特表 2024-501796 膜貫通タンパク質に結合する抗体、および抗体を産生する細胞を取得する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-16

(54)【発明の名称】膜貫通タンパク質に結合する抗体、および抗体を産生する細胞を取得する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240109BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20240109BHJP

   A01K 67/027 20240101ALI20240109BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240109BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20240109BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240109BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240109BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240109BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C12N5/0781 ZNA

A01K67/027

C12N15/62 Z

C12Q1/04

C12P21/08

C07K16/28

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023536468

(86)(22)【出願日】2021-12-22

(85)【翻訳文提出日】2023-06-15

(86)【国際出願番号】 US2021064769

(87)【国際公開番号】W WO2022140494

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】63/130,044

(32)【優先日】2020-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 一志

(72)【発明者】

【氏名】チェン、 ガン

(72)【発明者】

【氏名】シ、 エルガン

(72)【発明者】

【氏名】リー、 ウェン－イ

(72)【発明者】

【氏名】スー、 デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】ファール、 グレン

(72)【発明者】

【氏名】バブ、 ロバート

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QR48

4B063QS33

4B063QX01

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4H045AA11

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する細胞を取得する方法、かかる細胞から抗体を生成する方法、膜貫通タンパク質およびその断片に対する抗体、ならびに抗体をコードする核酸が開示される。より詳細には、本開示は、脂質二重層膜足場タンパク質複合体の使用に基づいて膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞を取得して、膜貫通タンパク質抗原を細胞に提示する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞を取得する方法であって、
（ａ）抗体産生細胞の集団を、前記目的の膜貫通タンパク質を含む脂質二重層膜足場タンパク質複合体と接触させて、前記細胞表面上で前記目的の膜貫通タンパク質が抗体に結合することを可能にすることと、
（ｂ）前記目的の膜貫通タンパク質に結合された細胞を収集することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記複合体が、少なくとも一つの膜足場タンパク質によって囲まれた円板状のリン脂質二重層を形成する複数の脂質を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記抗体産生細胞の集団が、脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、またはそれらの組み合わせから取得される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記抗体産生細胞の集団が、末梢血細胞、Ｂ細胞、形質細胞、形質細胞性骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記抗体産生細胞の集団が、Ｂ細胞を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記抗体産生細胞が、前記目的の膜貫通タンパク質に以前に免疫化された哺乳動物から取得される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記哺乳動物が、前記目的の膜貫通タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸、または前記目的の膜貫通タンパク質の少なくとも一部で免疫化されている、非ヒト哺乳動物である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記非ヒト哺乳動物が遺伝子操作される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記遺伝子操作された非ヒト哺乳動物が、内因性遺伝子から前記目的の膜貫通タンパク質を発現しない、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記遺伝子操作された非ヒト哺乳動物が、ヒト重鎖可変領域をコードする核酸配列、およびヒト軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記遺伝子操作された非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記目的の膜貫通タンパク質がヒト膜貫通タンパク質である、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

前記遺伝子操作された非ヒト哺乳動物が、前記膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ、または前記膜貫通タンパク質の前記非ヒトホモログをコードする核酸で免疫化されている、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

ステップ（ｂ）で収集される前記細胞は、前記ヒト膜貫通タンパク質、および前記膜貫通タンパク質の前記非ヒトホモログに結合する抗体を発現する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記遺伝子操作された非ヒト哺乳動物が、目的のキメラ膜貫通タンパク質または前記目的のキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸で免疫化されており、前記キメラ膜貫通タンパク質が、前記目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの一部分および前記ヒト膜貫通タンパク質の一部分を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

ステップ（ｂ）で収集される前記細胞は、前記ヒト膜貫通タンパク質上に位置するエピトープに結合する抗体を発現する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記目的の膜貫通タンパク質がキメラ膜貫通タンパク質であり、前記キメラタンパク質が、非ヒト膜貫通タンパク質の一部に操作可能に結合されたヒト膜貫通タンパク質の一部を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項18】

前記遺伝子操作された非ヒト哺乳動物が、前記ヒト膜貫通タンパク質、または前記ヒト膜貫通タンパク質をコードする核酸で免疫化されている、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ステップ（ｂ）で収集される前記細胞は、前記キメラ膜貫通タンパク質の前記ヒト部分に結合する抗体を発現する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記遺伝子操作された非ヒト哺乳動物が、前記膜貫通タンパク質の切断形態で免疫化されている、請求項８に記載の方法。

【請求項21】

前記遺伝子操作された非ヒト哺乳動物が、前記膜貫通タンパク質または前記膜貫通タンパク質をコードする核酸の完全長形態で免疫化されている、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記膜貫通タンパク質の前記切断形態が、前記膜貫通タンパク質の前記完全長形態のＮ末端ドメインまたはＣ末端ドメインを含有しない、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記膜貫通タンパク質の前記切断形態が細胞外ループを含み、ステップ（ｂ）で収集される前記細胞が、前記膜貫通タンパク質の前記切断形態の前記細胞外ループ上に位置するエピトープに結合する抗体を発現する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ステップ（ａ）が、前記抗体産生細胞の集団を少なくとも一つのブロッキング剤と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記少なくとも一つのブロッキング剤が、前記目的の膜貫通タンパク質の一部に結合するポリペプチドである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記ポリペプチドが、前記目的の膜貫通タンパク質のＮ末端ドメインまたは前記目的の膜貫通タンパク質のＣ末端ドメインに結合する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記膜貫通タンパク質が細胞外ループを含み、ステップ（ｂ）で収集される前記細胞が、前記目的の膜貫通タンパク質の前記細胞外ループ上に位置するエピトープに結合する抗体を発現する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記抗体産生細胞の集団が、前記目的の膜貫通タンパク質を含む前記脂質二重層膜足場タンパク質複合体で免疫化された哺乳動物から取得され、前記複合体が、第一の検出可能な標識をさらに含み、前記目的の膜貫通タンパク質が、第二の検出可能な標識を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

前記少なくとも一つのブロッキング剤が、（ｉ）前記第一の検出可能な標識に結合する第一のブロッキング剤、および（ｉｉ）前記第二の検出可能な標識に結合する第二のブロッキング剤を含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記少なくとも一つのブロッキング剤が、前記膜足場タンパク質に結合する第三のブロッキング剤を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記目的の膜貫通タンパク質が、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）タンパク質、テトラスパニンタンパク質、およびイオンチャネルタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項32】

前記目的の膜貫通タンパク質がＧＰＣＲタンパク質である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記目的の膜貫通タンパク質がイオンチャネルタンパク質である、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記目的の膜貫通タンパク質がテトラスパニンタンパク質である、請求項３１に記載の方法。

【請求項35】

前記複合体が、検出可能な標識にコンジュゲートされる少なくとも一つの膜足場タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項36】

前記目的の膜貫通タンパク質に結合された前記細胞を収集することが、
前記目的の膜貫通タンパク質への前記細胞の結合を検出することと、
前記目的の膜貫通タンパク質に結合された前記細胞を、前記目的の膜貫通タンパク質に結合されていない細胞から分離することと、および
前記結合された細胞を収集することと、を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記検出可能な標識がビオチンである、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記検出が、
ステップ（ｂ）の前記細胞をストレプトアビジン－フィコエリスリン（ＰＥ－ストレプトアビジン）とインキュベートすることと、
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して前記結合細胞を識別することと、を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記検出可能な標識が蛍光分子である、請求項３６に記載の方法。

【請求項40】

前記検出が、ＦＡＣＳを使用して前記結合細胞を識別することを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

（ｉ）ステップ（ｂ）で収集された細胞から、前記細胞によって発現される前記抗体の前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、および前記細胞によって発現される前記抗体の前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項42】

前記方法が、ステップ（ｉ）の後、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において単離された、前記重鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド配列を含む前記核酸、および前記軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド配列を含む前記核酸を導入するように、宿主細胞をトランスフェクトすることと、ならびに
（ｉｉｉ）前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域を含む抗体を発現する条件下で、ステップ（ｉｉ）からの前記宿主細胞を培養することと、を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

ステップ（ｉｉ）の前記宿主細胞が、前記重鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド配列を含む第一の発現ベクター、および前記軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド配列を含む第二の発現ベクターでトランスフェクトされる、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法によって得られる抗体。

【請求項47】

前記抗体が、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）、テトラスパニンタンパク質およびイオンチャネルタンパク質からなる群から選択される目的の膜貫通タンパク質に結合する、請求項４６に記載の抗体。

【請求項48】

前記目的の膜貫通タンパク質がＧＰＣＲタンパク質である、請求項４７に記載の抗体。

【請求項49】

前記目的の膜貫通タンパク質がイオンチャネルタンパク質である、請求項４７に記載の抗体。

【請求項50】

前記目的の膜貫通タンパク質がテトラスパニンタンパク質である、請求項４７に記載の抗体。

【請求項51】

前記抗体が、細胞中の前記目的の膜貫通タンパク質の機能を調節する、請求項４６に記載の抗体。

【請求項52】

請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法によって作製された哺乳類宿主細胞であって、前記宿主細胞が、前記目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体またはその断片を発現する、哺乳類宿主細胞。

【請求項53】

前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項５２に記載の哺乳類宿主細胞。

【請求項54】

前記目的の膜貫通タンパク質を含む前記脂質二重層膜足場タンパク質複合体が、一つ以上の洗剤の存在下で提供される脂質、膜足場タンパク質、および前記目的の膜貫通タンパク質を混合し、前記一つ以上の洗剤を除去して、前記目的の膜貫通タンパク質を含む前記複合体の形成を誘発することによって形成される、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２３日出願の米国仮特許出願第６３／１３０，０４４号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組み込み

【0002】

２０２１年１２月７日に作製され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３６５２６＿１０４６５ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の３０ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は概して、膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する細胞、それを生成するための方法、膜貫通タンパク質およびその断片に対する抗体、および抗体をコードする核酸に関する。より詳細には、本開示は、脂質二重層膜足場タンパク質複合体の使用に基づいて膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞を取得して、膜貫通タンパク質抗原を細胞に提示する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）およびイオンチャネルなどの膜貫通タンパク質は、ＦＤＡが承認したすべての低分子医薬品のほぼ半数の標的であるが、これまでのところ、治療に承認されている抗体は非常に少ない。Ｓａｎｔｏら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．１６：１９（２０１７）を参照されたい。典型的には、抗体または抗体産生細胞のスクリーニングに利用される方法は、非効率であるか、または膜貫通タンパク質に結合する抗体を取得することができない。例えば、エクソソーム、ウイルス様粒子、およびプロテオリポソームなどの担体へのマルチスパン（ｍｕｌｔｉｓｐａｎ）膜貫通タンパク質の単離およびパッケージングは、十分な量の生物学的に活性なタンパク質または立体構造的に正確な膜貫通タンパク質が存在するかどうかに関する不確実性を残す。さらに、ＧＰＣＲ発現細胞は、試薬のスクリーニングとしてあまり成功しておらず、膜貫通の膜貫通タンパク質に由来する小さなペプチドは、立体構造のコンテキストがないため、関連する抗体を得ることにほとんど成功していない。そのため、膜貫通タンパク質に対する抗体を取得および生成するための新しい方法が必要である。

【発明の概要】

【0005】

本明細書において、脂質二重層膜足場タンパク質複合体を利用して、膜貫通タンパク質抗原を抗体に提示する膜貫通タンパク質に対する抗体を取得する方法が開示される。本方法は、目的の膜貫通タンパク質、ならびに天然細胞の膜に共通して存在する脂質および膜足場タンパク質を含む複合体を利用して、その膜貫通タンパク質を抗体への天然の立体構造に提示する。このように、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、例えば、細胞外ドメインまたはその一部など、自然界でアクセス可能な膜貫通タンパク質上のエピトープに結合する抗体（または抗体を発現する細胞）の特定のサブセットを識別し、抗体（または抗体を発現する細胞）集団から収集するために、本開示の方法に使用される。したがって、本方法は、特定の抗体が目的の膜貫通タンパク質の所望の部分を認識するかどうかを確認するために、部位特異的変異誘発およびその他の周知の技術によるエピトープ特異的抗体の時間のかかるスクリーニング、識別および選択の必要性を迂回する。

【0006】

一態様では、目的の膜貫通タンパク質またはその一部を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体に、抗体産生細胞の集団を接触させることを含む、目的の膜貫通タンパク質に対する抗体または抗体を発現する細胞集団を取得する方法が提供される。

【0007】

いくつかの実施形態では、方法は、抗体産生細胞の集団を、目的の膜貫通タンパク質またはその一部を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体に接触させて、複合体によって提示される膜貫通タンパク質抗原と、細胞の表面上の抗体との間の結合を可能にし、結合抗体産生細胞を収集することを含む。

【0008】

一部の実施形態では、抗体産生細胞集団は、一つの特定のタイプの組織、臓器、または細胞から構成された細胞の均質集団である。他の実施形態では、抗体産生細胞集団は、二つ以上のタイプの組織、臓器、または細胞から構成された細胞の不均一な集団である。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、脾臓、リンパ節、骨髄、または他の臓器の一つ以上に由来する組織由来細胞を含む。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞の集団は、リンパ球を含む。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、血液細胞を含む。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、末梢血細胞、Ｂ細胞、形質細胞、形質細胞性骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、Ｂ細胞集団である。一実施形態では、抗体産生細胞の集団は、メモリーＢ細胞からなる。一実施形態では、抗体産生細胞の集団は、例えば、ハイブリドーマなどの組み換え細胞を含む。

【0009】

一部の実施形態では、方法は、動物から抗体産生細胞の集団を得ることを含む。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、目的の膜貫通タンパク質またはそれをコードする核酸免疫原を用いた免疫化後に、目的の膜貫通タンパク質に対する抗体を産生する動物から取得される。特定の実施形態では、動物または免疫化動物は、哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、ヤギ、ヒト、ハムスター、ブタ、サル、またはモルモットである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトではない。特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、またはヤギである。特定の実施形態では、哺乳動物は、マウスである。方法の別の実施形態では、哺乳動物は、例えば、免疫原に曝露されたヒトなどのヒトである。

【0010】

一部の例では、動物は免疫化される。特定の実施形態では、免疫された動物は、遺伝子操作される。例えば、動物が内因性遺伝子座位から目的の膜貫通タンパク質を発現しないように、動物を遺伝子操作することができる。特定の実施形態では、遺伝子操作された動物は、例えば、マウス、ヤギ、またはラットなどの非ヒト哺乳動物であり、当該動物は、ヒトイムノグロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびヒトイムノグロブリン軽鎖（ＩｇＬ）可変領域をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された動物は、ヒトイムノグロブリン重鎖およびヒトイムノグロブリン軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含み、目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性遺伝子も欠いている。特定の実施形態では、免疫化された遺伝子操作された動物は、例えば、ヒト化ＩｇＨ座位および／またはヒト化Ｉｇκ軽鎖座位を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスなどのマウスまたはラットである。一部の実施形態では、免疫化された遺伝子操作された動物は、ヒト化ＩｇＨ座位とヒト化Ｉｇκ軽鎖座位とを含むマウスであり、このマウスは対象の膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子を欠いている。一実施形態では、ヒトイムノグロブリン重鎖およびイムノグロブリンラムダ軽鎖（Ｉｇλ）可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作されたマウスである。特定の実施形態では、遺伝子操作されたマウスは、ヒトイムノグロブリン重鎖およびイムノグロブリンラムダ軽鎖（Ｉｇλ）可変領域をコードするＤＮＡを含み、また目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子を欠いている。

【0011】

一部の実施形態では、抗体産生細胞は、目的の免疫原の膜貫通タンパク質で免疫化された動物から取得される。特定の実施形態では、動物は、目的の膜貫通タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸、または目的の膜貫通タンパク質の少なくとも一部で免疫化されている。一部の実施形態では、動物は、目的の完全長膜貫通タンパク質をコードする核酸で免疫化されている。他の実施形態では、動物は、目的の膜貫通タンパク質をコードする核酸で免疫化されている。特定の実施形態では、核酸は、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分をコードするものではない。他の実施形態では、動物は、例えばプラスミド、発現ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、細胞、エクソソーム、およびリポソームなどの核酸を発現することができる担体に包含される目的の膜貫通タンパク質またはその一部をコードする核酸で免疫化されている。一部の実施形態では、動物は、目的の膜貫通タンパク質またはその一部で免疫化されている。特定の実施形態では、動物は、目的の完全長膜貫通タンパク質で免疫化されている。特定の実施形態では、目的の免疫原の膜貫通タンパク質は切断され、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分を含まない。特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質または核酸免疫原は、標識、マーカーまたは特徴などの一つ以上の検出可能な要素を含むように改変される。一部の実施形態では、免疫原は検出可能な標識を含む。特定の実施形態では、検出可能な標識は、ＦＬＡＧ－タグ、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－タグ）、Ａｖｉ－タグ、ＢｉｒＡ－タグ、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、目的の免疫原の膜貫通タンパク質は、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを有する。特定の実施形態では、検出可能な標識は、免疫原のアミノ末端またはカルボキシ末端に位置する。特定の実施形態では、動物は、脂質二重層膜足場タンパク質複合体に包含される目的の膜貫通タンパク質またはその一部で免疫化されている。

【0012】

特定の実施形態では、動物は、目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの一部に操作可能に連結された目的のヒト膜貫通タンパク質の一部分を含む、目的のキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列で免疫化される。非ヒトホモログは、例えば、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、またはヤギ由来のものであってもよい。特定の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｖｉタグ、またはＢｉｒ－Ａタグなどの検出可能な要素をコードするヌクレオチド配列も含む。他の実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質またはその一部で免疫化され、目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの一部に操作可能に連結された目的のヒト膜貫通タンパク質の一部分を含む。一実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｖｉタグ、またはＢｉｒ－Ａタグなどの検出可能な要素を含む。

【0013】

一部の例では、動物は、例えば、タンパク質またはペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸配列、修飾タンパク質またはコードＤＮＡ、ＶＬＰおよび目的の膜貫通タンパク質またはその一部を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体などの二つ以上の免疫原で免疫化される。

【0014】

方法は、目的の膜貫通タンパク質またはその一部を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体に、抗体産生細胞の集団を接触させて、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞集団を取得することを含む。

【0015】

脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、少なくとも一つの膜足場タンパク質（ＭＳＰ）および脂質を含む。一部の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、少なくとも一つのＭＳＰおよび複数の脂質を含む。特定の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、少なくとも二つまたは厳密には二つのＭＳＰを含む。他の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、三つ以上のＭＳＰを含む。一部の例では、脂質二重層膜足場タンパク質は、例えばＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１、ＭＳＰ１Ｄ１、ＭＳＰ２Ｎ３、およびＭＳＰ２Ｎ２などの少なくとも一つの膜足場タンパク質を含む。一実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、二つのＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＭＳＰは同じである。他の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のＭＳＰは、異なる。

【0016】

一部の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、標識、マーカーまたは特徴などの検出可能な要素を含む少なくとも一つの標識されたＭＳＰを含有する。特定の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、二つの標識されたＭＳＰおよび脂質二重層を含有する。一部の実施形態では、ＭＳＰタンパク質は、フルオロフォアなどの検出可能な標識を含む。特定の実施形態では、検出可能な要素は、複合体の一つ以上のＭＳＰ上に位置するＢｉｒＡタグまたはＡｖｉタグである。例示的な実施形態では、一つ以上のＭＳＰは、ＭＳＰを化学的にビオチン化することによって、またはＡｖｉ－タグをＭＳＰコード配列に遺伝子導入することによって、ビオチン化される。

【0017】

脂質二重層膜足場タンパク質複合体はまた、スフィンゴ脂質および／またはリン脂質などの複数の脂質を含む。複合体の脂質二重層は、単一のタイプの脂質または複数のタイプの脂質から構成され得る。いくつかの実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、膜足場タンパク質の周りの円板の形状の「円板状」リン脂質二重層を形成する脂質を含む。特定の実施形態では、脂質二重層は、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、およびそれらの誘導体のうちの一つ以上からなる。特定の実施形態では、脂質二重層は、１－ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１－パルミトイル２－オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳ）、ならびにホスファチジルリノシトール（ＰＩ）またはその組み合わせからなる。例示的な実施形態では、脂質二重層は、複数のＰＯＰＣリン脂質を含む。

【0018】

本方法で使用する脂質二重層膜足場タンパク質複合体はまた、抗体産生細胞によって生成された抗体に結合することができる抗原として、複合体によって細胞集団に提示される、少なくとも一つの目的の膜貫通タンパク質またはその一部を含む。複合体によって提示される目的の膜貫通タンパク質は、少なくとも一つの細胞外ドメインおよび少なくとも一つの膜貫通ドメインを有する天然型タンパク質であり得る。一部の実施形態では、複合体によって提示される目的の膜貫通タンパク質は、ヒトタンパク質である。他の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、マウス、ラット、霊長類、ハムスター、細菌、ウイルスタンパク質などの非ヒトタンパク質である。特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、その天然型から改変される。例示的な改変された目的の膜貫通タンパク質は、その天然アミノ酸配列に対して、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入の一つ以上の変化を含み得る。一実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、例えば、完全長タンパク質のＮ末端ドメインおよび／またはＣ末端ドメインなど、膜貫通タンパク質の一部分を欠失させる、すなわち「切断する」ように改変される。一部の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体に組み込まれる目的の膜貫通タンパク質は、アミノ末端、一つ以上の細胞外ループドメイン、一つ以上の膜貫通ドメイン、一つ以上の細胞内ドメイン、Ｃ末端、またはそれらの組み合わせに安定化変異を含む。一実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、リガンド活性化タンパク質であり、それにより、目的の膜貫通タンパク質は、リガンドの存在下または非存在下（すなわち、活性状態および不活性状態を有する）で立体構造を変化させる。別の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体に組み込まれた目的の膜貫通タンパク質は、キメラタンパク質であり、目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの一部に操作可能に連結された目的のヒト膜貫通タンパク質の一部を含む。一実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｖｉタグ、Ｂｉｒ－Ａタグまたはその組み合わせなどの検出可能な要素を含む。特定の実施形態では、複合体によって提示される対象の膜貫通タンパク質は、ＨｉｓタグおよびＦＬＡＧタグを含む。

【0019】

特定の例では、目的の膜貫通タンパク質は、ＧＰＣＲタンパク質、テトラスパニンタンパク質、またはイオンチャネルタンパク質である。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、例えば、ＣＣＲ５、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＤＲＢ３、Ｃ３ＡＲ１、ＡＤＲＡ２Ａ、ＧＬＰ１Ｒ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８およびＣＸＣＲ４などのＧＰＣＲタンパク質である。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＣＣＲ５またはその一部分である。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＡＤＲＡ２Ａまたはその一部分である。特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＡＤＯＲＡ２Ａまたはその一部分である。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、Ｃ３ＡＲ１またはその一部分である。

【0020】

一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、例えば、ＴＳＰＡＮ １からＴＳＰＡＮ１９、ＴＳＰＡＮ２１、ＴＳＰＡＮ２３、ＴＳＰＡＮ ３１、ＴＳＰＡＮ ３２、ＴＳＰＡＮ ３３、ＵＰＫ１Ｂ、ＰＲＰＨ２、ＣＤ１５１、ＣＤ５３、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ８２、ＣＤ６３、ＣＬＮＤ６およびＣＬＮＤ９などのテトラスパニンである。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＣＤ６３またはその一部分である。他の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、例えば、電位依存性イオンチャネルタンパク質などのイオンチャネルタンパク質である。特定の実施形態では、電位依存性イオンチャネルタンパク質は、電位依存性カルシウムチャネルまたは電位依存性カリウムチャネルタンパク質である。一部の実施形態では、イオンチャネルタンパク質は、カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質、ナトリウムチャネルタンパク質、カルシウムチャネルタンパク質、または塩化物チャネルである。本方法の特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、例えば、ＢＫＣａ、ＭａｘｉＫ、Ｓｋ、ＮａＶ１、ＣＡＣＮＧ１、ＣＡＶ、ＣＩＣ、または一過性受容器電位チャネル（ＴＲＰ）などのイオンチャネルタンパク質である。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＮａＶ１またはその一部分である。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＮａＶ１．７またはその一部分である。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＣＡＣＮＧ１またはその一部分である。

【0021】

本方法の特定の実施形態では、複合体によって提示される目的の膜貫通タンパク質は、抗体産生細胞の細胞表面上の抗体に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、エピトープ（目的の膜貫通タンパク質上に存在する結合ドメイン）に結合し、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインなど、目的の膜貫通タンパク質の特定のドメインに位置する。特定の実施形態では、抗体は、目的の膜貫通タンパク質のＮ末端ドメインの細胞外部分に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ループまたは目的の膜貫通タンパク質のＣ末端ドメインの細胞外部分に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は、目的の膜貫通タンパク質のＣ末端ドメインに位置するエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体は、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ループに位置するエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体は、目的の膜貫通タンパク質の細胞内ドメインに位置するエピトープに結合する。

【0022】

方法はまた、抗体産生細胞の集団を、目的の細胞表面タンパク質またはバイオマーカーに結合する検出可能な要素に接触させることを含み得る。例えば、免疫された動物から得られた抗体産生細胞の異種集団は、例えば、ＩｇＧなどのＢ細胞表面タンパク質に結合する蛍光標識された抗体と接触してもよい。次いで、抗体とＢ細胞との間の結合を検出し、結合された細胞を集団から単離することによって、抗体産生細胞Ｂ細胞のサブセットを集団から取得することができる。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、Ｂ細胞表面タンパク質に結合する蛍光標識された抗体と、細胞が目的の膜貫通タンパク質を含有する脂質二重層膜足場タンパク質複合体と接触するのと同時に接触することができ、または細胞を異なる時間に接触させることができる。

【0023】

特定の実施形態では、方法はまた、抗体産生細胞の集団をブロッキング剤と接触させることを含み得る。例えば、抗体産生細胞の集団は、対象の膜貫通タンパク質の一部、ＭＳＰタンパク質の一部、またはＨｉｓタグもしくはＦＬＡＧタグなどの検出可能なマーカーを認識または結合するペプチドまたは化合物などの分子と接触させることができる。こうした実施形態では、抗体産生細胞は、ブロッキング剤と、抗体産生細胞によって産生された抗体との間の結合を可能にするために、一つ以上のブロッキング剤とインキュベートされ、抗体産生細胞は、ブロッキング剤上に位置するエピトープに結合する。

【0024】

方法はまた、非結合材料または細胞を結合細胞から除去する期間、抗体産生細胞などの細胞集団を洗浄することを含み得る。

【0025】

抗体産生細胞によって生成された抗体と、脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される目的の膜貫通タンパク質上に存在する結合ドメイン（エピトープ）との間の結合を検出することができ、膜貫通タンパク質に結合された抗体産生細胞を収集することができる。例えば、一部の実施形態では、結合は、目的の膜貫通タンパク質の立体構造の変化、細胞中の目的の膜貫通タンパク質の活性化または非活性化、または一つ以上の検出可能なマーカーの使用によって検出される。特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質抗原に結合された抗体を提示する抗体産生細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）などの単一細胞単離のためのハイスループット技術を使用して、集団中の他の抗体産生細胞から検出および単離され得る。一実施形態では、ＦＡＣＳは、脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される目的の脂質の膜貫通タンパク質に結合した単一抗体産生細胞を識別および単離するために、そこに含まれた目的の複合体または膜貫通タンパク質に貼り付けられた検出可能な標識によって放射されるシグナルを検出することによって使用される。特定の実施形態では、シグナルは、ビオチン／ストレプトアビジン－ＰＥ複合体または蛍光分子のうちの、一つ以上の検出可能な標識によって放射される。

【0026】

方法はまた、抗体産生細胞から抗体または抗体をコードする核酸を取得または単離することを含み得る。

【0027】

特定の実施形態では、抗体（例えば、遺伝子）またはその一部をコードする核酸は、抗体産生細胞から単離される。一部の実施形態では、核酸は、抗体の可変ドメインをコードする。特定の実施形態では、核酸は、抗体重鎖またはその断片をコードする。他の実施形態では、核酸は、抗体軽鎖またはその断片をコードする。特定の例では、抗体産生細胞から単離された核酸は、完全長抗体をコードする。一部の実施形態では、本方法は、抗体産生細胞、細胞によって発現される抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、および細胞によって発現される抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸から単離することを含む。

【0028】

本方法の特定の実施形態では、抗体をコードする核酸は、宿主細胞に発現される。いくつかの実施形態では、核酸を含む宿主細胞は、完全長抗体を発現する条件下で培養され、抗体はその後、さらなる使用のために産生および単離され得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、抗体の可変ドメインをコードする核酸を含み、細胞は、可変ドメインを発現する条件下で培養される。一部の実施形態では、宿主細胞は、抗体の可変重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメインをコードする核酸を含み、細胞は、Ｖ_Ｈドメインを発現する条件下で培養される。一部の実施形態では、宿主細胞は、抗体の可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインをコードする核酸を含み、細胞は、Ｖ_Ｌドメインを発現する条件下で培養される。特定の実施形態では、宿主細胞は、抗体のＶ_Ｈドメインをコードする核酸と、抗体のＶ_Ｌドメインをコードする核酸とを含み、細胞は、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを発現する条件下で培養される。

【0029】

したがって、本開示の一態様では、本開示の方法を使用して単離された目的の膜貫通タンパク質に特異的な抗体をコードする核酸分子を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質に特異的な抗体の可変重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメインをコードする核酸を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質に特異的な抗体の可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインをコードする核酸を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質に特異的な抗体の可変重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメインをコードする核酸および抗体の可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインをコードする核酸を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。特定の実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。一実施形態では、細胞は、以下の細胞タイプのうちのいずれか一つ以上であってもよい：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（上皮性）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０およびＭＭＴ細胞および腫瘍細胞。特定の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。

【0030】

本開示の方法のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、添付図面と併せて取り込まれた方法の様々な態様の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
図面の簡単な説明および表

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】図１Ａ～１Ｂは、脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される目的の膜貫通タンパク質が、目的の膜貫通タンパク質を認識する抗体に特異的に結合し、開示された方法を使用してインビトロで検出可能であることを実証する。少なくとも二つの膜足場タンパク質を有する脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、それぞれ検出可能なＢｉｒ－Ａ標識を含有し、目的の第一の例示的な膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１との複合体）を含有し、ＧＰＣＲ１（陽性対照ＡＢ）と、ＧＰＣＲタンパク質と結合しないアイソタイプ対照ｍａｂ（陰性対照ＡＢ）に結合することが知られている例示的な抗体に結合する能力について、目的の膜貫通タンパク質（空の複合体）を含まない脂質二重層膜足場タンパク質複合体の制御と比較した。（Ａ）ヒストグラムは、脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される目的の膜貫通タンパク質が、陽性対照抗体（０．６ｎｍ）と特異的に結合するが、抗ＧＰＣＲ１抗体と空の複合体（－０．０５ｎｍ）、陰性対照抗体とＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質を含む脂質二重層膜足場タンパク質複合体（－０．０６ｎｍ）、または陰性対照抗体と空の複合体（－０．０３ｎｍ）とでは特異的に結合しないことを示す。（Ｂ）目的の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１との複合体）を提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体を検出し、目的の膜貫通タンパク質を含有しないビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体（空の複合体）と分離する能力は、膜貫通タンパク質のある場合とない場合のビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体をそれに繋ぎ止められたストレプトアビジンを有するプレートに提供し、その後ＧＰＣＲ１に結合することが知られている抗体（陽性対照ＡＢ）または陰性対照抗体とインキュベートすることによって、分析された。ヒストグラムは、脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される目的の膜貫通タンパク質が、陽性対照抗体に特異的に結合するが、陰性対照抗体には結合しないことを示す。

【0032】

【図2-1】図２Ａ～２Ｆは、フローサイトメトリーによる目的の例示的な膜貫通タンパク質に特異的な抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の検出および分離を示す。脾細胞を採取し、目的の第一の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１、Ｂ）、目的の第二の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ２、Ｄ）、または目的の第三の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ３、Ｆ）をコードするＤＮＡの注射により免疫化されなかった対照マウス（Ａ、Ｃ、Ｅ）および遺伝子操作されたマウスから単離した。目的の例示的な膜貫通タンパク質（抗原結合細胞）の各々に特異的な抗体を発現するＢ細胞（表面ＩｇＧ陽性細胞）の集団を検出し、脾細胞をＢ細胞マーカーに対する蛍光標識で染色し（すなわち、抗ＩｇＧ）、細胞集団を、目的の例示的な膜貫通タンパク質の一つを提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体と接触させることにより、ＦＡＣＳを使用して収集した。（Ａ）１００万個の脾細胞中の２個のＢ細胞のみが、示す（長方形）ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示された目的の第一の膜貫通タンパク質に非特異的に結合した。（Ｂ）目的の第一の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１）に特異的な抗体を発現する１００万個のＢ細胞中の１１個は、本方法を使用して検出された（長方形）。（Ｃ）対象マウスから取得した１００万個の脾細胞中の２個のＢ細胞のみが、示す（長方形）ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示された目的の第二の膜貫通タンパク質に非特異的に結合した。（Ｄ）目的の第二の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ２）に特異的な抗体を発現する１００万個のＢ細胞中の７８個は、本方法を使用して検出された（長方形）。（Ｅ）示す（長方形）ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示された目的の第三の膜貫通タンパク質に非特異的に結合された１１個のＢ細胞のみが、対照マウスからの１００万個の脾細胞から取得された。（Ｆ）目的の第三の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ３）に特異的な抗体を発現する１００万個のＢ細胞中の６５個は、本方法を使用して検出された（長方形）。

【図2-2】図２Ａ～２Ｆは、フローサイトメトリーによる目的の例示的な膜貫通タンパク質に特異的な抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の検出および分離を示す。脾細胞を採取し、目的の第一の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１、Ｂ）、目的の第二の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ２、Ｄ）、または目的の第三の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ３、Ｆ）をコードするＤＮＡの注射により免疫化されなかった対照マウス（Ａ、Ｃ、Ｅ）および遺伝子操作されたマウスから単離した。目的の例示的な膜貫通タンパク質（抗原結合細胞）の各々に特異的な抗体を発現するＢ細胞（表面ＩｇＧ陽性細胞）の集団を検出し、脾細胞をＢ細胞マーカーに対する蛍光標識で染色し（すなわち、抗ＩｇＧ）、細胞集団を、目的の例示的な膜貫通タンパク質の一つを提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体と接触させることにより、ＦＡＣＳを使用して収集した。（Ａ）１００万個の脾細胞中の２個のＢ細胞のみが、示す（長方形）ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示された目的の第一の膜貫通タンパク質に非特異的に結合した。（Ｂ）目的の第一の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１）に特異的な抗体を発現する１００万個のＢ細胞中の１１個は、本方法を使用して検出された（長方形）。（Ｃ）対象マウスから取得した１００万個の脾細胞中の２個のＢ細胞のみが、示す（長方形）ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示された目的の第二の膜貫通タンパク質に非特異的に結合した。（Ｄ）目的の第二の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ２）に特異的な抗体を発現する１００万個のＢ細胞中の７８個は、本方法を使用して検出された（長方形）。（Ｅ）示す（長方形）ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示された目的の第三の膜貫通タンパク質に非特異的に結合された１１個のＢ細胞のみが、対照マウスからの１００万個の脾細胞から取得された。（Ｆ）目的の第三の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ３）に特異的な抗体を発現する１００万個のＢ細胞中の６５個は、本方法を使用して検出された（長方形）。

【図2-3】図２Ａ～２Ｆは、フローサイトメトリーによる目的の例示的な膜貫通タンパク質に特異的な抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の検出および分離を示す。脾細胞を採取し、目的の第一の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１、Ｂ）、目的の第二の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ２、Ｄ）、または目的の第三の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ３、Ｆ）をコードするＤＮＡの注射により免疫化されなかった対照マウス（Ａ、Ｃ、Ｅ）および遺伝子操作されたマウスから単離した。目的の例示的な膜貫通タンパク質（抗原結合細胞）の各々に特異的な抗体を発現するＢ細胞（表面ＩｇＧ陽性細胞）の集団を検出し、脾細胞をＢ細胞マーカーに対する蛍光標識で染色し（すなわち、抗ＩｇＧ）、細胞集団を、目的の例示的な膜貫通タンパク質の一つを提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体と接触させることにより、ＦＡＣＳを使用して収集した。（Ａ）１００万個の脾細胞中の２個のＢ細胞のみが、示す（長方形）ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示された目的の第一の膜貫通タンパク質に非特異的に結合した。（Ｂ）目的の第一の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１）に特異的な抗体を発現する１００万個のＢ細胞中の１１個は、本方法を使用して検出された（長方形）。（Ｃ）対象マウスから取得した１００万個の脾細胞中の２個のＢ細胞のみが、示す（長方形）ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示された目的の第二の膜貫通タンパク質に非特異的に結合した。（Ｄ）目的の第二の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ２）に特異的な抗体を発現する１００万個のＢ細胞中の７８個は、本方法を使用して検出された（長方形）。（Ｅ）示す（長方形）ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示された目的の第三の膜貫通タンパク質に非特異的に結合された１１個のＢ細胞のみが、対照マウスからの１００万個の脾細胞から取得された。（Ｆ）目的の第三の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ３）に特異的な抗体を発現する１００万個のＢ細胞中の６５個は、本方法を使用して検出された（長方形）。

【0033】

【図3】図３は、ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体を使用して抗体産生細胞から単離されて、膜貫通タンパク質抗原を提示する抗体が、使用される免疫原の種類に依存せずに、目的の第二の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質に特異的に結合することを示す。抗体産生細胞は、目的の膜貫通タンパク質および抗体を提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体を使用して、膜貫通タンパク質（ＤＮＡ）をコードするＤＮＡ（ＤＮＡ）または精製された目的の膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡのいずれかで免疫化された遺伝子操作されたマウスから取得され、スクリーニングのために生成された。目的の抗原の完全長膜貫通タンパク質は細胞（ＴＭＢ過剰発現）に発現し、抗原発現細胞を、ＴＭＢ（親細胞）のいずれかをコードするＤＮＡでトランスフェクトされなかった対照細胞と比較した。次いで、細胞を抗体とインキュベートして、目的の例示的な膜貫通タンパク質に特異的に結合する抗体を識別した。破線上の抗体は、目的の膜貫通タンパク質に結合することができた。対照的に、破線下の抗体は、陽性（正方形）および陰性（三角形）対照抗体との比較によって示されるように、弱い結合物質であるか、または目的の膜貫通タンパク質に結合することができなかった。

【0034】

【図4】図４は、本開示の方法を使用して抗体産生細胞から単離された抗体を示し、この抗体は、スクリーニングのために発現され、細胞表面上に発現された目的の抗原の膜貫通タンパク質に結合した。抗体産生細胞は、目的の抗原の膜貫通タンパク質のｎ末端を切断した形態を示すビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体を使用して、免疫化され、遺伝子操作されたマウスから取得され、抗体がスクリーニングのために生成された。目的の抗原の膜貫通タンパク質の切断された形態が細胞に発現し（過剰発現した切断されたＴＭＢ）、または目的の抗原の膜貫通タンパク質の完全長形態が細胞に発現し（過剰発現した完全長ＴＭＢ）、細胞が抗体とインキュベートされて、目的の例示的な膜貫通タンパク質の細胞外ループドメイン（箱形）に配置されたエピトープに特異的に結合する抗体を識別した場合、抗原発現細胞を、切断されたＴＭＢ抗原または完全長ＴＭＢ（親細胞）のいずれかをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた対象細胞と比較した。

【発明を実施するための形態】

【0035】

表１：免疫されたマウスからの様々な膜貫通タンパク質に対して細胞表面抗体を発現する細胞からの抗体の単離。内因性遺伝子から目的の膜貫通タンパク質の発現を防ぐように遺伝子操作されたマウス（抗原を含まない遺伝子改変マウス）または内因性遺伝子から目的の膜貫通タンパク質を発現する遺伝子操作されたマウス（遺伝子改変マウス）を、目的の膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡ（ＤＮＡ）、膜貫通タンパク質の改変形態をコードするＤＮＡ（改変ＤＮＡ）、精製された膜貫通タンパク質（タンパク質）、目的の膜貫通タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体（抗原を含む複合体）またはその組み合わせで免疫化した。本明細書に開示される選別方法（抗原を有する細胞選別および複合体）を使用して収集された抗体産生細胞および抗体を、細胞から単離し、標準的なハイブリドーマ技術（ハイブリドーマ）を使用して得られた細胞から単離された抗体と比較した。分析された膜貫通タンパク質それぞれについて、目的の膜貫通タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体で細胞を選別することによって抗体産生から得られ、標準的なハイブリドーマ技術よりも、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体の割合が高かった。

【0036】

表２：目的の膜貫通タンパク質に特異的に結合する抗体を発現する抗体産生細胞を取得する能力について細胞選別戦略の比較。目的の例示的な膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子を有する（ＶＩ）、または有しない（ＶＩ－ＫＯ）遺伝子操作されたマウス、すなわちＧＰＣＲ１またはイオンチャネル２を、以下の免疫原の一つ以上の注射により免疫化した：目的の膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡ（ＤＮＡ）、精製された膜貫通タンパク質（タンパク質）、目的の膜貫通タンパク質を発現することができるウイルス様粒子（ＶＬＰ）、またはそれらの組み合わせ（ＶＬＰおよびＤＮＡ）。次いで、免疫化されたマウスから得られたＢ細胞を、膜貫通タンパク質を提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体（ＴＭＢを含む複合体）、ＶＬＰまたは精製された膜貫通タンパク質（タンパク質）のソーティング剤の一つを使用して選別した。次いで、ソーティング剤に結合した抗体を産生した細胞を収集し、比較のために各細胞から抗体を生成した。

【0037】

表３：各マウスから取得した細胞を、目的の膜貫通タンパク質を提示したビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体（ＴＭＢを含む複合体）を使用して選別した場合の、目的のヒト膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡ（ＤＮＡ）または精製されたヒト膜貫通タンパク質（タンパク質）のいずれかで免疫化した遺伝子操作されたマウスから取得した抗体産生細胞から生成された抗体の比較。このデータは、５つの代表的な免疫キャンペーンの結果を提示した。

【0038】

表４：抗体産生細胞の単離、および目的の二つの異なる例示的な膜貫通タンパク質（ＶＩ－ＫＯ）のマウスホモログを発現しない遺伝子改変マウスからの抗体の生成、目的の膜貫通タンパク質のマウスホモログ（マウスＴＭＢ）および目的の膜貫通タンパク質のヒトホモログに結合する交差反応性抗体を得るためにビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体を使用することができることを示す異なる免疫化戦略の比較。提供されたデータは、ＴＭＢ１に対する四つの代表的な免疫キャンペーンと、ＴＭＢ２に対する四つの代表的な免疫キャンペーンとの組み合わせである。

【0039】

表５：抗体産生細胞の単離および目的の例示的な膜貫通タンパク質のマウスホモログを発現しない遺伝子改変マウス（ＶＩ－ＫＯ）からの抗体の生成、ＡヒトＴＭＢ２タンパク質（ヒトＴＭＢ２）を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体による遺伝子改変マウスの免疫化、ヒトＴＭＢ２タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体（ヒトＴＭＢ２を含む複合体）を有する抗体産生Ｂ細胞および／またはマウスＴＭＢ２を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体（マウスＴＭＢ２を含む複合体）を有する抗体産生Ｂ細胞の選別、マウスＴＭＢ２とヒトＴＭＢ２タンパク質ホモログに結合することができる交差反応性抗体ならびにヒトＴＭＢ２タンパク質に特異的な抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の識別。提供されたデータは、二つの代表的な免疫キャンペーンの組み合わせである。

【0040】

本明細書において、脂質二重層膜足場タンパク質複合体を利用して、細胞により産生された抗体に膜貫通タンパク質抗原を提示する方法が開示される。脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、目的の膜貫通タンパク質またはその部分を含み、一般に脂質および膜足場タンパク質は天然の細胞の膜に見られ、その天然の立体構造において抗体に対して膜貫通タンパク質抗原を提示する。このように、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、例えば、細胞外ドメインなどの自然界でアクセス可能な膜貫通タンパク質上のエピトープに結合する集団において、抗体（または抗体を発現する細胞）の特定のサブセットを識別し、収集するために本発明の方法に使用される。

【0041】

任意の一つの理論に限定されるものではないが、本明細書に開示される方法は、動物を免疫化し、目的の抗原の膜貫通タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を使用して、免疫された動物から抗体産生細胞を単離することにより、立体構造的に正確な膜貫通タンパク質上でエピトープに特異的な抗体を産生する細胞を識別することができることを明らかにする。

【0042】

さらに、抗体および抗体をコードする核酸は、例えば、ＦＡＣＳなどの単一細胞単離および収集技術によって、抗体産生細胞から直接単離することができる。したがって、本開示はまた、抗体産生細胞の集団から直接膜貫通タンパク質に対する親和性を有する抗体を得るための効果的かつ効率的な方法を提供する。本方法は、特定の抗体が目的の膜貫通タンパク質の所望の部分を認識するかどうかを確認するために、部位特異的変異誘発およびその他の周知の技術によるエピトープ特異的抗体の時間のかかるスクリーニング、識別および選択の必要性を迂回する。

【0043】

本開示の一態様では、目的の膜貫通タンパク質またはその一部を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体に、抗体産生細胞の集団を接触させることを含む、目的の膜貫通タンパク質に対する抗体または抗体を発現する細胞集団を取得する方法が提供される。一実施形態では、方法は、動物から得られる抗体産生細胞の集団を、目的の膜貫通タンパク質またはその一部を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体に接触させて、膜貫通タンパク質（すなわち、抗原）と、細胞の表面上の抗体との間の結合を可能にし、細胞集団中の結合抗体産生細胞を収集することを含む。

【0044】

以下の説明では、用語の使用に関して特定の慣例に従う。概して、本明細書で使用される用語は、当業者に公知である用語の意味と一貫して解釈されることが意図される。本開示の実践において、当業者であれば、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学における多くの従来的技術が使用される。これらの技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第４版、Ｊ．Ｆ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ編 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２０１２；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｅｌｖｙｎ Ｌｉｔｔｌｅ、編 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、編１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編１９８７、定期的に更新）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓら、編、１９９４）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．、１９８８）；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｂａｒｂａｓら、２００１）により詳細に記載されている。これらの参考文献、および製造業者の指示を含む当業者によって広く知られ、かつ信頼されている標準プロトコルを含む他の参考文献の内容は、本開示の一部として参照により本明細書に組み込まれる。

【0045】

抗体産生細胞を生成するための免疫化
動物の免疫化は、当技術分野で公知の任意の方法によって達成することができる。例えば、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ”（１９８８）；Ｍａｌｉｋ ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｈｏｊ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９４年、ＣＡを参照されたい。例えば、免疫原は、限定されないが、アジュバント有無に関わらず、静脈内または腹腔内注射を含む様々な経路を介して、哺乳動物などの動物に直接投与されてもよく、アジュバントは免疫応答の刺激を助けることができる。当技術分野で公知のアジュバントとしては、限定されるものではないが、完全かつ不完全Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント、ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント系（Ｓｉｇｍａ社）、またはＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）が挙げられる。Ｏ’Ｈａｇａｎ、Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ、ｂｙ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，（２０００）ＮＪ．を参照されたい。用語「免疫原」は、抗原（例えば、目的の膜貫通タンパク質またはそれをコードする核酸など）を含む組成物を指し、それに対して抗原特異的抗体は、宿主の免疫反応によって生成される。用語「抗原」は、抗体またはその断片などの結合剤によって結合することができる分子または分子の一部分を指す。抗原はまた、各抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するために使用することができる。

【0046】

免疫原は、タンパク質、タンパク質もしくはその断片をコードする核酸配列、ペプチド断片、タンパク質融合体として、または目的の免疫原コード遺伝子もしくはタンパク質免疫原もしくはそのペプチド断片を含有する担体によって、宿主動物に投与することができる。免疫化プロセスは、宿主から免疫反応を誘導し、インビボで宿主の細胞発現機構を使用して抗原（例えば、対象の膜貫通タンパク質）を発現することができる。

【0047】

様々な免疫化技術が当該技術分野で公知であり、当該方法を実施する際に使用することができる。例えば、動物は、目的の膜貫通タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸、目的の膜貫通タンパク質の少なくとも一部、そのような核酸、目的の膜貫通タンパク質またはその一部を含む担体など、免疫原を注射することによって免疫化することができる。

【0048】

一部の例では、動物は、目的の膜貫通タンパク質またはその一部をコードする核酸で免疫化される。特定の実施形態では、動物は、目的の完全長膜貫通タンパク質をコードする核酸で免疫化される。特定の実施形態では、動物は、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質をコードする核酸で免疫化される。他の実施形態では、動物は、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質をコードする核酸で免疫化される。特定の実施形態では、動物は、目的の完全長マウス膜貫通タンパク質をコードする核酸で免疫化される。

【0049】

用語「核酸」または「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはそのリボヌクレオチドならびにそのポリマーを指す。この用語は、公知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基または結合を含有する核酸を包含し、それらは合成、天然、および非天然であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。用語「核酸コード」または「コードする核酸」は、ペプチド、タンパク質、検出可能な要素もしくは標識、および／または調節要素などのアミノ酸の配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。「遺伝子」とは、一つ以上のポリペプチド、タンパク質、または酵素のすべてまたは一部を含むアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ核酸配列を指し、イントロン、ならびに例えば、遺伝子または遺伝子産物が発現される条件に影響を与えるプロモーターまたはエンハンサー配列、５’非翻訳領域、または３’非翻訳領域などの調節ＤＮＡ配列を含んでも、含まなくてもよい。

【0050】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基のポリマーを指すために使用される。この用語は、一つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然のアミノ酸ポリマーおよび非天然のアミノ酸ポリマーを含む。用語「タンパク質」は、大きなポリペプチドを指す。例えば、本開示では、タンパク質は完全長タンパク質または内因性タンパク質であり得る。用語「ペプチド」は、一般的には、例えば、タンパク質またはポリペプチドの断片または部分などの短いポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「断片」または「部分」は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質発現産物よりも小さいポリペプチドの任意の部分を指す。断片または部分は、完全長タンパク質から一つ以上のアミノ酸残基が除去された完全長タンパク質の「切断された」または欠失類似体であってもよい。例えば、本開示では、ペプチドは、「切断されたタンパク質」または「タンパク質の一部分」または「タンパク質の断片」として記載され得る。特定の例では、目的の膜貫通タンパク質の「一部分」は、目的の膜貫通タンパク質の少なくとも全体の膜部分を含む。「切断されたタンパク質」は、完全長タンパク質のアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分を含まない目的の膜貫通タンパク質の一部分であってもよい。合成ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質は、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して、または当業者に公知の組み換え技術によって合成することができる。

【0051】

用語「膜貫通タンパク質」および「目的の膜貫通タンパク質」は、本明細書では同義に使用され、細胞またはオルガネラの膜に付着し、膜に埋め込まれるタンパク質またはそのポリペプチド部分を意味する。したがって、膜貫通タンパク質は、膜を横断するタンパク質であり、それゆえ、ドメインにわたる少なくとも一つの膜から構成される。一部の例では、膜貫通タンパク質はまた、少なくとも一つの細胞質ドメインおよび／または少なくとも一つの細胞外ドメインを含む。細胞質ドメインは、アミノ末端ドメイン、カルボキシ末端ドメイン、および細胞内ループドメインの一つ以上であってもよい。細胞外ドメインは、アミノ末端ドメイン、カルボキシ末端ドメイン、および細胞外ループドメインの一つ以上であってもよい。一部の例では、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、目的の膜貫通タンパク質のドメインにかかる一つ以上の膜の間のＮ末端細胞外ドメイン、Ｃ末端細胞外ドメイン、および／または細胞外ループドメインを含む。膜貫通タンパク質は、原核生物、真核生物、およびウイルスを含むがこれに限定されない、任意の生物に由来する天然由来のタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、膜貫通タンパク質は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、またはヤギタンパク質であり得る。一部の例では、膜貫通タンパク質は、ヒト、マウス、ラット、または霊長類の膜貫通タンパク質などの哺乳動物のタンパク質である。特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ヒトタンパク質である。特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、非ヒトタンパク質である。一実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、マウスタンパク質である。

【0052】

一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、本明細書に記載されるように改変される。例示的な改変された目的の膜貫通タンパク質は、その天然アミノ酸配列に対して、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入の一つ以上の変化を含み得る。いくつかの実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、例えば、完全長タンパク質のＮ末端ドメインおよび／またはＣ末端ドメインなど、膜貫通タンパク質の一部分を欠失させる、すなわち「切断する」ように改変される。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、アミノ末端、一つ以上の細胞外ループドメイン、一つ以上の膜貫通ドメイン、一つ以上の細胞内ドメイン、Ｃ末端、またはそれらの組み合わせに安定化変異を含む。特定の実施形態では、膜貫通タンパク質は、キメラ膜貫通タンパク質である。特定の実施形態では、目的の改変された膜貫通タンパク質は、例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｖｉタグ、またはＢｉｒ－Ａタグなどの一つ以上の検出可能な要素を含む。一部の実施形態では、目的の免疫原の膜貫通タンパク質は、ＨｉｓタグおよびＦＬＡＧタグを含む。

【0053】

一実施形態では、膜貫通タンパク質は、リガンド活性化タンパク質であり、それにより、膜貫通タンパク質は、リガンドの存在下または非存在下（すなわち、活性状態および不活性状態を有する）で立体構造を変化させる。例えば、細胞内または細胞外ドメイン上にリガンドと結合することができるリガンド活性化膜貫通タンパク質であって、それによって結合は、細胞内のシグナル伝達を調節する膜貫通タンパク質の一つ以上のドメインにおける立体構造変化を誘発する。一部の例では、目的の膜貫通タンパク質は、溶質輸送体トランスポーター（ＳＬＣ）、受容体、キナーゼ活性を有する受容体、クラスＩ成長因子受容体、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネルタンパク質またはテトラスパニンである。特定の例では、目的の膜貫通タンパク質は、ＧＰＣＲタンパク質、テトラスパニンタンパク質、またはイオンチャネルタンパク質である。一実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＳＬＣタンパク質である。

【0054】

一実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＧＰＣＲタンパク質である。本方法で使用するためのＧＰＣＲは、当該技術分野で周知である。例えば、Ｆｏｏｒｄら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．（２００５）５７：２７９－２８８を参照されたい、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。したがって、ＧＰＣＲは、アデノシン受容体、β－アドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、ムスカリン酸受容体、５－ヒドロキシトリプタミン受容体、アドレナリン受容体、アナフィラトキシン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、ドパミン受容体、エンドセリン受容体、遊離脂肪酸受容体、胆汁酸受容体、ガラニン受容体、モチリン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ＧｎＲＨ受容体、ヒスタミン受容体、ＫｉＳＳ１由来ペプチド受容体、ロイコトリエンおよびリポキシン受容体、リゾリン脂質受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、ニューロメジンＵ受容体、神経ペプチド受容体、Ｎ－ホルミルペプチドファミリー受容体、ニコチン酸受容体、ピオド受容体、、オプシン様受容体、オレキシン受容体、Ｐ２Ｙ受容体、ペプチドＰ５１８受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、レラキシン受容体、ソマトスタチン受容体、ＳＰＣ／ＬＰＣ受容体、タキキニン受容体、トレースアミノ受容体、サイロトロピン放出ホルモン受容体、ウロテンシン受容体、バソプレシン／オキシトシン受容体、オーファンＧＰＣＲ、カルシトニン受容体、副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体、グルカゴン受容体、副甲状腺受容体、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ受容体、ＬＮＢ７ＴＭ受容体、ＧＡＢＡ受容体、代謝型グルタミン酸受容体およびカルシウムセンサー受容体のいずれかであってよい。

【0055】

特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、例えば、ＣＣＲ５、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＤＲＢ３、Ｃ３ＡＲ１、ＡＤＲＡ２Ａ、ＧＬＰ１Ｒ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８およびＣＸＣＲ４などのＧＰＣＲタンパク質である。特定の実施形態では、膜貫通タンパク質は、以下のＧＰＣＲタンパク質から選択されるＧＰＣＲタンパク質である：ＣＣＲ５、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＤＲＢ３、Ｃ３ＡＲ１、ＡＤＲＡ２Ａ、ＧＬＰ１Ｒ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８またはＣＸＣＲ４。一実施形態では、膜貫通タンパク質はＣＣＲ５である。別の実施形態では、膜貫通タンパク質はＡＤＯＲＡ２Ａである。他の実施形態では、膜貫通タンパク質はＣ３ＡＲ１である。さらに別の実施形態では、膜貫通タンパク質はＡＤＲＡ２Ａである。他の実施形態では、膜貫通タンパク質はＧＬＰ１Ｒである。

【0056】

一部の例では、膜貫通タンパク質はテトラスパニンである。特定の例では、目的の膜貫通タンパク質は、例えば、ＴＳＰＡＮ １からＴＳＰＡＮ１９、ＴＳＰＡＮ２１、ＴＳＰＡＮ２３、ＴＳＰＡＮ ３１、ＴＳＰＡＮ ３２、ＴＳＰＡＮ ３３、ＵＰＫ１Ｂ、ＰＲＰＨ２、ＣＤ１５１、ＣＤ５３、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＴＣＤ６３、ＣＬＮＤ６およびＣＬＮＤ９などのテトラスパニンである。一部の実施形態では、膜貫通タンパク質はＣＤ６３である。別の実施形態では、ＣＬＤＮ６である。他の実施形態では、膜貫通タンパク質はＣＬＤＮ９である。

【0057】

他の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、イオンチャネルタンパク質である。一実施形態では、イオンチャネルタンパク質は、電位依存性イオンチャネルタンパク質である。特定の実施形態では、電位依存性イオンチャネルタンパク質は、電位依存性カルシウムチャネルガンマ－１サブユニット（ＣＡＣＮＧ１）、または例えば、ＫＶＳもしくはＫＩＲＳなどの電位依存性カリウムチャネルタンパク質である。他の実施形態では、イオンチャネルタンパク質は、カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質（例えば、ＢＫＣａ、ＭａｘｉＫ、またはＳｋ）、例えば、ＮａＶ１タンパク質（例えば、電位依存性チャネルアルファサブユニット９（ＮａＶ１．７）、電位依存性チャネルアルファサブユニット２（ＮａＶ１．２））、カルシウムチャネルタンパク質（例えば、ＣＡＶ）またはクロリドチャネルタンパク質などの電位依存性ナトリウムチャネルタンパク質である。いくつかの実施形態では、イオンチャネルタンパク質は、一過性受容器電位チャネル（ＴＲＰ）タンパク質である。特定の実施形態では、ＴＲＰは、カノニカル膜貫通タンパク質（ＴＲＰＣ）、バニロイド受容体（ＴＲＰＶ）、メラスタチン（ＴＲＰＭ）、ポリシスチン（ＴＲＰＰ）、ムコリピン（ＴＲＰＭＬ）、またはａｎａｎｋｙｒｉｎ膜貫通タンパク質１（ＴＲＰＡ１）、例えば、カノニカルＴＲＰ（ＴＲＰＣ）、バニロイド受容体（ＴＲＰＶ）、メラスタチン（ＴＲＰＭ）、ポリシスチン（ＴＲＰＰ）、ムコリピン（ＴＲＰＭＬ）、アンキリン膜貫通タンパク質１（ＴＲＰＡ１）である。特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＢＫＣａ、ＭａｘｉＫ、Ｓｋ、ＮＡＶ１．７、ＣＡＣＮＧ１、ＣＡＶ、ＣＩＣ、またはＴＲＰである。

【0058】

特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、電位依存性ナトリウムチャネルタンパク質である。電位依存性ナトリウムチャネルのファミリーは九つの公知のメンバーを有し、膜貫通セグメントおよび細胞外ループ領域において５０％超のアミノ酸同一性を有する。これらのチャネルのタンパク質は、ＮａＶ１．１～ＮａＶ１．９と命名され、概して「ＮａＶ１タンパク質」と呼称され、ＮａＶ１．１～ＮａＶ１．９をコードする遺伝子名はＳｃｎ１ａ～Ｓｃｎ１１ａと呼称される。ＮａＶ１タンパク質の各々は、四つのリピートドメインを有し、各々が六つの膜貫通セグメントを含有する。第四のセグメントは、高度に保存されており、チャネルの電圧センサとして機能する。このチャネルの電圧感度は、第四セグメントの三番目毎に位置する正のアミノ酸に起因する（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、（２０１２）「Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ ｔｏ Ｂｒａｉｎ」、第５版、ｐｇ．８６、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。膜貫通電圧の変化によって刺激されると、このセグメントは細胞膜の細胞外側に向かって移動し、チャネルがイオンを透過するようになる。イオンは、細孔を通して伝導され、これは二つの領域に分割され得る。細孔のより外側（すなわち、より細胞外側）部分は、四つのドメインのそれぞれの第五の膜貫通セグメントと第六の膜貫通セグメント（「Ｐループ」としても知られる）との間の領域によって形成される。この領域は細孔のより狭い部分であり、そのイオン選択性に関与する。細孔の内側部分（すなわち、より細胞質側）は、四つのドメインの第五の膜貫通セグメントと第六の膜貫通セグメントとの組み合わせによって形成される。より詳細には、ヒトＮａＶ１．１タンパク質は寄託番号Ｐ３５４９８．２に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒトＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号Ｑ９９２５０．３に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒトＮａＶ１．３タンパク質は寄託番号Ｑ９ＮＹ４６．２に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒトＮａＶ１．４タンパク質は寄託番号Ｐ３５４９９．４に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒトＮａＶ１．５タンパク質は寄託番号Ｑ１４５２４．２に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒトＮａＶ１．６タンパク質は寄託番号Ｑ９ＵＱＤ０．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒトＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号Ｑ１５８５８．３に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒトＮａＶ１．８タンパク質は寄託番号Ｑ９Ｙ５Ｙ９．２に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒトＮａＶ１．９タンパク質は寄託番号Ｑ９ＵＩ３３．２に記載されるアミノ酸配列に対応する。

【0059】

このような一実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＮａＶ１タンパク質である。特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＮＡＶ１．７である。ＮａＶ１．７は、後根神経節、交感神経細胞、シュワン細胞、および神経内分泌細胞において侵害受容性（疼痛）ニューロンで発現される。ＮａＶ１．７は、膜の興奮性の重要な要素であり、痛みの感覚に重要である。ヒトＳＣＮ９Ａ遺伝子における機能獲得変異は、疼痛症候群と関連し、機能喪失変異は、疼痛に対する重度の無感覚と関連している。ＮａＶ１．７は、以下の１４の動物種由来のＮａＶ１．７タンパク質の例示的な配列のアライメントから明らかなように、種を超えて高度に保存されている。ヒトＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号Ｑ１５８５８．３に記載されるアミノ酸配列に対応し；チンパンジーＮａＶ１．７ホモログは寄託番号ＸＰ＿０１６８０４９４７．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；アカゲザルＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号ＸＰ＿０１４９６５７６６．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；マレーヒヨケザルＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号ＸＰ＿００８５８８３７１．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ウシＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号ＮＰ＿００１１０４２５７．２に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒツジＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号ＸＰ＿００４００４６７９．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒトコブラクダＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号ＸＰ＿０１０９８０７６７．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；シャチＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号ＸＰ＿００４２６７３０２．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ウマＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号ＸＰ＿００１４９６４７３．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；イヌＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号ＸＰ＿０２２２７０５４７．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；マウスＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号Ｑ６２２０５．２に記載されるアミノ酸配列に対応し；ラットＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号Ｏ０８５６２．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ウサギＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号Ｑ２８６４４．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ニワトリＮａＶ１．７タンパク質は寄託番号ＮＰ＿００１２８０２１１．１に記載されるアミノ酸配列に対応する。

【0060】

特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ヒトＮａＶ１．７である。別の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質はマウスＮａＶ１．７である。

【0061】

特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＮＡＶ１．２である。ＮａＶ１．２は、中枢ニューロンおよび末梢ニューロンで発現する。ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子（ＮａＶ１．２をコードする）の変異は、いくつかの発作障害および自閉症スペクトラム障害と関連している。ＮａＶ１．２は、１４の動物種由来のＮａＶ１．２タンパク質の例示的な配列のアライメントから明らかなように、種を超えて高度に保存されている。アライメントに含まれる例示的な配列の寄託番号は：ヒトＮａＶ１．２ホモログは寄託番号Ｑ９９２５０．３に記載されるアミノ酸配列に対応し；チンパンジーＮａＶ１．２ホモログは寄託番号ＸＰ＿００３８２０９７０．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；アカゲザルＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＸＰ＿００１１００３６８．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；マレーヒヨケザルＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＸＰ＿００８５８２７２０．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ウシＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＮＰ＿００１１３７５８１．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒツジＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＸＰ＿０１４９４８８７０．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ヒトコブラクダＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＸＰ＿０１０９８０７６３．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；シャチＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＸＰ＿００４２８３６４１．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ウマＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＸＰ＿０１４５８８００１．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；マウスＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＮＰ＿００１０９２７６８．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ラットＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号Ｐ０４７７５．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ウサギＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＸＰ＿００８２５６９１５．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；ニワトリＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＮＰ＿００１２８０２１０．１に記載されるアミノ酸配列に対応し；アオウミガメＮａＶ１．２タンパク質は寄託番号ＸＰ＿００７０５６６９０．１に記載されるアミノ酸配列に対応する。

【0062】

特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ヒトＮａＶ１．２ホモログである。別の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は，マウスＮａＶ１．２ホモログである。

【0063】

一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ＣＡＣＮＧ１タンパク質である。一実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、ヒトＣＡＣＮＧ１タンパク質である。別の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、非ヒトＣＡＣＮＧ１タンパク質である。

【0064】

特定の例では、目的の膜貫通タンパク質は、ＳＬＣタンパク質である。ＳＬＣタンパク質は特徴付けられ、当業者に周知である。例えば、数百のヒト膜貫通ＳＬＣタンパク質が識別されており、例えばＬｉｎ、Ｌら Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．（２０１５）１４：８ ｐｐ．５４３－５６０、その内容全体は、参照により本明細書に明示的に援用される、に記載されるように、ＳＬＣタンパク質の多くのファミリーに組織化される。したがって、特定の実施形態において、目的の膜貫通タンパク質は、ＳＬＣタンパク質であり、例えば、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣＯ１Ｂ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＳＬＣＯ１Ｂ７、ＳＬＣＯ１Ｃ１、ＳＬＣＯ２Ａ１、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣＯ３Ａ１、ＳＬＣＯ４Ａ１、ＳＬＣＯ４Ｃ１、ＳＬＣＯ５Ａ１、ＳＬＣＯ６Ａ１、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ１Ａ４、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ１Ａ６、ＳＬＣ１Ａ７、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＬＣ２Ａ４、ＳＬＣ２Ａ５、ＳＬＣ２Ａ６、ＳＬＣ２Ａ７、ＳＬＣ２Ａ８、ＳＬＣ２Ａ９、ＳＬＣ２Ａ１０、ＳＬＣ２Ａ１１、ＳＬＣ２Ａ１２、ＳＬＣ２Ａ１３、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ３Ａ１、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ４Ａ２、ＳＬＣ４Ａ３、ＳＬＣ４Ａ４、ＳＬＣ４Ａ５、ＳＬＣ４Ａ７、ＳＬＣ４Ａ８、ＳＬＣ４Ａ９、ＳＬＣ４Ａ１０、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ５Ａ１、ＳＬＣ５Ａ２、ＳＬＣ５Ａ３、ＳＬＣ５Ａ４、ＳＬＣ５Ａ５、ＳＬＣ５Ａ６、ＳＬＣ５Ａ７、ＳＬＣ５Ａ８、ＳＬＣ５Ａ９、ＳＬＣ５Ａ１０、ＳＬＣ５Ａ１１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣ６Ａ１、ＳＬＣ６Ａ２、ＳＬＣ６Ａ３、ＳＬＣ６Ａ４、ＳＬＣ６Ａ５、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＬＣ６Ａ７、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＬＣ６Ａ９、ＳＬＣ６Ａ１０Ｐ、ＳＬＣ６Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１２、ＳＬＣ６Ａ１３、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ６Ａ１５、ＳＬＣ６Ａ１６、ＳＬＣ６Ａ１７、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ６Ａ１９、ＳＬＣ６Ａ２０、ＳＬＣ６Ａ２１Ｐ、ＳＬＣ７Ａ１、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＣ７Ａ３、ＳＬＣ７Ａ４、ＳＬＣ７Ａ５、ＳＬＣ７Ａ６、ＳＬＣ７Ａ７、ＳＬＣ７Ａ８、ＳＬＣ７Ａ９、ＳＬＣ７Ａ１０、ＳＬＣ７Ａ１１、ＳＬＣ７Ａ１３、ＳＬＣ７Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ１５Ｐ、ＳＬＣ８Ａ１、ＳＬＣ８Ａ２、ＳＬＣ８Ａ３、ＳＬＣ８Ｂ１、ＳＬＣ９Ａ１、ＳＬＣ９Ａ２、ＳＬＣ９Ａ３、ＳＬＣ９Ａ４、ＳＬＣ９Ａ５、ＳＬＣ９Ａ６、ＳＬＣ９Ａ７、ＳＬＣ９Ａ８、ＳＬＣ９Ａ９、ＳＬＣ９Ｂ１、ＳＬＣ９Ｂ２、ＳＬＣ９Ｃ１、ＳＬＣ９Ｃ２、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ１０Ａ２、ＳＬＣ１０Ａ３、ＳＬＣ１０Ａ４、ＳＬＣ１０Ａ５、ＳＬＣ１０Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ７、ＳＬＣ１１Ａ１、ＳＬＣ１１Ａ２、ＳＬＣ１２Ａ１、ＳＬＣ１２Ａ２、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＬＣ１２Ａ４、ＳＬＣ１２Ａ５、ＳＬＣ１２Ａ６、ＳＬＣ１２Ａ７、ＳＬＣ１２Ａ８、ＳＬＣ１２Ａ９、ＳＬＣ１３Ａ１、ＳＬＣ１３Ａ２、ＳＬＣ１３Ａ３、ＳＬＣ１３Ａ４、ＳＬＣ１３Ａ５、ＳＬＣ１４Ａ１、ＳＬＣ１４Ａ２、ＳＬＣ１５Ａ１、ＳＬＣ１５Ａ２、ＳＬＣ１５Ａ３、ＳＬＣ１５Ａ４、ＳＬＣ１５Ａ５、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１６Ａ３、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＬＣ１６Ａ５、ＳＬＣ１６Ａ６、ＳＬＣ１６Ａ７、ＳＬＣ１６Ａ８、ＳＬＣ１６Ａ９、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ１１、ＳＬＣ１６Ａ１２、ＳＬＣ１６Ａ１３、ＳＬＣ１６Ａ１４、ＳＬＣ１７Ａ１、ＳＬＣ１７Ａ２、ＳＬＣ１７Ａ３、ＳＬＣ１７Ａ４、ＳＬＣ１７Ａ５、ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ１７Ａ９、ＳＬＣ１８Ａ１、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＬＣ１８Ａ３、ＳＬＣ１８Ｂ１、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１９Ａ３、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＬＣ２０Ａ２、ＳＬＣ２２Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣ２２Ａ３、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２２Ａ５、ＳＬＣ２２Ａ６、ＳＬＣ２２Ａ７、ＳＬＣ２２Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ９、ＳＬＣ２２Ａ１０、ＳＬＣ２２Ａ１１、ＳＬＣ２２Ａ１２、ＳＬＣ２２Ａ１３、ＳＬＣ２２Ａ１４、ＳＬＣ２２Ａ１５、ＳＬＣ２２Ａ１６、ＳＬＣ２２Ａ１７、ＳＬＣ２２Ａ１８、ＳＬＣ２２Ａ２０Ｐ、ＳＬＣ２２Ａ２３、ＳＬＣ２２Ａ２４、ＳＬＣ２２Ａ２５、ＳＬＣ２２Ａ３１、ＳＬＣ２３Ａ１、ＳＬＣ２３Ａ２、ＳＬＣ２３Ａ３、ＳＬＣ２３Ａ４Ｐ、ＳＬＣ２４Ａ１、ＳＬＣ２４Ａ２、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ２４Ａ４、ＳＬＣ２４Ａ５、ＳＬＣ２５Ａ１、ＳＬＣ２５Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ３、ＳＬＣ２５Ａ４、ＳＬＣ２５Ａ５、ＳＬＣ２５Ａ６、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、ＳＬＣ２５Ａ１０、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＳＬＣ２５Ａ１２、ＳＬＣ２５Ａ１３、ＳＬＣ２５Ａ１４、ＳＬＣ２５Ａ１５、ＳＬＣ２５Ａ１６、ＳＬＣ２５Ａ１７、ＳＬＣ２５Ａ１８、ＳＬＣ２５Ａ１９、ＳＬＣ２５Ａ２０、ＳＬＣ２５Ａ２１、ＳＬＣ２５Ａ２２、ＳＬＣ２５Ａ２３、ＳＬＣ２５Ａ２４、ＳＬＣ２５Ａ２５、ＳＬＣ２５Ａ２６、ＳＬＣ２５Ａ２７、ＳＬＣ２５Ａ２８、ＳＬＣ２５Ａ２９、ＳＬＣ２５Ａ３０、ＳＬＣ２５Ａ３１、ＳＬＣ２５Ａ３２、ＳＬＣ２５Ａ３３、ＳＬＣ２５Ａ３４、ＳＬＣ２５Ａ３５、ＳＬＣ２５Ａ３６、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＳＬＣ２５Ａ３８、ＳＬＣ２５Ａ３９、ＳＬＣ２５Ａ４０、ＳＬＣ２５Ａ４１、ＳＬＣ２５Ａ４２、ＳＬＣ２５Ａ４３、ＳＬＣ２５Ａ４４、ＳＬＣ２５Ａ４５、ＳＬＣ２５Ａ４６、ＳＬＣ２５Ａ４７、ＳＬＣ２５Ａ４８、ＭＴＣＨ１、ＭＴＣＨ２、ＳＬＣ２５Ａ５１、ＳＬＣ２５Ａ５２、ＳＬＣ２５Ａ５３、ＳＬＣ２６Ａ１、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＣ２６Ａ３、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＬＣ２６Ａ６、ＳＬＣ２６Ａ７、ＳＬＣ２６Ａ８、ＳＬＣ２６Ａ９、ＳＬＣ２６Ａ１０、ＳＬＣ２６Ａ１１、ＳＬＣ２７Ａ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＬＣ２７Ａ３、ＳＬＣ２７Ａ４、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＣ２７Ａ６、ＳＬＣ２８Ａ１、ＳＬＣ２８Ａ２、ＳＬＣ２８Ａ３、ＳＬＣ２９Ａ１、ＳＬＣ２９Ａ２、ＳＬＣ２９Ａ３、ＳＬＣ２９Ａ４、ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ３０Ａ２、ＳＬＣ３０Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＣ３０Ａ５、ＳＬＣ３０Ａ６、ＳＬＣ３０Ａ７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＳＬＣ３０Ａ９、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＳＬＣ３１Ａ１、ＳＬＣ３１Ａ２、ＳＬＣ３２Ａ１、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ３４Ａ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ３４Ａ３、ＳＬＣ３５Ａ１、ＳＬＣ３５Ａ２、ＳＬＣ３５Ａ３、ＳＬＣ３５Ａ４、ＳＬＣ３５Ａ５、ＳＬＣ３５Ｂ１、ＳＬＣ３５Ｂ２、ＳＬＣ３５Ｂ３、ＳＬＣ３５Ｂ４、ＳＬＣ３５Ｃ１、ＳＬＣ３５Ｃ２、ＳＬＣ３５Ｄ１、ＳＬＣ３５Ｄ２、ＳＬＣ３５Ｄ３、ＳＬＣ３５Ｅ１、ＳＬＣ３５Ｅ２Ａ、ＳＬＣ３５Ｅ２Ｂ、ＳＬＣ３５Ｅ３、ＳＬＣ３５Ｅ４、ＳＬＣ３５Ｆ１、ＳＬＣ３５Ｆ２、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＬＣ３５Ｆ４、ＳＬＣ３５Ｆ５、ＳＬＣ３５Ｆ６、ＳＬＣ３５Ｇ１、ＳＬＣ３５Ｇ２、ＳＬＣ３５Ｇ３、ＳＬＣ３５Ｇ４、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＬＣ３５Ｇ６、ＳＬＣ３６Ａ１、ＳＬＣ３６Ａ２、ＳＬＣ３６Ａ３、ＳＬＣ３６Ａ４、ＳＬＣ３７Ａ１、ＳＬＣ３７Ａ２、ＳＬＣ３７Ａ３、ＳＬＣ３７Ａ４、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＬＣ３８Ａ２、ＳＬＣ３８Ａ３、ＳＬＣ３８Ａ４、ＳＬＣ３８Ａ５、ＳＬＣ３８Ａ６、ＳＬＣ３８Ａ７、ＳＬＣ３８Ａ８、ＳＬＣ３８Ａ９、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＳＬＣ３８Ａ１１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ２、ＳＬＣ３９Ａ３、ＳＬＣ３９Ａ４、ＳＬＣ３９Ａ５、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＬＣ３９Ａ７、ＳＬＣ３９Ａ８、ＳＬＣ３９Ａ９、ＳＬＣ３９Ａ１０、ＳＬＣ３９Ａ１１、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＳＬＣ３９Ａ１３、ＳＬＣ３９Ａ１４、ＳＬＣ４０Ａ１、ＳＬＣ４１Ａ１、ＳＬＣ４１Ａ２、ＳＬＣ４１Ａ３、ＲＨＡＧ、ＲＨＢＧ、ＲＨＣＧ、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ１、ＳＬＣ４４Ａ２、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ４５Ａ１、ＳＬＣ４５Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＳＬＣ４５Ａ４、ＳＬＣ４６Ａ１、ＳＬＣ４６Ａ２、ＳＬＣ４６Ａ３、ＳＬＣ４７Ａ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＬＣ４８Ａ１、ＦＬＶＣＲ１、ＦＬＶＣＲ２、ＳＬＣ４９Ａ３、ＳＬＣ４９Ａ４、ＳＬＣ５０Ａ１、ＳＬＣ５１Ａ、ＳＬＣ５１Ｂ、ＳＬＣ５２Ａ１、ＳＬＣ５２Ａ２、ＳＬＣ５２Ａ３、ＸＰＲ１、ＭＰＣ１、ＭＰＣ２、ＭＰＣ１Ｌ、ＬＥＴＭ１、ＬＥＴＭ２、ＬＥＴＭＤ１、ＳＦＸＮ１、ＳＦＸＮ２、ＳＦＸＮ３、ＳＦＸＮ４、ＳＦＸＮ５、ＮＩＰＡ１、ＮＩＰＡ２、ＮＩＰＡＬ１、ＮＩＰＡＬ２、ＮＩＰＡＬ３、ＮＩＰＡＬ４、ＭＡＧＴ１、ＴＵＳＣ３、ＭＦＳＤ２Ａ、ＭＦＳＤ２Ｂ、ＭＦＳＤ４Ａ、ＭＦＳＤ４Ｂ、ＭＦＳＤ５、ＡＮＫＨ、ＳＰＮＳ１、ＳＰＮＳ２、ＳＰＮＳ３、ＴＭＥＭ１６５、ＮＰＣ１、ＮＰＣ１Ｌ１、ＳＬＣ６６Ａ１、ＳＬＣ６６Ａ２、ＳＬＣ６６Ａ３、ＣＴＮＳおよびＭＰＤＵ１である。

【0065】

用語「内因性」は、宿主生物に自然に発現されるか、または細胞、組織もしくは生物に起源をもつポリペプチド、ポリヌクレオチド、もしくは他の組成物を指す。「外因性」とは、細胞、組織もしくは生物の外部に起源をもつ、または特定の宿主生物に外来性のポリペプチド、ポリヌクレオチド、もしくは他の組成物を指す。

【0066】

方法の一部の実施形態では、動物は、目的の膜貫通タンパク質またはその一部をコードする核酸で免疫化される。特定の実施形態では、核酸は、目的の完全長膜貫通タンパク質の短縮型をコードする。一部の実施形態では、目的の切断された膜貫通タンパク質は、一つ以上の細胞外ループドメイン、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分を含まない。特定の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分を含まない。その他の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のカルボキシ末端部分を含まない。一部の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインを含まない。

【0067】

一部の実施形態では、動物は、核酸を発現することができる担体に包含されている目的の膜貫通タンパク質またはその一部をコードする核酸で免疫化される。免疫で使用するための担体の非限定的な例として、プラスミド、発現ベクターなどのベクター、ならびにウイルス様粒子（ＶＬＰ）、照射細胞、エクソソーム、およびリポソームなどの細胞が挙げられる。用語「ベクター」は、コード情報を宿主細胞に伝達するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指すために使用される。ベクターの一例は、「発現ベクター」であり、宿主細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を有する、組み換え的にまたは合成的に作製された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であってもよい。特定の例では、発現ベクターは、プロモーターに操作可能に連結された転写される核酸を含む。例えば、「操作可能に連結される」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター転写因子結合部位のアレイ）と第二の核酸配列との機能的結合を指し、発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。

【0068】

一部の実施形態では、動物は、目的の膜貫通タンパク質またはその一部をコードする核酸を含むベクターで免疫化される。特定の実施形態では、動物は、目的の膜貫通タンパク質またはその一部をコードする核酸を含む発現ベクターで免疫化される。一実施形態では、動物は、目的の膜貫通タンパク質またはその一部をコードする核酸を含むプラスミドで免疫化される。

【0069】

一部の例では、免疫原は、静脈注射または腹腔内注射など、経時的な１回以上の注射によって宿主動物に投与される。特定の実施形態では、免疫原は、１回、２回、３回、４回以上の注射により、宿主哺乳動物に投与される。特に、免疫原は、３回の別個の注射によって投与される。

【0070】

動物に投与される免疫原の量は、公知の方法を使用して当業者によって容易に決定することができる。

【0071】

一部の例では、核酸免疫原は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で動物に注射される。特定の実施形態において、核酸免疫原は、０．５ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１２ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１１ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～１５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～４ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～３ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ～１２ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ～１２ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬ～１２ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ～１２ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ～１１ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ～１１ｍｇ／ｍＬまたは９．５ｍｇ／ｍＬ～１０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で動物に注射される。特定の実施形態では、核酸免疫原は、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、５．５ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍｇ／ｍＬ、６．５ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ、９．５ｍｇ／ｍＬ、１０．０ｍｇ／ｍＬ、１０．５ｍｇ／ｍＬ、１１．０ｍｇ／ｍＬ、１１．５ｍｇ／ｍＬ、１２．０ｍｇ／ｍＬ、１２．５ｍｇ／ｍＬ、１３．０ｍｇ／ｍＬ、１３．５ｍｇ／ｍＬ、１４．０ｍｇ／ｍＬ、１４．５ｍｇ／ｍＬ、１５．０ｍｇ／ｍＬ、１５．５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で動物に注射される。特定の実施形態では、核酸免疫原は、１．６ｍｇ／ｍＬの濃度で動物に注射される。一実施形態では、核酸免疫原は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で動物に注射される。

【0072】

一部の実施形態では、動物は、目的の膜貫通タンパク質またはその一部で免疫化される。特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質またはその一部は、ヒト起源である。他の実施形態では、動物は、目的の非ヒト膜貫通タンパク質で免疫化される。一部の実施形態では、動物は、目的の完全長マウス膜貫通タンパク質をコードする核酸で免疫化される。一部の実施形態では、動物は、目的の完全長膜貫通タンパク質で免疫化される。特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、切断される。一部の実施形態では、目的の切断された膜貫通タンパク質は、一つ以上の細胞外ループドメイン、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分を含まない。特定の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分を含まない。その他の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のカルボキシ末端部分を含まない。一実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインを含まない。

【0073】

特定の例では、タンパク質またはペプチド免疫原は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０．０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で動物に投与される。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチド免疫原は、０．１ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ～１５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ～８．０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ～７．０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ～６．０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ～３．０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ～２．０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～１０．０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～７．０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～６．０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～３ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１０．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～７．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～３．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～２．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～３．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～２．０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ～１０．０ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ～１０．０ｍｇ／ｍＬ、両端を含む、の濃度で動物に注射される。特定の実施形態では、ペプチドまたはペプチド免疫原は、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．３５ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．４５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．５５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．６５ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．８５ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、０．９５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、５．５ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍｇ／ｍＬ、６．５ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ、９．５ｍｇ／ｍＬ、１０．０ｍｇ／ｍＬ、１２．０ｍｇ／ｍＬ、１５．０ｍｇ／ｍＬ、２０．０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で動物に注射される。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチド免疫原は、０．９ｍｇ／ｍＬの濃度で動物に注射される。一実施形態では、タンパク質またはペプチド免疫原は、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で動物に注射される。別の実施形態では、タンパク質またはペプチド免疫原は、１．９ｍｇ／ｍＬの濃度で動物に注射される。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチド免疫原は、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で動物に注射される。

【0074】

特定の実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質または目的のキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列で免疫化される。本明細書で使用される場合、用語「キメラ」は、異なる種に由来する部分を有するタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸を指す。例えば、キメラタンパク質は、一つ以上のヒトドメインおよび少なくとも一つの非ヒトドメインを有してもよく、またはその逆であってもよい。キメラタンパク質をコードする核酸は、例えば、タンパク質の少なくとも一つのドメインをコードする非ヒト遺伝子に操作可能に連結されたタンパク質の一つ以上のドメインをコードするヒト遺伝子を有し得る。

【0075】

一つの非限定的な例では、キメラ核酸は、膜貫通タンパク質の異なる部分をコードするマウス遺伝子の一部に操作可能に連結された膜貫通タンパク質の第一の部分をコードするヒト遺伝子の一部を含む。一部の実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡで免疫化され、このＤＮＡはヒト膜貫通タンパク質の一つ以上の細胞外ループドメインをコードするヒト遺伝子配列、および膜貫通タンパク質のマウスホモログ由来のアミノ末端ドメインおよび／またはカルボキシ末端ドメインをコードするマウス遺伝子配列を含む。他の実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡで免疫化され、このＤＮＡはヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよび／またはカルボキシ末端ドメインをコードするＤＮＡ、および膜貫通タンパク質のマウスホモログの一つ以上の細胞外ループドメインをコードするＤＮＡを含む。一実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡで免疫化され、このＤＮＡはヒト膜貫通タンパク質由来の一つ以上の細胞外ループドメインをコードする遺伝子配列、および膜貫通タンパク質のマウスホモログ由来のアミノ末端ドメインをコードする配列を含む。特定の実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡで免疫化され、このＤＮＡはヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインをコードする遺伝子配列、および膜貫通タンパク質のマウスホモログ由来の一つ以上の細胞外ループドメインをコードする遺伝子配列を含む。特定の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｖｉタグ、またはＢｉｒ－Ａタグなどの検出可能な要素をコードするヌクレオチド配列も含むようにも改変される。

【0076】

一部実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質で免疫化され、目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの一部に操作可能に連結された目的のヒト膜貫通タンパク質の一部分を含む。一部の実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質で免疫化され、この目的のキメラ膜貫通タンパク質は、目的のヒト膜貫通タンパク質由来の一つ以上の細胞外ループドメイン、ならびに膜貫通タンパク質のマウスホモログ由来のアミノ末端ドメインおよび／またはカルボキシ末端ドメインを含む。一部の実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質で免疫化され、この目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来の一つ以上の細胞外ループドメイン、および膜貫通タンパク質のマウスホモログ由来のアミノ末端ドメインを含む。一部の実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質で免疫化され、この目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよび／またはカルボキシ末端ドメイン、ならびに膜貫通タンパク質のマウスホモログ由来の一つ以上の細胞外ループドメインを含む。一部の実施形態では、動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質で免疫化され、この目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよび膜貫通タンパク質のマウスホモログ由来の一つ以上の細胞外ループドメインを含む。特定の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｖｉタグ、またはＢｉｒ－Ａタグなどの検出可能な要素も含む。一実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ＨｉｓタグおよびＦＬＡＧタグを含む。

【0077】

特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質または核酸免疫原が改変される。一部の実施形態では、免疫原は、目的の改変された膜貫通タンパク質、または一つ以上の安定化アミノ酸置換を含む、それをコードするＤＮＡである。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質または核酸免疫原は、標識、マーカーまたは特徴などの一つ以上の検出可能な要素を含むように改変される。一実施形態では、改変された免疫原は、検出可能な標識を含む目的の膜貫通タンパク質である。特定の実施形態では、検出可能な標識は、ＦＬＡＧ－タグ、Ａｖｉ－タグ、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－タグ）、Ｂｉｒ－Ａ－タグ、またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、検出可能な標識は、膜貫通タンパク質免疫原のアミノ末端またはカルボキシ末端に位置する。一実施形態では、膜貫通タンパク質免疫原は、カルボキシ末端に貼り付けられたＦＬＡＧ－タグおよびＨｉｓ－タグを有する。

【0078】

本方法で使用するためのタンパク質は、当該技術分野で公知の方法によって作製することができる。例えば、目的の膜貫通タンパク質またはその一部は、適切な核酸によってコードされ、細胞内に発現され得る。目的の膜貫通タンパク質をコードする適切な核酸分子は、当技術分野で周知のように、標準的なクローニング技術、部位特異的変異誘発、およびＰＣＲを使用して作製され得る。適切な発現系として、例えば、細菌または酵母における構成的もしくは誘導性の発現系、バキュロウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびレンチウイルスなどのウイルス発現系、または昆虫もしくは哺乳類細胞における一過性トランスフェクションが挙げられる。適切な宿主細胞としては、大腸菌、ラクトコッカス乳酸、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス、スポドプテラ・フルギペルダ、およびイラクサギンウワバ細胞が挙げられる。適切な哺乳類宿主細胞としては、ＨＥＫ ２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＤＴ４０が挙げられる。適切な昆虫宿主細胞は、Ｓｆ９細胞およびＳ２細胞を含む。

【0079】

特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質またはその一部を含むタンパク質免疫原は、細胞中で発現され、免疫原タンパク質は、細胞によって産生され、免疫化のための精製タンパク質免疫原を提供するために精製される。

【0080】

特定の実施形態では、動物は、例えば、脂質二重層膜足場タンパク質複合体、ＶＬＰ、細胞、エクソソームおよびリポソームなどの担体に包含される目的の膜貫通タンパク質またはその一部で免疫化することができる。

【0081】

「脂質二重層膜足場タンパク質複合体」は、少なくとも一つの膜足場タンパク質（ＭＳＰ）との複合体中、すなわち少なくとも一つのＭＳＰによって結合された脂質二重層を含む組成物を意味する。脂質二重層膜足場タンパク質複合体が記述されている。例えば、Ｉｎａｇａｋｉ、Ｓ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｎａｎｏｄｉｓｃｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３）５９（３）：２８７－３００を参照されたい、その内容全体は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、例えば、二つの膜足場タンパク質によって囲まれ、安定化した円板状のリン脂質二重層として形成され得る。任意の一つの理論に拘束されるものではないが、複合体の形成および機能は、ＭＳＰの脂質比およびＭＳＰの長さによって調節される。例えば、ＭＳＰに対する脂質の比を調整して、脂質二重層膜足場タンパク質複合体の均一な集団または均一でない集団を生成することができる。さらに、天然のような環境を提供するために、ＭＳＰタンパク質は、膜貫通タンパク質または目的のタンパク質、脂質二重層形成の両方のための空間およびを提供する複合体を形成するのに十分な大きさであるべきである。

【0082】

本明細書で使用される場合、用語「膜足場タンパク質」または「ＭＳＰ」は、例えば、Ｓｃｈｕｌｅｒ、Ｍ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１３；９７４：４１５－４３３、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、に記載されるような、両親媒性アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（Ａｐｏ－ＡＩ）に由来する両親媒性らせん状のタンパク質のクラスを指す。膜足場タンパク質には、脂質疎水性テイルに接触するらせん体の内側上に疎水性残基を含む両親媒性らせん体、および外向き（脂質から離れて）の親水性残基が含まれる。膜足場タンパク質は、ＭＳＰアミノ酸配列の一部分における一つ以上のらせん体ドメインの欠失または挿入によって異なるサイズであってもよく、それにより、異なるサイズの脂質二重層－ＭＳＰ複合体の形成が可能となる。ＭＳＰの構造および機能は、脂質結合タンパク質のサポシンファミリーと異なることが理解される。

【0083】

一部の例では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、以下の例示的なＭＳＰから選択される少なくとも一つの膜足場タンパク質を含む：ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ１Ｅ１、ＭＳＰ１Ｅ２、ＭＳＰ１Ｅ３、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１、ＭＳＰ１Ｄ１、ＭＳＰ１Ｄ２、ＭＳＰ２Ｎ１、ＭＳＰ２Ｎ３、およびＭＳＰ２Ｎ２。

【0084】

いくつかの実施形態では、膜足場タンパク質は、構造ＦＸ－Ｈ１－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０［配列番号１２］を含むＭＳＰ１であり、式中、ＦＸは、アミノ酸配列ＭＧＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲ［配列番号１］を有する膜足場タンパク質のＮ末端ドメインであり、Ｈ１は、アミノ酸配列ＬＫＬＬＤＮＷＤＳＶＴＳＴＦＳＫＬＲＥＱＬＧ［配列番号２］を有するＨｅｌｉｘ １であり、Ｈ２は、アミノ酸配列ＰＶＴＱＥＦＷＤＮＬＥＫＥＴＥＧＬＲＱＥＭＳ［配列番号３］を有するＨｅｌｉｘ ２であり、Ｈ３は、アミノ酸配列ＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱ［配列番号４］を有するＨｅｌｉｘ ３であり、Ｈ４は、アミノ酸配列ＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥ［配列番号５］を有するＨｅｌｉｘ ４であり、Ｈ５は、アミノ酸配列ＰＬＲＡＥＬＱＥＧＡＲＱＫＬＨＥＬＱＥＫＬＳ［配列番号６］を有するＨｅｌｉｘ ５であり、Ｈ６は、アミノ酸配列ＰＬＧＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＶＤＡＬＲＴＨＬＡ［配列番号７］を有するＨｅｌｉｘ ６であり、Ｈ７は、アミノ酸配列ＰＹＳＤＥＬＲＱＲＬＡＡＲＬＥＡＬＫＥＮＧＧ［配列番号８］を有するＨｅｌｉｘ ７であり、Ｈ８は、アミノ酸配列ＡＲＬＡＥＹＨＡＫＡＴＥＨＬＳＴＬＳＥＫＡＫ［配列番号９］を有するＨｅｌｉｘ ８であり、Ｈ９はアミノ酸配列ＰＡＬＥＤＬＲＱＧＬＬ［配列番号１０］を有するＨｅｌｉｘ ９であり、Ｈ１０はアミノ酸配列ＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴＱ［配列番号１１］を有するＨｅｌｉｘ １０である。いくつかの実施形態では、膜足場タンパク質は、構造ＦＸ－Ｈ１－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０－ＧＴ－Ｈ１－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０［配列番号１３］を含むＭＳＰ２である。いくつかの実施形態では、膜足場タンパク質は、ＭＳＰ１アミノ酸配列に挿入された一つ以上の２２アミノ酸両親媒性らせん体を含む伸長した膜足場タンパク質である。こうした一実施形態では、伸長膜足場タンパク質は、構造Ｈ１－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０［配列番号１４］を含むＭＳＰ１Ｅ１であり、それによって、ＭＳＰ１のアミノ酸配列は、重複した「Ｈ４」を有することによって伸長される。別の実施形態では、伸長膜足場タンパク質は、構造ＦＸ－Ｈ１－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０［配列番号１５］を含むＭＳＰ１Ｅ２であり、それによって、ＭＳＰ１のアミノ酸配列は、重複した「Ｈ４－Ｈ５」を有することによって伸長される。さらに別の実施形態では、伸長膜足場タンパク質は、構造ＦＦＸ－Ｈ１－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０［配列番号１６］を含むＭＳＰ１Ｅ３であり、それによって、ＭＳＰ１のアミノ酸配列は、重複した「Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６」を有することによって伸長される。

【0085】

特定の実施形態では、膜足場タンパク質は、構造ＴＥＶ－Ｈ１Δ（１－１１）－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０［配列番号１７］を含むＭＳＰ１Ｄ１であり、それによって、ＴＥＶは、アミノ酸配列ＭＧＨＨＨＨＨＨＨ ＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧ［配列番号１８］を有する改変されたＮ末端ドメインであり、Ｈ１Δ（１－１１）は、アミノ酸配列ＳＴＦＳＫＬＲＥＱＬＧ［配列番号１９］を有する切断されたＨ１らせん体ドメインである。いくつかの実施形態では、膜足場タンパク質は、構造ＴＥＶ－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０［配列番号２０］を含むＭＳＰ１Ｄ２である。いくつかの実施形態では、膜足場タンパク質は、構造ＴＥＶ－Ｈ１Δ（１－１１）－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０－ＧＴ－Ｈ１Δ（１－１１）－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０［配列番号２１］を有するＭＳＰ２Ｎ１である。別の実施形態では、膜足場タンパク質は、構造ＴＥＶ－Ｈ１Δ（１－１１）－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０－ＧＴ－Ｈ１Δ（１－１１）－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０［配列番号２２］を有するＭＳＰ２Ｎ２である。さらに別の実施形態では、膜足場タンパク質は、構造ＴＥＶ－Ｈ１Δ（１－１１）－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０－ＧＴ－Ｈ１Δ（１－１７）－Ｈ２－Ｈ３－Ｈ４－Ｈ５－Ｈ６－Ｈ７－Ｈ８－Ｈ９－Ｈ１０［配列番号２４］を有するＭＳＰ２Ｎ３であり、それによって、Ｈ１Δ（１－１７）は、アミノ酸配列ＲＥＱＬＧ［配列番号２３］を有する切断されたＨ１らせん体ドメインである。

【0086】

特定の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、二つのＭＳＰを含む。一実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、ベルトのように、二つのＭＳＰ（例えば、ＭＳＰの二つの分子）によって囲まれた円板状のリン脂質二重層である。一実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１の二つの分子によって囲まれた円板状のリン脂質二重層である。

【0087】

一部の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、検出可能な標識を含む。特定の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、少なくとも二つの標識された膜足場タンパク質と、複数の脂質を含有する。特定の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、二つの標識された膜足場タンパク質および脂質二重層を含有する。いくつかの実施形態では、標識された膜足場タンパク質は、同一であるか、または異なっている。検出可能な標識は、当該技術分野で公知の任意の検出可能な標識とすることができる。例えば、検出可能な標識は、蛍光分子、Ｈｉｓ－タグおよびＦＬＡＧ－タグを含む。例示的な実施形態では、一つ以上の膜足場タンパク質は、ビオチン化のためのＢｉｒ－ＡタグまたはＡｖｉ－タグなどの検出可能なマーカーで標識される。特定の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中の全てのＭＳＰは、ビオチン化される。ビオチン化は、例えば、膜足場タンパク質を化学的にビオチン化することによって、またはＡｖｉ－タグもしくはＢｉｒ－ＡタグをＭＳＰ核酸コード配列内に遺伝子導入し、公知の技術を使用して改変タンパク質を産生することによって実施することができる。

【0088】

脂質二重層膜足場タンパク質複合体の脂質二重層部分が再構成される。脂質は、例えばスフィンゴ脂質および／またはリン脂質などの脂質の二層を形成することができる。複合体の脂質組成物は、例えば、複合体に含まれる特定の目的の膜貫通タンパク質の天然の細胞型に基づいて変化し得る。例えば、大腸菌膜は、７０～８０％のホスファチジルエタノールアミン、１５～２０％のホスファチジルグリセロール、および５％のカルジオリピンを含有する一方、ラット肝細胞膜は、１４～２０％のホスファチジルエタノールアミン、３２～４７％のホスファチジルコリン、８％のホスファチジルイノシトール、４～８％のホスファチジルセリン、および１３～１４％のスフィンゴミエリンを含有する。Ｉｎａｇａｋｉ、Ｓ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３）５９（３）：２８７－３００を参照されたい。したがって、脂質二重層膜足場タンパク質複合体の脂質組成物は、単一のタイプの脂質、または単一のタイプの脂質よりも多い脂質を含み得る。特定の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体を形成する脂質は、合成脂質または組換え産生脂質である。

【0089】

一部の実施形態では、脂質二重層は、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、およびそれらの誘導体の一つ以上からなる。特定の実施形態では、脂質二重層は、１－ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１－パルミトイル２－オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳ）、パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１′－ｒａｃ－グリセロール）（ＰＯＰＧ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＰＯＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）またはその組み合わせからなる。特定の実施形態では、脂質二重層は、複数のＰＯＰＣリン脂質を含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＧ、およびＰＯＰＳの一つ以上の複数の脂質を含む膜足場タンパク質の周りに円板状のリン脂質二重層を形成する脂質を含む。特定の実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、二つの膜足場タンパク質の周りに円板状のリン脂質二重層を形成する複数のＰＯＰＣ脂質を含む。こうした一実施形態では、脂質に対するＭＳＰの比は、１：１００～１：１５０、１：１１０～１：１４０、１：１２０～１：１４０、１：１２０～１：１４０、１：１２０～１：１３０、および１：１２５～１：１３５、両端を含む、である。他の実施形態では、脂質に対するＭＳＰの比は、１：１００、１：１１０、１：１１１、１：１１２、１：１１３、１：１１４、１：１１５、１：１１６、１：１１７、１：１１８、１：１１９、１：１２０、１：１２１、１：１２２、１：１２３、１：１２４、１：１２５、１：１２６、１：１２７、１：１２８、１：１２９、１：１３０、１：１３１、１：１３２、１：１３３、１：１３４、１：１３５、１：１３６、１：１３７、１：１３８、１：１３９、１：１４０、１：１４１、１：１４２、１：１４３、１：１４４、１：１４５、１：１４６、１：１４７、１：１４８、１：１４９または１：１５０、両端を含む、である。

【0091】

特定の例では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体はまた、少なくとも一つの抗原を含む。特定の実施形態では、抗原は、目的の膜貫通タンパク質またはその一部である。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質、目的の切断膜貫通タンパク質、目的のキメラ膜貫通タンパク質である。一部の実施形態では、目的の切断された膜貫通タンパク質は、一つ以上の細胞外ループドメイン、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分を含まない。特定の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分を含まない。特定の実施形態では、目的の切断された膜貫通タンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の少なくとも膜貫通部分全体を含む。その他の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のカルボキシ末端部分を含まない。一実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインを含まない。一部の実施形態では、切断されたタンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、目的の膜貫通タンパク質のドメインにかかる一つ以上の膜の間のＮ末端細胞外ドメイン、Ｃ末端細胞外ドメイン、および／または細胞外ループドメインを含む。その他の実施形態では、抗原は、本明細書に記載の目的のキメラ膜貫通タンパク質またはその一部である。

【0092】

一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質またはその部分などの抗原を含む脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、抗原の単一分子を含む（例えば、脂質二重層ＭＳＰ複合体につき、またはナノディスクにつき、膜貫通タンパク質またはその部分の一つのコピー）。一部の実施形態では、抗原を含む脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、抗原の複数の分子を含む（例えば、脂質二重層ＭＳＰ複合体につき、またはナノディスクにつき、膜貫通タンパク質またはその部分の複数のコピー）。

【0093】

目的の膜貫通タンパク質またはその一部を包含するものを含む脂質二重層膜足場タンパク質複合体の形成は、当技術分野に公知の方法を使用して実施することができる。例えば、Ｂａｙｂｕｒｔ ＴＨら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．（２００６）４５０：２１５－２２２、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる、を参照されたい。一般的に、脂質二重層膜足場タンパク質複合体の形成は、脂質、ＭＳＰ、および該当する場合には膜貫通タンパク質を混合することによって複合体の自己組織化を含む。典型的には、膜貫通タンパク質は、一つ以上の洗剤を使用して精製される。一部の実施形態では、精製された膜貫通タンパク質は、脂質およびＭＳＰと混合されて、膜貫通タンパク質を含む脂質二重層膜足場タンパク質複合体を形成する。一部の実施形態では、精製された膜貫通タンパク質は、一つ以上の洗剤（例えば、洗剤可溶化画分）の存在下で提供され、脂質およびＭＳＰと混合され、次いで一つ以上の洗剤が除去されて、複合体構造の形成を誘導する。

【0094】

一部の例では、精製工程を使用して、目的のタンパク質を含む複合体を、含まない複合体（すなわち、空の複合体）から分離することができる。精製は、親和性タグなどの複合体に含まれる目的の膜貫通タンパク質上に一つ以上の検出可能な標識を組み込み、一つ以上の標識を選択することによって達成することができる。親和性タグとして使用するための検出可能な標識の例には、限定されるものではないが、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって認識され得るＨｉｓタグ、ＦＬＡＧ Ｍ１抗ＦＬＡＧ免疫親和性クロマトグラフィー用のＦＬＡＧタグ、および１Ｄ４樹脂を使用した１Ｄ４タグが含まれる。分子ふるいクロマトグラフィーは、例えば、ＳＤＳページおよびウェスタンブロット分析を実施して、目的の膜貫通タンパク質またはその一部を含む脂質二重層膜足場タンパク質複合体の存在を識別および／または確認することによっても利用することができる。目的の膜貫通タンパク質およびＭＳＰの両方が検出可能な標識を含む実施形態では、ＭＳＰ上の少なくとも一つの標識と、目的の膜貫通タンパク質上の一つの標識とが異なる場合がある。

【0095】

特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質またはその一部を含有する脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、最初に、目的の膜貫通タンパク質を洗剤（例えば、Ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ）など）中で可溶化し、次いで、コール酸可溶化リン脂質および膜足場タンパク質と混合し、その後、洗剤を除去することによって形成され得る。一部の例では、洗剤は、バイオビーズを使用して混合物から抽出されてもよく、目的の精製された膜貫通タンパク質を統合する円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体のアセンブリを可能にする。次いで、目的の膜貫通タンパク質を組み込む、円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体を、親和性精製ビーズを使用して、膜貫通タンパク質を含まない円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体から単離することができる。例えば、目的の膜貫通タンパク質が、そのｃ末端またはｎ末端に、対応する「タグ」配列を含有する場合、抗「タグ」抗体（例えば、ＦＬＡＧ－タグ、Ｈｉｓ－タグ、ＨＡ－タグなど、そのようなタグは当該技術分野で周知である）を有するビーズである。さらなる精製は、分子ふるいクロマトグラフィーによって達成され得る。

【0096】

特定の例では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体に組み込まれる免疫原は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０．０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で、動物に投与される。特定の実施形態において、免疫原は、０．２ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～７．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～４．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～３．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～２．０ｍｇ／ｍＬまたは２．０ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬ、両端を含む、の濃度で動物に注射される。特定の実施形態では、免疫原は、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．５５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．６５ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．８５ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、０．９５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、５．５ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍｇ／ｍＬ、６．５ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ、９．５ｍｇ／ｍＬ、１０．０ｍｇ／ｍＬ、１２．０ｍｇ／ｍＬ、１５．０ｍｇ／ｍＬ、２０．０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で動物に注射される。一実施形態では、脂質二重層膜足場タンパク質複合体に組み込まれた目的の免疫原の膜貫通タンパク質は、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で動物に注射される。

【0097】

特定の実施形態では、動物は、照射細胞などの免疫原を発現する細胞で免疫化することができる。一つの特定の実施形態では、動物は、本明細書に記載される目的の免疫原の膜貫通タンパク質、その改変型、またはその一部を発現する細胞で免疫化することができる。

【0098】

一部の実施形態では、動物は、動物において目的の膜貫通タンパク質を発現するＶＬＰまたはエクソソームで免疫化することができる。特定の実施形態では、動物は、目的の膜貫通タンパク質、その改変型、またはその一部をコードする核酸を含むＶＬＰで免疫化することができる。

【0099】

一部の例では、動物は、例えば、タンパク質もしくはペプチド、改変されたタンパク質もしくはペプチド、核酸、改変された核酸、ＶＬＰおよび本明細書に記載の目的の膜貫通タンパク質もしくはその部分を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体で免疫化される。

【0100】

免疫化される動物は、任意の動物であってもよい。特定の実施形態では、動物は哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、ヤギ、ヒト、ハムスター、ブタ、サル、またはモルモットである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトではない。特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、またはヤギである。特定の実施形態では、哺乳動物は、マウスである。別の実施形態では、哺乳動物は、例えば、免疫原に曝露されたヒトなどのヒトである。

【0101】

一部の例では、免疫された動物は遺伝子操作される。遺伝子改変は、タンパク質をコードする遺伝子を削除または遮断するために使用されるものなど、公知の方法によって実施することができる。例えば、動物が内因性遺伝子座位から目的の膜貫通タンパク質（すなわち、抗原）を発現しないように（例えばノックアウト）、動物を遺伝子操作することができる。一例として、遺伝子操作された非ヒト哺乳動物は、例えば、内因性マウス膜貫通タンパク質の遺伝子座または内因性遺伝子の不活性化（例えば、完全または部分的に欠失）に対する遺伝子改変の結果として、目的の内因性マウス膜貫通タンパク質を発現することができないマウスである。

【0102】

特定の実施形態において、遺伝子操作された動物は、例えば、マウス、ヤギまたはラットなどの非ヒト哺乳動物であり、この非ヒト哺乳動物は、ゲノムに、（ｉ）一つ以上のヒト可変重鎖遺伝子セグメントを含む一つ以上のヒト化免疫グロブリン重鎖座位、（ｉｉ）一つ以上のヒト可変軽鎖遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および／または（ｉｉｉ）一つ以上のヒト可変軽鎖遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン軽鎖座位（例えば、κおよび／またはλ）を（例えば、交配または複数遺伝子標的化戦略を介して）含む。本明細書で使用される場合、用語「ヒト化」は、ヒト配列を含むように改変されたものを含む。例えば、ヒト化座位は、ヒト配列（例えば、遺伝子セグメントまたは遺伝子）を含むように改変された座位（例えば、内因性座位）である。

【0103】

一部の実施形態では、遺伝子操作された動物は、例えば、マウス、ヤギ、またはラットなどの非ヒト哺乳動物であり、そのゲノム中に、一つ以上のヒト可変重鎖遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖座位を含む。

【0104】

一部の実施形態では、遺伝子操作された動物は、例えば、マウス、ヤギ、またはラットなどの非ヒト哺乳動物であり、そのゲノム中に、一つ以上のヒト可変軽鎖遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。

【0105】

一部の実施形態では、遺伝子操作された動物は、例えば、マウス、ヤギ、またはラットなどの非ヒト哺乳動物であり、そのゲノム中に、一つ以上のヒト可変軽鎖遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン軽鎖座位（例えば、κおよび／またはλ）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された動物は、一つ以上のヒトカッパ可変（Ｖκ）遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された動物は、一つ以上のヒトラムダ可変（Ｖλ）遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。

【0106】

一部の実施形態では、ヒトイムノグロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）をコードする核酸配列および／またはヒトイムノグロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）をコードする核酸配列を含む遺伝子操作された動物は、目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性遺伝子も欠く場合もある。

【0107】

他の例では、動物は、目的の膜貫通タンパク質の内因性ホモログを発現する、「野生型」動物である。

【0108】

一部の実施形態では、遺伝子操作された動物（例えば、ラットまたはマウス）は、とりわけ重鎖を含む抗体を産生し、各重鎖は、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）の重鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒト重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された動物（例えば、ラットまたはマウス）は、とりわけ免疫グロブリン鎖を含む抗体を産生し、各免疫グロブリン鎖は、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）の重鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒト軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された動物（例えば、ラットまたはマウス）は、とりわけκ軽鎖を含む抗体を産生し、各κ軽鎖は、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトκ軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された動物（例えば、ラットまたはマウス）は、とりわけλ軽鎖を含む抗体を産生し、各λ軽鎖は、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された動物（例えば、ラットまたはマウス）は、とりわけ軽鎖を含む抗体を産生し、各軽鎖は、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された動物（例えば、ラットまたはマウス）は、とりわけλ軽鎖を含む抗体を産生し、各λ軽鎖は、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む。

【0109】

一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト哺乳動物（例えば、ラットまたはマウス）は、例えば、米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、第８，７９１，３２３号、第９，２２６，４８４号、およびＷＯ２０１９／１１３０６５に記述されるとおりであり、それらすべてが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。繁殖（または「交配」または「交雑」）は、当技術分野で容易に入手可能なプロトコルに従って行うことができる。例えば、ＪｏＶＥ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｗｅａｎｉｎｇ，ＪｏＶＥ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ，（２０１８）（ｖｉｄｅｏ ａｒｔｉｃｌｅ）；Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｉｃｅ、Ａ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｍａｎｕａｌ，（コピーライト）２００７ Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（すべては参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。あるいは、操作されたＩｇλ軽鎖座位を、ヒト化ＩｇＨ座位および／またはヒト化Ｉｇκ座位を含むＥＳ細胞に操作することができ、得られたＥＳ細胞を使用して、遺伝子操作された動物を生成するか、またはヒト化Ｉｇλ軽鎖座位を含む遺伝子操作された動物を、ヒト化ＩｇＨ座位および／またはヒト化Ｉｇκ座位を含む別の遺伝子操作された動物と交雑させてもよい。ヒト化ＩｇＨ座位および／またはヒト化Ｉｇκ座位を含む様々な遺伝子操作された動物が公知であり、例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）系統（例えば、米国特許第８，５０２，０１８号および／または第８，６４２，８３５号を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）系統（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ、Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５（２）：１４６－５６ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ａ．ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５－３５を参照、参照によりその全体が組み込まれる）、がある。

【0110】

一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作された動物は、米国特許第９，７９６，７８８号；第９，９６９，８１４号；米国特許公開第２０１１／０１９５４５４Ａ１号、第２０１２／００２１４０９Ａ１号、第２０１２／０１９２３００Ａ１号、第２０１３／００４５４９２Ａ１号、第２０１３／０１８５８２１Ａ１号、第２０１３／０３０２８３６Ａ１号；国際特許出願公開第２０１１／０９７６０３号、第２０１２／１４８８７３号、第２０１３／１３４２６３号、第２０１３／１８４７６１号、第２０１４／１６０１７９号、第２０１４／１６０２０２号（それら全てが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される限定された免疫グロブリン軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類動物は、ＷＯ２０１９／１１３０６５、ＷＯ２０１７２１４０８９、ＵＳ２０１８０１２５０４３、ならびに米国特許第９，０３５，１２８号、第９，０６６，５０２号、第９，１６３，０９２号、第９，１５０，６６２号、第９，３３４，３３３号、第９，００６，５１１号、第９，０２９，６２８号、第９，２０６，２６１号、第９，０１２，７１７号、第９，３９４，３７３号、第９，２０６，２６２号、第９，２０６，２６３号、第９，２２６，４８４号、第９，５４０，４５２号、および第９，３９９，６８３号、それら全てが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、に記載の免疫グロブリン軽鎖座位を含む。

【0111】

動物が免疫化されると、抗原特異的イムノアッセイを使用して、免疫原に対する動物の免疫反応がモニターされる。動物における体液性免疫反応は、目的の膜貫通タンパク質（抗原）に特異的な血清中の抗体の力価に基づいて決定され得る。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーベースのアッセイを含む、抗体力価を決定するために様々なアッセイを用いることができる（例えば、Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８９、１（２．０．１～２．０．３）（２０１０）を参照）；Ｈｅｎｒｉ Ｖ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｙｄｅら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｓｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｌａｒｉａ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌｔｒｙ，Ｖｏｌ．Ｖｏｌ．７１Ａ（４）：２４２～２５０（２００７）；両方とも参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、アッセイは、細胞表面上に目的の膜貫通タンパク質を発現するか、または発現するように操作された細胞を利用し、抗体力価は、細胞への抗体結合を測定することによって決定することができる。

【0112】

適切な免疫応答が達成されると、免疫された動物から細胞集団が収集される。細胞は、免疫された動物の脾臓、リンパ節、骨髄、および末梢血を含むがこれに限定されない、多数の供給源から収集され得る。一実施形態では、細胞は、免疫された動物の脾臓、すなわち脾細胞の集団から得られた細胞の集団である。一部の実施形態では、細胞集団は、免疫された動物の異なる組織、臓器または領域由来の細胞を含有する、細胞の不均一な集団である。特定の実施形態では、細胞集団は、免疫された動物の脾臓などの一つの臓器から取得される、細胞の均一な集団である。一実施形態では、細胞の集団は、脾臓、リンパ節および骨髄の一つ以上に由来する組織由来細胞を含む。他の実施形態では、細胞集団は、免疫された動物の血液から取得される。

【0113】

免疫された動物から収集された細胞は、（Ｂ細胞活性化の結果として）天然に、または組み換え技術および遺伝子工学（ハイブリドーマ細胞など）の結果として）、抗体を発現する細胞を指す、「抗体産生細胞」を含む。したがって、用語「抗体産生細胞」は、リンパ球などの免疫細胞を包含する。特定の非限定的な例では、リンパ球は、抗体を発現するメモリーＢ細胞、形質芽細胞、および最終分化形質細胞、ならびに抗体を発現するように操作されたハイブリドーマおよび非リンパ様細胞などの組み換え細胞を含む、抗原依存性Ｂ細胞系統でありうる。さらに、「抗体産生細胞」は、発現された抗体が細胞膜、すなわち細胞表面抗体、および抗体を分泌する細胞に結合または固定される細胞を包含する。

【0114】

特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、免疫された動物の脾臓、リンパ節、骨髄、または末梢血由来である。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、末梢血細胞、Ｂ細胞、形質細胞、形質細胞性骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、例えば、ハイブリドーマなどの組み換え細胞を含む。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、例えば、Ｂ細胞などのリンパ球集団である。一実施形態では、抗体産生細胞の集団は、メモリーＢ細胞から構成される。

【0115】

また、一部の例では、さらなる抗体産生細胞は、本開示の方法によって取得される抗体産生細胞の開始集団から誘導されてもよい。そのため、細胞株、形質細胞、メモリーＢ細胞、ハイブリドーマ、形質細胞性骨髄腫、および組み換え抗体発現細胞は、抗体産生細胞から誘導または取得され得る。例えば、抗体産生細胞は、ハイブリドーマを作製するために骨髄腫細胞に融合されてもよく、またはウイルス（例えば、ＥＢＶ）に感染するなど、そうでなければ不死化されてもよく、または特定のＢ細胞型によって発現されるタンパク質マーカーに基づいて細胞選別技術によって分化されてもよい。

【0116】

特定の実施形態では、用語「抗体産生細胞」は、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する細胞を意味する。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体は、細胞表面に位置する。特定の例では、抗体産生細胞の集団は、抗体産生細胞の不均一な集団であり、この集団は、複数の抗原に対する抗体を発現する抗体産生細胞を含有する。特定の一実施形態では、抗体産生細胞の集団は、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞と、少なくとも一つの他の抗原を含有する、抗体産生細胞の不均一な集団である。他の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、たった一つの抗原に結合する抗体を発現する抗体産生細胞を含有する、抗体産生細胞の均一な集団であってもよい。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞を含む、抗体産生細胞の均一な集団である。

【0117】

表１～５に示すように、様々な異なる免疫原を有する動物および免疫原の組み合わせの免疫化は、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞の集団を含む、抗体産生細胞の生成をもたらした。表１～５はまた、目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性遺伝子を発現しない遺伝子操作された動物の免疫が、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞を生成したことも示す。

【0118】

目的の膜貫通タンパク質に抗体を発現する抗体産生細胞の採取。
本明細書に記載されるように、膜貫通タンパク質に対する抗体の生成に対する障害には、目的の膜貫通タンパク質に対する抗体を産生する抗体または細胞に対して、十分な量の立体構造的に正確な膜貫通タンパク質抗原を提供することができないことを含む。例えば、精製された内因性膜貫通タンパク質は、その天然膜環境から単離されると立体構造的に損なわれ、現在の脂質ベースおよび細胞ベースの膜調製物は、高レベルの非特異的結合をもたらし、製剤化することが困難であり、展開されたまたは不適切に折り畳まれた膜貫通タンパク質抗原のサブセットを供給することが多い。

【0119】

本開示は、脂質二重層膜足場タンパク質複合体を利用して、抗体産生細胞によって産生された抗体に膜貫通タンパク質抗原を提示することによって、かかる障害を克服する。より詳細には、目的の膜貫通タンパク質、ならびに天然細胞の膜に共通して存在する脂質および膜足場タンパク質を含む複合体を利用して、その膜貫通タンパク質を抗体への天然の立体構造に提示する。このように、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、自然界で入手しやすい膜貫通タンパク質上のエピトープに結合する集団において、抗体（または抗体を発現する細胞）の特定のサブセットを識別し、回収するために、本発明の方法に使用される。

【0120】

目的の膜貫通タンパク質を含む脂質二重層膜足場タンパク質複合体が形成されると、その複合体は、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞の集団を検出および単離するためのソーティング剤として使用され得る。例えば、抗体産生細胞の異種集団は、本明細書に記載されるように免疫化された哺乳動物から取得することができ、次いで、抗体産生細胞の集団は、細胞によって産生される抗体に目的の抗原の膜貫通タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体と接触することができる。次いで、抗体産生細胞の複合体および集団をインキュベートして、複合体によって提示された目的の膜貫通タンパク質と細胞によって産生された抗体との間の結合を許容することができる。次いで、抗体と目的の膜貫通タンパク質との間の結合を検出し、さらに使用するために結合した細胞を収集することができる。

【0121】

一部の例では、免疫された動物から得られた抗体産生細胞の集団は、抗体産生細胞の不均一な集団であってもよく、この集団は、一つ以上の抗原に対する抗体を発現する抗体産生細胞を含有する。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する特定の抗体産生細胞と、少なくとも一つの他の抗原に結合する抗体を発現する特定の抗体産生細胞を含む、抗体産生細胞の不均一な集団である。特定の実施形態では、抗体産生細胞の不均一な集団は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１．０％、少なくとも１．５％、少なくとも２．０％、少なくとも３．０％、少なくとも４．０％、少なくとも５．０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０、少なくとも９０％、またはそれ以上の目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞からなる。

【0122】

他の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、たった一つの抗原に結合する抗体を発現する抗体産生細胞を含有する、抗体産生細胞の均一な集団であってもよい。特定の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞を含む、抗体産生細胞の均一な集団である。特定の実施形態では、抗体産生細胞の均一な集団は、対象の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する、少なくとも７０％、少なくとも８０、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の抗体産生細胞からなる。

【0123】

特定の実施形態では、抗体産生細胞が得られたのと同時に、免疫された動物から得られた異種の細胞集団からＢ細胞を検出および収集して、抗体産生Ｂ細胞集団を提供することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、免疫された動物から得られた異種の細胞集団から取得され、その後、異種の細胞集団から抗体産生細胞を取得することができる。さらに別の実施形態では、Ｂ細胞は、免疫された動物から得られた抗体産生細胞集団において検出されて、抗体産生Ｂ細胞集団を得ることができる。

【0124】

特定の一実施形態では、目的の膜貫通タンパク質に対する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞は、免疫された動物から得られ、細胞表面Ｂ細胞マーカーに基づいてＦＡＣＳによって単離された不均一な細胞集団において検出され得る。

【0125】

Ｂ細胞マーカーは当該技術分野で公知である。例えば、ＦＡＣＳの使用を通して検出され得る適用可能なＢ細胞マーカーには、限定されないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７８、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＴＬＲ４、ＩＬ－６、ＰＤＬ－２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＩＬ－１０およびＴＧＦβが挙げられる。特定の実施形態では、Ｂ細胞は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはそれらの組み合わせに特異的な標識を使用して検出することができる。一実施形態では、抗体産生Ｂ細胞は、ＩｇＧに特異的な抗体を使用して検出される。

【0126】

特定の実施形態では、免疫化後、脾細胞は、免疫化された動物から採取される。赤血球の除去後、本明細書に記載される方法を使用して、免疫された動物からのＩｇＧ^＋抗原陽性Ｂ細胞の集団を、不均一な細胞集団から単離する。例えば、脾細胞は、抗ＩｇＧ抗体と接触し、洗浄して、過剰な非結合細胞および抗体を除去する。次いで、細胞を、標識されたＢ細胞マーカー（例えば、抗ＩｇＧ抗体）に結合する蛍光抗体（すなわち、二次抗体）で染色する。次いで、本明細書に記載されるように、染色された細胞をフローサイトメトリーにより分析し、さらなる使用のために単離することができる。

【0127】

本方法の一部の実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、目的の抗原に対する体液性性免疫を有することが知られている哺乳動物から採取される。次いで、本開示の方法に従って、目的の抗原を認識する抗体を発現するＩｇＧ^＋、抗原陽性Ｂ細胞を、さらなる処理のために単離することができる。

【0128】

方法の一部の実施形態では、抗体産生細胞の集団は、抗体産生Ｂ細胞を含む。こうした一実施形態では、抗体産生集団は、目的の膜貫通タンパク質に対して抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞を含み、免疫された動物から得られた不均一な細胞集団において検出され、不均一な細胞集団を目的の膜貫通タンパク質を、提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体、および例えば、Ｂ細胞表面マーカーに結合する抗体などのＢ細胞マーカーに結合する分子と接触させることによって単離することができる。例えば、免疫化後、脾細胞は、免疫化された動物から採取される。赤血球の除去後、複数の細胞集団は、不均一な細胞集団において、抗ＩｇＧ抗体とＩｇＧ^＋陽性Ｂ細胞との間の結合を可能にするために、標識された抗ＩｇＧ抗体とインキュベートされる。標識された抗ＩｇＧ抗体とのインキュベーションと同時に、または後または前に、不均一な細胞集団は、膜足場タンパク質を細胞によって産生された抗体に結合することが可能になるように、目的の膜貫通タンパク質を提示する標識された脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされる。次いで、目的の膜貫通タンパク質に対して抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の集団は、例えば、フローサイトメトリーによって、標識抗ＩｇＧ抗体（Ｂ細胞）および標識脂質二重層膜足場タンパク質複合体の両方に結合された細胞を検出および単離（採取）することによって取得され得る。

【0129】

一部の例では、方法は、本明細書に記載の動物を免疫化することを含む。

【0130】

例えば、抗体産生細胞の集団などの細胞の集団を脂質二重層膜足場タンパク質複合体と接触させるまたはインキュベートすることを含む例において、脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０．０ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の濃度で、細胞培地に供給される。特定の実施形態において、複合体は、０．２ｍｇ／ｍＬ～２０．０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～１５．０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～７．０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１０．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～７．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～１０．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ～７．０ｍｇ／ｍＬまたは１．０ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬ、両端を含む、の濃度で細胞に供給される。特定の実施形態では、複合体は、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．５５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．６５ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．８５ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、０．９５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、５．５ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍｇ／ｍＬ、６．５ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ、９．５ｍｇ／ｍＬ、１０．０ｍｇ／ｍＬ、１２．０ｍｇ／ｍＬ、１５．０ｍｇ／ｍＬ、２０．０ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の濃度で細胞に供給される。

【0131】

方法の一態様では、免疫された動物は、非ヒト動物または例えばマウスまたはラットなどの遺伝子操作された非ヒト動物であり、目的のヒト膜貫通タンパク質またはその一部、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化される。

【0132】

本方法の特定の実施形態では、非ヒト動物または遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカーに対する標識された抗体（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、完全長ヒト膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされ、複合体によって提示された目的のヒト膜貫通タンパク質（抗原）と細胞によって産生された抗体とで結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0133】

本方法の一部の実施形態では、非ヒト動物または遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカーに対する標識された抗体（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、切断されたヒト膜貫通タンパク質などのヒト膜貫通タンパク質の部分を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされ、複合体によって提示された目的のヒト膜貫通タンパク質（抗原）の部分上のエピトープと、細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。細胞はその後洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、複合体によって提示された抗原上でエピトープと結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、回収することができる。

【0134】

目的の膜貫通タンパク質の一部分を含む脂質二重層膜足場タンパク質複合体を含む方法の実施形態では、複合体によって提示された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質を含まない。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、本明細書に記載されるように切断された膜貫通タンパク質である。特定の実施形態では、目的の切断された膜貫通タンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の少なくとも膜貫通部分全体を含む。特定の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、一つ以上の細胞外ループドメイン、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分を含まない。一部の実施形態では、切断されたタンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、目的の膜貫通タンパク質のドメインにかかる一つ以上の膜の間のＮ末端細胞外ドメイン、Ｃ末端細胞外ドメイン、および／または細胞外ループドメインを含む。特定の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分を含まない。特定の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のカルボキシ末端部分を含まない。一部の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインを含まない。

【0135】

方法の別の実施形態では、非ヒト動物または遺伝子操作された非ヒト動物、例えばマウスまたはラットは、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化される。脾細胞は、免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧ抗体）に対して標識された抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞集団を識別する。細胞はまた、目的のヒト膜貫通タンパク質の部分および目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの部分を含むキメラ膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的のキメラ膜貫通タンパク質（抗原）と細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、目的のキメラ膜貫通タンパク質のヒト部分上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0136】

目的のキメラ膜貫通タンパク質の使用を含む方法の実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に記載される二つの異なる種からの目的の膜貫通タンパク質の部分を含み得る。例えば、キメラ膜貫通タンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの一つ以上の部分に操作可能に結合されたヒト膜貫通タンパク質の一つ以上の部分を含み得る。一部の例では、キメラ膜貫通タンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、目的の膜貫通タンパク質のドメインにかかる一つ以上の膜の間に、Ｎ末端細胞外ドメイン、Ｃ末端細胞外ドメイン、および／または細胞外ループドメインを含む。非ヒトホモログは、例えば、マウス、ラット、ヤギ、ハムスター、ブタ、チンパンジー、ウマ、ヒツジ、サル、およびモルモットなどの任意の非ヒト動物であってもよい。特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、またはヤギである。特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウスである。

【0137】

本発明の方法の例示的な実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、目的のヒト膜貫通タンパク質由来の一つ以上の細胞外ループドメインならびに膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のアミノ末端ドメインおよび／またはカルボキシ末端ドメインを含む。一実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来の一つ以上の細胞外ループドメインならびにカルボキシ末端ドメインおよび膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のアミノ末端ドメインを含む。別の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、一つ以上の細胞外ループドメインおよびヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよび膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のカルボキシ末端ドメインを含む。別の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよびカルボキシ末端ドメインならびに膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来の一つ以上の細胞外ループドメインを含む。一実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよび一つ以上の細胞外ループドメインおよび膜貫通タンパク質由来の非ヒトホモログ由来のカルボキシ末端ドメインを含む。さらに別の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、非ヒトホモログ由来の一つ以上の細胞外ループドメインおよび膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のアミノ末端ドメインを含む。

【0138】

方法の別の実施形態では、非ヒト動物または遺伝子操作された非ヒト動物、例えばマウスまたはラットは、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化される。脾細胞は、免疫された非ヒト動物から単離され、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧ抗体）に対して標識された抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞集団を識別する。細胞はまた、膜貫通タンパク質の非ヒトホモログを包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された非ヒト膜貫通タンパク質（抗原）と細胞によって産生された交差反応性抗体との結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、目的の非ヒト膜貫通タンパク質および目的のヒト膜貫通タンパク質に提示されたエピトープに結合する交差反応性抗体を発現する均一な抗体産生Ｂ細胞の集団を識別し、回収することができる。

【0139】

目的の膜貫通タンパク質またはその一部の非ヒトホモログの使用を含む本発明の方法の実施形態では、非ヒトホモログは、任意の非ヒト生物であってもよい。非ヒト生物の特定の例には、限定されないが、非ヒト哺乳動物、爬虫類、魚、細菌、昆虫、およびウイルスが含まれる。一部の実施形態では、非ヒトタンパク質は、マウス、ラット、ヤギ、ハムスター、ブタ、チンパンジー、ウマ、ヒツジ、サル、およびモルモット由来であってもよい。特定の実施形態では、非ヒトタンパク質ホモログは、マウス、ラット、またはヤギ由来である。特定の実施形態では、非ヒトホモログは、目的の膜貫通タンパク質のマウスホモログである。

【0140】

方法の一部の実施形態では、非ヒト動物または遺伝子操作された非ヒト動物、例えばマウスまたはラットは、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質、同タンパク質をコードする核酸配列またはそれらの組み合わせで免疫化され、脾細胞は、免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、目的の完全長ヒト膜貫通の部分（ペプチドブロッキング剤）とインキュベートされて、ペプチドブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。細胞はまた、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）に対する標識抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞集団を識別し、完全長膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的の完全長膜貫通タンパク質（抗体）と、集団内の残りの結合していない細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）標識膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞を洗浄して、ペプチドブロッキング剤に結合されたすべての細胞、結合していないおよび余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去し、Ｂ細胞マーカーに対する標識抗体を選別から除去することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、ペプチドブロッキング剤に対応する部分に存在しない目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0141】

ブロッキング剤の使用を含む方法の実施形態では、ブロッキング剤は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、化学化合物などの任意の分子であってもよい。こうした実施形態では、ブロッキング剤は、目的の膜貫通タンパク質の一部に対応するポリペプチドもしくはペプチド、ＭＳＰタンパク質の一部に対応するポリペプチドもしくはポリペプチド、またはＨｉｓタグもしくはＦｌａｇタグなどの検出可能なマーカーであり得る。いくつかの実施形態では、ブロッキング剤は、検出可能な標識を含む。他の実施形態では、ブロッキング剤は、検出可能な標識を含まない。一実施形態では、ブロッキング剤は、目的の膜貫通タンパク質のペプチドまたはポリペプチド部分であり、抗体産生細胞の集団とインキュベートして、ブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する抗体産生細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。一実施形態では、ブロッキング剤は、目的の切断された膜貫通タンパク質である。特定の実施形態では、ブロッキング剤は、一つ以上の細胞外ループドメイン、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に対応するポリペプチドである。特定の実施形態では、ブロッキング剤は、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分を含むポリペプチドであってもよい。別の実施形態では、ブロッキング剤は、目的の完全長膜貫通タンパク質のカルボキシ末端部分を含むポリペプチドであってもよい。一実施形態では、ブロッキング剤は、目的の完全長膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインを含むポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、ブロッキング剤は、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、目的の完全長膜貫通タンパク質のドメインにかかる一つ以上の膜の間のＮ末端細胞外ドメイン、Ｃ末端細胞外ドメイン、および／または細胞外ループドメインを含む。別の実施形態では、ブロッキング剤は、ＭＳＰタンパク質のペプチドまたはポリペプチド部分であり、抗体産生細胞の集団とインキュベートして、ブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する抗体産生細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。さらに別の実施形態では、ブロッキング剤は、ＭＳＰまたは目的の膜貫通タンパク質に位置するペプチドまたはポリペプチド検出可能マーカーであり、抗体産生細胞の集団とインキュベートして、ブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する抗体産生細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。

【0142】

方法の他の実施形態では、非ヒト動物または遺伝子操作された非ヒト動物、例えばマウスまたはラットは、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列（免疫原）で免疫化される。

【0143】

一部の実施形態では、脾細胞は、免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧ抗体）に対して標識された抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞集団を識別する。細胞はまた、完全長ヒト膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的の完全長膜貫通タンパク質（抗原）と細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、アミノ酸配列または免疫原に存在するまたは免疫原によってコードされたドメインにも対応する、目的の抗原の完全長ヒト膜貫通タンパク質の部分に位置するエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、回収することができる。

【0144】

方法の他の実施形態では、非ヒト動物または遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカーに対する標識された抗体（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、免疫原として使用されるヒト膜貫通タンパク質の部分を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的のヒト膜貫通タンパク質の部分のエピトープ（抗原）と細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。細胞はその後洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、複合体によって提示された抗原上でエピトープと結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、回収することができる。

【0145】

目的の膜貫通タンパク質の一部分の使用を含む本発明の方法の実施形態では、膜貫通タンパク質の部分は、ペプチドまたはポリペプチドであって、目的の完全長膜貫通タンパク質を含まない。一実施形態では、目的の切断された膜貫通タンパク質は、一つ以上の細胞外ループドメイン、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分を含まない改変された膜貫通タンパク質であってもよい。特定の実施形態では、目的の改変膜貫通タンパク質は、切断された膜貫通タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質の部分は、検出可能な標識を含む。他の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質の部分は、検出可能な標識を含まない。特定の実施形態では、目的の切断された膜貫通タンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の少なくとも膜貫通部分全体を含む。特定の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分を含まない。特定の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のカルボキシ末端部分を含まない。一部の実施形態では、切断されたタンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、目的の膜貫通タンパク質のドメインにかかる一つ以上の膜の間のＮ末端細胞外ドメイン、Ｃ末端細胞外ドメイン、および／または細胞外ループドメインを含む。一実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインを含まない。

【0146】

方法の別の態様では、遺伝子操作された動物は、内因性遺伝子から目的の膜貫通タンパク質を発現せず、目的の非ヒト膜貫通タンパク質またはその一部、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化される。

【0147】

目的の非ヒト膜貫通タンパク質および遺伝子操作された動物は、同じ動物または異なる動物由来であってもよい。目的の非ヒト膜貫通タンパク質は、任意の非ヒト生物由来であってもよい。非ヒト生物の非限定的な例には、非ヒト哺乳動物、爬虫類、魚、細菌、昆虫、およびウイルスが含まれる。一部の実施形態では、非ヒト膜貫通タンパク質は、例えば、マウス、ラット、ヤギ、ハムスター、ブタ、チンパンジー、ウマ、ヒツジ、サル、およびモルモットなどの動物由来である。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。他の実施形態では、非ヒト膜貫通タンパク質は、マウス、ラット、またはヤギ由来である。特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウスである。

【0148】

方法の特定の実施形態では、遺伝子操作された動物は、マウスまたはラットなどの非ヒト動物であり、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列（免疫原）で免疫化される。脾細胞は、免疫された遺伝子操作された動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧ抗体）に対して標識された抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞集団を識別する。細胞はまた、完全長非ヒト膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的の膜貫通タンパク質（抗原）と細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出され、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0149】

方法の他の実施形態では、遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカーに対する標識された抗体（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされ、複合体によって提示された目的のヒト膜貫通タンパク質（抗原）と細胞によって産生された抗体とで結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出され、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質および目的の非ヒト膜貫通タンパク質上のエピトープに結合する交差反応性抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0150】

方法の一部の実施形態では、遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカーに対する標識された抗体（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、切断された膜貫通タンパク質などの完全長非ヒト膜貫通タンパク質の部分を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされ、複合体によって提示された目的の膜貫通タンパク質（抗原）の部分上のエピトープと、細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。細胞はその後洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、複合体によって提示された抗原上でエピトープと結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、回収することができる。

【0151】

目的の膜貫通タンパク質の一部分を含む脂質二重層膜足場タンパク質複合体を含む方法の実施形態では、複合体によって提示された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質を含まない。一実施形態では、目的の膜貫通タンパク質は、一つ以上の細胞外ループドメイン、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分を含まない切断された膜貫通タンパク質である。特定の実施形態では、目的の切断された膜貫通タンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の少なくとも膜貫通部分全体を含む。一部の実施形態では、切断されたタンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、目的の膜貫通タンパク質のドメインにかかる一つ以上の膜の間のＮ末端細胞外ドメイン、Ｃ末端細胞外ドメイン、および／または細胞外ループドメインを含む。特定の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分を含まない。特定の実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質のカルボキシ末端部分を含まない。一実施形態では、切断された膜貫通タンパク質は、目的の完全長膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインを含まない。

【0152】

方法の特定の実施形態では、例えばマウスまたはラットなどの遺伝子操作された非ヒト動物は、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質、それまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は、免疫された動物から単離され、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧ抗体の集団）に対する標識抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの部分および目的のヒト膜貫通タンパク質の部分を含むキメラ膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的のキメラ膜貫通タンパク質の非ヒト部分（抗原）と、細胞によって産生された複合体および抗体によって提示された目的のキメラ膜貫通タンパク質の非ヒト部分（抗原）との結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、目的のキメラ膜貫通タンパク質の非ヒト部分上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0153】

目的のキメラ膜貫通タンパク質の使用を含む方法の実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に記載される二つの異なる種からの目的の膜貫通タンパク質の部分を含み得る。例えば、キメラ膜貫通タンパク質は、膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの一つ以上の部分に操作可能に結合されたヒト膜貫通タンパク質の一つ以上の部分を含み得る。一部の例では、キメラ膜貫通タンパク質は、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、目的の膜貫通タンパク質のドメインにかかる一つ以上の膜の間に、Ｎ末端細胞外ドメイン、Ｃ末端細胞外ドメイン、および／または細胞外ループドメインを含む。非ヒトホモログは、例えば、マウス、ラット、ヤギ、ハムスター、ブタ、チンパンジー、ウマ、ヒツジ、サル、およびモルモットなどの任意の非ヒト動物であってもよい。特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、またはヤギである。特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウスである。

【0154】

本方法の例示的な実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来の一つ以上の細胞外ループドメイン、ならびに膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のアミノ末端ドメインおよび／またはカルボキシ末端ドメインを含む。一実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、一つ以上の細胞外ループドメインならびに膜貫通タンパク質由来の非ヒトホモログ由来のアミノ末端ドメインおよび／またはカルボキシ末端ドメインを含む。別の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、一つ以上の細胞外ループドメインおよびヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよび膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のカルボキシ末端ドメインを含む。別の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよびカルボキシ末端ドメインならびに膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来の一つ以上の細胞外ループドメインを含む。一実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよび一つ以上の細胞外ループドメインおよび膜貫通タンパク質由来の非ヒトホモログ由来のカルボキシ末端ドメインを含む。さらに別の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、非ヒトホモログ由来の一つ以上の細胞外ループドメインおよび膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のアミノ末端ドメインを含む。

【0155】

方法の他の実施形態では、例えばマウスまたはラットなどの遺伝子操作された非ヒト動物は、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質の一部、それらをコードする核酸配列、またはそれらの組み合わせ（免疫原）で免疫化される。

【0156】

このような例示的な一実施形態では、脾細胞は、免疫された遺伝子操作された動物から単離され、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧ抗体）に対して標識された抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞集団を識別する。細胞はまた、完全長非ヒト膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的の完全長膜貫通タンパク質（抗原）と細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、アミノ酸配列または免疫原に存在するまたは免疫原によってコードされたドメインにも対応する、目的の抗原の完全長非ヒト膜貫通タンパク質の部分に位置するエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、回収することができる。

【0157】

方法の他の実施形態では、遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカーに対する標識された抗体（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、免疫原として使用される非ヒト膜貫通タンパク質の部分を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的のヒト膜貫通タンパク質の部分のエピトープ（抗原）と細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）標識膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、複合体によって提示された抗原上でエピトープと結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、回収することができる。

【0158】

方法の別の態様では、内因性遺伝子から目的の膜貫通タンパク質を発現しない遺伝子操作された動物は、目的のキメラ膜貫通タンパク質、またはそれをコードする核酸で免疫化される。

【0159】

目的のキメラ膜貫通タンパク質の使用を含む例では、キメラタンパク質は、本明細書に記載される二つの異なる種からの目的の膜貫通タンパク質の部分を含み得る。例えば、キメラ膜貫通タンパク質は、膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの一つ以上の部分に操作可能に結合されたヒト膜貫通タンパク質の一つ以上の部分を含み得る。一部の例では、キメラ膜貫通タンパク質は、目的のヒト膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、目的の膜貫通タンパク質のドメインにかかる一つ以上の膜に操作可能に結合されたＮ末端細胞外ドメイン、Ｃ末端細胞外ドメイン、および／または細胞外ループドメインを含む。非ヒトホモログは、例えば、マウス、ラット、ヤギ、ハムスター、ブタ、チンパンジー、ウマ、ヒツジ、サル、およびモルモットなどの任意の非ヒト動物であってもよい。特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、またはヤギである。特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウスである。

【0160】

本発明の方法の例示的な実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、目的のヒト膜貫通タンパク質由来の一つ以上の細胞外ループドメインならびに膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のアミノ末端ドメインおよび／またはカルボキシ末端ドメインを含む。一実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来の一つ以上の細胞外ループドメインならびにカルボキシ末端ドメインおよび膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のアミノ末端ドメインを含む。別の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、一つ以上の細胞外ループドメインおよびヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよび膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のカルボキシ末端ドメインを含む。別の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよびカルボキシ末端ドメインならびに膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来の一つ以上の細胞外ループドメインを含む。一実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、ヒト膜貫通タンパク質由来のアミノ末端ドメインおよび一つ以上の細胞外ループドメインおよび膜貫通タンパク質由来の非ヒトホモログ由来のカルボキシ末端ドメインを含む。さらに別の実施形態では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、膜貫通ドメインに操作可能に結合された非ヒトホモログ由来の一つ以上の細胞外ループドメイン、および膜貫通タンパク質の非ヒトホモログ由来のアミノ末端ドメインを含む。

【0161】

方法の特定の一実施形態では、遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、ヒト膜貫通タンパク質の部分および膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの部分を含むキメラ膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカーに対する標識された抗体（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質（抗原）を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされ、複合体によって提示されたヒト抗原と、目的のキメラ膜貫通タンパク質のヒト部分に特異的な細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、目的のキメラ膜貫通タンパク質のヒト部分上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0162】

方法の別の実施形態では、遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、目的のヒト膜貫通タンパク質の部分および目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの部分を含むキメラ膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカーに対する標識された抗体（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質の部分を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体（抗原）とインキュベートされ、複合体によって提示されたヒト抗原と、目的のキメラ膜貫通タンパク質のヒト部分に特異的な細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、目的のキメラ膜貫通タンパク質のヒト部分上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0163】

さらに別の実施形態では、遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、目的のヒト膜貫通タンパク質の部分および目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの部分を含むキメラ膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカーに対する標識された抗体（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体（抗原）とインキュベートされ、複合体によって提示された非ヒト抗原と、目的のキメラ膜貫通タンパク質の非ヒト部分に特異的な細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、目的のキメラ膜貫通タンパク質の非ヒト部分上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0164】

方法の別の実施形態では、遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、目的のヒト膜貫通タンパク質の部分および目的の膜貫通タンパク質の非ヒトホモログの部分を含むキメラ膜貫通タンパク質、それらまたはそれらの組み合わせをコードする核酸配列で免疫化され、脾細胞は免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、Ｂ細胞マーカーに対する標識された抗体（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧ抗体）とインキュベートされて、Ｂ細胞の集団を識別する。細胞はまた、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質の部分を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体（抗原）とインキュベートされ、複合体によって提示された非ヒト抗原と、目的のキメラ膜貫通タンパク質の非ヒト部分に特異的な細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、目的のキメラ膜貫通タンパク質の非ヒト部分上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0165】

方法の別の態様では、例えば、マウスまたはラットなどの非ヒト動物または遺伝子操作された非ヒト動物は、目的の完全長膜貫通タンパク質またはその部分を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体で免疫化される。

【0166】

方法の一部の実施形態では、例えば、マウスまたはラットなどの非ヒト動物または遺伝子操作された非ヒト動物は、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体で免疫化される。脾細胞は、免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、一種類のまたは複数のブロッキング剤とインキュベートされて、このブロッキング剤は、複合体に含まれる各ＭＳＰタンパク質および複合体に含まれる各検出可能なマーカーに対応する、またはＨｉｓタグまたはＦｌａｇタグなどの目的の膜貫通タンパク質に貼り付けられ、ブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。細胞はまた、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧ抗体）に対する標識抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞集団を識別する。細胞は、その後、完全長ヒト膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的の完全長膜貫通タンパク質（抗原）と集団に残っている結合していない細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）標識膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞を洗浄して、ブロッキング剤に結合されたすべての細胞、ならびに結合していないおよび余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去し、Ｂ細胞マーカーに対する標識抗体を選別から除去することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出されて、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0167】

方法の一実施形態では、例えば、マウスまたはラットなどの非ヒト動物または遺伝子操作された非ヒト動物は、目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体で免疫化される。脾細胞は、免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、一種類のまたは複数のブロッキング剤とインキュベートされて、このブロッキング剤は、複合体に含まれる各ＭＳＰタンパク質および複合体に含まれる各検出可能なマーカーに対応する、またはＨｉｓタグまたはＦｌａｇタグなどの目的の膜貫通タンパク質に貼り付けられ、ブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。細胞はまた、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧ抗体）に対する標識抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞集団を識別する。細胞は、その後、ヒト膜貫通タンパク質の部分を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的の膜貫通タンパク質の部分（抗原）と、集団に残っている結合していない細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）標識膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞を洗浄して、ブロッキング剤に結合されたすべての細胞、ならびに結合していないおよび余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去し、Ｂ細胞マーカーに対する標識抗体を選別から除去することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識された抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出され、複合体によって提示された目的の完全長ヒト膜貫通タンパク質の部分のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0168】

方法の他の実施形態では、例えば、マウスまたはラットなどの遺伝子操作された非ヒト動物は、内因性遺伝子から目的の膜貫通タンパクを発現しなく、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体で免疫化される。脾細胞は、免疫された非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）から単離され、一種類のまたは複数のブロッキング剤とインキュベートされ、このブロッキング剤は、複合体に含まれる各ＭＳＰタンパク質および複合体に含まれる各検出可能なマーカーに対応し、またはＨｉｓタグまたはＦＬＡＧタグなどの目的の膜貫通タンパク質に貼り付けられ、ブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。細胞はまた、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧ抗体）に対する標識抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞集団を識別する。細胞は、その後、完全長非ヒト膜貫通タンパク質を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的の完全長膜貫通タンパク質（抗原）と集団において残っている結合していない細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）標識膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞を洗浄して、ブロッキング剤に結合されたすべての細胞、ならびに結合していないおよび余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去し、Ｂ細胞マーカーに対する標識抗体を選別から除去することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出され、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0169】

方法の一部の実施形態では、例えばマウスまたはラットなどの遺伝子操作された非ヒト動物は、内因性遺伝子から目的の膜貫通タンパク質を発現しなく、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質の一部分を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体で免疫化される。脾細胞は、免疫された動物から単離され、一種類のまたは複数のブロッキング剤とインキュベートされ、このブロッキング剤は、複合体に含まれる各ＭＳＰタンパク質および複合体に含まれる各検出可能なマーカーに対応し、またはＨｉｓタグまたはＦＬＡＧタグなどの目的の非ヒト膜貫通タンパク質の部分に貼り付けられ、ブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。細胞はまた、Ｂ細胞マーカー（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧ抗体）に対する標識抗体とインキュベートされて、Ｂ細胞集団を識別する。細胞は、その後、完全長非ヒト膜貫通タンパク質の部分または目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質（抗原）を包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされて、複合体によって提示された目的の膜貫通タンパク質と集団に残っている結合していない細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）標識膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞を洗浄して、ブロッキング剤に結合されたすべての細胞、ならびに結合していないおよび余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去し、Ｂ細胞マーカーに対する標識抗体を選別から除去することができる。結合したＢ細胞からのＰＥ蛍光およびシグナル（例えば、蛍光色素標識抗ＩｇＧシグナル）は、ＦＡＣＳによって検出され、目的の完全長非ヒト膜貫通タンパク質の部分上のエピトープに結合する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の均一な集団を識別し、収集することができる。

【0170】

ブロッキング剤の使用を含む方法の実施形態では、ブロッキング剤は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、化学化合物などの任意の分子を含み得る。こうした実施形態では、ブロッキング剤は、目的の膜貫通タンパク質の一部に対応するポリペプチドもしくはペプチド、ＭＳＰタンパク質の一部に対応するポリペプチドもしくはポリペプチド、またはＨｉｓタグもしくはＦＬＡＧタグなどの検出可能なマーカーであり得る。いくつかの実施形態では、ブロッキング剤は、検出可能な標識を含む。他の実施形態では、ブロッキング剤は、検出可能な標識を含む。一実施形態では、ブロッキング剤は、目的の膜貫通タンパク質のペプチドまたはポリペプチド部分であり、抗体産生細胞の集団とインキュベートして、ブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する抗体産生細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。一実施形態では、ブロッキング剤は、目的の切断された膜貫通タンパク質である。特定の実施形態では、ブロッキング剤は、一つ以上の細胞外ループドメイン、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に対応するポリペプチドである。特定の実施形態では、ブロッキング剤は、目的の完全長膜貫通タンパク質のアミノ末端部分を含むポリペプチドであってもよい。別の実施形態では、ブロッキング剤は、目的の完全長膜貫通タンパク質のカルボキシ末端部分を含むポリペプチドであってもよい。一実施形態では、ブロッキング剤は、目的の完全長膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインを含むポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、ブロッキング剤は、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、目的の膜貫通タンパク質のドメインにかかる一つ以上の膜の間のＮ末端細胞外ドメイン、Ｃ末端細胞外ドメイン、および／または細胞外ループドメインを含む切断されたタンパク質である。別の実施形態では、ブロッキング剤は、ＭＳＰタンパク質のペプチドまたはポリペプチド部分であり、抗体産生細胞の集団とインキュベートして、ブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する抗体産生細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。さらに別の実施形態では、ブロッキング剤は、ＭＳＰまたは目的の膜貫通タンパク質に位置するペプチドまたはポリペプチド検出可能マーカーであり、抗体産生細胞の集団とインキュベートして、ブロッキング剤と、ブロッキング剤に位置するエピトープに特異的に結合する抗体産生細胞によって産生された抗体との結合を可能にする。

【0171】

本開示の方法は、目的の膜貫通タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される抗原に結合される抗体産生細胞を検出、選別、および収集することを含む。検出、選別、および収集は、組み合わせられてもよく、または別個のステップとして実施されてもよい。検出、選別、および／または収集は、複合体上の一つ以上の検出可能な標識の検出によって、複合体によって提示された目的の膜貫通タンパク質によって結合された細胞を識別することを含んでもよい。次いで、結合した細胞を結合していない細胞から分離し（すなわち、選別し）、さらに使用するために選択することができる。

【0172】

一部の実施形態では、抗体産生細胞と、目的の膜貫通タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体との相互作用は、目的の膜貫通タンパク質の立体構造の変化、細胞における目的の膜貫通タンパク質の活性化もしくは不活性化、または検出可能な標識（例えば、蛍光分子、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓ－タグ）を使用して、目的の膜貫通タンパク質を含有する脂質二重層膜足場タンパク質複合体に結合した細胞を識別および捕捉することによって検出される。検出は、標識に特異的な抗体による免疫染色、または標識に結合する試薬による直接的な染色によって実施することができる。多数の検出キットおよび技術は、当技術分野で周知である。

【0173】

方法の特定の実施形態では、細胞は、約５分～約６０分間、緩衝液で洗浄して、結合していない抗原を除去し、合計１０～１２０分、例えば、１０分を３回、または３０分を１回、それぞれ１０～１５分を２～４回、緩衝液で洗浄する。一実施形態では、約１０分、または約１５分もしくは約２０分、または約２５分、または約３０分、または約３５分、または約４０分、または約４５分、または約５０分、または約５５分、または合計約６０分を１回洗浄することを含む時間の間、細胞を洗浄することができる。一部の実施形態では、約５分、または約１０分、または約１５分、または約２０分、または約２５分、または１回の洗浄あたり約３０分ごとに２回洗浄することを含む時間で、細胞を洗浄することができる。追加の洗浄間隔が企図され、本明細書に記述したものと本質的に同等である。

【0174】

一部の実施形態では、検出、選別、および収集を、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して実施して、膜貫通タンパク質特異的抗体を発現する単一抗体産生細胞を検出、選別、および選択することができる。フローサイトメトリーによる単一細胞の単離のプロトコルは周知である（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ら、２０１３、上記）。例えば、標識された（例えば、蛍光標識）脂質二重層膜足場タンパク質複合体（または蛍光標識されたストレプトアビジン／ビオチン化抗原）によって提示された抗原に結合する細胞は、抗原（すなわち、目的の膜貫通タンパク質）に特異的に結合する抗体を発現する細胞として検出され、識別され、その後、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレート上の個々のウェルに収集され得る。

【0175】

一旦収集されると、単一抗体産生細胞は、その後のＤＮＡ調製のための共通細胞培養技術によって増殖され得る。あるいは、抗体遺伝子は、単一抗体産生細胞から直接増幅され、その後ＤＮＡベクターにクローニングされてもよい。

【0176】

単抗体産生細胞は、当該技術分野で公知の代替的方法によって選別および収集されてもよく、限定されないが、手動の単細胞ピッキング、限定希釈、および吸着抗原のＢ細胞パンニングが含まれ、これらはすべて当該技術分野で周知である。例えば、Ｒｏｌｉｎｋら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（１９９６）１８３：１８７－１９４；Ｌｉｇｈｔｗｏｏｄ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００６）３１６（１－２）：１３３－４３を参照されたい。

【0177】

目的の膜貫通タンパク質に対する抗体を発現する抗体産生細胞から得られた核酸からの抗体の生成。
抗体またはその断片をコードする核酸は、本明細書に記載される方法を使用して生成され、取得された抗体産生細胞から単離することができる。

【0178】

一部の実施形態では、核酸は、可変ドメイン、定常ドメイン、またはそれらの組み合わせなどの抗体の断片をコードする。特定の実施形態では、抗体産生細胞から単離された核酸は、抗体の可変ドメインをコードする。一部の実施形態では、核酸は、抗体重鎖またはその断片をコードする。他の実施形態では、核酸は、抗体軽鎖またはその断片をコードする。

【0179】

特定の例では、抗体産生細胞から単離された核酸は、宿主細胞中で発現される。例えば、抗体産生細胞から単離された核酸は、哺乳動物細胞、細菌細胞、または昆虫細胞などの宿主細胞に発現され得る（例えば、クローン化され、組換え的に複製される）。一部の実施形態では、宿主細胞は、核酸を発現する条件下で培養され、抗体またはその一部がその後、さらなる使用のために産生および単離され得る。単離された核酸から抗体を作製する方法は、当技術分野で周知であり、任意のかかる方法を本開示と併せて使用することができる。

【0180】

一部の実施形態では、上記核酸の一つ以上を含む宿主細胞は、完全長抗体を発現する条件下で培養され、次いで抗体は、さらなる使用のために産生および単離され得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、抗体の可変ドメインをコードする核酸を含み、細胞は、可変ドメインを発現する条件下で培養される。他の実施形態では、宿主細胞は、抗体の可変重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメインをコードする核酸を含み、細胞は、Ｖ_Ｈドメインを発現する条件下で培養される。別の実施形態では、宿主細胞は、抗体の可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインをコードする核酸を含み、細胞は、Ｖ_Ｌドメインを発現する条件下で培養される。特定の実施形態では、宿主細胞は、抗体のＶ_Ｈドメインをコードする核酸と、抗体のＶ_Ｈドメインをコードする核酸とを含み、細胞は、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを発現する条件下で培養される。

【0181】

一部の実施形態では、ＤＮＡは、抗体を組換え的に産生するために、宿主から単離されてもよい。概して、免疫グロブリン可変重鎖および可変軽鎖（すなわち、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、ＶκおよびＶλ）をコードする遺伝子または核酸は、抗体産生細胞から単離された核酸を有するＲＴ－ＰＣＲプロトコルを使用して回収することができる。これらのＲＴ－ＰＣＲプロトコルは、例えば、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）２４４：２１７～２２５に記載され、本明細書に記載されるように、周知であり、通常の技術である。

【0182】

回収されると、抗体をコードする遺伝子または核酸は、ＩｇＧ重鎖および軽鎖発現ベクターにクローニングされ、宿主細胞のトランスフェクションを介して発現することができる。例えば、抗体をコードする遺伝子または核酸は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または細胞における発現（安定的または一過性）のために複製可能なベクターに挿入されてもよい。多くのベクター、特に発現ベクターは利用可能であるか、または遺伝子または核酸をコードする抗体の発現を調節するために必要な適切な調節エレメントを含むように操作することができる。

【0183】

本開示の状況での発現ベクターは、染色体核酸ベクター、非染色体核酸ベクター、および合成核酸ベクター（発現制御要素の適切な組を含む核酸配列）を含む任意の好適なベクターであってもよい。かかるベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合せに由来するベクター、およびウイルス性核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。

【0184】

一部の実施形態では、核酸分子は、例えば、線形発現要素（例えば、Ｓｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（１９９７）１２：３５５－５９に記述されるように）、圧縮した核酸ベクター（例えば、米国特許第６，０７７，８３５号に記述されるように）、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣ １９／１８のようなプラスミドベクターを含む、裸のＤＮＡまたはＲＮＡベクターに含まれる。かかる核酸ベクターおよびその使用法は当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，５８９，４６６号および米国特許５，９７３，９７２号を参照されたい。

【0185】

特定の実施形態では、発現ベクターは、酵母系における発現に適したベクターであってもよい。酵母系内での発現のために好適な任意のベクターが採用されてもよい。適切なベクターとして、例えば、酵母アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの恒常性または誘導性プロモーターを含むベクターが挙げられる。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；およびＧｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３，５１６－５４４（１９８７）を参照されたい。

【0186】

特定の実施形態では、ベクターは、抗体の重鎖をコードする核酸分子（または遺伝子）と、抗体の軽鎖をコードする核酸分子（または遺伝子）を含み、抗体は、本開示の方法によって取得された抗体産生細胞によって産生される。一般に、使用されるベクターは、記載の核酸分子（または遺伝子）を含む発現ベクターを含み、核酸分子（または遺伝子）は、宿主細胞における発現に適した発現制御配列に操作可能に結合する。

【0187】

ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。宿主細胞には、限定されないが、原核または真核（概して哺乳類）起源の細胞が含まれる。

【0188】

完全長抗体核酸配列または遺伝子は、その後、適切なベクターにクローニングされてもよいことが理解される。あるいは、単離された抗体のＦａｂ領域は、任意のアイソタイプの定常領域に沿ってベクターにクローニングされてもよい。したがって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ重鎖定常領域、またはキメラ重鎖定常領域を含む、単離された抗体の構築に任意の定常領域を利用してもよい。かかる定常領域は、抗体の使用目的に応じて、任意のヒトまたは動物種から取得することができる。また、抗体可変領域またはＦａｂ領域は、ＳｃＦｖ、ダイアボディなどの他のフォーマットでのタンパク質の発現のための適切なベクターにクローニングされてもよい。

【0189】

このように、本開示は、目的の膜貫通タンパク質に特異的な完全長抗体を含む核酸分子をコードする哺乳動物の宿主細胞も提供し、抗体をコードする核酸または遺伝子は、本発明の方法に従って取得された抗体産生細胞から単離された。一実施形態では、一次抗体産生細胞は、免疫化された哺乳動物から得られた細胞の異種集団から単離されたＢ細胞であった。

【0190】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞または酵母細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ細胞；ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）；幹細胞；網膜細胞；Ｖｅｒｏ細胞；ＣＶ１細胞；腎臓細胞、例えばＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ａＨａＫ、ＢＨＫ２１細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＷＩ３８、ＭＲＣ ５；Ｃｏｌｏ２５；ＨＢ ８０６５；ＨＬ－６０；Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＤａｕｄｉ細胞；Ａ４３１（表皮）細胞；ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３またはＬ細胞；Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０またはＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞のいずれかに由来する細胞株であってもよい。特定の実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ Ｋ１細胞である。

【0191】

この用語としての抗体は、当技術分野で既知であり、免疫系の抗原結合タンパク質を指す。本明細書で言及される用語「抗体」は、抗原結合領域を有する完全長抗体、およびその任意の断片を含み、そこで「抗原結合部分」または「抗原結合領域」が保持され、または単鎖、例えば、その単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも二つの重鎖（Ｈ）鎖と二つの軽鎖（Ｌ）とを含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と重鎖定常（ＣＨ）領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３という三つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）および軽鎖定常ＣＬ領域からなる。軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬから構成される。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分化することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。

【0192】

本明細書に示されるように、本開示は、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を得るために使用することができる。本明細書に記載される抗体産生細胞から得られた抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、本明細書に生成された抗体のいずれかの結合親和性、特異的エピトープ認識能力または機能的能力を決定することができる。

【0193】

「結合親和性」は概して、分子（例えば、抗体）の単一結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。別段の示唆が無い限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体および抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。その結合パートナーに対する分子の親和性は、一般に、解離平衡定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）によって表され得る。Ｋ_Ｄ（モル、Ｍ）値と結合親和性との間に逆の関係があり、Ｋ_Ｄ値（Ｍ）が小さいほど、分子のその結合エピトープに対する結合親和性が高い。

【0194】

用語「より高い親和性」または「高い親和性」は、概して、より強く、および／またはより速く抗原に結合し、および／またはより長く結合されたままである抗体を指す。一般的に、高親和性抗体は、強力な結合相互作用のために、所望の効果を達成するために、より低い濃度（Ｍ）の抗原を必要とする。逆に、用語「低親和性」および「より低い親和性」は、他の結合分子（例えば、抗体）と比較して、分子とその結合パートナーの間に相互作用を形成する能力の減少など、より弱い結合を反映するために使用される用語である。したがって、低親和性結合分子は、他の結合分子と比較してより大きなＫ_Ｄ値を有し、および／または抗原をゆっくりと結合し、容易に解離する傾向がある。

【0195】

「ｋｄ」（ｓｅｃ－１又は１／ｓ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合断片または分子相互作用の解離速度定数を指す。この値は、ｋ－ｏｆｆ値とも呼ばれている。

【0196】

「ｋａ」（Ｍ－１ ｘ ｓｅｃ －１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合断片もしくは分子相互作用の会合速度定数を指す。

【0197】

「ＫＤ」または「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合断片もしくは分子相互作用の平衡解離定数を指す。平衡解離定数は、ｋａをｋｄで割ることによって得られる。

【0198】

結合親和性を測定する様々な方法は、当技術分野で公知であり、そのいずれかが本開示の目的のために使用され得る。例えば、抗原に対する抗体の結合親和性は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定することができる。

【0199】

いくつかの実施形態では、目的の膜貫通タンパク質への抗体の結合は、膜貫通タンパク質が発現される細胞内（インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）の機能的活性を付与するか、または目的の膜貫通タンパク質との抗体の結合は、目的の膜貫通タンパク質の正常な機能的活性を、目的の膜貫通タンパク質の内因性リガンドの存在下または不在下で調節する。

【0200】

特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質に対する抗体は、膜貫通タンパク質機能のアンタゴニストである。アンタゴニスト抗体は、抗原の活性部位（すなわち、目的の膜貫通タンパク質）に対して向けられ、膜貫通タンパク質または膜貫通タンパク質自体に対する天然リガンドの活性を阻害することができる抗体を意味する。例えば、抗体の抗原への結合は、目的の膜貫通タンパク質の内因性機能を低減または禁止する。非限定的な一つの例では、アンタゴニスト抗体は、目的の膜貫通タンパク質に結合し、膜貫通タンパク質へのリガンド結合、受容体活性化、または類似のものへの干渉によって膜貫通タンパク質機能を調節することができる。

【0201】

さらに特定の実施形態では、目的の膜貫通タンパク質に対する抗体は、膜貫通タンパク質アンタゴニストである。アゴニスト抗体は、天然リガンド自体の非存在下で、目的の膜貫通タンパク質（すなわち抗原）を活性化することができる抗体を意味し、アゴニスト抗体は、目的の膜貫通タンパク質の機能的活性を誘導することができる。例えば、抗体の抗原への結合は、目的の膜貫通タンパク質の内因性機能を誘導または増加させる。非限定的な一つの例では、アゴニスト抗体は、目的の膜貫通タンパク質に結合することができ、タンパク質または受容体を活性化することによって、例えば、タンパク質の構造を変更することによって膜貫通タンパク質機能を調節することができる。

【0202】

抗体結合および膜貫通タンパク質機能を測定するためのアッセイは、当業者に周知である。例えば、膜貫通タンパク質の内部移行、構造変化、リン酸化、リガンド結合などを測定するためのアッセイは、当該技術分野で周知である。

【0203】

本明細書は、限定するものとして解釈すべきではない以下の実施例により、さらに例示される。全ての引用参考文献（本出願全体で引用される文献参照、発行特許、および公表された特許出願を含む）は、それらの全体が参照により本明細書に明確に援用される。

【実施例】

【0204】

実施例１．抗体産生細胞の生成および収集。
表１に示すように、比較のために、いくつかの免疫化キャンペーンが開始して、マウスにおいて免疫反応を生成し、目的の抗原（抗体産生細胞）に対する抗体を産生した細胞を生成した。次いで、抗体産生細胞を、本明細書に記載される方法に従って収集した。

【0205】

一般的に、免疫原、例えば、目的の膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡもしくはその部分、目的の精製された膜貫通タンパク質もしくはその部分、目的の膜貫通タンパク質もしくはその部分を含有する脂質二重層膜足場タンパク質複合体もしくはその部分、目的の膜貫通タンパク質を含有する、もしくは目的の膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡを発現することができるウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはその組み合わせを注射することによって、マウスを免疫化した。一部の例では、免疫原は、ヒト膜貫通タンパク質またはそれをコードするＤＮＡであった。他の例では、マウスを、目的のキメラ膜貫通タンパク質、膜貫通タンパク質の切断形態、目的の改変された膜貫通タンパク質、またはそれをコードするＤＮＡで免疫化した。

【0206】

本明細書に記載の方法で使用する膜貫通タンパク質を、以下のように生成した。一般に、膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、膜貫通タンパク質のカルボキシ末端に貼り付けられたＦＬＡＧタグおよびヒスチジンタグ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）を含むように改変された。改変されたヌクレオチド配列は、Ｓｆ９細胞またはＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に発現した。次いで、細胞を、Ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ）界面活性剤を使用して可溶化し、遠心分離して、改変膜貫通タンパク質を含有する界面活性剤可溶性画分を得た。次いで、改変タンパク質を、抗ＦＬＡＧ親和性ビーズを用いた親和性精製により、界面活性剤可溶性画分から単離し、これが改変膜貫通タンパク質に結合した。次いで、親和性ビーズおよびタンパク質を洗浄し、結合した膜貫通タンパク質をそれから溶出し、回収した。精製した膜貫通タンパク質の単離を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動およびウェスタンブロットにより検証した。

【0207】

精製された膜貫通タンパク質を組み込む脂質二重層膜足場タンパク質複合体が形成された。精製した膜貫通タンパク質は、ＤＤＭおよびコレステリルヘミスクシネートトリス塩（ＣＨＳ）からなる洗剤混合物に含まれた。この膜貫通タンパク質および洗剤混合物を、改変ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１膜足場タンパク質を含有する脂質混合物に対して１～１３０の膜足場タンパク質と合わせ、それはビオチニル化のためのＢｉｒ－Ａタグをカルボキシ末端、およびコール酸ナトリウム洗剤緩衝液に溶解されたホスファチジルコリン（１－パルミトイル－２－オレオイル－グリセロ－３－ホスホコリン）脂質を含み、膜貫通タンパク質、洗剤、膜足場タンパク質脂質および２０の膜足場タンパク質に対して１の膜貫通タンパク質の比で含有する緩衝液からなる最終混合物を作製した。洗剤は、その後、ビーズを使用して最終混合物から抽出され、目的の単一の膜貫通タンパク質を統合した円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体の構築を容易にした。目的の膜貫通タンパク質を組み込んだ円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、１０ｘ－ｈｉｓタグ親和性精製および／または分子ふるいクロマトグラフィーを使用して、目的の膜貫通タンパク質を含まない円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体から分離されて、さらなる使用のために目的の膜貫通タンパク質を組み込んだ円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体を得た。

【0208】

免疫化されるマウスは変えた。特定のコホートでは、目的の膜貫通タンパク質が内因性遺伝子から発現されないように、マウスを遺伝子操作した。他のコホートでは、マウスは野生型マウスであり、目的の膜貫通タンパク質のマウスホモログを発現いた。一部のコホートでは、マウスは、米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、第８，７９１，３２３号、第９，２２６，４８４号、およびＷＯ２０１９／１１３０６５、それらすべてが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、に記載されるように遺伝子操作された。一部のコホートでは、免疫化された遺伝子操作マウスは、例えば、米国特許第８，５０２，０１８号および／または第８，６４２，８３５号、それらそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、に記載されるようにＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）であった。一般的に、免疫化に使用されるＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含み、目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子を欠く場合もある。特定のコホートでは、ヒト化ＩｇＨ座位および／またはヒト化Ｉｇκ座位を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを免疫した。一部のコホートでは、目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子を欠くヒトイムノグロブリン重鎖およびイムノグロブリンラムダ軽鎖（Ｉｇλ）可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作マウスに、免疫原を注射した。

【0209】

抗体免疫応答は、目的の膜貫通タンパク質またはその一部分を発現するように操作された細胞を使用した細胞結合アッセイによってモニターされた。免疫化されたマウスにおいて所望の免疫応答が識別されると、それらの脾臓が採取された。脾細胞を取得し、赤血球細胞を溶解により除去した。

【0210】

ハイブリドーマが形成されて使用された例では、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合して、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。その後、ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、目的の膜貫通タンパク質に対する抗体を産生する細胞株を識別した。

【0211】

抗体産生細胞も、抗原陽性Ｂ細胞で単離した。マウスを免疫化すると、脾臓を採取した。脾細胞を取得し、赤血球細胞を溶解により除去した。次いで、脾細胞を、ＩｇＧなどのＢ細胞表面マーカーに特異的な蛍光色素標識抗体で染色して、Ｂ細胞を識別した。

【0212】

一般に、抗体産生Ｂ細胞の集団は、Ｂ細胞を、周知のソーティング剤、例えば、生成された膜貫通タンパク質もしくはその部分、目的のキメラ膜貫通タンパク質、目的の節ファンされた膜貫通タンパク質、ＶＬＰもしくはエクソソームの目的の膜貫通タンパク質、または目的の膜貫通タンパク質もしくはその部分を組み込んだ脂質二重層膜足場タンパク質複合体のいずれかと接触させることによって識別されて、目的の膜貫通タンパク質をＢ細胞の表面に存在する抗体に結合することを可能にする。次いで、ＦＡＣＳを使用して結合したＢ細胞を収集して、目的の膜貫通タンパク質に対する抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の集団を得た。複合体（対照）を含まない試料では、ＦＡＣＳを介してペプチドまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いて選別を行い、異種のＢ細胞集団から抗体産生Ｂ細胞を得た。複合体を有する試料では、ＦＡＣＳを介して蛍光標識された複合体を用いて選別を行い、抗体産生Ｂ細胞を得た。ここで、Ｂ細胞を、目的の膜貫通タンパク質を含有するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、結合していない複合体を除去した。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となった。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去した。Ｂ細胞試料のＰＥ蛍光をＦＡＣＳにより分析し、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する細胞集団を識別した。

【0213】

実施例２．抗体産生細胞の集団からの抗体の生成。
比較のために、抗体を、脂質二重層膜足場タンパク質複合体を有する場合、または有しない場合で、従来のハイブリドーマ技術または細胞ソーティングのいずれかによってスクリーニングのために単離した。抗体産生Ｂ細胞集団からの単一細胞を、３８４ウェルプレート上の個々のウェルで単離した。これらの単離された抗体産生Ｂ細胞からの抗体遺伝子のＲＴ－ＰＣＲを、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌａｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）２４４：２１７～２２５、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、に記載される方法に従って実施した。端的に、各々の単一抗体産生Ｂ細胞のｃＤＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）反応（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を介して合成された。次いで、得られた各々のＲＴ産物を分け、二つの３８４ウェルプレート上の二つの対応するウェルに移した。得られたＲＴ産物の１セットを、まず、ヒトＩｇＧ重鎖可変領域リーダー配列に特異的な５’縮重プライマー、およびマウス重鎖定常領域に特異的な３’プライマーを使用してＰＣＲにより増幅し、アンプリコンを形成した。次いで、ヒトＩｇＧ重鎖可変領域配列のフレームワーク１に特異的な５’縮重プライマーセット、およびヒトＩｇＧ重鎖可変領域配列のフレームワーク４に特異的な３’縮重プライマーセットを使用して、アンプリコンをＰＣＲにより再び増幅した。得られたＲＴ産物の他のセットを、まずヒトカッパまたはラムダ軽鎖可変領域リーダー配列に特異的な５’縮重プライマー、およびマウスカッパまたはラムダ軽鎖定常領域に特異的な３’プライマーを使用してＰＣＲにより増幅して、アンプリコンを形成した。次いで、アンプリコンを、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖可変領域配列のフレームワーク１に特異的な５’縮重プライマーセット、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖可変領域配列のフレームワーク４に特異的な３縮重プライマーセットを使用して、ＰＣＲにより再び増幅した。重鎖と軽鎖のＰＣＲ産物をそれぞれ、ＩｇＧ１重鎖定常領域とカッパ軽鎖定常領域を含有する抗体ベクターにクローニングした。組換えヒトＩｇＧ１抗体は、ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによって産生された。

【0214】

抗体産生細胞から得られた抗体の一次スクリーニングを、細胞結合について試験した。目的の膜貫通タンパク質と各抗体との間の結合の解離定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上で決定した。様々な条件下でのいくつかのキャンペーンの結果は、目的の膜貫通タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を使用した細胞ソーティングが、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体の識別に最も成功したことを示した。表１を参照されたい。

【表1】

【0215】

実施例３．脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって包含される目的の膜貫通タンパク質と抗体との間の結合の検出。
この例では、ＧＰＣＲ１タンパク質配列のカルボキシ末端にＦＬＡＧ－タグおよびＨｉｓ－タグ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）を貼り付けるように例示的なヒト膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１）をコードするヌクレオチド配列を改変し、改変ヌクレオチド配列を細胞内で発現し、実施例１に記載されるように精製した。次いで、目的の例示的なＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質を脂質二重層膜足場タンパク質複合体に組み込み、目的のＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を、実施例１に記載されるように精製した。

【0216】

周知の抗ＧＰＣＲ１抗体の、目的のＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体への結合能力は、図１Ａおよび１Ｂに示されるオクテットアッセイによって確認した。詳細には、ＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質を含む、３８μｇ／ｍＬの円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体、またはＧＰＣＲ１を含まない（空の複合体）１０μｇ／ｍＬの対照の円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体が、固定された抗ＧＰＣＲ１抗体（陽性対照ＡＢ）またはアイソタイプ対照抗体（陰性対照ＡＢ）を有するプレートに供給された。

【0217】

陽性対照（抗ＧＰＣＲ１）抗体と、ＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質を含む円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体（０．６ｎｍ）との間で結合が検出され、抗ＧＰＣＲ１抗体と空の複合体（－０．０５ｎｍ）との間、陰性対照抗体とＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質を含む円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体（－０．０６ｎｍ）との間、または陰性対照抗体と空の複合体（－０．０３ｎｍ）との間では、結合は検出されなかった。図１Ａを参照。複合体によって提示されるが複合体自体によっては提示されない目的の膜貫通タンパク質が、目的の膜貫通タンパク質に向けられた抗体に結合することを確認する。

【0218】

目的の膜貫通タンパク質を提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体を検出し、対照の脂質二重層膜足場タンパク質複合体から単離することができることを確認するために、ビオチン化対照の脂質二重層膜足場タンパク質複合体（空の複合体）、ＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１との複合体）を提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体または対照の脂質二重層膜足場タンパク質複合体、ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体（空の複合体）を、ストレプトアビジンを連結したプレートに供給し、ストレプトアビジンを複合体の膜足場タンパク質に貼り付けられたＢｉｒ－Ａタグに結合させることを可能にする。次いで、プレートを、５０μｇ／ｍＬの抗ＧＰＣＲ１抗体（陽性対照ＡＢ）または５０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照抗体（陰性対照ＡＢ）のいずれかとインキュベートした。図１Ｂを参照。

【0219】

最初に、図１Ｂは、目的のＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質を提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体およびビオチン化対照の脂質二重層膜足場タンパク質複合体が、複合体の膜足場タンパク質のそれぞれに貼り付けられたＢｉｒ－Ａタグに結合しているストレプトアビジンによって検出され、単離されたことを示す。これは、連結したストレプトアビジンと、ＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質（３．０ｎｍ）およびビオチン化空の複合体（０．６９ｎｍ）を含む、ビオチン化円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体の両方との間の結合を検出することによって示される。

【0220】

陽性対照（抗ＧＰＣＲ１）抗体と、ストレプトアビジンプレートに連結されたＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質を含むビオチン化円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体（０．６９ｎｍ）との間で結合が検出されたが、抗ＧＰＣＲ１抗体とビオチン化空の複合体（－０．０４ｎｍ）、陰性対照抗体と膜貫通タンパク質を含むビオチン化円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体（－０．０５ｎｍ）、または陰性対照抗体と空のビオチン化複合体（－０．０６ｎｍ）との間で結合は検出されなかった。図１Ｂを参照すると、ストレプトアビジンプレートに連結したビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、目的の膜貫通タンパク質を提示し、抗ＧＰＣＲ１抗体に特異的に結合するが、対照抗体には結合しないことを示している。

【0221】

実施例４．目的の例示的な膜貫通タンパク質に特異的に結合する抗体を発現する抗体産生細胞の取得。
第一、第二および第三の例示的なヒト膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓ ｔａｇ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）を膜貫通タンパク質のカルボキシ末端に貼り付くように改変し、改変されたヌクレオチド配列は細胞に発現し、実施例１に記載されるように精製された。目的の第一、第二または第三の例示的な膜貫通タンパク質のいずれかを包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を、Ｂｉｒ－Ａ標識膜足場タンパク質を使用して生成し、実施例１および３に記載されるように精製した。

【0222】

脾細胞は、目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子を欠くヒト化ＩｇＨ座位および／またはヒト化ＩＩｇκ座位を含む遺伝子改変されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから採取された。免疫化されていない対照マウス、または以下の注射によって免疫化された遺伝子改変マウスから、細胞を単離した：目的の第一の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ１）、目標の第二の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ２）、または目的の第三の膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ３）をコードするＤＮＡ。ここで、各マウスを遺伝子改変した。各マウスから収集された脾細胞を、蛍光標識でＢ細胞マーカー（すなわち、抗ＩｇＧ抗体）に染色し、同時に、そこに組み込まれた膜貫通タンパク質を含有する０．２ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬのビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、結合していない複合体を除去した。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となった。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去した。対照マウスおよび免疫化マウスからの細胞集団のＰＥ蛍光をＦＡＣＳによって検出し、ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現するＢ細胞集団を識別した。図２Ａ～図２Ｆを参照されたい。

【0223】

１００万の対照細胞のたった二つのＢ細胞のみがビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示されたＧＰＣＲ１膜貫通タンパク質に非特異的に結合し（図２Ａ、長方形）、目的の膜貫通タンパク質を含有する脂質二重層膜足場タンパク質複合体が膜貫通タンパク質抗原に向けて抗体を産生する細胞を検出し、単離するための非常に特異的なソーティング剤であることを示している。比較すると、ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される目的の第一の膜貫通タンパク質に結合する抗体産生Ｂ細胞の１００万個中１１個が、本発明の方法を使用して検出された（図２Ｂ、長方形）。

【0224】

図２Ｃに示されるように、対照マウスから得られた１００万個の脾細胞の二つのＢ細胞は、目的の第二の膜貫通タンパク質を提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体に対する非特異的な結合剤として検出された。目的の第二の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質に特異的な抗体（ＧＰＣＲ２）を発現する１００万個のＢ細胞のうち７８個は、図２Ｄに示されるように、本発明の方法を使用して検出された（長方形）。

【0225】

さらに別の例では、目的の第三の膜貫通タンパク質を提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体に非特異的に結合された１１個のＢ細胞のみが対照マウスから収集された１００万個の脾細胞から得られた。図２Ｅを参照されたい。一方で、目的の第三の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ３）に特異的な一次抗体を発現する１００万個のＢ細胞のうち６５個／が免疫化された遺伝子改変マウスから採取された脾細胞から検出され、得られた。

【0226】

実施例５．既知の細胞ソーティング戦略と、脂質二重層膜足場タンパク質複合体の使用を含むソーティング方法との比較。
技術分野で公知の抗体産生細胞を取得するための方法の有用性を本明細書に開示される発明の方法と比較するために、目的のヒト膜貫通タンパク質の例をコードするＤＮＡを実施例１に従って精製した。目的の膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡを用いたマウスコホートの免疫化のために、精製されたヒトＤＮＡを、目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子を発現する、または発現しない遺伝子操作されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに注射した。目的の膜貫通タンパク質で免疫化されたコホートについては、第一の例示的なヒト膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列を細胞中で発現し、実施例１に記載されるように精製し、注射により目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子を発現するまたは発現しない遺伝子操作されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに直接投与した。

【0227】

特定のコホートでは、マウスをＶＬＰで免疫した。目的のヒト膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドを作製し、ウイルス細胞内で発現させた。リポ粒子は、ウイルス細胞内で自己組織化され、ペグ化（ＰＥＧ）沈殿によって出芽が発生すると、ウイルス細胞から単離および精製され、その後、等密度遠心法およびウイルス細胞媒体の分画が行われた。精製されたＶＬＰを、公知の技術を使用して免疫化のためにマウスに注射した。

【0228】

比較のために、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子（ＶＩ－ＫＯ）を含む（ＶＩ）、または含まない（ＶＩ－ＫＯ）場合で、表２に記載されるように注射により免疫化した。

【0229】

次に、表２に記載されるソーティング戦略を使用して、抗体産生Ｂ細胞の集団を単離した。詳細には、脾細胞を、免疫された遺伝子改変マウスから収集した。収集した脾細胞を、Ｂ細胞マーカー（すなわち、抗ＩｇＧ抗体）への蛍光標識で染色し、０．２ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬの目的のソーティング剤ビオチン化膜貫通タンパク質（タンパク質）、または目的の膜貫通タンパク質を包含する０．２ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬのビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体（ＴＭＢとの複合体）、または表２に記載される２．０ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬのビオチン標識されたＶＬＰソーティング剤（ＶＬＰ）で同時にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、結合していないソーティング剤を除去した。続いて、細胞をＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートし、ビオチン（Ｂｉｒ－Ａ）標識ソーティング剤の各々へのストレプトアビジンの結合を可能にした。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去し、Ｂ細胞の試料のＰＥ蛍光をＦＡＣＳによって分析して、ソーティング剤によって提示される目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する不均一な細胞集団中のＢ細胞を識別した。

【0230】

次いで、目的の膜貫通タンパク質に結合するＢ細胞を産生する単一抗体を、実施例２に記載される３８４ウェルプレート上の個々のウェルに単離した。これらのＢ細胞由来の抗体遺伝子のＲＴ－ＰＣＲを、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌａｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）２４４：２１７～２２５に記載される方法に従って実施した。端的に、各々の単一Ｂ細胞のｃＤＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）反応（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を介して合成された。次いで、得られた各々のＲＴ産物を分け、二つの３８４ウェルプレート上の二つの対応するウェルに移した。得られたＲＴ産物の１セットを、まず、ヒトＩｇＧ重鎖可変領域リーダー配列に特異的な５’縮重プライマー、およびマウス重鎖定常領域に特異的な３’プライマーを使用してＰＣＲにより増幅し、アンプリコンを形成した。次いで、ヒトＩｇＧ重鎖可変領域配列のフレームワーク１に特異的な５’縮重プライマーセット、およびヒトＩｇＧ重鎖可変領域配列のフレームワーク４に特異的な３’縮重プライマーセットを使用して、アンプリコンをＰＣＲにより再び増幅した。得られたＲＴ産物の他のセットを、まずヒトカッパまたはラムダ軽鎖可変領域リーダー配列に特異的な５’縮重プライマー、およびマウスカッパまたはラムダ軽鎖定常領域に特異的な３’プライマーを使用してＰＣＲにより増幅して、アンプリコンを形成した。次いで、アンプリコンを、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖可変領域配列のフレームワーク１に特異的な５’縮重プライマーセット、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖可変領域配列のフレームワーク４に特異的な３縮重プライマーセットを使用して、ＰＣＲにより再び増幅した。重鎖と軽鎖のＰＣＲ産物をそれぞれ、ＩｇＧ１重鎖定常領域とカッパ軽鎖定常領域を含有する抗体ベクターにクローニングした。組換えヒトＩｇＧ１抗体は、ＣＨＯ Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションによって産生され、目的の膜貫通タンパク質に結合する能力について分析された。

【表2】

【0231】

表２は、脂質二重層膜足場タンパク質複合体を利用して膜貫通タンパク質を提示する抗体産生細胞を取得する方法が、使用される免疫原とは独立して、他のソーティング剤と比較した場合、目的の膜貫通に特異的に結合する抗体を発現する抗体産生細胞をより多く検出することを示す。

【0232】

目的の膜貫通タンパク質（ＶＩ）をコードする内因性マウス遺伝子を発現する遺伝子改変マウスから得られた精製された膜貫通タンパク質ソーティング剤で選別された細胞は、目的の膜貫通タンパク質（ＶＩ－ＫＯ）をコードする内因性マウス遺伝子を発現せず、膜貫通タンパク質を提示した脂質二重層膜足場タンパク質複合体で選別した遺伝子改変マウスから得られたものと比較した場合、目的の膜貫通タンパク質に結合する抗体をより多く生成した。しかしながら、分析すると、ＶＩマウスから生成された抗体は機能的結合物質ではなかった。脂質二重層膜足場タンパク質複合体を使用して膜貫通タンパク質を提示する抗体産生細胞を取得する方法は、膜貫通タンパク質の機能的に関連のあるエピトープに結合する抗体を取得することを示す。

【0233】

実施例６．目的の第二の例示的ＧＰＣＲ膜貫通タンパク質に結合する抗体の生成および単離。
目的のＧＰＣＲ膜貫通タンパク質（ＧＰＣＲ２）の第二の例をコードするヌクレオチド配列を、ＦＬＡＧタグおよびＧＰＣＲ２タンパク質のカルボキシ末端に貼り付けられた１０ｘ－Ｈｉｓタグを含むように実施例１に記載されるように改変した。さらに、以下の安定化変異を膜貫通タンパク質に導入した：アミノ酸置換：Ａ２ａ－Ｔ４Ｌ－デルタ、Ｖｅｌｉ－Ｐｅｋｋａ Ｊａａｋｏｌａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８年１１月２１日、３２２（５９０５）ｐｐ．１２１１－１２１７に記載されており、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。改変ＧＰＣＲ２ヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングし、Ｓｆ９細胞に発現した。次いで、細胞を可溶化し、改変ＧＰＣＲ２膜貫通タンパク質を取得して、実施例１のように精製した。

【0234】

次に、改変ヒトＧＰＣＲ２膜貫通タンパク質を含有する円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体を、実施例１および本明細書に記載されるように生成した。

【0235】

遺伝子改変されたＧＰＣＲ２ノックアウトマウス、すなわち、ヒト化ＩｇＨ座位と、目的の膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子も欠いているヒト化Ｉｇκ座位とを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、表３に示されるように、安定化変異（ＤＮＡ免疫原）を含む改変ヒトＧＰＣＲ２タンパク質をコードする外因性ＤＮＡの注射、または安定化変異を含む改変ヒトＧＰＣＲ２タンパク質の注射（タンパク質免疫化）により免疫化された。

【0236】

脾細胞が各マウスから収集され、蛍光標識でＢ細胞マーカー（すなわち、抗ＩｇＧ抗体）に染色し、同時に、そこに組み込まれた膜貫通タンパク質を含有する０．２ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬのビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、結合していない複合体を除去した。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となった。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去した。対照マウスおよび免疫化マウスからの細胞集団のＰＥ蛍光をＦＡＣＳによって検出して、ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される、目的の第二の例示的なＧＰＣＲ膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現するＢ細胞集団を識別した。

【0237】

次いで、目的の膜貫通タンパク質に結合したＢ細胞を産生する単一抗体を、３８４ウェルプレート上の個々のウェルに単離し、ＤＮＡをコードする抗体を各細胞から単離し、さらなる分析のために実施例２に記載されるように抗体を生成した。

【0238】

図３は、抗体産生細胞を取得するための発明の方法が、使用される免疫原のタイプとは無関係に、目的の膜貫通に特異的に結合する抗体を発現する抗体産生細胞を検出することを示す。詳細には、抗体産生細胞は、開示される方法に従って、目的の膜貫通タンパク質を提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体を使用して、膜貫通タンパク質（ＤＮＡ）をコードするＤＮＡ（ＤＮＡ）または精製された目的の膜貫通タンパク質（タンパク質）をコードするＤＮＡのいずれかで免疫化された遺伝子操作されたマウスから取得した。抗体は、実施例２に記載されるようにスクリーニングのために作製された。目的の抗原の完全長膜貫通タンパク質は、標準的なトランスフェクション技術を使用して、２９３細胞（ＴＭＢ過剰発現）に発現し、抗原発現２９３細胞を、目的の例示的な膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトされなかった対照の２９３細胞（親細胞）と比較した。次いで、細胞を抗体とインキュベートして、細胞の表面上の抗原と、目的の例示的な膜貫通タンパク質に特異的に結合する抗体との結合を可能にした。ＭＳＤ（メソスケール診断法）イムノアッセイを製造業者に従って実施し、５つの異なる免疫化マウスから得られた抗体産生細胞から生成された細胞結合抗体を識別した。マウス１、３、４および５は、精製ヒトＧＰＣＲ２膜貫通タンパク質で免疫し、マウス２は、ヒトＧＰＣＲ２膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡで免疫した。破線上の抗体は、目的の膜貫通タンパク質に結合することができた。対照的に、破線下の抗体は、陽性（正方形）および陰性（三角形）対照抗体との比較によって示されるように、弱い結合物質であるか、または目的の膜貫通タンパク質に結合することができなかった。

【0239】

結果は、本発明の方法を使用して得られた抗体産生細胞は、マウスが目的の膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡまたは目的の精製された膜貫通タンパク質で免疫されたかどうかに関わらず、目的の膜貫通タンパク質に結合することができる十分な量の抗体を産生することができることを示した。

【0240】

表３に示されるように、Ｂ細胞は、膜貫通タンパク質（ＴＭＢを含む複合体）を提示するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体を使用して、各免疫化マウスから取得され、抗体は、収集されたＢ細胞のサブセットから生成され、抗体は、目的の抗原に結合する能力をイムノアッセイにより試験された。目的の膜貫通タンパク質（抗原）に特異的に結合する抗体を発現する抗体産生細胞は、マウスが膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡまたは精製された膜貫通タンパク質で免疫されたかどうかに関わらず、本発明の方法を使用して豊富に取得された。

【表3】

【0241】

実施例７．目的の例示的な膜貫通タンパク質の特定のドメインに結合する抗体を発現する抗体産生細胞の取得。
本発明の方法を使用して、目的の膜貫通タンパク質の特定のドメインに位置するエピトープに特異的に結合する抗体も生成した。

【0242】

第一の例では、完全長ヒト膜貫通タンパク質（完全長ＴＭＢ）をコードするヌクレオチド配列を改変して、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）を膜貫通タンパク質のカルボキシ末端に貼り付け、実施例１に記載されるように精製および単離した。さらに、Ｎ末端の細胞外部分を喪失している切断されたヒト膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに改変して、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）を膜貫通タンパク質のカルボキシ末端に貼り付け、改変ヌクレオチド配列は細胞に発現し、実施例１に記載されるように精製した。切断ＴＭＢを包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、Ｂｉｒ－Ａ標識膜足場タンパク質を使用して生成され、実施例１および３に記載されるように精製された。ここで、切断ＴＭＢタンパク質は、細胞外ループドメイン、膜貫通ドメイン、および野生型ヒト膜貫通タンパク質の細胞内Ｃ末端ドメインの各々を含むが、細胞外Ｎ末端ドメインを含まない。したがって、切断ＴＭＢを包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、野生型ヒト膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインのみを細胞に提示する。

【0243】

ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、完全長ＴＭＢをコードするＤＮＡで免疫化した。免疫応答をモニターし、脾細胞を免疫化されたマウスから採取した。各マウスから収集された脾細胞を、蛍光標識でＢ細胞マーカー（すなわち、抗ＩｇＧ抗体）に染色し、同時に、そこに組み込まれた切断ＴＭＢを提示する０．２ｍｇ／ｍｌ～５．０ｍｇ／ｍＬのビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートして、切断ＴＭＢの細胞外ドメイン上のエピトープと、Ｂ細胞の表面上の抗体との結合を可能にした。次いで、細胞を洗浄して、結合していない複合体を除去した。その後、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となった。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去した。マウスから収集された細胞集団のＰＥ蛍光をＦＡＣＳによって検出し、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインに特異的な抗体を発現するＢ細胞集団を識別した。

【0244】

次いで、目的の膜貫通タンパク質に結合した単一の抗体産生Ｂ細胞を、３８４ウェルプレート上の個々のウェルに単離し、ＤＮＡをコードする抗体を各細胞から単離し、さらなる分析のために実施例２に記載されるように抗体を生成した。

【0245】

図４に示すように、目的の例示的な膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインに位置するエピトープに結合する抗体を、本発明の方法（箱形）を使用して得た。

【0246】

別の例では、完全長ヒト膜貫通タンパク質（完全長ＴＭＢ）をコードするヌクレオチド配列を改変して、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）を膜貫通タンパク質のカルボキシ末端に貼り付け、実施例１に記載されるように精製および単離する。さらに、ヒト膜貫通タンパク質（ＴＭＢ断片）の一部分をコードするヌクレオチド配列が生成され、ＴＭＢ断片ヌクレオチド配列が細胞に発現し、実施例１に記載されるように精製する。ここで、ＴＭＢ断片ポリペプチドＴＭＢは、目的の完全長膜貫通タンパク質のＮ末端部分に相当する。

【0247】

完全長ＴＭＢを包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、Ｂｉｒ－Ａ標識膜足場タンパク質を使用して生成され、実施例１および３に記載されるように精製された。

【0248】

一般に、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、完全長ＴＭＢをコードするＤＮＡで免疫化し、または完全長ＴＭＢで精製した。免疫応答をモニターし、脾細胞を免疫化されたマウスから採取する。各マウスから採取された脾細胞は、ＴＭＢ断片とインキュベートされ、ＴＭＢ断片と、完全長ＴＭＢのＮ末端に位置するエピトープに特異的な細胞表面上の抗体との間の結合を可能にする。このステップは、完全長ＴＭＢのＮ末端ドメインのエピトープに特異的な抗体を発現するすべての抗体産生細胞を、埋め込まれた完全長ＴＭＢを含有するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される完全長ＴＭＢへの結合から効果的に遮断する。次いで、細胞を蛍光標識でＢ細胞マーカー（すなわち、抗ＩｇＧ抗体）に対して染色して、脾細胞集団中の抗体産生Ｂ細胞を識別し、また完全長ＴＭＢを包含する０．２ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬのビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートして、完全長ＴＭＢの細胞外ループドメイン上のエピトープと、抗体産生Ｂ細胞の表面上の抗体との結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄して、結合していない複合体を除去する。細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンおよびＴＭＢ断片に結合した細胞を選別から除去する。マウスから収集された細胞集団のＰＥ蛍光をＦＡＣＳによって検出し、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインに特異的な抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の集団を識別する。

【0249】

次いで、目的の膜貫通タンパク質に結合する単一の抗体産生Ｂ細胞を、３８４ウェルプレート上の個々のウェルに単離し、ＤＮＡをコードする抗体を各細胞から単離し、さらなる分析のために実施例２に記載されるように抗体を生成する。

【0250】

別の例では、目的のヒト膜貫通タンパク質の一部分と、目的の膜貫通タンパク質のマウスホモログの一部分から構成される目的のキメラ膜貫通タンパク質を使用して、目的の膜貫通タンパク質の特定のドメインに位置するエピトープに特異的に結合する抗体を生成する。

【0251】

ここで、キメラ膜貫通タンパク質は、目的の膜貫通タンパク質のマウスホモログの一部に操作可能に結合された対象のヒト膜貫通タンパク質の一部分をコードするヌクレオチド配列を生成し、さらにヌクレオチド配列を改変して、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）をキメラ膜貫通タンパク質のカルボキシ末端に貼り付けることによって作製される。次いで、ヌクレオチド配列を精製し、実施例１に記載されるように単離する。さらに、キメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、細胞内に発現され、実施例１に記載されるように精製されて、目的の標識されたキメラ膜貫通タンパク質（キメラＴＭＢ）を生成する。この例では、目的のキメラ膜貫通タンパク質は、膜貫通タンパク質および細胞外ループドメイン、膜貫通ドメイン、および目的のヒト膜貫通タンパク質の細胞内Ｃ末端ドメインのマウスホモログに対応するＮ末端を有する。

【0252】

さらに、野生型ヒト膜貫通タンパク質（ヒトＴＭＢ）をコードするヌクレオチド配列は、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）を膜貫通タンパク質のカルボキシ末端に貼り付け、精製および単離されるように改変され、次いでヒト膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、細胞に発現し、実施例１に記載されるように精製される。

【0253】

ヒトＴＭＢまたはキメラＴＭＢを包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、Ｂｉｒ－Ａ標識膜足場タンパク質を使用して生成され、実施例１および３に記載されるように精製される。

【0254】

ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子改変ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、ヒトＴＭＢまたは精製ヒトＴＭＢタンパク質をコードするＤＮＡで免疫化される。免疫応答をモニターし、脾細胞を免疫化されたマウスから採取する。各マウスから収集された脾細胞は、蛍光標識でＢ細胞マーカー（すなわち、抗ＩｇＧ抗体）に対して染色され、同時に、キメラＴＭＢを包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされ、複合体によって提示されるキメラ－ＴＭＢのヒト部分上のエピトープと、Ｂ細胞の表面上の抗体との間の結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄して、結合していない複合体を除去する。

【0255】

細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンおよびＴＭＢ断片に結合した細胞を選別から除去する。マウスから収集された細胞集団のＰＥ蛍光をＦＡＣＳによって検出し、目的の膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインに特異的な抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の集団を識別する。

【0256】

この免疫およびソーティング戦略は、キメラＴＭＢのマウス部分に位置するヒト－ＴＭＢのエピトープに特異的な抗体を発現する、すべての抗体産生Ｂ細胞を効果的に除去する。

【0257】

別の免疫およびソーティング戦略では、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子改変されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、キメラＴＭＢまたは精製キメラＴＭＢタンパク質をコードするＤＮＡで免疫化する。免疫応答をモニターし、脾細胞を免疫化されたマウスから採取する。各マウスから収集された脾細胞は、Ｂ細胞マーカー（すなわち、抗ＩｇＧ抗体）に対して蛍光標識で染色され、同時に、ヒトＴＭＢを包含するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされ、複合体によって提示されるヒト－ＴＭＢの細胞外部分に位置するエピトープと、Ｂ細胞の表面上の抗体との間の結合を可能にする。次いで、細胞を洗浄して、結合していない複合体を除去する。

【0258】

細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを選別から除去する。マウスから収集された細胞集団のＰＥ蛍光をＦＡＣＳによって検出して、目的のヒト膜貫通タンパク質の細胞外ループドメインに特異的な抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の集団を識別する。

【0259】

この特定の免疫化およびソーティング戦略はまた、キメラ－ＴＭＢのマウス部に位置するエピトープに特異的な抗体を発現する、すべての抗体産生Ｂ細胞を効果的に除去する。

【0260】

その後、複合体によって提示された目的の膜貫通タンパク質に結合する単一の抗体産生Ｂ細胞を３８４ウェルプレートの個別のウェルに単離することができ、実施例２のように抗体の生成および分析のために、ＤＮＡをコードする抗体を各細胞から単離する。

【0261】

実施例８．目的の膜貫通タンパク質の特異的な交差反応性抗体を発現する抗体産生細胞の取得。
本発明の方法を使用して、目的の例示的な膜貫通タンパク質のマウス形態とヒト形態の両方を認識する抗体も作製した。

【0262】

二つの異なる例示的なヒト膜貫通タンパク質をコードする核酸、ヒトＴＭＢ１、およびヒトＴＭＢ２を改変して、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）を、各ヒト膜貫通タンパク質アミノ酸配列のカルボキシ末端に貼り付け、実施例１に記載されるように精製した。さらに、二つのヒト膜貫通タンパク質のそれぞれのマウスホモログをコードする核酸、マウスＴＭＢ１およびマウスＴＭＢ２を改変して、各マウス膜貫通タンパク質アミノ酸のカルボキシ末端にＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）を貼り付け、改変されたヌクレオチド配列を実施例１に記載されるように精製した。次に、ヒトＴＭＢ１、ヒトＴＭＢ２、マウスＴＭＢ１、およびマウスＴＭＢ２をそれぞれコードする核酸が各々、細胞に発現し、各タンパク質を、実施例１に記載されるように単離および精製した。ヒトＴＭＢ１タンパク質、ヒトＴＭＢ２タンパク質、マウスＴＭＢ１タンパク質、およびマウスＴＭＢ２タンパク質の一つを包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を、Ｂｉｒ－Ａ標識膜足場タンパク質を使用して生成し、実施例１に記載されるように精製した。

【0263】

目的の膜貫通タンパク質（すなわち、マウスＴＭＢ１またはマウスＴＭＢ２）に対して内因性マウスホモログを発現しないヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、マウスもしくはヒト膜貫通タンパク質をコードする外因性ＤＮＡ、または表４に記載されるように、ヒトＴＭＢ１およびマウスＴＭＢ２タンパク質をコードする外因性ＤＮＡの組み合わせを注射することによって、免疫化した。

【0264】

免疫応答をモニターし、脾細胞を免疫化されたマウスから採取した。各マウスから採取した脾細胞を、蛍光標識でＢ細胞マーカー（すなわち、抗ＩｇＧ抗体）に対して染色すると同時に、特定のヒトＴＭＢタンパク質（ヒトＴＭＢを含む複合体）または特定のマウスＴＭＢタンパク質（マウスＴＭＢを含む複合体）のいずれかを含むビオチン化脂質－二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートし、ビオチン化脂質－二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される目的膜貫通タンパク質とＢ細胞の表面上の抗体との間の結合を可能にする。細胞は、次いで、洗浄されて、結合していない複合体を除去し、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを選別から除去した。マウスから収集された細胞集団のＰＥ蛍光をＦＡＣＳによって検出して、目的の膜貫通タンパク質に特異的な抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の集団を識別した。

【0265】

次いで、目的の膜貫通タンパク質に結合した単一の抗体産生Ｂ細胞を、３８４ウェルプレート上の個々のウェルに単離し、ＤＮＡをコードする抗体を各細胞から単離し、さらなる分析のために実施例２に記載されるように抗体を生成した。

【0266】

表４に示されるように、マウスＴＭＢ１のみをコードするＤＮＡで遺伝子改変されたマウスの免疫化、およびヒトＴＭＢ１タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を有する抗体産生Ｂ細胞のソーティングにより、マウスＴＭＢ１およびヒトＴＭＢ１タンパク質を結合することができる交差反応性抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞が識別される。

【0267】

さらに、マウスＴＭＢ１タンパク質をコードするＤＮＡと、ヒトＴＭＢ１タンパク質をコードするＤＮＡとを一緒にコードするＤＮＡで遺伝子改変されたマウスの免疫化、およびヒトＴＭＢ１タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体、またはマウスＴＭＢ１タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体のいずれかによる抗体産生Ｂ細胞のソーティングによって、マウスＴＭＢ１およびヒトＴＭＢ１タンパク質を結合することができる交差反応性抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞が識別された。

【0268】

表４はまた、マウスＴＭＢ２のみをコードするＤＮＡで遺伝子改変されたマウスの免疫化、およびヒトＴＭＢ２タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を有する抗体産生Ｂ細胞のソーティングまたはマウスＴＭＢ２タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を有する抗体産生Ｂ細胞のソーティングにより、マウスＴＭＢ２およびヒトＴＭＢ２タンパク質を結合することができる交差反応性抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞が識別されることを示す。マウスＴＭＢ２のみをコードするＤＮＡで遺伝子改変されたマウスの免疫化、およびヒトＴＭＢ２タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を有する抗体産生Ｂ細胞のソーティングまたはマウスＴＭＢ２タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を有する抗体産生Ｂ細胞のソーティングにより、マウスＴＭＢ１およびヒトＴＭＢ１タンパク質を結合することができる交差反応性抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞も識別される。

【表4】

【0269】

実施例９．膜貫通タンパク質を含有する脂質二重層膜足場タンパク質複合体で免疫されたマウスからの、目的の膜貫通タンパク質に特異的な抗体を発現する抗体産生細胞の取得。
目的の膜貫通タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体が、目的の膜貫通タンパク質に特異的な抗体を発現する抗体産生細胞を取得するための免疫原として使用され得るかどうかを決定するために、例示的なヒト膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、そのカルボキシ末端に貼り付けられたＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグ（１０ｘ－Ｈｉｓタグ）を含むヒトＴＭＢ２を生成し、実施例８に記載されるように精製した。改変されたヒトＴＭＢ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は細胞に発現し、改変ＴＭＢ２タンパク質は、実施例８に記載されるように単離および精製した。ヒトＴＭＢ２タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体は、Ｂｉｒ－Ａ標識膜足場タンパク質を使用して生成され、実施例８に記載されるように精製された。

【0270】

さらに、Ｈｉｓタグをコードするヌクレオチド配列、および改変ヒトＴＭＢ２タンパク質に貼り付けられたＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列を生成し、細胞内で別々に発現し、実施例１に記載されるように精製して、それぞれＦＬＡＧ－ペプチドおよびＨＩＳ－ペプチドを得た。次に、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中に含まれる膜足場タンパク質をコードするヌクレオチド配列を生成し、細胞内で別々に発現し、実施例１に記載されるように精製して、ＭＳＰ－ペプチドを得た。

【0271】

表５に示されているように、目的の膜貫通タンパク質（すなわち、マウスＴＭＢ２）に対して内因性マウスホモログを発現しないヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに、ヒトＴＭＢ２タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体（ヒトＴＭＢ２を含む複合体）を０．５４ｍｇ／ｍＬ注射することによって、そのマウスを免疫化した。免疫応答をモニターし、脾細胞を免疫化されたマウスから採取した。免疫化された各マウスから収集された脾細胞は、Ｂ細胞マーカー（すなわち、抗ＩｇＧ抗体）に対して蛍光標識で染色され、同時に、ＭＳＰ－ペプチド、ＦＬＡＧ－ペプチド、およびＨＩＳ－ペプチドとインキュベートされて、ＭＳＰ－ペプチド、ＦＬＡＧ－ペプチド、およびＨＩＳ－ペプチドと、ＭＳＰ－ペプチド、ＦＬＡＧ－ペプチド、およびＨＩＳ－ペプチドにそれぞれ位置するエピトープに特異的なＢ細胞の表面上の抗体との結合を可能にした。このステップは、複合体によって提示されるヒトＴＭＢ２タンパク質以外の複合体の要素に特異的な抗体を発現する、すべての抗体産生Ｂ細胞を効果的に遮断する。

【0272】

続いて、残っているＢ細胞を、ヒトＴＭＢ２タンパク質（ヒトＴＭＢ２を含む複合体）またはマウスＴＭＢ２タンパク質（マウスＴＭＢ２を含む複合体）のいずれかを含むビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートして、ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される目的の膜貫通タンパク質と、Ｂ細胞の表面上の抗体との結合を可能にした。細胞は、その後洗浄して、結合していない複合体を除去し、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを選別から除去した。マウスから収集された細胞集団のＰＥ蛍光をＦＡＣＳによって検出して、目的の膜貫通タンパク質に特異的な抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞の集団を識別した。

【0273】

次いで、目的の膜貫通タンパク質に結合した単一の抗体産生Ｂ細胞を、３８４ウェルプレート上の個々のウェルに単離し、ＤＮＡをコードする抗体を各細胞から単離し、さらなる分析のために実施例２に記載されるように抗体を生成した。

【0274】

表５に示されるように、ヒトＴＭＢ２タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体による遺伝子改変マウスの免疫化およびヒトＴＭＢ２タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を有する抗体産生Ｂ細胞のソーティングにより、マウスＴＭＢ２およびヒトＴＭＢ２タンパク質ホモログならびにヒトＴＭＢ２タンパク質に特異的な抗体の結合を可能にする交差反応性抗体を発現する抗体産生Ｂ細胞を識別した。さらに、マウスＴＭＢ２タンパク質を包含する脂質二重層膜足場タンパク質複合体による遺伝子改変マウスの免疫化およびマウスＴＭＢ２タンパク質を提示する脂質二重層膜足場タンパク質複合体を有する抗体産生Ｂ細胞のソーティングにより、マウスＴＭＢ２タンパク質およびヒトＴＭＢ２タンパク質に結合することができる交差反応性抗体のみを発現する抗体産生Ｂ細胞を識別した。

【表5】

【0275】

実施例１０．目的の例示的なＳＬＣ膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現する抗体産生細胞の生成および細胞からＳＬＣタンパク質特異的抗体の取得。
目的のＳＬＣ膜貫通タンパク質の第一の例をコードするヌクレオチド配列を、例示的なＳＬＣタンパク質のＮ末端に貼り付けられたＦＬＡＧタグおよび１０ｘ－Ｈｉｓタグを含むように、実施例１に記載されるように、改変する。改変ＳＬＣ膜貫通タンパク質を包含するヌクレオチド配列は、発現ベクターにクローニングされ、Ｓｆ９細胞に発現される。次いで、細胞を可溶化し、改変ＳＬＣ膜貫通タンパク質を取得して、実施例１のように精製する。

【0276】

次に、改変ヒトＳＬＣ膜貫通タンパク質を含有する円板状の脂質二重層膜足場タンパク質複合体を、実施例１および本明細書に記載されるように生成する。

【0277】

遺伝子改変されたＳＬＣノックアウトマウス、すなわち、ヒト化ＩｇＨ座位と、目的のＳＬＣ膜貫通タンパク質をコードする内因性マウス遺伝子も欠いているヒト化Ｉｇκ座位とを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、実施例１に記載されるように、改変ヒトＳＬＣタンパク質をコードする外因性ＤＮＡの注射および改変ヒトＳＬＣタンパク質の注射によって免疫化される。

【0278】

脾細胞は、免疫された各マウスから収集され、蛍光標識でＢ細胞マーカー（すなわち、抗ＩｇＧ抗体）に対して染色され、同時に、０．２ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬのそこに埋め込まれたＳＬＣ膜貫通タンパク質を含有するビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体とインキュベートされる。次いで、細胞を洗浄して、結合していない複合体を除去する。続いて、細胞は、ＰＥ－ストレプトアビジンとインキュベートされ、脂質二重層膜足場タンパク質複合体中のビオチン標識（例えば、Ｂｉｒ－Ａ）膜足場タンパク質の各々へのストレプトアビジンの結合が可能となる。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、余剰なＰＥ－ストレプトアビジンを除去する。対照マウスおよび免疫化マウスからの細胞集団のＰＥ蛍光をＦＡＣＳによって検出して、ビオチン化脂質二重層膜足場タンパク質複合体によって提示される、目的の例示的なＳＬＣ膜貫通タンパク質に結合する抗体を発現するＢ細胞集団を識別した。

【0279】

目的のＳＬＣ膜貫通タンパク質に結合した単一の抗体産生Ｂ細胞を、３８４ウェルプレート上の個々のウェルに単離し、ＤＮＡをコードする抗体を各細胞から単離し、さらなる分析のために実施例２に記載されるように抗体を生成した。

【0280】

本開示のいくつかの態様が本明細書に説明および図示されているが、代替的な態様は、同じ目的を達成するために当業者によって影響されうる。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示の真の精神および範囲内にあるような代替的な態様のすべてを網羅することを意図するものである。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4】

【配列表】

2024501796000001.app

【国際調査報告】