ホーム > 特許ランキング > ＢＩＯＣＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-17
(54)【発明の名称】テデュグルチドの合成
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20240110BHJP
C07K 14/575 20060101ALN20240110BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
C07K14/575
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540754
(86)(22)【出願日】2022-01-03
(85)【翻訳文提出日】2023-09-01
(86)【国際出願番号】 IB2022050013
(87)【国際公開番号】W WO2022144860
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】202141000174
(32)【優先日】2021-01-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508159156
【氏名又は名称】バイオコン・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＣＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ガンガ ラム，ヴァサンサクマール
(72)【発明者】
【氏名】パティル，ニティン
(72)【発明者】
【氏名】スヴァルナ，ディーパ シャンカール
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA18
4H045DA30
4H045EA25
4H045FA33
4H045FA61
4H045GA25
(57)【要約】
本発明は、アスパラギン酸の側鎖カルボン酸基を固体支持体に固定することにより、様々な不純物の形成を回避し、それにより収率が高くなり、精製プロセスが容易になる、Ｃ末端アスパラギン酸を有するペプチドの固相合成の新規な合成アプローチを提供する。本発明はさらに、全体的な切断および固体支持体からのペプチドの単離中に形成される酸化性不純物の形成を無効にするための、切断カクテルにおける抗酸化剤としての遊離アミノ酸および還元剤の使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ、ｂ）カップリング剤の存在下、および任意にカオトロピック塩（単数または複数）の存在下、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステップ、
ｃ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｄ）任意に粗製テデュグルチドを精製するステップ、
を含むテデュグルチドの調製のためのプロセス。
【請求項2】
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）、ｂ）カップリング剤の存在下、および任意にカオトロピック塩（単数または複数）の存在下、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステップ、
ｃ）Ｆｍｏｃ基の脱保護のためのピペリジン：ギ酸：ＤＢＵ混合物の使用、
ｄ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｅ）任意に粗製テデュグルチドを精製するステップを含む、請求項１に記載のテデュグルチドの調製のためのプロセス。
【請求項3】
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）、ｂ）カップリング剤およびカオトロピック塩の存在下で、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステップ、
ｃ）保護基を除去し、切断カクテル（ｃｌｅａｖａｇｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を使用して樹脂からペプチドを切断することにより、粗製テデュグルチドが得られる、
ｄ）酸化不純物を減らすための切断カクテルにおける遊離アミノ酸の使用、
ｅ）粗製テデュグルチドの精製
を含み、ここで、遊離アミノ酸はメトニン、トリプトファンおよびヒスチジンから選択される、テデュグルチドの調製のためのプロセス。
【請求項4】
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）、ｂ）カップリング剤およびカオトロピック塩（単数または複数）の存在下で、側鎖保護アミノ酸を順次カップリングしてテデュグルチドを調製するステップ、
ｃ）Ｆｍｏｃ基の脱保護のためのピペリジン－ギ酸－ＤＢＵ混合物の使用、
ｄ）粗製テデュグルチドは、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｅ）酸化不純物を減らすための切断カクテルにおける遊離アミノ酸とＢＨＴの使用、
ｌ）粗製テデュグルチドの精製、
を含み、ここで、遊離アミノ酸はメトニン、トリプトファンおよびヒスチジンから選択される、テデュグルチドの調製のための方法。
【請求項5】
切断溶液が、抗酸化剤、アミノ酸およびＴＦＡカクテルを含む、切断溶液を使用して固体支持体からテデュグルチドを切断するためのプロセス。
【請求項6】
アミノ酸が、メトニン、トリプトファンおよびヒスチジンから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
酸化防止剤が、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）から選択される、請求項５に記載のプロセス。
【請求項8】
モノ保護されたヒスチジンが使用される、テデュグルチドの調製方法。
【請求項9】
使用される保護基がｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願：
本出願は、２０２１年１月４日に出願されたインド特許出願ＩＮ２０２１４１０００１７４の優先権の利益を主張し、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１月４日に出願されたインド特許出願ＩＮ２０２１４１０００１７４の優先権の利益を主張し、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
技術分野
本発明は、式－Ｉで表されるテデュグルチドの効率的な固相合成に関する。
本発明は、式－Ｉで表されるテデュグルチドの効率的な固相合成に関する。
【化1】
【背景技術】
【0003】
背景
ＧＡＴＴＥＸ（登録商標）（テデュグルチド）は、非経口サポートに依存している成人および１歳以上の短腸症候群（ＳＢＳ）の小児患者の治療を適応とするグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログである。
注射用ＧＡＴＴＥＸ（テデュグルチド）の有効成分はテデュグルチドで、組換えＤＮＡ技術によって改変された大腸菌株を使用して製造された３３アミノ酸のグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）類似体である。
ＧＡＴＴＥＸ（登録商標）（テデュグルチド）は、非経口サポートに依存している成人および１歳以上の短腸症候群（ＳＢＳ）の小児患者の治療を適応とするグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）アナログである。
注射用ＧＡＴＴＥＸ（テデュグルチド）の有効成分はテデュグルチドで、組換えＤＮＡ技術によって改変された大腸菌株を使用して製造された３３アミノ酸のグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）類似体である。
【0004】
テデュグルチドの化学組成は、Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－グリシル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グリシル－Ｌ－セリル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－セリル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタミル－Ｌ－メチオニル－Ｌ－アスパラギニル－である。Ｌ－スレオニル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－ロイシル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－アスパラギニル－Ｌ－ロイシル－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニル－Ｌ－アルギニル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－フェニルアラニルＬ－イソロイシル－Ｌ－アスパラギニル－Ｌ－トリプトファニル－Ｌ－ロイシル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－グルタミニル－Ｌ－トレオニル－Ｌ－リシル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－トレオニル－Ｌ－アスパラギン酸。
テデュグルチドの分子量は３７５２ダルトンである。テデュグルチド原薬は、無色透明から淡い麦わら色の液体である。
テデュグルチドの分子量は３７５２ダルトンである。テデュグルチド原薬は、無色透明から淡い麦わら色の液体である。
【0005】
米国特許第５，７８９，３７９Ｂ１号には、テデュグルチドおよびその製造方法が開示される。
従来技術開示の多くの刊行物には、テデュグルチドのフラグメント相合成を教示される。
ＷＯ２０１２０２８６０２Ａ１には、最初に位置１～４および５～３３でアミノ酸断片を合成し、次いでそれらをカップリングしてテデュグルチドを得る、テデュグルチドの断片相合成が開示される。
従来技術開示の多くの刊行物には、テデュグルチドのフラグメント相合成を教示される。
ＷＯ２０１２０２８６０２Ａ１には、最初に位置１～４および５～３３でアミノ酸断片を合成し、次いでそれらをカップリングしてテデュグルチドを得る、テデュグルチドの断片相合成が開示される。
【0006】
ＣＮ１０４０７２６０５Ａには、テデュグルチドの３つのフラグメント相合成法が開示される。１つは、まず位置１～９、１０～１８、および１９～３３のアミノ酸断片を合成し、次に各断片を組み合わせてテデュグルチドを得る方法である。第二に、まず１～４、５～１２、１３～２０、２１～３３のアミノ酸フラグメントを合成し、次に各フラグメントを結合してテデュグルチドを得る。第三に、まず１～４、５～９、１０～１８、１９～２６、２７～３３のアミノ酸フラグメントを合成し、次に各フラグメントをカップリングしてテデュグルチドを得る。
ＣＮ１０４４１８９４９Ａには、まず１～３位および４～３３位のアミノ酸フラグメントを合成し、次にそれらをカップリングしてテデュグルチドを得る、テデュグルチドの調製方法が開示される。
ＣＮ１０４４１８９４９Ａには、まず１～３位および４～３３位のアミノ酸フラグメントを合成し、次にそれらをカップリングしてテデュグルチドを得る、テデュグルチドの調製方法が開示される。
【0007】
ＣＮ１０４８１７６３８には、フラグメント１－２、３－４および５－３３を合成し、前記フラグメントを結合させてテデュグルチドを得る方法が開示される。
ＣＮ１０４０７２６０３には、Ｈｉｓ残基をフラグメント２－３３とカップリングすることによるテデュグルチドの合成が開示される。
ＣＮ１０４０７２６０３には、Ｈｉｓ残基をフラグメント２－３３とカップリングすることによるテデュグルチドの合成が開示される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上記の特許に記載されている合成方法は、まずフラグメントを合成し、次にフラグメントを接続してテデュグルチドを合成するものである。これらの方法は、接続する２つ以上のポリペプチド断片の合成を要求する。このアプローチは、断片を固体支持体上で１つずつ接続する必要があり、その後完全な保護が切断され、その後、断片が１つずつ接続される。最大の問題は、フラグメントが完全に保護された切断を受けると、一部の側鎖保護基が脱落し、その後の液相接続中にフラグメントの不純物が導入される可能性があることである。同時に、完全に保護されたフラグメントの純度が低い場合、これらのフラグメントを精製する必要がある可能性があり、プロセスがさらに複雑になる。第二に、フラグメントの縮合プロセスにおいて、反応を確実に完了させるために、通常、複数の量のフラグメントを供給する必要があり、その結果、大量の材料の無駄が生じる。さらに、フラグメントライゲーションのプロセスではアミノ酸のラセミ化が避けられないことが多く、これもその後の精製に大きな課題をもたらす。
本発明／明細書の利点：
本発明／明細書の利点：
【0009】
ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ－／ｔＢｕ戦略による標準的な固相アプローチによって達成され得る。しかしながら、合成中には複数の副反応が発生し、最終製品の収率と品質に影響を与える。
【0010】
本発明は、アスパラギン酸の側鎖カルボン酸基を固体支持体に固定することにより、様々な不純物の形成を回避し、それにより収率が高くなり、精製プロセスが容易になる、Ｃ末端アスパラギン酸を有するペプチドの固相合成の新規な合成アプローチを提供する。主要な不純物の１つは、ジケトピペラジン（ＤＫＰ）不純物の形成である。ＤＫＰは、欠失配列をもたらす固相ペプチド合成における副反応の１つによって生ずる。分子間環化は、Ｗａｎｇ樹脂に結合したジペプチドのＮ末端からＦｍｏｃ基が脱保護される際に発生する。
【0011】
本発明は、Ｃ末端アスパラギン酸を有する広範な種類のペプチドの固相合成に有用である。このクラスのペプチドの顕著な例は、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、オステオポンチンなどを含む多くのマトリックスタンパク質内に見られるアルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチドである。エプチフィバチドも別の例である。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明／明細書は、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨのα－カルボキシル基に対して、第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を側鎖カルボキシル基（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）を介してＷａｎｇ樹脂に固定することにより、標準的な手順が使用され、テデュグルチドの製造方法における上記問題を解決し、ＤＫＰ不純物の形成を最小限に抑えるものである。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕを使用する場合、７員環を形成する必要があるが、これは困難であるが、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨを使用する場合は、速度論的に安定した６員環ジケトピペラジンの形成が観察され、これによりＷａｎｇ樹脂からのペプチドの浸出が起こり、Ｔｈｒ－Ａｓｐクリップ不純物が生じる。したがって、本発明／明細書の本態様は、ジケトピペラジン不純物の形成が回避されるテデュグルチドの合成を提供する。
【0013】
ａ）アスパラギン酸の側鎖カルボキシル基を固体支持体に固定する役割：ジケトピペラジン（ＤＫＰ）不純物：
一般的なハードルの１つは、ジケトピペラジン（ＤＫＰ）不純物の生成である。ＤＫＰは、欠失配列をもたらす固相ペプチド合成における副反応の１つによって生じる。分子間環化は、Ｗａｎｇ樹脂に結合したジペプチドのＮ末端からＦｍｏｃ基が脱保護される際に発生する。テデュグルチドの場合、第１の２つのアミノ酸がアスパラギン酸とスレオニンであるため、分子間環化により樹脂からペプチドが浸出して、配列内の３番目のアミノ酸がＷａｎｇ樹脂に結合し、ＤｅｓＴｈｒ－Ａｓｐ不純物が形成される。
一般的なハードルの１つは、ジケトピペラジン（ＤＫＰ）不純物の生成である。ＤＫＰは、欠失配列をもたらす固相ペプチド合成における副反応の１つによって生じる。分子間環化は、Ｗａｎｇ樹脂に結合したジペプチドのＮ末端からＦｍｏｃ基が脱保護される際に発生する。テデュグルチドの場合、第１の２つのアミノ酸がアスパラギン酸とスレオニンであるため、分子間環化により樹脂からペプチドが浸出して、配列内の３番目のアミノ酸がＷａｎｇ樹脂に結合し、ＤｅｓＴｈｒ－Ａｓｐ不純物が形成される。
【0014】
【化2】
【0015】
本発明／明細書は、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨのα－カルボキシル基に対して、第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を側鎖カルボキシル基（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）を介してＷａｎｇ樹脂に固定することにより、標準的な手順が使用され、テデュグルチドの製造方法における上記問題を解決し、ＤＫＰ不純物の形成を最小限に抑えるものである。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕを使用する場合、７員環を形成する必要があるが、これは困難であるが、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨを使用する場合は、速度論的に安定した６員環ジケトピペラジンの形成が観察され、これによりＷａｎｇ樹脂からのペプチドの浸出が起こり、Ｔｈｒ－Ａｓｐクリップされた(Clipped)不純物が生じる。したがって、本発明／明細書の本態様は、ジケトピペラジン不純物の形成が回避されるテデュグルチドの合成を提供する。
【0016】
【表1】
【0017】
ｂ）樹脂からペプチドを切断するためのＴＦＡカクテルにおける遊離アミノ酸と抗酸化剤の役割：
【0018】
配列中にトリプトファンとメチオニンが存在することは、樹脂からのペプチドの切断および単離中に酸化につながり、これは、不純物の生成、収率の低下、およびこれらの不純物を除去するための精製ステップの追加をもたらし、プロセスが非経済的になる。本発明／明細書の態様の１つは、対応する遊離アミノ酸を切断カクテルに組み込むことによって上記の問題を解決する。遊離トリプトファンおよびメチオニンアミノ酸の添加は、酸化性不純物を最小限に抑えるのに有利であることが判明した。本発明／明細書はさらに、切断カクテルにおけるＢＨＴなどから選択される抗酸化剤の使用を含む。これらの追加のスカベンジは、酸化充填を目的のペプチドと共有し、ひいては酸化性不純物を最小限に抑える。本発明は、ペプチドの切断および単離中に酸化を受け得る配列中にトリプトファンおよびメチオニンを含むペプチドにおいて特に有用である。本発明の非限定的な例は、テデュグルチド、グルカゴンなどである。
【0019】
【化3】
【0020】
【化4】
【0021】
ｃ）Ｂｏｃ－Ｈｉｓ－ＯＨを使用する利点：
従来技術の方法は、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、ジ－Ｂｏｃ基、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）－ＯＨなどのヒスチジンに対する二重保護を使用する。二保護されたＨｉｓのカップリングは立体障害により遅く、ラセミ化を引き起こす可能性がある。さらに、二保護されたアミノ酸誘導体は、不要なτ異性体を分離するためにクロマトグラフィー技術または結晶化による追加の精製を必要とするため、大規模製造はコスト効率的ではない。一方、Ｈｉｓの保護されていないイミダゾール基はイミダゾール環のπ窒素を介してペプチドの伸長を引き起こす可能性があり、Ｈｉｓが配列の途中にある場合はかなりのラセミ化が可能である。Ｈｉｓはテデュグルチド配列の最後のアミノ酸であるため、Ｈｉｓの二保護は必須ではない。これにより、高価な二保護アミノ酸の使用が回避される。さらに、現在使用されているカップリング条件は、ラセミ化を大幅に回避する。したがって、遊離側鎖を持つヒスチジンアミノ酸の使用は、テデュグルチドの製造プロセス中に問題を引き起こすことはない。
従来技術の方法は、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、ジ－Ｂｏｃ基、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）－ＯＨなどのヒスチジンに対する二重保護を使用する。二保護されたＨｉｓのカップリングは立体障害により遅く、ラセミ化を引き起こす可能性がある。さらに、二保護されたアミノ酸誘導体は、不要なτ異性体を分離するためにクロマトグラフィー技術または結晶化による追加の精製を必要とするため、大規模製造はコスト効率的ではない。一方、Ｈｉｓの保護されていないイミダゾール基はイミダゾール環のπ窒素を介してペプチドの伸長を引き起こす可能性があり、Ｈｉｓが配列の途中にある場合はかなりのラセミ化が可能である。Ｈｉｓはテデュグルチド配列の最後のアミノ酸であるため、Ｈｉｓの二保護は必須ではない。これにより、高価な二保護アミノ酸の使用が回避される。さらに、現在使用されているカップリング条件は、ラセミ化を大幅に回避する。したがって、遊離側鎖を持つヒスチジンアミノ酸の使用は、テデュグルチドの製造プロセス中に問題を引き起こすことはない。
【0022】
ｄ）溶媒としてγ－バレロラクトンを使用し、カップリング剤としてＣＯＭＵ／ＨＣＴＵ／Ｔ３Ｐを使用する利点：
ペプチド合成では、カップリング試薬の選択は配列と入ってくるアミノ酸に基づいて異なる。ＣＯＭＵ／ＨＣＴＵ／Ｔ３Ｐは、カップリング中に使用されるより高度なカップリング試薬である。特にＣＯＭＵはより効率的な試薬であり、ＨＡＴＵやＨＢＴＵと比較してラセミ化を軽減し、危険性が低い安全性プロファイルを備える。その一方で、ＨＣＴＵとＴ３Ｐは効率的でコスト効率に優れている。本発明／明細書において、ＣＯＭＵ／ＨＣＴＵ／Ｔ３Ｐを溶媒としてのγ－バレロラクトンと組み合わせてカップリング剤として使用した場合、試薬は安定であり、これらの条件がラセミ化を抑制したことが判明した。上記の組み合わせは環境にも優しい。
ペプチド合成では、カップリング試薬の選択は配列と入ってくるアミノ酸に基づいて異なる。ＣＯＭＵ／ＨＣＴＵ／Ｔ３Ｐは、カップリング中に使用されるより高度なカップリング試薬である。特にＣＯＭＵはより効率的な試薬であり、ＨＡＴＵやＨＢＴＵと比較してラセミ化を軽減し、危険性が低い安全性プロファイルを備える。その一方で、ＨＣＴＵとＴ３Ｐは効率的でコスト効率に優れている。本発明／明細書において、ＣＯＭＵ／ＨＣＴＵ／Ｔ３Ｐを溶媒としてのγ－バレロラクトンと組み合わせてカップリング剤として使用した場合、試薬は安定であり、これらの条件がラセミ化を抑制したことが判明した。上記の組み合わせは環境にも優しい。
【0023】
ｅ）全体的切断後のペプチドの単離中にＡＣＮおよびＭＩＢＫを使用する利点：
全体的切断後、ペプチドを含むＴＦＡカクテルを濃縮し、貧溶媒としてＭＴＢＥ、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどのエーテルを使用して粗製ペプチドの沈殿を実施した。ペプチドの沈殿に貧溶媒としてエーテルを使用する場合、粗製ペプチドのアッセイ率は２０～２５％に低下する。これは、側鎖保護基とスカベンジャー付加物が目的のペプチドとともに沈殿するためである。粗製ペプチドのアッセイは、ＡＣＮまたはＭＩＢＫで粗製ペプチドを沈殿させることにより増加する。付加物は母液中に残り、濾過中に除去される。さらに、テデュグルチドは、その配列中にメチオニン、トリプトファン、ヒスチジンなどのアミノ酸が存在するため、酸化されやすい。エーテルには微量の過酸化物が含まれており、酸化不純物の増加につながることが知られている。アセトニトリルの使用は、酸化不純物の低減に大きく貢献した。粗製ペプチドの純度およびアッセイ比較を以下に表に示する。
全体的切断後、ペプチドを含むＴＦＡカクテルを濃縮し、貧溶媒としてＭＴＢＥ、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどのエーテルを使用して粗製ペプチドの沈殿を実施した。ペプチドの沈殿に貧溶媒としてエーテルを使用する場合、粗製ペプチドのアッセイ率は２０～２５％に低下する。これは、側鎖保護基とスカベンジャー付加物が目的のペプチドとともに沈殿するためである。粗製ペプチドのアッセイは、ＡＣＮまたはＭＩＢＫで粗製ペプチドを沈殿させることにより増加する。付加物は母液中に残り、濾過中に除去される。さらに、テデュグルチドは、その配列中にメチオニン、トリプトファン、ヒスチジンなどのアミノ酸が存在するため、酸化されやすい。エーテルには微量の過酸化物が含まれており、酸化不純物の増加につながることが知られている。アセトニトリルの使用は、酸化不純物の低減に大きく貢献した。粗製ペプチドの純度およびアッセイ比較を以下に表に示する。
【0024】
【表2】
【0025】
ｆ）ピペリジンを使用したＦｍｏｃ脱保護中のギ酸とＤＢＵの役割：アスパルチミド不純物：
テデュグルチド合成に関与する主な副反応の１つは、配列中に５つのアスパラギン酸単位があるため、複数のアスパルチミド不純物の形成である。アスパルチミド不純物は、ピペリジンやその他の強力な塩基を使用するため、脱保護の各段階で生成される。
テデュグルチド合成に関与する主な副反応の１つは、配列中に５つのアスパラギン酸単位があるため、複数のアスパルチミド不純物の形成である。アスパルチミド不純物は、ピペリジンやその他の強力な塩基を使用するため、脱保護の各段階で生成される。
【0026】
【化5】
【0027】
本発明／明細書の態様の１つは、Ｆｍｏｃ脱保護中にピペリジン溶液とともにギ酸溶液を導入することによってアスパルチミド不純物の形成が最小限に抑えられる、テデュグルチドの製造方法における上記の問題を解決する。ピペリジンはギ酸からプロトンを引き抜き、ピペリジニウムイオンを形成するため、Ｆｍｏｃ脱保護に影響を与えることなくアスパルタミドの生成を最小限に抑える。
【化6】
【0028】
ＤＢＵを使用する利点：
プロセスの特定の段階では、疎水性アミノ酸の存在により、Ｆｍｏｃ脱保護中に樹脂の収縮が観察された。これはＦｍｏｃ基の不完全な脱保護をもたらし、ひいては欠失不純物の形成に寄与する。Ｆｍｏｃ基の脱保護が不完全であるという問題を克服するために、ギ酸とピペリジンを含む試薬に１～３％ＤＢＵを組み込みました。ＤＢＵを組み込むと樹脂の効率的な膨潤が観察され、Ｆｍｏｃ基が完全に脱保護される。
プロセスの特定の段階では、疎水性アミノ酸の存在により、Ｆｍｏｃ脱保護中に樹脂の収縮が観察された。これはＦｍｏｃ基の不完全な脱保護をもたらし、ひいては欠失不純物の形成に寄与する。Ｆｍｏｃ基の脱保護が不完全であるという問題を克服するために、ギ酸とピペリジンを含む試薬に１～３％ＤＢＵを組み込みました。ＤＢＵを組み込むと樹脂の効率的な膨潤が観察され、Ｆｍｏｃ基が完全に脱保護される。
【0029】
目的
本発明／明細書の目的は、必要に応じて無機塩の助けを借りて、式Ｉで表されるテデュグルチドを調製するための、単純で堅牢かつ商業的に実施可能なプロセスを開発することである。
本発明／明細書の目的は、必要に応じて無機塩の助けを借りて、式Ｉで表されるテデュグルチドを調製するための、単純で堅牢かつ商業的に実施可能なプロセスを開発することである。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【0031】
本発明の概要
本発明の一側面は、
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ、
ｂ）カップリング剤の存在下、および任意にカオトロピック塩（単数または複数）の存在下、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステップ、
ｃ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｄ）任意に粗製テデュグルチドを精製するステップ
を含むテデュグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
本発明の一側面は、
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ、
ｂ）カップリング剤の存在下、および任意にカオトロピック塩（単数または複数）の存在下、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステップ、
ｃ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｄ）任意に粗製テデュグルチドを精製するステップ
を含むテデュグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
【0032】
一側面において、本発明は
ｅ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ、
ｇ）カップリング剤の存在下、および任意にカオトロピック塩（単数または複数）の存在下、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステップ、
ｇ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｈ）任意に粗製テデュグルチドを精製するステップ
を含むテデュグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
ｅ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ、
ｇ）カップリング剤の存在下、および任意にカオトロピック塩（単数または複数）の存在下、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステップ、
ｇ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｈ）任意に粗製テデュグルチドを精製するステップ
を含むテデュグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
【0033】
別の側面において、本発明は
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定する（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）、
ｂ）カップリング剤の存在下、および任意にカオトロピック塩の存在下、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製する、
ｃ）Ｆｍｏｃ基の脱保護のためのピペリジン：ギ酸：ＤＢＵ混合物の使用、
ｄ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｅ）任意に粗製テデュグルチドを精製する
ステップを含むテデュグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定する（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）、
ｂ）カップリング剤の存在下、および任意にカオトロピック塩の存在下、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製する、
ｃ）Ｆｍｏｃ基の脱保護のためのピペリジン：ギ酸：ＤＢＵ混合物の使用、
ｄ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｅ）任意に粗製テデュグルチドを精製する
ステップを含むテデュグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
【0034】
別の側面において、本発明は
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）、
ｂ）カップリング剤およびカオトロピック塩（単数または複数）の存在下で、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステップ、
ｃ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および切断カクテルを使用して樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｄ）酸化不純物を減らすために切断カクテルに遊離アミノ酸を使用する、
ｅ）粗製のテデュグルチドを精製するステップ、
を含み、
ここで、遊離アミノ酸はメトニン、トリプトファンおよびヒスチジンから選択される、テデュグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）、
ｂ）カップリング剤およびカオトロピック塩（単数または複数）の存在下で、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステップ、
ｃ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および切断カクテルを使用して樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｄ）酸化不純物を減らすために切断カクテルに遊離アミノ酸を使用する、
ｅ）粗製のテデュグルチドを精製するステップ、
を含み、
ここで、遊離アミノ酸はメトニン、トリプトファンおよびヒスチジンから選択される、テデュグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
【0035】
別の側面において、本発明は、
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）、
ｂ）カップリング剤およびカオトロピック塩（単数または複数）の存在下で、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステプ、
ｃ）Ｆｍｏｃ基の脱保護のためのピペリジン：ギ酸：ＤＢＵ混合物の使用、
ｄ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｅ）酸化不純物を減らすための切断カクテルにおける遊離アミノ酸とＢＨＴの使用、
ｆ）粗製のテデュグルチドの精製
を含み、ここで、遊離アミノ酸はメトニン、トリプトファンおよびヒスチジンから選択される、
テデュグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
ａ）第１のアミノ酸であるアスパラギン酸を、側鎖のカルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定するステップ（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ）、
ｂ）カップリング剤およびカオトロピック塩（単数または複数）の存在下で、側鎖保護アミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製するステプ、
ｃ）Ｆｍｏｃ基の脱保護のためのピペリジン：ギ酸：ＤＢＵ混合物の使用、
ｄ）粗製テデュグルチドが、保護基の除去および樹脂からのペプチドの切断によって得られる、
ｅ）酸化不純物を減らすための切断カクテルにおける遊離アミノ酸とＢＨＴの使用、
ｆ）粗製のテデュグルチドの精製
を含み、ここで、遊離アミノ酸はメトニン、トリプトファンおよびヒスチジンから選択される、
テデュグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
【0036】
さらに別の態様では、本発明は、抗酸化剤、アミノ酸およびＴＦＡカクテルを含む切断溶液を使用して固体支持体からテデュグルチドを切断する方法を開示する。
本発明の上記態様のアミノ酸は、メトニン、トリプトファンおよびヒスチジンから選択される。
本発明の上記態様の酸化防止剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）から選択される。
さらに別の態様では、本発明は、モノ保護されたヒスチジンが使用される、テデュグルチドの調製方法を開示する。
本発明の上記態様のアミノ酸は、メトニン、トリプトファンおよびヒスチジンから選択される。
本発明の上記態様の酸化防止剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）から選択される。
さらに別の態様では、本発明は、モノ保護されたヒスチジンが使用される、テデュグルチドの調製方法を開示する。
【0037】
本発明の上記態様の保護基は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）である。
使用されるアプローチは、連続的アプローチによるテデュグルチドの固相ペプチド合成であり、カップリング中に選択的カップリング剤および添加剤とともに無機塩が関与する。この方法により、カップリング反応と脱保護反応が完了し、ラセミ化が減少するため、標的分子に非常に近い異性体不純物が制御され、ペプチドの精製プロセスが容易になる。
使用されるアプローチは、連続的アプローチによるテデュグルチドの固相ペプチド合成であり、カップリング中に選択的カップリング剤および添加剤とともに無機塩が関与する。この方法により、カップリング反応と脱保護反応が完了し、ラセミ化が減少するため、標的分子に非常に近い異性体不純物が制御され、ペプチドの精製プロセスが容易になる。
【0038】
本発明の詳細な記載
発明の詳細な説明
本発明は、固相アプローチを使用する連続的カップリングによるテデュグルチドの効率的な製造方法に関する。これには、保護されたアミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製し、続いて保護基を除去し、固体支持体からペプチドを切断し、得られた粗製テデュグルチドを精製することが含まれる。
発明の詳細な説明
本発明は、固相アプローチを使用する連続的カップリングによるテデュグルチドの効率的な製造方法に関する。これには、保護されたアミノ酸を連続的にカップリングしてテデュグルチドを調製し、続いて保護基を除去し、固体支持体からペプチドを切断し、得られた粗製テデュグルチドを精製することが含まれる。
【0039】
本発明は以下の例によって表される。これらの例は説明のみを目的としており、したがって本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0040】
【表3】
【0041】
プロセスの概略説明は次のとおりである。
【化7】
【0042】
例：
例１：アスパラギン酸（第１のアミノ酸）をＡｓｐのα－カルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定することによるテデュグルチドの合成。
溶媒としてＭＤＣの存在下、ＤＩＰＣおよび触媒量のＤＭＡＰを使用して、Ｃ末端アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨをＷａｎｇ樹脂に充填することによって合成を実施した。未反応の機能部位を、無水酢酸とＤＩＰＥＡを使用してキャップした。Ｆｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の１０～２０％ピペリジン溶液を使用して５＋１０分間で２回実施した。ペプチドの伸長は、テデュグルチド配列に従ってアミノ酸を連続的に添加することによって実施された。得られたペプチド保護樹脂は以下のとおりである。
Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｍｅｔ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｗａｎｇ樹脂
ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノールをカクテルとして使用して完全な切断を実施し、エーテルを使用してペプチドを単離した。純度２８．７７％の粗製ペプチドが得られた。
例１：アスパラギン酸（第１のアミノ酸）をＡｓｐのα－カルボキシル基を介してＷａｎｇ樹脂に固定することによるテデュグルチドの合成。
溶媒としてＭＤＣの存在下、ＤＩＰＣおよび触媒量のＤＭＡＰを使用して、Ｃ末端アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨをＷａｎｇ樹脂に充填することによって合成を実施した。未反応の機能部位を、無水酢酸とＤＩＰＥＡを使用してキャップした。Ｆｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の１０～２０％ピペリジン溶液を使用して５＋１０分間で２回実施した。ペプチドの伸長は、テデュグルチド配列に従ってアミノ酸を連続的に添加することによって実施された。得られたペプチド保護樹脂は以下のとおりである。
Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｍｅｔ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｗａｎｇ樹脂
ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノールをカクテルとして使用して完全な切断を実施し、エーテルを使用してペプチドを単離した。純度２８．７７％の粗製ペプチドが得られた。
【0043】
例２：Ａｓｐの側鎖カルボキシル基を介してアスパラギン酸（第１のアミノ酸）をＷａｎｇ樹脂に固定することによるテデュグルチドの合成。
ステップ１：Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ３３－Ｗａｎｇ樹脂の合成
Ｗａｎｇ樹脂（０．３～０．６ｍｍｏｌ／ｇ、充填容量）を、１０ｖのＭＤＣを使用してペプチド合成容器に充填し、排出し、７ｖのＭＤＣを添加し、１時間膨潤させた。溶媒を完全に排出した。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ（２．０～４．０当量）をＭＤＣに溶解させ、反応容器に移した。ＤＭＡＰ（０．０１～０．１当量）をＭＤＣに溶解させ、ペプチド合成容器に添加し、続いてＤＩＰＣ（４．０～８．０当量）を添加した。エステル化は室温で１．０～３．０時間実施した。反応塊を排出し、アミノ酸を充填した樹脂をＭＤＣ、続いてＤＭＦで洗浄した。未反応の機能部位のキャッピングは、無水酢酸とＤＩＰＥＡを使用して実施した。
ステップ１：Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ３３－Ｗａｎｇ樹脂の合成
Ｗａｎｇ樹脂（０．３～０．６ｍｍｏｌ／ｇ、充填容量）を、１０ｖのＭＤＣを使用してペプチド合成容器に充填し、排出し、７ｖのＭＤＣを添加し、１時間膨潤させた。溶媒を完全に排出した。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ（２．０～４．０当量）をＭＤＣに溶解させ、反応容器に移した。ＤＭＡＰ（０．０１～０．１当量）をＭＤＣに溶解させ、ペプチド合成容器に添加し、続いてＤＩＰＣ（４．０～８．０当量）を添加した。エステル化は室温で１．０～３．０時間実施した。反応塊を排出し、アミノ酸を充填した樹脂をＭＤＣ、続いてＤＭＦで洗浄した。未反応の機能部位のキャッピングは、無水酢酸とＤＩＰＥＡを使用して実施した。
【0044】
ステップ２：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護を、樹脂をＤＭＦ中５～１５％のピペリジンで５分間および／または１０分間洗浄することによって実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0045】
Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0046】
ステップ３：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、樹脂をＤＭＦ中５～１５％のピペリジンで５分間および／または１０分間洗浄することによって実施された。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0047】
ステップ４：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、樹脂をＤＭＦ中５～１５％のピペリジンで５分および／または１０分間洗浄することによって実施された。樹脂をＤＭＦ中の０．０１～０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0048】
ステップ５：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、樹脂をＤＭＦ中５～１５％のピペリジンで５分および／または１０分間洗浄することによって実施された。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0049】
Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0050】
ステップ６：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、樹脂をＤＭＦ中５～２０％のピペリジンで５分間および／または１０分間洗浄することによって実施された。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0051】
Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0052】
ステップ７：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、樹脂をＤＭＦ中５～２０％のピペリジンで５分および／または１０分間洗浄することによって実施された。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した
【0053】
Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0054】
ステップ８：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0055】
Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0056】
ステップ９：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0057】
Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0058】
ステップ１０：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0059】
Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0060】
ステップ１１：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0061】
Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0062】
ステップ１２：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0063】
Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0064】
ステップ１３：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0065】
Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0066】
ステップ１４：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ、Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0067】
Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0068】
ステップ１５：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0069】
Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0070】
ステップ１６：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0071】
Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0072】
ステップ１７：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0073】
Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を用いて、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡおよびカオトロピック塩などとカップリングさせた。溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下で、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）として。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0074】
ステップ１８：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0075】
Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0076】
ステップ１９：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0077】
Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0078】
ステップ２０：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0079】
Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0080】
ステップ２１：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0081】
Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0082】
ステップ２２：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0083】
Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0084】
ステップ２３：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0085】
Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0086】
ステップ２４：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0087】
Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0088】
ステップ２５：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中５～２０％のピペリジンまたは０．１Ｍ～１Ｍのギ酸で樹脂をＤＭＦ中５～２０％のピペリジンまたは０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～３％のＤＢＵ、およびＤＭＦ中５～２０％のピペリジンで５分間および／または１０分間洗浄することによって実施した。。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ、Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0089】
Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0090】
ステップ２６：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中５～２０％のピペリジンまたは０．１Ｍ～１Ｍのギ酸で樹脂をＤＭＦ中５～２０％のピペリジンまたは０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～３％のＤＢＵ、およびＤＭＦ中５～２０％のピペリジンで５分間および／または１０分間洗浄することによって実施した。。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔで洗浄した。Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）。
【0091】
Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0092】
ステップ２７：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0093】
Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0094】
ステップ２８：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0095】
Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0096】
ステップ２９：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0097】
Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0098】
ステップ３０：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0099】
Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡおよびカオトロピック塩などとカップリングさせた。溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下で、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）として。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0100】
ステップ３１：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0101】
Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0102】
ステップ３２：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0103】
Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0104】
ステップ３３：充填アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の５～２０％のピペリジン、または０．１Ｍ～１Ｍのギ酸と５～２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液、またはＤＭＦ中の０．１Ｍ～１Ｍのギ酸、１～２％のＤＢＵ、および５～２０％ピペリジンで、５分および／または１０分間洗浄することにより実施した。樹脂を０．０１から０．１ＭのＨＯＢｔ．Ｈ２ＯのＤＭＦ溶液（２×７ｖ）、続いてＤＭＦ（５×７ｖ）で洗浄した。
【0105】
Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２．０～４．０当量）を、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＨＢＴＵ（２～４．０当量）およびオキシマピュアおよびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ、好ましくはＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．０～４．０当量）などの添加剤を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰなどの塩基、好ましくはＤＩＰＥＡ、および、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２などのカオトロピック塩、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）を使用して、溶媒としてのＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣの存在下でカップリングさせた。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。カップリングの完了は、ＨＰＬＣおよび／またはカイザーテストによって監視した。
【0106】
配列に従ってアミノ酸を連続的に付加した後に得られたペプチジル樹脂を、ＤＭＦ、ＭＤＣ、メタノールおよびＭＴＢＥで２回洗浄した。樹脂をＶＴＤ内で真空乾燥し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノールを８０：１０：１０の比率で使用して完全な切断を行った。切断は、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製の純度：３９．９９％。
【0107】
例３：粗製ペプチドの合成
プロセスはステップ３２まで例２に記載したものと同じままである。最終アミノ酸、すなわちＨｉｓについては、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ－ＯＨ（２．０～４．０当量）およびＨＣＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴ、Ｔ３ＰおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＣＯＭＵ（２～４．０当量）、ＤＭＡＰ（０．１～０．５当量）を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰ、好ましくはＤＩＰＥＡなどの塩基を用いてカップリングを実施した。γ－バレロラクトン（ＧＶＬ）、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＭＤＣおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒の存在下で、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）などのカオトロピック塩。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。
プロセスはステップ３２まで例２に記載したものと同じままである。最終アミノ酸、すなわちＨｉｓについては、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ－ＯＨ（２．０～４．０当量）およびＨＣＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＥＰＢＴ、Ｔ３ＰおよびＤＩＣなどのカップリング剤、好ましくはＣＯＭＵ（２～４．０当量）、ＤＭＡＰ（０．１～０．５当量）を使用して、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰ、好ましくはＤＩＰＥＡなどの塩基を用いてカップリングを実施した。γ－バレロラクトン（ＧＶＬ）、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＭＤＣおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒の存在下で、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２、好ましくはＭｇＣｌ２（０．０５～０．５当量）などのカオトロピック塩。カップリング反応は２５～４０℃で１～２時間実施された。反応塊を排出し、ＤＭＦおよび／またはＮＭＰおよび／またはＭＤＣで３回洗浄した。
【0108】
配列に従ってアミノ酸を連続的に付加した後に得られたペプチジル樹脂を、ＤＭＦ、ＭＤＣ、メタノールおよびＭＴＢＥで２回洗浄した。樹脂をＶＴＤ中で真空下で乾燥させ、８０：７．５：７．５：５：５の比のＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳを使用して完全な切断を行った。切断は、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製するために採取した。粗製の純度：４６．６９％
【0109】
例４：ＴＦＡを使用した切断：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ（８０：７．５：７．５：５：５）
プロセスはステップ３２まで例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓのカップリングは例３と同様に実施した。乾燥ペプチジル樹脂（５ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳを８０：７．５：７．５：５：５の比率で含有するカクテル１０～１５ｖで処理した。切断を、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製純度：４７．７％、ＡＰＩ含有量：０．６４ｇ
プロセスはステップ３２まで例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓのカップリングは例３と同様に実施した。乾燥ペプチジル樹脂（５ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳを８０：７．５：７．５：５：５の比率で含有するカクテル１０～１５ｖで処理した。切断を、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製純度：４７．７％、ＡＰＩ含有量：０．６４ｇ
【0110】
例５：ＴＦＡを使用した切断：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｍｅｔ（７５：５：５：５：５：５）
プロセスは例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓのカップリングは例３のとおり実施した。乾燥ペプチジル樹脂（５ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｍｅｔを７５：５：５：５：５：５の比率で含有するカクテル１０～１５ｖで処理した。切断は、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製純度：４８．９４％、ＡＰＩ含有量：０．７４ｇ
プロセスは例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓのカップリングは例３のとおり実施した。乾燥ペプチジル樹脂（５ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｍｅｔを７５：５：５：５：５：５の比率で含有するカクテル１０～１５ｖで処理した。切断は、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製純度：４８．９４％、ＡＰＩ含有量：０．７４ｇ
【0111】
例６：ＴＦＡを使用した切断：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐ（７５：５：５：５：５：５）
プロセスは例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓの結合は例３のとおり実施した。乾燥したペプチジル樹脂（５ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐを７５：５：５：５：５：５の比率で含有するカクテル１０～１５ｖで処理した。切断を、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製純度：４３．８５％、ＡＰＩ含有量：０．７６ｇ
プロセスは例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓの結合は例３のとおり実施した。乾燥したペプチジル樹脂（５ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐを７５：５：５：５：５：５の比率で含有するカクテル１０～１５ｖで処理した。切断を、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製純度：４３．８５％、ＡＰＩ含有量：０．７６ｇ
【0112】
例７：ＴＦＡを使用した切断：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐ：Ｍｅｔ（７５：５：５：５：５：２．５：２．５）
プロセスは例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓのカップリングは例３のように行った。乾燥ペプチジル樹脂（５ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐ：Ｍｅｔを７５：５：５：５：５：２．５：２．５の比率で含有するカクテル１０～１５ｖで処理した。切断を、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製純度：４６．０６％、ＡＰＩ含有量：０．７５ｇ
プロセスは例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓのカップリングは例３のように行った。乾燥ペプチジル樹脂（５ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐ：Ｍｅｔを７５：５：５：５：５：２．５：２．５の比率で含有するカクテル１０～１５ｖで処理した。切断を、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製純度：４６．０６％、ＡＰＩ含有量：０．７５ｇ
【0113】
例８：ＴＦＡを使用した切断：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐ：Ｍｅｔ：水（７５：４：５：５：５：２．５：２．５：１）
プロセスは例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓのカップリングは例３のように実施した。乾燥ペプチジル樹脂（５ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐ：Ｍｅｔ：水を７５：４：５：５：５：２．５：２．５：１の比率で含有するカクテル１０～１５容で処理した。切断は、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製の純度：４８．０９％、ＡＰＩ含有量：０．７２ｇ。
プロセスは例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓのカップリングは例３のように実施した。乾燥ペプチジル樹脂（５ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐ：Ｍｅｔ：水を７５：４：５：５：５：２．５：２．５：１の比率で含有するカクテル１０～１５容で処理した。切断は、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製の純度：４８．０９％、ＡＰＩ含有量：０．７２ｇ。
【0114】
例９：ＴＦＡを使用した切断：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐ：Ｍｅｔ：ＢＨＴ（７４：７．５：７．５：２．５：２．５：２．５：２．５：１）
プロセスは例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓのカップリングは例３のとおりに実施した。乾燥したペプチジル樹脂（２００ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐ：Ｍｅｔ：ＢＨＴを７４：７．５：７．５：２．５：２．５：２．５：２．５：１の比率で含有するカクテル１０～１５ｖで処理した。切断は、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製の純度：５２．５４％、ＡＰＩ含有量：３６．４０ｇ。
プロセスは例２に記載したものと同じである。３３番目のアミノ酸、すなわちＨｉｓのカップリングは例３のとおりに実施した。乾燥したペプチジル樹脂（２００ｇ）を採取し、ＴＦＡ：ＴＩＳ：フェノール：ＮＨ４Ｉ：ＤＭＳ：Ｔｒｐ：Ｍｅｔ：ＢＨＴを７４：７．５：７．５：２．５：２．５：２．５：２．５：１の比率で含有するカクテル１０～１５ｖで処理した。切断は、窒素雰囲気下、２０～３０℃で３～４時間実施した。反応塊を濾過し、ペプチドおよびＴＦＡカクテルを含む濾液を濃縮し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの任意の混合物から選択される溶媒を使用してペプチドの単離を行った。沈殿した固体を遠心分離および／または濾過し、ＭＴＢＥ、ジイソプロピルエーテル、ＭＩＢＫ、ＡＣＮおよびそれらの混合物から選択される溶媒で洗浄し、ＶＴＤで真空乾燥し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。粗製の純度：５２．５４％、ＡＰＩ含有量：３６．４０ｇ。
【図1】
【国際調査報告】