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特表2024-502143トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチド、発現カセット及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-17
(54)【発明の名称】トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチド、発現カセット及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20240110BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240110BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20240110BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240110BHJP
C12N 9/04 20060101ALI20240110BHJP
C12P 7/22 20060101ALI20240110BHJP
C12P 17/18 20060101ALI20240110BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/70 Z
C12N1/21
C12N9/04 Z
C12P7/22
C12P17/18 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023541107
(86)(22)【出願日】2022-01-05
(85)【翻訳文提出日】2023-09-04
(86)【国際出願番号】 CN2022070188
(87)【国際公開番号】W WO2022148351
(87)【国際公開日】2022-07-14
(31)【優先権主張番号】202110015598.1
(32)【優先日】2021-01-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523022158
【氏名又は名称】上▲海▼晟平医▲療▼器械有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】523022169
【氏名又は名称】上▲海▼博璞▲諾▼科技▲発▼展有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】523022170
【氏名又は名称】浙江博▲シャオ▼生物制▲薬▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】▲楊▼ 勇
(72)【発明者】
【氏名】黄 平
(72)【発明者】
【氏名】姜 ▲標▼
(72)【発明者】
【氏名】朱 文峰
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC17
4B064AE49
4B064AE54
4B064AE55
4B064AE57
4B064CA02
4B064CA19
4B064CB12
4B064CC24
4B064CD06
4B064DA01
4B064DA16
4B065AA26X
4B065AA44Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB06
4B065CA05
4B065CA16
4B065CA18
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
生物工学及び医薬化学工業生産の分野に属する。具体的には、トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドを含む発現カセット、ベクター及び宿主細胞、並びにそれらのｃｉｓ－シクロヘキサジエン－ｏ－ジオール系化合物の製造における使用をさらに提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トルエンジオキシゲナーゼＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡのコード配列を含み、５′末端から３′末端に、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するＴｏｄＣ１のコード配列を含む第１のヌクレオチド配列と、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するＴｏｄＣ２のコード配列を含む第２のヌクレオチド配列と、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するＴｏｄＢのコード配列を含む第３のヌクレオチド配列と、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＴｏｄＡのコード配列を含む第４のヌクレオチド配列と、を含み、
前記第１、第２、第３及び第４のヌクレオチド配列は、それぞれ、大腸菌が好むコドンを独立して使用し、ＴｏｄＢの終止コドンＴＡＡ及びＴｏｄＡの開始コドンＡＴＧは、入れ子配列ＴＡＡＴＧを形成する、ポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記第１のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第１～１３５０位のヌクレオチドを含み、及び／又は、前記第２のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第１４６４～２０２４位のヌクレオチドを含み、及び／又は、
前記第３のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第２０３６～２３５６位のヌクレオチドを含み、及び／又は、
前記第４のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第２３５９～３５８８位のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記ポリヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に位置する第１のスペーサー配列、及び／又は第２のヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列との間に位置する第２のスペーサー配列をさらに含み、前記第１のスペーサー配列は、５′末端から３′末端に、Ｔ７プロモーターと、Ｌａｃオペレータと、原核生物リボソーム結合部位（ｒｂｓ）と、を含み、及び／又は、前記第２のスペーサー配列は、ＡＧリッチなｒｂｓ配列を含み、
好ましくは、前記第１のスペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列を含み、及び／又は
前記第２のスペーサー配列は、ＧＴＧＡＴＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第２０２８～２０３５位のヌクレオチド）又はＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における第２０２８～２０４１位のヌクレオチド）を含む、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現カセット又はベクター。
【請求項6】
５′末端から３′末端に、（１）第２のＴ７プロモーター（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチド配列を有する）と、
（２）請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
（３）任意選択的に存在するＴ７転写ターミネーター（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のヌクレオチド配列を有する）と、を含み、
好ましくは、前記第２のＴ７プロモーターと第１のヌクレオチド配列との間に位置する第２の原核生物リボソーム結合部位（好ましくは、前記第２の原核生物リボソーム結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド配列を有する）をさらに含み、
より好ましくは、前記第２のＴ７プロモーターと第２の原核生物リボソーム結合部位との間に位置する第２のＬａｃオペレータ（好ましくは、前記第２のＬａｃオペレータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド配列を有する）をさらに含む、請求項５に記載の発現カセット又はベクター。
【請求項7】
ｐＥＴ－３ａ－ｄ、ｐＥＴ－９ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ－ｄ、ｐＥＴ－１４ｂ、ｐＥＴ－２１ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ３１ｂ（＋）、ｐＥＴ３２ａ－ｃ（＋）、ｐ３３ｂ、ｐＥＴ－４１ａ－ｃ（＋）及びｐＥＴ－４２ａ－ｃ（＋）から選択されたベクターに由来する、請求項５に記載のベクター。
【請求項8】
請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド或いは請求項５～７のいずれか一項に記載の発現カセット又はベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌であり、より好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＴＭ ２（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＴＭ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）及びＬｅｍｏ２１（ＤＥ３）から選択される、宿主細胞。
【請求項9】
発現カセット又はベクターの発現に適した条件で請求項８に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、トルエンジオキシゲナーゼを製造する方法。
【請求項10】
トルエンジオキシゲナーゼを発現する宿主細胞を溶解して、トルエンジオキシゲナーゼを含有する溶解液を得るステップをさらに含み、好ましくは、トルエンジオキシゲナーゼを精製するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項５～７のいずれか一項に記載の発現カセット又はベクター、或いは請求項８に記載の宿主細胞の、式（２）の化合物の製造における使用であって、【化1】
好ましくは、Ｒは、ハロゲン、メチル、－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＣＨ＝ＣＨＢｒ、－ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、シクロヘキシル、シクロヘキセニル及びフェニルから選択される、使用。
【請求項12】
式（２）の化合物【化2】
発現カセット又はベクターの発現に適した条件で請求項８に記載の宿主細胞を培養するステップ（１）と、
ステップ（１）における宿主細胞を含む培養液に、式（１）の化合物を基質として添加して反応させて、式（２）の化合物を含む発酵液を得るステップ（２）と、
【化3】
Ｒは、請求項１１に定義されたとおりである、方法。
【請求項13】
Ｒは、メチルであり、式（１）の化合物は、トルエンであり、式（２）の化合物は、ｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－メチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオールであり、或いは、Ｒは、Ｉであり、式（１）の化合物は、ヨードベンゼンであり、式（２）の化合物は、ｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－ヨード－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオールであり、或いは、
Ｒは、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３であり、式（１）の化合物は、酢酸ベンジルであり、式（２）の化合物は、ｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項５～７のいずれか一項に記載の発現カセット又はベクター、或いは請求項８に記載の宿主細胞の、テトロドトキシンの製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０２１年１月６日に提出された「トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチド、発現カセット及びその使用」と題された第２０２１１００１５５９８．１号の中国特許出願の優先権を主張するものであり、該出願の全ての内容は、参照により本願に組み込まれるものとする。
【0002】
本発明は、生物工学及び医薬化学工業生産の分野に属する。具体的には、本発明は、トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含む発現カセット、ベクター及び宿主細胞、並びにそれらのｃｉｓ－シクロヘキサジエン－ｏ－ジオール系化合物の製造における使用を提供する。
【背景技術】
【0003】
Ｒ．Ｅ．Ｋａｌｌｉｏらは、１９６０年代後半に、芳香族炭化水素分解菌に１種の芳香環ジヒドロキシル化オキシゲナーゼ（Ｇｉｂｓｏｎ、Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９６８、７、２６５３）を有することを発見しており、これらの酵素において、ベンゼン、トルエン、ナフタレン及びビフェニルなどの基質を用いて、芳香核の活性化、環分裂及びクエン酸回路中間体を通じて芳香環の原核生物の代謝を完了し、該研究は、自然界の炭素循環過程を理解し利用することに対して重要な意義を有するとともに、独特なキラル化学中間体を合成する点でも使用価値を有する。トルエンジオキシゲナーゼは、最も広く研究されている種類の生物触媒であり、１）芳香族ｃｉｓ－ジヒドロキシ化反応、２）オレフィン－ｃｉｓ－ジヒドロキシ化反応、３）硫化物酸化反応、４）ベンジルヒドロキシル化反応、５）炭化水素の脱飽和反応及びＮ－脱アルキル化反応などの重要な官能基変換作業を完了することに役立つ。芳香環は、トルエンオキシゲナーゼの作用で、独特なキラル代謝物であるｃｉｓ－シクロヘキサ－３，５－ジエン－１，２－ジオール又はｃｉｓ－ジヒドロジオール中間体に特異的に変換され、このような酵素反応は、キラルなｃｉｓ－ジヒドロジオール系化合物を前駆体とする複雑な分子合成化学に新しい経路を提供する。Ｔｏｍａｓ Ｈｕｄｌｉｃｋｙらは、トルエンジオキシゲナーゼ系の大腸菌ＪＭ１０９（ｐＤＴＧ６０１）を使用してトルエン又はその類似体をｃｉｓ－シクロヘキサジエン－ｏ－ジオール系化合物中間体に変換した、酵素全細胞発酵によるジヒドロキシル化反応を２０１８年に報告した（Ｂａｉｄｉｌｏｖ、Ｄ．ｅｔ ａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１８、５７、１０９９４－１０９９８）。彼らは、文献分析を通じて、Ｆｕｋｕｙａｍａらが報告した方法により、２１ステップの反応を経て天然物のテトロドトキシンを該中間体から合成することができると考え、提案した。
【0004】
Ｔｏｍａｓ Ｈｕｄｌｉｃｋｙらが使用した発現プラスミドｐＤＴＧ６０１に搭載されたトルエンジオキシゲナーゼ系ＤＮＡは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｆ１ゲノムにおける元の配列に直接由来し、該配列は、ｔｏｄＣ１／ｔｏｄＣ２／ｔｏｄＢ／ｔｏｄＡの４つの遺伝子のコード配列を含むだけでなく、コード配列間のスペーサー配列及び４つのコード配列の組み合わせ方式をさらに含む。一般的に、異なる種のＤＮＡ配列が大腸菌で直接発現されると、コドン使用頻度の好み、プロモーター及びリボソームの認識部位に関する種差のため、タンパク質の発現効果が満足のいくものではないことにより、酵素の触媒効果に影響を与える。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
一態様において、本発明に係るポリヌクレオチドは、トルエンジオキシゲナーゼＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡのコード配列を含む。
【0006】
一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、５′末端から３′末端に、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するＴｏｄＣ１のコード配列を含む第１のヌクレオチド配列と、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するＴｏｄＣ２のコード配列を含む第２のヌクレオチド配列と、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するＴｏｄＢのコード配列を含む第３のヌクレオチド配列と、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＴｏｄＡのコード配列を含む第４のヌクレオチド配列と、を含み、前記第１、第２、第３及び第４のヌクレオチド配列は、それぞれ、大腸菌が好むコドンを独立して使用し、ＴｏｄＢの終止コドンＴＡＡ及びＴｏｄＡの開始コドンＡＴＧは、入れ子配列ＴＡＡＴＧを形成する。
【0007】
具体的な実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含む。
【0008】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセット又はベクター、及び本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
【0009】
別の態様において、本発明に係る、トルエンジオキシゲナーゼを製造する方法は、発現カセット又はベクターの発現に適した条件で本発明の宿主細胞を培養するステップを含む。
【0010】
さらに別の態様において、本発明に係る、式（２）の化合物を製造する方法は、
発現カセット又はベクターの発現に適した条件で本発明の宿主細胞を培養するステップ（１）と、
ステップ（１）における宿主細胞を含む培養液に、式（１）の化合物を基質として添加して反応させて、式（２）の化合物を含む発酵液を得るステップ（２）と、
ステップ（２）における発酵液から式（２）の化合物を回収するステップ（３）と、を含み、
式中、Ｒは、ハロゲン、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ１－６アルキル－ＣＮ、－Ｃ１－６アルキル－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ３－８シクロアルキル、－Ｃ３－８シクロアルケニル、－Ｃ６－１０アリールから選択され、ここで、上記Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ１－６アルキル－ＣＮ、－Ｃ１－６アルキル－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ３－８シクロアルキル、－Ｃ３－８シクロアルケニル、－Ｃ６－１０アリールは、１つ又は複数のハロゲンで任意選択的に置換され、
好ましくは、Ｒは、ハロゲン、メチル、－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＣＨ＝ＣＨＢｒ、－ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、シクロヘキシル、シクロヘキセニル及びフェニルから選択される。
【化1】
ステップ（１）における宿主細胞を含む培養液に、式（１）の化合物を基質として添加して反応させて、式（２）の化合物を含む発酵液を得るステップ（２）と、
【化2】
式中、Ｒは、ハロゲン、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ１－６アルキル－ＣＮ、－Ｃ１－６アルキル－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ３－８シクロアルキル、－Ｃ３－８シクロアルケニル、－Ｃ６－１０アリールから選択され、ここで、上記Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ１－６アルキル－ＣＮ、－Ｃ１－６アルキル－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ３－８シクロアルキル、－Ｃ３－８シクロアルケニル、－Ｃ６－１０アリールは、１つ又は複数のハロゲンで任意選択的に置換され、
好ましくは、Ｒは、ハロゲン、メチル、－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＣＨ＝ＣＨＢｒ、－ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、シクロヘキシル、シクロヘキセニル及びフェニルから選択される。
【0011】
したがって、さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター及び宿主細胞の式（２）の化合物の製造における使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＡとＢは、それぞれｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１とｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２のプラスミドマップである。マップにおけるＮｄｅＩ酵素切断部位とＢａｍＨＩ酵素切断部位との間に含まれる断片が本発明のポリヌクレオチドである。Ｃは、ＳＥＱ１、ＳＥＱ２、ＳＥＱ１２及びＳＥＱ１３の配列アノテーション図である。Ｓ１とＳ２は、それぞれ、第１のスペーサー配列と第２のスペーサー配列を表し、Ｏは、配列がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｆ１株のゲノムにおける元の配列に由来することを表し、Ａは、配列が人工的に設計された配列であることを表す。
【図2】ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲル電気泳動図に対する分析により、組換え株におけるトルエンジオキシゲナーゼの可溶性発現を示し、クマシーブリリアントブルー染色において、ＴｏｄＣ１及びＴｏｄＣ２を表すタンパク質バンドを示す。０、１２、１３、１、及び２は、それぞれ、組換え株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１２）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１）、及びＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２）を表す。Ｔ、Ｓ、及びＰは、それぞれ、全細胞、上清、及び沈殿を表す。
【図3】酢酸ベンジルを基質として、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１）株により生体内変換を行う過程におけるＨＰＬＣ検出チャートであり、１３ｍｉｎの位置が生成物のジオール化合物としてのｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオール（ＣＡＳ：１３１０４３－５１－１）であり、２５ｍｉｎの位置が基質としての酢酸ベンジルである。
【図4】酢酸ベンジルを基質として、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１）株により生体内変換を行って取得された生成物のｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオール（ＣＡＳ：１３１０４３－５１－１）のＮＭＲスペクトルであり、溶媒が重水素化クロロホルムである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、特定の具体的な実施形態により本発明の技術内容を説明するが、当業者は、本発明の他の利点と効果を本明細書に開示された内容から容易に理解することができる。本発明は、他の異なる具体的な実施形態により実施されるか又は使用されてもよい。当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、様々な修飾及び変更を行うことができる。明確に述べられない限り、以下の実施例において使用される試薬及び機器は、いずれも本分野における従来の試薬及び機器であり、市販により入手することができ、使用される方法も従来の方法であり、当業者は、明細書の内容に基づいて、どのように上記実験を完了して対応する結果を取得するかを明確に知ることができる。
【0014】
一般的な用語及び定義
本発明において、特に断りのない限り、本明細書において使用される科学用語及び技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有する。また、本明細書において使用されるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学の関連用語は、いずれも対応する分野で広く使用されている用語である。また、本発明をよりよく理解するために、以下、関連用語の定義及び解釈を提供する。
本発明において、特に断りのない限り、本明細書において使用される科学用語及び技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有する。また、本明細書において使用されるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学の関連用語は、いずれも対応する分野で広く使用されている用語である。また、本発明をよりよく理解するために、以下、関連用語の定義及び解釈を提供する。
【0015】
本明細書において使用される場合、単数形の「１つ」、「１種」又は「この」という表現は、文脈で別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【0016】
本明細書において言及される範囲は、それらの端点、その中の全てのポイント値、及びこれらの値で構成された部分範囲を包含する。例えば、Ｃ１－６は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１－５、Ｃ２－６、Ｃ３－５、Ｃ２－４などを包含する。また例えば、Ｃ３－８は、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ３－７、Ｃ４－８、Ｃ５－７などを包含する。
【0017】
本明細書において使用される「１つ以上」又は「少なくとも１つ」という用語は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はそれ以上を包含する。
【0018】
本明細書において、「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドと、リボヌクレオチドと、それらの誘導体と、を含む。「ヌクレオチド」は、一般的に、その中の塩基を表す１文字で指定され、「Ａ（ａ）」は、デオキシアデニル酸又はアデニル酸を指し、「Ｃ（ｃ）」は、デオキシチジル酸又はチジル酸を指し、「Ｇ（ｃ）」は、デオキシグアノシル酸又はグアノシル酸を指し、「Ｕ（ｕ）」は、ウリジル酸を指し、「Ｔ（ｔ）」は、デオキシチミジル酸を指す。
【0019】
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマー（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチドのポリマー（ＲＮＡ）を指す。「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を指すために互換的に使用されてもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖でも二本鎖でもよい。ポリヌクレオチドはまた、合成ヌクレオチドと、非天然ヌクレオチドと、修飾ヌクレオチドと、を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、１つ又は複数のヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つの配列）を含んでもよい。ヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質又はポリペプチドをコードするコード配列と、コード配列の発現を調節する調節配列と、制限酵素の酵素切断部位と、を含んでもよいが、これらに限定されない。
【0020】
本明細書において使用される場合、「コドン」は、特定のアミノ酸をコードする、ポリヌクレオチドにおける３つの連続したヌクレオチド配列（トリプレットコードとも呼ばれる）を指す。種によってコドンの使用の好みがあり、即ち、同義コドン（同じアミノ酸をコードするコドン）は、異なる種において使用される頻度が異なる。一般的に、ある種が好むコドンを使用するタンパク質コード配列は、該種の発現系において比較的に高い翻訳効率及び正確率を有することができると考えられている。「大腸菌が好むコドン」は、大腸菌において使用頻度が比較的に高いコドンを指す。本発明のポリヌクレオチドに含まれるコード配列は、大腸菌が好むコドンを使用する。
【0021】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により共有結合で連結された２つ以上のアミノ酸を含むポリマーを指す。「タンパク質」は、１つ又は複数のポリペプチドを含んでもよく、ここで、ポリペプチドの間は、共有結合又は非共有結合の方式により相互作用する。特に断りのない限り、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用されてもよい。
【0022】
本明細書において使用される場合、「単離」は、物質（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）がその存在するソース又は環境から分離され、即ち、実質的に他の任意の成分を含まないことを意味する。
【0023】
本明細書において使用される場合、「発現カセット」という用語は、調節配列に操作可能に連結された標的コード配列を含む、標的コード配列の発現を指示できるポリヌクレオチドを指す。本発明の発現カセットは、大腸菌発現系においてタンパク質又はＲＮＡを発現させるために用いられる。本発明の発現カセットに使用できる調節配列は、例えば、プロモーター、転写因子結合部位（例えば、リボソーム結合部位）、エンハンサー及び転写終止シグナル（例えば、転写ターミネーター）を含んでもよい。
【0024】
本明細書において使用される場合、「操作可能に連結」は、一方のヌクレオチド配列の機能が他方のヌクレオチド配列により影響されるように、ヌクレオチド配列間が連結されるか又は隣接することを指す。例えば、標的コード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、標的コード配列の転写を指示し、標的コード配列に操作可能に連結されたリボソーム結合部位は、標的コード配列の翻訳を指示する。
【0025】
本明細書において、「コード配列」は、標的タンパク質（例えば、ＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡ）又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。
【0026】
本明細書において、「発現」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、標的コード配列）からタンパク質を生産する過程を指す。いくつかの実施形態において、本発明の発現ベクターは、「誘導性発現」である。「誘導性発現」は、遺伝子の発現を特定の条件（例えば、誘導物質の存在）で実現する必要があることを指す。例えば、本発明の実施形態において、誘導物質（例えば、ＩＰＴＧ）を組換え株の培養液に添加することにより、トルエンジオキシゲナーゼＴｏｄＣ１Ｃ２ＢＡの発現を誘導する。
【0027】
本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼと正確な転写に必要な他の因子とを含む認識配列によりコード配列の発現を制御する、ＲＮＡポリメラーゼの認識を含むヌクレオチド配列を指す。「プロモーター調節配列」は、近位及びより遠位の上流エレメント及び／又は下流エレメントを含んでもよい。プロモーター調節配列は、それに操作可能に連結されたコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング又は安定性、又は翻訳に影響を与える。「プロモーター」という用語の意味は、「プロモーター調節配列」を含む。
【0028】
本明細書において使用される場合、「エンハンサー」は、標的コード配列の転写を増強できるヌクレオチド配列である。エンハンサーは、プロモーターと同種であってもよく、プロモーターと異種であってもよい。エンハンサーは、プロモーター配列内、その上流又は下流に位置してもよい。
【0029】
本明細書において使用される場合、「形質転換」は、ポリヌクレオチド又はベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞からポリヌクレオチド又はベクターを発現できることを指す。形質転換は、一時的であってもよく、安定的であってもよい。本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターで形質転換された宿主細胞は、「組換え細胞」と呼ばれてもよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、例えば、大腸菌の細菌株であり、そのような組換え細胞は、「組換え株」と呼ばれてもよい。
【0030】
本明細書において使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ポリヌクレオチド又はベクターを受け取り、維持し、複製し、発現させるための細胞を指す。本発明において、好ましい宿主細胞は、標的コード配列を発現させることができる細胞である。
【0031】
「トルエンジオキシゲナーゼ」又は「ＴｏｄＣ１Ｃ２ＢＡ」という用語は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）Ｆ１株のタンパク質ＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡの総称を指す。シュードモナス・プチダＦ１のｔｏｄＣ１、ｔｏｄＣ２、ｔｏｄＢ及びｔｏｄＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ０４９９６．１における第６２０～４２１０位のヌクレオチドに示されるとおりであり（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、その中にスペーサー配列を含む。「ＴｏｄＣ１」は、ｔｏｄＣ１（ｂｎｚＡとも呼ばれる）遺伝子によりコードされ、Ｂｅｎｚｅｎｅ １，２－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｌｐｈａとも呼ばれ、Ｕｎｉｐｒｏｔ識別番号（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）：Ａ５Ｗ４Ｆ２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を有する。「ＴｏｄＣ２」は、ｔｏｄＣ２（ｂｎｚＢとも呼ばれる）遺伝子によりコードされ、Ｂｅｎｚｅｎｅ １，２－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａとも呼ばれ、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ａ５Ｗ４Ｆ１に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を有する。「ＴｏｄＢ」は、ｔｏｄＢ遺伝子によりコードされ、Ｔｏｌｕｅｎｅ １，２－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔとも呼ばれ、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ａ５Ｗ４Ｆ０に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を有する。「ＴｏｄＡ」は、ｔｏｄＡ遺伝子によりコードされ、Ｔｏｌｕｅｎｅ １，２－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ－－ＮＡＤ（＋）ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔとも呼ばれ、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ａ５Ｗ４Ｅ９に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を有する。
【0032】
ＴｏｄＣ１Ｃ２ＢＡは、以下に示す、トルエン又はトルエン類似体（式（１））からｃｉｓ－シクロヘキサジエン－ｏ－ジオール系化合物（式（２））までの反応を共同触媒する。
【0033】
【化3】
【0034】
本明細書において使用される場合、「トルエン又はトルエン類似体」は、上記式（１）に示される構造を有する。
【0035】
本明細書において使用される場合、「ｃｉｓ－シクロヘキサジエン－ｏ－ジオール系化合物」という用語は、上記式（２）に示される構造を有する。
【0036】
本明細書で使用される場合、「置換」という用語は、指定した原子のうちの１つ又は複数の水素が、所定の基の選択で置き換えられていることを示し、条件は、現在の状況における指定した原子の正常な原子価を超えず、かつ上記置換により、安定的な化合物を形成することである。置換基及び／又は可変要素の組み合わせは、このような組み合わせが安定的な化合物を形成する場合にのみ許容される。本明細書において言及される、任意選択的に置換された基の置換基の例は、ハロゲンであってもよい。本明細書に記載のアルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールは、場合により置換されてもよい。
【0037】
本明細書において使用される場合、「ハロゲン」という用語は、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）を指す。
【0038】
本明細書において、「ｉ～ｊ」又は類似の表現は、端点、その中の各整数、及びその中の整数で構成された部分範囲を包含する範囲を指す。例えば、Ｃ１－６は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ２－５、Ｃ３－４などを包含する。
【0039】
本明細書において使用される場合、「アルキル」という用語は、単独で使用されるか又は他の用語と組み合わせて使用されることに関わらず、特定の数の炭素原子を有する分岐又は直鎖の飽和脂肪族炭化水素基を指す。特に指定しない限り、「アルキル」は、Ｃ１－６アルキルを指す。例えば、「Ｃ１－６アルキル」は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。
【0040】
本明細書において使用される場合、「アルケニル」という用語は、単独で使用されるか又は他の用語と組み合わせて使用されることに関わらず、炭素－炭素二重結合を含む特定の数の炭素原子の分岐又は直鎖の不飽和脂肪族炭化水素基を指す。特に指定しない限り、「アルケニル」は、Ｃ２－６アルケニルを指す。
【0041】
本明細書において使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、単独で使用されるか又は他の用語と組み合わせて使用されることに関わらず、特定の数の炭素原子を有する飽和脂肪族環式炭化水素基を指す。特に指定しない限り、「シクロアルキル」は、Ｃ３－８シクロアルキルを指す。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。
【0042】
本明細書において使用される場合、「シクロアルケニル」という用語は、単独で使用されるか又は他の用語と組み合わせて使用されることに関わらず、炭素－炭素二重結合を含む特定の数の炭素原子の不飽和脂肪族環式炭化水素基を指す。特に指定しない限り、「シクロアルケニル」は、Ｃ３－８シクロアルケニルを指す。例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどを含むが、これらに限定されない。
【0043】
本明細書において使用される場合、「アリール」という用語は、単独で使用されるか又は他の用語と組み合わせて使用されることに関わらず、５員又は６員の芳香族炭素環を含む芳香族炭化水素基を指す。特に指定しない限り、「アリール」は、Ｃ６－１０アリールを指す。例えば、フェニル、ナフチルなどを含むが、これらに限定されない。
【0044】
本明細書において使用される組換えＤＮＡ技術は、本分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ、１９８９を参照）。
【0045】
ポリヌクレオチド
一態様において、本発明に係るポリヌクレオチドは、シュードモナス・プチダＦ１株のトルエンジオキシゲナーゼＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡのコード配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは、単離されていることが好ましい。
一態様において、本発明に係るポリヌクレオチドは、シュードモナス・プチダＦ１株のトルエンジオキシゲナーゼＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡのコード配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは、単離されていることが好ましい。
【0046】
一実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、５′末端から３′末端に、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するＴｏｄＣ１のコード配列を含む第１のヌクレオチド配列と、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するＴｏｄＣ２のコード配列を含む第２のヌクレオチド配列と、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するＴｏｄＢのコード配列を含む第３のヌクレオチド配列と、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＴｏｄＡのコード配列を含む第４のヌクレオチド配列と、を含み、
上記第１、第２、第３及び第４のヌクレオチド配列は、それぞれ、大腸菌が好むコドンを独立して使用し、ＴｏｄＢの終止コドンＴＡＡ及びＴｏｄＡの開始コドンＡＴＧは、入れ子配列ＴＡＡＴＧを形成する。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するＴｏｄＣ１のコード配列を含む第１のヌクレオチド配列と、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するＴｏｄＣ２のコード配列を含む第２のヌクレオチド配列と、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するＴｏｄＢのコード配列を含む第３のヌクレオチド配列と、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＴｏｄＡのコード配列を含む第４のヌクレオチド配列と、を含み、
上記第１、第２、第３及び第４のヌクレオチド配列は、それぞれ、大腸菌が好むコドンを独立して使用し、ＴｏｄＢの終止コドンＴＡＡ及びＴｏｄＡの開始コドンＡＴＧは、入れ子配列ＴＡＡＴＧを形成する。
【0047】
１つの好ましい実施形態において、上記第１のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第１～１３５０位のヌクレオチド（また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における第１～１３５０位のヌクレオチドを参照）を含む。別の好ましい実施形態において、上記第２のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第１４６４～２０２４位のヌクレオチド（また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における第１４６４～２０２４位のヌクレオチドを参照）を含む。さらなる好ましい実施形態において、上記第３のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第２０３６～２３５６位のヌクレオチド（また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における第２０４２～２３６２位のヌクレオチドを参照）を含む。さらなる好ましい実施形態において、上記第４のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第２３５９～３５８８位のヌクレオチド（また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における第２３６５～３５９４位のヌクレオチドを参照）を含む。
【0048】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に位置する第１のスペーサー配列、及び／又は第２のヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列との間に位置する第２のスペーサー配列をさらに含む。
【0049】
一実施形態において、上記第１のスペーサー配列は、５′末端から３′末端に、Ｔ７プロモーターと、Ｌａｃオペレータ（ＬａｃＯ）と、原核生物リボソーム結合部位（ｒｂｓ）と、を含む。一実施形態において、Ｔ７プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、原核生物リボソーム結合部位は、ＡＡＧＧＡＧなどのＡＧリッチなものである。１つの具体的な実施形態において、原核生物リボソーム結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、Ｌａｃオペレータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド配列を含む。
【0050】
一実施形態において、上記第２のスペーサー配列は、ＧＴＧＡＴＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第２０２８～２０３５位のヌクレオチド）を含む。一実施形態において、上記第２のスペーサー配列は、ＡＡＧＧＡＧなどのＡＧリッチなｒｂｓ配列を含む。さらに好ましい実施形態において、第２のスペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド配列を含む。
【0051】
好ましくは、上記第１のスペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列を含み、及び／又は、上記第２のスペーサー配列は、ＧＴＧＡＴＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第２０２８～２０３５位のヌクレオチド）又はＧＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における第２０２８～２０４１位のヌクレオチド）を含む。
【0052】
１つの具体的な実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含む。
【0053】
一実施形態において、上記第１、第２、第３及び第４のヌクレオチド配列は、それぞれ独立してポリペプチドタグのコード配列をさらに含む。ポリペプチドタグのコード配列と標的ポリペプチドのコード配列（例えば、ＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ又はＴｏｄＡのコード配列）とは、ポリペプチドタグ及び標的ポリペプチドが同じオープンリーディングフレームから融合ポリペプチドとして発現されるように、操作可能に連結される。ポリペプチドタグの例は、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、ポリヒスチジンタグ（即ち、Ｈｉｓ５、Ｈｉｓ６、Ｈｉｓ８などのＨｉｓタグ）と、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と、連鎖球菌Ｇタンパク質のＢ１ドメイン（ＧＢ１）と、チオレドキシン（ＴＲＸ）と、低分子ユビキチン関連修飾タンパク質（ＳＵＭＯ）と、を含むが、これらに限定されない。
【0054】
発現カセット及びベクター
さらに別の態様において、本発明に係るベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む。
さらに別の態様において、本発明に係るベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む。
【0055】
ベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであってもよい。好ましい実施形態において、上記ベクターは、発現ベクターである。
【0056】
好ましい実施形態において、ベクターは、発現カセットの形態で本発明のポリヌクレオチドを含み、このようなベクターは、発現ベクターであってもよい。したがって、別の態様において、本発明に係る発現カセットは、本発明のポリヌクレオチド及び調節配列を含む。調節配列は、本発明のポリヌクレオチドに操作可能に連結され、かつ標的タンパク質（例えば、トルエンジオキシゲナーゼＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡ）の発現を指示する。発現カセットに適用される調節配列は、プロモーターと、転写エンハンサーと、翻訳エンハンサーと、原核生物リボソーム結合部位と、Ｌａｃオペロンの調節エレメントと、転写ターミネーターと、それらの組み合わせと、を含んでもよいが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、調節配列は、プロモーター、原核生物リボソーム結合部位、転写ターミネーター又はそれらの組み合わせである。より好ましい実施形態において、調節配列は、プロモーター、Ｌａｃオペロンの調節エレメント、原核生物リボソーム結合部位、転写ターミネーター又はそれらの組み合わせである。
【0057】
プロモーターは、一般的に、標的タンパク質のコード配列の上流に位置する。本発明に用いることができる好ましいプロモーターは、Ｔ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターの例示的なヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される。一実施形態において、調節配列は、本発明のポリヌクレオチドの上流に位置する第２のプロモーターを含む。１つの具体的な実施形態において、第２のプロモーターは、Ｔ７プロモーターである。１つの具体的な実施形態において、Ｔ７プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチド配列を含む。
【0058】
原核生物リボソーム結合部位は、一般的に、プロモーターと標的タンパク質のコード配列との間に位置する。好ましくは、原核生物リボソーム結合部位は、開始コドンの上流の５～１０個の塩基に位置する。原核生物リボソーム結合部位は、例えば、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列であってもよい。好ましい原核生物リボソーム結合部位の配列は、ＡＧリッチなものである。原核生物リボソーム結合部位の例示的なヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。一実施形態において、調節配列は、上述した第２のプロモーターと本発明のポリヌクレオチドとの間に位置する第２の原核生物リボソーム結合部位をさらに含む。１つの具体的な実施形態において、第２の原核生物リボソーム結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド配列を含む。
【0059】
Ｌａｃオペロンの調節エレメントは、例えば、Ｌａｃオペレータ（Ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、ＬａｃＯ）、Ｌａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）のプロモーター配列及びコード配列であってもよい。好ましい実施形態において、本発明の発現カセットは、プロモーターと標的タンパク質のコード配列との間に位置するＬａｃオペレータを含み、Ｌａｃリプレッサーのプロモーター配列及びコード配列は、同じベクターの別の発現カセットに存在する。他の実施形態において、本発明の発現カセットは、プロモーターと標的タンパク質のコード配列との間に位置するＬａｃオペレータを含み、Ｌａｃリプレッサーのプロモーター及びコード配列は、第２のベクターに存在する。Ｌａｃオペレータの例示的なヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される。さらなる実施形態において、調節配列は、上述した第２のプロモーターと第２の原核生物リボソーム結合部位との間に位置する第２のＬａｃオペレータをさらに含む。１つの具体的な実施形態において、第２のＬａｃオペレータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド配列を含む。
【0060】
１つの具体的な実施形態において、上記発現カセット又はベクターは、５′末端から３′末端に、（１）第２のプロモーターと、（２）本発明のポリヌクレオチドと、を含む。１つの具体的な実施形態において、第２のプロモーターは、Ｔ７プロモーターである。１つの具体的な実施形態において、Ｔ７プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチド配列を含む。
【0061】
１つの具体的な実施形態において、上記発現カセット又はベクターは、５′末端から３′末端に、（１）第２のプロモーターと、（２）第２の原核生物リボソーム結合部位と、（３）本発明のポリヌクレオチドと、を含む。１つの具体的な実施形態において、第２のプロモーターは、Ｔ７プロモーターである。一実施形態において、Ｔ７プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチド配列を含む。１つの好ましい実施形態において、第２の原核生物リボソーム結合部位の配列は、ＡＧリッチなものである。１つの具体的な実施形態において、第２の原核生物リボソーム結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド配列を含む。
【0062】
さらなる１つの具体的な実施形態において、上記発現カセット又はベクターは、５′末端から３′末端に、（１）第２のプロモーターと、（２）第２のＬａｃオペレータと、（３）第２の原核生物リボソーム結合部位と、（４）本発明のポリヌクレオチドと、を含む。１つの具体的な実施形態において、第２のプロモーターは、Ｔ７プロモーターである。１つの具体的な実施形態において、Ｔ７プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチド配列を含む。１つの好ましい実施形態において、第２の原核生物リボソーム結合部位の配列は、ＡＡＧＧＡＧなどのＡＧリッチなものである。１つの具体的な実施形態において、第２の原核生物リボソーム結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド配列を含む。別の具体的な実施形態において、第２のＬａｃオペレータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド配列を含む。
【0063】
上述した実施形態において、上記発現カセット又はベクターは、転写ターミネーターをさらに含んでもよい。転写ターミネーターは、標的タンパク質のコード配列の下流に位置してもよい。転写ターミネーターは、ベクターにおけるプロモーター及び宿主系に含まれるＲＮＡポリメラーゼに応じて選択される。プロモーターがＴ７プロモーターである実施形態において、転写ターミネーターは、Ｔ７転写ターミネーターであってもよい。Ｔ７転写ターミネーターの例示的なヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。一実施形態において、第２のプロモーターは、Ｔ７プロモーターであり、転写ターミネーターは、Ｔ７転写ターミネーターである。１つの具体的な実施形態において、Ｔ７転写ターミネーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のヌクレオチド配列を含む。
【0064】
一実施形態において、上記発現カセット又はベクターは、５′末端から３′末端に、
（１）第２のＴ７プロモーター（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチド配列を有する）と、
（２）本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を有する）と、
（３）任意選択的に存在するＴ７転写ターミネーター（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のヌクレオチド配列を有する）と、を含み、
好ましくは、上記発現カセット又はベクターは、第２のＴ７プロモーターと第１のヌクレオチド配列との間に位置する第２の原核生物リボソーム結合部位（好ましくは、上記第２の原核生物リボソーム結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド配列を有する）をさらに含み、
より好ましくは、上記発現カセット又はベクターは、上記第２のＴ７プロモーターと第２の原核生物リボソーム結合部位との間に位置する第２のＬａｃオペレータ（好ましくは、上記第２のＬａｃオペレータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド配列を有する）をさらに含む。
（１）第２のＴ７プロモーター（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチド配列を有する）と、
（２）本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を有する）と、
（３）任意選択的に存在するＴ７転写ターミネーター（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のヌクレオチド配列を有する）と、を含み、
好ましくは、上記発現カセット又はベクターは、第２のＴ７プロモーターと第１のヌクレオチド配列との間に位置する第２の原核生物リボソーム結合部位（好ましくは、上記第２の原核生物リボソーム結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド配列を有する）をさらに含み、
より好ましくは、上記発現カセット又はベクターは、上記第２のＴ７プロモーターと第２の原核生物リボソーム結合部位との間に位置する第２のＬａｃオペレータ（好ましくは、上記第２のＬａｃオペレータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド配列を有する）をさらに含む。
【0065】
１つの具体的な実施形態において、上記発現カセット又はベクターは、５′末端から３′末端に、（１）第２のＴ７プロモーター（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチド配列を有する）と、（２）第２のＬａｃオペレータ（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド配列を有する）と、（３）第２の原核生物リボソーム結合部位（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド配列を有する）と、（４）本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を有する）と、（５）Ｔ７転写ターミネーター（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のヌクレオチド配列を有する）と、を含む。
【0066】
ベクターは、複製起点（例えば、ｐＵＣ ｏｒｉｇｉｎ、ｐＢＲ３２２ ｏｒｉｇｉｎ又はｐＭＢ１ ｏｒｉｇｉｎ）と、抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子又はアンピシリン耐性遺伝子）の発現カセットとをさらに含んでもよい。抗生物質耐性遺伝子の発現カセットは、一般的に、プロモーターと、抗生物質耐性遺伝子のコード配列と、を含んでもよい。本発明に用いることができる複製起点及び抗生物質耐性遺伝子の発現カセットは、市販のベクターに使用される複製起点及び抗生物質耐性遺伝子の発現カセットなどの当業者に周知のものであってもよい。
【0067】
本発明のポリヌクレオチドを、市販のベクターにクローニングすることができる。本発明に用いることができるベクターは、好ましくは、プラスミドベクターである。好ましい市販のプラスミドベクターは、Ｔ７プロモーターと、原核生物リボソーム結合部位と、Ｔ７転写ターミネーターと、を含んでもよく、Ｔ７ポリメラーゼを発現させる宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させるように指示することができる。さらに好ましい市販のプラスミドベクターは、Ｌａｃオペロンの調節エレメントをさらに含んでもよい。このようなベクターは、例えば、ｐＥＴシリーズベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、ｐＥＴ－３ａ－ｄ、ｐＥＴ－９ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ－ｄ、ｐＥＴ－１４ｂ、ｐＥＴ－２１ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ３１ｂ（＋）、ｐＥＴ３２ａ－ｃ（＋）、ｐ３３ｂ、ｐＥＴ－４１ａ－ｃ（＋）及びｐＥＴ－４２ａ－ｃ（＋）から選択されたベクターに由来する。ファージベクター及びファージミドベクターを考慮してもよい。１つの具体的な実施形態において、本発明のベクターは、ｐＥＴ－２４ａ（＋）に由来し、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含む。
【0068】
宿主細胞
別の態様において、本発明に係る宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む。
別の態様において、本発明に係る宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む。
【0069】
トルエンジオキシゲナーゼを発現させるために、本発明の発現カセット又はベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。本発明に用いることができる宿主細胞は、市販できるものである。好ましい宿主細胞は、大腸菌である。タンパク質を発現させるための宿主細胞として、大腸菌がより好ましい。より好ましくは、大腸菌がＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させることができるように、上記大腸菌の染色体には、（Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼのコード配列を含有）λファージＤＥ３領域が組み込まれる。より好ましくは、大腸菌におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現は、誘導性である。例えば、大腸菌におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼをＬａｃオペロンの制御で、ＩＰＴＧで誘導して発現させることができる。一実施形態において、上記宿主細胞は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＴＭ ２（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＴＭ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）及びＬｅｍｏ２１（ＤＥ３）から選択される。１つの具体的な実施形態において、上記宿主細胞は、トルエンジオキシゲナーゼ発現ベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であり、上記トルエンジオキシゲナーゼ発現ベクターは、ｐＥＴ－２４ａ（＋）に由来し、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含む。
【0070】
本分野で知られている従来の形質転換技術を使用して、本発明のベクターを宿主細胞に導入することができる。このような技術は、リン酸カルシウム共沈殿と、塩化カルシウム共沈殿と、熱ショックと、組換えファージ形質導入と、エレクトロポレーションと、三親接合と、を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ、１９８９を参照）。
【0071】
トルエンジオキシゲナーゼを製造する方法
さらに別の態様において、本発明に係る、トルエンジオキシゲナーゼを製造する方法は、本発明の発現カセット又はベクターの発現に適した条件で本発明の宿主細胞を培養するステップを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、トルエンジオキシゲナーゼを発現させる宿主細胞を溶解して、トルエンジオキシゲナーゼを含有する溶解液を得るステップをさらに含む。さらに別の実施形態において、上記方法は、トルエンジオキシゲナーゼを精製するステップをさらに含む。
さらに別の態様において、本発明に係る、トルエンジオキシゲナーゼを製造する方法は、本発明の発現カセット又はベクターの発現に適した条件で本発明の宿主細胞を培養するステップを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、トルエンジオキシゲナーゼを発現させる宿主細胞を溶解して、トルエンジオキシゲナーゼを含有する溶解液を得るステップをさらに含む。さらに別の実施形態において、上記方法は、トルエンジオキシゲナーゼを精製するステップをさらに含む。
【0072】
１つの具体的な実施形態において、上記宿主細胞は、本発明のベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【0073】
１つの具体的な実施形態において、発現カセット又はベクターの発現に適した条件で宿主細胞を培養する上記ステップは、
（１）温度が約３０～３７℃で、ｐＨ約が６．８～７．３で、溶存酸素≧２０％の条件で、本発明のベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、無機塩培地を使用して培養するステップと、
（２）溶存酸素が急激に多くなる場合、６６％グルコース溶液を１２～１８ｍＬ／ｈｒ／Ｌの速度で添加して供給するステップと、
（３）ＯＤ６００が約３０～５０である場合、温度を２０～３０℃に下げ、最終濃度が０．１～１ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシドを添加して発現を誘導するステップと、を含む。
（１）温度が約３０～３７℃で、ｐＨ約が６．８～７．３で、溶存酸素≧２０％の条件で、本発明のベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、無機塩培地を使用して培養するステップと、
（２）溶存酸素が急激に多くなる場合、６６％グルコース溶液を１２～１８ｍＬ／ｈｒ／Ｌの速度で添加して供給するステップと、
（３）ＯＤ６００が約３０～５０である場合、温度を２０～３０℃に下げ、最終濃度が０．１～１ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシドを添加して発現を誘導するステップと、を含む。
【0074】
１つの具体的な実施形態において、上記無機塩培地は、６～１０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４・３Ｈ２Ｏと、１１～１５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４と、１～３ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４と、１～３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏと、１～３ｇ／Ｌのくえん酸三ナトリウム二水和物と、２～５ｇ／Ｌの大豆ペプトンと、５～１０ｇ／Ｌのグルコース一水和物と、０．１～１ｇ／Ｌの消泡剤と、１０～２０ｍＬ／Ｌの微量元素溶液と、を含み、上記微量元素溶液は、１０～２０ｇ／Ｌのくえん酸一水和物と、１～５ｇ／ＬのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏと、０．５～１ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏと、０．１～０．５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏと、０．１～０．５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏと、０．１～０．５ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３と、１～５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏと、１～５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏと、を含む。
【0075】
シクロヘキサジエン－ｏ－ジオール系化合物を製造する方法
さらに別の態様において、本発明に係る、式（２）の化合物
を製造する方法は、
発現カセット又はベクターの発現に適した条件で本発明の宿主細胞を培養するステップ（１）と、
ステップ（１）における宿主細胞を含む培養液に、式（１）の化合物を基質として添加して反応させて、式（２）の化合物を含む発酵液を得るステップ（２）と、
ステップ（２）における発酵液から式（２）の化合物を回収するステップ（３）と、を含み、
式中、Ｒは、ハロゲン、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ１－６アルキル－ＣＮ、－Ｃ１－６アルキル－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ３－８シクロアルキル、－Ｃ３－８シクロアルケニル、－Ｃ６－１０アリールから選択され、ここで、上記Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ１－６アルキル－ＣＮ、－Ｃ１－６アルキル－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ３－８シクロアルキル、－Ｃ３－８シクロアルケニル、－Ｃ６－１０アリールは、１つ又は複数のハロゲンで任意選択的に置換され、
好ましくは、Ｒは、ハロゲン、メチル、－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＣＨ＝ＣＨＢｒ、－ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、シクロヘキシル、シクロヘキセニル及びフェニルから選択される。
さらに別の態様において、本発明に係る、式（２）の化合物
【化4】
発現カセット又はベクターの発現に適した条件で本発明の宿主細胞を培養するステップ（１）と、
ステップ（１）における宿主細胞を含む培養液に、式（１）の化合物を基質として添加して反応させて、式（２）の化合物を含む発酵液を得るステップ（２）と、
【化5】
式中、Ｒは、ハロゲン、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ１－６アルキル－ＣＮ、－Ｃ１－６アルキル－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ３－８シクロアルキル、－Ｃ３－８シクロアルケニル、－Ｃ６－１０アリールから選択され、ここで、上記Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ１－６アルキル－ＣＮ、－Ｃ１－６アルキル－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ３－８シクロアルキル、－Ｃ３－８シクロアルケニル、－Ｃ６－１０アリールは、１つ又は複数のハロゲンで任意選択的に置換され、
好ましくは、Ｒは、ハロゲン、メチル、－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＣＨ＝ＣＨＢｒ、－ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、シクロヘキシル、シクロヘキセニル及びフェニルから選択される。
【0076】
１つの具体的な実施形態において、Ｒは、メチルであり、式（１）の化合物は、トルエンであり、式（２）の化合物は、ｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－メチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオールである。１つの具体的な実施形態において、Ｒは、ヨウ素（Ｉ）であり、式（１）の化合物は、ヨードベンゼンであり、式（２）の化合物は、ｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－ヨード－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオールである。さらなる１つの具体的な実施形態において、Ｒは、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３であり、式（１）の化合物は、酢酸ベンジルであり、式（２）の化合物は、ｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオールである。
【0077】
１つの具体的な実施形態において、上記宿主細胞は、トルエンジオキシゲナーゼ発現ベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であり、上記トルエンジオキシゲナーゼ発現ベクターは、ｐＥＴ－２４ａ（＋）に由来し、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含む。
【0078】
１つの具体的な実施形態において、上記方法のステップ（１）は、
温度が約３０～３７℃で、ｐＨが約６．８～７．３で、溶存酸素≧２０％の条件で、本発明のベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、無機塩培地を使用して培養するステップ（１－１）と、
溶存酸素が急激に多くなる場合、６６％グルコース溶液を１２～１８ｍＬ／ｈｒ／Ｌの速度で添加して供給するステップ（１－２）と、
ＯＤ６００が約３０～５０である場合、温度を２０～３０℃に下げ、最終濃度が０．１～１ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して発現を誘導するステップ（１－３）と、を含む。
温度が約３０～３７℃で、ｐＨが約６．８～７．３で、溶存酸素≧２０％の条件で、本発明のベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、無機塩培地を使用して培養するステップ（１－１）と、
溶存酸素が急激に多くなる場合、６６％グルコース溶液を１２～１８ｍＬ／ｈｒ／Ｌの速度で添加して供給するステップ（１－２）と、
ＯＤ６００が約３０～５０である場合、温度を２０～３０℃に下げ、最終濃度が０．１～１ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して発現を誘導するステップ（１－３）と、を含む。
【0079】
一実施形態において、上記方法のステップ（２）は、ＩＰＴＧによる発現誘導の開始後、上記式（１）の化合物を発酵槽に流加して、６６％グルコースの供給速度を発酵の終了まで６～１２ｍＬ／ｈｒ／Ｌに低減するステップを含む。一実施形態において、ステップ（２）は、ＨＰＬＣで生成物の濃度を検出し、生成物の濃度が増加しなくなる時に反応を停止するステップをさらに含む。
【0080】
一実施形態において、上記方法のステップ（３）は、遠心分離して発酵液の上清を収集するステップ（３－１）と、発酵液の上清から生成物である式（２）の化合物を得るステップ（３－２）と、を含む。
【0081】
１つの具体的な実施形態において、上記ステップ（３）は、
発酵液のｐＨを７．５～９．０に調節し、かつ遠心分離して発酵液の上清を収集するステップ（３－１）と、
ステップ（３－１）における発酵液の上清にジクロロメタン又は酢酸エチルを添加して抽出して、水相と、生成物を含有する有機相とを得るステップ（３－２）であって、任意選択的に、水相にジクロロメタン又は酢酸エチルを添加して再度抽出し、有機相を合わせる、ステップ（３－２）と、
ステップ（３－２）における有機相を減圧濃縮し、適量の無水硫酸ナトリウムを添加し、濾過して、生成物の粗液を得るステップ（３－３）と、
ステップ（３－３）における生成物の粗液を引き続き濃縮し、石油エーテルを添加して、油状物が固体になるまで叩解するステップ（３－４）と、
ステップ（３－４）における固体にメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルを添加して叩解し、３０～５０℃で減圧乾燥して、生成物である式（２）の化合物を得るステップ（３－５）と、を含む。
発酵液のｐＨを７．５～９．０に調節し、かつ遠心分離して発酵液の上清を収集するステップ（３－１）と、
ステップ（３－１）における発酵液の上清にジクロロメタン又は酢酸エチルを添加して抽出して、水相と、生成物を含有する有機相とを得るステップ（３－２）であって、任意選択的に、水相にジクロロメタン又は酢酸エチルを添加して再度抽出し、有機相を合わせる、ステップ（３－２）と、
ステップ（３－２）における有機相を減圧濃縮し、適量の無水硫酸ナトリウムを添加し、濾過して、生成物の粗液を得るステップ（３－３）と、
ステップ（３－３）における生成物の粗液を引き続き濃縮し、石油エーテルを添加して、油状物が固体になるまで叩解するステップ（３－４）と、
ステップ（３－４）における固体にメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルを添加して叩解し、３０～５０℃で減圧乾燥して、生成物である式（２）の化合物を得るステップ（３－５）と、を含む。
【0082】
１つの具体的な実施形態において、上記式（１）の化合物は、酢酸ベンジルであり、上記式（２）の化合物は、ｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオールである。
【0083】
したがって、さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター及び宿主細胞の式（２）の化合物の製造における使用に関する。
【0084】
式（２）の化合物（特にｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオール及びｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－ヨード－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオール）は、反応中間体としてテトロドトキシンの製造に用いることができる（例えば、Ｂａｉｄｉｌｏｖ、Ｄ．ｅｔ ａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１８、５７、１０９９４－１０９９８を参照）。それに応じて、さらに別の態様において、本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター及び宿主細胞のテトロドトキシンの製造における使用に関する。
【0085】
有益な効果
本発明に係るポリヌクレオチドは、シュードモナス・プチダＦ１株のトルエンジオキシゲナーゼ（即ち、ＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡ）のコード配列を含む。本発明に係る発現カセット及びベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチド、発現カセット及びベクターは、大腸菌において上記トルエンジオキシゲナーゼを発現させるのに適する。
本発明に係るポリヌクレオチドは、シュードモナス・プチダＦ１株のトルエンジオキシゲナーゼ（即ち、ＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡ）のコード配列を含む。本発明に係る発現カセット及びベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチド、発現カセット及びベクターは、大腸菌において上記トルエンジオキシゲナーゼを発現させるのに適する。
【0086】
従来技術（例えば、Ｂａｉｄｉｌｏｖ、Ｄ．ｅｔａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１８、５７、１０９９４－１０９９８など）の発現系は、ｐＤＴＧ６０１ベクター及びＪＭ１０９株であり、ｐＤＴＧ６０１ベクターは、ｔａｃプロモーターを使用し、かつＴｏｄＣ１Ｃ２ＢＡをコードする配列とコード配列との間のスペーサー配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｆ１株のゲノムに直接由来する（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ０４９９６．１における第６２０～４２１０位のヌクレオチド、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される）。
【0087】
対照的に、本発明の発現カセット又はベクターは、強力なＴ７プロモーターを使用し、ＴｏｄＣ１Ｃ２ＢＡのコード配列において、大腸菌が好むコドンを使用し、かつコード配列間のスペーサー配列を、Ｔ７プロモーター及び／又は大腸菌リボソーム結合部位を含む配列に置き換える。本発明のポリヌクレオチドで構築されたベクター及び組換え株を利用して、大腸菌においてトルエンジオキシゲナーゼ系を効率的に発現させるという有益な効果を達成することができる。
【0088】
本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター及び組換え株は、シクロヘキサジエン－ｏ－ジオール系化合物（例えば、ｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオール）を製造するために用いることができ、かつ生成物の濃度は、２．１～７．８ｇ／Ｌ、例えば２．１、２．３及び７．８ｇ／Ｌであり、従来技術の１．７～２．１ｇ／Ｌより高い。本発明の発現系は、大規模かつ高効率な連続生産の能力を有し、キラルなｃｉｓ－ジヒドロジオール系化合物を前駆体とするテトロドトキシンなどの複雑な分子の大規模な人工全合成のために新しい方法を提供することにより、テトロドトキシンを監視規制基準に合致する候補薬物として臨床試験を行うことが可能となり、テトロドトキシンが人間の鎮痛及び解毒候補薬物となるためのｃ－ＧＭＰ原薬製造の基礎を築きます。
【0089】
実施例
材料
特に説明しない限り、本明細書で使用される機器、設備及び試薬材料は、いずれも市販のものである。
材料
特に説明しない限り、本明細書で使用される機器、設備及び試薬材料は、いずれも市販のものである。
【0090】
ＬＢ液体培地：１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ。
【0091】
ＴＢ液体培地：１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母エキス、４ｍＬ／Ｌのグリセリン、２．３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１６．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ。
【0092】
微量元素溶液：１４．４ｇ／Ｌのくえん酸一水和物、３．０ｇ／ＬのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．９ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、１．１ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ。
【0093】
無機塩培地：７．９ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、１３．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２．１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．７ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．１ｇ／Ｌのくえん酸三ナトリウム二水和物、２．５ｇ／Ｌの大豆ペプトン、７．５ｇ／Ｌのグルコース一水和物、０．５ｇ／Ｌの消泡剤、１０ｍＬ／Ｌの微量元素溶液。
【0094】
６６％グルコース溶液：６６０ｇ／Ｌのグルコース一水和物。
【実施例1】
【0095】
ジオキシゲナーゼ系ＴｏｄＣ１Ｃ２ＢＡ発現株の構築
シュードモナス・プチダＦ１株における、ＴｏｄＣ１Ｃ２ＢＡをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ０４９９６．１における第６２０－４２１０位のヌクレオチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）に基づいて、大腸菌系においてＴｏｄＣ１／ＴｏｄＣ２／ＴｏｄＢ／ＴｏｄＡタンパク質を発現させるのに適した、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるヌクレオチド配列を有する２つのポリヌクレオチドを設計する。
シュードモナス・プチダＦ１株における、ＴｏｄＣ１Ｃ２ＢＡをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ０４９９６．１における第６２０－４２１０位のヌクレオチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）に基づいて、大腸菌系においてＴｏｄＣ１／ＴｏｄＣ２／ＴｏｄＢ／ＴｏｄＡタンパク質を発現させるのに適した、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるヌクレオチド配列を有する２つのポリヌクレオチドを設計する。
【0096】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のヌクレオチド配列と比較して、本発明のポリヌクレオチドは、以下の特徴を有する。
【0097】
（１）ＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡのコード配列は、大腸菌が好むコドンを使用する。
【0098】
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２におけるＴｏｄＣ１終止コドンＴＧＡとＴｏｄＣ２開始コドンＡＴＧとの間の１１０個のヌクレオチド配列（第１のスペーサー配列、Ｓ１）をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列に置き換える。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、５′末端から３′末端に、Ｔ７プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）と、Ｌａｃオペレータ（ＬａｃＯ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と、原核生物リボソーム結合部位（ｒｂｓ）配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と、を含む。
【0099】
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２におけるＴｏｄＣ２終止コドンＴＡＧとＴｏｄＢ開始コドンＡＴＧとの間の配列（第２のスペーサー配列、Ｓ２）ＧＴＧＡＴＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第２０２８～２０３５位のヌクレオチド）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の対応する位置で、変化せず、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の対応する位置で、ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における第２０２８～２０４１位のヌクレオチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に対応）に置き換えられる。
【0100】
（４）ＴｏｄＢ終止コドンＴＡＡ及びＴｏｄＡ開始コドンＡＴＧは、コドン入れ子配列ＴＡＡＴＧであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２と一致する。
【0101】
トルエンジオキシゲナーゼコード配列を含むポリヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の５′末端と３′末端に、それぞれｃａｔヌクレオチド配列と制限酵素ＢａｍＨＩ酵素切断部位ｇｇａｔｃｃを付加し、合成のために蘇州金唯智生物科技有限公司に依頼し、かつそれらをベクターｐＥＴ－２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ酵素切断部位にクローニングして、それぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１及びｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２（図１Ａ及び１Ｂ）を得る。発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換して、トルエンジオキシゲナーゼＴｏｄＣ１Ｃ２ＢＡを発現させる組換え株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１）及びＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２）を得る。
【0102】
それとともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の配列に示されるポリヌクレオチドを設計する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３におけるＴｏｄＣ１、ＴｏｄＣ２、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡのコード配列は、大腸菌が好むコドンを使用し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における対応する配列と同じであるが、２つのスペーサー配列であるＳ１及びＳ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２における対応する配列と一致する。上述したように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に基づいて、発現プラスミドｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１２とｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１３をそれぞれ構築する。ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１２及びｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１３をＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換することにより、組換え株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１２）及びＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１３）を製造する。
【0103】
図１Ｃは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、１３、１及び２に示される４つの配列におけるコード配列とスペーサー配列との間の設計の違いを詳細に示す。
【実施例2】
【0104】
トルエンジオキシゲナーゼＴｏｄＣ１Ｃ２ＢＡ発現株のタンパク質レベルの検出
組換え株のシングルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植菌し、３７℃で１６ｈｒ生育させて種液を得る。ＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に種液を１％の割合で接種し、ＯＤ６００＝０．５～１．０まで３７℃でシェーカーで培養し、シェーカーの温度を２５℃に下げ、最終濃度が０．１ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して発現を誘導し、シェーカーで２４ｈｒ引き続き培養する。４℃で、発酵液を８０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離して菌体を収集する。菌体を結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ＭのＮａＣｌ）で１回洗浄した後、結合緩衝液に再懸濁し（全細胞（Ｔ）サンプルとして少量の菌液を保存する）、菌懸濁液を氷水浴中で超音波で破砕する。４℃で、破砕後の菌液を１２０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、それぞれ溶解液の上清（Ｓ）及び沈殿（Ｐ）を収集してタンパク質サンプルの製造に用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲル電気泳動分析を行う。
組換え株のシングルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植菌し、３７℃で１６ｈｒ生育させて種液を得る。ＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に種液を１％の割合で接種し、ＯＤ６００＝０．５～１．０まで３７℃でシェーカーで培養し、シェーカーの温度を２５℃に下げ、最終濃度が０．１ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して発現を誘導し、シェーカーで２４ｈｒ引き続き培養する。４℃で、発酵液を８０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離して菌体を収集する。菌体を結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ＭのＮａＣｌ）で１回洗浄した後、結合緩衝液に再懸濁し（全細胞（Ｔ）サンプルとして少量の菌液を保存する）、菌懸濁液を氷水浴中で超音波で破砕する。４℃で、破砕後の菌液を１２０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、それぞれ溶解液の上清（Ｓ）及び沈殿（Ｐ）を収集してタンパク質サンプルの製造に用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲル電気泳動分析を行う。
【0105】
図２に示すように、空ベクター株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ）において、標的タンパク質の発現が示されない。
【0106】
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１２）株において、ＴｏｄＣ１のみが明らかなタンパク質発現を有し、図２におけるサンプル１２Ｔ、１２Ｓ及び１２Ｐを比較すると、発現されたＴｏｄＣ１タンパク質の大部分が不溶性形態で封入体沈殿内に存在することが分かる。ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１３）株においても、ＴｏｄＣ１のみが明らかなタンパク質発現を有し、図２におけるサンプル１３Ｔ、１３Ｓ及び１３Ｐを比較すると、発現されたＴｏｄＣ１タンパク質について一部のみが可溶性であることが分かる。以上より、標的タンパク質のコドン最適化は、タンパク質の発現及び溶解度にとって非常に重要である。
【0107】
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１）株及びＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２）株において、ＴｏｄＣ１及びＴｏｄＣ２タンパク質は、明らかな可溶性発現を有し、２つの株間でタンパク質発現レベルに明らかな違いがない。ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１３）と比較して、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１）及びＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２）におけるＴｏｄＣ２タンパク質の可溶性発現が顕著に増加し、第１のスペーサー配列の設計が下流タンパク質（少なくともＴｏｄＣ２）の発現に対して非常に重要であることを示す。
【0108】
また、ＴｏｄＢ及びＴｏｄＡタンパク質が４つの株において明らかな発現バンドがなく、それらのコード配列が発現カセットの比較的に下流の位置に位置することに関連する可能性がある。
【実施例3】
【0109】
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１）株のｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオール（ＣＡＳ：１３１０４３－５１－１）の製造における使用
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１）株のシングルコロニーを採取し、ＴＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植菌し、３７℃で１６ｈｒ生育させて種液を得る。２５Ｌの無機塩培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）を予め充填した発酵槽に種液を１％の割合で接種し、３７℃で培養し、アンモニア水でｐＨを７．０に制御し、タンク圧力、回転数及び通気量を調節することにより、溶存酸素≧２０％になるように制御する。約第４～５ｈｒで、溶存酸素が急激に多くなり（初期炭素源が枯渇したことを意味）、６６％グルコース溶液の供給を開始し、供給速度を１５ｍＬ／ｈｒ／Ｌに設定する。約第８～９ｈｒで、ＯＤ６００が約４０である場合、温度を２５℃に下げ、最終濃度が０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導する。約第１９～２２ｈｒで、９０ｇの基質としての酢酸ベンジルを発酵槽内に３時間以内に等速で流加し、６６％グルコースの供給速度を発酵の終了まで１２ｍＬ／ｈｒ／Ｌに低減する。ＨＰＬＣで検出された生成物が増加しなくなる場合、変換を停止し、生成物の濃度が約２．１ｇ／Ｌであった。変換過程におけるＨＰＬＣ検出スペクトルを図３に示す。
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１）株のシングルコロニーを採取し、ＴＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植菌し、３７℃で１６ｈｒ生育させて種液を得る。２５Ｌの無機塩培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）を予め充填した発酵槽に種液を１％の割合で接種し、３７℃で培養し、アンモニア水でｐＨを７．０に制御し、タンク圧力、回転数及び通気量を調節することにより、溶存酸素≧２０％になるように制御する。約第４～５ｈｒで、溶存酸素が急激に多くなり（初期炭素源が枯渇したことを意味）、６６％グルコース溶液の供給を開始し、供給速度を１５ｍＬ／ｈｒ／Ｌに設定する。約第８～９ｈｒで、ＯＤ６００が約４０である場合、温度を２５℃に下げ、最終濃度が０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導する。約第１９～２２ｈｒで、９０ｇの基質としての酢酸ベンジルを発酵槽内に３時間以内に等速で流加し、６６％グルコースの供給速度を発酵の終了まで１２ｍＬ／ｈｒ／Ｌに低減する。ＨＰＬＣで検出された生成物が増加しなくなる場合、変換を停止し、生成物の濃度が約２．１ｇ／Ｌであった。変換過程におけるＨＰＬＣ検出スペクトルを図３に示す。
【0110】
ＨＰＬＣ分析方法において、機器がアジレント・テクノロジー社の液体クロマトグラフィー１２６０システム、クロマトグラフィーカラムがＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８ ５μｍ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、移動相が（Ａ：メタノール、Ｂ：水）、流速が１ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長が２７０ｎｍ、カラム温度が３０℃、サンプル注入体積が１０μＬ、動作時間が３５ｍｉｎである。ＨＰＬＣグラジエント条件は、以下のとおりである。
【表1】
【0111】
サンプルの製造において、発酵液を１２０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を採取し、メタノールで５～１０倍希釈し、均一に混合した後、１２０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を液相に入れる。
【0112】
発酵及び変換が終了した後、発酵液のｐＨを５ＮのＮａＯＨで８．０に調節する。８０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して、発酵液の上清を約３０Ｌ収集する。発酵液の上清内に６０Ｌのジクロロメタンを添加し、撹拌し、静置し分層した後に有機相を収集する。上層の水相に６０Ｌのジクロロメタンを添加して１回再度抽出し、有機相を合わせる。有機相を４０℃で１Ｌに減圧濃縮し、適量の無水硫酸ナトリウムを添加し、濾過して、褐色の透明液体を得る。透明液体を引き続き濃縮し、石油エーテルを添加して、油状物が固体になるまで叩解し、上清を廃棄する。固体をさらにメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで叩解し、３０℃で減圧乾燥して、４５．３ｇの灰白色の固体生成物を得た。生成物のｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオール（ＣＡＳ：１３１０４３－５１－１）のＮＭＲスペクトル（Ｂｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚ）を図４に示す。
【実施例4】
【0113】
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２）株のｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオール（ＣＡＳ：１３１０４３－５１－１）の製造における使用
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２）株のシングルコロニーを採取し、ＴＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植菌し、３７℃で１６ｈｒ生育させて種液を得る。２５Ｌの無機塩培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）を予め充填した発酵槽に種液を１％の割合で接種し、３７℃で培養し、アンモニア水でｐＨを約７．０に制御し、タンク圧力、回転数及び通気量を調節することにより、溶存酸素≧２０％になるように制御する。約第４～５ｈｒで、溶存酸素が急激に多くなり（初期炭素源が枯渇したことを意味）、６６％グルコース溶液の供給を開始し、供給速度を１５ｍＬ／ｈｒ／Ｌに設定する。約第８～９ｈｒで、ＯＤ６００が約４０である場合、温度を２５℃に下げ、最終濃度が０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導する。約第１９～２２ｈｒで、９０ｇの基質としての酢酸ベンジルを発酵槽内に３時間以内に等速で流加し、６６％グルコースの供給速度を発酵の終了まで１２ｍＬ／ｈｒ／Ｌに低減する。ＨＰＬＣで検出された生成物が増加しなくなる場合、変換を停止し、生成物の濃度が約２．３ｇ／Ｌであった。
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２）株のシングルコロニーを採取し、ＴＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植菌し、３７℃で１６ｈｒ生育させて種液を得る。２５Ｌの無機塩培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）を予め充填した発酵槽に種液を１％の割合で接種し、３７℃で培養し、アンモニア水でｐＨを約７．０に制御し、タンク圧力、回転数及び通気量を調節することにより、溶存酸素≧２０％になるように制御する。約第４～５ｈｒで、溶存酸素が急激に多くなり（初期炭素源が枯渇したことを意味）、６６％グルコース溶液の供給を開始し、供給速度を１５ｍＬ／ｈｒ／Ｌに設定する。約第８～９ｈｒで、ＯＤ６００が約４０である場合、温度を２５℃に下げ、最終濃度が０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導する。約第１９～２２ｈｒで、９０ｇの基質としての酢酸ベンジルを発酵槽内に３時間以内に等速で流加し、６６％グルコースの供給速度を発酵の終了まで１２ｍＬ／ｈｒ／Ｌに低減する。ＨＰＬＣで検出された生成物が増加しなくなる場合、変換を停止し、生成物の濃度が約２．３ｇ／Ｌであった。
【0114】
発酵及び変換が終了した後、発酵液のｐＨを５ＮのＮａＯＨで８．０に調節する。８０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して、発酵液の上清を約３０Ｌ収集する。発酵液の上清内に３０Ｌの酢酸エチルを添加し、撹拌し、静置し分層した後に有機相を収集する。上層の水相に３０Ｌの酢酸エチルを添加して１回再度抽出し、有機相を合わせる。有機相を４０℃で１Ｌに減圧濃縮し、適量の無水硫酸ナトリウムを添加し、吸引濾過して、褐色の透明液体を得る。透明液体を引き続き濃縮し、石油エーテルを添加して、油状物が固体になるまで叩解し、上清を廃棄する。固体をさらにメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで叩解し、３０℃で減圧乾燥して、約５０ｇの灰白色の固体生成物を得た。
【実施例5】
【0115】
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１２）株及びＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１３）株のｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオール（ＣＡＳ：１３１０４３－５１－１）の生体内変換における使用
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１２）株のシングルコロニーを採取し、ＴＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植菌し、３７℃で１６ｈｒ生育させて種液を得る。２５Ｌの無機塩培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）を予め充填した発酵槽に種液を１％の割合で接種し、３７℃で培養し、アンモニア水でｐＨを約７．０に制御し、タンク圧力、回転数及び通気量を調節することにより、溶存酸素≧２０％になるように制御する。約第４～５ｈｒで、溶存酸素が急激に多くなり（初期炭素源が枯渇したことを意味）、６６％グルコース溶液の供給を開始し、供給速度を１５ｍＬ／ｈｒ／Ｌに設定する。約第８～９ｈｒで、ＯＤ６００が約４０である場合、温度を２５℃に下げ、最終濃度が０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導する。約第１９～２２ｈｒで、９０ｇの基質としての酢酸ベンジルを発酵槽内に３時間以内に等速で流加し、６６％グルコースの供給速度を発酵の終了まで１２ｍＬ／ｈｒ／Ｌに低減する。ＨＰＬＣで検出された生成物の濃度が約０．７ｇ／Ｌであり、大量の基質が残留した。
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１２）株のシングルコロニーを採取し、ＴＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植菌し、３７℃で１６ｈｒ生育させて種液を得る。２５Ｌの無機塩培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）を予め充填した発酵槽に種液を１％の割合で接種し、３７℃で培養し、アンモニア水でｐＨを約７．０に制御し、タンク圧力、回転数及び通気量を調節することにより、溶存酸素≧２０％になるように制御する。約第４～５ｈｒで、溶存酸素が急激に多くなり（初期炭素源が枯渇したことを意味）、６６％グルコース溶液の供給を開始し、供給速度を１５ｍＬ／ｈｒ／Ｌに設定する。約第８～９ｈｒで、ＯＤ６００が約４０である場合、温度を２５℃に下げ、最終濃度が０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導する。約第１９～２２ｈｒで、９０ｇの基質としての酢酸ベンジルを発酵槽内に３時間以内に等速で流加し、６６％グルコースの供給速度を発酵の終了まで１２ｍＬ／ｈｒ／Ｌに低減する。ＨＰＬＣで検出された生成物の濃度が約０．７ｇ／Ｌであり、大量の基質が残留した。
【0116】
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ１３）株を上記ステップに従って生体内変換し、ＨＰＬＣで検出された生成物の濃度が約０．９ｇ／Ｌであり、大量の基質が残留した。
【実施例6】
【0117】
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２）株のｃｉｓ－（１Ｓ，２Ｒ）－３－アセトキシメチル－３，５－シクロヘキサジエン－１，２－ジオール（ＣＡＳ：１３１０４３－５１－１）の１００グラムスケールの製造における使用
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２）株のシングルコロニーを採取し、ＴＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植菌し、３７℃で１６ｈｒ生育させて種液を得る。５０Ｌの無機塩培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）を予め充填した発酵槽に種液を１％の割合で接種し、３７℃で培養し、アンモニア水でｐＨを約７．０に制御し、タンク圧力、回転数及び通気量を調節することにより、溶存酸素≧２０％になるように制御する。約第４～５ｈｒで、溶存酸素が急激に多くなり（初期炭素源が枯渇したことを意味）、６６％グルコース溶液の供給を開始し、供給速度を１５ｍＬ／ｈｒ／Ｌに設定する。約第８～９ｈｒで、ＯＤ６００が約４０である場合、温度を２５℃に下げ、最終濃度が０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導する。第１５～２２ｈｒで、７００ｇの基質としての酢酸ベンジルを発酵槽内に７時間以内に等速で流加し、６６％グルコースの供給速度を発酵の終了まで１２ｍＬ／ｈｒ／Ｌに低減する。ＨＰＬＣで検出された生成物が増加しなくなる場合、変換を停止し、生成物の濃度が約７．８ｇ／Ｌであった。
ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－２４ａ－ＳＥＱ２）株のシングルコロニーを採取し、ＴＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植菌し、３７℃で１６ｈｒ生育させて種液を得る。５０Ｌの無機塩培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）を予め充填した発酵槽に種液を１％の割合で接種し、３７℃で培養し、アンモニア水でｐＨを約７．０に制御し、タンク圧力、回転数及び通気量を調節することにより、溶存酸素≧２０％になるように制御する。約第４～５ｈｒで、溶存酸素が急激に多くなり（初期炭素源が枯渇したことを意味）、６６％グルコース溶液の供給を開始し、供給速度を１５ｍＬ／ｈｒ／Ｌに設定する。約第８～９ｈｒで、ＯＤ６００が約４０である場合、温度を２５℃に下げ、最終濃度が０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導する。第１５～２２ｈｒで、７００ｇの基質としての酢酸ベンジルを発酵槽内に７時間以内に等速で流加し、６６％グルコースの供給速度を発酵の終了まで１２ｍＬ／ｈｒ／Ｌに低減する。ＨＰＬＣで検出された生成物が増加しなくなる場合、変換を停止し、生成物の濃度が約７．８ｇ／Ｌであった。
【0118】
発酵及び変換が終了した後、発酵液のｐＨを５ＮのＮａＯＨで８．０に調節する。連続流管型遠心分離機で遠心分離して、発酵液の上清を約６０Ｌ収集する。発酵液の上清内に６０Ｌの酢酸エチルを添加し、撹拌し、静置し分層した後に有機相を収集する。上層の水相に６０Ｌの酢酸エチルを添加して１回再度抽出し、有機相を合わせる。有機相を４０℃で１０Ｌに減圧濃縮し、適量の無水硫酸ナトリウムを添加し、吸引濾過して、褐色の透明液体を得る。透明液体を引き続き濃縮し、石油エーテルを添加して、油状物が固体になるまで叩解し、上清を廃棄する。固体をさらにメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルで叩解し、３０℃で減圧乾燥して、約３５１ｇの灰白色の固体生成物を得た。
【0119】
本発明では好ましい実施例を前述のとおり開示したが、本発明を限定するためのものではなく、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変形及び修飾を行うことができるため、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で限定された内容を基準とする。
配列表
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチド
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチド
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ 第１のスペーサー配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＴｏｄＣ１
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ＴｏｄＣ２
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ ＴｏｄＢ
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ ＴｏｄＡ
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ Ｔ７プロモーター
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ 原核生物リボソーム結合部位
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ Ｌａｃオペレータ
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ Ｔ７転写ターミネーター
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ Ｊ０４９９６．１における第６２０～４２１０位のヌクレオチド
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチド
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配列表
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチド
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチド
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ 第１のスペーサー配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＴｏｄＣ１
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ＴｏｄＣ２
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ ＴｏｄＢ
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ ＴｏｄＡ
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ Ｔ７プロモーター
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ 原核生物リボソーム結合部位
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ Ｌａｃオペレータ
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ Ｔ７転写ターミネーター
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ Ｊ０４９９６．１における第６２０～４２１０位のヌクレオチド
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ トルエンジオキシゲナーゼのコード配列を含むポリヌクレオチド
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】