特表 2024-502044 センス・サプレッサートランスファーＲＮＡ組成物ならびに関連する用途及び機能

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-17

(54)【発明の名称】センス・サプレッサートランスファーＲＮＡ組成物ならびに関連する用途及び機能

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240110BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240110BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240110BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240110BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 110

C12N15/86 Z ZNA

A61P35/00

A61K31/7088

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539999

(86)(22)【出願日】2021-12-29

(85)【翻訳文提出日】2023-07-24

(86)【国際出願番号】 US2021065508

(87)【国際公開番号】W WO2022147120

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】63/132,932

(32)【優先日】2020-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/151,416

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/151,436

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】504315680

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ アイオワ リサーチ ファンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】アハーン， クリストファー

【テーマコード（参考）】

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

(57)【要約】

本発明は、少なくとも部分的に、アクセプターステム、及び非同族トリプレットコドンを含むアンチコドンアームを含む、センス・サプレッサートランスファーＲＮＡ（ｓｓｔＲＮＡ）、ならびにその使用方法に関する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アクセプターステム、及び非同族コドンに特異的なアンチコドンを含む、センス・サプレッサートランスファーＲＮＡ（ｓｓｔＲＮＡ）。

【請求項2】

前記アンチコドンが、ロイシンコドンに特異的である、請求項１に記載のｓｓｔＲＮＡ。

【請求項3】

前記アクセプターステムが、プロリンに特異的である、請求項２に記載のｓｓｔＲＮＡ。

【請求項4】

前記ｓｓｔＲＮＡが、配列番号３及び４に記載の配列にコードされる、請求項３に記載のｓｓｔＲＮＡ。

【請求項5】

前記アンチコドンが、プロリンコドンに特異的である、請求項１に記載のｓｓｔＲＮＡ。

【請求項6】

前記アクセプターステムが、ロイシンに特異的である、請求項５に記載のｓｓｔＲＮＡ。

【請求項7】

前記ｓｓｔＲＮＡが、配列番号１、２、及び５～１３に記載の配列にコードされる、請求項６に記載のｓｓｔＲＮＡ。

【請求項8】

前記アクセプターステムが、イソロイシンに特異的である、請求項５に記載のｓｓｔＲＮＡ。

【請求項9】

前記ｓｓｔＲＮＡが、配列番号１４及び１５に記載の配列にコードされる、請求項８に記載のｓｓｔＲＮＡ。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのｓｓｔＲＮＡ、任意に、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも２つまたは３つのｓｓｔＲＮＡをコードする、オリゴヌクレオチド。

【請求項11】

前記オリゴヌクレオチドの全長が、１５０ヌクレオチドまたは３００ヌクレオチド未満である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項12】

前記オリゴヌクレオチドが、ｃＤＮＡなどのＤＮＡである、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項13】

前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項14】

プロモーター、及び、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのｓｓｔＲＮＡ、任意に、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも２つもしくは３つのｓｓｔＲＮＡをコードする核酸、または請求項１０～１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、発現カセット。

【請求項15】

さらに、ターミネーターを含む、請求項１４に記載の発現カセット。

【請求項16】

配列番号１６～２６に記載のヌクレオチド配列を含み、任意に、配列番号１６～２６に記載の少なくとも２つまたは３つの異なるヌクレオチド配列を含む、発現カセット。

【請求項17】

請求項１０～１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１４～１６のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、ベクター。

【請求項18】

前記ベクターが、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターである、請求項１７に記載のベクター。

【請求項19】

組成物であって、
請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのｓｓｔＲＮＡ、任意に、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも２つもしくは３つのｓｓｔＲＮＡ、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１４～１６いずれか１項に記載の発現カセット、または請求項１７もしくは１８に記載のベクター、及び薬学的に許容される担体
を含む、前記組成物。

【請求項20】

前記薬学的に許容される担体が、ナノ粒子などの粒子である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記粒子が、リポソームまたは脂質ナノ粒子である、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのｓｓｔＲＮＡ、任意に、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも２つもしくは３つのｓｓｔＲＮＡ、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項１７もしくは１８に記載のベクター、または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物、を含む細胞。

【請求項23】

タンパク質の発現または機能を改変または破壊する方法であって、細胞のタンパク質発現または機能を破壊するのに有効な量の、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのｓｓｔＲＮＡ、任意に、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも２つもしくは３つのｓｓｔＲＮＡ、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項１７もしくは１８に記載のベクター、または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物を、前記細胞に送達することを含む、前記方法。

【請求項24】

細胞を死滅させる方法であって、細胞を死滅させる有効な量の、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのｓｓｔＲＮＡ、任意に、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも２つもしくは３つのｓｓｔＲＮＡ、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項１７もしくは１８に記載のベクター、または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物と、前記細胞を接触させることを含む、前記方法。

【請求項25】

細胞の生存を低減させる方法であって、前記細胞の生存を低減させるのに有効な量の、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのｓｓｔＲＮＡ、任意に、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも２つもしくは３つのｓｓｔＲＮＡ、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項１７もしくは１８に記載のベクター、または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物と、前記細胞を接触させることを含む、前記方法。

【請求項26】

細胞移動性を低減させる方法であって、前記細胞の移動性を低減させるのに有効な量の、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのｓｓｔＲＮＡ、任意に、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも２つもしくは３つのｓｓｔＲＮＡ、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項１７もしくは１８に記載のベクター、または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物と、前記細胞を接触させることを含む、前記方法。

【請求項27】

免疫細胞を活性化させる方法であって、免疫細胞を活性化させるのに有効な量の、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのｓｓｔＲＮＡ、任意に、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも２つもしくは３つのｓｓｔＲＮＡ、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項１７もしくは１８に記載のベクター、または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物と、前記細胞を接触させることを含む、前記方法。

【請求項28】

前記細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏである、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

過剰増殖性疾患または障害に罹患する対象を処置する方法であって、前記過剰増殖性疾患または障害を処置するのに有効な量の、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのｓｓｔＲＮＡ、任意に、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも２つもしくは３つのｓｓｔＲＮＡ、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項１７もしくは１８に記載のベクター、または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項31】

前記過剰増殖性疾患または障害が、がんである、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記がんが、メラノーマまたは乳癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

少なくとも２つまたは３つのｓｓｔＲＮＡが存在する場合、前記少なくとも２つまたは３つのｓｓｔＲＮＡが、同じオリゴヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または組成物中にある、請求項２３～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

少なくとも２つまたは３つのｓｓｔＲＮＡが存在する場合、前記少なくとも２つまたは３つのｓｓｔＲＮＡが、少なくとも２つまたは３つの異なるオリゴヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または組成物中にある、請求項２３～３２のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年１２月３１日に出願された米国仮出願第６３／１３２，９３２号、２０２１年２月１９日に出願された米国仮出願第６３／１５１，４１６号、及び２０２１年２月１９日に出願された米国仮出願第６３／１５１，４３６号に対する優先権を主張する。上記で参照された出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ＤＮＡ分子は、ＤＮＡポリマーを構成するヌクレオチド塩基の配列の形態で遺伝情報を保有する。４つのヌクレオチド塩基：アデニン、グアニン、シトシン、及びチミンのみが、ＤＮＡで利用される。本情報は、連続する３塩基のコドンの形態で、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次に、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームにより翻訳されてタンパク質が形成される。ＲＮＡでは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルが利用される。遺伝コードは、トリプレットコドン及び特定のアミノ酸間の関係である。６４の可能なコドントリプレットが、遺伝コードを形成し、３つの終止（「終結」または「ナンセンス」とも呼ばれる）コドンが、翻訳機序（細胞リボソーム）にシグナルを与えて、特定のコドンでのタンパク質産生を停止させる。他の６１のコドントリプレット（「センスコドン」とも呼ばれる）は、２０の標準アミノ酸のうちの１つに対応する。

【0003】

ＤＮＡは、リボソームにより翻訳され、ＤＮＡにより特別に提供される遺伝的指示に従って、各アミノ酸が１つずつ結合してポリペプチドが形成されるようになる。トランスファーＲＮＡは、ｍＲＮＡをリボソーム上のタンパク質に翻訳する。各ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の相補コドンとハイブリダイズする「アンチコドン」領域を含有する。所定のアミノ酸を運搬するｔＲＮＡは、「荷電」ｔＲＮＡと呼ばれる。ｔＲＮＡが６１のアミノ酸関連ｔＲＮＡ（または「センスｔＲＮＡ」）の１つである場合、通常、そのアミノ酸は成長中のペプチドに結合するであろう。ｔＲＮＡの構造遺伝子は、約７２～９０ヌクレオチド長であり、クローバーの葉の構造に折りたたまれる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

驚くべきことに、ｔＲＮＡが非同族コドンを認識し、ポリペプチド産生のための代替アミノ酸を運搬するようにｔＲＮＡを改変し得ることが判明している。これらのセンス・サプレッサーｔＲＮＡは、タンパク質の発現または機能の破壊をもたらし、且つ、細胞の生存を減少させ得るポリペプチド及びタンパク質のアミノ酸を切り替えるために使用することができる。

【0005】

従って、一態様では、アクセプターステム、及び非同族コドンに特異的なアンチコドンを含むセンス・サプレッサートランスファーＲＮＡ（ｓｓｔＲＮＡ）が提供される。

【0006】

本明細書で提供されるｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、アンチコドンは、任意の非同族コドンに特異的である。本明細書で提供されるそのようなｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、アクセプターステムは、そのアンチコドンにコードされるものとは異なる任意のアミノ酸に特異的である。

【0007】

本明細書で提供されるｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、アンチコドンは、ロイシンコドンに特異的である。本明細書で提供されるそのようなｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、アクセプターステムは、プロリンに特異的であり、ポリペプチドまたはタンパク質の産生においてロイシンをプロリンと置換し得る。本明細書で提供されるそのようなｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、ｓｓｔＲＮＡは、配列番号３及び４に示される配列にコードされる。

【0008】

本明細書で提供されるｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、アンチコドンは、プロリンコドンに特異的である。本明細書で提供されるそのようなｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、アクセプターステムは、ロイシンに特異的であり、ポリペプチドまたはタンパク質の産生においてプロリンをロイシンと置換し得る。本明細書で提供されるそのようなｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、ｓｓｔＲＮＡは、配列番号１、２、及び５～１３に示される配列にコードされる。

【0009】

本明細書で提供されるｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、アンチコドンは、プロリンコドンに特異的である。本明細書で提供されるそのようなｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、アクセプターステムは、イソロイシンに特異的であり、ポリペプチドまたはタンパク質の産生においてプロリンをイソロイシンと置換し得る。本明細書で提供されるそのようなｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、ｓｓｔＲＮＡは、配列番号１４及び１５に示される配列にコードされる。

【0010】

本明細書で提供されるｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、アンチコドンは、ミスセンス変異を有するコドンに特異的である。本明細書で提供されるそのようなｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの一実施形態では、アクセプターステムは、ミスセンス変異を有するコドンにコードされるものとは異なる代替アミノ酸に特異的であり、ポリペプチドまたはタンパク質の産生のために代替アミノ酸を置換し得る。

【0011】

別の態様では、本明細書で提供されるｓｓｔＲＮＡのいずれか１つをコードするオリゴヌクレオチドが提供される。本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全長が１５０または３００ヌクレオチド未満である。本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡである。本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡである。

【0012】

別の態様では、プロモーター、及び、本明細書で提供されるｓｓｔＲＮＡのいずれか１つまたはオリゴヌクレオチドのいずれか１つをコードする核酸を含む発現カセットが提供される。本明細書で提供される発現カセットのいずれか１つの一実施形態では、発現カセットは、さらに、ターミネーターを含む。本明細書で提供される発現カセットのいずれか１つの一実施形態では、発現カセットは、配列番号１６～２６に記載のヌクレオチド配列を含む。

【0013】

別の態様では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドまたは発現カセットのいずれか１つを含むベクターが提供される。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。

【0014】

別の態様では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドまたは発現カセットのいずれか１つは、ｃＤＮＡの形態である。

【0015】

別の態様では、本明細書で提供されるｓｓｔＲＮＡのいずれか１つ、オリゴヌクレオチドのいずれか１つ、発現カセットのいずれかいずれか１つ、またはベクターのいずれか１つ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物が提供される。

【0016】

別の態様では、ｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの少なくとも２つもしくは少なくとも３つ、オリゴヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも２つもしくは少なくとも３つ、発現カセットのいずれか１つの少なくとも２つもしくは少なくとも３つを含む組成物、または本明細書で提供されるベクターのいずれか１つの少なくとも２つもしくは少なくとも３つ、及び薬学的に許容される担体が提供される。

【0017】

本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの一実施形態では、少なくとも２つまたは３つのｓｓｔＲＮＡが存在する場合、少なくとも２つまたは３つのｓｓｔＲＮＡは、同じオリゴヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または組成物中にある。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの別の実施形態では、少なくとも２つまたは３つのｓｓｔＲＮＡが存在する場合、少なくとも２つまたは３つのｓｓｔＲＮＡは、少なくとも２つまたは３つの異なるオリゴヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または組成物中にある。

【0018】

別の態様では、本明細書で提供されるｓｓｔＲＮＡのいずれか１つ、オリゴヌクレオチドのいずれか１つ、発現カセットのいずれか１つ、またはベクターのいずれか１つを含む細胞が提供される。

【0019】

別の態様では、ｓｓｔＲＮＡのいずれか１つの少なくとも２つもしくは少なくとも３つ、オリゴヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも２つもしくは少なくとも３つ、発現カセットのいずれか１つの少なくとも２つもしくは少なくとも３つ、または本明細書で提供されるベクターのいずれか１つの少なくとも２つもしくは少なくとも３つが提供される。

【0020】

本明細書で提供される、ｓｓｔＲＮＡのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、オリゴヌクレオチドのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、発現カセットのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、ベクターのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、または組成物のいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）と、細胞を接触させることを含む方法が提供される。

【0021】

別の態様では、本明細書で提供される、ｓｓｔＲＮＡのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、オリゴヌクレオチドのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、発現カセットのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、ベクターのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、または組成物のいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）を送達することを含む、タンパク質の発現または機能を改変または破壊する方法が提供される。そのような方法のいずれか１つの一実施形態では、ｓｓｔＲＮＡ（複数可）、オリゴヌクレオチド（複数可）、発現カセット（複数可）、ベクター（複数可）、または組成物（複数可）の量は、細胞内でタンパク質の発現または機能を改変または破壊するのに有効である。

【0022】

別の態様では、本明細書で提供される、ｓｓｔＲＮＡのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、オリゴヌクレオチドのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、発現カセットのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、ベクターのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、または組成物のいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）と、細胞を接触させることを含む、細胞を殺傷する方法が提供される。そのような方法のいずれか１つの一実施形態では、ｓｓｔＲＮＡ（複数可）、オリゴヌクレオチド（複数可）、発現カセット（複数可）、ベクター（複数可）、または組成物（複数可）の量は、細胞を死滅させるのに有効である。そのような方法のいずれか１つの一実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。そのような方法のいずれか１つの一実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏである。

【0023】

別の態様では、本明細書で提供される、ｓｓｔＲＮＡのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、オリゴヌクレオチドのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、発現カセットのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、ベクターのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、または組成物のいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）と、細胞を接触させることを含む、細胞の生存を低減させる方法が提供される。別の態様では、本明細書で提供される、ｓｓｔＲＮＡのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、オリゴヌクレオチドのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、発現カセットのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、ベクターのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、または組成物のいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）と、細胞を接触させることを含む、細胞移動性を低減させる方法が提供される。

【0024】

本明細書で提供される、ｓｓｔＲＮＡのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、オリゴヌクレオチドのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、発現カセットのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、ベクターのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、または組成物のいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）と、細胞を接触させることを含む、免疫細胞を活性化させる方法が提供される。一実施形態では、細胞は、免疫応答が活性化されるように、免疫細胞または他の免疫成分と接触するようになるか、または接触させることができる。

【0025】

別の態様では、本明細書で提供される、ｓｓｔＲＮＡのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、オリゴヌクレオチドのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、発現カセットのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、ベクターのいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）、または組成物のいずれか１つ（例えば、少なくとも１つもしくは少なくとも２つもしくは少なくとも３つ）を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患または障害に罹患する対象を処置する方法が提供される。そのような方法のいずれか１つの一実施形態では、ｓｓｔＲＮＡ（複数可）、オリゴヌクレオチド（複数可）、発現カセット（複数可）、ベクター（複数可）、または組成物（複数可）の量は、過剰増殖性疾患または障害を処置するのに有効である。そのような方法のいずれか１つの一実施形態では、過剰増殖性疾患または障害は、がんである。そのような方法のいずれか１つの一実施形態では、がんは、メラノーマまたは乳癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌である。

【0026】

別の態様では、ｓｓｔＲＮＡを識別する方法が提供される。本明細書で提供される識別方法のいずれか１つの一実施形態では、ｓｓｔＲＮＡは、非同族コドンに特異的なアンチコドンを含むように選択または改変される。本明細書で提供される識別方法のいずれか１つの一実施形態では、ｓｓｔＲＮＡは、アンチコドンにコードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸に特異的なアクセプターステムまたはアームを有するものである。本明細書で提供される識別方法のいずれか１つの一実施形態では、方法は、ハイスループットのクローニング及びスクリーニングを含むか、または、さらに含む。本明細書で提供される識別方法のいずれか１つの一実施形態では、方法は、トランスフェクションなどにより細胞内でｓｓｔＲＮＡを発現させること、ならびに、タンパク質の発現もしくは機能の改変もしくは破壊、及び／または細胞死、死滅、生存、または移動性を評価することを含むか、または、さらに含む。本明細書で提供される識別方法のいずれか１つの一実施形態では、方法は、タンパク質の発現もしくは機能の改変もしくは破壊、及び／または細胞死、死滅、生存、もしくは移動性をもたらすｓｓｔＲＮＡを選択することを含むか、または、さらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】遺伝コードの表を提供する。

【図2】Ｔアーム、Ｄアーム、アンチコドンアーム、及びアクセプターステム（またはアーム）を含むｔＲＮＡの一般的な４アーム構造を示す。これらの領域は、全体を通して「ループ」と呼ばれることもある。

【図3】ＧＦＰ発現及び細胞分裂が急速に緩和されたＳＷＴＸ２及びＳＷＴＸ３の同時トランスフェクションの結果を示す。

【図4】ＳＷＴＸ５及びＳＷＴＸ７の同時トランスフェクションの結果を示す。

【図5】ＧＦＰプラスミドライブラリースクリーニングのプレートマップを示す。

【図6】２４時間でのプレート／細胞の監視の結果を示す。

【図7】４４時間でのプレート／細胞の監視の結果を示す。

【図8】個々のプラスミドを発現するＨＥＫ２９３－Ｔ細胞における４４時間でのＧＦＰの強度を示す。

【図9】ＲＰＭＩ－７９５１細胞（メラノーマ細胞株）におけるトランスフェクションの３０時間後のＧＦＰ発現を示す（ＧＦＰ単独）。

【図10】ＲＰＭＩ－７９５１細胞（メラノーマ細胞株）におけるトランスフェクションの３０時間後のＧＦＰ発現を示す（ＧＦＰ＋ｓｓｔＲＮＡ５１）。

【図11】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における４３時間でのＧＦＰ発現の結果を示す。

【図12】ＳＫＭＥＬ３細胞（メラノーマ細胞株）における４３時間でのＧＦＰ発現の結果を示す。

【図13】ＲＰＭＩ－７９５１細胞（Ｐ１４）ＳＷＴＸ＋／－ｔｄｔｏｍａｔｏ（１μｇ／ウェル）によるＦｕｇｅｎｅトランスフェクションの結果を示す（２４時間でのＦｕｇｅｎｅ：ＤＮＡ比２：１）。

【図14】ＲＰＭＩ－７９５１細胞（Ｐ１４）ＳＷＴＸ＋／－Ｎｌｕｃ ＷＴ（１μｇ／ウェル）によるＦｕｇｅｎｅトランスフェクションの結果を示す（２４時間で２：１のＦｕｇｅｎｅ：ＤＮＡ比）。

【図15】ＲＰＭＩ－７９５１細胞（Ｐ１４）ＳＷＴＸ＋／－ｔｄｔｏｍａｔｏ（１μｇ／ウェル）によるＦｕｇｅｎｅトランスフェクションの結果を示す（４８時間で２：１のＦｕｇｅｎｅ：ＤＮＡ比）。

【図16】ＲＰＭＩ－７９５１細胞（Ｐ１４）ＳＷＴＸ＋／－Ｎｌｕｃ ＷＴ（１μｇ／ウェル）によるＦｕｇｅｎｅトランスフェクションの結果を示す（４８時間で２：１のＦｕｇｅｎｅ：ＤＮＡ比）。

【図17】ＧＦＰ、５１、または５１プラスミドのｃＤＮＡと、１：１．５、１：３、及び１：６の比のリポフェクタミン３０００によるトランスフェクションの結果を示す。ＧＦＰシグナルが示される。

【図18】リポフェクタミン３０００（ＬＰ）のトランスフェクションの結果、ＳＫＭＥＬ３メラノーマ株における、試薬対ｃＤＮＡの比による概要を示す。各プロットは、同じ条件の２つの生物学的複製を示す。

【図19-1】ＨＣＣトリプルネガティブ乳癌株の結果を示す。

【図19-2】同上。

【図20】示された条件におけるＦｕｇｅｎｅがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を示す。４８時間でスクラッチアッセイを実行し、ＧＦＰ発現及び細胞密度をイメージングした。７２時間での画像は、ＧＦＰでの移動性／生存を示すが、ＳＷＴＸ２＋ＳＷＴＸ３条件を示さない。

【図21】３つのｓｓｔＲＮＡの組み合わせでの結果を示す。実験条件は、以下の通りであった：ゲルを底に達するまで１５０Ｖで実行；転写を４℃、２５０ｍＡで２時間実施；１ＸのＴＢＳＴ中５％のミルク中、ＲＴで３０分間ブロック；最初に４℃でＯ／Ｎ（１：２０００のブロッキング溶液中Ｓｉｇｍａ Ｔ２９４９）；１ＸのＴＢＳＴで３回洗浄；次に、ブロッキング溶液（１：１００００の抗ウサギＩｇＧ）中、室温で１時間；１ＸのＴＢＳＴで３回洗浄；ＥＣＬイメージング＋「５ショット」。

【発明を実施するための形態】

【0028】

トランスファーＲＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡの「設計図」のデコーダーであり、細胞及び組織の構造を形成するタンパク質の作成を助ける。これらのＲＮＡ分子は、遺伝子コードの系統的な「再コーディング」を可能にし得るように改変または操作することができる。本明細書では、ポリペプチドまたはタンパク質産生において非同族アミノ酸を送達するために使用できるように、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の部位特異的変化に基づくプラットフォーム技術が提供される。例えば、プロリンｔＲＮＡなどのｔＲＮＡは、ロイシンコドンなどの非同族コドンを認識してデコードするように操作することができる。この例では、ｔＲＮＡは、ロイシンコドンを抑制し、ポリペプチドまたはタンパク質の産生中にそれをプロリンに置換するために使用することができる。そのような標的化された変化の生物学的影響は、ポリペプチドまたはタンパク質の産生に、発現及び／または機能の改変、低下などの悪影響があり得る。プロリンの場合、一例として、アミノ酸が「ねじれ」を促進するので、発現したポリペプチドまたはタンパク質は、一般に、形状が変化し、それにより、タンパク質の機能が無効になる。他のアミノ酸置換にも悪影響があり得る。いくつかの実施形態では、最終的な結果は、細胞死、死滅、生存、または移動性であり得る。従って、本明細書で提供されるｔＲＮＡは、細胞死、死滅、生存、または移動性に利点がある疾患または障害の処置に使用することができる。これらのセンス・サプレッサーｔＲＮＡは、タンパク質の発現及び／または機能、好ましくは、内因性タンパク質のタンパク質発現及び／または機能を改変または破壊するために使用することもできる。

【0029】

従って、本明細書では、代替アミノ酸をコードする目的で非同族センスコドンを抑制し得るセンス・サプレッサーｔＲＮＡが提供される。本明細書で使用される場合、「センス・サプレッサートランスファーＲＮＡ（ｓｓｔＲＮＡ）」は、そのアンチコドンにコードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸を運搬、送達、または供給し得るｔＲＮＡを指す。好ましくは、アミノ酸は、天然アミノ酸であるが、そのアンチコドンにコードされるアミノ酸とは異なる。換言すれば、ｓｓｔＲＮＡは、そのアンチコドンにコードされるアミノ酸を抑制し、その場所の別のアミノ酸を置換する。本明細書で使用される場合、そのアンチコドンにコードされるアミノ酸は、アンチコドンが特異的であるアミノ酸である。本明細書で使用される場合、アクセプターステムまたはアームのアミノ酸特異性を指す場合、「に特異的な」は、ｔＲＮＡのアクセプターステムもしくはアームにより運搬、送達、もしくは供給されるか、またはそれがなされ得るアミノ酸を指す。

【0030】

ｔＲＮＡのアンチコドンループ（ＲＮＡメッセージに結合する部分）を変更することにより、タンパク質のコドンの意味を切り替える能力を有する新規ｔＲＮＡ配列が識別されている。例えば、プロリンコドンをＲＮＡとして構造的に異なるアミノ酸であるロイシンにデコードし得るか、ロイシンコドンをプロリンにデコードし得るか、またはプロリンコドンをイソロイシンにデコードし得るｔＲＮＡ分子が生成されている。実際には、上述のコドンの遺伝的意味を切り替える。本技術は、トランスファーＲＮＡコドン交換による置換の頭字語に基づいて「ＳＷＴＸ」ｔＲＮＡとも呼ばれている。本明細書で提供されるｔＲＮＡは、本明細書では、センス・サプレッサーｔＲＮＡとも呼ばれる。この治療的アプローチは、「コードスイッチング」を利用する。コドン選択的なアミノ酸変換を施すことによるコードスイッチングにより、サイズ、形状、及び／または電荷の変化など、タンパク質改変への複数の経路が可能になる。そのような変化のいずれか１つ以上は、本明細書で提供される方法のうちのいずれか１つにおいて望ましい結果であり得る。系統的且つ選択的な側鎖変換により、細胞機能の麻痺、細胞分裂及び／または成長の停止などが引き起こされ得る。

【0031】

ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、合成で生成することができる。また、数百のヒトｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が既知であり、一般に、Ｇｅｎｂａｎｋなどの情報源を通して当業者らが入手可能である。ｔＲＮＡの構造は、高度に保存されており、ｔＲＮＡは、種を超えて機能的であり得る。従って、細菌または他の真核生物のｔＲＮＡ配列も、本発明のｔＲＮＡの潜在的な供給源である。特定のｔＲＮＡが、例えば、所望の哺乳動物細胞において、要望通りに機能するかどうかの判定は、本明細書に記載のように、または本明細書で提供される教示の恩恵を受ける当業者には明らかとなる他の実験を通して確認することができる。

【0032】

現在の研究は、ｔＲＮＡ内のアンチコドン配列の分子編集を通してｔＲＮＡを変更し得ることを示す。このアプローチにより、センスコドンをリプログラミングして、非同族アミノ酸に置換することが可能になる。本明細書で提供される改変ｔＲＮＡは、特定のアミノ酸へのコドンの「再編集」を可能にする。これらのｔＲＮＡ分子は、サイズが小さい（例えば、ｔＲＮＡ＋プロモーターは、わずか約３００ｂｐ以下である）ので、迅速に発現に適する。本発明のさらなる利点は、システム全体がコンパクトであり得るので、容易な発現及び細胞送達を提供することである。要約すると、ヒト細胞などの細胞内で機能するｔＲＮＡ遺伝子の構造成分を含むオリゴヌクレオチドを合成することができる。このオリゴヌクレオチドの配列は、既知の配列に基づいて設計され、ｔＲＮＡのアンチコドン領域に置換が行われ、これにより、特定のｔＲＮＡが特定のコドンを認識するが、代替アミノ酸が送達される。

【0033】

ｔＲＮＡは、Ｔアーム、Ｄアーム、アンチコドンアーム、及びアクセプターステムまたはアームを含む一般的な４アーム構造を有する（図２）。Ｔアームは、「Ｔステム」及び「ＴΨＣループ」で構成される。本明細書で提供されるｔＲＮＡのいずれか１つは、この４アーム構造を含み得る。ｔＲＮＡは、長さが約１００ヌクレオチドであり、細胞に容易に導入することができる。

【0034】

特定の実施形態では、ｔＲＮＡは、発現カセットにコードされる。ｔＲＮＡコード化配列が内部プロモーター配列であるので、ｔＲＮＡ配列は、別の転写単位に含まれる必要はないが、別の転写単位で提供され得る。従って、本発明は、本明細書で提供されるｔＲＮＡをコードする配列を含む発現カセットも提供する。特定の実施形態では、発現カセットは、さらに、プロモーターを含む。特定の実施形態では、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。送達されるべきｔＲＮＡをコードする配列の発現を引き起こすプロモーターは、既知の考慮事項、例えば、プロモーターに機能的に連結された核酸の発現レベル及びベクターが導入される細胞型、により選択される所望の任意のプロモーターであり得る。プロモーターは、外因性プロモーターまたは内因性プロモーターであり得る。

【0035】

本明細書で使用される「発現カセット」は、適切な細胞内で特定のヌクレオチド配列の発現を指示可能な核酸配列を意味し、これには、終結シグナルに作動可能に連結され得る目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターが含まれ得る。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってよい。発現カセットは、また、天然に存在するが、異種発現に有用な組み換え形態で得られているものであってよい。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは調節可能なプロモーターの制御下にあり得る。発現カセットは、ベクターであっても、ベクターに含有されていてもよい。

【0036】

「作動可能に連結された」は、配列のうちの１つの機能が別の配列により影響を受けるような、核酸配列の単一の核酸フラグメントへの会合を指す。例えば、２つの配列が、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を与えるように位置している（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）場合、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と「作動可能に連結している」または「会合している」と言われる。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結され得る。

【0037】

本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを指し、全長タンパク質及びそのフラグメントを含む。従って、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、多くの場合、本明細書で互換的に使用される。

【0038】

本方法は、細胞に核酸を送達する方法を提供する。細胞への投与は、単に細胞と接触させることを含む任意の手段により達成することができる。細胞との接触は、任意の所望の期間にあり得る。細胞には、ヒト、ならびに、他の大型（非齧歯動物）哺乳動物、例えば、霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及びイヌの任意の所望の細胞が含まれ得る。本明細書で提供される対象のいずれか１つは、ヒトまたは他の哺乳動物であり得る。「哺乳動物」という用語には、ヒト、マウス、ラット、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、及びヒツジが含まれるが、これらに限定されない。

【0039】

当該技術分野では、対象への送達及び導入のための好適な方法も提供または理解される。一実施形態では、医薬組成物は、治療有効量、すなわち、タンパク質の発現もしくは機能を破壊するのに十分な量、細胞死、死滅、生存、もしくは移動性をもたらすのに十分な量、または問題の病状の症状を低減もしくは改善するのに十分な量、あるいは所望の利益をもたらすのに十分な量の目的の核酸を生じる十分な遺伝物質を含むであろう。

【0040】

ｔＲＮＡは、内在性ｔＲＮＡシンテターゼなどのｔＲＮＡシンテターゼを用いて、有効量で細胞内に送達することができる。ｔＲＮＡシンテターゼは、本発明に従ってｔＲＮＡが導入される細胞内に存在する場合、細胞にとって「内因性」であるとみなされる。当業者らに明らかなように、ｔＲＮＡシンテターゼは、関連する種類の細胞内に天然に見出されるかどうかに関わらず、または、それを含有もしくは発現させるように、問題の特定の細胞が改変されるか、もしくは他の方法で人の手により操作されるかに関わらず、これらの目的のために内因性であるとみなされ得る。

【0041】

医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含有するであろう。そのような賦形剤には、過度の毒性なしに投与され得る任意の薬剤が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ならびに液体、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールが含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など、ならびに、有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを、それらに含むことができる。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などは、そのようなビヒクル中に存在し得る。薬学的に許容される賦形剤についての完全な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。

【0042】

本明細書の教示を考慮すれば当業者らには明らかなように、提供されるｔＲＮＡの有効量は、実験的に決定され得る。投与は、処置の期間中、１回の用量で連続的または断続的に実施することができる。投与の最も効果的な手段及び投薬量を決定する方法は、治療薬の組成、標的細胞、及び処置される対象などにより変化し得る。単回投与及び複数回投与は、処置する内科医が選択した用量レベル及びパターンを用いて実施することができる。

【0043】

水、生理食塩水、人工ＣＳＦ、または他の既知の物質を含むビヒクルを、本発明で用いることができる。製剤を調製するために、精製組成物を単離することができる。次に、組成物は、適切な濃度に調整され、使用のために包装され得る。

【0044】

「核酸」という用語は、糖、リン酸、及びプリンまたはピリミジンのいずれかの塩基を含有するモノマー（ヌクレオチド）から構成される、一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。特に限定しない限り、用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し且つ天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知のアナログを含有する核酸を包含する。

【0045】

「核酸フラグメント」は、所定の核酸分子の一部である。ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準パラメーターを使用して記載されたアラインメントプログラムの１つを使用した参照配列と比較して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、もしくは７９％、または少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、もしくは８９％、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、もしくは９４％、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を含むことを意味する。

【0046】

外因性遺伝物質（例えば、ｓｓｔＲＮＡまたはＳＷＴＸ ｔＲＮＡをコードする）は、トランスフェクションなどの遺伝子導入法によりｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入することができる。様々な発現ベクター（すなわち、外因性遺伝物質の標的細胞への送達を促進する媒体）が当業者に既知である。本明細書で使用される場合、「細胞のトランスフェクション」は、取り込みによる細胞による新しい遺伝物質の獲得を指す。従って、トランスフェクションは、物理的または化学的方法を使用して細胞に核酸を挿入することを指す。いくつかのトランスフェクション手法は、当業者らに既知であるか、または別途本明細書に記載されている。

【0047】

本明細書で使用される場合、「外因性遺伝物質」は、天然または合成の核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。これは、細胞内に天然には見出されないか、または、細胞内に自然に存在する場合、細胞により生物学的に有意なレベルで転写または発現されない。従って、「外因性遺伝物質」には、例えば、ｔＲＮＡに転写することができる天然に存在しない核酸が含まれる。

【0048】

通常は、外因性遺伝物質には、新しい遺伝子の転写を制御するためのプロモーターとともに異種遺伝子が含まれ得る。プロモーターは、転写を開始するために必要な特定の塩基配列を特徴として有する。任意に、外因性遺伝物質は、さらに、所望の遺伝子転写活性を得るために必要な追加の配列（すなわち、エンハンサー）を含み得る。外因性遺伝物質は、コード配列の転写を可能にするためにプロモーター及びコード配列が作動可能に連結されるように、プロモーターのすぐ下流で細胞ゲノムに導入され得る。

【0049】

少なくとも１つのプロモーター及び少なくとも１つの異種核酸に加えて、発現ベクターは、発現ベクターでトランスフェクトされている細胞の選択を容易にするための選択遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含んでもよい。あるいは、細胞は、２つ以上の発現ベクター、ｔＲＮＡをコードする遺伝子（複数可）を含有する少なくとも１つのベクター、選択遺伝子を含有する他のベクターをトランスフェクトすることができる。過度の実験をすることなく、好適なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子、及び／またはシグナル配列（下記）の選択することは、当業者の範囲内であるとみなされる。

【0050】

本明細書で提供される実施形態のいずれか１つの実施形態では、ｓｓｔＲＮＡ（複数可）は、ｃＤＮＡの形態であり、そのまま、細胞に送達するか、またはこれと接触させることができる。

【0051】

本明細書で提供される実施形態のいずれか１つの実施形態では、ｓｓｔＲＮＡ（複数可）は、所望のアミノ酸で荷電されているか、または荷電されておらず、そのまま、細胞に送達するか、または細胞と接触させることができる。

【0052】

一実施形態における本発明には、例えば、本発明のｓｓｔＲＮＡまたはＳＷＴＸ ｔＲＮＡの投与を通して過剰増殖性疾患または障害を処置するための、本明細書で提供される方法または使用のいずれか１つのための組成物及び方法が含まれる。本明細書で使用される場合、「過剰増殖性疾患または障害」は、急速な分裂、実質的な過剰増殖などによる異常に高い細胞増殖速度が存在する任意の疾患または障害を指す。本開示の特定の実施形態は、哺乳動物などの対象における過剰増殖性疾患または障害を処置する方法を提供する。特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。

【0053】

本開示の特定の実施形態は、例えば、ヒトなどの哺乳動物などの対象の過剰増殖性疾患または障害を処置するために、本明細書に提供される方法または使用のいずれか１つに有用な薬剤を調製する、本明細書に記載のｓｓｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または組成物の使用を提供する。特定の実施形態では、治療法は、非腫瘍性または非悪性の過剰増殖性障害と共に、腫瘍、がん、及び腫瘍性組織を含む過剰増殖性疾患または障害の処置／管理に利用可能性を有する。特定の実施形態では、過剰増殖性疾患または障害は、がん、例えば、メラノーマまたは乳癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌である。がんは、また、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮頸部／子宮癌、膀胱癌、または肝臓癌であってよい。

【0054】

がんは、耐性がんであるものであってよい。「耐性がん」とは、処置を受けているが、それにも関わらず、処置を受けても進行しているものである。一実施形態では、耐性癌は、化学療法、放射線、及び／または標的療法などの複数の処置にも関わらず、がんが進行する「汎耐性がん」である。

【0055】

本開示は、本明細書に記載のｓｓｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、発現カセット、またはベクターを含む細胞も提供する。細胞は、ヒトなどの哺乳動物であってよい。一態様によれば、細胞発現系が提供される。発現系は、本明細書で提供される細胞及び発現カセットを含む。発現カセットには、プラスミド、ウイルスベクター、及び異種遺伝物質を細胞に送達するための他のビヒクルが含まれるが、これらに限定されない。

【0056】

細胞発現系は、生体内で形成することができる。さらに別の態様によれば、ｉｎ ｖｉｖｏで対象を処置する方法が提供される。本方法は、ｓｓｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または組成物をｉｎ ｖｉｖｏで対象に導入することを含む。対象は、ヒトなどの哺乳動物であってよい。

【0057】

「処置する」及び「処置」という用語は、症状を緩和するか、または対象に何らかの利益を提供し得る治療的処置及び手段の両方を指し、その目的は、がんの増殖、発生、または広がりなどの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速させる（軽減する）ことである。本発明の目的上、有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能または検出不可能に関わらず、症状の緩和、疾患の程度の軽減、病状の安定化（すなわち、悪化していない）、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、及び寛解（部分的または全てに関わらず）が含まれるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けなかった場合、予想される生存期間と比較して生存期間を延長することも意味し得る。処置が必要な者らには、既に状態、疾患、または障害を患っている者らが含まれる。

【0058】

「治療的有効量」という語句は、本明細書に記載の、（ｉ）特定の疾患、状態、もしくは障害を処置するか、（ｉｉ）特定の疾患、状態、もしくは障害の１つ以上の症状を軽減、改善、もしくは除去するか、または、（ｉｉｉ）特定の疾患、状態、もしくは障害の１つ以上の症状の発症を予防もしくは遅延させる、本発明の化合物の量を意味する。がんの場合、治療的有効量の薬剤は、がん細胞の数を低減させ；腫瘍サイズを低減させ；末梢臓器へのがん細胞の浸潤を抑制し（すなわち、ある程度減速し、好ましくは、停止し）；腫瘍の転移を抑制し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは、停止し）；及び／または、がんと関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減し得る。薬物が成長を阻止し、及び／または既存のがん細胞を死滅させ得る限り、それは、細胞増殖抑制性及び／または細胞傷害性であり得る。がん治療の場合、有効性は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を評価すること、及び／または奏効率（ＲＲ）を決定することにより測定することができる。

【0059】

「がん」及び「がん性」という用語は、通常、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、または記載する。「腫瘍」は、１つ以上のがん性細胞を含む。がんの例としては、がん腫、悪性腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例としては、メラノーマまたは乳癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌が挙げられる。

【0060】

本発明の薬剤は、過剰増殖性疾患または障害（例えば、がん）と関連する少なくとも１つの症状の低減をもたらすために投与することができる。投与量は、選択された組成物、限定されないが、特定の疾患、体重、身体状態、及び哺乳動物の年齢を含む様々な要因に応じて変化するであろう。そのような因子は、動物モデルまたは当該技術分野で既知の他の試験システムを用いて、臨床医がより容易に決定することができる。

【0061】

本発明によるｓｓｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または組成物の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態（投与の目的が治療的であるかどうかに関わらず）及び熟練専門医に既知の他の要因に応じて、連続的であっても断続的であってもよい。本発明の薬剤の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であっても、一連の間隔をあけた投与であってもよい。

【0062】

本発明のｓｓｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または組成物を有する１つ以上の好適な単位剤形を製剤化してもよく、様々な経路により投与することができる。本発明の薬剤を投与用に調製される場合、それらは、医薬製剤または単位剤形を形成するように、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わされてもよい。そのような製剤中の全活性成分には、製剤の０．１～９９．９重量％が含まれる。「薬学的に許容される」は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではない担体、希釈剤、賦形剤、及び／または塩である。本発明の薬剤を含有する医薬製剤は、周知の容易に入手可能な成分を使用して、当該技術分野で既知の手順で調製することができる。本発明の薬剤は、投与に適した溶液として製剤化することもできる。本発明の薬剤の医薬製剤は、水性もしくは無水の溶液もしくは分散液の形態、あるいはエマルションもしくは懸濁液の形態をとることもできる。

【0063】

従って、薬剤は、投与用に製剤化され得、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入容器、または防腐剤が添加された複数回用量容器の単位用量形態で提供され得る。活性成分は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションのような形態をとり得、製剤化剤、例えば、懸濁剤、安定化剤、及び／または分散剤を含有し得る。あるいは、有効成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌の発熱性物質不含水中に存在し得る。必要な有効量が、複数の投薬単位を投与することにより達成することができるので、各剤形の個々の用量に含まれる活性成分（複数可）の単位含有量は、それ自体は、特定の適応症または疾患を処置するための有効量を構成する必要がないことが理解されるであろう。さらに、有効量は、個別にまたは一連の投与で、剤形の用量未満を使用して達成され得る。

【0064】

本発明の医薬製剤は、任意の成分として、薬学的に許容される担体、希釈剤、可溶化剤、または乳化剤、及び当該技術分野で周知の種類の塩を含んでもよい。本発明の医薬製剤において有用な担体及び／または希釈剤の具体的な非限定例としては、水及び生理学的に許容される緩衝食塩水、例えば、ｐＨ７．０～８．０のリン酸緩衝食塩水及び水、が挙げられる。

【0065】

本明細書で提供される組成物のいずれも、トランスフェクションまたは形質導入などの遺伝子導入法を用いて、細胞に接触させるか、細胞に投与するか、または細胞に導入することができる。従って、本明細書で提供される組成物のいずれも、遺伝子送達ビヒクルと共に、または遺伝子送達ビヒクル中に含まれ得る。遺伝子送達ビヒクルは、当該技術分野で既知の任意の送達ビヒクルであり得、受容体及び／または脂質媒介トランスフェクションにより促進されるネイキッド核酸、ならびに多くのベクターのいずれかを含み得る。ベクターには、真核生物ベクター、原核生物ベクター（例えば、細菌ベクター）、及び、限定されないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター（ヒト及びブタを含む他のベクター）、ヘルペスウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、及びシュードタイプウイルスベクターを含むウイルスベクターが含まれる。

【0066】

「レトロウイルス」という用語は、複製サイクル中に逆転写酵素を利用するＲＮＡウイルスに関して使用される。レトロウイルス科には、システルナウイルスＡ、オンコウイルスＡ、オンコウイルスＢ、オンコウイルスＣ、オンコウイルスＤ、レンチウイルス、及びスプマウイルスを含む、いくつかの属が含まれる。レトロウイルスは、様々な種に感染し、水平方向及び垂直方向の両方に感染し得る。

【0067】

本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、ゆっくりと進行性疾患を引き起こすレトロウイルスの群（または属）を指す。この群に含まれるウイルスには、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体；ビスナ－マエディ（ヒツジに脳炎（ビスナ）または肺炎（マエディ）を引き起こす）、ヤギ関節炎・脳炎ウイルス（ヤギに免疫不全、関節炎、及び脳症を引き起こす）；ウマ伝染性貧血ウイルス（馬に自己免疫性溶血性貧血及び脳症を引き起こす）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）（ネコに免疫不全を引き起こす）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）（ウシにリンパ節腫脹、リンパ球増加症、場合により、中枢神経系感染症を引き起こす）；ならびに、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（亜ヒト霊長類に免疫不全や脳症を引き起こす）が含まれる。これらのウイルスが引き起こす疾患は、長い潜伏期間及び長引く経過を特徴とする。通常、ウイルスは、単球及びマクロファージに潜在的に感染し、そこから他の細胞に広がる。ＨＩＶ、ＦＩＶ、及びＳＩＶは、容易に、Ｔリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）にも感染する。

【0068】

一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。「ＡＡＶ」ベクターは、アデノ随伴ウイルスを指し、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。用語は、別途必要な場合を除き、全てのサブタイプ、血清型、及び偽型、ならびに、天然型及び組み換え型の両方を網羅する。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、規定の抗血清とのカプシドタンパク質反応性に基づいて他のＡＡＶにより識別され、他のＡＡＶと区別されるＡＡＶを指す。例えば、ＡＡＶ－１～ＡＡＶ－９及びＡＡＶｒｈ１０の霊長類ＡＡＶの既知の８つの血清型がある。例えば、血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子からコードされるカプシドタンパク質と、同じＡＡＶ２血清型由来の５’及び３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムを含有するＡＡＶを指すために使用される。本明細書で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶ１は、同じ血清型由来のカプシドタンパク質及び５’－３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すために使用され得るか、または１つの血清型由来のカプシドタンパク質及び異なるＡＡＶ血清型由来の５’－３’ＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ血清型２由来のカプシド及びＡＡＶ血清型５由来のＩＴＲ、を有するＡＡＶを指し得る。本明細書に示される各例では、ベクターの設計及び作製の記載は、カプシドの血清型及び５’－３’ＩＴＲ配列について説明している。略語「ｒＡＡＶ」は、組み換えアデノ随伴ウイルスを指し、これは、組み換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる。

【0069】

「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶの全てのカプシドタンパク質）及びカプシド化ポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子）を含む場合、それは、通常、「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。

【0070】

一実施形態では、ＡＡＶ発現ベクターは、少なくとも、転写の方向に作動可能に連結された構成要素として、転写開始領域、目的のＤＮＡ、及び転写終結領域を含む制御エレメントを提供するために、既知の手法を使用して構築される。制御要素は、哺乳動物細胞内で機能するように選択される。作動可能に連結された構成要素を含有する得られたコンストラクトは、機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列と（５’及び３’で）隣接する。

【0071】

「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、ＤＮＡ複製の起点として、及びウイルスのパッケージングシグナルとして、シスで一緒に機能する、ＡＡＶゲノムの各末端に見出される当該技術分野で認識されている領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶｒｅｐコード領域とともに、隣接する２つのＩＴＲ間に配置されたヌクレオチド配列の効率的な切除及びレスキュー、及び哺乳動物細胞ゲノムへの組み込みを提供する。

【0072】

ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は、既知である。本明細書で使用される「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により改変され得る。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などを含む、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクター内の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、意図された、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列を切除及びレスキューすることを可能にするように、ならびに、ＡＡＶＲｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合、レシピエント細胞のゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするように、機能する限り、必ずしも、同じＡＡＶ血清型または単離物と同一またはそれに由来する必要はない。

【0073】

一実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などを含むいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶ発現ベクター内の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、意図された、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列を切除及びレスキューすることを可能にするように、ならびに、ＡＡＶＲｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合、レシピエント細胞のゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを可能にするように、機能する限り、必ずしも、同じＡＡＶ血清型または単離物と同一またはそれに由来する必要はない。

【0074】

一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２に由来し得る。ＡＡＶベクターでの使用に適したＤＮＡ分子は、サイズが約５キロベース（ｋｂ）未満、約４．５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３．５ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２．５ｋｂ未満であり、当該技術分野で既知である。

【0075】

本明細書で使用される場合、「弱毒化ウイルス」という用語は、目的の対象の病原性が実質的に低減されるように改変されている任意のウイルス（例えば、弱毒化レンチウイルス）を指す。ウイルスは、臨床的観点から非病原性となる点まで弱毒化され得る。すなわち、ウイルスに曝露された対象は、対照対象と比較して病理レベルの統計的に有意な増加を示さない。

【0076】

本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスまたはベクターの核酸のウイルスカプシドまたは粒子への挿入に必要な、または少なくともこれを促進する、ウイルスゲノムまたはベクター内に位置する配列を指す。「パッケージングシグナル」という用語は、便宜上、機能的なパッケージングシグナルに転写されるベクター配列を指すためにも使用される。パッケージングベクター及び導入遺伝子ベクターの差異は、パッケージングベクターでは、主要なパッケージングシグナルが不活化されており、導入遺伝子ベクターでは、主要なパッケージングシグナルが機能的であり得る。理想的には、いくつかの実施形態では、パッケージングベクターでは、全てのパッケージングシグナルが不活化され、導入遺伝子ベクターでは、全てのパッケージングシグナルが機能するであろう。しかし、ウイルス力価の最大化または相同組み換えの抑制など、相殺される考慮事項は、そのようなコンストラクトをより望ましくないものにし得る。

【0077】

本明細書で提供される組成物は、細胞と接触させるか、またはナノ粒子などの粒子内で対象に送達もしくは投与することができる。ナノ粒子などの粒子は、脂質ベースのナノ粒子（本明細書では脂質ナノ粒子とも呼ばれ、すなわち、構造を構成する材料の大部分が脂質であるナノ粒子である）、ウイルス様粒子（すなわち、主にウイルス構造タンパク質で構成されるが、感染性がない、もしくは感染力が低い粒子）、及び／またはナノ材料を組み合わせた粒子であり得るが、これらに限定されない。粒子は、限定されないが、回転楕円形、立方形、角錐形、楕円形、円筒形、環状形などを含む、様々な異なる形状であってよい。

【0078】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子などの粒子は、１つ以上の脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子などの粒子は、リポソームを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子などの粒子は、脂質二重層を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子などの粒子は、脂質単層を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子などの粒子は、ミセルを含んでもよい。

【0079】

ここで、本発明は、以下の非限定例により説明される。

【実施例】

【0080】

実施例１
非同族トリプレットＤＮＡコドンに特異的となるようにアンチコドンループが改変されているトランスファーＲＮＡ分子が生成されている。これらのＳＷＴＸ（ｔＲＮＡ交換による置換）ｔＲＮＡは、ヒト遺伝コード内のセンスコドンを抑制し得る（本明細書ではセンス・サプレッサーｔＲＮＡ（ｓｓｔＲＮＡ）とも呼ばれる）。

【0081】

要約すると、単一プラスミド設計を使用して、コドン交換ｔＲＮＡ及びＧＦＰレポーターを発現させた。ｔＲＮＡカセットは、上流のリーダー配列と、それに続く下流のターミネーターを含有する。ＨＥＫ２９３細胞を以下のようにリバーストランスフェクトした。細胞を、解凍後少なくとも３日間毎日培養液中で継代し、７０％のコンフルエントまで成長させた。プラスミドｃＤＮＡを、トランスフェクション試薬と混合し、９６ウェルに添加し、続いて、１０Ｋ／１８０ｕｌの密度のＨＥＫ２９３細胞を添加した。次に、２４時間及び４８時間の時点で、細胞をＧＦＰ発現についてイメージングした。

【0082】

結果
代替アミノ酸を送達し得るＳＷＴＸ ｔＲＮＡまたはｓｓｔＲＮＡが生成されている。例えば、ＳＷＴＸ２及びＳＷＴＳ３は、プロリン（ＣＣＡ）コドンにロイシンを配置するために、プロリントリプレットコドンをデコードする（小文字は、アンチコドントリプレットを示す）。換言すれば、ロイシンｔＲＮＡを再コードして、プロリン（ＣＣＡ）コドンのロイシンをコードし、生成した。

ＳＷＴＸ２：
ＡＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴｔｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＴＴＣＡＴＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＡ（配列番号１）

ＳＷＴＸ３：
ＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＣＴＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴｔｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＧＧＴＡ（配列番号２）

【0083】

これらのコンストラクトの同時トランスフェクションにより、ＧＦＰ発現及び細胞分裂が急速に緩和された（図３）。一過性トランスフェクションによるＳＷＴＸ２またはＳＷＴＸ３ ｔＲＮＡコンストラクトの共発現は、ＧＦＰの細胞産生を減少させ、結果として、急速で有害な生物活性を示す。ＳＷＴＸ５またはＳＷＴＸ７ ｔＲＮＡコンストラクトの共発現の結果も示される（図４）。

【0084】

実施例２
上記のように生成されたｔＲＮＡコンストラクト、ならびに得られるＧＦＰ強度に関してプラスミドで発現させた時にスクリーニングされたいくつかのｔＲＮＡコンストラクト（ＳＷＴＸ５１及び５２は、オールインワンのプラスミド設計を有する）に対するさらなる例（図５～８）は、以下の通りである：

Ｐｒｏ→Ｌｅｕ ＡＡＧ（Ｌｅｕを抑制してＰｒｏに変換）
ＳＷＴＸ１１：
ＧＧＣＴＣＧＴＴＧＧＴＣＴＡＧＧＧＧＴＡＴＧＡＴＴＣＴＣＧＣＴＴａａｇＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧｔＣＣＣＧＧＧＴＴＣＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＣＧＡＧＣＣＣ（配列番号３）

ＳＷＴＸ１３：
ＧＧＣＴＣＧＴＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＴＧＡＴＴＣＴＣＧＣＴＴａａｇＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧｔＣＣＣＧＧＧＴＴＣＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＣＧＡＧＣＣＣ（配列番号４）

Ｌｅｕ→Ｐｒｏ ＡＧＧ（Ｐｒｏを抑制してＬｅｕに変換）
ＳＷＴＸ３１：
ＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｃｔＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴａｇｇＧＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡ（配列番号５）

ＳＷＴＸ３２：
ＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｃｔＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴａｇｇＧＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＴＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡ（配列番号６）

ＳＷＴＸ３３：
ＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｃｔＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴａｇｇＧＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡ（配列番号７）

ＳＷＴＸ３４：
ＡＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴａｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡ（配列番号８）

ＳＷＴＸ３５：
ＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴａｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴＣＧＧＴＡ（配列番号９）

ＳＷＴＸ３６：
ＡＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴａｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＴＴＣＡＴＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＡ（配列番号１０）

Ｌｅｕ→Ｐｒｏ ＴＧＧ（Ｐｒｏを抑制してＬｅｕに変換）
ＳＷＴＸ５０：
ＡＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴｔｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡ（配列番号１１）

ＳＷＴＸ５１：ＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴｔｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴＣＧＧＴＡ（配列番号１２）

ＳＷＴＸ５２：
ＡＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴｔｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＴＴＣＡＴＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＡ（配列番号１３）

Ｉｌｅ→Ｐｒｏ ＡＧＧ（Ｐｒｏを抑制してＩｌｅに変換）
ＳＷＴＸ５５：
ＧＧＣＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＴＴＧＧＴｔＡＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴａｇｇＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧｔＣＧＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＣＴＧＧＣＣＡ（配列番号１４）

ＳＷＴＸ５７：
ＧＧＣＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＴＴＧＧＴｔＡＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴａｇｇＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧｔＣＧＣＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＴＡＣＧＧＧＣＣＡ（配列番号１５）

【0085】

使用されたプラスミド配列は、以下の通りである。

ＳＷＴＸ３１ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｃｔＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴａｇｇＧＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号１６）

ＳＷＴＸ３２ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｃｔＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴａｇｇＧＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣ（配列番号１７）

ＳＷＴＸ３３ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｃｔＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴａｇｇＧＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＴＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号１８）

ＳＷＴＸ３４ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｃｔＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴａｇｇＧＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号１９）

ＳＷＴＸ３５ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴａｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２０）

ＳＷＴＸ３６ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴａｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴＣＧＧＴＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２１）

ＳＷＴＸ５０ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｃｔＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴｔｇｇＧＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２２）

ＳＷＴＸ５１ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴｔｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２３）

ＳＷＴＸ５２ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴｔＡＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴｔｇｇＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴＣＧＧＴＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２４）

ＳＷＴＸ５５ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＧＧＣＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＴＴＧＧＴｔＡＧＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴａａｇＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧｔＣＧＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＣＧＧＧＣＣＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２５）

ＳＷＴＸ５７ Ｇ０６１９ ｐＦＢＡＡＶｍｃｓＣＭＶｅＧＦＰＳＶ４０ｐＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＴＴＧＧＴｔＡＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴａａｇＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧｔＣＧＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＣＴＧＧＣＣＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２６）

【0086】

実施例３
多数の生成されたｓｓｔＲＮＡ（ＷＴ ＧＦＰまたはＧＦＰ＋ＳＷＴＸ５１またはＳＷＴＸ５２コンストラクト、ＳＷＴＸ５１及び５２は、オールインワンプラスミド設計を有する）も、以下の細胞株にトランスフェクトした（上記と同様のＨＥＫ２９３Ｔ、図８及び１１）。

【0087】

ＳＫ－ＭＥＬ－３：悪性メラノーマ、皮膚；転移部位：リンパ節に由来。この細胞株の基礎培地は、ＡＴＣＣ配合マッコイ５ａ改変培地（カタログ番号３０－２００７）であった。完全成長培地を作成するために、以下の構成成分：ウシ胎児血清を最終濃度１５％まで基礎培地に添加した。リバーストランスフェクションを実施した。

【0088】

ＲＰＭＩ－７９５１：悪性メラノーマ、皮膚；転移部位：リンパ節に由来。この細胞株の基礎培地は、ＡＴＣＣ配合イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）（カタログ番号３０－２００３）であった。完全成長培地を作成するために、以下の構成成分：ウシ胎児血清を最終濃度１０％まで基礎培地に添加した。トランスフェクション試薬としてＦＵＧＥＮＥを使用した。

【0089】

結果は、ＳＷＴＸ５１及びＳＷＴＸ５２がメラノーマ株におけるタンパク質産生を減少させることを示す（図９、１０、及び１２）。

【0090】

実施例４
両方のｔＲＮＡがＧＦＰレポーターと同じプラスミドペイロード（すなわち、「シス」構成）にある、ＳＷＴＸ５１及び５２ｔＲＮＡの「オールインワン」設計を使用して、ＧＦＰ発現に対するｔＲＮＡカセットプロモーターの干渉の可能性を評価した。ＳＷＴＸ５１及び５２ｔＲＮＡを、レポーターとは別の独自のプラスミド（ＳＷＴＸ２及びＳＷＴＸ３と呼ばれる）で共発現させた。これは、「トランス」立体構造である。ｔｄｔｏｍａｔｏ（赤色蛍光タンパク質）及びナノルシフェラーゼの発現について、メラノーマ細胞株を使用して、ＳＷＴＸ２及びＳＷＴＸ活性を評価した。ＳＷＴＸ２及びＳＷＴＸ３は、ｔｄｔａｔａｔｏ及びｎａｎｏｌｕｃをうまくノックアウトした（図１３及び１４（２４時間の結果）ならびに図１５（４８時間の結果）ならびに図１６（２４及び４８時間の結果））。

【0091】

実施例５
ｔＲＮＡがリポフェクタミン及びリバーストランスフェクションで送達された場合、ＧＦＰのｔＲＮＡ媒介性ノックダウンが、ＲＰＭＩ－７９５１メラノーマ細胞で見られた。ＳＷＴＸ５１及びＳＷＴＸ５２は、ＳＫＭＥＬメラノーマ株におけるレポータータンパク質の機能／発現を減少させる。結果は、ＳＫ Ｍｅｌ３メラノーマ株及びＨＣＣトリプルネガティブ細胞株で示される（図１７～１９）。ＳＫ Ｍｅｌでは、ＲＰＭＩ－７９５１及びＨＥＫの比較が示され、一番上にＷＴ ＧＦＰがあり、ＳＷＴＸ５１及びＳＷＴＸ５２が続く。

【0092】

実施例６
２つのコンストラクト：ＳＷＴＸ２及びＳＷＴＸ３の組み合わせである「ｔＲＮＡ単独」バージョンのＳＷＴＸ５１及び５２を使用した。データは、宿主リボソームを同時に攻撃する２つのｔＲＮＡが、単一のコンストラクトよりも強力であり得ることを示唆する。４８時間までに（図２０）、細胞死は、ＳＷＴＸ２＋３条件で見られるが、ＧＦＰ単独では、見られない。細胞が、取り除かれた領域に戻る能力を測定するために、４８時間でスクラッチアッセイを実施した。７２時間で、ＧＦＰ細胞は、以前として健常で蛍光性があり、引っかき傷によりできた隙間をほぼ再充填している。ＳＷＴＸ２＋３細胞では、広範な細胞死があり、移動性はなく、ＧＦＰ発現はほとんどない。

【0093】

実施例７
ＨＥＫ細胞及びｓｓｔＲＮＡの３つの組み合わせを使用して、代謝調節因子である内因性代謝タンパク質ｍＴＯＲの発現を調査した。このタンパク質は、ロイシンまたはイソロイシンに変異することができる９０を超えるプロリンコドンを有する。図２１の左側の青色の染色は、全てタンパク質であり、同じ図の右側は、様々な条件及び時点でのｍＴＯＲに対するウェスタン染色である。

【0094】

ＳＷＴＸ ｔＲＮＡの多くの組み合わせを試験し、ＳＷＴＸ２／３／５７の３つの組み合わせが７２時間で最大の影響を及ぼした（赤いアスタリスク）。レーンがタンパク質で満たされている場合でも、ｍＴＯＲのレベルは、大きな影響を受ける。この効果は、リボソームに影響を与えるために一般に使用されるシクロヘキサミドよりもさらに顕著である。

【0095】

上述の明細書及び実施例は、本発明を十分に開示し、可能にするものであるが、本発明の範囲を限定するものではなく、これは、添付の特許請求の範囲により規定される。

【0096】

全ての刊行物、特許、及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上述の明細書では、本発明をその特定の実施形態に関連して説明し、多くの詳細は、例示目的で記載されているが、本発明が追加の実施形態が可能であること及び本明細書に記載されている詳細の一部が発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更され得ることが、当業者らには明らかであろう。

【0097】

本発明を説明する文脈における「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語、ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書で別途指示のない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅するものと解釈されるべきである。「を含むこと」、「を有すること」、「を含むこと」、及び「を含有すること」という用語は、別途記載のない限り、無制限の用語（すなわち、「を含むが、それらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の詳述は、本明細書に別途記載がない限り、その範囲内にある別々の値をそれぞれ個別に参照する簡略的な方法として機能することが単に意図され、別々の値はそれぞれ、あたかも本明細書に個別に詳述されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別途指示のない限り、または別途文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供される、ありとあらゆる例、または例示的な表現（例えば、「例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより良く理解することを意図しており、別途請求の範囲に記載のない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書のいかなる文言も、請求の範囲に記載されていないいかなる要素も、本発明の実施に必須であると示すものとして解釈されるべきではない。

【0098】

本発明を実施するための発明者らに既知の最良様式を含む、本発明の実施形態は、本明細書に記載されている。これらの実施形態の変形は、上述の説明の解釈時に、当業者らに明らかになり得る。本発明者らは、当業者らが必要に応じてそのような変形を用いることを期待しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明には、適用される法律により認められる、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載された主題の全ての修正及び等価物が含まれる。さらに、本明細書で別途指示のない限り、または別途文脈と明らかに矛盾しない限り、可能な全ての変形における上述の要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図20】

【図21】

【配列表】

2024502044000001.app

【国際調査報告】