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特表2024-501832高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによるｒｈＰＣＲベース増幅産物シーケンシングにおいて、プライマー二量体及びオフターゲット増幅を低減するＲＮアーゼＨ２突然変異体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-16
(54)【発明の名称】高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによるｒｈＰＣＲベース増幅産物シーケンシングにおいて、プライマー二量体及びオフターゲット増幅を低減するＲＮアーゼＨ２突然変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20240109BHJP
C12N 9/22 20060101ALI20240109BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240109BHJP
C12Q 1/48 20060101ALI20240109BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20240109BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240109BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20240109BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20240109BHJP
C12Q 1/6848 20180101ALI20240109BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20240109BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20240109BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55
C12N9/22 ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/48
C40B40/06
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6827 Z
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6848 Z
C12N9/10
C12Q1/6876 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023538971
(86)(22)【出願日】2021-12-22
(85)【翻訳文提出日】2023-08-21
(86)【国際出願番号】 US2021064879
(87)【国際公開番号】W WO2022140553
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】63/277,273
(32)【優先日】2021-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/130,548
(32)【優先日】2020-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】510288529
【氏名又は名称】インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ドボシー，ジョゼフ
(72)【発明者】
【氏名】フローリグ，ジョン
(72)【発明者】
【氏名】パーシュバチャー，キャサリン
(72)【発明者】
【氏名】ベルツ，クリスティン
(72)【発明者】
【氏名】ローズ，スコット
(72)【発明者】
【氏名】ベールケ，マーク・アーロン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA17
4B063QR08
4B063QR14
4B063QR42
4B063QR62
4B063QR66
4B063QS24
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、生物であるピロコックス・アビッシ（Ｐ．ａ．）、テルモコックス・コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄ）及びピロコックス・フリオーススに由来するアミノ酸配列の断片を含むハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質のほか、これを使用して、ミスマッチ識別及び高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液中の活性を改善する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物であるピロコックス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐ．ａ．）、テルモコックス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）（Ｔ．ｋｏｄ）及びピロコックス・フリオースス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）に由来するアミノ酸配列の断片を含むハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項2】
Ｔ．ｋｏｄ ＲＮアーゼＨ２のアミノ酸残基２６～４０及び残基１００～１２０を含む、請求項１に記載のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項3】
配列番号２及び３から選択される、請求項１に記載のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項4】
配列番号１４～２０から選択される、請求項１に記載のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項5】
請求項１～４のいずれかに記載のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質をコードする、組換え核酸。
【請求項6】
プライマー伸長を実行するための方法であって、プライマー伸長法に適する条件下において、請求項１～４のいずれか一項に記載のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質を、プライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼと接触させ、これにより、伸長プライマーを作製するステップを含む方法。
【請求項7】
ＤＮＡポリメラーゼが、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
プライマーが、ブロックされた切断可能プライマーを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
プライマー伸長法が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行するための方法を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ＰＣＲを実行するための方法が、プライマーと、ポリヌクレオチド鋳型との間において形成されたプライマー：ポリヌクレオチドハイブリッド体における、ミスマッチ識別を改善する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ミスマッチ識別の改善が、３’側におけるミスマッチ識別の改善を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～４に記載のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物。
【請求項13】
ＤＮＡポリメラーゼが、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１２に記載の反応混合物。
【請求項14】
少なくとも１つのプライマーが、ブロックされた切断可能プライマーを含む、請求項１２又は１３に記載の反応混合物。
【請求項15】
ｒｈＰＣＲを実施するための方法であって、請求項１～４の一項に記載のハイブリッドＲＮアーゼＨ２及びプライマーにより、プライマー伸長を実施するステップを含む方法。
【請求項16】
請求項１５に記載の、ｒｈＰＣＲを実施するための方法であって、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼにより、プライマー伸長を実施するステップを含む方法。
【請求項17】
ハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素が、化学修飾、アプタマー又は遮断抗体により可逆的に不活化されている、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
ブロッキング基が、プライマーの３’末端ヌクレオチドへと結合されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
ブロッキング基が、３’末端残基の５’側へ結合され、プライマーが、ＤＮＡ合成のための鋳型として用いられることを阻害する、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ブロッキング基が、１つ以上の脱塩基残基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
１つ以上の脱塩基残基が、Ｃ３スペーサーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項22】
ブロッキング基が、ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭ及びＤｘｘＤからなる群から選択される、１つのメンバー［配列中、Ｒは、ＲＮＡ残基であり、Ｄは、ＤＮＡ残基であり、Ｍは、ミスマッチ残基であり、ｘは、Ｃ３スペーサー又はＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻止する他の方法である］を含む、請求項１８～２１の一項に記載の方法。
【請求項23】
ブロッキング基が、伸長増幅反応の検出を可能とする標識を含む、請求項１８～２２のいずれかに記載の方法。
【請求項24】
増幅反応の検出を可能とする標識が、切断部位から３’側において、オリゴヌクレオチドプライマーへ結合されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
標識が、フルオロフォアである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
標識が、質量分析による増幅反応の検出のための質量タグである、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
ブロックされた切断可能プライマーの切断ドメインが、以下の部分：ＤＮＡ残基、脱塩基残基、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチド間修飾リン酸連結のうちの１つ以上を含む、請求項１４～２６のいずれかに記載の方法。
【請求項28】
切断ドメインが、単一のＲＮＡ残基を含む、請求項１４～２６のいずれかに記載の方法。
【請求項29】
切断ドメインが、２つの隣接するＲＮＡ残基を含む、請求項１４～２６のいずれかに記載の方法。
【請求項30】
切断ドメインが、３つ以上のＲＮＡ残基による連続配列を含む、請求項１４～２６のいずれかに記載の方法。
【請求項31】
切断ドメインが、ＲＮＡ残基を欠く、請求項１４～２６のいずれかに記載の方法。
【請求項32】
切断ドメインが、１つ以上の２’修飾ヌクレオシドを含む、請求項１４～２６のいずれかに記載の方法。
【請求項33】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキルＲＮＡヌクレオシド、２’－フルオロヌクレオシド、ロックド核酸、２’－エチレン核酸残基、２’－アルキルヌクレオシド、２’－アミノヌクレオシド及び２’－チオヌクレオシドからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが、２’－フルオロヌクレオシドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項36】
標的ＤＮＡ配列を増幅する方法であって、（ａ）（ｉ）オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端において、又はこの近傍において連結されたブロッキング基の５’側に配置された、ＲＮアーゼＨ２酵素により切断可能である切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、ブロッキング基が、プライマー伸長を阻止し、及び／又はオリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ合成のための鋳型として機能することを阻害する、オリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉ）標的配列の場合もあり、標的配列でない場合もある試料核酸；
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；及び
（ｉｖ）請求項１～４に記載のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質
を含む反応混合物を用意するステップ；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて、二本鎖基質を形成するステップ；
（ｃ）ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーを、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素により、切断ドメイン内の切断部位又は切断ドメインと隣接する切断部位において切断して、ブロッキング基を、オリゴヌクレオチドプライマーから除去するステップ
を含む方法。
【請求項37】
ＤＮＡポリメラーゼが、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
ＲＮアーゼＨ２タンパク質が、化学修飾アプタマー又は遮断抗体により可逆的に不活化されている、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項39】
ブロッキング基が、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチドへと結合されている、請求項３６～３８のいずれかに記載の方法。
【請求項40】
ブロッキング基が、３’末端残基の５’側へと結合され、オリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ合成のための鋳型として機能することを阻害する請求項３６～３８のいずれかに記載の方法。
【請求項41】
ブロッキング基が、１つ以上の脱塩基残基を含む、請求項３６～４０のいずれかに記載の方法。
【請求項42】
１つ以上の脱塩基残基が、Ｃ３スペーサーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
ブロッキング基が、ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭ及びＤｘｘＤからなる群から選択される、１つのメンバー［配列中、Ｒは、ＲＮＡ残基であり、Ｄは、ＤＮＡ残基であり、Ｍは、ミスマッチ残基であり、ｘは、Ｃ３スペーサー又はＤＮＡポリメラーゼによる伸長を遮断する他の方法である］を含む、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項44】
ブロッキング基が、伸長増幅反応の検出を可能とする標識を含む、請求項３６～４３のいずれかに記載の方法。
【請求項45】
増幅反応の検出を可能とする標識をさらに含み、標識が、切断部位から３’側において、オリゴヌクレオチドプライマーへ結合されている、請求項３６～４４のいずれかに記載の方法。
【請求項46】
標識が、フルオロフォアである、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
標識が、質量分析による増幅反応の検出のための質量タグである、請求項４５に記載の方法。
【請求項48】
切断ドメインが、以下の部分：ＤＮＡ残基、脱塩基残基、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチド間修飾リン酸連結のうちの１つ以上を含む、請求項３６～４７のいずれかに記載の方法。
【請求項49】
切断ドメインが、単一のＲＮＡ残基を含む、請求項３６～４８のいずれかに記載の方法。
【請求項50】
切断ドメインが、２つの隣接するＲＮＡ残基を含む、請求項３６～４８のいずれかに記載の方法。
【請求項51】
切断ドメインが、３つ以上のＲＮＡ残基による連続配列を含む、請求項３６～４８のいずれかに記載の方法。
【請求項52】
切断ドメインが、１つ以上の２’修飾ヌクレオシドを含む、請求項３６～４８のいずれかに記載の方法。
【請求項53】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキルＲＮＡヌクレオシド、２’－フルオロヌクレオシド、ロックド核酸、２’－エチレン核酸残基、２’－アルキルヌクレオシド、２’－アミノヌクレオシド及び２’－チオヌクレオシドからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項55】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが、２’－フルオロヌクレオシドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項56】
切断部位に隣接する配列が、ヌクレアーゼによる切断に対して耐性である、１つ以上のヌクレオチド間連結を含有する、請求項３６～５５のいずれかに記載の方法。
【請求項57】
ヌクレアーゼ耐性連結が、ホスホロチオエートである、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
伸長プライマーを作製するためのキットであって、請求項１～４に記載のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質を提供する、少なくとも１つの容器を含むキット。
【請求項59】
（ａ）プライマー伸長条件下において、所定のポリヌクレオチド鋳型とハイブリダイズ可能であるプライマーを提供する容器；（ｂ）ヌクレオシド三リン酸を提供する容器；（ｃ）プライマー伸長に適する緩衝液を提供する容器及び（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、１つ以上のさらなる容器をさらに含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項60】
ＤＮＡポリメラーゼが、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項５９に記載のキット。
【請求項61】
ブロックされた切断可能プライマーを含有する容器からなる群から選択される、１つ以上のさらなる容器をさらに含む、請求項５８～６０のいずれかに記載のキット。
【請求項62】
標的ＤＮＡ配列の増幅を実施するためのキットであって、請求項１～４に記載のＲＮアーゼＨ２と、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼとを含む反応緩衝液を含むキット。
【請求項63】
１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端において、又はこの近傍において連結されたブロッキング基の５’側に配置された、ＲＮアーゼＨ２酵素により切断可能である切断ドメインであって、ブロッキング基が、プライマー伸長を阻止し、及び／又はオリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ合成のための鋳型として機能することを阻害する、切断ドメインを有する、請求項６２に記載のキット。
【請求項64】
ブロッキング基が、ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭ及びＤｘｘＤからなる群から選択される、１つのメンバー［配列中、Ｒは、ＲＮＡ残基であり、Ｄは、ＤＮＡ残基であり、Ｍは、ミスマッチ残基であり、ｘは、Ｃ３スペーサー又はＤＮＡポリメラーゼによる伸長を遮断する他の部分である］を含む、請求項６３に記載のキット。
【請求項65】
鋳型核酸の増幅産物ライブラリーを調製する方法であって、混合物を形成するステップであって、混合物が、
核酸集団；
少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマー；
ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質；
ｄＮＴＰ；
ＤＮＡポリメラーゼ；及び
緩衝液
を含み、
ハイブリッド二重鎖が、混合物中の、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーと、核酸集団との間において形成する、ステップ；
少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーを、ハイブリッド突然変異体ＲＮアーゼＨ２タンパク質により切断して、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長が可能である、少なくとも１つの活性プライマーを作出するステップ；並びに
緩衝液中、１つ以上の鋳型核酸の、核酸集団からの増幅を可能とする条件下において、ＤＮＡポリメラーゼにより、少なくとも１つの活性プライマーを伸長させ、これにより、鋳型核酸の増幅産物を作出するステップ
を含む方法。
【請求項66】
ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質が、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ又は他の高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼである、請求項６５に記載の方法。
【請求項68】
緩衝液が、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液又は別の高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液である、請求項６５に記載の方法。
【請求項69】
大量並列シークエンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実施する方法であって、核酸集団；
ハイブリッドＲＮアーゼＨ２の突然変異体タンパク質；
少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマー；
ＤＮＡポリメラーゼ；
ｄＮＴＰ；及び
緩衝液
を含む混合物によるＰＣＲを実施するステップを含む、鋳型核酸のライブラリー集団を調製するステップ、
；並びに
鋳型核酸のライブラリー集団に由来する、複数の所望の鋳型核酸をシーケンシングするステップ
を含む方法。
【請求項70】
ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質が、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
ＳＮＰ含有核酸鋳型を、核酸鋳型の増幅産物ライブラリーから検出する方法であって、混合物を形成するステップであって、混合物が、
核酸鋳型の増幅産物ライブラリー；
少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマー；
ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質；
ｄＮＴＰ；
ＤＮＡポリメラーゼ；及び
緩衝液
を含み、
混合物中の、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーと、核酸鋳型の増幅産物ライブラリー内のＳＮＰ含有核酸鋳型との間において、ハイブリッド二重鎖が形成する、ステップ；
ハイブリッド二重鎖の、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーを、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質により切断して、ＤＮＡポリメラーゼによる、ハイブリッド二重鎖のプライマー伸長が可能な、少なくとも１つの活性プライマーを作出するステップ；並びに
緩衝液中、１つ以上の鋳型核酸の、核酸鋳型の増幅産物ライブラリーからの増幅を可能とする条件下において、ＤＮＡポリメラーゼにより、ハイブリッド二重鎖内の、少なくとも１つの活性プライマーを伸長させ、これにより、ＳＮＰ含有核酸鋳型を検出するステップ
を含む方法。
【請求項72】
ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質が、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
ループ媒介増幅反応を実施する方法であって、混合物を形成するステップであって、混合物が、
核酸鋳型；
ＲＮアーゼＨ２タンパク質に対する基質である核酸鋳型と共に、二重鎖を形成する、４つのブロックされた切断可能プライマー；
Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択されるＲＮアーゼＨ２タンパク質；
ＤＮＡポリメラーゼタンパク質；
ｄＮＴＰ；及び
緩衝液
を含む、ステップ；並びに
混合物により、等温増幅サイクルを実施するステップ
を含む方法。
【請求項74】
請求項６、１５、３６、６９、７１及び７３のいずれか一項に記載の方法を、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）を用いて使用して作製された混合産物であって、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）から作製された混合産物が、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（配列番号１）により作製された混合産物と比べて、プライマー二量体分子種が低減された集団を含む、混合産物。
【請求項75】
プライマー二量体の形成が低減されたｒｈＰＣＲアッセイを実施する方法であって、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）により、プライマー伸長を実施するステップを含み、プライマー二量体形成の低減が、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）によるｒｈＰＣＲアッセイ時に形成されたプライマー二量体の量の、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（配列番号１）により行われたｒｈＰＣＲアッセイと比較した低減に対応する、方法。
【請求項76】
所望の産物について、マッピング率及びオンターゲット率が改善されたｒｈＰＣＲアッセイを実施する方法であって、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）により、プライマー伸長を実施するステップを含み、マッピング率及びオンターゲット率の改善が、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）によるｒｈＰＣＲアッセイ時に形成された、所望の産物のマッピング及びオンターゲット増幅の、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（配列番号１）により行われたｒｈＰＣＲアッセイと比較した増大に対応する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の下において、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれた、２０２０年１２月２４日に出願され、「ＲＮＡＳＥ Ｈ２ ＭＵＴＡＮＴＳ ＴＨＡＴ ＥＮＨＡＮＣＥ ＭＩＳＭＡＴＣＨ ＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＩＮ ＨＩＧＨ－ＦＩＤＥＬＩＴＹ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＢＵＦＦＥＲ」と題された、米国特許仮出願第６３／１３０，５４８号及び２０２１年１１月９日に出願され、「ＲＮＡＳＥ Ｈ２ ＭＵＴＡＮＴＳ ＴＨＡＴ ＲＥＤＵＣＥ ＰＲＩＭＥＲ ＤＩＭＥＲＳ ＡＮＤ ＯＦＦ－ＴＡＲＧＥＴ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＩＮ ＲＨＰＣＲ－ＢＡＳＥＤ ＡＭＰＬＩＣＯＮ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ ＷＩＴＨ ＨＩＧＨ－ＦＩＤＥＬＩＴＹ ＤＮＡ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ」と題された、米国特許仮出願第６３／２７７，２７３号に対する優先権を主張する。
【0002】
本発明の分野
本発明は、ＩＩ型ＲＮアーゼＨ（本明細書の後出において、ＲＮアーゼＨ２と称される）ハイブリッド酵素変異体、及び核酸鎖を切断して生物学的アッセイを開始する、支援する、モニタリングする、又は実施する方法に関する。
本発明は、ＩＩ型ＲＮアーゼＨ（本明細書の後出において、ＲＮアーゼＨ２と称される）ハイブリッド酵素変異体、及び核酸鎖を切断して生物学的アッセイを開始する、支援する、モニタリングする、又は実施する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ＲＮアーゼＨ２酵素のファミリーは、広範に特徴付けられている。これらの酵素は、ＤＮＡ配列（二重鎖形態にある）内に埋め込まれている単一のリボヌクレオチド（Ｅｄｅｒ、ら、（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、７５、１２３～１２６）を切断するための基質特異性を有する。興味深いことに、切断は、ＲＮＡ残基の５’側において生じる（スキームＩを参照されたい）。これらの酵素、それらの特性及び生物学的アッセイについての適用についての概要は、Ｗａｌｄｅｒらによる、米国特許第８，９１１，９４８Ｂ２号にまとめられている。
【0004】
【化1】
【0005】
超好熱菌である、ピロコックス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐ．ａ．）から単離されたＲＮアーゼＨ２酵素は、それ以外は、全て、ＤＮＡから作られた核酸鎖内に埋め込まれているリボヌクレオチドの５’側において切断する。ＲＮアーゼＨ２依存型ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）は、３’末端上のブロッキング基を除去し、３’末端の近傍において、単一のリボヌクレオチドを含有するプライマーを切断するように熱安定性ＲＮアーゼＨ２酵素を使用してＰＣＲの特異性を改善する（Ｄｏｂｏｓｙら、２０１１；米国特許第８，９１１，９４８Ｂ２号）。このプライマーは、当初、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長が不可能であるが、ＲＮアーゼＨ２により、３’末端から、ブロッキング基が除去されると、伸長が可能である。Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２は、ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二重鎖内、リボヌクレオチドの近傍における、一塩基ミスマッチに感受性であり、ミスマッチ含有鋳型をはるかな低率において切断する。これにより、完全なマッチ二重鎖の優先的な切断及び伸長が可能となる。これは、ｒｈＰＣＲ反応における特異性の増大を結果としてもたらし、プライマー二量体形成及び他のオフターゲット増幅を低下させる。
【0006】
ｒｈＰＣＲは、ＰＣＲの特異性にもたらす増強にもかかわらず、現状では限界を有する。ｒｈＰＣＲによる、見かけのミスマッチ識別は、理論的に達成可能であるべき識別より低度である。ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２は、ＲＮＡ塩基の直接の向かい側における、一塩基ミスマッチを、高度に認識するが、効率は、ミスマッチの性質に応じて変化する。加えて、天然の酵素は、ＲＮＡ塩基の、すぐの５’側又は３’側の位置におけるミスマッチ識別も、比較的限定的である。この限界にもかかわらず、これらの位置における突然変異の配置は、有利でありうる。例として述べると、ＲＮＡの、すぐの５’側におけるミスマッチは、プライマー切断後のＰＣＲ増幅における、識別性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ７８４Ｑテルムス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼなど）の使用を伴う二次選択ステップとして使用されうる（米国特許出願第１５／３６１２８０号を参照されたい）。ミスマッチ認識は、鋳型転換中に１回ではなく、サイクルごとに生じるので、ＲＮＡの３’側における、ミスマッチの配置は、鋳型転換の可能性を低減する。
【0007】
ｒｈＰＣＲの有用性にもかかわらず、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２によるミスマッチ識別は、「遺漏」がありうる結果として、プライマー二量体の、ある程度の増幅をもたらす。シーケンシングライブラリーの増幅時にもたらされるプライマー二量体は、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルに結合し、シーケンシングを受けるが、有意味なデータをもたらさないため、問題である。高レベルのプライマー二量体は、目的の標的へとマッピングされるリード画分を減少させ、最終的に、アッセイ感度を低減する、又は低頻度変異体の検出のために必要な数のオンターゲットリードを作出するように、シーケンシング費用の著明な増大を要求する。低頻度変異体の検出もまた、ＰＣＲ時における増幅エラーの導入により影響を受ける場合がある。高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ及び最適化緩衝液条件の使用により、エラー率は、低下しうる。しかし、これらの緩衝液条件は、ｒｈＰＣＲにおける、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の酵素活性及びミスマッチ感度を低減する。
【0008】
他の類縁の分子種に由来する配列による、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２のアミノ酸配列の部分的組換えを介して作出されたＲＮアーゼＨ２突然変異体の使用は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液中の、ＲＮアーゼＨ２酵素活性の改善を結果としてもたらすことが、既に示されている。これらの突然変異体のうちの２つである、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡｌ０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、テルモコックス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液を使用する場合に酵素活性が改善していることが示された。加えて、いずれの突然変異体も、ＲＮＡ塩基の向かい側におけるミスマッチのほか、ＲＮＡ塩基の３’及び５’におけるミスマッチ識別の、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較した増強を示す。その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、２０２０年１２月２４日に出願され、「ＲＮＡＳＥ Ｈ２ ＭＵＴＡＮＴＳ ＴＨＡＴ ＥＮＨＡＮＣＥ ＭＩＳＭＡＴＣＨ ＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＩＮ ＨＩＧＨ－ＦＩＤＥＬＩＴＹ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＢＵＦＦＥＲ」と題された、米国特許仮出願第６３／１３０，５４８号（代理人整理番号：ＩＤＴ０１－０１８－ＰＲＯ）を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】米国特許第８９１１９４８Ｂ２号明細書
【特許文献2】米国特許第８９１１９４８Ｂ２号明細書
【特許文献3】米国特許出願第１５／３６１２８０号
【特許文献4】米国特許仮出願第６３／１３０５４８号
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｅｄｅｒ、ら、（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、７５、１２３～１２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本開示は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ及び緩衝液を含有するマルチプレックスｒｈＡｍｐＳｅｑワークフローにおける、これらの新規のハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素変異体のうちの１つであるＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２に関する。野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較して、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、ＰＣＲ増幅時に作製されるプライマー二量体を低減し、これにより、マッピング率及びオンターゲット率を改善する。これらのメトリックを改善しながら、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、増幅産物の均一性、増幅産物のドロップアウト率及び増幅産物の均一性分布を含む、他の極めて重要なシーケンシングメトリックに対して、影響を及ぼさなかった。
【課題を解決するための手段】
【0012】
（発明の要旨）
第１の態様において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質が提供される。ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、生物であるピロコックス・アビッシ（Ｐ．ａ．）、テルモコックス・コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄ）及びピロコックス・フリオースス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）に由来するアミノ酸配列の断片を含む。
第１の態様において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質が提供される。ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、生物であるピロコックス・アビッシ（Ｐ．ａ．）、テルモコックス・コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄ）及びピロコックス・フリオースス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）に由来するアミノ酸配列の断片を含む。
【0013】
第２の態様において、本明細書において開示された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質のうちのいずれかをコードする組換え核酸が提供される。
【0014】
第３の態様において、プライマー伸長を実行するための方法が提供される。方法は、プライマー伸長法に適する条件下において、本明細書において開示された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質を、プライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼと接触させ、これにより、伸長プライマーを作製するステップを含む。
【0015】
第４の態様において、反応混合物が提供される。反応混合物は、本明細書において記載された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼを含む。
【0016】
第５の態様において、ｒｈＰＣＲを実施するための方法が提供される。方法は、本明細書において記載された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２、ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーにより、プライマー伸長を実施するステップを含む。
【0017】
第６の態様において、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法が提供される。方法は、いくつかのステップを含む。第１のステップは、以下：（ｉ）オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端において、又はこの近傍において連結されたブロッキング基の５’側に配置された、ＲＮアーゼＨ２酵素により切断可能である切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、ブロッキング基が、プライマー伸長を阻止し、かつ／又はオリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ合成のための鋳型として用いられることを阻害する、オリゴヌクレオチドプライマー；（ｉｉ）標的配列の場合もあり、標的配列でない場合もある試料核酸；（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；及び（ｉｖ）本明細書において開示された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質を含む反応混合物を用意するステップである。第２のステップは、オリゴヌクレオチドプライマーを、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて、二本鎖基質を形成するステップを含む。第３のステップは、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーを、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素により、切断ドメイン内の切断部位又は切断ドメインと隣接する切断部位において切断して、ブロッキング基を、オリゴヌクレオチドプライマーから除去するステップである。
【0018】
第７の態様において、伸長プライマーを作製するためのキットが提供される。キットは、本明細書において開示された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質を提供する、少なくとも１つの容器を含む。
【0019】
第８の態様において、標的ＤＮＡ配列の増幅を実施するためのキットが提供される。キットは、本明細書において記載されたＲＮアーゼＨ２と、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼとを含む反応緩衝液を含む。
【0020】
第９の態様において、鋳型核酸の増幅産物ライブラリーを調製する方法が提供される。方法は、いくつかのステップを含む。第１のステップは、ハイブリッド二重鎖が、混合物中の、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーと、核酸集団との間において形成するように、核酸集団、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマー、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ及び緩衝液を含む混合物を形成するステップである。第２のステップは、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーを、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質により切断して、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長が可能である、少なくとも１つの活性プライマーを作出するステップである。第３のステップは、緩衝液中、１つ以上の鋳型核酸の、核酸集団からの増幅を可能とする条件下において、ＤＮＡポリメラーゼにより、少なくとも１つの活性プライマーを伸長させ、これにより、鋳型核酸の増幅産物を作出するステップである。第１の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択される。第２の関連事項において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ又は他の高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼである。第３の関連事項において、緩衝液は、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液である。
【0021】
第１０の態様において、大量並列シークエンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実施する方法が提供される。方法は、いくつかのステップを含む。第１のステップは、ＰＣＲ法において、核酸集団、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２突然変異体タンパク質、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び緩衝液を使用して、鋳型核酸のライブラリー集団を調製するステップである。第２のステップは、鋳型核酸のライブラリー集団に由来する、複数の所望の鋳型核酸をシーケンシングするステップである。第１の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択される。
【0022】
第１１の態様において、ＳＮＰ含有核酸鋳型を、核酸鋳型の増幅産物ライブラリーから検出する方法が提供される。方法は、いくつかのステップを含む。第１のステップは、核酸鋳型の増幅産物ライブラリー；少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマー；ハイブリッド突然変異体ＲＮアーゼＨ２タンパク質；ｄＮＴＰ；ＤＮＡポリメラーゼ；及び緩衝液を含む混合物を形成するステップを含む。ハイブリッド二重鎖は、混合物中の、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーと、核酸鋳型の増幅産物ライブラリー内のＳＮＰ含有核酸鋳型との間において形成する。第２のステップは、ハイブリッド二重鎖の、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーを、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質により切断して、ＤＮＡポリメラーゼによる、ハイブリッド二重鎖のプライマー伸長が可能な、少なくとも１つの活性プライマーを作出するステップを含む。第３のステップは、緩衝液中、１つ以上の鋳型核酸の、核酸鋳型の増幅産物ライブラリーからの増幅を可能とする条件下において、ＤＮＡポリメラーゼにより、二重鎖内の、少なくとも１つの活性プライマーを伸長させ、これにより、ＳＮＰ含有核酸鋳型を検出するステップを含む。第１の関連事項において、方法は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のハイブリッド突然変異体ＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択されるハイブリッド突然変異体ＲＮアーゼＨ２タンパク質を含む。第２の関連事項において、方法は、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液である緩衝液を含む。
【0023】
第１２の態様において、ループ媒介増幅反応を実施する方法が提供される。方法は、２つのステップを含む。第１のステップは、核酸鋳型；ＲＮアーゼＨ２タンパク質に対する基質である核酸鋳型と共に、二重鎖を形成する、４つのブロックされた切断可能プライマー；Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択されるＲＮアーゼＨ２タンパク質；ＤＮＡポリメラーゼタンパク質；ｄＮＴＰ；及び緩衝液を含む混合物を形成するステップを含む。第２のステップは、混合物により、等温増幅サイクルを実施するステップを含む。
【0024】
第１３の態様において、プライマー二量体の形成が低減されたｒｈＰＣＲアッセイを実施する方法が提供される。方法は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）により、プライマー伸長を実施するステップを含む。プライマー二量体形成の低減は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）によるｒｈＰＣＲアッセイ時に形成されたプライマー二量体の量の、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（配列番号１）により行われたｒｈＰＣＲアッセイと比較した低減に対応する。
【0025】
第１４の態様において、所望の産物について、マッピング率及びオンターゲット率が改善されたｒｈＰＣＲアッセイを実施する方法が提供される。方法は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）により、プライマー伸長を実施するステップを含む。マッピング率及びオンターゲット率の改善は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）によるｒｈＰＣＲアッセイ時に形成された、所望の産物のマッピング及びオンターゲット増幅の、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（配列番号１）により行われたｒｈＰＣＲアッセイと比較した増大に対応する。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1A】突然変異体である、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素を使用する場合の二量体率が、全ての酵素濃度において、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素と比較して低下したことを示す例示的プロットを描示する図である。
【図1B】突然変異体である、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素によるマッピング率が、全てのＲＮアーゼＨ２酵素濃度において、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素と比較して高度であることについての例示的データを描示する図である。
【図1C】突然変異体である、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素によるオンターゲット率が、全ての酵素濃度において、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素と比較して高度であることを示す、例示的データを描示する図である。
【図2】同定された各プライマー対１つ当たりの平均値正規化二量体カウントの例を描示する図であり、この場合、突然変異体である、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素は、同定された最多のプライマー二量体を、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素と比較して、半数に低減する。
【図3A】≧０．２倍の増幅産物均一性及び≦０．０５倍の増幅産物均一性（ドロップアウト率）についての例示的データを描示する図であり、ライブラリーの収量は、全ての濃度について、突然変異体である、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素と、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素との間において同等である。
【図3B】突然変異体である、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素についての、≧０．２倍の全増幅産物均一性が、多様な被験濃度において、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素と同等であることを描示する図である。
【図3C】増幅産物のドロップアウト率が、全ての被験滴定濃度について、突然変異体である、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素と、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素との間において、同様であることを描示する図である。
【図4】均一性分布（増幅産物の平均値カバレッジと比較して、０～０．１倍、０．１～０．２倍、０．２倍～０．５倍、０．５倍～１．５倍、１．５倍～２．５倍及び２．５～５倍の範囲内のカバレッジを有する、増幅産物のパーセント）が、突然変異体である、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素と、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素との間において、同等であることを示す例示的データを描示する図である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本発明は、二重鎖鋳型内のミスマッチ識別を保持又は増強する、それらの能力を保持しながら、ある特定のＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を使用するｒｈＰＣＲ時の酵素活性を増強する、新規のハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素変異体を提供する。ＲＮアーゼＨ２酵素ハイブリッドは、生物であるピロコックス・アビッシ（Ｐ．ａ．）、テルモコックス・コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄ）及びピロコックス・フリオーススに由来するアミノ酸配列の断片を組み合わせる。結果として得られるハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素のほか、これらの酵素に基づく、選り抜きの突然変異体は、ミスマッチ識別を、著明に増強する。特に、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）は、とりわけ、プライマー伸長を実行する方法、ｒｈＰＣＲを実施する方法、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法、大量並列シークエンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実施する方法、ＳＮＰ含有核酸鋳型を、核酸鋳型の増幅産物ライブラリーから検出する方法、及びループ媒介増幅反応を実施する方法において、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（配列番号１）により作製された混合産物と比べて、プライマー二量体分子種が低減された集団を有する混合産物をもたらすことが示される。
【0028】
定義
本発明の理解の一助とするため、いくつかの用語について、下記に規定する。
本発明の理解の一助とするため、いくつかの用語について、下記に規定する。
【0029】
本発明について記載する文脈において（とりわけ、以下の特許請求の範囲の文脈において）使用された、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、「その」及び同様の指示対象は、本明細書においてそうでないことが指し示されない限り、又は、文脈により、逆の記載がない限り、単数形及び複数形の両方を対象とすると理解されるものとする。「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を有すること」、「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「～を含有すること」という用語は、そうでないことが注記されない限りにおいて、オープンエンドの用語である（すなわち、「～を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において、そうでないことが指し示されない限りにおいて、範囲内に収まる、各個別の値に、個別に言及する簡便法として用いられることだけを意図するものであり、各個別の値は、本明細書において、個別に列挙された場合と同様に、本明細書へと組み込まれる。本明細書において記載された全ての方法は、本明細書においてそうでないことが指し示されない限り、又は、文脈により、逆の記載がない限り、任意の適切な順序において実施されうる。本明細書において提示された、任意の例又は例示的な表現及び全ての例又は例示的な表現（例えば、「など」）の使用は、本発明を、よりよく例示することだけを意図するものであり、別の形において特許請求されている、本発明の範囲に対して、限定を付与するものではない。本明細書における、いかなる表現も、任意の特許請求されていない要素を、本発明の実施に不可欠であると指し示すものとして理解されないものとする。
【0030】
本明細書において使用された、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）及びプリン塩基又はピリミジン塩基のＮグリコシドである、他の任意の種類のポリヌクレオチドを指す。「核酸」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語の間において、長さの区別は意図されず、これらの用語は、互換的に使用される。これらの用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、これらの用語は、二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡのほか、二本鎖ＲＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを含む。本発明における使用のために、オリゴヌクレオチドはまた、塩基、糖又はリン酸骨格が修飾されたヌクレオチド類似体のほか、非プリンヌクレオチド類似体又は非ピリミジンヌクレオチド類似体も含みうる。
【0031】
オリゴヌクレオチドは、各々が、参照により本明細書に組み込まれた、；Ｎａｒａｎｇら、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０～９９によるホスホジエステル法；Ｂｒｏｗｎら、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９～１５１によるホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９～１８６２によるジエチルホスホルアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号による固体支持法などの方法による直接的な化学合成を含む、任意の適切な方法により調製されうる。オリゴヌクレオチドコンジュゲート及び修飾ヌクレオチドの合成法の総説については、参照により本明細書に組み込まれた、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１（３）：１６５～１８７において提示されている。
【0032】
本明細書において使用された、「プライマー」という用語は、適切な条件下においてＤＮＡ合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。このような条件は、適切な緩衝液中及び適切な温度、４つの異なるヌクレオシド三リン酸及び伸長のための薬剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下において、核酸鎖と相補性である、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件を含む。プライマー伸長はまた、ヌクレオチド三リン酸のうちの１つ以上の非存在下においても実行される場合があり、この場合、限定的な長さの伸長産物が産生される。本明細書において使用された、「プライマー」という用語は、１つのオリゴヌクレオチドが、隣接する位置においてハイブリダイズする、第２のオリゴヌクレオチドとのライゲーションにより「伸長」させられる、ライゲーション媒介反応において使用されたオリゴヌクレオチドを包含することが意図される。したがって、本明細書において使用された、「プライマー伸長」という用語は、プライマーを、ＤＮＡ合成の開始点として使用する、個別のヌクレオシド三リン酸の重合及び伸長産物を形成する、２つのオリゴヌクレオチドのライゲーションの両方を指す。
【0033】
プライマーは、好ましくは、一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適切な長さは、意図されたプライマーの使用に依存するが、典型的に、６～５０ヌクレオチド、好ましくは、１５～３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般に、鋳型と、十分に安定的なハイブリッド複合体を形成するのに、低温を要求する。プライマーは、鋳型核酸の正確な配列を反映する必要がないが、ハイブリダイズするのに、鋳型と、十分に相補性でなければならない。当技術分野において、増幅に適するプライマーのデザインは周知であり、本明細書に引用された文献に記載されている。
【0034】
プライマーは、プライマーの検出又は固定化を可能とするが、プライマーの基本的特性である、ＤＮＡ合成の開始点として作用する特性を変更しない、さらなる特徴を組み込みうる。例えば、プライマーは、標的核酸とハイブリダイズしないが、増幅産物のクローニング又は検出を容易とする、５’末端における、さらなる核酸配列を含有しうる。本明細書において、鋳型と、ハイブリダイズする程度に十分に相補性である、プライマーの領域は、ハイブリダイジング領域と称される。
【0035】
本明細書において使用された、「標的」、「標的配列」、「標的領域」及び「標的核酸」という用語は、同義語であり、増幅、シーケンシング又は検出される、核酸の領域又は配列を指す。
【0036】
本明細書において使用された、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的塩基対合に起因する、２つの一本鎖核酸による、二重鎖構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に相補性である核酸鎖の間において生じる場合もあり、小さなミスマッチ領域を含有する、「実質的に相補性」である核酸鎖の間において生じる場合もある。完全に相補性である核酸鎖のハイブリダイゼーションが、強く好ましい条件は、「厳密なハイブリダイゼーション条件」又は「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と称される。実質的に相補性である配列による、安定的な二重鎖は、それほど厳密でないハイブリダイゼーション条件下において達成されうるが；許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の適切な調整により制御される。核酸技術の当業者は、当技術分野により提示される指針（参照により本明細書に組み込まれた、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗｅｔｍｕｒ、１９９１、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６（３／４）：２２７～２５９；及びＯｗｃｚａｒｚｙら、２００８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７：５３３６～５３５３を参照されたい）に従い、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対組成、イオン強度並びにミスマッチ塩基対の発生を含む、多数の変数を、経験的に考慮して、二重鎖の安定性を決定しうる。
【0037】
「増幅反応」という用語は、鋳型核酸配列のコピーの増大を結果としてもたらす、又は鋳型核酸の転写を結果としてもたらす、酵素反応を含む、任意の化学反応を指す。増幅反応は、リバース転写、リアルタイムＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照されたい）を含む、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒａｎｙら、米国特許第５，４９４，８１０号を参照されたい）を含む。例示的「増幅反応条件」又は「増幅条件」は、典型的に、２ステップサイクル又は３ステップサイクルを含む。２ステップサイクルは、高温度変性ステップに続く、ハイブリダイゼーション／伸長（又はライゲーション）ステップを有する。３ステップサイクルは、変性ステップに続く、ハイブリダイゼーションステップに続く、別個の伸長又はライゲーションステップを含む。
【0038】
本明細書において使用された、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を指す。一般に、酵素は、核酸鋳型配列へとアニーリングされたプライマーの３’末端における合成を開始する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。公知のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ピロコックス・フリオースス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０８：１）、Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ及びＤｏｕｂｌｅｄａｙ、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１１：７５０５）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：３１１２）、テルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ及びＧｅｌｆａｎｄ、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：７６６１）、バシルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ及びＭｃＧｏｗａｎ、１９７７、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、４７５：３２）、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（また、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼとも称された；Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：４１９３）、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ及びＳａｂｉｎｏ、１９９８、Ｂｒａｚ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９）、テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ、１２７：１５５０）、テルモコックス・コダカレンシス／ピロコックス・コダカレンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ－３ＤＮＡポリメラーゼ（特許出願第ＷＯ０１３２８８７号）、及びピロコックス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）ＧＢ－Ｄ（ＰＧＢ－Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ－Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８２０）を含む。上記の酵素のうちのいずれかのポリメラーゼ活性は、当技術分野で周知の手段により決定されうる。
【0039】
本明細書において使用された、プライマーは、十分に厳密な条件下にある増幅反応において使用される場合に、標的核酸に主にハイブリダイズするならば、標的配列に対して「特異的」である。典型的に、プライマーは、プライマー－標的二重鎖の安定性が、プライマーと、試料中に見出される、他の任意の配列との間において形成する二重鎖の安定性より大きいならば、標的配列に対して特異的である。当業者は、塩条件のほか、プライマーの塩基組成及びミスマッチの位置など、多様な因子が、プライマーの特異性に影響を及ぼし、多くの場合に、常套的な実験による、プライマー特異性の確認が必要とされることを認識する。プライマーが、標的配列だけと、安定的な二重鎖を形成しうるハイブリダイゼーション条件が選び出されうる。したがって、適切に厳密な増幅条件下における、標的特異的プライマーの使用は、標的のプライマー結合性部位を含有する標的配列の選択的増幅を可能とする。
【0040】
本明細書において使用された、「非特異的増幅」という用語は、標的配列以外の配列とハイブリダイズし、次いで、プライマー伸長のための基質として用いられるプライマーから生じる、標的配列以外の核酸配列の増幅を指す。プライマーの、非標的配列とのハイブリダイゼーションは、「非特異的ハイブリダイゼーション」と称され、とりわけ、低温時、低厳密性時、増幅前状態において、又は一塩基多型（ＳＮＰ）の場合における通り、試料中に、真の標的と極めて近縁の配列を有する変異体対立遺伝子が存在する状況下においてに生じる傾向がある。
【0041】
「３’側におけるミスマッチ識別」という用語は、完全相補性配列を、伸長される核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）が、核酸がハイブリダイズする鋳型と比較して、核酸の３’末端において、ミスマッチを有する、ミスマッチ含有（ほぼ相補性である）配列から区別する、ＤＮＡポリメラーゼの特性を指す。一部の実施形態において、伸長される核酸は、完全な相補性配列と比べて、３’末端において、ミスマッチを含む。
【0042】
「３’側ミスマッチ識別アッセイ」という用語は、標的ＤＮＡ配列が、それらのそれぞれの３’末端において、又は３’末端の近傍において異なる塩基組成を有する、１つ以上のヌクレオチド残基の発生を除き、実質的に同一な配列を有する、２つのプライマーにより精査される場合に、標的ＤＮＡ配列の増幅の特異性の改善の存在を見分けるアッセイを指す。例えば、標的ＤＮＡ配列と完全に相補的である、３’末端配列を有する、第１のプライマーは、３’側マッチプライマーであると考えられ、標的ＤＮＡ配列と非相補的である、少なくとも１つのヌクレオチド塩基を有する、３’末端配列を有する、第２のプライマーは、３’側ミスマッチプライマーであると考えられる。３’側ミスマッチ識別アッセイの例は、とりわけ、実施例４の表１０及び１１など、実施例のうちの多くにおいて提示されている。
【0043】
本明細書において使用された、「プライマー二量体」という用語は、プライマー伸長から生じると考えられる、鋳型非依存性の非特異的増幅産物を指し、この場合、別のプライマーは、鋳型として用いられる。プライマー二量体は、しばしば、２つのプライマーのコンカタマー、すなわち、二量体であるが、２つを超えるプライマーのコンカタマーもまた生じる。本明細書において、「プライマー二量体」という用語は、一般に、鋳型非依存性の非特異的増幅産物を包含するように使用される。
【0044】
本明細書において使用された、「反応混合物」という用語は、所与の反応を実行するのに必要な試薬を含有する溶液を指す。増幅反応を実行するのに必要な試薬を含有する溶液を指す、「増幅反応混合物」は、典型的に、適切な緩衝液中に、オリゴヌクレオチドプライマー及びＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼを含有する。「ＰＣＲ反応混合物」は、典型的に、適切な緩衝液中に、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（最も典型的に、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ及び二価金属カチオンを含有する。反応混合物は、反応を可能とするのに必要な、全ての試薬を含有する場合に、完全であると称され、必要な試薬のサブセットだけを含有する場合に、不完全であると称される。当業者により、反応成分は、規定により、簡便さ、保管安定性の理由のために、又は適用に依存する成分濃度の調整を可能とするように、各々が、全成分のサブセットを含有する、個別の溶液として保管され、反応成分は、完全反応混合物を創出するように、反応の前に組み合わされることが理解される。さらに、当業者により、反応成分は、個別にパッケージングされ、有用な市販キットは、本発明の保護化プライマーを含む、反応成分の任意のサブセットを含有しうることが理解される。
【0045】
本発明の目的のために、本明細書において使用された、「非活性化」又は「不活化」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼが、それらの意図された目的のために、オリゴヌクレオチドと相互作用できないため、プライマー伸長反応又はライゲーション反応に関与することが不可能であるプライマー又は他のオリゴヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドが、プライマーである、一部の実施形態において、非活性化状態は、プライマーが、プライマー伸長を防止するように、３’末端において、又はこの近傍において保護化されているために生じる。特異的基が、プライマーの３’末端において、又はこの近傍において結合された場合、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーに結合することができず、伸長は生じえない。しかし、非活性化プライマーは、実質的に相補性のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能である。
【0046】
本発明の目的のために、本明細書において使用された、「活性化」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼとの反応に関与することが可能であるプライマー又は他のオリゴヌクレオチドを指す。プライマー又は他のオリゴヌクレオチドは、実質的に相補性である核酸配列とハイブリダイズした後に活性化され、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼと相互作用しうるよう、機能的な３’末端又は５’末端をもたらすように切断される。例えば、オリゴヌクレオチドが、プライマーであり、プライマーが、鋳型とハイブリダイズされる場合、ＤＮＡポリメラーゼが、プライマーの３’末端に結合し、プライマー伸長を促進するように、３’ブロッキング基は、例えば、切断性酵素により、プライマーから除去される。
【0047】
本明細書において使用された、「切断ドメイン」又は「切断性ドメイン」という用語は、同義語であり、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドを切断する、切断化合物、例えば、切断酵素により認識された、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドの５’末端と、３’末端との間に配置された領域を指す。本発明の目的のために、切断ドメインは、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドが、相補性核酸配列とハイブリダイズされた場合に限り切断され、一本鎖である場合に切断されないようにデザインされる。切断ドメイン又はこれに隣接する配列は、ａ）ポリメラーゼ若しくはリガーゼによる、プライマー若しくは他のオリゴヌクレオチドの伸長若しくはライゲーションを、阻止若しくは阻害する部分、ｂ）変異体対立遺伝子を検出する識別を増強する部分又はｃ）所望されない切断反応を抑制する部分を含みうる。１つ以上のこのような部分は、切断ドメイン内に含まれる場合もあり、これに隣接する配列内に含まれる場合もある。
【0048】
本明細書において使用された、「ＲＮアーゼＨ切断ドメイン」という用語は、ＲＮアーゼＨに対する基質をもたらす、１つ以上のリボ核酸残基又は代替的類似体を含有する、切断ドメインの種類である。ＲＮアーゼＨ切断ドメインは、プライマー又はオリゴヌクレオチド内の任意の箇所への配置が可能であり、好ましくは、分子の３’末端に、若しくはこの近傍に、又は５’末端に配置される。
【0049】
「ＲＮアーゼＨ２切断ドメイン」は、１つのＲＮＡ残基を含有する場合もあり、隣接して連結されたＲＮＡ残基の配列を含有する場合もあり、ＤＮＡ残基又は他の化学基により隔てられたＲＮＡ残基を含有する場合もある。一実施形態において、ＲＮアーゼＨ２切断ドメインは、２’－フルオロヌクレオシド残基である。より好ましい実施形態において、ＲＮアーゼＨ２切断可能ドメインは、２つの隣接する２’－フルオロ残基を含む。
【0050】
本明細書において使用された、「保護化プライマー」という用語は、最小限において、標的配列と、十分にハイブリダイズするために適する切断性ドメイン、切断可能ドメイン、及び切断が生じるまで、プライマーの３’末端からの伸長を防止するブロッキング基を保有するプライマーを指す。好ましい実施形態において、切断可能ドメインは、ＲＮアーゼＨ切断ドメインであり、ブロッキング基は、プロパンジオール（Ｃ３）スペーサーである。
【0051】
本明細書において使用された、「切断化合物」又は「切断剤」という用語は、プライマー内又は他のオリゴヌクレオチド内の切断ドメインを認識し、切断ドメインの存在に基づき、オリゴヌクレオチドを選択的に切断しうる、任意の化合物を指す。本発明において利用された切断化合物は、実質的に相補性の核酸配列とハイブリダイズされた場合に限り、切断ドメインを含むプライマー又は他のオリゴヌクレオチドを選択的に切断し、一本鎖である場合に、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドを切断しない。切断化合物は、切断ドメイン内である、又はこれに隣接する、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドを切断する。本明細書において使用された、「隣接する」という用語は、切断化合物が、切断ドメインの５’末端又は３’末端において、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドを切断することを意味する。本発明において好ましい切断反応は、５’－リン酸基及び３’－ＯＨ基をもたらす。
【0052】
好ましい実施形態において、切断化合物は、「切断酵素」である。切断酵素は、プライマー又は他のヌクレオチドが、実質的に相補性の核酸配列とハイブリダイズされた場合に、切断性ドメインを認識することが可能であるが、相補性核酸配列を切断しない（すなわち、二重鎖内の一本鎖切断をもたらす）、タンパク質又はリボザイムである。切断酵素はまた、それが、一本鎖である場合、切断ドメインを含むプライマー又は他のオリゴヌクレオチドも切断しない。切断酵素の例は、である。ＲＮアーゼＨ酵素及び他のニッキング酵素である。
【0053】
本明細書において使用された、「ニッキング」という用語は、完全二本鎖核酸又は部分的二本鎖核酸の二本鎖部分の１つの鎖だけの切断を指す。核酸がニッキングされる位置は、「ニッキング部位」（ＮＳ）と称される。「ニッキング剤」（ＮＡ）は、二本鎖核酸を、部分的に、又は完全にニッキングする薬剤である。ＮＡは、酵素の場合もあり、他の任意の化合物又は組成物の場合もある。ある特定の実施形態において、ニッキング剤は、完全二本鎖核酸又は部分的二本鎖核酸の、特定のヌクレオチド配列を認識し、認識配列の位置と比べて、特異的位置（すなわち、ＮＳ）において、完全二本鎖核酸又は部分的二本鎖核酸の１つの鎖だけを切断しうる。このようなニッキング剤（「配列特異的ニッキング剤」と称される）は、ニッキングエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ）を含むがこれらに限定しない。
【0054】
したがって、本明細書において使用された、「ニッキングエンドヌクレアーゼ」（ＮＥ）とは、完全に二本鎖である核酸分子又は部分的に二本鎖である核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、認識配列と比べて特異的位置において、核酸分子の一方の鎖だけを切断するエンドヌクレアーゼを指す。このような場合において、認識部位から、切断点までの全配列が、「切断ドメイン」を構成する。
【0055】
本明細書において使用された、「ブロッキング基」という用語は、増幅反応が生じないように、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドに結合された化学的部分を指す。例えば、プライマー伸長及び／又はＤＮＡライゲーションは生じない。ブロッキング基が、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドから除去されると、オリゴヌクレオチドは、それがデザインされたアッセイ（ＰＣＲ、ライゲーション、シーケンシングなど）に関与することが可能である。したがって、「ブロッキング基」は、ポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼによる認識を阻害する、任意の化学的部分でありうる。ブロッキング基は、一般に、切断ドメインの５’型又は３’側に配置された切断ドメインへと組み込まれうる。ブロッキング基は、１つを超える化学的部分で構成されうる。本発明において、「ブロッキング基」は、典型的に、オリゴヌクレオチドの、その標的配列とのハイブリダイゼーションの後に除去される。
【0056】
「蛍光発生プローブ」という用語は、ａ）フルオロフォア及び消光剤を接合させたオリゴヌクレオチド及び、任意選択的に、副溝結合剤又はｂ）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ染料などのＤＮＡ結合性試薬を指す。
【0057】
「蛍光標識」又は「フルオロフォア」という用語は、蛍光発光の最大値が、約３５０～９００ｎｍの間である化合物を指す。５－ＦＡＭ（また、５－カルボキシフルオレセインとも呼ばれ；また、Ｓｐｉｒｏ（イソベンゾフラン－１（３Ｈ）、９’－（９Ｈ）キサンテン）－５－カルボン酸，３’，６’－ジヒドロキシ－３－オキソ－６－カルボキシフルオレセインとも呼ばれる）；５－ヘキサクロロ－フルオレセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’－ヘキサクロロ－（３’，６’－ジピバロイル－フルオレセイニル）－６－カルボン酸］）；６－ヘキサクロロ－フルオレセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’－ヘキサクロロ－（３’，６’－ジピバロイルフルオレセイニル）－５－カルボン酸］）；５－テトラクロロ－フルオレセイン；（［４，７，２’，７’－テトラ－クロロ－（３’，６’－ジピバロイルフルオレセイニル）－５－カルボン酸］）；６－テトラクロロ－フルオレセイン；（［４，７，２’，７’－テトラクロロ－（３’，６’－ジピバロイルフルオレセイニル）－６－カルボン酸］）；５－ＴＡＭＲＡ（５－カルボキシテトラメチルローダミン）；９－（２，４－ジカルボキシフェニル）－３，６－ｂｉｓ（ジメチル－アミノ）である、Ｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ；６－ＴＡＭＲＡ（６－カルボキシテトラメチルローダミン）；９－（２，５－ジカルボキシフェニル）－３，６－ビス（ジメチルアミノ）；ＥＤＡＮＳ（５－（（２－アミノエチル）アミノ）ナフタレン－１－スルホン酸）；１，５－ＩＡＥＤＡＮＳ（５－（（（（２－ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン－１－スルホン酸）；Ｃｙ５（インドジカルボシアニン－５）；Ｃｙ３（インド－ジカルボシアニン－３）；及びＢＯＤＩＰＹＦＬ（２，６－ジブロモ－４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸）；Ｑｕａｓａｒ（登録商標）－６７０染料（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ染料（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｒｏｘ染料；Ｍａｘ染料（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のほか、これらの適切な誘導体を含むがこれらに限定されない、多種多様なフルオロフォアが使用されうる。
【0058】
本明細書において使用された、「消光剤」という用語は、ドナーと結合させた場合又はドナーと近接する場合に、蛍光ドナーからの発光を低減することが可能な分子又は化合物の部分を指す。消光は、蛍光共鳴エネルギー移動、光誘起電子移動、常磁性項間交差増強、デクスター交換カップリング及び暗色複合体の形成などの励起カップリングを含む、いくつかの機構のうちのいずれかにより生じうる。蛍光は、フルオロフォアにより発光させた蛍光が、消光剤の非存在下における蛍光と比較して、少なくとも１０％、例えば、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％以上低減された場合に、「消光」されている。当技術分野において、多数の市販消光剤が公知であり、ＤＡＢＣＹＬ、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２及びＢＨＱ－３）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱを含むがこれらに限定されない。これらは、いわゆる暗色消光剤である。これらは、天然の蛍光を有さず、内因的に蛍光性であるＴＡＭＲＡなど、他の消光剤に伴うバックグラウンド問題を、事実上消失させる。
【0059】
本明細書において使用された、「ライゲーション」という用語は、２つのポリヌクレオチド末端の共有結合的接続を指す。多様な実施形態において、ライゲーションは、第１のポリヌクレオチド（アクセプター）の３’末端の、第２のポリヌクレオチド（ドナー）の５’末端への、共有結合的接続を伴う。ライゲーションは、ポリヌクレオチド末端の間において形成するホスホジエステル結合を結果としてもたらす。多様な実施形態において、ライゲーションは、ポリヌクレオチド末端の共有結合的接続を結果としてもたらす、任意の酵素、化学反応又は過程により媒介されうる。ある特定の実施形態において、ライゲーションは、リガーゼ酵素により媒介される。
【0060】
本明細書において使用された、「リガーゼ」は、１つのポリヌクレオチドの３’ヒドロキシル基を、第２のポリヌクレオチドの５’リン酸基へと、共有結合的に連結することが可能な酵素を指す。リガーゼの例は、Ｅ．コリーＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどを含む。
【0061】
ライゲーション反応は、また、「リガーゼ増幅反応」（ＬＡＲ）とも称された、「リガーゼ連鎖反応」（ＬＣＲ）などのＤＮＡ増幅法において利用されうる（参照により本明細書に組み込まれた、Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８：１８９（１９９１）；及びＷｕ及びＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４：５６０（１９８９）も参照されたい）。ＬＣＲにおいて、標的ＤＮＡのうちの一方の鎖に固有にハイブリダイズする２つの隣接するオリゴヌクレオチド、及び向かい側の鎖とハイブリダイズする隣接するオリゴヌクレオチドの相補性セットである、４つのオリゴヌクレオチドが混合され、ＤＮＡリガーゼが、混合物へと添加される。標的配列の存在下において、ＤＮＡリガーゼは、ハイブリダイズされた分子の各セットを、共有結合的に連結する。重要なことは、ＬＣＲにおいて、２つのオリゴヌクレオチドは、配列と、ギャップを伴わずに塩基対合する場合に限り、一体にライゲーションされることである。変性、ハイブリダイゼーション及びライゲーションのサイクルの反復は、ＤＮＡの短いセグメントを増幅する。隣接するオリゴヌクレオチド間の接続部におけるミスマッチは、ライゲーションを阻害する。他のオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイにおいて、この特性は、ＬＣＲが、ＳＮＰなどの変異体対立遺伝子を区別するのに使用されることを可能とする。ＬＣＲはまた、一塩基変化の検出の増強を達成するように、ＰＣＲと組み合わせても使用されている（Ｓｅｇｅｖ、ＰＣＴ公開第ＷＯ９００１０６９号（１９９０）を参照されたい）。
【0062】
「コドン最適化」という用語は、ポリペプチドをコードする、特定の核酸を修飾するので、所与の微生物細胞（例えば、とりわけ、Ｅ．コリー、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ））又は哺乳動物細胞（例えば、とりわけ、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などのヒト細胞）など、所与の宿主細胞内における効率的発現に好ましいコドンの組入れを指す。当技術分野において、このような好ましいコドンは、様々な生物について開発された、コドンバイアス表に基づき、周知である。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コドンバイアス表が開発されている、又はこのような表が、経験的決定から、たやすく見分けられうる、任意の公知の生物のための、コドン最適化オープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチドを含む。
【0063】
「ＢａｓｅＸによるＰＣＲ増幅法」という語句は、各増幅サイクルについて、増幅産物の、２倍を超える増大を可能とし、これにより、従来のＰＣＲを上回る、感度及び速度の増大を可能とする、高度に効率的な核酸増幅を指す。この方法は、その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、２０１９年４月３０日に公開された、Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ（出願者：Ｃｅｐｈｅｉｄ）による、「Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｂａｓｅ－ｇｒｅａｔｅｒ－ｔｈａｎ－２ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題された、米国特許公開第ＵＳ１０２７３５３４（Ｂ２）号において開示されている。
【0064】
「融合タンパク質」又は「融合ポリペプチド」という語句は、追加のアミノ酸情報が、共有結合的に接合された、タンパク質に天然ではない、追加のアミノ酸情報の組入れを指す。このような追加のアミノ酸情報は、融合タンパク質の精製又は同定を可能とするタグを含みうる。このような追加のアミノ酸情報は、融合タンパク質が、細胞へと輸送され、かつ／又は細胞内の特異的位置へと輸送されることを可能とするペプチドを含みうる。これらの目的のためのタグの例は、以下：酵素であるＢｉｒＡによるビオチニル化を可能とするので、タンパク質は、ストレプトアビジンにより単離されうるペプチドである、ＡｖｉＴａｇ；タンパク質であるカルモジュリンにより結合されるペプチドである、カルモジュリンタグ；Ｍｏｎｏ－Ｑなどのアニオン交換樹脂に、効率的に結合するペプチドである、ポリグルタミン酸タグ；抗体により認識されたペプチドである、Ｅタグ；抗体により認識されたペプチドである、ＦＬＡＧタグ；抗体により認識されたヘマグルチニンに由来するペプチドである、ＨＡタグ；典型的に、ニッケルキレート剤又はコバルトキレート剤により結合させた、５つ～１０のヒスチジンである、Ｈｉｓタグ；抗体により認識されたｃ－ｍｙｃに由来するペプチドである、Ｍｙｃタグ；モノクローナルＩｇＧ１抗体により認識され、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫沈降及び組換えタンパク質のアフィニティー精製を含む、広範にわたる適用において有用である、新規の１８アミノ酸の合成ペプチドである、ＮＥタグ；リボヌクレアーゼＡに由来するペプチドである、Ｓタグ；ストレプトアビジンに結合するペプチドである、ＳＢＰタグ；哺乳動物における発現が意図された、Ｓｏｆｔａｇ １；原核生物における発現が意図された、Ｓｏｆｔａｇ ３；ストレプトアビジン又はストレプトアクチンと呼ばれた改変ストレプトアビジンに結合するペプチド（ＳｔｒｅｐタグＩＩ）である、Ｓｔｒｅｐタグ；ＦｌＡｓＨ二ヒ素化合物及びＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物により認識された二ヒ素テトラシステインタグである、ＴＣタグ；抗体により認識されたペプチドである、Ｖ５タグ；抗体により認識されたペプチドである、ＶＳＶタグ；Ｘｐｒｅｓｓタグ；ピリンＣタンパク質に共有結合的に結合するペプチドである、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ；ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合的に結合するペプチドである、ＳｐｙＴａｇ；ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合的に結合するペプチドである、ＳｎｏｏｐＴａｇ；ストレプトアビジンによる認識を可能とするように、ＢｉｒＡによりビオチニル化されたタンパク質ドメインである、ＢＣＣＰ（ｂｉｏｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）；固定化されたグルタチオンに結合するタンパク質である、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ；自発的蛍光発光性であり、抗体により結合されうるタンパク質である、緑色蛍光タンパク質タグ；反応性のハロアルカン基質に共有結合的に接合して、多種多様な基質への接合を可能とする、突然変異細菌ハロアルカンデハロゲナーゼである、ＨａｌｏＴａｇ；アミロースアガロースに結合するタンパク質である、マルトース結合性タンパク質タグ；Ｎｕｓタグ；チオレドキシンタグ；並びに二量体化及び可溶化を可能とし、プロテインＡセファロース上における精製のために使用されうる、免疫グロブリンＦｃドメインに由来するＦｃタグを含む。ＳＶ４０から得られたＮＬＳなどの核局在シグナル（ＮＬＳ）は、タンパク質が、細胞に侵入した直後に、核へと輸送されることを可能とする。天然のＣａｓ９タンパク質が、細菌由来であるため、天然において、ＮＬＳモチーフを含まないことを踏まえると、１つ以上のＮＬＳモチーフの、組換えＣａｓ９タンパク質への付加は、標的ゲノムのＤＮＡ基質が、核内に常在する、真核細胞内において使用された場合に、ゲノム編集活性の改善を示すことが期待される。当業者は、これらの多様な融合タグ技術、関与する特定のアミノ酸配列のほか、これらを含む融合タンパク質を、どのように作製し、どのように使用するのかを理解する。一実施形態において、高度に好ましい融合タンパク質又は融合ポリペプチドは、Ｈｉｓタグモチーフを含むが、当業者は、上記において言及された通り、他のタグも含まれうることを理解する。本発明は、融合タンパク質又は融合ポリペプチドのほか、さらなるアミノ酸配列情報を欠く、対応するタンパク質又はポリペプチドの、元の突然変異形を含む。
【0065】
公知のＲＮアーゼＨ２酵素に由来するアミノ酸配列の組換えリシャッフリングにより作出された、新規のハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素変異体
新規かつ有用な特性を伴う、２つのハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素は、ピロコックス・アビッシ、テルモコックス・コダカレンシス及びピロコックス・フリオーススを含む、３つのＲＮアーゼＨ２酵素に由来するアミノ酸配列の部分的組換え（「シャッフリング」）を介して作出され、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素を結果としてもたらすことができる。特に、生物であるピロコックス・アビッシ、テルモコックス・コダカレンシス及びピロコックス・フリオーススに由来するアミノ酸配列の断片を組み合わせる、２つの突然変異体ＲＮアーゼＨ２酵素である、ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２（配列番号８９）及びＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号９０）は、ミスマッチ識別を、著明に増強することが発見された。突然変異体は、ＲＮアーゼＨ２配列のランダムシャッフリングにより創出されたライブラリーから選択された。他の変化もまた存在するが、いずれの突然変異体酵素も、Ｔ．ｋｏｄ ＲＮアーゼＨ２のアミノ酸残基２６～４０及び残基１００～１２０の断片を含有する。公知の結晶構造（Ｍｕｒｏｙａら、２００１；Ｒｙｃｈｌｉｋら、２０１０）との相同性に基づき、これらの残基は、結合されたＤＮＡ二重鎖と接触する可能性が高い。いかなる特定の理論にも束縛されずに述べると、Ｔ．ｋｏｄ ＲＮアーゼＨ２の残基２６～４０及び残基１００～１２０は、基質二重鎖に対する酵素結合ポケットを変化させる結果として、結合アフィニティー及び核酸切断の触媒作用の変化をもたらすことが仮定されうる。野生型Ｐ．ａｂ．ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号８８）、ハイブリッドＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号８９）及びハイブリッドＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号９０）のアミノ酸配列を、表１に描示する。野生型Ｐ．ａｂ．ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号１）、ハイブリッドＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号２）及びハイブリッドＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号３）の、対応する（Ｈｉｓ）６タグ付けアミノ酸配列もまた調製され、さらなる突然変異体ＲＮアーゼＨ２タンパク質を作出するためのベースとして用いられた（表３を参照されたい）。
新規かつ有用な特性を伴う、２つのハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素は、ピロコックス・アビッシ、テルモコックス・コダカレンシス及びピロコックス・フリオーススを含む、３つのＲＮアーゼＨ２酵素に由来するアミノ酸配列の部分的組換え（「シャッフリング」）を介して作出され、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素を結果としてもたらすことができる。特に、生物であるピロコックス・アビッシ、テルモコックス・コダカレンシス及びピロコックス・フリオーススに由来するアミノ酸配列の断片を組み合わせる、２つの突然変異体ＲＮアーゼＨ２酵素である、ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２（配列番号８９）及びＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号９０）は、ミスマッチ識別を、著明に増強することが発見された。突然変異体は、ＲＮアーゼＨ２配列のランダムシャッフリングにより創出されたライブラリーから選択された。他の変化もまた存在するが、いずれの突然変異体酵素も、Ｔ．ｋｏｄ ＲＮアーゼＨ２のアミノ酸残基２６～４０及び残基１００～１２０の断片を含有する。公知の結晶構造（Ｍｕｒｏｙａら、２００１；Ｒｙｃｈｌｉｋら、２０１０）との相同性に基づき、これらの残基は、結合されたＤＮＡ二重鎖と接触する可能性が高い。いかなる特定の理論にも束縛されずに述べると、Ｔ．ｋｏｄ ＲＮアーゼＨ２の残基２６～４０及び残基１００～１２０は、基質二重鎖に対する酵素結合ポケットを変化させる結果として、結合アフィニティー及び核酸切断の触媒作用の変化をもたらすことが仮定されうる。野生型Ｐ．ａｂ．ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号８８）、ハイブリッドＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号８９）及びハイブリッドＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号９０）のアミノ酸配列を、表１に描示する。野生型Ｐ．ａｂ．ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号１）、ハイブリッドＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号２）及びハイブリッドＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２タンパク質（配列番号３）の、対応する（Ｈｉｓ）６タグ付けアミノ酸配列もまた調製され、さらなる突然変異体ＲＮアーゼＨ２タンパク質を作出するためのベースとして用いられた（表３を参照されたい）。
【0066】
【表1】
【0067】
配列番号８９及び９０によりコードされた、結果として得られるハイブリッドＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２酵素及びＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素は、ミスマッチが、ＲＮＡヌクレオチドに配置された場合、ミスマッチ識別を改善するが、多様な程度において、異なる特異性を伴う（データは示さない）。同様に、配列番号８９及び９０によりコードされた、ＳＥＬ２８突然変異体ＲＮアーゼＨ２酵素及びＳＥＬ２９突然変異体ＲＮアーゼＨ２酵素は、ＲＮＡヌクレオチドの５’側におけるミスマッチ識別を改善する（データは示さない）。
【0068】
テルムス・アクアティクス（Ｔａｑ）に由来するＤＮＡポリメラーゼではなく、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ピロコックス・フリオースス及びテルモコックス・コダカレンシス（ＫＯＤ）に由来するＤＮＡポリメラーゼなど）を使用するｒｈＰＣＲｃｏｕｌｄもまた実施されうる。しかし、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２、ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２及びＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、高忠実度ポリメラーゼ及び関連する反応緩衝液を使用するｒｈＰＣＲにおける活性が限定的である。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに最適の反応緩衝液は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに最適の緩衝液と実質的に異なる。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのための反応緩衝液中の成分に対して、より大きな許容性を有する、ＲＮアーゼＨ２内の突然変異が見出されうる。本発明者らは、Ｑ４８Ｒ、Ａ１０７Ｖ及びＰ１３Ｓ／Ａ１０７Ｖが、ハイブリッド突然変異体である、ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２又はＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２へと付加された場合に、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液を使用する酵素活性を増強することを示す。
【0069】
本発明は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ及びその最適の反応緩衝液を使用するｒｈＰＣＲ時に、酵素活性を増強する、突然変異体ＲＮアーゼＨ２酵素に関する。ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２の第４８アミノ酸及び第１０７アミノ酸における突然変異は、この活性を改善することが示されている。ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２又はＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２のバックグラウンドを伴う、７つの点突然変異体のスクリーンを実施したところ、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２が、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液を使用する酵素活性を増強することが示された。これらはまた、ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２のミスマッチ識別能を保持又は増強することも示された。
【0070】
ＲＮアーゼＨ２媒介ＰＣＲ
本明細書において開示されたハイブリッドＲＮアーゼＨ２突然変異体タンパク質は、様々なＰＣＲ適用において使用されうる。ＲＮアーゼＨ２に依存するＰＣＲは、ピロコックス・アビッシ又は類縁の生物に由来するＲＮアーゼＨ２並びに単一のリボヌクレオチド残基及び３’保護部分を含有するＤＮＡプライマー（「ブロックされた切断可能プライマー」）を使用することにより、ＰＣＲの特異性を増大させ、プライマー二量体を消失させる方法である。ブロックされた切断可能プライマーは、ＲＮアーゼＨ２酵素により切断された場合に活性化される。切断は、プライマーの、標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション後、ＲＮＡ塩基の５’側において生じる。プライマーは、完全にマッチされた標的配列とハイブリダイズした後に限り切断されうるため、プライマー二量体は低減される。高標的相補性に対する要求は、近縁配列の増幅を低減する。
本明細書において開示されたハイブリッドＲＮアーゼＨ２突然変異体タンパク質は、様々なＰＣＲ適用において使用されうる。ＲＮアーゼＨ２に依存するＰＣＲは、ピロコックス・アビッシ又は類縁の生物に由来するＲＮアーゼＨ２並びに単一のリボヌクレオチド残基及び３’保護部分を含有するＤＮＡプライマー（「ブロックされた切断可能プライマー」）を使用することにより、ＰＣＲの特異性を増大させ、プライマー二量体を消失させる方法である。ブロックされた切断可能プライマーは、ＲＮアーゼＨ２酵素により切断された場合に活性化される。切断は、プライマーの、標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション後、ＲＮＡ塩基の５’側において生じる。プライマーは、完全にマッチされた標的配列とハイブリダイズした後に限り切断されうるため、プライマー二量体は低減される。高標的相補性に対する要求は、近縁配列の増幅を低減する。
【0071】
この点において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２突然変異体タンパク質は、特に、次世代シーケンシング適用（ＮＧＳ）など、ハイスループットマルチプレックスシーケンシング適用のための、高品質ゲノムの増幅産物ライブラリーの作出における性能の増強に適する。特に、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９は、ＲＮアーゼＨ２媒介ＰＣＲ適用及び本出願者らのｒｈＡｍｐＳｅｑ（商標）システムなどのシステムに有用なＲＮアーゼＨ２酵素である。
ＲＮアーゼＨ２媒介ＳＮＰ検出及びＲＮアーゼＨ２媒介稀少対立遺伝子検出
３’側におけるミスマッチ識別属性の増強のために、本明細書において開示されたハイブリッドＲＮアーゼＨ２突然変異体タンパク質は、一塩基多型検出及び稀少対立遺伝子検出を検出するのに使用されうる。所望のＳＮＰ含有核酸鋳型とに限り、完全な二重鎖を形成する、ブロックされた切断可能プライマーの使用は、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２突然変異体タンパク質により認識及び切断され、これにより、適切な条件下における、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長のための、プライマー：所望の核酸鋳型二重鎖を活性化させる。
ＲＮアーゼＨ２媒介ＳＮＰ検出及びＲＮアーゼＨ２媒介稀少対立遺伝子検出
３’側におけるミスマッチ識別属性の増強のために、本明細書において開示されたハイブリッドＲＮアーゼＨ２突然変異体タンパク質は、一塩基多型検出及び稀少対立遺伝子検出を検出するのに使用されうる。所望のＳＮＰ含有核酸鋳型とに限り、完全な二重鎖を形成する、ブロックされた切断可能プライマーの使用は、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２突然変異体タンパク質により認識及び切断され、これにより、適切な条件下における、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長のための、プライマー：所望の核酸鋳型二重鎖を活性化させる。
【0072】
ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）におけるＲＮアーゼＨ２
本明細書において、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）におけるＲＮアーゼＨ２の使用もまた想定される。ＬＡＭＰ増幅法は、サイクリング中の反応温度の変化を伴わない、等温条件下において実施される。ＬＡＭＰは、所望の単位複製配列の、６つの異なる領域を認識するようにデザインされた、最小限４つの異なるプライマーを要求する（Ｎｏｔｏｍｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８（１２）（２０００））。増幅反応は、通例、バシルス・ステアロテルモフィルス（Ｂｓｔ）に由来する、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性に依存する。産物は、標的配列の長鎖逆方向反復からなる構造を有する。
本明細書において、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）におけるＲＮアーゼＨ２の使用もまた想定される。ＬＡＭＰ増幅法は、サイクリング中の反応温度の変化を伴わない、等温条件下において実施される。ＬＡＭＰは、所望の単位複製配列の、６つの異なる領域を認識するようにデザインされた、最小限４つの異なるプライマーを要求する（Ｎｏｔｏｍｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８（１２）（２０００））。増幅反応は、通例、バシルス・ステアロテルモフィルス（Ｂｓｔ）に由来する、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性に依存する。産物は、標的配列の長鎖逆方向反復からなる構造を有する。
【0073】
ＬＡＭＰ反応は、多数のプライマー及び方法における中温性ＤＮＡポリメラーゼの使用のために、プライマー二量体産物を形成しやすい。ＬＡＭＰはまた、この活性が、不可欠の鎖置換活性と競合することにより、増幅を破壊するという事実のために、ＢＳＴポリメラーゼの増幅において、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性も欠く。ブロックされた切断可能プライマー及びＲＮアーゼＨ２の使用は、ＬＡＭＰ反応における、プライマー二量体シグナルの検出を低減する、又はこれを消失させるのに利用されうる。この点において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２突然変異体タンパク質は、特に、プライマー二量体の付随的生成を伴わずに、ＬＡＭＰ反応において形成された、所望の産物の性能の増強に適する。
【0074】
適用
第１の態様において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質が提供される。ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、生物であるピロコックス・アビッシ（Ｐ．ａ．）、テルモコックス・コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄ）及びピロコックス・フリオーススに由来するアミノ酸配列の断片を含む。第１の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、Ｔ．ｋｏｄ ＲＮアーゼＨ２のアミノ酸残基２６～４０及び残基１００～１２０を含む。第２の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、配列番号２及び３から選択される。第３の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、配列番号１４～２０から選択される。
第１の態様において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質が提供される。ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、生物であるピロコックス・アビッシ（Ｐ．ａ．）、テルモコックス・コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄ）及びピロコックス・フリオーススに由来するアミノ酸配列の断片を含む。第１の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、Ｔ．ｋｏｄ ＲＮアーゼＨ２のアミノ酸残基２６～４０及び残基１００～１２０を含む。第２の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、配列番号２及び３から選択される。第３の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、配列番号１４～２０から選択される。
【0075】
第２の態様において、本明細書において開示された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質のうちのいずれかをコードする組換え核酸が提供される。第１の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質のうちのいずれかをコードする例示的組換え核酸は、表１４の配列番号７９～８７を含む。
【0076】
第３の態様において、プライマー伸長を実行するための方法が提供される。方法は、プライマー伸長法に適する条件下において、本明細書において開示された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質を、プライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼと接触させ、これにより、伸長プライマーを作製するステップを含む。第１の関連事項において、ＤＮＡポリメラーゼは、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。第２の関連事項において、プライマーは、ブロックされた切断可能プライマーを含む。第３の関連事項において、プライマー伸長法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行するための方法を含む。第４の関連事項において、ＰＣＲを実行するための方法は、プライマーと、ポリヌクレオチド鋳型との間において形成されたプライマー：ポリヌクレオチドハイブリッド体における、ミスマッチ識別を改善する。第５の関連事項において、ミスマッチ識別の改善は、３’側におけるミスマッチ識別の改善を含む。
【0077】
第４の態様において、反応混合物が提供される。反応混合物は、本明細書において記載された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼを含む。第１の関連事項において、反応混合物は、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼであるＤＮＡポリメラーゼを含む。第２の関連事項において、反応混合物は、ブロックされた切断可能プライマーである少なくとも１つのプライマーを含む。
【0078】
第５の態様において、ｒｈＰＣＲを実施するための方法が提供される。方法は、本明細書において記載された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２、ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーにより、プライマー伸長を実施するステップを含む。第１の関連事項において、ｒｈＰＣＲを実施する方法は、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼにより、プライマー伸長を実施するステップを含む。第２の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素は、化学修飾、アプタマー又は遮断抗体により可逆的に不活化される。第３の関連事項において、ブロッキング基は、プライマーの３’末端ヌクレオチドへと結合される。第４の関連事項において、ブロッキング基は、３’末端残基の５’側へと結合され、プライマーが、ＤＮＡ合成のための鋳型として用いられることを阻害する。第５の関連事項において、ブロッキング基は、１つ以上の脱塩基残基を含む。第６の関連事項において、１つ以上の脱塩基残基は、Ｃ３スペーサーである。第７の関連事項において、ブロッキング基は、ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭ及びＤｘｘＤからなる群から選択される、１つのメンバー［配列中、Ｒは、ＲＮＡ残基であり、Ｄは、ＤＮＡ残基であり、Ｍは、ミスマッチ残基であり、ｘは、Ｃ３スペーサー又は分解に対して耐性である、特許権のある他の基である］を含む。この点において、ブロッキング基は、伸長増幅反応の検出を可能とする標識を含む。この点において、増幅反応の検出を可能とする標識は、切断部位から３’側において、オリゴヌクレオチドプライマーへと結合される。この点において、標識は、フルオロフォア又は質量分析による増幅反応の検出のための質量タグである。さらなる態様において、ブロックされた切断可能プライマーの切断ドメインは、以下の部分：ＤＮＡ残基、脱塩基残基、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチド間修飾リン酸連結のうちの１つ以上を含む。さらなる関連事項において、切断ドメインは、単一のＲＮＡ残基、２つの隣接するＲＮＡ残基、３つ以上のＲＮＡ残基による連続配列を含み、ＲＮＡ残基又は１つ以上の２’修飾ヌクレオシドを欠く。切断ドメインが、１つ以上の２’修飾ヌクレオシドを含む関連事項において、１つ以上の２’修飾ヌクレオシドは、２’－Ｏ－アルキルＲＮＡヌクレオシド、２’－フルオロヌクレオシド、ロックド核酸、２’－エチレン核酸残基、２’－アルキルヌクレオシド、２’－アミノヌクレオシド及び２’－チオヌクレオシドからなる群から選択される。例示的２’修飾ヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシド及び２’－フルオロヌクレオシドを含む。
【0079】
第６の態様において、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法が提供される。方法は、いくつかのステップを含む。第１のステップは、以下：（ｉ）オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端において、又はこの近傍において連結されたブロッキング基の５’側に配置された、ＲＮアーゼＨ２酵素により切断可能である切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、ブロッキング基が、プライマー伸長を阻止し、かつ／又はオリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ合成のための鋳型として用いられることを阻害する、オリゴヌクレオチドプライマー；（ｉｉ）標的配列の場合もあり、標的配列でない場合もある試料核酸；（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；及び（ｉｖ）本明細書において開示された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質を含む反応混合物を用意するステップである。第２のステップは、オリゴヌクレオチドプライマーを、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて、二本鎖基質を形成するステップである。第３のステップは、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーを、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２酵素により、切断ドメイン内の切断部位又は切断ドメインと隣接する切断部位において切断して、ブロッキング基を、オリゴヌクレオチドプライマーから除去するステップである。方法についての第１の関連事項において、ＤＮＡポリメラーゼは、古細菌高忠実度ＤＮＡポリメラーゼである。第２の関連事項において、ＲＮアーゼＨ２タンパク質は、化学修飾又は遮断抗体により可逆的に不活化される。方法についてのさらなる関連事項において、ブロッキング基は、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチドへと結合される。方法についてのさらなる関連事項において、ブロッキング基は、３’末端残基の５’側へと結合され、オリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ合成のための鋳型として用いられることを阻害する。方法についてのさらなる関連事項において、ブロッキング基は、１つ以上の脱塩基残基を含む。方法についてのさらなる関連事項において、１つ以上の脱塩基残基は、Ｃ３スペーサー又は分解に対して耐性である、特許権のある他の基である。方法についてのさらなる関連事項において、ブロッキング基は、ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭ及びＤｘｘＤからなる群から選択される、１つのメンバー［配列中、Ｒは、ＲＮＡ残基であり、Ｄは、ＤＮＡ残基であり、Ｍは、ミスマッチ残基であり、ｘは、Ｃ３スペーサー又は分解に対して耐性である、特許権のある他の基である］を含む。方法についてのさらなる関連事項において、ブロッキング基は、伸長増幅反応の検出を可能とする標識を含む。方法についてのさらなる関連事項において、方法は、増幅反応の検出を可能とする標識をさらに含み、この場合、標識は、切断部位から３’側において、オリゴヌクレオチドプライマーへと結合される。これらの関連事項において、標識は、フルオロフォア又は質量分析による増幅反応の検出のための質量タグである。方法についてのさらなる関連事項において、切断ドメインは、以下の部分：ＤＮＡ残基、脱塩基残基、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチド間修飾リン酸連結のうちの１つ以上を含む。方法についてのさらなる関連事項において、切断ドメインは、単一のＲＮＡ残基、２つの隣接するＲＮＡ残基、３つ以上のＲＮＡ残基による連続配列又は１つ以上の２’修飾ヌクレオシドを含む。切断ドメインが、１つ以上の２’修飾ヌクレオシドを含む関連事項において、これらの２’修飾ヌクレオシドは、２’－Ｏ－アルキルＲＮＡヌクレオシド、２’－フルオロヌクレオシド、ロックド核酸、２’－エチレン核酸残基、２’－アルキルヌクレオシド、２’－アミノヌクレオシド及び２’－チオヌクレオシドからなる群から選択される。例示的２’修飾ヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシド及び２’－フルオロヌクレオシドを含む。
【0080】
第７の態様において、伸長プライマーを作製するためのキットが提供される。キットは、本明細書において開示された、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質を提供する、少なくとも１つの容器を含む。第１の関連事項において、キットは、（ａ）伸長条件下において、所定のポリヌクレオチド鋳型とハイブリダイズ可能であるプライマーを提供する容器；（ｂ）ヌクレオシド三リン酸を提供する容器；（ｃ）プライマー伸長に適する緩衝液を提供する容器及び（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、１つ以上のさらなる容器をさらに含む。第２の関連事項において、ＤＮＡポリメラーゼは、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。第３の関連事項において、前述のキットは、ブロックされた切断可能プライマーを含有する、１つ以上のさらなる容器を含む。
【0081】
第８の態様において、標的ＤＮＡ配列の増幅を実施するためのキットが提供される。キットは、本明細書において記載されたＲＮアーゼＨ２と、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼとを含む反応緩衝液を含む。第１の関連事項において、キットは、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端において、又はこの近傍において連結されたブロッキング基の５’側に配置された、ＲＮアーゼＨ２酵素により切断可能である切断ドメイン、ブロッキング基が、プライマー伸長を阻止し、かつ／又はオリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ合成のための鋳型として用いられることを阻害する、切断ドメインを有する。第２の関連事項において、キットは、ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭ及びＤｘｘＤからなる群から選択される、１つのメンバー［配列中、Ｒは、ＲＮＡ残基であり、Ｄは、ＤＮＡ残基であり、Ｍは、ミスマッチ残基であり、ｘは、Ｃ３スペーサー又は分解に対して耐性である、特許権のある他の基である］であるブロッキング基を含む。
【0082】
第９の態様において、鋳型核酸の増幅産物ライブラリーを調製する方法が提供される。方法は、いくつかのステップを含む。第１のステップは、ハイブリッド二重鎖が、混合物中の、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーと、核酸集団との間において形成するように、核酸集団、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマー、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ及び緩衝液を含む混合物を形成するステップである。第２のステップは、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーを、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質により切断して、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長が可能である、少なくとも１つの活性プライマーを作出するステップである。第３のステップは、緩衝液中、１つ以上の鋳型核酸の、核酸集団からの増幅を可能とする条件下において、ＤＮＡポリメラーゼにより、少なくとも１つの活性プライマーを伸長させ、これにより、鋳型核酸の単位複製配列を作出するステップである。第１の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択される。第２の関連事項において、ＤＮＡポリメラーゼは、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼ又は他のＤＮＡポリメラーゼである。第３の関連事項において、緩衝液は、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液である。
【0083】
第１０の態様において、大量並列シークエンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実施する方法が提供される。方法は、いくつかのステップを含む。第１のステップは、ＰＣＲ法において、核酸集団、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２突然変異体タンパク質、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び緩衝液を使用して、鋳型核酸のライブラリー集団を調製するステップである。第２のステップは、鋳型核酸のライブラリー集団に由来する、複数の所望の鋳型核酸をシーケンシングするステップである。第１の関連事項において、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択される。
【0084】
第１１の態様において、ＳＮＰ含有核酸鋳型を、核酸鋳型の増幅産物ライブラリーから検出する方法が提供される。方法は、いくつかのステップを含む。第１のステップは、核酸鋳型の増幅産物ライブラリー；少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマー；ハイブリッド突然変異体ＲＮアーゼＨ２タンパク質；ｄＮＴＰ；ＤＮＡポリメラーゼ；及び緩衝液を含む混合物を形成するステップを含む。ハイブリッド二重鎖は、混合物中の、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーと、核酸鋳型の増幅産物ライブラリー内のＳＮＰ含有核酸鋳型との間において形成する。第２のステップは、ハイブリッド二重鎖の、少なくとも１つのブロックされた切断可能プライマーを、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質により切断して、ＤＮＡポリメラーゼによる、ハイブリッド二重鎖のプライマー伸長が可能な、少なくとも１つの活性プライマーを作出するステップを含む。第３のステップは、緩衝液中、１つ以上の鋳型核酸の、核酸鋳型の増幅産物ライブラリーからの増幅を可能とする条件下において、ＤＮＡポリメラーゼにより、二重鎖内の、少なくとも１つの活性プライマーを伸長させ、これにより、ＳＮＰ含有核酸鋳型を検出するステップを含む。第１の関連事項において、方法は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択されるハイブリッド突然変異体ＲＮアーゼＨ２タンパク質を含む。第２の関連事項において、方法は、高忠実度古細菌ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液である緩衝液を含む。
【0085】
第１２の態様において、ループ媒介増幅反応を実施する方法が提供される。方法は、２つのステップを含む。第１のステップは、核酸鋳型；ＲＮアーゼＨ２タンパク質に対する基質である核酸鋳型と共に、二重鎖を形成する、４つのブロックされた切断可能プライマー；Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）又は他のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質から選択されるＲＮアーゼＨ２タンパク質；ＤＮＡポリメラーゼタンパク質；ｄＮＴＰ；及び緩衝液を含む混合物を形成するステップを含む。第２のステップは、混合物により、等温増幅サイクルを実施するステップを含む。
【0086】
第１３の態様において、プライマー二量体の形成が低減されたｒｈＰＣＲアッセイを実施する方法が提供される。方法は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）により、プライマー伸長を実施するステップを含む。プライマー二量体形成の低減は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）によるｒｈＰＣＲアッセイ時に形成されたプライマー二量体の量の、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（配列番号１）により行われたｒｈＰＣＲアッセイと比較した低減に対応する。
【0087】
第１４の態様において、所望の産物について、マッピング率及びオンターゲット率が改善されたｒｈＰＣＲアッセイを実施する方法が提供される。方法は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）により、プライマー伸長を実施するステップを含む。マッピング率及びオンターゲット率の改善は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８）によるｒｈＰＣＲアッセイ時に形成された、所望の産物のマッピング及びオンターゲット増幅の、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（配列番号１）により行われたｒｈＰＣＲアッセイと比較した増大に対応する。
【0088】
最後に、本発明のＲＮアーゼＨ２ポリペプチドは、その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ１０２７３５３４（Ｂ２）号において開示された、高度に効率的な増幅法である、ＢａｓｅＸによるＰＣＲ増幅法における使用に適する。
【実施例】
【0089】
本発明は、以下の実施例の参照により、さらに例示される。しかし、これらの例は、上記において記載された実施形態と同様に、例示的なものであり、真のいかなる形でも、本発明の許容範囲を制限するものとしては理解されるべきではないことに留意されたい。
【0090】
［実施例１］ 組換えリシャッフリングを介する、ＳＥＬ２８ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質及びＳＥＬ２９ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質の作出
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ組換え法及び指向型分子進化法を使用して、突然変異体ＲＮアーゼＨ２タンパク質を合成した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓとの契約合意書の下において、Ａｌｔｒａｖａｘ（商標）Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）が、突然変異体５，５００のライブラリーを作出した。ＩＤＴにおいてなされた初期スクリーニングにおいて、ＳＥＬ２８突然変異体及びＳＥＬ２９突然変異体を選択したところ、突然変異体は、ＲＮアーゼＨ２切断反応におけるミスマッチ識別の増大を呈した。突然変異体は、エスケリキア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．コリー））ＢＬ２１（ＤＥ３）内部の、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）プラスミドベクター内において創出した。Ｔ７系に基づき発現させたタンパク質は、Ｎ末端におけるｐｅｌＢシグナル配列、突然変異ＲＮアーゼＨ２遺伝子、ヒト単純ヘルペスウイルス２エピトープタグ及びＣ末端における６ヒスチジンタグを含有する。５０ｍＬのＴＰＰ ＴｕｂｅＳｐｉｎ（登録商標）Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ（Ｔｅｃｈｎｏ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＡＧ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｔｅｋｎｏｖａ（商標）、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）を伴う、１２ｍＬのＬＢ培養液中において、Ｅ．コリー細胞を増殖させた。３７℃、２０時間にわたり、オーバーナイト型Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、ＲＮアーゼＨ２の発現を誘導した。ＭａｘＱ（商標）４０００ ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、２５０ｒｐｍにおいて振盪しながら、細菌発現株を増殖させた。ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）Ｌｅｇｅｎｄ ＸＴＲ遠心分離機内、７，５００×ｇにおいて、１０分間にわたり、細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペーストを、－８０℃において保管し、５０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１倍濃度のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）、１倍濃度のｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）、０．１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（約６００単位、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）及び４Ｕ／ｍＬのＡｍｂｉｏｎ（商標）ＤＮａｓｅ Ｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含有する細胞再懸濁緩衝液からなる、０．６ｍＬの溶解液中に再懸濁させた。溶解は、細胞を、１２０ｒｐｍにおいて振盪しながら、２５℃において、１５分間を要した。１６，０００×ｇにおいて、２０分間にわたる遠心分離により、不溶性物質を除去した。７５℃において、１５分間にわたり、ＤＮａｓｅ Ｉ及び天然のＥ．コリータンパク質を変性させた。１６，０００×ｇにおいて、１５分間にわたる遠心分離により、不溶性の変性タンパク質を、再度除去した。タンパク質精製のために、Ｃａｐｔｕｒｅｍ（商標）Ｈｉｓ－Ｔａｇｇｅｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ（商標）、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用した。キットからの結合カラムを、細胞再懸濁緩衝液により洗浄し、ＲＮアーゼＨ２を含有する上清を、カラム上にロードした。１１，０００×ｇにおいて、１分間にわたる遠心分離により、溶液を、カラムから取り出した。２０ｍＭのイミダゾールを添加した、２００μＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６）により、カラムを、２回にわたり洗浄した。２００μＬの溶出緩衝液（２０ｍＭのＮａ３ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．６）により、ＲＮアーゼＨ２酵素を溶出させ、Ｄ－Ｔｕｂｅ（商標）Ｄｉａｌｙｚｅｒ Ｍｉｄｉ，ＭＷＣＯ ６－８ ｋＤａ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、１Ｌの２倍濃度保管緩衝液Ｆ（ｐＨ８．４、４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＫＣｌ）に対して、一晩にわたり透析した。透析槽内の透析緩衝液を、少なくとも１回置き換えた。試料を、透析から回収し、９９．８％（ｖ／ｖ）グリセロール及び０．２％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の混合物と、１：１の容量比において混合した。これらの精製及び濃縮されたＲＮアーゼＨ２溶液を、－２０℃において保管した。これらの純度は、Ａｎｙ ｋＤ（商標）Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、ＳＤＳゲル電気泳動により推定した。ＲＮアーゼＨ２酵素は、全ての精製試料中において、主要タンパク質バンド（＞７５％）を呈し、その位置は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）と比較して、１モル当たり２８．９ｋｇの分子量に対応した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ組換え法及び指向型分子進化法を使用して、突然変異体ＲＮアーゼＨ２タンパク質を合成した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓとの契約合意書の下において、Ａｌｔｒａｖａｘ（商標）Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）が、突然変異体５，５００のライブラリーを作出した。ＩＤＴにおいてなされた初期スクリーニングにおいて、ＳＥＬ２８突然変異体及びＳＥＬ２９突然変異体を選択したところ、突然変異体は、ＲＮアーゼＨ２切断反応におけるミスマッチ識別の増大を呈した。突然変異体は、エスケリキア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．コリー））ＢＬ２１（ＤＥ３）内部の、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）プラスミドベクター内において創出した。Ｔ７系に基づき発現させたタンパク質は、Ｎ末端におけるｐｅｌＢシグナル配列、突然変異ＲＮアーゼＨ２遺伝子、ヒト単純ヘルペスウイルス２エピトープタグ及びＣ末端における６ヒスチジンタグを含有する。５０ｍＬのＴＰＰ ＴｕｂｅＳｐｉｎ（登録商標）Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ（Ｔｅｃｈｎｏ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＡＧ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｔｅｋｎｏｖａ（商標）、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）を伴う、１２ｍＬのＬＢ培養液中において、Ｅ．コリー細胞を増殖させた。３７℃、２０時間にわたり、オーバーナイト型Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、ＲＮアーゼＨ２の発現を誘導した。ＭａｘＱ（商標）４０００ ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、２５０ｒｐｍにおいて振盪しながら、細菌発現株を増殖させた。ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）Ｌｅｇｅｎｄ ＸＴＲ遠心分離機内、７，５００×ｇにおいて、１０分間にわたり、細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペーストを、－８０℃において保管し、５０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１倍濃度のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）、１倍濃度のｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）、０．１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（約６００単位、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）及び４Ｕ／ｍＬのＡｍｂｉｏｎ（商標）ＤＮａｓｅ Ｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含有する細胞再懸濁緩衝液からなる、０．６ｍＬの溶解液中に再懸濁させた。溶解は、細胞を、１２０ｒｐｍにおいて振盪しながら、２５℃において、１５分間を要した。１６，０００×ｇにおいて、２０分間にわたる遠心分離により、不溶性物質を除去した。７５℃において、１５分間にわたり、ＤＮａｓｅ Ｉ及び天然のＥ．コリータンパク質を変性させた。１６，０００×ｇにおいて、１５分間にわたる遠心分離により、不溶性の変性タンパク質を、再度除去した。タンパク質精製のために、Ｃａｐｔｕｒｅｍ（商標）Ｈｉｓ－Ｔａｇｇｅｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ（商標）、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用した。キットからの結合カラムを、細胞再懸濁緩衝液により洗浄し、ＲＮアーゼＨ２を含有する上清を、カラム上にロードした。１１，０００×ｇにおいて、１分間にわたる遠心分離により、溶液を、カラムから取り出した。２０ｍＭのイミダゾールを添加した、２００μＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６）により、カラムを、２回にわたり洗浄した。２００μＬの溶出緩衝液（２０ｍＭのＮａ３ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．６）により、ＲＮアーゼＨ２酵素を溶出させ、Ｄ－Ｔｕｂｅ（商標）Ｄｉａｌｙｚｅｒ Ｍｉｄｉ，ＭＷＣＯ ６－８ ｋＤａ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、１Ｌの２倍濃度保管緩衝液Ｆ（ｐＨ８．４、４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＫＣｌ）に対して、一晩にわたり透析した。透析槽内の透析緩衝液を、少なくとも１回置き換えた。試料を、透析から回収し、９９．８％（ｖ／ｖ）グリセロール及び０．２％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の混合物と、１：１の容量比において混合した。これらの精製及び濃縮されたＲＮアーゼＨ２溶液を、－２０℃において保管した。これらの純度は、Ａｎｙ ｋＤ（商標）Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、ＳＤＳゲル電気泳動により推定した。ＲＮアーゼＨ２酵素は、全ての精製試料中において、主要タンパク質バンド（＞７５％）を呈し、その位置は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）と比較して、１モル当たり２８．９ｋｇの分子量に対応した。
【0091】
突然変異体タンパク質のアミノ酸配列を、表１、配列番号８９及び９０に示す。シーケンシングは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ｖ３．１キットを使用して行った。プラスミドＤＮＡは、製造元のプロトコールに従い、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により、細菌株から単離した。シーケンシングデータは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにより収集した。
【0092】
［実施例２］ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２内の、Ｑ４８Ｒ ＳＤＭ突然変異体及びＡ１０７Ｖ ＳＤＭ突然変異体は、テルモコックス・コダカレンシスＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液中の酵素活性を、ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２と比較して増大させる
（Ｈｉｓ）６タグ付け突然変異体である、ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２タンパク質及びＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２タンパク質は、部位指定突然変異誘発（ＳＤＭ）法（例えば、ＷｅｉｎｅｒＭ．ら、Ｇｅｎｅ、１５１：１１９～１２３（１９９４）を参照されたい）により作出した。ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２及びＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２のＳＤＭのために使用されたプライマーを、表２、配列番号４～１３に示す。突然変異体の配列を検証し、標準法を使用して、タンパク質を、Ｅ．コリー内において発現させた。精製は、既に記載されている（Ｄｏｂｏｓｙら、２０１１；及び米国特許第８，９１１，９４８Ｂ２号）通りに、帯電Ｎｉ２＋カラム上のアフィニティー精製により行った。突然変異体タンパク質のアミノ酸配列を、表３、配列番号２～３、１４～２０に示す。
（Ｈｉｓ）６タグ付け突然変異体である、ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２タンパク質及びＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２タンパク質は、部位指定突然変異誘発（ＳＤＭ）法（例えば、ＷｅｉｎｅｒＭ．ら、Ｇｅｎｅ、１５１：１１９～１２３（１９９４）を参照されたい）により作出した。ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２及びＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２のＳＤＭのために使用されたプライマーを、表２、配列番号４～１３に示す。突然変異体の配列を検証し、標準法を使用して、タンパク質を、Ｅ．コリー内において発現させた。精製は、既に記載されている（Ｄｏｂｏｓｙら、２０１１；及び米国特許第８，９１１，９４８Ｂ２号）通りに、帯電Ｎｉ２＋カラム上のアフィニティー精製により行った。突然変異体タンパク質のアミノ酸配列を、表３、配列番号２～３、１４～２０に示す。
【0093】
【表2】
【0094】
【表3】
【0095】
Ｐ１３Ｓ ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２及びＰ１３Ｓ／Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２又はＰ１３Ｓ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２又はＰ１３Ｓ／Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２が、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液中の活性を、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較して増大させるのかどうかを、ｒｈＰＣＲにより決定するために、ＳＭＡＤ７内のｒｓ４９３９８２７ ＳＮＰをターゲティングする、定量的ｒｈＰＣＲアッセイをデザインした。このＳＮＰは、ｒｈＰＣＲの効率及び特異性を特徴付けるのに既に利用されており（Ｄｏｂｏｓｙら、２０１１；及び米国特許第８，９１１，９４８Ｂ２号）、示差的条件下におけるその応答が十分に理解されている。このアッセイにおいて使用されたプライマーを、表４、配列番号２１～２３に示す。アッセイは、１０μＬの反応容量中において行った。サーマルサイクリング及びデータ収集は、ＣＦＸ３８４（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上において行った。略述すると、２００ｎＭ（２ピコモル）の保護化フォワードプライマー（配列番号２２）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号２３）又は２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないフォワードプライマー（配列番号２１）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号２３）を、２．５ｍＭ（総濃度）のＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ（各濃度）のｄＮＴＰ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）及び０．５倍濃度のＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）染料（Ｂｉｏｔｉｕｍ Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を伴う、１倍濃度の内部ＫＯＤ緩衝液（ＲＯＫＳｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ２．０又はｖ１．６６）（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）へと混合した。ＲＮアーゼＨ２希釈緩衝液（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）又は２１フェムトモルのＷＴ Ｐ．ａ．（配列番号１）、ＳＥＬ２８（配列番号２）ＲＮアーゼＨ２酵素、ＳＥＬ２９（配列番号３）ＲＮアーゼＨ２酵素、Ｐ１３Ｓ ＳＥＬ２８（配列番号１４）ＲＮアーゼＨ２酵素、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２８（配列番号１５）ＲＮアーゼＨ２酵素、Ｐ１３Ｓ／Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２８（配列番号１６）ＲＮアーゼＨ２酵素、Ｐ１３Ｓ ＳＥＬ２９（配列番号１７）ＲＮアーゼＨ２酵素、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）ＲＮアーゼＨ２酵素、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９（配列番号１９）ＲＮアーゼＨ２酵素又はＰ１３Ｓ／Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９（配列番号２０）ＲＮアーゼＨ２酵素を、各反応物へと添加した。ｒｓ４９３９８２７ ＳＮＰにおいて、ホモ接合性の遺伝子型を表す、１０ｎｇの細胞系のゲノムＤＮＡ（細胞系である、ＮＡ１２８７８；Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）を、各反応物へと添加した。反応を、三連において実施し、結果を平均した。反応を、以下の条件：９５℃３：００→（９５℃０：１０→６０℃０：３０）×７５下においてサイクル化した。挿入されたＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）についての蛍光データは、各伸長時点の後に収集した。アッセイを完了させた後に、データを解析し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェアの自動判定機能を使用して、Ｃｑ値を計算した。結果を、表５に提示する。
【0096】
【表4】
【0097】
【表5】
【0098】
これらのデータは、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、テルモコックス・コダカレンシスＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液中の酵素活性を、バックグラウンドのＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２と比較して増大させたが、Ｐ１３Ｓ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＰ１３Ｓ／Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、増大させなかったことを示す。加えて、Ｐ１３Ｓ ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２、及びＰ１３Ｓ／Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２は、テルモコックス・コダカレンシスＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液中の酵素活性を、バックグラウンドのＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２と比較して増大させない。ＲＮアーゼＨ２を添加しない限りにおいて、ブロックされたプライマーは、切断されず、このため、ＰＣＲを支援することができない。特許権のあるエクソヌクレアーゼ耐性のブロックされたプライマーの使用は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの脱保護を防止するのに必要である。ＷＴ（Ｐ．ａ．）ＲＮアーゼＨ２は、ブロックされたプライマーを切断することが可能であるが、増幅を遅延させる結果として、ブロックされていないプライマーと比較して、ＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ２．０中の１２．４サイクル及びＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ１．６６中の２１．１サイクルのΔＣｑをもたらす。増幅の遅延についての、ΔＣｑの定量は、ＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ２．０中において、ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２についての１７．１サイクル及びＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２についての２４．６サイクルへと増大し、ＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ１．６６中において、ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２についての３０．６サイクル及びＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２についての３０．３サイクルへと増大する。増幅の遅延についての、ΔＣｑの定量は、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（ＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ２．０中の１７．２サイクル及びＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ１．６６中の２５．４サイクル）及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（ＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ２．０中の１３．９サイクル及びＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ１．６６中の２１．９サイクル）により減少する。Ｐ１３Ｓ／Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、増幅の遅延についてのΔＣｑの定量を、ＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ２．０中の２６．９サイクル及びＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ１．６６．中の３２．８サイクルへと増大させるが、Ｐ１３Ｓ ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２及びＰ１３Ｓ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、ＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ２．０又はＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ１．６６中において、見かけの活性を有さない。加えて、Ｐ１３Ｓ／Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２は、増幅の遅延についてのΔＣｑの定量を、ＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ２．０中の２１．５サイクル及びＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ１．６６中の３１．８サイクルへと増大させる。Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２８ ＲＮアーゼＨ２は、増幅の遅延についてのΔＣｑの定量を、ＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ２．０中の２０．０サイクル及びＲＯＫｓｔａｒ ｂｕｆｆｅｒ ｖ１．６６中の３５．８サイクルへと増大させる。Ｑ４８Ｒ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２、Ａ１０７Ｖ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２及びＰ１３Ｓ／Ａ１０７Ｖ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２のいずれもが、テルモコックス・コダカレンシスＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液中の酵素活性を増大させ、Ｐ１３Ｓ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２も、テルモコックス・コダカレンシスＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液中において、低度であるが、測定可能な酵素活性を有したので、これらの結果は、Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２内の突然変異と対照的である。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、テルモコックス・コダカレンシスＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液と共に使用された場合に、酵素活性（異なる程度においてであるが）を改善する。
【0099】
［実施例３］ ミスマッチが、ＲＮＡの向かい側に配置される場合に、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、ミスマッチ識別を、ＷＴ ＲＮアーゼＨ２と比較して増大させる
酵素の特異的活性は、蛍光ベース反応速度アッセイを使用して決定した。ＤＮＡ基質のための配列を、表６、配列番号２４～２５に示す。基質は、二本鎖領域内において、ＲＮＡ塩基をマッチさせたＤＮＡヘアピンである。プローブの３’末端に、６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセインが接合され；プローブの５’末端に、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ（配列番号２４）が接合される。無傷のヘアピンプローブにおいて、６－ＦＡＭの蛍光は、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ部分により消光させる。ＲＮアーゼＨ２は、６－ＦＡＭを伴うプローブの３’末端を、ＲＮＡ塩基の５’側において切断し、放出する。したがって、６－ＦＡＭの蛍光は、もはや、消光されず、蛍光発光しうる。ＲＮＡ塩基を伴うが、フルオロフォア又は消光剤を伴わないＤＮＡヘアピンを、競合剤として使用した（配列番号２５）。アッセイは、１０μＬの反応容量中において実施した。データ収集は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）により実行した。略述すると、１倍濃度のｒｈＡｍｐ（商標）Ｂａｃｋｂｏｎｅ ｖ３を、２００ｎＭ（２ピコモル）の標識化ヘアピン（配列番号２４）及び１０μＭ（１００ピコモル）の競合剤であるヘアピン（配列番号２５）と組み合わせて使用した。０．５、１．０、２．０又は５．０フェムトモルのＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（配列番号１）又は突然変異体ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８～１９）を、各反応物へと添加した。反応液は、当初、アッセイを開始する前に、基質の切断を防止するように、４℃に保った。試料は、６５℃において行った。蛍光励起波長は、４８３ｎｍであり；蛍光発光波長は、５３３ｎｍであった。蛍光強度は、１３．７５秒間ごとに、１３５分間にわたり収集した。各反応液について、初期速度及び１フェムトモルあたりの速度を計算した。各突然変異体について、１フェムトモルあたりの速度を、酵素１μｇ当たり１７単位の特異的活性を有することが既に決定された、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２についての値に照らして正規化した。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、酵素１μｇ当たり４６．０３単位の特異的活性を有し、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、酵素１μｇ当たり７．７７単位の特異的単位活性を有する。
酵素の特異的活性は、蛍光ベース反応速度アッセイを使用して決定した。ＤＮＡ基質のための配列を、表６、配列番号２４～２５に示す。基質は、二本鎖領域内において、ＲＮＡ塩基をマッチさせたＤＮＡヘアピンである。プローブの３’末端に、６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセインが接合され；プローブの５’末端に、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ（配列番号２４）が接合される。無傷のヘアピンプローブにおいて、６－ＦＡＭの蛍光は、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ部分により消光させる。ＲＮアーゼＨ２は、６－ＦＡＭを伴うプローブの３’末端を、ＲＮＡ塩基の５’側において切断し、放出する。したがって、６－ＦＡＭの蛍光は、もはや、消光されず、蛍光発光しうる。ＲＮＡ塩基を伴うが、フルオロフォア又は消光剤を伴わないＤＮＡヘアピンを、競合剤として使用した（配列番号２５）。アッセイは、１０μＬの反応容量中において実施した。データ収集は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）により実行した。略述すると、１倍濃度のｒｈＡｍｐ（商標）Ｂａｃｋｂｏｎｅ ｖ３を、２００ｎＭ（２ピコモル）の標識化ヘアピン（配列番号２４）及び１０μＭ（１００ピコモル）の競合剤であるヘアピン（配列番号２５）と組み合わせて使用した。０．５、１．０、２．０又は５．０フェムトモルのＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（配列番号１）又は突然変異体ＲＮアーゼＨ２（配列番号１８～１９）を、各反応物へと添加した。反応液は、当初、アッセイを開始する前に、基質の切断を防止するように、４℃に保った。試料は、６５℃において行った。蛍光励起波長は、４８３ｎｍであり；蛍光発光波長は、５３３ｎｍであった。蛍光強度は、１３．７５秒間ごとに、１３５分間にわたり収集した。各反応液について、初期速度及び１フェムトモルあたりの速度を計算した。各突然変異体について、１フェムトモルあたりの速度を、酵素１μｇ当たり１７単位の特異的活性を有することが既に決定された、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２についての値に照らして正規化した。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、酵素１μｇ当たり４６．０３単位の特異的活性を有し、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、酵素１μｇ当たり７．７７単位の特異的単位活性を有する。
【0100】
【表6】
【0101】
これらの突然変異体ＲＮアーゼＨ２酵素が、ＲＮＡ塩基の直接の向かい側におけるミスマッチに対するミスマッチ識別を改善するのかどうかを、十分に決定するために、既に記載されている（Ｄｏｂｏｓｙら、２０１１；及び米国特許第８，９１１，９４８Ｂ２号）通りに、合成による、定量的ｒｈＰＣＲアッセイを利用した。このアッセイは、各々の、特異的な、一塩基ミスマッチの影響を、完全なマッチと直接比較しうる。このアッセイにおいて使用されたプライマーを、表７、配列番号２６～３１に示す。アッセイは、１０μＬの反応容量中において行った。サーマルサイクリング及びデータ収集は、ＣＦＸ３８４（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上において行った。略述すると、２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされたリバースプライマー（配列番号２８～３１）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないフォワードプライマー（配列番号２６）又は２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号２７）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないフォワードプライマー（配列番号２６）を、１倍濃度のｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（登録商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）へと混合した。５ｍＵのＷＴ Ｐ．ａ．（配列番号１）ＲＮアーゼＨ２酵素、４０ｍＵのＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）ＲＮアーゼＨ２酵素又は５ｍＵのＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９（配列番号１９）ＲＮアーゼＨ２酵素を、各反応物へと添加した。各々が、ＲＮＡ塩基の直接の向かい側に、異なるヌクレオチドを伴う、２０，０００コピーの各合成標的配列（配列番号３２～３５）を、各反応物へと添加した。反応を、三連において実施し、結果を平均した。反応を、以下の条件：９５℃３：００→（９５℃０：１０→６０℃０：３０）×７５下においてサイクル化した。挿入されたＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎについての蛍光データは、各伸長時点の後に収集した。アッセイが完了した後、データを解析し、各対応のある組合せについて、平均Ｃｑ値及びΔＣｑ値を計算した。結果を、表８及び９に提示する。
【0102】
【表7】
【0103】
【表8】
【0104】
【表9】
【0105】
これらのデータは、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について、ミスマッチが、ｒＣの向かい側にある場合に、ミスマッチ識別の大幅な増大（それぞれ、約１４．０サイクル及び約１３．５サイクル）を示す。特に、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について、ｒＣ：Ｃ対に対するミスマッチ識別の大きな増大が見られる（それぞれ、２１．９サイクル及び１５．２サイクル）。ミスマッチが、ｒＵの向かい側にある場合、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について、ミスマッチ識別の著明な増大が見られる（約１１．２サイクル）が、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について、著明な増大は見られない（約４．３サイクル）。ミスマッチが、ｒＡの向かい側にある場合、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について、ミスマッチ識別の著明な変化が見られる（それぞれ、約８．５サイクル及び約６．０サイクル）。ミスマッチが、ｒＧの向かい側にある場合、ミスマッチ識別の変化は小さいが；ＷＴ ＲＮアーゼＨ２を使用した場合のミスマッチ識別が、ｒＧについて、既にかなり効果的であったので、ミスマッチ識別の変化の、この欠如は、それほど重要ではない。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２についての、ミスマッチ識別の、これらの増大は、バックグラウンドのＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２についてのミスマッチ識別と同様である。いずれの突然変異も、ミスマッチが、ＲＮＡ塩基の直接の向かい側に配置される場合に、ミスマッチ識別を改善するが、程度が異なり、特異性も異なる。
【0106】
［実施例４］ ミスマッチが、ＲＮＡの５’側に配置される場合に、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、ミスマッチ識別を、ＷＴ ＲＮアーゼＨ２と比較して増大させる
ミスマッチが、ＲＮＡヌクレオチドの５’側に配置される場合に、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素を使用する、ミスマッチ識別する程度を決定するために、ＳＮＰを、ＲＮＡの５’側に直に接して配置して、ｒｓ１１３４８８０２２（ヒトＢＲＡＦ遺伝子内のＶ６００Ｅ ＳＮＰ）をターゲティングするアッセイをデザインした。このアッセイにおいて使用されたプライマーを、表１０、配列番号３６～３９に示す。アッセイは、１０μＬの反応容量中において行った。サーマルサイクリング及びデータ収集は、ＣＦＸ３８４（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上において行った。略述すると、２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされたフォワードプライマー（配列番号３８又は３９）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号３７）又は２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないフォワードプライマー（配列番号３６）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号３７）を、１倍濃度のｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（登録商標）へと混合した。５ｍＵ若しくは１０ｍＵのＷＴ（配列番号１）Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素、５ｍＵ若しくは１０ｍＵのＳＥＬ２９（配列番号３）ＲＮアーゼＨ２酵素、２０ｍＵ若しくは４０ｍＵのＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）ＲＮアーゼＨ２酵素又は５ｍＵ若しくは１０ｍＵのＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９（配列番号１９）ＲＮアーゼＨ２酵素を、各反応物へと添加した。各々が、ｒｓ１１３４８８０２２ ＳＮＰ（配列番号４０又は４１）における、ホモ接合性の遺伝子型に対応する、２，０００コピーの合成二本鎖ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）鋳型を、各反応物へと添加した。反応は、三連において実施した。反応を、以下の条件：９５℃３：００→（９５℃０：１０→６０℃０：３０）×６５下においてサイクル化した。挿入されたＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎについての蛍光データは、各伸長時点の後に収集した。アッセイが完了した後、データを解析し、各対応のある組合せについて、平均Ｃｑ値及びΔＣｑ値を計算した。結果を、表１１に提示する。
ミスマッチが、ＲＮＡヌクレオチドの５’側に配置される場合に、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素を使用する、ミスマッチ識別する程度を決定するために、ＳＮＰを、ＲＮＡの５’側に直に接して配置して、ｒｓ１１３４８８０２２（ヒトＢＲＡＦ遺伝子内のＶ６００Ｅ ＳＮＰ）をターゲティングするアッセイをデザインした。このアッセイにおいて使用されたプライマーを、表１０、配列番号３６～３９に示す。アッセイは、１０μＬの反応容量中において行った。サーマルサイクリング及びデータ収集は、ＣＦＸ３８４（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上において行った。略述すると、２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされたフォワードプライマー（配列番号３８又は３９）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号３７）又は２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないフォワードプライマー（配列番号３６）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号３７）を、１倍濃度のｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（登録商標）へと混合した。５ｍＵ若しくは１０ｍＵのＷＴ（配列番号１）Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素、５ｍＵ若しくは１０ｍＵのＳＥＬ２９（配列番号３）ＲＮアーゼＨ２酵素、２０ｍＵ若しくは４０ｍＵのＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）ＲＮアーゼＨ２酵素又は５ｍＵ若しくは１０ｍＵのＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９（配列番号１９）ＲＮアーゼＨ２酵素を、各反応物へと添加した。各々が、ｒｓ１１３４８８０２２ ＳＮＰ（配列番号４０又は４１）における、ホモ接合性の遺伝子型に対応する、２，０００コピーの合成二本鎖ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）鋳型を、各反応物へと添加した。反応は、三連において実施した。反応を、以下の条件：９５℃３：００→（９５℃０：１０→６０℃０：３０）×６５下においてサイクル化した。挿入されたＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎについての蛍光データは、各伸長時点の後に収集した。アッセイが完了した後、データを解析し、各対応のある組合せについて、平均Ｃｑ値及びΔＣｑ値を計算した。結果を、表１１に提示する。
【0107】
【表10】
【0108】
【表11】
【0109】
これらのデータは、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２が、ＲＮＡヌクレオチドの５’側におけるミスマッチ識別を著明に改善することを示す。ＴｒＧプライマーについての、ΔＣｑの定量は、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２による３．８サイクルから、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２による５．９サイクル（５ｍＵのＷＴ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について）へと増大し、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２による４．５サイクルから、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２による６．９サイクル（５ｍＵのＷＴ ＲＮアーゼＨ２及び４０ｍＵのＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について）へと増大した。ＡｒＧプライマーについての、ΔＣｑの定量は、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２による１０．１サイクルから、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２による１１．２サイクル（５ｍＵのＷＴ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について）へと増大するが、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２による１０．９サイクルから、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２による１０．２サイクル（５ｍＵのＷＴ ＲＮアーゼＨ２及び４０ｍＵのＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について）へと減少した。ＷＴ酵素を使用した場合のΔＣｑが、このプライマーに対して、既にかなり効果的であったので、ＡｒＧプライマーに対するミスマッチ識別の変化は、それほど重要ではない。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２についての、ミスマッチ識別の、これらの増大は、バックグラウンドのＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２についてのミスマッチ識別と同様である。したがって、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、ミスマッチが、ＲＮＡ塩基の５’側に配置される場合に、ミスマッチ識別を改善する。
【0110】
［実施例５］ ミスマッチが、ＲＮＡの３’側に配置される場合に、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、ミスマッチ識別を、ＷＴ ＲＮアーゼＨ２と比較して増大させる
ミスマッチが、ＲＮＡヌクレオチドの３’側に配置される場合に、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素が、ミスマッチ識別を改善しうるのかどうかを決定するために、ミスマッチを、ＲＮＡの３’側に直に接して配置して、ｒｓ７５８３１６９ ＳＮＰ及びｒｓ３１１７９４７ ＳＮＰをターゲティングするアッセイをデザインした。このアッセイにおいて使用されたプライマーを、表１２、配列番号４２～４７に示す。アッセイは、１０μＬの反応容量中において行った。サーマルサイクリング及びデータ収集は、ＣＦＸ３８４（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上において行った。略述すると、２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされたフォワードプライマー（配列番号４３又は４６）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号４４又は４７）又は２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないフォワードプライマー（配列番号４２又は４５）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号４４又は４７）を、３．０ｍＭ（総濃度）のＭｇＣｌ２及び０．５倍濃度のＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）染料（Ｂｉｏｔｉｕｍ Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を伴う、１倍濃度のＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）へと混合した。５ｍＵ若しくは１０ｍＵのＷＴ（配列番号１）Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素、５０ｍＵ若しくは１００ｍＵのＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）ＲＮアーゼＨ２酵素又は２０ｍＵ若しくは４０ｍＵのＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９（配列番号１９）ＲＮアーゼＨ２酵素を、各反応物へと添加した。ｒｓ７５８３１６９ ＳＮＰ及びｒｓ３１１７９４７ ＳＮＰにおいて、２つのホモ接合性の遺伝子型を表す、２０ｎｇの細胞系のゲノムＤＮＡ（細胞系である、ＮＡ１２８７８及びＮＡ２４３８５；Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）を、各反応物へと添加した。反応を、三連において実施し、結果を平均した。反応を、以下の条件：９５℃３：００→（９５℃０：１０→６０℃０：３０）×６５下においてサイクル化した。挿入されたＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）についての蛍光データは、各伸長時点の後に収集した。アッセイが完了した後、データを解析し、各対応のある組合せについて、平均Ｃｑ値及びΔＣｑ値を計算した。結果を、表１３に提示する。
ミスマッチが、ＲＮＡヌクレオチドの３’側に配置される場合に、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２酵素が、ミスマッチ識別を改善しうるのかどうかを決定するために、ミスマッチを、ＲＮＡの３’側に直に接して配置して、ｒｓ７５８３１６９ ＳＮＰ及びｒｓ３１１７９４７ ＳＮＰをターゲティングするアッセイをデザインした。このアッセイにおいて使用されたプライマーを、表１２、配列番号４２～４７に示す。アッセイは、１０μＬの反応容量中において行った。サーマルサイクリング及びデータ収集は、ＣＦＸ３８４（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上において行った。略述すると、２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされたフォワードプライマー（配列番号４３又は４６）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号４４又は４７）又は２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないフォワードプライマー（配列番号４２又は４５）及び２００ｎＭ（２ピコモル）のブロックされていないリバースプライマー（配列番号４４又は４７）を、３．０ｍＭ（総濃度）のＭｇＣｌ２及び０．５倍濃度のＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）染料（Ｂｉｏｔｉｕｍ Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を伴う、１倍濃度のＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）へと混合した。５ｍＵ若しくは１０ｍＵのＷＴ（配列番号１）Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素、５０ｍＵ若しくは１００ｍＵのＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９（配列番号１８）ＲＮアーゼＨ２酵素又は２０ｍＵ若しくは４０ｍＵのＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９（配列番号１９）ＲＮアーゼＨ２酵素を、各反応物へと添加した。ｒｓ７５８３１６９ ＳＮＰ及びｒｓ３１１７９４７ ＳＮＰにおいて、２つのホモ接合性の遺伝子型を表す、２０ｎｇの細胞系のゲノムＤＮＡ（細胞系である、ＮＡ１２８７８及びＮＡ２４３８５；Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）を、各反応物へと添加した。反応を、三連において実施し、結果を平均した。反応を、以下の条件：９５℃３：００→（９５℃０：１０→６０℃０：３０）×６５下においてサイクル化した。挿入されたＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）についての蛍光データは、各伸長時点の後に収集した。アッセイが完了した後、データを解析し、各対応のある組合せについて、平均Ｃｑ値及びΔＣｑ値を計算した。結果を、表１３に提示する。
【0111】
【表12】
【0112】
【表13】
【0113】
これらのデータは、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９が、ＲＮＡヌクレオチドの３’側におけるミスマッチ識別を、著明に増大させることを示す。ｒｓ７５８３１６９ ＳＮＰのミスマッチ識別についての、ΔＣｑの定量は、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２による０．０サイクルから、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２による１．４サイクル（５ｍＵのＷＴ ＲＮアーゼＨ２及び４０ｍＵのＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について）へと増大し、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２による０．０サイクルから、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２による１１．５サイクル（５ｍＵのＷＴ ＲＮアーゼＨ２及び１００ｍＵのＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について）へと増大した。ｒｓ３１１７９４７ ＳＮＰのミスマッチ識別についての、ΔＣｑの定量は、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２による１０．７サイクルから、Ａ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２による２２．３サイクル（５ｍＵのＷＴ ＲＮアーゼＨ２及び４０ｍＵのＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について）へと増大し、ＷＴ Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２による１０．７サイクルから、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２による２０．４サイクル（５ｍＵのＷＴ ＲＮアーゼＨ２及び１００ｍＵのＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について）へと増大した。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２についての、ミスマッチ識別の、これらの増大は、バックグラウンドのＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２についてのミスマッチ識別より、著明に大きい。したがって、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、ミスマッチが、ＲＮＡ塩基の３’側に配置される場合に、ミスマッチ識別を改善する。
【0114】
［実施例６］ ＬＡＭＰ反応における、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質及びＡ１０７Ｖ ＳＥＬ２９ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質の使用
本実施例は、ＬＡＭＰ反応において、プライマー二量体形成を低減する、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質の使用を裏付ける方法を概括する。
本実施例は、ＬＡＭＰ反応において、プライマー二量体形成を低減する、ハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質の使用を裏付ける方法を概括する。
【0115】
異なるＲＮアーゼＨ２タンパク質（ＷＴ ＲＮアーゼＨ２タンパク質又はハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質）を含むＬＡＭＰプロトコールのための、ｒｈＰｒｉｍｅｒｓの機能性について査定するために、（１）非改変対照プライマー；ｒＤＤＤＤＭｘプライマー［配列中、「ｒ」は、ＲＮＡ塩基であり、「Ｄ」は、ＤＮＡ塩基であり、「ｍ」は、ミスマッチであり、「ｘ」は、Ｃ３スペーサーである］である、「Ｇｅｎ１」；及びｒＤｘｘＤＭプライマーである、「Ｇｅｎ２」を使用する、３つのアッセイをデザインすることができた。使用されるアッセイの詳細について、表１４、１５及び１６において詳述する。各種類のプライマーを利用するＬＡＭＰ反応液は、試験前の０又は２時間にわたり、２５℃（室温）において保持される。これは、プライマー二量体産物の形成を可能とする。室温における保持の後、全ての反応は、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ３８４又はＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０内、６５℃において、２時間にわたり行う。これらの反応液の全てにおけるシグナルの発生は、１倍濃度のＥｖａＧｒｅｅｎを、反応へと添加して実施される（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００７年１２月、２９巻、１２号、１９３９～１９４６頁を参照されたい）。
【0116】
【表14】
【0117】
【表15】
【0118】
【表16】
【0119】
各アッセイは、以下の通りに実施しうる：試料は、Ｃｏｒｉｅｌｌ ｇＤＮＡ又はラムダファージゲノムＤＮＡである。各アッセイ条件は、試料インプットを、５ｎｇラムダファージゲノムＤＮＡ又は２０ｎｇヒトゲノムＤＮＡとして、三連において試行されうる。各アッセイについて、反応は、非改変プライマー挿入染料（例えば、ＥｖａＧｒｅｅｎ）及び挿入染料を伴う、切断可能なブロックされたプライマーを使用して試行されうる。各アッセイについて、反応は、ゼロレベル又は滴定レベルのＲＮアーゼＨ２（ＷＴ ＲＮアーゼＨ２タンパク質又はハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質）を使用して試行される。
【0120】
各アッセイは、三連において試行される。非改変ＬＡＭＰアッセイと、改変ＬＡＭＰアッセイとの比較は、シグナル発生産物の形成のために要求された時間の長さを比較することにより実施される。ＬＡＭＰ反応液中のハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質は、従来の野生型ＲＮアーゼＨ２タンパク質を含有する反応液より、著明に遅れて、これらの産物をもたらすことが予測される。
【0121】
２５μＬのＥｖａＧｒｅｅｎ反応混合物は、
１２．５μＬの２倍濃度Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２５℃、ｐＨ８．８、１倍濃度の２０ｍＭトリス、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０、１．４ｍＭのｄＮＴＰ）
１．６μＭのＦＩＰプライマー
１．６μＭのＢＩＰプライマー
１倍濃度のＥｖａＧｒｅｅｎ染料
０．２μＭのＦ３プライマー
０．２μＭのＢ３プライマー
８ＵのＢＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｍ０２７５－ｂｓｔ－ｄｎａ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ－ｌａｒｇｅ－ｆｒａｇｍｅｎｔ）
１μＬのハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質（ＲＮアーゼＨ２対照に、緩衝液Ｄは使用されない）
２５ｕＬまでのヌクレアーゼ非含有水
２μＬの試料（１０ｎｇ／μＬのヒトｇＤＮＡ又は２．５ｎｇ／ｕＬのラムダゲノムＤＮＡ）
を含む。
１２．５μＬの２倍濃度Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２５℃、ｐＨ８．８、１倍濃度の２０ｍＭトリス、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０、１．４ｍＭのｄＮＴＰ）
１．６μＭのＦＩＰプライマー
１．６μＭのＢＩＰプライマー
１倍濃度のＥｖａＧｒｅｅｎ染料
０．２μＭのＦ３プライマー
０．２μＭのＢ３プライマー
８ＵのＢＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｍ０２７５－ｂｓｔ－ｄｎａ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ－ｌａｒｇｅ－ｆｒａｇｍｅｎｔ）
１μＬのハイブリッドＲＮアーゼＨ２タンパク質（ＲＮアーゼＨ２対照に、緩衝液Ｄは使用されない）
２５ｕＬまでのヌクレアーゼ非含有水
２μＬの試料（１０ｎｇ／μＬのヒトｇＤＮＡ又は２．５ｎｇ／ｕＬのラムダゲノムＤＮＡ）
を含む。
【0122】
［実施例７］ Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、１７７プレックススアッセイパネルを使用する、マルチプレックスｒｈＰＣＲ単位複製配列シーケンシングワークフローにおいて、ＮＧＳライブラリーの品質を、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較して改善する
改変ｒｈＡｍｐＳｅｑプロトコールを、低頻度の変異体検出のために適合させた。このプロトコールは、増幅エラーを低減する、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ及びエラーを補正するためのＵＭＩ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）の両方を使用する。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２を、二量体形成が低減されるのかどうかを決定するのに、このシステムにおいて、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較した。
改変ｒｈＡｍｐＳｅｑプロトコールを、低頻度の変異体検出のために適合させた。このプロトコールは、増幅エラーを低減する、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ及びエラーを補正するためのＵＭＩ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）の両方を使用する。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２を、二量体形成が低減されるのかどうかを決定するのに、このシステムにおいて、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較した。
【0123】
各ステップに続き、ＳＰＲＩ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）クリーンアップを伴う、２つのＰＣＲサイクリングステップを行う。第１のＰＣＲステップ（ＰＣＲ１）の目的は、標的単位複製配列の各側に、６ヌクレオチドの縮重ＵＭＩを組み込むことである。このステップはまた、３’側のブロックされたプライマーの使用も含み、ＲＮアーゼＨ２が、保護剤を切断することを要求し、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼが、各標的を伸長させ、増幅することを可能とする。標的特異的アッセイパネルは、特許権のある、１７７のプライマー対を含有し、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２が、ＰＣＲ１内に存在する場合に、全リードのうちの約２０％が、プライマー二量体となる結果をもたらす。このパネルが、多量のプライマー二量体をもたらすので、このパネルは、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２について調べるのに最適である。
【0124】
Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２及び野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（８７．５ｍＵ／ｕＬ、１７５ｍＵ／ｕＬ及び３５０ｍＵ／ｕＬ）についての、多様な１０倍滴定液を、ＲＮアーゼＨ２保管緩衝液（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）中において調製した。各ＰＣＲ１反応液は、２０μＬの最終容量であり、１０ｎＭ（２００フェムトモル）ずつの、各フォワードプライマー及び各リバースプライマー、０．０３Ｕ／μＬのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、２０ｎｇの細胞系のゲノムＤＮＡ（細胞系である、ＮＡ２４３８５；Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）及び最終濃度を１倍濃度とする、特許権のある高忠実度ポリメラーゼ緩衝液中のＲＮアーゼＨ２を含有した。サーマルサイクリングは、Ｔ１００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上において、表１７に列挙されたサイクリング条件により実施した。ＰＣＲ１サーマルサイクリングに続き、速やかに、ＳＰＲＩクリーンアップを行った。１．２５倍濃度（２５μＬ）のＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、各ウェルへと添加し、十分に混合した。プレートを、作業台上、室温において、５分間にわたりインキュベートするのに続き、磁石上において、５分間にわたりインキュベートした。上清を廃棄し、ライブラリーを、８０％のエタノールにより、２回にわたり洗浄した。２２μＬのＩＤＴＥｐＨ７．５（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）中において、試料を溶出させた。２０μＬの溶出産物を、ＰＣＲ２のためのインプットとして繰り入れた。
【0125】
【表17】
【0126】
第２のＰＣＲステップ（ＰＣＲ２）の目的は、ＰＣＲ１産物を増幅し、プーリング及びシーケンシンを目的として、ＵＭＩ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ）配列を付加することであった。ＰＣＲ２は、ＲＮアーゼＨ２の使用を要求しない。ＰＣＲ２反応は、５０μＬの最終容量において実施した。最終濃度を１倍濃度とするために、ＰＣＲ１において使用された、高忠実度ポリメラーゼ緩衝液の２倍濃度型を、ＰＣＲ１からの各溶出試料へと添加した。各反応液はまた、ｉ５ ｈＡｍｐＳｅｑインデックスプライマー（ＩＤＴ）と、ｉ７ｒ ＩＤＴとの固有の組合せも、各々、５００ｎＭにおいて有した。サーマルサイクリングは、Ｔ１００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上において、表１８に列挙されたサイクリング条件により実施した。ＰＣＲ２の直後に、ＳＰＲＩクリーンアップを行ったが、これは、ＰＣＲ２後に、０．９倍において使用されたＡＭＰｕｒｅビーズ濃度を除き、上記において列挙された方法と同一である。２２μＬのＩＤＴＥｐＨ７．５（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）中において、試料を溶出させた。２０μＬの溶出産物を取り、シーケンシングまで、－２０℃において保管した。
【0127】
【表18】
【0128】
結果として得られたライブラリーを、シーケンシングのために、等容量においてプーリングした（５ｕＬ）。Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、このプールを定量し、４ｎＭの最終濃度へと希釈した。等量のライブラリープールを、０．２ＮのＮａＯＨと組み合わせて、ライブラリーを変性させた。その後、この反応液を、２．５％のＰｈｉＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）スパイクインを含有する、８ｐＭの最終濃度へと希釈した。この反応液を、ＭｉＳｅｑ ３００サイクルキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）へとロードし、試行した（クラスター密度：１００２±３４；Ｑ３０：９３．１３％）。結果を、自社内の特許権のある、ＩＤＴ ｒｈＡｍｐＳｅｑ ＶＩＩバイオインフォマティクス解析パイプラインにかけた。
【0129】
本開示の目的のために、下記の結果に関する計算及び用語を、ここに列挙する。シーケンシングライブラリーの増幅時にもたらされる、プライマー二量体の量は、二量体率により規定される。ｒｈＡｍｐＳｅｑ ＶＩＩパイプラインは、同定された二量体の全カウントを取り、ＱＣ合格リードの数（ｃｆ（ｃｈａｓｔｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒ）を合格したリードの総数）により除することにより、これを計算する。マッピング率は、マッピングされたリードの総数を取り、ＱＣ合格リード数により除することにより計算される。オンターゲット率は、オンターゲットリードの総数を取り、ＱＣ合格リード数により除することにより計算される。全単位複製配列均一性又は≧０．２倍の単位複製配列均一性は、単位複製配列の平均値カバレッジの０．２倍以上である、正常単位複製配列のパーセントとして計算される。ドロップアウト率又は≦０．０５倍の均一性は、単位複製配列の平均値カバレッジの０．０５倍未満である、正常単位複製配列のパーセントとして計算される。単位複製配列の均一性分布は、所与の試料について、各単位複製配列のカバレッジを、平均値単位複製配列カバレッジと比べて比較し、以下の範囲：０．１～０．２倍、０．２～０．５倍、０．５～１．５倍、１．５～２．５倍及び２．５～５倍内においてプロットする。
【0130】
ｒｈＡｍｐＳｅｑ ＶＩＩパイプラインはまた、各プライマー二量体の形成に寄与するプライマーも同定する。正規化された二量体カウントは、百分率各プライマー二量体が、全二量体率に寄与することを反映し、以下の式：
【0131】
【数1】
【0132】
全ての被験濃度について、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、二量体率を、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較して低減し、また、マッピング率及びオンターゲット率も増大させた。最低濃度（８．７５ｍＵ／μＬ）において、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、１１％の二量体をもたらした対照野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較して、二量体が４％であるライブラリーをもたらした（図１、パネルＡ）。
【0133】
最低濃度のＱ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２（８．７５ｍＵ／μＬ）により作製されたライブラリーについてのマッピング率及びオンターゲット率は、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２についての８８％と比較して、９６％へと増大した（図１、パネルＢ及びＣ）。
【0134】
二量体率は、もたらされる個別のプライマー二量体へと分割され、次いで、各プライマー二量体の、上記において記載された、全二量体率への寄与を決定するように正規化される（正規化二量体カウント）。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、最多のプライマー二量体量を、半数に低減する。例えば、最低濃度のＱ４８Ｒ Ｍｕｔ ２９ ＲＮアーゼＨ２（８．７５ｍＵ／μＬ）により作出されたライブラリーのうち、全ての試料ライブラリー内において同定された、最上位の二量体（ＮＯＴＣＨ１＿１９．ＧＡＰ９５．９６２３．ｒｅｌａｘ．ｔ０＿ＦＯＲ：ＮＯＴＣＨ１＿９．ＧＡＰ１０４．１２４６．ｒｅｌａｘ．ｔ０＿ＲＥＶ）は、２．８３％である野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較して、全二量体率のうちの１．２３％を占めるに過ぎない。ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ：ＴＥＲＴ＿１５．ＧＡＰ２７．５１１．ｒｅｌａｘ．ｔ０＿ＲＥＶ Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２ライブラリーの場合、一部の二量体は、過半数が低減され、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較して７５％少ない、０．１１％の二量体をもたらすが、この場合、この二量体は、全二量体率に対して、０．４７％の寄与をもたらす（表１９及び図２）。
【0135】
【表19】
【0136】
Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２が、二量体率を低減する能力は、ライブラリー収量、全均一性及びドロップアウト率又は均一性分布のメトリックに影響を及ぼさない。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、単位複製配列の平均値カバレッジにより裏付けられる通り、全ての滴定被験濃度により、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素と比較して、同様のライブラリー収量をもたらす（図３、パネルＡ）。加えて、≧０．２倍の全単位複製配列均一性及び単位複製配列ドロップアウト率（≦０．０５倍の単位複製配列均一性）は、全ての滴定被験濃度、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２と、野生型Ｐ．ａ．酵素との間において、同等である（図３、パネルＢ及びＣ）。さらに、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９と、野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２との間における均一性分布も、同様であると考えられる（図４）。Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２は、他の重要なシーケンシングメトリックを変更せずに、ｒｈＡｍｐｓｅｑワークフロー内のライブラリー作出時における、プライマー二量体形成を、標準的野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２と比較して低減する。
【0137】
まとめると、これらのデータは、Ｑ４８Ｒ ＳＥＬ２９ ＲＮアーゼＨ２が、高忠実度緩衝液中の、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用する、マルチプレックス次世代シーケンシングライブラリーの作出を改善することを示す。
【0138】
［実施例８］ ＲＮアーゼＨ２タンパク質をコードする、例示的なアミノ酸配列及び核酸配列
ＲＮアーゼＨ２タンパク質をコードする、例示的なアミノ酸配列及び核酸配列は、下記に提示される。
ＲＮアーゼＨ２タンパク質をコードする、例示的なアミノ酸配列及び核酸配列は、下記に提示される。
【0139】
【表20】
【0140】
【表21】
【0141】
【表22】
【0142】
引用された参考文献
Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ Ｄｏｂｏｓｙ、Ｓｃｏｔｔ Ｄ Ｒｏｓｅ、Ｋｒｉｓｔｉｎ Ｒ Ｂｅｌｔｚ、Ｓｕｓａｎ Ｍ Ｒｕｐｐ、Ｋｒｉｓｔｙ Ｍ Ｐｏｗｅｒｓ、Ｍａｒｋ Ａ Ｂｅｈｌｋｅ及びＪｏｓｅｐｈ Ａ Ｗａｌｄｅｒ、ＲＮａｓｅ Ｈ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）：ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｂｌｏｃｋｅｄ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｐｒｉｍｅｒｓ、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）、１１：８０
Ａｙｕｍｕ Ｍｕｒｏｙａ、Ｄａｉｓｕｋｅ Ｔｓｕｃｈｉｙａ、Ｍｏｍｏｙｏ Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｍｉｔｓｕｒｕ Ｈａｒｕｋｉ、Ｍａｓａａｋｉ Ｍｏｒｉｋａｗａ、Ｓｈｉｇｅｎｏｒｉ Ｋａｎａｙａ、及びＫｏｓｕｋｅ Ｍｏｒｉｋａｗａ、Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ａｎ ａｒｃｈａｅａｌ ｔｙｐｅ ２ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｘ‐ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）、１０：７０７～７１４
Ｍｏｎｉｋａ Ｐ．Ｒｙｃｈｌｉｋ、Ｈｙｏｎｇｉ Ｃｈｏｎ、Ｓｕｓａｎａ Ｍ．Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉ、Ｐａｕｌｉｎａ Ｋｌｉｍｅｋ、Ｒｏｂｅｒｔ Ｊ．Ｃｒｏｕｃｈ、及びＭａｒｃｉｎ Ｎｏｗｏｔｎｙ、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ＲＮａｓｅ Ｈ２ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＲＮＡ－ＤＮＡ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２０１０）、４０：６５８～６７０
Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ Ｄｏｂｏｓｙ、Ｓｃｏｔｔ Ｄ Ｒｏｓｅ、Ｋｒｉｓｔｉｎ Ｒ Ｂｅｌｔｚ、Ｓｕｓａｎ Ｍ Ｒｕｐｐ、Ｋｒｉｓｔｙ Ｍ Ｐｏｗｅｒｓ、Ｍａｒｋ Ａ Ｂｅｈｌｋｅ及びＪｏｓｅｐｈ Ａ Ｗａｌｄｅｒ、ＲＮａｓｅ Ｈ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）：ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｂｌｏｃｋｅｄ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｐｒｉｍｅｒｓ、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）、１１：８０
Ａｙｕｍｕ Ｍｕｒｏｙａ、Ｄａｉｓｕｋｅ Ｔｓｕｃｈｉｙａ、Ｍｏｍｏｙｏ Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｍｉｔｓｕｒｕ Ｈａｒｕｋｉ、Ｍａｓａａｋｉ Ｍｏｒｉｋａｗａ、Ｓｈｉｇｅｎｏｒｉ Ｋａｎａｙａ、及びＫｏｓｕｋｅ Ｍｏｒｉｋａｗａ、Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ａｎ ａｒｃｈａｅａｌ ｔｙｐｅ ２ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｘ‐ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）、１０：７０７～７１４
Ｍｏｎｉｋａ Ｐ．Ｒｙｃｈｌｉｋ、Ｈｙｏｎｇｉ Ｃｈｏｎ、Ｓｕｓａｎａ Ｍ．Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉ、Ｐａｕｌｉｎａ Ｋｌｉｍｅｋ、Ｒｏｂｅｒｔ Ｊ．Ｃｒｏｕｃｈ、及びＭａｒｃｉｎ Ｎｏｗｏｔｎｙ、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ＲＮａｓｅ Ｈ２ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＲＮＡ－ＤＮＡ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２０１０）、４０：６５８～６７０
【0143】
本明細書において引用された、刊行物、特許出願及び特許を含む、全ての参考文献は、各参考文献が、参照により組み込まれることが、個別に、かつ、具体的に指し示され、その全体において、本明細書に明示された場合と同じ程度において、参照により本明細書に組み込まれる。
【0144】
本明細書において、本発明者らに公知である、本発明を実行するための、最良の方式を含む、本発明の、好ましい実施形態が記載される。前出の記載を読めば、これらの好ましい実施形態に対する変動は、当業者に明らかとなりうる。本発明者らは、当業者が、必要に応じて、このような変動を利用することを期待しており、本発明者らは、本発明が、本明細書において具体的に記載された方式以外の方式において実施されることを意図する。したがって、本発明は、本明細書に付属の特許請求の範囲において列挙された対象物に対する、全ての改変及びこれらの均等物を、適用可能な法規により許容されたものとして含む。さらに、本明細書においてそうでないことが指し示されない限り、又は、文脈により、明らかに逆の記載がない限り、上記において記載された要素の、これらの全ての可能な変動における、任意の組合せも、本発明に包含される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】