特表 2024-501821 心臓組織細胞に対する特異性を有するウイルスカプシドタンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-16

(54)【発明の名称】心臓組織細胞に対する特異性を有するウイルスカプシドタンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/005 20060101AFI20240109BHJP

   C07K 14/015 20060101ALI20240109BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20240109BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240109BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240109BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240109BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240109BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240109BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240109BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240109BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240109BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20240109BHJP

【ＦＩ】

C07K14/005 ZNA

C07K14/015

C12N15/35

C12N15/63 Z

C12N15/86 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/12

A61P9/00

A61K35/76

A61K31/7088

A61K48/00

A61K38/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023538731

(86)(22)【出願日】2021-12-23

(85)【翻訳文提出日】2023-08-21

(86)【国際出願番号】 EP2021087522

(87)【国際公開番号】W WO2022136655

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】20217171.6

(32)【優先日】2020-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21171861.4

(32)【優先日】2021-05-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503385923

【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ラムラ， トルステン

(72)【発明者】

【氏名】ブラゼヴィッチ， ドラギカ

(72)【発明者】

【氏名】ミヒェルフェルダー， シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】ドゥヒス， マティアス

(72)【発明者】

【氏名】クロイツ， ゼバスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ザウアー， アヒム

(72)【発明者】

【氏名】マイヤー， フローリアン

(72)【発明者】

【氏名】シュティアーストルファー， ビルギット

(72)【発明者】

【氏名】ヴォラート， カイ クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】コルフ－クリンゲビール， モーティマー

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084BA02

4C084BA16

4C084BA17

4C084BA23

4C084CA23

4C084NA14

4C084ZA36

4C086AA01

4C086AA02

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4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA36

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA36

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、全般的には、遺伝性または後天性疾患の処置のための、ウイルスベクター、特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用することによる体細胞遺伝子療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、霊長類における心臓疾患を処置または予防するための、マウス内皮細胞の特異的形質導入をもたらすウイルスカプシドタンパク質に関する。ウイルスカプシドタンパク質は、霊長類心臓組織細胞、特に、霊長類心臓筋肉細胞に特異的に結合することが見出されており、霊長類心筋細胞の効率的かつ選択的な形質導入をもたらし、霊長類における１種または複数の導入遺伝子の心臓組織特異的発現を確実にするために使用することができる。本発明は、さらに、カプシド中に少なくとも１種の導入遺伝子がパッケージングされたカプシドを含む組換えウイルスベクター、好ましくは、ＡＡＶベクターに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、マウス内皮細胞の特異的形質導入をもたらすカプシドタンパク質であって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、カプシドタンパク質。

【請求項2】

前記カプシドタンパク質が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２もしくは３のアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）もしくは（ｂ）のバリアント
を含む、請求項１に記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質。

【請求項3】

霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のためのカプシドタンパク質であって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含み、前記カプシドタンパク質が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２もしくは３のアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）もしくは（ｂ）のバリアント
を含む、カプシドタンパク質。

【請求項4】

心筋症を処置または予防する方法における使用のためのカプシドタンパク質であって、前記カプシドタンパク質が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２もしくは３のアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）もしくは（ｂ）のバリアント
を含む、カプシドタンパク質。

【請求項5】

前記カプシドタンパク質が、３００～８００アミノ酸の長さを有する、請求項１～４のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質。

【請求項6】

前記カプシドタンパク質が、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するウイルスのカプシドタンパク質、好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のカプシドタンパク質である、請求項１～５のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質。

【請求項7】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型２、４、６、８および９からなる群から選択され、前記ＡＡＶが、好ましくは、血清型２である、請求項６に記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質。

【請求項8】

前記カプシドタンパク質が、ＡＡＶ血清型２のＶＰ１タンパク質である、請求項７に記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質。

【請求項9】

配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記アミノ酸配列またはそれらの前記バリアントが、前記カプシドタンパク質のアミノ酸５５０～６００の領域に挿入されている、請求項１～８のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質。

【請求項10】

前記カプシドタンパク質が、
（ａ）配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７もしくは配列番号８の前記アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に定義されている前記アミノ酸配列のうち１種の断片
を含む、請求項１～９のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質。

【請求項11】

前記カプシドタンパク質が、
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２７のアミノ酸配列；または
（ｅ）それぞれ配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号２７の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のバリアント
を含む、請求項２～９のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質。

【請求項12】

霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、請求項１～１１のいずれかに記載のカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドであって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、ウイルスカプシド。

【請求項13】

霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、請求項１～１１のいずれかに記載のカプシドタンパク質をコードする核酸であって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、核酸。

【請求項14】

霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、請求項１３に記載の核酸を含むプラスミドであって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、プラスミド。

【請求項15】

（Ａ）霊長類における心臓疾患を処置もしくは予防する方法であって、心臓疾患を処置もしくは予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、方法における；または
（Ｂ）霊長類における心筋症を処置もしくは予防する方法における；または
（Ｃ）霊長類における心不全もしくは慢性心不全を処置もしくは予防する方法における
使用のための、組換えウイルスベクターであって、前記ベクターが、カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含み、前記カプシドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のバリアント；
（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２５のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２６のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２７のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）もしくは（ｈ）のバリアント、
（ｊ）配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸配列；または
（ｋ）配列番号７もしくは配列番号８の前記アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
を含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含む、組換えウイルスベクター。

【請求項16】

前記心筋症が、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）および左室心筋緻密化障害（ＬＶＮＣ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項17】

前記心筋症が、原発性心筋症、好ましくは、遺伝性心筋症、自然突然変異によって引き起こされる心筋症、および後天性心筋症、好ましくは、アテローム硬化性または他の冠動脈疾患によって引き起こされる虚血性心筋症、心筋の感染または中毒によって引き起こされる心筋症からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項18】

前記心臓疾患が、狭心症、心線維症および心肥大からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項19】

前記心不全または慢性心不全が、駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）、駆出率が低減した心不全（ＨＦｒＥＦ）または駆出率が中間域にある心不全（ＨＦｍｒＥＦ）である、請求項１５に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項20】

前記ＨＦｐＥＦが、ステージＣもしくはステージＤ ＨＦｐＥＦであるか、または前記ＨＦｒＥＦが、ステージＣもしくはステージＤ ＨＦｒＥＦである、請求項１９に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項21】

前記ベクターが、組換えＡＡＶベクターである、請求項１５～２０のいずれかに記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項22】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型２、４、６、８および９、好ましくは、ＡＡＶ血清型２からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項23】

前記導入遺伝子が、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの形態である、請求項１５～２２のいずれかに記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項24】

前記導入遺伝子が、心修復因子、カルシウム調節因子または血管新生促進性因子の群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１５～２３のいずれかに記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項25】

前記導入遺伝子が、心修復因子ｈｕＭｙｄｇｆをコードする、請求項２４に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項26】

前記導入遺伝子が、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＳＵＭＯ１およびＳ１００Ａ１からなる群から選択されるカルシウム調節因子をコードする、請求項２４に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項27】

前記導入遺伝子が、血管新生促進性因子ＶＥＧＦをコードする、請求項２４に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項28】

前記導入遺伝子が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする、請求項１５～２３のいずれかに記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項29】

前記マイクロＲＮＡが、ＭＡＰＫ経路、ＭＹＯＤ経路、ＦＯＸＯ３経路またはＥＲＫ－ＭＡＰＫ経路の調節に関与する、請求項２８に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項30】

前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－３７８、ｍｉＲ６６９ａ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ２１２およびｍｉＲ１３２からなる群から選択される、請求項２８または２９に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項31】

前記導入遺伝子が、処置されるべき前記霊長類における欠損遺伝子を補充する筈である遺伝子である、請求項１５～３０のいずれかに記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項32】

前記遺伝子が、ベータ－ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）、ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ３）、トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）、トロポミオシンアルファ－１鎖（ＴＰＭ１）またはミオシン軽鎖（ＭＹＬ３）の群から選択されるタンパク質をコードする、請求項３１に記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項33】

前記ベクターが、静脈内投与のために製剤化されている、請求項１５～３２のいずれかに記載の方法における使用のための組換えウイルスベクター。

【請求項34】

カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含む組換えウイルスベクターであって、前記カプシドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のバリアント；
を含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含み、前記導入遺伝子が、心修復因子ｈｕＭｙｄｇｆをコードする、組換えウイルスベクター。

【請求項35】

前記ｈｕＭｙｄｇｆが、
（ａ）配列番号１８、２０、３３もしくは３４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１８、２０、３３もしくは３４の前記アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に定義されている前記アミノ酸配列のうち１種の断片
を含む、請求項３４に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項36】

前記カプシドタンパク質が、
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２７のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号２７の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のバリアント
を含む、請求項３４または３５に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項37】

カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含み、前記カプシドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のバリアント
を含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含み、前記ｈｕＭｙｄｇｆが、機能的なゴルジ／小胞体保留シグナルを欠如し、好ましくは、ｈｕＭｙｄｇｆが、配列番号２０または配列番号３４の配列を含む、請求項３４～３６のいずれかに記載の組換えウイルスベクター。

【請求項38】

（ｉ）心臓疾患を処置もしくは予防する方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、霊長類における心臓疾患；または
（ｉｉ）霊長類における心筋症；または
（ｉｉｉ）霊長類における心不全もしくは慢性心不全
を処置または予防する方法における使用のための、請求項３４～３７のいずれかに記載の組換えウイルスベクター。

【請求項39】

カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含む組換えウイルスベクターであって、前記カプシドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のバリアント
を含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含み、前記導入遺伝子が、ヒトカルシウム調節因子ＳＥＲＣＡ２ａをコードする、組換えウイルスベクター。

【請求項40】

前記ヒトカルシウム調節因子ＳＥＲＣＡ２ａが、
（ａ）配列番号２８～３２のいずれかのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２８～３２の前記アミノ酸配列のうち１種に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に定義されている前記アミノ酸配列のうち１種の断片
を含む、請求項３９に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項41】

前記カプシドタンパク質が、
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２７のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号２７の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のバリアント
を含む、請求項３９または４０に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項42】

（ｉ）心臓疾患を処置もしくは予防する方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、霊長類における心臓疾患；
（ｉｉ）慢性心不全；または
（ｉｉｉ）駆出率が低減した心不全患者
を処置または予防する方法における使用のための、請求項３９～４１のいずれかに記載の組換えウイルスベクター。

【請求項43】

請求項１～１１のいずれかに記載のカプシドタンパク質、請求項１２に記載のウイルスカプシド、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載のプラスミド、または請求項１５～４２のいずれかに記載の組換えウイルスベクターを含む医薬組成物。

【請求項44】

前記霊長類が、ヒトである、請求項１～１１のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質、請求項１２に記載の方法における使用のためのウイルスカプシド、請求項１３に記載の方法における使用のためのヌクレオチド配列、請求項１４に記載の方法における使用のためのプラスミド、請求項１５～３３、３８および４２に記載の方法における使用のための組換えＡＡＶベクター、または請求項４３に記載の方法における使用のための医薬組成物。

【請求項45】

霊長類における心臓疾患を処置または予防するための医薬の製造のための、請求項１～１１のいずれかに記載のカプシドタンパク質、請求項１２に記載のウイルスカプシド、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載のプラスミド、請求項１５～４２のいずれかに記載の組換えウイルスベクター、または請求項４３に記載の医薬組成物の使用。

【請求項46】

ラットまたは霊長類の単離された心臓組織細胞、好ましくは、単離された心筋細胞の形質導入のための、請求項１５～４２のいずれかに記載のベクターの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、全般的には、遺伝性または後天性疾患の処置のための、ウイルスベクター、特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用することによる体細胞遺伝子療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、霊長類における心臓疾患を処置または予防するための、マウス内皮細胞の特異的形質導入をもたらすウイルスカプシドタンパク質に関する。ウイルスカプシドタンパク質は、霊長類心臓組織細胞、特に、霊長類心臓筋肉細胞に特異的に結合することが見出されており、霊長類心筋細胞の効率的かつ選択的な形質導入をもたらし、霊長類における１種または複数の導入遺伝子の心臓組織特異的発現を確実にするために使用することができる。本発明は、さらに、カプシド中にパッケージングされた少なくとも１種の導入遺伝子を有するカプシドを含む組換えウイルスベクター、好ましくは、ＡＡＶベクターに関する。ウイルスベクターは、霊長類における心障害または疾患の治療的処置に適している。本発明は、さらに、本発明に係るウイルスベクターを含む細胞および医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
その有効性および有利な安全性プロファイルにより、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターは現在、体細胞遺伝子療法のために最も広く使用されているベクター系である。ＡＡＶベクターは、導入遺伝子を一本鎖または二本鎖ＤＮＡとして様々な組織の分裂および非分裂細胞に導入し、効率的かつ長期の安定した発現をもたらすことができる。組換えＡＡＶベクターを使用した臨床試験は、レーバー先天黒内障（Ｌｕｘｔｕｒｎａ）および脊髄性筋萎縮症（Ｚｏｌｇｅｎｓｍａ）の処置のために初めて販売承認されたＡＡＶに基づく治療法等の重要な画期的出来事を達成することにより、遺伝子療法のさらなる進歩に著しく寄与した。

【0003】

心筋症（ＣＭ）は、心臓筋肉疾患の不均一なグループ、ならびに西洋社会における罹患および死亡の最も一般的な原因である心不全（ＨＦ）の主因である。ＨＦの診断時に、最良の利用可能な処置を用いたとしても、５年生存率は、わずか約５０％である（Writing Group et al, 2016）。ＣＭのための現在の処置選択肢は、主に対症的なものであり、疾患の進行を停止することができず、ＨＦを予防する唯一の選択肢として心臓移植を残す。大部分の心疾病について、現在利用可能な対症的処置モダリティは不適切である。しかし、ＡＡＶに基づく遺伝子療法が、遺伝性ＣＭにおける治療介入のために特異的分子変化を反転するための有望なツールとして出現した（Chemaly et al, 2013; Tilemann et al, 2012）。

【0004】

最初に、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）ベクターによって送達された筋小胞体（sarcoplasmatic）カルシウムＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）の心特異的アイソフォームは、進行型ＨＦ患者を処置するための心ＡＡＶ遺伝子療法のヒト初回投与試験をもたらした（Jessup et al, 2011; Zsebo et al, 2014）。残念ながら、第１相臨床治験に見られたプラス効果は、次の第２相試験；ＣＵＰＩＤ２ｂ治験（Greenberg et al, 2016）において確認することができなかった。患者試料のレトロスペクティブ解析は、非常に低い形質導入有効性、およびＡＡＶ１がＳＥＲＣＡ２ａを心筋細胞に送達することができないことを示した。実際に、全ての心筋細胞の１％未満が、ウイルスベクターゲノムを含有した。したがって、ＡＡＶ１が細胞に形質導入することができないことが、治験のマイナスのアウトカムの主な理由として示唆される。

【0005】

いくつかのＡＡＶ血清型と共に操作されたＡＡＶバリアントが、前臨床モデルにおいて試験および比較された。それらの中で、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）は、全身的に注射されたときに、心筋細胞に形質導入するのに最も効率的であることが判明した。結果的に、心組織においてＬＡＭＰ２Ｂを発現させるためにＡＡＶ９を使用したダノン病のための臨床第１相治験（ＲｏｃｋｅｔＰｈａｒｍａ）は現在、リクルート（recruiting）相である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３８８２４３７）。ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶＲｈ．１０を含む他のバリアント、または操作されたカプシドバリアント、すなわち、ＡＡＶ－ＶＮＳ（Ying et al, 2010）、Ｍ４１（Yang et al, 2009）、ＡＡＶ２ｉ８（Asokan et al, 2010）は最初に、マウスにおける心遺伝子移入のための優れた標的化特性を有することが報告されたが、これらのデータは、未だ臨床的により意義のあるより大型の動物へと移行させることができていない（Chamberlain et al, 2017）（Tarantal et al, 2017）。

【0006】

心筋細胞に形質導入するＡＡＶ９の能力の他に、ＡＡＶ９は、他の組織に対して非常に幅広くかつ非特異的なトロピズムも有する。これにより、１）幅広い範囲の組織へのベクターカプシドタンパク質（カーゴＤＮＡを含む）の広汎な分布、ならびに２）肝臓、中枢神経系、腎臓、肺および膵臓を含むがこれらに制限されない組織における治療用カーゴの発現が生じる。心筋細胞選択的発現は、意図される標的組織への遺伝子発現を制御するための治療用導入遺伝子カセットの３’プライム末端に導入された、細胞型特異的プロモーター、調節エレメントまたは特異的ｍＲＮＡ結合部位を使用することにより達成することができる（Powell et al, 2015；Qiao et al, 2011）。しかし、利用可能な心特異的プロモーターの大部分は、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーター等の遍在性プロモーターと比較して、より低い活性を有し、最終的に、治療用カーゴの十分な発現レベルを達成するために、さらにより高いベクター用量を要求するであろう（Korbelin et al, 2016a；Korbelin et al, 2016b）。ＡＡＶのパッケージング容量が、より大型のエレメントの使用を限定するという事実に加えて、調節エレメントを使用することによるある特定の組織または細胞型への遺伝子発現の制御は、それぞれの系の高頻度に観察される漏れやすさによって引き起こされる、オフターゲット組織における残渣遺伝子発現のリスクを常に有する。より高いベクター用量と共に、広汎なカプシドおよび導入遺伝子分布ならびに関連性のない（「オフターゲット」）組織に発現される治療用ペイロードの両方が、免疫系の活性化（例えば、ＴＬＲ９を介したＴ細胞活性化）（Colella et al, 2018）、血小板の急性減退、補体活性化、またはさらには、急性肝毒性を含む重篤有害事象（Wilson & Flotte, 2020）を引き起こし得る。

【0007】

いくつかの治療タンパク質が、心不全および急性心筋梗塞を軽快させるのに有用であることが示された。例えば、ＷＯ２０１４／１１１４５８は、急性心筋梗塞を処置するための骨髄系由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）の使用を開示する。Ｋｏｒｆ－Ｋｌｉｎｇｅｂｉｅｌ ｅｔ ａｌ（２０１５）は、Ｍｙｄｇｆが、心筋梗塞後に骨髄細胞によって分泌され、心筋細胞生存および血管新生を促進することを報告する。Ｋｏｒｆ－Ｋｌｉｎｇｅｂｉｅｌは、骨髄由来単球およびマクロファージが、このタンパク質を内在性に産生して、心筋梗塞後に心臓を保護および修復することを示す。さらに、Ｋｏｒｆ－Ｋｌｉｎｇｅｂｉｅｌは、組換えＭｙｄｇｆによる処置が、心筋梗塞後の瘢痕サイズおよび収縮不全を低減させることを示す。Ｋｏｒｆ－Ｋｌｉｎｇｅｂｉｅｌ ｅｔ ａｌ（２０２１）は、骨髄由来炎症性細胞におけるＭｙｄｇｆのトランスジェニック過剰発現が、圧負荷誘導性肥大および機能障害を減弱したことを記載した。具体的には、レンチウイルスベクターによるマウスの形質導入について記載されている。ＷＯ２０２１／１４８４１１ Ａ１は、レンチウイルスにより形質導入されたマウスにおけるＭｙｄｇｆの発現について同様に記載する。しかし、レンチウイルスベクターは、重大な不利益を伴う。

【0008】

レンチウイルスベクターは、（ｉ）宿主ゲノムへの安定したベクター組込みによる持続した遺伝子送達；（ｉｉ）分裂および非分裂細胞の両方に感染する能力；（ｉｉｉ）重要な遺伝子および細胞療法標的細胞型を含む幅広い組織トロピズム；（ｉｖ）ベクター形質導入後にウイルスタンパク質の発現がないこと；（ｖ）ポリシストロニックまたはイントロン含有配列等の複雑な遺伝的エレメントを送達する能力；（ｖｉ）潜在的により安全な組込み部位プロファイル；ならびに（ｖｉｉ）ベクターマニピュレーションおよび産生のための相対的に容易な系（Sakuma et al. 2012）を含む、遺伝子送達媒体としてのいくつかの魅力的な特性を提供する。特性のいくつかは、必ずしも望まれるとは限らない。潜在的により安全な組込み部位プロファイルによって軽減され得る宿主ゲノムへのベクター組込みは、特に、幅広い組織トロピズムとの関連で、可能であれば回避されるべき傾向であり、幅広い組織トロピズムは、同様に必ずしも望まれるとは限らず、送達されるべき導入遺伝子が、標的臓器の外側で発現されたときにリスクを構成する場合に問題を提起し得る。さらに、レンチウイルスは、ベクターマニピュレーションおよび産生のための相対的に容易な系であり得るが、依然として、取り扱うことがより容易なウイルスプラットフォームの必要がある。ウイルスの頑強性および実験室規模を越えた産生の複雑性は、同様に現在まで、レンチウイルスの使用を限定してきた因子であり得る。
過去数十年間にわたり体細胞遺伝子療法の分野において為された進歩にもかかわらず、依然として、他の組織の標的化が最小で心臓組織の効率的かつ選択的な形質導入を可能にする新規ウイルスベクターの必要がある。そのようなベクターは、低いベクター用量で、患者、特に、ヒトにおける治療活性があるタンパク質の妥当なレベルを達成し、これにより、患者にとって望まれない副作用を予防するべきである。ベクターはまた、中和ＩｇＧに対して低い親和性を示して、既存の免疫を有する患者におけるその使用を可能にするべきである。したがって、本発明の目的は、霊長類における心臓疾患を処置または予防するのに有用な新規ウイルスベクターを提供することである。具体的には、これらのベクターは、霊長類心臓組織、特に、霊長類心筋細胞の効率的かつ選択的な形質導入をもたらすべきである。
特に、本発明の目的は、レンチウイルスの弱点を克服することである。具体的には、本発明の目的は、レンチウイルスよりも低い頻度でゲノムに組み込むウイルスベクターを提供することである。好ましくは、ウイルスベクターは、ゲノムにごく稀に組み込むべきである。さらにより好ましくは、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、Gill-Farina et al, (2016)を参照）等、処置されるべき患者にリスクを課す比率でゲノムに組み込むべきでは断じてない。本発明のさらに別の目的は、心臓を特異的に標的化するウイルスベクターを提供することであり、この場合、オフターゲット形質導入は、心臓トロピズムを有することが公知であるＡＡＶと比較してより低い。最も好ましくは、本発明のウイルスベクターによって両方の目的が取り組まれる。本発明のさらに別の目的は、ＡＡＶ等、大規模で製造することがレンチウイルスよりも容易であるベクターを提供することである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第２０１４／１１１４５８号

【特許文献2】国際公開第２０２１／１４８４１１号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Writing Group M, Mozaffarian D, Benjamin EJ, Go AS, Arnett DK, Blaha MJ, Cushman M, Das SR, de Ferranti S, Despres JP et al (2016) Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation 133: e38-360

【非特許文献2】Chemaly ER, Hajjar RJ, Lipskaia L (2013) Molecular targets of current and prospective heart failure therapies. Heart 99: 992-1003

【非特許文献3】Tilemann L, Ishikawa K, Weber T, Hajjar RJ (2012) Gene therapy for heart failure. Circ Res 110: 777-793

【非特許文献4】Jessup M, Greenberg B, Mancini D, Cappola T, Pauly DF, Jaski B, Yaroshinsky A, Zsebo KM, Dittrich H, Hajjar RJ et al (2011) Calcium Upregulation by Percutaneous Administration of Gene Therapy in Cardiac Disease (CUPID): a phase 2 trial of intracoronary gene therapy of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase in patients with advanced heart failure. Circulation 124: 304-313

【非特許文献5】Zsebo K, Yaroshinsky A, Rudy JJ, Wagner K, Greenberg B, Jessup M, Hajjar RJ (2014) Long-term effects of AAV1/SERCA2a gene transfer in patients with severe heart failure: analysis of recurrent cardiovascular events and mortality. Circ Res 114: 101-108

【非特許文献6】Greenberg B, Butler J, Felker GM, Ponikowski P, Voors AA, Desai AS, Barnard D, Bouchard A, Jaski B, Lyon AR, Pogoda JM, Rudy JJ, Zsebo KM. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in patients with cardiac disease (CUPID 2): a randomised, multinational, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet. 2016 Mar 19;387(10024):1178-86. doi: 10.1016/S0140-6736(16)00082-9. Epub 2016 Jan 21. PMID: 26803443.

【非特許文献7】Ying Y, Muller OJ, Goehringer C, Leuchs B, Trepel M, Katus HA, Kleinschmidt JA (2010) Heart-targeted adeno-associated viral vectors selected by in vivo biopanning of a random viral display peptide library. Gene Ther 17: 980-990

【非特許文献8】Yang L, Jiang J, Drouin LM, Agbandje-McKenna M, Chen C, Qiao C, Pu D, Hu X, Wang DZ, Li J et al (2009) A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 3946-3951

【非特許文献9】Asokan A, Conway JC, Phillips JL, Li C, Hegge J, Sinnott R, Yadav S, DiPrimio N, Nam HJ, Agbandje-McKenna M et al (2010) Reengineering a receptor footprint of adeno-associated virus enables selective and systemic gene transfer to muscle. Nat Biotechnol 28: 79-82

【非特許文献10】Chamberlain K, Riyad JM, Weber T (2017) Cardiac gene therapy with adeno-associated virus-based vectors. Curr Opin Cardiol

【非特許文献11】Tarantal AF, Lee CCI, Martinez ML, Asokan A, Samulski RJ (2017) Systemic and Persistent Muscle Gene Expression in Rhesus Monkeys with a Liver De-Targeted Adeno-Associated Virus Vector. Hum Gene Ther 28: 385-391

【非特許文献12】Powell SK, Rivera-Soto R, Gray SJ (2015) Viral expression cassette elements to enhance transgene target specificity and expression in gene therapy. Discov Med 19: 49-57

【非特許文献13】Qiao C, Yuan Z, Li J, He B, Zheng H, Mayer C, Li J, Xiao X (2011) Liver-specific microRNA-122 target sequences incorporated in AAV vectors efficiently inhibits transgene expression in the liver. Gene Ther 18: 403-410

【非特許文献14】Korbelin J, Dogbevia G, Michelfelder S, Ridder DA, Hunger A, Wenzel J, Seismann H, Lampe M, Bannach J, Pasparakis M et al (2016a) A brain microvasculature endothelial cell-specific viral vector with the potential to treat neurovascular and neurological diseases. EMBO Mol Med 8: 609-625

【非特許文献15】Korbelin J, Sieber T, Michelfelder S, Lunding L, Spies E, Hunger A, Alawi M, Rapti K, Indenbirken D, Muller OJ et al (2016b) Pulmonary Targeting of Adeno-associated Viral Vectors by Next-generation Sequencing-guided Screening of Random Capsid Displayed Peptide Libraries. Mol Ther 24: 1050-1061

【非特許文献16】Colella P, Ronzitti G, Mingozzi F (2018) Emerging Issues in AAV-Mediated In Vivo Gene Therapy. Mol Ther Methods Clin Dev 8: 87-104

【非特許文献17】Wilson JM, Flotte TR (2020) Moving Forward After Two Deaths in a Gene Therapy Trial of Myotubular Myopathy. Hum Gene Ther 31: 695-696

【非特許文献18】Korf-Klingebiel M., Reboll M.R., Klede S., Brod T., Pich A., Polten F., et al. Myeloid-derived growth factor (C19orf10) mediates cardiac repair following myocardial infarction. Nat Med. 2015Feb; 21 (2): 140-149.

【非特許文献19】Korf-Klingebiel M, Reboll MR, Polten F, Weber N, Jaeckle F, Wu X, Kallikourdis M, Kunderfranco P, Condorelli G, Giannitsis E, Kustikova OS, Schambach A, Pich A, Widder JD, Bauersachs J, Heuvel J , Kraft T, Wang Y, Wollert KC (2021), Myeloid-Derived Growth Factor Protects Against Pressure Overload-Induced Heart Failure by Preserving Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase Expression in Cardiomyocytes, Circulation, 144:1227-1240

【非特許文献20】Sakuma T, Barry MA, Ikeda Y; Lentiviral vectors: basic to translational, Biochem J, 443 (3): 603-618

【非特許文献21】Irene Gil-Farina, Raffaele Fronza, Christine Kaeppel, Esperanza Lopez-Franco, Valerie Ferreira, Delia D'Avola, Alberto Benito, Jesus Prieto, Harald Petry, Gloria Gonzalez-Aseguinolaza, Manfred Schmidt, Recombinant AAV Integration Is Not Associated With Hepatic Genotoxicity in Nonhuman Primates and Patients, Molecular Therapy, Volume 24, Issue 6, 2016, Pages 1100-1105, ISSN 1525-0016, https://doi.org/10.1038/mt.2016.52.

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

発明の簡単な概要
本発明は、霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、マウス内皮細胞の特異的形質導入をもたらすカプシドタンパク質に関する。マウス内皮細胞、特に、脳または肺のマウス内皮細胞の選択的形質導入をもたらすカプシドタンパク質が、霊長類において異なるトロピズムを発揮し、霊長類においては、心臓組織細胞の選択的形質導入をもたらす（ラットにおいて、状況は、霊長類と同様であった）ことが見出された。したがって、マウス内皮細胞の特異的形質導入を生じるカプシドタンパク質は、ヒトまたは非ヒト霊長類における心臓組織細胞、特に、心筋細胞に導入遺伝子を導入するための高度に有用なツールである。カプシドタンパク質は、改変されていなくてよい、すなわち、天然に存在していてよい、またはそのトロピズムに影響を与えるペプチド配列の挿入によって改変されていてよい。本発明は、また、マウスへの投与時に内皮細胞に特異的に形質導入し、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏにおける霊長類、すなわち、ヒトまたは非ヒト霊長類（Ｈｏｍｏ属またはＮＨＰ）への全身的ベクター投与による心筋細胞の選択的形質導入および導入遺伝子発現に有用である、改変されていないまたは改変されたカプシドを有するウイルスベクター、特に、ＡＡＶベクターを提供する。ベクターは、霊長類におけるＣＮＳ、肺、腎臓、膵臓および骨格筋等のオフターゲット組織の最小の形質導入を生じる。心遺伝子療法に現在使用されている標準ベクターであり、進行中の臨床第Ｉ相治験において試験されているＡＡＶ９と比較して、本発明のウイルスベクターの観察された肝臓標的化解除（detargeting）は、オフターゲットプロファイルの実質的な改善を表す、４３．３分の１の肝臓発現をもたらした。著しく改善されたオフターゲット化プロファイルは、より高度の投薬を可能にし、これにより、導入遺伝子発現および治療効率を増加させることができる。したがって、本発明のウイルスベクターは、心臓疾患を患う霊長類への、特に、ヒト患者への導入遺伝子の送達に特に適する。

【0012】

標的組織への選択的ホーミングおよびそこでの遺伝子発現をもたらす改変されたカプシドを有するウイルスベクターは、動物モデルにおいて以前に記載された。具体的には、ウイルスカプシドタンパク質へのペプチド配列の取込みが、ある特定の標的組織に対するベクター系の親和性を増加させる適した仕方であることが報告された。例えば、ＷＯ２０１５／１５８７４９は、全身的投与後にベクターをマウスの脳または脊髄に選択的にガイドする、ペプチドＮＲＧＴＥＷＤを含む改変されたカプシドタンパク質（配列番号１として本明細書に提供される）を有するＡＡＶ２バリアントについて記載する。このＡＡＶ２バリアントは、ＡＡＶ ＢＩ－１５．１と本明細書で称される。同様に、ＷＯ２０１５／０１８８６０は、全身的投与後にベクターをマウスの肺に選択的にガイドする、ペプチドＥＳＧＨＧＹＦを含む改変されたカプシドタンパク質（配列番号３として本明細書に提供される）を有するＡＡＶ２バリアントについて記載する。このＡＡＶバリアントは、ＡＡＶ ＢＩ－１５．２と本明細書で称される。ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２は両者共に、自身の特異的ペプチドによってガイドされるそれらの個々の標的組織内の内皮細胞に形質導入する（ＢＩ－１５．１、マウス脳の小さい脈管構造およびＢＩ－１５．２、マウス肺の肺脈管構造）。ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２について記載されるそのような特有のベクター特性は、標的化遺伝子療法の開発に適用されるために高度に魅力的である。

【0013】

両方のベクター、ＡＡＶ ＢＩ－１５．１およびＡＡＶ ＢＩ－１５．２を、ラットおよびＮＨＰにおいて全身的投与後にｉｎ ｖｉｖｏで、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポーター等のペイロードを送達および発現するそれらの能力について本明細書において検討した。具体的には、ＡＡＶ ＢＩ－１５．１およびＡＡＶ ＢＩ－１５．２は、２種の異なるラット系統（ＷＫＹ／ＫｙｏＲｊおよびスプラーグドーリーラット）において体内分布試験において試験して、異なるプロモーターを使用した用量漸増試験において、ＡＡＶ９と比較して、それらの効力およびオフターゲットプロファイルを探索した。最も重要なことに、非ヒト霊長類（カニクイザル（cynomolgus macaque）、ＮＨＰ）においてＡＡＶ ＢＩ－１５．１およびＡＡＶ ＢＩ－１５．２を解析して、移行性に関して（translationally）より妥当なある種において両方のベクターの組織トロピズムを調査した。両方のバリアントの投与が、ラットおよびＮＨＰの両方において心筋細胞の選択的形質導入を生じたことが見出された。加えて、両方のバリアントはまた、ｉＰＳＣ由来ヒト心筋細胞に選択的に形質導入することが見出された。

【0014】

ラットにおける心組織へのホーミングは、両方のベクターについてほとんど匹敵するレベルであったが、ＡＡＶ ＢＩ－１５．１は、ＮＨＰにおいてＡＡＶ ＢＩ－１５．２と比較して、より有利な心臓対肝臓ホーミング比を有した（０．５１および０．１１）。重要なことに、両方のベクターは、明らかに、文献で報告された比（およそ０．０２）（Hordeaux et al, 2018）と比較して、それぞれおよそ２５．７倍（ＡＡＶ ＢＩ－１５．１）および５，９倍（ＡＡＶ ＢＩ－１５．２）のその心対肝臓ホーミング比に関して、ＮＨＰにおいてＡＡＶ９よりも優れていた。ベクターゲノムの有利な心対肝臓組織分布に加えて、ＡＡＶ ＢＩ－１５．１およびＡＡＶ ＢＩ－１５．２はまた、心筋細胞における有意な導入遺伝子発現を誘発した。これは、肝臓、骨格筋および様々な他の組織における最小の発現と平行した。最も重要なことに、１０^１３ｖｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）の用量により、ＡＡＶ ＢＩ－１５．１は、霊長類心細胞の最大２３％に形質導入した。

【0015】

ラットおよびＮＨＰにおける心臓特異的トロピズムの種間保存、ならびにヒトｉＰＳＣ由来ヒト心筋細胞の形質導入におけるそれらの有効性により、ＡＡＶベクターの記載されているトロピズムが、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト心筋細胞に繋がると予想されるべきである。したがって、治療関連分子（例えば、Ｍｙｄｇｆ）の発現のためのこれらのベクターの適用は、現在限定的な処置選択肢のみが利用可能な、生命を脅かす心疾患のために有効な遺伝子療法アプローチを確立するために有用である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A】図１は、クライオおよびネガティブ染色透過型電子顕微鏡を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ体内分布および発現試験のために産生された、精製されたＡＡＶベクターストックの解析の結果を示す。（Ａ）サイトメガロウイルス初期エンハンサー＋ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーターの制御下で高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を有する導入遺伝子カセットを有するＢＩ－１５．１、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でｅＧＦＰを有するＢＩ－１５．２を、クライオ－透過型電子顕微鏡（クライオＴＥＭ）を使用して撮像した。代表的なクライオＴＥＭ画像は、フル（full）ＡＡＶ粒子（黒色矢印）、および空粒子（白色矢印）またはダブレット（doublet）（白色矢じり）の亜集団を示す。ＡＡＶ以外の大型の構造物（黒色破線矢印）およびある程度の氷混入（白色破線矢印）が観察された（上部レベルＡ）。画像に基づく内部密度解析によってパッケージング統計を作成した（下部レベルＡ、Ｂ、Ｃ）。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（ｎｓＴＥＭ）は、試料純度およびインタクトなカプシドのパーセンテージを説明する。（Ｂ）サイズ分布および相対的濃度は、ｎｓＴＥＭに基づく画像によって自動的に検出された。（Ｃ）４種の粒子クラスを定義した；一次粒子（インタクトなＡＡＶ、緑色）、一次破壊粒子（内部染色された、紫色）、プロテアソーム様粒子（小さいサイズの不純物、青色）および二次粒子（未知の変動するサイズの不純物、赤色）。

【図1B】図１は、クライオおよびネガティブ染色透過型電子顕微鏡を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ体内分布および発現試験のために産生された、精製されたＡＡＶベクターストックの解析の結果を示す。（Ａ）サイトメガロウイルス初期エンハンサー＋ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーターの制御下で高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を有する導入遺伝子カセットを有するＢＩ－１５．１、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でｅＧＦＰを有するＢＩ－１５．２を、クライオ－透過型電子顕微鏡（クライオＴＥＭ）を使用して撮像した。代表的なクライオＴＥＭ画像は、フル（full）ＡＡＶ粒子（黒色矢印）、および空粒子（白色矢印）またはダブレット（doublet）（白色矢じり）の亜集団を示す。ＡＡＶ以外の大型の構造物（黒色破線矢印）およびある程度の氷混入（白色破線矢印）が観察された（上部レベルＡ）。画像に基づく内部密度解析によってパッケージング統計を作成した（下部レベルＡ、Ｂ、Ｃ）。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（ｎｓＴＥＭ）は、試料純度およびインタクトなカプシドのパーセンテージを説明する。（Ｂ）サイズ分布および相対的濃度は、ｎｓＴＥＭに基づく画像によって自動的に検出された。（Ｃ）４種の粒子クラスを定義した；一次粒子（インタクトなＡＡＶ、緑色）、一次破壊粒子（内部染色された、紫色）、プロテアソーム様粒子（小さいサイズの不純物、青色）および二次粒子（未知の変動するサイズの不純物、赤色）。

【図1C】図１は、クライオおよびネガティブ染色透過型電子顕微鏡を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ体内分布および発現試験のために産生された、精製されたＡＡＶベクターストックの解析の結果を示す。（Ａ）サイトメガロウイルス初期エンハンサー＋ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーターの制御下で高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を有する導入遺伝子カセットを有するＢＩ－１５．１、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でｅＧＦＰを有するＢＩ－１５．２を、クライオ－透過型電子顕微鏡（クライオＴＥＭ）を使用して撮像した。代表的なクライオＴＥＭ画像は、フル（full）ＡＡＶ粒子（黒色矢印）、および空粒子（白色矢印）またはダブレット（doublet）（白色矢じり）の亜集団を示す。ＡＡＶ以外の大型の構造物（黒色破線矢印）およびある程度の氷混入（白色破線矢印）が観察された（上部レベルＡ）。画像に基づく内部密度解析によってパッケージング統計を作成した（下部レベルＡ、Ｂ、Ｃ）。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（ｎｓＴＥＭ）は、試料純度およびインタクトなカプシドのパーセンテージを説明する。（Ｂ）サイズ分布および相対的濃度は、ｎｓＴＥＭに基づく画像によって自動的に検出された。（Ｃ）４種の粒子クラスを定義した；一次粒子（インタクトなＡＡＶ、緑色）、一次破壊粒子（内部染色された、紫色）、プロテアソーム様粒子（小さいサイズの不純物、青色）および二次粒子（未知の変動するサイズの不純物、赤色）。

【0017】

【図2A-2D】図２は、マウスにおいてＨＥＫまたはＳｆ９細胞において産生されたＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２を使用してベクター分布および遺伝子発現試験から得られた結果を描写する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける低用量：５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ ＢＷ、中用量：１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ ＢＷおよび高用量：２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ ＢＷのｉ．ｖ．投与の３週間後に、ＨＥＫ産生（Ａ）ＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－ｅＧＦＰまたは（Ｂ）ＢＩ－１５．２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰベクターのベクターＤＮＡコピーを、脳、肺、心臓、脾臓および肝臓のホモジナイズされた組織において定量化した。ＢＩ－１５．１のベクターコピー数は、同じ用量の他の全臓器と比較して脳において有意に増加する（左パネル）＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（指し示されている用量における脳ｖｓ．肝臓、脾臓、心臓および肺）。ＢＩ－１５．２のベクターコピー数は、同じ用量の他の全臓器と比較して肺において有意に増加する＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（それぞれ全用量について肺ｖｓ．肝臓、脾臓、心臓および脳、＊＊ｐ＜０．０１（最高用量における肺ｖｓ．脳）。試料におけるポリメラーゼＩＩのｍＲＮＡ発現に対して正規化された、脳、肺、心臓、脾臓および肝臓の組織におけるｅＧＦＰ ｍＲＮＡの測定によって導入遺伝子発現解析を行った。（Ｃ）脳およびオフターゲット対照臓器におけるＢＩ－１５．１媒介性ｅＧＦＰ－ｍＲＮＡ発現＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（指し示されている用量における脳ｖｓ．肝臓、脾臓、心臓および肺）。（Ｄ）標的およびオフターゲット対照臓器におけるＢＩ－１５．２媒介性ｅＧＦＰ－ｍＲＮＡ発現＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（同じ用量における肺ｖｓ．肝臓、脾臓、心臓および脳）。１０^１１ｖｇ／マウスのｉ．ｖ．投与の２週間後に、Ｓｆ９産生（Ｅ）ＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－ｅＧＦＰまたは（Ｆ）ＢＩ－１５．２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰベクターのベクターＤＮＡコピーを、脳、肺および肝臓のホモジナイズされた組織において定量化した。

【図2E-2F】図２は、マウスにおいてＨＥＫまたはＳｆ９細胞において産生されたＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２を使用してベクター分布および遺伝子発現試験から得られた結果を描写する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける低用量：５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ ＢＷ、中用量：１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ ＢＷおよび高用量：２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ ＢＷのｉ．ｖ．投与の３週間後に、ＨＥＫ産生（Ａ）ＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－ｅＧＦＰまたは（Ｂ）ＢＩ－１５．２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰベクターのベクターＤＮＡコピーを、脳、肺、心臓、脾臓および肝臓のホモジナイズされた組織において定量化した。ＢＩ－１５．１のベクターコピー数は、同じ用量の他の全臓器と比較して脳において有意に増加する（左パネル）＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（指し示されている用量における脳ｖｓ．肝臓、脾臓、心臓および肺）。ＢＩ－１５．２のベクターコピー数は、同じ用量の他の全臓器と比較して肺において有意に増加する＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（それぞれ全用量について肺ｖｓ．肝臓、脾臓、心臓および脳、＊＊ｐ＜０．０１（最高用量における肺ｖｓ．脳）。試料におけるポリメラーゼＩＩのｍＲＮＡ発現に対して正規化された、脳、肺、心臓、脾臓および肝臓の組織におけるｅＧＦＰ ｍＲＮＡの測定によって導入遺伝子発現解析を行った。（Ｃ）脳およびオフターゲット対照臓器におけるＢＩ－１５．１媒介性ｅＧＦＰ－ｍＲＮＡ発現＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（指し示されている用量における脳ｖｓ．肝臓、脾臓、心臓および肺）。（Ｄ）標的およびオフターゲット対照臓器におけるＢＩ－１５．２媒介性ｅＧＦＰ－ｍＲＮＡ発現＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（同じ用量における肺ｖｓ．肝臓、脾臓、心臓および脳）。１０^１１ｖｇ／マウスのｉ．ｖ．投与の２週間後に、Ｓｆ９産生（Ｅ）ＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－ｅＧＦＰまたは（Ｆ）ＢＩ－１５．２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰベクターのベクターＤＮＡコピーを、脳、肺および肝臓のホモジナイズされた組織において定量化した。

【0018】

【図3A-3D】図３は、ラットにおけるベクター分布および遺伝子発現試験から得られた結果を示す。ウィスター京都（Wistar Kyoto）ラットにおけるＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２ベクターによって媒介された用量依存性体内分布およびプロモーター依存性ｅＧＦＰ発現が示されている。動物は、静脈内（ｉ．ｖ．）適用によって低用量（１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）および高用量（５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）の（Ａ）ＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－ｅＧＦＰベクターおよび（Ｂ）ＢＩ－１５．２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰベクターを受けた。ＡＡＶ適用の３週間後に、心臓、肝臓、肺、脳および骨格筋（ｓｋ．ｍ．）組織由来のホモジナイズされた組織試料においてベクターＤＮＡコピーを定量化した。ｅＧＦＰ ｍＲＮＡレベルの解析は、（Ｃ）ＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－ｅＧＦＰおよび（Ｄ）ＢＩ－１５．２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰベクターによって媒介された心臓および骨格筋におけるプロモーター依存性発現を示す。試料におけるポリメラーゼＩＩのｍＲＮＡ発現に対して正規化された、心臓、肝臓、肺、脳およびｓｋ．ｍ．の組織におけるｅＧＦＰ ｍＲＮＡの測定によって導入遺伝子発現解析を行った。全データは、バー（平均）±ＳＤ、群当たりｎ＝６匹の動物として示す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ｖｓ．肝臓、肺、脳およびｓｋ．ｍ．、または指し示される通り）。

【0019】

【図4A】図４は、ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２ベクターによって媒介されたｅＧＦＰの心発現の試験由来の結果を示す。（Ａ）１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ（低用量）および５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ（高用量）の両方のベクターまたはＰＢＳ（対照）をウィスター京都ラットにｉ．ｖ．適用してから３週間後に、全体をパラフィン包埋された心臓の水平カットを、ＤＡＢ染色による可視化後のｅＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学によって染色した。各切片は、指し示される群の１匹の動物由来の心臓を表す。（Ｂ）免疫組織化学に基づく面積定量化は、心筋細胞におけるｅＧＦＰ発現の用量依存性増加を指し示す。面積定量化解析のため、データは、１匹の個々の動物の心臓切片におけるｅＧＦＰ発現面積のパーセンテージをそれぞれ表す、プロットされたデータ点による±ＳＤとして示す（ベクター処置群当たりｎ＝６匹の動物および媒体処置群当たりｎ＝５）。

【図4B】図４は、ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２ベクターによって媒介されたｅＧＦＰの心発現の試験由来の結果を示す。（Ａ）１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ（低用量）および５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ（高用量）の両方のベクターまたはＰＢＳ（対照）をウィスター京都ラットにｉ．ｖ．適用してから３週間後に、全体をパラフィン包埋された心臓の水平カットを、ＤＡＢ染色による可視化後のｅＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学によって染色した。各切片は、指し示される群の１匹の動物由来の心臓を表す。（Ｂ）免疫組織化学に基づく面積定量化は、心筋細胞におけるｅＧＦＰ発現の用量依存性増加を指し示す。面積定量化解析のため、データは、１匹の個々の動物の心臓切片におけるｅＧＦＰ発現面積のパーセンテージをそれぞれ表す、プロットされたデータ点による±ＳＤとして示す（ベクター処置群当たりｎ＝６匹の動物および媒体処置群当たりｎ＝５）。

【0020】

【図5A-5B】図５は、ＢＩ－１５．１およびＡＡＶ９によって媒介されたベクター分布および遺伝子発現の解析由来の結果を示す。スプラーグドーリーラットにおける３×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｉ．ｖ．適用の３週間後に、（Ａ）ＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－ｅＧＦＰまたは（Ｂ）ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｅＧＦＰベクターのベクターＤＮＡコピーを、ホモジナイズされた心臓、肝臓、脳、骨格筋（ｓｋ．ｍ．）、肺、腎臓、膵臓および脾臓組織試料において定量化した。データは、バー（平均）±ＳＤ、群当たりｎ＝８匹の動物として示す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ｖｓ．肝臓、脳、ｓｋ．ｍ．、肺、腎臓、膵臓、脾臓）。（Ｃ）ｅＧＦＰ ｍＲＮＡレベルの解析は、様々な組織におけるＢＩ－１５．１（白色バー）およびＡＡＶ９（黒色バー）ベクターによって媒介されたＣＡＧ駆動遺伝子発現を示す。データは、バー（平均）±ＳＤ、群当たりｎ＝８匹の動物として示す。Ｐ値は、スチューデント－ｔ検定によって解析されたＢＩ１５．１ 対 ＡＡＶ９の有意な値を指し示す＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．１。（Ｄ）有効性指数は、それらの平均ＲＮＡ発現レベルに基づき計算された、個々の組織におけるＢＩ－１５．１ 対 ＡＡＶ９の相対的発現有効性を説明する。

【図5C-5D】図５は、ＢＩ－１５．１およびＡＡＶ９によって媒介されたベクター分布および遺伝子発現の解析由来の結果を示す。スプラーグドーリーラットにおける３×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｉ．ｖ．適用の３週間後に、（Ａ）ＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－ｅＧＦＰまたは（Ｂ）ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｅＧＦＰベクターのベクターＤＮＡコピーを、ホモジナイズされた心臓、肝臓、脳、骨格筋（ｓｋ．ｍ．）、肺、腎臓、膵臓および脾臓組織試料において定量化した。データは、バー（平均）±ＳＤ、群当たりｎ＝８匹の動物として示す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ｖｓ．肝臓、脳、ｓｋ．ｍ．、肺、腎臓、膵臓、脾臓）。（Ｃ）ｅＧＦＰ ｍＲＮＡレベルの解析は、様々な組織におけるＢＩ－１５．１（白色バー）およびＡＡＶ９（黒色バー）ベクターによって媒介されたＣＡＧ駆動遺伝子発現を示す。データは、バー（平均）±ＳＤ、群当たりｎ＝８匹の動物として示す。Ｐ値は、スチューデント－ｔ検定によって解析されたＢＩ１５．１ 対 ＡＡＶ９の有意な値を指し示す＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．１。（Ｄ）有効性指数は、それらの平均ＲＮＡ発現レベルに基づき計算された、個々の組織におけるＢＩ－１５．１ 対 ＡＡＶ９の相対的発現有効性を説明する。

【0021】

【図6A-6C】図６は、ウィスター京都ラットにおけるＡＡＶ９の広汎な発現プロファイルと比較したＢＩ－１５．１の心臓特異的発現パターンを説明する。（Ａ）３×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９（上部パネル）およびＢＩ－１５．１（下部パネル）ベクターのｉ．ｖ．適用の３週間後に、心臓、肝臓、ＣＮＳ、肺、腎臓および膵臓に由来する全体をパラフィン包埋された組織切片を、ＤＡＢ染色による可視化後のｅＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学によって染色した。各切片は、指し示される処置群由来の動物の１枚の切片から得られる代表的な染色である。（Ｂ）ＰＢＳ注射対照群、ＡＡＶ９およびＢＩ－１５．１注射動物から得られる個々の組織切片において解析されたｅＧＦＰの免疫組織化学に基づく面積定量化。面積定量化解析のため、データは、平均値（バーの上に描写された数）±ＳＤ（ベクター処置群当たりｎ＝６匹の動物および媒体処置群当たりｎ＝５）として示す。（Ｃ）個々の組織におけるＢＩ－１５．１ 対 ＡＡＶ９の相対的発現有効性を、面積定量化による形質導入された面積のそれらの平均パーセンテージに基づき計算し、有効性指数として提示する。

【0022】

【図7A-7B】図７は、ＮＨＰにおけるＢＩ－１５．１ベクターの体内分布および導入遺伝子発現プロファイルのデータを要約する。１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＢＩ－１５．１ベクターの静脈内注入の３週間後に、カニクイザルの組織におけるベクターＤＮＡコピー数およびベクター媒介性導入遺伝子発現を定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって定量化した。（Ａ）ＢＩ－１５．１送達ベクターゲノムの妥当なコピー数を、心房（左および右心房）、心室（左および右心室）、肝臓および脾臓において検出したが、他の組織は不十分（spared）であった。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（群当たりｎ＝３匹の動物）。（Ｂ）心房（左および右心房）と心室（左および右心房）における優勢なＢＩ－１５．１ベクター媒介性ｅＧＦＰ－ｍＲＮＡ発現と、それに続く肝臓におけるある程度の発現。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（群当たりｎ＝３匹の動物）。（Ｃ）心、肝臓および脳組織のパラフィン包埋組織切片におけるＢＩ－１５．１ベクター媒介性ｅＧＦＰ発現を、ＤＡＢによる可視化後のｅＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学によって染色した。各パネル（ａ～ｏ）は、目的の組織の代表的な区域を表示する。各列は、個々に処置された動物の切片を表示する。（ａ～ｃ）心房、（ｄ～ｆ）心室、（ｇ～ｉ）肝臓、（ｊ～ｏ）脳。スケールバーのサイズは１００μｍ。（Ｄ）免疫組織化学に基づく面積定量化によって解析された心組織におけるＢＩ－１５．１ベクター媒介性導入遺伝子発現、および（Ｅ）心組織におけるｅＧＦＰ発現のＥＬＩＳＡに基づく定量的解析（右パネル）。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（ｎ＝３匹の動物、ＢＩ １５．１処置およびｎ＝１、ＰＢＳ処置）。

【図7C-7D】図７は、ＮＨＰにおけるＢＩ－１５．１ベクターの体内分布および導入遺伝子発現プロファイルのデータを要約する。１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＢＩ－１５．１ベクターの静脈内注入の３週間後に、カニクイザルの組織におけるベクターＤＮＡコピー数およびベクター媒介性導入遺伝子発現を定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって定量化した。（Ａ）ＢＩ－１５．１送達ベクターゲノムの妥当なコピー数を、心房（左および右心房）、心室（左および右心室）、肝臓および脾臓において検出したが、他の組織は不十分（spared）であった。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（群当たりｎ＝３匹の動物）。（Ｂ）心房（左および右心房）と心室（左および右心房）における優勢なＢＩ－１５．１ベクター媒介性ｅＧＦＰ－ｍＲＮＡ発現と、それに続く肝臓におけるある程度の発現。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（群当たりｎ＝３匹の動物）。（Ｃ）心、肝臓および脳組織のパラフィン包埋組織切片におけるＢＩ－１５．１ベクター媒介性ｅＧＦＰ発現を、ＤＡＢによる可視化後のｅＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学によって染色した。各パネル（ａ～ｏ）は、目的の組織の代表的な区域を表示する。各列は、個々に処置された動物の切片を表示する。（ａ～ｃ）心房、（ｄ～ｆ）心室、（ｇ～ｉ）肝臓、（ｊ～ｏ）脳。スケールバーのサイズは１００μｍ。（Ｄ）免疫組織化学に基づく面積定量化によって解析された心組織におけるＢＩ－１５．１ベクター媒介性導入遺伝子発現、および（Ｅ）心組織におけるｅＧＦＰ発現のＥＬＩＳＡに基づく定量的解析（右パネル）。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（ｎ＝３匹の動物、ＢＩ １５．１処置およびｎ＝１、ＰＢＳ処置）。

【0023】

【図8A-8B】図８は、ＮＨＰにおけるＢＩ－１５．２ベクターの体内分布および導入遺伝子発現を示す。１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＢＩ－１５．２ベクターの静脈内注入の３週間後に、カニクイザルの組織におけるベクターＤＮＡコピー数およびベクター媒介性導入遺伝子発現を定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって評価した。（Ａ）ＢＩ－１５．２送達ベクターゲノムの妥当なコピー数を、肝臓および脾臓と、それに続いて心房（左および右心房）、心室（左および右心室）において検出した。ある程度のゲノムコピー数が骨格筋（ｓｃ．筋肉）において検出されたが、他の組織は不十分であった。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（群当たりｎ＝２匹の動物）。（Ｂ）心房（左および右心房）と心室（左および右心房）における優勢なＢＩ－１５．２ベクター媒介性ｅＧＦＰ－ｍＲＮＡ発現と、それに続くｓｃ．筋肉および肝臓におけるある程度の発現。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（群当たりｎ＝２匹の動物）。（Ｃ）ＤＡＢによる可視化後のｅＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学によって染色された、心、肝臓および脳組織のパラフィン包埋組織切片において染色されたＢＩ－１５．２ベクター媒介性ｅＧＦＰ発現。各パネル（ａ～ｈ）は、目的の組織の代表的な区域を表示する。各列は、個々に処置された動物の切片を表示する。（ａ～ｂ）心房、（ｂ～ｃ）心室、（ｅ～ｆ）肝臓、（ｇ～ｈ）肺。スケールバーのサイズは１００μｍ。（Ｄ）免疫組織化学に基づく面積定量化によって解析された心組織におけるＢＩ－１５．２ベクター媒介性導入遺伝子発現、および（Ｅ）心組織におけるｅＧＦＰ発現のＥＬＩＳＡに基づく定量的解析（右パネル）。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（ｎ＝２匹の動物、ＢＩ １５．２処置およびｎ＝１、ＰＢＳ処置）。

【図8C-8D】図８は、ＮＨＰにおけるＢＩ－１５．２ベクターの体内分布および導入遺伝子発現を示す。１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＢＩ－１５．２ベクターの静脈内注入の３週間後に、カニクイザルの組織におけるベクターＤＮＡコピー数およびベクター媒介性導入遺伝子発現を定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって評価した。（Ａ）ＢＩ－１５．２送達ベクターゲノムの妥当なコピー数を、肝臓および脾臓と、それに続いて心房（左および右心房）、心室（左および右心室）において検出した。ある程度のゲノムコピー数が骨格筋（ｓｃ．筋肉）において検出されたが、他の組織は不十分であった。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（群当たりｎ＝２匹の動物）。（Ｂ）心房（左および右心房）と心室（左および右心房）における優勢なＢＩ－１５．２ベクター媒介性ｅＧＦＰ－ｍＲＮＡ発現と、それに続くｓｃ．筋肉および肝臓におけるある程度の発現。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（群当たりｎ＝２匹の動物）。（Ｃ）ＤＡＢによる可視化後のｅＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学によって染色された、心、肝臓および脳組織のパラフィン包埋組織切片において染色されたＢＩ－１５．２ベクター媒介性ｅＧＦＰ発現。各パネル（ａ～ｈ）は、目的の組織の代表的な区域を表示する。各列は、個々に処置された動物の切片を表示する。（ａ～ｂ）心房、（ｂ～ｃ）心室、（ｅ～ｆ）肝臓、（ｇ～ｈ）肺。スケールバーのサイズは１００μｍ。（Ｄ）免疫組織化学に基づく面積定量化によって解析された心組織におけるＢＩ－１５．２ベクター媒介性導入遺伝子発現、および（Ｅ）心組織におけるｅＧＦＰ発現のＥＬＩＳＡに基づく定量的解析（右パネル）。データは、プロットされた個々のデータ点によるバー（平均）±ＳＤとして示す（ｎ＝２匹の動物、ＢＩ １５．２処置およびｎ＝１、ＰＢＳ処置）。

【0024】

【図9】図９は、人工多能性幹細胞から分化されたヒト心筋細胞においてｅＧＦＰを形質導入および発現するＡＡＶ９、ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２の能力を説明する。

【0025】

【図10A-10B】図１０は、（Ａ）ＣＡＧプロモーターの制御下におけるヒトＭｙｄｇｆ発現をコードするｐＡＡＶ－ＣＡＧ＿ｈｕＭｙｄｇｆ、および（Ｂ）ＣＡＧプロモーターの制御下における突然変異体バージョンＭｙｄｇｆ（４個のＣ末端に位置するアミノ酸ＲＴＥＬが欠失されている）をコードするｐＡＡＶ－ＣＡＧ＿ｈｕＭｙｄｇｆ－ＲＴＥＬのＡＡＶプラスミドマップ（ｐＡＡＶ）を示す。

【0026】

【図11】図１１は、逆位末端配列（ＩＴＲ；配列番号１６および１７）に挟まれたｐＡＡＶ発現構築物にクローニングされたＣＡＧ－プロモーターの制御下におけるヒトＭｙｄｇｆまたはヒトＭｙｄｇｆ－ＲＴＥＬの配列をトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３細胞における、Ｍｙｄｇｆおよび突然変異体バージョンＭｙｄｇｆ－ＲＴＥＬの誘導を示す。トランスフェクションの４８時間後に、溶解されたＨＥＫ－２９３細胞または培地を使用して、抗ＭＹＤＧＦイムノブロットを行った。レーンは、細胞ライセート（５０μｇ総タンパク質）または馴化培地（無希釈）を含有する。

【0027】

【図12】図１２は、２．５×１０^１１ｖｇ／ｋｇのＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－Ｍｙｄｇｆの静脈内注入の３週間後の、スプラーグドーリーラットの垂直にスライスされた心臓全体におけるＭｙｄｇｆについての組織学染色を示す。

【0028】

【図13】図１３は、２．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇのＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－Ｍｙｄｇｆの静脈内注入の３週間後の、スプラーグドーリーラットの垂直にスライスされた心臓全体におけるＭｙｄｇｆについての組織学染色を示す。矢印は、心臓全体に及ぶＭｙｄｇｆ陽性染色された区域を指し示す。

【0029】

【図14】図１４は、２．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－Ｍｙｄｇｆの静脈内注入の３週間後の、スプラーグドーリーラットの垂直にスライスされた心臓全体におけるＭｙｄｇｆについての組織学染色を示す。矢印は、心臓全体に及ぶＭｙｄｇｆ陽性染色された区域を指し示す。

【0030】

【図15】図１５は、スプラーグドーリーラットの心臓組織において測定されたＭｙｄｇｆ ｍＲＮＡ発現を示す。低（２．５×１０^１１ｖｇ／ｋｇ）、中（２．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）および高用量（２．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）のＢＩ－１５．１－ＣＡＧ－Ｍｙｄｇｆの静脈内注入の３週間後に、Ｍｙｄｇｆ ｍＲＮＡ発現について心臓組織を解析した。Ｍｙｄｇｆ ｍＲＮＡの用量依存性増加および測定可能なレベルを、２．５×１０^１２および２．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇについて評価した。データは、バー（平均）±ＳＤとして示す。各用量を１匹の動物に与え、ハウスキーパーラットポリメラーゼ２を使用してｄｄＣＴ値を計算した、ｎ．ｄ．＝検出不能。

【0031】

【図16A-16B】図１６は、虚血／再灌流心筋梗塞モデルにおける左心室（ＬＶ）リモデリングおよび収縮機能障害におけるＭｙｄｇｆおよびＭｙｄｇｆ－ＲＴＥＬタンパク質療法の効果を示す。心機能およびＬＶリモデリングは、（Ａ）面積変化率（fractional area change）（ＦＡＣ）および（Ｂ）ＬＶ収縮末期面積（ＬＶＥＳＡ）ｖｓ ＬＶ拡張末期面積（ＬＶＥＤＡ）によって評価した。ｎ＝６～８／群、データは、平均＋／－ＳＥＭとして提示される。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ．シャム（sham）；＃＃＃Ｐ＜０．００１、＃＃Ｐ＜０．０１、Ｍｙｄｇｆ ｖｓ．プラセボ、＃Ｐ＜０．０５ Ｍｙｄｇｆ－ＲＴＥＬ ｖｓ．プラセボ、テューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。

【0032】

【図17A-17B】図１７は、虚血／再灌流心筋梗塞モデルにおける血管新生および瘢痕サイズにおけるＭｙｄｇｆおよびＭｙｄｇｆ－ＲＴＥＬタンパク質療法の効果を示す。（Ａ）梗塞境界ゾーンにおけるイソレクチンＢ４（ＩＢ４）＋増殖性内皮細胞を評価することにより、血管新生を評価した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５ ｖｓシャム；＃＃Ｐ＜０．０１ Ｍｙｄｇｆ ｖｓプラセボ、＃＃Ｐ＜０．０１ Ｍｙｄｇｆ－ＲＴＥＬ ｖｓプラセボ。（Ｂ）マッソントリクロームで染色された代表的な組織切片の解析により、瘢痕サイズを評価し、面積は、左心室（ＬＶ）サイズの％として提示される。＃＃Ｐ＜０．０１ Ｍｙｄｇｆ ＷＴ ｖｓ．プラセボ、＃Ｐ＜０．０５ Ｍｙｄｇｆトランケート型ｖｓプラセボ、ｎ＝６～８／群、データは、平均＋／－ＳＥＭとして提示される。テューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。

【発明を実施するための形態】

【0033】

発明の説明
本発明は、ヒト等の霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、マウス内皮細胞の特異的形質導入をもたらすカプシドタンパク質に関する。本発明のカプシドタンパク質は、マウス内皮細胞の特異的形質導入を生じ、このことは、マウスへのそのようなカプシドタンパク質を含むウイルスベクターの全身的投与後に、ベクターゲノムは、好ましくは、脳または肺の内皮細胞等の内皮細胞において蓄積することを意味する。したがって、脳または肺の内皮細胞等のマウスの内皮細胞におけるベクターゲノムの数は、非内皮細胞において蓄積するベクターゲノムの数よりも多い。好ましくは、ベクターの投与後にマウスの内皮細胞において見出すことができるベクターゲノムの数は、非内皮細胞において蓄積するベクターゲノムの数よりも５０％、より好ましくは、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、１０００％またはさらには最大２０００％多い。形質導入の特異性は、定量的ＰＣＲ方法によって測定することができる。

【0034】

カプシドタンパク質は、ウイルスにおいて天然に存在する改変されていないタンパク質であり得る。しかし、カプシドタンパク質が、例えば、標的組織へのホーミングをもたらすペプチド配列の挿入により、特定の標的組織に対するその親和性をモジュレートするように改変されていることが好まれる。霊長類心臓組織への選択的ホーミングをもたらす適したペプチドは、配列番号１および配列番号２として本明細書に提供される。

【0035】

したがって、霊長類における心臓疾患を処置または予防するために使用されるカプシドタンパク質が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号１もしくは配列番号２の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）もしくは（ｂ）のバリアント
を含むことが特に好まれる。

【0036】

本発明のさらに別の態様では、カプシドタンパク質が、霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のために提供され、前記カプシドタンパク質は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号１もしくは配列番号２の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）もしくは（ｂ）のバリアント
を含み、前記カプシドタンパク質は、好ましくは、マウス内皮細胞に形質導入する。

【0037】

本発明のカプシドタンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列を含むことができる。あるいは、それらの対応する参照アミノ酸配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列のバリアントを使用することができる。バリアントが、カプシドの一部として、マウス内皮細胞および／または霊長類心筋細胞の受容体構造へのベクターの特異的結合を媒介する能力を保持する限りにおいて、改変は、アミノ酸の置換、欠失または挿入であり得る。

【0038】

本発明は、ＣまたはＮ末端アミノ酸が改変された、配列番号１または配列番号２の配列のバリアントを包含する。本発明はまた、配列番号１または配列番号２のアミノ酸の１個が別のアミノ酸によって置換された、バリアントを包含する。好ましくは、置換は、保存的置換、すなわち、同様の機能特性をペプチドに与える、あるアミノ酸の、同様の極性のアミノ酸による置換である。好ましくは、置換されたアミノ酸は、置換えに使用されるアミノ酸と同じ群のアミノ酸に由来する。例えば、疎水性残基は、別の疎水性残基に置き換えることができる、または極性残基は、別の極性残基によって置き換えることができる。保存的置換によって互いに交換され得る機能的に同様のアミノ酸は、例えば、グリシン、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニンおよびトリプトファン等の非極性アミノ酸を含む。無電荷極性アミノ酸の例は、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシンおよびシステインである。荷電、極性（酸性）アミノ酸の例は、ヒスチジン、アルギニンおよびリシンを含む。荷電、極性（塩基性）アミノ酸の例は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。本発明はまた、配列番号１または配列番号２のペプチド配列にアミノ酸が挿入された、バリアントを包含する。その結果生じるバリアントが、マウス内皮細胞および／または霊長類心筋細胞の受容体構造に特異的に結合するその能力を保持する限りにおいて、そのような挿入は、いかなる位置において実行することもできる。本発明によって、改変されたアミノ酸が導入された、配列番号１または配列番号２の配列のアミノ酸配列のバリアントも包含される。本発明において、このような改変されたアミノ酸は、ビオチン化、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、分枝化（branching）および／または環化によって改変されたアミノ酸であり得る。

【0039】

後述する例において、配列番号２のアミノ酸配列ならびにＮ末端における２個の追加のアミノ酸、グルタミン酸およびセリンを含むヘプタマー（heptamer）配列が使用された。ヘプタマー配列は、配列番号３として本明細書に提供される。しかし、アラニンスキャンによって、２個のＮ末端アミノ酸が、形質導入の特異性に関連性がないことを実証することができる。したがって、配列番号２のコア構造のみが、霊長類における心臓組織特異性の原因となる。しかし、配列番号３として本明細書に提供されるヘプタマー配列が、カプシドタンパク質を改変するために配列番号２のアミノ酸配列と同じ仕方で使用することができる、配列番号２のアミノ酸配列の単なる一実施形態であることを理解されたい。したがって、好まれる一実施形態では、霊長類における心臓疾患を処置または予防するために使用されるカプシドタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なるそのバリアントを含む。

【0040】

したがって、本発明は、ウイルスベクター等の治療剤を霊長類の心臓組織に方向付けるのに特に適するカプシドタンパク質を提供する。本発明の方法において使用されるカプシドタンパク質は、３００～８００アミノ酸、より好ましくは、４００～８００アミノ酸、より好ましくは５００～８００アミノ酸または６００～８００アミノ酸の長さを有する。例えば、本発明の方法において使用されるカプシドタンパク質は、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸または少なくとも７００アミノ酸の長さを有することができる。

【0041】

カプシドタンパク質は、遺伝子療法の分野において使用されてきたいずれかのウイルスに由来する場合があるが、本発明の方法において使用されるカプシドタンパク質が、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するウイルスに由来するカプシドタンパク質であることが好まれる。カプシドタンパク質が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来することが特に好まれる。ＡＡＶは、先行技術に記載されているいずれかの血清型のものであり得、カプシドタンパク質は、好ましくは、血清型２、４、６、８および９のうち１種のＡＡＶに由来する。血清型２のＡＡＶのカプシドタンパク質が、特に好まれる。

【0042】

ＡＡＶ野生型のカプシドは、重複するｃａｐ遺伝子領域によってコードされるカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３で構成されている。全３種のタンパク質は、同じＣ末端領域を有する。ＡＡＶのカプシドは、１：１：８の比で発現された、約６０コピーのタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。上に定義されている配列番号１もしくは配列番号２またはこれらのいずれかのバリアントのペプチド配列は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のいずれかに挿入することができるが、ペプチド配列が、カプシドタンパク質ＶＰ１に、より好ましくは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質ＶＰ１に挿入されることが好まれる。

【0043】

ＡＶＶの全３種のカプシドタンパク質において、ホーミング機能をもたらすためにペプチド配列を挿入することができる部位が同定された。とりわけ、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質における５８８位に存在するアルギニン（Ｒ５８８）が、ホーミングペプチドの挿入のために特に提案された。ウイルスカプシドのこのアミノ酸位置は、その天然受容体へのＡＡＶ２の結合に明らかに関与する。先行技術において、Ｒ５８８が、その天然受容体へのＡＡＶ２の結合を媒介する４個のアルギニン残基のうち１個であることが示唆された。したがって、カプシドのこの領域における改変は、ＡＡＶ２の天然のトロピズムを弱めるのに、またはそれを完全に排除するのに役立つ。

【0044】

したがって、本発明において、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらのバリアントのペプチド配列が、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質のアミノ酸５５０～６００の領域に、より詳細には、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質のアミノ酸５６０～６００、５７０～６００、５６０～５９０または５７０～５９０の領域に挿入されることが好まれる。ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質の野生型アミノ酸配列は、本明細書において配列番号４に描写されている。

【0045】

ペプチド配列が、後述する例において例証されるスタッファー（stuffer）配列を有するペプチドに挿入されることが本明細書において特に好まれる。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を提供するために、配列番号２４のアミノ酸配列が、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質等のカプシドタンパク質中に入るように操作されることが好まれる。同様に、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を提供するために、配列番号２５のアミノ酸配列が、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質等のカプシドタンパク質中に入るように操作されることが好まれる。タンパク質配列の改変の結果として、本発明のカプシドタンパク質は、好ましくは、配列番号２６のアミノ酸配列または配列番号２７のアミノ酸配列を含む。

【0046】

配列が、ウイルスカプシドタンパク質のアミノ酸配列に挿入されることが好まれ、前記配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２４、配列番号２５、またはこれらのいずれかのバリアントのアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。したがって、特に好まれる態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７またはこれらのいずれかのバリアントのアミノ酸配列を含むウイルスカプシドタンパク質に関する。表０は、ヘプタマー型配列ＮＲＧＴＥＷＤおよびＥＳＧＨＧＹＦを、どのようにＡＡＶ２のＶＰ１等のウイルスカプシド中に入るように操作することができるかについて記載する。野生型ＡＡＶ２（配列番号４）と比べた５８８位の後に、スタッファーとして機能するグリシンおよびアラニンにそれぞれ挟まれて、ヘプタマー型配列が挿入される。ＡＡＶ２骨格において、５８７位におけるアスパラギンは、好ましくは、グルタミンによって交換される（Ｎ５８７Ｑ）。

【0047】

【表0】

【0048】

配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２４、配列番号２５、またはこれらのいずれかのバリアントのアミノ酸配列は、ＶＰ１タンパク質、特に、配列番号４のＶＰ１タンパク質の次のアミノ酸のうち１つの後ろに（すなわち、Ｃ末端の方向に）挿入することができる：５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９または６００。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２４、配列番号２５、またはこれらのいずれかのバリアントのアミノ酸配列が、配列番号４のＶＰ１タンパク質のアミノ酸５８８（または別のカプシドタンパク質におけるそれぞれのアミノ酸位置）に続くことが特に好まれる。ＡＡＶ２骨格において、５８７位におけるアスパラギンは、好ましくは、グルタミンによって交換される（Ｎ５８７Ｑ）。

【0049】

配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２４、配列番号２５、またはこれらのいずれかのバリアントのペプチド配列が、予め選択されたアミノ酸、例えば、５８８位におけるアミノ酸の後ろに挿入される場合、クローニングの結果である１個または複数のアミノ酸が、ＶＰ１野生型のそれぞれのアミノ酸と、ホーミングペプチド配列（スタッファー配列）の最初のアミノ酸との間に位置する可能性がある。例えば、最大５アミノ酸、すなわち、１、２、３、４または５アミノ酸が、ＶＰ１野生型のそれぞれのアミノ酸と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２４、配列番号２５またはこれらのいずれかのバリアントのペプチド配列の最初のアミノ酸との間に位置することができる。

【0050】

ＶＰ１のための上に指し示されるカプシドタンパク質のアミノ酸配列における部位および領域は、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ２およびＶＰ３に、類似して適用される。ＡＡＶ２の３種のカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、Ｎ末端配列の長さのみが異なり、同一のＣ末端を有するため、当業者は、配列比較を行って、ＶＰ１およびＶＰ２のアミノ酸配列におけるペプチドリガンドの挿入のために、上に指し示される部位を、全く問題なく同定するであろう。例えば、ＶＰ１におけるアミノ酸５８８は、ＶＰ２（配列番号５）のＲ４５１位および／またはＶＰ３（配列番号６）のＲ３８６位に対応する。

【0051】

配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２４、配列番号２５またはこれらのいずれかのバリアントのペプチド配列を、ウイルスベクターのカプシドタンパク質に挿入するための方法は、ベクター操作の分野で周知である。例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２４、配列番号２５のペプチド配列をコードする核酸配列は、配列番号４に示すＡＡＶ２ ＶＰ１タンパク質をコードする遺伝子等、ＶＰ１遺伝子の読み枠にクローニングすることができる。クローニングされた配列の挿入は、好ましくは、読み枠のいかなる変化も、翻訳の中途終結も生じない。上述に要求される方法は、ベクター操作の分野で働く当業者のルーチンの技能範囲内にある。

【0052】

特に好まれる態様では、本発明は、配列番号１もしくは配列番号２またはこれらのいずれかのバリアントのペプチド配列の挿入によって改変された、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質を提供する。例えば、配列番号７は、配列番号１のペプチド配列の導入後のＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質の配列を示す。クローニングにより、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質のネイティブ配列に存在しない２個の追加のアミノ酸を有する。具体的には、配列番号１のペプチド配列は、そのＮ末端で５８９位におけるグリシンに、およびそのＣ末端で５９７位におけるアラニンに挟まれる。加えて、ネイティブ配列の５８７位におけるアスパラギンは、グルタミンに置き換えられる。同様に、配列番号８は、配列番号３のペプチド配列の導入後のＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質の配列を示す。クローニングにより、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質のネイティブ配列に存在しない２個の追加のアミノ酸を有する。そのようなわけで、配列番号３のペプチド配列は、そのＮ末端で５８９位におけるグリシンに、およびそのＣ末端で５９７位におけるアラニンに挟まれる。加えて、ネイティブ配列の５８７位におけるアスパラギンは、グルタミンに置き換えられる。

【0053】

したがって、一実施形態では、霊長類における心臓疾患を処置または予防するために使用されるカプシドタンパク質は、
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２７のアミノ酸配列；または
（ｅ）配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号２７の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のバリアント
を含む。

【0054】

配列番号２４もしくは配列番号２５、またはこれらのいずれかのバリアントのアミノ酸配列が、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質における５８８位におけるアスパラギン残基（Ｒ５８８）（または別のカプシドタンパク質におけるそれぞれのアミノ酸位置）に続くことが特に好まれる。

【0055】

よって、特に好まれる実施形態では、本発明の方法における使用のためのカプシドタンパク質は、配列番号１またはそのバリアントのペプチド配列の挿入によって改変されたＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質である。この改変されたカプシドタンパク質は、次の：
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｂ）その長さ全体にわたり配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは、９０、９５もしくは９９％同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に定義されているアミノ酸配列のうち１種の断片
を含む。

【0056】

別の特に好まれる実施形態では、本発明の方法における使用のためのカプシドタンパク質は、配列番号２またはそのバリアントのペプチド配列の挿入によって改変されたＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質である。この改変されたカプシドタンパク質は、次の：
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｂ）その長さ全体にわたり配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは、９０、９５もしくは９９％同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に定義されているアミノ酸配列のうち１種の断片
を含む。

【0057】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、本明細書で上述されている少なくとも１種のカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドに関する。好まれる実施形態では、ウイルスカプシドは、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種のカプシドタンパク質等、本明細書で上述されている２種以上のカプシドタンパク質を含む。ウイルスカプシドは、好ましくは、ＡＡＶ、より好ましくは、ＡＡＶ２に由来する。

【0058】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、請求項１～９のいずれかに記載のカプシドタンパク質をコードする核酸に関する。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましくは、本発明のカプシドタンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ分子である。好ましくは、核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である。

【0059】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、上に定義されている核酸を含むプラスミドに関する。好ましくは、プラスミドは、完全ウイルスベクターのゲノムを含むｄｓＤＮＡ分子である。

【0060】

本明細書で使用される場合、２種またはそれよりも多い核酸またはポリペプチド配列の文脈における、用語「同一」または「パーセント同一性」は、最大の一致のために比較および整列したときに、長さが同じである、および／または同じである指定のパーセンテージのヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する、２種またはそれよりも多い配列または部分配列（subsequence）を指す。

【0061】

パーセント同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的で整列される（例えば、第２のアミノ酸（amino）または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列におけるある位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合には、両分子は、当該位置において同一である。２種の配列の間のパーセント同一性は、両配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置（例えば、重複する位置）の総数×１００）。一部の実施形態では、比較される２種の配列は、適宜（例えば、比較されている配列を越えて伸長する追加の配列を除外する）配列内にギャップが導入された後に、同じ長さである。

【0062】

用語「配列番号Ｘの長さにわたる配列番号Ｘのアミノ酸配列に対する％配列同一性」は、整列が、配列番号Ｘの配列（参照配列）の長さ全体を覆うべきであることを意味する。後述するアルゴリズムが、試験配列と参照配列の長さ全体との整列を供しないが、前記参照配列の部分配列にわたる整列のみを供する場合、試験配列に同一対応物を有しない参照配列内のアミノ酸残基は、ミスマッチとして計算される。次に、前記アルゴリズムによって得られるパーセント同一性スコアが調整される：アルゴリズムが、Ｌ個のアミノ酸の整列の長さにわたりＫ個の同一アミノ酸を生じ、Ｋ／Ｌ＊１００のパーセント同一性を生じる場合、項Ｌは、参照配列のアミノ酸の数によって置き換えられる（この数が、Ｌよりも多い場合）。例えば、試験配列が、Ｎ末端において参照配列配列番号７よりも１アミノ酸少ない（ただし、この差を除いて他の点では同一である）場合、パーセント同一性は、７４３／７４４＊１００％≒９９．８％である。逆もまた同じで、核酸配列にも同じことが当てはまる。

【0063】

２種の配列の間のパーセント同一性またはパーセント類似性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２種の配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好まれる非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように改変されたKarlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長さ＝１２により行って、目的のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３により行って、目的のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ入りの整列を得るために、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されている通りにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子の間の遠い関係性を検出する繰り返しの検索を行うことができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好まれる非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表（weight residue table）、ギャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用することができる。配列解析のための追加のアルゴリズムは、当技術分野で公知であり、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載されているＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8に記載されているＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡ内で、ｋｔｕｐは、検索の感度およびスピードを設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２である場合、比較されている２種の配列における同様の領域は、整列された残基のペアを調べることにより見出される；ｋｔｕｐ＝１である場合、単一の整列されたアミノ酸が検討される。ｋｔｕｐは、タンパク質配列では２もしくは１に、またはＤＮＡ配列では１～６に設定することができる。デフォルトは、ｋｔｕｐが指定されない場合、タンパク質では２であり、ＤＮＡでは６である。あるいは、タンパク質配列整列は、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402によって記載されている通りに、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して実行することができる。

【0064】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、組換えウイルスベクターであって、ベクターが、カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含み、カプシドが、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なるそのバリアントを含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含む、組換えウイルスベクターに関する。さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、組換えウイルスベクターであって、ベクターが、カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含み、カプシドが、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なるそのバリアントを含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含む、組換えウイルスベクターに関する。さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、組換えウイルスベクターであって、ベクターが、カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含み、カプシドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なるそのバリアントを含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含む、組換えウイルスベクターに関する。さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、組換えウイルスベクターであって、ベクターが、カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含み、カプシドが、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なるそのバリアントを含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含む、組換えウイルスベクターに関する。さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、組換えウイルスベクターであって、ベクターが、カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含み、カプシドが、配列番号２５のアミノ酸配列、または配列番号２５の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なるそのバリアントを含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含む、組換えウイルスベクターに関する。

【0065】

本発明の方法における使用のための組換えウイルスベクターは、好ましくは、組換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、いずれかの血清型のＡＡＶに、例えば、血清型２、４、６、８または９に由来し得る。しかし、本発明の方法における使用のための組換えウイルスベクターが、ＡＡＶ血清型２に由来することが最も好まれる。異なるＡＡＶ血清型は、主に、それらの天然のトロピズムによって異なる。そのようなわけで、野生型ＡＡＶ２は、肺胞細胞により容易に結合し、一方、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ９は、上皮細胞に主に感染する。当業者であれば、細胞の特異性におけるこのような天然の差を活用して、ある特定の細胞または組織に対する、本発明に係るペプチドによって媒介される特異性をさらに増強することができる。核酸レベルでは、様々なＡＡＶ血清型が高度に相同である。例えば、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３およびＡＡＶ６は、核酸レベルで８２％同一である。

【0066】

肝臓ホーミングは、心遺伝子療法のために現在試験されているほとんどではないにしても多くのＡＡＶベクターの一般的であるが都合の悪い特色である。したがって、肝臓および他の組織へのベクターホーミングの低減が非常に望ましい。本発明のベクターＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２は、ＡＡＶ９と比較して、肝臓への有意に低減されたホーミングに関連する。このことを実証するために、ベクターＢＩ－１５．１またはＢＩ－１５．２を以前に注射されたＮＨＰの心臓、肝臓および様々な他の組織において、ベクターゲノムの数（ＡＡＶベクター粒子の数に対応する）を決定した。その後、心臓対肝臓または心臓対組織比を計算し、心ホーミングの性能指標として使用した。ＮＨＰの心臓における絶対的ＡＡＶベクターゲノム数は、心臓の４種の異なる組織学的領域、すなわち、左心房、右心房、左心室および右心室の組織ライセートから得られたＤＮＡ調製物を使用することにより決定された。肝臓における絶対的ＡＡＶベクターゲノム数は、肝葉正中セクションの組織ライセートから得られたＤＮＡ調製物に基づき決定された。腎臓における絶対的ＡＡＶベクターゲノム数は、皮質および髄質の組織ライセートから得られたＤＮＡ調製物に基づき決定された。肺における絶対的ＡＡＶベクターゲノム数は、気管支（bronches）、細気管支および肺胞の組織ライセートから得られたＤＮＡ調製物に基づき決定された。脳における絶対的ＡＡＶベクターゲノム数は、解析された次の８種の領域：コア神経叢（core plexus）、脳室、脳幹、皮質、小脳、海馬、視床下部および線条体の組織ライセートから得られたＤＮＡ調製物に基づき決定された。骨格筋における絶対的ＡＡＶベクターゲノム数は、腓腹筋の組織ライセートから得られたＤＮＡ調製物に基づき決定された。眼における絶対的ＡＡＶベクターゲノム数は、網膜の組織ライセートから得られたＤＮＡ調製物に基づき決定された。ベクターゲノムの定量化は、参照標準として導入遺伝子プラスミドを使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して行われた。

【0067】

個々の動物それぞれにおける心臓対肝臓または心臓対組織比を使用して、ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２の平均心臓対組織比を計算した（下の表を参照）。ＡＡＶ ＢＩ－１５．１は、ＡＡＶ ＢＩ－１５．２と比較して、ＮＨＰにおけるより有利な心臓対肝臓ホーミング比を有した（０．５１５ 対 ０．１１９）。これはまた、様々な試験された組織において、ＡＡＶ ＢＩ－１５．２と比較して、より有利な心臓対組織ホーミング比を有した。計算された心臓対肝臓比を、ＡＡＶ９について計算された対応する比（ＮＨＰにおけるＡＡＶ９について報告された心臓対肝臓比は、およそ０．０２である（Hordeaux et al, 2018））と比較した場合、ＢＩ－１５．１が、ＡＡＶ９よりもおよそ２５．７倍優れ、ＢＩ－１５．２が、ＡＡＶ９よりもおよそ５．９倍優れると結論付けることができる。

【0068】

【表1】

【0069】

霊長類、好ましくは、ヒトにおける治療目的で、上に定義されている少なくとも１種のカプシドタンパク質、例えば、配列番号１、２、３、２４、２５、２６もしくは２７のいずれかのアミノ酸配列、またはこれらのいずれかに対して少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含むカプシドを有するウイルスベクターが、好ましくは使用されるであろう。ＮＨＰへの投与時に、ウイルスベクターが、同じ動物の次の組織：腎臓、骨格筋、肺、脳、脊髄、卵巣、子宮または眼のうち１種または複数におけるものよりも少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍または少なくとも４倍高いＮＨＰの心臓におけるベクターゲノム数をもたらすことも好まれる。特定の好まれる実施形態では、ＮＨＰの心臓におけるベクターゲノム数は、同じ動物の次の組織：腎臓、骨格筋、肺、脳および脊髄のうち全てにおけるものよりも少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍または少なくとも４倍高くなるであろう。ＮＨＰの心臓におけるベクターゲノムの数が、心臓の左心房、右心房、左心室および右心室において決定されたベクターゲノム数に基づき決定される平均値であることが特に好まれる。

【0070】

ラットへの投与時に、ウイルスベクターが、同じ動物の次の組織：腎臓、骨格筋、肺、脳、脊髄、卵巣、子宮または眼のうち１種または複数におけるものよりも少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍または少なくとも４倍高い、ラットの心臓におけるベクターゲノム数をもたらすことが同様に好まれる。特定の好まれる実施形態では、ラットの心臓におけるベクターゲノム数は、同じ動物の次の組織：腎臓、骨格筋、肺、脳および脊髄のうち全てにおけるものよりも少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍または少なくとも４倍高くなるであろう。ラットの心臓におけるベクターゲノムの数が、心臓の左心房、右心房、左心室および右心室において決定されたベクターゲノム数に基づき決定される平均値であることが特に好まれる。

【0071】

加えて、霊長類、好ましくは、ヒトにおける治療目的で使用される場合、上に定義されている少なくとも１種のカプシドタンパク質、例えば、配列番号１、２、３、２４、２５、２６もしくは２７のいずれかのアミノ酸配列、またはこれらのいずれかに対して少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含むカプシドを有するウイルスベクターは、好ましくは、ＡＡＶ９ベクターよりも高い特異性で、ＮＨＰまたはラットの心臓組織細胞、特に、心筋細胞に形質導入する。したがって、心臓対肝臓比は、ＡＡＶ９ベクターを受けたＮＨＰまたはラットと比較して、より高くなるであろう。好ましくは、本発明の少なくとも１種のカプシドタンパク質を含むウイルスベクターの心臓対肝臓比は、ＡＡＶ９の心臓対肝臓比よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍高い。ＮＨＰまたはラットの心臓におけるベクターゲノムの数が、心臓の左心房、右心房、左心室および右心室において決定されたベクターゲノム数に基づき決定される平均値であることが特に好まれる。

【0072】

上に定義されている少なくとも１種のカプシドタンパク質を含むカプシドを有するウイルスベクターは、マウス内皮細胞と共に、ラットおよび霊長類の心臓組織細胞、特に、心筋細胞に特異的に形質導入する。このことは、本発明のウイルスベクターが、マカク等のＮＨＰにおいて測定されるＢＩ－１５．１またはＢＩ－１５．２のベクターコピー心臓対肝臓比またはＧＦＰ心臓対肝臓発現比の少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を有することを意味する（図７および図８に示す通り）。

【0073】

本発明において、配列番号１、２、３、２４または２５に示すアミノ酸配列のバリアントを含むカプシドタンパク質を有するベクターが、マカク等のＮＨＰにおけるＢＩ－１５．１またはＢＩ－１５．２のベクターコピー心臓対肝臓比またはＧＦＰ心臓対肝臓発現比の少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を有することも好まれる（図７および図８に示す通り）。

【0074】

本発明の組換えウイルスベクターは、その中にパッケージングされた導入遺伝子を含む。本明細書で使用される場合、導入遺伝子は、ベクターのゲノム中に遺伝子操作することによって導入された、正常であればウイルスゲノムに属さない遺伝子を指す。本発明の方法における使用のための組換えウイルスベクター中にパッケージングされた導入遺伝子は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ）の形態で存在することができる。これは、心筋症等の心臓疾患の処置または予防において役立つことができるいずれかのタンパク質をコードすることができる。例えば、導入遺伝子は、心修復因子、カルシウム調節因子または血管新生促進性因子の群から選択されるタンパク質をコードすることができる。一実施形態では、導入遺伝子は、ヒト骨髄系由来増殖因子（ｈｕＭｙｄｇｆ）等の心修復因子をコードする。単球およびマクロファージによって産生されるこの増殖因子が、心筋梗塞後に心臓修復を促進することが報告された（ＷＯ２０１４／１１１４５８、Korf-Klingebiel et al. (2015, 2021)、Ebenhoch et al. 2019、ＷＯ２０２１／１４８４１１）。シグナル配列を含むｈｕＭｙｄｇｆのアミノ酸配列は、配列番号１８として本明細書に提供される（シグナル配列なしは、配列番号３３として本明細書に提供される）。このタンパク質をコードする対応する核酸配列は、配列番号１９として本明細書に提供される。一実施形態では、本発明の方法における使用のための組換えウイルスベクター中にパッケージングされた導入遺伝子は、
・ 配列番号１８のアミノ酸配列、またはその長さ全体にわたり配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９９％もしくは１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または好ましくは、これからなる、または
・ 配列番号３３のアミノ酸配列、またはその長さ全体にわたり配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９９％もしくは１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ｈｕＭｙｄｇｆタンパク質をコードする。

【0075】

例えば、本発明の方法における使用のための組換えウイルスベクター中にパッケージングされた導入遺伝子は、配列番号１９の核酸配列、またはその長さ全体にわたり配列番号１９の核酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９９％もしくは１００％同一性を有する核酸配列を含む（またはこれからなる）ことができる。

【0076】

一部の実施形態では、推定小胞体（ＥＲ）／ゴルジ保留シグナル（Bortnov et al., 2019）を表す、配列番号１８において描写される４個のＣ末端アミノ酸（ＲＴＥＬ）を欠如する突然変異体タンパク質としてｈｕＭｙｄｇｆを発現させることが有利となり得る。ＥＲ／ゴルジ保留シグナルは、当技術分野で公知である（例えば、Capitani & Sallese (2009)）。

【0077】

シグナル配列を含むが、Ｃ末端アミノ酸ＲＴＥＬを欠如するｈｕＭｙｄｇｆのアミノ酸配列は、配列番号２０として本明細書に提供される（シグナル配列がないｈｕＭｙｄｇｆのアミノ酸配列は、配列番号３４として本明細書に提供される）。この突然変異体タンパク質をコードする対応する核酸配列は、配列番号２１として本明細書に提供される。したがって、別の実施形態では、本発明の方法における使用のための組換えウイルスベクター中にパッケージングされた導入遺伝子は、
・ 配列番号２０のアミノ酸配列、またはその長さ全体にわたり配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９９％もしくは１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む（または好ましくは、これからなる）；または
・ 配列番号３４のアミノ酸配列、またはその長さ全体にわたり配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９９％もしくは１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、機能的なＥＲ／ゴルジ保留シグナルを欠如する
ｈｕＭｙｄｇｆタンパク質をコードする。

【0078】

例えば、本発明の方法における使用のための組換えウイルスベクター中にパッケージングされた導入遺伝子は、配列番号２１の核酸配列、またはその長さ全体にわたり配列番号２１の核酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９９％もしくは１００％同一性を有する核酸配列を含む（またはこれからなる）ことができる。

【0079】

別の実施形態では、導入遺伝子は、カルシウム調節因子タンパク質筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、低分子ユビキチン関連修飾因子１（ＳＵＭＯ１）およびＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１（Ｓ１００Ａ１）からなる群から選択されるカルシウム調節因子をコードする。さらに別の実施形態では、導入遺伝子は、血管新生促進性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする。

【0080】

Ｓｅｒｃａ２ａを発現する遺伝子療法アプローチによる駆出率が低減した心不全患者の標的化は、臨床試験（Ｃｕｐｉｄ １、進行型心不全のための遺伝学的に標的化された酵素補充療法の有効性および安全性試験と命名、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ００４５４８１８）において肯定的な結果を出した。筋小胞体Ｃａ^２＋ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）のアイソフォームの損なわれたレベルは、駆出率が低減した心不全患者（ＨＦｒＥＦ）における典型的な異常である。

【0081】

本明細書において、ＡＡＶ１中にパッケージングされ、経皮的に投与されたＡＡＶ遺伝子カセットからのＳＥＲＣＡ２ａの発現は、ＳＥＲＣＡ２ａレベルおよび機能の回復において有望なデータをもたらした（Zsebo et al. (2014)）。経過観察ＣＵＰＩＤ ２－ｂ試験（進行型心不全のための遺伝学的に標的化された酵素補充療法の試験（ＣＵＰＩＤ－２ｂ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０１６４３３３０）は、残念ながら、優れた安全性データにもかかわらず、有望な結果を出すことができなかった。ＣＵＰＩＤ ２－ｂ治験のための異なる製造手順が、一部には、観察される有効性の欠如の原因となり得ることが推測された。ＣＵＰＩＤ ２治験に登録された患者において測定された心臓筋肉におけるＤＮＡレベルは、１μｇのヒトＤＮＡ当たり１０～１９２ ｓｓＤＮＡコピーのレベルを報告し、一方、前臨床データは、１μｇの宿主ＤＮＡ当たり８０００～４２０００コピーのウイルスＤＮＡの送達効率を報告した（Lyon et al. (2020)）。

【0082】

まとめると、経皮的に送達された高用量のＡＡＶ１は、安全と考慮されたが、非臨床試験と比較して、有意なＤＮＡ低減が患者心臓に送達された。したがって、ＡＡＶベクター心形質導入効率および選択性の改善が必要とされ（Bass-Stringer et al. (2018)）、送達が未だ主な課題であり（Yamada et al. (2020)）、心臓筋肉へのＳＥＲＣＡ２ａの改善された、より高い形質導入有効性、増強された発現およびより高いコピー数送達が、臨床的に有益なレベルのＳＥＲＣＡ２ａおよび付随してＣａ^２＋レベルをもたらすべきである（Greenberg et al. (2016)）と仮定される。

【0083】

同様に、２０２１年に開始されたＣＵＰＩＤ ３治験（心疾患における遺伝子療法の経皮的投与によるカルシウム上方調節（ＣＵＰＩＤ－３）、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０４７０３８４２）において、正確な構築物（ＳＥＲＣＡ２ａを発現するＡＡＶ１）は、心臓筋肉へのベクターの送達を改善するために、ＣＵＰＩＤ ２と比較して３倍多い用量（３×Ｅ１３）で実行されている。あるいは、改善された体内分布と組み合わせた、より低い用量でヒト心臓筋肉のより効率的な形質導入を可能にするであろう新規ベクターが、より安全でより効率的な薬品を可能にするであろうと仮定することができる。

【0084】

あるいは、本発明の方法における使用のためのウイルスベクターの導入遺伝子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードすることができる。マイクロＲＮＡは、好ましくは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、ＭＹＯＤ経路、ＦＯＸＯ３経路またはＥＲＫ－ＭＡＰＫ経路の調節に関与するマイクロＲＮＡである。特に好まれる実施形態では、本発明の方法における使用のためのウイルスベクターの導入遺伝子によってコードされるマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－３７８、ｍｉＲ６６９ａ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ２１２およびｍｉＲ１３２からなる群から選択される。

【0085】

本発明の方法における使用のためのウイルスベクターの導入遺伝子は、処置されるべき対象における対応する欠損遺伝子を補充する筈である遺伝子をコードすることができる。したがって、導入遺伝子を含むウイルスベクターは、遺伝子療法アプローチにおいて使用される。そのような導入遺伝子は、ベータ－ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）、ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ３）、トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）、トロポミオシンアルファ－１鎖（ＴＰＭ１）またはミオシン軽鎖（ＭＹＬ３）の群から選択されるタンパク質をコードすることができる。

【0086】

さらに、本発明のウイルスベクターは、血流への全身的投与に意図される、分泌タンパク質をコードする導入遺伝子を含むこともできる。そのような分泌タンパク質は、心血管系の一部である肺毛細血管床経由で血流に効率的に送達され得る。

【0087】

導入遺伝子は、１個または複数の発現カセットの形態で、ウイルスベクター中に存在することができる。発現カセットは通常、導入遺伝子とは別に、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む。プロモーターは、導入遺伝子に作動可能に連結される。適したプロモーターは、心臓組織、特に、心筋細胞において選択的にまたは構成的に活性を有することができる。適したプロモーターの非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはニワトリベータアクチン／サイトメガロウイルスハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ、配列番号１４）、ＶＥ－カドヘリンプロモーター等の内皮細胞特異的プロモーター、ならびにステロイドプロモーターおよびメタロチオネインプロモーターを含むがこれらに限定されない。特に好まれる実施形態では、導入遺伝子に機能的に連結されたプロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。別の好まれる実施形態では、導入遺伝子に機能的に連結されたプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。さらに別の好まれる実施形態では、導入遺伝子に機能的に連結されたプロモーターは、心筋細胞特異的プロモーターである。心筋細胞特異的プロモーターの使用によって、心臓組織に対する本発明のウイルスベクターの特異性をさらに増加させることができる。本明細書で使用される場合、心筋細胞特異的プロモーターは、心筋細胞におけるその活性が、心筋細胞ではない細胞における活性よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍高いプロモーターである。発現カセットは、発現されるべき外因的タンパク質の発現レベルを増加させるためのエンハンサーエレメントを含むこともできる。さらに、発現カセットは、ＳＶ４０ポリアデニル化配列（配列番号１５）またはウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列等、ポリアデニル化配列を含むことができる。

【0088】

ＢＩ－１５．１またはＢＩ－１５．２等、本発明のウイルスベクターは、先行技術で広範に記載されているいくつかの異なる仕方によって、処置を必要する霊長類に投与することができる。例えば、ウイルスベクターは、様々な投与経路のために、例えば、静脈内注射または静脈内注入のために製剤化することができる。投与は、例えば、静脈内注入によって、例えば、６０分以内、３０分以内または１５分以内で行うことができる。あるいは、ウイルスベクターは、局所的に心臓に、例えば、心筋内、心膜内、血管内、経血管（trans-vascular）投与によって、または前室間（anterior interventricular）静脈への選択的圧力調節レトロ注入（retro-infusion）による左前下行枝（ＬＡＤ）の区域への投与によって投与することもできる。

【0089】

注射または注入による投与に適している組成物は典型的に、溶液および分散液、または溶液および分散液を調製することができる粉末を含む。そのような組成物は、少なくとも１種の適した薬学的に許容される担体と組み合わせたウイルスベクターを含むであろう。静脈内投与に適した薬学的に許容される担体は、静菌（bacterostatic）水、リンゲル溶液、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）を含む。注射および／または注入のための滅菌組成物は、要求される量のウイルスベクターを適切な担体に導入し、次いで濾過によって滅菌することにより調製することができる。注射または注入による投与のための組成物は、延長された期間にわたり、その調製後に貯蔵条件下で安定を保つべきである。組成物は、この目的で保存料を含有することができる。適した保存料は、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールを含む。対応する製剤および適したアジュバントの調製は、例えば、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy," Lippincott Williams & Wilkins; 21st edition (2005)に記載されている。本明細書において、本発明のウイルスベクターが、静脈内投与のために製剤化されることが好まれる。

【0090】

治療効果を達成するために投与されなければならないウイルスベクターの正確な量は、いくつかのパラメーターに依存する。投与されるべきウイルスベクターの量に関連性のある因子は、例えば、ウイルスベクターの投与経路、疾患の性質および重症度、処置されている対象の病歴、ならびに処置されるべき対象の年齢、体重、身長および健康を含む。さらに、治療効果の達成に要求される導入遺伝子の発現レベル、患者の免疫応答と共に、遺伝子産物の安定性が、投与されるべき量に関連性がある。ウイルスベクターの治療有効量は、一般知識および本開示に基づいて当業者によって決定することができる。ウイルスベクターは、好ましくは、１．０×１０^８～１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当たりのウイルスゲノム）の範囲内のウイルスの用量に対応する量で投与されるが、１．０×１０^１０～１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０^１２～５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇまたは１．０×１０^１１～１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの範囲がより好まれる。本発明に係るＡＡＶ２ベクター等、投与されるべきウイルスベクターの量は、例えば、１種または複数の導入遺伝子の発現の強度に従って調整することができる。

【0091】

別の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２４、配列番号２５、またはこれらのいずれかのバリアントのアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質をコードするプラスミドが使用されているウイルスベクターを産生するための方法に関する。例えば、ウイルスベクターは、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含むことができる。本発明のウイルスベクターは、当技術分野で記載されている周知方法に従って調製することができる。例えば、導入遺伝子を含む組換えＡＡＶベクターを産生する基本的な方法は、先行技術において詳細に記載されている（Xiao et al, 1998）。例えば、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞は、３種のプラスミドをトランスフェクトされる。第１のプラスミドは、ＡＡＶゲノムのｃａｐおよびｒｅｐ領域を含むが、天然に存在する逆方向反復（ＩＴＲ）は失われている。第２のプラスミドは、パッケージングシグナルを構成する、対応するＩＴＲに挟まれた導入遺伝子発現カセットを含む。したがって、発現カセットは、ウイルス粒子のアセンブリの経過においてカプシド中にパッケージングされる。第３のプラスミドは、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞におけるＡＡＶ複製に要求される、ヘルパータンパク質Ｅ１Ａ、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４－ｏｒｆ６、ＶＡをコードするアデノウイルスヘルパープラスミドである。あるいは、昆虫細胞においてＡＡＶベクターを産生することも可能である。Ｓｆ９昆虫細胞においてウイルスベクターを産生するための適した方法は、例えば、ＷＯ２０１５／１５８７４９またはＵＳ２０１７００２９４６４Ａ１に記載されている。ウイルスベクターの純度は、ＰＣＲ増幅等の適した方法によってチェックすることができる。本発明のウイルスベクターは、例えば、ゲル濾過によって、または塩化セシウムもしくはイオジキサノール勾配超遠心分離によって精製することができる。投与に使用されるウイルスベクターは、野生型および複製能力があるウイルスを実質的に含まないでいる必要がある。

【0092】

別の態様では、本発明は、心臓障害または疾患を処置または予防する方法における使用のための、上に記載されているカプシドタンパク質、これをコードする核酸、そのような核酸を含むプラスミドまたは組換えウイルスベクターを含む細胞に関する。細胞は、好ましくは、ヒト細胞または細胞系である。一実施形態では、細胞は、例えば、生検によってヒト対象から得られ、次いで、ｅｘ ｖｉｖｏ手順でウイルスベクターをトランスフェクトされた。次に、細胞は、例えば、移植または注入によって、対象に再び植え込むまたは他の仕方で供給することができる。細胞を得た対象が、細胞が投与される対象と遺伝的に同様のものである場合、移植された細胞の拒絶の見込みは、より低くなる。したがって、トランスフェクトされた細胞が供給される対象が、細胞を以前に得たのと同じ対象であることが好まれる。細胞は、好ましくは、ヒト心臓組織細胞（sale）、特に、ヒト心筋細胞である。トランスフェクトされるべき細胞は、ヒト成体幹細胞等の幹細胞であってもよい。本発明において、トランスフェクトされるべき細胞は、本発明に係るウイルスベクター、例えば、上に記載されている組換えＡＡＶ２ベクターをｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた自家細胞であることが特に好まれる。

【0093】

別の態様では、本発明は、霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、上に定義されているカプシドタンパク質、核酸、プラスミドまたは組換えウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。処置されるべき心臓疾患は、好ましくは、心筋症である。

【0094】

本発明は、霊長類における心臓疾患を処置または予防するための、上に定義されているカプシドタンパク質、核酸、プラスミド、組換えウイルスベクターまたは医薬組成物の使用に関する。処置されるべき心臓疾患は、好ましくは、心筋症である。心筋症は、好ましくは、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、不整脈原性（arrythmogenic）右室心筋症（ＡＲＶＣ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）および左室心筋緻密化障害（ＬＶＮＣ）からなる群から選択される。表１は、ヒトにおける心筋症の処置において有用である、治療活性があるタンパク質の概観を提供する。

【0095】

処置されるべき対象は、ヒトまたは非ヒト霊長類である。非ヒト霊長類は、サル、リスザル、ヨザル、ヒヒ、チンパンジー、マーモセット、ゴリラ、類人猿、キツネザル、マカクおよびテナガザルを含むがこれらに限定されない。好まれる実施形態では、非ヒト霊長類は、チンパンジーである。さらに、本明細書で使用される場合、ヒト霊長類は、ヒトを含む。

【0096】

別の態様では、本発明は、霊長類における心臓疾患を処置または予防するための医薬の製造のための、上に定義されているカプシドタンパク質、核酸、プラスミド、組換えウイルスベクターまたは医薬組成物の使用に関する。処置されるべき心臓疾患は、好ましくは、心筋症である。

【0097】

【表1-2】

【0098】

さらなる態様では、本発明は、霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法であって、ヒトまたは非ヒト霊長類等の霊長類への本発明に係るウイルスベクター、好ましくは、上に記載されているＡＡＶベクターの投与を含む前記方法に関する。ベクターは、好ましくは、配列番号１もしくは配列番号２またはこれらのいずれかのバリアントのアミノ酸配列を含有する少なくとも１種のカプシドタンパク質を有するカプシドを含む。特に好まれる実施形態では、ベクターは、配列番号７もしくは配列番号８またはこれらのいずれかの断片のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる少なくとも１種のカプシドタンパク質を有するカプシドを含む。ウイルスベクターは、好ましくは、導入遺伝子、例えば、心臓疾患を処置または予防するのに有用な治療タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。霊長類への投与後に、ベクターは、霊長類の心臓組織細胞における導入遺伝子の特異的な発現をもたらす。

【0099】

本発明のさらなる実施形態は、下文に記載されている。

【0100】

本発明の一つの実施形態では、本発明は、霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、マウス内皮細胞の特異的形質導入をもたらすカプシドタンパク質であって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、カプシドタンパク質に関する。ＷＯ２０１９／１９９８６７は、ＡＡＶ １５．１の使用について言及するが、霊長類心筋細胞の形質導入の文脈において言及するものではない。ＷＯ２０１９／１９９８６７において記載されているウイルスベクターによって媒介される遺伝子療法のための標的臓器は、明らかに心臓ではない。

【0101】

第二の実施形態では、本発明は、霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のためのカプシドタンパク質に関し、心臓疾患を処置または予防する前記方法は、霊長類心筋細胞の形質導入を含み、カプシドタンパク質は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２もしくは３のアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）もしくは（ｂ）のバリアント
を含む。

【0102】

本発明の第四の実施形態は、心筋症を処置または予防する方法における使用のためのカプシドタンパク質に関し、前記カプシドタンパク質は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２もしくは３のアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）もしくは（ｂ）のバリアント
を含む。

【0103】

例えば、カプシドタンパク質は、心臓にｈｕＭｙｄｇｆを送達する、より具体的には、心筋細胞に形質導入するウイルスベクターの一部であり得る。心筋症（cariomypathy）の処置のためのｈｕＭｙｄｇｆの使用は、公知である（ＷＯ２０１４／１１１４５８、Korf-Klingebiel et al. (2015, 2021)、Ebenhoch et al. 2019、ＷＯ２０２１／１４８４１１）。

【0104】

本発明の第五の実施形態は、上記実施形態のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質に関し、前記カプシドタンパク質は、３００～８００アミノ酸の長さを有する。

【0105】

本発明の第六の実施形態は、上記実施形態のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質に関し、前記カプシドタンパク質は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するウイルスのカプシドタンパク質であり、好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のカプシドタンパク質である。

【0106】

本発明の第七の実施形態は、上記実施形態のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質に関し、前記ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型２、４、６、８および９からなる群から選択され、前記ＡＡＶは、好ましくは、血清型２である。

【0107】

本発明の第八の実施形態は、請求項７に記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質に関し、前記カプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型２のＶＰ１タンパク質である。

【0108】

本発明の第九の実施形態は、上記実施形態のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質に関し、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記アミノ酸配列またはそれらの前記バリアントは、カプシドタンパク質のアミノ酸５５０～６００の領域に挿入されている。

【0109】

さらなる実施形態は、
（ｉ）前記カプシドタンパク質が、
（ａ）配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に定義されているアミノ酸配列のうち１種の断片
を含む、上述の実施形態のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質
（ｉｉ）前記カプシドタンパク質が、
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２７のアミノ酸配列；または
（ｅ）それぞれ配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号２７の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のバリアント
を含む、上述の実施形態のいずれかに記載の方法における使用のためのカプシドタンパク質
（ｉｉｉ）霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、上述の実施形態のいずれかに記載のカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドであって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、ウイルスカプシド
（ｉｖ）霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、上述の実施形態のいずれかに記載のカプシドタンパク質をコードする核酸であって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、核酸
（ｖ）霊長類における心臓疾患を処置または予防する方法における使用のための、（ｉｖ）に係る核酸を含むプラスミドであって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、プラスミド
に関する。

【0110】

本発明のさらなる実施形態では、本発明は、以下の方法（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）：
（Ａ）霊長類における心臓疾患を処置もしくは予防する方法であって、心臓疾患を処置もしくは予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、方法；または
（Ｂ）霊長類における心筋症を処置もしくは予防する方法；または
（Ｃ）霊長類における心不全もしくは慢性心不全を処置もしくは予防する方法
のいずれかにおける使用のための組換えウイルスベクターに関し、ベクターは、カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含み、カプシドは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のバリアント；
（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２５のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２６のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２７のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）もしくは（ｈ）のバリアント、
（ｊ）配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸配列；または
（ｋ）配列番号７もしくは配列番号８の前記アミノ酸配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含む。

【0111】

例えば、ウイルスベクターは、心臓にｈｕＭｙｄｇｆまたはＳＥＲＣＡ２ａを送達することができ、より具体的には、心筋細胞に形質導入することができる。心筋症（cardiomypathy）および心不全の処置のためのｈｕＭｙｄｇｆの使用は、Ｍｙｄｇｆで公知である。（慢性）心不全または駆出率が低減した心不全患者の処置のためのＳＥＲＣＡ２ａの使用もまた、公知である。

【0112】

さらなる実施形態は、以下に関する：
（ｉ）前記心筋症が、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）および左室心筋緻密化障害（ＬＶＮＣ）からなる群から選択される、先行する実施形態における使用のための組換えウイルスベクター。
（ｉｉ）前記心筋症が、原発性心筋症、好ましくは、遺伝性心筋症、自然突然変異によって引き起こされる心筋症、および後天性心筋症、好ましくは、アテローム硬化性または他の冠動脈疾患によって引き起こされる虚血性心筋症、心筋の感染または中毒によって引き起こされる心筋症からなる群から選択される、先行する実施形態における使用のための使用のための組換えウイルスベクター。
（ｉｉｉ）前記心臓疾患が、狭心症、心線維症および心肥大からなる群から選択される、先行する実施形態における使用のための使用のための組換えウイルスベクター。
（ｉｖ）前記心不全または慢性心不全が、駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）、駆出率が低減した心不全（ＨＦｒＥＦ）または駆出率が中間域にある心不全（ＨＦｍｒＥＦ）である、先行する実施形態における使用のための使用のための組換えウイルスベクター。
（ｖ）前記ＨＦｐＥＦが、ステージＣもしくはステージＤ ＨＦｐＥＦであるか、または前記ＨＦｒＥＦが、ステージＣもしくはステージＤ ＨＦｒＥＦである、先行する実施形態における使用のための使用のための組換えウイルスベクター。

【0113】

例えば、上で言及されている通りの処置のためのｈｕＭｙｄｇｆの使用は、公知であり、ＷＯ２０１４／１１１４５８、Korf-Klingebiel et al. (2015, 2021)、Ebenhoch et al. 2019、ＷＯ２０２１／１４８４１１に記載されている。

【0114】

さらなる実施形態は、先行する実施形態における使用のための使用のための組換えウイルスベクターであって、前記ベクターが、組換えＡＡＶベクターであり、
（ｉ）ＡＡＶ血清型２、４、６、８および９、好ましくは、ＡＡＶ血清型２からなる群から選択され、
（ｉｉ）導入遺伝子が、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの形態であり、
（ｉｉｉ）導入遺伝子が、心修復因子、カルシウム調節因子または血管新生促進性因子の群から選択されるタンパク質をコードし、
（ｉｖ）導入遺伝子が、心修復因子ｈｕＭｙｄｇｆをコードし、
（ｖ）導入遺伝子が、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＳＵＭＯ１およびＳ１００Ａ１からなる群から選択されるカルシウム調節因子をコードし、
（ｖｉ）導入遺伝子が、血管新生促進性因子ＶＥＧＦをコードし、
（ｖｉｉ）導入遺伝子が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードし、好ましくは、前記マイクロＲＮＡが、ＭＡＰＫ経路、ＭＹＯＤ経路、ＦＯＸＯ３経路またはＥＲＫ－ＭＡＰＫ経路の調節に関与し、より好ましくは、前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－３７８、ｍｉＲ６６９ａ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ２１２およびｍｉＲ１３２からなる群から選択され、
（ｖｉｉｉ）導入遺伝子が、処置されるべき霊長類における欠損遺伝子を補充する筈である遺伝子であり、好ましくは、前記遺伝子が、ベータ－ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）、ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ３）、トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）、トロポミオシンアルファ－１鎖（ＴＰＭ１）またはミオシン軽鎖（ＭＹＬ３）の群から選択されるタンパク質をコードし、ベクターが、静脈内投与のために製剤化されている、
組換えウイルスベクターに関する。

【0115】

本発明のさらなる実施形態では、本発明は、カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含む組換えウイルスベクターであって、カプシドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のバリアント；
を含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含み、導入遺伝子が、
（ａ）配列番号１８、２０、３３もしくは３４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１８、２０、３３もしくは３４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％もしくは１００％同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）ｈｕＭｙｄｇｆの機能を有し、好ましくは、１００を超える、より好ましくは、１２０アミノ酸の長さを有する、（ａ）もしくは（ｂ）に定義されているアミノ酸配列のうち１種の断片
を含むタンパク質をコードする、組換えウイルスベクターに関する。

【0116】

好ましくは、タンパク質バリアントまたは断片は、１．１４および１．１５と併せて１．１２に従った材料と方法（ｉ）に従ったアッセイによって決定される、ｈｕＭｙｄｇｆの活性の少なくとも一部、より好ましくは、完全活性を保存する。タンパク質バリアントまたは断片が、１．１２および１．１４および１．１５における妥当な生物学的効果を示す場合、活性は、保存されていると考えられる。さらに、好ましくは、タンパク質バリアントまたは断片は、１．１６の活性アッセイにおけるｈｕＭｙｄｇｆの効力を有する。比較目的で、配列番号３５に従った配列を有するｈｕＭｙｄｇｆを使用することが好ましい。

【0117】

さらなる実施形態は、１または複数の先行する実施形態に記載の組換えウイルスベクターに関し、前記カプシドタンパク質は、
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２７のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号２７の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のバリアント
を含む。

【0118】

さらなる実施形態は、カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含む、１または複数の先行する実施形態に記載の組換えウイルスベクターに関し、カプシドは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のバリアント
を含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含み、導入遺伝子は、機能的なゴルジ／小胞体保留シグナルを欠如するタンパク質、好ましくは、配列番号２０または配列番号３４の配列を含むタンパク質をコードする。

【0119】

さらなる実施形態は、導入遺伝子が、
（ａ）配列番号１８、２０、３３もしくは３４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１８、２０、３３もしくは３４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％もしくは１００％同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）ｈｕＭｙｄｇｆの機能を有し、好ましくは、１００を超える、より好ましくは、１２０アミノ酸の長さを有する、（ａ）もしくは（ｂ）に定義されているアミノ酸配列のうち１種の断片
を含むタンパク質をコードする、組換えウイルスベクターであって、
（ｉ）霊長類における心臓疾患であって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、霊長類における心臓疾患；または
（ｉｉ）霊長類における心筋症；または
（ｉｉｉ）霊長類における心不全もしくは慢性心不全
を処置または予防する方法における使用のための、組換えウイルスベクターに関する。

【0120】

好ましくは、タンパク質バリアントまたは断片は、１．１４および１．１５と併せて１．１２に従った材料と方法（ｉ）に従ったアッセイによって決定される、ｈｕＭｙｄｇｆの活性の少なくとも一部、より好ましくは、完全活性を保存する。タンパク質バリアントまたは断片が、１．１２および１．１４および１．１５における妥当な生物学的効果を示す場合、活性は、保存されていると考えられる。さらに、好ましくは、タンパク質バリアントまたは断片は、１．１６の活性アッセイにおけるｈｕＭｙｄｇｆの効力を有する。比較目的で、配列番号３５に従った配列を有するｈｕＭｙｄｇｆを使用することが好まれる。

【0121】

さらなる実施形態は、カプシドおよびその中にパッケージングされた導入遺伝子を含む、１または複数の先行する実施形態に記載の組換えウイルスベクターに関し、カプシドは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のバリアント
を含む少なくとも１種のカプシドタンパク質を含み、導入遺伝子は、ヒトカルシウム調節因子ＳＥＲＣＡ２ａをコードし、
ヒトカルシウム調節因子ＳＥＲＣＡ２ａは、好ましくは、
（ａ）配列番号２８～３２のいずれかのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２８～３２の前記アミノ酸配列のうち１種に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に定義されている前記アミノ酸配列のうち１種の断片
を含み、かつ
前記カプシドタンパク質は、好ましくは、
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２７のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号２７の前記配列とは１個のアミノ酸の改変によって異なる、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のバリアント
を含む。

【0122】

本発明のさらなる実施形態は、導入遺伝子が、ヒトカルシウム調節因子ＳＥＲＣＡ２ａをコードする、組換えウイルスベクターであって、
（ｉ）霊長類における心臓疾患であって、心臓疾患を処置または予防する前記方法が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、霊長類における心臓疾患；
（ｉｉ）慢性心不全；または
（ｉｉｉ）駆出率が低減した心不全患者
を処置または予防する方法における使用のための、組換えウイルスベクターに関する。

【0123】

さらなる実施形態は、医学的使用のための、好ましくは、本発明に係る霊長類の心臓疾患を処置または予防する方法のための、本発明に係るカプシドタンパク質、本発明に係るウイルスカプシド、本発明に係る核酸、本発明に係るプラスミドまたは本発明に係る組換えウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。処置または予防方法は、好ましくは、ヒトである霊長類を対象にする。

【0124】

さらなる実施形態は、霊長類、好ましくは、ヒトにおける心臓疾患を処置または予防するための医薬の製造のための、本発明に係るカプシドタンパク質、本発明に係るウイルスカプシド、本発明に係る核酸、本発明に係るプラスミドまたは本発明に係る組換えウイルスベクターを含む医薬組成物の使用に関する。

【0125】

さらなる実施形態は、霊長類、好ましくは、ヒトにおける心臓疾患を処置または予防するための医薬の製造のための、本発明に係るカプシドタンパク質、本発明に係るウイルスカプシド、本発明に係る核酸、本発明に係るプラスミドまたは本発明に係る組換えウイルスベクターを含む医薬組成物の使用において霊長類を処置する方法に関する。

【0126】

本発明は、さらに、対象、好ましくは、ヒトに、本発明に係る有効量の医薬組成物またはウイルスベクターを投与するステップを含む、対象における、
（Ａ）霊長類における心臓疾患を処置するための方法であって、心臓疾患を処置または予防する前記が、霊長類心筋細胞の形質導入を含む、方法；または
（Ｂ）霊長類における心筋症を処置または予防する方法；または
（Ｃ）霊長類における心不全もしくは慢性心不全を処置または予防する方法；または
（Ｄ）駆出率が低減した心不全患者を処置または予防する方法
に関する。

【0127】

本発明は、さらに、ラットまたは霊長類の単離された心臓組織細胞、好ましくは、単離された心筋細胞の形質導入のための、本発明に係るウイルスベクターの使用に関する。

【0128】

【表6-1】

【表6-2】

【実施例】

【0129】

本発明のある特定の態様および実施形態をさらに説明するために、次の実施例が提供される。しかし、実施例は、本発明の範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
１． 材料と方法
１．１ ベクター産生および定量化
ＨＥＫ－２９３細胞へのＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２およびＡＡＶ９ ｒｅｐ２／ｃａｐプラスミド、ｐヘルパー（phelper）および一本鎖（ｓｓ）ＣＡＧ－ｅＧＦＰまたはＣＭＶ－ｅＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミドの等モルトランスフェクションによる細胞ディスク（CELLdisc）を使用して、ＡＡＶベクターストックを産生した。ヒトＩＰＳＣ由来心筋細胞の形質導入のため、自己相補的（ｓｃ）ＣＭＶ－ｅＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミドをレポーター導入遺伝子として使用した。以前に記載された通りに（Strobel et al, 2019）、ポリエチレングリコール沈殿と、それに続くイオジキサノール密度勾配超遠心分離および限外濾過によって精製を行った。ＷＯ２０１５／１５８７４９またはＵＳ２０１７００２９４６４Ａ１に記載されている通りに、Ｓｆ９昆虫細胞における組換えＡＡＶベクターの産生を行った。ｑＰＣＲによってゲノム力価を決定した。手短に説明すると、ウイルスヌクレオチド抽出ウイルスエクスプレス核酸抽出キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃３０９５）を使用して、ウイルスＤＮＡを抽出した。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（４３７００７４；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＣＡＧプロモーターにおいても含有されるＣＭＶプロモーターの配列セグメントに特異的に結合するプライマー／プローブセットを使用して、定量的ＰＣＲを実行した。次のプライマーを使用した：
ＣＭＶ＿フォワード：５’－ＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧ－３’（配列番号１１）
ＣＭＶ＿リバース：５’－ＡＧＧＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＡＡＴＧＣ－３’（配列番号１２）
ＣＭＶ＿プローブ：５’－ＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣ－３’（配列番号１３）

【0130】

それぞれのプラスミドを使用して、系列１：５希釈によって定量化のための標準曲線を準備した。デジタルドロップレットのために、ＱＸ２００システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）を使用して定量化ＰＣＲを行った。次に、９μｌのウイルスＤＮＡ（１：１０００～１：１０^９希釈）を、プローブのための１０μＬの２×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）および目的の標的配列（ここでは：ＣＡＧまたはＣＭＶプロモーター）に特異的な１μＬの２０×プライマー－プローブセットに添加した。次に、ミックスをＤＧ８カートリッジに移し、Ｂｉｏ－Ｒａｄドロップレット生成装置およびウェル当たり７０μＬのドロップレット生成装置オイルを使用してドロップレットを生成した。４４μＬのドロップレットを９６ウェルプレートに慎重に移した後に、プレートを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰＸ１プレートシーラーを使用して密封し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｘ５０ｓ ＰＣＲマスターサイクラーに移した。サイクリング条件は次の通りであった：１０分間９５℃の初期変性ステップと、それに続く４０サイクルの３０秒間９５℃および１分間アニーリング６０℃（ランプ速度：２℃／秒）。最適なアニーリング温度は、温度勾配を実行することにより以前に同定された。１０分間９８℃の最終加熱ステップの後に、プレートを１０℃まで冷却し、ドロップレットリーダー内に置いた。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してデータを解析した。陽性および陰性ドロップレットの適正な分離を示した試料希釈度を、ＡＡＶゲノム力価の計算に使用した。

【0131】

１．２ ＡＡＶ結合アッセイ（ｂＡｂ）
ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）プラットフォームにおける架橋免疫原性アッセイフォーマットを使用して、ＮＨＰの血清における既存の総抗カプシド抗体の存在を解析した。標準マルチアレイＭＳＤプレート（Ｌ１５ＸＡ－１）を、５分間７５０ｒｐｍの振盪下でＡＡＶ－製剤緩衝剤においてウェル当たり５×１０^８ＡＡＶカプシドでコーティングした。４℃で一晩のインキュベーション後に、プレートを３回洗浄した。ブロッキング溶液（ＰＢＳにおける３％ブロッカーＡ（Ｒ９３ＢＡ－２、ＭＳＤ））を使用して１時間室温（ｒｔ）でブロッキングを行い、続いて洗浄した。対照としてのＮＨＰの血清、ＩＶＩＧ（Ｋｉｏｖｉｇ；Ｂａｘｔｅｒ）、またはＡＡＶ２コーティング対照としてのマウスＡ２０（Ｐｒｏｇｅｎ；６１０５５）を、１％ブロッカーＡ溶液において系列１：２希釈で調製し、コーティングされたＡＡＶカプシドにおいて１時間ｒｔでインキュベートした。洗浄後に、１時間ｒｔの抗ヒトＮＨＰ ＩｇＧ１－３（ＭＳＤ；Ｄ２０ＪＬ－６）または抗マウスＩｇＧ（ＭＳＤ；Ｒ３２ＡＣ－１）対照とのインキュベーションと、それに続く洗浄および２×ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝剤の添加によって、結合したＩｇＧ_１－３の量を検出した。５分以内に、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアバージョン３．０．１８を使用したＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００によって電気化学発光を検出した。個々のＡＡＶコーティング試料それぞれから、個々の血清（またはＩＶＩＧ）希釈度毎のＰＢＳコーティングウェルの値を引いた。相対的なＩｇＧ_１－３ＭＳＤシグナルを、Ａ２０値に対して正規化した。ＩｇＧ１－３シグナルの最大値の５０％を媒介した血清希釈度を、ｂＡＢ－力価として報告した。

【0132】

１．３ 中和アッセイ（ｎＡｂ）
抗カプシド抗体および潜在的に中和抗体に加えて、形質導入阻害アッセイは、ＮＨＰ血清中に存在する非抗体中和因子を検出することができる。９６ウェルプレートに、２４時間にわたりウェル当たり５×１０^４個のＨＥＫ２９３細胞を播種した。組換えＢＩ－１５．１もしくはＢＩ－１５．２またはＡＡＶ２（抗ＦＩＴＣを有する）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において希釈し、ＮＨＰ血清試料の２倍系列希釈物（１：２～１：１０２４）と共に３０分間３７℃でインキュベートした。その後、２５０００ＶＧ／細胞（ＡＡＶ２－ＮＲＧＴＥＷＤおよびＡＡＶ２－ＥＳＧＨＧＹＦ）または２５００ＶＧ／細胞（ＡＡＶ２）に対応する血清・ベクター混合物を、プレーティングされた細胞に添加し、ＤＭＥＭ・１０％ＦＣＳにおいて７２時間３７℃で５％ＣＯ_２にてインキュベートした。各混合を３回繰り返して行った。上清を９６ウェルプレートに移し、次いで、抗ＦＩＴＣ ＥＬＩＳＡによって抗ＦＩＴＣの量を決定した。形質導入効率をウェル当たりの相対的計数として測定した。中和力価は、血清なしの対照と比較して、５０％だけｒＡＡＶ形質導入を阻害した最高血清希釈度として報告した。

【0133】

１．４ ベクターストックの電子顕微鏡解析
クライオＴＥＭおよびｎｓＴＥＭ解析は、Ｖｉｒｏｎｏｖａ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）において行った。適した「グリッド上（on grid）」濃度までＡＡＶ試料を希釈した。クライオＴＥＭのため、３μｌの各試料を、連続したまたは穴のあいた（holey）カーボンＥＭグリッド上にアプライし、その後、ＦＥＩ Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（商標）を使用して液体エタン中で浸漬（plunge）凍結した。２００ｋＶ加速電圧で実行されたＪＥＯＬ ＪＥＭ－２１００ＦまたはＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ２００電界放出銃透過型電子顕微鏡を使用してグリッドを撮像した。ｎｓＴＥＭのため、試料を、適した連続したカーボングリッド上にアプライし、水で洗浄し、２％酢酸ウラニル（ＵＡｃ）または他の適した染色を使用してネガティブ染色した。２５ｋＶ加速電圧で実行されたＭｉｎｉＴＥＭ（商標）を使用してグリッドを撮像した。低および高拡大率の両方で代表的な区域を撮像した。適したグリッド上濃度、粒子分布および画像コントラストを示すグリッド上でのみ、フルセットの画像を取得した。ＥＭグリッドは、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（ｎｓＴＥＭ）のために液滴試料調製物を載せる、ＳＯＰ Ｖ０１４９に従って調製した。１．５マイクロメートルＦＯＶ画像において自動検出および分類を行って、見出された粒子の形態学的分類およびサイズ分布プロットおよび統計を生成した。

【0134】

１．５ ヒト心筋細胞における形質導入の解析
ＩＭＩ－ＳｔｅｍＢＡＮＣＣプロジェクト（Morrison et al, 2015）（http://stembancc.org）からヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ、系統ＳＦＣ０８６－０３－０１）を得た。ｈｉＰＳＣを、増殖因子低減マトリゲルでコーティングされた培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）上に播種した。１００，０００Ｕ／ｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｌストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、３７℃、５％ＣＯ２でｈｉＰＳＣを維持した。およそ７０％のコンフルエンスに達した後に、３～５日毎に０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞を継代した。

【0135】

（Burridge et al, 2014）によって発表されたプロトコールを改変したものに基づき、ｈｉＰＳＣから心筋細胞への分化を行った。手短に言えば、１×１０^４個のｈｉＰＳＣｓ／ｃｍ^２を、増殖因子低減マトリゲルコーティング培養プレート上で、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＥ８－ｆｌｅｘ培地において播種し、培地をＥ８－ｆｌｅｘ培地に４日間にわたり毎日交換した。５．５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した０．２５％ウシアルブミン画分Ｖ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．２１ｍｇ／ｍＬ Ｌ－アスコルビン酸２リン酸（L-ascorbic acid s-phosphat s-phosphat）（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ））を補充したＣＭＤ培地（ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）への培地交換によって分化を誘導した（分化０日目）。４８時間後に、５μＭ ＩＷＰ２（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）を補充したＣＭＤ培地で培地を交換した。４８時間後に、ＣＭＤ培地で培地を１日置きに新しくした。製造業者のプロトコールに従って複数組織（Multi Tissue）解離キット３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、分化１４日目に細胞を凍結保存した。製造業者のプロトコールに従ってＰＳＣ由来心筋細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の非心筋細胞枯渇ステップを使用して心筋細胞を精製した。

【0136】

フィブロネクチン（０．８μｇ／ｃｍ^２；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）コーティング培養フラスコ内で、ＲＢ＋培地（１：５０ Ｂ２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地）および１０μＭ Ｙ－２７６３２において、凍結保存された心筋細胞を解凍した。２４時間後に、ＲＢ＋培地で培地を新しくした。翌日に、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞を剥離し、ウェル当たり１．５×１０^４個の細胞を、フィブロネクチンコーティング９６ハーフエリア（half area）ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で、ＲＢ＋培地において播種した。辺縁ウェルにＰＢＳを添加した。４８時間後に、成熟培地（ＭＭ；ＤＭＥＭグルコースなし、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ非必須アミノ酸（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭ Ｌ－カルニチン、５ｍＭクレアチン、５ｍＭタウリン、１：１００ ＩＴＳ＋３液体培地サプリメント（全てＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（Drawnel et al, 2014））でスフェロイドを洗浄し、ＭＭにおいて培養した。７２時間後にＭＭを新しくした。形質導入のために、９６ウェルハーフエリアマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において細胞を播種し、２×１０^９ｖｇの指し示されるベクターを含有する１０μｌをアプライし、プレートを４８時間インキュベートし、その後、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテンツスクリーニングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、形質導入有効性の写真を評価した。

【0137】

１．６ ベクター体内分布および遺伝子発現の解析
解剖の直後に液体窒素中で組織試料を瞬間凍結した。ＤＮＡおよびＲＮＡ単離のため、６０００ｒｐｍで３０秒間Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ ２４ホモジナイザーおよびセラミックビーズチューブ（ＫＴ０３９６１－１－００９．２、ＶＷＲ）を使用して、９００μＬ ＲＬＴ緩衝剤（７９２１６、Ｑｉａｇｅｎ）中で試料をホモジナイズした。試料を直ちに氷上に置いた。次に、３５０μＬフェノール－クロロホルム－イソアミルアルコール（７７６１７、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、位相ロック（phase lock）ゲルチューブ内の７００μＬホモジネートに添加し、振盪によって混合した。５分間１６０００×ｇの遠心分離後に、３５０μＬクロロホルム－イソアミルアルコール（２５６６６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、再度混合物を振盪した。ｒｔで３分間のインキュベーションおよび５分間１２０００×ｇの遠心分離の後に、上部の相を収集し、ドライアイス上に置かれた深いウェルプレートにピペットで入れた。全試料の処理後に、必要に応じた「カラム上でのＤＮａｓｅ消化」ステップを含む使用説明書の通りにＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ ９６キット（８０３１１、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡを精製した。細胞をペレットにし、続いて、３５０μＬ ＲＬＴ緩衝剤に溶解し、ＲＮｅａｓｙミニキット（７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製することにより、細胞培養物由来のＲＮＡを単離した。断片アナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）によってＲＮＡの完全性を確認した。体内分布解析のため、抽出されたＤＮＡ、およびそれぞれの発現プラスミドの系列希釈物によって作成された標準曲線を使用して、ＡＡＶベクターゲノムを検出した。Ｔａｑｍａｎ実行は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ ７リアルタイムＰＣＲシステムにおいて行った。遺伝子発現解析のため、使用説明書の通りにＨｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ＲＴキット（Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅキット；＃４３２２１６９、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、等しい量のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとした。次に、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（＃４３７００７４、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびｅＧＦＰまたはＭｙｄｇｆ（Ｈｓ００３８４０７７＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）遺伝子に特異的に結合するプライマーを使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲ反応をセットアップした。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡ ＰＯＬＩＩ遺伝子ＩＤ；ＸＭ＿０１５４３７３９８．１またはＲｎ０１７５２０２６＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）ハウスキーパー発現に対して発現を正規化した。

【0138】

１．７ 免疫組織化学
マウス、ラットおよびＮＨＰ起源の組織試料を４％ＰＦＡにおいて固定し、パラフィン包埋した（ホルマリン固定パラフィン包埋、ＦＦＰＥ）。免疫組織化学染色のために、キシレンおよび段階的なエタノールの交換を系列的に通過させることにより、スーパーフロストプラス（super frost plus）スライド上のＦＦＰＥ組織の３μｍの厚さの切片を脱パラフィンおよび再水和した。Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ酵素溶液（Ｂｏｎｄ酵素前処置キット、Ｃａｔ＃３５６０７）において切片を５分間インキュベートすることにより、抗原修復を行った。切片を抗ＧＦＰ抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ２９０、ウサギポリクローナル）と共にインキュベートした。抗体をＬｅｉｃａ一次抗体希釈剤（ＡＲ９３５２；Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｕｓｓｌｏｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で希釈し（１：１５００）、３０分間室温でインキュベートした。Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ検出（Ｃａｔ＃３７０７２）を、検出（色素原としての３，３’ジアミノベンジジン、ＤＡＢ）および対比染色（ヘマトキシリン）のために使用した。自動Ｌｅｉｃａ ＩＨＣ Ｂｏｎｄ－ＩＩＩプラットフォーム（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｕｓｓｌｏｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において染色を行った。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ Ｍ２顕微鏡およびＺＥＮ ｓｌｉｄｅｓｃａｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて試料の顕微鏡評価を実行した。Ｍｙｄｇｆの染色のため、クエン酸塩における３０分間９５℃でのインキュベーションによる前処置ステップを行い、１：５００希釈された（希釈剤Ｃａｔ＃３５０８９；Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｕｓｓｌｏｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）抗Ｍｙｄｇｆ抗体（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ａｒｔ．：１１３５３－１－ＡＰ、ウサギＩｇＧポリクローナル）を検出のために使用した。抗ウサギＩｇＧのための標準Ｌｅｉｃａ染色プロトコールを使用して染色を行った。

【0139】

１．８ 画像解析
定量的解析のため、明視野照明で２０×対物レンズ（０．２２μｍ／ｐｘ）を使用したＡｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１ホールスライドスキャナー（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、心臓の抗ＧＦＰ染色された切片をスキャンした。面積定量化モジュール１．０を使用した画像処理ソフトウェアＨＡＬＯ ３．０（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ、Ｃｏｒｒａｌｅｓ、ＮＭ、ＵＳＡ）を用いて、抗ＧＦＰ陽性組織の面積を同定した。カラーデコンボリューションを使用して、ヘマトキシリンおよびＤＡＢのシグナルを分割した。バックグラウンドシグナルに対する応答を最小化しつつ、閾値を手作業で最適化して、ＤＡＢチャネルにおける陽性面積ａ_ｐを同定した。バックグラウンドよりも著しく高い光学密度を有する面積から、総組織面積Ａを得た。総組織面積ＡによってＤＡＢ陽性面積ａ_ｐを正規化することにより、染色された面積の分率ｆを得た、すなわち、ｆ＝ａ_ｐ／Ａ。本試験を通して同一のカラーデコンボリューション、閾値および組織面積検出設定を使用して、比較性を確実にした。

【0140】

１．９ ウエスタンブロッティングによるｈｕＭｙｄｇｆの発現および検出
哺乳動物細胞における発現のため、ＣＡＧ－プロモーターの制御下のｈｕＭｙｄｇｆ（配列番号２２）またはｈｕＭｙｄｇｆ－ＲＴＥＬ（配列番号２３）を有する２．５μｇ ｐＡＡＶプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ＃Ｌ３０００００１）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏから得たＨＥＫ２９３細胞（＃１１６３１－０１７）にトランスフェクトした。１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭにおいて細胞を育成した。一過性トランスフェクションのため、トランスフェクションの１６時間前に、６ウェルプレート内の育成培地に１×１０^６個の細胞をプレーティングした。４８時間後に、細胞層をインタクトに残しつつ、馴化培地を慎重に収集し、収集された培地中のいかなる細胞も遠心分離によってスピンダウンした。細胞スクレーパーによりプレートから細胞を除去して、１ｍｌの冷ＰＢＳに入れた。細胞を４００の相対遠心力でペレットにし、ＰＢＳを除去した。ペレットにされた細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ＃８９９０１；＃７８４３８）入りの１００μｌのＲＩＰＡ緩衝剤で溶解した。ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ＃２３２２５）によりライセートタンパク質濃度を決定した。イムノブロッティングのため、２．５％β－メルカプトエタノール（Ｂｉｏｒａｄ＃１６１０７４７）入りの４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝剤において、５０μｇライセートタンパク質または３０μｌ無希釈馴化培地を５分間９５℃で煮沸した。ＰＶＤＦ膜を５％粉ミルクでブロッキングした。１μｇ／ｍｌ抗ＭＹＤＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ＃ＡＦ１１４７）を一晩４℃でインキュベートした。１００ｎｇ／ｍｌの二次抗ヤギ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ＃７０５－０３５－００３）を１時間室温で使用した。

【0141】

１．１０ 動物
全ての動物手順は、ドイツ動物保護法（German animal protection code）によって発表され、地方自治体（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｅｓｉｄｉｕｍ Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって承認された実験動物の管理および使用のためのガイドに従って行った。トロピズム試験のため、８～１０週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ウィスター京都（whistar kyoto）ラット（ＷＫＹ／ＫｙｏＲｊ）またはスプラーグドーリーラットおよび非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、モーリシャス（mauritian）起源）にＡＡＶベクターを投与した。

【0142】

１．１１ ＡＡＶ適用プロトコール
トロピズム試験のため、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ウィスター京都ラットまたはスプラーグドーリーラットに、麻酔（３．５％イソフルラン）下で、５ｍｌ／ｋｇ体重の体積を尾静脈に注射した。全てのＮＨＰ（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、モーリシャス起源）は、中和抗体についてプレスクリーニングし、選択された個体に、１ｍｌ／ｋｇ体重の体積を３ｍｌ／分の注入速度で腕静脈に注射した。
全てのグラフおよび統計は、Ｐｒｉｓｍ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用して作成した。ダネットの多重比較検定または独立両側スチューデントＴ－検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。

【0143】

１．１２ 心筋梗塞のマウスモデル
Korf-Klingebiel et al. 2015に記載されている通りに心筋梗塞（ＭＩ）を誘導した。一過性左前下行枝冠動脈（ＬＡＤ）結紮によって、９～１０週齢ＦＶＢ／ＮマウスにおいてＭＩを誘導した。０．０２ｍｇ ｋｇ^－１アトロピン皮下（ＳＣ）（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）および２ｍｇ ｋｇ^－１ブトルファノールＳＣ（Ｐｆｉｚｅｒ）でマウスを前処置した。マウスを、フェースマスク経由で３～４％イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ）で換気した。経口挿管後に、１．５～２％イソフルランで麻酔を維持した。左開胸術を行い、スリップノットでＬＡＤを結紮し（虚血）、これを１時間後に除去した（再灌流）。対照マウスにおいて、ＬＡＤの周りに結紮糸を結び付けなかった（シャム手術）。１～２％イソフルランで鎮静されたマウスにおける高分解能二次元経胸壁心エコーを行った（線形２０～４６ＭＨｚトランスデューサーＭＸ４００、Ｖｅｖｏ ３１００、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）。長軸傍胸骨像から得たＬＶ拡張末期面積（ＬＶＥＤＡ）およびＬＶ収縮末期面積（ＬＶＥＳＡ）を記録した。面積変化率（ＦＡＣ）は、［（ＬＶＥＤＡ－ＬＶＥＳＡ）／ＬＶＥＤＡ］×１００として計算した。右頸動脈経由で挿入された１．４Ｆマイクロマノメーター（micromanometer）先端のコンダクタンスカテーテルを用いてＬＶ圧・容積ループを記録した（ＳＰＲ－８３９、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。麻酔のため、マウスを２ｍｇ ｋｇ^－１ブトルファノールＳＣで前処置し、フェースマスク経由で４％イソフルランで換気した。経口挿管後に、マウスを０．８ｍｇ ｋｇ^－１パンクロニウム腹腔内（ＩＰ）（Ａｃｔａｖｉｓ）で処置し、２％イソフルランで麻酔を維持した。定常状態圧・容積ループを１ｋＨｚの比率で測定し、ＬａｂＣｈａｒｔ ７ Ｐｒｏソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて解析した。冠血管再灌流の直前に、組換えＭｙｄｇｆ、Ｍｙｄｇｆ－ＲＴＥＬまたは希釈剤（ＰＢＳ）を充填した浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ）を、ＳＣ肩甲骨間ポケットに置いた。７ｄ注入のためにモデル１００７Ｄを使用した（ポンピング速度０．５μｌ／時間、１２μｌ当たり１０μｇのそれぞれのタンパク質を充填）。

【0144】

１．１３ 組換えＭｙｄｇｆおよび組換えＭｙｄｇｆ－ＲＴＥＬ
図１６および図１７の実験において使用された第１のタンパク質は、次の配列を有するＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された組換えＭｙｄｇｆであった：
(M)VSEPTTVAFDVRPGGVVHSFSHNVGPGDKYTCMFTYASQGGTNEQWQMSLGTSEDHQHFTCTIWRPQGKSYLYFTQFKAEVRGAEIEYAMAYSKAAFERESDVPLKTEEFEVTKTAVAHRPGAFKAELSKLVIVAKASRTEL
タンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、次のスキームに記載されているプロセスによって回収／精製した：
１．細胞破壊＋封入体（ＩＢ）回収、ＩＢ可溶化＋リフォールディング
２．透析濾過
３．ＡＩＥＣ捕捉（ＹＭＣ Ｑ７５）
４．ＨＩＣ中間体（Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ）
５．ＵＦＤＦ（限外濾過／透析濾過）
６．およそ１００ｍｇの精製された産物
図１６および図１７の実験において使用された第２のタンパク質は、次の配列を有する組換えＭｙｄｇｆ－ＲＴＥＬであった：
MGWSLILLFLVAVATRVLS
HHHHHHAGSENLYFQGVSEPTTVAFDVRPGGVVHSFSHNVGPGDKYTCMFTYASQGGTNEQWQMSLGTSEDHQHFTCTIWRPQGKSYLYFTQFKAEVRGAEIEYAMAYSKAAFERESDVPLKTEEFEVTKTAVAHRPGAFKAELSKLVIVAKAS
図１６および図１７において使用されたＭＹＤＧＦ（－ＲＴＥＬ）タンパク質は、シグナルペプチド（ＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ）と、それに続くＨｉｓタグ、リンカーおよび次いでＴＥＶ切断部位を伴って、上で描写される。シグナルペプチドは、発現の際に切断され、上のシグナルペプチド配列の下に示す成熟タンパク質配列をもたらす。このタンパク質をＨＥＫ ２９３Ｅ細胞において発現させた。上で参照されるタンパク質をコードするＤＮＡは、哺乳動物細胞発現のためのコドン最適化を用いて合成により産生し、標準方法によって制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩにおいてｐＴＴ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へとクローニングした。各トランスフェクションは、トランスフェクション方法としてＰｏｌｙＰｌｕｓ ＰＥＩを使用した１Ｌトランスフェクションサイズであった。トランスフェクション後４日目に細胞を採取し、９３００×ｇ、３０分間、４Ｃの遠心分離によって上清を収集した。一晩４ＣのＮｉ－ＮＴＡバッチ結合によって上清からタンパク質を精製した。溶出されたタンパク質は、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルおよび分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって特徴付けた。タンパク質は、ＴＥＶ切断部位を有するが、タンパク質は、切断されておらず、依然としてＨｉｓタグを含有した。

【0145】

１．１４ 瘢痕サイズ測定
Korf-Klingebiel et al, 2015に記載されている通りに瘢痕サイズ測定を実行した。再灌流の２８日後に瘢痕サイズを測定するために、左心室をＯＣＴ化合物（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）に包埋し、液体窒素中で即時（snap）凍結し、－８０℃で貯蔵した。基底、心室中部（midventricular）および尖端スライスから得た６μｍ切片をカットし、次いで、マッソントリクロームで染色し、光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１）において解析した。基底、心室中部および尖端切片において、瘢痕面積の総ＬＶ面積に対する平均比として瘢痕サイズを計算した。

【0146】

１．１５ 毛細血管化
虚血／再灌流の２８日後に梗塞境界ゾーンにおける毛細血管化の評価のために、心室中部スライスから６μｍ凍結切片をカットした。蛍光染色のために、凍結切片をローダミン標識コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色して、心筋細胞境界および間質性マトリックスを可視化し、フルオレセイン標識ＧＳＬ ＩイソレクチンＢ４（ＩＢ４、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色して、毛細血管を可視化した。ａｘｉｏ ｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して、心筋細胞当たりのＩＢ４陽性細胞を計算した。

【0147】

１．１６ 活性アッセイ
ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）における掻爬アッセイ。２４ウェルプレート内で、１０％ＦＣＳを有するＥＧＭ－２培地において、ウェル当たり１ｍｌの総体積で、ウェル当たり５５．０００～６０．０００個のＨＣＡＥＣの密度でＨＣＡＥＣを播種する。播種の２４時間後に（細胞は、コンフルエントである必要がある）、各ウェル２％ＦＣＳを含有する１ｍＬ ＭＣＤＢ培地に培地を交換し、３～４時間インキュベートする。インキュベーション後に、各ウェルにおいて黄色ピペットチップ（２００μｌ）で単層を掻爬する（掻爬が十分に大きくなることを確実にするために、垂直にチップを使用する）。次に、細胞を、２％ＦＣＳを有するＭＣＤＢ培地で１回洗浄し、その後、各ウェルに、１ｍＬの新鮮培地（ＭＣＤＢ／２％ＦＣＳ）を添加する。その後、出発濃度および１：１．５の系列希釈で、各ウェルで異なる濃度のタンパク質プローブで細胞を刺激する。Ｔ＝０時間における処置の直後に、顕微鏡（例えば、５０×拡大率（５×対物レンズ）で、位相差設定によるＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１）で全ウェルからの写真を撮る必要がある。理想的には、ウェルの中央から写真を撮る（そこで最適なコントラストが観察されるため）。次に、プレートを３７℃でインキュベートする。１６時間のインキュベーション時間の後（Ｔ＝１６時間）に、再度、前に記載された通りに、各ウェルの写真を撮る必要がある。活性の決定のため、０時間目の写真および１６時間目の写真における無細胞面積を測定することにより（例えば、ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアまたはＩｍａｇｅＪを用いて）、アッセイにおける回復を計算する。回復（％）は、［（０時間目の無細胞面積－１６時間目の無細胞面積）／０時間目の無細胞面積］×１００として計算される。

【0148】

２． 結果
２．１ ベクター産生
ラットおよび非ヒト霊長類における心筋細胞を標的化するベクターとしてのＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２の潜在力を評価するために、０．６～１．２×１０^１５ｖｇの範囲に及ぶベクターバッチ（表２に要約）を、以前に記載された通りに細胞ディスクにおいて産生した（Strobel et al, 2019）。ベクターを産生して、１．）サイトメガロウイルス初期エンハンサー＋ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーターの制御下または２．）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下のいずれかで高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現させた。

【表2】

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって、純度、凝集、カプシドアセンブリおよびパッケージング比に関して、ＨＥＫに基づくベクター調製物の品質を解析した。クライオＴＥＭ解析は、高濃度の均等に分布したフルＡＡＶ粒子を示し、粒子凝集物の検出はないかまたは微量のクラスター形成があった（ＢＩ－１５．１の図１Ａ上部パネルおよびＢＩ－１５．２の上部パネル）。画像に基づく内部密度解析は、両方のベクター調製物についてほぼ９６％のパッケージング比を示した（それぞれのカプシドバリアント毎の図１Ａ下部パネル）。加えて、ネガティブ染色ＴＥＭ（ｎｓＴＥＭ）を使用して、試料純度および粒子分類を評価した。すると、ＢＩ－１５．１は、ほぼ４３％の一次ＡＡＶ粒子およびほぼ５７％一次破壊粒子で構成されていた。ＢＩ－１５．２は、ほぼ７０％一次ＡＡＶ粒子と、対応するより少ない量の一次破壊粒子（ほぼ３０％）で構成されていた。両方のベクターバッチについて、破壊されたＡＡＶ粒子および小さいサイズの粒子（プロテアソームである可能性がある）は、５％を下回ると報告された。

【0149】

２．２ マウスにおけるベクター分布
ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２の以前に発表されたカプシド媒介性トロピズムおよび遺伝子送達特性を確認するために、ベクターを、３種の異なる用量（低用量：５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）、中用量：１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ ＢＷ、高用量：５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ ＢＷ）で雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈内注射した。ベクター投与の３週間後に、脳、肺、およびオフターゲット組織のパネルの組織試料においてベクター分布を決定した。ウイルスゲノムコピー数の定量化は、全用量コホートにおいて脳へのＢＩ－１５．１の有意なカプシド媒介性ホーミングを確認した一方で、ごく少ないベクターコピー数が、オフターゲット臓器において検出された（図２Ａ）。付随して、ＲＮＡ転写物の定量化によって解析されたｅＧＦＰ遺伝子発現レベルは、オフターゲット組織と比較して、脳全体のライセートにおいて有意にかつ特異的により強かった（図２Ｃ）。ＢＩ－１５．２注射マウスにおいて、ベクターゲノムに基づく組織分布解析によって、肺組織への有意なカプシド媒介性ベクターホーミングが確認された。より少ない量のベクターゲノムが、脳および心組織において検出され、ごく弱い～検出不能なベクターコピー数シグナルが、様々な他の対照組織に存在した（図２ＢＡ）。これらのデータと合致して、統計的に有意でかつ強くかつ用量依存性のＢＩ－１５．２媒介性レポーター遺伝子発現が、肺におけるｅＧＦＰ転写物の定量化によって確認された（図２Ｄ）。Ｓｆ９産生ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２の生物活性を確認するために、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１０ｅ１１ｖｇ／マウスを静脈内注射した。ベクター投与の２週間後に、脳、肺および肝臓の組織試料においてベクター分布が決定された。ウイルスゲノムコピー数の定量化は、脳へのＢＩ－１５．１の有意なカプシド媒介性ホーミングを確認した一方で、ごく少ないベクターコピー数が、肝臓において検出された（図２Ｅ）。ウイルスゲノムコピー数の定量化は、肺へのＢＩ－１５．２の有意なカプシド媒介性ホーミングを確認した一方で、ごく少ないベクターコピー数が、肝臓において検出された（図２Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＨＥＫと共にＳｆ９産生ＢＩ－１５．１およびＢＩ１５．２の生物活性を確認する。全ベクターが、マウスにおけるＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２の以前に報告されたカプシド媒介性標的化特性を示しており、したがって、より大型の動物モデルへの適用のためにベクターは適格である。

【0150】

２．３ ラットにおけるベクター分布
ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２の体内分布および遺伝子発現プロファイルをさらに解析するために、ＷＫＹ／ＫｙｏＲｊラットに、１×１０^１３および５×１０^１３ｖｇ／ｋｇを静脈内注射した。２１日後に、ウイルス分布のＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２ ＤＮＡ定量化ならびに遺伝子発現のＲＮＡ解析は、心組織への有意かつ用量依存性のカプシド媒介性ベクターホーミングを示した（図３Ａ、図３Ｂ）。重要なことに、ＢＩ－１５．１カプシド媒介性心ホーミングは、ＲＮＡ発現パターンによって示されるＣＡＧ駆動心遺伝子発現と強く相関した（図３Ｃ）。このことは、心臓全体の切片において評価された免疫組織学的ｅＧＦＰシグナル（図４Ａ）および面積定量化（図４Ｂ）の用量依存性増加によってさらに確認された。ＢＩ－１５．１によって媒介される強い心特異的ｅＧＦＰ発現とは対照的に、ＢＩ－１５．２ベクター媒介性発現は、骨格筋においてより高く、続いて心臓であった（図３Ｄ）。このことは、ＣＡＧが、心において、骨格筋よりも効率的にｅＧＦＰ遺伝子発現を駆動する一方で、ＣＭＶ駆動発現が、骨格筋においてより強いことを示す。しかし、免疫組織学的ｅＧＦＰシグナル（図４Ａ）およびｅＧＦＰ陽性染色心面積の面積定量化（図４Ｂ）の用量依存性増加が、ＢＩ－１５．２ベクターについて観察された。

【0151】

２．４ ＢＩ－１５．１対ＡＡＶ９の性能の比較
ＢＩ－１５．１およびＡＡＶ９（前臨床モデルにおける心遺伝子移入のための現在の標準）の性能を比較した。スプラーグドーリーラットへのｉ．ｖ．全身的ベクター投与の３週間後に（ベクター用量３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ ＢＷ）、ＤＮＡ定量化は、ＢＩ－１５．１カプシド媒介性心トロピズムを確認した。有意により多いウイルスＤＮＡコピー数が、肝臓、脳、骨格筋、肺、腎臓、膵臓および脾臓と比較して、心臓において検出された（図５Ａ）。このことは、ＢＩ－１５．１カプシド媒介性心トロピズムが、２種の異なるラット系統において保存されていることを示す。これらの結果は、ＡＡＶ９の発表された幅広いトロピズムを確認する（図５Ｂ）。加えて、様々な組織におけるより多いＤＮＡコピー数は、ＢＩ－１５．１と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ９のより長い半減期の時間を示唆する。この全身的な持続は、より強いオフターゲット効果、例えば、肝臓形質導入を生じ得る。ＢＩ－１５．１およびＡＡＶ９の体内分布パターンは、ＲＮＡ解析（図５Ｃ）、免疫組織化学的ｅＧＦＰ染色（図６Ａ）および面積定量化（図６Ｂ）によって示されるベクター媒介性遺伝子発現と相関する。ベクターホーミングを比較すると、ＡＡＶ９は、心臓におけるより多いＤＮＡコピー数を示した（１１．３倍）。ＢＩ－１５．１のＲＮＡ発現レベルは依然として、ＡＡＶ９の２８％に達したが（図５Ｄ）。このことは、ＢＩ－１５．１についてより高いＤＮＡ対ＲＮＡ発現比を指し示す。これと合致して、有効性指数もまた、様々な組織におけるＢＩ－１５．１ベクターの有利な発現プロファイルを示す（図５Ｄ）。これらの知見は、面積定量化に基づく有効性指数によってさらに確認された。心臓におけるＢＩ－１５．１ベクター媒介性発現は、ＡＡＶ９の７４％に達した一方で、様々なオフターゲット組織における有意な標的化解除が示される（図６Ｃ）。

【0152】

２．５ 非ヒト霊長類におけるベクター分布
異なる種にわたるトロピズム移行性（translatability）の欠如は、ＡＡＶに基づく遺伝子療法の主な問題の１つである。非ヒト霊長類における心組織に遺伝子を特異的に送達するＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２ベクターの能力を探索するために、本出願人らは、下の表３に提示される投薬量を使用して、成体カニクイザルにおいて体内分布試験を行った。

【表3】

ＡＡＶに対する抗体の存在は、前臨床実験にとって重要な意義を有する場合がある。したがって、試験に含まれた全動物の血清を、中和抗体と共にＡＡＶ結合ＩｇＧ_１－３抗体の存在について試験した。ｎＡｂ力価は、血清なしの対照と比較して、５０％だけｒＡＡＶ形質導入を阻害した最高血清希釈度として報告される。ＩｇＧ１－３シグナルの最大値の５０％を媒介した血清希釈度は、ｂＡｂ－力価として報告された。表３は、ＮＨＰ血清試料（ｎ＝１６匹の個々の動物）におけるＡＡＶ中和または結合抗体（ｎＡｂまたはｂＡｂ）の力価を要約する。ＡＡＶ投薬群に含まれた全個体は、中和抗体アッセイ（ｎＡｂ－アッセイ）において陰性の試験結果であった。動物ＡＪ５６２は、結合抗体アッセイにおいて、ＩｇＧに対して低い反応性を示しており（カットオフ＜１：４を下回る）、これは、投薬後にＡＡＶ形質導入（ｂＡｂ－アッセイ）に影響を与えないと考慮された。動物ＡＪ５７４（ＰＢＳ対照群）は、ｎＡｂおよびｂＡｂ（１＜６４）の両方で陽性の試験結果であった。表３、４および５を参照されたい。

【表4】

【表5】

ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２ベクターを、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ ＢＷで静脈内注射し（表３）、注射３週間後にベクターゲノム分布プロファイルを検討した。ＢＩ－１５．１について、妥当なベクターコピー数が、心室、心房、肝臓および脾臓において検出された（図７Ａ）。対照的に、ＢＩ－１５．２ベクターＤＮＡは、肝臓および脾臓において優勢に検出された。これは、ＢＩ－１５．１またはＢＩ－１５．２処置動物群における別個の心対肝臓比によって示される（図７Ａ、図８Ａ）。したがって、ＢＩ－１５．１が、ＢＩ－１５．２と比較して、改善された心ホーミングプロファイルを有すると結論付けることができる。しかし、ＢＩ－１５．１とＢＩ－１５．２の両方について、カプシド媒介性ホーミングは、ベクターＤＮＡ定量化によって示される通り、様々な他の組織において観察されなかった（図７Ａ、図８Ａ）。示される通り、ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２ベクター媒介性遺伝子発現は、ベクター分布と相関した。本出願人らは、心房と心室における強い心筋（myocardic）ｅＧＦＰ発現を示すが、肝臓においては中等度の形質導入のみが観察された。ｍＲＮＡ解析に基づき、ＢＩ－１５．２はまた、骨格筋のある程度の形質導入を示した。様々な他の組織は、ｅＧＦＰ ＲＮＡレベルに基づき発現を示さなかった（図７Ｂ、図８Ｂ）。ラットにおける以前の結果から予想される通り、おそらく、ＣＡＧ－プロモーターのより高い活性が原因で、ＢＩ－１５．１媒介性発現は、ＢＩ－１５．２よりも優れていた。加えて、本出願人らは、組織切片の免疫組織化学的染色によって、ｍＲＮＡに基づく遺伝子発現プロファイルの結果を確証した。本出願人らは、心臓の底部と共に心室における心筋細胞の強いが局所的なｅＧＦＰシグナルを観察し、本出願人らの以前の結果を確認した。他のオフターゲット組織において、ｅＧＦＰの陽性染色は、単一の肝細胞、ニューロンおよび脾臓の胚中心に主に限定された（図７Ｃ、図８Ｃ）。ｅＧＦＰ陽性細胞がない臓器は、肺、眼、子宮、脊髄、膵臓、骨格筋および腎臓であった。矢状心臓全体切片における遺伝子発現パターンの定量化のために、本出願人らは、ｅＧＦＰ陽性細胞の面積定量化を行った。ＢＩ－１５．１について、これは、心房における最大ほぼ２３％のパーセント陽性染色細胞および心室における最大ほぼ１５％陽性細胞をもたらす（図７Ｄ）。加えて、組織ライセートにおけるｅＧＦＰのＥＬＩＳＡ定量化は、これらの結果を確認した（図７Ｅ）。ＢＩ－１５．１と比較して、ＢＩ－１５．２による心筋細胞のより低い形質導入は、ＣＭＶ－プロモーターによって媒介されるより低い発現活性と組み合わせた、低減した心ホーミングに起因するより低いベクター性能が原因であった（図８Ｄ、図８Ｅ）。
主に２種の特色が、ＮＨＰにおいて心組織を標的化するため、および心臓において特異的に遺伝子を発現させるために、ＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２の特有の標的化特性を補完する。ペプチドは、標的組織に提示される受容体、受容体サブクラスまたは細胞炭水化物を介した（ただしこれらに限定されない）心組織／細胞への受容体標的化、および肝臓の標的化解除を媒介した。両方の特色は、ペプチドの個々の設計、それらの特有のスタッファー配列、ならびにＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２に使用された特異的挿入部位（Ｒ５８８）に依存する。加えて、マウスにおける内皮細胞を標的化するためのＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２のそれらの特有の特性は、マウスにおける内皮構造が、ラットおよびＮＨＰにおける心筋細胞ならびにｈｉＰＳＣ由来ヒト心筋細胞を標的化するための代理モデルとなり得ることを指し示すことができる。

【0153】

２．６ 心修復因子を発現するベクター
心筋症は、心不全の主因である（Writing Group et al, 2016）。ＢＩ－１５．１を使用して心組織へと特異的に送達された、Ｍｙｄｇｆ等の心修復因子を発現する遺伝子療法（Korf-Klingebiel et al, 2015, 2016；Korf-Klingebiel et al, 2021）は、心発育不全および心線維症を軽快させて、心機能を回復することができる。患者の心組織に遺伝子を送達する臨床潜在力を探索するために、ヒト心筋細胞でＢＩ－１５．１およびＢＩ－１５．２を試験した。したがって、ｈｉＰＳＣ由来ヒト心筋細胞を、ＢＩ－１５．１、ＢＩ－１５．２および対照としてのＡＡＶ９で形質導入した。４８時間後に、蛍光イメージングによってｅＧＦＰ発現を解析した。全ベクターが、匹敵する有効性でｈｉＰＳＣ由来ヒト心筋細胞に形質導入した（図９）。ｐＡＡＶ発現プラスミドからＭｙｄｇｆ（Bortnov et al, 2018；Bortnov et al, 2019）を発現させることができるかについて取り組むために、本出願人らは、ＣＡＧプロモーターの制御下でＭｙｄｇｆをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした（図１０）。トランスフェクションの４８時間後に、イムノブロット解析は、ｐＡＡＶ構築物から発現されたＭｙｄｇｆが、細胞画分（ライセート）に主に保持される一方で、末端４アミノ酸ＲＴＥＬが欠失された突然変異体バージョン（Ｍｙｄｇｆ－ＲＴＥＬ）が、培地へと広範に分泌されることを示した（図１１）。これらのデータは、ＡＡＶ発現ＭｙｄｇｆまたはＭｙｄｇｆ－ＲＴＥＬが、局所的にまたは分泌因子としてのいずれかでＢＩ－１５．１によって送達され得ることを示す。心修復遺伝子を送達する潜在力および心組織におけるその発現をさらに探索するために、スプラーグドーリーラットに、２．５×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇまたは２．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの１５．１を静脈内注射し、ＣＡＧプロモーターの制御下でＭｙｄｇｆ配列を移入する。Ｍｙｄｇｆの形質導入および発現の解析のために、１５．１の注射の２１日後に、免疫組織化学を用いて心臓全体スライスにおけるＭｙｄｇｆタンパク質レベル（ＩＨＣ、図１２、図１３および図１４）および心臓組織におけるＭｙｄｇｆ ｍＲＮＡ発現（図１５）について、心臓組織を解析した。２．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇおよび２．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇについて、Ｍｙｄｇｆの発現は、心臓全体のスライスにおけるＩＨＣと共に、心臓組織におけるｍＲＮＡレベルによって確認することができる。そこで、組織におけるＭｙｄｇｆのｍＲＮＡレベルと染色の両方におけるシグナルのＡＡＶ １５．１用量依存性増加が観察された。また、心臓全体のスライスの解析は、用量２．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇおよび２．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇについて心臓の総区域にわたるＭｙｄｇｆの広い分布を示した。これらのデータは、１５．１を使用して、ヒト心疾患のための、および心疾患のために治療アプローチを試験するためのモデル生物として高い関連性を有する種において、ｉｎ ｖｉｖｏで心臓において心修復因子の発現を誘導することができることを示す（Patten and Hall-Porter, 2009；Riehle et al., 2019）。
Ｍｙｄｇｆ－ＲＴＥＬバリアントもまた、活性を有し、１５．１ベクターのための治療用カーゴとして使用することができることを示すために、Ｍｙｄｇｆの両方のバリアントを、マウス心臓虚血再灌流モデルにおいて適用した。マウスは、冠動脈結紮と、それに続く、組換えＭｙｄｇｆおよび組換えＭｙｄｇｆ－ＲＴＥバリアントによるタンパク質処置を受けた。再灌流時の初期ボーラスと、それに続く７日間の一定の曝露として、タンパク質を与えた。手術２８日後に、両方のＭｙｄｇｆバリアントによる処置が、手術およびプラセボ処置マウスと比較して、左心室リモデリングおよび収縮機能障害におけるプラス効果を示し（図１６Ａ、図１６Ｂ）、また、血管新生におけるプラス効果を示し（図１７Ａ）、梗塞サイズを低減させた（図１７Ｂ）。これらのデータは、Ｍｙｄｇｆ－ＲＴＥＬバリアントの活性を指し示し、したがって、心筋症を処置するための、１５．１のための治療用カーゴとしてのこのバリアントの使用を支持する。

【0154】

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【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A-2D】

【図2E-2F】

【図3A-3D】

【図4A】

【図4B】

【図5A-5B】

【図5C-5D】

【図6A-6C】

【図7A-7B】

【図7C-7D】

【図8A-8B】

【図8C-8D】

【図9】

【図10A-10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A-16B】

【図17A-17B】

【配列表】

2024501821000001.app

【国際調査報告】