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特表2024-501892新規の核酸誘導型ヌクレアーゼ

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-16

(54)【発明の名称】新規の核酸誘導型ヌクレアーゼ

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20240109BHJP

C12N 15/55 20060101ALI20240109BHJP

C12N 9/22 20060101ALI20240109BHJP

C12N 15/31 20060101ALI20240109BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240109BHJP

C12N 15/62 20060101ALI20240109BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20240109BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240109BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240109BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240109BHJP

C12N 5/0781 20100101ALI20240109BHJP

C12N 5/0783 20100101ALI20240109BHJP

C12N 15/12 20060101ALI20240109BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/55 ZNA

C12N9/22

C12N15/31

C12N15/63 Z

C12N15/62 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N5/0781

C12N5/0783

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023540672

(86)(22)【出願日】2021-12-29

(85)【翻訳文提出日】2023-08-25

(86)【国際出願番号】 US2021065554

(87)【国際公開番号】W WO2022147157

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】63/133,089

(32)【優先日】2020-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523244934

【氏名又は名称】ギガミューン，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本健策

(72)【発明者】

【氏名】ジョンソン，デイビッドスコット

(72)【発明者】

【氏名】シモンズ，ジャンフレドリック

(72)【発明者】

【氏名】リム，ユーンウィアン

(72)【発明者】

【氏名】スピンドラー，マシュージェイムズ

(72)【発明者】

【氏名】カーター，カイルピアス

(72)【発明者】

【氏名】サンドゥー，サブリートカウル

(72)【発明者】

【氏名】ワーグナー，エレンキャスリーン

(72)【発明者】

【氏名】コールズ，ギャリー

(72)【発明者】

【氏名】エドガー，ロバート

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA31

4B065CA46

(57)【要約】

本開示は、新規の核酸誘導型ヌクレアーゼおよびゲノム編集のためにそのヌクレアーゼを使用する方法を提供する。本開示は、核酸誘導型ヌクレアーゼ、核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成するための異種ガイド核酸、および標的領域に結合するよう構成された編集ポリヌクレオチドを含む、ゲノム内の標的領域を編集するためのシステムをさらに提供する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作された、天然に存在しない標的化可能なヌクレアーゼシステムであって、（ａ）配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレアーゼポリペプチドを含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、および（ｂ）前記ヌクレアーゼと複合体を形成するよう設計され、ガイド配列を含む少なくとも１つの操作されたガイドポリヌクレオチドであって、前記ガイド配列が真核細胞の標的配列とハイブリダイズするよう設計されている、ガイドポリヌクレオチドを含み、（ｃ）前記ヌクレアーゼと前記ガイドポリヌクレオチドとの複合体が天然に存在しない、標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項2】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項3】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号２～２７３に対して１００％未満の配列同一性を有する、請求項２のいずれか一項に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項4】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号１２３、１１６、１４６、４３、２５４、および１７５より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項5】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号１２３、１４６、２５４、および１７５より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項6】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号８１５～８２２より選択される配列を含む、請求項５に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項7】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号８１５～８２２の配列を含む、請求項６に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項8】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号１１６および４３より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項9】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号１２３の配列を含む、請求項１に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項10】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号１１６の配列を含む、請求項１に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項11】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号１４６の配列を含む、請求項１に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項12】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号３２の配列を含む、請求項１に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項13】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号２５４の配列を含む、請求項１に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項14】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号１７５の配列を含む、請求項１に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項15】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、融合ペプチドに融合している、請求項２から１４のいずれか一項に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項16】

前記融合ペプチドが、前記ヌクレアーゼポリペプチドにインフレームで融合したシグナルペプチドである、請求項１５に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項17】

前記融合ペプチドが、前記ヌクレアーゼポリペプチドに融合した核局在化配列である、請求項１５に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項18】

前記核局在化配列が、配列番号６２８～６３１より選択される配列を有する、請求項１７に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項19】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｄｉｃｕｓ、Ａｇａｔｈｏｂａｃｔｅｒｒｅｃｔａｌｉｓ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＦａｌｋｏｗｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＦａｌｋｏｗｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＧｏｔｔｅｓｍａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＪａｃｋｓｏｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭａｇａｓａｎｉｋｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｏｒａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰａｃｅｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＲｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＲｙａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＵｈｒｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＷｉｌｄｅｒｍｕｔｈｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＹｏｎａｔｈｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｏｖｕｌｕｍｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｌｉｇｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｐｅｃｔｉｎｏｓｃｈｉｚａ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｓｐ．、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｌａｃｕｎａｔａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｏｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｓｐ．、Ｍｕｒｉｂａｃｕｌａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｔｅｓｃｉｂａｃｔｅｒｉａｇｒｏｕｐｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｂｒｅｖｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｏｐｒｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｓｉｌｉａｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｓｐ．、Ｐｒｏｌｉｘｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｘｙｌａｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｏｒｕｍ、Ｓｎｅａｔｈｉａａｍｎｉｉ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａｓｐ．を起源とする、請求項１から１８のいずれか一項に記載の標的化可能なヌクレアーゼシステム。

【請求項20】

配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドセグメントを含むポリヌクレオチド。

【請求項21】

融合ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドセグメントをさらに含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項22】

前記第１のポリヌクレオチドセグメントが、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２０から２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項23】

前記第１のポリヌクレオチドセグメントが、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項24】

前記第１のポリヌクレオチドセグメントが、配列番号７２２～７６６より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を有する、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項25】

前記第１のポリヌクレオチドセグメントが、配列番号７２２～７６６より選択される配列を有する、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項26】

配列番号７６７～８１１より選択される配列を含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項27】

前記第１のポリヌクレオチドセグメントが、細菌細胞における発現のためにコドン最適化されている、上記請求項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項28】

配列番号６３２～６７６より選択される配列を含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項29】

前記第１のポリヌクレオチドセグメントが、配列番号６７７～７２１より選択される配列を有する、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項30】

請求項２０から２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするベクター。

【請求項31】

前記核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項３０に記載のベクター。

【請求項32】

請求項２０から２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３０から３１のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項33】

核酸誘導型ヌクレアーゼを生成する方法であって、
ａ．請求項３２に記載の宿主細胞を培養するステップと、
ｂ．前記宿主細胞の培養物から前記核酸誘導型ヌクレアーゼを単離するステップと
を含む方法。

【請求項34】

真核生物または原核生物のゲノムの標的領域を改変する方法であって、
ａ．前記標的領域を含む試料を、
ｉ．配列番号２～２７３からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸誘導型ヌクレアーゼ、および
ｉｉ．前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成したガイド核酸
と接触させるステップと、
ｂ．前記核酸誘導型ヌクレアーゼに前記標的領域を改変させるステップと
を含む方法。

【請求項35】

前記接触させるステップが、前記標的領域に結合するよう構成された相同鋳型の存在下でさらに実施される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ガイド核酸が異種ガイド核酸である、請求項３４から３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記核酸誘導型ヌクレアーゼが、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｄｉｃｕｓ、Ａｇａｔｈｏｂａｃｔｅｒｒｅｃｔａｌｉｓ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＦａｌｋｏｗｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＦａｌｋｏｗｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＧｏｔｔｅｓｍａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＪａｃｋｓｏｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭａｇａｓａｎｉｋｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｏｒａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰａｃｅｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＲｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＲｙａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＵｈｒｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＷｉｌｄｅｒｍｕｔｈｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＹｏｎａｔｈｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｏｖｕｌｕｍｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｌｉｇｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｐｅｃｔｉｎｏｓｃｈｉｚａ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｓｐ．、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｌａｃｕｎａｔａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｏｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｓｐ．、Ｍｕｒｉｂａｃｕｌａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｔｅｓｃｉｂａｃｔｅｒｉａｇｒｏｕｐｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｂｒｅｖｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｏｐｒｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｓｉｌｉａｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｓｐ．、Ｐｒｏｌｉｘｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｘｙｌａｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｏｒｕｍ、Ｓｎｅａｔｈｉａａｍｎｉｉ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａｓｐ．を起源とする、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記核酸誘導型ヌクレアーゼが、配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または１００％の同一性を有する、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号１２３、１１６、１４６、４３、２５４、および１７５より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号１２３、１４６、２５４、および１７５より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号８１５～８２２より選択される配列を含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号８１５～８２２の配列を含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、配列番号１１６および４３より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項３９に記載の方法。

【請求項44】

前記ヌクレアーゼポリペプチドが、１２３、１１６、１４６、３２、２５４、２７５、および１７５より選択される配列を含む、請求項３４から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記試料が真核細胞を含む、請求項３４から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記試料が細菌細胞を含む、請求項３４から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記試料が植物細胞を含む、請求項３４から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記試料が哺乳動物細胞を含む、請求項３４から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記試料が免疫細胞を含む、請求項３４から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記免疫細胞が、Ｂ細胞またはＴ細胞である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

Ｔ細胞受容体が、前記ゲノムにおいて操作されている、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

内因性Ｔ細胞受容体が破壊されている、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

Ｔ細胞受容体が、前記ゲノムにおいて操作されており、そして内因性Ｔ細胞受容体が、破壊されている、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記相同鋳型が、前記標的領域に相補的な配列を含む、請求項３５から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記相同鋳型が、前記標的領域と比較して、挿入、欠失、または改変を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記ガイド核酸が、操作された、天然に存在しないポリヌクレオチドである、請求項３４から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ガイド核酸および前記相同鋳型が、単一のポリヌクレオチドを形成する、請求項３５から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

請求項３４から５７のいずれか一項に記載の方法によって改変されたゲノムを含む細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１．関連出願の相互参照
本出願は、その開示がこれによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１２月３１日に出願された米国仮出願第６３／１３３，０８９号の利益を主張する。

【0002】

２．配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂにより提出され、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１２月２１日に作成され、ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿２０２１１２２１．ＴＸＴの名称であり、サイズが３，７３３，２２５バイトである。

【背景技術】

【0003】

３．背景
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）－Ｃａｓ９システムは生細胞におけるゲノム配列の標的化された変更を可能にし、標的化された非相同末端接合および相同組換え修復によりｅｘｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｖｏでの遺伝子編集療法を可能にする。カノニカルＣａｓ９ヌクレアーゼファミリーに加えて、ＣａｓＸ、Ｃｐｆ１／Ｃａｓ１２ａ（ＭＡＤ７を含む）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、およびＣａｓ１３を含むさらなる核酸誘導型ヌクレアーゼファミリーが発見されている。

【0004】

しかしながら、当技術分野で利用可能なヌクレアーゼは、ゲノム工学または他の適用における使用のための大規模な精製が困難であること、およびそれらのサイズに起因する送達における課題などの制限を有する。これらは、ＰＡＭ認識配列によって課される特異性、処理能力、ゲノム編集効率、およびゲノム標的化の制限に関連する制限をさらに有する。

【0005】

したがって、Ｃａｓ９ファミリーの酵素と比較して、さらなるもしくは改善された標的化機能のおよび／または改善された機能をもたらすさらなる核酸誘導型ヌクレアーゼに対する需要が存在する。さらに、特定の適用および目的に最適なツールを選択するための選択肢をもたらすために、様々なゲノム編集ツールの開発が望まれる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

４．概要
本開示は、新規の核酸誘導型ヌクレアーゼおよびゲノム編集のためにそのヌクレアーゼを使用する方法を提供する。本明細書において提供される新たなゲノム編集ツールは、各ヌクレアーゼが、標的認識特異性および遺伝子編集効率に影響を及ぼし得る固有の特徴を有するため、ゲノム編集技術を適用する際の柔軟性を増加させることが期待される。さらに、ヌクレアーゼは、それらのゲノム編集効率および特異性に関して所望の特性を有する。これらの利益は、生物医学研究、農業、ヒト遺伝子療法、ヒト細胞療法、および診断における適用、ならびに多くの他の商業的および工業的適用にとって重要である。

【0007】

したがって、本開示の一態様は、操作された、天然に存在しない標的化可能なヌクレアーゼシステムであって、（ａ）配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレアーゼポリペプチドを含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、および（ｂ）ヌクレアーゼと複合体を形成するよう設計され、ガイド配列を含む少なくとも１つの操作されたガイドポリヌクレオチドであって、ガイド配列が真核細胞の標的配列とハイブリダイズするよう設計されている、ガイドポリヌクレオチドを含み、（ｃ）ヌクレアーゼとガイドポリヌクレオチドとの複合体が天然に存在しない、標的化可能なヌクレアーゼシステムを提供する。

【0008】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２～２７３に対して１００％未満の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１２３、１１６、１４６、４３、２５４、および１７５より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１２３、１４６、２５４、および１７５より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。

【0009】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号８１５～８２２より選択される配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号８１５～８２２の配列を含む。

【0010】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１１６および４３より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。

【0011】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１２３の配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１１６の配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４６の配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号３２の配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２５４の配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１７５の配列を含む。

【0012】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、融合ペプチドに融合している。一部の実施形態では、融合ペプチドは、ヌクレアーゼポリペプチドにインフレームで融合したシグナルペプチドである。一部の実施形態では、融合ペプチドは、ヌクレアーゼポリペプチドに融合した核局在化配列である。一部の実施形態では、核局在化配列は、配列番号６２８～６３１より選択される配列を有する。

【0013】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｄｉｃｕｓ、Ａｇａｔｈｏｂａｃｔｅｒｒｅｃｔａｌｉｓ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＦａｌｋｏｗｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＦａｌｋｏｗｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＧｏｔｔｅｓｍａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＪａｃｋｓｏｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭａｇａｓａｎｉｋｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｏｒａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰａｃｅｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＲｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＲｙａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＵｈｒｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＷｉｌｄｅｒｍｕｔｈｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＹｏｎａｔｈｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｏｖｕｌｕｍｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｌｉｇｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｐｅｃｔｉｎｏｓｃｈｉｚａ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｓｐ．、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｌａｃｕｎａｔａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｏｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｓｐ．、Ｍｕｒｉｂａｃｕｌａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｔｅｓｃｉｂａｃｔｅｒｉａｇｒｏｕｐｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｂｒｅｖｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｏｐｒｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｓｉｌｉａｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｓｐ．、Ｐｒｏｌｉｘｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｘｙｌａｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｏｒｕｍ、Ｓｎｅａｔｈｉａａｍｎｉｉ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａｓｐ．を起源とする。

【0014】

別の態様では、本開示は、配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドセグメントを含むポリヌクレオチドを提供する。

【0015】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、融合ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドセグメントをさらに含む。

【0016】

一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドセグメントは、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドセグメントは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。

【0017】

一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドセグメントは、配列番号７２２～７６６より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドセグメントは、配列番号７２２～７６６より選択される配列を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７６７～８１１より選択される配列をさらに含む。

【0018】

一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドセグメントは、細菌細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６３２～６７６より選択される配列を含む。

【0019】

一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドセグメントは、配列番号６７７～７２１より選択される配列を有する。

【0020】

さらに別の態様では、本開示は、請求項２０から２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするベクターを提供する。

【0021】

一部の実施形態では、ベクターは、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターをさらに含む。

【0022】

一態様では、本開示は、本明細書において提供されるポリヌクレオチドまたは本明細書において提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0023】

本開示の一態様は、核酸誘導型ヌクレアーゼを生成する方法であって、本明細書に記載の宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞の培養物から核酸誘導型ヌクレアーゼを単離するステップとを含む、方法を提供する。

【0024】

一態様では、本開示は、真核生物または原核生物のゲノムの標的領域を改変する方法であって、標的領域を含む試料を、配列番号２～２７３からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸誘導型ヌクレアーゼ、および核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成したガイド核酸と接触させるステップと、核酸誘導型ヌクレアーゼに標的領域を改変させるステップとを含む、方法を提供する。

【0025】

一部の実施形態では、接触させるステップは、標的領域に結合するよう構成された相同鋳型の存在下でさらに実施される。

【0026】

一部の実施形態では、ガイド核酸は、異種ガイド核酸である。

【0027】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｄｉｃｕｓ、Ａｇａｔｈｏｂａｃｔｅｒｒｅｃｔａｌｉｓ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＦａｌｋｏｗｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＦａｌｋｏｗｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＧｏｔｔｅｓｍａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＪａｃｋｓｏｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭａｇａｓａｎｉｋｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｏｒａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰａｃｅｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＲｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＲｙａｎｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＵｈｒｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＷｉｌｄｅｒｍｕｔｈｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＹｏｎａｔｈｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｏｖｕｌｕｍｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｌｉｇｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｐｅｃｔｉｎｏｓｃｈｉｚａ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｓｐ．、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｌａｃｕｎａｔａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｏｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｓｐ．、Ｍｕｒｉｂａｃｕｌａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｔｅｓｃｉｂａｃｔｅｒｉａｇｒｏｕｐｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｂｒｅｖｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｏｐｒｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｓｉｌｉａｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｓｐ．、Ｐｒｏｌｉｘｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｘｙｌａｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｏｒｕｍ、Ｓｎｅａｔｈｉａａｍｎｉｉ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａｓｐ．を起源とする。

【0028】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１２３、１１６、１４６、４３、２５４、および１７５より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１２３、１４６、２５４、および１７５より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。

【0029】

【0030】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１１６および４３より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、１２３、１１６、１４６、３２、２５４、２７５、および１７５より選択される配列を含む。

【0031】

一部の実施形態では、試料は真核細胞を含む。一部の実施形態では、試料は細菌細胞を含む。一部の実施形態では、試料は植物細胞を含む。一部の実施形態では、試料は哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、試料は免疫細胞を含む。一部の実施形態では、免疫細胞はＢ細胞またはＴ細胞である。

【0032】

一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ゲノムにおいて操作されている。一部の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体は破壊されている。一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ゲノムにおいて操作されており、そして内因性Ｔ細胞受容体は、破壊されている。

【0033】

一部の実施形態では、相同鋳型は、標的領域に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、相同鋳型は、標的領域と比較して、挿入、欠失、または改変を含む。

【0034】

一部の実施形態では、ガイド核酸は、操作された、天然に存在しないポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイド核酸および相同鋳型は、単一のポリヌクレオチドを形成する。

【0035】

別の態様では、本開示は、本開示の方法によって改変されたゲノムを含む細胞、組織または生物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0036】

５．図面の簡単な説明

【図1】図１。ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋのデータベースの１３４，６５５個の原核生物ゲノムの配列検索において同定した、本発明者らが「ＧＩＧ－」ヌクレアーゼまたは「ＧＩＧ－」酵素と呼ぶ、新規Ｃａｓ酵素（配列番号２～２７３）に関して、ＭＡＤ７に対するアミノ酸パーセント同一性を示すヒストグラム。

【0037】

【図2】図２。ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋデータベースの１３４，６５５個の原核生物ゲノムの配列検索において同定した新規ＧＩＧ－Ｃａｓ酵素（配列番号２～２７３）間の関係を示す配列ツリー。

【0038】

【図3】図３。ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋデータベースの１３４，６５５個の原核生物ゲノムの配列検索において同定した新規ＧＩＧ－Ｃａｓ酵素（配列番号２～２７３）のゲノム近傍におけるｃｒＲＮＡＣＲＩＳＰＲリピート（配列番号２７４～６２７）をまとめた配列ロゴ。

【0039】

【図4】図４。ｉｎｖｉｔｒｏでの転写および翻訳に関するＴ７ｐ１４ＤＮＡ構築物のベクターマップ（配列番号８１４）。

【0040】

【図5-1】図５Ａ～５Ｃ。ｉｎｖｉｔｒｏでのＧＦＰレポーターアッセイによる新規ＧＩＧ－Ｃａｓ酵素の機能評価。図５Ａ：ＧＩＧ－１（配列番号１２３）およびＧＩＧ－２（配列番号４３）；図５Ｂ：ＧＩＧ－４（配列番号２５４）およびＧＩＧ－５（配列番号２８）；図５Ｃ：ＧＩＧ－３（配列番号７９）。横軸：インキュベーション時間、各サイクルは合計１８時間の１０分に相当する。縦軸：ＧＦＰ相対蛍光シグナル（それぞれ励起／発光：４８５／５２０ｎｍ）。

【図5-2】同上。

【図5-3】同上。

【0041】

【図6】図６。Maxwell et al.(Methods, 2018)のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングシステムを使用して同定したＧＩＧ－Ｃａｓ酵素のＰＡＭ活性のヒートマップ。

【0042】

【図7-1】図７Ａ～７Ｄ。Maxwell et al.(Methods, 2018)のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングシステムを使用して同定した新規ＧＩＧまたは他のＣａｓ酵素と共に機能するＰＡＭ配列モチーフ。

【図7-2】同上。

【図7-3】同上。

【図7-4】同上。

【0043】

【図8】図８。細菌発現のためのｐＥＴ２１構築物のベクターマップ（配列番号８１２）。

【0044】

【図9】図９。精製した組換えＧＩＧヌクレアーゼ（ＧＩＧ－１、ＧＩＧ－２、ＧＩＧ－５、ＧＩＧ－１０、ＧＩＧ－１２、ＧＩＧ－１５、ＧＩＧ－１６、およびＧＩＧ－１７）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。各タンパク質１μｇを４～２０％のゲルにロードした。（Ｈ）Ｈｉｓ精製によって試料を精製した；（Ｃ）Ｈｉｓ精製の後に試料をＣＥＸ精製した。

【0045】

【図10-1】図１０Ａ～１０Ｃ。ＨｉｓおよびＣＥＸ精製の後に精製したＧＩＧ－Ｃａｓヌクレアーゼ（ＧＩＧ－１、ＧＩＧ－２、ＧＩＧ－５、ＧＩＧ－１０、ＧＩＧ－１２、ＧＩＧ－１５、ＧＩＧ－１６、およびＧＩＧ－１７）のＳＥ－ＨＰＬＣ解析。図１０Ａ：ＡｓＣａｓ１２ａ、ＭＡＤ７、ＧＩＧ－１およびＧＩＧ－２；図１０Ｂ：ＧＩＧ－５、ＧＩＧ－１０、ＧＩＧ－１２およびＧＩＧ－１５；図１０Ｃ：ＧＩＧ－１６およびＧＩＧ－１７。

【図10-2】同上。

【図10-3】同上。

【0046】

【図11】図１１。Ｊｕｒｋａｔ細胞のヒトＴＲＡＣ遺伝子座における選択されたＧＩＧヌクレアーゼのノックダウン効率およびＨＤＲ効率。表示したヌクレアーゼおよびＴＲＡＣ標的化ｓｇＲＮＡからなるＲＮＰ（ＧＲ－３１、ＧＲ－４０、およびＧＲ－４２）を細胞に電気穿孔した。陰性対照として、ＡｓＣａｓ１２ａおよびスクランブルｓｇＲＮＡからなるＲＮＰも電気穿孔した。さらに、ＧＦＰ発現のための相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型も各試料に電気穿孔した。細胞をＣＤ３およびＴＣＲαβに対する蛍光コンジュゲート抗体で染色し、電気穿孔の５日後にフローサイトメトリーによって解析した。ノックダウン効率が高いほど、ＣＤ３およびＴＣＲαβの発現レベルが低いことを示す。ＨＤＲ鋳型の組込みに成功した細胞はＧＦＰを発現する。

【0047】

【図12】図１２。Ｊｕｒｋａｔ細胞のヒトＴＲＡＣ遺伝子座における選択されたＧＩＧヌクレアーゼのノックダウン効率およびＨＤＲ効率。ＧＦＰ発現のためのＨＤＲ鋳型だけでなく、表示したヌクレアーゼおよびＴＲＡＣ標的化ｓｇＲＮＡからなるＲＮＰを細胞に電気穿孔した。陰性対照として、ＨＤＲ鋳型を用いずにＲＮＰを電気穿孔した。細胞をＣＤ３およびＴＣＲαβに対する蛍光コンジュゲート抗体で染色し、電気穿孔の５日後にフローサイトメトリーによって解析した。ノックダウン効率が高いほど、ＣＤ３およびＴＣＲαβの発現レベルが低いことを示す。ＨＤＲ鋳型の組込みに成功した細胞はＧＦＰを発現する。

【0048】

【図13】図１３。Ｊｕｒｋａｔ細胞のヒトＢ２Ｍ遺伝子座におけるＡｓＣａｓ１２ａおよびＧＩＧ－１７ヌクレアーゼのノックダウン効率。表示したヌクレアーゼおよび３つの固有のＢ２Ｍ標的化ｓｇＲＮＡからなるＲＮＰ（ＧＲ－４４、ＧＲ－４５、ＧＲ－４６）を細胞に電気穿孔した。細胞をＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃに対する蛍光コンジュゲート抗体で染色し、電気穿孔の５日後にフローサイトメトリーによって解析した。ノックダウン効率が高いほど、Ｂ２Ｍ欠損細胞のレベルが高いことを示す。

【0049】

【図14】図１４。Ｔ２細胞のヒトＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子座におけるＡｓＣａｓ１２ａおよびＧＩＧ－１７ヌクレアーゼのノックダウン効率。表示したヌクレアーゼおよび３つの固有のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１標的化ｓｇＲＮＡからなるＲＮＰ（ＧＲ－７１、ＧＲ－７２またはＧＲ－７３）を細胞に電気穿孔した。細胞をＨＬＡ－Ａ２に対する蛍光コンジュゲート抗体で染色し、電気穿孔の５日後にフローサイトメトリーによって解析した。ノックダウン効率が高いほど、ＨＬＡ－Ａ２欠損細胞のレベルが高いことを示す。

【0050】

【図15】図１５。哺乳動物での発現のためのｐＲｅｃｅｉｖｅｒレンチウイルス構築物（配列番号８１３）のベクターマップ。

【0051】

図面は、例示のためだけに本発明の様々な実施形態を示す。当業者は、本明細書で例示された構造および方法の代替の実施形態を本明細書に記載の発明の原理から逸脱することなく用いることができることを、以下の議論から容易に認識するであろう。

【発明を実施するための形態】

【0052】

６．詳細な説明
６．１．定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明に関する技術分野における当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、それぞれ以下の意味を有する。

【0053】

「異種ガイド核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成して、天然には存在しないリボ核酸粒子（ＲＮＰ）を形成することが可能であるガイド核酸を指す。

【0054】

「適合性の」という用語は、本明細書で使用される場合、複合体を形成して、標的化されたヌクレアーゼ複合体として機能するＲＮＰを形成することが可能であるガイド核酸および核酸誘導型ヌクレアーゼを指す。

【0055】

「バリアント」または「変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在するものから逸脱する質を示す生体物質（例えば、タンパク質、ポリヌクレオチドなど）を指す。例えば、バリアントまたは変異体は、野生型ポリペプチドから、１つもしくは複数のアミノ酸の変異を有するか、または１つもしくは複数のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換を含有するポリペプチドであり得る。

【0056】

「ｃｒＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」および「ガイドＲＮＡ」という用語は、他に、例えばＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７に記載されているように、互換的に使用される。一般に、ｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有して、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指示するポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列の間の相補性の度合いは、約５０％もしくはそれより高い、約６０％もしくはそれより高い、約７０％もしくはそれより高い、約８０％もしくはそれより高い、約９０％もしくはそれより高い、約９５％もしくはそれより高い、約９９％もしくはそれより高い、またはそれらのパーセンテージを超えるパーセンテージである。

【0057】

本発明の実施では、別段に示されていない限り、当業者にとって周知である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、組換えＤＮＡの従来技術を用いる。Green and Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), CurrentProtocols in Molecular Biology (Ausubel, et al., eds.), Antibodies: aLaboratory Manual (Harlow & Taylor, eds.)を参照されたい。

【0058】

６．２．他の解釈についての慣習
本明細書に列挙された範囲は、列挙された終点を含み、その範囲内の値のすべてに対する省略表現であることが理解される。例えば、１～５０という範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０からなる群に由来する任意の数、数の組合せ、または下位範囲を含むことが理解される。

【0059】

６．３．核酸誘導型ヌクレアーゼ
第１の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼが提供される。ヌクレアーゼは、原核細胞および真核細胞において機能的であり、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ、およびｉｎｖｉｖｏでのゲノム編集適用に対して有用である。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは天然に存在する。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、天然に存在しない。ある特定の実施形態では、天然に存在しないヌクレアーゼは、操作されたヌクレアーゼである。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは精製タンパク質である。

【0060】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸を含む「標的化可能なヌクレアーゼシステム」の一部である。標的化可能なヌクレアーゼシステムを使用して、「標的配列」と呼ばれることが多い標的ポリヌクレオチド配列を結合、切断、改変および／または編集することができる。本明細書に記載の方法、システム、ベクター、ポリヌクレオチド、および組成物は、タンパク質などの遺伝子産物の合成、ポリヌクレオチドの切断、ポリヌクレオチドの編集、ポリヌクレオチドのスプライシング、標的ポリヌクレオチドの輸送、標的ポリヌクレオチドの単離、標的ポリヌクレオチドの可視化などを変更または改変することを含む様々な適用で使用されてよい。本発明の態様は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏ、またはｅｘｖｉｖｏで原核細胞、古細菌細胞、または真核細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更または操作することとして定義される「ゲノム工学」における、本明細書に記載の組成物およびシステムの方法および使用も含む。例えば、核酸誘導型ヌクレアーゼの使用については、参照により全体として本明細書に組み込まれるＵＳ１０，０１１，８４９に記載されている。

【0061】

６．３．１．ヌクレアーゼ
本開示は、新規の天然に存在するおよび天然に存在しない核酸誘導型ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、好適な核酸誘導型ヌクレアーゼは、以下を含むがこれらに限定されない属に由来する生物から得られる：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ、Ｌｉｍｉｈａｌｏｇｌｏｂｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｔｅｎｏｖｕｌｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ、およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｓｉｌｉａ。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼのバリアントまたは改変である。

【0062】

一部の実施形態では、新規ヌクレアーゼは、任意の以前に開示されたＣｐｆ１、Ｃａｓ１２ａ、およびＭＡＤ７酵素に対する９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２０％未満の配列同一性を含む。さらに、本明細書において提供されるヌクレアーゼは、当技術分野で公知のＣｐｆ１、Ｃａｓ１２ａ、およびＭＡＤ７酵素とは異なる。例えば、本開示のエンドヌクレアーゼは、ＵＳ９７９０４９０Ｂ２に開示された配列と異なる配列を有する。一部の実施形態では、本開示の新規ヌクレアーゼは、ＵＳ９７９０４９０Ｂ２に開示された配列のいずれかに対する９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、または４０％未満の配列同一性を含む。ＵＳ９７９０４９０Ｂ２およびそこに開示された配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0063】

「オルソログ」または「ホモログ」という用語は、本明細書で使用される場合、好適な配列アライメントアルゴリズムを用いてアライメントされた場合に、少なくとも８０％、または好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を有するタンパク質を指す。平均して、本明細書において報告された新規ヌクレアーゼは、以前に報告されたサブタイプＶ－ＡのＣｐｆ１配列（ＵＳ９７９０４９０Ｂ２を参照されたい）に対して約３８％の配列同一性のみを有する（図１）。よって、本開示において報告されたほとんどのヌクレアーゼは、以前より知られているホモログを有さない。

【0064】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ファミリーｃａｓ１、ｃａｓ２、およびｃｐｆ１より選択される遺伝子に関する細菌ゲノムの遺伝子座ならびにＣＲＩＳＰＲアレイから得られる。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１またはＣｐｆ１様ペプチド配列は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｍｅｎａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｍａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属の生物を起源とする。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１またはＣｐｆ１様ペプチド配列は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｍｅｎａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｍａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属以外の生物を起源とする。

【0065】

一部の実施形態では、本開示の核酸誘導型ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼポリペプチドを含む。ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２～２７３より選択される配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２～２７３より選択される配列に対して１００％未満の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１２３、１１６、１４６、４３、２５４、および１７５より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。

【0066】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター１内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１８８、２０４、２２１、２５６、２４０、２３３、１８９、２０２、１８５、２４７、１９１、２０１、２４６、８１、８３、２４３、８８、２５８、２２３、１３１、２１４、２２６、８５、２３１、７９、８０、２１７、２３８、８７、２５４、２４８、２４１、２４２、６５、９４、９５、１４３、１７６、１７、１６９、１６５、１６０、１７２、１５７、１６６、１６３、１０、１６、１２２、１２６、１３９、１４４、１４５、２３、１５５、１２３、１３７、１３８、１８、４８、１２５、１２７、１２８、１３５、１３６、１５０、１５３、１、５９、１５、１３４、１７１、３２、１７５、１８４、１５９、１５６、１９９、１４７、１４６、１４９、１５４、１４８、１９８、６０、１２０、１９、１９７、１６１、１７３、１７４、５０、４９、１９６、５、１３０、３、２００、７４、９７、１７７、３３、４１、および８６より選択される配列を含む。

【0067】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター２内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２２８、２３６、および８より選択される配列を含む。

【0068】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター３内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２４５および２７２より選択される配列を含む。

【0069】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター４内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１０１、１０２、６９、２１２、２５５、２３７、２０７、２１６、２３５、２２７、２２９、７０、１０５、および１７０より選択される配列を含む。

【0070】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター５内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１１０、１１３、１１１、７３、６６、５４、５５、１１２、７５、１０６、１０９、１０８、５３、１１８、１００、１０３、１１４、５６、６７、および１６２より選択される配列を含む。

【0071】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター６内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１０４、１０７、２６０、２５３、９１、９９、９２、２６２、および２７１より選択される配列を含む。

【0072】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター７内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２６９、２２０、２２５、２６６、および１８６より選択される配列を含む。

【0073】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター８内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１９４、２０３、１１５、２１１、２７３、および２４９より選択される配列を含む。

【0074】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター９内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１３２、１３３、１２４、１５２、１５１、７２、２０６、２４、２５、６８、１９５、２３２、３０、１２、１８２、２５２、２５９、２２２、２５１、１９０、２０９、２３９、２５０、１９２、２０５、７１、７６、２１５、９３、２６４、２０８、２６７、１８３、２６５、１９３、２１０、８９、２６３、２６８、２７０、２１３、２２４、２１８、２５７、３６、１７８、１８７、および２４４より選択される配列を含む。

【0075】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター１０内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１５８、２３０、２３４、１４０、１６４、１４２、１４１、１８０、７７、７８、１６７、１３、３５、および１７９より選択される配列を含む。

【0076】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター１１内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号６２、１２１、６１、８２、４、２９、３９、１１７、５８、５７、４０、２７、７、６、３１、９、２８、３８、３７、２６、３４、１２９、９６、１８１、１６８、４７、２６１、２、４６、２２、６３、４２、４４、４３、４５、２０、５１、５２、６４、１１、８４、１１６、２１、１４、および１１９より選択される配列を含む。

【0077】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター１２内にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２１９および９０より選択される配列を含む。

【0078】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター３、４、５、６、７、８、９、または１０内にある。

【0079】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター１内にない。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター２内にない。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター３、４、５、６、７、８、９、または１０内にない。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、実施例１および図２に記載のクラスター１１内にない。

【0080】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、進化的に関連していると推定されるヌクレアーゼの複数の配列アライメントによって同定された保存ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、クラスター１の保存ペプチド配列（配列番号８１５～８２２）のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、クラスター４の保存ペプチド配列（配列番号８２３～８３２）のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、クラスター６の保存ペプチド配列（配列番号８３３）を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、クラスター７の保存ペプチド配列（配列番号８３４）を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、クラスター９の保存ペプチド配列（配列番号８３５～８４０）のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチド保存ペプチド配列は、クラスター１０のコンセンサス配列（配列番号８４１～８４４）のうちの１つまたは複数を含む。

【0081】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、クラスター１のコンセンサス配列（配列番号８１５～８２２）のすべてを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、クラスター４のコンセンサス配列（配列番号８２３～８３２）のすべてを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、クラスター９のコンセンサス配列（配列番号８３５～８４０）のすべてを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、クラスター１０のコンセンサス配列（配列番号８４１～８４４）のすべてを含む。

【0082】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１２３に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１２３の配列を含む。

【0083】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１１６に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１１６の配列を含む。

【0084】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４６に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４６の配列を含む。

【0085】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号３２に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号３２の配列を含む。

【0086】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２５４に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２５４の配列を含む。

【0087】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１７５に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１７５の配列を含む。

【0088】

一部の実施形態では、ポリペプチドは、特定の機能的特性について天然配列から操作される。一部の実施形態では、これらの操作されたポリペプチドは、天然配列に対して９９％、９５％、９０％、７５％、または５０％の配列同一性を有する。

【0089】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１～２７３より選択される配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１～２７３より選択される配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１～２７３より選択される配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１～２７３より選択される配列に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１～２７３より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１～２７３より選択される配列に対して少なくとも９４％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１～２７３より選択される配列に対して少なくとも９３％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１～２７３より選択される配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１～２７３より選択される配列に対して少なくとも９１％の配列同一性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１～２７３より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドである。

【0090】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは組換えタンパク質である。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、コドン最適化ポリヌクレオチドから発現される。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、細胞培養物から発現される。

【0091】

６．３．２．操作されたヌクレアーゼ
一部の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼが使用される。一部の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼは、化学的または生物学的に改変される。一部の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼは、宿主細胞からの発現を増加させる、ヒトまたは哺乳動物のコドンのために最適化する（参照により組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７を参照されたい）、タンパク質の安定性を増加させる、その遺伝子編集効率を増加させる、オフターゲット特異性を低下させる、またはＰＡＭ配列特異性を変化させるように改変される。一部の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼは、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで所望の標的化のために改変される。

【0092】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼの機能の変化に関連する以前に記載された１つまたは複数の改変は、本明細書に記載のヌクレアーゼに導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数の変異または改変は、触媒ドメインでなされる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの触媒活性は、ＤＮＡ結合活性が保持されるが、ヌクレアーゼの酵素機能は低減または破壊されるように、低減または破壊される。一部の実施形態では、不活性化ヌクレアーゼは、１つまたは複数の機能的ドメイン、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性（transcription release factor activity）、ヒストン改変活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、エキソヌクレアーゼ活性、一塩基編集活性、リコンビナーゼ活性、インテグラーゼ活性、逆転写活性、または分子スイッチを有する機能的ドメインに融合している。本明細書におけるタンパク質の「機能的バリアント」は、タンパク質の少なくとも部分的な活性を保持するこのようなタンパク質のバリアントを指す。一部の実施形態では、本出願の操作されたヌクレアーゼは、本出願において開示された天然に存在するヌクレアーゼの機能的バリアントを含む。機能的バリアントは、常にホモログであるわけではない。

【0093】

一部の実施形態では、特異性を改善または低下させるために、変異誘発のための主要な残基は、ヌクレアーゼのＲｕｖＣドメイン内にある。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Slaymaker et al., 2015, "Rationally engineered Cas9 nucleaseswith improved specificity"を参照されたい。一部の実施形態では、変異体は、例えば、ＰＡＭ特異性を変更する変異を選択し、これらの変異をオンターゲット対オフターゲット配列に対する特異性を増加させる（または低下させる）ｎｔ溝変異と組み合わせることによって、ＰＡＭ認識における改変を収容するように設計される。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレアーゼのＰＡＭ認識部位を異なるヌクレアーゼのＰＡＭ認識部位で置換して、そのＰＡＭ特異性を変化させることができる。

【0094】

一部の実施形態では、変異は、ＲＥＣｌｏｂ、ＲＥＣ１ドメイン、ＲＥＣ２ドメイン、Ｎｕｃローブ、ＰＡＭ相互作用ドメイン、ＷＥＤドメイン、および／またはブリッジヘリックス（ＢＨ）に対して特異的になされる。例えば、Paul & Montoya, Biomedical Journal, 43(1): 8-17を参照されたい。

【0095】

一部の実施形態では、変異は、正もしくは負に荷電しているか、疎水性もしくは親水性であるか、ヌクレアーゼの構造溝もしくは他の構造的構成成分に位置しているか、任意の残基をアラニン残基で置換するか、または極性もしくは非極性であるアミノ酸の改変を含む。

【0096】

一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、本明細書に列挙された任意の数の酵素の融合体または本明細書に列挙された酵素と任意の他のＣａｓ酵素との融合体である。操作されたヌクレアーゼは、本明細書に列挙された酵素のいずれかとの９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、または３０％の配列同一性を含み得る。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、本明細書に記載の天然に存在するヌクレアーゼの断片を含む。一部の実施形態では、融合体は、本明細書に記載のヌクレアーゼの１つまたは複数の機能的ドメインを置換することによって作製される。

【0097】

一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、表２の非保存配列を改変することによって生成される。ある特定の実施形態では、クラスター１（表２）からの任意のヌクレアーゼを、アミノ酸６３０～６５２、８９１～９０１、９１５～９３１、１０３４～１０５４、１０５８～１０６３、１２１７～１２２９、１２９９～１３０７、１３０８～１３３５、および１５８８～１５８９の外側の１つまたは複数のアミノ酸位置で変異させる。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、クラスター１の保存配列（配列番号８１５～８２２）を含む。

【0098】

ある特定の実施形態では、クラスター４からの任意のヌクレアーゼを、アミノ酸９２～９９、１０６～１１１、１１３～１５２、２２３～２３９、２９１～３０３、３９６～４０４、４０９～４２１、７３１～７９１、または８１６～８７４の外側の１つまたは複数のアミノ酸位置で改変する。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、クラスター４の保存配列（配列番号８２３～８３２）を含む。

【0099】

ある特定の実施形態では、クラスター６の任意のヌクレアーゼを、アミノ酸位置１１２０～１１２６を含むアミノ酸位置の外側で変異させる。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、クラスター６の保存配列（配列番号８３３）を含む。

【0100】

ある特定の実施形態では、クラスター７の任意のヌクレアーゼを、アミノ酸６００～６５４の外側の１つまたは複数のアミノ酸位置において変異させる。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、クラスター７の保存配列（配列番号８３４）を含む。

【0101】

ある特定の実施形態では、クラスター９からの任意のヌクレアーゼを、アミノ酸４９２～５０１、５９６～６２５、６８５～６９５、６９７～７０７、８４１～８９１、または１１９１～１２２７を含むアミノ酸位置の外側で変異させる。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、クラスター９の保存配列（配列番号８３５～８４０）を含む。

【0102】

ある特定の実施形態では、クラスター１０の任意のヌクレアーゼを、アミノ酸１５９～２１５、６３０～６５５、８６８～８７９、または１０５２～１０７６の外側の１つまたは複数のアミノ酸位置において変異させる。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、クラスター１０の保存配列（配列番号８４１～８４４）を含む。

【0103】

本発明のある特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、多様なヌクレアーゼに存在する保存配列を含む融合タンパク質、例えば、クラスター４からの保存アミノ酸配列と融合したクラスター１からの保存アミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、保存配列を同定し、変異させる以外の方法を使用して、例えば、機能的ドメインを同定するために３Ｄ構造を作製する、機械学習を使用して機能的ドメインを同定する、および／または大規模もしくは小規模変異誘発スクリーニングと、その後にｉｎｖｉｖｏもしくはｉｎｖｉｔｒｏでバリアントの機能的解析を行う方法を使用して、ヌクレアーゼ機能を変更する。

【0104】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、細菌または哺乳動物の発現構築物から発現され、組換えタンパク質または精製タンパク質として評価される。一部の実施形態では、機能性は、ＤＮＡ二本鎖切断を生じる能力ならびに細胞におけるインデル（挿入および欠失）変異および機能喪失（ＬＯＦ）変異の誘導を検査することによって決定される。一部の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、ガイド核酸を各核酸誘導型ヌクレアーゼと共にインキュベートすることによって生成される。特定の一実施形態では、ＲＮＰ複合体は、３７５ｐｍｏｌのガイド核酸を５０ｐｍｏｌの各核酸誘導型ヌクレアーゼと共に１０分間インキュベートすることによって生成される。一部の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、電気穿孔またはヌクレオフェクションを使用して細胞内に導入され、切断効率は、目的の遺伝子に切断部位を含有するＰＣＲアンプリコンに関してサンガーシーケンシングおよびＩＣＥ（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓ、Ｓｙｎｔｈｅｇｏからのオンラインツール）解析を実施することによって、編集された集団における挿入／欠失変異の頻度を定量することによって測定される。一部の実施形態では、ＬＯＦ変異の成功裏の生成は、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡを使用して、標的化された遺伝子のタンパク質発現レベルを測定することによって確認される。

【0105】

６．３．３．シグナルペプチド融合体
一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、融合ペプチドに融合している。実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、（１）ヌクレアーゼポリペプチドおよび（２）融合ペプチドを含む。融合ペプチドは、シグナルペプチドであり得る。シグナルペプチドは、ヌクレアーゼポリペプチドにインフレームで融合した原核生物または真核生物のシグナルペプチドであり得る。融合ペプチドは、ヌクレアーゼポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。融合ペプチドは、ヌクレアーゼポリペプチドの中央に融合され得る。一部の実施形態では、融合ペプチドは、レポータータンパク質またはエンドヌクレアーゼポリペプチドの精製用タグである。一部の実施形態では、融合ペプチドは、転写活性化、転写抑制、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基編集、リコンビナーゼ／インテグラーゼ活性、およびニッカーゼ活性を含むさらなる機能的属性を提供する。

【0106】

一部の実施形態では、融合ペプチドはシグナルペプチドである。

【0107】

一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ヌクレアーゼポリペプチドのＣ末端にインフレームで融合している。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ヌクレアーゼポリペプチドのＮ末端にインフレームで融合している。

【0108】

ＮＬＳ融合体
一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多くのＮＬＳに融合している。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、アミノ末端もしくはその付近に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、もしくはそれよりも多くのＮＬＳ、カルボキシ末端もしくはその付近に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、もしくはそれよりも多くのＮＬＳ、またはこれらの組合せを含む（例えば、アミノ末端に１つまたは複数のＮＬＳ、およびカルボキシ末端に１つまたは複数のＮＬＳ）。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれを他のＮＬＳとは独立に選択することができ、その結果、単一のＮＬＳが２つ以上のコピーで、および／または１つもしくは複数のコピーで存在する１つもしくは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在してもよい。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近くのアミノ酸がポリペプチド鎖に沿ってＮまたはＣ末端から約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸、またはそれよりも多くのアミノ酸以内にある場合、ＮまたはＣ末端の付近に存在すると考えられる。

【0109】

一部の実施形態では、単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳと呼ばれるＮＬＳ（ＳＶ４０ラージＴ抗原からのＰＫＫＫＲＫＶ、ｃ－ＭｙｃからのＰＡＡＫＲＶＫＬＤ、またはＴＵＳタンパク質からのＫＬＫＩＫＲＰＶＫ）は、ヌクレアーゼポリペプチドのＮまたはＣ末端に融合している。一部の実施形態では、双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）またはヌクレオプラスミンＮＬＳと呼ばれるＮＬＳ（ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ）は、ＮまたはＣ末端に融合している。

【0110】

一部の実施形態では、ＮＬＳと融合したヌクレアーゼ酵素は、融合酵素を細胞、例えば、哺乳動物の細胞の核への輸送を必要とする適用に使用される。融合酵素は、そこで、細胞のゲノムを操作するために使用される。

【0111】

機能的融合体
一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、転写活性化ドメインに融合している。転写活性化ドメインは、ヌクレアーゼポリペプチドのＮまたはＣ末端に融合され得る。融合は、直接的であってもリンカーを介してもよい。融合した転写活性化ドメインは、転写開始前複合体を遺伝子のプロモーターに動員し、ＲＮＡポリメラーゼ媒介型の発現をもたらす。一部の実施形態では、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６タンパク質、核因子カッパＢ、６５ｋＤａのサブユニット（ｐ６５）、Ｒｔａ（エプスタイン－バーウイルスＲのトランスアクチベーター）であるかまたはそのバリアントであり、一部の実施形態では、同じタイプの複数のドメインまたは組合せが含まれる。

【0112】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、ＵＤＧ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合している。ＵＧＩドメインは、ヌクレアーゼポリペプチドのＮまたはＣ末端に融合され得る。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼポリペプチドのＣ末端に融合している。融合は、直接的であってもリンカーを介してもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、ヌクレアーゼポリペプチドのＮ末端のデアミナーゼドメイン、およびＣ末端のＵＧＩドメインに融合している。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、ＤＮＡ内に意図せず存在するウラシルを認識し、ウラシルとデオキシリボース糖の間のＮ－グリコシド結合を切断し、ウラシルを放出し、塩基性部位（ＡＰ部位）を残すことによって、ウラシル切除修復経路を開始する。一部の実施形態では、ＵＧＩドメインは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのバクテリオファージＰＢＳ１またはＰＢＳ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１４７３９）由来のＵＧＩであるかまたはそのバリアントである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドは、二本鎖切断修復選択に関与する因子に融合している（例えば、ＣｔｌＰ、Ｍｒｅ１１、およびＤＮ１ｓという名称のｐ５３の短縮された小片）。

【0113】

６．４．ガイド核酸
好ましい実施形態では、ガイド核酸は、適合性核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成する。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、異種ガイド核酸と一緒に使用される。

【0114】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよび異種ガイド核酸は、２つの異なる種を起源とする。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよび異種ガイド核酸は、同じ種を起源とする。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよび異種ガイド核酸は、同じ種を起源とするが、自然界では同じ細胞内に存在しない。

【0115】

核酸誘導型ヌクレアーゼとガイド核酸の適合性は、実証的試験によって決定することができる。異種ガイド核酸は、異なる細菌種に由来しても、または天然に存在しなくても、合成であっても操作されていてもよい。

【0116】

一部の実施形態では、ガイド核酸はＤＮＡである。一部の実施形態では、ガイド核酸はＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイド核酸は、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含む。一部の実施形態では、ガイド核酸は、天然に存在しないヌクレオチドを含む。ガイド核酸がＲＮＡを含む場合、ＲＮＡガイド核酸は、ＤＮＡ配列によってコードされ得る。

【0117】

一部の実施形態では、ガイド核酸は、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイド核酸は、標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列、および核酸誘導型ヌクレアーゼと相互作用するかまたはそれと複合体を形成することが可能な足場配列を含む。一部の実施形態では、ガイド配列および足場配列は、単一のポリヌクレオチド内に存在する。一部の実施形態では、ガイド配列および足場配列は、２つまたはそれよりも多くの別々のポリヌクレオチド内に存在する。

【0118】

ガイド核酸は、足場配列を含み得る。一般に、「足場配列」は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成を促進する配列を有する任意の配列を含み、ここで、ＲＮＰは、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸を含む。一部の実施形態では、足場配列は、足場配列内の２つの配列領域、例えば、二次構造の形成に関与する１つまたは２つの配列領域の長さに沿って相補性を有することによって、ＲＮＰの形成を促進する。一部の場合には、１つまたは２つの配列領域は、同じポリヌクレオチドに存在する。一部の場合には、１つまたは２つの配列領域は、別々のポリヌクレオチドに存在する。最適なアライメントは、任意の好適なアライメントアルゴリズムによって決定されてもよく、１つまたは２つの配列領域内のいずれかにおける自己相補性などの二次構造をさらに占めてもよい。一部の実施形態では、最適にアライメントした場合の２つのうちの短い方の長さに沿った１つまたは２つの配列領域間の相補性の度合いは、約２５％もしくはそれより高い、約３０％もしくはそれより高い、約４０％もしくはそれより高い、約５０％もしくはそれより高い、約６０％もしくはそれより高い、約７０％もしくはそれより高い、約８０％もしくはそれより高い、約９０％もしくはそれより高い、約９５％もしくはそれより高い、約９７．５％もしくはそれより高い、約９９％もしくはそれより高い、またはそれより高いパーセンテージである。一部の実施形態では、２つの配列領域の少なくとも１つは、約５もしくはそれより長い、約６もしくはそれより長い、約７もしくはそれより長い、約８もしくはそれより長い、約９もしくはそれより長い、約１０もしくはそれより長い、約１１もしくはそれより長い、約１２もしくはそれより長い、約１３もしくはそれより長い、約１４もしくはそれより長い、約１５もしくはそれより長い、約１６もしくはそれより長い、約１７もしくはそれより長い、約１８もしくはそれより長い、約１９もしくはそれより長い、約２０もしくはそれより長い、約２５もしくはそれより長い、約３０もしくはそれより長い、約４０もしくはそれより長い、約５０もしくはそれより長い、またはそれを超えるヌクレオチド長である。

【0119】

一部の実施形態では、ガイド核酸の足場配列は、二次構造を含む。二次構造は、シュードノット領域を含み得る。一部の場合には、ガイド核酸の核酸誘導型ヌクレアーゼに対する結合動態は、足場配列内の二次構造によって部分的に決定される。一部の場合には、ガイド核酸の核酸誘導型ヌクレアーゼに対する結合動態は、足場配列を含む核酸配列によって部分的に決定される。

【0120】

一部の実施形態では、ガイド核酸は、ガイド配列（すなわち、スペーサー配列）を含む。ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有して、標的配列とハイブリダイズし、複合体を形成した核酸誘導型ヌクレアーゼの標的配列への配列特異的結合を指示するポリヌクレオチド配列である。ガイド配列とその対応する標的配列の間の相補性の度合いは、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントされた場合に、約５０％もしくはそれより高い、約６０％もしくはそれより高い、約７５％もしくはそれより高い、約８０％もしくはそれより高い、約８５％もしくはそれより高い、約９０％もしくはそれより高い、約９５％もしくはそれより高い、約９７．５％もしくはそれより高い、約９９％またはそれより高いパーセンテージであってもよい。最適なアライメントは、配列をアライメントするのに好適な任意のアルゴリズムの使用によって決定することができる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５もしくはそれより長い、約１０もしくはそれより長い、約１１もしくはそれより長い、約１２もしくはそれより長い、約１３もしくはそれより長い、約１４もしくはそれより長い、約１５もしくはそれより長い、約１６もしくはそれより長い、約１７もしくはそれより長い、約１８もしくはそれより長い、約１９もしくはそれより長い、約２０もしくはそれより長い、約２１もしくはそれより長い、約２２もしくはそれより長い、約２３もしくはそれより長い、約２４もしくはそれより長い、約２５もしくはそれより長い、約２６もしくはそれより長い、約２７もしくはそれより長い、約２８もしくはそれより長い、約２９もしくはそれより長い、約３０もしくはそれより長い、約３５もしくはそれより長い、約４０もしくはそれより長い、約４５もしくはそれより長い、約５０もしくはそれより長い、約７５もしくはそれより長い、またはそれを超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０ヌクレオチド長未満である。好ましい実施形態では、ガイド配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである。ガイド配列は、１５～２０ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、１５ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、１６ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、１７ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、１８ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、１９ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、２０ヌクレオチド長であり得る。

【0121】

ガイド核酸は、操作されて、ガイド配列が標的配列に対して相補的であるようにガイド配列を変更することによって所望の標的配列を標的化し、それによって、ガイド配列と標的配列の間のハイブリダイゼーションを可能にし得る。操作されたガイド配列を含むガイド核酸は、操作されたガイド核酸と称することができる。操作されたガイド核酸は、天然に存在しないことが多い。

【0122】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼによるゲノム編集は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）配列を必要としないかもしくはそれに依存しないおよび／またはダイレクトリピートは、ガイド（標的またはスペーサー）配列の５’（上流）に存在する。

【0123】

１つまたは複数の天然に存在しないガイド核酸を含む標的化可能なヌクレアーゼシステムは、天然に存在しないシステムである。

【0124】

一部の実施形態では、ＲＮＡの安定性、細胞内での標的化、トラッキング（例えば、蛍光標識による）を変更する化学改変を使用してガイドＲＮＡを改変する。これらの改変は、特定の適用に対する新規エンドヌクレアーゼの機能を改善するのに有用である。

【0125】

一部の実施形態では、ガイド核酸は、ホスホロチオエート、逆極性連結（ｉｎｖｅｒｔｅｄｐｏｌａｒｉｔｙｌｉｎｋａｇｅ）、および脱塩基ヌクレオシド連結、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）；ならびに２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、および２’－フルオロ、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、２’－ジメチルアミノエトキシエトキシより選択される改変糖部分を含む。さらなる改変は、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））または３’ポリアデニル化テイル（すなわち、３’ポリ（Ａ）テイル）のコンジュゲーションを含む。さらなる改変は、５－メチルシトシン；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；アデニンの６－メチル誘導体；グアニンの６－メチル誘導体；アデニンの２－プロピル誘導体；グアニンの２－プロピル誘導体；２－チオウラシル；２－チオチミン；２－チオシトシン；５－プロピニルウラシル；５－プロピニルシトシン；６－アゾウラシル；６－アゾシトシン；６－アゾチミン；シュードウラシル；４－チオウラシル；８－ハロアデニン；８－アミノアデニン；８－チオールアデニン；８－チオアルキルアデニン；８－ヒドロキシルアデニン；８－ハログアニン；８－アミノグアニン；８－チオールグアニン；８－チオアルキルグアニン；８－ヒドロキシルグアニン；５－ハロウラシル；５－ブロモウラシル；５－トリフルオロメチルウラシル；５－ハロシトシン；５－ブロモシトシン；５－トリフルオロメチルシトシン；５－置換ウラシル；５－置換シトシン；７－メチルグアニン；７－メチルアデニン；２－Ｆ－アデニン；２－アミノ－アデニン；８－アザグアニン；８－アザアデニン；７－デアザグアニン；７－デアザアデニン；３－デアザグアニン；３－デアザアデニン；三環式ピリミジン；フェノキサジンシチジン；フェノチアジンシチジン；置換フェノキサジンシチジン；カルバゾールシチジン；ピリドインドールシチジン；７－デアザグアノシン；２－アミノピリジン；２－ピリドン；５－置換ピリミジン；６－アザピリミジン；Ｎ－２、Ｎ－６もしくはＯ－６置換プリン；２－アミノプロピルアデニン；５－プロピニルウラシル；または５－プロピニルシトシンを含む。

【0126】

６．７．ＲＮＰ
リボヌクレオタンパク質粒子またはＲＮＰは、上記セクションで記載されたヌクレアーゼ誘導型ヌクレアーゼとガイド核酸の間に形成される複合体である。適合性であるヌクレアーゼ誘導型ヌクレアーゼとガイド核酸は、標的化可能なヌクレアーゼ活性を有するＲＮＰを形成することができる。好ましい実施形態では、ＲＮＰは、遺伝子編集に使用され得る。

【0127】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼ誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸は、天然の対である。一部の実施形態では、これは、核酸誘導型ヌクレアーゼと異種ガイド核酸の複合体である。一部の実施形態では、異種ガイド核酸は、天然に存在せず、合成であるかまたは操作されている。

【0128】

６．８．ポリヌクレオチド
別の態様では、本発明は、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の天然に存在しない核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする。ある特定の実施形態では、天然に存在しないヌクレアーゼは、本明細書に記載の操作された核酸誘導型ヌクレアーゼである。

【0129】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメントおよび融合ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含む。融合ペプチドは、シグナルペプチドまたは１つもしくは複数のＮＬＳであり得る。

【0130】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドセグメントを含む。

【0131】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドはコドン最適化されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌または真核生物または酵母における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。

【0132】

一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドセグメントは、配列番号７２２～７６６より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドセグメントは、配列番号７２２～７６６より選択される配列を有する。

【0133】

一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドセグメントは、配列番号６７７～７２１より選択される配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドセグメントは、配列番号６７７～７２１より選択される配列を有する。

【0134】

別の態様では、本開示は、本明細書において提供される核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ベクターは、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターまたは他の調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、調節エレメントは、組織特異的に（例えば、肝臓、脳、リンパ球、筋肉、腫瘍、ウイルス感染細胞など）または時間的に特異的に（例えば、胚、胎児、細胞周期特異的など）発現を駆動する。一部の実施形態では、ベクターはプラスミドである。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、またはレンチウイルス（ＩＤＬＶを含む）である。ある特定の実施形態では、送達の手段は、粒子、ナノ粒子、または脂質ナノ粒子である。ある特定の実施形態では、送達の手段は、エキソソームまたはフソソームによるものである。ある特定の実施形態では、送達の手段は、微小気泡である。ある特定の実施形態では、送達の手段は、電気穿孔によるものである。一部の実施形態では、発現構築物は、電気穿孔を使用して標的細胞内に導入されるか、または脂質もしくは化学ベースの方法、粒子銃を使用する「遺伝子銃」、マイクロインジェクション、リガンド媒介型遺伝子送達、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、レーザー照射、フォトポレーション（ｐｈｏｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、ハイドロポレーション（ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、およびマグネトフェクションを使用してトランスフェクトされる。

【0135】

一部の実施形態では、原核生物および真核生物の発現構築物は、標的細胞において核酸誘導型ヌクレアーゼとガイド核酸の両方を発現するように設計される。一部の実施形態では、発現構築物は、標的細胞における一過的発現または安定した発現のためのものである。一部の実施形態では、構築物は、単一または多数のガイド核酸をタンデムに発現するように設計される。

【0136】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸は、ＲＮＡとして送達される。

【0137】

一部の実施形態では、生物学的ツール、またはウイルスベクターなどのシステムを使用して、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸を標的細胞へと送達する。一部の実施形態では、これは、ヘルパー細胞株においてウイルス粒子を産生するベクターの生成を伴う。ウイルス粒子を採取し、標的細胞株に形質導入するために使用する。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、組込みベクターまたは非組込みベクターのいずれか、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスのベクターである。一部の実施形態では、これらの生物学的ツールを使用して、核酸誘導型ヌクレアーゼとガイド核酸のいずれかまたは両方を標的細胞中に導入する。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼとガイド核酸の両方またはいずれかの発現は、誘導性発現ベクターを使用して制御される。一部の実施形態では、ベクターからの発現は、特定の細胞型において核酸誘導型ヌクレアーゼとガイド核酸のいずれかまたは両方の発現を駆動するために細胞型特異的プロモーターを使用して制御される。これにより、ウイルス粒子の全身送達が可能になるが、生物中での特定の細胞型に発現は制限される。

【0138】

６．９．宿主細胞
さらに別の態様では、本開示は、本明細書において提供される核酸誘導型ヌクレアーゼを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。

【0139】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質である。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、合成または操作されたタンパク質である。

【0140】

一部の実施形態では、宿主細胞は、ガイド核酸をさらに含む。一部の実施形態では、ガイド核酸は、異種ガイド核酸である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ガイド核酸をコードする発現構築物を含む。一部の実施形態では、ガイド核酸は、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む単一のポリヌクレオチドのカセット中に提供される。

【0141】

宿主細胞は、１つもしくは複数のベクター、線状ポリヌクレオチド、ポリペプチド、核酸－タンパク質複合体、またはこれらの任意の組合せで一過的または非一過的にトランスフェクトされ得る。

【0142】

一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１３／７４６６７が参照される。一部の実施形態では、生殖系細胞に対して改変がなされ、遺伝子操作された多細胞生物、例えば、ノックインもしくはノックアウトマウス、ラット、またはヒトが得られる。参照により本明細書に組み込まれる、Platt et al., Cell, 159(2):440-455を参照されたい。一部の実施形態では、宿主細胞は、非哺乳動物の真核細胞、例えば、家禽（例えば、ニワトリ）、脊椎骨のある魚（例えば、サケ）、甲殻類（例えば、カキ、二枚貝、エビ）、昆虫（例えば、ミバエ）、酵母、または植物（例えば、キャッサバ、トウモロコシ、ソルガム、ダイズ、オート麦、コメ、柑橘類、堅果の木、綿、タバコ、食用果物、食用野菜、コーヒー、カカオ）であってよく、その結果、細胞、組織または完全な生物が、ヌクレアーゼを使用して編集される。

【0143】

６．１０．標的化可能なヌクレアーゼシステム
一態様では、本開示は、真核生物または原核生物のゲノムの標的領域を編集するための標的化可能なヌクレアーゼシステムであって、（１）核酸誘導型ヌクレアーゼ、および（２）核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成するためのガイド核酸を含む、標的化可能なヌクレアーゼシステムを提供する。一部の実施形態では、システムは、（３）標的領域に結合するよう構成された相同鋳型をさらに含む。

【0144】

６．１０．１．核酸誘導型ヌクレアーゼ
遺伝子編集システムは、本明細書に記載の核酸誘導型ヌクレアーゼを含む。核酸誘導型ヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼまたは操作されたヌクレアーゼであり得る。

【0145】

標的化可能なヌクレアーゼシステムは、本明細書に記載の核酸誘導型ヌクレアーゼのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２～２７３より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレアーゼを含む。

【0146】

【0147】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、コドン最適化ポリヌクレオチドから産生される。

【0148】

６．１０．２．ガイド核酸
遺伝子編集システムは、本明細書に記載のガイド核酸をさらに含む。ガイド核酸は、天然に存在するか、合成であるか、または操作されている可能性がある。

【0149】

一部の実施形態では、操作されたガイドポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼと複合体を形成するように設計されており、ガイド配列を含み、ここで、ガイド配列は、原核細胞または真核細胞において標的配列とハイブリダイズするように設計されている。

【0150】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼを、核酸誘導型ヌクレアーゼと適合性である異種ガイド核酸と一緒に使用し、それによって機能的ＲＮＰを形成する。

【0151】

【0152】

６．１０．３．相同鋳型
相同鋳型は、標的配列と相同な配列を含む。標的配列は、原核細胞または真核細胞に対して内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的配列は、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、標的領域は、真核細胞ゲノム内に存在する。一部の実施形態では、標的領域は、細菌細胞ゲノム内に存在する。一部の実施形態では、標的領域は、植物細胞ゲノム内に存在する。一部の実施形態では、標的領域は、哺乳動物細胞ゲノム内に存在する。一部の実施形態では、標的領域は、ヒトゲノム内に存在する。

【0153】

標的配列は、コード配列または非コード配列であり得る。標的配列は、ＰＡＭ；すなわち、ＲＮＰによって認識される短い配列の近くに局在するかまたはＰＡＭを含み得る。一部の実施形態では、ＰＡＭは、標的配列に隣接する２～５塩基対の配列である。ＰＡＭは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより長いヌクレオチド長であり得る。

【0154】

一部の実施形態では、ＰＡＭ配列はＴＴＴＶ（ここで、Ｖは、Ａ、Ｃ、またはＧより選択されるいずれか１つの塩基である）である。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＴＶではない。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＮＴＴＮ、ＮＣＴＶ、ＣＴＴＶ、ＧＴＴＶ、ＮＣＴＶ、ＴＣＴＶ、およびＮＴＴＶ（ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧより選択されるいずれか１つの塩基である）より選択される。

【0155】

相同鋳型は、標的配列に対して少なくとも１つの変異または改変を含み得る。一部の実施形態では、相同鋳型は、標的領域と比較して、挿入、欠失、または改変を含む。相同鋳型は、標的領域に相補的な配列を含み得る。

【0156】

相同鋳型は、標的配列に対する少なくとも１つの変異または改変に隣接する相同領域（または相同アーム）を含み得、その結果、隣接する相同領域は、編集配列の標的配列への相同組換えを促進する。一部の実施形態では、少なくとも１つの変異は、ＰＡＭ部位を変異または欠失させる１つまたは複数のＰＡＭ変異である。ＰＡＭ変異は、サイレント変異であり得る。ＰＡＭ変異は、非サイレント変異であり得る。非サイレント変異は、ミスセンス変異を含み得る。編集配列は、標的部位に対してコード配列または非コード配列に１つまたは複数の変異を含み得る。

【0157】

一部の実施形態では、相同鋳型は、標的配列に対して少なくとも１つの変異を含む。変異は、サイレント変異またはミスセンス変異などの非サイレント変異であり得る。変異は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは塩基対の挿入を含み得る。変異は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは塩基対の欠失を含み得る。変異は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは塩基対での異なる１つまたは複数のヌクレオチドまたは塩基対の置換を含み得る。挿入されたかまたは置換された配列は、外因性の配列または異種配列を含み得る。一部の実施形態では、相同鋳型は、相同領域に隣接した外因性配列をさらに含む。

【0158】

一部の実施形態では、相同鋳型内の相同領域は編集カセットの１つまたは複数の変異に隣接し、組換えによって標的配列中に挿入され得る。組換えは、例えば、核酸誘導型ヌクレアーゼによるＤＮＡ切断、および相同組換えによる修復を含み得る。

【0159】

一部の実施形態では、相同鋳型は、ベクター内に存在するかまたは別のポリヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチド、線状ポリヌクレオチド、もしくは合成ポリヌクレオチドとして提供される。一部の実施形態では、相同鋳型は、ガイド核酸として同じポリヌクレオチドに存在する。一部の実施形態では、相同鋳型は、ガイド核酸として別のポリヌクレオチドに存在する。一部の実施形態では、相同鋳型は、核酸誘導型ヌクレアーゼによってニックを入れられるかまたは切断される標的配列内またはその付近で、相同組換えの鋳型として機能するように設計される。相同鋳型は、任意の好適な長さ、例えば、約１０もしくはそれより長い、約１５もしくはそれより長い、約２０もしくはそれより長い、約２５もしくはそれより長い、約５０もしくはそれより長い、約７５もしくはそれより長い、約１００もしくはそれより長い、約１５０もしくはそれより長い、約２００もしくはそれより長い、約５００もしくはそれより長い、約１０００もしくはそれより長い、またはそれより長いヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、相同鋳型は、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に対して相補性である。相同鋳型は、標的配列の１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、約１もしくはそれより長い、約５もしくはそれより長い、約１０もしくはそれより長い、約１５もしくはそれより長い、約２０もしくはそれより長い、約２５もしくはそれより長い、約３０もしくはそれより長い、約３５もしくはそれより長い、約４０もしくはそれより長い、約５０もしくはそれより長い、約１００もしくはそれより長い、約１５０もしくはそれより長い、約２００もしくはそれより長い、約２５０もしくはそれより長い、約３００もしくはそれより長い、約４００もしくはそれより長い、約５００もしくはそれより長い、約６００もしくはそれより長い、約７００もしくはそれより長い、約８００もしくはそれより長い、約９００もしくはそれより長い、約１０００もしくはそれより長い、またはそれより多いヌクレオチド）と重複し得る。

【0160】

６．１１．ゲノムを編集する方法
一態様では、本開示は、本明細書において提供される遺伝子編集システムを使用して真核生物または原核生物のゲノムの標的領域を改変する方法を提供する。方法は、（１）標的領域を含む試料を、（ｉ）核酸誘導型ヌクレアーゼおよび（ｉｉ）核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成したガイド核酸と接触させるステップと、（２）核酸誘導型ヌクレアーゼに標的領域を改変させるステップとを含み得る。一部の実施形態では、試料を、（ｉｉｉ）標的領域に結合するように構成された相同鋳型とさらに接触させる。

【0161】

一部の実施形態では、試料は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞、哺乳動物細胞またはヒト細胞を含む。一部の実施形態では、試料は免疫細胞を含む。一部の実施形態では、免疫細胞はＢ細胞またはＴ細胞である。一部の実施形態では、ゲノム編集のための細胞は、ヒト、マウス、またはラットなどのトランスジェニック多細胞生物をもたらす生殖系細胞である。一部の実施形態では、ゲノム編集のための細胞は、幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、またはヌクレアーゼに媒介されるゲノム編集とその後の特定の細胞または組織型の派生を可能にする他のこのような標的細胞である。

【0162】

一部の実施形態では、遺伝子編集システムの１つまたは複数の構成成分をコードする１つまたは複数のベクターは、宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸は、別のベクターの別の調節エレメントに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、単一のベクター内で組み合わされた同一または異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つまたはそれより多くが導入される。いくつかのエレメントが単一のベクター内で組み合わされる場合、１つのエレメントのコード配列は、第２のエレメントのコード配列と同一の鎖または反対の鎖に位置付けられ、同一または反対の方向に方向付けられてもよい。一部の実施形態では、単一のプロモーターは、核酸誘導型ヌクレアーゼおよび１つまたは複数のガイド核酸をコードする転写物の発現を駆動する。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよび１つまたは複数のガイド核酸は、同じプロモーターに作動可能に連結され、それから発現される。他の実施形態では、１つもしくは複数のガイド核酸または１つもしくは複数のガイド核酸をコードするポリヌクレオチドは、核酸誘導型ヌクレアーゼまたは核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を既に含むｉｎｖｉｔｒｏ環境下で、細胞内に導入される。核酸標的化システムの１つまたは複数のエレメントの発現のための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、およびそれらの構成成分は、他の箇所、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７で使用されるものと同様である。

【0163】

一部の実施形態では、方法は、２つ以上のガイド核酸を接触させるステップを含む。一部の実施形態では、２つ以上のガイド核酸のそれぞれは、異なるガイド配列を有し、それによって、異なる標的配列を標的化する。

【0164】

一部の実施形態では、方法は、ｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏ、またはｉｎｖｉｔｒｏで、原核細胞または真核細胞において標的領域を改変するために使用される。一部の実施形態では、方法は、原核細胞などの細胞もしくは細胞の集団、または遺伝子編集のためのヒトもしくは非ヒト動物もしくは植物由来のものをサンプリングするステップを含む。培養するステップは、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏのいずれの段階で行われてもよい。細胞（１つまたは複数）は、宿主にさらに再導入されてもよい。

【0165】

一部の実施形態では、方法は、ＲＮＰを標的配列に結合させて、前記標的領域を切断させ、それによって、標的領域を改変するステップを含む。

【0166】

本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列標的化を伴う遺伝子発現の制御に使用されるシステム、方法、および組成物の操作および最適化に関し、核酸標的化システムおよびその構成成分に関する。一部の実施形態では、ウイルスベクターを使用して、ヌクレアーゼ誘導型ヌクレアーゼのライブラリーおよびまたはガイド核酸のライブラリーを標的細胞へと送達する。一部の実施形態では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓなどの細菌を使用して、ヌクレアーゼ誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸の配列を植物ゲノム内に移入する。

【0167】

一部の実施形態では、これらの方法を使用して、ヌクレアーゼ誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸の配列を、細菌、酵母、真菌、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、霊長類、および他の動物モデル系を含むがこれらに限定されない原核生物および真核生物に導入する。

【0168】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸の配列は、上記システムを使用して標的細胞へと送達されて、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによってノックアウト（ＫＯ）またはＬＯＦ変異を作製する。

【0169】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸の配列は、ノックイン（ＫＩ）変異を作製するための相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型により送達される。一部の実施形態では、ＨＤＲ鋳型は、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡとして提供され、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸と同時に導入されるか、または上記遺伝子移入のための方法を使用して逐次導入される。一部の実施形態では、ＨＤＲ鋳型を操作して、天然に存在するかまたは合成の配列を標的ゲノム内に組み込む。

【0170】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼの改変バージョンは、ＤＮＡ一本鎖切断をもたらす「ＣＲＩＳＰＲ－ニッカーゼ」を作製するために生成される。一部の実施形態では、この変更は、忠実度を増強し、オフターゲット編集を減少させる場合があり、ＫＯまたはＫＩ変異を生成するために使用される。

【0171】

６．１２．ゲノム編集された細胞
一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法によって改変されたゲノムを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、細胞はＢ細胞またはＴ細胞である。

【0172】

本発明の利点は、細胞のゲノムを編集しながら、オフターゲット結合およびその生じる副作用を最小限にするかまたは回避することである。

【0173】

一部の実施形態では、疾患に関連する遺伝子またはポリヌクレオチドが改変されている。一部の実施形態では、Ｂ細胞またはＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドが改変されている。

【0174】

一部の実施形態では、遺伝子編集は、遺伝子をノックアウトすること、遺伝子調節配列を改変してＲＮＡ発現を増加または低下させること、遺伝子を編集すること、遺伝子を変更すること、遺伝子を増幅させること、遺伝子を置き換えること、遺伝子を挿入すること、および特定の変異を修復することを含む。

【0175】

一部の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼは、宿主細胞のゲノムＤＮＡ配列を変更させることなく、標的遺伝子の転写をブロックするために使用される酵素的に失活したヌクレアーゼである。

【0176】

一部の実施形態では、酵素的に失活した核酸誘導型ヌクレアーゼを転写アクチベーターに融合させて、宿主細胞のゲノムＤＮＡ配列を変更させることなく、標的遺伝子の転写を増強する。

【0177】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼまたはガイド核酸の配列ライブラリーを細胞内に導入し、遺伝子発現を変更させて、遺伝子機能をゲノムレベルで特定する。一部の実施形態では、これらのスクリーニングは、新規生物学的洞察または新規薬物標的の同定をもたらし得る。

【0178】

一部の実施形態では、酵素的に失活した核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸は、ゲノムの領域のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）に利用される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをタンパク質タグに融合させて、クロマチンの特定領域への結合およびその精製を可能にする。一部の実施形態では、これらのタグは、ヘマグルチニン（ＨＡ）ドメイン、ＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、緑色蛍光タンパク質ドメイン、および６×Ｈｉｓタグを含む。一部の実施形態では、これらのタンパク質を特定のクロマチン領域のエピジェネティックプロファイリング、ゲノムプロファイリング、およびプロテオミックプロファイリングに使用する。

【0179】

一部の実施形態では、酵素的に失活した核酸誘導型ヌクレアーゼを、ＤＮＡを改変または標識する酵素に融合させる。一部の実施形態では、酵素、例えば、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、およびデアセチラーゼを使用して、標的細胞ゲノムへの改変を付加または除去する。

【0180】

一部の実施形態では、酵素的に失活した核酸誘導型ヌクレアーゼを蛍光タンパク質に融合させて、ＤＮＡ複製などの細胞プロセス中のクロマチン動態を可視化させる。一部の実施形態では、酵素的に不活性な核酸誘導型ヌクレアーゼ蛍光レポーターを使用して、生細胞または死細胞内の特定の核酸を検出する。

【0181】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼを診断薬として使用して、生体試料中のウイルス病原体または微生物の夾雑物を検出する。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、酵素的に活性であるかまたは酵素的に失活しており、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素レポーター、または緑色蛍光タンパク質などの蛍光レポーターを使用して核酸を検出するために使用される。

【0182】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸を胚細胞、配偶子、接合子、卵割球、および胚性幹に導入して、基礎研究または疾患モデリングのための遺伝子操作された多細胞生物を生成する。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸を、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ、またはｉｎｖｉｖｏ方法を使用して細胞内に導入する。一部の実施形態では、改変された生物は、真菌、植物、および真核生物である。

【0183】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸をｉｎｖｉｖｏで体細胞内に導入して、遺伝子操作された多細胞生物を生成する。一部の実施形態では、改変された生物は、真菌、植物、および真核生物である。一部の実施形態では、これらのアプローチは、発生した生物または発生中の生物内の特定の細胞型またはすべての細胞を改変することを目的とする。

【0184】

一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸は、静脈内注射、後眼窩注射、気管内注射、腫瘍内注射、関節および軟組織注射、筋肉内注射、病巣内注射、眼内注射、または核酸、ウイルスベクター、もしくはＲＮＡおよびタンパク質複合体を生存生物内の組織へと送達するための他の方法論によって導入される。

【0185】

一部の実施形態では、これらの方法は、がんまたは疾患のモデリング、細胞生物学的または遺伝子研究、疾患関連変異の補正、細胞療法、創傷治癒および再生、診断、イメージングツール、農業目的、創薬、ならびに薬物開発および製造に使用される。

【0186】

一部の実施形態では、患者からの初代細胞を得、核酸誘導型ヌクレアーゼおよびガイド核酸をｅｘｖｉｖｏで細胞へと送達する。一部の実施形態では、細胞は、上記のゲノムの変更、エピゲノムの変更、またはトランスクリプトームの変更のいずれかを含有するよう改変される。一部の実施形態では、改変された細胞を治療目的で患者に導入して戻す。一部の実施形態では、これらの改変は、疾患関連変異を補正するか、または配列を導入して、免疫細胞の再生もしくは健康促進能を増強させる。一部の実施形態では、操作された細胞は、がん、自己免疫疾患、または感染性疾患に対する治療薬として使用される。一部の実施形態では、標的細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、および造血幹細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を患者由来の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）内に導入し、患者に注入して戻す。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、遺伝子、例えば、内因性ＴＣＲ、ヒト白血球抗原、または免疫抑制遺伝子のＫＯに使用される。一部の実施形態では、標的細胞は同種である（すなわち、患者ではなくドナーに由来する）。一部の実施形態では、腫瘍浸潤を促進する分子スイッチ、死滅スイッチ、または分泌もしくは膜結合タンパク質を操作された細胞内に導入する。

【実施例】

【0187】

６．１３．実施例
６．１３．１．
（実施例１）
原核生物ゲノムの核酸誘導型ヌクレアーゼの同定およびコンピューター解析
ＭＡＤ７は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種由来のカノニカルＡｓＣｐｆ１とアミノ酸レベルで３１％の相同性しか有さないＣａｓ１２ａバリアントであり、ＡｓＣｐｆ１と比較して、Ｃａｓ９からさらに離れて進化している。ＭＡＤ７アミノ酸配列をクエリーとして使用して、他の原核生物内のホモログを検索した。ｂｌａｓｔｘを使用して、ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋのデータベースの１３４，６５５個の原核生物ゲノムに対してクエリーを実行した。本発明者らが「ＧＩＧ－」ヌクレアーゼまたは「ＧＩＧ－」酵素または「ＧＩＧ－」Ｃａｓヌクレアーゼまたは「ＧＩＧ－」Ｃａｓ酵素と称する３８１個のＭＡＤ７ホモログをこのコンピューター検索において同定した。全長コード配列を得るために努力して、ホモログ配列を最も近いメチオニン（存在する場合）の上流、および最も近い停止コドン（存在する場合）の下流に延長させた。これらのホモログは、ＭＡＤ７アミノ酸配列に対して平均４４．２％（２２．９６％～９８．８９％の範囲）の同一性を有した（図１）。ホモログタンパク質の配列を、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ（配列表を参照されたい）を使用してＭＡＤ７に対してアライメントし、系統樹を作製した（図２）。

【0188】

ヌクレアーゼ配列が発見された同一のゲノムでは、ＣＲＩＳＰＲリピートアレイをＰＩＬＥＲ－ＣＲ（Edgar BMC Bioinformatics 8:18, 2007）を使用して検索した。転写された際に、ＣＲＩＳＰＲリピートは、配列特異的標的化のためのステムループ構造およびスペーサー領域を含有するＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を形成する。ステムループアーム長５ヌクレオチド、およびループ長３～５ヌクレオチド以内を使用するＲパッケージ、ＢｉｏｓｔｒｉｎｇｓのｆｉｎｄＰａｌｉｎｄｒｏｍｅｓ機能を使用して、ＣＲＩＳＰＲリピート配列内のパリンドローム配列を検索した。予測されたｃｒＲＮＡの大部分は、ＴＣＴＡＣというカノニカルステムループ左アーム配列を含有し、ＴＣＴＧＣ、ＡＴＴＴＣ、またはＣＣＴＡＣという新規のステムループ左アーム配列を含有するものは少数派であった（図３）。ＣＲＩＳＰＲリピート配列を配列番号２７４～６２７として列挙する。

【0189】

ＭＡＤ７ホモログにおける保存ドメインを同定するために、クラスターをＭＡＤ７ホモログのリスト内で同定した。Ｒパッケージ、ａｐｅおよびｇｅｉｇｅｒを使用して、様々な数のホモログ配列を含有する１２個のクラスターを同定した（図２）。複数の配列アライメントを実施し、表１に示すように各クラスター内の配列に関してコンセンサスアミノ酸配列を生成した。

【0190】

さらに、コンセンサス配列の中で、保存ドメインは、多義的なアミノ酸が１０％以下で、ギャップがない、４アミノ酸以上を含有するストリング（すなわち、ペプチド）として同定された。これらの保存ペプチド配列は、ＧＩＧ－Ｃａｓ酵素にとって機能的に重要なドメインを表す場合があり、表２に列挙されている。保存ドメイン中の非保存アミノ酸は、Ｘとマークしている。
表1. 272種のMAD7 GIG-ヌクレアーゼホモログのClustalWによるアライメント。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

表2. 272種のMAD7 GIG-ヌクレアーゼホモログをclustalwによりアライメントすることによって同定した保存配列。

【表2-1】

【表2-2】

【0191】

６．１３．２．
（実施例２）
核酸誘導型ヌクレアーゼの機能的解析
ＧＩＧ－ヌクレアーゼのｉｎｖｉｔｒｏでの機能を試験するための方法
新規ＧＩＧ－ヌクレアーゼの機能的特性を、Maxwell et al.(Methods. 2018 July 01; 143: 48-57)によって以前に記載されたＥ．ｃｏｌｉに由来するｉｎｖｉｔｒｏ転写－翻訳システムを使用して試験する。簡単に説明すると、新規ＧＩＧ－ヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列および選択したＤＮＡ配列を標的化する同族ガイドＲＮＡを、強力な細菌プロモーターの制御下に置き、無細胞系（ＡｒｂｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩから市販されている）で発現させる。ヌクレアーゼのＤＮＡ配列は、ＰＣＲによって増幅するか、またはギブソンアセンブリー、遺伝子ブロック、オリゴヌクレオチド、もしくは類似の方法を使用して、ｄｅｎｏｖｏで合成する。ヌクレアーゼＤＮＡ配列は、野生型であるかまたはコドン最適化されている。具体的には、ヌクレアーゼの転写はＴ７プロモーター（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’）によって駆動され、構成的に活性なｐ７０ａプロモーター（例えば、ＡｒｂｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのプラスミドｐＴＸＴＬ－Ｐ７０ａ－Ｔ７ｒｎａｐ）の制御下で同一反応中に発現されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写される。ガイドＲＮＡの発現はＰ７０ａプロモーターの制御下に置かれ、強力な転写ターミネーターの存在により、適切な転写終結が保証される。あるいは、ｉｎｖｉｔｒｏ転写－翻訳反応からｇＲＮＡ転写用の鋳型を省略し、ＧＩＧ－Ｃａｓヌクレアーゼの発現が完了した後に、合成的に合成したｇＲＮＡを代わりに添加する。さらに、標的ＤＮＡは、環状プラスミドまたは線状ＤＮＡ断片のいずれかの形態で反応に添加する。機能的ヌクレアーゼおよびその同族ガイドＲＮＡを発現させると、標的ＤＮＡの切断が起こり、これはアガロースゲル上での移動度シフト解析、キャピラリー電気泳動またはマイクロ流体システムを含む様々な解析方法によって検出することができる。代替の読み出し方法としては、定量的ＰＣＲが挙げられる。

【0192】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによる生産的切断では、プロトスペーサー標的配列のすぐ近くに真のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列が必要とされる。典型的には３～５ヌクレオチド長で、プロトスペーサー配列のすぐ隣に位置するかまたは数ヌクレオチドが除去された許容されるＰＡＭ配列の非存在下では、切断は起こらない。ＰＡＭ配列が元々知られていない新規ＧＩＧ－Ｃａｓヌクレアーゼの場合、標的配列への改変後に、上記のｉｎｖｉｔｒｏ転写－翻訳システムを使用して、認識されるＰＡＭ配列を決定する。この目的のために、プロトスペーサー配列のすぐ隣の領域に、ヌクレオチドのランダム化ストレッチを導入する。典型的には、このような領域は、６、７、８、９または１０個のランダム化ヌクレオチドからなる。前述のランダム化ＰＡＭ配列のライブラリーをＧＩＧヌクレアーゼ消化に供することによって、許容されるＰＡＭヌクレオチドのバリアントと位置に対応する配列が切断され、適合しないＰＡＭバリアントを有する配列は未消化のままである。ハイスループットＤＮＡシーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａによって製造された「次世代シーケンシング」、またはＮＧＳ）によって、差が、消化された試料と、ガイドＲＮＡを欠くかまたは無関係なガイドＲＮＡを追加補充した対照との間の各ＰＡＭ配列バリアントの存在量であるので、ＰＡＭプロファイルを決定する。

【0193】

特定のＰＡＭ配列が、例えば、ヌクレアーゼの特定のサブタイプに広く存在するある特定の事例では、ヌクレアーゼに媒介される切断およびレポーター遺伝子の不活性化に基づくスクリーニングが用いられる。例えば、タンパク質のＣａｓ１２ａファミリー（ＭＡＤ７を含むクラスＩＩ、タイプＶヌクレアーゼ）の多くのメンバーは、プロトスペーサー配列のすぐ５’側にＴＴＴＶ（ここで、Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ）のコンセンサスモチーフを有するＰＡＭ配列をカノニカルに認識する。このような場合には、Maxwell et al. (Methods. 2018 July 01; 143: 48-57)および上に記載されているような前駆的ヌクレアーゼ活性スクリーニングを設計して、多数の新規ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を迅速に検出することができる。一実施態様では、レポーター遺伝子は、ＧＦＰまたはＲＦＰなどの蛍光タンパク質をコードする。遺伝子のコード領域内、好ましくはＡＴＧ開始コドンの近傍、またはオープンリーディングフレームのすぐ上流に、テトラヌクレオチドＴＴＴＡ、ＴＴＴＣまたはＴＴＴＧに対応するＰＡＭ配列モチーフを同定し、ガイドＲＮＡを設計して、標的遺伝子の切断を促進する。Ｍａｘｗｅｌｌらのｉｎｖｉｔｒｏ転写－翻訳方法を使用して、新規ＧＩＧ－ヌクレアーゼ、その同族レポーター標的化ガイドＲＮＡおよびレポータータンパク質を試験管内で発現させ、レポータータンパク質の蓄積および関連する蛍光シグナルを経時的に（１０分ごとに１８時間）モニターする。レポーター遺伝子の切断は、標的特異的ガイドＲＮＡを欠くかまたはスクランブルスペーサーを有するガイドＲＮＡを含む非標的化ガイドＲＮＡを追加補充した陰性対照と比較して蛍光の低下をもたらす。あるいは、蛍光レポータータンパク質、またはベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼもしくは抗生物質選択マーカーなどの一般的に使用される他のレポーターを使用して、細菌細胞または任意の他の細胞系、すなわち、哺乳動物細胞における機能性を暗黙的に試験するための細胞系で、スクリーニングを確立することができる。このシステムは、数百の新規ヌクレアーゼを活性についてスクリーニングするのに好適であり、推定ＰＡＭ配列が利用できる場合、候補ヌクレアーゼの初期スクリーニングとして使用することができる。また、このシステムは、適切な修正により、ヌクレアーゼの相対的活性および動力学的特性を評価するために使用することができる。

【0194】

機能する標的化可能なヌクレアーゼ複合体を有するために、核酸誘導型ヌクレアーゼおよび適合性のガイド核酸が必要とされる。適合性のガイド核酸の配列、特にガイド核酸の足場配列部分を決定するために、複数のアプローチが取られる。最初に、各核酸誘導型ヌクレアーゼの内因性遺伝子座の近くに足場配列が求められる。内因性足場配列が見られない場合、他の新規ＧＩＧ－Ｃａｓヌクレアーゼの内因性遺伝子座の近くに見られた足場配列を試験する。

【0195】

核酸誘導型ヌクレアーゼおよび対応するガイド核酸の機能性を評価するために、相同鋳型を作製する。相同鋳型は、標的配列に対して変異を含む。変異は、切断された標的配列への組換えを可能にする相同性の領域（相同アームまたはＨＡ）に挟まれている。様々な足場配列を含むガイド核酸を試験する。

【0196】

核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする発現構築物を、上記のような編集ポリヌクレオチドと一緒に宿主細胞に添加する。編集効率は、回収された細胞中の編集プラスミドをハイスループットで測定するｑＰＣＲによって決定される。編集ポリヌクレオチドは、編集された細胞をより容易に選択できるように、選択可能なマーカーを含むことができる。

【0197】

適合性のＰＡＭ配列の同定
新規Ｃａｓタンパク質について許容されるＰＡＭバリアントを解明するために、Maxwellet al. (Methods, 2018)のｉｎｖｉｔｒｏシステムを用いた。簡潔には、Ｔ７プロモーターの調節下にあるＣａｓタンパク質ＯＲＦを含有するプラスミド（例えば、図４および配列番号８１４）、プロトスペーサーのすぐ５’側に位置するランダム化１０ｍｅｒカセット（５’－配列）を有する、標的遺伝子であるＭＲ１遺伝子（ＮＭ＿００１５３１．２）を含有するプラスミド、およびＰ７０ａプロモーターの制御下にある同族ガイドＲＮＡ（５’－ｇｇｇｃｇｔｔｔｃｇｇａｔｃｃｃａｔｃｃａｔｇｇｇｇ－３’）をコードする合成ＤＮＡ分子を、ｉｎｖｉｔｒｏ転写－翻訳システム（ＡｒｂｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加し、２９℃で１８時間インキュベートして、ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを発現させ、標的ＤＮＡを切断させる。ガイドＲＮＡの例を表３に、および標的ＭＲ１配列の例を表４に示す。
表3. MR1遺伝子を標的化する新規GIG-ヌクレアーゼのためのガイドRNAの例。大文字=リピート配列;小文字=MR1遺伝子を標的化するスペーサー配列。

【表3】

表4. PAM部位を強調した標的MR1配列の例。大文字、太字/下線=PAM配列、またはランダム化PAMスクリーニングカセット;小文字=MAD7のための21塩基対のプロトスペーサー配列。

【表4】

【0198】

ガイドＲＮＡを欠く陰性対照を並行して実施した。インキュベーション後に、ＰＡＭカセットを包含するＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅させ、ハイスループットシーケンシングに供した。推定ＰＡＭカセットの各位置に対するＧＩＧ－Ｃａｓヌクレアーゼのヌクレオチド優先度を、ガイドＲＮＡ含有試料とガイドＲＮＡ欠損試料の間の存在量の相対差として計算した。このアッセイを使用して、ＧＩＧ－１（配列番号１２３）、ＧＩＧ－４（配列番号２５４）およびＧＩＧ－５（配列番号２８）のＰＡＭは、ＴＴＴＶであると決定された。

【0199】

より高いスループットのために、同様のｉｎｖｉｔｒｏ転写－翻訳システムを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子と組み合わせて実装し、４３個のＧＩＧ－ヌクレアーゼの活性を評価した。選択した４３個のＧＩＧ－ヌクレアーゼは、ＧＩＧ－Ｃａｓヌクレアーゼのフルセット（配列番号２～２７３）のタンパク質配列の多様性を代表しており、すなわち、解析した配列は、ＧＩＧ－Ｃａｓヌクレアーゼのクレード（すなわち、図２）の多様なサンプリングを表した。この事例では、標的遺伝子がＧＦＰをコードし、ガイドＲＮＡスペーサー配列がＧＦＰタンパク質のオープンリーディングフレーム内の天然に存在するＴＴＴＣＰＡＭ配列のすぐ近傍に存在するように選択された以外は、基本的に上記のように反応を設定した。標的遺伝子をＡＴＧ開始コドンの近くで切断することにより、標的特異的ガイドＲＮＡを含有する試料では、ガイドＲＮＡを欠く対照と比較して、ＧＦＰ活性が低下することが予測された。成功した実験では、反応物にＧＦＰ標的化ガイドＲＮＡを追加補充した場合、蛍光の明確な低下が観察され、いくつかのＧＩＧ－ヌクレアーゼは他のものよりも顕著な効果を実証した。ＭＲ１標的化アッセイについて上述したように、インキュベーション後に、ＰＡＭカセットを包含するＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅させ、ハイスループットシーケンシングに供した。推定ＰＡＭカセットの各位置に対するＧＩＧ－Ｃａｓヌクレアーゼのヌクレオチド優先度を、ガイドＲＮＡ含有試料とガイドＲＮＡ欠損試料の間の存在量の相対差として計算した。

【0200】

図５Ａ～５Ｃは、本発明からのＧＩＧ－１（配列番号１２３）、ＧＩＧ－４（配列番号２５４）、ＧＩＧ－３（配列番号７９）、ＧＩＧ－２（配列番号４３）、およびＧＩＧ－５（配列番号２８）に関するＰＡＭスクリーニングの例示的ＧＦＰレポーター結果を示す。図６は、３１例のＧＩＧ－酵素についての定量的シーケンシングヒートマップ結果を示す。図７Ａ～７Ｄは、３１例のＧＩＧ－酵素についてのヒートマップを要約する配列ロゴを示す。表５は、本明細書に記載のＧＩＧ－ヌクレアーゼについて同定されたコンセンサス優勢ＰＡＭ配列を提供する。本発明のほとんどのＧＩＧ－ヌクレアーゼは、以前に開示されたＣｐｆ１ヌクレアーゼとの類似性を示すが、ＧＩＧ－ヌクレアーゼの多くは、公知のＰＡＭ配列との定量的または定性的な差異を示す。例えば、ＰＡＭの－２位にシトシンを有する、強い活性を有さないＭＡＤ７とは対照的に、ＧＩＧ－２、ＧＩＧ－２０、およびＧＩＧ－２７は、ＰＡＭの－３位および－２位にシトシンヌクレオチドを持つことができる。このような差異は、ゲノムの操作の適用に利点を与える可能性がある。
表5は、酵素ID、アミノ酸配列、E.coli最適化ヌクレオチド配列、ヒト最適化ヌクレオチド配列、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、およびクラスターを関連付けるためのルックアップキーを提供する。

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【0201】

ヌクレアーゼタンパク質の発現および精製
本発明のヌクレアーゼは、当業者に周知の方法を使用して精製される。ヌクレアーゼのコード配列は、Ｅ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化し（例えば、配列番号６３２～６７６および６７７～７２１）、６×ｈｉｓタグとインフレームでｐＥＴ２１ｂ発現ベクター（例えば、図８およびｐＥＴ２１ｂ－ＧＩＧ－１７の配列番号８１２）にクローニングした。他の種類の精製タグ、例えば、ＦＬＡＧタグなども使用することができる。プラスミドをＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、ＯＤが０．５になるまで培養し、氷上に１５分間置き、次いで、発現のために、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、２０℃で一晩振盪した。細胞を採取し、化学的および／または物理的な方法によって溶解させた。Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、遊離ＩＭＡＣ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡ）、またはカラムに充填した樹脂を使用し、溶出用イミダゾールを用いて、溶解物から捕捉した。さらなる精製は、ＣＥＸカラムクロマトグラフィーを使用して、ｐＨ５．５～７．５および高塩溶出で実施した。最終的な洗練は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して実施した。精製したヌクレアーゼは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌｐＨ７．５中で製剤化し、４℃または－８０℃で保存する。

【0202】

精製したタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図９）およびＳＥ－ＨＰＬＣ（図１０Ａ～１０Ｃ）を使用して純度について、Ａ２８０による濃度とともに評価した。結果を表６にまとめる。
表6. Ni-NTA(Hisタグ捕捉)およびCEX精製方法を使用する本発明のGIG-ヌクレアーゼに関する精製結果。

【表6-1】

【表6-2】

【0203】

ＧＩＧ－ヌクレアーゼに関するゲノム編集活性アッセイ
ＳｐＣａｓ９（ＳｙｎｔｈｅｇｏＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＲｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ａｌｔ－ＲＡｓＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）Ｖ３（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）、精製ＭＡＤ７および精製ＧＩＧ－ヌクレアーゼを、ＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してＪｕｒｋａｔＥ６－１細胞（ＴＩＢ－１５２、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）へと電気穿孔した。リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体は、ＳｐＣａｓ９、ＡｓＣａｓ１２ａ、またはＧＩＧ－ヌクレアーゼを合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と１：１．２のモル比で室温にて１０分間インキュベートすることによって調製した。ａｓＣａｓ１２ａおよびＧＩＧ－ヌクレアーゼと共に使用したｓｇＲＮＡ配列は、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）により合成され、表７に提供する。ｓｐＣａｓ９と共に使用したｓｇＲＮＡ配列は、ＳｙｎｔｈｅｇｏＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＲｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって合成され、ＴＲＡＣ標的化プロトスペーサー（表７）およびＳｙｎｔｈｅｇｏからの所有権のある足場からなる。細胞をペレットにし、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＳＥ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に細胞１×１０^７個／ｍＬで再懸濁させた。Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃｐｆ１ＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）を細胞に添加し、次いで、２０μＬの細胞懸濁物を電気穿孔直前に４０ｐｍｏｌのＲＮＰ複合体と混合した。次いで、細胞を９６ウェルプレートに移し、１０％のＦＢＳを追加補充した２００μＬのＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。２４時間回復させた後、細胞を１０％のＦＢＳを追加補充した２ｍＬのＲＰＭＩ培地を含有する６ウェルプレートに移した。細胞を、電気穿孔の５日後に、フローサイトメトリーによってノックダウン効率について解析した。

【0204】

電気穿孔したＪｕｒｋａｔＥ６－１細胞をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いでＡＰＣ抗ヒトＣＤ３抗体（ＣｌｏｎｅＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５抗ヒトＴＣＲα／β抗体（ＣｌｏｎｅＩＰ２６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で４℃にて３０分間染色した。ＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞をＤＡＰＩで染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して解析した。各試料について、５０，０００個の生細胞（ＤＡＰＩ－）のサイトメトリーデータを収集した。ＴＣＲノックダウン効率は、野生型細胞に対して正規化した電気穿孔試料におけるＴＣＲαβ＋／ＣＤ３＋細胞のパーセンテージを評価することによって決定した。これらの実験の結果を、表８～９および図１１～１２に示す。

【0205】

表7. TRAC標的ゲノムおよびsgRNA配列。

【表7】

表8. Jurkat細胞のヒトTRAC遺伝子座における選択されたGIGヌクレアーゼのノックダウンおよびHDR効率。

【表8】

表9. Jurkat細胞のヒトTRAC遺伝子座における選択されたGIGヌクレアーゼのノックダウンおよびHDR効率。

【表9-1】

【表9-2】

【0206】

結果は、表１０にまとめたように、クラスター１または１１のいくつかのヌクレアーゼ（例えば、ＧＩＧ－１、ＧＩＧ－１７、ＧＩＧ－１０、ＧＩＧ－２）が、他のクラスターの他のヌクレアーゼと比較して、特に強いヌクレアーゼ活性を有することを示す。
表10. HDR効率の高い順のGIGヌクレアーゼ

【表10】

【0207】

精製したＧＩＧ－１７のゲノム編集活性をさらに解析し、Ａｌｔ－ＲＡｓＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）Ｖ３（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）の活性と比較した。ＪｕｒｋａｔＥ６－１およびＴ２細胞系において、それぞれ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子内に機能喪失変異を生じさせるように設計したｓｇＲＮＡ（表１１）を用いて、上記のようにＲＮＰを生成した。ＪｕｒｋａｔＥ６－１細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＳＥに再懸濁させ、Ｔ２細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＳＦ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に細胞１×１０^７個／ｍＬで再懸濁させた。細胞懸濁物２０μＬを電気穿孔の直前に４０ｐｍｏｌのＲＮＰ複合体と混合した。次いで、細胞を９６ウェルプレートに移し、２００μＬの適切な培地（ＪｕｒｋａｔＥ６－１細胞については１０％のＦＢＳを追加補充したＲＰＭＩ培地、およびＴ２細胞については２０％のＦＢＳを追加補充したＩＭＤＭ培地）中に再懸濁させた。回復後に、細胞を適切な培地２ｍＬを含有する６ウェルプレートに移した。細胞は、上記のように電気穿孔の５日後にフローサイトメトリーによってノックダウン効率について解析した。ＪｕｒｋａｔＥ６－１細胞をＰＥ抗ヒトＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体（クローンＷ６／３２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、Ｔ２細胞をＰＥ抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（クローンＢＢ７．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。ノックダウン効率は、電気穿孔試料中のＨＬＡ欠損細胞のパーセンテージを評価することによって決定した。これらの実験の結果を、表１２～１３および図１３～１４に示す。

【0208】

ＧＩＧ－ヌクレアーゼ哺乳動物発現ベクターの例は、図１５および配列番号８１３に示す。哺乳動物発現のためにコドン最適化されたＧＩＧ－ヌクレアーゼの例は、配列番号７２２～８１１に列挙する。
表11. B2MおよびHLA-A*02:01標的ゲノムならびにsgRNA配列。

【表11-1】