特表 2024-502061 組換えバチルス属微生物およびこれを用いた母乳オリゴ糖製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-17

(54)【発明の名称】組換えバチルス属微生物およびこれを用いた母乳オリゴ糖製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20240110BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20240110BHJP

   C12P 19/18 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240110BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/21

C12N1/20 A

C12P19/18

C12N15/31

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023540465

(86)(22)【出願日】2021-12-28

(85)【翻訳文提出日】2023-06-30

(86)【国際出願番号】 KR2021020000

(87)【国際公開番号】W WO2022145944

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】10-2020-0189491

(32)【優先日】2020-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500578515

【氏名又は名称】サムヤン コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】110002837

【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ホン，ウンヨン

(72)【発明者】

【氏名】パク，ブス

(72)【発明者】

【氏名】イ，サンヒ

(72)【発明者】

【氏名】クォン，スンギュ

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ウンス

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AF04

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA10

4B065AA15X

4B065AA15Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC01

4B065CA21

4B065CA29

4B065CA41

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、組換えバチルス属微生物およびこれを用いた母乳オリゴ糖製造方法に関するものである。
【選択図】図１ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列と、これと作動可能に連結された調節配列を含み、
前記調節配列は恒常的発現プロモーターを含むものである、
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）微生物でα－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセット（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）。

【請求項2】

前記恒常的発現プロモーターは、ｐ３６１０、ｐ１２４５５、ｐ２４９３０、ｐＴｕ、およびｐＰＤＣからなる群より選択された１種以上である、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。

【請求項3】

前記調節配列は、配列番号２１の核酸配列を含むリボソーム結合部位（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）を含む、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。

【請求項4】

前記α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列は、配列番号１～５からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むものである、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。

【請求項5】

前記α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列は、配列番号６～１０からなる群より選択された１種以上の核酸配列を含むものである、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。

【請求項6】

前記遺伝子発現カセットは、ラクトース膜輸送タンパク質をコードする核酸配列を追加的に含むものである、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。

【請求項7】

前記ラクトース膜輸送タンパク質は、Ｌａｃ１２およびＬａｃＹからなる群より選択された１種以上である、請求項６に記載の遺伝子発現カセット。

【請求項8】

前記ラクトース膜輸送タンパク質の調節配列を追加的に含み、前記調節配列はプロモーターおよびＲＢＳからなる群より選択された１種以上である、請求項６に記載の遺伝子発現カセット。

【請求項9】

前記バチルス属微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群より選択された１種以上である、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。

【請求項10】

請求項１～９のうちのいずれか一項によるα－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセットを含むベクター。

【請求項11】

前記ベクターは、図１ａの切断地図を有する組換えベクターである、請求項１０に記載のベクター。

【請求項12】

請求項１～９のうちのいずれか一項による遺伝子発現カセットを含むか、前記発現カセットを含むベクターで形質転換された組換えバチルス属微生物。

【請求項13】

前記ベクターは、フコース合成遺伝子発現カセットを追加的に含むものである、請求項１２に記載の微生物。

【請求項14】

前記微生物は、フコース合成遺伝子発現カセットを含むベクターを追加的に含むものである、請求項１２に記載の微生物。

【請求項15】

前記フコース合成遺伝子発現カセットは、
ＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、ホスホマンノムターゼをコードする核酸配列、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＷｃａＧ）をコードする核酸配列、およびＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼをコードする核酸配列からなる群より選択された１種以上と、これと作動可能に連結された調節配列を含み、
前記調節配列は恒常的発現プロモーターを含むものである、請求項１３または１４に記載の微生物。

【請求項16】

前記フコース合成遺伝子発現カセットに含まれる調節配列は、ｐ３６１０、ｐ１２４５５、ｐ２４９３０、ｐ０７０６、ｐＴｕ、およびｐＰＤＣからなる群より選択された１種以上の恒常的発現プロモーターを含むものである、請求項１５に記載の微生物。

【請求項17】

前記フコース合成遺伝子発現カセットを含むベクターは、図１ｂの切断地図を有する組換えベクターである、請求項１４に記載の微生物。

【請求項18】

前記バチルス属微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群より選択された１種以上である、請求項１２に記載の微生物。

【請求項19】

請求項１２に記載の組換えバチルス属微生物を用いて得られたα－１，２－フコース転移酵素、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、２'－フコシルラクトース生産用組成物。

【請求項20】

請求項１～９のうちのいずれか一項による遺伝子発現カセットを含むか、前記発現カセットを含むベクターで形質転換された組換えバチルス属宿主細胞を培養する工程を含む、２’－フコシルラクトース（２’－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ）の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フコース転移酵素を生産する組換えバチルス属微生物およびこれを用いた母乳オリゴ糖製造方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

母乳中含量が最も高いオリゴ糖三つを含む１３７種がフコシル化されており、その比率が約７７％であり、残りのオリゴ糖は大部分シアル化されたもの（３９個）で約２８％に該当する。このうち、特に２’－フコシルラクトースと３’－フコシルラクトースは、プレバイオティク（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）効果、病原菌腸内付着抑制効果、そして免疫調節システム調節効果などを有する。Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ効果は、今まで最も多くの研究が行われ、母乳のオリゴ糖は、乳児の腸で初期に優占種として育つＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍの生育を選択的に増進させる反面、有害菌によっては用いられない。また、母乳オリゴ糖は病原菌の腸内付着を抑制すると知られており、これは腸内レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）と結合する病原菌の細胞壁多糖体構造が時々母乳オリゴ糖の一部構造と類似しているためである。したがって、母乳オリゴ糖が水溶性リガンド類似体を提供して、母乳授乳乳児が病原菌による感染に耐性を有すると見られる。しかし、女性の約２０％は、２’－フコシルラクトースを合成するフコース転移酵素の変異によって、体内でこれらを十分に合成できないと知られている。これによって、２’－フコシルラクトースの産業的生産が必要であるのが実情である。

【0003】

母乳オリゴ糖の一部は、大部分哺乳動物（霊長類、牛、豚、ヤギ、羊、象）の乳でも少量発見される。このうち、ヤギの乳が母乳オリゴ糖組成と最も類似しており、これによって、ヤギ乳チーズ生産工程の乳清副産物から大規模膜利用分離技術が提示された。また、最近開発された固相化学合成法（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用いると、一日内にＬｅｗｉｓ Ｘ－Ｌｅｗｉｓ Ｙ糖を生産することができ、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いることにより、２’－フコシルラクトースの速い合成が可能になった。しかし、前記分離法や化学的合成法の開発にもかかわらず、母乳オリゴ糖の産業化のための大量生産にはいくつかの障害が残っており、これは本技術の低い立体選択性、低い総収率と毒性試薬の使用などが食品または薬品産業に適しないためである。従って、より環境にやさしく収率の高い生産法が必要になり、最近、微生物による高濃度の２’－ＦＬ生産方法が報告される傾向にある。

【0004】

しかし、２’－フコシルラクトース生合成遺伝子は、Ｂｉｏ Ｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ ２菌株Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉから確保された２’－フコシルラクトースを使用して主に母乳授乳代替用粉乳および乳児用食品に適用時消費者の認識に否定的な要素として作用することがあり、国内生産販売許可に適しなかった。したがって、食品添加物としてより安定性の高い遺伝子を適用してＢｉｏ Ｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ １菌株開発を通じた２’－フコシルラクトース生産が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の一例は、α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列と、これと作動可能に連結された調節配列を含む、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）微生物でα－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセット（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を提供するためのものである。

【0006】

本発明のまた他の一例は、前記α－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセットを含むベクター（ｖｅｃｔｏｒ）を提供するためのものである。

【0007】

本発明のまた他の一例は、前記遺伝子発現カセットを含み、α－１，２－フコース転移酵素を生産する組換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）微生物を提供するためのものである。

【0008】

本発明のまた他の一例は、前記組換えバチルス属微生物を用いて得られたα－１，２－フコース転移酵素、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、２'－フコシルラクトース生産用組成物を提供するためのものである。

【0009】

本発明のまた他の一例は、前記遺伝子発現カセットを含む組換えバチルス属微生物を培養する工程を含む、２’－フコシルラクトース（２’－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ）の製造方法を提供するためのものである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列と、これと作動可能に連結された調節配列を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）微生物でα－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセット、前記遺伝子発現カセットを含む組換えバチルス属微生物、およびこれを用いて母乳オリゴ糖中２'－フコシルラクトースを生産する方法に関するものであって、多様な遺伝子変異を導入して組換えバチルス属微生物を製造し、前記微生物の２'－フコシルラクトース生産量を最適化する方法に関するものである。具体的に、本発明は、２'－フコシルラクトース合成に関与する酵素ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、ＷｃａＧ、Ｇｍｄの選別、基質であるｌａｃｔｏｓｅを菌株がよく用いることができるように分解経路遮断および膜輸送タンパク質（ｌａｃＹ）過発現、新規恒常的発現プロモーターの選別およびバチルス属微生物に導入して２'－フコシルラクトースを生産することに関するものである。

【0011】

本明細書で“発現カセット”は、発現対象核酸配列の発現に関与する遺伝子を含むものであって、前記α－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセットは、α－１，２－フコース転移酵素の生産に関与する遺伝子を含み、具体的にはα－１，２－フコース転移酵素のコーディング核酸配列に機能的に連結された調節配列を含む。したがって、発現ユニットと異なり、発現カセットは、転写および翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写および翻訳の結果としてタンパク質として発現されるのに必要な核酸配列を含む。

【0012】

本明細書で“調節配列”は、プロモーターを含み発現対象核酸配列または遺伝子に機能的に連結された後に前記核酸または前記遺伝子の発現、即ち、転写および翻訳を調節する発現活性を有する核酸を意味する。

【0013】

本明細書で“プロモーター”、“プロモーター活性を有する核酸分子”または“プロモーター配列”は、転写対象の目的核酸配列に機能的に連結されて前記目的核酸配列の転写を調節する核酸を意味する。

【0014】

転写対象核酸配列は、化学的意味で必ずしもプロモーターに直接連結を必要とするのではなく、追加的な遺伝子調節配列および／またはリンカー核酸配列などを含むことができる。転写対象目的核酸配列がプロモーター配列の下部に（即ち、プロモーター配列の３’末端に）位置する配列が好ましい。プロモーター配列と転写対象核酸配列の間の距離は、例えば、２００個塩基未満、または１００個塩基未満であってもよい。

【0015】

本明細書で“リボソーム結合部位（ＲＢＳ）”の配列（またはシャイン－ダルガノ配列とも称する）は、Ａ／Ｇリッチポリヌクレオチド配列を意味する。

【0016】

本明細書で“作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”は、一般的機能を果たすように核酸発現調節配列と目的とするタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されている状態を意味する。例えば、プロモーターとタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列が作動可能に連結されてコーディング配列の発現に影響を与えることができる。発現ベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られた遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡ切断および連結は当該技術分野で一般に知られた酵素などを使用することができる。

【0017】

本発明による全ての核酸分子は、好ましくは自然に存在しない形態（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であり、単離された核酸分子の形態または合成されたまたは組換え方法によって製造される核酸分子である。“単離された”核酸分子は、前記核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から除去され、追加的に、組換え技術によって製造される場合、本質的に他の細胞性物質または培養培地が存在しないか、化学的に合成される場合には化学的前駆体または他の化学物質が存在しないことになる。

【発明の効果】

【0018】

本発明は、バイオセーフティーレベル１（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １）であるＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）菌株を用いて２’－フコシルラクトースを生産することができ、安定性側面から消費者の憂慮がなく、２’－フコシルラクトース生産能に優れた組換えバチルス属微生物、およびこれを用いた２’－フコシルラクトース生産方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1a】本発明の一例によるベクター切断地図（ｃｌｅａｖａｇｅ ｍａｐ）である。

【図1b】本発明の一例によるベクター切断地図（ｃｌｅａｖａｇｅ ｍａｐ）である。

【図1c】本発明の一例による組換え微生物の２'－フコシルラクトース生合成経路を示した図である。

【図2】本発明の一例によってＸ－ｇａｌ実験を通じた野生型と△ＬａｃＺ変異株の表現型比較結果を示した図である。

【図3】本発明の一例によって時間による△ＬａｃＺ変異株と野生型のラクトース残存量比較結果を示した図である。

【図4】本発明の一例によって△ＬａｃＺ変異株への恒常的発現プロモーターの導入による２'－フコシルラクトース生産性効果を示した図である。

【図5】本発明の一例によって△ＬａｃＺ変異株へのＬａｃ１２導入による２'－フコシルラクトースの生産効果を示した図である。

【図6】本発明の一例によって△ＬａｃＺ変異株にＬａｃＹ導入による２'－フコシルラクトースの生産効果を示した図である。

【図7】本発明の一例によって△ＬａｃＺ変異株に多様なＧＤＰ－ｆｕｃ合成酵素の組み合わせを通じた生産性比較結果を示した図である。

【図8】本発明の一例によって△ＬａｃＺ変異株に多様なＧＤＰ－ｆｕｃ酵素と恒常的発現プロモーターを組み合わせた菌株別の２'－フコシルラクトースの生産比較結果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明の一例は、α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列と、これと作動可能に連結された調節配列を含む、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）微生物でα－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセット（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）に関するものである。

【0021】

本発明の一例によるα－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列と作動可能に連結された調節配列は、前記α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に作動可能なように連結され、転写プロモーターを含み、追加的にリボソーム結合部位（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）を含むことができる。

【0022】

本発明の一例によるα－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列と作動可能に連結された調節配列は、ｐ３６１０、ｐ１２４５５、ｐ２４９３０、ｐＴｕ（バチルス・メガテリウム１４５８１ｇｅｎｏｍｅ上のｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｔｕプロモーター）、およびｐＰＤＣ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅプロモーター）からなる群より選択された１種以上の恒常的発現プロモーターを含むものであってもよく、前記プロモーターは下記表１に例示的に記載する。前記プロモーターは、配列番号１１～１５からなる群より選択された１種以上の核酸配列を含むものであってもよい。一例として、前記プロモーターは、ｐ１２４５５および／またはｐＴｕプロモーターを含むものであってもよい。一例として、前記プロモーターは、配列番号１２および／または配列番号１４の核酸配列を含む核酸分子を含むものであってもよい。

【0023】

【表1】

【0024】

前記恒常的発現プロモーターは、その下部に位置するα－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列の転写を調節して２’－フコシルラクトース生産能を改善するものであり得る。具体的に、前記プロモーターは、２’－フコシルラクトース生産能をキシロース誘導プロモーター（ｐｘｙｌプロモーター）に対比して、１．０５倍以上、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．４５倍以上、１．５倍以上、１．５５倍以上、または１．６倍以上増加させるものであり得る。前記２’－フコシルラクトース生産能は、３０℃温度、ｐＨ７．０条件で測定されたものであり得る。

【0025】

前記恒常的発現プロモーターは、２’－フコシルラクトース生産能を改善するものであり得る。具体的に、前記調節配列は、２’－フコシルラクトース生産能をキシロース誘導プロモーター（ｐｘｙｌプロモーター）に対比して、１．０５倍以上、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、２．４倍以上、３倍以上、３．４倍以上、または３．９倍以上増加させるものであり得る。前記２’－フコシルラクトース生産能は、１８℃温度、ｐＨ７．０条件で測定されたものであり得る。

【0026】

前記恒常的発現プロモーターは、低温での２’－フコシルラクトース生産能を改善するものであり得る。前記低温は、例えば、１０～３０℃未満、１０～２９℃、１０～２８℃、１０～２７℃、１０～２６℃、１０～２５℃、１０～２４℃、１０～２３℃、１０～２２℃、１０～２１℃、１０～２０℃、１５～３０℃未満、１５～２９℃、１５～２８℃、１５～２７℃、１５～２６℃、１５～２５℃、１５～２４℃、１５～２３℃、１５～２２℃、１５～２１℃、または１５～２０℃、例えば１８℃の温度であり得る。具体的に、前記調節配列は、１８℃温度での２’－フコシルラクトース生産能を３０℃温度での２’－フコシルラクトース生産能に対比して、１倍超過、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．７５倍以上、１．８倍以上、または１．８５倍以上増加させるものであり得る。前記低温での２’－フコシルラクトース生産能を改善する恒常的発現プロモーターの具体的一例は、ｐ１２４５５であってもよく、一例として配列番号１２の核酸配列を有するものであってもよい。

【0027】

本発明の一例によるα－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列と作動可能に連結された調節配列は、リボソーム結合部位（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）を追加的に含むものであってもよく、具体的に、配列番号２１の核酸配列を含むＲＢＳ配列を追加的に含むものであってもよい。

【0028】

本発明による遺伝子発現カセットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）微生物でα－１，２－フコース転移酵素を発現するものであって、α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列は特に限定されず、例えば、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）またはバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）に由来したものであってもよい。例えば、前記α－１，２－フコース転移酵素は、配列番号１～５からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよい。

【0029】

具体的に、本発明の一例によるα－１，２－フコース転移酵素を下記表２に例示的に記載する。よって、前記α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列は、配列番号１～５からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子を含むことができる。

【0030】

【表2】

【0031】

例えば、前記α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列は、配列番号６～１０からなる群より選択された１種以上の核酸配列を含むものであってもよい。具体的に、本発明の一例によるα－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列を下記表３に例示的に記載する。

【0032】

【表3-1】

【0033】

【表3-2】

【0034】

本発明の一例によるα－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセットは、ラクトース膜輸送タンパク質（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ）をコードする核酸配列を追加的に含むものであってもよい。前記ラクトース膜輸送タンパク質は、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）またはバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のものであってもよい。

【0035】

例えば、前記ラクトース膜輸送タンパク質は、Ｌａｃ１２および／またはＬａｃＹであってもよい。具体的に、前記ラクトース膜輸送タンパク質は、配列番号１７および／または配列番号１８のアミノ酸配列を含むものであってもよい。さらに具体的に、前記Ｌａｃ１２は配列番号１７を有するものであってもよく、前記ＬａｃＹは配列番号１８を有するものであってもよい。

【0036】

例えば、前記ラクトース膜輸送タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１９および／または配列番号２０の核酸配列を含むものであってもよい。さらに具体的に、前記Ｌａｃ１２をコードする核酸配列は、配列番号１９の核酸配列を含むものであってもよく、前記ＬａｃＹをコードする核酸配列は、配列番号２０の核酸配列を含むものであってもよい。

【0037】

前記ラクトース膜輸送タンパク質は、２’－フコシルラクトース生産能を改善するものであり得る。具体的に、前記ラクトース膜輸送タンパク質をコードする核酸配列を追加的に含む遺伝子発現カセットは、ラクトース膜輸送タンパク質をコードする核酸配列を含まない遺伝子発現カセットに対比して、２’－フコシルラクトース生産能を、１．１倍以上、１．２倍以上、１．２５倍以上、または１．３倍以上増加させるものであり得る。前記２’－フコシルラクトース生産能は、３０℃温度、および７．０ｐＨ条件で測定されたものであり得る。

【0038】

具体的一例として、前記ラクトース膜輸送タンパク質はＬａｃＹであり、２’－フコシルラクトース生産能を改善するものであり得る。具体的に、ＬａｃＹをコードする核酸配列を含む遺伝子発現カセットは、Ｌａｃ１２をコードする核酸配列を含む遺伝子発現カセットに対比して、２’－フコシルラクトース生産能を、１．０５倍以上、１．１倍以上、１．１４倍以上、または１．１５倍以上増加させるものであり得る。前記２’－フコシルラクトース生産能は、３０℃温度、７．０ｐＨ条件で測定されたものであり得る。

【0039】

本発明の一例によるα－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセットは、前記ラクトース膜輸送タンパク質をコードする核酸配列の調節配列を追加的に含み、前記ラクトース膜輸送タンパク質をコードする核酸配列の調節配列は、プロモーターおよび／またはＲＢＳであってもよい。例えば、前記ラクトース膜輸送タンパク質をコードする核酸配列の調節配列は、配列番号２２の核酸配列を含むリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むものであってもよい。

【0040】

本発明の具体的一例によれば、前記バチルス属微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群より選択された１種以上のものであってもよく、一例としてバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）であってもよいが、これに制限されるわけではない。

【0041】

本発明の一例によるα－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセットは、５’末端から３’末端方向に順次に位置する、転写プロモーター、ＲＢＳ、およびα－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸分子を含むものであってもよい。好ましくは、前記遺伝子発現カセットは、５’末端から３’末端方向に順次に位置する、転写プロモーター、ＲＢＳ、α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸分子、およびラクトース膜輸送タンパク質をコードする核酸配列を含むものであってもよい。さらに好ましくは、前記遺伝子発現カセットは、５’末端から３’末端方向に順次に位置する、プロモーター、ＲＢＳ、α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸分子、ラクトース膜輸送タンパク質をコードする核酸配列の調節配列、およびラクトース膜輸送タンパク質をコードする核酸配列を含むものであってもよい。前記プロモーター、前記ＲＢＳ、前記ラクトース膜輸送タンパク質などは、前述の通りである。

【0042】

本発明の一例で、前記α－１，２－フコース転移酵素を発現する発現カセットは、発現のためのポリヌクレオチド配列であって、複製起点、リーダー（ｌｅａｄｅｒ）、選択可能なマーカ、クローニング部位および制限酵素認識部位からなる群より選択された１種以上の配列を追加的に含むことができる。

【0043】

本発明のまた他の一例は、本発明によるα－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセットを含むベクター（ｖｅｃｔｏｒ）、特にシャトルベクターまたはプラスミドベクターに関するものである。前記α－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセットは、前述の通りである。

【0044】

本発明の一例による組換えベクターは、当該技術分野に広く知られた方法を通じてクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築できる。前記組換えベクターは、遺伝子組換えに用いられるベクターであれば全て使用可能であり、例えば、プラスミド発現ベクター、ウイルス発現ベクター（例、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ連関ウイルス）およびこれらと同等な機能を果たすことができるウイルスベクターなどからなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるわけではない。

【0045】

例えば、前記組換えベクターは、ｐＭＭ１５２５、ｐＨＩＳ１５２５、ｐＳＴＯＰ１６２２、およびｐＭＧＢｍ１９ベクターなどからなる群より選択されたものから製作されたものであってもよく、例えばＰ３ｓｔｏｐ１６２３ ２ＲＢＳベクターであってもよい。

【0046】

前記遺伝子発現カセットのポリヌクレオチドは、それ自体で、または前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターの形態で使用できる。前記組換えベクターとは、作動可能なように連結された目的ポリヌクレオチドを伝達することができる組換え核酸分子を意味し、前記目的ポリヌクレオチドは、プロモーターおよび転写終結因子などからなる一つ以上の転写調節要素と作動可能に連結されているものであってもよい。

【0047】

一例として、前記ベクターは、図１ａの切断地図を有する組換えベクターであってもよい。

【0048】

本発明の一例によれば、前記ベクターは、α－１，２－フコース転移酵素を発現する発現カセットに加えて、フコース合成遺伝子発現カセットを追加的に含むものであってもよい。

【0049】

前記フコース合成遺伝子発現カセットは、フコース合成遺伝子をコードする核酸配列と、これと作動可能に連結された調節配列を含むものであってもよい。

【0050】

具体的に、前記フコース合成遺伝子発現カセットは、ＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＭａｎＣ）をコードする核酸配列、ホスホマンノムターゼ（ＨｙｐｏまたはＭｎＢ）をコードする核酸配列、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＷｃａＧ）をコードする核酸配列、およびＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（Ｇｍｄ）をコードする核酸配列からなる群より選択された１種以上と、これと作動可能に連結された調節配列を含むものであってもよい。好ましくは、前記フコース合成遺伝子発現カセットは、ＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＭａｎＣ）を含むものであってもよい。

【0051】

例えば、前記フコース合成遺伝子発現カセットは、配列番号２３～２６からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むものであってもよい。

【0052】

例えば、前記フコース合成遺伝子発現カセットは、配列番号２７～３０からなる群より選択された１種以上の核酸配列を含むものであってもよい。

【0053】

前記フコース合成遺伝子をコードする核酸配列と作動可能に連結された調節配列は、前記フコース合成遺伝子の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に作動可能なように連結され、転写プロモーターを含み、追加的にリボソーム結合部位（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）を含むことができる。

【0054】

例えば、前記フコース合成遺伝子をコードする核酸配列と作動可能に連結された調節配列は、ｐ３６１０、ｐ１２４５５、ｐ２４９３０、ｐ０７０６、ｐＴｕ、およびｐＰＤＣからなる群より選択された１種以上の恒常的発現プロモーターを含むものであってもよい。例えば、前記調節配列は、配列番号１１～１６からなる群より選択された１種以上を含むものであってもよい。一例として、前記調節配列は、ｐ１２４５５および／またはｐ０７０６プロモーターを含むものであってもよい。具体的に、前記調節配列は、配列番号１２および／または配列番号１６の核酸配列を含む核酸分子を含むものであってもよい。

【0055】

前記フコース合成遺伝子をコードする核酸配列と作動可能に連結された調節配列は、配列番号３１の核酸配列を含むリボソーム結合部位（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）を追加的に含むものであってもよい。

【0056】

本発明のまた他の一例は、本発明による少なくとも一つの遺伝子発現カセットを運搬するベクター、特にシャトルベクターまたはプラスミドベクターを含む組換え微生物、特にバチルス属微生物に関するものである。即ち、本発明のまた他の一例は、本発明による遺伝子発現カセットを含むか、前記発現カセットを含むベクターで形質転換された組換えバチルス属微生物に関するものである。

【0057】

前記組換えベクターで宿主細胞を形質転換する方法は、当業界に公知の全ての形質転換方法を特別な制限なく選択して使用することができ、例えば、細菌原形質体の融合、電気穿孔法、遺伝子銃法（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、およびウイルスベクターを使用した感染などから選択されたものであってもよい。

【0058】

本発明の一例による組換えバチルス属微生物は、導入されたα－１，２－フコース転移酵素を過発現することができ、したがって長期間安定的に高いα－１，２－フコース転換能を提供することができる。したがって、前記組換えバチルス属微生物は、α－１，２－フコース製造に有用に使用でき、α－１，２－フコース生産収率を向上させることができる。

【0059】

本発明の一例による組換えバチルス属微生物は、フコース合成能を有するか、フコース合成能が改善されたものであってもよい。具体的に、本発明の一例による組換え微生物は、フコース合成酵素、例えばＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ－４，６－ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＧＤＰ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＷｃａＧ）、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）、およびＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）からなる群より選択された１種以上を保有していることを特徴とすることができる。

【0060】

具体的な一例として、前記フコース合成能が改善された組換えバチルス属微生物は、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ－４，６－ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＧＤＰ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＷｃａＧ）、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）、およびＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が導入されたものであってもよい。

【0061】

具体的一例として、前記フコース合成能が改善された組換えバチルス属微生物は、ＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＭａｎＣ）が導入され、ホスホマンノムターゼ（Ｈｙｐｏ）は導入されていないものであってもよい。

【0062】

具体的一例として、前記フコース合成能が改善された組換えバチルス属微生物は、ホスホマンノムターゼ（Ｈｙｐｏ）が導入され、ＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＭａｎＣ）が導入されていないものであってもよい。

【0063】

具体的一例として、前記フコース合成能が改善された組換えバチルス属微生物は、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＷｃａＧ）が導入され、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（Ｇｍｄ）が導入されていないものであってもよい。

【0064】

具体的一例として、前記フコース合成能が改善された組換えバチルス属微生物は、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（Ｇｍｄ）が導入され、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）、および／またはＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が追加的に導入されたものであってもよい。

【0065】

具体的に、前記組換えバチルス属微生物は、前記組換えバチルス属微生物に導入されるベクターがフコース合成遺伝子発現カセットを含んでフコース合成能が改善されたものであるか、前記組換えバチルス属微生物がフコース合成遺伝子発現カセットを含むベクターを追加的に含んでフコース合成能が改善されたものであり得る。即ち、本発明の一例による組換えバチルス属微生物は、本発明によるα－１，２－フコース転移酵素を発現する遺伝子発現カセットを含むベクターと共に、フコース合成遺伝子を発現する遺伝子発現カセットを含む別途のベクターを追加的に含むものであり得る。一例として、前記フコース合成遺伝子発現カセットを含むベクターは、図１ｂの切断地図を有する組換えベクターであり得る。

【0066】

よって、本発明の一例による組換えバチルス属微生物は、α－１，２－フコース転移酵素の過発現特性と共に、フコース合成能が改善されてα－１，２－フコース生産収率がさらに向上できる。

【0067】

具体的に、前記フコース合成能を有するか、フコース合成能が改善された組換えバチルス属微生物は、フコース合成能を有しない対照群に対比して、２’－フコシルラクトース生産能が、１．０５倍以上、１．１倍以上、１．１５倍以上、または１．１８倍以上増加させるものであり得る。前記フコース合成能を有しない対照群は、例えば、フコース合成遺伝子を過発現していない対照群、またはフコース合成遺伝子を導入していない対照群であり得る。一例として、前記対照群は、ラクトース膜輸送タンパク質を発現し、恒常的発現プロモーターと連結されたフコース転移酵素が導入されたが、フコース合成遺伝子は導入されていない△ＬａｃＺ変異株であり得る。

【0068】

本発明の一例による組換えバチルス属微生物は、ラクトース分解酵素の活性が減少するか除去されたものであってもよい。具体的に、前記微生物は、ＬａｃＺ遺伝子が除去されたものであってもよい。

【0069】

本発明の具体的一例によれば、前記バチルス属微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群より選択された１種以上であってもよく、一例としてバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）であってもよいが、これに制限されるわけではない。

【0070】

本発明のまた他の一例は、本発明による組換えバチルス属微生物を用いて得られたα－１，２－フコース転移酵素、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、２'－フコシルラクトース生産用組成物に関するものである。前記組換えバチルス属微生物、前記α－１，２－フコース転移酵素、前記２'－フコシルラクトースなどは、前述の通りである。

【0071】

前記培養物は、前記バチルス属微生物から生産された酵素を含むものであって、前記微生物を含むか、前記微生物を含まない無細胞（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ）形態であってもよい。前記破砕物は、前記バチルス属微生物を破砕した破砕物または前記破砕物を遠心分離して得られた上清液を意味するものであって、前記バチルス属微生物から生産された酵素を含むものである。本明細書において、別途の言及がない限り、２'－フコシルラクトース製造に使用されるバチルス属微生物は、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、および前記微生物の破砕物からなる群より選択された１種以上を意味するものとして使用される。

【0072】

本発明のまた他の一例は、本発明による遺伝子発現カセットを含むか、前記発現カセットを含むベクターで形質転換された組換えバチルス属宿主細胞を培養する工程を含む、２’－フコシルラクトース（２’－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ）の製造方法に関するものである。前記遺伝子発現カセット、前記発現カセットを含むベクター、前記組換えバチルス属宿主細胞などは、前述の通りである。

【0073】

具体的一例として、前記遺伝子発現カセットは、調節配列としてｐ１２４５５の恒常的発現プロモーターを含み、低温で２’－フコシルラクトース生産能が改善されるものであり得る。一例として、前記調節配列は、ｐ１２４５５の恒常的発現プロモーターを含み、前記培養する工程は、１０～２５℃温度で培養することであり得る。

【0074】

前記製造方法は、培養物から得られたα－１，２－フコース転移酵素、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上をラクトース含有原料と反応して、２'－フコシルラクトースを生産することであり得る。

【実施例】

【0075】

以下、本発明を下記の実施例によってさらに詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって限定されるのではない。

【0076】

実施例１．ｌａｃｔｏｓｅ分解酵素が除去されたバチルス属微生物製造
１－１： △ＬａｃＺ変異株製造
本発明で微生物開発に選定したバチルス・メガテリウム（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）１４５８１は、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）で寄託番号４０４４１で入手した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ １４５８１遺伝子内にｂ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（以下、ＬａｃＺ）をｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ方法を通じて除去し、遺伝子が除去されたかどうかはｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを通じてもう一度確認した。

【0077】

１－２： 表現型を通じたＬａｃＺ欠失確認
確保した△ＬａｃＺ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ １４５８１菌株の表現型が変化したか確認するために、ｘ－ｇａｌ実験を行った。図２のように野生型の場合、ＬａｃＺ遺伝子を保有するためｘ－ｇａｌを分解して青色を帯びる反面、本実施例で製造された△ＬａｃＺ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ １４５８１変異株の場合、ｘ－ｇａｌを分解しなくて菌株本来の白色を維持することを確認した。

【0078】

１－３： ラクトース分解能を通じたＬａｃＺ欠失確認
変異株のラクトース分解程度を観測するために、前記製造された△ＬａｃＺ変異株にラクトースを入れて時間によるラクトース量の変化をＨＰＬＣ分析を通じて確認した。図３に示されているように、前記製造された△ＬａｃＺ変異株は、野生型と異なり、ラクトースの残存量が維持されるのを確認した。

【0079】

実施例２．△ＬａｃＺ_変異株で恒常的発現プロモーター探索および温度特性確認
２－１： フコース転移酵素スクリーニング
生産しようとするバチルス・メガテリウム（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）１４５８１は、フコース転移酵素を保有しておらず、２’－フコシルラクトースの生産が不可能である。したがって、フコース転移酵素を人為的に導入しようとし、酵素としてはＢｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １菌株に由来したα－１，２－フコース転移酵素５種を選別した。選別されたフコース転移酵素を表２に示した。表２で配列番号１のフコース転移酵素は、アッカーマンシア・ムシニフィラ由来であり、Ａｍ２ＦＴ_２と命名した。配列番号２～４のフコース転移酵素はバチルス・メガテリウム由来であり、それぞれＢｍ２ＦＴ、Ｂｍ２ＦＴ_２、およびＢｍ２ＦＴ_３と命名した。配列番号５のフコース転移酵素はバチルス属由来であり、Ｂｓ２ＦＴと命名した。
選別された５種酵素の２’－フコシルラクトース生産活性を確認するために、５種の酵素プラスミドをそれぞれバチルス・メガテリウムにｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ後、３７℃で育てた。それぞれのｐｌａｔｅで２つのｃｏｌｏｎｙを接種して、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅを行った。ｓｅｅｄ ２００μＬを２２ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅが添加された４ｍＬ培地に添加して、３０℃で反応を行った。２０ｈ後、ＨＰＬＣで分析した。２’－フコシルラクトース生産活性を確認した結果、Ａｍ２ＦＴ_２は約５（ｍｇ／Ｌ）、Ｂｍ２ＦＴは約１５（ｍｇ／Ｌ）、Ｂｍ２ＦＴ_２は約３（ｍｇ／Ｌ）、Ｂｍ２ＦＴ_３は約４（ｍｇ／Ｌ）、およびＢｓ２ＦＴは約１（ｍｇ／Ｌ）の２’－フコシルラクトースを生成し、５種酵素全て２ＦＬ生産活性を有することを確認した。このうち、Ｂｍ２ＦＴ酵素を代表的に選定して以後の実験に使用した。

【0080】

２－２： 恒常的発現プロモーターの探索
バチルス・メガテリウム内組換えタンパク質を過発現するために従来に主に使用されるプロモーターは、キシロース誘導プロモーター（以下、ｐＸｙｌ）である。キシロースの添加がなくてもタンパク質を過発現するために、恒常的発現プロモーターをバチルス・メガテリウム１４５８１ ｇｅｎｏｍｅ上で探索した。ベクター形態でＢｍ２ＦＴ遺伝子を過発現しようとキシロース誘導プロモーターを代替するｐ３６１０、ｐ１２４５５、ｐ２４９３０恒常的発現プロモーターを最終的に選択して、Ｂｍ２ＦＴを発現するようにプラスミドを製作し、これを実施例１で製造したＬａｃＺ欠失菌株に形質転換して最終２'－フコシルラクトースの生産をＨＰＬＣ分析を通じて確認した。
具体的に、ＯＤ₆₀₀が～０．８程度になるとき、２２ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅを入れた後、２０ｈ後にＨＰＬＣで分析した。５ ｔｅｓｔ ｔｕｂｅ反応の場合、ｓｅｅｄ ２００μＬを２２ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅが添加された４ｍＬ培地に添加後、ＨＰＬＣで分析した。
恒常的発現プロモーターの導入による２'－フコシルラクトース生産性効果を表４および図４に示した。３種恒常的発現プロモーターを導入時、ｐＨ７．０および３０℃温度で既存ｐｘｙｌに対比して全て増大された２'－フコシルラクトースの生産性を示し、特にｐ１２４５５の場合、ｐＸｙｌに対して生産性が６０％以上増大した。

【0081】

【表4】

【0082】

２－３： 低温での生産性評価
それぞれのプロモーターの低温での生産性の変化を確認するために、Ｂｍ２ＦＴに恒常的発現プロモーターを導入した菌株５種をそれぞれ１８℃温度で６５時間培養後、時間による２'－フコシルラクトースの生産をＨＰＬＣ分析を通じて確認し、２ＦＬ生産量（ｍｇ／Ｌ）を表５に示した。表５に示されているように、ｐ１２４５５の場合、低温で生産性が約１．８倍以上向上することが分かった。

【0083】

【表5】

【0084】

実施例３．ラクトース膜輸送タンパク質を発現する△ＬａｃＺ変異株で恒常的発現プロモーター探索
３－１： Ｌａｃ１２導入
Ｌａｃｔｏｓｅを細胞内にさらに多く導入するために、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のラクトース膜輸送タンパク質（以下、Ｌａｃ１２）を実施例２で製造した恒常的発現プロモーターｐ１２４５５が導入された△ＬａｃＺバチルス・メガテリウムに導入して、その効果を確認した。プラスミド形態でＬａｃ１２とＢｍ２ＦＴをｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃなように導入して、３０℃温度、ｐＨ７で培養後、６５時間以後のその生産量をＢｍ２ＦＴのみ導入された菌株と比較分析して、表６および図５に示した。表６および図５に示されているように、Ｂｍ２ＦＴのみを導入した時に対比して、Ｌａｃ１２を共に導入した場合に、その生産量が３０％以上増大することを確認した。

【0085】

【表6】

【0086】

３－２： ＬａｃＹ導入
バチルス・メガテリウム由来のラクトース膜輸送タンパク質（以下、ＬａｃＹ）をプラスミド形態で菌株に導入して、その効果を、３０℃温度、ｐＨ７で培養後に確認して、実施例３－１でＬａｃ１２を導入した変異株の活性１００％を基準にして示した。表７および図６に示されているように、Ｌａｃ１２に対比して２'－フコシルラクトースの生産が約１５％以上増大することを確認した。

【0087】

【表7】

【0088】

実施例４．主要ＧＤＰ－ｆｕｃ合成遺伝子選別
バチルス・メガテリウム１４５８１菌株のＧＤＰ－ｆｕｃ合成酵素４種であるＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（以下、Ｇｍｄ）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（以下、ＷｃａＧ）、ホスホマンノムターゼ（以下、ＨｙｐｏまたはＭａｎＢ）、およびＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（以下、ＭａｎＣ）４種酵素を、恒常的発現プロモーターを使用して過発現されるようにプラスミド形態に形質転換して、生産性を向上させようとした。具体的に、５０μｌプラスミドをｌｙｓｏｚｍｅを処理した５００ｍｌ ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔと混合した。ＰＥＧ－Ｐ １．５ｍＬが入っている１５ｍＬファルコンに５ｍＬ ＳＭＭＰを添加し、慎重にファルコンを転がして混合した。１３００ｇで１０分遠心分離して細胞収去後、ＳＭＭＰに細胞を解いて、１．５ｍＬ ３７℃で２５０ｒｐｍ ｓｈａｋｉｎｇして、形質転換を完了した。
製作が完了した菌株を使用して、３０℃温度、ｐＨ７で８０時間反応を行い、表８および図７に示されているように、製作して生産性を確認した多様な組み合わせのうちＭａｎＣ、Ｈｙｐｏ、ＷｃａＧ、Ｇｍｄが同時発現された時の生産性がＧＤＰ－ｆｕｃ合成酵素を過発現していない対照群△ＬａｃＺ_ｐ１２４５５_Ｂｍ２ＦＴ_Ｌａｃ１２に対比して、約１５％以上増大することを確認した。このような傾向は、ＭａｎＣのみを組換えタンパク質形態で発現する際にも示され、ＭａｎＣをプラスミド形態で導入していない対照群△ＬａｃＺ_ｐ１２４５５_Ｂｍ２ＦＴ_Ｌａｃ１２に対比して、約１５％以上増大する２'－フコシルラクトース生産性を確認した。

【0089】

【表8】

【0090】

実施例５．２'－フコシルラクトースの生産性確認
最終的に製作された菌株の生産性を比較するために、３０℃温度、ｐＨ７でラクトースを添加して６５時間培養後、２'－フコシルラクトースの生産を比較した。ＧＤＰ－ｆｕｃ酵素と恒常的発現プロモーターの多様な組み合わせを通じて、菌株別２'－フコシルラクトースの生産性を比較した（表９および図８）。

【0091】

【表9】

【0092】

表９および図８に示されているように、野生型Ｂ． ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ １４５８１の場合、２'－フコシルラクトースを生産することができないが、α－１，２－フコース転移酵素導入、多様な恒常的発現プロモーター導入、ＬａｃＺ除去、ラクトース膜輸送タンパク質導入、ＧＤＰ－ｆｕｃ合成酵素導入などによって、従来のキシロース誘導プロモーターに対比して、顕著に高い２'－フコシルラクトース生産性を達成することができた。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】