特表 2024-502012 腫瘍浸潤リンパ球を調製するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-17

(54)【発明の名称】腫瘍浸潤リンパ球を調製するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/078 20100101AFI20240110BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240110BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240110BHJP

【ＦＩ】

C12N5/078

A61K35/17

A61P35/00

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539872

(86)(22)【出願日】2021-12-29

(85)【翻訳文提出日】2023-08-23

(86)【国際出願番号】 CN2021142540

(87)【国際公開番号】W WO2022143785

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】202011629408.7

(32)【優先日】2020-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520370577

【氏名又は名称】シャンハイ・セルラー・バイオファーマシューティカル・グループ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100172683

【弁理士】

【氏名又は名称】綾 聡平

(74)【代理人】

【識別番号】100219265

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 崇大

(74)【代理人】

【識別番号】100203208

【弁理士】

【氏名又は名称】小笠原 洋平

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】リー，ジア

(72)【発明者】

【氏名】ホウ，ジヤン

(72)【発明者】

【氏名】ゴング，ジジェン

(72)【発明者】

【氏名】ク，イジエ

(72)【発明者】

【氏名】チン，シチャオ

(72)【発明者】

【氏名】ワン，シェンチェン

(72)【発明者】

【氏名】シュウ，ワンチン

(72)【発明者】

【氏名】ウー，ジュンフォン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，フェイ

(72)【発明者】

【氏名】チャン，リー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065BA21

4B065BC01

4B065BD39

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB64

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB26

(57)【要約】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大増殖させるための方法であって、第１の拡大増殖された細胞集団を得るために、ＴＩＬを含有する最初の細胞集団を第１の支持細胞とともに共培養することと、次いで、拡大増殖されたＴＩＬ集団を得るために、前記第１の拡大増殖された細胞集団を第２の支持細胞とともに共培養することと、を含む、方法が提供される。本方法は、小さな腫瘍試料から多数のＴＩＬを迅速に生産することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インビトロで腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製するための方法であって、
（１）試料からＴＩＬを含有する最初の細胞集団を提供する工程であって、前記最初の細胞集団中のＴＩＬの数はｎ０である、工程と、
（２）場合によって、前記最初の細胞集団を前処理する工程であって、前記前処理は、前記最初の細胞集団をＩＬ７、ＩＬ１５および／またはＩＬ２１とともに約６時間～約３６時間培養し、前処理された最初の細胞集団を得ることを含む、工程と、
（３）前記最初の細胞集団または前記前処理された最初の細胞集団を第１の支持細胞とともに第１の培養培地中で約７日～約１６日の第１の期間共培養し、第１の拡大増殖された細胞集団を得る工程であって、前記第１の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬの数はｎ１であり、ｎ１／ｎ０は約１０００～約１０，０００の範囲であり、ｎ１は少なくとも１×１０^７である、工程と、
（４）前記第１の拡大増殖された細胞集団を第２の支持細胞とともに第２の培養培地中で約１０日～約１６日の第２の期間共培養し、拡大増殖されたＴＩＬ集団を得る工程であって、前記拡大増殖されたＴＩＬ集団中のＴＩＬの数はｎ２であり、ｎ２／ｎ１は約４０００～約１０，０００の範囲であり、ｎ２は少なくとも１×１０^１０である、工程と、
を含む、方法。

【請求項2】

前記試料が腫瘍試料である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記腫瘍試料が固形腫瘍に由来する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記固形腫瘍が肺癌、子宮頸癌、卵巣癌または黒色腫である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記試料が、約０．０１ｇ～約０．５ｇの範囲の重量を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記腫瘍試料が、約０．０１ｇ～約０．０５ｇの範囲の重量を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ｎ０が約１，０００～約５０，０００の範囲である、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

ｎ０が約２，０００～約１０，０００の範囲である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

ｎ０が約３，０００～約１０，０００の範囲である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

工程（１）において、前記最初の細胞集団を得るために、前記試料が解離溶液で解離され、前記解離溶液は、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、ＤＮａｓｅおよびヒアルロニダーゼを含む等張溶液を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

工程（２）において、ＩＬ７が約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

工程（２）において、ＩＬ１５が約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

工程（２）において、ＩＬ２１が約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記第１の培養培地が、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５およびＩＬ２１からなる群より選択される１つ以上のサイトカインを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記第１の培養培地が、抗ＣＤ３抗体またはその断片、抗４１ＢＢ抗体またはその断片、抗ＯＸ４０抗体またはその断片、および抗ＰＤ－１抗体またはその断片からなる群より選択される１つ以上の抗体を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記抗ＣＤ３抗体またはその断片がＯＫＴ３抗体またはその断片である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第２の培養培地が、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記抗ＣＤ３抗体またはその断片がＯＫＴ３抗体またはその断片である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記第２の培養培地が、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片で被覆されたマイクロビーズを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記第１の支持細胞および／または前記第２の支持細胞が抗原提示細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記第１の支持細胞および／または前記第２の支持細胞が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

請求項１に記載の方法によって調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）。

【請求項23】

請求項１５に記載のＴＩＬを含む薬学的組成物。

【請求項24】

患者における疾患を処置する方法であって、請求項２３に記載の薬学的組成物を前記患者に投与することを含む、方法。

【請求項25】

前記疾患が癌である、請求項２４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月３１日に出願された中国特許出願第２０２０１１６２９４０８７号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0002】

本開示は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

近年、癌の免疫療法では、大きく進歩が起こっている。養子細胞療法としても知られる細胞免疫療法では、抗原特異的免疫応答を増強するための遺伝子改変または選択的拡大増殖のために、患者の免疫細胞が収集される。

【0004】

Ｔ細胞養子再注入療法は、主に、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ－ＴおよびＴＩＬを使用することを含む。ＣＡＲ－Ｔは血腫の処置において有効であるが、固形腫瘍を処置する上でのその有効性はなお改善される必要がある。黒色腫臨床試験の結果が最初に開示されて以来、固形腫瘍の処置におけるＴＩＬの有効性が多くの局面において研究されてきた。ＴＩＬ臨床試験は、肺癌、子宮頸癌、頭頸部癌などの処置に拡大されてきた。しかしながら、限界の１つは、ＴＩＬが癌組織から得られ、拡大増殖のための培養時間が比較的長いことである。これは、手術不能な癌を有する患者を処置するのに十分な数のＴＩＬ細胞を得ることを困難にする。

【0005】

既存のＴＩＬ拡大増殖法は、主に、大きな腫瘍組織から始まる。免疫療法の成功には多数のＴＩＬが必要とされる。これは、細胞拡大増殖に伴う技術的および物流上の問題のために達成することが困難であった。外科試料を得ることが困難な患者からＴＩＬを拡大増殖することは特に困難である。現在のＴＩＬ製造過程は、長さ、コストおよび他の要因によっても制限される。

【0006】

特に極めて小さな腫瘍試料または少数のＴＩＬを含有する試料から開始して、効率的かつ迅速なＴＩＬ拡大増殖法を提供する緊急の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、極めて小さな腫瘍試料または少数の出発ＴＩＬ細胞から多数のＴＩＬを迅速に得ることができる方法を提供する。

【0008】

本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をインビトロで拡大増殖または調製するための方法を提供する。本方法は、
（１）試料からＴＩＬを含有する最初の細胞集団を提供する工程であって、前記最初の細胞集団中のＴＩＬの数はｎ０である、工程と、
（２）場合により、前記最初の細胞集団を前処理する工程であって、前記前処理は、前記最初の細胞集団をＩＬ７、ＩＬ１５および／またはＩＬ２１とともに約６時間～約３６時間、約６時間～約４８時間、約６時間～約１２時間、約６時間～約２４時間、約１２時間～約３６時間、約２４時間～約３６時間または約２４時間～約４８時間培養し、前処理された最初の細胞集団を得ることを含む、工程と、
（３）前記最初の細胞集団または前記前処理された最初の細胞集団を第１の支持細胞とともに第１の培養培地中で第１の期間共培養し、第１の拡大増殖された細胞集団を得る工程であって、前記第１の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬの数はｎ１である、工程と、
（４）前記第１の拡大増殖された細胞集団を第２の支持細胞とともに第２の培養培地中で第２の期間共培養し、拡大増殖されたＴＩＬ集団を得る工程であって、前記拡大増殖されたＴＩＬ集団中のＴＩＬの数はｎ２である、工程と、
を含み得る。

【0009】

本明細書で記載される場合、工程（３）は、第１の拡大増殖または第１のＴＩＬ拡大増殖と称される。工程（４）は、第２の拡大増殖または第２のＴＩＬ拡大増殖と称される。

【0010】

第１の期間は、約７日～約１６日、約８日～約１６日、約９日～約１６日、約１０日～約１６日、約１１日～約１６日、約１２日～約１６日、約７日～約１４日、約８日～約１４日、約９日～約１４日、約１０日～約１４日、約１１日～約１４日または約１２日～約１４日の範囲であり得る。

【0011】

第２の期間は、約１０日～約１６日、約８日～約１６日、約９日～約１６日、約１１日～約１６日、約１２日～約１６日、約８日～約１４日、約９日～約１４日、約１０日～約１４日、約１１日～約１４日または約１２日～約１４日の範囲であり得る。

【0012】

試料は腫瘍試料であり得る。腫瘍試料は、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌または黒色腫などの固形腫瘍に由来し得る。

【0013】

試料は、約０．０１ｇ～約０．５ｇ、約０．０１ｇ～約０．４ｇ、約０．０１ｇ～約０．３ｇ、約０．０１ｇ～約０．２ｇ、約０．０１ｇ～約０．１ｇ、約０．０１ｇ～約０．０９ｇ、約０．０１ｇ～約０．０８ｇ、約０．０１ｇ～約０．０７ｇ、約０．０１ｇ～約０．０６ｇ、約０．０１ｇ～約０．０５ｇ、約０．０１ｇ、約０．０２ｇ、約０．０３ｇ、約０．０４ｇまたは約０．０５ｇの範囲の重量を有し得る。

【0014】

最初の細胞集団中のＴＩＬの数ｎ０は、約１，０００～約５０，０００、約２，０００～約５０，０００、約３，０００～約５０，０００、約４，０００～約５０，０００、約５，０００～約５０，０００、約１，０００～約３０，０００、約２，０００～約３０，０００、約３，０００～約３０，０００、約４，０００～約３０，０００、約５，０００～約３０，０００、約１，０００～約１０，０００、約２，０００～約１０，０００、約３，０００～約１０，０００、約４，０００～約１０，０００、または約５，０００～約１０，０００の範囲であり得る。

【0015】

ｎ１／ｎ０は、約１，０００～約１０，０００、約２，０００～約１０，０００、約３，０００～約１０，０００、約４，０００～約１０，０００、約５，０００～約１０，０００、約６，０００～約１０，０００、約７，０００～約１０，０００または約８，０００～約１０，０００の範囲であり得る。

【0016】

第１の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬの数ｎ１は、少なくとももしくは約１×１０^７、少なくとももしくは約０．１×１０^７、少なくとももしくは約０．３×１０^７、少なくとももしくは約０．５×１０^７、少なくとももしくは約０．７×１０^７、少なくとももしくは約０．９×１０^７、少なくとももしくは約１．５×１０^７、少なくとももしくは約２×１０^７、少なくとももしくは約２．５×１０^７、少なくとももしくは約３×１０^７、少なくとももしくは約３．５×１０^７、少なくとももしくは約４×１０^７、少なくとももしくは約４．５×１０^７、少なくとももしくは約５×１０^７、少なくとももしくは約６×１０^７、少なくとももしくは約７×１０^７、少なくとももしくは約８×１０^７、少なくとももしくは約９×１０^７、少なくとももしくは約１×１０^８、少なくとももしくは約１．５×１０^８、少なくとももしくは約２×１０^８、少なくとももしくは約２．５×１０^８、少なくとももしくは約３×１０^８、少なくとももしくは約３．５×１０^８、少なくとももしくは約４×１０^８、少なくとももしくは約４．５×１０^８、少なくとももしくは約５×１０^８、少なくとももしくは約６×１０^８、少なくとももしくは約７×１０^８、少なくとももしくは約８×１０^８、または少なくとももしくは約９×１０^８であり得る。ある特定の態様において、ｎ１は、約０．１×１０^８～約３．０×１０^８または約０．３×１０^８～約２．０×１０^８である。

【0017】

ある特定の態様において、ｎ１／ｎ０は、約１０００～約１０，０００の範囲であり、ｎ１は、少なくとも１×１０^７である。

【0018】

第２の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬの数ｎ２は、少なくとももしくは約１×１０^１０、少なくとももしくは約０．１×１０^１０、少なくとももしくは約０．３×１０^１０、少なくとももしくは約０．５×１０^１０、少なくとももしくは約０．７×１０^１０、少なくとももしくは約０．９×１０^１０、少なくとももしくは約１．５×１０^１０、少なくとももしくは約２×１０^１０、少なくとももしくは約２．５×１０^１０、少なくとももしくは約３×１０^１０、少なくとももしくは約３．５×１０^１０、少なくとももしくは約４×１０^１０、少なくとももしくは約４．５×１０^１０、少なくとももしくは約５×１０^１０、少なくとももしくは約６×１０^１０、少なくとももしくは約７×１０^１０、少なくとももしくは約８×１０^１０、少なくとももしくは約９×１０^１０、少なくとももしくは約１×１０^１１、少なくとももしくは約１．５×１０^１１、少なくとももしくは約２×１０^１１、少なくとももしくは約２．５×１０^１１、少なくとももしくは約３×１０^１１、少なくとももしくは約３．５×１０^１１、少なくとももしくは約４×１０^１１、少なくとももしくは約４．５×１０^１１、少なくとももしくは約５×１０^１１、少なくとももしくは約６×１０^１１、少なくとももしくは約７×１０^１１、少なくとももしくは約８×１０^１１、または少なくとももしくは約９×１０^１１であり得る。ある特定の態様において、ｎ２は、約１×１０^１０～約２×１０^１１である。ある特定の態様において、ｎ２は、約１．０×１０^１１～約２．０×１０^１１である。

【0019】

ｎ２／ｎ１は、約１，０００～約１０，０００、約２，０００～約１０，０００、約３，０００～約１０，０００、約４，０００～約１０，０００、約５，０００～約１０，０００、約６，０００～約１０，０００、約７，０００～約１０，０００、または約８，０００～約１０，０００の範囲であり得る。

【0020】

ある特定の態様において、ｎ２／ｎ１は、約４０００～約１０，０００の範囲であり、ｎ２は、少なくとも１×１０^１０である。

【0021】

最初の細胞集団を得るために、（例えば、工程（１）において）試料を解離溶液で解離させ得る。解離溶液は、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、ＤＮａｓｅおよびヒアルロニダーゼを含む等張溶液を含み得る。

【0022】

第１の培養培地は、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５およびＩＬ２１からなる群より選択される１つ以上のサイトカインを含み得る。

【0023】

第１の培養培地中のＩＬ２の濃度は、約３００ＩＵ／ｍｌ～約１００００ＩＵ／ｍｌの範囲であり得るか、または本明細書に記載される通りであり得る。

【0024】

第１の培養培地において（例えば、第１の拡大増殖において、または工程（３）において）、第２の培養培地（例えば、第２の拡大増殖において、または工程（４）において）または前処理工程（例えば、工程（２））において、ＩＬ７、ＩＬ１５またはＩＬ２１は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌまたは約３ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度を有し得る。

【0025】

第１の拡大増殖と第２の拡大増殖は、同じ培養容器内で、または異なる培養容器内で行われ得る。例えば、第１の拡大増殖は第１の培養容器内で行われ得、第２の拡大増殖は第２の培養容器内で行われ得る。

【0026】

第１の培養培地は、抗ＣＤ３抗体またはその断片、抗４１ＢＢ抗体またはその断片、抗ＯＸ４０抗体またはその断片、および抗ＰＤ－１抗体またはその断片から選択される１つ以上の抗体を含み得る。

【0027】

第２の培養培地は、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片を含み得る。

【0028】

第２の培養培地は、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片で被覆されたマイクロビーズを含み得る。

【0029】

抗ＣＤ３抗体またはその断片は、ＯＫＴ３抗体またはその断片であり得る。

【0030】

第１の支持細胞および／または第２の支持細胞は、抗原提示細胞であり得る。第１の支持細胞および／または第２の支持細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。

【0031】

本開示はまた、本方法によって調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（例えば、拡大増殖されたＴＩＬ集団）を提供する。

【0032】

ＴＩＬ（例えば、拡大増殖後に、例えば、拡大増殖されたＴＩＬ集団）を含む薬学的組成物も本開示によって包含される。

【0033】

薬学的組成物は、薬学的に許容され得る担体をさらに含み得る。

【0034】

本開示はまた、患者における疾患を処置する方法であって、薬学的組成物またはＴＩＬを前記患者に投与することを含む方法を提供する。

【0035】

疾患は癌であり得る。

【0036】

本開示の第１の局面は、ＴＩＬ細胞を調製するための方法を提供する。本方法は、
（１）腫瘍試料からＴＩＬ細胞を含有する最初の細胞集団を提供する工程であって、前記最初の細胞集団中のＴＩＬ細胞の数はｎ０である、工程と、
（２）場合により、前記最初の細胞集団を前処理する工程であって、前記前処理は、前記最初の細胞集団をＩＬ７、ＩＬ１５および／またはＩＬ２１の存在下で約６時間～約３６時間、約８時間～約３０時間または約１０時間～約２４時間培養し、前処理された最初の細胞集団を得ることを含む、工程と、
（３）前記最初の細胞集団（または前記前処理された最初の細胞集団）と第１の支持細胞とを第１の培養培地中で期間、ｔ１共培養し、第１の拡大増殖された細胞集団を得る工程であって、前記第１の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬ細胞の数はｎ１であり、ｎ１／ｎ０は、約１０００～約１００００であり、ｎ１≧１×１０^７である、工程と、
（４）前記第１の拡大増殖された細胞集団を第２の支持細胞とともに第２の培養培地中で期間、ｔ２共培養し、第２の拡大増殖された細胞集団（すなわち、拡大増殖されたＴＩＬ集団）を得る工程であって、前記第２の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬ細胞の数はｎ２であり、ｎ２／ｎ１は、約４０００～約１００００であり、ｎ２≧１×１０^１０である、工程と、
を含み得る。

【0037】

工程（３）は、第１の培養容器内で実施され得る。工程（４）は、第２の培養容器内で実施され得る。工程（３）と工程（４）は、同じ培養容器内で実施され得る。

【0038】

ある特定の態様において、ｔ１は、約７日間～約１６日間または約９日間～約１４日間である。

【0039】

ある特定の態様において、ｔ２は、約１０日～約１６日、または約１２日～約１４日である。

【0040】

ある特定の態様において、第２の拡大増殖された細胞集団中の細胞の総数を基準として、第２の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬ細胞の純度は、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９２％、少なくとももしくは約９４％、少なくとももしくは約９５％であり、またはそれより高い。

【0041】

ある特定の態様において、工程（３）および（４）の総拡大増殖比ｎ２／ｎ０は、約０．１×１０^７～約２０×１０^７、または約１×１０^７～約１０×１０^７である。

【0042】

ある特定の態様において、ｎ０は、≧２０００である。

【0043】

ある特定の態様において、第１の培養培地は、基礎培養培地、血清または血清代替物、および／またはＬ－グルタミンを含む。ある特定の態様において、第１の培養培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１から選択される１つ以上のサイトカインを含む。ある特定の態様において、第１の培養培地は、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片（例えば、ＯＫＴ３抗体またはその断片）、抗４１ＢＢ抗体もしくはその断片、抗ＯＸ４０抗体もしくはその断片、抗ＰＤ－１抗体もしくはその断片、またはこれらの組み合わせを含む。

【0044】

ある特定の態様において、第１の拡大増殖では、共培養の開始時に、最初の細胞集団（または前処理された最初の細胞集団）中のＴＩＬ細胞の、第１の支持細胞に対する細胞数比Ｒ１は、約１：１０～約１：１００００、約１：１０～約１：１０００、約１：１０～約１：５０００、約１：２０～約１：５０００、約１：１０～約１：５００、約１：２５～約１：５００、約１：２５～約１：４００、約１：２５～約１：３００、約１：２５～約１：２００または約１：２５～約１：１００の範囲である。

【0045】

ある特定の態様において、第２の拡大増殖では、共培養の開始時に、第１の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬ細胞の、第２の支持細胞に対する細胞数比Ｒ２は、約１：２～約１：４００、約１：２～約１：１，０００、約１：２～約１：５００、約１：２～約１：３００、約１：２～約１：２００、約１：２～約１：１００、約１：５～約１：４００、約１：５～約１：１，０００、約１：５～約１：５００、約１：５～約１：３００、約１：５～約１：２００、約１：５～約１：１００、約１：１０～約１：４００、約１：１０～約１：１，０００、約１：１０～約１：５００、約１：１０～約１：３００、約１：１０～約１：２００または約１：１０～約１：１００の範囲である。

【0046】

ある特定の態様において、腫瘍試料はインビトロ試料である。

【0047】

ある特定の態様において、腫瘍試料は、極めて小さな腫瘍試料または少数の出発ＴＩＬを含有する試料である。

【0048】

ある特定の態様において、腫瘍試料は、切除生検試料および切開生検試料などの生検試料であり得る。ある特定の態様において、腫瘍試料は腫瘍生検試料であり得る。ある特定の態様において、腫瘍試料は、穿刺吸引生検試料などの吸引生検試料であり得る。ある特定の態様において、腫瘍試料は、切除または剥離された腫瘍試料であり得る。ある特定の態様において、腫瘍試料は穿刺試料であり得る。ある特定の態様において、腫瘍試料は外科試料であり得る。

【0049】

ある特定の態様において、腫瘍試料は腫瘍患者から得られる。

【0050】

ある特定の態様において、試料は、高用量ＩＬ－２（例えば、６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む増殖培地中で維持され得、腫瘍の破壊および／またはＴＩＬの増殖についてモニターされ得る。処理後に残存している生存細胞を有する任意の腫瘍は単一細胞懸濁液へと酵素的に消化されて、凍結保存され、またはＴＩＬの拡大増殖のために直接処理され得る。

【0051】

ある特定の態様において、ＴＩＬ細胞は、解離後のＴＩＬの選択などの方法によって得られた少数の出発細胞を含む。

【0052】

ある特定の態様において、腫瘍試料は、限定されないが、肺癌、子宮頸癌および卵巣癌などの固形腫瘍を含む。

【0053】

ある特定の態様において、腫瘍試料は、約０．０１ｇ～約０．０５ｇ、約０．０１ｇ～約０．０５ｇ、約０．０２ｇ～約０．０４ｇ、約０．０１ｇ、約０．０２ｇ、約０．０３ｇ、約０．０４ｇまたは約０．０５ｇの重量を有する。

【0054】

ある特定の態様において、腫瘍試料は、約０．０１ｇ～約０．５ｇ、約０．０１ｇ～約０．４５ｇ、約０．０１ｇ～約０．４ｇ、約０．０１ｇ～約０．３５ｇ、約０．０１ｇ～約０．３ｇ、約０．０１ｇ～約０．２５ｇ、約０．０１ｇ～約０．２ｇ、約０．０１ｇ～約０．１５ｇ、約０．０１ｇ～約０．１ｇ、約０．０１ｇ～約０．０９ｇ、約０．０１ｇ～約０．０８ｇ、約０．０１ｇ～約０．０７ｇ、約０．０１ｇ～約０．０６ｇ、約０．０６ｇ、約０．０７ｇ、約０．０８ｇ、約０．０９ｇ、約０．１ｇ、約０．１５ｇ、約０．２ｇ、約０．２５ｇ、約０．３ｇ、約０．３５ｇ、約０．４ｇ、約０．４５ｇまたは約０．５ｇの重量を有する。

【0055】

ある特定の態様において、ｎ０は、約１，０００～約５０，０００、約２，０００～約５０，０００、約２，０００～約１０，０００または約３，０００～約１０，０００である。

【0056】

ある特定の態様において、ｎ１は、約０．１×１０^８～約３．０×１０^８または約０．３×１０^８～約２．０×１０^８である。

【0057】

ある特定の態様において、ｎ２は、約１×１０^１０～約２×１０^１１である。ある特定の態様において、ｎ２は、約１．０×１０^１１～約２．０×１０^１１である。

【0058】

本方法の一態様は、ＴＩＬを（場合により単離し、）培養する前に固形腫瘍組織を酵素的に消化することをさらに含む。

【0059】

ある特定の態様において、腫瘍試料は、ＴＩＬ細胞を含有する最初の細胞集団を得るために解離溶液で解離され得る。解離溶液は、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、ＤＮａｓｅ、ヒアルロニダーゼおよび／または等張溶液を含み得る。

【0060】

ある特定の態様において、等張溶液は、培養培地、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）などを含むが、これらに限定されない。

【0061】

ある特定の態様において、解離溶液中で、コラゲナーゼＩＩは、約０．１ｇ／ｍｌ～約１０ｇ／ｍｌの濃度を有し、コラゲナーゼＩＶは、約０．１ｇ／ｍｌ～約１０ｇ／ｍｌの濃度を有し、ＤＮａｓｅは、約０．１ｇ／ｍｌ～約１０ｇ／ｍｌの濃度を有し、ヒアルロニダーゼは約１０Ｕ／ｍｌ～約１０００Ｕ／ｍｌの濃度を有する。

【0062】

ある特定の態様において、前処理工程（例えば、工程（２））では、第１の培養培地では（（例えば、工程（３）では）または第２の培養培地では（（例えば、工程（４）では）、ＩＬ７は約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度を有し得る。ＩＬ１５は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度を有し得る。ＩＬ２１は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度を有し得る。

【0063】

ある特定の態様において、最初の細胞集団中のＴＩＬ細胞の、第１の支持細胞に対する細胞数比は、約１：１０～約１：１００００、約１：１００～約１：６００または約１：２００～約１：４００であり得る。

【0064】

ある特定の態様において、第１の培養培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１から選択される１つ以上のサイトカインを含有する。ある特定の態様において、第１の培養培地は、抗ＣＤ３抗体またはその断片（例えば、ＯＫＴ３抗体またはその断片）、抗４１ＢＢ抗体またはその断片、抗ＯＸ４０抗体またはその断片および抗ＰＤ－１抗体またはその断片から選択される１つ以上の抗体を含有する。

【0065】

ある特定の態様において、第１の培養培地は液体培養培地である。

【0066】

ある特定の態様において、第１の培養培地は完全培養培地である。

【0067】

ある特定の態様において、第１の培養培地中で、ＯＫＴ３は約３ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの濃度を有する。

【0068】

ある特定の態様において、第１の培養培地中でまたは第２の培養培地中で、ＩＬ２は、約３００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約５，０００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約８００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約１，０００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約１，２００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約１，５００ＩＵ／ｍｌ～約１００００ＩＵ／ｍｌ、約１，８００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約２，０００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約３，０００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約４，０００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約５，０００ＩＵ／ｍｌ～約１００００ＩＵ／ｍｌ、約６，０００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約７，０００ＩＵ／ｍｌ～約１００００ＩＵ／ｍｌ、約８，０００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約９，０００ＩＵ／ｍｌ～約１００００ＩＵ／ｍｌ、約３００ＩＵ／ｍｌ～約５，０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ～約５，０００ＩＵ／ｍｌ、約１，０００ＩＵ／ｍｌ～約８，０００ＩＵ／ｍｌ、約１，０００ＩＵ／ｍｌ～約５，０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ、約６００ＩＵ／ｍｌ、約７００ＩＵ／ｍｌ、約８００ＩＵ／ｍｌ、約９００ＩＵ／ｍｌ、約１，０００ＩＵ／ｍｌ、約２，０００ＩＵ／ｍｌ、約３，０００ＩＵ／ｍｌ、約４，０００ＩＵ／ｍｌ、約５，０００ＩＵ／ｍｌ、約６，０００ＩＵ／ｍｌ、約７，０００ＩＵ／ｍｌ、約８，０００ＩＵ／ｍｌ、約９，０００ＩＵ／ｍｌまたは約１０，０００ＩＵ／ｍｌの濃度を有する。

【0069】

ある特定の態様において、第１の拡大増殖（例えば、工程（３））において、培養過程の間、ＴＩＬ細胞の数は、約２０万細胞／ｍｌ（０．２×１０^６細胞／ｍｌ）～約４００万細胞／ｍｌ（４×１０^６細胞／ｍｌ）であるように調節される。

【0070】

ある特定の態様において、細胞密度は、流体／培地置換または灌流／注入によって調節される。

【0071】

ある特定の態様において、第１の支持細胞は、放射線照射された細胞である。

【0072】

ある特定の態様において、支持細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および／または抗原提示細胞などを含むが、これらに限定されない。ある特定の態様において、支持細胞は、ＰＢＭＣ由来の支持細胞を含み得る。ある特定の態様において、支持細胞は、Ｋ５６２細胞から生じた人工抗原提示細胞を含み得る（Ｆｏｒｇｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｇｒａｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１４，３７（９）：４４８－４６０；Ｌｏｚｚｉｏ ｅｔｃ．，Ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ－ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，Ｂｌｏｏｄ．１９７５，４５：３２１－３３４）。

【0073】

いくつかの態様において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。いくつかの態様において、ＰＢＭＣは放射線照射され、同種異系である。いくつかの態様において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。

【0074】

一態様において、支持細胞は、放射線照射されたＰＢＭＣである。

【0075】

第１の支持細胞と第２の支持細胞は、同じであり得、または異なり得る。

【0076】

ある特定の態様では、工程（３）において、培養は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ Ｓｙｓｔｅｍで行われる。

【0077】

ある特定の態様では、工程（３）において、培養は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で行われる。

【0078】

ある特定の態様において、細胞は、第１の拡大増殖後に（例えば、工程（３）の後に）凍結保存される。

【0079】

ある特定の態様において、第２の拡大増殖（例えば、工程（４））のために接種されるＴＩＬ細胞の数は、２０×１０^６よりも大きい。

【0080】

ある特定の態様において、第２の培養培地は液体培養培地である。

【0081】

ある特定の態様において、第２の培養培地は完全培養培地である。

【0082】

ある特定の態様において、完全培養培地は、基礎培養培地、血清もしくは血清代替物、Ｌ－グルタミンおよび／またはサイトカインを含む。

【0083】

ある特定の態様において、基礎培養培地は、ＡＩＭ－Ｖ、ＲＰＭＩ－１６４０、オプティマイザＣＴＳ Ｔ細胞拡大増殖基礎培養培地、Ｘ－ｖｉｖｏ １５、ＴｅｘＭＡＣＳまたはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0084】

ある特定の態様において、血清または血清代替物は、ヒトＡＢ ＳｅｒｕｍまたはＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）を含むが、これらに限定されない。

【0085】

ある特定の態様において、Ｌ－グルタミンは、Ｌ－グルタミン１００×またはＳＧ－２００ Ｓｔａｂｌｅ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅを含むが、これらに限定されない。

【0086】

ある特定の態様において、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0087】

ある特定の態様において、ＩＬ２の濃度範囲は、約３００ＩＵ／ｍｌ～約１０，０００ＩＵ／ｍｌである。

【0088】

ある特定の態様において、ＩＬ７、ＩＬ１５および／またはＩＬ２１の濃度範囲は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌである。

【0089】

ある特定の態様において、第２の培養培地は、ＯＫＴ３、抗ＣＤ３ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）またはこれらの組み合わせを含む成分をさらに含有する。

【0090】

ある特定の態様において、第２の培養培地において、ＯＫＴ３は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度を有する。

【0091】

ある特定の態様において、第２の培養培地において、抗ＣＤ３ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の量（数）は、接種されたＴＩＬ細胞の数の約１～３倍である。

【0092】

ある特定の態様において、第２の培養培地において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の量（数）は、接種されたＴＩＬ細胞の数の１～３倍である。

【0093】

ある特定の態様において、工程（４）では、培養は、Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）、ＷＡＶＥまたはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）などの培養容器中で行われる。

【0094】

ある特定の態様において、第１の拡大増殖された細胞集団および第２の支持細胞は、Ｘｕｒｉ Ｗ２５細胞バッグ中に接種される。

【0095】

ある特定の態様において、細胞バッグの体積は、約２Ｌ～約５０Ｌである。

【0096】

ある特定の態様において、Ｘｕｒｉ Ｗ２５は、以下から選択される１つ以上のパラメータを含む：

【表1】

【0097】

ある特定の態様において、ＴＩＬがＸｕｒｉ Ｗ２５中で拡大増殖される場合、培養体積は約３００ｍｌ～約２５０００ｍｌの範囲内である。

【0098】

ある特定の態様において、ＴＩＬがＸｕｒｉ Ｗ２５中で拡大増殖される場合、ＴＩＬ細胞の密度範囲は、約０．０１×１０^６細胞／ｍｌ～約５０×１０^６細胞／ｍｌである。

【0099】

ある特定の態様において、ＴＩＬがＸｕｒｉ Ｗ２５中で拡大増殖される場合、培養過程中の灌流手順は以下の通りである。

【表2】

【0100】

注:Vは培養系の体積である。

【0101】

ある特定の態様において、前記方法は、ＴＩＬ細胞を得るために、第１の拡大培養されたＴＩＬ細胞集団の再拡大増殖を行う工程（５）をさらに含む。工程（５）において、再拡大増殖は、Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）、ＷＡＶＥまたはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）などの培養系において実施され得る。

【0102】

ある特定の態様において、工程（５）では、再拡大増殖後に、細胞の洗浄、濃縮および／または採集が行われる。洗浄および濃縮は、ＬＯＶＯ／Ｓｅｆｉａ／Ｓｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ／Ｓｅｐａｘ ２／ＣＳ５＋／ＣＳＥなどにおいて実施され得る。いくつかの態様において、採集は、ＬＯＶＯ細胞処理系を使用して行われる。

【0103】

ある特定の態様において、ＬＯＶＯ／Ｓｅｆｉａ／Ｓｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ／Ｓｅｐａｘ ２／ＣＳ５＋／ＣＳＥのパラメータ（洗浄および濃縮パラメータを含む）は以下の通りである。

【0104】

処理することができる試料の体積は、約５０ｍｌ～約２２０００ｍｌの範囲である；
容器中に流入する試料の速度は、約５０ｍｌ／分～約２００ｍｌ／分の範囲である；
容器から流出する試料の速度は、約５０ｍｌ／分～約２００ｍｌ／分の範囲である；
洗浄サイクルの数は、約１～約５の範囲である；および／または
細胞を洗浄し、濃縮した後、排出体積は約５０ｍｌ～約２０００ｍｌの範囲である。

【0105】

ある特定の態様において、洗浄用の洗浄液は、０．９％塩化ナトリウム溶液、化合物電解質（注入）組成物、グルコースおよび塩化ナトリウム（注入）組成物またはこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0106】

ある特定の態様において、洗浄溶液は、約０．１％～約５％のヒト血清アルブミンをさらに含有する。

【0107】

ある特定の態様において、工程（４）では、一定分量に分割することが再拡大増殖後に行われる。

【0108】

ある特定の態様において、一定分量に分割することは、Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｎｅｃｔ試料分割パイプラインおよびＳｅｐａｘ ２、Ｓｅｐａｘ Ｃ－ｐｒｏまたはＳｅｆｉａ試料分割装置を使用することによって実行される。

【0109】

ある特定の態様において、一定分量に分割することは、洗浄および濃縮後に行われる。

【0110】

ある特定の態様において、洗浄および濃縮パラメータは、以下を含む：
処理することができる試料の体積は、約５ｍｌ～約５００ｍｌの範囲である；
一定分量への分割の排出体積は約５ｍｌ～約４００ｍｌの範囲である；および／または
凍結保存溶液を添加した後の細胞試料中のＤＭＳＯの濃度は、０％～約１０％の範囲である。

【0111】

いくつかの態様において、前記方法は、凍結保存過程を使用して、第１の拡大増殖後および／または第２の拡大増殖後に細胞を凍結保存する工程をさらに含む。

【0112】

いくつかの態様において、凍結保存過程は、採集されたＴＩＬ集団の、凍結保存培地に対する１：１の比を使用して行われる。

【0113】

いくつかの態様において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。いくつかの態様において、凍結保存培地は、７％～１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。

【0114】

いくつかの態様において、第２の拡大増殖後に採集されたＴＩＬの治療集団は、ＴＩＬの治療有効投与量に十分なＴＩＬを含む。

【0115】

いくつかの態様において、治療有効投与量に十分なＴＩＬの数は、少なくとももしくは約１×１０^１０、少なくとももしくは約２×１０^１０、少なくとももしくは約３×１０^１０、少なくとももしくは約４×１０^１０、少なくとももしくは約５×１０^１０、少なくとももしくは約６×１０^１０、少なくとももしくは約７×１０^１０、少なくとももしくは約８×１０^１０、少なくとももしくは約９×１０^１０、または少なくとももしくは約１０×１０^１０である。

【0116】

本開示の第２の局面は、本開示の第１の局面に記載された方法によって調製／拡大増殖されたＴＩＬ細胞を提供する。

【0117】

本開示の第３の局面は、本方法によって調製されたＴＩＬ細胞の、抗腫瘍薬の調製における適用を提供する。

【0118】

本開示の範囲内で、本開示の上記技術的特徴および以下で具体的に説明される技術的特徴（態様など）は、互いに組み合わせて、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成することができることを理解されたい。紙幅の制約のため、ここでは１つずつ繰り返さない。

【図面の簡単な説明】

【0119】

【図1】図１は、小さな試料からのＴＩＬ拡大増殖の概略図である。

【図2】図２は、小さな試料からのＴＩＬ拡大増殖の方法フロー図である。

【図3】図３は、凍結保存前および後の第１の拡大増殖から得られたＴＩＬ細胞の比較を示す。

【図4】図４は、第１の拡大増殖および第２の拡大増殖のＴＩＬ拡大増殖曲線を示す。

【図5】図５は、第１の拡大増殖（第１の迅速拡大増殖プロトコル（ＲＥＰ）または「第１のＲＥＰ」）および第２の拡大増殖（「第２のＲＥＰ」）から得られたＴＩＬ細胞のマーカーの比較を示す。

【図6】図６は、Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）を使用した第１の拡大増殖についての細胞の増殖曲線を示すグラフである。

【図7】図７は、第１の拡大増殖中のＴＩＬ細胞の増殖および分化に対する添加されたサイトカインの効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0120】

本開示は、ＴＩＬを拡大増殖させるための改善された方法を提供する。本方法は、ＴＩＬの改善された有効性、改善された表現型、および増加した代謝的健康をもたらす。

【0121】

本開示は、極めて小さな腫瘍試料から多数のＴＩＬを迅速に得ることができる方法を提供する。例えば、解離および拡大増殖後に、小さな腫瘍組織から多数のＴＩＬ細胞を生産することができる。本方法は、ＴＩＬ洗浄およびパッケージングを実行するために、Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）／Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）／Ｗａｖｅおよび他の細胞拡大増殖システム、ならびにＬＯＶＯ／Ｓｅｆｉａ／Ｓｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ／Ｓｅｐａｘ ２／ＣＳ５＋／ＣＳＥおよび他の閉鎖系の使用を含み得、これらは生産能力を改善し得、工業生産に適している。

【0122】

本方法では、腫瘍反応性Ｔ細胞（例えば、ＴＩＬ）が単離され得、（例えば、養子細胞移入療法において）投与を必要とする患者に投与するために、細胞は所望の量まで培養拡大増殖される。

【0123】

本発明のＴＩＬまたは組成物によって処置されるべき様々な癌の例には、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが含まれるが、これらに限定されない。

【0124】

本開示は、腫瘍反応性Ｔ細胞を単離および培養するための組成物および方法を提供する。一態様において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離し、培養するための組成物および方法を提供する。

【0125】

本開示は、養子免疫療法において使用するための細胞を急速に単離および培養するための組成物および方法を含む。一態様において、単離された細胞は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。

【0126】

ＴＩＬは、固形腫瘍組織の試料から単離され、培養され得る。

【0127】

別の局面において、本開示は、養子移入のための細胞療法において使用するためのＴＩＬを濃縮および拡大増殖させることを含む。一態様において、ＴＩＬは、インビトロ拡大増殖の前に腫瘍試料から選択的に単離される。

【0128】

さらに別の局面において、細胞はＩＬ－２の存在下で培養される。

【0129】

さらに別の局面において、本開示は、患者において腫瘍を処置する方法であって、腫瘍を処置することを必要とする患者に有効量のＴＩＬの集団を投与することを含む、方法を含む。

【0130】

凍結保存培地は、細胞の凍結保存のために使用することができる任意の培地を指し得る。このような培地は、７％～１０％のＤＭＳＯを含む培地を含むことができる。例示的な培地としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍａｓｏｌおよびこれらの組み合わせが挙げられる。「ＣＳ１０」という用語は、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから得られる凍結保存培地を指す。ＣＳ１０培地は、商品名「ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０」と呼ばれ得る。ＣＳ１０培地は、ＤＭＳＯを含む無血清動物成分非含有培地である。

【0131】

一般に、ＴＩＬは、最初に患者腫瘍試料から得られ（「初代ＴＩＬ」）、次いで、本明細書中に記載されるようなさらなる操作のために、より大きな集団に拡大増殖され得、凍結保存、解凍または再刺激されてもよく、ＴＩＬの健康の指標として表現型および代謝パラメータについて評価されてもよい。

【0132】

患者腫瘍試料は、外科的切除、針生検、または腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を得るための他の手段などを介して、当技術分野で公知の方法を用いて取得され得る。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍または転移性腫瘍を含む任意の固形腫瘍に由来し得る。腫瘍試料はまた、血液悪性腫瘍から得られる腫瘍などの液体腫瘍であり得る。固形腫瘍は、乳房、膵臓、前立腺、結腸直腸、肺、脳、腎臓、胃および皮膚癌（扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫および黒色腫を含むが、これらに限定されない）を含むがこれらに限定されない任意の癌型のものであり得る。

【0133】

一旦得られると、腫瘍試料は、鋭的剥離を使用して小片に断片化され得る。ＴＩＬは、酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養され得る。このような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液、２ｍＭグルタマート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅおよび１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、その後の（例えば、組織解離器を使用した）機械的解離によって生成され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に配置し、約１分間腫瘍を機械的に解離させた後、５％ ＣＯ_２中、３７℃で３０分間インキュベーションを行い、その後、小さな組織片のみが存在するまで前述の条件下での機械的解離およびインキュベーションのサイクルを繰り返すことによって生成され得る。この方法の最後に、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するために、ＦＩＣＯＬＬ分岐親水性多糖を使用した密度勾配分離が実施され得るその開示が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替方法が使用され得る。前述の方法のいずれもが、ＴＩＬを拡大増殖させる方法または癌を処置する方法に関して本明細書に記載される態様のいずれにおいても使用され得る。

【0134】

いくつかの態様において、断片化は、例えば、剥離および消化を含む物理的な断片化を含む。いくつかの態様において、断片化は物理的断片化である。いくつかの態様において、断片化は剥離である。いくつかの態様において、断片化は消化によるものである。いくつかの態様において、ＴＩＬは、酵素的腫瘍消化物および患者から得られた腫瘍断片から最初に培養され得る。一態様において、ＴＩＬは、酵素的腫瘍消化物および患者から得られた腫瘍断片から最初に培養され得る。

【0135】

いくつかの態様において、ＴＩＬは腫瘍消化物から得られる。いくつかの態様において、腫瘍消化物は、酵素培地、例えば限定するものではないが、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅおよび１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中でのインキュベーション、その後の機械的解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．）によって生成される。腫瘍を酵素培地中に配置した後、腫瘍を約１分間機械的に解離させることができる。次いで、５％ＣＯ_２中３７℃で、溶液を３０分間インキュベートすることができ、次いで再び約１分間機械的に破壊される。５％ＣＯ_２中３７℃で３０分間再びインキュベートした後、約１分間、腫瘍に３回目の機械的破壊を行うことができる。いくつかの態様において、第３の機械的破壊の後に大きな組織片が存在する場合、５％ＣＯ_２中、３７℃でさらに３０分間のインキュベーションありまたはなしで、１または２回の追加の機械的解離が試料に適用された。いくつかの態様において、最終インキュベーションの最後に、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するために、Ｆｉｃｏｌｌを使用した密度勾配分離を実施することができる。

【0136】

いくつかの態様において、第１の拡大増殖は、約７日間～約１６日間、約９日間～約１４日間、約５日間～約１６日間、約６日間～約１６日間、約８日間～約１６日間、約９日間～約１６日間、約１０日間～約１６日間、約１１日間～約１６日間、約１２日間～約１６日間、約９日間～約１２日間、約８日間～約１２日間または約７日間～約１２日間進行することができる。

【0137】

いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間または約２０日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約１日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約２日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約３日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約４日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約５日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約６日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約７日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約８日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約９日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、１０日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約１１日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約１２日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約１３日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約１日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、２日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約３日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約４日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約５日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約６日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、７日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約８日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約９日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第１のＴＩＬ拡大増殖は、約１０日間～約１１日間進行することができる。

【0138】

いくつかの態様において、第２の拡大増殖は、約７日間～約１６日間、約９日間～約１４日間、約５日間～約１６日間、約６日間～約１６日間、約８日間～約１６日間、約９日間～約１６日間、約１０日間～約１６日間、約１１日間～約１６日間、約１２日間～約１６日間、約９日間～約１２日間、約８日間～約１２日間、約７日間～約１２日間、約５日間～約１８日間、約６日間～約１８日間、約７日間～約１８日間、約８日間～約１８日間、約９日間～約１８日間、約１０日間～約１８日間、約１１日間～約１８日間、約１２日間～約１８日間、約１３日間～約１８日間、約５日間～約１６日間、約６日間～約１６日間、約８日間～約１６日間、約９日間～約１６日間、約１０日間～約１６日間、約１１日間～約１６日間、約１２日間～約１６日間進行することができる。

【0139】

いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間または約２０日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約１日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約２日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約３日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約４日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約５日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約６日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約７日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約８日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約９日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約１０日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約１１日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約１２日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約１３日間～約１４日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約１日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約２日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約３日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約４日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約５日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約６日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約７日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約８日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約９日間～約１１日間進行することができる。いくつかの態様において、第２のＴＩＬ拡大増殖は、約１０日間～約１１日間進行することができる。

【0140】

ある特定の態様では、（第１の拡大増殖のための）第１の培養培地において、ＯＫＴ３は、約３ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ～約８０ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ～約６０ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌまたは約３ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度を有し得る。いくつかの態様において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。一態様において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬおよび約１ｐｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。一態様において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。

【0141】

ある特定の態様では、（第２の拡大増殖のための）第２の培養培地において、ＯＫＴ３は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌまたは約３ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌの濃度を有し得る。いくつかの態様において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。一態様において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬおよび約１ｐｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。一態様において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。

【0142】

いくつかの態様において、支持細胞は、ＰＢＭＣなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。一態様において、第１の拡大増殖および／または第２の拡大増殖における、ＴＩＬの、支持細胞（例えば、ＰＢＭＣおよび／または抗原提示細胞）に対する比は、約１～２５、約１～５０、約１～１００、約１～１２５、約１～１５０、約１～１７５、約１～２００、約１～２２５、約１～２５０、約１～２７５、約１～３００、約１～３２５、約１～３５０、約１～３７５、約１～４００または約１～５００である。一態様において、第１の拡大増殖および／または第２の拡大増殖における、ＴＩＬの、支持細胞（例えば、ＰＢＭＣ）に対する比は、１～５０と１～３００の間である。一態様において、第１の拡大増殖および／または第２の拡大増殖における、ＴＩＬの、支持細胞（例えば、ＰＢＭＣおよび／または抗原提示細胞）に対する比は、１～１００と１～２００の間である。

【0143】

ある特定の態様において、支持細胞は、健康な血液ドナーからの標準的な全血単位から得られた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準的な方法を使用して取得され得る。

【0144】

支持細胞（例えば、ＰＢＭＣ）は、第１または第２の拡大増殖において使用される前に、例えば放射線照射または熱処理を介して不活化され得る。

【0145】

免疫細胞は、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞であり得る。本明細書に記載されている方法は、癌、感染性疾患および免疫不全症を含む多数の疾患を処置するために使用され得る。

【0146】

一態様において、ＴＩＬは患者にとって自家である。

【0147】

ある特定の態様において、腫瘍反応性Ｔ細胞は、固形腫瘍組織から単離される。腫瘍組織は、ＴＩＬを調製する前に患者から除去される。ＩＬ－２の存在下で細胞を培養することによって、ＴＩＬをさらに濃縮することができる。

【0148】

別の態様は、腫瘍組織からＴ細胞を得ることを含む。腫瘍組織は癌性細胞を含み得る。Ｔ細胞は、フローサイトメトリー、負もしくは正の選択、または他の方法などによって、培養または拡大増殖の前に腫瘍組織の塊から単離され得る。

【0149】

別の局面において、ＴＩＬの集団は、末梢血、骨髄または腹水などの液体腫瘍組織から単離される。

【0150】

本開示はまた、対象から腫瘍組織試料を得ることおよび腫瘍組織からＴＩＬを単離することを含む、養子細胞免疫療法のために対象から拡大された数のＴＩＬを得る方法を含む。

【0151】

本発明は、腫瘍反応性Ｔ細胞の集団の単離および拡大増殖のための方法を包含する。

【0152】

培養装置は、インビトロで細胞を培養する際に一般的に使用される任意の培養装置であり得る。

【0153】

細胞培養培地は、細胞の培養中に任意の時点で交換され得る。例えば、細胞培地を３～４日毎に交換され得る。

【0154】

細胞は、任意の所望の段階で培養装置から採集され得、その時点で、細胞は、すぐに使用され得るか、または後に使用するために保存するために凍結保存され得る。

【0155】

一局面において、本開示は、腫瘍反応性Ｔ細胞を培養する方法であって、閉鎖されたチャンバー内の固形腫瘍組織の試料から細胞を単離し、培養することを含む方法を含む。閉鎖されたチャンバーまたは密閉された装置内で細胞を培養することにより、汚染のリスクを防止し、または実質的に軽減し得る。閉鎖されたチャンバーまたは密閉された装置は、細胞療法を生成するために臨床研究室において使用される任意の適切な培養容器を含み得る。

【0156】

一態様において、ＩＬ２の存在下で細胞を培養することができる。

【0157】

一態様において、抗ＣＤ３抗体（またはその断片）および／または抗ＣＤ２８抗体（またはその断片）などの免疫細胞刺激リガンドの存在下で細胞を培養することができる。

【0158】

別の態様において、抗ＣＤ３抗体（またはその断片）および／または抗ＣＤ２８抗体（またはその断片）は、細胞とともに培養されるビーズに結合される。抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体（またはその断片）は、同じビーズ上に、すなわち「シス」で、または別個のビーズに、すなわち「トランス」で、ビーズ上に固定化され得る。一態様において、ＴＩＬ細胞拡大増殖および細胞増殖のためにビーズに結合された各抗体（またはその断片）の１：１の比が使用される。一態様において、ビーズに結合されたＣＤ３：ＣＤ２８抗体（またはこれらの断片）の比は、１００：１から１：１００の範囲およびその間の全ての整数値である。本開示の一局面において、抗ＣＤ３抗体（またはその断片）よりも多くの抗ＣＤ２８抗体（またはその断片）が粒子に結合されている、すなわちＣＤ３：ＣＤ２８の比は１：１未満である。本開示のある特定の態様において、ビーズに結合された、抗ＣＤ２８抗体（またはその断片）の、抗ＣＤ３抗体（またはその断片）に対する比は２：１より大きい。特定の一態様において、ビーズに結合された抗体（またはその断片）の約１：１００の抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８比が使用される。別の態様において、ビーズに結合された抗体（またはその断片）の約１：７５の抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８比が使用される。さらなる態様において、ビーズに結合された抗体（またはその断片）の約１：５０の抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８比が使用される。別の態様において、ビーズに結合された抗体（またはその断片）の約１：３０の抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８比が使用される。１つの好ましい態様において、ビーズに結合された抗体（またはその断片）の約１：１０の抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８比が使用される。別の態様において、ビーズに結合された抗体（またはその断片）の約１：３の抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８比が使用される。さらに別の態様において、ビーズに結合された抗体（またはその断片）の約３：１の抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８比が使用される。

【0159】

ある特定の態様において、マイクロビーズはポリマーマイクロビーズである。ある特定の態様において、マイクロビーズは磁性マイクロビーズである。ある特定の態様において、マイクロビーズは磁性ポリマーマイクロビーズである。ある特定の態様において、マイクロビーズは超常磁性ポリマーマイクロビーズである。ポリマーは、ポリスチレン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリクオタニウムポリマー、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマーまたはポリウレタンを含み得る。ある特定の態様において、マイクロビーズは磁性ビーズである。ある特定の態様において、マイクロビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）である。ある特定の態様において、マイクロビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））は、γＦｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４磁性材料を含む単分散／均一、超常磁性およびポリマー性マイクロスフェアである。マイクロビーズは、ＣＤ３および／またはＣＤ２８細胞表面分子に対して特異的な抗体を吸着または結合するための担体として作用するポリマー材料の層で被覆される。

【0160】

細胞培養に適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト胎児血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦＰおよびＴＮＦ－αまたは当業者に公知の、細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＭｅｄｉａまたはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。細胞の増殖のための他の添加剤としては、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、添加されたアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンを含む、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができ、無血清であるか、または適切な量の血清（または血漿）もしくは所定のホルモンのセット、ならびに／もしくは細胞の増殖および拡大増殖に十分な量の（１または複数の）サイトカインが補充されている。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。

【0161】

本開示は、ＴＩＬ細胞を調製するための方法を提供する。本方法は、
（１）腫瘍試料からＴＩＬ細胞を含有する最初の細胞集団を提供する工程であって、前記最初の細胞集団中のＴＩＬ細胞の数はｎ０である、工程と、
（２）場合により、前記最初の細胞集団に対する前処理を実施する工程であって、前記前処理は、ＩＬ７、ＩＬ１５および／またはＩＬ２１サイトカインの存在下で６～３６時間（好ましくは８～３０時間、より好ましくは１０～２４時間）培養し、前処理された最初の細胞集団を得る工程を含む、工程と、
（３）第１の培養容器中で、前の工程で得られた前記最初の細胞集団と第１の支持細胞とを第１の培養培地中で期間ｔ１共培養し、拡大増殖されたＴＩＬ細胞を含有する第１の拡大増殖された細胞集団を得る工程であって、前記第１の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬ細胞の数はｎ１であり、ｎ１／ｎ０は、１０００～１００００であり、ｎ１≧１×１０^７である、工程と、
（４）前記第１の拡大増殖された細胞集団を第２の培養容器に移し、第２の支持細胞とともに第２の培養培地中で期間ｔ２共培養し、拡大増殖されたＴＩＬを含有する第２の拡大増殖された細胞集団を得る工程であって、前記第２の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬ細胞の数はｎ２であり、ｎ２／ｎ１は、４０００～１００００であり、ｎ２≧１×１０^１０である、工程と、
を含み得る。

【0162】

ある特定の態様において、ｔ１は、７～１６日または９～１４日である。

【0163】

ある特定の態様において、ｔ２は、１０～１６日または１２～１４日である。

【0164】

ある特定の態様において、第２の拡大増殖された細胞集団中の細胞の総数を基準として、第２の拡大増殖された細胞集団中のＴＩＬ細胞の純度Ｐは９０％以上である。

【0165】

ある特定の態様において、純度Ｐは、少なくとももしくは約９２％、少なくとももしくは約９４％、および少なくとももしくは約Ｐ≧９５％であり、またはそれより高い。

【0166】

ある特定の態様において、工程（３）および（４）の総拡大増殖率（ｎ１×ｎ２）／ｎ０は、０．１×１０^７～２０×１０^７、好ましくは１×１０^７～１０×１０^７である。

【0167】

ある特定の態様において、ｎ０は≧２０００である。

【0168】

ある特定の態様において、工程（３）では、共培養の開始時に、最初の細胞集団中での、ＴＩＬ細胞の第１の支持細胞に対する細胞数比Ｒ１は、１：１０～１：１００００である。

【0169】

ある特定の態様において、工程（４）では、共培養の開始時に、最初の細胞集団中の、ＴＩＬ細胞の第２の支持細胞に対する細胞数比Ｒ２は、１：２～１：４００である。

【0170】

ある特定の態様において、腫瘍試料はインビトロ試料である。

【0171】

ある特定の態様において、腫瘍試料は、限定されないが、肺癌、子宮頸癌および卵巣癌などの固形腫瘍を含む。

【0172】

好ましくは、腫瘍試料は、０．０１～０．０５ｇ以上、より好ましくは０．０２～０．０４ｇ、例えば０．０２ｇ、０．０３ｇまたは０．０４ｇの重量を有する。

【0173】

好ましくは、ｎ０は、１，０００～５０，０００、好ましくは２，０００～５０，０００、より好ましくは２，０００～１０，０００、より好ましくは３，０００～１０，０００である。

【0174】

ある特定の態様において、ｎ１は、０．１×１０^８～３．０×１０^８、好ましくは０．３×１０^８～２．０×１０^８である。

【0175】

ある特定の態様において、ｎ２は、１×１０^１０～２×１０^１１である。

【0176】

ある特定の態様において、ｎ２は、１．０×１０^１１～２．０×１０^１１である。

【0177】

ある特定の態様において、工程（１）では、ＴＩＬ細胞を含有する最初の細胞集団を得るために、腫瘍試料は解離溶液で解離され、解離溶液は、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、ＤＮａｓｅ、ヒアルロニダーゼおよび細胞等張溶液を含む、
ある特定の態様において、等張溶液は、培養培地、ＤＰＢＳなどを含むが、これらに限定されない。

【0178】

ある特定の態様では、解離溶液中で、コラゲナーゼＩＩは、０．１ｇ／ｍｌ～１０ｇ／ｍｌの濃度を有し、コラゲナーゼＩＶは、０．１ｇ／ｍｌ～１０ｇ／ｍｌの濃度を有し、ＤＮａｓｅは、０．１ｇ／ｍｌ～１０ｇ／ｍｌの濃度を有し、ヒアルロニダーゼは１０Ｕ／ｍｌ～１０００Ｕ／ｍｌの濃度を有する。

【0179】

ある特定の態様では、工程（２）において、ＩＬ７サイトカインは、１０ｎｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの濃度を有する。

【0180】

ある特定の態様では、工程（２）において、ＩＬ１５サイトカインは、１０ｎｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの濃度を有する。

【0181】

ある特定の態様では、工程（２）において、ＩＬ２１サイトカインは、１０ｎｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの濃度を有する。

【0182】

ある特定の態様では、工程（３）において、最初の細胞集団中での、ＴＩＬ細胞の第１の支持細胞に対する細胞数比は、１：１０～１：１００００、好ましくは１：１００～１：６００、より好ましくは１：２００～１：４００である。

【0183】

ある特定の態様において、第１の培養培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＯＫＴ３抗体、抗４１ＢＢ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ－１またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインを含有する。

【0184】

さらなる局面において、本開示は、ＴＩＬを含む薬学的組成物を提供する。

【0185】

ＴＩＬはまた、治療、例えば細胞療法、または疾患の予防において薬学的組成物として使用することができる。薬学的組成物は、動物またはヒト、例えばヒト患者に移植され得る。薬学的組成物は、薬学的有効量の薬学的組成物の哺乳動物への投与を含むことがある、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の処置および／または予防のために使用することができる。本開示の薬学的組成物は、処置（または予防）されるべき疾患に適切な様式で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験によって決定され得る。

【0186】

本方法によって得られる、ＴＩＬの組成物は、単独で、または希釈剤とおよび／もしくはサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせて薬学的組成物として投与され得る。簡潔には、本薬学的組成物は、１つ以上の薬学的にまたは生理学的に許容され得る、担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、ＴＩＬを含み得る。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤などを含み得る。

【0187】

一態様において、本方法を使用して拡大増殖されたＴＩＬは、薬学的組成物として患者に投与される。一態様において、薬学的組成物は、無菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本方法を使用して拡大増殖されたＴＩＬは、当技術分野で公知の任意の適切な経路によって投与され得る。いくつかの態様において、ＴＩＬは、約３０～６０分持続し得る単一の動脈内または静脈内注入として投与される。他の適切な投与経路としては、腹腔内、髄腔内およびリンパ内が挙げられる。

【0188】

薬学的組成物中に提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、組成物が投与される形態、処置されるべき対象の性別および年齢、処置されるべき対象の体重、ならびに主治医の選好および経験に依存する。適切であれば、臨床的に確立された投与量のＴＩＬも使用され得る。ＴＩＬの投与量など、本明細書の方法を使用して投与される薬学的組成物の量は、処置されているヒトまたは哺乳動物、障害または症状の重症度、投与速度、活性薬学的成分の体内動態および処方医師の裁量に依存する。

【0189】

いくつかの態様において、ＴＩＬは単回用量で投与され得る。このような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。いくつかの態様において、ＴＩＬは複数回用量で投与され得る。投薬は、１年間に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または６回超であり得る。投薬は、１ヶ月に１回、２週間に１回、１週間に１回、または１日おきに１回であり得る。ＴＩＬの投与は、必要な限り長く継続し得る。

【0190】

有効量のＴＩＬは、鼻腔内および経皮経路、動脈内注射、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植、または吸入によるものを含む、同様の有用性を有する作用物質の許容された投与様式のいずれによっても、単回用量または複数回用量のいずれかで投与され得る。

【0191】

本開示はまた、本ＴＩＬまたは本組成物を含有するキットを包含する。

【0192】

いくつかの態様において、キットは、本発明のＴＩＬまたは本発明の組成物、およびキットを使用するための説明書を含む。要素は、個別にまたは組み合わせて提供され得る。

【0193】

いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載される要素の１つ以上を利用する方法において使用するための１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器で提供され得る。例えば、キットは、１つ以上の反応または保存緩衝剤を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態で、または使用前に（例えば、濃縮物または凍結乾燥形態での）１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態で提供され得る。

【0194】

「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」という用語は、血流から離れて腫瘍内に移動した白血球を指す。ＴＩＬは、以下の細胞：ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１およびＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞およびＭ１マクロファージの１つ以上の種類を含み得る。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子改変されたＴＩＬを含むことができる。

【0195】

ＴＩＬは、一般に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、または腫瘍に浸潤して処置をもたらす能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、以下のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１およびＣＤ２５の１つ以上を発現することによって分類され得る。これに加えておよびこれに代えて、ＴＩＬは、患者内への再導入に際して固形腫瘍に浸潤する能力によって機能的に定義することができる。

【0196】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、腫瘍組織または間質に浸潤する単核免疫細胞を指し得る。ＴＩＬは、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を含み得、その集団は、機能、活性および／またはバイオマーカー発現に基づいて細分類され得る。例えば、ＴＩＬの集団は、例えばＣＤ３および／またはＣＤ８を発現する細胞傷害性Ｔ細胞、ならびにＦＯＸＰ３発現によってしばしば特徴付けられる制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても知られる）を含み得る。

【0197】

抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ３が含まれる。抗ＣＤ３抗体はまた、Ｔ３およびＣＤ３ｃとしても知られるＵＨＣＴ１クローンを含む。他の抗ＣＤ３抗体としては、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブおよびビジリズマブが挙げられる。ある特定の態様において、ＯＫＴ３は、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体であり得る。

【0198】

本明細書で使用される場合、「ＩＬ２」という用語はインターロイキン２である。ＩＬ２には、ヒト型および哺乳動物型、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオ後続品およびこれらのバリアントを含むＩＬ２の全ての形態が含まれる。ＩＬ－２は、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２，３９８３－８８、およびＭａｌｅｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，４５３－７９に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。例えば、ＩＬ－２という用語は、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、使い捨てバイアル当たり２２００万ＩＵで複数の供給業者から市販されている）などの、ヒトの組換え形態のＩＬ－２ならびにＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎ．Ｈ．，ＵＳＡ（ＣＥＬＬＧＲＯ ＧＭＰ）またはＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２０９－ｂ）によって市販されている組換えＩＬ－２の形態および他の供給元からの他の市販の等価物を包含する。アルデスロイキン（デス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、およそ１５ｋＤａの分子量を有するＩＬ－２の非グリコシル化ヒト組換え形態である。ＩＬ－２という用語はまた、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４を含む、ＩＬ－２のペグ化形態も包含する。

【0199】

「抗体」という用語は、インタクトな分子ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体などの抗体断片の両方を含む。本明細書で使用される 「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を指し得る。抗体は、任意の種、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヒトなどのものであり得る。治療目的のために、非ヒト抗原結合断片が使用される場合には、当該分野で公知の任意の方法によって非ヒト抗原結合断片をヒト化することができる。抗体はまた、修飾された抗体（例えば、オリゴマー、還元された抗体、酸化された抗体および標識された抗体）であり得る。

【0200】

本明細書で使用される場合、「Ｘｕｒｉ Ｗ２５」という用語は、Ｘｕｒｉ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｗ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を指す。

【0201】

本明細書で使用される場合、「完全培養培地」という用語は、基礎培養培地、血清または血清代替物、Ｌ－グルタミンおよび１つ以上のサイトカインの混合物を指す。基礎培養培地は、ＡＩＭ－Ｖ、ＲＰＭＩ－１６４０、オプティマイザＣＴＳ Ｔ細胞拡大増殖基礎培地、Ｘ－ｖｉｖｏ １５およびＴｅｘＭＡＣＳを含むが、これらに限定されない。血清または血清代替物は、Ｈｕｍａｎ ＡＢ ＳｅｒｕｍおよびＣＴＳ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ＳＲを含むが、これらに限定されない。Ｌ－グルタミンは、Ｌ－グルタミン１００×およびＳＧ－２００ Ｓｔａｂｌｅ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅを含むが、これらに限定されない。サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１を含むが、これらに限定されない。ある特定の態様において、ＩＬ－２の濃度範囲は、約３００ＩＵ／ｍｌ～約６０００ＩＵ／ｍｌであり得る。ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１の濃度範囲は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌであり得る。

【0202】

本方法の主な利点は、以下のことを含み得る。小さな腫瘍組織または少数の出発ＴＩＬ細胞から、本方法は、比較的短い期間で１０^１１個以上のＴＩＬ細胞を生産することができる。本開示による方法は、ＴＩＬ細胞がほとんど分化せずに素早く拡大増殖され得るように、小さな腫瘍試料中の微量のＴＩＬ細胞を急速かつ容易に刺激することができる。２巡の、拡大増殖および支持細胞との共培養の組み合わせは、Ｔｅｆｆ（エフェクターＴ細胞）への細胞の分化を抑制しながら、短い期間で多数のＴＩＬ細胞を生産するのに役立つ。本開示による方法では、ＴＩＬ細胞の開始数は、わずか数千個のＴＩＬ細胞（例えば、２０００以上）とすることができ、従来技術で必要とされる開始数よりもはるかに少ない。方法全体のために使用される時間は、約１９～約２４日以内であり得る。本開示による方法では、支持細胞の数を調整することによって、約９～約１４日以内に、異なる出発数のＴＩＬ細胞を少なくとも３０００万個の細胞に拡大増殖させることができる。本方法は、１×１０^１１～２×１０^１１個のＴＩＬ細胞を生成することができ、これは、先行技術における方法によって得られるものよりも多い。本開示による方法では、組織／細胞は、直接培養される代わりに最初に解離される。本方法は、従来技術の方法よりも簡単であり、２回の拡大増殖後に所望の数の細胞を得ることができる。本開示による方法では、第１の拡大増殖後に得られる細胞は２．５×１０^７であり得、第２の拡大増殖後に１０^１１以上のＴＩＬ細胞を生成することができる。総拡大増殖比は、従来技術の総拡大増殖比をはるかに超える。ある特定の態様において、細胞の数に影響を与えることなくセントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）の比を増加させるために、ＩＬ７／ＩＬ１５／ＩＬ２１の組み合わせが第１の拡大増殖において使用される。本開示による方法では、第１の工程で使用されるＩＬ２の濃度は、約３００ＩＵ／ｍｌ～約１００００ＩＵ／ｍｌの低い濃度であり得る。

【0203】

常に明示的に述べられているわけではないが、全ての数値指定には「約」という用語が前置され得ることを理解されたい。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記載がない限り、「約」という用語は、特定の値に対して許容され得る誤差範囲内を意味すると仮定されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の値±１０％を指す。

【0204】

処置されるべき症状
ＴＩＬおよび組成物は、癌、免疫不全疾患および感染症を処置するために患者に投与され得る。

【0205】

ＴＩＬおよび組成物は、過剰増殖性障害を処置するために患者に投与され得る。

【0206】

いくつかの態様において、過剰増殖性障害は癌である。いくつかの態様において、過剰増殖性障害は、固形腫瘍癌である。いくつかの態様において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌または腎細胞癌腫であり得る。いくつかの態様において、過剰増殖性障害は血液悪性腫瘍である。いくつかの態様において、固形腫瘍癌は、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫またはマントル細胞リンパ腫であり得る。

【0207】

ＴＩＬは、免疫活性（リンパ球活性、ナチュラルキラー細胞活性など）の機能障害に罹患している患者に投与され得る。例えば、患者は、処置されていない免疫細胞に対して抵抗性である低酸素腫瘍を有し得る。あるいは、患者は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症または他の真核細胞感染症（すなわち、原虫）などの感染性疾患に罹患し得る。本明細書の組成物および細胞は、炎症を引き起こす任意の疾患を処置するために使用され得る。組成物および細胞はまた、抗病原体Ｔ細胞の効力を増加させる必要が存在する任意の疾患を処置するために使用され得る。

【0208】

本開示は、患者において腫瘍を処置する方法であって、腫瘍を処置することを必要とする患者に有効量のＴＩＬの集団を投与することを含む、方法を提供する。

【0209】

いくつかの態様において、癌には、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、子宮内膜癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌および腎細胞癌腫が含まれるが、これらに限定されない。

【0210】

ＴＩＬは、血液悪性腫瘍または固形腫瘍を処置するために患者に投与され得る。

【0211】

「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節およびリンパ系の組織を含むがこれらに限定されない、造血およびリンパ組織の哺乳動物癌および腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液体腫瘍」とも呼ばれる。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。「Ｂ細胞性血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。液体腫瘍癌には、白血病、骨髄腫およびリンパ腫、ならびに他の血液悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。

【0212】

固形腫瘍は良性または悪性であり得る。固形腫瘍には、悪性、新生物性または癌性固形腫瘍が含まれ得る。固形腫瘍癌には、肉腫、癌腫およびリンパ腫、例えば、肺、乳房、前立腺、結腸、直腸および膀胱の癌が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣＣ）を含む）神経膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵臓癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌および非小細胞肺癌腫から選択される。

【0213】

ある特定の態様において、炎症性疾患には、喘息、自己免疫疾患（多発性硬化症および関節リウマチなど）、慢性炎症、慢性前立腺炎、糖尿病（糖尿病性潰瘍を含む）、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再灌流傷害、関節リウマチまたは血管炎が含まれるが、これらに限定されない。

【0214】

疾患がウイルス感染症である場合、疾患は、アデノウイルス科のメンバー（アデノウイルスなど）、コロナウイルス科のメンバー（ＳＡＲＳなど）、ピコルナウイルス科のメンバー（コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルスまたはポリオウイルスなど）、ヘルペスウイルス科のメンバー（エプスタイン・バー・ウイルス、単純ヘルペス、１型、単純ヘルペス、２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、８型または水痘帯状疱疹ウイルスなど）、ヘパドナウイルス科のメンバー（Ｂ型肝炎ウイルスなど）、フラビウイルス科のメンバー（Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルスなど）、レトロウイルス科のメンバー（ＨＩＶまたはＨＴＬＶ－１など）、オルトミクソウイルス科のメンバー（インフルエンザウイルスなど）、パラミクソウイルス科のメンバー（麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）、パポーバウイルス科のメンバー（パピローマウイルスなど）、ラブドウイルス科のメンバー（狂犬病ウイルスなど）またはトガウイルス科のメンバー（風疹ウイルスなど）の（例えば）任意の１つによって引き起こされ得る。ある特定の態様において、ウイルスは、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡウイルスまたはｄｓＲＮＡウイルスである。ウイルスは、エンベロープを有するか、またはエンベロープを有しないことがあり得る。

【0215】

いくつかの態様において、処置されるべき疾患は、乳癌；膀胱癌；肺癌；前立腺癌；甲状腺癌；白血病およびリンパ腫、例えば、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）、ＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＰＭＬ（前骨髄球性白血病）；結腸癌；神経膠腫；精上皮腫；肝臓癌；膵臓癌；膀胱癌；腎癌；子宮頸癌；精巣癌；頭頸部癌；卵巣癌；神経芽細胞腫および黒色腫などの癌である。

【0216】

本明細書の処置方法は、ヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの任意の哺乳動物とともに使用され得ることが理解されよう。いくつかの態様において、対象は脊椎動物である。ある特定の態様において、対象は哺乳動物である。

【0217】

ある特定の態様において、本発明の細胞は、抗腫瘍剤、抗癌剤などを含むがこれらに限定されない治療剤と組み合わせて使用することができる。

【0218】

ある特定の態様において、抗腫瘍剤または抗癌剤は、アルキル化薬、葉酸拮抗薬、プリン拮抗薬、ピリミジン拮抗薬、紡錘体毒、ポドフィロトキシン、抗生物質、ニトロソ尿素、無機イオン、生物学的応答調節剤、酵素またはホルモンである。

【0219】

ある特定の態様において、養子免疫療法は、免疫応答を増強する第２の処置と組み合わされる。第２の処置は、例えば、アジュバントおよび／またはサイトカインであり得る。サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。ヒト成長ホルモン、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；上皮成長因子；肝成長因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子－αおよび腫瘍壊死因子－β；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ－αなどの神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ－αおよびＴＧＦ－βなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子－Ｉおよび－ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン－α、－βおよび－γなどのインターフェロン マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）；および顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）；ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ－αまたはＴＮＦ－βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子がサイトカインに含まれる。サイトカインには、天然源由来または組換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。

【0220】

本開示は、特定の態様に関連して以下でさらに説明される。これらの態様は、本開示を例示するためにのみ使用され、本開示の範囲を限定するために使用されるものではないことを理解されたい。以下の実施例において特定の条件を示さない実験方法は、通常、慣用の条件または製造業者によって推奨される条件に従う。特に明記しない限り、百分率および部は重量によって計算される。

【0221】

［実施例１］
ＴＩＬ細胞を調製するための方法を研究した。小さな腫瘍試料中のＴＩＬの拡大増殖の概略図が図１に示されており、過程フローチャートが図２に示されている。方法は以下の通りである。

【0222】

１．腫瘍組織解離：
ａ．腫瘍組織を秤量し、ＤＰＢＳで数回すすぎ、細胞培養皿に移した。腫瘍組織を使い捨てのメスで小片に切断した後、約５～５０ｍｌ／ｇ（解離溶液体積／試料重量）の比率で解離溶液を添加した。解離溶液中の小さな腫瘍組織片を、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブまたは通常のチューブ、トランスファー・バッグ、細胞培養皿などの１つ以上の反応容器中に入れた。

【0223】

解離溶液は、等張溶液中にコラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、ＤＮａｓｅ、ヒアルロニダーゼを含有した。等張溶液は、培養培地、ＤＰＢＳなどを含むことができるが、これらに限定されない。コラゲナーゼＩＩの濃度範囲：０．１ｇ／ｍｌ～１０ｇ／ｍｌであり；コラゲナーゼＩＶの濃度範囲：０．１ｇ／ｍｌ～１０ｇ／ｍｌであり；ＤＮａｓｅの濃度範囲：０．１ｇ／ｍｌ～１０ｇ／ｍｌであり；ヒアルロニダーゼの濃度範囲は１０Ｕ／ｍｌ～１０００Ｕ／ｍｌであった。

【0224】

ｂ．プログラムを設定して実行した。腫瘍試料の異なる腫瘍型に応じて異なるプログラムを使用した。解離手順が終了した後、Ｃチューブチューブを組織プロセッサから取り外し、組織から解離された全ての断片および細胞が懸濁液から分離されるように、遠心分離のために遠心分離機に配置した。

【0225】

様々な腫瘍組織に対して、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳは、３７℃＿ｈ＿ＴＤＫ＿１または３７℃＿ｈ＿ＴＤＫ＿２または３７℃＿ｈ＿ＴＤＫ＿３を使用することができる。あるいは、手動ピペット操作と組み合わせて、または３７℃の一定温度で振盪もしくは回転させることによる混合と組み合わせて、３７℃のインキュベーターが使用され得る。

【0226】

ｃ．腫瘍試料の解離後、細胞懸濁液を吸引し、（約２０μｍ～約７０μｍのろ過器孔径を有する）細胞ろ過器を通してろ過して、細胞を含有するろ液を得た。遠心分離後、上清を除去して、解離された細胞（最初の細胞集団）を得た。

【0227】

ｄ．最初の細胞集団をＴＩＬ細胞培養培地中に再懸濁した。ＩＬ７、ＩＬ１５およびＩＬ２１サイトカインを添加し（ＩＬ７、ＩＬ１５およびＩＬ２１サイトカインはそれぞれ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度を有した）、約６時間～約３６時間培養して、前処理された最初の細胞集団を得た。

【0228】

２．支持細胞と最初の細胞集団との共培養（第１の拡大増殖）
ａ．放射線照射された支持細胞を、ＴＩＬ細胞の数に応じて一定の割合で細胞培養培地（完全培養培地）中に再懸濁し、上記の前処理された最初の細胞集団と混合した。次いで、ＯＫＴ３抗体、高濃度ＩＬ２ならびに他の関連サイトカインおよび／または抗体を添加したときに、それらを一緒にＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍに移した。

【0229】

ＴＩＬの、支持細胞に対する細胞数比は、約１：１０～約１：１００００の範囲であった。

【0230】

ＯＫＴ３の濃度範囲は約３ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌであり、
ＩＬ２の濃度範囲は約３００ＩＵ／ｍｌ～約１００００ＩＵ／ｍｌであった。

【0231】

他の関連する因子は、ＩＬ７／ＩＬ１５／ＩＬ２１および抗４１ＢＢ抗体またはその断片、抗ＯＸ４０抗体またはその断片、抗ＰＤ１抗体またはその断片および他のＴ細胞刺激物質の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0232】

ｂ．細胞増殖および分化状態を厳密にモニターした。培養培地の注入および置換を適時に行った。

【0233】

過程中に、細胞をサンプリングし、計数した。予想細胞数に達した後、第１の拡大増殖を開始した。拡大増殖された細胞は、第２の拡大増殖前に凍結保存され得る。

【0234】

第１の拡大増殖のパラメータは以下の通りであった：
溶液注入体積の範囲は２～１００ｍｌであった。

【0235】

拡大増殖後に採集されたＴＩＬ細胞の数は２×１０^７個～２×１０^８個であった。

【0236】

第１の拡大増殖は、約７日～約１６日、または約９日～約１４日であった。

【0237】

凍結保存溶液は、ＣＳ１０などを含むが、これに限定されない。

【0238】

３．第１の拡大増殖された細胞集団である支持細胞およびＴＩＬ細胞の第２の共培養（第２の拡大増殖）
ａ．工程２で得られたＴＩＬ細胞（第１の拡大増殖された細胞集団）、または凍結保存された細胞を解凍した後１～３日間培養された細胞を支持細胞とともに、Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）／Ｗａｖｅ／Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）などの細胞拡大増殖システム中に接種した。凍結保存前および後の第１の拡大増殖から得られたＴＩＬ細胞の比較が図３に示されている。このように、凍結保存は、細胞の特性に著しく影響しなかった。活性化剤ＯＫＴ３／抗ＣＤ３ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ／抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを添加して、細胞を急速に拡大増殖させた。

【0239】

凍結保存された細胞を解凍した後、約０．５×１０^６／ｍｌ～約５×１０^６／ｍｌの範囲の密度でＴＩＬ細胞を接種し、約１２時間～約７２時間、前培養した。

【0240】

ＴＩＬ細胞の、支持細胞に対する細胞数比は、ＴＩＬ：支持細胞＝１：２０～１：４００の範囲であった。接種時のＴＩＬ細胞数は２０×１０^６個を超えていた。活性化剤ＯＫＴ３の濃度範囲は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌであった。抗ＣＤ３ Ｄｙｎａｂｅａｄｓおよび抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓの数は、接種されたＴＩＬ細胞の数の１～３倍であった。

【0241】

Ｘｕｒｉ Ｗ２５（２Ｌ／１０Ｌ／２０Ｌ／５０Ｌ Ｃｅｌｌｂａｇ）の例では、Ｘｕｒｉ Ｗ２５の装置パラメータが表１に示されている。

【表3】

【0242】

Ｘｕｒｉ Ｗ２５（２Ｌ／１０Ｌ／２０Ｌ／５０Ｌ Ｃｅｌｌｂａｇ）中でＴＩＬ細胞を急速に拡大増殖させた場合、培養体積は約３００ｍｌ～約２５０００ｍｌの範囲であり、ＴＩＬ細胞密度は約０．０１×１０^６／ｍｌ～約５０×１０^６／ｍｌの範囲であった。培養過程における灌流手順のパラメータが表２に示されている。

【表4】

【0243】

ｂ．６～１８日間培養した後、急速な拡大増殖後のＴＩＬ細胞の洗浄および濃縮のために、ＬＯＶＯ／Ｓｅｆｉａ／Ｓｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ／Ｓｅｐａｘ ２／ＣＳ５＋／ＣＳＥを使用した。

【0244】

細胞の洗浄および濃縮のための装置は、ＬＯＶＯ／Ｓｅｆｉａ／Ｓｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ／Ｓｅｐａｘ ２／ＣＳ５＋／ＣＳＥを含むが、これらに限定されない。

【0245】

処理された試料の体積は、約５０ｍｌ～約２２０００ｍｌの範囲であった。

【0246】

容器に流入する試料の速度は、約５０ｍｌ／分～約２００ｍｌ／分の範囲であった。

【0247】

容器から流出する試料の速度は、約５０ｍｌ／分～約２００ｍｌ／分の範囲であった。

【0248】

洗浄サイクルの数は１～５の範囲であった。

【0249】

細胞を洗浄し、濃縮した後、排出体積は５０ｍｌ～２０００ｍｌの範囲であった。

【0250】

洗浄溶液は、０．９％塩化ナトリウム溶液、化合物電解質注射組成物、およびグルコースおよび塩化ナトリウム注射組成物、ならびにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。洗浄溶液はまた、約０．１％～約５％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンを含み得る。

【0251】

ｃ．工程ｂの後にＴＩＬ細胞を一定分量に分割するために、Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｎｅｃｔアリコーティングチューブ、Ｓｅｐａｘ ２、Ｓｅｐａｘ Ｃ－ｐｒｏ、Ｓｅｆｉａおよび他のアリコーティング機器または消耗品が使用され得る。

【0252】

工程ｃでは、まず凍結保存液を添加し、次いで細胞を一定分量に分割した。アリコーティングシステムは、Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｎｅｃｔアリコーティングチューブ、Ｓｅｐａｘ ２、Ｓｅｐａｘ Ｃ－ｐｒｏおよびＳｅｆｉａを含むが、これらに限定されない。

【0253】

取り扱うことができる試料の体積は５ｍｌ～５００ｍｌの範囲であった。

【0254】

一定分量への分割の排出体積は５ｍｌ～４００ｍｌの範囲であった。

【0255】

凍結保存溶液を添加した後の細胞試料中のＤＭＳＯの最終濃度は、０％～１０％（ｖ／ｖ）の範囲内であった。

【0256】

実験結果
第１の拡大増殖および第２の拡大増殖のＴＩＬ拡大増殖曲線が図４に示されている。図４から、いずれの拡大増殖も、ＴＩＬ細胞を効果的に拡大増殖させることを可能にすることが明らかである。

【0257】

第１の拡大増殖（第１のＲＥＰ）および第２の拡大増殖（第２のＲＥＰ）後の細胞マーカーのレベルが図５に示されている。図５から、ＴＩＬ細胞のマーカーが拡大増殖後に効果的に発現されたことが明らかである。

【0258】

第１の拡大増殖において、ＴＩＬ細胞の増殖および分化に対する、添加されたサイトカインの効果が図７に示す。図７から、添加されたサイトカインは、ＴＩＬ細胞の増殖を効果的に促進することができることが明らかである。

【0259】

［実施例２～５および比較実施例１～２］
実施例２～５では、異なる腫瘍患者からの腫瘍試料を使用したことを除いて、実施例１を繰り返した。

【0260】

比較例１では、異なる前処理を使用した。比較例２では、ＯＫＴ３は使用されず、培養された細胞は支持細胞と直接接触しなかった。

【0261】

実施例１～５と比較例１～２の間での調製過程の差およびそれらの拡大増殖効果が、表３および表４に示されている。

【表5】

【表6】

【0262】

［実施例６］
細胞の出発数がスクリーニング後に２０００個の選択されたＴＩＬであったことを除いて、実施例１を繰り返した。第１の拡大増殖はＰｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で行った。細胞増殖曲線が図６に示されている。

【0263】

考察
ＴＩＬ細胞を調製する本方法の態様／実施例と国際公開第２０１９１０００２３号の態様／実施との比較が表５に示されている。

【表7】

【0264】

表５から、本開示に記載されている方法は、多数のＴＩＬ細胞を生成するために、極めて少数のＴＩＬ細胞を拡大増殖させることができることが明らかである。

【0265】

本開示の範囲は、本明細書の上で具体的に示され、説明されたものによって限定されない。当業者は、材料、構成、構造および寸法の図示された例に対する適切な代替が存在することを認識するであろう。特許および様々な刊行物を含む多数の参考文献が、本発明の説明において引用され、論述されている。そのような参考文献の引用および論述は、単に本開示の説明を明確にするために提供されており、任意の参考文献が本明細書に記載されている本発明の先行技術であることを認めるものではない。本明細書で引用および論述される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載されているものの変形、修正、およびその他の実施は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者に想到されるであろう。本開示のある特定の態様を示し、説明してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく変更および修正を行い得ることは当業者には明らかであろう。前述の説明および添付の図面に記載された事項は、例示としてのみ提供され、限定として提供されるものではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】