日目に、各群のマウスに対応する抗体を腹腔内注射した。腫瘍細胞接種後の５日目、８日目、１２日目、１５日目、１８日目、２１日目に腫瘍の体積を測定して、その後マウスを安楽死させた。結果は表１６及び図９に示すように、本出願の抗ヒトＬＩＦＲ抗体ＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８は、陰性対照に比べて、単独で使用する場合に腫瘍成長に対して一定の抑制作用を有する。ＭＳＣ－１陽性対照抗体に比べて、本願に記載の抗ヒトＬＩＦＲ抗体は、腫瘍成長に対する阻害作用がより強い。本研究において、全ての群のマウスは、接種後２５日で、マウスの体重に明らかな変化がなかった。
【0150】
７．３．ＮＣＩ－Ｈ２９２モデル
本試験では、ＮＣＩ－Ｈ２９２マウス腫瘍モデルを用いて抗ヒトＬＩＦＲ抗体の抗腫瘍活性を研究した。ＮＣＩ－Ｈ２９２マウスモデルにおけるＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８抗体単独投与（１５ｍｇ／ｋｇ）の薬力学を研究した。ヒト膵臓癌ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣ細胞ライブラリー）５ｘ１０ｅ６細胞を雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅマウスに皮下接種した（Ｖｉｔａｌｒｉｖｅｒ）。抗体群の処理方法は、腫瘍細胞接種後の５日目、８日目、１２日目、１５日目、１８日目及び２１日目に、各群のマウスに対応する抗体を腹腔内注射した。腫瘍細胞接種後の５日目、８日目、１２日目、１５日目、１８日目、２１日目に腫瘍の体積を測定した後、マウスを安楽死させた。結果は表１７及び図１０に示すように、本出願の抗ヒトＬＩＦＲ抗体ＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８は、陰性対照に比べて、単独で使用する場合に腫瘍成長に対して一定の抑制作用を有する。ＭＳＣ－１陽性対照抗体と比べて、本願に記載の抗ヒトＬＩＦＲ抗体は、腫瘍成長に対する阻害作用が弱い。本研究において、全ての群のマウスは接種後２５日後に、マウスの体重が減少した。
本試験では、ＮＣＩ－Ｈ２９２マウス腫瘍モデルを用いて抗ヒトＬＩＦＲ抗体の抗腫瘍活性を研究した。ＮＣＩ－Ｈ２９２マウスモデルにおけるＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８抗体単独投与（１５ｍｇ／ｋｇ）の薬力学を研究した。ヒト膵臓癌ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣ細胞ライブラリー）５ｘ１０ｅ６細胞を雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅマウスに皮下接種した（Ｖｉｔａｌｒｉｖｅｒ）。抗体群の処理方法は、腫瘍細胞接種後の５日目、８日目、１２日目、１５日目、１８日目及び２１日目に、各群のマウスに対応する抗体を腹腔内注射した。腫瘍細胞接種後の５日目、８日目、１２日目、１５日目、１８日目、２１日目に腫瘍の体積を測定した後、マウスを安楽死させた。結果は表１７及び図１０に示すように、本出願の抗ヒトＬＩＦＲ抗体ＰＲ３００５１６及びＰＲ３０１１６８は、陰性対照に比べて、単独で使用する場合に腫瘍成長に対して一定の抑制作用を有する。ＭＳＣ－１陽性対照抗体と比べて、本願に記載の抗ヒトＬＩＦＲ抗体は、腫瘍成長に対する阻害作用が弱い。本研究において、全ての群のマウスは接種後２５日後に、マウスの体重が減少した。
【0151】
【表12】
【0152】
【表13】
【0153】
【表14】
【0154】
【表15】
【0155】
【表16】
【0156】
【表17】
【0157】
以上の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示したに過ぎず、その説明は、より具体的で詳細であるが、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。なお、当業者であれば、本発明の思想を逸脱することなく、若干の変形及び改良を行うことができ、これらはいずれも本発明の保護範囲に属する。したがって、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲を基準とする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）配列番号１に示す重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号５に示すＨＣＤＲ２、配列番号１６に示すＨＣＤＲ３、配列番号２６に示す軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（２）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号７に示すＨＣＤＲ２、配列番号１８に示すＨＣＤＲ３、配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（３）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号６に示すＨＣＤＲ２、配列番号１７に示すＨＣＤＲ３、配列番号２７に示すＬＣＤＲ１、配列番号３４に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（４）配列番号２に示すＨＣＤＲ１、配列番号７に示すＨＣＤＲ２、配列番号１９に示すＨＣＤＲ３、配列番号２６に示すＬＣＤＲ１、配列番号３３に示すＬＣＤＲ２、配列番号４１に示すＬＣＤＲ３、
（５）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１２に示すＨＣＤＲ２、配列番号２３に示すＨＣＤＲ３、配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（６）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１０に示すＨＣＤＲ２、配列番号２０に示すＨＣＤＲ３、配列番号２９に示すＬＣＤＲ１、配列番号３６に示すＬＣＤＲ２、配列番号４２に示すＬＣＤＲ３、
（７）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１０に示すＨＣＤＲ２、配列番号２１に示すＨＣＤＲ３、配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３７に示すＬＣＤＲ２、配列番号４３に示すＬＣＤＲ３、
（８）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（９）配列番号３に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３９に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
（１０）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、又は
（１１）配列番号１に示すＨＣＤＲ１、配列番号１３に示すＨＣＤＲ２、配列番号２２に示すＨＣＤＲ３、配列番号３０に示すＬＣＤＲ１、配列番号３８に示すＬＣＤＲ２、配列番号４４に示すＬＣＤＲ３、
というＨＣＤＲ及びＬＣＤＲを含む、ヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項2】
（１）配列番号４６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、配列番号６０と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、（２）配列番号４８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号６２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（３）配列番号４７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号６１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（４）配列番号４９と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号６２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（５）配列番号５５と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号６７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（６）配列番号５２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号６５と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（７）配列番号５３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号６６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（８）配列番号５４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号６７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（９）配列番号５４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号６８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（１０）配列番号５６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号６７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（１１）配列番号５７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号６７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
というＶＨ及びＶＬを含む、請求項１に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項3】
（１）配列番号７０と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）、配列番号８４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）、（２）配列番号７２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ、配列番号８６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ、
（３）配列番号７１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ、配列番号８５と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ、
（４）配列番号７３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ、配列番号８６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ、
（５）配列番号７９と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ、配列番号９１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ、
（６）配列番号７６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ、配列番号８９と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ、
（７）配列番号７７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ、配列番号９０と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ、
（８）配列番号７８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ、配列番号９１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ、
（９）配列番号７８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ、配列番号９２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ、
（１０）配列番号８０と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ、配列番号９１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ、又は
（１１）配列番号８１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ、配列番号９１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ、
というＨＣ及びＬＣを含む、請求項１又は２に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項4】
キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体を含む、請求項１－３のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項5】
全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体及び／又は単一ドメイン抗体、又は前記抗体から製造されたモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を含む、請求項１－４のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質。
【請求項6】
請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項8】
請求項６に記載の核酸分子又は請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項9】
請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項10】
請求項９に記載のキメラ抗原受容体を含む、免疫細胞。
【請求項11】
請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質と、酵素、放射性核種、蛍光染料、発光物質又はビオチンである検出可能な標識分子とを含む、抗原結合タンパク質誘導体。
【請求項12】
請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質と、別の抗体又はその断片又は抗体類似体とを含み、二重特異性抗体、三重特異性抗体又は四重特異性抗体である、多重特異性抗体。
【請求項13】
抗体薬物複合体であって、前記抗体薬物複合体は、抗体部分と複合部分とを含み、
前記抗体部分は、請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を含み、
前記複合部分は、検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されず、
前記抗体部分と複合部分とは、化学結合又はリンカーによって複合される、抗体薬物複合体。
【請求項14】
請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質誘導体、請求項１２に記載の多重特異性抗体及び／又は請求項１３に記載の抗体薬物複合体、及び任意の薬学的に許容されるベクターを含む、薬物組成物。
【請求項15】
前記薬物組成物は、組み合わせ治療剤をさらに含み、前記組み合わせ治療剤は、化学治療剤、放射線治療剤、免疫抑制剤、細胞毒性薬を含むが、これらに限定されない、請求項１４に記載の薬物組成物。
【請求項16】
請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質の製造方法であって、請求項１－５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を発現させた状態で、請求項８に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項17】
請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞、請求項９に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質誘導体、請求項１２に記載の多重特異性抗体、請求項１３に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１４又は１５に記載の薬物組成物の、ＬＩＦ及び／又はＬＩＦＲ遮断薬物、キット及び／又は医療装置の製造における応用。
【請求項18】
請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞、請求項９に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質誘導体、請求項１２に記載の多重特異性抗体、請求項１３に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１４又は１５に記載の薬物組成物の、ＬＩＦＲ陽性疾患を予防及び／又は治療するための薬物、キット及び／又は投与装置の製造における応用。
【請求項19】
前記ＬＩＦＲ陽性疾患は、腫瘍であり、前記腫瘍は、胆管癌、結腸直腸癌、神経膠腫、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、鼻咽頭癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌及び非小細胞肺癌を含むが、これらに限定されない、請求項１８に記載の用途。
【請求項20】
請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質を用いてＬＩＦＲを定性的又は定量的に分析して検出する、ＬＩＦＲ検出方法。
【請求項21】
請求項１－５のいずれか一項に記載のヒトＬＩＦＲ抗原結合タンパク質、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞、請求項９に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質誘導体、請求項１２に記載の多重特異性抗体、請求項１３に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１４又は１５に記載の薬物組成物、並びに任意の説明書を含む、キット。
【請求項22】
（１）必要な被験者に請求項１４又は１５に記載の薬物組成物を投与するための輸液モジュール、及び（２）任意の薬効監視モジュールを含む、投与装置。
【国際調査報告】