特表 2024-502035 ＴＮＦＲ２に対する抗体およびそれの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-17

(54)【発明の名称】ＴＮＦＲ２に対する抗体およびそれの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240110BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240110BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240110BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240110BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

C12N1/19 ZNA

C12N1/21

C12N1/15

C12N5/10

C12N15/63 Z

C12N15/13

A61K39/395 N

A61P37/02

A61P35/00

C07K16/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539977

(86)(22)【出願日】2021-12-30

(85)【翻訳文提出日】2023-08-22

(86)【国際出願番号】 US2021065649

(87)【国際公開番号】W WO2022147222

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】63/132,584

(32)【優先日】2020-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/166,042

(32)【優先日】2021-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521339223

【氏名又は名称】ノヴァロック バイオセラピューティクス， リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100103182

【弁理士】

【氏名又は名称】日野 真美

(74)【代理人】

【識別番号】100209037

【弁理士】

【氏名又は名称】猪狩 俊博

(72)【発明者】

【氏名】ペイ，イ

(72)【発明者】

【氏名】ファン，ハイチュン

(72)【発明者】

【氏名】レイ，ミン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ハン

(72)【発明者】

【氏名】サム，チ，シン

(72)【発明者】

【氏名】プリツカー，アラ

(72)【発明者】

【氏名】リン，ボル－ルエイ

(72)【発明者】

【氏名】タン，ファンチアン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB41

4C085BB43

4C085BB44

4C085CC23

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4H045AA11

4H045BA09

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA20

4H045GA23

4H045GA25

(57)【要約】

本開示は、ヒトＴＮＦＲ２に結合する抗体およびそれの抗体断片を提供する。本開示の抗体は、ＴＮＦ－ＴＮＦＲ２シグナル伝達軸を阻害し、エフェクターＴ細胞におけるサイトカイン分泌を増強し、したがって、単独でまたは他の薬剤との組合せでのいずれかで、がんの処置に有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１３、ＣＤＲ２：配列番号１４、ＣＤＲ３：配列番号１５、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１６、ＣＤＲ２：配列番号１７、ＣＤＲ３：配列番号１８；
（ｂ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１９、ＣＤＲ２：配列番号２０、ＣＤＲ３：配列番号２１、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号２２、ＣＤＲ２：配列番号２３、ＣＤＲ３：配列番号２４；
（ｃ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号２５、ＣＤＲ２：配列番号２６、ＣＤＲ３：配列番号２７、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号２８、ＣＤＲ２：配列番号２９、ＣＤＲ３：配列番号３０；
（ｄ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３１、ＣＤＲ２：配列番号３２、ＣＤＲ３：配列番号３３、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号３５、ＣＤＲ３：配列番号３６；
（ｅ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号３８、ＣＤＲ３：配列番号３９、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号４０、ＣＤＲ３：配列番号４１；
（ｆ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号４９、ＣＤＲ３：配列番号３９、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号４０、ＣＤＲ３：配列番号４１；または
（ｇ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４２、ＣＤＲ２：配列番号４３、ＣＤＲ３：配列番号４４、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４５、ＣＤＲ２：配列番号４６、ＣＤＲ３：配列番号４７
を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体。

【請求項2】

（ａ）配列番号１に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号２に記載の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号３に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号４に記載の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号５に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号６に記載の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号７に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号８に記載の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号９に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号１０に記載の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号４８に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号１０に記載の配列を有する軽鎖可変領域；または
（ｇ）配列番号１１に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号１２に記載の配列を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体。

【請求項3】

配列番号５０に記載の重鎖定常領域を含む、請求項２に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体。

【請求項4】

配列番号５１に記載の軽鎖定常領域を含む、請求項２に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体。

【請求項5】

完全ヒト抗体である、請求項１に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体。

【請求項6】

キメラ抗体である、請求項１に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体。

【請求項7】

二重特異性抗体または多重特異性抗体である、請求項１に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体。

【請求項8】

ヒト化抗体である、請求項１に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体。

【請求項9】

抗体断片である、請求項１に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体。

【請求項10】

前記抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、単鎖抗体、ミニボディ、ならびにダイアボディからなる群から選択される、請求項９に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体。

【請求項11】

活性成分として、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体の少なくとも１つおよび医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項12】

抗ＴＮＦＲ２のＴＮＦ－αへの結合を阻害することによって免疫系をモジュレートするのに使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

がんを処置するのに使用するための、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

がんを処置する方法であって、請求項１１または１２に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項15】

請求項１に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項16】

配列番号１～１２のいずれか１つに記載の配列をコードする、請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項17】

請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項18】

請求項１６に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項19】

請求項１に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の作製方法であって、請求項１８に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、作製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本国際特許出願は、それの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１２月３１日出願の、米国仮特許出願第６３／１３２，５８４号の利益を主張するものである。

【0002】

配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、コピー用紙の代わりにテキストフォーマットで提供され、ここで、本明細書に参照により組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名前は、１２７７５５－５０１１－ＵＳ０２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ．である。テキストファイルは、約１０２ＫＢであり、およそ２０１８年７月１９日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂにより電子的に提出されている。

【0003】

分野
本開示は、免疫療法の分野であり、ヒトＴＮＦＲ２受容体に結合する抗体およびそれの断片、これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列、およびそれらを産生する細胞に関する。本開示は、これらの抗体を含む組成物、およびがん免疫療法のＴＮＦ－ＴＮＦＲ２軸をモジュレートするためそれらの使用方法にさらに関する。

【背景技術】

【0004】

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ／ＴＮＦＲＳＦ）は、免疫と非免疫細胞両方の細胞活性の調節に重要な役割を果たす（Dostert et al., Physiol. Rev., 99(1):115-160, 2019）。実際、ＴＮＦＳＦ／ＴＮＦＲＳＦメンバーは、免疫応答の共刺激または共阻害のいずれかを駆動する様々な細胞および分子メカニズムの調整のために重要な方法で自然免疫細胞と獲得免疫細胞の両方を制御する（Ward-Kavanagh, et al., Immunity, 44: 1005-1019, 2016）。ＴＮＦは、腫瘍微小環境内に豊富であり、腫瘍免疫回避を容易にし、腫瘍増殖を促進する。

【0005】

ＴＮＦ、炎症性サイトカインは、主に免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、ならびにＴおよびＢ細胞）によって産生され、２つの構造的に異なる膜貫通受容体：Ｉ型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ１、ｐ５５およびＴＮＦＲＳＦ１Ａとしても公知）およびＩＩ型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２、ｐ７５およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂとしても公知）をとおしてその生物学的効果を遂行する。ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２は、発現パターン、構造、シグナル伝達メカニズムおよび機能に明らかな違いを有する。ほとんどすべての細胞型に普遍的に発現されるＴＮＦＲ１とは異なり、ＴＮＦＲ２は、リンパ球、内皮細胞、およびヒト間充織幹細胞のマイナーサブセットを含む、限定された細胞のセットに発現される。ＴＮＦＲ２の限定発現パターンは患者への毒性を下げると考えられる（Dostert et al., Physiol. Rev., 99(1):115-160, 2019）。

【0006】

重要なことに、ＴＮＦＲ２は、ヒトＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に構成的に発現される。ＴＮＦＲ２受容体を発現するＴｒｅｇは、ヒトとマウスの両方で強く免疫抑制性であり、ＴＮＦＲ２^＋Ｔｒｅｇは、ヒトおよびマウス腫瘍で見出される主要な腫瘍浸潤細胞である（Torrey et al., Leukemia, 33:1206-1218, 2018）。一部のヒトがんでは、浸潤ＴｒｅｇでのＴＮＦＲ２の発現は、対照者での循環Ｔｒｅｇでよりも１００倍高いと推定される（Torrey et al., Leukemia, 33:1206-1218, 2018）。ＴＮＦＲ２を介して、ＴＮＦは、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の表現型安定性、増殖性拡大、および抑制機能を優先的に活性化、拡大、および促進する（Shaikh et al., Front. Immunol., 18 June, 2018、およびVanamee et al., Science Signaling, Vol. 11, Issue 511, eaao4910, 2018）。

【0007】

ＴＮＦＲ２は、ＴＭＥにおける骨髄性抑制性細胞（ＭＤＳＣ）、別の免疫抑制細胞の蓄積に関与することも報告されている。骨髄性抑制性細胞（ＭＤＳＣ）におけるＴＮＦＲ２の膜結合ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）活性化は、腫瘍免疫回避にさらに寄与し、腫瘍進行を促進する（Ba et al. Int. Immunopharm, 2017）。

【0008】

ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣに加えて、ＴＮＦＲ２も、卵巣がん、大腸がん、腎癌、ホジキンリンパ腫、および骨髄腫を含む、一部の腫瘍細胞で発現される（Shaikh et al., Front. Immunol., 18 June, 2018）。ＴＮＦＲ２は、癌遺伝子として認識され、がんの免疫療法戦略としてＴＮＦＲ２を標的化するアンタゴニスト抗体の使用を記載する報告が近年公表されている（Case et al., Leukoc. Biol., 1-11, 2020、Torrey et al., Sci. Signal., 10:462, 2017、Torrey et al., Leukemia 33, 1206-1218, 2019、Yang et al., J. Leukoc. Biol., 1-10, 2020、Martensson et al, AACR 2020, Abstract #725、Martensson et al. AACR Annual Meeting 2020, Poster #936）。

【0009】

ＴＮＦＲ２発現はナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞では低いが、ＴＮＦＲ２は、腫瘍微小環境の活性化ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞の表面に発現される強力な共刺激分子として報告される。ＴＮＦＲ２結合は、それらの活性化、増殖およびサイトカイン産生を促進する（Kim. E et al, J Immunol October 1, 2004, 173 (7) 4500-4509；およびYe LL, et al. Front Immunol, 9:583, 2018）。したがって、ＴＮＦＲ２に対するアゴニスト抗体は、エフェクターＴ細胞機能およびそれらの抗腫瘍応答をさらに増強する能力を有する（Tam et al., Sci. Transl. Med., 11:512, eaax0720, 2019、Martensson et al. AACR Annual Meeting 2020, Poster #936、Wei et al., AACR Annual Meeting 2020, Poster #2282）。

【0010】

腫瘍微小環境におけるＴＮＦＲ２へのＴＮＦ結合は、Ｔｒｅｇおよび骨髄性抑制性細胞（ＭＤＳＣ）の拡大および活性化を誘導し、それによりエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の免疫応答を抑制する。結果として、ＴＭＥにおいて、アンタゴニストまたはアゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体のいずれかを使用して抑制細胞活性を下方制御するかまたはエフェクター細胞活性を上方制御することは、がんの処置における新規の戦略を提供する。

【0011】

いくつかの抗がん免疫療法が食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されているが、今日までに、ＦＤＡによって認可された抗ＴＮＦＲ２治療はない。したがって、単独で、または他の薬剤との組合せで、がん免疫療法のＴＮＦ－ＴＮＦＲ２軸をモジュレートするために使用することができる、安全かつ効果的な抗ＴＮＦＲ２抗体を提供するアンメットニーズがある。

【発明の概要】

【0012】

本開示は、抗腫瘍壊死因子受容体２抗体（抗ＴＮＦＲ２抗体）およびそれの断片を提供することにより、上のニーズを解決する。これらの抗体およびそれの断片は、ＣＤＲ配列の独自のセット、ＴＮＦＲ２に対する特異性（ＴＮＦＲ１に対してではない）、およびカニクイザルＴＮＦＲ２との交差反応性によって特徴付けられる。より具体的には、本開示は、ヒトＴＮＦＲ２に結合する抗体に、およびがん免疫療法のためにＴＮＦ－ＴＮＦＲ２軸をモジュレートするためのそれらの使用に関する。開示された抗体は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１耐性に寄与する枯渇したＴ細胞、抑制性骨髄細胞、または制御性Ｔ細胞が豊富な腫瘍微小環境のために特に有益であり得る。

【0013】

一部の実施形態によれば、抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１および４８から選択される重鎖（ＨＣ）可変領域の３つのＣＤＲ、ならびに、配列番号２、４、６、８、１０および１２から選択される軽鎖（ＬＣ）可変領域の３つのＣＤＲ、または、同定された抗体または断片配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するそれのアナログもしくは誘導体からなる群から選択される一連の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。

【0014】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号１３、ＣＤＲ２：配列番号１４、およびＣＤＲ３：配列番号１５を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号１６、ＣＤＲ２：配列番号１７、およびＣＤＲ３：配列番号１８を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0015】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号１９、ＣＤＲ２：配列番号２０、およびＣＤＲ３：配列番号２１を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号２２、ＣＤＲ２：配列番号２３、およびＣＤＲ３：配列番号２４を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0016】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号２５、ＣＤＲ２：配列番号２６、およびＣＤＲ３：配列番号２７を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号２８、ＣＤＲ２：配列番号２９、およびＣＤＲ３：配列番号３０を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0017】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号３１、ＣＤＲ２：配列番号３２、およびＣＤＲ３：配列番号３３を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号３５、およびＣＤＲ３：配列番号３６を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0018】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号３８、およびＣＤＲ３：配列番号３９を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号４０、およびＣＤＲ３：配列番号４１を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0019】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号４９、およびＣＤＲ３：配列番号３９を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号４０、およびＣＤＲ３：配列番号４１を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0020】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号４２、ＣＤＲ２：配列番号４３、およびＣＤＲ３：配列番号４４を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号４５、ＣＤＲ２：配列番号４６、およびＣＤＲ３：配列番号４７を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0021】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１、および４８からなる群から選択される可変重鎖配列を含む。

【0022】

他の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号２、４、６、８、１０、および１２からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む。

【0023】

他の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１、および４８からなる群から選択される可変重鎖配列、ならびに、配列番号２、４、６、８、１０、および１２からなる群から選択される可変軽鎖配列、を含む。

【0024】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体または抗体断片は、以下の組合せ：
（ａ）配列番号１を含む可変重鎖配列および配列番号２を含む可変軽鎖配列；
（ｂ）配列番号３を含む可変重鎖配列および配列番号４を含む可変軽鎖配列；
（ｃ）配列番号５を含む可変重鎖配列および配列番号６を含む可変軽鎖配列；
（ｄ）配列番号７を含む可変重鎖配列および配列番号８を含む可変軽鎖配列；
（ｅ）配列番号９を含む可変重鎖配列および配列番号１０を含む可変軽鎖配列；
（ｆ）配列番号４８を含む可変重鎖配列および配列番号１０を含む可変軽鎖配列；ならびに
（ｇ）配列番号１１を含む可変重鎖配列および配列番号１２を含む可変軽鎖配列
から選択される可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含む。

【0025】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体が提供され、この場合、抗体は、（ａ）ＣＤＲ１：配列番号１３、ＣＤＲ２：配列番号１４、およびＣＤＲ３：配列番号１５を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号１６、ＣＤＲ２：配列番号１７、およびＣＤＲ３：配列番号１８を含む軽鎖可変領域；（ｂ）ＣＤＲ１：配列番号１９、ＣＤＲ２：配列番号２０、およびＣＤＲ３：配列番号２１を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号２２、ＣＤＲ２：配列番号２３、およびＣＤＲ３：配列番号２４を含む軽鎖可変領域；（ｃ）ＣＤＲ１：配列番号２５、ＣＤＲ２：配列番号２６、およびＣＤＲ３：配列番号２７を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号２８、ＣＤＲ２：配列番号２９、およびＣＤＲ３：配列番号３０を含む軽鎖可変領域；（ｄ）ＣＤＲ１：配列番号３１、ＣＤＲ２：配列番号３２、およびＣＤＲ３：配列番号３３を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号３５、およびＣＤＲ３：配列番号３６を含む軽鎖可変領域；（ｅ）ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号３８、およびＣＤＲ３：配列番号３９を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号４０、およびＣＤＲ３：配列番号４１を含む軽鎖可変領域；（ｆ）ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号４９、およびＣＤＲ３：配列番号３９を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号４０、およびＣＤＲ３：配列番号４１を含む軽鎖可変領域；または（ｇ）ＣＤＲ１：配列番号４２、ＣＤＲ２：配列番号４３、およびＣＤＲ３：配列番号４４を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号４５、ＣＤＲ２：配列番号４６、およびＣＤＲ３：配列番号４７を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0026】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体およびそれの抗体断片は、表１に開示の１つもしくは複数の重鎖可変領域ＣＤＲおよび／または表２に開示の１つもしくは複数の軽鎖可変領域ＣＤＲを含む。

【0027】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、以下の構造的および機能的特徴の１つまたは複数を、単独でまたは組合せで呈する：（ａ）ヒトＴＮＦＲ２に特異的である、（ｂ）ヒトＴＮＦＲ１に結合しない、（ｃ）ＴＮＦＲ２のＮ末端システインリッチドメインのＣＲＤ３またはＣＲＤ４領域のエピトープに結合する、（ｄ）カニクイザルＴＮＦＲ２と交差反応する、（ｅ）ヒトＴＮＦ結合相互作用を妨害する、（ｆ）Ｆｃ受容体への結合の非存在下で可溶性ＴＮＦα刺激Ｔ細胞活性化を阻害する、（ｇ）Ｆｃ受容体への結合の非存在下で膜貫通ＴＮＦ刺激Ｔ細胞活性化を阻害する、（ｈ）Ｆｃ受容体への結合時に慢性的に刺激されるヒトエフェクターＴ細胞におけるアゴニスト活性を増強する、（ｉ）ヒトＴＮＦＲ２ノックインＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいて抗腫瘍効果を示す、（ｊ）ヒトＴＮＦＲ２ノックインＭＣ３８腫瘍モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１処置の腫瘍増殖阻害を増強する、（ｋ）ヒトＴＮＦＲ２ノックインＰＤ１耐性Ｂ１６Ｆ１０メラノーマモデルにおいて抗ＰＤ－Ｌ１処置の有効性を増強する、または抗腫瘍活性に寄与するＡＤＣＣ活性を示す、または（ｍ）腫瘍内のＣＤ８対Ｔｒｅｇ比を増強する。

【0028】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２の内因性レベルを発現するヒト細胞におよびＴＮＦＲ２を過剰発現するように改変された宿主細胞に特異的に結合し、ヒトＴＮＦＲ１を発現する細胞への結合を示さない。本明細書に開示の抗ＴＮＦＲ２抗体または抗体断片は、サブナノモルのＥＣ_５０値でヒトまたはカニクイザルＴＮＦＲ２を過剰発現する細胞に結合する。

【0029】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体または抗体断片は、ＴＮＦＲ２のＮ末端システインリッチドメインのＣＲＤ３またはＣＲＤ４領域のエピトープに結合する。代替の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体およびそれの抗体断片は、ＣＲＤ１またはＣＲＤ２領域のエピトープに結合する。

【0030】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体または抗体断片は、カニクイザルＴＮＦＲ２（ｃｙｎｏＴＮＦＲ２）と交差反応する。

【0031】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体およびそれの抗体断片は、ヒトＴＮＦ／ＴＮＦＲ２結合相互作用を遮断する。代替の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体およびそれの抗体断片は、ヒトＴＮＦ／ＴＮＦＲ２結合相互作用を遮断しないが、可溶性ＴＮＦおよび膜ＴＮＦの活性をアンタゴナイズする。

【0032】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体およびそれの抗体断片は、ＴＮＦＲ２を発現するヒト細胞の可溶性ＴＮＦαと膜ＴＮＦα刺激応答の両方を阻害する。

【0033】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体およびそれの抗体断片は、ＦｃγＲとの多価の架橋活性を増加させるように改変されたＦｃ領域を含み、それはＴ細胞のＦｃ依存性アゴニスト活性を増強するであろう。

【0034】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体は、枯渇したヒトエフェクターＴ細胞によるサイトカイン分泌を増強する。

【0035】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２ノックインＭＣ３８同系マウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍効果を示す。

【0036】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２ノックインＭＣ３８腫瘍モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１処置の腫瘍増殖阻害を増強する。

【0037】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２ノックインＰＤ１耐性Ｂ１６Ｆ１０メラノーマモデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１処置の効果を増強する。

【0038】

一部の実施形態では、開示した抗ＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍効果は、腫瘍微小環境からの制御性Ｔ細胞のＡＤＣＣ媒介性枯渇によって達成され得る。

【0039】

一部の実施形態では、開示した抗ＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍効果は、腫瘍微小環境においてＣＤ８対Ｔｒｅｇ比を増強することによって達成され得る。

【0040】

本開示は、上の抗体分子の少なくとも１つをコードする単離したヌクレオチド配列も提供する。

【0041】

本開示は、上のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含むプラスミドも提供する。

【0042】

本開示は、上のヌクレオチド配列の１つ、または上のプラスミドの１つを含む細胞も提供する。

【0043】

本開示は、本明細書に開示の抗体またはそれの断片の少なくとも１つを含むかまたはそれからなる医薬組成物、場合により、医薬的に許容される希釈剤、担体、ビヒクルおよび／または賦形剤も提供する。そのような医薬組成物は、がんの抗体ベースの免疫療法のために使用され得る。

【0044】

本開示は、治療有効量の開示した抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの断片の少なくとも１つを、単独で、または別の治療剤との組合せで、患者に投与するステップを含む、患者におけるがんの処置のための方法にも関する。

【0045】

本開示の前述の概要、および以下の詳細な説明は、添付の図と併せて読むことで、よりよく理解されよう。本開示を例示する目的で、目下好ましい実施形態を図に示している。しかし、示されたまさにその通りの構成、例および手段に、本開示が限定されないことを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1-1】図１は、ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列ならびにそれらのそれぞれのＣＤＲ配列（カバットナンバリング）を提供する図である。配列識別子が提供されており、ＣＤＲについては可変ドメイン配列に下線が引かれている。

【図1-2】図１は、ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列ならびにそれらのそれぞれのＣＤＲ配列（カバットナンバリング）を提供する図である。配列識別子が提供されており、ＣＤＲについては可変ドメイン配列に下線が引かれている。

【図1-3】図１は、ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列ならびにそれらのそれぞれのＣＤＲ配列（カバットナンバリング）を提供する図である。配列識別子が提供されており、ＣＤＲについては可変ドメイン配列に下線が引かれている。

【図1-4】図１は、ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列ならびにそれらのそれぞれのＣＤＲ配列（カバットナンバリング）を提供する図である。配列識別子が提供されており、ＣＤＲについては可変ドメイン配列に下線が引かれている。

【図1-5】図１は、ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列ならびにそれらのそれぞれのＣＤＲ配列（カバットナンバリング）を提供する図である。配列識別子が提供されており、ＣＤＲについては可変ドメイン配列に下線が引かれている。

【図2】図２Ａ－２Ｂは、フローサイトメトリー（Ａ）および画像結合アッセイ（Ｂ）による、ヒトＴＮＦＲ２発現ＨＥＫ２９３ＴにおけるＴＮＦＲ２抗体の結合活性を示す図である。

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、抗ＴＮＦＲ２抗体のエピトープビニングおよびビニングクラスターを示す図である。図３Ａに、ＴＮＦＲ２抗体の６つの代表的なクローンの交差遮断活性を示し、図３Ｂに交差遮断結果のビニングクラスターを示す。

【図4】図４は、ビオチン化ＴＮＦのヒトＴＮＦＲ２発現ＨＥＫ２９３Ｔへの結合の阻害のパーセンテージを示す図である。

【図5】図５は、ＮＦκＢルシフェラーゼレポーターを発現するＴＨＰ１細胞におけるＴＮＦＲ２抗体による可溶性ＴＮＦ刺激ＮＦκＢシグナル伝達の阻害のパーセンテージを示す図である。

【図6】図６Ａ－６Ｂは、組換えＴＮＦＲ２を発現するＪｕｒｋａｔ細胞におけるＴＮＦＲ２抗体による膜ＴＮＦ刺激ＮＦκＢシグナル伝達の阻害のパーセンテージを示す図であり、ＮＦκＢルシフェラーゼレポーターは１５ｎＭ（Ａ）および８ｎＭ（Ｂ）で試験した。

【図7】図７Ａ－７Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞シグナル伝達への抗ＴＮＦＲ２抗体の架橋結合の効果を示す図である。図７Ａに、Ｊｕｒｋａｔ－ＴＮＦＲ２レポーターアッセイの概略図を示し、図７ＢにＴＨＰ－１細胞と共培養した場合のＪｕｒｋａｔ ＮＦκＢ活性化ヘの効果を示す。図７Ｃに、ＴＮＦＲ２抗体または対照による処置時の、制御性Ｔ細胞と共培養したＣＤ８ Ｔ細胞からの分泌されたＩＦＮγのレベルを示す。凡例は、μｇ／ｍＬの試験抗体の濃度を示す。

【図8】図８Ａ－８Ｄは、ＴＮＦＲ２抗体または対照による処置時の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した枯渇ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖（Ａ）、ＩＦＮγ（Ｂ）、ＴＮＦ（Ｃ）、およびグランザイム（Ｄ）を示す図である。グラフで示した処置は、抗体とともに可溶性Ｆ（ａｂ’）_２架橋剤を含む。

【図9】図９Ａおよび９Ｂは、ＴＮＦＲ２抗体またはアイソタイプ対照抗体による処置時の、ＭＣ３８腫瘍担持ｈＴＮＦＲ２ノックインマウスにおける腫瘍増殖を示す図である。図９（Ａ）に、腫瘍増殖曲線を示す。図９（Ｂ）に、異なる処置群の腫瘍サイズの一元配置分散分析を提供する。

【図10】図１０Ａおよび１０Ｂは、単一薬剤としてまたは組み合わせた、抗ｍＰＤ－Ｌ１および／または抗ＴＮＦＲ２抗体、またはビヒクル対照による処置時の、ｈＴＮＦＲ２ノックインモデルのＭＣ３８腫瘍担持マウスの生存を示す図である。図１０（Ａ）に、腫瘍増殖曲線を示す。図１０（Ｂ）に、延命効果を示す。

【図11】図１１は、単一薬剤としてまたは組み合わせた、抗ｍＰＤ－Ｌ１および／または抗ＴＮＦＲ２抗体、またはビヒクル対照による処置時の、ｈＴＮＦＲ２ノックインのＢ１６－Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍増殖阻害を示す図である。

【図12】図１２Ａおよび１２Ｂは、２つの異なるアイソタイプのＴＮＦＲ２抗体、またはビヒクル対照による処置時の、ＭＣ３８腫瘍担持ｈＴＮＦＲ２ノックインマウスの腫瘍増殖を示す図である。図１２（Ａ）に、腫瘍増殖曲線を示す。図１２（Ｂ）に、異なる処置群の腫瘍サイズの一元配置分散分析を提供する。

【図13】図１３Ａおよび１３Ｂは、２つの異なるマウスＩｇＧバリアントのＴＮＦＲ２抗体による処置時の、ＭＣ腫瘍担持ｈＴＮＦＲ２ノックインマウスの腫瘍増殖を示す図である。図１３（Ａ）に、腫瘍増殖曲線を示し、図１３（Ｂ）に、一元配置分散分析結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0047】

本開示がより容易に理解することができるように、ある特定の技術的および科学的用語について下に具体的に定義する。本文書の他の場所で特に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者であれば一般に理解される意味を有する。

【0048】

本開示全体をとおして、以下の略語が使用される：
ｍＡｂまたはＭａｂまたはＭＡｂ － モノクローナル抗体。
ＣＤＲ － 免疫グロブリン可変領域の相補性決定領域。
ＶＨまたはＶＨ － 免疫グロブリン重鎖可変領域。
ＶＬまたはＶＬ － 免疫グロブリン軽鎖可変領域。
ＦＲ － 抗体フレームワーク領域、ＣＤＲ領域を除外する免疫グロブリン可変領域。

【0049】

「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」（ＴＮＦＲ）という用語は、共通のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）によって特徴付けられる、カルボキシ末端細胞内ドメインおよびアミノ末端細胞外ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質の群を指す。ＴＮＦＲスーパーファミリーは、ＴＮＦスーパーファミリーの１つまたは複数のリガンドへの結合の結果として細胞シグナル伝達を媒介する受容体を含む。ＴＮＦＲスーパーファミリーは、３つのサブグループ：（ｉ）細胞内部分にデスドメイン（ＤＤ）を含有し、ＤＤ結合パートナー（例えば、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）またはＴＮＦＲ１関連デスドメイン（ＴＲＡＤＤ））を介してアポトーシスを活性化するデス受容体（ＤＲ）；（ｉｉ）ＴＲＡＦファミリーのメンバーと相互作用するＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）相互作用受容体；および（ｉｉｉ）サイトゾルドメインを欠損するデコイ受容体（ＤｃＲ）に分けられ得る。

【0050】

「ＴＮＦＲ２」、「ＴＮＦＲ２受容体」、または「ＴＮＦＲ２タンパク質」という用語には、ヒトＴＮＦＲ２、特に、ヒトＴＮＦＲ２の天然配列ポリペプチド、アイソフォーム、キメラポリペプチド、すべての相同体、断片、および前駆体が含まれる。ヒト、カニクイザルおよびマウスＴＮＦＲ２のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１０５７．１（ヒト）（配列番号５２）；ＸＰ＿００５５４４８１７．１（カニクイザル）（配列番号５３）；ＮＰ＿０３５７４０．２（マウス）（配列番号５４）に提供されている。カニクイザルとマウスのＴＮＦＲ２のオルソログは、それぞれヒトタンパク質と９５％および７７％の配列同一性を共有する。

【0051】

「ＴＮＦＲ１」、「ＴＮＦＲ１受容体」、または「ＴＮＦＲ１タンパク質」という用語には、ヒトＴＮＦＲ１、特に、ヒトＴＮＦＲ１の天然配列ポリペプチド、アイソフォーム、キメラポリペプチド、すべての相同体、断片、および前駆体が含まれる。ヒトＴＮＦＲ１のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１０５６．１（ヒト）（配列番号５５）に提供されている。ヒトＴＮＦＲ１とＴＮＦＲ２は、１８％の配列同一性を共有する。

【0052】

「ＴＮＦ」、および「ＴＮＦ－α」という用語は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００５８５．２（ヒト）（配列番号５６）に提供されている天然ＴＮＦポリペプチドを指す。腫瘍壊死因子－αは、２つの生物学的に活性な形態、膜結合ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ－α）（配列番号５７）および可溶性ＴＮＦ－α（ｓＴＮＦ－α）で存在する。膜貫通ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ－α）は、ＴＮＦＲ２の主要なリガンドである。

【0053】

本明細書で使用される場合、「腫瘍壊死因子受容体２シグナル伝達」、「ＴＮＦＲ２シグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）」、「ＴＮＦＲ２シグナル伝達（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」等の用語は、交換可能に使用され、内因性ＴＮＦＲ２リガンド、例えばＴＮＦαによるＴＮＦＲ２＋細胞（例えば、Ｔ－ｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、またはＴＮＦＲ２^＋がん細胞）の表面でのＴＮＦＲ２の活性化時に通常起こる細胞事象を指す。ＴＮＦＲ２シグナル伝達は、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ５、ＣＨＵＫ、ＮＫＦＢＩＥ、ＮＫＦＢＩＡ、ＭＡＰ３Ｋ１１１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＲｅｌＢ、ｃＩＡＰ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現の増加が見出されることにより証明され得る（Torrey et al. Sci. Signal., 10: 462, 2017、Yang et al., Front Immunol, 9, 2018）。あるいは、ＴＮＦＲシグナル伝達は、サイトカイン、例えばＴＮＦ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６およびＩＦＮγの発現が見出されることにより示され得る（Holbrook et al., F1000Res, Jan 28;8, 2019）。

【0054】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含めて、種々の抗体構造を包含する。

【0055】

本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体」および「アンタゴニストＴＮＦＲ２抗体」という用語は、Ｆｃ受容体への結合の非存在下で、ＴＮＦＲ２の活性化を阻害または低減する、ＴＮＦＲ２によって媒介される１つまたは複数のシグナル伝達経路を弱める、および／またはＴＮＦＲ２の活性化によって媒介される少なくとも１つの活性を低減または阻害することができるＴＮＦＲ２特異的抗体を指す。例えば、アンタゴニストＴＮＦＲ２抗体は、制御性Ｔ細胞の成長および増殖を阻害または低減し得る。アンタゴニストＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２のＴＮＦα結合を遮断することにより、ＴＮＦＲ２活性化を阻害または低減し得る。

【0056】

「アゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体」および「アゴニストＴＮＦＲ２抗体」という用語は、Ｆｃ受容体ヘの結合の非存在下で、ＴＮＦＲ２によって媒介される１つまたは複数のシグナル伝達経路を活性化することができるＴＮＦＲ２特異的抗体を指す。例えば、アゴニストＴＮＦＲ２抗体は、ＡＫＴまたはＮＦＫＢシグナル伝達経路を活性化し、標的細胞の増殖促進または生存促進をもたらし得る。アゴニスト抗ＴＮＲ２抗体は、例えば、ＩＦＮγ、グランザイムＢ、ＴＮＦまたはＩＬ－２の放出を増加する、エフェクターＴ細胞機能を増強することもできる。

【0057】

本明細書で使用される場合、「遮断する」という用語は、可溶性形態または膜形態のいずれかでＴＮＦの結合を遮断する抗ＴＮＦＲ２抗体の能力を指す。

【0058】

本明細書で使用される場合、「抗腫瘍壊死因子受容体２抗体」、「抗ＴＮＦＲ２抗体」、「抗ＴＮＦＲ２抗体部分」、および／または「抗ＴＮＦＲ２抗体断片」等という用語には、少なくとも免疫グロブリン分子の一部、例えば、ＴＮＦＲ２に特異的に結合することができる、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、もしくはそれのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、またはこれらの任意の部分が含まれるが、これらに限定されない、任意のタンパク質またはペプチド含有分子が含まれる。

【0059】

「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、例えば、当該集団を構成する個々の抗体は、可能性のあるバリアント抗体を除いて、同一でありかつ／または同じエピトープに結合する。例えば、バリアント抗体は、天然に存在する突然変異を含有するかまたはモノクローナル抗体調製物の製造および／または保存過程で発生する。様々な決定基（エピトープ）に対して向けられた様々な抗体を通常では含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられたものである。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な集団の抗体から得られている抗体の性状を指示するものであり、任意の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、それらに限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めて、様々な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法およびその他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。

【0060】

「キメラ抗体」という用語は、組換え抗体であって、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一または相同であるが、一方で、その鎖（複数可）の残部は、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一または相同である、組換え抗体、同様に、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、かかる抗体の断片を指す。加えて、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植を実施して、親和性または特異性を始めとする抗体分子のある特定の特性を変えることができる。通常では、可変ドメインはげっ歯類動物などの実験動物（「親抗体」）由来の抗体から得られ、そして定常ドメイン配列はヒト抗体から得られるので、生成するキメラ抗体は、ヒト対象においてエフェクター機能を方向付けることができ、それが由来する親（例えば、マウス）抗体よりも、有害な免疫応答を誘発する可能性が低くなる。

【0061】

「ヒト化抗体」という用語は、重鎖および／または軽鎖の非ヒト（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）相補性決定領域（ＣＤＲ）と一緒に、可変領域において１つまたは複数のヒトフレームワーク領域を含むように改変された抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域を除いて完全にヒト型である配列を含む。ヒト化抗体は通常では、非ヒト化抗体と比べてヒトに対する免疫原性が低く、したがってある特定の状況において治療効果を提供する。当業者であれば、ヒト化抗体について知っており、それらを生成するのに適した技法についても知っている。例えば、それらのそれぞれは全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Hwang, W. Y. K., et al., Methods 36:35, 2005；Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033, 1989；Jones et al., Nature, 321:522-25, 1986；Riechmann et al., Nature, 332:323-27, 1988；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-36, 1988；Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833-37, 1989；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６１号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；およびSelick et al.、国際公開第９０／０７８６１号パンフレットを参照されたい。

【0062】

「ヒト抗体」とは、ヒトによって生成される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する、および／または当業者にとっては既知のヒト抗体を作製するための技法のいずれかを使用して作製されている、抗体である。ヒト抗体に関する本定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。ヒト抗体は、Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al, J. Immunol, 147(I):86-95 (1991)に記載の方法を含めて、当技術分野で既知の種々の技法を使用して生成することができる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)もまた参照されたい。ヒト抗体は、トランスジェニック動物に標的抗原を投与することによって調製することができるが、当該トランスジェニック動物は抗原負荷に応答してかかる抗体を産生するように改変されており、その動物の内因性の遺伝子座は無効とされている、例えば、免疫ＨｕＭａｂマウス（例えば、ＨｕＭａｂマウスに関しては、Nils Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／０３９１８号パンフレットおよび国際公開第０１／０９１８７号パンフレットを参照されたい）、ゼノマウス（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては、米国特許第６，０７５，１８１号明細書および同第６，１５０，５８４号明細書を参照されたい）またはＴｒｉａｎｎｉマウス（例えば、国際公開第２０１３／０６３３９１号パンフレット、国際公開第２０１７／０３５２５２号パンフレットおよび国際公開第２０１７／１３６７３４号パンフレットを参照されたい）である。

【0063】

抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体に関し主たる５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの様々なクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

【0064】

抗体の「抗原結合ドメイン」という用語（または単に「結合ドメイン」）または同様の用語は、抗原複合体に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、以下が含まれる、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨの各ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）合成リンカーによって必要に応じて連結することができる２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せ。

【0065】

抗体の「可変ドメイン」（Ｖドメイン）は、結合を媒介し、特定の抗体の抗原に特異性を付与する。しかし、可変性は、可変ドメインの１１０個のアミノ酸全長にわたって均等には分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれが９～１２個のアミノ酸長である「超可変領域」またはＣＤＲと本明細書では呼ばれる極度の可変性のより短い領域によって分離された１５～３０個のアミノ酸からなるフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変である区間から、構成される。当業者であれば理解されるように、ＣＤＲの正確なナンバリングおよび配置は、様々なナンバリングシステムのうちで異なってもよい。しかし、可変重配列および／または可変軽配列の開示には関連するＣＤＲの開示が含まれることを理解されたい。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。

【0066】

本明細書で使用される用語として「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、特異的抗原認識の媒介を主に担う、重鎖と軽鎖の両ポリペプチドの可変領域内の短いポリペプチド配列を指す。各ＶＬおよび各ＶＨの内には、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される）が存在する。本明細書で特に明記されない限り、ＣＤＲ領域およびフレームワーク領域は、カバットナンバリングスキームに従ってアノテーションが付けられている（Kabat E. A., et al., 1991, Sequences of proteins of Immunological interest, In: NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, Bethesda, Md）。

【0067】

他の実施形態では、抗体のＣＤＲは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、MacCallum RM et al, (1996) J Mol Biol 262: 732-745に従って、または、それらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132- 136およびLefranc M-P et al, (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212に記載のＩＭＧＴナンバリングシステムに従って、決定することができる。また、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)も、参照されたい。他の実施形態では、抗体のＣＤＲはＡｂＭナンバリングスキームに従って決定することができ、このスキームはＡｂＭ超可変領域を参照とするものであるが、この領域とは、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループとの間の妥協を表し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）により使用されている。

【0068】

「フレームワーク」または「フレームワーク領域」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般には、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４から構成される。

【0069】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンのＶＬフレームワーク配列またはＶＨフレームワーク配列の選択において最も普通に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンのＶＬ配列またはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ由来である。一般に、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), Vols. 1-3にあるような、サブグループである。一実施形態では、ＶＬの場合、サブグループは、Kabat et al.、上掲にあるような、サブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨの場合、サブグループは、Kabat et al.、上掲にあるような、サブグループＩｌｌである。

【0070】

「ヒンジ領域」は一般に、ヒトＩｇＧ１の２１６～２３８（ＥＵナンバリング）または２２６～２５１（カバットナンバリング）からのストレッチングとして定義される。ヒンジは、個別の３つの領域、上部、中間（例えばコア）、および下部の各ヒンジにさらに分けることができる。

【0071】

本明細書で使用される「Ｆｃ領域」および「定常領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する。本用語には、天然配列のＦｃ領域およびバリアントＦｃ領域が含まれる。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書で別段の指定がない限り、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載のＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従う。

【0072】

本明細書で使用される場合、「非天然の定常領域」という用語は、抗体可変領域とは異なる供給源に由来する抗体定常領域を指すか、または天然の抗体定常領域配列とは異なるアミノ酸配列を有するヒト生成の合成ポリペプチドである。例えば、非天然の定常領域を含有する抗体は、非ヒト供給源（例えば、マウス、ラット、もしくはウサギ）に由来する可変領域およびヒト供給源に由来する定常領域（例えば、ヒト抗体定常領域）、または別の霊長類（例えば、中でも、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、モルモット、ウシ科のメンバー（例えば、中でもウシ、バイソン、バッファロー、エルク、およびヤク）、ウシ、ヒツジ、ウマ、またはバイソン）に由来する定常領域を有し得る。

【0073】

「内因性」という用語は、特定の生物（例えば、ヒト）または生物内の特定の位置（例えば、組織、器官、または細胞）に自然に見出される分子（例えば、ポリペプチド、核酸または共因子）、例えばヒト細胞によって発現されるＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを記載する。

【0074】

抗体Ｆｃ領域とある特定のＦｃ受容体との相互作用に由来する「エフェクター機能」という用語には、それらに必ずしも限定されないが、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃｙＲ介在性エフェクター機能、ならびに細胞表面受容体の下方調節が含まれる。かかるエフェクター機能には、一般に、Ｆｃ領域が抗原結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることが必要である。

【0075】

「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する抗体受容体を記載し、抗原認識に関与し、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、およびマスト細胞を含むある特定の免疫細胞の膜にある。ＩｇＧのＦｃ部分を認識するＦｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれる。ＦｃγＲファミリーは、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライス形態を含む。構造、機能、およびＩｇＧ結合の親和性の違いに基づき、ＦｃγＲは３つの主な群：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ（ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂ）ならびにＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ）に分類される。中でも、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）は、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩａのγサブユニットに、またはＦｃγＲＩＩａの細胞質テールに、シグナル伝達モチーフ、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する受容体を活性化する。抗原－抗体複合体の結合後、活性化Ｆｃγ受容体（ヒト：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢおよびマウス：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＶ）は、免疫エフェクター機能を駆動する。対照的に、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）は阻害受容体である。ＦｃγＲＩＩｂの架橋結合は、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）のリン酸化および阻害シグナル伝達をもたらす（Patel et al. Front Immunol. 2019; 10: 223）。

【0076】

本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」という用語は、他の免疫細胞、例えばＣＤ８陽性（ＣＤ８＋）エフェクターＴ細胞の増殖、活性化および細胞傷害性能を抑制／阻害することによる制御的役割を有する免疫系の細胞を指す。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、マスター転写因子ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｐ３（Ｆｏｘｐ３）の発現によって特徴付けられる。Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なサブセット、胸腺で発生する「内在性（ｎａｔｕｒａｌ）」Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞、およびＣＤ４＋ Ｆｏｘｐ３－従来Ｔ細胞から末梢において生じる「誘導性」Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞がある。内在性Ｔｒｅｇは、ＣＤ４ Ｔ細胞共受容体と、ＩＬ－２受容体の成分であるＣＤ２５の両方を発現するとして特徴付けられる。Ｔｒｅｇは、したがって、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋である。核転写因子Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｐ３（ＦｏｘＰ３）の発現は、内在性Ｔｒｅｇの発生および機能を決定する定義特性である。Ｔｒｅｇ細胞は、阻害サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ、ＩＬ－３５）の分泌、樹状細胞機能／成熟の調節、免疫制御性表面分子（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３）の発現または細胞溶解（例えば、グランザイムＡおよび／またはＢ媒介性）による抑制を含む多くの様式の作用によりそれらの抑制効果を発揮する。

【0077】

本明細書で使用される場合、「骨髄性抑制性細胞」または「ＭＤＳＣ」は、様々なエフェクター細胞および抗原提示細胞、例えば中でも、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、およびマクロファージの活性をモジュレートする免疫系の細胞を指す。ＭＤＳＣは、マクロファージ、顆粒球、および樹状細胞の未成熟前駆細胞を含む、未成熟骨髄細胞の不均質な集団である。集団は、マウスのＧｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞およびヒトのＨＬＡ－ＤＲ－ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋細胞として広く認識されている。それは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで自然および獲得免疫応答を抑制する顕著な能力を有する。

【0078】

本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞の集団、例えばＴＮＦＲ２＋細胞（例えば、Ｔ－ｒｅｇ、ＭＤＳＣ、またはＴＮＦＲ２＋がん細胞）の集団の文脈で、複数の細胞を産生するための細胞の有糸分裂および細胞質分裂を指す。細胞増殖は、例えば、細胞の試料中の細胞（例えばＴＮＦＲ＋細胞）の量の、所与の期間にわたる、例えば１日または数日にわたる増加を見出すことによって証明され得る。本開示では、細胞増殖は、細胞の集団、例えば本明細書に記載のアンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体と接触したＴＮＦＲ２＋細胞の集団の割合が、対照細胞、例えばアンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体と接触しないＴＮＦＲ２＋細胞の集団の増殖と比較して減少する場合、「阻害された」と考えられる。

【0079】

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、抗原のアミノ酸残基のうちの、参照抗体と比較して重複するセットと接触するか、または競合アッセイにおいて参照抗体の抗原への結合を５０％以上で遮断する抗体を指す。抗原と接触する抗体のアミノ酸残基は、例えば、抗原と複合した抗体の結晶構造を決定することによって、または、水素／重水素交換を行うことによって決定することができる。一部の実施形態では、抗原に５Å以内である抗体の残基は抗原と接触すると考えられる。一部の実施形態では、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、競合アッセイにおいて、参照抗体の抗原への結合を５０％以上で遮断し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、当該抗体の抗原への結合を５０％以上で遮断する。

【0080】

「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、当該インタクトな抗体の部分を含む、当該インタクトな抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の例としては、それらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる同一の２つの抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する表記である、残りの「Ｆｃ」断片とが生成される。Ｆａｂ断片は、重（Ｈ）鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）とともに軽（Ｌ）鎖全体、および１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）から構成される。抗体のペプシン処理により、単一の大きいＦ（ａｂ）_２断片が得られ、これは、およそ、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド連結のＦａｂ断片に相当しており、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらなる数個の残基を有する点でＦａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、Ｆａｂ’に関する本明細書における表記であるが、この場合、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つ。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は当初、Ｆａｂ’断片の間にヒンジシステインを有する、Ｆａｂ’断片の対として生成されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。

【0081】

「Ｆｖ」は、緊密な、非共有結合の会合にある１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体から構成される。これらの２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基を与えるとともに抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖にそれぞれ由来の３ループ）が生じる。

【0082】

「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ抗体ドメインおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合にとって所望の構造を形成することを可能にする、ポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含む。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。

【0083】

抗体の「抗原結合ドメイン」という用語（または、単に「結合ドメイン」）または同様の用語は、抗原複合体に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、以下が含まれる、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨの各ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）合成リンカーによって必要に応じて連結することができる２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せ。

【0084】

「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、特に、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体をカバーするが、この場合、ＶＨ－ＶＬ単位が多重エピトープ特異性を有する（例えば、１つの生体分子上の異なる２つのエピトープまたは異なる生体分子上の各エピトープに結合することができる）。かかる多重特異性抗体としては、それらに限定されないが、完全長抗体、２つ以上のＶＬドメインおよびＶＨドメインを有する抗体、二重特異性ダイアボディおよびトリアボディが挙げられる。「多重エピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。

【0085】

「デュアル特異性（Dual specificity）」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の異なる２つのエピトープに特異的に結合する能力を指す。しかし、二重特異性抗体とは対照的に、デュアル特異性抗体はアミノ酸配列が同一である２つの抗原結合アームを有し、各Ｆａｂアームは２つの抗原を認識することができる。デュアル特異性によって、抗体は、単一のＦａｂまたはＩｇＧ分子として異なる２つの抗原と高親和性を持って相互作用することが可能となる。一実施形態によれば、ＩｇＧ１形態にある多重特異性抗体は、各エピトープに、５μＭ～０．００１ｐＭ、３μＭ～０．００１ｐＭ、１μＭ～０．００１ｐＭ、０．５μＭ～０．００１ｐＭ、または０．１μＭ～０．００１ｐＭの親和性で結合する。「単一特異性」とは、１つのエピトープのみに結合する能力を指す。多重特異性抗体は、完全な免疫グロブリン分子と類似の構造を有することができ、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。かかる構造には、それらに限定されないが、ＩｇＧ－Ｆｖ、ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）_２、ＤＶＤ－Ｉｇ、（ｓｃＦｖ）_２－（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃおよび（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ－（ｓｃＦｖ）_２が含まれ得る。ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）_２の場合、ｓｃＦｖは、重鎖もしくは軽鎖のいずれかのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに付着させることができる。

【0086】

本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、多くはヒトまたはヒト化抗体を指す。本開示では、結合特異性の一方は、ＴＮＦＲ２の方に向けることができ、もう一方は、任意の他の抗原、例えば、細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異的抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスによってコードされたエンベロープタンパク質、細菌に由来するタンパク質、または細菌性表面タンパク質等に向けることができる。

【0087】

本明細書で使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、２つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体を指し、この場合、各ポリペプチド鎖は、同じペプチド鎖上のＶＨドメインとＶＬドメインとの分子内会合を可能とするには短すぎるリンカー（例えば、アミノ酸５個で構成されるリンカー）によって連結されたＶＨドメインとＶＬドメインを含む。この配置により、各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補ドメインと強制的に対になってホモ二量体構造を形成する。したがって、「トリアボディ」という用語は、３つのペプチド鎖を含む三価の抗体を指し、ペプチド鎖のそれぞれが、同じペプチド鎖内におけるＶＨドメインとＶＬドメインとの分子内会合を可能とするには極端に短いリンカー（例えば、アミノ酸１～２個から構成されるリンカー）によって連結された１つのＶＨドメインと１つのＶＬドメインを含有する。

【0088】

「単離された抗体」という用語は、本明細書に開示の種々の抗体を説明して使用される場合、抗体が発現された細胞からまたは細胞培養物から特定されかつ分離および／または回収された抗体を意味する。その天然環境の混入成分とは、ポリペプチドの診断的または治療的用途を通常では妨害すると思われる物質であり、混入成分には酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。一部の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）の各アプローチによって決定して、９５％または９９％を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価方法の概説については、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 2007を参照されたい。好ましい実施形態では、抗体は、（１）スピニングカップ配列決定装置の使用によりＮ末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して非還元条件下または還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製される。

【0089】

抗体の標的分子への結合に関して、「特異的結合」、あるいは特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピト－プ「に特異的に結合する」またはそれ「に特異的」であるという用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似する対照分子、例えば過剰な非標識標的との競合によって決定することができる。この場合、特異的結合は、プロ－ブへの標識標的の結合が、過剰な非標識標的によって競合的に阻害される場合に、指摘される。本明細書で使用される「特異的結合」、あるいは特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピト－プ「に特異的に結合する」またはそれ「に特異的」であるという用語は、例えば、１０－４Ｍ以下、代替的に１０－５Ｍ以下、代替的に１０－６Ｍ以下、代替的に１０－７Ｍ以下、代替的に１０－８Ｍ以下、代替的に１０－９Ｍ以下、代替的に１０－１０Ｍ以下、代替的に１０－１１Ｍ以下、代替的に１０－１２Ｍ以下の標的に対するＫｄを有する分子、または、１０－４Ｍ～１０－６Ｍもしくは１０－６Ｍ～１０－１０Ｍもしくは１０－７Ｍ～１０－９Ｍの範囲のＫｄを有する分子によって示され得る。当業者であれば理解するように、親和性およびＫｄの値は反比例している。抗原に対する高親和性は、低いＫｄ値によって測定される。一実施形態では、「特異的結合」という用語は、ある分子が、実質的に他のいずれのポリペプチドまたはポリペプチドエピト－プにも結合することなく、ＴＮＦＲ２にまたはＴＮＦＲ２エピト－プに結合する、結合を指す。

【0090】

本明細書で使用される場合、「ＴＮＦＲ２に特異的に結合する」という用語は、抗体または抗原結合断片が、内因性ヒトＴＮＦＲ２が正常細胞または悪性細胞の表面上に、および安定または一過性のいずれかでヒトＴＮＦＲ２を過剰発現するように改変された組換え細胞に存在する場合に、内因性ヒトＴＮＦＲ２を認識しかつこれに結合する能力を指す。

【0091】

本明細書で使用される「親和性」という用語は、抗体のエピトープへの結合強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］（式中、［Ａｂ－Ａｇ］は抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である）として定義される解離定数Ｋｄにより与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定する方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、およびMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)に見出すことができ、これらの参照文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定する当分野においてよく知られている一標準法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析によるもの）の使用である。

【0092】

「エピトープ」は、抗体とその抗原（複数可）との間の相互作用の部位（単数または複数）を指示する、技術用語である。（Janeway, C, Jr., P. Travers, et al. (2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3- 8. New York, Garland Publishing, Inc.）：によって：「抗体は一般に、タンパク質などの大分子の表面上の小領域のみを一般に認識する…」と記載されているように：［ある特定のエピトープ］が、タンパク質の折り畳みによって一緒にされた、［抗原］ポリペプチド鎖の異なる部分からのアミノ酸で構成される可能性が高い。この種の抗原決定基は、認識される構造が、抗原のアミノ酸配列中では不連続であるが３次元構造では一緒になっているタンパク質のセグメントから構成されるので、立体配座エピトープまたは不連続エピトープとして知られている。対照的に、ポリペプチド鎖の単一セグメントから構成されるエピトープは、連続エピトープまたは線状エピトープと称される（Janeway, C. Jr., P. Travers, et al. (2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3-8. New York, Garland Publishing, Inc.）。

【0093】

「Ｋｄ」という用語は、本明細書で使用される場合、ｋｄのｋａに対する比（すなわち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される、平衡解離定数を指す。抗体のＫｄ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫｄを決定するための好ましい方法には、好ましくはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤデバイスを使用するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）解析、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴、またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード解析が含まれる。

【0094】

薬剤および特定の活性（例えば、細胞への結合、酵素活性の阻害、免疫細胞の活性化または阻害）に関する「ＥＣ_５０」とは、かかる活性に関して薬剤の最大の応答または効果の５０％を生じる当該薬剤の効果的濃度を指す。薬剤および特定の活性に関する「ＥＣ_１００」とは、かかる活性に関して薬剤の実質的に最大の応答を生じる当該薬剤の効果的濃度を指す。

【0095】

「腫瘍微小環境」という用語は、腫瘍を形成するがん細胞および非がん細胞の集団、分子、および／または腫瘍内の血管または境界もしくは周辺のがん細胞を指す。

【0096】

本明細書で使用される場合、「抗体ベースの免疫療法」および「免疫療法」という用語は広義には、抗ＴＮＦＲ２抗体、二重特異性分子、抗原結合ドメイン、または抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはそれの抗体断片もしくはＣＤＲを含む融合タンパク質のターゲティング特異性に依存して、ＴＮＦＲ２発現細胞に及ぼす直接的または間接的な影響を媒介する、任意の形態の療法を指して、使用される。本用語は、ネイキッド抗体、二重特異性抗体（Ｔ細胞結合、ＮＫ細胞結合、およびその他の免疫細胞／エフェクター細胞結合の各方式を含めて）、抗体薬物コンジュゲートを使用する処置の方法、ＴＮＦＲ２特異的キメラ抗原受容体を含むように改変されたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）またはＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）、およびＴＮＦＲ２特異的結合剤を含む腫瘍溶解性ウイルスを使用する細胞療法、ならびに抗ＴＮＦＲ２抗体の抗原結合配列を送達することによる遺伝子療法を包含することを意図するものであり、かつ、ｉｎ ｖｉｖｏで相当する抗体断片を発現させることを意図するものである。

【0097】

ＴＮＦ／ＴＮＦＲスーパーファミリー
ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ／ＴＮＦＲＳＦ）は、現在、１９個のサイトカイン様リガンド分子および２９個の関連受容体から構成される（Dostert et al., Physiol.Rev., 99(1):115-160, 2019、Vanamee et al., Science Signaling, Vol. 11, Issue 511, eaao4910, 2018）。

【0098】

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の受容体は、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドによって自然に活性化される。リガンドと受容体の相互作用は、通常、非常に特異的および高親和性である（Zhang, G., Current Opinion in Structural Biology, 14(2):154-16, 2004）。一部のＴＮＦＳＦリガンドは、複数の受容体を有し、一部の受容体は複数のリガンドにも結合する。

【0099】

腫瘍壊死因子αは、２つの生物学的に活性な形態、膜貫通ＴＮＦ－α（ｔｍＴＮＦ－α）および可溶性ＴＮＦ－α（ｓＴＮＦ－α）で存在する。可溶性ＴＮＦ－αは高親和性でＴＮＦＲ１とＴＮＦＲ２の両方に結合するが、シグナルは、ほとんど排他的にＴＮＦＲ１による。膜貫通ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ－α）は、ＴＮＦＲ２の主要なリガンドであり、ＴＮＦＲ２を効果的に活性化する唯一の形態である（Grell et al., Cell, 83:793-8021995）。

【0100】

サイトカインは、ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）と呼ばれる、保存されたカルボキシ末端相同ドメインに基づき、ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）に割り当てられる（Wajant H., Cell Death Differ., 22(11):1727-1741, 2015）。ＴＨＤは、ＴＮＦリガンドの三量体化および三量体化受容体複合体へのそれらの結合を担う。ＴＨＤは、ＴＮＦＲのＮＨ２末端のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合する。ＴＮＦリガンドは、通常、膜結合形態で合成され、タンパク質分解によって切断され、可溶性リガンドを産生し得る。

【0101】

ＴＮＦＳＦリガンドのすべての公知の構造は、三量体として存在し（Zhang, G., Current Opinion in Structural Biology, 14(2):154-16, 2004）、構造および生化学研究からのデータは、シグナル伝達の開始に必須の役割を果たすＴＮＦファミリーリガンドの高次クラスタリングを確立する。膜結合または可溶性ＴＮＦＳＦリガンド三量体の、細胞の表面上のその相当する受容体への結合は、受容体タンパク質の三量体化およびそれらの下流のシグナル伝達経路の活性化を引き起こす（Dostert et al., Physiol. Rev., 99(1):115-160, 2019）。

【0102】

ＴＮＦリガンドは、免疫系のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージおよびＢ細胞によって主に発現されるが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、内皮細胞、胸腺内皮細胞、および平滑筋細胞によっても産生される（Dostert et al., Physiol. Rev., 99(1):115-160, 2019）。

【0103】

ＴＮＦＲＳＦのメンバーは、細胞内のシグナル伝達タンパク質を動員する、外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインからなる膜貫通タンパク質である。ＴＮＦＲＳＦの外部ドメインは、４つの反復システインリッチドメイン（ＣＲＤ）（ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３およびＣＲＤ４）を含むシステインリッチシグネチャーによって特徴付けられるが、細胞内ドメインが異なる。

【0104】

それらの細胞質シグナル伝達ドメインに基づき、ＴＮＦＲは、通常、３つのグループに分類され得る：（ｉ）細胞内部分にデスドメイン（ＤＤ）を含有し、ＤＤ結合パートナー（例えば、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）またはＴＮＦＲ１関連デスドメイン（ＴＲＡＤＤ））を介してアポトーシスを活性化するデス受容体（ＤＲ）（例えば、ＤＲ３、ＤＲ６、ＴＮＦＲ１）；（ｉｉ）ＴＲＡＦファミリーのメンバーと相互作用するＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）相互作用受容体（例えば、ＴＮＦＲＩＩ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ３０、ＬＴｂＲ、ＣＤ４０；および（ｉｉｉ）サイトゾルドメインを欠損するデコイ受容体（ＤｃＲ）（例えば、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４）（Vanamee et al., Science Signaling, Vol. 11(511), eaao4910, 2018）。

【0105】

ＴＮＦＲは、上記のように可溶性および膜貫通三量体として生じるＴＮＦスーパーファミリーのリガンドによって自然に活性化される。それらの特異的ＴＮＦＳＦリガンドの高親和性結合は、同族の標的細胞で発現された受容体のクラスタリングを誘導し、次いで細胞応答の最終段階でシグナル伝達経路を開始する（Ward-Kavanagh et al., Immunity, 44: 1005-1019, 2016）。完全および強固なＴＮＦＲの活性化は、２つのステップを必要とする。最初に、３つのＴＮＦＲ分子はＴＮＦＳＦリガンド（ＴＮＦＬ）三量体と相互作用する。第２のステップでは、これらの最初に形成された三量体リガンド受容体複合体の２つ以上が、超分子のシグナル伝達クラスターにアセンブルする。効率的なＴＮＦＲ２シグナル伝達は、複数の受容体サブユニットのクラスタリング／オリゴマー化を必要とすることが報告されている（Vanamee et al., Science Signaling, Vol. 11(511), eaao4910, 2018）。

【0106】

可溶性ＴＮＦＬ三量体へのそれらの応答に基づき、ＴＮＦＲの２つのカテゴリーが既定され得る。カテゴリーＩのＴＮＦＲは可溶性ＴＮＦＬ三量体に結合し、その後凝集し、この方法で完全におよび強く活性化される。対照的に、カテゴリーＩＩのＴＮＦＲ（例えば、ＴＮＦＲ２、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５、ＯＸ４０およびＦｎ１４）も、高親和性で可溶性ＴＮＦＬ三量体と相互作用するが、その後のクラスタリングおよびシグナル伝達ができない。しかしながら、可溶性ＴＮＦＬ三量体のオリゴマー化および／または細胞付着は、可溶性ＴＮＦＬ三量体にカテゴリーＩＩのＴＮＦＲを強く刺激させる（Wajant H. Cell Death Differ., 22(11):1727-1741, 2015）。

【0107】

典型的なＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達複合体の構造は、３つの受容体に結合した三量体リガンドからなる（Vanamee et al., Science Signaling, Vol. 11, Issue 511, eaao4910, 2018およびWajant H., Cell Death Differ., 22(11):1727-1741, 2015）。ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ、およびＴＮＦ－ＴＮＦＲ２を含む、いくつかのＴＮＦＳＦ／ＴＮＦＲＳＦリガンド－受容体結晶構造が解明されており、それらはすべてリガンド－受容体対の三量体化を示す（Dostert et al., Physiol. Rev., 99(1):115-160, 2019）。これらの観察は、３：３比が、ＴＮＦＳＦ／ＴＮＦＲＳＦシグナル伝達の共通基準であることを確認した。

【0108】

自然および獲得免疫細胞の両方とも、免疫応答の共刺激または共阻害のいずれかを駆動する様々な細胞および分子メカニズムの調整のために重要である方法で、ＴＮＦＳＦ／ＴＮＦＲＳＦメンバーによって制御される。ＴＮＦＲによって開始される細胞および分子の結果は、リガンド－受容体特異性のパターン、細胞のＴＮＦＲ発現プロファイル、ならびに相互作用に関与する免疫細胞型の同一性およびＦｃγＲ発現プロファイルによる。

【0109】

ＴＮＦＲ２
ＴＮＦＲＳＦ１ＢおよびＣＤ１２０ｂとしても公知の、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２またはＴＮＦＲＩＩ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の共刺激メンバーであり、タンパク質、例えばＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む。ＴＮＦＲ２は、Ｔ細胞上に発現される細胞表面受容体であり、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞の活性化を増強し、Ｔｒｅｇ媒介性抑制を減少させることが示されている。

【0110】

ＴＮＦＲ２発現は、主に免疫細胞（例えば、ヒトＰＢＭＣ中のＣＤ４^＋、ＣＤ８＋、ＭＤＳＣ、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞およびＮＫ細胞）および一部の腫瘍細胞に限定されるが、ＴＮＦＲ１は普遍的な発現を示す。ＴＮＦＲ２は、同族リガンド、ｔｍＴＮＦ－α、ＩＩ型膜貫通タンパク質、および分泌されたリガンドリンフォトキシン－α（ＬＴα）に結合し、その両方ともＴＮＦＲ１にも結合する（Ward-Kavanagh et al., Immunity, 44: 1005-1019, 2016）。

【0111】

ＴＮＦＲ２は、ＴＲＡＦ相互作用ＴＮＦＲＳＦのメンバーを示す。ＴＣＲ刺激の存在下で、ＴＲＡＦ相互作用受容体様ＴＮＦＲ２、４１ＢＢおよびＯＸ４０は強力なＴ細胞共刺激分子として機能する。ＴＲＡＦ相互作用受容体は、活性化されたメモリーＴ細胞上で発現されるが、休止Ｔ細胞上では発現されず、それらの同族リガンドは、活性化された抗原提示細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、自然リンパ球細胞、および多くの他の炎症細胞型に優性に発現される（Dostert et al., Physiol. Rev., 99(1):115-160, 2019およびWilliams et al., Oncotarget, 7(42):68278-68291, 2016）。それらの免疫増強共刺激特性を標的化し、Ｔ細胞増殖、生存およびいくつかのがんの型でのエフェクター機能を促進することにより、抗腫瘍免疫をブーストすることができる。典型的には、標的化戦略は、受容体に特異的なアゴニスト抗体または組換え可溶性リガンドの使用を含む。

【0112】

ＴＮＦＲ２の活性化は、主に、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３ Ｅ３リガーゼを介する生存促進性のＮＦ－κＢ経路を引き起こすと考えられるが、ＴＮＦＲ１の活性化は、ＴＲＡＤＤを細胞質デスドメインに動員し、カスパーゼ依存性経路を活性化する（Brenner et al., Nat. Rev. Immunol.,15:362-374, 2015）。ＴＲＡＦ２／３およびＮＦκＢシグナル伝達の制御により、ＴＮＦＲ２は、細胞生存および増殖を促進する遺伝子の転写を媒介することができる。したがって、ＴＮＦは、ＴＮＦＲ１への結合を介してアポトーシスを促進するが、ＴＮＦＲ２を介して生存促進効果を発揮する。

【0113】

いくつかの論文は、ＴＮＦＲ２が、ＣＤ４^＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（Govindaraj et al., Front. Immunol., 4:233, 2013）、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）（Chen et al., Sci. Rep., 6:32834, 2016）、ＣＤ８^＋Ｔｒｅｇ（Ablamunits et al., Eur. J. Immunol., 40(10):2891-901, 2010）、ＣＤ８^＋Ｔｅｆｆ（Krummey et al., J. Immunol., 197(5):2009-15, 2016）およびＭＤＳＣ（Hu et al., J. Immunol., 192 (3):1320-1331, 2014）を含む免疫細胞で発現され、重要な役割を有することを報告している。これらの発見は、ＴＮＦＲ２が、腫瘍免疫回避に寄与し得る様々な免疫応答に含まれることを示している。ＴＮＦＲ２の阻害は、Ｔｒｅｇ活性を減少させることにより、腫瘍関連免疫耐性を破壊するのを助けるであろう。あるいは、ＴＮＦＲ２のアゴニズムは、ＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増強するであろう。

【0114】

ＴＮＦＲ２は、ヒトおよびマウスＴｒｅｇの、Ｔｒｅｇの最大に免疫抑制性のサブセットで優先的に発現される。ＴＮＦＲ２が、ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋ＴｒｅｇでのＴＮＦの刺激活性を媒介し、Ｔｒｅｇの増殖拡大、活性化および表現型安定性をもたらす明らかな証拠がある（Chen and Oppenheim, Sci. Signal., 10(462), eaal2328, 2017）。

【0115】

加えて、ＴＮＦＲ２は、いくつかの型の腫瘍細胞で異常に発現され、いくつかのシグナル伝達カスケードにより腫瘍進行を誘導する。ＴＮＦＲ２は、いくつかの種類の腫瘍細胞の増殖を直接促進する（Sheng et al., Front. Immunol., 9: 1170 2018、およびChen and Oppenheim, Sci. Signal., 10(462), eaal2328, 2017、Torrey et al, Sci. Signal (2017)、Yang et al., J. Leukocyte Biol., 107:6, 2020）。

【0116】

免疫療法のためのＴＮＦ／ＴＮＦＲ２標的化
典型的には、ＴＮＦＲＳＦ受容体特異的抗体は、腫瘍細胞上のＴＮＦＲＳＦ受容体を活性化して細胞死を引き起こすこと（ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２）または免疫細胞上の共刺激受容体を活性化して抗腫瘍免疫を促進すること（４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ４０）を意図して使用される（Wajant H. Cell. Death. Differ., 22(11):1727-1741, 2015）。一部の場合（ＴＮＦＲ２、ＣＤ３０、Ｆｎ１４）では、ある特定のＴＮＦＲＳＦ受容体の腫瘍関連発現パターンを用いて、ＡＤＣＣ誘導抗体または抗体免疫毒によって腫瘍細胞を標的化する。

【0117】

ＴＮＦＲ２は、活性化された制御性Ｔ細胞で優先的に高発現され、Ｔｒｅｇ増殖拡大、表現型安定性およびｉｎ ｖｉｖｏ免疫抑制機能の促進に重要な役割を有する（Chen and Oppenheim, Sci. Signal., 10(462), eaal2328, 2017）。さらに、ＴＮＦＲ２を発現する一部の腫瘍細胞の生存および増殖は、ＴＮＦＲ２のリガンドによって促進される。加えて、Ｔｏｒｒｅｙらによって作成されたＴＮＦＲ２アンタゴニストは、ＯＶＣＡＲ３、ＴＮＦＲ２の表面発現を有する卵巣がん細胞株の死を誘導する能力を有する（Torrey et al., Sci. Signal., 10:462, 2017）。したがって、腫瘍の処置においてＴＮＦＲ２を標的化する理論的根拠としては、２要素ある：ＴＮＦＲ２の阻害剤が、ＴＮＦＲ２発現Ｔｒｅｇの活性を阻害するか、またはＴＮＦＲ２発現Ｔｒｅｇの除去により、抗腫瘍応答をブーストする、およびＴＮＦＲ２発現腫瘍細胞を直接死滅させる能力。

【0118】

腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞は、腫瘍免疫回避の主な細胞メカニズムを示し、自然発生および治療誘導性の抗腫瘍免疫応答を弱めるのに主要な役割を果たす、強力な免疫抑制細胞である。腫瘍組織内のＴｒｅｇ細胞の蓄積、および結果生じるエフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞に対するＴｒｅｇ細胞の高い比は、肺がん（４）、乳がん（５）、結腸直腸がん（６）、膵がん（７）、および他の悪性腫瘍を有するものを含む、がん患者の予後不良と相関する。それらの数を減らすかまたはチェックポイント阻害剤を使用して、それらの免疫抑制機能を下方制御するかのいずれかによるＴｒｅｇ活性の除去は、がん治療の有効性を増強する有効な戦略である。

【0119】

Ｔｒｅｇに加えて、ＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^＋ＭＤＳＣも、腫瘍担持マウスにおいて腫瘍免疫回避に寄与する。近年、ＭＤＳＣの生成、蓄積、および機能がＴＮＦ／ＴＮＦＲ２シグナル伝達によることが示された。ＭＤＳＣは、マウスおよびヒトにおいて、炎症および腫瘍進行の間に広く拡大し、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍応答を抑制することによって腫瘍増殖を増強することができる。ＴＮＦＲ１ではなく、ＴＮＦＲ２のシグナル伝達が、ＭＤＳＣ蓄積に重要であることが示された（Zhao et al., J. Clin. Invest., 122(11):4094-4104, 2012）。腫瘍担持マウスでは、ＭＤＳＣは、中枢器官（骨髄）および末梢器官（脾臓、血液、流入領域リンパ節）、ならびに腫瘍部位に蓄積する（Zhao et al.,上記）。

【0120】

抗ＴＮＦＲ２抗体
本開示の抗ＴＮＦＲ２抗体（Ｒ２＿ｍＡｂ－１～Ｒ２＿ｍＡｂ－６、あるいは本明細書では図面においてＲ２－１～Ｒ２－６と呼ばれる）は、ヒトＴＮＦＲ２に特異的である（例えば、特異的に結合する）。本開示の抗体およびそれの断片は、ＣＤＲ配列の独自のセット、ＴＮＦＲ２に対する特異性によって特徴付けられ、単剤療法として、または他の抗がん剤との組合せでがん免疫療法に有用である。より具体的には、本開示は、ヒトＴＮＦＲ２に結合する抗体に、および腫瘍微小環境に局在する細胞のＴＮＦ／ＴＮＦＲ２介在性活性をモジュレートするためのそれらの使用に関する。

【0121】

ＴＮＦＲ活性の阻害とＴＮＦＲの刺激の両方とも、価値のある治療活性を引き出し得ることが認識されている。例えば、ＴＮＦＲ２刺激は、エフェクターＴ細胞を拡大および活性化する、ならびにそれらの抗腫瘍活性を増強する手段を提供し得る。対照的に、ＴＮＦＲ２媒介性阻害またはＴＮＦＲ２発現細胞（Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣおよび腫瘍細胞）の枯渇は、腫瘍抑制微小環境を確立および維持することができた。腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する免疫刺激受容体に対するアンタゴニストおよびアゴニスト抗体は、有望ながん免疫療法として現れた。しかしながら、今日までに、ＴＮＦＲ２に対する認可された治療抗体はない。

【0122】

本発明者らは、より良い免疫療法のため、免疫抑制環境およびＴ細胞枯渇を克服する新規のメカニズムを示す独自のＴＮＦＲ２抗体を発見したと考えた。本開示の抗ＴＮＦＲ２抗体は、枯渇Ｔ細胞、抑制性骨髄細胞、または抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１耐性に寄与する制御性Ｔ細胞が豊富な腫瘍微小環境に特に有益である。

【0123】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、以下の構造的および機能的特徴の１つまたは複数を、単独でまたは組合せで呈する：（ａ）ヒトＴＮＦＲ２に特異的である、（ｂ）ヒトＴＮＦＲ１に結合しない、（ｃ）ＴＮＦＲ２のＮ末端システインリッチドメインのＣＲＤ３またはＣＲＤ４領域のエピトープに結合する、（ｄ）カニクイザルＴＮＦＲ２と交差反応する、（ｅ）ヒトＴＮＦ結合相互作用を妨害する、（ｆ）Ｆｃ受容体への結合の非存在下で可溶性ＴＮＦα刺激Ｔ細胞活性化を阻害する、（ｇ）Ｆｃ受容体への結合の非存在下で膜貫通ＴＮＦ刺激Ｔ細胞活性化を阻害する、（ｈ）Ｆｃ受容体への結合時に慢性的に刺激されるヒトエフェクターＴ細胞におけるアゴニスト活性を増強する、（ｉ）ヒトＴＮＦＲ２ノックインＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいて抗腫瘍効果を示す、（ｊ）ヒトＴＮＦＲ２ノックインＭＣ３８腫瘍モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１処置の腫瘍増殖阻害を増強する、（ｋ）ヒトＴＮＦＲ２ノックインＰＤ１耐性Ｂ１６Ｆ１０メラノーマモデルにおいて抗ＰＤ－Ｌ１処置の有効性を増強する、または（ｌ）抗腫瘍活性に寄与するＡＤＣＣ活性を示す、または（ｍ）腫瘍内のＣＤ８対Ｔｒｅｇ比を増強する。

【0124】

一実施形態では、本開示の抗体は、Ｆｃ受容体相互作用により単球ＴＨＰ１細胞においてＴＮＦＲ２シグナル伝達を阻害する。代替の実施形態では、ＴＨＰ１細胞によるＦｃ受容体架橋は、抗体にＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＴＮＦＲ２シグナル伝達を活性化させる。さらに、原発性ＣＤ８Ｔ細胞では、架橋依存的な方法で、それらは抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激によるＩＦＮγ放出を増強する。より具体的には、架橋したＴＮＦＲ２抗体は、それらが共培養環境で制御性Ｔ細胞からの抑制効果を克服できるような方法で、ＣＤ８エフェクターＴ細胞の機能を促進する。

【0125】

別の代替の実施形態では、１つまたは複数の本開示の抗ＴＮＦＲ２抗体による、枯渇した表現型（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８反復刺激によって誘導される）を有するＣＤ８エフェクターＴ細胞の処置は、細胞増殖の増加、ＩＦＮ－γおよびグランザイム放出の改善、ならびに放出された可溶性ＴＮＦαのレベルの増加によって特徴付けられるＣＤ８ Ｔ細胞機能を回復した。対照的に、抗ＰＤ１による処置は、枯渇したＣＤ８ Ｔ細胞の機能を回復しなかった。ヒトＴＮＦＲ２ノックインＭＣ３８マウス腫瘍モデルを使用して、２つの開示した抗体が強い抗腫瘍効果を示した。

【0126】

一部の実施形態では、本開示の抗ＴＮＦＲ２抗体が、ｈＴＮＦＲ２とカニクイザルＴＮＦＲ２（ｃｙｎｏＴＮＦＲ２）の両方に結合することは有利である。カニクイザル（例えば、Macaca fascicularis）の細胞上に発現したＴＮＦＲ２との交差反応性は、代理抗体を使用することなく抗体分子の動物試験が可能になるため有利である。本開示の抗ＴＮＦＲ２抗体、Ｒ２＿ｍＡｂ１～Ｒ２＿ｍＡｂ６は、すべて顕著な親和性によりカニクイザル由来のＴＮＦＲ２に結合する。

【0127】

ＩｇＧなどの例示的な抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。

【0128】

超可変領域は一般に、軽鎖可変領域における、アミノ酸残基約２４～３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）および８９～９７（ＬＣＤＲ３）からのアミノ酸残基、ならびに、重鎖可変領域における、約３１～３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は重鎖を示す）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）周辺のアミノ酸残基を包含し；Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)、ならびに／または、超可変ループを形成するそれら残基を包含する（例えば、軽鎖可変領域における、２６～３２残基（ＬＣＤＲ１）、５０～５２残基（ＬＣＤＲ２）および９１～９６残基（ＬＣＤＲ３）、ならびに、重鎖可変領域における、２６～３２残基（ＨＣＤＲ１）、５３～５５残基（ＨＣＤＲ２）および９６～１０１残基（ＨＣＤＲ３））；Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917。

【0129】

一実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、表１に開示の一連のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨを含む。例えば、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、表１に開示の抗ＴＮＦＲ２抗体の１つまたは複数においてそういったＣＤＲに相当する一連のＣＤＲ（例えば、Ｒ２＿ｍＡｂ １のＣＤＲ）を含むことができる。

【0130】

別の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体は、表２に開示の一連のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を有するＶＬを含む。例えば、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、表２に開示の抗ＴＮＦＲ２抗体の１つまたは複数においてそういったＣＤＲに相当する一連のＣＤＲ（例えば、Ｒ２＿ｍＡｂ ２のＣＤＲ）を含むことができる。

【0131】

【表1】

【0132】

【表2】

【0133】

代替の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、表１に開示の一連のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨ、ならびに表２に開示の一連のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を有するＶＬを含む。

【0134】

一実施形態では、抗体は、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体、またはそれの抗原結合部分とすることができる。一実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、ヒト抗体としてフォーマットされた、Ｒ２＿ｍＡｂ １、Ｒ２＿ｍＡｂ ２、Ｒ２＿ｍＡｂ ３、Ｒ２＿ｍＡｂ ４、Ｒ２＿ｍＡｂ ５、またはＲ２＿ｍＡｂ ６抗体のＣＤＲ領域の６つすべてを含む。代替の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体または抗体断片は、Ｒ２＿ｍＡｂ ５．１可変重鎖のＣＤＲ領域およびＲ２＿ｍＡｂ ５可変軽鎖のＣＤＲ領域を含む。

【0135】

一実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号１３、ＣＤＲ２：配列番号１４、ＣＤＲ３：配列番号１５；
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１９、ＣＤＲ２：配列番号２０、ＣＤＲ３：配列番号２１；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号２５、ＣＤＲ２：配列番号２６、ＣＤＲ３：配列番号２７；
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号３１、ＣＤＲ２：配列番号３２、ＣＤＲ３：配列番号３３；
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号３８、ＣＤＲ３：配列番号３９；
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号４９、ＣＤＲ３：配列番号３９；および
（ｖｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号４２、ＣＤＲ２：配列番号４３、ＣＤＲ３：配列番号４４
からなる群から選択される一連の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有するＶＨを含む。

【0136】

一実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号１６、ＣＤＲ２：配列番号１７１、ＣＤＲ３：配列番号１８；
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号２２、ＣＤＲ２：配列番号２３、ＣＤＲ３：配列番号２４；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号２８、ＣＤＲ２：配列番号２９、ＣＤＲ３：配列番号３０；
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号３５、ＣＤＲ３：配列番号３６；
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号４０、ＣＤＲ３：配列番号４１；および
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号４５、ＣＤＲ２：配列番号４６、ＣＤＲ３：配列番号４７、
からなる群から選択される一連の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有するＶＬを含む。

【0137】

別の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、
（ａ）
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号１３、ＣＤＲ２：配列番号１４、ＣＤＲ３：配列番号１５；
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１９、ＣＤＲ２：配列番号２０、ＣＤＲ３：配列番号２１；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号２５、ＣＤＲ２：配列番号２６、ＣＤＲ３：配列番号２７；
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号３１、ＣＤＲ２：配列番号３２、ＣＤＲ３：配列番号３３；
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号３８、ＣＤＲ３：配列番号３９；
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号４９、ＣＤＲ３：配列番号３９；および
（ｖｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号４２、ＣＤＲ２：配列番号４３、ＣＤＲ３：配列番号４４、
からなる群から選択される一連の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有するＶＨと、
（ｂ）
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号１６、ＣＤＲ２：配列番号１７、ＣＤＲ３：配列番号１８；
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号２２、ＣＤＲ２：配列番号２３、ＣＤＲ３：配列番号２４；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号２８、ＣＤＲ２：配列番号２９、ＣＤＲ３：配列番号３０；
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号３５、ＣＤＲ３：配列番号３６；
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号４０、ＣＤＲ３：配列番号４１；および
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号４５、ＣＤＲ２：配列番号４６、ＣＤＲ３：配列番号４７、
からなる群から選択される一連の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有するＶＬと、
を含む。

【0138】

一実施形態では、抗体は、
（ｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１３、ＣＤＲ２：配列番号１４、ＣＤＲ３：配列番号１５、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１６、ＣＤＲ２：配列番号１７、ＣＤＲ３：配列番号１８；
（ｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１９、ＣＤＲ２：配列番号２０、ＣＤＲ３：配列番号２１、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号２２、ＣＤＲ２：配列番号２３、ＣＤＲ３：配列番号２４；
（ｉｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号２５、ＣＤＲ２：配列番号２６、ＣＤＲ３：配列番号２７、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号２８、ＣＤＲ２：配列番号２９、ＣＤＲ３：配列番号３０；
（ｉｖ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３１、ＣＤＲ２：配列番号３２、ＣＤＲ３：配列番号３３、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号３５、ＣＤＲ３：配列番号３６；
（ｖ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号３８、ＣＤＲ３：配列番号３９、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号４０、ＣＤＲ３：配列番号４１；
（ｖｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３７、ＣＤＲ２：配列番号４９、ＣＤＲ３：配列番号３９、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号３４、ＣＤＲ２：配列番号４０、ＣＤＲ３：配列番号４１；および
（ｖｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４２、ＣＤＲ２：配列番号４３、ＣＤＲ３：配列番号４４、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４５、ＣＤＲ２：配列番号４６、ＣＤＲ３：配列番号４７
からなる群から選択される一連の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有する、ＶＨおよびＶＬの組合せを含む。

【0139】

一実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１、および４８からなる群から選択される可変重鎖配列、ならびに／または配列番号２、４、６、８、１０、および１２からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む。

【0140】

一実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、一対の可変重鎖配列と可変軽鎖配列を含み、これは以下の組合せから選択される：配列番号１を含む可変重鎖配列と配列番号２を含む可変軽鎖配列；配列番号３を含む可変重鎖配列と配列番号４を含む可変軽鎖配列；配列番号５を含む可変重鎖配列と配列番号６を含む可変軽鎖配列；配列番号７を含む可変重鎖配列と配列番号８を含む可変軽鎖配列；配列番号９を含む可変重鎖配列と配列番号１０を含む可変軽鎖配列；配列番号４８を含む可変重鎖配列と配列番号１０を含む可変軽鎖配列；配列番号１１を含む可変重鎖配列と配列番号１２を含む可変軽鎖配列。当業者であれば、可変軽鎖および可変重鎖を独立して選択して、または混合およびマッチさせて、上で特定されたペアリングとはまったく別である、可変重鎖と可変軽鎖の組合せを含む抗ＴＮＦＲ２抗体を調製することができることを、さらに理解するであろう。

【0141】

代替の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、一対の可変重鎖配列と可変軽鎖配列を含み、これは以下の組合せから選択される：配列番号１と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；配列番号３と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号４と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；配列番号５と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号６と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；配列番号７と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号８と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；配列番号９と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号１０と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；配列番号１１と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号１２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列。当業者であれば、可変軽鎖および可変重鎖を独立して選択して、または混合およびマッチさせて、上で特定されたペアリングとはまったく別である、可変重鎖と可変軽鎖の組合せを含む抗ＴＮＦＲ２抗体を調製することができることを、さらに理解するであろう。したがって、一実施形態では、抗体断片は、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＤＲを含む。抗体断片は、本明細書に記載の、少なくとも２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含むことができる。抗体断片は、本明細書に記載の抗体の少なくとも１つの可変領域ドメインをさらに含むことができる。可変領域ドメインは、任意のサイズであってもアミノ酸組成であってもよいが、全体として、ヒト抗ＴＮＦＲ２への結合を担う少なくとも１つのＣＤＲ配列を、例えば、本明細書に記載のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、および／またはＣＤＲ－Ｌ３を含むことになるが、これは、１つまたは複数のフレームワーク配列に隣接しているかまたはそれとインフレームである。

【0142】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含む。当業者であれば、保存的アミノ酸置換とは、１つのアミノ酸と、類似した構造的または化学的特性、例えば類似した側鎖などを有する別のアミノ酸との置換であると理解するであろう。例示的な保存的置換は、当技術分野において、例えば、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Publication Company, 4th Ed. (1987)に記載されている。

【0143】

「保存的改変」とは、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響することがないまたはこれを変えることがないアミノ酸改変を指す。保存的改変には、アミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。保存的置換とは、アミノ酸が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーについては十分に定義されており、それとしては、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および含硫側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸が挙げられる。さらに、アラニンスキャニング突然変異誘発について既に記載されているように（MacLennan et al., Acta Physiol Scand Suppl 643: 55-67, 1998、Sasaki et al., Adv Biophys 35: 1-24, 1998）、ポリペプチド中の任意の天然残基をアラニンで置換することもできる。本開示の抗体に対するアミノ酸置換は、既知の方法によって、例えばＰＣＲ突然変異誘発によって行うことができる（米国特許第４，６８３，１９５号明細書）。

【0144】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、５、７、９、４８、または１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、可変重鎖配列を含む。他の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、５、７、９、４８または１１の可変重鎖配列を含む抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片の結合活性（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ）および／または機能活性を保持する。さらに他の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、５、７、９、４８、または１１の可変重鎖配列を含み、かつ、重鎖可変配列に、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５の保存的アミノ酸置換を有する。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換は、配列番号１、３、５、７、９、４８、または１１の１つまたは複数のフレームワーク領域に包含される（カバットのナンバリングシステムに基づく）。他の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、５、７、９、４８または１１の可変重鎖配列を含み、かつ、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、４８または１１の１つまたは複数のＣ末端アミノ酸残基を欠損する。

【0145】

特定の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、５、７、９、４８、または１１に記載の抗ＴＮＦＲ２重鎖可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変重鎖配列を含む、可変重鎖配列を含み、フレームワーク領域に１つまたは複数の保存的アミノ酸置換（カバットのナンバリングシステムに基づく）を含み、配列番号１、３、５、７、９、４８、または１１に記載の可変重鎖配列と配列番号２、４、６、８、１０、または１２に記載の可変軽鎖配列とを含む抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片の結合活性および／または機能活性を保持する。

【0146】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、可変軽鎖配列を含む。他の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２の可変軽鎖配列を含む抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片の結合活性（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ）および／または機能活性を保持する。さらに他の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２の可変軽鎖配列を含み、かつ、軽鎖可変配列に、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５の保存的アミノ酸置換を有する。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２の１つまたは複数のフレームワーク領域に包含される（カバットのナンバリングシステムに基づく）。

【0147】

特定の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２に記載の抗ＴＮＦＲ２軽鎖可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変軽鎖配列を含み、フレームワーク領域に１つまたは複数の保存的アミノ酸置換（カバットのナンバリングシステムに基づく）を含み、配列番号１、３、５、７、９、４８、または１１に記載の可変重鎖配列と配列番号２、４、６、８、１０、または１２に記載の可変軽鎖配列とを含む抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片の結合活性および／または機能活性を保持する。

【0148】

一部の実施形態では、抗体は完全長抗体である。他の実施形態では、抗体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、およびそれにＴＮＦＲ２特異的結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドからなる群から選択される抗体断片を始めとする抗体断片である。

【0149】

一部の実施形態では、本明細書に開示の抗ＴＮＦＲ２抗体の可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸で、少なくとも１つの他の抗体ドメインまたはそれの断片に共有結合で付着させることができる。したがって、例えば、可変領域ドメインに存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたはそれの断片に連結することができる。同様に、ＶＬドメインはＣＫドメインまたはそれの断片に連結することができる。このように、例えば、抗体はＦａｂ断片とすることができるが、この場合、抗原結合ドメインは、会合したＶＨドメインおよびＶＬドメインを含有し、これらドメインは、そのＣ末端で、それぞれＣＨ１ドメインおよびＣＫドメインに共有結合で連結されている。ＣＨ１ドメインをさらなるアミノ酸で伸長させて、例えば、Ｆａｂ断片に見られるようなヒンジ領域またはヒンジ領域ドメインの一部を供給すること、または、抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインなどのさらなるドメインを供給することができる。

【0150】

一部の実施形態では、本明細書に開示の抗ＴＮＦＲ２抗体は、配列番号５０および５１に開示の抗体定常領域の１つもしくは両方、またはそれのバリアントも含み得る。配列番号５０および５１に提供した配列は、ヒト起源であり、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖定常領域およびヒトカッパ軽鎖定常領域を表す。当業者は、マウス腫瘍モデルにおける抗ＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍効果を評価するため、非天然の定常領域を含む組換え抗ＴＮＦＲ２抗体を調製することが望ましい場合があることも認めるであろう。別の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号５０または５１を含み、ＣまたはＮ末端トランケーションを有し得る（例えば、Ｃ末端リジントランケーション）。

【0151】

しかし、特定のｍＡｂがアゴニストまたはアンタゴニスト特性を持つかどうか決定する決まりは、現在、不明確である。より具体的には、抗ＴＮＦＲ２抗体のエピトープ位置、アイソタイプおよび生物学的活性の間の関係は完全には理解されていない。例えば、Ｔｏｒｒｅｙらは、ＴＮＦＲ２をアンタゴナイズすることができる抗体を開示し、ＴＮＦ－αアゴニズムの存在下での抗体の生物学的活性に基づき、優性アンタゴニストまたは劣性アンタゴニストのいずれかとしてアンタゴニスト抗体を記載している（Torrey et al., Sci. Signal., 10:462, 2017）。Ｔｏｒｒｅｙらは、ＴＮＦＲ２アンタゴニスト抗体ＡおよびＢは、その両方がＴＮＦ－αリガンド結合を防ぐために選択され、ＴＮＦＲ２活性化は、外因性ＴＮＦの存在下でのＴｒｅｇアッセイにおいてアンタゴニスト効果を発揮できなかったことを示した。しかしながら、抗ＴＮＦＲ２抗体１および２は、用量依存的にＴＮＦアゴニズムを克服することができ、十分な濃度のＴＮＦの存在下でＴｒｅｇ拡大を減少させた。これは、抗体ＡおよびＢを劣性ＴＮＦＲ２アンタゴニストとして、ならびに抗体１および２を優性ＴＮＦＲ２アンタゴニストとして分類した。エピトープマッピング研究に基づき、Ｔｏｒｒｅｙらは、優性および劣性抗ＴＮＦＲ２抗体が、それぞれＣＲＤ３／４およびＣＲＤ２領域に位置する異なるエピトープに結合すると結論付けた（Torrey et al., Sci. Signal., 10:462, 2017）。

【0152】

国際公開第２０１６／１８７０６８号パンフレットは、Ｔｏｒｒｅｙらによって記載された優性アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体が、ＫＣＲＰＧモチーフの１つまたは複数の残基を含有するエピトープを認識することを開示する（ヒトＴＮＦＲ２内の１４２～１４６残基（国際公開第２０１６／１８７０６８号パンフレットの配列番号７）。国際公開第２０１９／０９４５５９号パンフレットは、ＫＣＲＰＧモチーフ内のエピトープに結合する必要なく、ＴＮＦＲ２のＣＲＤ３またはＣＤ４内の１つまたは複数のエピトープに結合するさらなる優性アンタゴニストＴＮＦＲ２抗体を開示する。Ｔｏｒｒｅｙら、国際公開第２０１６／１８７０６８号パンフレットおよび国際公開第２０１９／０９４５５９号パンフレットに開示のアンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体は、１つまたは複数の有益な生物学的特性、例えばＴｒｅｇ細胞を死滅させるおよび／もしくはその増殖を阻害する能力、ＴＮＦＲ２＋がん細胞を死滅させるおよび／もしくはその増殖を阻害する能力、骨髄性抑制性細胞（ＭＤＳＣ）を死滅させるおよび／もしくはその増殖を阻害する能力、ならびに／またはエフェクターＴ細胞の増殖を誘導する能力を呈する。Ｔｏｒｒｅｙらは、両方の優性抗ＴＮＦＲ２アンタゴニスト抗体の機能活性が、外因性ＩｇＧ法を使用するＦｃγ受容体結合および受容体架橋結合に非依存的であることを報告した（Torrey, et al., Sci. Signal., 10:462, 2017）。

【0153】

Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ社は、がん免疫療法の開発において、ＢＩ－１８０８と指定される前臨床抗ＴＮＦＲ２抗体を有する（がん免疫療法のための標的化ＴＮＦＲ２：Ligand blocking depletors versus receptor agonists, Martensson, et al AACR 2020, Abstract # 936、Martensson et al, AACR 2020, Abstract #725）。ＢＩ－１８０８は、ＴＮＦ－αのＴＮＦＲ２ヘの結合を遮断し、ＴＮＦ－α誘導性ＴＮＲ２シグナル伝達を阻害し、生物学的活性のためＦｃγＲ結合を必要とする。ｉｎ ｖｉｖｏ作用機序研究は、ＢＩ－１８０８の作用の優性メカニズムが腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇およびＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の改善（Martensson,et al）であることを示した。マウスＢＩ－１８０８代理抗体（マウスＩｇＧ２ａフォーマットの３Ｆ１０）のｉｎ ｖｉｖｏ治療活性は、活性化Ｆｃ受容体とのＦｃγＲ相互作用への絶対的な依存によって特徴付けられる。Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ社によって出願された、国際公開第２０２０／０８９４７４号パンフレットは、アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体を記載し、一部ＣＲＤ４に依存して、アンタゴニスト抗体のエピトープがドメイン３（アミノ酸１３４～１６０を包含する）の中心にあることを示す。

【0154】

国際公開第２０１７／０４０３１２号パンフレットは、ＴＮＦＲ２シグナル伝達およびＴｒｅｇの拡大／増殖を促進するように機能するアゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体を開示する。アゴニスト抗体は、配列ＫＣＳＰＧを含むエピトープに特異的に結合するとしてさらに特徴付けられる。ＨｉＦｉＢｉｏ社、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ社およびＭｅｒｒｉｍａｃｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社によって公開された近年のポスターは、腫瘍微小環境においてＴ細胞活性をモジュレートするために開発下にあるアゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体を記載する。

【0155】

ＨｉＦｉＢｉｏ社の候補、ＨＦＢ２００３０１は、ヒト化抗ＴＮＦＲ２抗体であり、ＴＮＦとＴＮＦＲ２結合を競合せず、活性化ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を刺激し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのそれらの増殖を増強し、ヒトＴＮＦＲ２ノックインマウスの同系ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、Ｆｃ受容体依存性抗腫瘍活性を示す（Wei et al., AACR 2020, Poster #2282）。

【0156】

Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ社の候補ＢＩ－１９１０も、ＴＮＦＲ２ヘの結合からＴＮＦ－αを遮断せず、ＴＮＦＲ２シグナル伝達の強い活性化によって特徴付けられ、生物学的活性のためにＦｃ結合を必要としないが、ＩｇＧアイソタイプまたはＦｃγＲの活性化とは反対に、阻害のための結合を改善するように指定されたバリアントＦｃ領域として活性の増強を示す。Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ社によって出願された国際公開第２０２０／０８９４７３号パンフレットは、アゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体を記載し、アゴニスト抗体がＣＲＤ３の遠位のＣ末端部分に結合し、その結合が、同じエピトープマッピング実験で評価されたアンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体よりもＣＲＤ４により大きく依存するようであることを示す。ＢＩ－１９１０のマウス代理抗体（すなわちマウスＩｇＧ１フォーマットの抗体５Ａ０５）による処置は、ＣＴ２６同系モデルにおいて腫瘍内ＣＤ８ Ｔ細胞を早期に増加させ、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増強をもたらした（Martensson, et al AACR 2020, Abstract # 936）。

【0157】

Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ社の抗ＴＮＦＲ２抗体候補、ＭＭ－４０１は、マウス抗体Ｙ９と同じエピトープに結合し（ＣＲＤ１のエピトープに結合するとして、Tam et al., Sci. Transl. Med.,11(512), 2019に記載される）、その作用の優性メカニズムはＴ細胞の共刺激活性による。より具体的には、それは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を刺激し、Ｔ細胞において免疫抑制マーカーおよびＴＮＦＲ２の下方制御を媒介し、腫瘍浸潤ＣＤ８Ｔ細胞の強さおよびエフェクター機能を増加させる。マウス同系腫瘍モデルの抗腫瘍効果は、ＦｃγＲ依存性であり、阻害性ＦｃγＲの結合によって増強される（Richards et al, MM-401, a novel anti-TNFR2 antibody that induces T cell co-stimulation. AACR 2019, Abstract # 4848）。

【0158】

そのｉｎ ｖｉｖｏ治療活性への抗体のアイソタイプの効果を理解するため、当業者は、異なるアイソタイプならびに活性化および阻害性Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）への固有の異なる結合親和性によって特徴付けられる複数の重鎖定常領域と組み合わせた同じ可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を有する組換え抗体を作成することが望ましいことを容易に認識するであろう。例えば、当業者には、マウスＩｇＧ２ＡがヒトＩｇＧ１と機能的に似ており、活性化ＦｃγＲにより結合するが、マウスＩｇＧ１がヒトＩｇＧ４に最も近く機能的に等価であり、ＦｃγＲへの結合をより減少させると考えられることが公知である。

【0159】

ＴＮＦＲ２ヘの結合に加えて、本明細書に開示のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体分子の完全長バージョンも、Ｆｃγ受容体に結合するであろう。累積証拠により、免疫調節抗体は、それらの調節活性およびエフェクター機能のため、異なる型のＦｃγ受容体に結合することを示す。より具体的には、どのように抗体免疫複合体が免疫細胞活性化をモジュレートするかが活性化および阻害性Ｆｃγ受容体への相対的な結合によって決定されることが公知である。異なる抗体アイソタイプは、異なる親和性で、活性化および阻害性Ｆｃγ受容体に結合し、異なる活性化：阻害比（Ａ：Ｉ比）を生じる（Nimmerjahn et al., Science, 310(5753):1510-2, 2005、Teige et al., Front Immunol, 10, 2019）。

【0160】

過去１０年間のｉｎ ｖｉｖｏ研究により、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体抗体の、細胞発現Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）への係留が、それらの受容体刺激活性に決定的な関連があり得ることが示唆されている。特に、ＦｃγＲＩＩＢ受容体は、免疫調節性アゴニスト抗体の活性を正に制御することが示されている（Liu et al., Antibodies, 9:64, 2020）。ＬｉおよびＲａｖｅｔｃｈは、アゴニストＣＤ４０抗体の抗腫瘍活性が阻害性Ｆｃγ受容体の結合を必要とすることを報告した（Li and Ravetch, Proc. Nat’l Acad. Sci. (USA), 109:10966-71, 2012、Li and Ravetch, 333(6045): 1030-1034, 2011）。ＴＮＦＳＦの他のカテゴリーＩＩ共刺激メンバー（例えば、４－１ＢＢおよびＯＸ４０）の抗腫瘍データを報告する論文は、ＦｃγＲＩＩＢ／抗体相互作用の、ＴＮＦＳＦ受容体を標的化する免疫調節性アゴニスト抗体の活性を正に制御する能力を確認した（Zhang et al., J Biol Chem., 291(53): 27134-27146, 2016、White et al., J. Immunol., 187, 1754-1763, 2011、White et al., J. Immunol., 193, 1828-1835, 2014およびYu et al., Cancer Cell, 33, 664-675, 2018）。

【0161】

抗体開発に関する文献は、抗ＴＮＦＲ２抗体の生物学的活性の決定におけるＦｃγＲ相互作用の重要性についていくらかの決まりをもたらしてももたらさなくてもよい。他の抗ＴＮＦＲカテゴリーＩＩ特異的抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＣＤ９５、抗Ｆｎ１４）の生物学的活性に関する研究は、抗ＴＮＦＲ ＩｇＧ抗体のイディオタイプが、アゴニスト活性の付与を担う決定因子ではないことを明らかにした。ＴＮＦＲカテゴリーＩＩ受容体を標的化する抗体による強いアゴニズムに必要な決定因子は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）結合である（Medler et al. Cell Death and Disease, 10:224, 2019、Li and Ravetch, PNAS (USA), 109:10966-71, 2012およびWhite et al., J. Immunol., 187, 1754-1763, 2011）。

【0162】

当業者は、Ｆｃの操作が、本開示の抗ＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍活性（例えば、エフェクター機能）を改変するために使用され、それらのアゴニスト活性および／またはエフェクター機能を増強し得ることを認識するであろう。文献は、いくつかの代替のＦｃ操作戦略を記載し、そのすべてが本明細書に開示の抗体の１つの可変領域を含む改変された抗ＴＮＦＲ２抗体を設計するのに好適であり、ＦｃγＲ依存的な方法またはＦｃγＲ非依存的な方法のいずれかでＴＮＦ／ＴＮＦＲ２軸をモジュレートする。例えば、免疫刺激のために最適化された抗体を産生するため、本明細書に開示の抗ＴＮＦＲ２抗体の可変領域ドメインは、低Ａ：Ｉ比を付与するように改変された免疫グロブリンＦｃドメインにＣ末端アミノ酸で共有結合され得る。したがって、一部の実施形態では、ＴＮＦＲ２の三量体リガンド受容体複合体の超分子シグナル伝達クラスターへの超架橋によりエフェクターＴ細胞活性化を刺激するため、本明細書に開示の抗ＴＮＦＲ２抗体を改変して、阻害性ＦｃγＲ（例えば、ＣＤ３２ｂ）ヘの結合を増強することができる。

【0163】

例えば、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）結合親和性の増加は、２つの突然変異Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆ（すなわち「ＳＥＬＦ」）（２６７位のセリンをグルタミン酸によって置き換え、３２８位のロイシンをフェニルアラニンによって置き換える）をヒトＩｇＧ１定常領域に導入することによって、ヒトＩｇＧ１定常領域へと改変され得る（Chu et al, Mol. Immunol. 45(15):3926-3933, 2008）。これら２つのＦｃ突然変異は、およそ４３０倍、ＣＤ３２ｂへの結合親和性を増加することが報告されており、ＷＴ ｈＩｇＧ１と比較して、ＦｃＲＩおよびＦｃＲＩＩＡ－Ｈ１３１ヘの結合が最小変化であり、ＦｃＲＩＩＩＡ－Ｖ１５８ヘの結合を除去する（Liu et al., Antibodies, 9:64, 2020）。ｉｎ ｖｉｖｏでは、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ改変抗ＣＤ４０ ｈＩｇＧ２抗体は、ＷＴ ｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ２バリアントのいずれかと比較した場合、ｈＦｃＲ／ｈＣＤ４０トランスジェニックマウスにおいてＴ細胞を活性化する能力が増強した（Liu et al., Antibodies, 9:64, 2020およびDahan et al., Cancer Cell, 29, 820-831, 2016）。単一のＳ２６７Ｅ（「ＳＥ」）突然変異を持つ抗ＤＲ５抗体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃγＲＩＩＢへの親和性を数百倍増加し、ＦＣγＲＩＩＢをヒト化したマウスモデルにおいて腫瘍退縮を改善したことが報告されている（Li and Ravetch, Proc. Nat’l Acad. Sci., (USA), 109:10966-71, 2012）。

【0164】

あるいは、本明細書に開示の抗ＴＮＦＲ２抗体の可変領域ドメインは、Ｍｉｍｏｔｏらによって既定されたＶ１２突然変異（Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ）またはＶ１１突然変異（Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ）のいずれかを含むように改変された免疫グロブリンＦｃドメインにＣ末端アミノ酸で共有結合的に付着され得る。Ｖ１２およびＶ１１突然変異は、ＷＴ ｈＩｇＧ１と比較して、ＦｃγＲＩＩＢヘの結合が増強されたが、活性化ＦｃＲ（ＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩＡ－Ｈ１３１、ＦｃＲＩＩＩＡ－Ｖ１３１）ヘの結合を完全に廃止するまたは著しく減少する突然変異Ｐ２３８Ｄの観察について詳しく実施した研究に基づいて解明された（Mimoto et al., Protein Eng. Des. Sel., 26:589-598, 2013）。Ｖ１２およびＶ１１突然変異は、野生型ヒトＩｇＧ１（Mimoto et al.）と比較して、それぞれＦｃγＲＩＩＢ結合をおよそ２１７倍および４０倍に増強したことが報告された。

【0165】

Ｚｈａｎｇらは、抗ＯＸ４０抗体ＳＦ２のアゴニズムおよびエフェクター機能の増強への異なるＦｃ操作アプローチの系統的評価を実施した。研究は、「ＳＥＬＦ」突然変異、Ｖ１２突然変異、ならびに抗体のアゴニズムおよびエフェクター機能を増強する代替の戦略として、細胞表面抗原に結合した場合、ＩｇＧ１ Ａｂの六量体化を容易にするＦｃ突然変異を比較した（Zhang et al., J. Bio. Chem., 291(53):27134-27146, 2016）。評価した六量体化突然変異は、単一のＥ３４５ＲおよびＥ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ二重突然変異およびＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ三重突然変異を含む（Diebolder et al., Science 343, 1260-1263, 2014）。突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢ架橋結合に依存することなく、ＯＸ４０受容体のクラスタリングを促進することによって、ＳＦ２のアゴニズム／エフェクター機能を増強すると予測された。単一のＥ３４５Ｒ突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢ架橋結合によらず、ＳＦ２のアゴニズムに最良の効果を有すると報告された。Ｚｈａｎｇらは、Ｅ３４５Ｒ六量体化突然変異が、ＦｃγＲＩＩＢ架橋結合によらず、より高いアゴニズム、局所的な微小環境におけるＦｃγＲ発現レベルにかかわらず、エフェクター機能を付与できる特徴を容易にすることができると結論付けた。しかしながら、ＦｃγＲ非依存性は、ＦｃγＲ発現細胞の浸潤が低レベルの腫瘍微小環境に有利であると考えられ得るが、それは非特異的にアゴニズムを刺激し、望まないオフターゲット効果をもたらし得る（Zhang et al., J. Biol. Chem., 291(53):27134-27146, 2016）。

【0166】

ＭｅｄｌｅｒおよびＷａｊａｎｔは、近年、ＴＮＦＲ２特異的ＩｇＧ１抗体Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）（ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ、およびＦｃγＲ３Ａへの結合と干渉するように選択された点突然変異）の異種細胞表面係留ドメインとの遺伝子融合により、標的化された制御ＦｃγＲ非依存的なアゴニスト活性を有するＴＮＦＲＳＦ受容体特異的抗体融合タンパク質を記載した（Medler et al., Cell Death and Disease, 10:224, 2019）。細胞表面係留ドメインは、相当するサイトカイン受容体発現細胞への結合を可能にするサイトカイン（マウスＩＬ－２、マウスＧＩＴＲＬ、ヒトＧＩＴＲＬまたはマウス４－１ＢＢＬ）；および腫瘍関連抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ７０に特異的なｓｃＦｖを含む。調べた４つすべてのＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）サイトカイン融合タンパク質は、それらの相当する細胞表面に曝露されたサイトカイン受容体に係留するとＦｃγＲ非依存的な方法でＴＮＦＲ２を活性化する。同様に、すべての抗ＴＮＦＲ２ ｓｃＦｖ特異的融合タンパク質は、相当する腫瘍抗原を発現するＪｕｒｋａｔ細胞と共培養したＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞におけるＴＮＦＲ２シグナル伝達を活性化した。

【0167】

ＭｅｄｌｅｒおよびＷａｊａｎｔは、係留ドメインとしての腫瘍抗原特異的ｓｃＦｖの使用は、ＴＭＥにおけるＦｃγＲ結合の必要性を排除するだけでなく、全身性副作用の低減を約束することもできると推測した（Medler et al., Cell Death and Disease, 10:224, 2019）。さらに、腫瘍関連抗原は、ＦｃγＲと比較してずっと高い発現レベルに達し得るため、それらはさらに細胞表面係留抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体融合タンパク質が、ＦｃγＲ結合従来型抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体よりも高い全活性を得ることができるとさらに推定した（Medler et al.）。ＴＭＥに存在する細胞表面標的に特異的な係留ドメインを含むように改変された融合タンパク質として、開示された抗ＴＮＦＲ２抗体の可変領域ドメインの使用は、がんの抗体ベースの免疫療法のため、本明細書に開示の抗体の使用を容易にすることができた。

【0168】

抗体の作製方法
抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、当技術分野で知られている任意の方法によって作製することができる。例えば、レシピエントは、ヒトＴＮＦＲ２もしくはそれの断片をコードするＤＮＡ、ＴＮＦＲ２の完全長外部ドメインを含む融合タンパク質、またはＩｇＦｃドメインと組み合わせた４つの反復システインリッチドメイン（ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３およびＣＲＤ４）の１つもしくは複数の任意の組合せ、またはＣＲＤのいずれか１つからの標的エピトープをコードするポリペプチド配列、またはヒトＴＮＦＲ２を過剰発現するように改変された組換え細胞で免疫することができる。適切な任意の免疫方法を使用することができる。かかる方法としては、アジュバント、他の免疫刺激剤、反復ブースター免疫、および１つまたは複数の免疫経路の使用を挙げることができる。

【0169】

様々な形態のＴＮＦＲ２抗原を使用して、生物学的に活性な抗ＴＮＦＲ２抗体の特定のための免疫応答を誘発させることができる。したがって、誘発ＴＮＦＲ２抗原は、単独でまたは１つもしくは複数の免疫原性増強剤との組合せの、単一のエピトープであっても、多重のエピトープであっても、タンパク質全体であってもよい。一部の態様では、誘発抗原は、単離された可溶性完全長タンパク質、または完全長配列未満を含む可溶性タンパク質である（例えば、ヒトＴＮＦＲ２の単一のＣＲＤドメインまたはＴＮＦＲ２外部ドメインの特定のサブドメイン由来のペプチドを含むペプチドで免疫する）。本明細書で使用される場合、「部分」という用語は、必要に応じて、目的の抗原の免疫原性エピトープを構成する、最小数のアミノ酸または核酸を指す。目的の細胞の形質転換に適したあらゆる遺伝的ベクターを用いることができ、それには、アデノウイルスベクター、プラスミド、およびカチオン性脂質などの非ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

【0170】

マウス、げっ歯類、霊長類、ヒト等などの種々の哺乳動物宿主から、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製することが望ましい。かかるモノクローナル抗体を調製する技法に関する記載が、例えば、Sties et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed.) Lance Medical Publication, Los Altos, CAに、およびそこで引用される参考文献；Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2nd ed.) Academic Press, New York, NYに見出すことができる。通常では、所望の抗原で免疫した動物由来の脾臓細胞が、普通には骨髄腫細胞との融合によって、不死化される（Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6(7):511-9, 1976）。不死化についての代替の方法としては、エプスタイン・バーウイルス、癌遺伝子、もしくはレトロウイルスを用いる形質転換、または当該分野において知られている他の方法が挙げられる。例えば、Doyle et al. (eds. 1994 and periodic supplements) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, New York, NYを参照されたい。抗原に対する所望の特異性および所望の親和性の抗体の産生のために、単一の不死化細胞から生じるコロニーをスクリーニングする。かかる細胞により産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注入を含めて、種々の技法によって増大することができる。あるいは、例えば、Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281に概説された一般的プロトコルに従って、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはそれの抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列を単離することができる。したがって、抗体は、当技術分野で熟練した研究者によく知られている様々な技法によって得ることができる。

【0171】

他の適切な技法には、ファージ、酵母、ウイルスまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリの選択が関与する。例えば、Huse et al.上掲；およびWard et al. (1989) Nature 341:544-546を参照されたい。本明細書で開示のポリペプチドおよび抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含めて、改変の有無にかかわらず使用することができる。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを供給する物質を、共有結合または非共有結合のいずれかで連結することによって、標識されることもある。科学文献と特許文献どちらにおいても、幅広い様々の標識およびコンジュゲーションの技法が、知られており、広く報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害因子、蛍光性の部分、化学発光性の部分、および磁性粒子等が挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，９３９６，３４５号明細書；同第４，２７７，４３７号明細書；同第４，２７５，１４９号明細書；および同第４，３６６，２４１号明細書が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンも産生させることができる、Cabilly米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびQueen et al. (1989) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 10029-10023を参照されたい；または、トランスジェニックマウスにおいて作製することができる、Nils Lonberg et al., (1994), Nature 368:856-859；およびMendez et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156；TRANSGENIC ANIMALS AND METHODS OF USE （国際公開第２０１２／６２１１８号パンフレット）、Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｔｒｉａｎｎｉ、Ａｂｇｅｎｉｘ、Ａｂｌｅｘｉｓ、ＯｍｉｎｉＡｂ、Ｈａｒｂｏｕｒおよびそのほかの技法を参照されたい。

【0172】

一部の実施形態では、ＴＮＦＲ２および／またはＴＮＦＲスーパーファミリーの他の関連するメンバーに結合する産生された抗体の能力は、標準的な結合アッセイを使用して、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＦｏｔｅＢｉｏ（ＢＬＩ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫蛍光、フローサイトメトリー解析、走化性アッセイ、および細胞移動アッセイを使用して、評価することができる。一部の態様では、産生された抗体はまた、溶液中または細胞の表面上のいずれかでのＴＮＦα／ＴＮＦＲ結合相互作用を遮断／阻害するそれの能力について評価することができる。

【0173】

ハイブリドーマまたは宿主細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが通常の精製技法である。プロテインＡのアフィニティーリガンドとしての適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトガンマ１、ガンマ２、またはガンマ４の各重鎖をベースとする抗体を精製することができる（例えば、Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13を参照されたい）。プロテインＧが、すべてのマウスアイソタイプにおよびヒトガンマ３に推奨される（Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575, 1986）。アフィニティーリガンドが付着されるマトリクスはほとんどの場合アガロースであるが、その他のマトリクスも利用可能である。多孔性ガラス（controlled pore glass）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリクスによって、アガロースで得ることができるよりも早い流速および短い処理時間が可能となる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）レジン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製向けの他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。

【0174】

任意の予備的精製ステップに続いて、目的の抗体と混入物を含む混合物を、通常では低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍ塩から）で行うが、ｐＨ約２．５～４．５の間にての溶出緩衝剤を使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができる。

【0175】

また、本開示の抗体または抗体断片をコードする単離されたポリヌクレオチド配列により表わされるヌクレオチド配列の全部または一部（例えば、可変領域をコードする部分）に、本明細書で定義の、低、中および高のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、核酸も含まれる。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は典型的には、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０または５０）ヌクレオチド長である。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、抗ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、重鎖可変領域または軽鎖可変領域）をコードする核酸またはその相補鎖の一部または全部の配列と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一である。本明細書に記載のタイプのハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマーまたは診断プローブとして使用することができる。

【0176】

ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
他の実施形態は、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、および宿主細胞、ならびに上記抗体を作製するための組換え技法を包含する。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、完全長モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含めて、所望の任意の形態の抗ＴＮＦＲ２抗体をコードすることができる。

【0177】

一部の実施形態には、配列番号１、３、５、７、９、１１、および４８のアミノ酸配列を有する抗体または抗体断片の重鎖可変領域をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態には、配列番号２、４、６、８、１０、および１２のいずれかのアミノ酸配列を有する抗体または抗体断片の軽鎖可変領域をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。

【0178】

一実施形態では、単離されたポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１含む可変重鎖配列および配列番号２を含む可変軽鎖配列；
（ｂ）配列番号３を含む可変重鎖配列および配列番号４を含む可変軽鎖配列；
（ｃ）配列番号５を含む可変重鎖配列および配列番号６を含む可変軽鎖配列；
（ｄ）配列番号７を含む可変重鎖配列および配列番号８を含む可変軽鎖配列；
（ｅ）配列番号９を含む可変重鎖配列および配列番号１０を含む可変軽鎖配列；
（ｆ）配列番号４８を含む可変重鎖配列および配列番号１０を含む可変軽鎖配列；ならびに
（ｆ）配列番号１１を含む可変重鎖配列および配列番号１２を含む可変軽鎖配列
のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する抗体または抗体断片をコードする。

【0179】

別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；
（ｂ）配列番号３と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号４と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；
（ｃ）配列番号５と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号６と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；または、
（ｄ）配列番号７と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号８と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列
（ｅ）配列番号９と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号１０と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；ならびに
（ｆ）配列番号１１と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号１２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列
のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する抗体または抗体断片をコードする。

【0180】

抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを、当技法分野で知られている、１つまたは複数の調節配列または制御配列に融合することができ、かつ、それを当技術分野において知られている適切な発現ベクターまたは宿主細胞に含有せしめることができる。重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチド分子それぞれを、独立して、ヒト定常ドメインなどの定常ドメインをコードするポリヌクレオチド配列に融合することができ、その結果、インタクトな抗体の作製が可能となる。あるいは、ポリヌクレオチドまたはその一部を互いに融合することができ、その結果、単鎖抗体の作製用の鋳型がもたらされる。

【0181】

組換え産生の場合、抗体をコードするポリヌクレオチドを、クローニング用（ＤＮＡの増幅）または発現用の複製可能なベクターに挿入する。組換え抗体を発現させるための適切な多くのベクターが利用可能である。ベクター成分としては一般に、それらに限定されないが、以下の１つまたは複数が挙げられる：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。

【0182】

抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片はまた、融合ポリペプチドとして産生されてもよく、この場合、抗体または断片は、シグナル配列などの異種ポリペプチド、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドと融合されている。選択された異種シグナル配列は典型的には、宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。抗ＴＮＦＲ２抗体シグナル配列を認識かつプロセシングしない原核宿主細胞の場合、シグナル配列を、原核生物のシグナル配列によって置換することができる。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、リポタンパク質、熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダー等とすることができる。酵母での分泌の場合、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼアルファ因子（サッカロマイセス（Saccharomyces）およびクルイベロマイセス（Kluyveromyces）のアルファ因子リーダーを含めて）、酸性ホスファターゼ、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）グルコアミラーゼ、または国際公開第９０／１３６４６号パンフレットに記載のシグナルから得られるリーダー配列で置換することができる。哺乳動物細胞では、哺乳動物シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルを使用することができる。かかる前駆体領域のＤＮＡを、抗ＴＮＦＲ２抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレーム内でライゲートする。

【0183】

発現ベクターおよびクローニングベクターは、１つまたは複数の選択された宿主細胞においてベクターが複製することを可能とする核酸配列を含有する。一般には、クローニングベクター内でのその配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能とするものであり、これは複製起点または自律複製配列を含む。様々な細菌、酵母、およびウイルスについて、かかる配列はよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は大半のグラム陰性細菌にとって適切であり、２－υ．プラスミド起点は酵母に適切であり、種々のウイルス性起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、およびＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、複製成分の起点は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有するという理由だけで、通常では使用することができる）。

【0184】

発現ベクターおよびクローニングベクターは、発現の特定を容易にする選択マーカーをコードする遺伝子を含有することができる。通常の選択マーカー遺伝子は、抗生物質もしくはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする、または代替的には補完性の栄養要求性欠損症である、あるいは他の選択肢では、選択マーカー遺伝子は複合培地に存在しない特定の栄養分を供給する、例えば、上記遺伝子はバシラス綱（Bacilli）のためのＤ－アラニンラセミ化酵素をコードする。

【0185】

組成物および処置方法
本開示はまた、上皮細胞由来の原発性または転移性がんを有する患者の処置のための治療薬として使用するための抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片を含む、例えば、医薬組成物を始めとする組成物を提供する。特定の実施形態では、本明細書に記載の治療有効量の組成物は、腫瘍細胞を死滅させるためにがん患者に投与される。例えば、本明細書に記載の組成物を使用して、ＴＮＦＲ２を発現または過剰発現するがん細胞の存在によって特徴付けられる腫瘍の患者を処置することができる。一部の態様では、本開示の組成物を使用して、ＴＮＦＲ２を発現しないが、抗ＴＮＦＲ２が免疫応答を刺激し、腫瘍浸潤免疫細胞におけるＴＮＦＲ２の上昇を引き起こす腫瘍を有する患者を処置することができる。

【0186】

腫瘍は固形腫瘍または液性腫瘍であり得る。ある特定の実施形態では、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、非免疫原性である。処置のためのがんの非限定的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、胃がん、腎がん（renal cancer）、卵巣がん、肝臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん（kidney cancer）、前立腺がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵がん、乳がん、頭頸部がん、メラノーマ、骨がん、子宮がん、および２つの主要な血液細胞系統、例えばリンパ細胞株の骨髄細胞株などのいずれかに由来する他の血液悪性腫瘍が挙げられる。

【0187】

一部の態様では、がんの処置は、組合せ戦略が特に望ましい分野である、なぜなら、２つ、３つ、４つ、またはさらに多い制がん薬／療法の組合せ作用によって、しばしば、単剤療法アプローチの影響よりもかなり強い相乗効果が生みだされるからである。本明細書で提供される薬剤および組成物（例えば、医薬組成物）は、単独で、または手術、放射線照射、化学療法および／または骨髄移植（自家、同系、同種または非血縁）などの従来の治療レジメンとの組合せで使用することができる。薬剤および組成物はまた、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害剤、免疫チェックポイント阻害剤、共刺激分子、キナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、小分子標的治療薬およびマルチエピトープ戦略のうちの１つまたは複数との組合せで使用してもよい。したがって、本開示の別の実施形態では、がん処置は、種々の他の薬物と効果的に組み合わせることができる。

【0188】

本開示の抗ＴＮＦＲ２抗体は、単独で、またはがんを処置するのに有用である他の組成物との組合せでのいずれかで投与することができる。一実施形態では、本開示の抗体は、単独で、またはがんを処置するのに有用な他の抗体を始めとする他の免疫療法との組合せでのいずれかで投与することができる。例えば、一実施形態では、他の免疫療法とは、ヒトプログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＮＫＧ２Ａ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１３７、ＴＩＧＩＴならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される免疫チェックポイント分子に対する抗体である。代替の実施形態では、第２の免疫療法は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体である。各組合せは、本開示の別々の実施形態を表す。

【0189】

抗ＴＮＦＲ２抗体は、免疫原性剤（腫瘍ワクチン）、例えばがん細胞、組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む精製した腫瘍抗原と組み合わせることができる。ＴＮＦＲ２活性化を介してＴ細胞活性化の閾値を下げることにより、宿主における腫瘍応答を活性化することができ、免疫原性が制限された非免疫原性腫瘍の処置を可能にする。

【0190】

抗ＴＮＦＲ２抗体は、チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１／ＰＤＬ１遮断薬、および腫瘍免疫回避を克服することができる他の治療、例えばＰＤＬ１／ＴＧＦｂトラップと組み合わせることができる。動物モデルにおけるＴＮＦＲ２標的化の抗ＰＤ－１との相乗作用は（Wei et al., AACR 2020, Poster #2282）、ＴＮＦＲ２共刺激およびＰＤ１遮断が、ＰＤ１単独療法よりも抗腫瘍免疫応答の増強をもたらす可能性があることを示している。

【0191】

抗ＴＮＦＲ２抗体は、標準的ながん治療（例えば、外科手術、放射線および化学療法）と組み合わされ得る。これらの場合では、化学療法の用量を下げ、がん患者における化学療法および放射線療法の効果を改善し、彼らの生存を延長することが可能であり得る。

【0192】

本明細書で論議の治療剤の組合せは、二重特異性もしくは多重特異性結合剤もしくは融合タンパク質の成分として、または医薬的に許容される担体に含まれる単一組成物として同時に投与することができる。あるいは、療法薬の組合せは、医薬的に許容される担体に含まれる各薬剤を有する別々の組成物として同時に投与してもよい。別の実施形態では、治療剤の組合せを順次に投与する場合もある。

【0193】

医薬組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995に開示のものなどの従来の技法に従って、医薬的に許容される担体または希釈剤、ならびにその他の任意の既知のアジュバントおよび賦形剤とともに製剤化することができる。一部の態様では、医薬組成物は、がんを処置するのに対象に投与される。

【0194】

本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」には、生理学的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮の各投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、二重特異性分子および多重特異性分子を、物質でコーティングして、化合物を不活性化するおそれのある酸およびその他の自然条件の作用から当該化合物を保護することができる。

【0195】

本開示の組成物は、当技術分野で知られている様々な方法によって投与することができる。当業者であれば理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なる。活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化による送達系を含めて、制御放出製剤などの、急速な放出に対して化合物を保護することになる担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤を調製する方法は一般に当業者に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。

【0196】

医薬組成物中の有効成分の投薬量レベルは、対象にとって毒性がなく、特定の対象、組成物および投与様式に関して所望の治療反応を達成するのに効果的である、有効成分の量が得られるように、変えることができる。選択される投薬量レベルは、採用する本開示の特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、採用する特定の化合物の排泄速度、処置の期間、採用する特定の組成物との組合せで使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康、および以前の病歴等の医学分野でよく知られている要因を含めて様々な薬物動態の要因に左右されるであろう。

【0197】

本明細書に記載の医薬組成物は、有効量で投与することができる。「有効量」とは、単独で、もしくはさらなる用量とともに所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患のまたは特定の状態の処置の場合、所望の反応は好ましくは、疾患の経過の阻害に関連する。このことは、疾患の進行を遅延させること、および特に、疾患の進行を中断または好転させることを含む。

【0198】

特定されるすべての特許および刊行物は、例えば、本開示に関連して使用することが可能なかかる刊行物に記載の方法論を、説明および開示することを目的として、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示ために提供されるに過ぎない。この点に関していかなるものも、本発明者らが、先行開示を理由としてまたは他のいかなる理由によっても、かかる開示に先行する権利を有さないことを承認するものと解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関する声明または内容に関する表現はすべて、本出願人にとって入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性に関していかなる承認も構成するものではない。

【0199】

先に指示されていない限りでは、本明細書に記載および例示される様々な実施形態のいずれでも、本明細書に開示の他の実施形態のうちのいずれかに示される特性を組み込むようにさらに改変され得ることは、当業者であれば理解されるであろう。

【0200】

本開示の広範な範囲は、以下の例を参照して最もよく理解されるが、本例は本開示を特定の実施形態に限定することを意図するものではない。本明細書に記載される特定の実施形態は、例としてのみ提供されるものであり、本開示は、添付の特許請求の範囲の条件によって、かかる特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲を含めて、制限されるものである。

【実施例】

【0201】

一般方法
エレクトロポレーションを使用して、ヒト（Homo sapiens）配列（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１０５７．１、配列番号５２）またはカニクイザル（Macaca fascicularis）配列（ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿００５５４４８１７．１、配列番号５３）、もしくはマウス（Mus musculus）配列（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０３５７４０．２、配列番号５４）からのＴＮＦＲ２、またはヒト（Homo sapiens）配列（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１０５６．１、配列番号５５）からのＴＮＦＲ１を発現するｐｃＤＮＡベースのプラスミドを、選択された宿主細胞（すなわち、両方ともＡＴＣＣから購入したＣＨＯ－Ｋ１もしくはＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはＫｙｉｎｎｏ ＃ＫＣ－０１４９からのＪｕｒｋａｔ ＮＦκＢ細胞）にトランスフェクトすることによって、ＴＮＦＲ２またはＴＮＦＲ１を発現する安定な細胞株を生成した。ヒト配列（配列番号５７）由来のＴＮＦの膜結合非開裂形態を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Horiuchi, T. et al. (Rheumatology, 1215-1228, 2010)によって記載された情報に従って生成した。

【0202】

表面発現をアッセイするためのフローサイトメトリーを使用して、トランスフェクションの２４時間および４８時間後に適切な抗体を使用して発現を確認した。プラスミド構築物に適切な抗生物質を使用して、統合された細胞を選択した。選択の７～１０日後、選択圧下にトランスフェクタントを維持しながら９６ウェルプレート中で生存細胞を限界希釈した。

【0203】

必要であれば、１０～１４日後に、ＴＮＦＲ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＦＡＢ２１６Ａ）およびＴＮＦＲ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ２２５Ｐ）特異的抗体でフローサイトメトリーを使用してスクリーニングするため、単一コロニーをピックアップした。上位３～５位の高発現クローンを、さらなる開発のために選択した。数回の継代後、発現レベルをフローサイトメトリーおよびイメージアッセイによって確認し、それが安定であることを確かめた。

【0204】

ハイブリドーマクローンについて重鎖および軽鎖の可変領域の配列を下記のように決定した。全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）製のＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して、１～２×１０^６個のハイブリドーマ細胞から抽出した。ｃＤＮＡは、Ｔａｋａｒａ（Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’Ｋｉｔを使用して５’ＲＡＣＥ反応を実行することによって生成した。ＰＣＲを、ＮＥＢ（Ｉｐｓｗｉｔｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）製のＱ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して実行して、適当な免疫グロブリンの３’マウス定常領域に対する遺伝子特異的プライマーとの組合せで、Ｔａｋａｒａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘを使用して重鎖および軽鎖からの可変領域を増幅した。重鎖および軽鎖について増幅可変領域を２％アガロースゲル上でランし、適当なバンドを切り取り、次いでＱｉａｇｅｎ製のＭｉｎｉ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してゲル精製した。精製ＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してクローニングし、Ｔａｋａｒａ製のＳｔｅｌｌａｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、ＬＢ寒天培地＋５０μｇ／ｍＬカナマイシンプレートに播種した。直接コロニーサンガー配列決定をＧｅｎｅＷｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって実行した。生成するヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴ Ｖ－ＱＵＥＳＴを使用して分析して、生産的再編成を特定し、翻訳されたタンパク質配列を分析した。ＣＤＲ決定は、ＩＭＧＴナンバリングに基づいた。

【0205】

蛍光活性化細胞ソーティング検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））を含めて、フローサイトメトリーの方法が利用可能である。例えば、Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.；Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, N.J.；Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.を参照されたい。例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチド、ならびに抗体を含めて、核酸を修飾するのに適切な蛍光試薬が、利用可能である。Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.；Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, Mo.。

【0206】

免疫沈降、クロマトグラフィー、および電気泳動を始めとするタンパク質精製の方法が記載されている。Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New Yorkを参照されたい。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、およびタンパク質のグリコシル化が記載されている。例えば、Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York；Ausubel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, N.Y., pp. 16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.; pp. 45-89；Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391を参照されたい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製、および断片化が記載されている。Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York；Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane、上掲。

【0207】

リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準技法が利用可能である。例えば、Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New Yorkを参照されたい。特定の作用機構を備える抗体の特性評価に適当な抗体機能特性評価の標準方法も、当業者にはよく知られている。

【0208】

マウスにおける有効性研究を可能にするため、マウス定常領域と合わせて抗ＴＮＦＲ２特異的ヒトＶＬおよびＶＬドメインを使用することにより、キメラＴＮＦＲ２特異的抗体を生成した。マウスＦｃは、ＡＤＣＣ能があるマウスＩｇＧ２ａ（配列番号５８）（本明細書ではＭｓ ＩｇＧ２ａと呼ばれる）であってもよく、ＡＤＣＣ不活性であるかまたはマウスＩｇＧ１（配列番号６０）の２６５位（Ｄ２６５Ａ）におけるアスパラギン酸のアラニンによる置換が、このアイソタイプと低親和性ＩｇＧ Ｆｃ受容体の間の相互作用の完全な廃止をもたらす、マウスＩｇＧ１（配列番号５９）であってもよい。Baudino et al. (2008) J Immunol. 2008 Nov 1;181(9):6664-9。

【0209】

本明細書で「陽性対照３」（Ｒ２－ＰＣ３またはＰＣ３）と呼ばれる社内製ＴＮＦＲ２特異的抗体を、国際公開第２０２０／０８９４７４号パンフレットで公開された公共で利用可能な情報に基づいて調製した（配列番号７に記載のＶＨ；および配列番号８に記載のＶＬを含む、「００１－Ｈ１０ ＶＨ」として指定される抗体）。ＰＣ３抗体を、本明細書に開示の抗ＴＮＦＲ２特異的抗体を評価および特徴付けるために使用した結合および機能アッセイでの対照として使用した。

【0210】

例えば、抗原性断片、リーダー配列、タンパク質折り畳み、機能的ドメイン、ＣＤＲアノテーション、グリコシル化部位、および配列アラインメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である。

【0211】

[実施例１]
抗ＴＮＦＲ２抗体の生成
ヒト抗体ＶＨおよびＶＬ遺伝子を発現する、ヒトＩｇＧ Ｔｒｉａｎｎｉトランスジェニックマウスを免疫することによって、完全ヒト抗ヒトＴＮＦＲ２抗体を生成した（例えば、国際公開第２０１３／０６３３９１号パンフレット、ＴＲＩＡＮＮＩ（登録商標）マウス）。Ｔｒｉａｎｎｉトランスジェニックマウスは、Ｔｒｉａｎｎｉ社によって生成された。

【0212】

免疫－上記のＴＲＩＡＮＮＩマウスを、組換えヒトＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃７２６－Ｒ２）で免疫した。

【0213】

免疫応答を、後眼窩採血によってモニタリングした。血漿をＥＬＩＳＡまたはイメージングまたはＦＡＣＳ（下記のように）によってスクリーニングした。抗ＴＮＦＲ２力価を十分に備えるマウスを融合に使用した。マウスを免疫原で追加免疫し、その後、屠殺し、脾臓およびリンパ節を取り出した。

【0214】

抗ＴＮＦＲ２抗体を産生するマウスの選択－ＴＮＦＲ２に結合する抗体を産生するマウスを選択するために、免疫マウスからの血清を、組換えＴＮＦＲ２タンパク質またはＴＮＦＲ２タンパク質を発現する細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＴＮＦＲ２遺伝子、ＮＣＢＩ：ＮＭ＿００１０６６．３でトランスフェクトした）への結合について、ＥＬＩＳＡまたはイメージングまたはＦＡＣＳによってスクリーニングした。

【0215】

ＥＬＩＳＡの場合、簡単に説明すると、組換えヒトＴＮＦＲ２タンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＴＮ１－Ｈ５２２２）を免疫マウスからの血清の希釈液とともにインキュベートし、アッセイプレートを洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１１５－０３６－０７１）およびＡＢＴＳ基質（Ｍｏｓｓ ＃ＡＢＴＳ－１０００）を用いて特異的抗体結合を検出した。次いで、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用してプレートを読み取った。

【0216】

イメージングアッセイの場合、簡単に説明すると、ヒトＴＮＦＲ２（ＮＣＢＩ：ＮＭ＿００１０６６．３）を安定に過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３９８５）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、免疫マウスからの希釈した血清をプレートに添加した。次いで、細胞を２％パラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ ＃Ｊ６１８９９）によって固定し、インキュベーション後にＰＢＳＴ［０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ、（Ｔｅｃｈｎｏｖａ ＃１１９３）］により３回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ａ１１００１）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ｈ３５７０）を細胞に添加し、１時間インキュベートした。ＰＢＳＴによる３回の洗浄後、ブロッキング緩衝液［ＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃１４０４０２１６）中０．５％ ＢＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃３７５２５）］をプレートに添加した。プレートをスキャンし、イメージングマシン（Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５、Ｂｉｏｔｅｋ）で解析した。

【0217】

ＦＡＣＳの場合、簡単に説明すると、ヒトＴＮＦＲ２（ＮＣＢＩ：ＮＭ＿００１０６６．３）を安定に過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞または３００．１９細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液［ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ ＃１７－５１６Ｑ）＋２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＃２６１４０－０７９）］中にアリコットし、免疫マウスからの血清の段階希釈とともにインキュベートした。細胞を２％パラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ ＃Ｊ６１８９９）によって固定し、次いで過剰なＦＡＣＳ緩衝液［ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、＃１７－５１６Ｑ）＋２％ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃２６１４０－０７９）］で１回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ａ－２１２３５）をコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体を細胞に添加し、１時間インキュベートし、反応は続いて、フローサイトメトリーによって解析した（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳ）。

【0218】

ＴＮＦＲ２に対するＭＡｂを産生するハイブリドーマの生成－本開示のヒト抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、脾細胞およびリンパ節細胞を、免疫マウスから単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適当な不死化細胞株に融合した。生成するハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。例えば、免疫マウスからの脾細胞およびリンパ節細胞の単細胞懸濁液を、電気融合によって等数のＳｐ２／０マウスＩｇＧ非分泌性骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）に融合した。細胞を平底９６ウェル組織培養プレートに播種し、これに続いて選択培地（ＨＡＴ培地）で約２週間インキュベーションし、次いでハイブリドーマ培養培地に切り替えた。細胞播種の概１０～１４日後に、個々のウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡ、イメージングまたはＦＡＣＳによってスクリーニングした（上記のように）。

【0219】

抗体分泌性ハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、再びスクリーニングした。抗ＴＮＦＲ２がなおも陽性である場合、陽性ハイブリドーマを、単一細胞ソーターを使用するソーティングによって、サブクローニングした。次いで、安定したサブクローンをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、精製およびさらなる特性評価に使用する少量の抗体を生成した。

【0220】

[実施例２]
ＴＮＦＲ２抗体の結合特異性
ヒトＴＮＦＲ２を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはヒトＴＮＦＲ１を安定に過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞をＦＡＣＳ緩衝液中にアリコットし、ＴＮＦＲ２抗体の段階希釈とともにインキュベートした。細胞を２％パラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ ＃Ｊ６１８９９）によって固定し、次いで過剰なＦＡＣＳ緩衝液［ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ ＃１７－５１６Ｑ）＋２％ ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＃２６１４０－０７９）］で１回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７をコンジュゲートした二次抗体を細胞に添加した。インキュベート後、反応は続いて、フローサイトメトリーによって解析した。あるいは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３８４ウェル黒色透明底ポリ－Ｄ－リジン処置プレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５６６９７）に一晩播種し、組織培養インキュベーター内で、３７℃で一晩インキュベートした。試験抗体は、培養培地［１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１６１４０－０７１）および１×ａｎｔｉ－ａｎｔｉ（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１５２４０－０６２）を補足したＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１１９６５－０８４）］中で段階希釈し、結合アッセイのため、細胞に移した。濃度－応答を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアの４パラメーターロジスティック非線形回帰モデルにフィットし、ＥＣ_５０値を得た。

【0221】

抗ヒトＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２とカニクイザルＴＮＦＲ２の両方に強い結合を示した。代表的なクローンのデータを図２に示す。ヒトＴＮＦＲ２へのそれらの結合のＥＣ_５０値は、０．１０ｎＭ～０．３８ｎＭの範囲であった（表３）。抗ＴＮＦＲ２ ｍＡｂ ＰＣ３は、「００１－１Ｈ１０」として指定された抗体について公共で利用可能な配列情報（ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列）に基づいて作成された社内製対照である。ＰＣ３の結合活性も、同じ実験で評価し、ＥＣ_５０は０．１６ｎＭであると測定された（図２Ｂ）。表３に示すように、代表的な抗体は、１０μｇ／ｍＬまで、ヒトＴＮＦＲ１へのいずれの結合も示さなかった。

【0222】

【表3】

【0223】

[実施例３]
ＴＭＦＲ２抗体の交差反応性
ヒトＴＮＦＲ２、カニクイザルＴＮＦＲ２、またはマウスＴＮＦＲ２を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＦＡＣＳ緩衝液中にアリコットし、ＴＮＦＲ２抗体の段階希釈とともに２時間インキュベートした。細胞を２％パラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、＃Ｊ６１８９９）によって固定し、次いで過剰なＦＡＣＳ緩衝液［ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、＃１７－５１６Ｑ）＋２％ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃２６１４０－０７９）］で１回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７をコンジュゲートした二次抗体を細胞に添加し、１時間インキュベートし、反応を続いて、フローサイトメトリーによって解析した。

【0224】

濃度－応答を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアの４パラメーターロジスティック非線形回帰モデルにフィットし、ＥＣ_５０値を得た。

【0225】

ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２とカニクイザルＴＮＦＲ２の間で強く交差反応した（表４）。６つの代表的なクローンのそれぞれの場合、ヒトおよびカニクイザルＴＮＦＲ２を比較する結合ＥＣ_５０値は、互いに２倍以内である（データは示さない）。対照的に、ＴＮＦＲ２抗体は、１０μｇ／ｍＬまでマウスＴＮＦＲ２に結合しなかった。

【0226】

【表4】

【0227】

[実施例４]
ＴＮＦＲ２抗体のエピトープビニング
ＴＮＦＲ２抗体の結合エピトープは、一連の結合アッセイフォーマットを使用してビニングされた。

【0228】

抗ヒトＦｃプローブ（Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｆｅ、＃ＰＬ１６８－１６００４）を、アッセイ緩衝液（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）を含有する９６ウェルプレートに３０秒間ロードし（ベースラインステップ）、次いで、抗ＴＮＦＲ２抗体を含有する９６ウェルに１８０秒間ロードした後（会合ステップ、抗体を捕捉する）、ベースラインステップを３０秒間、次いで、プローブを、ヒトＴＮＦＲ２ Ｈｉｓタグタンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＴＮ２－Ｈ５２２７、Ｌｏｔ＃：３８７－８ＡＵＦ１－Ｍ１）を含有する９６ウェルプレートに１８０秒間ロードした後、別のベースラインステップ、次いで、ハイブリドーマから精製した抗ＴＮＦＲ２抗体と１８０秒間会合した。データは、Ｇａｔｏｒソフトウェアを使用して処理し、第１の会合ステップのものとは異なる第２の会合ステップ中の曲線は、参照抗体よりも非占有エピトープに結合することを示す。さらなる結合の欠如は、参照抗体に対するエピトープブロッキングを示す。

【0229】

この連続的な結合実験から、受容体タンパク質が別のＴＮＦＲ２抗体によって既に結合された場合、ＴＮＦＲ２抗体はヒトＴＮＦＲ２に結合する異なる能力を示した（図３Ａ）。これらの結果に基づき、抗体は、それらの結合エピトープの類似性を示す５つの異なるビンにグループ分けすることができる（図３Ｂ）。

【0230】

[実施例５]
ＴＮＦリガンドとのＴＮＦＲ２抗体の結合競合
ＴＮＦＲ２への結合における、ＴＮＦリガンドに対するＴＮＦＲ２抗体の結合競合を、ハイコンテンツイメージングアッセイで評価した。

【0231】

ヒトＴＮＦＲ２受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３８４ウェル透明底ポリＤリジン処置プレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５６６９７）に播種し、組織培養インキュベーター内で、３７℃で一晩インキュベートした。試験抗体は、培養培地［１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１６１４０－０７１）および１×ａｎｔｉ－ａｎｔｉ（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１５２４０－０６２）を補足したＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１１９６５－０８４）］中で段階希釈し、細胞に移した。

【0232】

１時間のインキュベーション後、ビオチン標識ＴＮＦ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＴＮＡ－Ｈ８２１１）を結合反応に添加し、さらに１時間インキュベートした。細胞を、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、次いで、０．５％ウシ血清アルブミンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ緩衝生理食塩水で２回洗浄した。続いて、Ａｌｅｘａ４８８フルオロフォアをコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５２３５）およびＨｏｅｃｈｓｔ核染色（Ｔｈｅｒｍｏ ＃６２２４９）を細胞プレートに添加した。１時間インキュベートすると、細胞を、０．５％ウシ血清アルブミンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ緩衝生理食塩水で２回洗浄した。

【0233】

細胞表面に結合したビオチン－ＴＮＦは、Ｃｅｌｉｇｏセルサイトメーター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）で蛍光シグナルを測定することによって検出した。結合競合を決定し、データは、ビオチン－ＴＮＦの非存在下でのシグナルを１００％阻害と設定することによりノーマライズした。

【0234】

図４に示すように、ＴＮＦＲ２抗体のリードパネルは、ＴＮＦリガンドに対して競合するそれらの能力が異なる。さらに、図４に示したように、代表的なクローンＲ２－ｍＡｂ１はＴＮＦの結合を阻害しなかったが、クローンＲ２＿ｍＡｂ－２、Ｒ２＿ｍＡｂ－３、Ｒ２＿ｍＡｂ－４、Ｒ２＿ｍＡｂ－５、およびＲ２＿ｍＡｂ－６は、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦの結合を完全に阻害した。ＰＣ３も評価し、完全な阻害を示した。

【0235】

[実施例６]
可溶性ＴＮＦ刺激ＮＦκＢシグナル伝達におけるＴＮＦＲ２抗体のアンタゴニスト活性
ＴＮＦＲ２活性化は、細胞内でＮＦκＢにシグナル伝達することが公知である（David J. MacEwan (2020) British Journal of Pharmacology (2002) 135, 855）。ＮＦκＢ応答ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、ＴＮＦＲ２抗体のアンタゴニスト活性を評価した。

【0236】

試験抗体は、培養培地［１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１６１４０－０７１）および１×ａｎｔｉ－ａｎｔｉ（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１５２４０－０６２）を補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１１８７５－０８５）］中で段階希釈し、３８４ウェルのソリッドボトム白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３７５２）に移した。ＴＮＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃１０２９１－ＴＡ）を細胞プレートに添加した後、ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｋｙｉｎｎｏ ＃ＫＣ－１２１６）でトランスフェクトしたＴＨＰ１細胞を添加した。反応は、組織培養インキュベーター内で、一晩インキュベートした。翌日、ルシフェラーゼレポーターの発現を、ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｅ６１３０）を使用することにより、測定した。発光は、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｎｅｏ２プレートリーダーで測定した。抗体の活性を決定し、データは、ＴＮＦの非存在下でのシグナルを１００％阻害と設定することによりノーマライズした。

【0237】

ＴＨＰ１細胞におけるＴＮＦ刺激は、ＴＮＦＲ２アンタゴニストによって阻害されたレポーター細胞におけるＮＦκＢルシフェラーゼ活性の増加をもたらした（図５）。クローンＲ２＿ｍＡｂ－１、Ｒ２＿ｍＡｂ－２、Ｒ２＿ｍＡｂ－３、Ｒ２＿ｍＡｂ－４、Ｒ２＿ｍＡｂ－５、Ｒ２＿ｍＡｂ－６によって示されるように、ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦによって誘導されるＮＦκＢルシフェラーゼ活性を完全に阻害した。ＰＣ３も試験し、完全なシグナル伝達阻害を示した。

【0238】

[実施例７]
膜ＴＮＦ刺激ＮＦκＢシグナル伝達におけるＴＮＦＲ２抗体のアンタゴニスト活性
試験抗体は、培養培地［１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１６１４０－０７１）および１×ａｎｔｉ－ａｎｔｉ（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１５２４０－０６２）を補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１１８７５－０８５）］中で段階希釈し、３８４ウェルソリッドボトム白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３７５２）に移した。膜結合ＴＮＦを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔを細胞プレートに添加した後、ヒトＴＮＦＲ２およびＮＦκＢルシフェラーゼレポーター遺伝子を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞を添加した。反応は、組織培養インキュベーター内で、一晩インキュベートした。翌日、ルシフェラーゼレポーターの発現を、ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｅ６１３０）を使用することにより、測定した。発光は、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｎｅｏ２プレートリーダーで測定した。データは、膜ＴＮＦの非存在下でのシグナルを１００％阻害と設定することによりノーマライズした。

【0239】

図６Ａに示すように、ＴＮＦＲ２抗体のリードパネルは、膜ＴＮＦによって刺激されるＴＮＦＲ２シグナル伝達に対するアンタゴニスト活性が異なる。クローンＲ２＿ｍＡｂ－１およびＲ２＿ｍＡｂ－６は、シグナル伝達を部分的に阻害した。Ｒ２＿ｍＡｂ－２、Ｒ２＿ｍＡｂ－３、Ｒ２＿ｍＡｂ－４、Ｒ２＿ｍＡｂ－５によって示されるクローンは、ＴＮＦＲ２シグナル伝達の完全なブロッキングを示した。ＰＣ３と比較して、Ｒ２＿ｍＡｂ－４およびＲ２＿ｍＡｂ－５は類似のブロッキング活性を示した（図６Ｂ）。

【0240】

[実施例８]
架橋の非存在または存在下でのＴＮＦＲ２抗体の活性
抗体架橋時のＴＮＦＲ２抗体の活性を評価するため、本発明者らは、ＦｃγＲ、または抗体に架橋するための抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）_２を発現する、いずれかのＴＨＰ１細胞を用いた。

【0241】

Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター細胞を、単独で培養かまたはＴＨＰ１細胞と共培養した。ＴＮＦＲ２抗体Ｒ２＿ｍＡｂ－４を、様々な濃度で細胞に適用した。ＴＨＰ１細胞の非存在下では、ＴＮＦＲ２抗体Ｒ２＿ｍＡｂ－４はいずれの活性も示さなかった（図７Ｂ）。図解（図７Ａ）に示したように、ＴＮＦＲ２抗体が、ＴＨＰ１細胞上でＦｃγＲによって架橋された場合、Ｒ２＿ｍＡｂ－４は、ルシフェラーゼレポーター活性の増加によって証明されるアゴニスト活性を呈した（図７Ｂ）。

【0242】

架橋効果も、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）_２を使用することによって評価した。ＣＤ８ Ｔエフェクター細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１６１４０－０７１）、１×ａｎｔｉ－ａｎｔｉ（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１５２４０－０６２）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃１５６３０－０８０）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１１３６０－０７０）、０．１ｍＭ ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１１１４０－０５０）および１×ａｎｔｉ－ａｎｔｉ（Ｔｈｅｒｍｏ １５２４０－０６２）を補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ ＃１１８７５－０８５）中で培養し、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＃１０９９１）およびＩＬ－２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃５８９１０６）による処置によって活性化した。試験抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）_２（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９－００６－０９８）の存在または非存在下で、アッセイ培地（１０％熱不活性化ウシ胎仔血清および１×ａｎｔｉ－ａｎｔｉを補足したＲＰＭＩ１６４０）中で段階希釈し、３８４ウェル透明底黒色プレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５３９６２）に移した。ＣＤ８Ｔ細胞を回収し、単離した制御性Ｔ細胞と共培養した。放出されたＩＦＮγの測定のために上清を回収した。ＩＦＮγのレベルは、公知の濃度のヒトＩＦＮγを使用して構築した標準曲線に対して、ヒトＩＦＮγ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＃ＡＬ２１７Ｆ）を使用して定量した。シグナルは、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｎｅｏ２プレートリーダーで測定した。すべての実験を、３回実施した。

【0243】

ＣＤ８Ｔ細胞との共培養中の制御性Ｔ細胞の存在は、現在の実験条件下でのＩＦＮγ分泌の抑制を引き起こした（データは示さない）。ＴＮＦＲ２抗体のみの存在下では、対照と比較してＩＦＮγ分泌が減少した（図７Ｃ）。さらに、図７Ｃに示すように、ＴＮＦＲ２抗体の架橋は、対照による処置群よりもＩＦＮγ分泌を増加させた。

【0244】

[実施例９]
ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した枯渇ＣＤ８Ｔ細胞へのＴＮＦＲ２抗体の効果
Balkhi M. et al (iScience (2018) 2: 105-122)と同様に確立され、特徴付けられたＴ細胞枯渇のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを採用した。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＃１０９９１）による反復刺激下で拡大させ、ヒト組換えＩＬ－２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃５８９１０６）を補足したＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＸＦ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＃１０９８１）中で培養した。細胞は、表面マーカーの変化およびサイトカイン分泌の減少を観察することによって枯渇表現型の発現を確かめるために特徴付けられた。続いて、細胞は、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）を補足した拡大培地中で培養し、１０μｇ／ｍｌ（６６ｎＭ）の試験抗体またはアイソタイプ対照の存在下で９６ウェルプレートにプレートした。一部の場合では、抗ヒトＦｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）_２（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９－００６－０９８）を、抗体を含有するウェルに添加した。細胞は、架橋剤ありまたはなしで、抗体の存在下で培養した。すべての実験は、３回実施した。

【0245】

増殖の増加は、抗体単独の条件下では観察されなかったが、架橋剤の存在は、アイソタイプ対照抗体に対して細胞増殖の増加を引き起こした（図８Ａ）。Ｔ細胞の枯渇は、ＩＬ－２、ＩＦＮγおよびグランザイムＢレベルの段階的な減少によって特徴付けられる（データは示さない）。上清を、Ｔ細胞増殖が測定された同じウェルから回収し、ＢＤサイトメトリービーズアッセイ（ＣＢＡ）を使用して、分泌されたヒトＩＦＮγ（ＢＤ カタログ番号５５８２６９）、ヒトグランザイムＢ（ＢＤ カタログ番号５６０３０４）およびヒトＴＮＦ（ＢＤ カタログ番号５６０１１２）の存在について解析した。サイトカイン濃度は、キットに含まれる標準曲線に基づいて算出した。個々のＴＮＦＲ２抗体単独により、サイトカインレベルは減少するかまたは変化しなかった（図８）。

【0246】

架橋剤の存在下では、抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＩＦＮγ（図８Ｂ）、ＴＮＦ（図８Ｃ）、およびグランザイム（図８Ｄ）の分泌の増加を引き起こした。対照的に、抗ＰＤ－１抗体は、増殖の増加に影響したが、ＩＦＮγ（図８Ｂ）、ＴＮＦ（図８Ｃ）、およびグランザイム（図８Ｄ）のいずれの増強も促進することができなかった。

【0247】

[実施例１０]
ｈＴＮＦＲ２ノックイン同系腫瘍モデルにおける抗ＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍効果
Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）からの６～７週齢の雌のホモ接合Ｂ－ｈＴＮＦＲ２マウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ^{ｔｍ１（ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）}／Ｂｃｇｅｎ）に、０．１ｍＬ ＰＢＳ中の５×１０^５個の生存ＭＣ３８細胞を、右脇腹の皮下に注射した。７日後、腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ^３に達すると、マウスをグループに無作為にソートし、腹腔内注射による処置を開始した（８日目）。ビヒクル対照を受けたグループ１；２００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－４ Ｍｓ ＩｇＧ２ａを受けたグループ２；２００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－５ Ｍｓ ＩｇＧ２ａを受けたグループ３。処置は、３週間にわたり週に２回投与された。

【0248】

体重は、週に２回測定した。腫瘍容積は、式Ｖ＝１／２^＊Ｌ×Ｗ×Ｗ［式中、Ｌは異種移植片の長い方の長さであり、Ｗは短い方の長さである］を使用して、異なる時点で決定した。２５００ｍｍ^３を超える腫瘍を有するいずれのマウスも屠殺した。

【0249】

図９Ａに示すように、Ｒ２＿ｍＡｂ－４ Ｍｓ ＩｇＧ２ａとＲ２＿ｍＡｂ－５ Ｍｓ ＩｇＧ２ａの両方で処置したマウスにおいて、腫瘍増殖の顕著な阻害が観察された。研究の２９日目に、ｐ値は、一元配置分散分析により、両処置において＜０．０００１であると決定された（図９Ｂ）。さらに、Ｒ２＿ｍＡｂ－４ ＭｓＩｇＧ２ａとＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａの両方による処置は、マウスの体重に影響しなかった（データは示さない）。

【0250】

[実施例１１]
ＭＣ３８大腸がんモデルにおけるＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗腫瘍効果の評価
Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）からの６～７週齢の雌のホモ接合Ｂ－ｈＴＮＦＲ２マウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ^{ｔｍ１（ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）}／Ｂｃｇｅｎ）に、０．１ｍＬ ＰＢＳ中の５×１０^５個の生存ＭＣ３８細胞を、右脇腹の皮下に注射した。８日後、腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ^３に達すると、マウスを無作為にグループ分けし、腹腔内注射による処置を開始した（８日目）。ビヒクル対照を受けたグループ１；６０μｇの抗ｍＰＤ－Ｌ１抗体を受けたグループ２；１００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａを受けたグループ；６０μｇの抗ｍＰＤ－Ｌ１抗体とともに１００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａを受けたグループ３。抗ｍＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブの公共の配列情報に基づき、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎによって提供された。処置は、３週間にわたり週に２回投与された。

【0251】

体重は、週に２回測定した。腫瘍容積は、式Ｖ＝１／２^＊Ｌ×Ｗ×Ｗ［式中、Ｌは異種移植片の長い方の長さであり、Ｗは短い方の長さである］を使用して、異なる時点で決定した。２０００ｍｍ^３を超える腫瘍を有するいずれのマウスも屠殺した。マウスの生存は、腫瘍移植後６３日までモニターした。

【0252】

図１０Ａに示すように、５ｍｐｋでの単剤Ｒ２＿ｍＡｂ５ ＭｓＩｇＧ２ａは、３２日目に、９１．７％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を呈した。抗ｍＰＤ－Ｌ１は、３ｍｐｋで単独で投与されると、７１．４％のＴＧＩを生じた。しかしながら、Ｒ２－ｍＡｂ５ ＭｓＩｇＧ２ａがＰＤＬ１遮断と組み合わせて投与されると、ＴＧＩ値は、３２日目に９６％になった。ＰＤＬ１遮断と組み合わせたＴＮＦＲ２の利点も、図１０Ｂの生存解析中に示され、対照からのマウスは３９日を超える生存を示さなかった。抗ｍＰＤ－Ｌ１抗体処置は、研究観察の終わりに１４％の生存をもたらした。対照的に、単剤としてまたは抗ｍＰＤ－Ｌ１との組合せのいずれかで、Ｒ２＿ｍＡｂ５ ＭｓＩｇＧ２ａによって処置したマウスは、それぞれ、５０％および６３％の生存をもたらした。

【0253】

[実施例１２]
ＰＤ１耐性モデルＢ１６Ｆ１０におけるＴＮＦＲ２抗体の評価
ＰＤ１耐性患者におけるＴＮＦＲ２抗体処置の治療能を予測するため、ＰＤ１耐性腫瘍モデルＢ１６Ｆ１０メラノーマモデルを使用して、単剤の抗ＴＮＦＲ２抗体およびＰＤＬ１遮断と組み合わせた抗ＴＮＦＲ２処置の効果を比較した。Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）からの６～７週齢の雌のホモ接合Ｂ－ｈＴＮＦＲ２マウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ^{ｔｍ１（ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）}／Ｂｃｇｅｎ）に、０．１ｍＬ ＰＢＳ中の１×１０^５個の生存Ｂ１６－Ｆ１０細胞を、右脇腹の皮下に注射した。８日後、腫瘍サイズが７５ｍｍ^３と１００ｍｍ^３の間に達すると、マウスを無作為にグループ分けし、腹腔内注射による処置を開始した（８日目）。ビヒクル対照を受けたグループ１；６０μｇの抗ｍＰＤ－Ｌ１抗体を受けたグループ２；１００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａを受けたグループ；６０μｇの抗ｍＰＤ－Ｌ１抗体とともに１００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａを受けたグループ３。処置は、３週間にわたり週に２回投与した。

【0254】

体重は、週に２回測定した。腫瘍容積は、式Ｖ＝１／２^＊Ｌ×Ｗ×Ｗ［式中、Ｌは異種移植片の長い方の長さであり、Ｗは短い方の長さである］を使用して、異なる時点で決定した。２５００ｍｍ^３を超える腫瘍を有するいずれのマウスも屠殺した。マウスの生存は、腫瘍移植後２６日までモニターした。

【0255】

図１１に示すように、５ｍｐｋの抗ｍＰＤ－Ｌ１抗体処置したグループからのマウスは、接種後１５日目に１９．３％のＴＧＩ値を有し、５ｍｐｋのＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａ処置は、３４％のＴＧＩ値を有した。抗ｍＰＤ－Ｌ１と組み合わせたＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａが５８％のＴＧＩ値をもたらす場合、ＰＤＬ１またはＴＮＦＲ２のいずれかの単剤処置よりも良かった。

【0256】

[実施例１３]
ＴＮＦＲ２抗体の効果は完全にはＡＤＣＣ依存性ではない
腫瘍微小環境に存在するＴｒｅｇ細胞での高発現レベルのＴＮＦＲ２は、ＴｒｅｇのＡＤＣＣ媒介性枯渇が抗ＴＮＦＲ２抗体の効果を説明するという仮定をもたらす。本発明者らは、マウスＩｇＧ２ａフォーマット（ＡＤＣＣ能がある）およびマウスＩｇＧ１フォーマット（ＡＤＣＣ不活性）の両方でのＲ２＿ｍＡｂ－５の効果を評価した。

【0257】

Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）からの６～７週齢の雌のホモ接合Ｂ－ｈＴＮＦＲ２マウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ^{ｔｍ１（ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）}／Ｂｃｇｅｎ）に、０．１ｍＬ ＰＢＳ中の５×１０^５個の生存ＭＣ３８細胞を、右脇腹の皮下に注射した。８日後、腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ^３に達すると、マウスを無作為にグループにソートし、腹腔内注射による処置を開始した（８日目）。ビヒクル対照を受けたグループ１；２００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａを受けたグループ２；２００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ１を受けたグループ３。処置は、３週間にわたり週に２回投与した。

【0258】

体重は、週に２回測定した。腫瘍容積は、式Ｖ＝１／２^＊Ｌ×Ｗ×Ｗ［式中、Ｌは異種移植片の長い方の長さであり、Ｗは短い方の長さである］を使用して、異なる時点で決定した。２５００ｍｍ^３を超える腫瘍を有するいずれのマウスも屠殺した。

【0259】

図１２Ａに示すように、Ｒ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａとＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ１の両方で処置したマウスにおいて、腫瘍増殖の顕著な阻害が観察された。研究の３２日目に、ｐ値は、一元配置分散分析により、両処置において＜０．０００１であると決定された（図１２Ｂ）。腫瘍阻害は、Ｒ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ１と比較してＲ２－５ Ｒ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａでわずかに強かったが、その差は統計的に顕著ではなかった。この結果は、ＡＤＣＣがＲ２－ｍＡｂ５の抗腫瘍効果に寄与するが、その効果は完全にはＡＤＣＣに依存しないことを示唆している。

【0260】

[実施例１４]
ＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍効果は、部分的にＦｃ受容体架橋活性に依存する
ＴＮＦＲ２アンタゴニスト抗体の作用のメカニズムをさらに解くために、マウスＩｇＧ１の２６５位でのアラニンによるアスパラギン酸の置換（Ｄ２６５Ａ）が、このアイソタイプと低親和性ＩｇＧ Ｆｃ受容体（ＦｃガンマＲＩＩＢおよびＦｃガンマＲＩＩＩ）の間の相互作用の完全な欠如をもたらすため、Ｒ２＿ｍＡｂ－５の効果を、マウスＩｇＧ２ａフォーマット（ＡＤＣＣ能がある）とマウスＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａフォーマット（ＡＤＣＣおよびＦｃ架橋不活性）の両方で評価した。

【0261】

Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）からの６～７週齢の雌のホモ接合Ｂ－ｈＴＮＦＲ２マウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ^{ｔｍ１（ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）}／Ｂｃｇｅｎ）に、０．１ｍＬ ＰＢＳ中の５×１０^５個の生存ＭＣ３８細胞を、右脇腹の皮下に注射した。８日後、腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ^３に達すると、マウスを無作為にグループにソートし、腹腔内注射による処置を開始した（８日目）。ビヒクル対照を受けたグループ１；１００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａを受けたグループ２；２００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－５ ＭｓＩｇＧ２ａを受けたグループ３、および１００μｇのＲ２＿ｍＡｂ－５ Ｍｓ ＩｇＧ１Ｄ２６５Ａを受けたグループ４。処置は、３週間にわたり週に２回投与した。

【0262】

体重は、週に２回測定した。腫瘍容積は、式Ｖ＝１／２^＊Ｌ×Ｗ×Ｗ［式中、Ｌは異種移植片の長い方の長さであり、Ｗは短い方の長さである］を使用して、異なる時点で決定した。２５００ｍｍ^３を超える腫瘍を有するいずれのマウスも屠殺した。

【0263】

図１３Ａに示すように、Ｒ２＿ｍＡｂ－５ Ｍｓ ＩｇＧ２ａとＲ２＿ｍＡｂ－５ Ｍｓ ＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａの両方で処置したマウスにおいて、腫瘍増殖の顕著な阻害が観察された。Ｒ２＿ｍＡｂ－５ Ｍｓ ＩｇＧ２ａは、用量依存性を示し、グループ３（１０ｍｐｋ）はグループ２（５ｍｐｋ）よりも強い抗腫瘍効果を示し、ＴＧＩ８９．９％対ＴＧＩ７１．４％であった。さらに、ＭｓＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａバリアントを使用することによるＦｃ架橋効果が除去された場合、抗腫瘍効果はＴＧＩ４１．２％に減少し、Ｆｃ機能が、ＴＮＦＲ２抗体Ｒ２＿ｍＡｂ５の完全な抗腫瘍効果に必要とされることを示している。研究の２５日目に、ｐ値は、一元配置分散分析により、両処置において＜０．０００１であると決定された（図１３Ｂ）。この結果は、Ｆｃ架橋がＲ２－ｍＡｂ５の抗腫瘍効果に寄与するが、その効果はＦｃ架橋に完全には依存しないことを示唆している。

【0264】

特に指示のない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件等を表現するすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解すべきである。したがって、そうではないと指示のない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において記載する数値パラメータは、本開示によって得ようとする所望の特性に応じて異なってもよい近似値である。少なくとも、均等論の原則を特許請求の範囲に適用することを限定しようとする試みではなく、各数値パラメータは、報告された有効桁の数値を考慮してかつ通常の四捨五入技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。

【0265】

本開示の幅広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるが、特定の例において記載される数値はできるだけ正確に報告されている。いずれの数値も、しかし、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含有する。

【0266】

本開示を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、および類似の指示対象は、本明細書に特に指示のない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方をカバーすると解釈される。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲に入る各個別の値に個々に言及することの省略方法としての役割を果たすことが意図されている。本明細書に特に指示のない限り、個々の値はそれぞれ、本明細書に個別に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に特に指示のない限り、またはさもなければ文脈と明らかに矛盾しない限り、適切な任意の順序で行うことができる。本明細書で提供されるあらゆる例、または例示的な言い回し（例えば「などの（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に、本開示をより良く例示することを意図するものであり、特に主張しない限り開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言い回しも、特許請求されていない要素が本発明の実施にとって必須であることを示すものと解釈すべきではない。

【0267】

本明細書に開示された開示の代替要素または実施形態の群分けは、限定であると解釈すべきではない。各群の構成要素は、個々に、または群の他の構成要素もしくは本明細書に見出される他の構成要素との任意の組合せで、言及することができかつ特許請求することができる。ある群の１つまたは複数の構成要素が、便宜上および／または特許性の理由から、群に包含され、または群から削除され得る。なんらかのかかる包含または削除が生じる場合、本明細書は、改変された群を含み、したがって、添付の特許請求の範囲で使用される全マーカッシュ群の書面による明細を満足するものである。

【0268】

本開示のある特定の実施形態が、発明者らが知っている本開示を実施するためのベストモードを含めて、本明細書に記載されている。もちろん、それら記載の実施形態の変形例は、前述の説明を読み解くことで当業者であれば明らかとなるであろう。本発明者らは、当業者であれば必要に応じてかかる変形を採用すると考えており、本開示が本明細書に具体的に記載のもの以外の方法で実行されることを意図している。したがって、本開示は、適用法が許すなら、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙された主題の改変形態および均等物すべてを包含する。さらに、それらの可能なすべての変形における上記の要素の任意の組合せも、本明細書に特に指示のない限り、またはさもなければ文脈と明らかに矛盾しない限り、本開示によって包含される。

【0269】

本明細書に開示の具体的な実施形態は、「からなる」または「から本質的になる」という言い回しを使用して、特許請求の範囲においてさらに限定することができる。出願されたか、補正によって追加されたかにかかわらず、特許請求の範囲において使用される場合、「からなる」という移行句は、特許請求の範囲に規定されてないいかなる要素をも、ステップをもまたは成分をも、排除する。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲を、特定された材料またはステップ、ならびに基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。そのように特許請求される本開示の実施形態が、本明細書に本質的にまたは明示的に説明されており、本明細書において有効である。

【0270】

本明細書に開示された本開示の実施形態は、本開示の原理の例示であることが理解されよう。採用することができる他の改変は、本開示の範囲内である。したがって、一例であって限定されないが、本開示の代替の構成が本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本開示は、示されかつ記載されたように厳密にそのものに限定されるものではない。

【0271】

本開示を、種々の具体的な材料、手順および例を参照することによって、本明細書で説明し、例示してきたが、本開示は、その目的のために選択された材料および手順の特定の組合せに限定されるものではないと理解される。かかる詳細の多数の変形が、当業者であれば理解されるように、暗に含まれ得る。本明細書および例は、例示的なものに過ぎないと考えられ、本開示の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって指示されることが意図される。本願で参照されたすべての参考文献、特許、および特許出願は、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】