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特表2024-502114Ｖ型ＣａｓシステムのためのガイドＲＮＡデザインおよび複合体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-17
(54)【発明の名称】Ｖ型ＣａｓシステムのためのガイドＲＮＡデザインおよび複合体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240110BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240110BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240110BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240110BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240110BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20240110BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240110BHJP
A61P 35/00 20060101ALN20240110BHJP
A61P 31/12 20060101ALN20240110BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/11 Z ZNA
A61P43/00 105
A61P37/04
A61K35/17
A61K35/545
C12N5/10
A61P35/00
A61P31/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023541017
(86)(22)【出願日】2022-01-05
(85)【翻訳文提出日】2023-09-05
(86)【国際出願番号】 US2022011294
(87)【国際公開番号】W WO2022150372
(87)【国際公開日】2022-07-14
(31)【優先権主張番号】63/133,945
(32)【優先日】2021-01-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518258629
【氏名又は名称】ホライズン・ディスカバリー・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001807
【氏名又は名称】弁理士法人磯野国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】マチャド、ハイド ブエノ
(72)【発明者】
【氏名】ヘンプヒル、ケビン
(72)【発明者】
【氏名】ブラスバーグ、ロバート
(72)【発明者】
【氏名】スミス、アマンダ
(72)【発明者】
【氏名】ラシュトン、マイケル ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】ペレス－ドゥラン、パブロ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BA02
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB61
4C087BB65
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZB33
(57)【要約】
新規ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体を提供する。本複合体は、塩基編集のためにＶ型Ｃａｓタンパク質と追加のエフェクターをＤＮＡに引き寄せるために使用可能である。本システムのデザインは、ＤＮＡを編集する際にフレキシビリティーを提供する効率的なモジュラー構成要素の製造を可能にする。
【選択図】図３Ｃ
【選択図】図３Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体であって、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体は、ａ．ｇＲＮＡであって、前記ｇＲＮＡは６０～２１０ヌクレオチドを含み、前記ｇＲＮＡは、
ｉ．ｃｒＲＮＡ配列であって、前記ｃｒＲＮＡ配列は、３５～６０ヌクレオチド長であり、前記ｃｒＲＮＡ配列は、Ｃａｓ会合領域であって、前記Ｃａｓ会合領域は、１８～３０ヌクレオチド長であるものと、標的化領域であって、前記標的化領域は、１８～３０ヌクレオチド長であるものとを含むｃｒＲＮＡ配列と、
ｉｉ．ｔｒａｃｒＲＮＡ配列であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、４５～１２０ヌクレオチド長であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、アンチリピート領域および遠位領域を含み、前記アンチリピート領域は、前記Ｃａｓ会合領域の少なくとも１８個の連続するヌクレオチドに渡って前記Ｃａｓ会合領域と少なくとも８０％相補的であり、前記Ｃａｓ会合領域および前記アンチリピート領域は、ハイブリダイズすることが可能であるハイブリダイゼーション領域を形成し、前記ハイブリダイゼーション領域は、Ｖ型Ｃａｓタンパク質のＲＮＡ結合ドメインとの会合を保持することが可能である、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含むｇＲＮＡ；並びに
ｂ．リガンド結合部分であって、前記リガンド結合部分は（ｉ）前記ｇＲＮＡに直接結合しているか、または、（ｉｉ）リンカーを介して前記ｇＲＮＡに結合しているリガンド結合部分を含むことを特徴とする、ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項2】
前記ｇＲＮＡがヌクレオチド一本鎖によって形成され、前記ヌクレオチド一本鎖が前記ｃｒＲＮＡ配列および前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項3】
前記Ｃａｓ会合領域と前記アンチリピート領域との間にループ配列が存在する、請求項２に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項4】
前記ループ配列が４～４０ヌクレオチド長である、請求項３に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項5】
前記ｇＲＮＡがヌクレオチド第一鎖およびヌクレオチド第二鎖から構成され、前記ヌクレオチド第一鎖が前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み、前記ヌクレオチド第二鎖が前記ｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項6】
前記ｇＲＮＡおよび前記リガンド結合部分の少なくとも一方が少なくとも１つの修飾を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項7】
前記ループ配列が少なくとも１つの修飾を含む、請求項３に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項8】
前記少なくとも１つの修飾が１～３０個の２’修飾である、請求項７に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項9】
前記１～３０個の２’修飾が１～１０個の２’修飾である、請求項８に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項10】
前記１～１０個の２’修飾が前記標的化領域に位置する、請求項９に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項11】
前記１～１０個の２’修飾が前記Ｃａｓ会合領域に位置する、請求項９に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項12】
前記１～１０個の２’修飾が前記アンチリピート領域に位置する、請求項９に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項13】
前記１～１０個の２’修飾が前記遠位領域に位置する、請求項９に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項14】
前記少なくとも１つの修飾が少なくとも１つのホスホロチオエート連結である、請求項７に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項15】
前記少なくとも１つの修飾が少なくとも１つのホスホロチオエート連結である、請求項６に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項16】
前記ホスホロチオエート連結が前記標的化領域に位置する、請求項１５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項17】
前記ホスホロチオエート連結が前記Ｃａｓ会合領域に位置する、請求項１５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項18】
前記ホスホロチオエート連結が前記アンチリピート領域に位置する、請求項１５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項19】
前記ホスホロチオエート連結が前記遠位領域に位置する、請求項１５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項20】
前記リガンド結合部分がヌクレオチド配列を含み、前記リガンド結合部分の前記ヌクレオチド配列が少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項21】
前記リガンド結合部分の前記２’修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、または２－アミノプリン修飾ヌクレオチドである、請求項２０に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項22】
前記リガンド結合部分がホスホロチオエート連結を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項23】
前記ｇＲＮＡが５’末端を有し、前記リガンド結合部分が前記ｇＲＮＡの前記５’末端で前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項２に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項24】
前記ｇＲＮＡが３’末端を有し、前記リガンド結合部分が前記ｇＲＮＡの前記３’末端で前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項２に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項25】
前記ｇＲＮＡが３’末端と５’末端を有し、前記リガンド結合部分が前記３’末端または前記５’末端以外のヌクレオチドで前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項２に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項26】
前記リガンド結合部分が前記標的化領域内の前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項２５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項27】
前記リガンド結合部分が前記Ｃａｓ会合領域内の前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項２５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項28】
前記リガンド結合部分が前記アンチリピート領域内の前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項２５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項29】
前記リガンド結合部分が前記遠位領域内の前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項２５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項30】
前記リガンド結合部分が前記ループ配列で前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項３に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項31】
前記ｇＲＮＡがループ配列を含み、前記リガンド結合部分が前記ループ配列で前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項32】
前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体がリンカーを含み、前記リガンド結合部分が前記リンカーを介して前記ｇＲＮＡに結合する、請求項１から２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項33】
前記ｇＲＮＡが５’末端を有し、前記リンカーが前記ｇＲＮＡの前記５’末端で前記ｇＲＮＡに結合している、請求項２に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項34】
前記ｇＲＮＡが３’末端を有し、前記リンカーが前記ｇＲＮＡの前記３’末端で前記ｇＲＮＡに結合している、請求項３２に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項35】
前記ｇＲＮＡが３’末端と５’末端を有し、前記リンカーが前記３’末端または前記５’末端以外のヌクレオチドで前記ｇＲＮＡに結合している、請求項３２に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項36】
前記リンカーが前記標的化領域内の前記ｇＲＮＡに結合している、請求項３５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項37】
前記リンカーが前記Ｃａｓ会合領域内の前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項３５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項38】
前記リンカーが前記アンチリピート領域内の前記ｇＲＮＡに直接結合している、請求項３５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項39】
前記リンカーが前記遠位領域内の前記ｇＲＮＡに結合している、請求項３５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項40】
前記Ｃａｓ会合領域と前記アンチリピート領域との間にループ配列があり、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体がリンカーを含み、前記リンカーが前記ループ配列に結合している、請求項２に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項41】
前記リンカーが、修飾および非修飾オリゴヌクレオチド、修飾および非修飾オリゴペプチド、無機部分、修飾および非修飾多糖、修飾および非修飾脂質、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３２から４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項42】
前記リンカーが修飾オリゴヌクレオチド配列を含み、前記修飾オリゴヌクレオチド配列が２’修飾およびホスホロチオエート連結の少なくとも一方を含む、請求項４１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項43】
前記リンカーがレブリニル部分を含む、請求項３２～４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項44】
前記リンカーがエチレングリコール部分を含む、請求項３２～４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項45】
前記リンカーが１８Ｓ、９ＳまたはＣ３からなる群より選択される、請求項３２～４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項46】
前記リンカーが１～２４ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である、請求項３２～４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項47】
前記リガンド結合部分がビオチンまたはストレプトアビジンを含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項48】
前記リガンド結合部分が、ＭＳ２、Ｋｕ、ＰＰ７、ＳｆＭｕ、Ｓｍ７、Ｔａｔ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＣＳＹ４、Ｑｂｅｔａ、ＣＯＭ、ｐｕｍｉｌｉｏ、抗Ｈｉｓタグ（６Ｈ７）、λＮ２２ｐｌｕｓ、ＳＮＡＰ－Ｔａｇ、レクチン、およびＰＤＧＦβ鎖からなる群からのリガンドと結合することができる、請求項１～４６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項49】
前記リガンドがＭＳ２である、請求項４８に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項50】
前記リガンド結合部分が５’修飾ヌクレオチドを含み、前記５’修飾ヌクレオチドが２’修飾、５’ＰＯ４基、または窒素塩基の修飾のうちの少なくとも１つを含む、請求項１から４９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項51】
前記リガンド結合部分が第一リガンド結合部分であり、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体が第二リガンド結合部分を含み、前記リンカーが第一リンカーであり、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体が第二リンカーを含み、前記第一リガンド結合部分が前記第一リンカーに結合し、前記第二リガンド結合部分が前記第二リンカーに結合している、請求項３２～５０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項52】
前記第一リンカーおよび前記第二リンカーがそれぞれ前記ｃｒＲＮＡ配列に結合している、請求項５１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項53】
前記第一リンカーおよび前記第二リンカーがそれぞれ前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に結合している、請求項５１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項54】
前記第一リンカーおよび前記第二リンカーの一方が前記ｃｒＲＮＡ配列に結合し、前記第一リンカーおよび前記第二リンカーの他方が前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に結合している、請求項５１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項55】
前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体が前記リンカーを含み、前記リガンド結合部分が第一リガンド結合部分であり、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体が第二リガンド結合部分を含み、前記リンカーが第一リンカーであり、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体が第二リンカーを含み、前記第一リガンド結合部分が前記第一リンカーに結合し、前記第二リガンド結合部分が前記第二リンカーに結合し、そして、前記第一リンカーが前記ループ配列に結合している、請求項３に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項56】
前記第二リンカーが前記ｃｒＲＮＡ配列に結合している、請求項５５に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項57】
前記第二リンカーが前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に結合している、請求項５６に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項58】
前記リガンド結合部分がＭＳ２であり、前記リガンド結合部分が１～１２ヌクレオチド長の上流配列および１～１２ヌクレオチド長の下流配列を含み、前記上流配列および前記下流配列がＭＳ２に直接隣接し、前記上流配列が前記下流配列に相補的である、請求項１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項59】
前記上流配列および前記下流配列のそれぞれが２ヌクレオチド長である、請求項５８に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項60】
前記上流配列および前記下流配列のそれぞれがＧＣである、請求項５９に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項61】
ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体が配列番号：２８を含むかまたはコードする、請求項１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項62】
ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体が、配列番号：５９～配列番号：６５のいずれかを含むかまたはコードする、請求項１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項63】
ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体が、配列番号：６７～配列番号：７１のいずれかを含むかまたはコードする、請求項１に記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体。
【請求項64】
ａ．請求項１～６３のいずれかに記載のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体；およびｂ．Ｖ型Ｃａｓタンパク質であって、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の前記ハイブリダイゼーション領域が前記Ｖ型Ｃａｓタンパク質と会合している、Ｖ型Ｃａｓタンパク質を含む、塩基編集複合体。
【請求項65】
前記Ｖ型Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである、請求項６４に記載の塩基編集複合体。
【請求項66】
前記Ｖ型Ｃａｓタンパク質が活性型ＲｕｖＣドメインを含む、請求項６４に記載の塩基編集複合体。
【請求項67】
前記Ｖ型Ｃａｓタンパク質が不活性型ＲｕｖＣドメインを含む、請求項６４に記載の塩基編集複合体。
【請求項68】
前記Ｖ型Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｅ、およびＣａｓ１２ｆからなる群より選択される、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の塩基編集複合体。
【請求項69】
エフェクターをさらに含み、前記エフェクターが前記リガンド結合部分のリガンドに結合し、前記リガンド結合部分のリガンドが前記リガンド結合部分と結合可能である、請求項６４～６８のいずれか一項に記載の塩基編集複合体。
【請求項70】
前記エフェクターが、デアミナーゼ、逆転写酵素転写調節因子および修復酵素からなる群より選択される、請求項６９に記載の塩基編集複合体。
【請求項71】
前記エフェクターが、ＡＩＤ、ＣＤＡ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＤＡ、ＡＤＡＲ１、ＴａｄＡ、ＴＡＤＡ、ＴＡＤ３、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、およびＴＤＧからなる群より選択される、請求項６９に記載の塩基編集複合体。
【請求項72】
前記リガンドがＭＣＰである、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の塩基編集複合体。
【請求項73】
システイン／セレノシステインタグをさらに含む、請求項６４～７２のいずれか一項に記載の塩基編集複合体。
【請求項74】
クリックケミストリーを介した環化付加のための要素をさらに含む、請求項６４～７２のいずれか一項に記載の塩基編集複合体。
【請求項75】
前記エフェクターが第一エフェクターであり、前記塩基編集複合体が第二エフェクターをさらに含む、請求項６４～７２のいずれか一項に記載の塩基編集複合体。
【請求項76】
前記第二エフェクターが前記Ｖ型Ｃａｓタンパク質に直接または中間体部分を介して共有結合または非共有結合している、請求項７５に記載の塩基編集複合体。
【請求項77】
請求項６４～７６のいずれか一項に記載の塩基編集複合体を二本鎖ＤＮＡに曝露する工程を含む塩基編集方法。
【請求項78】
前記方法がｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
前記方法がｉｎ ｖｉｖｏで実施される、請求項７７に記載の方法。
【請求項80】
前記方法がｅｘ ｖｉｖｏで実施される、請求項７７に記載の方法。
【請求項81】
請求項６５～７７のいずれか一項に記載の塩基編集複合体を一本鎖ＤＮＡに曝露する工程を含む塩基編集方法。
【請求項82】
前記方法がｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、請求項８２に記載の方法。
【請求項83】
前記方法がｉｎ ｖｉｖｏで実施される、請求項８２に記載の方法。
【請求項84】
前記方法がｅｘ ｖｉｖｏで実施される、請求項８２に記載の方法。
【請求項85】
細胞においてＤＮＡを編集する方法であって、請求項６５から７７のいずれか一項に記載の塩基編集複合体を前記細胞に曝露する工程を含む、方法。
【請求項86】
前記細胞が免疫細胞である、請求項８６に記載の方法。
【請求項87】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項８６に記載の方法。
【請求項88】
前記免疫細胞がＩＰＳＣ細胞である、請求項８６に記載の方法。
【請求項89】
対象を治療する方法であって、請求項７７に記載の方法を含み、前記曝露が対象の外部で行われ、前記曝露の後、前記対象に細胞を注入する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年１月５日に出願された米国仮出願シリアル番号６３／１３３，９４５の出願日の利益を主張するものであり、その開示全体は、参照により本明細書に完全に記載されているかのように組み込まれる。
本出願は、２０２１年１月５日に出願された米国仮出願シリアル番号６３／１３３，９４５の出願日の利益を主張するものであり、その開示全体は、参照により本明細書に完全に記載されているかのように組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本発明は遺伝子編集分野に関する。
本発明は遺伝子編集分野に関する。
【背景技術】
【0003】
研究者たちは、ＤＮＡを改変するためにＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）システムの利用を積極的に模索している。現在までのところ、この分野における研究の大部分はＣａｓ９システム中のものである。これらのシステムでは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）とｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）は、２本の別々のヌクレオチド鎖または１本のヌクレオチド鎖の領域のいずれかの形でハイブリダイズしてＣａｓ９タンパク質をリクルートし、ｃｒＲＮＡ内の配列と相補的なＤＮＡ位置にＣａｓ９タンパク質を誘導する。こうして、そのＤＮＡ内の相補配列が標的部位となり、Ｃａｓ９タンパク質はその機能ドメインに基づいて、この標的部位で編集を起こすことができる。
【0004】
Ｃａｓ９システムの威力は今やよく知られているが、これらのシステムは全ての用途に有効というわけではない。Ｃａｓ９システムの限界の一つは、Ｃａｓ９システムが作用できる機能ドメインが、使用するＣａｓ９タンパク質の機能ドメインによって定義されることである。
【0005】
他のＣａｓタンパク質も知られている。これらの他のＣａｓタンパク質のうち、その可能性が十分に追求されていないのがＶ型ファミリー内のものである。Ｖ型ファミリーの酵素の使用は、標的部位またはその近傍に複数の編集部位を導入しようとする場合、特に未開拓である。そのため、改良型ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）や、それを組み込んで使用する複合体やシステムの開発が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、新規かつ進歩性のあるｇＲＮＡ－リガンド結合複合体、塩基編集複合体、および塩基編集とゲノム改変のための方法を提供する。本発明の様々な実施形態の使用により、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で効率的かつ効果的に塩基編集を行うことができる可能性がある。さらに、本発明のいくつかの実施形態は、同じＶ型Ｃａｓタンパク質が異なる標的部位に導かれ、任意ではあるが、同じ部位または異なる部位で各種エフェクタータンパク質と会合することを可能にするモジュラーデザインを提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
第一実施形態によれば、本発明は、ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体を提供し、ここで、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体は、（ａ）ｇＲＮＡであって、前記ｇＲＮＡは６０～２１０ヌクレオチドまたは８０～１８０ヌクレオチドを含み、前記ｇＲＮＡは、（ｉ）ｃｒＲＮＡ配列であって、前記ｃｒＲＮＡ配列は、３６～６０ヌクレオチド長または３５～６０ヌクレオチド長であり、前記ｃｒＲＮＡ配列は、Ｃａｓ会合領域であって、前記Ｃａｓ会合領域は、１８～３０ヌクレオチド長であるものと、標的化領域であって、前記標的化領域は、１８～３０ヌクレオチド長であるものとを含むｃｒＲＮＡ配列と、（ｉｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、４５～１２０ヌクレオチド長であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、アンチリピート領域および遠位領域を含み、前記アンチリピート領域は、前記Ｃａｓ会合領域の少なくとも１８個の連続するヌクレオチドに渡って前記Ｃａｓ会合領域と少なくとも８０％相補的であり、前記Ｃａｓ会合領域および前記アンチリピート領域は、ハイブリダイズすることが可能であるハイブリダイゼーション領域を形成し、前記ハイブリダイゼーション領域は、Ｖ型Ｃａｓタンパク質のＲＮＡ結合ドメインとの会合を保持することが可能である、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含むｇＲＮＡ、並びに、（ｂ）リガンド結合部分であって、前記リガンド結合部分は（ｉ）前記ｇＲＮＡに直接結合しているか、または、（ｉｉ）リンカーを介して前記ｇＲＮＡに結合しているリガンド結合部分を含むことを特徴とする。
【0008】
第二実施形態によれば、本発明は、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体およびＶ型Ｃａｓタンパク質を含む塩基編集複合体であって、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の前記Ｃａｓ会合領域および前記アンチリピート領域が前記Ｖ型Ｃａｓタンパク質と会合する塩基編集複合体を提供する。任意ではあるが、前記リガンド結合部分は、エフェクター分子に結合しているか又はその一部であるリガンドと可逆的に結合する。
【0009】
第３の実施形態によれば、本発明は塩基編集方法を提供する。前記方法は、本発明の塩基編集複合体を二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）または一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）に曝露する工程を含む。前記塩基編集複合体は、塩基編集が可能な条件下でｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡに暴露してもよい。
【0010】
第４の実施形態によれば、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体は、配列番号：２８を含むか又はコードする。
【0011】
第５の実施形態によれば、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体は、配列番号：５９～配列番号：６５のいずれかを含むか又はコードする。
【0012】
第６の実施形態によれば、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体は、配列番号：６７～配列番号：７１のいずれかを含むか又はコードする。
【発明の効果】
【0013】
エフェクターがリガンドに結合している（あるいはリガンドを含んでいる）場合、本システムはモジュラーデザインを有する。ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体中にリガンド結合部分が存在することにより、その複合体はエフェクターと結合する（またはエフェクター内に含まれる）対応するリガンドと結合することができる。このように、リガンド結合部分は、リガンドと結合できることを可能とする方法と向きでｇＲＮＡと結合する。同様に、リガンドは、エフェクターがリガンド結合部分と可逆的に結合できるようにする方法で、エフェクターに結合または会合される。
【0014】
リガンドとリガンド結合部分が互いに結合している場合、リガンドと結合しているエフェクターは、ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体を含む任意の塩基編集複合体の一部となる。塩基編集複合体がＣａｓタンパク質も含んでいる場合、そのＣａｓタンパク質とエフェクターは、同じ場所、例えば、目的の標的部位またはその近傍に保持可能である。
【0015】
したがって、特定のエフェクターをＣａｓタンパク質と併用したい場合は、そのエフェクターと、そのＣａｓタンパク質を含む塩基編集複合体の一部であるリガンド結合部分と可逆的に結合できるリガンドとを会合させるだけでよい。あるシステムから次のシステムへエフェクターを変えるには、エフェクター－リガンドを変えるだけでよい。その結果、同じｇＲＮＡ－リガンド結合複合体とそれに会合するＣａｓタンパク質を複数の異なるエフェクターと共に使用することができる。複数の異なるエフェクターは、そのリガンドをリガンド結合部分に結合させたり解離させたりすることにより、同一系内で経時的に使用することもできるし、異なる系内で同時または経時的に使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【発明を実施するための形態】
【0017】
発明の詳細な説明
次に、本発明の様々な実施形態について詳細に説明するが、その例は添付の図に示されている。以下の説明では、本発明を十分に理解するために、数多くの具体的な詳細を述べる。しかしながら、文脈から別段の指示または暗示がない限り、詳細は例示を意図したものであり、本発明の範囲をいかなる形でも限定するものとみなされるべきではない。さらに、様々な実施形態または特定の実施形態に関連して記載された特徴は、そのような排他性が明示的に記載されているか、または文脈から暗黙的に記載されていない限り、本明細書に開示された他の実施形態に関連して使用するのに適切でないと解釈されるものではない。
次に、本発明の様々な実施形態について詳細に説明するが、その例は添付の図に示されている。以下の説明では、本発明を十分に理解するために、数多くの具体的な詳細を述べる。しかしながら、文脈から別段の指示または暗示がない限り、詳細は例示を意図したものであり、本発明の範囲をいかなる形でも限定するものとみなされるべきではない。さらに、様々な実施形態または特定の実施形態に関連して記載された特徴は、そのような排他性が明示的に記載されているか、または文脈から暗黙的に記載されていない限り、本明細書に開示された他の実施形態に関連して使用するのに適切でないと解釈されるものではない。
【0018】
見出しは、読者の便宜のために本明細書で提供されるものであり、本明細書で開示される任意の実施形態の範囲を限定するものではない。
【0019】
定義
【0020】
別段の記載がない限り、または文脈から明らかな場合を除き、次の用語は以下に定める意味を有するものとする：
【0021】
「２’修飾」という語句は、糖部分の２’位が修飾された糖部分を有するヌクレオチド単位を指す。２’修飾の例は、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチドを形成する２’－Ｏ－アルキル修飾または２’ハロゲン修飾ヌクレオチドを形成する２’ハロゲン修飾である。
【0022】
語句「２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド」は、糖部分、例えば、酸素原子が糖の２’位に位置する炭素原子およびアルキル基の両方に結合するように２’位が修飾されたデオキシリボシルまたはリボシル部分を有するヌクレオチド単位を指す。様々な実施形態において、アルキル部分は炭素（複数可）と水素（複数可）からなる、または実質的に炭素と水素からなる。Ｏ部分とそれが結合しているアルキル基を１つの基として見た場合、それらはＯ－アルキル基と呼ばれることがあり、例えば、－Ｏ－メチル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－Ｏ－イソプロピル、－Ｏ－ブチル、－Ｏ－イソブチル、－Ｏ－エチル－Ｏ－メチル（－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、および－Ｏ－エチル－ＯＨ（－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）である。２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチドは、置換されていても置換されていなくてもよい。
【0023】
語句「２’ハロゲン修飾ヌクレオチド」は、糖部分、例えば、その位置の炭素がハロゲン種、例えば、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒに直接結合するように２’位が修飾されたデオキシリボシル部分を有するヌクレオチド単位を指す。
【0024】
「リガンド結合部分」とは、アプタマーのような部分を指し、例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチド、または、特定のリガンドに結合し、そのリガンドと可逆的または不可逆的に結合することができる他の化合物である。
【0025】
用語「修飾ヌクレオチド」は、塩基、糖および／またはリン酸の化学構造において少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを指し、修飾には、限定はされないが、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシン外環アミンにおける修飾、および５－ブロモ－ウラシルまたは５－ヨードウラシルの置換が含まれる；並びに２’－修飾（２’－ＯＨがＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮのような基で置換されている糖修飾リボヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）も含まれる。
【0026】
修飾塩基とは、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシン、キューオシンなどのヌクレオチド塩基であって、１つ以上の原子または基の置換または付加によって修飾されたものを指す。これらのタイプの修飾のいくつかの例としては、限定はされないが、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化、またはアセチル化塩基単独またはそれらの様々な組み合わせが挙げられる。より具体的な修飾塩基としては、例えば、５－プロピニルウリジン、５－プロピニルシチジン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，－ジメチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－プロピルグアニン、２－アミノアデニン、１－メチルイノシン、３－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジンおよび５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ハロシチジン、５－ハロリジン、４－アセチルシチジン、１－メチルアデノシン、２－メチルアデノシン、３－メチルシチジン、６－メチルウリジン、２－メチルグアノシン、７－メチルグアノシン、２，２－ジメチルグアノシン、５－メチルアミノエチルウリジン、５－メチルオキシウリジン、７－デアザアデノシンなどのデアザヌクレオチド、６－アゾリジン、６－アゾシチジン、６－アゾチミジン、５－メチル－２－チオウリジン、他のチオ塩基（例、２－チオウリジン、４－チオウリジン、２－チオシチジン）、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチル基および置換ナフチル基、Ｏ－およびＮ－アルキル化プリンおよびピリミジン（例、Ｎ６－メチルアデノシン）、５－メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５－オキシ酢酸、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル基、修飾フェニル基（例、アミノフェノール、２，４，６－トリメトキシベンゼン）、Ｇクランプヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、８－置換アデニンおよびグアニン、５－置換ウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、並びにアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。修飾ヌクレオチドには、糖部分に関して修飾されたヌクレオチド、リボシルでない糖またはその類似体を有するヌクレオチドも含まれる。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４－チオリボース、および他の糖、複素環、または炭素環であるか、またはそれらに基づく場合がある。
【0027】
「コードする」（ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ）という語句および「コード化する」（ｅｎｃｏｄｅｓ）という用語は、１つの配列が、参照されるヌクレオチド配列と同一である配列、参照されるヌクレオチド配列のＤＮＡもしくはＲＮＡ等価体、または参照されるヌクレオチド配列のＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体であるＤＮＡもしくはＲＮＡもしくは配列のいずれかを含むことを意味する。したがって、引用されたＤＮＡ配列をコードする又はコード化する配列に言及する場合、特に断らない限り、同じＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列の相補体、その配列のＲＮＡ等価体、またはその配列のＲＮＡ相補体、あるいは１つ以上のリボヌクレオチドがそのデオキシリボヌクレオチド対応物に置換されているか、または１つ以上のデオキシリボヌクレオチドがそのリボヌクレオチド対応物に置換されている前述のいずれかの配列を指す。
【0028】
用語「相補」は、従来のワトソン－クリック塩基対形成または他の非従来型の塩基対形成のいずれかによって、他の核酸配列と１つ以上の水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントは、二つ目の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対）を形成できる核酸分子の残基の割合を示す（例えば、１０個のうち５個、６個、７個、８個、９個、１０個の場合、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、ある核酸配列の全ての連続した残基が、二つ目の核酸配列の同じ数の連続した残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域に渡って少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である度合を指す。またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【0029】
用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズする」という用語は、特定のハイブリダイゼーション条件下で、完全に、実質的に、または部分的に相補的な核酸鎖が一緒になり、２つの構成鎖が水素結合によって結合した二本鎖構造または領域を形成するプロセスを指す。特に断りのない限り、ハイブリダイゼーション条件は自然発生または実験室でデザインされた条件である。水素結合は通常、アデニンとチミンまたはウラシルの間（ＡとＴまたはＵ）、あるいはシチジンとグアニンの間（ＣとＧ）に形成されるが、他の塩基対が形成されることもある（例えば、Ａｄａｍｓら、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、第１１版、１９９２年参照）。
【0030】
「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその修飾体、およびその類似体を指す。ヌクレオチドには、プリン（例、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン）およびそれらの誘導体や類似体、ならびにピリミジン（例、シトシン、ウラシル、チミン）およびそれらの誘導体や類似体からなる種が含まれる。好ましくは、ヌクレオチドは、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、またはグアニン部分を含む。さらに、ヌクレオチドという用語には、例えば放射性部分または蛍光部分などの検出可能な標識、またはヌクレオチドに付いた質量標識を有する種も含まれる。ヌクレオチドという用語には、当技術分野でユニバーサル塩基として知られているものも含まれる。例として、ユニバーサル塩基には３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、ネブラリンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヌクレオチドアナログは、例えば、イノシン、キューオシン、キサンチンのような塩基、２’－メチルリボースのような糖、およびメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアセテートのような非天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合やペプチドを有するヌクレオチドを含むことを意味する。
【0031】
用語「対象」および「患者」は、生物（例、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト）を指すために本明細書中で互換的に使用される。哺乳類には、ネズミ、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物、イヌやネコなどのペットなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で得られた又はインビトロで培養された生物または他の生物学的実体の組織、細胞およびその子孫も、対象および患者という用語に包含される。さらに、いくつかの実施形態では、対象は無脊椎動物、例えば昆虫や線虫であってもよく、一方、他の実施形態では、対象は植物や菌類であってもよい。
【0032】
本明細書において使用される「治療」、「処置」、「緩和」、および「改善」は、互換的に使用される。これらの用語は、治療的利益および／または予防的利益を含むがこれらに限定されない、有益または望ましい結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療中の一若しくは複数の疾患、状態、または症状における任意の治療上適切な改善または効果を意味する。予防的利益のために、本発明の複合体は、特定の疾患、状態、または症状を発症するリスクのある対象、又は、対象の細胞もしくは組織、または体外に再投与前の別の対象の細胞もしくは組織に、あるいは疾患、状態、または症状がまだ顕在化していない可能性があるにもかかわらず、疾患の１つ以上の生理学的症状を報告する対象に、投与することができる。
【0033】
本明細書に開示されているように、多くの値の範囲が提供される。その範囲の上限と下限の間に介在する、下限の単位の１０分の１までの各中間値も、文脈上明らかにそうでない場合を除き、具体的に開示されていると理解される。記載された範囲内の任意の記載値または中間値と、その記載範囲内の任意の他の記載値または中間値との間の各小範囲も、本発明に包含される。これらの小範囲の上限と下限は、それぞれ独立して、前記範囲に含まれることも除外されることもあり、小範囲に限界値のどちらかが含まれるか、どちらも含まれないか、または両方が含まれる各範囲も、記載された範囲に特に具体的に除外された任意の限界値を条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方または両方を除いた範囲も本発明に含まれる。
【0034】
「約」という用語は、一般的に表示数値のプラスマイナス１０％を指す。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示し、「約２０％」は１８～２２％の範囲を意味する場合がある。四捨五入など、「約」の他の意味は文脈から明らかな場合があり、例えば「約１」は０．５～１．４を意味することもある。
【0035】
考察
【0036】
第一実施形態によれば、本発明は、ｇＲＮＡとリガンド結合部分の両方を含むｇＲＮＡ－リガンド結合複合体を含む。この複合体はＶ型Ｃａｓタンパク質との会合を維持する能力を持つ。ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体において、ｇＲＮＡはリガンド結合部分に直接共有結合していても、リンカーを介してリガンド結合部分に結合していてもよい。
【0037】
ｇＲＮＡ
【0038】
ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体のｇＲＮＡは、自己相補的な少なくとも１つの領域を有するヌクレオチドの一本鎖か、またはそれぞれが他方の鎖の領域と相補的な少なくとも１つの領域を有するヌクレオチドの二本鎖のいずれかである。ｇＲＮＡの中には、それがヌクレオチドの一本鎖であるか、ヌクレオチドの二本鎖であるかにかかわらず、一つ以上のループが存在することがある。ｇＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの２つの部分を含む。
【0039】
ｇＲＮＡ内のヌクレオチドは、完全にＲＮＡであってもよいし、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドなどの他のヌクレオチドの組み合わせであってもよい。各ヌクレオチドは修飾されていなくてもよく、または１つ以上のヌクレオチドは、例えば以下の修飾（２’－Ｏ－メチル、２’フルオロまたは２－アミノプリン）の１つで修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、１個から４０個または２個から２０個または２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３５個または３６個のヌクレオチドの１つまたは複数の範囲に渡って、連続的に修飾されたヌクレオチドが存在するか、または２番目ごと、もしくは３番目ごと、もしくは４番目ごとのヌクレオチドがその２’位で修飾され、他の全てのヌクレオチドは修飾されていないという修飾パターンが存在する。加えてまたは代替的に、連続するヌクレオチドの１つ以上の対または全ての対の間に、修飾または非修飾のヌクレオチド間連結が存在し得る。
【0040】
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは３５～６０ヌクレオチド若しくは３６～６０ヌクレオチド長、または、４０～５５ヌクレオチド長である。ｃｒＲＮＡの配列内には、１８～３０ヌクレオチド長または２０～２５ヌクレオチド長の、リピート領域とも呼ばれる場合があるＣａｓ会合領域と、１８～３０ヌクレオチド長または２０～２５ヌクレオチド長の、スペーサー領域とも呼ばれる場合がある標的化領域がある。
【0041】
標的化領域は標的化配列を含み、これはＣａｓタンパク質および／またはエフェクターが塩基編集を引き起こすことを望む場所に基づいて選択可能な可変配列である。このように、標的化領域は、あらかじめ選択された目的の標的部位に相補的でハイブリダイゼーション可能な領域を含むようにデザインされることがある。例えば、標的化領域と対応する標的部位配列との間の相補的領域は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２５ヌクレオチドより長い連続するヌクレオチドであるか、あるいは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２５ヌクレオチドより長い連続するヌクレオチドのＤＮＡの領域と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％相補的である。標的化領域はｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズしない領域で、Ｃａｓ会合領域の下流にある場合がある。Ｃａｓ会合は、会合を意図するＣａｓタンパク質のＲＮＡ結合ドメインに基づいてデザインされる。（Ｃａｓに会合する部分内の全てのヌクレオチドがＣａｓタンパク質と直接結合する必要はない）。
【0042】
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、例えば、３０～２１０ヌクレオチド長、または４５～１２０ヌクレオチド長、または６０～１００ヌクレオチド長、または７０～９０ヌクレオチド長である。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列はアンチリピート領域と遠位領域を含む。いくつかの実施形態において、アンチリピート領域は、１８～６０ヌクレオチド長、または２５～５０ヌクレオチド長、または３０～４０ヌクレオチド長である。遠位領域は、例えば、１８から６０ヌクレオチド長、または２５から５０ヌクレオチド長、または３０から４０ヌクレオチド長である。遠位領域はｃｒＲＮＡとハイブリダイズしない領域で、アンチリピート領域の上流に位置する場合がある。
【0043】
アンチリピート領域は、Ｃａｓ会合領域の少なくとも１８個の連続するヌクレオチドに渡って、Ｃａｓ会合領域と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的であり、その結果、Ｃａｓ会合領域とアンチリピート領域はハイブリダイズしてハイブリダイゼーション領域を形成することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡがハイブリダイゼーション領域上でハイブリダイズすると、ｇＲＮＡはＶ型Ｃａｓタンパク質のＲＮＡ結合ドメインと会合を維持することができる。好ましくは、この会合は、複合体を使用する天然に存在する条件下と実験室条件下の両方で可能である。
【0044】
ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡがヌクレオチドの連続鎖の一部である場合、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの間には、例えば４～２０または８～１５ヌクレオチドのループ領域が存在する場合がある。５’から３’方向において、ｇＲＮＡは、遠位領域、アンチリピート領域、ループ、Ｃａｓ会合領域、および標的化領域を含むか、それらからのみなるか、実質的にそれらからなる。
【0045】
本発明に関連して使用することができるｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの例を以下に示す（すべて５’→３’方向で、Ｎは任意のヌクレオチド、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵである）。以下の各配列には、特定の数のＮヌクレオチドが示されている。しかしながら、これらの配列のいずれにおいても、Ｎは１６～３０であってもよく、これは１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のヌクレオチドが存在し得ることを意味する。
アリシクロバチルス アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、ＡａｃＣａｓ１２ｂ ｃｒＲＮＡ
配列番号：１
５’－ＧＵＣＧＧＡＵＣＡＣＵＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＵＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号：２
５’－ＣＧＡＧＣＧＡＵＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号：３
５’－ＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
ＡａｃＣａｓ１２ｂ ｔｒａｃｒＲＮＡ
配列番号：４
５’－ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＡＧ－３’
配列番号：５
５’－ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＡ－３’
配列番号：６
５’－ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧ－３’
ＡａｃＣａｓ１２ｂ ｇＲＮＡ
配列番号：７
５’－ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＵＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
ＡａＣａｓ１２ｂ人工キメラｇＲＮＡ（ａｒｔｇＲＮＡ１３）
配列番号：８
５’－ＧＵＣＧＵＣＵＡＵＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＧＧＡＧＵＧＣＡＧＵＧＣＵＣＵＵＵＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣＣＣＧＵＵＧＧＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｔｈ Ｃａｓ１２ｂ ｔｒａｃｒＲＮＡ
配列番号：９
５’－ＣＧＡＧＧＵＵＣＵＧＵＣＵＵＵＵＧＧＵＣＡＧＧＡＣＡＡＣＣＧＵＣＵＡＧＣＵＡＵＡＡＧＵＧＣＵＧＣＡＧＧＧＧＵＧＵＧＡＧＡＡＡＣＵＣＣＵＡＵＵＧＣＵＧＧＡＣＧＡＵＧＵＣＵＣＵＵＵＵＡＵ－３’
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｔｈ Ｃａｓ１２ｂ ｃｒＲＮＡ
配列番号：１０
５’－ＧＵＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＵＧＡＵＡＣＧＡＧＧＣＡＵＵＡＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号：１１
５’－ＡＡＡＵＧＡＵＡＣＧＡＧＧＣＡＵＵＡＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号：１２
５’－ＣＧＡＧＧＣＡＵＵＡＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｅ、デルタプロテオバクテリア由来ＣａｓＸ
Ｃａｓ１２ｅ、ＤｐｂＣａｓＸ、ｃｒＲＮＡ
配列番号：１３
５’－ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｅ、ＤｐｂＣａｓＸ、ｔｒａｃｒＲＮＡ
配列番号：１４
５’－ＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ－３’
Ｃａｓ１２ｅ、ＤｐｂＣａｓＸ、ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体、短小型変異体）
配列番号：１５
５’－ＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｅ、ＤｐｂＣａｓＸ、ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体、長型変異体）
配列番号：１６
５’－ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｆヌクレアーゼ
Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｇＲＮＡ
配列番号：１７
５’－ＧＧＧＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｆ ｔｒａｃｒＲＮＡ
配列番号：１８
５’－ＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３’
Ｃａｓ１２ｆ ｃｒＲＮＡ
配列番号：１９
５’－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号：２０
５’－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｆ ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体）
配列番号：２１
５’－ＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
アリシクロバチルス アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、ＡａｃＣａｓ１２ｂ ｃｒＲＮＡ
配列番号：１
５’－ＧＵＣＧＧＡＵＣＡＣＵＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＵＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号：２
５’－ＣＧＡＧＣＧＡＵＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号：３
５’－ＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
ＡａｃＣａｓ１２ｂ ｔｒａｃｒＲＮＡ
配列番号：４
５’－ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＡＧ－３’
配列番号：５
５’－ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＡ－３’
配列番号：６
５’－ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧ－３’
ＡａｃＣａｓ１２ｂ ｇＲＮＡ
配列番号：７
５’－ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＵＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
ＡａＣａｓ１２ｂ人工キメラｇＲＮＡ（ａｒｔｇＲＮＡ１３）
配列番号：８
５’－ＧＵＣＧＵＣＵＡＵＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＧＧＡＧＵＧＣＡＧＵＧＣＵＣＵＵＵＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣＣＣＧＵＵＧＧＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｔｈ Ｃａｓ１２ｂ ｔｒａｃｒＲＮＡ
配列番号：９
５’－ＣＧＡＧＧＵＵＣＵＧＵＣＵＵＵＵＧＧＵＣＡＧＧＡＣＡＡＣＣＧＵＣＵＡＧＣＵＡＵＡＡＧＵＧＣＵＧＣＡＧＧＧＧＵＧＵＧＡＧＡＡＡＣＵＣＣＵＡＵＵＧＣＵＧＧＡＣＧＡＵＧＵＣＵＣＵＵＵＵＡＵ－３’
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｔｈ Ｃａｓ１２ｂ ｃｒＲＮＡ
配列番号：１０
５’－ＧＵＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＵＧＡＵＡＣＧＡＧＧＣＡＵＵＡＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号：１１
５’－ＡＡＡＵＧＡＵＡＣＧＡＧＧＣＡＵＵＡＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号：１２
５’－ＣＧＡＧＧＣＡＵＵＡＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｅ、デルタプロテオバクテリア由来ＣａｓＸ
Ｃａｓ１２ｅ、ＤｐｂＣａｓＸ、ｃｒＲＮＡ
配列番号：１３
５’－ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｅ、ＤｐｂＣａｓＸ、ｔｒａｃｒＲＮＡ
配列番号：１４
５’－ＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ－３’
Ｃａｓ１２ｅ、ＤｐｂＣａｓＸ、ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体、短小型変異体）
配列番号：１５
５’－ＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｅ、ＤｐｂＣａｓＸ、ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体、長型変異体）
配列番号：１６
５’－ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｆヌクレアーゼ
Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｇＲＮＡ
配列番号：１７
５’－ＧＧＧＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｆ ｔｒａｃｒＲＮＡ
配列番号：１８
５’－ＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３’
Ｃａｓ１２ｆ ｃｒＲＮＡ
配列番号：１９
５’－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号：２０
５’－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
Ｃａｓ１２ｆ ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体）
配列番号：２１
５’－ＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
【0046】
リガンド結合部分
【0047】
リガンド結合部部分は、例えば非共有結合的な相互作用を形成することによって、リガンドと可逆的に結合することができる要素である。いくつかの実施形態では、リガンド結合部分はアプタマーである。リガンド結合部分は、例えば共有結合を介して直接ｇＲＮＡに結合してもよいし、リンカーを介して結合してもよい。リガンド結合部分とｇＲＮＡとの結合は、共有結合を介した直接結合かリンカーを介した結合かにかかわらず、例えば、アンチリピート領域もしくは遠位領域のいずれかのｔｒａｃｒＲＮＡ、または標的化領域もしくはＣａｓ会合領域のｃｒＲＮＡ、または存在する場合にはｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間のループなど、多数の位置のいずれにあってもよい。リガンド結合部分は、ｇＲＮＡ内のヌクレオチド、例えばユニットの骨格リン酸、糖部分、又はヌクレオチドの窒素塩基に結合していれば、ｇＲＮＡに直接結合するとされる。
【0048】
非限定的な例として、リガンド結合部分は、例えばｇＲＮＡが一本鎖の場合は、ｇＲＮＡの３’末端または５’末端（ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端およびｃｒＲＮＡの３’末端に対応する）に、あるいは、ｃｒＲＮＡの３’末端、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端、またはｃｒＲＮＡの５’末端（それらが別々の鎖である場合）に、（例えば共有結合を介して）直接結合することができる。したがって、リガンド結合部部分は、ｇＲＮＡの最初または最後のヌクレオチド、あるいはｇＲＮＡのいずれかの鎖の最初または最後のヌクレオチドに結合可能である。あるいは、リガンド結合部分は、ｇＲＮＡ（一本鎖の場合）またはｔｒａｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡ（別々の鎖の場合）の最初または最後のヌクレオチドではないヌクレオチドに結合する場合もある。
【0049】
リガンド結合部分がヌクレオチド配列であり、それがｇＲＮＡの５’末端または３’末端に直接結合している場合、それはｇＲＮＡと同じ５’から３’方向であってもよい。このような状況では、リガンド結合部分とｇＲＮＡの両方を含むヌクレオチドの連続鎖が存在し、従って、
・５’－［ｇＲＮＡ］－［リガンド結合部分］－３’または
・５’－［リガンド結合部分］－［ｇＲＮＡ］－３’のいずれかである。
他の実施形態では、リガンド結合部分はｇＲＮＡに反対方向に直接結合されることがあり、従って、
・５’－［ｇＲＮＡ］－３’－３’－［リガンド結合部分］－５’または
・３’－［リガンド結合部分］－５’－５’－［ｇＲＮＡ］－３’のいずれかである。
・５’－［ｇＲＮＡ］－［リガンド結合部分］－３’または
・５’－［リガンド結合部分］－［ｇＲＮＡ］－３’のいずれかである。
他の実施形態では、リガンド結合部分はｇＲＮＡに反対方向に直接結合されることがあり、従って、
・５’－［ｇＲＮＡ］－３’－３’－［リガンド結合部分］－５’または
・３’－［リガンド結合部分］－５’－５’－［ｇＲＮＡ］－３’のいずれかである。
【0050】
リガンド結合部分は、５’末端または３’末端以外の位置でｇＲＮＡに結合することもできる。リガンド結合部分がヌクレオチド配列である場合、それはｇＲＮＡ中に挿入される可能性があり、したがって、例えば、リガンド結合部分の５’にあるｇＲＮＡの第一セクションと、リガンド結合部分の３’にあるｇＲＮＡの第二セクションが存在し、１つのオリゴヌクレオチド配列である５’－［ｇＲＮＡの第一セクション］－［リガンド結合部分］－［ｇＲＮＡの第二セクション］－３’が存在する。リガンド結合部分を含まないｇＲＮＡと比較して、ｇＲＮＡと挿入されたリガンド結合部分を含む複合体では、Ｃａｓ会合領域または標的化領域のいずれからもヌクレオチドが欠失することはない場合がある。あるいは、挿入位置に１つ以上のヌクレオチド（例えば、１～１０ヌクレオチド）の欠失がある場合もある。
【0051】
いくつかの実施形態では、リガンド結合部分はステムとループの複合体を形成する。いくつかの実施形態では、このリガンド結合部分のステムとループの複合体は、リガンド結合部分が存在しない場合にはバルジまたは別のステムとループの複合体が存在する位置に存在する場合がある。
【0052】
いくつかの実施形態では、リガンド結合部分がヌクレオチド配列ではなく、５’末端または３’末端以外の位置でｇＲＮＡに結合する場合、例えば、連続する２つのヌクレオチドの間に結合する場合がある：
・５’－［ｇＲＮＡの第一セクション］－［リガンド結合部分］－［ｇＲＮＡの第二セクション］－３’、
または、ｇＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかで、リン部分、糖の例えば２’、３’または５’位、または窒素塩基に結合していてもよい。これらのリガンド結合部分は、例えば、ｇＲＮＡのバルジやステムループの位置、またはバルジやステムループのない位置に結合する場合もある。
・５’－［ｇＲＮＡの第一セクション］－［リガンド結合部分］－［ｇＲＮＡの第二セクション］－３’、
または、ｇＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかで、リン部分、糖の例えば２’、３’または５’位、または窒素塩基に結合していてもよい。これらのリガンド結合部分は、例えば、ｇＲＮＡのバルジやステムループの位置、またはバルジやステムループのない位置に結合する場合もある。
【0053】
他の実施形態では、リガンド結合部分は、ｇＲＮＡの３’末端、ｇＲＮＡの５’末端、またはｇＲＮＡ内の別の１つ以上の位置に結合されるリンカーに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーおよびリガンド結合部分の各々は、独立して、ヌクレオチドを含むか、実質的にヌクレオチドからなるか、またはヌクレオチドからなっていてもよい。いくつかの実施形態において、リンカーおよびリガンド結合部分の各々は、独立して、ヌクレオチド以外の部分を含むか、実質的にその部分からなるか、またはその部分からなっていてもよい。
【0054】
リガンド結合部分がヌクレオチド配列であり、リンカーを介してｇＲＮＡの５’末端または３’末端に結合している場合、ｇＲＮＡ、リンカー、リガンド結合部分のそれぞれは同じ５’から３’方向であってもよい。このような状況では、リガンド結合部分とｇＲＮＡの両方を含むヌクレオチドの連続鎖が存在し、それらは、
・５’－［ｇＲＮＡ］－［リンカー］－［リガンド結合部分］－３’、または
・５’－［リガンド結合部分］－［リンカー］－［ｇＲＮＡ］－３’のいずれかである。
他の実施形態では、リガンド結合部分および／またはリンカーはｇＲＮＡに反対方向に直接結合されることがあり、従って、
・５’－［ｇＲＮＡ］－３’－３’－［リンカー］－５’－３’－［リガンド結合部分］－５’、
・５’－［ｇＲＮＡ］－３’－５’－［リンカー］－３’－３’－［リガンド結合部分］－５’、
・３’－［リガンド結合部分］－５’－３’－［リンカー］－５’－５’－［ｇＲＮＡ］－３’、または
・３’－［リガンド結合部分］－５’－５’－［リンカー］－３’－５’－［ｇＲＮＡ］－３’である。
・５’－［ｇＲＮＡ］－［リンカー］－［リガンド結合部分］－３’、または
・５’－［リガンド結合部分］－［リンカー］－［ｇＲＮＡ］－３’のいずれかである。
他の実施形態では、リガンド結合部分および／またはリンカーはｇＲＮＡに反対方向に直接結合されることがあり、従って、
・５’－［ｇＲＮＡ］－３’－３’－［リンカー］－５’－３’－［リガンド結合部分］－５’、
・５’－［ｇＲＮＡ］－３’－５’－［リンカー］－３’－３’－［リガンド結合部分］－５’、
・３’－［リガンド結合部分］－５’－３’－［リンカー］－５’－５’－［ｇＲＮＡ］－３’、または
・３’－［リガンド結合部分］－５’－５’－［リンカー］－３’－５’－［ｇＲＮＡ］－３’である。
【0055】
リガンド結合部分は、５’末端または３’末端以外の位置でリンカーを介してｇＲＮＡに結合することもできる。リガンド結合部分とリンカーがヌクレオチド配列である場合、それらはｇＲＮＡ中に挿入される可能性があり、したがって、例えば、リガンド結合部分とリンカーの５’にあるｇＲＮＡの第一セクションと、リガンド結合部分とリンカーの３’にあるｇＲＮＡの第二セクションが存在する。いくつかの実施形態では、リガンド結合部分に隣接して存在するリンカーが２つある。
【0056】
リンカー配列が１つしかない場合、それはリガンド結合部分の５’または３’のどちらかである。したがって、その複合体は、
・５’－［ｇＲＮＡの第一セクション］－［リンカー］－［リガンド結合部分］－［ｇＲＮＡの第二セクション］－３’、または
・５’－［ｇＲＮＡの第一セクション］－［リガンド結合部分］－［リンカー］－［ｇＲＮＡの第二セクション］－３’である。
・５’－［ｇＲＮＡの第一セクション］－［リンカー］－［リガンド結合部分］－［ｇＲＮＡの第二セクション］－３’、または
・５’－［ｇＲＮＡの第一セクション］－［リガンド結合部分］－［リンカー］－［ｇＲＮＡの第二セクション］－３’である。
【0057】
２つのリンカー配列がある場合、第一リンカーはリガンド結合部分の５’であり、第二リンカーはリガンド結合部分の３’である場合がある。従って、その複合体は、
・５’－［ｇＲＮＡの第一セクション］－［第一リンカー］－［リガンド結合部分］－［第二リンカー］－［ｇＲＮＡの第二セクション］－３’である。
・５’－［ｇＲＮＡの第一セクション］－［第一リンカー］－［リガンド結合部分］－［第二リンカー］－［ｇＲＮＡの第二セクション］－３’である。
【0058】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの第一セクション、リンカー、リガンド結合部分、第二リンカー、およびｇＲＮＡの第二セクションの各々は、同じ配向のヌクレオチド配列である。他の実施形態では、第一リンカー、リガンド結合部分および第二リンカーの１つ以上は、ｇＲＮＡの第一セクションおよびｇＲＮＡの第二セクション（これらセクションは同じ向きである）のとは反対の向きである。
【0059】
いくつかの実施形態では、リガンド結合部分がｇＲＮＡの第一セクションとｇＲＮＡの第二セクションの間にある場合（１つまたは２つのリンカーが存在する場合、それらもｇＲＮＡの第一セクションとｇＲＮＡの第二セクションの間にある）：
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは遠位領域の残りとアンチリピート領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは遠位領域の残りとアンチリピート領域全体とｃｒＲＮＡを含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域全体を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはアンチリピート領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域全体を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはアンチリピート領域全体とｃｒＲＮＡを含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域全体とアンチリピート領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはアンチリピート領域の残りを含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域全体とアンチリピート領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはアンチリピート領域の残りとｃｒＲＮＡを含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｇＲＮＡの第二セクションはｃｒＲＮＡを含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ会合領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはＣａｓ会合領域の残りと標的化領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはＣａｓ会合領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはＣａｓ会合領域の残りと標的化領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ会合領域全体を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは標的化領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはＣａｓ会合領域全体を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは標的化領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ会合領域全体と標的化領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは標的化領域の残りを含む；および、
・ｇＲＮＡの第一セクションはＣａｓ会合領域全体と標的化領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは標的化領域の残りを含む。
リガンド結合部分（および任意ではあるが一又は複数のリンカー）を含まないｇＲＮＡと比較して、ｇＲＮＡとそこに挿入されたリガンド結合部分を含む複合体では、その挿入領域から又はその挿入領域の周辺のヌクレオチドが欠失することはない場合がある。あるいは、挿入位置に又は挿入位置の周辺に１つ以上のヌクレオチド（例えば、１～１０ヌクレオチド）の欠失がある場合もある。
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは遠位領域の残りとアンチリピート領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは遠位領域の残りとアンチリピート領域全体とｃｒＲＮＡを含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域全体を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはアンチリピート領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域全体を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはアンチリピート領域全体とｃｒＲＮＡを含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域全体とアンチリピート領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはアンチリピート領域の残りを含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションは遠位領域全体とアンチリピート領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはアンチリピート領域の残りとｃｒＲＮＡを含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｇＲＮＡの第二セクションはｃｒＲＮＡを含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ会合領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはＣａｓ会合領域の残りと標的化領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはＣａｓ会合領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションはＣａｓ会合領域の残りと標的化領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ会合領域全体を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは標的化領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはＣａｓ会合領域全体を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは標的化領域全体を含む；
・ｇＲＮＡの第一セクションはｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ会合領域全体と標的化領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは標的化領域の残りを含む；および、
・ｇＲＮＡの第一セクションはＣａｓ会合領域全体と標的化領域の一部を含み、ｇＲＮＡの第二セクションは標的化領域の残りを含む。
リガンド結合部分（および任意ではあるが一又は複数のリンカー）を含まないｇＲＮＡと比較して、ｇＲＮＡとそこに挿入されたリガンド結合部分を含む複合体では、その挿入領域から又はその挿入領域の周辺のヌクレオチドが欠失することはない場合がある。あるいは、挿入位置に又は挿入位置の周辺に１つ以上のヌクレオチド（例えば、１～１０ヌクレオチド）の欠失がある場合もある。
【0060】
２つのリンカーが存在する場合、それらは互いにハイブリダイズできるような十分な相補性があってもよい。例えば、各リンカーは１～２０ヌクレオチド長であり、リンカーは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％相補的であり、バルジを含まないか、１つまたは複数のバルジを有する場合もある。いくつかの実施形態では、リンカーは同じサイズであり、他の実施形態では、リンカーは互いに異なるサイズである。
【0061】
リガンド結合部分が直接またはリンカーを介してｇＲＮＡのループに結合される場合、結合は例えば、ループ内の第１ヌクレオチド、ループ内の第２ヌクレオチド、ループ内の第３ヌクレオチド、ループ内の第４ヌクレオチド、ループが奇数ヌクレオチドである場合はループ内の中央ヌクレオチド、ループが偶数ヌクレオチドである場合はループ内の２つの最中央ヌクレオチドのうちの１つ、またはループ内の最後のヌクレオチドであってもよい。前述のヌクレオチドおよび／またはそれらに対応する５’および／または３’ヌクレオチド間連結のいずれか１つ以上が修飾されていてもよい。これらの修飾は、例えば、リガンド結合部分がｇＲＮＡに（直接またはリンカーを介して）結合している箇所で起こるか、またはリガンド結合部分がｇＲＮＡに（直接またはリンカーを介して）結合している箇所以外の場所でのみ起こる場合がある。例えば、リガンド結合部分は糖の２’位に結合したり、ｇＲＮＡオリゴヌクレオチド配列の窒素塩基に結合したりしてもよい。
【0062】
いくつかの実施形態において、リガンド結合部分は、修飾されていないか、あるいは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。例えば、リガンド結合部分は１０～５０または１８～５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、リガンド結合部分はステムループ構造を形成する。リンカーが存在しない場合、リガンド結合部分はｇＲＮＡの５’もしくは３’、またはｔｒａｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡの５’もしくは３’のすぐ近くにあるｇＲＮＡ配列の延長として現れることもあれば、挿入として現れることもある。
【0063】
いくつかの実施形態において、リガンド結合部分は、ビオチンまたはストレプトアビジンを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0064】
いくつかの実施形態において、リガンド結合部分は、以下のリガンドと結合する部分からなる群より選択される：ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、Ｋｕ、ＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）、Ｃｏｍ ＲＮＡ結合タンパク質またはその結合ドメイン、ＳｆＭｕ、Ｓｍ７、Ｔａｔ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＣＳＹ４、Ｑｂｅｔａ、ＣＯＭ、ｐｕｍｉｌｉｏ、抗Ｈｉｓタグ（６Ｈ７）、ＳＮＡＰ－タグ、ラムダ（λ）Ｎ２２、レクチン（この場合、リガンド結合部分は炭水化物または糖鎖またはオリゴ糖であってもよい）、およびＰＤＧＦβ鎖。いくつかの実施形態において、リガンド結合部分は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその両方の組み合わせからなるアプタマーである。したがって、非限定的な例として、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、骨格（バックボーン）に修飾ヌクレオシドを有するＤＮＡアプタマー、骨格（バックボーン）に修飾ヌクレオシドを有するＲＮＡアプタマー、およびそれらの組み合わせを使用することができる。
【0065】
いくつかの実施形態では、天然に存在するＭＳ２アプタマーがリガンド結合部分として使用される。他の実施形態では、ＭＳ２ Ｃ－５変異体、ＭＳ２ Ｆ－５変異体、または修飾ＭＳ２（例、１つ以上の、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の修飾ヌクレオチド（例、１０位のアミノプリン）が存在するＭＳ２であって、ここで１０位はアプタマーの５’末端から１０番目のヌクレオチドであるもの）を使用する。２－アミノプリンは、例えば、２’デオキシ－２－アミノプリンまたは２’リボース２－アミノプリンである。任意のある位置の修飾は、別の位置の修飾に加えてもよいし、任意のまたは全ての他の位置での修飾を除いてのものであってもよい。
【0066】
いくつかの実施形態において、リガンド結合部分は、５’修飾ヌクレオチドを含むアプタマーであり、ここで、５’修飾ヌクレオチドは、２’修飾、５’ＰＯ４基、または窒素塩基の修飾のうちの少なくとも１つを含む。
【0067】
いくつかの実施形態では、リガンド結合部分はアプタマーであって、アプタマー－リガンド対の一方の部分であるか、またはそれを含むものである。後述するように、エフェクターはアプタマー－リガンド対の他方の部分に連結されるか、またはそれを含む。例えば、アプタマーは、ＭＳ２コートタンパク質ＭＣＰに特異的に結合するＭＳ２オペレーターモチーフを含んでいてもよい。また、当業者であれば理解できるように、アプタマーはＭＣＰ部分（または他のリガンド）を含むことができ、その場合エフェクターはＭＳ２オペレーターモチーフ（または他の対応するリガンド結合部分）を含むか、またはＭＳ２オペレーターモチーフに連結される。
【0068】
リンカー
【0069】
リンカーは、存在する場合、リガンド結合部分とｇＲＮＡをつなぐ一種であってもよい。リガンド結合部分とｇＲＮＡのそれぞれに１ヶ所ずつ結合していてもよいし、ｇＲＮＡとリガンド結合部分のいずれか一方または両方に複数ヶ所結合していてもよい。複数の場所に結合すると、リガンド結合部分、ひいては使用されるエフェクターの三次元空間におけるより詳細な制御を可能にする場合がある。
【0070】
非限定的な例として、リンカーは１箇所でｇＲＮＡに結合し、２箇所以上でリガンド結合部分に結合する；またはリンカーは１箇所でリガンド結合部分に結合し、２箇所以上でｇＲＮＡに結合する。リンカーが２箇所以上でｇＲＮＡに結合している場合、リンカーは標的化領域でのみｇＲＮＡに結合してもよく、Ｃａｓ会合領域のみ、あるいは標的化領域とＣａｓ会合領域の両方に存在してもよく、アンチリピート領域にのみ存在してもよく、遠位領域のみに存在してもよく、アンチリピート領域と遠位領域の両方、遠位領域と標的化領域の両方、アンチリピート領域とＣａｓ会合領域の両方、アンチリピート領域と標的化領域の両方、またはＣａｓ会合領域と遠位領域の両方に存在してもよい。
【0071】
いくつかの実施形態において、リンカーは、オリゴヌクレオチド配列を含むか、実質的にオリゴヌクレオチド配列からなるか、またはオリゴヌクレオチド配列からなり、任意ではあるが、リンカーは、少なくとも１つまたは複数の２’修飾を含み、例えば、リンカー内の全てのヌクレオチドは２’修飾ヌクレオチドである。ヌクレオチド配列はランダムであってもよいし、アプタマー、ｇＲＮＡまたはＤＮＡの標的部位内の配列と望ましくない相補性がないように意図的にデザインされていてもよい。
【0072】
いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0073】
いくつかの実施形態において、リンカーは、レブリニル部分を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0074】
いくつかの実施形態において、リンカーは、エチレングリコール部分を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0075】
いくつかの実施形態では、リンカーは、１８Ｓ、９ＳまたはＣ３を含むか、それらよりなる群から選択される。
【0076】
いくつかの実施形態において、リンカーは、１～６０個、１～２４個、２～２０個、または５～１５個のヌクレオチド長であるヌクレオチド配列である。さらに、いくつかの実施形態では、リンカーはＧＣリッチであり、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のＧＣヌクレオチドを有する。リンカーがヌクレオチドを含む場合、それは例えば、一本鎖または二本鎖、あるいは部分的に一本鎖および部分的に二本鎖であってもよい。さらに、リンカーがオリゴヌクレオチドである場合、リンカーはＲＮＡのみ、ＤＮＡのみ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【0077】
いくつかの実施形態において、リンカーは、リガンド結合部分の上流または下流にあるヌクレオチド配列である。リンカーがリガンド結合部分の上流にあり、ｇＲＮＡがリンカーの上流にある場合、リガンド結合部分の下流にあるリンカーに相補的な別の配列が存在する可能性がある。同様に、リンカーがリガンド結合部分の下流にあり、ｇＲＮＡがリンカーの下流にある場合、リガンド結合部分の上流にあるリンカーに相補的な別の配列があってもよい。当業者であれば認識するように、相補性は、オリゴヌクレオチド自身が折り畳まれ、鎖が５’から３’方向に各対応部分と整列したときに決定される。
【0078】
したがって、いくつかの実施形態において、リガンド結合部分、例えばＭＳ２は、１～１２ヌクレオチド長である上流配列および１～１２ヌクレオチド長である下流配列を有し、これらの上流配列および下流配列は、リガンド結合部分に直接隣接し（すなわち、リガンド結合部分と上流配列および下流配列の各々との間に他のヌクレオチドは存在しない）、上流配列は下流配列に相補的である。いくつかの実施形態において、上流配列および下流配列の各々は、１ヌクレオチド長、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、または１２ヌクレオチド長である。一実施形態では、上流配列と下流配列のそれぞれがＧＣを含むか、ＧＣである。上流配列と下流配列の両方がある場合、それらは伸長配列と呼ばれることもある。
【0079】
修飾
【0080】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡまたはリガンド結合部分の少なくとも１つが修飾され、あるいはリンカーが存在する場合、ｇＲＮＡ、リガンド結合部分またはリンカーの少なくとも１つが修飾される。修飾とは、天然には存在しない部位や種を導入することである。修飾は、安定性と特異性の一方または両方を高めるために使用可能である。いくつかの実施形態において、安定性は、Ｃａｓタンパク質の活性ドメイン（例えば、ＲｕｖＣドメイン）および本発明の複合体が導入される系内の１つ以上の他の酵素の活性ドメインの一方または両方（任意のエフェクターを含むが、これらに限定されない）に対する耐性に関して改善される。修飾がオフターゲット効果の可能性を減少させ、および／または、本発明の塩基編集複合体がその標的部位に到達する可能性を増加させる場合、特異性は改善される。ヌクレオチドは、リボース、リン酸連結、および／または塩基部分で修飾可能である。例えば、ホスホロチオエート骨格は、ｇＲＮＡ、アンチリピート領域、遠位領域、標的化領域またはＣａｓ会合領域および／またはリガンド結合部分および／またはリンカー（存在する場合）内の１つ、複数または全ての位置で使用され得る。
【0081】
いくつかの実施形態において、修飾は、１つ以上の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ）の存在および／またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結の存在、あるいはｇＲＮＡおよび／またはリガンド結合部分の５’－ＰＯ４基の導入である。
【0082】
いくつかの実施形態において、修飾または修飾のセットは、その修飾または修飾のセットを欠くｇＲＮＡ－リガンド結合複合体と比較して、ＲｕｖＣ活性ヌクレアーゼドメインに対する耐性を付与するように選択される。ある実施形態では、耐性は立体障害によって引き起こされることがある。いくつかの実施形態において、修飾（複数可）は、標的化領域内のヌクレオチドのすべてではないにしても、１つまたは複数個の中および／または間に位置する。
【0083】
１つより多い修飾が存在する場合、修飾は、例えば、すべて標的化領域にあってもよく；すべてＣａｓ会合領域にあってもよく；すべてアンチリピート領域にあってもよく；すべて遠位領域にあってもよく；すべてリガンド結合部分にあってもよく；すべてリンカー（存在する場合）にあってもよく；標的化領域とＣａｓ会合領域の両方にあってもよく；Ｃａｓ会合領域とリガンド結合部分の両方にあってもよく；Ｃａｓ会合領域とリンカー（存在する場合）の両方にあってもよく；標的化領域とリガンド結合部分の両方にあってもよく；標的化領域とリンカー（存在する場合）の両方にあってもよく；リガンド結合部分とリンカー（存在する場合）の両方にあってもよく；Ｃａｓ会合領域と標的化領域とリガンド結合部分の３者すべてにあってもよく；Ｃａｓ会合領域と標的化領域とリンカー（存在する場合）にあってもよく；Ｃａｓ会合領域とリガンド結合部分とリンカー（存在する場合）にあってもよく；標的化領域とリガンド結合部分とリンカー（存在する場合）にあってもよく；Ｃａｓ会合領域と標的化領域とリガンド結合部分とリンカー（存在する場合）のそれぞれにあってもよく；アンチリピート領域と遠位領域にあってもよく；アンチリピート領域とＣａｓ会合領域にあってもよく；アンチリピート領域と標的化領域にあってもよく；遠位領域とＣａｓ会合領域にあってもよく；遠位領域と標的化領域にあってもよく；遠位領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；アンチリピート領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；Ｃａｓ会合領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；標的化領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；標的化領域とＣａｓ会合領域とアンチリピート領域と遠位領域のそれぞれにあってもよく；リガンド結合部分およびアンチリピート領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；リガンド結合部分およびＣａｓ会合領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；リガンド結合部分および標的化領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；および、リガンド結合部分および標的化領域とＣａｓ会合領域とアンチリピート領域と遠位領域のそれぞれにあってもよい。
【0084】
いくつかの実施形態では、１～６０個または１～３０個または１～１０個または１０～２０個または２０～３０個または３０～４０個または４０～５０個または５０～６０個の２’修飾がある。非限定的な例として、２’修飾のセットは、標的化領域；アンチリピート領域；遠位領域；リガンド結合部分がオリゴヌクレオチド配列であるか、またはオリゴヌクレオチド配列を含む場合、リガンド結合部分；またはＣａｓ会合領域、あるいはそれらの組み合わせに位置していてもよい。修飾は連続したヌクレオチド上にあってもよいし、規則的または不規則的なパターンで修飾ヌクレオチド間に１対以上の非修飾ヌクレオチドがあってもよい。さらなる非限定的な例として、ｇＲＮＡ内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８位のいずれか１つ以上が２’－Ｏ－アルキル基を含み、その位置はｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡの５’末端または３’末端から数えられる。
【0085】
いくつかの実施形態において、２’修飾ヌクレオチドに加えて又は２’修飾ヌクレオチドの非存在下で、ホスホロチオエート連結のような修飾ヌクレオチド間連結が存在する。ｇＲＮＡ、（オリゴヌクレオチドにおける）リガンド結合部分、および（存在する場合、およびオリゴヌクレオチドの）リンカーの骨格に対する修飾の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’－５’連結を有するセレノホスファートおよびボランホスファート、これらの２’－５’連結アナログ、ならびに１つ以上のヌクレオチド間連結が３’－３’連結、５’－５’連結または２’－２’連結である反転極性を有するものが挙げられる。反転極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、最も３’末端のヌクレオチド間連結、すなわち、アベーシック（核酸塩基が欠損しているか、その代わりにヒドロキシル基を有するもの）であってもよい単一の反転ヌクレオシド残基における単一の３’から３’への連結を含む。前述のヌクレオチド間連結の種々の塩（例えば、カリウムまたはナトリウムなどのもの）、混合塩および遊離酸形態も本発明の範囲に含まれる。
【0086】
また、本発明の範囲内には、その中にリン原子を含まず、代わりに短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有するポリヌクレオチド骨格の使用もある。これらの修飾には、（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）モルホリノ連結を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、スルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルマセチルおよびチオホルマセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケンを含む骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸塩およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２構成部分が混在している他の骨格が含まれる。
【0087】
いくつかの実施形態では、複合体の１つ以上の部分は、１～６０個、または１～２０個、または１～１０個、または１０～２０個、または２０～３０個、または３０～４０個、または４０～５０個、または５０～６０個のホスホロチオエート連結を有する。これらのホスホロチオエート連結は、すべて標的化領域にあってもよく；すべてＣａｓ会合領域にあってもよく；すべてアンチリピート領域にあってもよく；すべて遠位領域にあってもよく；すべてリガンド結合部分にあってもよく；すべてリンカー（存在する場合）にあってもよく；標的化領域とＣａｓ会合領域の両方にあってもよく；Ｃａｓ会合領域とリガンド結合部分の両方にあってもよく；Ｃａｓ会合領域とリンカー（存在する場合）の両方にあってもよく；標的化領域とリガンド結合部分の両方にあってもよく；標的化領域とリンカー（存在する場合）の両方にあってもよく；リガンド結合部分とリンカー（存在する場合）の両方にあってもよく；Ｃａｓ会合領域と標的化領域とリガンド結合部分の３者すべてにあってもよく；Ｃａｓ会合領域と標的化領域とリンカー（存在する場合）にあってもよく；Ｃａｓ会合領域とリガンド結合部分とリンカー（存在する場合）にあってもよく；標的化領域とリガンド結合部分とリンカー（存在する場合）にあってもよく；Ｃａｓ会合領域と標的化領域とリガンド結合部分とリンカー（存在する場合）のそれぞれにあってもよく；アンチリピート領域と遠位領域にあってもよく；アンチリピート領域とＣａｓ会合領域にあってもよく；アンチリピート領域と標的化領域にあってもよく；遠位領域とＣａｓ会合領域にあってもよく；遠位領域と標的化領域にあってもよく；遠位領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；アンチリピート領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；Ｃａｓ会合領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；標的化領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；標的化領域とＣａｓ会合領域とアンチリピート領域と遠位領域のそれぞれにあってもよく；リガンド結合部分およびアンチリピート領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；リガンド結合部分およびＣａｓ会合領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；リガンド結合部分および標的化領域を除くｇＲＮＡの全領域にあってもよく；および、リガンド結合部分および標的化領域とＣａｓ会合領域とアンチリピート領域と遠位領域のそれぞれにあってもよい。
【0088】
本発明の複合体内の任意のヌクレオチドは、１つ以上の置換された糖部分を含む場合がある。これらのヌクレオチドは、以下から選択される糖置換基を含んでいてもよい：ＯＨ；Ｈ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｃｏ－アルキルであって、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい糖置換基。特に好適なものは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、ここでｎおよびｍは１～約１０である。他の適切なヌクレオチドは、以下から選択される糖置換基を含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基。非限定的な例として、好適な修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られるもの）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５年、７８、４８６－５０４）または別のアルコキシアルコキシ基を含む。さらなる好適な修飾としては、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’－ＤＭＡＯＥとしても知られているもの）、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’－Ｏ－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても当該技術分野で知られているもの）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２が挙げられる。
【0089】
他の適切な糖置換基としては、メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）、アミノプロポキシ（－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、－Ｏ－アリル（ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）が挙げられる。２’－糖置換基はアラビノ位（上）またはリボ位（下）にあってもよい。適切な２’－アラビノ修飾は２’－Ｆである。同様の修飾は、オリゴマー化合物の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上の糖の３’位または２’－５’連結オリゴヌクレオチド中、および５’末端ヌクレオチドの５’位でも行うことができる。
【0090】
本発明の複合体内の任意のヌクレオチドはまた、核酸塩基（当技術分野ではしばしば単に「塩基」と呼ばれる）の修飾または置換を含み得る。修飾核酸塩基には、限定はされないが、以下のような他の合成および天然の核酸塩基が含まれる：５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンとグアニンの６－メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２－プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン、チミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、その他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、その他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンと７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、８－アザグアニンと８－アザアデニン、７－デアザグアニンと７－デアザアデニン、３－デアザグアニンと３－デアザアデニン。さらなる修飾核酸塩基としては、限定はされないが、三環ピリミジン（例、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン））、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）などのＧ－クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）、および５－メトキシウラシルが挙げられる。
【0091】
複素環式塩基部分には、限定はされないが、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置換されたもの、例えば７－デアザアデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、２－ピリドンなども含まれる。他の核酸塩基の例としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８－８５９ページ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．、編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１年、３０、６１３、によって開示されているもの、および、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９－３０２ページ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．とＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年により開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基の一部は、オリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに有用である：５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、Ｎ－２、Ｎ－６、Ｏ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシン。さらに、５－メチルシトシン置換は、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせると有利である。
【0092】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに結合される２つのリガンド結合部分、すなわち第一リガンド結合部分と第二リガンド結合部分が存在する。任意ではあるが、２つのリンカー：第一リンカーと第二リンカーが存在していてもよく、第一リガンド結合部分は第一リンカーに結合し、第二リガンド結合部分は第二リンカーに結合する。これらの実施形態において、第一リンカーおよび第二リンカーはそれぞれ、Ｃａｓ会合領域に結合していてもよい；または、第一リンカーと第二リンカーはそれぞれ標的化領域に結合していてもよい；または、第一リンカーおよび第二リンカーの一方がＣａｓ会合領域に結合され、第一リンカーおよび第二リンカーの他方が標的化領域に結合されてもよく、または第一リンカーおよび第二リンカーがそれぞれアンチリピート領域に結合されてもよい；または、第一リンカーと第二リンカーはそれぞれ遠位領域に結合していてもよい；または、第一リンカーおよび第二リンカーの一方が遠位領域に結合され、第一リンカーおよび第二リンカーの他方がアンチリピート領域に結合されてもよい；または、第一リンカーおよび第二リンカーの一方が遠位領域に結合され、第一リンカーおよび第二リンカーの他方がＣａｓ会合領域に結合されてもよい；または、第一リンカーおよび第二リンカーの一方が遠位領域に結合され、第一リンカーおよび第二リンカーの他方が標的化領域に結合されてもよい；または、第一リンカーおよび第二リンカーの一方がアンチリピート領域に結合され、第一リンカーおよび第二リンカーの他方がＣａｓ会合領域に結合されてもよい；または、第一リンカーおよび第二リンカーの一方がアンチリピート領域に結合され、第一リンカーおよび第二リンカーの他方が標的化領域に結合されてもよい；または、第一リンカーおよび第二リンカーの一方がループ領域（存在する場合）に結合され、第一リンカーおよび第二リンカーの他方が標的化領域、Ｃａｓ会合領域、アンチリピート領域、もしくは遠位領域の一つに結合されてもよい。
【0093】
図１Ａは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、リガンド結合部分１１４が、（ｃｒＲＮＡ１１０がｔｒａｃｒＲＮＡの一部とハイブリダイズする別個の鎖である）Ｃａｓ１２ｂ ｇＲＮＡ中のｔｒａｃｒＲＮＡ１１２の５’末端に結合している。図１Ｂは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、リガンド結合部分１２４がｔｒａｃｒＲＮＡ１２２の３’末端に結合している。また、ｃｒＲＮＡ１２０も示されている。図１Ｃは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、リガンド結合部分１３４がｃｒＲＮＡ１３０の５’末端に結合している。また、ｔｒａｃｒＲＮＡ１３２も示されている。図１Ｄは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、第一リガンド結合部分１４６がｔｒａｃｒＲＮＡ１４２の５’末端に結合し、第二リガンド結合部分１４４がｃｒＲＮＡ１４０の５’末端に結合している。非限定的な例として、図１Ａ～図１Ｄおよび他の全ての図に示されるリガンド結合部分の各々は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー、炭水化物またはオリゴ糖基、ＳＮＡＰ／ＣＬＩＰタギング用のベンジルグアニンまたはベンジルシトシン基、バイオコンジュゲーション基（例えば、クリックケミストリー用のアジド－アルキン基）、ビオチン、または親和性結合または共有結合に使用される他の官能基であってもよい。図１Ｄに示すような二重リガンド結合部分システムでは、機能性をさらに高めるために、異なるまたは類似の官能基が各分子に結合可能である。
【0094】
図２Ａは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、リガンド結合部分２１４が、（ｃｒＲＮＡ２１０がｔｒａｃｒＲＮＡと同じヌクレオチドの鎖の一部である）Ｃａｓ１２ｂ ｇＲＮＡ中のｔｒａｃｒＲＮＡ２１２の５’末端に結合している。図２Ｂは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、リガンド結合部分２２４が、Ｃａｓ１２ｂ ｇＲＮＡ中のｔｒａｃｒＲＮＡ２２２とｃｒＲＮＡ２２０の間のループに結合している。図２Ｃは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、第一リガンド結合部分２３４がｔｒａｃｒＲＮＡ２３２とｃｒＲＮＡ２３０の間のループ領域に結合し、第二リガンド結合部分２３６がＣａｓ１２ｂ ｇＲＮＡ中のｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に結合している。図２Ｄは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、リガンド結合部分２４４がｔｒａｃｒＲＮＡ領域２４２内のループに結合し、ｃｒＲＮＡ２４０がＣａｓ１２ｂ ｇＲＮＡ中のｇＲＮＡの３’部分を形成する。
【0095】
図３Ａは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、リガンド結合部分３１４が（別の鎖であるｃｒＲＮＡ３１０を有する）Ｃａｓ１２ｅ ｇＲＮＡ内のｔｒａｃｒＲＮＡ３１２の３’末端に結合している。図３Ｂは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、リガンド結合部分３２４が（別の鎖であるｃｒＲＮＡ３２０を有する）Ｃａｓ１２ｅ ｇＲＮＡ内のｔｒａｃｒＲＮＡ３２２の５’末端に結合している。図３Ｃは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、リガンド結合部分３３４が（別の鎖であるｔｒａｃｒＲＮＡ３３２を有する）Ｃａｓ１２ｅ ｇＲＮＡ内のｃｒＲＮＡ３３０の５’末端に結合している。図３Ｄは、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体の図示であって、リガンド結合部分３３４が（別の鎖であるｔｒａｃｒＲＮＡ３４２を有する）Ｃａｓ１２ｅ ｇＲＮＡ内のｃｒＲＮＡ３４０の３’末端に結合している。
【0096】
図４Ａは、Ｃａｓ１２ｅシステム用のｇＲＮＡの図示であって、第一リガンド結合部分４１４がｃｒＲＮＡ４１０の５’末端に結合し、第二リガンド結合部分４１６がｔｒａｃｒＲＮＡ４１２の５’末端に結合している。図４Ｂは、Ｃａｓ１２ｅシステム用のｇＲＮＡの図示であって、第一リガンド結合部分４２６がｃｒＲＮＡ４２０の３’末端に結合し、第二リガンド結合部分４２４がｔｒａｃｒＲＮＡ４２２の３’末端に結合している。図４Ｃは、Ｃａｓ１２ｅシステム用のｇＲＮＡの図示であって、第一リガンド結合部分４３４がｔｒａｃｒＲＮＡ４３２の５’末端に結合し、第二リガンド結合部分４３６がｃｒＲＮＡ４３０の３’末端に結合している。
【0097】
図５Ａは、Ｃａｓ１２ｅシステム用のｇＲＮＡの図示であって、第一リガンド結合部分５１４がｔｒａｃｒＲＮＡ５１２の５’末端に結合し、ｃｒＲＮＡ５１０はｔｒａｃｒＲＮＡと同じヌクレオチド鎖の一部である。図５Ｂは、Ｃａｓ１２ｅシステム用のｇＲＮＡの図示であって、リガンド結合部分５２４がｔｒａｃｒＲＮＡ５２２とｃｒＲＮＡ５２０の間のループに結合している。図５Ｃは、Ｃａｓ１２ｅシステム用のｇＲＮＡの図示であって、リガンド結合部分５３４が（ｔｒａｃｒＲＮＡ５３２の下流にあって、その内部でヘアピンを形成する）ｃｒＲＮＡ５３０の３’末端に結合している。図５Ｄは、Ｃａｓ１２ｅシステム用のｇＲＮＡの図示であって、リガンド結合部分５４４がｔｒａｃｒＲＮＡ５４２内のループに結合し、ｃｒＲＮＡ５４０はｔｒａｃｒＲＮＡとヘアピンを形成する。
【0098】
図６Ａは、Ｃａｓ１２ｆシステム用のｇＲＮＡの図示であって、リガンド結合部分６１４がｔｒａｃｒＲＮＡ６１２の５’末端に結合し、ｃｒＲＮＡ６１０は別鎖であってｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイゼーション領域を形成する。図６Ｂは、Ｃａｓ１２ｆシステム用のｇＲＮＡの図示であって、リガンド結合部分６２４がｔｒａｃｒＲＮＡ６２２の３’末端に結合し、ｃｒＲＮＡ６２０は別鎖であってｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイゼーション領域を形成する。図６Ｃは、Ｃａｓ１２ｆシステム用のｇＲＮＡの図示であって、リガンド結合部分６３４がｃｒＲＮＡ６３０の５’末端に結合し、ｔｒａｃｒＲＮＡ６３２は示されたものである。
【0099】
図７Ａは、Ｃａｓ１２ｆシステム用のｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの両方を含むヌクレオチド単鎖であるｇＲＮＡであって、リガンド結合部分７１４がｔｒａｃｒＲＮＡ７１２の５’末端に結合され、ｔｒａｃｒＲＮＡ７１２はｃｒＲＮＡ７１０と連続したヌクレオチド鎖を形成している。図７Ｂは、Ｃａｓ１２ｆシステム用のｔｒａｃｒＲＮＡ７２２とｃｒＲＮＡ７２０の両方を含むヌクレオチド単鎖であるｇＲＮＡであって、リガンド結合部分７２４がｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの間のループに結合される。図７Ｃは、Ｃａｓ１２ｆ用のｇＲＮＡであって、第一リガンド結合部分７３６がｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ７３２の５’末端に位置し、第二リガンド結合部分７３４がｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡ７３０との間のループに位置する。
【0100】
塩基編集複合体
【0101】
本発明の別の実施形態によれば、塩基編集複合体が存在する。この塩基編集複合体は、本発明のｇＲＮＡ－リガンド結合複合体およびＶ型Ｃａｓタンパク質を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、前記ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体のＣａｓ会合領域およびアンチリピート領域は前記Ｖ型Ｃａｓタンパク質と会合する。このように、ｇＲＮＡはＣａｓタンパク質と会合することができる。会合が起こると、Ｃａｓタンパク質は標的化配列の同一性に基づいて標的部位を見つける。
【0102】
Ｖ型Ｃａｓタンパク質
【0103】
一般的に、Ｃａｓタンパク質は少なくとも一つのＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ結合ドメインはＣａｓ会合領域でガイドＲＮＡと相互作用する。本発明で使用するＶ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ会合領域に対して十分な相補性を有するアンチリピート領域を含むｔｒａｃｒＲＮＡの存在下で、ｇＲＮＡ－リガンド結合複合体が会合できるものである。いくつかの実施形態において、Ｖ型Ｃａｓタンパク質はＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼである。このＲｕｖＣドメインは、エンドヌクレアーゼ活性が不活性化されるように変異している場合がある。いくつかの実施形態では、このタンパク質は活性化または非活性化ＲｕｖＣドメインを含むニッカーゼである。
【0104】
本発明に関連して使用され得るＶ型Ｃａｓタンパク質の例としては、活性型または不活性化型のＣａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｅ、ＣａｓＭＩＮＩおよびＣａｓ１２ｆが挙げられるが、これらに限定されない。
【0105】
Ｃａｓタンパク質は、精製または単離された形態で提供可能であり、組成物または複合体の一部である場合もある。好ましくは、組成物中にある場合、本タンパク質はまずある程度まで精製され、より好ましくは高いレベルの純度（例えば、約８０％、９０％、９５％、または９９％以上）まで精製される。本発明の複合体およびコンポーネント（構成要素）が貯蔵および移入され得る組成物は、所望の任意のタイプの組成物であってよく、例えば、当業者であれば、本発明との関連において有用であると理解するであろう、ＲＮＡ誘導標的化（ターゲティング）のための組成物として使用され、またはその組成物への包含に適した水性組成物である。
【0106】
いくつかの実施形態において、Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、（ａ）活性型、部分的に不活性化された、または不活性化されたＶ型Ｃａｓタンパク質、および（ｂ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）阻害ペプチド（ＵＧＩ）を有する融合タンパク質を含む。ＵＧＩペプチドはＶ型Ｃａｓタンパク質に直接、あるいは１～１００アミノ酸残基からなるリンカーペプチドを介して融合可能である。いくつかの実施形態において、ＵＧＩは、ＢａｃｉｌｌｕｓファージＰＢＳ２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐ１４７３９）由来の野生型ＵＧＩ配列：ＭＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴＳＤＡＰＥＹＫＰＷＡＬＶＩＱＤＳＮＧＥＮＫＩＫＭＬ（配列番号：２２）を含む。いくつかの実施形態において、ＵＧＩは、野生型ＵＧＩペプチドのフラグメントまたは配列番号：２２に相同なアミノ酸配列を含む、配列番号：２２の変異体を含む。いくつかの実施形態において、相同配列のＵＧＩフラグメントは、野生型ＵＧＩペプチド配列（配列番号：２２）に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の相同性を含む。
【0107】
いくつかの実施形態において、活性化または不活性化Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、２つ以上のＵＧＩペプチドまたは変異体との融合体を含んでなる。ＵＧＩペプチドまたはＵＧＩペプチドの変異体は、別のＵＧＩペプチドまたはＶ型Ｃａｓタンパク質に直接、または１～１００アミノ酸残基のリンカーを介して別のＵＧＩペプチドまたはＶ型Ｃａｓタンパク質に連結することができる。
【0108】
Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質融合体は、精製または単離された形態で提供可能であり、組成物または複合体の一部である場合もある。
【0109】
エフェクター
【0110】
本発明の塩基編集複合体は、リガンドに結合したエフェクターを含んでいてもよい。リガンドは、リガンド結合部分と可逆的または不可逆的に結合することができる。このように、リガンド結合部分は、リガンドとの結合を保持することができるため、リガンドと融合しているか、そうでなければリガンドと結合しているエフェクター（例、塩基編集酵素）をリクルートする。このデザインは、ｇＲＮＡの核酸配列標的化機能とエフェクター機能が異なる分子に存在するモジュラーデザインを提供するため、特に有利であると考えられる。例えば、同じ部位に連続的に修飾を導入するには、同じリガンドに結合する互いに異なるエフェクターを使うことができる。逆に、異なる部位に同じ修飾を導入するには、同じエフェクター－リガンドを使いながら、互いに異なるｇＲＮＡで同じリガンド結合部分を使うことができる。従って、このデザインは、ｇＲＮＡやＣａｓタンパク質のいずれかにエフェクターを融合させるという望ましくない負担なしに、システムの多重化を可能にする。
【0111】
本発明に関連して使用され得るエフェクターの例には、シチジン脱アミノ化またはアデニン脱アミノ化活性を有するものなどの脱アミノ化酵素（デアミナーゼ）、ならびに転写調節因子、修復酵素、エピジェネティック修飾因子、ヒストンアセチル化酵素（アセチラーゼ）、脱アセチル化酵素（デアセチラーゼ）、（ヒストンおよびヌクレオチドの）メチル化酵素（メチラーゼ）、および（ヒストンおよびヌクレオチドの）脱メチル化酵素（デメチラーゼ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、エフェクターは、ＡＩＤ、ＣＤＡ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＤＡ、ＡＤＡＲおよびｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼからなる群より選択される。エフェクターの例と、それらが引き起こす遺伝的変化のタイプを表１に示す。
【0112】
表１エフェクタータンパク質の例
【0113】
【表1】
【0114】
エフェクタータンパク質のフルネーム：
ＡＩＤ：活性化誘導シチジンデアミナーゼ、別名ＡＩＣＤＡ
ＡＰＯＢＥＣ１：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒１
ＡＰＯＢＥＣ３Ａ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ａ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｂ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｃ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｄ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｆ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｇ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｈ
ＡＤＡ：アデノシンデアミナーゼ
ＡＤＡＲ１：ＲＮＡ作用アデノシンデアミナーゼ１
ＡＤＡＲ２：ＲＮＡ作用アデノシンデアミナーゼ２
ＡＤＡＲ３：ＲＮＡ作用アデノシンデアミナーゼ３
Ｄｎｍｔ１：ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ１
Ｄｎｍｔ３ａ：ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３アルファ
ＴａｄＡ：ｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ
ＴＡＤＡ：ｔＲＮＡ（アデニン（３４））デアミナーゼ、葉緑体性
ＴＡＤ３：ｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼＴＡＤ３
ＴＥＴ１：メチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ１
ＴＥＴ２：メチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ２
ＴＤＧ：Ｇ／Ｔミスマッチ特異的チミンＤＮＡグリコシラーゼ
ＡＩＤ：活性化誘導シチジンデアミナーゼ、別名ＡＩＣＤＡ
ＡＰＯＢＥＣ１：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒１
ＡＰＯＢＥＣ３Ａ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ａ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｂ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｃ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｄ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｆ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｇ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ポリペプチド様触媒３Ｈ
ＡＤＡ：アデノシンデアミナーゼ
ＡＤＡＲ１：ＲＮＡ作用アデノシンデアミナーゼ１
ＡＤＡＲ２：ＲＮＡ作用アデノシンデアミナーゼ２
ＡＤＡＲ３：ＲＮＡ作用アデノシンデアミナーゼ３
Ｄｎｍｔ１：ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ１
Ｄｎｍｔ３ａ：ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３アルファ
ＴａｄＡ：ｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ
ＴＡＤＡ：ｔＲＮＡ（アデニン（３４））デアミナーゼ、葉緑体性
ＴＡＤ３：ｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼＴＡＤ３
ＴＥＴ１：メチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ１
ＴＥＴ２：メチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ２
ＴＤＧ：Ｇ／Ｔミスマッチ特異的チミンＤＮＡグリコシラーゼ
【0115】
いくつかの実施形態では、塩基編集複合体は２つ以上のエフェクターを含む。２つのエフェクターがある場合、それらは第１エフェクターと第２エフェクターと呼ばれることがある。各エフェクターは、異なるリガンドを介して異なるリガンド結合部分に結合していてもよい。あるいは、２つのエフェクターが存在する場合、１つはリガンドに結合し、そしてリガンド結合部分を通してｇＲＮＡに結合し、もう１つはＣａｓタンパク質に直接結合する。
【0116】
リガンド
【0117】
上述したように、エフェクターはリガンドに、例えば１つ以上の共有結合によって結合する。本発明の様々な実施形態で使用され得るリガンド結合部分－リガンド対の例の非網羅的リストを表２に示す。未修飾形および化学修飾形の両方、または、リガンド結合部分およびリガンドは、本発明の範囲内である。
【0118】
【表2】
【0119】
上記の結合ペアの配列の一部を以下に示す。
【0120】
１．テロメラーゼＫｕ結合モチーフ／Ｋｕヘテロ二量体
ａ．Ｋｕ結合ヘアピン
５’－ＵＵＣＵＵＧＵＣＧＵＡＣＵＵＡＵＡＧＡＵＣＧＣＵＡＣＧＵＵＡＵＵＵＣＡＡＵＵＵＵＧＡＡＡＡＵＣＵＧＡＧＵＣＣＵＧＧＧＡＧＵＧＣＧＧＡ－３’（配列番号：２３）
ｂ．Ｋｕヘテロ二量体
ＭＳＧＷＥＳＹＹＫＴＥＧＤＥＥＡＥＥＥＱＥＥＮＬＥＡＳＧＤＹＫＹＳＧＲＤＳＬＩＦＬＶＤＡＳＫＡＭＦＥＳＱＳＥＤＥＬＴＰＦＤＭＳＩＱＣＩＱＳＶＹＩＳＫＩＩＳＳＤＲＤＬＬＡＶＶＦＹＧＴＥＫＤＫＮＳＶＮＦＫＮＩＹＶＬＱＥＬＤＮＰＧＡＫＲＩＬＥＬＤＱＦＫＧＱＱＧＱＫＲＦＱＤＭＭＧＨＧＳＤＹＳＬＳＥＶＬＷＶＣＡＮＬＦＳＤＶＱＦＫＭＳＨＫＲＩＭＬＦＴＮＥＤＮＰＨＧＮＤＳＡＫＡＳＲＡＲＴＫＡＧＤＬＲＤＴＧＩＦＬＤＬＭＨＬＫＫＰＧＧＦＤＩＳＬＦＹＲＤＩＩＳＩＡＥＤＥＤＬＲＶＨＦＥＥＳＳＫＬＥＤＬＬＲＫＶＲＡＫＥＴＲＫＲＡＬＳＲＬＫＬＫＬＮＫＤＩＶＩＳＶＧＩＹＮＬＶＱＫＡＬＫＰＰＰＩＫＬＹＲＥＴＮＥＰＶＫＴＫＴＲＴＦＮＴＳＴＧＧＬＬＬＰＳＤＴＫＲＳＱＩＹＧＳＲＱＩＩＬＥＫＥＥＴＥＥＬＫＲＦＤＤＰＧＬＭＬＭＧＦＫＰＬＶＬＬＫＫＨＨＹＬＲＰＳＬＦＶＹＰＥＥＳＬＶＩＧＳＳＴＬＦＳＡＬＬＩＫＣＬＥＫＥＶＡＡＬＣＲＹＴＰＲＲＮＩＰＰＹＦＶＡＬＶＰＱＥＥＥＬＤＤＱＫＩＱＶＴＰＰＧＦＱＬＶＦＬＰＦＡＤＤＫＲＫＭＰＦＴＥＫＩＭＡＴＰＥＱＶＧＫＭＫＡＩＶＥＫＬＲＦＴＹＲＳＤＳＦＥＮＰＶＬＱＱＨＦＲＮＬＥＡＬＡＬＤＬＭＥＰＥＱＡＶＤＬＴＬＰＫＶＥＡＭＮＫＲＬＧＳＬＶＤＥＦＫＥＬＶＹＰＰＤＹＮＰＥＧＫＶＴＫＲＫＨＤＮＥＧＳＧＳＫＲＰＫＶＥＹＳＥＥＥＬＫＴＨＩＳＫＧＴＬＧＫＦＴＶＰＭＬＫＥＡＣＲＡＹＧＬＫＳＧＬＫＫＱＥＬＬＥＡＬＴＫＨＦＱＤ＞（配列番号：２４）
ＭＶＲＳＧＮＫＡＡＶＶＬＣＭＤＶＧＦＴＭＳＮＳＩＰＧＩＥＳＰＦＥＱＡＫＫＶＩＴＭＦＶＱＲＱＶＦＡＥＮＫＤＥＩＡＬＶＬＦＧＴＤＧＴＤＮＰＬＳＧＧＤＱＹＱＮＩＴＶＨＲＨＬＭＬＰＤＦＤＬＬＥＤＩＥＳＫＩＱＰＧＳＱＱＡＤＦＬＤＡＬＩＶＳＭＤＶＩＱＨＥＴＩＧＫＫＦＥＫＲＨＩＥＩＦＴＤＬＳＳＲＦＳＫＳＱＬＤＩＩＩＨＳＬＫＫＣＤＩＳＥＲＨＳＩＨＷＰＣＲＬＴＩＧＳＮＬＳＩＲＩＡＡＹＫＳＩＬＱＥＲＶＫＫＴＷＴＶＶＤＡＫＴＬＫＫＥＤＩＱＫＥＴＶＹＣＬＮＤＤＤＥＴＥＶＬＫＥＤＩＩＱＧＦＲＹＧＳＤＩＶＰＦＳＫＶＤＥＥＱＭＫＹＫＳＥＧＫＣＦＳＶＬＧＦＣＫＳＳＱＶＱＲＲＦＦＭＧＮＱＶＬＫＶＦＡＡＲＤＤＥＡＡＡＶＡＬＳＳＬＩＨＡＬＤＤＬＤＭＶＡＩＶＲＹＡＹＤＫＲＡＮＰＱＶＧＶＡＦＰＨＩＫＨＮＹＥＣＬＶＹＶＱＬＰＦＭＥＤＬＲＱＹＭＦＳＳＬＫＮＳＫＫＹＡＰＴＥＡＱＬＮＡＶＤＡＬＩＤＳＭＳＬＡＫＫＤＥＫＴＤＴＬＥＤＬＦＰＴＴＫＩＰＮＰＲＦＱＲＬＦＱＣＬＬＨＲＡＬＨＰＲＥＰＬＰＰＩＱＱＨＩＷＮＭＬＮＰＰＡＥＶＴＴＫＳＱＩＰＬＳＫＩＫＴＬＦＰＬＩＥＡＫＫＫＤＱＶＴＡＱＥＩＦＱＤＮＨＥＤＧＰＴＡＫ（配列番号：２５）
ａ．Ｋｕ結合ヘアピン
５’－ＵＵＣＵＵＧＵＣＧＵＡＣＵＵＡＵＡＧＡＵＣＧＣＵＡＣＧＵＵＡＵＵＵＣＡＡＵＵＵＵＧＡＡＡＡＵＣＵＧＡＧＵＣＣＵＧＧＧＡＧＵＧＣＧＧＡ－３’（配列番号：２３）
ｂ．Ｋｕヘテロ二量体
ＭＳＧＷＥＳＹＹＫＴＥＧＤＥＥＡＥＥＥＱＥＥＮＬＥＡＳＧＤＹＫＹＳＧＲＤＳＬＩＦＬＶＤＡＳＫＡＭＦＥＳＱＳＥＤＥＬＴＰＦＤＭＳＩＱＣＩＱＳＶＹＩＳＫＩＩＳＳＤＲＤＬＬＡＶＶＦＹＧＴＥＫＤＫＮＳＶＮＦＫＮＩＹＶＬＱＥＬＤＮＰＧＡＫＲＩＬＥＬＤＱＦＫＧＱＱＧＱＫＲＦＱＤＭＭＧＨＧＳＤＹＳＬＳＥＶＬＷＶＣＡＮＬＦＳＤＶＱＦＫＭＳＨＫＲＩＭＬＦＴＮＥＤＮＰＨＧＮＤＳＡＫＡＳＲＡＲＴＫＡＧＤＬＲＤＴＧＩＦＬＤＬＭＨＬＫＫＰＧＧＦＤＩＳＬＦＹＲＤＩＩＳＩＡＥＤＥＤＬＲＶＨＦＥＥＳＳＫＬＥＤＬＬＲＫＶＲＡＫＥＴＲＫＲＡＬＳＲＬＫＬＫＬＮＫＤＩＶＩＳＶＧＩＹＮＬＶＱＫＡＬＫＰＰＰＩＫＬＹＲＥＴＮＥＰＶＫＴＫＴＲＴＦＮＴＳＴＧＧＬＬＬＰＳＤＴＫＲＳＱＩＹＧＳＲＱＩＩＬＥＫＥＥＴＥＥＬＫＲＦＤＤＰＧＬＭＬＭＧＦＫＰＬＶＬＬＫＫＨＨＹＬＲＰＳＬＦＶＹＰＥＥＳＬＶＩＧＳＳＴＬＦＳＡＬＬＩＫＣＬＥＫＥＶＡＡＬＣＲＹＴＰＲＲＮＩＰＰＹＦＶＡＬＶＰＱＥＥＥＬＤＤＱＫＩＱＶＴＰＰＧＦＱＬＶＦＬＰＦＡＤＤＫＲＫＭＰＦＴＥＫＩＭＡＴＰＥＱＶＧＫＭＫＡＩＶＥＫＬＲＦＴＹＲＳＤＳＦＥＮＰＶＬＱＱＨＦＲＮＬＥＡＬＡＬＤＬＭＥＰＥＱＡＶＤＬＴＬＰＫＶＥＡＭＮＫＲＬＧＳＬＶＤＥＦＫＥＬＶＹＰＰＤＹＮＰＥＧＫＶＴＫＲＫＨＤＮＥＧＳＧＳＫＲＰＫＶＥＹＳＥＥＥＬＫＴＨＩＳＫＧＴＬＧＫＦＴＶＰＭＬＫＥＡＣＲＡＹＧＬＫＳＧＬＫＫＱＥＬＬＥＡＬＴＫＨＦＱＤ＞（配列番号：２４）
ＭＶＲＳＧＮＫＡＡＶＶＬＣＭＤＶＧＦＴＭＳＮＳＩＰＧＩＥＳＰＦＥＱＡＫＫＶＩＴＭＦＶＱＲＱＶＦＡＥＮＫＤＥＩＡＬＶＬＦＧＴＤＧＴＤＮＰＬＳＧＧＤＱＹＱＮＩＴＶＨＲＨＬＭＬＰＤＦＤＬＬＥＤＩＥＳＫＩＱＰＧＳＱＱＡＤＦＬＤＡＬＩＶＳＭＤＶＩＱＨＥＴＩＧＫＫＦＥＫＲＨＩＥＩＦＴＤＬＳＳＲＦＳＫＳＱＬＤＩＩＩＨＳＬＫＫＣＤＩＳＥＲＨＳＩＨＷＰＣＲＬＴＩＧＳＮＬＳＩＲＩＡＡＹＫＳＩＬＱＥＲＶＫＫＴＷＴＶＶＤＡＫＴＬＫＫＥＤＩＱＫＥＴＶＹＣＬＮＤＤＤＥＴＥＶＬＫＥＤＩＩＱＧＦＲＹＧＳＤＩＶＰＦＳＫＶＤＥＥＱＭＫＹＫＳＥＧＫＣＦＳＶＬＧＦＣＫＳＳＱＶＱＲＲＦＦＭＧＮＱＶＬＫＶＦＡＡＲＤＤＥＡＡＡＶＡＬＳＳＬＩＨＡＬＤＤＬＤＭＶＡＩＶＲＹＡＹＤＫＲＡＮＰＱＶＧＶＡＦＰＨＩＫＨＮＹＥＣＬＶＹＶＱＬＰＦＭＥＤＬＲＱＹＭＦＳＳＬＫＮＳＫＫＹＡＰＴＥＡＱＬＮＡＶＤＡＬＩＤＳＭＳＬＡＫＫＤＥＫＴＤＴＬＥＤＬＦＰＴＴＫＩＰＮＰＲＦＱＲＬＦＱＣＬＬＨＲＡＬＨＰＲＥＰＬＰＰＩＱＱＨＩＷＮＭＬＮＰＰＡＥＶＴＴＫＳＱＩＰＬＳＫＩＫＴＬＦＰＬＩＥＡＫＫＫＤＱＶＴＡＱＥＩＦＱＤＮＨＥＤＧＰＴＡＫ（配列番号：２５）
【0121】
２．テロメラーゼＳｍ７結合モチーフ／Ｓｍ７ホモヘプタマー
ａ．Ｓｍコンセンサス部位（一本鎖）
５’－ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡ－３’（配列番号：２６）
ｂ．単量体Ｓｍ様タンパク質（古細菌）
ＧＳＶＩＤＶＳＳＱＲＶＮＶＱＲＰＬＤＡＬＧＮＳＬＮＳＰＶＩＩＫＬＫＧＤＲＥＦＲＧＶＬＫＳＦＤＬＨＭＮＬＶＬＮＤＡＥＥＬＥＤＧＥＶＴＲＲＬＧＴＶＬＩＲＧＤＮＩＶＹＩＳＰ（配列番号：２７）
ａ．Ｓｍコンセンサス部位（一本鎖）
５’－ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡ－３’（配列番号：２６）
ｂ．単量体Ｓｍ様タンパク質（古細菌）
ＧＳＶＩＤＶＳＳＱＲＶＮＶＱＲＰＬＤＡＬＧＮＳＬＮＳＰＶＩＩＫＬＫＧＤＲＥＦＲＧＶＬＫＳＦＤＬＨＭＮＬＶＬＮＤＡＥＥＬＥＤＧＥＶＴＲＲＬＧＴＶＬＩＲＧＤＮＩＶＹＩＳＰ（配列番号：２７）
【0122】
３．ＭＳ２ファージオペレーターステムループ／ＭＳ２コートタンパク質
ａ．ＭＳ２ファージオペレーターステムループ
５’－ＧＣＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵＧＣ－３’（配列番号：２８）
ｂ．ＭＳ２コートタンパク質
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＩＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＧＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ（配列番号：２９）
ａ．ＭＳ２ファージオペレーターステムループ
５’－ＧＣＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵＧＣ－３’（配列番号：２８）
ｂ．ＭＳ２コートタンパク質
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＩＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＧＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ（配列番号：２９）
【0123】
４．ＰＰ７ファージオペレーターステムループ／ＰＰ７コートタンパク質
ａ．ＰＰ７ファージオペレーターステムループ
５’－ＡＵＡＡＧＧＡＧＵＵＵＡＵＡＵＧＧＡＡＡＣＣＣＵＵＡ－３’（配列番号：３０）
ｂ．ＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）
ＭＳＫＴＩＶＬＳＶＧＥＡＴＲＴＬＴＥＩＱＳＴＡＤＲＱＩＦＥＥＫＶＧＰＬＶＧＲＬＲＬＴＡＳＬＲＱＮＧＡＫＴＡＹＲＶＮＬＫＬＤＱＡＤＶＶＤＣＳＴＳＶＣＧＥＬＰＫＶＲＹＴＱＶＷＳＨＤＶＴＩＶＡＮＳＴＥＡＳＲＫＳＬＹＤＬＴＫＳＬＶＡＴＳＱＶＥＤＬＶＶＮＬＶＰＬＧＲ（配列番号：３１）
ａ．ＰＰ７ファージオペレーターステムループ
５’－ＡＵＡＡＧＧＡＧＵＵＵＡＵＡＵＧＧＡＡＡＣＣＣＵＵＡ－３’（配列番号：３０）
ｂ．ＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）
ＭＳＫＴＩＶＬＳＶＧＥＡＴＲＴＬＴＥＩＱＳＴＡＤＲＱＩＦＥＥＫＶＧＰＬＶＧＲＬＲＬＴＡＳＬＲＱＮＧＡＫＴＡＹＲＶＮＬＫＬＤＱＡＤＶＶＤＣＳＴＳＶＣＧＥＬＰＫＶＲＹＴＱＶＷＳＨＤＶＴＩＶＡＮＳＴＥＡＳＲＫＳＬＹＤＬＴＫＳＬＶＡＴＳＱＶＥＤＬＶＶＮＬＶＰＬＧＲ（配列番号：３１）
【0124】
５．ＳｆＭｕ Ｃｏｍステムループ／ＳｆＭｕ Ｃｏｍ結合タンパク質
ａ．ＳｆＭｕ Ｃｏｍステムループ
５’－ＣＵＧＡＡＵＧＣＣＵＧＣＧＡＧＣＡＵＣ－３’（配列番号：３２）
ｂ．ＳｆＭｕ Ｃｏｍ結合タンパク質
ＭＫＳＩＲＣＫＮＣＮＫＬＬＦＫＡＤＳＦＤＨＩＥＩＲＣＰＲＣＫＲＨＩＩＭＬＮＡＣＥＨＰＴＥＫＨＣＧＫＲＥＫＩＴＨＳＤＥＴＶＲＹ（配列番号：３３）
ａ．ＳｆＭｕ Ｃｏｍステムループ
５’－ＣＵＧＡＡＵＧＣＣＵＧＣＧＡＧＣＡＵＣ－３’（配列番号：３２）
ｂ．ＳｆＭｕ Ｃｏｍ結合タンパク質
ＭＫＳＩＲＣＫＮＣＮＫＬＬＦＫＡＤＳＦＤＨＩＥＩＲＣＰＲＣＫＲＨＩＩＭＬＮＡＣＥＨＰＴＥＫＨＣＧＫＲＥＫＩＴＨＳＤＥＴＶＲＹ（配列番号：３３）
【0125】
６．ＢｏｘＢアプタマー／λＮ２２ｐｌｕｓ
ａ．ＢｏｘＢアプタマー
５’－ＧＣＣＣＵＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：３４）
ｂ．λＮ２２ｐｌｕｓタンパク質
ＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ（配列番号：３５）
ａ．ＢｏｘＢアプタマー
５’－ＧＣＣＣＵＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：３４）
ｂ．λＮ２２ｐｌｕｓタンパク質
ＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ（配列番号：３５）
【0126】
７．Ｃｓｙ４結合ステムループ／Ｃｓｙ４［Ｈ２９Ａ］
ａ．Ｃｓｙ４結合モチーフ
５’－ＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣ－３’（配列番号：３６）
ｂ．Ｃｓｙ４［Ｈ２９Ａ］
ＭＤＨＹＬＤＩＲＬＲＰＤＰＥＦＰＰＡＱＬＭＳＶＬＦＧＫＬＡＱＡＬＶＡＱＧＧＤＲＩＧＶＳＦＰＤＬＤＥＳＲＳＲＬＧＥＲＬＲＩＨＡＳＡＤＤＬＲＡＬＬＡＲＰＷＬＥＧＬＲＤＨＬＱＦＧＥＰＡＶＶＰＨＰＴＰＹＲＱＶＳＲＶＱＡＫＳＮＰＥＲＬＲＲＲＬＭＲＲＨＤＬＳＥＥＥＡＲＫＲＩＰＤＴＶＡＲＡＬＤＬＰＦＶＴＬＲＳＱＳＴＧＱＨＦＲＬＦＩＲＨＧＰＬＱＶＴＡＥＥＧＧＦＴＣＹＧＬＳＫＧＧＦＶＰＷＦ（配列番号：３７）
ａ．Ｃｓｙ４結合モチーフ
５’－ＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣ－３’（配列番号：３６）
ｂ．Ｃｓｙ４［Ｈ２９Ａ］
ＭＤＨＹＬＤＩＲＬＲＰＤＰＥＦＰＰＡＱＬＭＳＶＬＦＧＫＬＡＱＡＬＶＡＱＧＧＤＲＩＧＶＳＦＰＤＬＤＥＳＲＳＲＬＧＥＲＬＲＩＨＡＳＡＤＤＬＲＡＬＬＡＲＰＷＬＥＧＬＲＤＨＬＱＦＧＥＰＡＶＶＰＨＰＴＰＹＲＱＶＳＲＶＱＡＫＳＮＰＥＲＬＲＲＲＬＭＲＲＨＤＬＳＥＥＥＡＲＫＲＩＰＤＴＶＡＲＡＬＤＬＰＦＶＴＬＲＳＱＳＴＧＱＨＦＲＬＦＩＲＨＧＰＬＱＶＴＡＥＥＧＧＦＴＣＹＧＬＳＫＧＧＦＶＰＷＦ（配列番号：３７）
【0127】
８．Ｑβ結合ステムループ［Ｑ６５Ｈ］
ａ．Ｑβファージオペレーターステムループ
５’－ＡＴＧＣＴＧＴＣＴＡＡＧＡＣＡＧＣＡＴ－３’（配列番号：９６）
ｂ．Ｑβコートタンパク質［Ｑ６５Ｈ］
ＭＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＨＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＡＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ（配列番号：９７）
ａ．Ｑβファージオペレーターステムループ
５’－ＡＴＧＣＴＧＴＣＴＡＡＧＡＣＡＧＣＡＴ－３’（配列番号：９６）
ｂ．Ｑβコートタンパク質［Ｑ６５Ｈ］
ＭＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＨＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＡＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ（配列番号：９７）
【0128】
前述の各配列において、例えば、同一の配列や、結合対の一方または両方の配列に１つ以上の挿入、欠失または置換を有する配列を使用することができる。非限定的な例として、結合対のどちらか一方または両方のメンバーに、前述の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同じ配列を使用することができる。
【0129】
その他のケミストリー
【0130】
いくつかの実施形態では、本発明の塩基編集複合体は、追加のケミストリー技術と組み合わされる。例えば、いくつかの実施形態では、塩基編集複合体は、システイン／セレノシステインタグをさらに含む。いくつかの実施形態では、塩基編集複合体は、クリックケミストリーを介した環化付加のための要素を含んでいるか、またはそれに結合している。
【0131】
塩基編集方法
【0132】
別の実施形態では、本発明は、塩基編集方法を提供する。これらの方法では、本発明の塩基編集複合体を二本鎖ＤＮＡ、またはｄｓＤＮＡを含む溶液、またはｄｓＤＮＡを含む細胞、または対象に曝露する。本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施してもよく、治療のための医薬の一部として塩基編集複合体を対象に送達する工程を含んでいてもよい。
【0133】
これらの方法は、例えば、Ｔ細胞（初代Ｔ細胞を含む）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、ＣＤ３４＋造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）から選択される免疫細胞を改変するために使用可能である。免疫細胞は、ＣＡＲやＴＣＲを含むＴ細胞などの改変型免疫細胞であってもよい。従って、本明細書の方法は、治療に有用なＣＡＲおよび／またはＴＣＲを含むように既に改変された細胞をさらに改変するために適用することができる。さらなる例として、宿主動物や患者内に自然に存在する、あるいは、幹細胞や人工多能性幹細胞［ｉＰＳＣ］に由来する初代免疫細胞を、本明細書で提供する方法や複合体を用いて遺伝子改変することができる。適切な幹細胞としては、限定はされないが、ヒト幹細胞のような哺乳類幹細胞が挙げられ、造血幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、筋肉幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の幹細胞としては、マウス幹細胞、例えばマウス胚性幹細胞などの哺乳類幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0134】
本明細書には、原核細胞または真核細胞において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでゲノム工学（例えば、１つ以上の遺伝子または１つ以上の遺伝子産物の発現を変化させる、または操作する）を行うための方法も提供される。特に、本明細書で提供される方法は、初代ヒトＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例、臍帯血または骨髄から単離されたＨＳＰＣおよびそれらから分化した細胞）を含む哺乳動物細胞における標的の塩基編集による破壊に有用である場合がある。
【0135】
また、本明細書には、本明細書に記載の方法に従って改変された、Ｔ細胞などの造血幹細胞から生じる遺伝子改変細胞も提供される。
【0136】
場合によっては、本方法は、ＨＳＣまたはｉＰＳＣから生じた、治療応用に「普遍的に許容可能な」細胞として適した遺伝子改変Ｔ細胞を産生するように構成される。造血幹細胞（ＨＳＣ）はヘマンジオブラストから発生し、ヘマンジオブラストは造血幹細胞、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞に分化する血管芽細胞を生み出すことができる。造血幹細胞は、一般的な骨髄系前駆細胞や一般的なリンパ系前駆細胞を生み出し、そこからＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、骨髄芽球、赤芽球、その他血液、骨髄、脾臓、リンパ節、胸腺の細胞産生に関与する細胞が生まれる。このような方法は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えば臍帯血や骨髄から単離されたＨＳＰＣやそれらから分化した細胞にも適用可能である。
【0137】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、塩基編集による修正のために疾患を標的とする方法である。いくつかの方法では、塩基編集複合体は治療のために対象に送達される。標的配列は、疾患関連ポリヌクレオチドまたは遺伝子であれば何でもよい。本発明による内因性遺伝子配列の変異または修正の有用な適用の例としては、疾患に関連する遺伝子変異の改変、スプライス部位をコードする配列の改変、調節配列の改変、機能獲得変異を引き起こす配列の改変、および／または機能喪失変異を引き起こす配列の改変、ならびにタンパク質の構造的特徴をコードする配列の標的化改変が挙げられるが、これらに限定されない。
【0138】
細胞内への構成成分の送達
【0139】
塩基編集複合体またはその構成要素は、様々な方法、様々な形式（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）、またはこれらの異なる形式の組み合わせによって標的細胞や生物に送達可能である。塩基編集構成要素は、（ａ）タンパク質エフェクターまたはガイドＲＮＡに対応する配列をコードするＤＮＡポリヌクレオチド；（ｂ）タンパク質エフェクター（メッセンジャーＲＮＡ）またはガイドＲＮＡの配列をコードする合成ＲＮＡ；（ｃ）エフェクターの精製タンパク質として送達可能である。タンパク質形式で送達する場合、Ｖ型Ｃａｓタンパク質はガイドＲＮＡと組み立てられてリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成し、標的細胞や生物に送達することができる。
【0140】
例えば、組み立てられた構成要素または複合体は、エレクトロポレーションによって、ヌクレオフェクションによって、トランスフェクションによって、ナノ粒子を介して、ウイルス媒介ＲＮＡ送達によって、非ウイルス媒介送達によって、細胞外小胞（例えば、エクソソームおよびマイクロベシクル）を介して、真核細胞移入（例えば、組換え酵母によって）、およびゲノム全体像に変化を与えることなく標的生細胞に送達できるように分子をパッケージできる他の方法によって、一緒にまたは別々に送達され得る。
【0141】
他の方法としては、分子が所望のＲＮＡ分子に転写され、アミノ酸を含む成分がタンパク質またはタンパク質断片に翻訳されるように、タンパク質のリクルートに関連する配列を含むＤＮＡポリヌクレオチドの非組込み型一過性導入が挙げられるが、これらに限定されない。これには、限定されないが、ＤＮＡのみのビヒクル（例えば、プラスミド、Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ（ミニサークル）、ミニベクター、ミニストリング、プロテロメラーゼにより生成されたＤＮＡ分子（例えば、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標））、人工染色体（例えば、ＨＡＣ）、およびコスミド）、ナノ粒子、細胞外小胞（例えば、エクソソームおよびマイクロベシクル）によるＤＮＡビヒクルを介したもの、真核細胞移入（例えば、組換え酵母による）、ＡＡＶによる一過性のウイルス移入、非組込み型ウイルス粒子（例えば、レンチウイルスやレトロウイルスに基づくシステム）、細胞貫通ペプチドや、ゲノム全体像に直接組込むことなくＤＮＡを細胞内に導入することができる他の技術が挙げられる。ＲＮＡ成分の導入のための別の方法としては、ＲＮＡ転写のための機構を標的細胞のゲノムに安定的に導入するための組込み型遺伝子導入技術の使用がある。これは、ＲＮＡの発現を減弱させるために、構成的あるいはプロモーター誘導性のシステムを介して制御することができ、また、効用が満たされた後にシステムを除去できるようにデザインすることもできる（例えば、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換えシステムを導入する）。安定した遺伝子導入のためのこのような技術には、ウイルス粒子（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスに基づくシステム）による組込み、トランスポザーゼを介した導入（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙやＰｉｇｇｙＢａｃ(商標)）、ＤＮＡ切断によって導入される非相同修復経路の利用（例えば、ＣＲＩＳＰＲやＴＡＬＥＮの利用）技術やサロゲートＤＮＡ分子、目的の細胞への標的ＤＮＡの組込みを促すその他の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0142】
本発明の複合体の様々な構成要素は、細胞内または溶液内で酵素的に合成されない場合、化学的に作製されるか、または天然に存在する場合、天然に存在する供給源から単離精製可能である。本発明の様々な実施形態を化学的および酵素的に合成する方法は、当業者に周知である。同様に、本発明の構成要素間に共有結合を連結または導入する方法も、当業者に周知である。
【0143】
応用例
【0144】
非限定的な例として、本発明の複合体は、ｐ６５やＶ６４のような転写活性化因子や、エピジェネティック修飾を導入したりＨＤＲに影響を与える部分をリクルートしたりするために使用可能である。本発明の複合体は、以下の用途（塩基編集、ゲノム編集、ゲノムスクリーニング、治療細胞の作製、ゲノムタギング、エピゲノム編集、核型改変、クロマチンイメージング、トランスクリプトームおよび代謝経路改変、遺伝回路改変、細胞シグナル感知、細胞事象記録、系統情報再構築、遺伝子操作、ＤＮＡジェノタイピング、ｍｉＲＮＡ定量、ｉｎ ｖｉｖｏクローニング、部位特異的突然変異誘発、ゲノム多様化、およびｉｎ ｓｉｔｕプロテオーム解析）に使用可能でもある。いくつかの実施形態では、細胞または細胞集団を本発明の塩基編集複合体に曝露し、その細胞または細胞集団は点滴によって対象に導入される。
【0145】
また、応用例には、ヒト疾患の研究（例、がん免疫療法、抗ウイルス療法、バクテリオファージ療法、がん診断、病原体スクリーニング、微生物叢リモデリング、幹細胞初期化、免疫ゲノム工学、ワクチン開発、抗体産生）が挙げられる。
【実施例】
【0146】
実施例
【0147】
実施例１：哺乳類細胞におけるＣａｓ１２ｅ塩基編集用プラスミド構成要素のトランスフェクション（予測）
【0148】
ベクター構築
【0149】
Ｃａｓ１２ｅのコード配列は、合成的に入手され、赤色蛍光タンパク質－ピューロマイシン融合体を有するＴ２Ａポリシストロニックカセット中のマウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）の制御下でベクターにクローニング可能である。非活性化バージョンのＣａｓ１２ｅおよび非活性化Ｃａｓ１２ｅ変異体への２ｘＵＧＩ融合体もまた得られ、前述のベクター中でクローニング可能である。ＭＳ２コートタンパク質－ＡＰＯＢＥＣ融合体（ＭＣＰ－ＡＰＯＢＥＣ）のコード配列を入手し、マウスＣＭＶプロモーターの制御下で発現ベクターにクローニングしてもよい。ＭＳ２リガンド結合部分とユニークなスペーサー領域を含むｇＲＮＡの配列は、ｈＵ６プロモーターの制御下で発現ベクターにクローニングすることができる。
【0150】
トランスフェクション：
【0151】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１１２６８）は、トランスフェクションの前日に９６穴プレートに１ウェル当たり２０，０００細胞で播種することができる。細胞は、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ(商標) Ｄｕｏトランスフェクション試薬（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｔ－２０１０）および２００ｎｇのＣａｓ１２ｅプラスミド、またはＵＧＩと融合または非融合のその不活性化変異体、５０ｎｇのＭＣＰ－ＡＰＯＢＥＣプラスミド、ならびに５０ｎｇのｇＲＮＡプラスミドを用いてコトランスフェクションしてもよい。ｇＲＮＡプラスミドは、１０１ヌクレオチドの一定領域長、ＰＰＩＢまたはＥＭＸ１遺伝子標的内の転写産物を標的とする各種スペーサー配列から構成され、ＭＳ２リガンド結合部分を５’末端、３’末端、５’末端でも３’末端でもない内部、またはそれらの組み合わせに有する場合がある。
【0152】
細胞をピューロマイシン含有培地で選択し、トランスフェクション後４８時間で回収し、以下に記述するようにさらに処理する。以下の配列が使用可能である。
【0153】
Ｃａｓ１２ｅ ｇＲＮＡ配列：
【0154】
５’－ＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号：３８）
【0155】
５’－ＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号：３９）
【0156】
５’－ＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号：４０）
【0157】
５’－ＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣ－３’（配列番号：４１）
【0158】
５’－ＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号：４２）
【0159】
ＥＭＸ１標的配列：
【0160】
５’－ＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＧＴＡＣ－３’（配列番号：４３）
【0161】
５’－ＴＧＧＣＡＡＴＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＴＴＧ－３’（配列番号：４４）
【0162】
５’－ＴＣＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＡＣＴＣＡＧＧＣ－３’（配列番号：４５）
【0163】
５’－ＴＣＴＧＣＴＣＧＧＡＣＴＣＡＧＧＣＣＣＴ－３’（配列番号：４６）
【0164】
５’－ＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＴＴＧＴＡＣ－３’（配列番号：４７）
【0165】
ＰＰＩＢ標的配列
【0166】
５’－ＡＡＡＡＡＣＡＧＴＧＧＡＴＡＡＴＴＴＴＧ－３’（配列番号：４８）
【0167】
５’－ＧＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＴＣＡＣＣＣ－３’（配列番号：４９）
【0168】
５’－ＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：５０）
【0169】
５’－ＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＧＡＣＣＴ－３’（配列番号：５１）
【0170】
５’－ＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ－３’（配列番号：５２）
【0171】
実施例２：哺乳類細胞におけるＣａｓ１２ｅ塩基編集のためのｍＲＮＡと合成ガイドのエレクトロポレーション（予測）
【0172】
ｍＲＮＡの調製：
メッセンジャーｍＲＮＡは、Ｔ７プロモーターおよびＣａｓ１２ｅ、ｄＣａｓ１２ｅ－ＵＧＩならびにＭＣＰ－ＡＰＯＢＥＣのコード配列を有するＤＮＡベクターから、ｍＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための標準プロトコールに従って調製することができる。
メッセンジャーｍＲＮＡは、Ｔ７プロモーターおよびＣａｓ１２ｅ、ｄＣａｓ１２ｅ－ＵＧＩならびにＭＣＰ－ＡＰＯＢＥＣのコード配列を有するＤＮＡベクターから、ｍＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための標準プロトコールに従って調製することができる。
【0173】
ＲＮＡ合成：
【0174】
ｃｒＲＮＡは、２’－アセトキシエチルオルトエステル（２’－ＡＣＥ）または２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（２’－ＴＢＤＭＳ）保護ケミストリーのいずれかを用いてＨｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙにより合成可能である。ＲＮＡオリゴは、２’－脱保護／脱塩され、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のいずれかによって精製可能である。オリゴは、エレクトロポレーション前に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５緩衝液に再懸濁してもよい。
【0175】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１１２６８）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｎｅｏｎ（商標）トランスフェクションシステムの１０μｌキットを使用してエレクトロポレーション可能である。５０，０００個の細胞、１μｇのＣａｓ１２ｅまたはｄＣａｓ１２ｅ－ＵＧＩ ｍＲＮＡおよびＭＣＰ－ＡＰＯＢＥＣ ｍＲＮＡ、ならびに３μＭの合成ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの混合物を、１１５０Ｖで２０ｍｓおよび２パルスに渡ってエレクトロポレーションすることができる。化学合成されたｃｒＲＮＡは、２３ヌクレオチドの一定領域長、ＰＰＩＢまたはＥＭＸ１遺伝子標的内の転写産物を標的とする各種スペーサー配列から構成され、ＭＳ２リガンド結合部分を５’末端、３’末端、５’末端または３’末端のいずれでもない内部、あるいはそれらの組み合わせに有する場合がある。各配列は、１つ以上の塩基および１つ以上の連結部内に化学修飾を含む場合がある。細胞は、完全血清培地を用いて９６穴プレートに撒き、さらに処理するために７２時間後に回収してもよい。以下のシーケンスが使用可能である。
【0176】
Ｃａｓ１２ｅ ｃｒＲＮＡ配列（Ｎ、標的配列）：
【0177】
５’－ＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号：５３）
【0178】
５’－ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣ－３’（配列番号：５４）
【0179】
Ｃａｓ１２ｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（Ｎ、標的配列）：
【0180】
５’－ＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ－３’（配列番号：５５）
【0181】
５’－ＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ－３’（配列番号：５６）
【0182】
５’－ＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣ－３’（配列番号：５７）
【0183】
実施例１と実施例２の両方について：
【0184】
細胞処理
【0185】
細胞は、プロテイナーゼＫ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＦＥＲＥＯ０４９２）、ＲＮアーゼＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＦＥＲＥＮ０５３１）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） ＧＣバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｆ－５１８Ｌ）を含む１００μＬのバッファー中で、５６℃で３０分間溶解し、その後９５℃で５分間熱失活させる場合がある。この細胞溶解液は、塩基編集部位（複数可）を含む領域にまたがるＰＣＲアンプリコンを生成するために使用可能である。長さ５００～１０００ｂｐの未精製ＰＣＲアンプリコンは、サンガー配列決定法で塩基配列を決定することができる。
【0186】
編集分析
【0187】
塩基編集効率は、オープンソースツールＢＥＡＴを改造したＣｈｉｍｅｒａ解析ツールを用いて計算することができる（Ｘｕら、２０１９年、ＢＥＡＴ：Ａ Ｐｙｔｈｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ Ｑｕａｎｔｉｆｙ Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ ２，２２３－２２９）。Ｃｈｉｍｅｒａは、まずバックグラウンドノイズを差し引いてサンプル内で予想されるばらつきを定義することにより、編集効率を決定する。これにより、対照サンプルに正規化することなく、編集効率を推定することができる。続いて、ＣｈｉｍｅｒａはＭＡＤ（Ｍｅｄｉａｎ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）法を用いてノイズからいずれの異常値も除外し、２０ｂｐの入力ガイド配列の範囲で塩基エディターの編集効率を評価する。
【0188】
実施例３～６
【0189】
実施例３～６では、以下の材料と方法を使用した。
【0190】
ｇＲＮＡ配列
【0191】
実施例３－５（Ｃａｓ１２ｂ塩基エディターを使用）では、表３に示す配列によってコードされるｇＲＮＡ配列を使用した。全てのｇＲＮＡデザインは、９１ｎｔの一定のｇＲＮＡ配列、標的特異的２０ｎｔスペーサー配列、および７ｎｔのポリＴ Ｕ６ターミネーションシグナルからなるＡ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｃａｓ１２ｂのｇＲＮＡに基づいた。全ての改変はｇＲＮＡの定常領域に対して行われ、ＲＮＡアプタマーヘアピンを含めることで構成されている。ＭＳ２ヘアピン配列（Ｃ５変異体）の１コピーを、ｇＲＮＡの５’、３’のステムループ又は内部ポリＵ（ｇＲＮＡ内のＵＵＵＵＵの内部ストレッチ）のいずれかに組み込んだ。対応するｇＲＮＡ配列は、ｈＵ６プロモーターの制御下で別の発現ベクターにクローニングされた。
【0192】
表３中、Ｎは２０ｎｔの標的特異的スペーサー配列を示す。前述の一定のｇＲＮＡ配列は太字で強調表示されている。ＭＳ２（Ｃ５変異体）はイタリック体で表示し、アプタマーの拡張はイタリック体と下線で示す。内部のポリＵストレッチに導入された変異は太字で下線を引いてある。
【0193】
表３：Ｃａｓ１２ｂと共に使用するｇＲＮＡ配列
【0194】
【表3】
【0195】
実施例６（ＣａｓＭＩＮＩ塩基エディターを使用）では、表４に示す配列でコードされるｇＲＮＡ配列を使用した。全てのｇＲＮＡデザインは、１６２ｎｔの一定のｇＲＮＡ配列、ターゲット特異的な２３ｎｔのスペーサー配列、および７ｎｔのポリＴ Ｕ６ターミネーションシグナルからなるＡｃｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｌｆｕｒｏｘｉｄａｎｓ Ｃａｓ１２ｆ ｇＲＮＡに基づいている。全ての修飾はｇＲＮＡの一定の構成要素に対して行われ、ＲＮＡアプタマーヘアピンの組み込みとステムループの短縮から成っている。ＭＳ２ヘアピン配列（Ｃ５変異体）の１コピーを、５’、５’およびステムループ１の短縮部、ステムループ１の延長部、ステムループ２の置換部およびステムループ１の短縮部、またはリピート：アンチリピートの置換部のいずれかに組み込んだ。対応するｇＲＮＡ配列は、ｈＵ６プロモーターの制御下で別の発現ベクターにクローニングされた。
【0196】
表４中、Ｎは２３ｎｔの標的特異的スペーサー配列を示す。一定のｇＲＮＡ配列は太字で強調表示されている。ＭＳ２（Ｃ５変異体）はイタリック体で表示し、アプタマーの拡張はイタリック体と下線で示す。デザイン１は５’ＭＳ２に対応し、デザイン２は５’ＭＳ２およびステムループ１の短縮部に対応し、デザイン３はステムループ１の延長部に位置するＭＳ２に対応し、デザイン４はステムループ２の置換部とステムループ１の短縮部に位置するＭＳ２に対応し、デザイン５はリピート：アンチリピート領域の置換部に位置するＭＳ２に対応する。
【0197】
表４：ＣａｓＭＩＮＩと共に使用するｇＲＮＡ配列
【0198】
【表4】
【0199】
プラスミドデザイン
【0200】
ｇＲＮＡは別として、使用したシステムの全ての構成要素は２つのベクターにコードされ、ＣＭＶプロモーターから発現した。第一ベクターは、強化ヒトＡｐｏｂｅｃ３Ａ－ＭＣＰまたはＡｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ Ａｐｏｂｅｃ１ａ－ＭＣＰ融合タンパク質をコードしていた（デアミナーゼベクター）。第二ベクターは、Ｃ末端を通して２コピーのＵＧＩに融合したｄＣａｓ１２ｂ（Ｄ５６９Ａ、Ｅ８４７Ａ、Ｄ９７６Ａ）またはｄＣａｓＭＩＮＩ（Ｄ３２５Ａ；Ｄ５０９Ａ）をコードした（Ｃａｓベクター）。ｄＣａｓＭＩＮＩはｄＵｎ１Ｃａｓ１２ｆ１の既述のバージョンである。ｄＣａｓ１２ｂ－ＵＧＩ－ＵＧＩおよびｄＣａｓＭＩＮＩ－ＵＧＩ－ＵＧＩ融合タンパク質は、Ｃａｓ配列のＮ末端とＵＧＩ配列のＣ末端に２コピーのＳＶ４０ ＮＬＳで挟まれていた。さらに、トランスフェクション効率をモニターできるように、ベクターはｔｕｒｂｏＲＦＰの発現をコードしていた。
【0201】
対応するｇＲＮＡ配列は、ｈＵ６プロモーターの制御下で別の発現ベクターにクローニングされた（ｇＲＮＡ発現ベクター）。
【0202】
以下に配列番号：７２として示され、実施例３、４および５で使用された１つのプラスミドは、２つのＵＧＩに融合した不活性型Ｃａｓ１２ｂ（：ｄＣａｓ１２ｂ－ＵＧＩ－ＵＧＩ）をコードする。以下のフォントが使用されている：
【0203】
配列番号：７２に対応するアミノ酸配列は、配列番号：７３として以下に示され、その配列では以下のフォントが使用されている：
【0204】
配列番号：７４として以下に示され、実施例６で使用された第二プラスミドは、２つのＵＧＩに融合した不活性型ＣａｓＭＩＮＩ（：ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＵＧＩ－ＵＧＩ）をコードする。以下のフォントが使用されている：
【0205】
配列番号：７４に対応するアミノ酸配列は、配列番号：７５として以下に示され、その配列では以下のフォントが使用されている：
【0206】
第三プラスミドは、配列番号：７６として以下に示すが、ＭＣＰに融合したデアミナーゼ（強化型ヒトＡｐｏｂｅｃ３Ａ－ＭＣＰ）をコードする。以下のフォントが使用されている：
【0207】
配列番号：７６に対応するアミノ酸配列は、配列番号：７７として以下に示され、その配列では以下のフォントが使用されている：
【0208】
第４のプラスミドは配列番号：７８として以下に示すもので、ＭＣＰに融合したデアミナーゼ（Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ Ａｐｏｂｅｃ１ａ－ＭＣＰ）をコードする。以下のフォントが使用されている：
【0209】
配列番号：７８に対応するアミノ酸配列は、配列番号：７９として以下に示され、その配列では以下のフォントが使用されている：
【0210】
塩基編集システムのｇＲＮＡ構成要素は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって発現が駆動される別のベクター（ｇＲＮＡ発現ベクター）で発現させた。このｇＲＮＡは、Ａ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｃａｓ１２ｂまたはＡｃｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｌｆｕｒｏｘｉｄａｎｓ Ｃａｓ１２ｆのｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの構成要素が先に記述された人工テトラループで連結されたものを包含する単一ユニットとして発現させた。各Ｃａｓタンパク質に対するｇＲＮＡ標的配列のリストを表５に示す。
【0211】
表５：塩基編集のためのｇＲＮＡ標的部位配列。
【0212】
【表5】
【0213】
細胞培養とトランスフェクション
【0214】
ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１００Ｕ ｍｌ－１ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、９６穴プレートの１ウェルに１０，０００個の細胞を播種し、トランスフェクションのためのコンフルエントが７０％程度になるようにした。２４時間後、９６穴プレートの１ウェルあたり０．７μｌのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標） ＤＵＯ（Ｈｏｒｉｚｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）を用い、２００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（７５ｎｇのＣａｓベクター、７５ｎｇのデアミナーゼベクター、５０ｎｇのｇＲＮＡ発現ベクター）で細胞を脂質トランスフェクションした。
【0215】
細胞溶解
【0216】
トランスフェクションから７２時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、５０μｌのＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を各ウェルに添加した。細胞をばらばらにした後、新鮮なＤＭＥＭを１００μｌ加え、再懸濁した細胞２０μｌを９６穴プレートに移し、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ溶解試薬（Ｖｉａｇｅｎ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）６０μｌとともに以下の条件（５５℃で４５分間、次いで９５℃で１５分間）でインキュベートし、続いて細胞溶解液を－２０℃で保存した。
【0217】
標的領域のＰＣＲ増幅
【0218】
１回のＰＣＲ反応につき、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ溶解試薬を用いて得た細胞溶解液１μｌを使用した。ＮＧＳ解析では、ｓｇＲＮＡ標的部位の増幅にＱ５ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２ｘ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＮＥＢ）を用い、反応ミックスは以下のように設定した：
【0219】
【0220】
ＰＣＲ反応は以下に記載されるサーモサイクリング条件で行った：
【0221】
【0222】
サンガー配列決定解析のために、目的領域はＧｏＴａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＰＣＲ増幅した。反応ミックスは以下のように設定した：
【0223】
【0224】
使用したプライマーの詳細は表４に示す。
【0225】
表６：プライマー［５’→３’］
【0226】
【表6】
【0227】
塩基編集の分析
【0228】
ＰＣＲ産物はサンガー配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に供した。データは独自の社内ソフトウェア（Ｃｈｉｍｅｒａ）で解析した。
【0229】
実施例３：Ｃａｓ１２ｂを使用する塩基編集
【0230】
この実施例では、サイト２のアンプリコン領域の次世代シークエンシング解析は、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞株におけるＣａｓ１２ｂ塩基エディターの導入により導入された特異的なＣからＴへの変異を示す。ｈＡｐｏｂｅｃ３Ａ（Ａｐｏｂｅｃ３Ａ－ＭＣＰ）またはＡｎｏＡｐｏｂｅｃ（Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ Ａｐｏｂｅｃ１ａ－ＭＣＰ）の２つの異なるエフェクターを用いた。それらは、それぞれ配列番号：７６および配列番号：７８で強調した配列を発現するプラスミドのトランスフェクションにより導入した。同時に、ｄＣａｓ１２ｂ－ＵＧＩ－ＵＧＩは、配列番号：７２で強調した配列を発現するプラスミドをトランスフェクションして導入した。ｇＲＮＡは、配列番号：５８から６５に対応するｇＲＮＡ骨格を発現するプラスミドをトランスフェクションすることで導入した。標的部位の配列は配列番号：８０に対応する。ＤＮＡプラスミド脂質トランスフェクションによって構成要素を導入し、トランスフェクション後７２時間後に細胞を溶解した後、ＰＣＲによって標的遺伝子座を増幅し、次世代シークエンシングによって解析した。
【0231】
結果をそれぞれ図８Ａと図８Ｂに報告する。これらの図は、ＨＥＫ－２９３細胞へのＤＮＡプラスミド導入による塩基編集構成要素の送達によって達成されたＣからＴへの変異のレベルを示している。Ｘ軸はｇＲＮＡ中のＭＳ２アプタマーの各種位置を示し、表３で強調した配列に対応する。Ｕ－＞Ｇは、ｈＵ６プロモーター下での転写効率を高めるために導入されたＣａｓ１２ｂ ｇＲＮＡ骨格に存在する内部ポリＵストレッチの変化を示す。Ｙ軸は、ＮＧＳによって測定された、プロトスペーサー内の指定されたＣ残基におけるＣからＴへの編集のパーセンテージを表示する。各バーは標的プロトスペーサー内の標的Ｃ残基を表し、図の凡例中の数字は該当するＣ残基の位置を示し、１はＰＡＭ近位、２０はＰＡＭ遠位である。ｎｏ－ｔｆ（ｔｆ無し）＝トランスフェクション対照なし。ｈＡｐｏｂｅｃ３Ａ＝Ａｐｏｂｅｃ３Ａ－ＭＣＰ；ＡｎｏＡｐｏｂｅｃ＝Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ Ａｐｏｂｅｃ１ａ－ＭＣＰ。エラーバーは２回繰り返した平均値の標準誤差を示す。
【0232】
図８Ａと図８Ｂは、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞株においてＣａｓ１２ｂ塩基エディターが機能しており、サイト２においてｈＡｐｏｂｅｃ３ＡとＡｎｏＡｐｏｂｅｃの両方で編集が観察されたことを示している。５’ＭＳ２デザインとＰｏｌｙＵ－ＭＳ２デザインの両方で編集が観察され、２つのｇＲＮＡデザインが機能している。さらに、ＭＳ２アプタマーがない場合（ＭＳ２不含）には編集が観察されないことから、観察された編集は、ＭＣＰリガンドとＭＳ２リガンド結合部分の相互作用によるデアミナーゼのリクルートと、それに続く塩基編集複合体のアセンブリに依存していることがわかる。編集は、１４ｎｔのウィンドウで最大５つのＣ残基が編集されるＣａｓ９塩基エディターで観察されたものとは異なり、広いウィンドウで観察される。編集ウィンドウがシフトされたことは、ツールの一般的な適用可能性と、塩基編集の対象となり得る部位の範囲を広げる可能性を強く示している。
【0233】
実施例４：複数部位での塩基編集
【0234】
この実施例は、Ｃａｓ１２ｂ塩基エディターが複数のゲノム遺伝子座と配列コンテキストで機能することを実証する。塩基編集解析は、Ｃａｓ１２ｂ塩基エディターがＨＥＫ－２９３Ｔ細胞株の各種部位にＣからＴへの変異を導入することを示している。７つの異なる領域がｓｇＲＮＡの標的となった：ＶＥＧＦＡ＿ｓｇＲＮＡ１、配列番号：８２；ＶＥＧＦＡ＿ｓｇＲＮＡ６、配列番号：８３；ＦＡＮＣＦ＿ｓｇＲＮＡ３、配列番号：８４；サイト２＿ｓｇＲＮＡ２、配列番号：９３；サイト２＿ｓｇＲＮＡ４、配列番号：８１；Ｂ２Ｍ＿ｓｇＲＮＡ２、配列番号：９４；およびＢ２Ｍ＿ｓｇＲＮＡ３、配列番号：９５。ｈＡｐｏｂｅｃ３ＡまたはＡｎｏＡｐｏｂｅｃの２つの異なるエフェクターを用い、それぞれ配列番号：７６および配列番号：７８に対応する配列を発現するプラスミドをトランスフェクションして導入した。Ｃａｓ１２ｂは、配列番号：７２に対応する配列を発現するプラスミドをトランスフェクションすることによって導入した。ｇＲＮＡの５’ＭＳ２バージョン（配列番号：５９）を全ての条件で使用した。標的部位の配列は、配列番号：９３～９５および８１～８４に対応する。ＤＮＡプラスミド脂質トランスフェクションによって構成要素を導入し、トランスフェクション後７２時間後に細胞を溶解した後、ＰＣＲによって標的遺伝子座を増幅し、サンガー配列決定法によって解析した。スペーサー配列を表５に、編集領域を増幅するプライマーを表６に示す。
【0235】
図９Ａ（ＶＥＧＦＡ＿ｓｇＲＮＡ１）、図９Ｂ（ＶＥＧＦＡ＿ｓｇＲＮＡ６）、図９Ｃ（ＦＡＮＣＦ＿ｓｇＲＮＡ３）、図９Ｄ（サイト２＿ｓｇＲＮＡ２）、図９Ｅ（サイト２＿ｓｇＲＮＡ４）、図９Ｆ（Ｂ２Ｍ＿ｓｇＲＮＡ２）、および図９Ｇ（Ｂ２Ｍ＿ｓｇＲＮＡ３）。複数のゲノム部位と配列コンテキストでのＨＥＫ－２９３細胞へのＤＮＡプラスミド導入による塩基編集構成要素の送達によって達成されたＣからＴへの変異のレベル。Ｘ軸は使用した試薬（ｄＣａｓ１２ｂ－ＵＧＩ－ＵＧＩと併用）を示す；ｈＡｐｏｂｅｃ３Ａ＝５’ＭＳ２ ｇＲＮＡ＋Ａｐｏｂｅｃ３Ａ－ＭＣＰ；ＡｎｏＡｐｏｂｅｃ＝５’ＭＳ２ ｇＲＮＡ＋Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ Ａｐｏｂｅｃ１ａ－ＭＣＰ；ＭＳ２不含－ｈＡｐｏｂｅｃ３Ａ＝ｇＲＮＡがＭＳ２アプタマーを含まない以外はｈＡｐｏｂｅｃ３Ａと同じ；ＭＳ２不含－ＡｎｏＡｐｏｂｅｃ＝ｇＲＮＡがＭＳ２アプタマーを含まない以外はＡｎｏＡｐｏｂｅｃと同じ；ｎｏ－ｔｆ（ｔｆ無し）＝トランスフェクション無しの対照。Ｙ軸は、サンガー配列決定とその後のＣｈｉｍｅｒａ解析によって測定された、プロトスペーサー内の指定されたＣ残基におけるＣからＴへの編集のパーセンテージを表示する。各バーは標的プロトスペーサー内の標的Ｃ残基を表し、図の凡例中の数字は該当するＣ残基の位置を示し、１はＰＡＭ近位、２０はＰＡＭ遠位である。エラーバーは２回繰り返した平均値の標準誤差を示す。
【0236】
図９Ａ－９Ｇは、Ｃａｓ１２ｂ塩基エディターが一般的な塩基編集ツールとして実行可能であり、複数のゲノム遺伝子座と配列コンテキストで編集が観察されたことを示している。ここでも、編集はプロトスペーサー内の複数のＣ残基で観察され、編集ウィンドウのサイズと位置はＣａｓ９塩基編集システムで観察されるものとは異なっている。したがって、このツールのユニークな機能的応用の可能性をさらに強化するものである。さらに、ＭＳ２アプタマーがない場合（ＭＳ２不含）には、編集はほとんど観察されなかった。これは、観察された編集は、ＭＣＰリガンドとＭＳ２リガンド結合部分の間の相互作用によるデアミナーゼのリクルートと、それに続く塩基編集複合体の組み立てに依存していることを示している。
【0237】
実施例５：各種細胞株における塩基編集
【0238】
この実施例は、Ｃａｓ１２ｂ塩基エディターが異なる細胞株において機能的であることを実証する。サンガー配列決定とＣｈｉｍｅｒａ解析は、Ｃａｓ１２ｂ塩基エディターがＵ２ＯＳ細胞株においてＣからＴへの変異を導入することを示している。１つのｓｇＲＮＡが標的とする１つの領域、ＶＥＧＦＡ＿ｓｇＲＮＡ１、配列番号：８３を示す。ｈＡｐｏｂｅｃ３ＡまたはＡｎｏＡｐｏｂｅｃの２つの異なるエフェクターを用い、それぞれ配列番号：７６および配列番号：７８に対応する配列を発現するプラスミドをトランスフェクションして導入した。Ｃａｓ１２ｂは、配列番号：７２に対応する配列を発現するプラスミドをトランスフェクションすることによって導入した。５’ＭＳ２バージョンのｓｇＲＮＡ（配列番号：５９）を発現するプラスミドを全ての条件でトランスフェクションした。ＤＮＡプラスミド脂質トランスフェクションによって構成要素を導入し、トランスフェクション後７２時間後に細胞を溶解した後、ＰＣＲによって標的遺伝子座を増幅し、サンガー配列決定法によって解析した。
【0239】
図１０は、Ｕ２ＯＳ細胞へのＤＮＡプラスミド導入による塩基編集構成要素の送達によって達成されたＣからＴへの変異のレベルを示している。データはガイドＶＥＧＦＡ＿ｓｇＲＮＡ１、配列番号：８３について示されている。Ｘ軸は使用した試薬（ｄＣａｓ１２ｂ－ＵＧＩ－ＵＧＩと併用）を示す；ｈＡｐｏｂｅｃ３Ａ＝５’ＭＳ２ ｇＲＮＡ＋Ａｐｏｂｅｃ３Ａ－ＭＣＰ；ＡｎｏＡｐｏｂｅｃ＝５’ＭＳ２ ｇＲＮＡ＋Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ Ａｐｏｂｅｃ１ａ－ＭＣＰ；ＭＳ２不含－ｈＡｐｏｂｅｃ３Ａ＝ｇＲＮＡがＭＳ２アプタマーを含まない以外はｈＡｐｏｂｅｃ３Ａと同じ；ＭＳ２不含－ＡｎｏＡｐｏｂｅｃ＝ｇＲＮＡがＭＳ２アプタマーを含まない以外はＡｎｏＡｐｏｂｅｃと同じ；ｎｏ－ｔｆ（ｔｆ無し）＝トランスフェクション無しの対照。Ｙ軸は、サンガー配列決定とその後のＣｈｉｍｅｒａ解析によって測定された、プロトスペーサー内の指定されたＣ残基におけるＣからＴへの編集のパーセンテージを表示する。各バーは標的プロトスペーサー内の標的Ｃ残基を表し、図の凡例中の数字は該当するＣ残基の位置を示し、１はＰＡＭ近位、２０はＰＡＭ遠位である。エラーバーは２回繰り返した平均値の標準誤差を示す。
【0240】
図１０は、図９Ａと同じｓｇＲＮＡについて、Ｃａｓ１２ｂ塩基編集ツールがＵ２ＯＳ細胞株で機能することを示しており、塩基編集ツールの一般的な適用性をさらに実証する。編集は両方のデアミナーゼで観察され、ＨＥＫ－２９３細胞で観察されたように、編集は広いウィンドウに渡って見られる。
【0241】
実施例６：ＣａｓＭＩＮＩを使用する塩基編集
【0242】
この実施例は、ｇＲＮＡ－リガンド塩基編集システムがＣａｓ１２ｂ以外のＶ型酵素にも適用できることを実証する。ここでは、ＣａｓＭＩＮＩ塩基エディターがＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の各種部位にＣからＴへの変異を導入することが示されている。ｈＡｐｏｂｅｃ３ＡまたはＡｎｏＡｐｏｂｅｃの２つの異なるエフェクターを用い、それぞれ配列番号：７６および配列番号：７８に対応する配列を発現するプラスミドをトランスフェクションして導入した。ＣａｓＭＩＮＩは、配列番号：７４に対応する配列を発現するプラスミドをトランスフェクションすることによって導入した。ｇＲＮＡは、配列番号：６６から７１に対応するｇＲＮＡ骨格を発現するプラスミドをトランスフェクションすることで導入した。ＶＥＧＦＡ＿ｓｇＲＮＡ１、配列番号：８５、およびＶＥＧＦＡ＿ｓｇＲＮＡ２、配列番号：８６の２つの異なるｓｇＲＮＡが標的とする２つの異なる領域が示されている。ＤＮＡプラスミド脂質トランスフェクションによって構成要素を導入し、トランスフェクション後７２時間後に細胞を溶解した後、ＰＣＲによって標的遺伝子座を増幅し、サンガー配列決定法によって解析した。
【0243】
図１１Ａ～図１１Ｄ：ＨＥＫ－２９３細胞へのＤＮＡプラスミド導入によるＣａｓＭＩＮＩ塩基編集構成要素の送達によって達成されたＣからＴへの変異のレベル。Ｘ軸はｇＲＮＡ中のＭＳ２アプタマーの各種位置を示し、表４で強調した配列に対応する。ｓｇＲＮＡデザイン１、配列番号：６７は５’ＭＳ２に対応する；ｓｇＲＮＡデザイン２、配列番号：６８は、５’ＭＳ２と短縮型ステムループ１に対応する；ｓｇＲＮＡデザイン３、配列番号：６９は、ステムループ１の延長上に位置するＭＳ２に対応する；ｓｇＲＮＡデザイン４、配列番号：７０は、ステムループ２の置換部とステムループ１の短縮部に位置するＭＳ２に対応する；ｓｇＲＮＡデザイン５、配列番号：７１は、リピート：アンチリピート領域を置換して位置するＭＳ２に対応する。これらの図中のＭＳ－２不含は配列番号：６６に対応する。Ｙ軸は、サンガー配列決定とその後のＣｈｉｍｅｒａ解析によって測定された、プロトスペーサー内の指定されたＣ残基におけるＣからＴへの編集のパーセンテージを表示する。各バーは標的プロトスペーサー内の標的Ｃ残基を表し、図の凡例中の数字は該当するＣ残基の位置を示し、１はＰＡＭ近位、２０はＰＡＭ遠位である。エラーバーは２回繰り返した平均値の標準誤差を示す。
【0244】
図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄは、ＣａｓＭＩＮＩ塩基エディターがＨＥＫ－２９３Ｔ細胞で機能していることを示している。Ｃａｓ１２ｂで実証されたように、ＡｎｏＡｐｏｂｅｃとｈＡｐｏｂｅｃ３ａの両方がＣａｓＭＩＮＩ塩基エディターの一部として機能し、３つの異なるｇＲＮＡデザイン（デザイン２、３、４）は一貫して機能する。興味深いことに、リガンド結合部分の配置は編集挙動に明確な影響を及ぼし、デザイン４は広い編集ウィンドウと幅広い編集レベルの上昇を示す一方で、デザイン２と３はプロトスペーサー内の特定のＣ残基に対する顕著な選好性を示した。ｇＲＮＡ内のリガンド結合部分の配置を変えることによって、編集ウィンドウを（位置的にもサイズ的にも）変えることができるこの能力は、ｇＲＮＡ－リガンド塩基編集システムのユニークな実用化とフレキシビリティーをさらに例証している。繰り返しになるが、ＭＳ２アプタマーがない場合（ＭＳ２不含）には、編集はほとんど観察されなかった。これは、観察された編集は、ＭＣＰリガンドとＭＳ２リガンド結合部分の間の相互作用によるデアミナーゼのリクルートと、それに続く塩基編集複合体の組み立てに依存していることを示している。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【配列表】
【国際調査報告】