特表 2024-501750 ＮＫ細胞を含む免疫細胞活性を大幅に増進させる免疫強化鹿茸酵素分解抽出物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-15

(54)【発明の名称】ＮＫ細胞を含む免疫細胞活性を大幅に増進させる免疫強化鹿茸酵素分解抽出物

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/10 20160101AFI20240105BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240105BHJP

   A61K 35/32 20150101ALI20240105BHJP

   A23L 2/52 20060101ALI20240105BHJP

【ＦＩ】

A23L33/10

A61P37/04

A61K35/32

A23L2/00 F

A23L2/52

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023540829

(86)(22)【出願日】2021-12-29

(85)【翻訳文提出日】2023-07-21

(86)【国際出願番号】 KR2021020127

(87)【国際公開番号】W WO2022146016

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】10-2020-0187513

(32)【優先日】2020-12-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2021-0189206

(32)【優先日】2021-12-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523250740

【氏名又は名称】ユハン ケア カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＹＵＨＡＮ ＣＡＲＥ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】３４Ｆ， １０８， Ｙｅｏｕｉ－ｄａｅｒｏ Ｙｅｏｎｇｄｅｕｎｇｐｏ－ｇｕ Ｓｅｏｕｌ， ０７３３５， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001025

【氏名又は名称】弁理士法人レクスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カン ジョンス

(72)【発明者】

【氏名】チョン キョン イン

(72)【発明者】

【氏名】パク イル ボム

(72)【発明者】

【氏名】パク ヒュン ジェ

(72)【発明者】

【氏名】ソン エイリ

(72)【発明者】

【氏名】オム セミ

(72)【発明者】

【氏名】チョン ヒェ ジン

(72)【発明者】

【氏名】ベク シン ファ

【テーマコード（参考）】

4B018

4B117

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B018LB01

4B018LB02

4B018LB03

4B018LB04

4B018LB05

4B018LB06

4B018LB07

4B018LB08

4B018LB09

4B018LE01

4B018LE02

4B018LE03

4B018MD73

4B018MD90

4B018ME14

4B018MF01

4B018MF06

4B018MF12

4B117LC04

4B117LG04

4B117LK08

4B117LK13

4B117LK14

4B117LK17

4B117LP01

4B117LP06

4B117LP14

4B117LP17

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB46

4C087NA14

4C087ZB09

(57)【要約】

本発明は、免疫増強用組成物に関し、より詳細には、ＮＫ細胞活性に富む鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含むことによって免疫細胞を増殖させ、特に、ＮＫ細胞活性を増進させて免疫増強効果を示すので、免疫増強用食品組成物、ひいては健康機能食品又は薬学組成物として活用可能である。
【選択図】 図１０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

鹿茸をＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素で分解させた鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含む免疫増強用食品組成物。

【請求項2】

前記酵素は、ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫増強用食品組成物。

【請求項3】

前記ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素は、カビ由来のプロテアーゼ及びペプチダーゼの複合物であることを特徴とする、請求項２に記載の免疫増強用食品組成物。

【請求項4】

前記カビ由来のプロテアーゼ及びペプチダーゼの複合物は、アスペルギルスオリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のエンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼの複合物であることを特徴とする、請求項３に記載の免疫増強用食品組成物。

【請求項5】

前記エンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼの複合物は、フラボザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）であることを特徴とする、請求項４に記載の免疫増強用食品組成物。

【請求項6】

前記ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素は、バチルス由来の中性のプロテアーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の免疫増強用食品組成物。

【請求項7】

前記バチルス由来の中性のプロテアーゼは、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の水中発酵（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって生産される中性のメタロ（Ｚｎ）エンドプロテアーゼであることを特徴とする、請求項６に記載の免疫増強用食品組成物。

【請求項8】

前記中性のメタロ（Ｚｎ）エンドプロテアーゼは、ニュートラーゼ（Neutrase）であることを特徴とする、請求項７に記載の免疫増強用食品組成物。

【請求項9】

前記鹿茸酵素分解抽出物は、生鹿茸又は冷凍鹿茸を凍結乾燥させた乾燥鹿茸を酵素処理によって加水分解させた鹿茸酵素分解抽出物であることを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載の免疫増強用食品組成物。

【請求項10】

生鹿茸又は冷凍鹿茸を凍結乾燥させる凍結乾燥鹿茸準備段階；及び
前記凍結乾燥鹿茸１０重量部に水５０～５００重量部及び酵素０．０１～１重量部を入れ、３０～６０℃で１～４８時間反応させる酵素処理段階；を含み、
前記酵素は、ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素であることを特徴とする、免疫増強活性を有する鹿茸酵素分解抽出物の製造方法。

【請求項11】

前記酵素は、ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素であることを特徴とする、請求項１０に記載の免疫増強活性を有する鹿茸酵素分解抽出物の製造方法。

【請求項12】

鹿茸をＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素で分解させた鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含む免疫増強用薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫増強用組成物に関し、より詳細には、ＮＫ細胞活性に富む鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含む免疫増強用食品組成物、特に、免疫増強用健康機能食品、免疫増強用薬学組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

生活水準の向上及び食生活の西欧化に伴って、栄養過剰、運動不足などによる肥満、糖尿、高血圧及び心臓病などのような生活習慣病（成人病）の発病が増えている。また、平均寿命の伸びによる老齢化社会への進入が加速化するにつれて健康増進に対する関心も高まっている。

【0003】

健康増進（ｈｅａｌｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ）とは、疾病、特に慢性退行性疾患や感染症、続くストレスに対する抵抗力の増大、及び日常の活動力の増大を図ることであり、その方策としては、栄養の改善、免疫機能強化、適切な運動と休息、精神的活動の持続など、生活様式全般にわたる管理が必要である。

【0004】

特に、免疫力が高いと、普段疾病にかかりにくく、例え疾病にかかっても回復が早い。このような健康な状態を維持し続けながら年を取ると寿命が伸びることは明らかである。したがって、免疫力は人間の健康と寿命に直結しており、健康を維持し、寿命を伸ばすためには、免疫力を管理することが必須であるといえよう。

【0005】

免疫（Ｉｍｍｕｎｅ）とは、人間及び動物の体内で外因性及び内因性の異物を生理的に認識して排除し、恒常性を維持させるための機序のことを指す。ここで、異物を抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）といい、これを除去する過程に多種の白血球細胞とタンパク質が関与する。免疫は、大きく、生まれながら持っている先天免疫と、後天的に生活などに適応して得られる獲得免疫とに区別される。

【0006】

先天免疫（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）は、自然免疫、自然抵抗ともいう。抗原に対して非特異的に反応し、特別な記憶作用はない。先天的な兔疫体系には、抗原の侵入を遮断する皮膚・粘液組織、強い酸性の胃酸、血液に存在する補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）などがある。細胞には、食菌作用を担当する大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）と多形核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、感染細胞を殺し得るＮＫ細胞などがある。また、大食細胞によって生産されるサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）がある。実際に、大部分の感染は、上記の先天免疫によって防御される。

【0007】

外部感染に対する最初の認識は主に大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）が行う。大食細胞が抗原を貪食する過程で免疫反応を媒介するサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が生産される。

【0008】

また、サイトカインは、身体の防御体系を制御し刺激する信号物質として用いられる糖タンパク質であり、免疫、感染病、造血機能、組織回復、細胞の発展及び成長に重要な機能を持つ。サイトカインは、局所部位に炎症を誘発することによって免疫細胞を感染部位に集める機能を有することから、炎症性サイトカイン（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）とも呼ばれる。最も重要な免疫機能は、インターロイキン、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子として知られたサイトカインの集団によって行われる。これらのうち、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）は、免疫反応が起きる諸段階に作用して免疫反応を調節することによって人体の防御作用に重要な役割を担う物質であり、その種類はＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２などがある。

【0009】

また、ＮＫ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；自然殺害細胞）は、抗原による事前感作なしにも腫瘍細胞、バクテリア、細胞内寄生生物又はウイルスに感染された宿主細胞を除去する機能を担い、不適切な骨髄移植を拒否し、Ｔ細胞の免疫反応を調節するなど、生体内免疫系防御機序の第一線で働く行動細胞であり、ＮＫ細胞の活性が高いと、標的細胞を攻撃及び除去する能力も増加することが知られている。

【0010】

一方、鹿茸（Ｃｅｒｖｉ Ｐａｒｖｕｍ Ｃｏｒｎｕ，Ａｎｔｌｅｒ）は、梅花鹿、大鹿又は馬鹿の雄鹿の毛が密生し、まだ骨質化していないか、多少骨質化した幼い角を切断して乾燥させたものであり、育ち始めて２カ月以内の、角質化が進んでいなく、組織が軟らかく、毛が均一に覆われている雄鹿の角を意味する。角質化が進んでいない鹿の角はややぶよぶよしているが、時期的に秋には硬く角質化して鹿茸の効能が低下する。これを鹿角と呼ぶ。

【0011】

東医宝鑑などの古文献によれば、鹿茸は、強壮、生長発育促進、補血、造血、五臓六腑の亢進、心不全症治療、身体機能亢進、身体活力増強及び腎臓の利尿機能強化など、多くの薬理的効能を有するものと知られている。動物を利用した効能に関する研究としては、白ネズミの成長促進、造血、血清コレステロール低下、タンパク質合成促進、老化防止、白ネズミの脊椎神経酵素活性増大、鎮痛及び抗疲労、免疫活性増大及び鎮静作用などがあることが報告された。

【0012】

鹿茸の生理活性成分には、アミノ酸、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、コラーゲン、リン脂質、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、グルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、パントクリン（ｐａｎｔｏｃｒｉｎ）、ガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）などが知られている。

【0013】

従来、漢方で使用する鹿茸の服用方法には、乾燥鹿茸を多種の生薬剤と混合、粉砕した後、水を溶媒にして加熱抽出してその濾液を服用する方法と、乾燥鹿茸と生薬剤を粉砕して粉にした後、丸にして服用する方法が主に用いられている。抽出して服用する方法は、鹿茸の有効成分の吸収がしやすいが、抽出粕に含まれている有効成分を活用できない限界があり、丸剤形は、鹿茸自体を摂取するという利点があるが、体内で有効成分の完全な吸収が難しいという問題点があった。

【0014】

韓国公開特許第２００５－００９００４１号では、鹿茸を粉砕した後に抽出し、タンパク分解酵素処理及び塩酸分解処理をする鹿茸抽出方法を記述しているが、抽出、タンパク分解酵素処理及び塩酸分解処理を順次に行っているため、工程が複雑であり、人体に有用な生理活性物質が分解される問題があった。

【0015】

また、韓国公開特許第２０１３－００７８７２４号では、鹿茸を酸性条件でペプシン及び脂肪分解酵素で処理した後、中性条件でタンパク質分解酵素でさらに処理する方法を記述しているが、単純に遊離アミノ酸の含有量及びリン脂質の含有量が増加したとの記載があるだけで、実際の生理活性や具体的機能性については記述していない限界があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【特許文献1】韓国公開特許第２００５－００９００４１号

【特許文献2】韓国公開特許第２０１３－００７８７２４号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

本発明が解決しようとする課題は、鹿茸をＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素で分解させたＮＫ細胞活性に富む鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含む免疫増強用食品組成物を提供することである。

【0018】

本発明が解決しようとする他の課題は、生鹿茸又は冷凍鹿茸を凍結乾燥させる凍結乾燥鹿茸準備段階；及び、前記凍結乾燥鹿茸１０重量部に水５０～５００重量部及び酵素０．０１～１重量部を入れ、３０～６０℃で１～４８時間反応させる酵素処理段階；を含み、前記酵素は、ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素であることを特徴とする、免疫増強活性を有する鹿茸酵素分解抽出物の製造方法を提供することである。

【0019】

本発明が解決しようとする他の課題は、鹿茸をＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素で分解させたＮＫ細胞活性に富む鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含む免疫増強用薬学組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0020】

本発明は、前記課題を達成するために、鹿茸をＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素で分解させた鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含む免疫増強用食品組成物を提供する。

【0021】

本発明の一実施例によれば、前記鹿茸酵素分解抽出物は、鹿茸をＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素で分解させた鹿茸酵素分解抽出物であってよい。

【0022】

本発明の一実施例によれば、前記ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素は、カビ由来のプロテアーゼ及びペプチダーゼの複合物であってよい。

【0023】

本発明の一実施例によれば、前記カビ由来のプロテアーゼ及びペプチダーゼの複合物はアスペルギルスオリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のエンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼの複合物であってよい。

【0024】

本発明の一実施例によれば、前記エンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼの複合物は、フラボザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）（登録商標）であってよい。

【0025】

本発明の一実施例によれば、前記ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素は、バチルス由来の中性のプロテアーゼであってよい。

【0026】

本発明の一実施例によれば、前記バチルス由来の中性のプロテアーゼは、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の水中発酵（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって生産される中性のメタロ（Ｚｎ）エンドプロテアーゼであってよい。

【0027】

本発明の一実施例によれば、前記中性のメタロ（Ｚｎ）エンドプロテアーゼは、ニュートラーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ）であってよい。

【0028】

本発明の一実施例によれば、前記鹿茸酵素分解抽出物は、生鹿茸又は冷凍鹿茸を凍結乾燥させた乾燥鹿茸を酵素処理によって加水分解させた鹿茸酵素分解抽出物であってよい。

【0029】

また、本発明は、生鹿茸又は冷凍鹿茸を凍結乾燥させる凍結乾燥鹿茸準備段階；及び、前記凍結乾燥鹿茸１０重量部に水５０～５００重量部及び酵素０．０１～１重量部を入れ、３０～６０℃で１～４８時間反応させる酵素処理段階；を含み、前記酵素は、ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素であることを特徴とする、免疫増強活性を有する鹿茸酵素分解抽出物の製造方法を提供する。

【0030】

また、本発明は、ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素で分解させた鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含む免疫増強用薬学組成物を提供する。

【0031】

本発明の一実施例によれば、前記鹿茸酵素分解抽出物は、鹿茸をＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素で分解させた鹿茸酵素分解抽出物であってよい。

【発明の効果】

【0032】

本発明のＮＫ細胞活性に富む鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含む組成物は、免疫細胞を増殖させたり免疫細胞の機能を活性化させるので、免疫増強用食品組成物、ひいては健康機能食品又は薬学組成物として活用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】実験例２において鹿茸酵素分解抽出物の抗原刺激白血球免疫活性増進効果を確認するために、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇを用いて免疫関連サイトカイン発現を分析法を用いて示す図であり、アップレギュレーション（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されるほど赤色、ダウンレギュレーション（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されるほど青色で表示している。

【図2】実験例３において鹿茸酵素分解抽出物の種類及び濃度による大食細胞での酸化窒素生成効果を比較したグラフである。

【図3】実験例４において鹿茸酵素分解抽出物の種類及び濃度による大食細胞でのｉＮＯＳ遺伝子発現量を比較したグラフである。

【図4】実験例４において鹿茸酵素分解抽出物の種類及び濃度による大食細胞でのＣＯＸ２遺伝子発現量を比較したグラフである。

【図5】実験例５において鹿茸酵素分解抽出物の種類及び濃度によるＴＮＦ－αの相対発現量を比較したグラフである。

【図6】実験例５において鹿茸酵素分解抽出物の種類及び濃度によるＩＦＮ－γの相対発現量を比較したグラフである。

【図7】実験例５において鹿茸酵素分解抽出物の種類及び濃度によるＩＬ－６の相対発現量を比較したグラフである。

【図8】実験例５において鹿茸酵素分解抽出物の種類及び濃度によるＩＬ－１βの相対発現量を比較したグラフである。

【図9】実験例６において鹿茸酵素分解抽出物の種類及び濃度による培養時間の変化による大食細胞増殖能を比較したグラフである。

【図10】実験例７において免疫抑制動物モデルで鹿茸酵素分解抽出物の種類及び投与濃度によるＮＫ細胞活性を比較したグラフである。

【図11】実験例７において免疫抑制動物モデルで鹿茸酵素分解抽出物の種類及び投与濃度によるＴＮＦ－α濃度を比較したグラフである。

【図12】実験例７において免疫抑制動物モデルで鹿茸酵素分解抽出物の種類及び投与濃度によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）濃度を比較したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0035】

本発明の発明者らは、鹿茸酵素分解抽出物、特に、鹿茸をＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素又はＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素で分解させた鹿茸酵素分解抽出物、好ましくは、ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素で分解させた鹿茸酵素分解抽出物が、ＮＫ細胞活性に優れ、免疫関連サイトカイン発現を増進させて免疫増強活性を示すことを確認した。

【0036】

前記鹿茸は、生後２カ月以内の骨質化されていない鹿の角を指す。

【0037】

前記鹿茸は、低湿度環境で数週にわたって自然乾燥させた乾燥鹿茸を使用してもよいが、好ましくは、本発明では生鹿茸又は冷凍鹿茸を凍結乾燥させた乾燥鹿茸を使用することができる。

【0038】

生鹿茸又は冷凍鹿茸を自然乾燥させたり又は凍結乾燥前に殺菌するために熱湯処理する場合に、鹿茸深部の温度が酵素失活温度まで上昇する前に、内因性酵素の作用によって非特異的且つ不均一な酵素分解が発生する問題がある。このため、生鹿茸又は冷凍鹿茸を自然乾燥させたり又は凍結乾燥前に熱湯処理しないで直に凍結乾燥すると、品質が均一であり且つ免疫増強活性に富む鹿茸酵素分解抽出物の製造が可能である。一応凍結乾燥させた乾燥鹿茸は、通常の方法で殺菌後に使用してよく、例えば、１２０～１３０℃で３０秒～２０分熱処理後に使用することができる。

【0039】

前記ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２３．１の酵素、例えば、ペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）、アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａｓｐａｒｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｎａｓｅ）のような酵素も、鹿茸酵素分解抽出物を製造しても免疫増強効果を示さない。ペプシンはアスパラギン酸エンドペプチダーゼであり、選択的に疎水性、特に、芳香族アミノ酸残基を切断する。

【0040】

前記ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．１１．１の酵素、例えば、Ａ－ＬＡＰ、ａｃｉｄｉｃ Ｍ１７ ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ＡｃＬＡＰ、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、「フラボザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）」（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）などは、酵素処理によって鹿茸酵素分解抽出物を製造する場合に、従来の鹿茸熱水抽出物又は超臨界鹿茸抽出物に比べてはるかに優れた免疫増強効果を示す。前記フラボザイムは、アスペルギルスオリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の水中発酵（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって生産されるエンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼの複合物である。

【0041】

また、前記ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素は、バチルス由来の中性のプロテアーゼであり、例えば、バチロリシン、バチルスメタロエンドペプチダーゼ、アニロザイムＰ１０；バチルスメタロプロテイナーゼ、メガテリオペプチダーゼ、「ニュートラーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ）」（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）などは、酵素処理によって鹿茸酵素分解抽出物を製造する場合に、従来の鹿茸熱水抽出物又は超臨界鹿茸抽出物に比べて遥かに優れた免疫増強効果を示す。前記ニュートラーゼは、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の水中発酵（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって生産される中性のメタロ（Ｚｎ）エンドプロテアーゼである。ニュートラーゼの他に、前記酵素クラスに属するバクテリア起源の中性メタロプロテイナーゼである「Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｎ ‘Ａｍａｎｏ’」（Ａｍａｎｏ Ｅｎｚｙｍｅ社製）及び「Ｃｏｒｏｌａｓｅ Ｎ」（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ社製）などによって酵素処理された鹿茸酵素分解抽出物なども、従来の鹿茸熱水抽出物又は超臨界鹿茸抽出物に比べて遥かに優れた免疫増強効果を示す。

【0042】

しかし、ＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２１．６２の酵素、例えば、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）、サブチリシン、コロラーゼＮ（ｃｏｌｏｒａｓｅ Ｎ）、ＡＬＫ－酵素；バチロペプチダーゼＡ；バチロペプチダーゼＢ；バチルスサブチリスアルカリラインプロテイナーゼバイオプラーゼ（ｂｉｏｐｒａｓｅ）；バイオプラーゼＡＬ１５；バイオプラーゼＡＰＬ３０；コリスチナーゼ（ｃｏｌｉｓｔｉｎａｓｅ）；サブチリシンＪ；サブチリシンＳ４１；サブチリシンセンダイ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｓｅｎｄａｉ）；サブチリシンＧＸ；サブチリシンＥ；サブチリシンＢＬ；サブチリシンＡ（Ｔｙｐｅ ＶＩＩＩ）；ジェネナーゼ（ｇｅｎｅｎａｓｅ）Ｉ；エスペラーゼ（ｅｓｐｅｒａｓｅ）；マキサターゼ（ｍａｘａｔａｓｅ）；サーモアーゼ（ｔｈｅｒｍｏａｓｅ）ＰＣ１０；プロテアーゼＸＸＶＩＩ；サーモアーゼ；スーパーアーゼ（ｓｕｐｅｒａｓｅ）；サブチリシンＤＹ；スブチロペプチダーゼ；ＳＰ２６６；サビナーゼ（ｓａｖｉｎａｓｅ）８．０Ｌ；サビナーゼ４．０Ｔ；カズサーゼ（ｋａｚｕｓａｓｅ）；プロテアーゼＶＩＩＩ；オプチマーゼ；オプチクリーン（ｏｐｔｉｃｌｅａｎ）；バチルスサブチリスアルカラインプロテイナーゼ；ｐｒｏｔｉｎ Ａ３Ｌ；サビナーゼ；サビナーゼ１６．０Ｌ；サビナーゼ３２．０Ｌ ＥＸ；オリエンターゼ（ｏｒｉｅｎｔａｓｅ）１０Ｂ；プロテアーゼＳ及び類似のセリンエンドペプチダーゼは、酵素処理によって鹿茸酵素分解抽出物を製造しても免疫増強効果を示さない。

【0043】

また、ＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２４．２８の酵素及びＩＵＢＭＢ酵素命名クラスＥＣ ３．４．２１．６２の酵素の複合物である「プロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）」（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）の場合にも、酵素処理によって鹿茸酵素分解抽出物を製造しても免疫増強効果を示さない。

【0044】

前記鹿茸酵素分解抽出物の製造は、水に適切な量の鹿茸と酵素を投入して酵素処理する。例えば、凍結乾燥させた鹿茸のような乾燥鹿茸１０重量部に対して５０～５００重量部、好ましくは１００～４００重量部の水を投入し、酵素は０．０１～１重量部、好ましくは０．０２～０．８重量部、より好ましくは０．０５～０．５重量部を投入できるが、その投入量は必要によって任意に変更して使用してもよい。

【0045】

前記酵素処理温度は、選択された酵素の最適温度によって適切な範囲を選択でき、好ましくは３０～６０℃、より好ましくは４０～５５℃で反応させることができる。

【0046】

前記酵素処理時間は、酵素処理によって生成されるペプチドの量、ペプチドの分子量及びそのプロファイルによって適切な時間を選択でき、好ましくは１時間以上、より好ましくは２時間以上、さらに好ましくは３時間以上であり、一定時間以上で酵素処理しても生産収率に及ぼす影響はわずかで、工程費用だけが上昇することがあるため、好ましくは４８時間以下、より好ましくは２４時間以下、さらに好ましくは１２時間以下で反応させる。

【0047】

前記酵素処理段階後には、酵素を不活性化させる段階をさらに含んでよい。酵素不活性化は、通常の技術者に公知であるいかなる方法を適用してもよく、例えば、８５℃以上の温度で２０分以上処理して不活性化させることができる。

【0048】

前記「鹿茸酵素分解抽出物」は、鹿茸に酵素処理によって得られた反応生成物、それらから分画した分画物、それらの分解物又は分画物をさらに濃縮した濃縮物、それを精製又は分離した精製物も含み、前記反応生成物、分画物、濃縮物又は精製物を乾燥させた乾燥物又はそれを粉砕した粉末を含む意味で使われる。

【0049】

前記濃縮物又は精製物の製造のために遠心分離したり、分子量カット－オフ値を有する限外濾過膜を通過させたり、又は様々なクロマトグラフィー（大きさ、電荷、疎水性又は親和性による分離のために製作されたもの）による分離など、さらに実施された様々な精製方法を付加できる。

【0050】

本発明は、鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含む免疫増強用食品組成物に関する。

【0051】

前記「食品組成物」は、有効成分として鹿茸酵素分解抽出物の他に、食品製造に通常使用される食品の基準及び規格（「食品公典」）に記載された食品に使用可能な食品原料、食品添加物公典に記載された食品添加物も含む。

【0052】

特に限定する必要はないが、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。前記炭水化物は、単糖類、例えばブドウ糖、果糖など；二糖類、例えばマルトース、砂糖、乳糖など；オリゴ糖又はポリサッカライド、例えばデキストリン、水飴、シクロデキストリンなど；糖アルコール、例えばキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどを使用することができる。前記香味剤は、天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど］）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使用することができる。

【0053】

前記鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として食品組成物を製造する場合に、鹿茸酵素分解抽出物は、免疫増強効能を示す含有量であれば特に限定する必要はないが、例えば、０．１～９９重量％、０．５～９５重量％、１～９０重量％、２～８０重量％、３～７０重量％、４～６０重量％、５～５０重量％で含まれてよい。

【0054】

前記食品組成物において有効成分である鹿茸酵素分解抽出物は、摂取者の状態、体重、疾病の有無や程度及び期間によって異なるが、通常の技術者によって適切に選択されてよい。例えば、１日投与量を基準に１～５，０００ｍｇ、好ましくは５～２，０００ｍｇ、さらに好ましくは１０～１，０００ｍｇ、特に好ましくは２０～８００ｍｇ、最も好ましくは５０～５００ｍｇであってよく、投与回数は、特に限定する必要はないが、１日に３回～１週に１回の範囲内で通常の技術者が調節できる。健康及び衛生を目的としたり又は健康調節を目的とする長期間の摂取では前記範囲以下であってよい。

【0055】

前記食品組成物は、特に限定する必要はないが、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、エキス剤、ジェリー剤、ティーバッグ剤又は飲料剤であってよい。

【0056】

また、一般食品に免疫増強機能性を付与するために前記鹿茸酵素分解抽出物を添加してもよく、添加が可能な食品は、特に限定する必要はないが、例えば、食品衛生法第７条による食品の基準及び規格（「食品公典」）に例示された菓子類、パン又は餅類、ココア加工品類又はチョコレート類、食肉又は卵加工品、魚肉加工品、豆腐類又は寒天類、麺類、茶類、コーヒー、飲料類、特殊用途食品、醤油類、調味食品、ドレッシング類、キムチ類、塩辛類、塩漬け食品、煮物食品、酒類、干し物類、その他食品類などに添加されてよい。また、畜産物衛生管理法第４条による畜産物の加工基準及び成分規格（「畜産物公典」）に例示された乳加工品、食肉加工品及び包装肉、卵加工品に添加されてよい。

【0057】

一方、前記鹿茸酵素分解抽出物は、ＮＫ細胞活性に富み、免疫関連サイトカイン発現を増進させるので、前記鹿茸酵素分解抽出物を有効成分とする食品組成物は単独で「免疫増強を助ける健康機能食品」として利用可能である。

【0058】

前記「健康機能食品」は、人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用して法的基準によって製造（加工を含む）した食品（健康機能食品に関する法律第３条第１号）のことを指す。前記「健康機能食品」は、国別に用語や範囲が異なり得るが、米国の「食餌補充剤（Ｄｉｅｔａｒｙ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）」、ヨーロッパの「食品補充剤（Ｆｏｏｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｎｅｔ）」、日本の「保健機能食品」又は「特定保健用食品（Ｆｏｏｄ ｆｏｒ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｕｓｅ，ＦｏＳＨＵ）」、中国の「保健食品」などに該当し得る。

【0059】

前記食品組成物又は健康機能食品は、食品添加物をさらに含んでよく、食品添加物としての適否は、他の規定がない限り、「食品添加物公典」の総則及び一般試験法などによって当該品目に関する規格及び基準にしたがう。

【0060】

また、前記健康機能食品には、前記鹿茸酵素分解抽出物と共に「免疫増強を助ける健康機能食品」に使用される「機能性原料」として告示された原料又は個別認定された原料としてＬ－グルタミン、ゲルマニウム酵母、クムサメシマコブ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ加熱処理乾燥粉末、トウキ混合抽出物、冬虫夏草酒精抽出物、スピルリナ、クロレラ、清麹醤菌培養生成物（ポリガンマグルタミン酸カリウム）、椎茸菌糸体、酵母ベータグルカン、人参多糖体抽出物などの免疫増強に関連した健康機能食品素材を複合して使用することができる。

【0061】

本発明は、鹿茸酵素分解抽出物を有効成分として含む免疫増強用薬学組成物に関する。

【0062】

前記「薬学組成物」は、有効成分として、ＮＫ細胞活性に富み、免疫関連サイトカイン発現を増進させる鹿茸酵素分解抽出物の他に、薬学組成物などの製造に通常使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤もさらに含んでよい。

【0063】

前記「免疫増強用薬学組成物」は、免疫抗癌剤又は抗癌補助剤であってよい。前記免疫抗癌剤は、免疫因子の発現を誘導して免疫細胞の活性を増加させ、癌細胞を死滅させるものであり、前記癌細胞は固形癌の癌細胞であってよく、より詳細には、前記固形癌は、大腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、上皮性卵巣癌、脳癌、皮膚癌及び肝癌からなる群から選ばれてよいが、これに限定されない。前記抗癌補助剤は、抗癌剤投与による副作用を緩和させることができ、前記抗癌剤投与による副作用は、体重又は免疫因子の減少及び悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）からなる群から選ばれてよい。

【0064】

前記「免疫増強用薬学組成物」は、抗ウイルス用ワクチンの効能を増幅させる免疫増強剤であってよい。前記免疫増強剤は、抗ウイルス用ワクチンと併用して又は順次に投与されてよい。

【0065】

前記抗ウイルス用ワクチンは、インフルエンザー、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペス単純ウイルス（２型）、小児痲痺、ジフテリア、百日咳、ヘモフィルスＢ型インフルエンザー（Ｈｉｂ）、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、腸チフス熱、水疱瘡（チキンポックス）、デング熱、エプスタイン－パールウイルス感染、人乳頭腫ウイルス感染、肺炎球菌感染、髄膜球菌感染、肺炎レンサ球菌感染、ウイルス髄膜炎、ロタウイルス感染、ダニ媒介脳炎、旅行中下痢、コレラ、黄熱病又は結核の予防のためのヒト用ワクチンであってよい。

【0066】

前記「担体」は、細胞又は組織内への化合物の付加を容易にする化合物である。前記「希釈剤」は、対象化合物の生物学的活性形態を安定化させるだけでなく、化合物を溶解させる水に希釈される化合物である。

【0067】

前記担体、賦形剤及び希釈剤には、特に限定する必要はないが、例えば、乳糖、ブドウ糖、砂糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などを挙げることができる。

【0068】

前記薬学組成物の使用量は、患者の年齢、性別、体重によって変わってよく、特に、治療対象個体の状態、治療対象疾患の特定のカテゴリー又は種類、投与経路、使用される治療剤の属性に依存するであろう。

【0069】

前記薬学組成物は、体内で活性成分の吸収度、排泄速度、患者又は治療対象動物の年齢及び体重、性別及び状態、治療する疾病の重症程度などによって適切に選択されるが、一般に、１日に０．１～１，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１～５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは５～２５０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１０～１００ｍｇ／ｋｇで投与されてよい。このように剤形化された単位投与型製剤は、必要によって一定の時間間隔で数回投与されてよい。

【0070】

前記薬学組成物は、個別的に予防剤又は治療剤として投与してもよく、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与されてよい。

【0071】

前記薬学組成物はそれぞれ、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口剤形、そして滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などの非経口剤形に剤形化して使用されてよい。

【0072】

剤形化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製されてよい。

【0073】

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記鹿茸酵素分解抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、砂糖又は乳糖、ゼラチンなどを混ぜて調製できる。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用されてよい。経口のための液状製剤には、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、しばしば使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてよい。

【0074】

非経口投与のための製剤には非水性溶剤、懸濁溶剤にはプロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてよい。

【0075】

以下、好ましい実施例を挙げて発明をより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、これによって本発明の範囲が限定されないということは、当業界における通常の知識を有する者に明らかであろう。

【0076】

製造例１：鹿茸粉末の製造
血液を含む冷凍鹿茸（ニュージーランド産）を洗浄した後、適切な大きさに粉砕して凍結乾燥させた後、それを再び粉砕して１２３℃で７分熱処理し、凍結乾燥鹿茸粉末を製造した。

【0077】

製造例２：鹿茸酵素分解抽出物の製造
製造例１の鹿茸粉末１０ｇを取って水１９９ｍＬを混合した。その混合物を、各酵素による必要温度、例えば、それぞれ、アルカラーゼは６０℃、フラボザイム、ニュートラーゼ及びプロタメックスは５０℃水浴で１００ｒｐｍで撹拌した。それぞれの酵素溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを、１：１００の酵素：基質の比率にして添加し、２３時間まで温度を保ちながら撹拌して酵素処理した。９５℃水浴上で８５℃以上保ちながら２０分保持して酵素を不活性化させた後、冷却した酵素分解物を２５℃で遠心分離した。上澄液を水で２００ｍＬ定容し、真空下でＣｅｌｉｔｅ５４５を用いて濾過後に殺菌及び乾燥させて粉末化した。粉末は、生理活性分析のために－２０℃に保管し、それらの試料をそれぞれ１Ｆ、２Ｆ、３Ｆ及び５Ｆとした。

【0078】

ペプシンの場合、製造例１の鹿茸粉末１０ｇを取ってｐＨ２の薄い塩酸１９９ｍＬを混合した。その混合物を５０℃水浴で１００ｒｐｍで撹拌した。ペプシン酵素溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを、１：１００の酵素：基質の比率にして添加し、２３時間まで温度を保ちながら撹拌して酵素処理した。６Ｍ水酸化ナトリウム８ｍＬを入れ、ｐＨ５．５～６に調整して分解を中断させ、９５℃水浴上で８５℃以上保ちながら２０分保持して酵素を不活性化させた後、冷却した酵素分解物を２５℃で遠心分離した。上澄液を水で２００ｍＬ定容し、真空下でＣｅｌｉｔｅ５４５を用いて濾過後に殺菌及び乾燥させて粉末化した。粉末は、生理活性分析のために－２０℃に保管し、この試料を４Ｆとした。

【0079】

製造例３：対照群の製造
鹿茸酵素分解抽出物の対照群として、鹿茸超臨界抽出物、鹿茸熱水抽出物及びＶＡＲＮＺ ＲｅｐａｉＲｘをそれぞれ、Ｃ１、Ｃ２及びＣ３とした。

【0080】

鹿茸超臨界抽出物（Ｃ１）は、製造例１の鹿茸粉末を、溶媒として二酸化炭素及びエタノール、抽出圧力３００ｂａｒ、抽出温度４０℃、分離圧力５４ｂａｒ、分離温度４０℃、供給重量４９．７ｇ、平均二酸化炭素流速７．９ｇ／ｍｉｎ、平均エタノール流速２．０ｇ／ｍｉｎ、二酸化炭素供給比率２２：１及びエタノール供給比率３：１の条件で抽出しながら毎１５分ごとに回収して真空減圧乾燥させて製造した。

【0081】

鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）は、製造例１の鹿茸粉末１０ｇを水２００ｍＬと混ぜて丸底フラスコに入れ、熱水で３時間熱水抽出した後、氷で冷却して２５℃で３０分間２５，０００ｇで遠心分離した。上澄液を水で２００ｍＬ定容し、真空下でＣｅｌｉｔｅ５４５を用いて濾過した後に乾燥させた粉末を、活性分析のために－２０℃に保管した。

【0082】

ＶＡＲＮＺ ＲｅｐａｉＲｘは、米国特許第０７５４７７６１号によって製造されたものであり、１／２５に希釈したものをＣ３試料として用いた。

【0083】

実験例１：鹿茸酵素分解抽出物の収率
製造例２で製造された１Ｆ～５Ｆの鹿茸酵素分解抽出物及び対照群Ｃ２の濃度を測定し、それらから計算した収率を表１に示した。

【0084】

【表1】

１Ｆから５Ｆまでの酵素処理した全ての鹿茸酵素分解抽出物は、鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）に比べて高い収率を示した。鹿茸酵素分解抽出物の中でもフラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）、ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）及びプロタメックスを用いた鹿茸酵素分解抽出物（５Ｆ）は、鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）はもとより、他の酵素アルカラーゼ（１Ｆ）及びペプシン（４Ｆ）で処理した鹿茸酵素分解抽出物に比べても約２～３倍高い収率を示した。

【0085】

実験例２：鹿茸酵素分解抽出物の抗原刺激白血球免疫活性増進効果
白血球は、１２人の支援者（ＮＺ Ｂｌｏｏｄ，Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）から供給された血液サンプルを用いて分離した。赤血球溶解試薬（ＴＡＣバッファー：８５ｍＭ Ｔｒｉｓ、７８ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）は、３７℃に予熱して使用した。各全血５ｍＬにＴＡＣバッファー４５ｍＬを添加し、３７℃水浴（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）に１０分間静置する。５００ｘｇで１０分間遠心分離後に上澄液を除去し、ＰＢＳ（０．１Ｍ ＥＤＴＡ）２５ｍＬで均一に浮遊させた。同一の方法で遠心分離した後に上澄液を除去し、ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，５％のＦＣＳ添加）５ｍＬで浮遊させた。当該実験に使用された白血球細胞の数は、１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。

【0086】

９６ウェルプレートに、５０μｌの分離した白血球を分注した後、それぞれ、２５μｌのＲＰＭＩ／ＦＣＳ（ｃｏｎｔｒｏｌ）又は製造例２の鹿茸酵素分解抽出物及び対照群をそれぞれ１／１００に希釈して添加し、３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーターに３時間静置した。２５μｌのスティミュレーター（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）を添加し、３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーターに２時間静置した。スティミュレーターはそれぞれ、ＳＥＢ（２００ｎｇ／ｍＬブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＷＭ（２μｇ／ｍＬヤマゴボウマイトジェン（ｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）（４ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）である。細胞溶解液（Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）は、プレートを３５０ｘｇで遠心分離した後に上澄液を除去し、１０μｌ／ｗｅｌｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴで浮遊させて使用した。

【0087】

抗原刺激白血球免疫活性増進効果は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇを用いて免疫関連サイトカイン発現を分析法を用いて図１に示した。図１で、アップレギュレーション（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されるほど赤色、ダウンレギュレーション（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されるほど青色で表示した。図１で、赤色及び青色はＰ＜０．０５であり、橙色及び空色はＰ＜０．１を表す。

【0088】

酵素種類による鹿茸酵素分解抽出物の免疫関連遺伝子増進効果について説明すると、アルカラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（１Ｆ）は、鹿茸粉末の製造方法に関係なく遺伝子増進効果を示さなかった。

【0089】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物のうち、凍結乾燥鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）は、１ＦＮＢ１、１Ｌ１２Ｂ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ２、ＩＬ４及びＩＬ９の総６種の遺伝子の発現を増加させた。

【0090】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物のうち、凍結乾燥鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）は、ＩＦＮＢ１、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ２及びＩＬ９の総６種の遺伝子発現を増加させた。

【0091】

ペプシンを用いた鹿茸酵素分解抽出物のうち、凍結乾燥鹿茸酵素分解抽出物（４Ｆ）は、いかなる遺伝子発現も増加させなかった。

【0092】

プロタメックスを用いた鹿茸酵素分解抽出物のうち、凍結乾燥鹿茸酵素分解抽出物（５Ｆ）は、いかなる遺伝子発現も増加させなかった。

【0093】

対照群Ｃ１、Ｃ２及びＣ３は、免疫関連のいかなる遺伝子発現も増進させなく、Ｃ３は、ＰＴＧＳ２遺伝子発現のみを増進させた。

【0094】

鹿茸酵素分解抽出物の免疫関連サイトカイン発現増進活性は、フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）及びニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）において高い活性を示し、他の酵素で処理したり或いは酵素処理しなかった場合は、免疫関連サイトカイン発現増進活性が非常に低かった。

【0095】

以降の実験には、フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）、ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）、ペプシンを用いた鹿茸酵素分解抽出物（４Ｆ）、プロタメックスを用いた鹿茸酵素分解抽出物（５Ｆ）及び鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）を用いて実施した。

【0096】

実験例３：鹿茸酵素分解抽出物の大食細胞の酸化窒素生成効果
マウス由来大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞株を、ＤＭＥＭ（Ｃａｔ Ｎｏ．１１９９５－０６５，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、ＦＢＳ（Ｌｏｔ Ｎｏ．ＡＥ２９１５５３０６，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）及びＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ １００ｘ（Ｂａｔｃｈ Ｎｏ．ＡＤＤ６７００７６，Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｒａｎｃｅ）をそれぞれ、４４５ｍＬ、５０ｍＬ及び５ｍＬ混合した培地で３７℃、５％ＣＯ_２条件のＣＯ_２インキュベーター（ＭＣＯ－２０ＡＩＣ，Ｓａｎｙｏ，Ｊａｐａｎ）で培養し、使用前まで２～３日の間隔で継代培養して使用した。

【0097】

鹿茸酵素分解抽出物の大食細胞酸化窒素（ＮＯ）生成効果を確認する前に、試料の細胞毒性を確認するためにＭＴＴ分析を行った。活性化されたＲＡＷ ２６４．７細胞株を３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートにそれぞれ分注し、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した。鹿茸酵素分解抽出物試料を、０．００１～１００ｍｇ／ｍＬで濃度別に調製した培地に交換し、２４時間培養後にｃｃｋ－８（Ｃａｔ Ｎｏ．ＣＫ０４－１３，Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｊａｐａｎ）１０μｌを添加して３７℃、ＣＯ_２インキュベーターで１時間追加培養し、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ波長で吸光度を測定し、正常対照群の細胞生存率に対する各試料の濃度別細胞生存率を求めた。

【0098】

鹿茸酵素分解抽出物試料２Ｆ、３Ｆ、５Ｆ及びＣ２はそれぞれ、０．５、２．５、６及び５０ｍｇ／ｍＬ以下では細胞毒性を示さなかった。

【0099】

酸化窒素生成効果は、ＲＡＷ ２６４．７細胞株を６ウェルプレートに５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注し、２４時間培養した。培養培地を除去し、陽性対照群及び濃度別に製造した試料含有培地に交換した後、２４時間追加培養した。細胞培養液を回収して１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、新しいチューブに上澄液を移した後、ＮＯ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＤＩ－９１７－０２０，Ｅｎｚｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ）のプロトコールによって試験を実施し、ＮＯ生成量は、５４０ｎｍ波長で測定された吸光度の値を標準曲線の４－Ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎを用いて定量して図２に示した。

【0100】

試験物質を処理していない正常対照群（Ｎ）は、１４．８９μｍｏｌｅ／Ｌの酸化窒素を生成した。陽性対照群（ＬＰＳ１μｇ／ｍＬ）は、４７．７４μｍｏｌｅ／Ｌの酸化窒素を生成し、正常対照群と比較して有意に増加した（ｐ＜０．０１）。

【0101】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群（１００、５００μｇ／ｍＬ）の酸化窒素生成量はそれぞれ２５．７３、３９．６５μｍｏｌｅ／Ｌの値と濃度によって増加し、正常対照群と比較して有意に増加した（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）。

【0102】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）処理群（５００、１０００μｇ／ｍＬ）の酸化窒素生成量はそれぞれ３０．４２、２９．３９μｍｏｌｅ／Ｌの値であり、正常対照群と比較して有意に増加したが（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０１）、５００μｇ／ｍＬの同一濃度で処理したフラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群に比べて増加幅は約２３．３％低い値を示した。

【0103】

プロタメックスを用いた鹿茸酵素分解抽出物（５Ｆ）及び鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）処理群では、正常対照群と比較して大きな差を示さなかった。

【0104】

大食細胞での酸化窒素生成量は、哺乳類免疫系において外部物質に対して防御作用をする大食細胞の活性化の有無が分かる指標であり、フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）が酸化窒素生成量において最も優れており、その次は、ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）であることが確認できた。

【0105】

実験例４：鹿茸酵素分解抽出物のｉＮＯＳ及びＣＯＸ２遺伝子発現増大効果
ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２遺伝子発現量を測定するために、ＲＡＷ ２６４．７細胞株を６ウェルプレートに５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注し、２４時間培養した。培養培地を除去し、陽性対照群及び濃度別に製造した試料含有培地に交換した後、２４時間追加培養した。細胞を回収してＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔ ｋｉｔ（Ｃａｔ Ｎｏ．７４１０６，Ｑｕｉｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のプロトコールによって全ＲＮＡを抽出した。抽出された全ＲＮＡは、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ（ＴＥＣＡＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ波長で吸光度を測定して定量後に、濃度に合わせて希釈した。ＴＯＰｒｅａｌ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｋｉｔ（Ｃａｔ Ｎｏ．ＲＴ４３２Ｍ，ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）を用いてｉＮＯＳ及びＣＯＸ２の遺伝子発現量測定を行い、全ての反応はβ－ａｃｔｉｎで補正し、正常対照群を基準に２－^ΔΔＣＴ方法で正規化し、ｉＮＯＳの相対発現量は図３に、ＣＯＸ２の相対発現量は図４にそれぞれ示した。

【0106】

図３で、陽性対照群（ＬＰＳ，１μｇ／ｍＬ）のｉＮＯＳ発現量は６７．３７倍に増加し、正常対照群と比較して統計学的に有意に増加した（ｐ＜０．０５）。

【0107】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群（１００、５００μｇ／ｍＬ）のｉＮＯＳ発現量は、正常対照群と比較してそれぞれ２１．５５、３０．４５倍と濃度によって有意に増加した（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）。

【0108】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）処理群（５００μｇ／ｍＬ）のｉＮＯＳ発現量は、正常対照群と比較して２１．７４倍に増加したが（ｐ＜０．０１）、５００μｇ／ｍＬの同一濃度で処理したフラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群に比べて増加幅は約２８．４％低い値を示した。

【0109】

鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）処理群（５００μｇ／ｍＬ）のｉＮＯＳ発現量は、正常対照群と比較して１．９３倍に増加したが、フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）及びニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）に比べては顕著に低い値を示した。

【0110】

一方、図４で、陽性対照群（ＬＰＳ，１μｇ／ｍＬ）のＣＯＸ２発現量は、２６４．５４倍に増加し、正常対照群と比較して統計学的に有意に増加した（ｐ＜０．０５）。

【0111】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群（１００，５００μｇ／ｍＬ）のＣＯＸ２発現量は、正常対照群と比較してそれぞれ７．８２、１７．４９倍と、濃度によって有意に増加した（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０１）。

【0112】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）処理群（５００μｇ／ｍＬ）のＣＯＸ２発現量は、正常対照群と比較して８．８６倍に増加したが（ｐ＜０．０１）、５００μｇ／ｍＬの同一濃度で処理したフラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群に比べて増加幅は約４９．３％低い値を示した。

【0113】

鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）処理群（５００μｇ／ｍＬ）のＣＯＸ２発現量は、正常対照群と比較して０．９８倍であり、差がなかった。

【0114】

ｉＮＯＳは、活性化された大食細胞においてＬ－アルギニンによってＮＯを生成する作用に関与する遺伝子で、ＣＯＸ２は、ＮＯ生成及び他のサイトカインによって増加する遺伝子であって、両遺伝子ともフラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）において発現量が最も顕著に増加し、その次は、ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）において増加したことが確認できた。

【0115】

実験例５：鹿茸酵素分解抽出物の免疫関連サイトカイン増大効果
実験例４と同じ方法でＴＯＰｒｅａｌ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｋｉｔを用いて免疫関連サイトカインＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６及びＩＬ－１β相対発現量を測定し、それぞれ、図５、図６、図７及び図８に示した。

【0116】

図５で、陽性対照群（ＬＰＳ１μｇ／ｍＬ）のＴＮＦ－α発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較して統計学的に有意に増加した（ｐ＜０．０１）。

【0117】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群（１００，５００μｇ／ｍＬ）のＴＮＦ－α発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較してそれぞれ３．１７及び３．５８倍と、濃度によって有意に増加した（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０１）。

【0118】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）処理群（５００，１０００μｇ／ｍＬ）のＴＮＦ－α発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較してそれぞれ３．２及び３．３８倍と、濃度によって有意に増加した（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０１）。

【0119】

ペプシンを用いた鹿茸酵素分解抽出物（４Ｆ）処理群（１００、５００、２０００μｇ／ｍＬ）、プロタメックスを用いた鹿茸酵素分解抽出物（５Ｆ）処理群（１００、５００、２０００μｇ／ｍＬ）及び鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）処理群（１００，５００μｇ／ｍＬ）は、全ての処理濃度においてＴＮＦ－α発現量が正常対照群と比較して差がなかった。

【0120】

また、図６で、陽性対照群（ＬＰＳ１μｇ／ｍＬ）のＩＦＮ－γ発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較して統計学的に有意に減少した（ｐ＜０．０５）。

【0121】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群（１００，５００μｇ／ｍＬ）のＩＦＮ－γ発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較してそれぞれ０．４４及び０．５９倍と、統計的に有意に減少した（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０５）。

【0122】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）処理群（５００μｇ／ｍＬ）のＩＦＮ－γ発現量も、正常対照群（Ｎ）と比較して０．５４倍と有意に減少した（ｐ＜０．０５）。

【0123】

しかし、鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）処理群（５００μｇ／ｍＬ）は、ＩＦＮ－γ発現量が正常対照群（Ｎ）と比較して差がなかった。

【0124】

また、図７で、陽性対照群（ＬＰＳ１μｇ／ｍＬ）のＩＬ－６発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較して統計学的に有意に増加した（ｐ＜０．０５）。

【0125】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群（１００、５００μｇ／ｍＬ）のＩＬ－６発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較してそれぞれ２．０及び２．９７倍と濃度によって増加したし、５００μｇ／ｍＬ処理濃度において統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０１）。

【0126】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）処理群（５００，１０００μｇ／ｍＬ）のＩＬ－６発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較してそれぞれ１．８５及び１．８３倍と濃度によって有意に増加した（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０５）。

【0127】

ペプシンを用いた鹿茸酵素分解抽出物（４Ｆ）処理群（１００、５００、２０００μｇ／ｍＬ）、プロタメックスを用いた鹿茸酵素分解抽出物（５Ｆ）処理群（１００、５００、２０００μｇ／ｍＬ）及び鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）処理群（１００、５００μｇ／ｍＬ）は、全ての処理濃度においてＩＬ－６発現量が正常対照群（Ｎ）と比較して差がなかった。

【0128】

また、図８で、陽性対照群（ＬＰＳ１μｇ／ｍＬ）のＩＬ－１β発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較して統計学的に有意に増加した（ｐ＜０．０５）。

【0129】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群（１００，５００μｇ／ｍＬ）のＩＬ－１β発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較してそれぞれ３．１８及び６．９倍と濃度によって増加したし、５００μｇ／ｍＬ処理濃度において統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０１）。

【0130】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）処理群（５００μｇ／ｍＬ）のＩＬ－１β発現量は、正常対照群（Ｎ）と比較して２．８２倍と有意に増加したが（ｐ＜０．０５）、５００μｇ／ｍＬの同一濃度で処理したフラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群に比べて増加幅は約５９．１％低い値を示した。

【0131】

鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）処理群（５００μｇ／ｍＬ）は、全ての処理濃度においてＩＬ－１β発現量が正常対照群（Ｎ）と比較して差がなかった。

【0132】

実験例６：鹿茸酵素分解抽出物の大食細胞増殖能
活性化されたＲＡＷ２６４．７細胞株を５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートにそれぞれ分注し、２４時間３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターで培養した。陽性対照群及び濃度別に調製した鹿茸酵素分解抽出物を含む培地に交換し、２４時間培養後にｃｃｋ－８（Ｃａｔ Ｎｏ．ＣＫ０４－１３，Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｊａｐａｎ）１０μｌを添加して３７℃、ＣＯ_２インキュベーターで１時間追加培養し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ（ＴＥＣＡＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて４５０ｎｍ波長で吸光度を測定し、正常対照群の細胞増殖率対比の各濃度別細胞増殖率を求めて図９に示した。

【0133】

細胞増殖能は、試験物質投与前（０ｈ）を基準に試験物質処理後の時間帯別に細胞増殖率を計算し、統計処理は、それぞれの時点別の正常対照群を基準に算出した。

【0134】

正常対照群は、２４、４８及び７２時間においてそれぞれ２．３５、６．０９及び１４．５２倍に細胞が増殖し、陽性対照群（ＬＰＳ，１μｇ／ｍＬ）は、２４、４８及び７２時間においてそれぞれ２．８、１１．３及び１７．７倍に細胞増殖が増加し、特に、２４時間と４８時間の時点において正常対照群と比較して統計学的に有意な差を示した（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）。

【0135】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）処理群（１００、５００μｇ／ｍＬ）は、試験物質処理４８時間においてそれぞれ１０．６、１１．０倍と、正常対照群の４８時間の細胞増殖率と比較して増加したし、統計学的に有意な差を示した（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１）。７２時間ではそれぞれ２１．６８、２０．７１倍であり、正常対照群の７２時間に比べて細胞増殖が増加した。

【0136】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）処理群（５００μｇ／ｍＬ）は、４８、７２時間においてそれぞれ１１．２及び２２．４倍であり、正常対照群と比較して統計学的に有意に増加した（ｐ＜０．０１）。

【0137】

鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）処理群（５００μｇ／ｍＬ）は、全ての測定時点で２．１８、６．３４及び１５．９０倍であり、正常対照群と差がなかった。

【0138】

実験例７：免疫抑制動物モデルにおいて鹿茸酵素分解抽出物投与による免疫力改善効果
免疫力低下動物モデルにおいてＮＫ細胞活性、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）濃度及びＴＮＦ－α濃度を測定し、鹿茸酵素分解抽出物が免疫力改善に及ぼす影響を評価した。

【0139】

Ｂａｌｂ／ｃマウスを６匹ずつ９グループ、すなわち、正常対照群（Ｇ１）、陰性対照群（Ｇ２）及び試験物質投与群（Ｇ３～Ｇ９）に分け、フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）を５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ投与群（それぞれ、Ｇ３、Ｇ４及びＧ５）、ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ投与群（それぞれ、Ｇ６及びＧ７）、鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ投与群（それぞれ、Ｇ８及びＧ９）に設定して試験物質を投与した。正常対照群を除く陰性対照群（Ｇ２）及び試験物質投与群（Ｇ３～Ｇ９）は、免疫抑制を誘導するために、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ＣＰ）を７０ｍｇ／ｋｇの容量で試験物質投与前３日間、そして試験物質投与１３日目に腹腔投与した。試験物質は１４日間に１日１回経口投与し、正常対照群（Ｇ１）及び陰性対照群（Ｇ２）は、試験物質の代わりに賦形剤を経口投与した。全ての試験群は、一般症状を毎日観察し且つ週に２回体重を測定した。

【0140】

体重は、正常対照群（Ｇ１）に比べて陰性対照群（Ｇ２）において減少したが、試験物質投与群（Ｇ３～Ｇ９）の体重変化は陰性対照群（Ｇ２）と統計的に差がなかった。

【0141】

１．ＮＫ細胞活性増進効果
試験物質投与１４日後に、剖検を実施して脾臓を摘出した後、脾臓細胞を分離してＮＫ細胞活性を測定した。

【0142】

ＮＫ細胞活性は、商用化されたＬＤＨ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．：０４７４４９２６００１，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を用いて行った。効果器細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）としては分離された脾臓細胞を使用し、標的細胞（ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）は、マウスリンフォーマ（ｍｏｕｓｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ）細胞株であるＹＡＣ－１細胞を使用した。効果器細胞（１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と標的細胞（１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を５０：１の割合で混ぜて４時間培養した。効果器細胞によって標的細胞が攻撃されて放出するＬＤＨの量を測定し、図１０に示した。

【0143】

ＮＫ細胞は、先天性免疫において重要な役割を担うものと知られており、微生物によって感染された細胞や癌細胞を直接殺害し、サイトカインを分泌することで、単核球及び樹状細胞を活性化させる役割を担う。

【0144】

図１０によれば、ＮＫ細胞活性が正常対照群（Ｇ１）では１６．５％だったが、陰性対照群（Ｇ２）では２．３％であり、正常対照群と比較して統計的に有意に減少した（ｐ＜０．０１）。

【0145】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）を５０、１００及び２００ｍｇ／ｋｇで投与したＧ３、Ｇ４及びＧ５群は、ＮＫ細胞活性がそれぞれ２３．１、２６．４及び２３．７％の値であり、陰性対照群（Ｇ２）と比較して統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０１）。また、同一濃度の鹿茸熱水抽出物（Ｇ８、Ｇ９）と比較しても統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０１）。

【0146】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）を１００及び２００ｍｇ／ｋｇで投与したＧ６及びＧ７は、ＮＫ細胞活性がそれぞれ１９．３及び１７．９％の値であり、陰性対照群（Ｇ１）と比較して統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０１）。しかし、同一濃度のフラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）と比較してはＮＫ細胞活性が低かったし、また、同一濃度の鹿茸熱水抽出物（Ｇ８及びＧ９）と比較しても統計的に有意な差を示さなかった。

【0147】

鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）を１００及び２００ｍｇ／ｋｇで投与したＧ８及びＧ９は、ＮＫ細胞活性がそれぞれ１３．８及び１１．６％の値であり、陰性対照群と比較して統計的に有意に増加したが、同一濃度のフラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）及びニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）に比べては低い値を示した。

【0148】

２．血液内免疫サイトカイン分析
Ｔｈ１細胞によって分泌される代表的なサイトカインはＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γであり、大食細胞の活性を増加させて貪食作用を刺激するサイトカインとして知られている。前記剖検時に採取した血液は、常温で１５～３０分間放置後に遠心分離して血清を分離した後、ＴＮＦ－α（Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＭＴＡ００Ｂ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＩＦＮ－γ（Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＭＩＦ００，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）ＥＬＩＳＡキットを用いてメーカーのマニュアルにしたがってＩＦＮ－γ濃度を測定し、それぞれ図１１及び図１２に示した。

【0149】

図１１で、正常対照群（Ｇ１）の血液内ＴＮＦ－α濃度は９．７ｐｇ／ｍＬで、陰性対照群（Ｇ２）の値は１２．２ｐｇ／ｍＬであり、免疫抑制が誘導された陰性対照群（Ｇ２）において正常対照群（Ｇ１）と比較して統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０１）。

【0150】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）を５０、１００及び２００ｍｇ／ｋｇで投与したＧ３、Ｇ４及びＧ５は、ＴＮＦ－α濃度がそれぞれ１０．１、１０．３及び１０．０ｐｇ／ｍＬの値であり、低濃度、中濃度及び高濃度の投与群において投与濃度に関係なく陰性対照群（Ｇ１）と比較して有意に減少した（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０５）。

【0151】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）を１００及び２００ｍｇ／ｋｇで投与したＧ６及びＧ７は、ＴＮＦ－α濃度がそれぞれ１０．６及び１０．３ｐｇ／ｍＬの値であり、中濃度では陰性対照群（Ｇ２）と有意な差がなく、高濃度でのみ陰性対照群（Ｇ２）に比べて有意に減少した（ｐ＜０．０５）。

【0152】

したがって、フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）は、５０ｍｇ／ｋｇ低濃度投与群においてＴＮＦ－α濃度が陰性対照群（Ｇ２）に比べて有意に減少したのに対し、ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）は、２００ｍｇ／ｋｇ高濃度投与群においてＴＮＦ－α濃度が陰性対照群（Ｇ２）に比べて有意に減少することが確認できた。

【0153】

また、鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）を１００及び２００ｍｇ／ｋｇで投与したＧ８及びＧ９は、陰性対照群（Ｇ１）と比較してＴＮＦ－α濃度に有意な差がなかった。

【0154】

図１２で、正常対照群（Ｇ１）の血液内ＩＦＮ－γ濃度は１２．７ｐｇ／ｍＬで、陰性対照群（Ｇ２）の値は１０．２ｐｇ／ｍＬであり、免疫抑制が誘導された陰性対照群（Ｇ２）において正常対照群（Ｇ１）と比較して統計的に有意に減少した（ｐ＜０．０１）。

【0155】

フラボザイムを用いた鹿茸酵素分解抽出物（２Ｆ）を５０、１００及び２００ｍｇ／ｋｇで投与したＧ３、Ｇ４及びＧ５は、ＩＦＮ－γ濃度がそれぞれ１０．８、１１．４及び１１．７ｐｇ／ｍＬの値であり、陰性対照群（Ｇ２）と比較して濃度によって増加し、特に、１００及び２００ｍｇ／ｋｇ投与したＧ４及びＧ５において統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）。また、同一濃度の鹿茸熱水抽出物（Ｇ８及びＧ９）と比較しても統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）。

【0156】

ニュートラーゼを用いた鹿茸酵素分解抽出物（３Ｆ）を１００及び２００ｍｇ／ｋｇで投与したＧ６及びＧ７、そして鹿茸熱水抽出物（Ｃ２）を１００及び２００ｍｇ／ｋｇで投与したＧ８及びＧ９は、陰性対照群（Ｇ２）と差がなかった。

【0157】

以下に、本発明の鹿茸酵素分解抽出物を含む組成物の製剤例を説明するが、これは本発明を限定するためのものではなく、単に具体的に説明するためのものである。

【0158】

製剤例１：散剤の製造
製造例２の鹿茸酵素分解抽出物粉末 ２０ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
上記の成分を混合して気密布に充填して散剤を製造する。

【0159】

製剤例２：錠剤の製造
製造例２の鹿茸酵素分解抽出物粉末 １０ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠して錠剤を製造する。

【0160】

製剤例３：カプセル剤の製造
製造例２の鹿茸酵素分解抽出物粉末 １０ｍｇ
結晶性セルロ－ス ３ｍｇ
ラクトース １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法によって上記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。

【0161】

製剤例４：顆粒剤の製造
製造例２の鹿茸酵素分解抽出物粉末 １，０００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０μｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２μｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０μｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０μｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
無機質混合物 適量
硫酸第１鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
第１リン酸カリウム １５ｍｇ
第２リン酸カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
上記のビタミン及びミネラル混合物の組成比は、健康機能食品に適合する成分を好ましい実施例として混合組成したが、その配合比を任意に変形実施しても構わなく、通常の健康機能食品製造方法によって上記の成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法によって健康機能食品組成物の製造に使用することができる。

【0162】

製剤例５：飲料剤形の製造
製造例２の鹿茸酵素分解抽出物粉末 １，０００ｍｇ
クエン酸 １，０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
梅エキス ２ｇ
タウリン １ｇ
精製水を加えて全体９００ｍＬ
通常の飲料製造方法によって上記の成分を混合した後、８５℃で約１時間撹拌加熱し、その後、作られた溶液を濾過して２Ｌ滅菌容器に取得して密封滅菌後に冷蔵保管し、本発明の機能性飲料組成物の製造に使用する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】