特表 2024-502211 無細胞ＤＮＡ上の子宮内膜症のエピジェネティックな特徴を有する患者における子宮内膜症の治療におけるデオキシリボヌクレアーゼＩの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-17

(54)【発明の名称】無細胞ＤＮＡ上の子宮内膜症のエピジェネティックな特徴を有する患者における子宮内膜症の治療におけるデオキシリボヌクレアーゼＩの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20240110BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20240110BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20240110BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N9/22 ZNA

A61K38/46

A61P15/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023564262

(86)(22)【出願日】2022-01-05

(85)【翻訳文提出日】2023-09-04

(86)【国際出願番号】 EP2022050171

(87)【国際公開番号】W WO2022148792

(87)【国際公開日】2022-07-14

(31)【優先権主張番号】21305014.9

(32)【優先日】2021-01-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523255996

【氏名又は名称】エンドライフ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】アンドレ アズー

(72)【発明者】

【氏名】モンセフ バン カリファ

【テーマコード（参考）】

4C084

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084CA53

4C084DC22

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA81

(57)【要約】

本発明は、DNaseIを投与して子宮内膜症を治療する方法に関し、特に、無細胞DNAレベルが正常値を超えている患者を治療する方法に関し、この無細胞DNAが子宮内膜症に典型的なメチル化プロファイルを有する場合はなおさらである。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

子宮内膜症の治療における使用のためのDNase。

【請求項2】

前記DNaseが組換えDNaseである、請求項1に記載の使用のための、請求項1に記載のDNase。

【請求項3】

前記DNaseがDNaseIである、請求項1に記載の使用のための、請求項1または2に記載のDNase。

【請求項4】

子宮内膜症を有していない女性における遊離DNAのレベルより統計的に大きい無細胞DNAのレベルを有する患者における、子宮内膜症の治療における使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のDNase。

【請求項5】

前記患者の無細胞DNAが、
（ｉ）遺伝子CALD1、RRP1、FN1、FAM87B、TCEAL6、RPL29P2、ATP11A-AS1、DIP2C、SLCO2B1およびRMI2によって形成される群から選択される1つ以上の遺伝子が高メチル化されている、及び／又は
（ｉｉ）遺伝子FBX038、ACVR2A、USP1、TDRD5およびSTAU2-AS1によって形成される群から選択される1以上の遺伝子が低メチル化されている
メチル化プロファイルを有することを特徴とする、請求項４に記載の使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のDNase。

【請求項6】

前記DNaseが筋肉内に投与されることを特徴とする、請求項１、４および５のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のDNase。

【請求項7】

前記DNaseが少なくとも2500UIの用量で2日ごとに、少なくとも2週間投与されることを特徴とする、請求項１、および４～６のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のDNase。

【請求項8】

前記DNaseが2500UIの1日用量で投与されることを特徴とする、請求項７に記載の使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のDNase。

【請求項9】

前記DNaseが毎日または2日ごとに2500UIの用量で１～３ヶ月間投与されることを特徴とする、請求項７又は８に記載の使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のDNase。

【請求項10】

I期またはII期の子宮内膜症に罹患している患者を治療するための、請求項１、および４～９のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のDNase。

【請求項11】

外科手術と関連する、ステージIIIまたはIVの子宮内膜症に罹患している患者を治療するための、請求項１、および４～９のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のDNase。

【請求項12】

請求項７～９のいずれか一項に記載の第１の積極的治療の後、前記患者が、ホルモン療法および／または前記積極的治療期間よりも低い用量または頻度でのDNaseの投与から選択される維持治療を受けることを特徴とする、請求項１、および４～１１のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のDNase。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、子宮内膜症の治療の分野に関する。

【0002】

より詳細には、本発明は、慢性子宮内膜症疼痛に罹患し、特定の高メチル化および低メチル化遺伝子プロファイルを有する患者において、過剰の遊離デオキシリボ核酸(無細胞DNA)を加水分解する、デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)による治療を提示する。

【背景技術】

【0003】

子宮内膜症

【0004】

子宮内膜症は、子宮内膜の細胞が子宮腔外、主に骨盤内臓器および組織に移動することによる、エストロゲン依存性の慢性炎症性疾患である。骨盤痛に関連し、時には不妊状態を伴うこの炎症状態は、出産年齢の若い女性の3～10％を苦しませている。

【0005】

この疾患は、表在性腹膜および漿液性病変から卵巣の子宮内膜症嚢胞(子宮内膜)および深部子宮内膜の結節に至るまで不均一であり、しばしば線維症および癒着を伴うことがある。子宮内膜症は、痛みに苦しんでいる思春期前の少女に起こり(Marsh and Laufer 2005)、その後思春期から閉経期にかけて月経周期性と痛みが消失する。

【0006】

異所性子宮内膜細胞の増殖はエストロゲンに依存していることが知られている。子宮内膜症は、子宮内膜から隣接する臓器、さらには腹部、肺、肝臓、脳への細胞の移動を伴う月経血の逆流として広く説明されている。

【0007】

ごくまれに、子宮内膜症は男性の泌尿生殖器にも見られる(Rei et Feloney、2018)。肝臓子宮内膜症の２２の例も、発表されている(Liu et al., 2015)。これは逆行性月経流出の支配的な理論に反する議論である。子宮内膜症を発症する女性はわずか10％であるのに対し、月経逆流は生殖年齢の女性の76％から90％で起こる(Blumenkrantz et al., 1981; Halme et al., 1984)。

【0008】

上述のように、子宮内膜症は異所性子宮内膜細胞の存在を特徴とする疾患である。表在性形態では、重篤度が低く、これらの細胞は移動して腹膜に固定される。より重篤な形態では、細胞は様々な器官：卵巣、膀胱または腸壁に到達する。この異所性は重度の炎症に関連している。それは、特に期間中に痛みを引き起こし、時には不妊を引き起こす。その後、結節を除去するために手術が必要になることが多い。

【0009】

深刻な形態の病気に苦しんでいる女性は、腹膜に大きな酸化ストレスを有している。このドレスは、循環血液中の遊離DNA断片の大幅な増加を伴う (Zachariah et al 2004)。

【0010】

この段階では、子宮内膜症がストレスの原因であるかどうか、またはその逆であるかどうかを述べることは困難である。しかし、インビトロで行われた実験は、この酸化ストレスを阻害することにより、子宮内膜細胞の増殖が阻止されることを示している (Filev et al 2019)。

【0011】

子宮内膜症に罹患している女性の40％～90％が痛みに苦しんでいる。主な症状は再発性の骨盤痛で、特に生理中の痛みが強いことがある。病変はエストロゲンに感受性があるため、月経周期ごとに増殖し、出血し、繊維状の瘢痕を残す。生理期間以外でも、患者は性交渉時（性交困難症）や排尿・排便時に痛むことがある（McPeak et al.,2018）

【0012】

まれに、まったく無症状の場合もある。この場合、患者が不妊症について相談したときに偶然発見される。この関連性の科学的説明は完全には解明されていない。最近の研究では、これらの患者は子宮内膜にホルモンプロファイルを有し、異常遺伝子が発現していることが示されている（Naqvi et al 2014; Lagana et al 2019; Vassilopoulou et al 2019）。

【0013】

しかしながら、臨床医は女性の90％が逆行性出血を起こしていると推定しているのに対し、腹腔鏡検査で確認される子宮内膜症病変を発症するのはわずか10％である。

【0014】

子宮内膜症は身体的影響だけでなく心理的影響を及ぼし、うつ病や不安を引き起こし、社会的関係を危うくする。さらに、子宮内膜症は性生活や社会的関係に悪影響を及ぼす(Della Corte et al 2020)。

【0015】

子宮内膜症の診断

【0016】

子宮内膜症の診断は腹腔鏡検査中に行われ、抽出された病変の分析によって確認される。治療は、軽度から中等度の形態(改訂されたAFSスコアまたはASRMスコアに準拠したステージIおよびII)に対しては医学的であることが多く、重篤な形態(改訂されたAFSスコアまたはASRMスコアに準拠したステージIIIおよびIV ― American Society of Reproductive Medicine)に対しては、即時又はホルモン療法の後の外科的治療であることが多い。

【0017】

2018年にフランス高等衛生局とフランス国立産婦人科学会（CNGOF）が発表した「子宮内膜症診療に関する勧告（RPC endometriosis）」に基づく別の分類によると、子宮内膜症には3つのタイプがある：
― 表在性（または腹膜）子宮内膜症：腹膜の表面に異所性子宮内膜が着床しているもの、
― 卵巣子宮内膜症：卵巣子宮内膜症は、チョコレート色の液体で特徴づけられる卵巣嚢腫である。
― 深在性骨盤内（または腹膜下）子宮内膜症は、腹膜表面下5mm以上の深さに浸潤する病変に相当する。深在性子宮内膜症は、典型的には子宮仙骨靭帯（症例の50％）、膣後索（15％）、主に直腸前面と直腸S状結腸接合部に代表される腸（20～25％）、膀胱（10％）、尿管（3％）、そして骨盤腔以外ではS状結腸、上行結腸、虫垂、回腸末端を最も頻繁に浸潤する。

【0018】

子宮内膜症は、ホルモンまたは免疫疾患、および環境要因への曝露によって引き起こされる遺伝性疾患として代替的に説明されている。さらに、いくつかの研究は、子宮内膜症の病因におけるさまざまなエピジェネティックな異常を示唆している (Koninck et al., 2019)。

【0019】

病気の表現型の不均一性は、症状を有する女性における多数の偽陰性の腹腔鏡検査によって証明されている。したがって、病変の解剖学的、免疫組織化学的およびエピジェネティックな検査は、特にプロゲステロンのB受容体、e-カドヘリン、ホメオボックスA10(HOXA10)、エストロゲン受容体ベータ、ステロイド原性因子１（SF1）およびアロマターゼのゲノムDNAのメチル化に関して信頼できることが証明されていない(Ahn et al., 2017)。

【0020】

遺伝子プロモーターのCpGアイランド(シトシンリン酸グアニン)のシトシン塩基の5位にメチル基を付加して、対応する遺伝子発現を無症候性にさせる、DNAメチルトランスフェラーゼの異常な発現が子宮内膜症で実証されている (Nasu et al., 2011)。

【0021】

子宮内膜症の治療
患者が疼痛性である場合、通常、第一選択治療として、生理を抑制することを目的としたホルモン治療（持続性単相黄体ホルモンまたは黄体ホルモン避妊薬、ダナゾールまたはGnRHアナログ製剤）が行われる。この治療法は、抗腺刺激作用によって痛みを軽減する。さらに、これらの治療法は、性器が活発な時期には、子育て計画の達成を妨げる。

【0022】

無細胞DNA
ヒトの血液中には、細胞なしで循環する遊離DNA(cfDNA)の存在が1948年に報告された (Mandel and Metais in 1948)。cfDNAは、幅広い生理学的および病理学的状態、特に炎症性疾患、酸化ストレス、カップルの不妊症(EP2879696 B1)、および悪性腫瘍で研究されている。

【0023】

健康な個体では、食作用の間に、アポトーシスまたは壊死体がマクロファージによって摂取される。したがって、遊離DNAの放出現象は起こり得ない。一方、マクロファージによって放出されるヌクレオソームにDNAの断片が残っている場合、それらは酵素分解から保護され、血液循環中に残存する。

【0024】

cfDNAは、ゲノムDNAよりも分子量の低い二本鎖核酸で構成されている。これらのゲノム断片のサイズは可変であり、最短で70～200 bp、最長で最大21 kbの範囲である。cfDNAは、50 et 250 ng/ml(EP2879696 B1)の間で評価された血中濃度で、健康な被験者に存在する。

【0025】

血中への遊離DNAの放出の生物学的メカニズムは完全には知られていない。遊離DNAの断片は、マクロファージによって飲み込まれた壊死細胞に由来する可能性があり、その後、部分的に放出される。この仮説によれば、cfDNAのレベルは細胞壊死および/またはアポトーシスの程度と相関しているはずである(Grabushnig et al 2020)。

【0026】

血液循環からのcfDNAのクリアランスは急速である (半減期：16.3分)；cfDNAは血漿ヌクレアーゼに感受性であるが、腎臓および肝臓のクリアランスもその排除に関与している。

【0027】

cfDNAは血漿および血清から単離することができるが、血清は約6倍の濃度のDNAを含む(細胞内への取り込み)。

【0028】

DNAのレベルおよび断片化スキームは、診断、予後、および治療の目的に興味深い可能性を提供する。

【0029】

Zachariah(2009)による研究では、参照群(p = 0.046)よりも、最小から軽度の子宮内膜症に罹患している女性のグループで有意に高い核およびミトコンドリアcfDNAが示された。ROC曲線からの閾値は、70%の感度と87%の特異度を示した。著者らは、循環cfDNAが最小および軽度の子宮内膜症の潜在的なバイオマーカーを構成する可能性があると結論付けた。

【0030】

エンドヌクレアーゼI(DNaseI)
DNaseIは、細胞外DNAの消化に関与する酵素である。

【0031】

DNaseIは、デオキシリボ核酸をヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに触媒する。

【0032】

DNaseIは、ホスホジエステル結合を加水分解し、好ましくはピラミッド状の土台にニックを作る。マンガンイオンの存在下では、平滑末端で2本のストランドを切断する。マグネシウムイオンでは、ストランドを小さな断片に切断する。

【0033】

DNAを加水分解するDNaseIの能力は、例えば細胞ゲノム上に固定されたタンパク質のプリントを検出するために、生化学において頻繁に利用される。医学では、DNaseIのヒト組換え型は、Pulmozyme（登録商標）という名前で、嚢胞性線維症の継続的な毎日の治療に使用される最も強力な粘液溶解薬である。

【0034】

原因を特定せずに(特に子宮内膜症の診断なしに)不妊症の女性にDNaseIを使用することに関して、特許EP2879696 B1に示されているデータは、DNaseIの2500 UIの注射が短期間で循環遊離DNAのレベルを40%減少させたことを示している。

【0035】

現時点では、中等度から重度の子宮内膜症の痛みと炎症に対するDNaseIの有効性を示す研究は存在しない。

【発明の概要】

【0036】

本発明は、子宮内膜症を治療するためのDnaseの使用に関する。

【0037】

特に、本発明は、高レベルの遊離DNA、候補遺伝子のプロファイル、およびメチル化の差異がすべて誘発的である子宮内膜症に罹患している患者において、外因性DNaseIを使用して炎症と痛みを軽減し、妊娠の可能性を維持、あるいは妊娠に有利にすることを目的とする。

【発明を実施するための形態】

【0038】

以前の研究で、本発明者らは、子宮内膜症の診断における無細胞DNAのレベル、ならびに子宮内膜症のエピジェネティックなプロファイルの関連性を示した(特許出願 PCT/EP2020/069015、本出願の出願前には公開されていない)。

【0039】

これは本発明者らが、(i）CALD1、RRP1、FN1、FAM87B、TCEAL6、RPL29P2、ATP11A-AS1、DIP2C、SLCO2B1、RMI2、MIR3170、LINC01007、TSPAN17、MIR4693、HYOU1、TLR4、ADGRL3、IL6、VIRMA、MKRN1、INSIG1、ROR2、MRPL3、FMNL2、TMEM19、ZNF438、LINC01192、RCBTB1、TSPAN33、NKD2、FGFR2、TPRG1、MIR4644、FOXO4、FSTL1およびCLMNから選択される遺伝子の高メチル化、および／または（ii）STAU2-AS1、TDRD5、USP1、ACVR2A、FBXO38、NT5C2、NAV1、SOD3、C3、UBE3A、MIR4655、MYO5C、COX6C、MIR6133、BRSK2、MIR4277、MIR4251、MN1、MIR3666、AZIN1、MIR4251、SLC37A2、FZD10、FASN、MKRN9PおよびPCCA-AS1から選択される遺伝子の低メチル化は、子宮内膜症のマーカーを構成し、その発症の可能性は、測定された高メチル化または低メチル化が大きいほど高くなる：
ということを示したためである。

【0040】

より詳細には、本発明者らは、子宮内膜症に高度に関与する15の遺伝子のリストを同定した。
― (10および5)、すなわち：CALD1、RRP1、FN1、FAM87B、TCEAL6、RPL29P2、ATP11A-AS1、DIP2C、SLCO2B1およびRMI2、子宮内膜症に罹患している女性の無細胞DNAにおける高メチル化、および
― FBX038、ACVR2A、USP1、TDRD5およびSTAU2-AS1、子宮内膜症に罹患している女性の無細胞DNAにおける低メチル化。

【0041】

子宮内膜症に罹患している患者を治療することを目的として研究を続け、本発明者らは、患者の無細胞DNAに作用させることによって、特にDNaseを患者に投与することによって、子宮内膜症を治療できるという証拠を示す以下の実験結果を得た。

【0042】

DNaseの投与による子宮内膜症の治療

【0043】

第1の態様によれば、本発明は、子宮内膜症の治療におけるDNaseの使用に関する。

【0044】

「治療」とは、ここでは、子宮内膜症の重大性および／または進行の軽減または改善、特にその1つ以上の症状の軽減、例えば炎症および／または痛みの軽減等を意味する。この改善は、DNaseの単独投与によって、またはDNaseと他の療法（例えば、最も重篤な型に対する手術）を組み合わせた療法によってもたらされる。

【0045】

本発明の特定の実施形態によれば、投与されるDNaseは組換えDNaseである。

【0046】

より詳細には、本発明は、現在、嚢胞性線維症に罹患している患者の呼吸機能を改善するための気管支うっ血の治療において示されている、ドルナーゼアルファ(Pulmozyme（登録商標）)などのDNase Iを投与することによって実施することができる。

【0047】

患者のサブグループ

【0048】

本発明の特定の実施態様において、DNaseは、子宮内膜症でない女性における遊離DNAのレベルよりも統計的に大きいレベルの無細胞DNAを有する患者における子宮内膜症の治療において使用される。

【0049】

実際には、当業者は、子宮内膜症に罹患している患者および対照（例えば、子宮内膜症に罹患していない女性）のコホートに関する日常的な研究により、DNaseによる治療が特に推奨される、1つまたは複数の無細胞DNAの閾値（任意に、子宮内膜症のタイプに応じて異なる）を決定することができる。治療に最も反応しやすい患者を決定するために、患者の生体液のサンプルから無細胞DNAを測定することができる。本発明の文脈で使用できる生体液として、血液、血漿および血清を非限定的に挙げることができる。

【0050】

cfDNAは、以下の実験部分に示すように、または科学文献に記載されているその他の方法、特にQUBIT（登録商標）((Life Technologies)やNANODROP（商標）(Thermo Scientific)などの蛍光光度法または分光光度法によって定量できる。近年、無細胞DNAの分析は、特定の癌を診断する方法または染色体異常の出生前診断について豊富に記載されている。したがって、無細胞DNAを単離および分析するためのいくつかの技術が、科学出版物および特許文献の両方に記載されている。当業者は、記載された多くの技術から、DNaseによる治療から利益を得る立場にある患者を同定するのに適切と思われるものを完全に選択することができる。

【0051】

本発明の別の特定の実施形態によれば、DNaseは、無細胞DNAが特定のプロファイルを有する患者における子宮内膜症の治療に使用される；これは、上述のように、本発明者らは、無細胞DNAにおける特定の遺伝子の高メチル化および/または他の特定の遺伝子における低メチル化が子宮内膜症のバイオマーカーを構成することを同定したためである。

【0052】

より詳細には、本発明は、患者における子宮内膜症を治療するためのDnaseの使用に関し、その無細胞DNAは以下のようなメチル化プロファイルを有する：
(i)遺伝子CALD1、RRP1、FN1、FAM87B、TCEAL6、RPL29P2、ATP11A-AS1、DIP2C、SLCO2B1およびRMI2によって形成される群から選択される1つ以上の遺伝子が高メチル化されている、および/または
(ii)遺伝子FBX038、ACVR2A、USP1、TDRD5およびSTAU2-AS1によって形成される群から選択される1以上の遺伝子が低メチル化されている。

【0053】

「遺伝子の高メチル化」(または「遺伝子の低メチル化」)は、ここでは、遺伝子のコード配列の15%の正常メチル化レベルよりも高い(または低い)メチル化レベルを意味し、この遺伝子の発現の増加(または抑制)を引き起こす。

【0054】

明らかに、当業者は、無細胞DNAのメチル化プロファイルを増強および/または改良して、本発明による治療に最も有利に応答するであろう患者を同定することを可能にする。

【0055】

当業者は、特に、日常的な作業により、様々なコホート（DNaseによる治療に反応した、または反応しなかった子宮内膜症に罹患している患者）において、上記の遺伝子の全てまたは一部（15遺伝子のシグネチャー、または発明を実施するための形態の第2段落に記載された36の高メチル化遺伝子および26の低メチル化遺伝子のリスト）のメチル化差を測定し、従って、これらのメチル化レベルを測定するために使用される技術に従って、患者のプロファイルが比較される参照プロファイルを確立することができる。当業者であれば、子宮内膜症が重篤であるか否かを問わず、DNaseによる治療に反応した、または反応しなかった患者の様々なコホートにおいて、これらの日常的な測定を行うことにより、様々な形態の子宮内膜症に対応するプロファイルを確立することができる。そして、患者のプロファイルをこれらの様々なプロファイルと比較することで、治療に有利に応答しやすい患者を特異的に治療することが可能になる。

【0056】

本発明による治療に最も応答しやすい患者を特定するために、それらの無細胞DNAのメチル化プロファイルは、科学文献に記載されている任意の方法によって測定することができる。

【0057】

特に、酵素的検出、免疫学的検出、化学的検出の3つの主要な分子生物学的手法により、メチル化シトシンのマッピングが可能である。本発明の文脈において、これらの様々な技術は、より詳細な解像度を得るために、チップ上でのハイブリダイゼーションや高速シーケンシングの方法と組み合わせることができる。通常、最も使用される4つの技術は、MeDIP-seq、WGBS、RRBS、450K Bead Arrayである。これらの様々な方法は、文献や市販のキット、専門の研究室で詳細なプロトコルが入手できるため、当業者であれば容易に実施することができる。これらの様々な方法は、サンプル間で異なるメチル化領域の検出感度が異なるものの、一致した結果をもたらす。したがって、本発明の文脈では、分析される遺伝子のメチル化の「正常」レベルは、生体サンプルを用いて遺伝子のメチル化レベルを測定するために使用される技術を用いて較正されなければならない。

【0058】

免疫学的検出法

【0059】

メチル化シトシンの特異的抗体は、MeDIP（Methylated DNA ImmunoPrecipitation）と呼ばれる方法に従って、免疫沈降法による検出を可能にする。従来、DNAは超音波処理によって断片化され、最もメチル化された断片が抗体の存在下で最も有利に沈殿する。本発明の文脈では、無細胞DNAの断片化された性質を考慮すると、超音波処理ステップは必須ではない。高速シーケンシング（MeDIP-seq）と組み合わせることで、この方法は、断片の平均サイズに相当する約200ヌクレオチドの分解能で、局所的なメチル化密度を合理的なコストで測定することが可能にする。CpGユニットが最も豊富な領域に偏りがあっても、遺伝子を完全なカバレッジを可能にする。

【0060】

化学的検出方法

【0061】

個々のシトシンのスケールでメチル化状態を調べることを可能にする唯一のツールは、重亜硫酸塩に基づいている。この化合物の存在下では、シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは影響を受けない。この方法では、変換前のリファレンスゲノム上の一塩基多型（SNPs）(Tは非修飾シトシン、Cはメチル化シトシン)を解析することでメチル化を読み取ることができる。

【0062】

重亜硫酸塩処理後のDNAの完全なシーケンシング、またはWGBS(全ゲノム重亜硫酸塩シーケンシング)により、すべてのシトシンのメチル化状態にアクセスすることが可能となり、ゲノムのメチル化をマッピングするすべての手法の中でも卓越したものとなっている。

【0063】

RRBS(還元表現重亜硫酸塩シーケンシング)は、制限酵素の使用によるCpG豊富なゲノム領域の事前選択に基づく、WGBSから派生した技術である。シーケンシングするフラグメントの数を減らすことにより、シーケンシングのコストと深さが大幅に改善され、MeDIP-seqと同じオーダーになる。

【0064】

最後に、重亜硫酸塩で変換されたDNAは、子宮内膜症患者における差次的なメチル化遺伝子の特定のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドチップ上でハイブリダイズすることもできる。

【0065】

DNaseの投与方法

【0066】

気管支うっ血を治療するために投与される場合、このDNaseは通常、圧縮空気噴霧システムによって生成されたエアロゾルの吸入によって投与される。しかしながら、この投与方法は、おそらく投与される用量を増加させることを除いて、循環無細胞DNAの濃度に有意な影響を与えるのに十分な血漿濃度を得ることを可能にしない。さらに、Pulmozyme（登録商標）の毒物学的研究は、この製品が静脈内を含む他の方法で投与された場合に、いかなる二次的影響も有さないことを示した。したがって、本発明の文脈において、DNaseは優先的に筋肉内投与される。当然のことながら、当業者は、一般的なガレヌス知識に基づいて、治療レベルで有効である濃度のDNaseを得ることを可能にする任意の他の投与方法を選択することができる。

【0067】

薬量学と治療プロトコル

【0068】

以下に報告する実験において、本発明者らは、DNase Iの筋肉内(IM)注射によって1ヶ月間治療された子宮内膜症に罹患している患者において、2日毎に2500UIの用量で明らかな臨床的改善を観察した。特に、何人かの患者は、疼痛および排尿障害の軽減に関連する生活の質の改善を記録した。

【0069】

生物学的レベルでは、本発明者らは遊離DNAのレベルの有意な減少を観察した。

【0070】

これらの結果は、子宮内膜症の治療、特に高レベルの無細胞DNAを有する患者におけるDNaseの有効性の証拠を示し、この病気を治療する新規な方法への道を開拓する。

【0071】

本発明の特定の実施形態によれば、DNaseは、子宮内膜症を治療するために、2日ごとに少なくとも2500UIの用量で、少なくとも2週間、好ましくは少なくとも3週間、さらにより好ましくは1ヶ月以上投与される。

【0072】

本発明の別の実施形態によれば、2倍大きい用量が患者に投与される。例えば、5000UIの用量を2日毎に投与することができ、またはDNaseを2500UIの1日用量で投与することができる。

【0073】

本発明の別の実施形態によれば、症状の有意な改善が観察されるまで(例えば、疼痛が有意に減少するまで)、および/または無細胞DNAのレベルが所定の閾値を下回るまで(例えば、子宮内膜症に罹患していない対象において平均的に観察されるレベルに近いレベルに対応するまで)、毎日または2日ごとに2500UIの用量が投与される。

【0074】

本発明の別の実施形態によれば、毎日または2日毎に2500UIの用量が、最初に決定された期間、例えば1、2または3ヶ月間投与される。当業者は、子宮内膜症の重大性のレベルおよび/または他のパラメータ（例えば、治療開始時の患者における無細胞DNAのレベル等）に従って、この期間を明らかに調整することができる。

【0075】

当然のことながら、当業者は、特にガレヌスに関する一般的な知識を用いて、投与方法および／または徐放性ガレヌス形態を同定することも可能であり、これにより、DNaseの満足な血漿中濃度を経時的に維持しながら、注射の間隔を空けることが可能になる。

【0076】

様々な治療プロトコルが本発明の文脈において想定され、特に子宮内膜症の重篤度のレベルに依存する。

【0077】

したがって、重篤度の低い段階(ステージIまたはIIの子宮内膜症)については、子宮内膜症は上記のようにDNaseを投与することによってのみ治療することができ、一方、より重篤な形態(ステージIIIまたはIVの子宮内膜症)については、Dnaseによる治療は手術による補完を有利に可能にする。

【0078】

本発明の別の実施形態によれば、治療は複数の段階を含む。「積極的段階」と呼ばれる第1段階では、患者はかなり高用量、例えば1日当たり2500UIでDNaseを受ける。この積極的段階は、固定期間(例えば、1～3ヶ月)、または疾患の臨床的発展または生物学的マーカー(形質無細胞DNAのレベルなど)によって決定される期間を有し得る。

【0079】

この積極的段階が終了すると、並びに治療結果を改善するため及び／又は再発を避けるために、治療は、さまざまな要素に従って開業医により選択される、維持治療によって継続される。例えば、妊娠を計画している患者に対しては、DNaseによる治療は、場合によっては、積極的治療の期間よりも低い用量または頻度を選択することによって継続される。例えば、2500UIを週に1～2回、あるいは2週に1回、あるいは月に1回投与することも考えられる。妊娠を計画していない患者の場合、維持治療は、Dnaseによる治療の継続（妊娠を希望する患者と同じ条件下で）、または生理を抑制することを目的としたホルモン治療（単相の連続的な黄体ホルモンまたは黄体ホルモン避妊薬、ダナゾールまたはGnRH類似体または拮抗薬）のいずれかである。

【0080】

本発明を以下の実験部分でさらに説明するが、発明の範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0081】

序論

【0082】

医学的および/または外科的に治療された32人の女性(子宮内膜症の前例のない16人および子宮内膜症の前例のある16人)のグループに関する研究において、本発明者らは、子宮内膜症群が平均して対照群よりも56%多くの遊離DNAを含むことを示した。

【0083】

同定された各遺伝子について、そのメチル化状態を分析して、完全ゲノム研究(WGS)による2つのグループのそれぞれの5人の女性のcfDNAを比較することにより、本発明者らは次に特定の遺伝子のメチル化レベルに有意差を観察した。

【0084】

これは本発明者らが、(i）CALD1、RRP1、FN1、FAM87B、TCEAL6、RPL29P2、ATP11A-AS1、DIP2C、SLCO2B1、RMI2、MIR3170、LINC01007、TSPAN17、MIR4693、HYOU1、TLR4、ADGRL3、IL6、VIRMA、MKRN1、INSIG1、ROR2、MRPL3、FMNL2、TMEM19、ZNF438、LINC01192、RCBTB1、TSPAN33、NKD2、FGFR2、TPRG1、MIR4644、FOXO4、FSTL1およびCLMNから選択される遺伝子の高メチル化、および／または（ii）STAU2-AS1、TDRD5、USP1、ACVR2A、FBXO38、NT5C2、NAV1、SOD3、C3、UBE3A、MIR4655、MYO5C、COX6C、MIR6133、BRSK2、MIR4277、MIR4251、MN1、MIR3666、AZIN1、MIR4251、SLC37A2、FZD10、FASN、MKRN9PおよびPCCA-AS1から選択される遺伝子の低メチル化は、子宮内膜症のマーカーを構成し、その発症の可能性は、測定された高メチル化または低メチル化が大きいほど高くなる：
ということを示したためである。

【0085】

より詳細には、本発明者らは、子宮内膜症に高度に関与する15の遺伝子(10の高メチル化および5の低メチル化)のリスト、すなわち:CALD1、RRP1、FN1、FAM87B、TCEAL6、RPL29P2、ATP11A-AS1、DIP2C、SLCO2B1、RMI2、FBX038、ACVR2A、USP1、TDRD5、およびSTAU2-AS1を同定した。

【0086】

これらの結果は、本出願の出願前に公開されていない特許出願 PCT/EP2020/069015に詳細に記載されている。

【0087】

子宮内膜症に罹患している患者を治療するためにそれらの研究を続け、本発明者らは以下の実験結果を得た。

【0088】

実施例１：DNaseIによる子宮内膜症患者の臨床的改善

【0089】

材料と方法

【0090】

患者の選択

【0091】

― 腹腔鏡検査で子宮内膜症が正式に証明された、26歳から39歳の疼痛性、原発性不妊症の若年性患者9人が、外因性DNaseIによる治療を1ヵ月間受けることに同意した。

【0092】

― 患者は全員、慢性的な腹骨盤の痛み、性交困難症、月経周期中の不正出血に苦しんでいた。

【0093】

― 全員が子宮内膜症の診断を確定するために腹腔鏡検査を受けた。

【0094】

― 彼女らは少なくとも強いステージIIまたはそれ以上の骨盤子宮内膜症を有していた（ステージIIIおよびIV）；概略的には、IIA期は腹膜、および/または子宮仙骨靭帯、もしくは卵管に位置し；、IIIA期は卵巣に関連し、IV期は消化管、特に直腸膣中隔に関連する。

【0095】

― 患者は3ヵ月以上現在の治療を受けておらず、DNaseによる治療中は鎮痛剤を服用してはならない。

【0096】

― この研究に参加した女性は、治療および治療のモニタリングに関する情報を受け取ることができた。

【0097】

― 全員が、自身の痛みを評価し、生活の快適さを分析するために医師とコミュニケーションをとることができると判定された。

【0098】

各患者は、治療の内容や方法、生物学的評価について説明を受けた後、同意書に署名した。

【0099】

スース大学の倫理委員会は、治療プロジェクトと患者の生物臨床モニタリングに同意した。

【0100】

治療方法

【0101】

2500UIのDNase I（Pulmozyme; Laboratoire Roche France, Neuilly sur Seine）1アンプルを2日に1回、1ヶ月間筋肉内(IM)注射した。

【0102】

吸入用溶液であるPulmozyme（登録商標）(ドルナーゼアルファ)は、DNAを選択的に切断するヒト組換えデオキシリボヌクレアーゼI(rhDNase)の無菌、透明、無色、高純度の溶液である。

【0103】

Pulmozyme（登録商標）は通常、圧縮空気噴霧システムによって生成されたエアロゾルの吸入によって投与される。しかしながら、rhDNaseの全身レベルは吸入後に非常に低い(最大15％)。そこで、Pulmozymeの毒性試験で、静脈内投与も含めて副次的な影響がなかったことに注目し、DNaseの濃度を高めるために、同製品をIM注射で投与することにした。

【0104】

2500UIを2日ごとに投与することにしたのは、遊離DNA濃度を、子宮内膜症やその他の炎症性病変のない女性に通常見られるレベルまで下げたいという意図からである。

【0105】

酸化ストレスおよび炎症を劇的に減少させるためには、1ヶ月の治療期間が必要と思われた。

【0106】

治療期間中、定期的な診察によって、患者の痛みの強さや生活の快適さを評価することができた。

【0107】

生活の質：評価手段

【0108】

利用可能な様々な質問票のうち、患者にはRushらによって2018年に作成されたPWI（Personal Well Being Index）のうち、生活の快適さ、仕事の成果、社会的関係、安全、地域社会とのコミュニケーション、将来のビジョン、総合的な生活満足度に関する8項目を0から10（完全に不満足なものから完全に満足なものまで）の尺度で評価した。

【0109】

痛みを評価するために、月経困難症、性交困難症、慢性骨盤痛、排尿困難の5項目について、VASスケール（Visual Analogue Scale）を用い、全く痛みのない状態から耐え難い痛みまで、10cmの水平スケールで評価した。

【0110】

臨床的結果

【0111】

痛みの影響

【0112】

― 治療を受けた９人の患者のうち７人は、痛みの軽減に気づいた。他の２人は、手順に違反したため評価できなかった。

【0113】

― ７人中６人の患者が、子宮内膜症の段階に関係なく痛みが軽減したと申告した。

【0114】

５人はVASスケールのマークとして９から４に変更され、38歳、ステージIIIである１人は、８から４に変更された。

【0115】

最年少、26歳、強いステージII子宮内膜症である１人の患者は、痛みの有意な減少を示さなかった。

【0116】

あらゆるタイプの子宮内膜症に外科的介入を行っても、日常的に痛みがなくなるわけではないことが知られている。後者はまた、炎症性状況、異所性子宮内膜の出血、神経の活性化または侵害受容チャネルの活性化障害に関連している。

【0117】

炎症反応は実際、子宮収縮、出血、痛みの原因となるサイトカイン（IL6、TNFα、NGF）やその他のプロスタグランジン（PGE2）の局所分泌を伴う。

【0118】

― 対象となった6人の患者は、性交困難症が改善したと申告した；PWIスケールで８から４にマークした。

【0119】

そのうちの1人は、性交困難症が完全に消失し、生活の快適さが改善したと申告した：８から１にマークした。

【0120】

また、痛みが50％改善した、38歳、ステージIIIの子宮内膜症患者は、性交困難症は10％しか改善しなかった。

【0121】

子宮内膜症が性的関係及びより一般的な人間関係に与える影響は、この病態の本質的なデータの一つである。

【0122】

子宮内膜症の病期や子宮内膜症の部位による違いは観察されなかった。

【0123】

性機能障害については、心理的要因や他の併存疾患を考慮すると、解釈はより難しくなる。

【0124】

― 生理の7～10日前に子宮膣部からの不正出血を起こす習慣のある患者7人のうち4人が、ドルナーゼアルファによる治療で子宮膣部からの不正出血が完全に消失したことを申告した。

【0125】

この子宮内作用は、子宮外妊娠部位にも同じ作用があり、腹部骨盤痛の軽減にも関与している。この結果は、治療の有効性に関して非常に有望である。

【0126】

実施例２：子宮内膜症に罹患している患者におけるDNaseIによる治療の生物学的効果

【0127】

材料と方法

【0128】

以下に示す分析は、モンペリエのACOBIOM研究プラットフォームによって実施された。

【0129】

シーケンシングによるDNAメチル化の分析

【0130】

特定の遺伝子の発現は、DNAのCpGジヌクレオチドアイランドにおけるシトシンのメチル化によって制御され得る。メチル化の調節解除は、さまざまな病状(神経疾患、癌など)を引き起こす可能性がある。ここで採用される方法は、非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸塩による処理である。メチル化シトシンは保護されているため、シーケンシング(サンガー法またはNGSタイプのプラットフォーム(次世代シーケンシング))によって容易に同定できる。

【0131】

無血清DNAの抽出方法

【0132】

Quiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit カタログ番号/ ID：51104を、05/2016バージョンのプロトコル＜QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook＞に従って使用した。

【0133】

1.5 mlのマイクロチューブでピペッティングした400 μlの血清に、約600 mAU/mlまたは40 mAU/mgの濃度のプロテアーゼ(プロテイナーゼK)40 μlとグアニジンを含む変性バッファー(Qiagen社製ALバッファー)400 μlを添加し、ボルテックス(5秒を5回)で混合した後、56 ℃で10分間インキュベートした。

【0134】

前述の混合物に、400μlの100%非変性エタノールを加え、ボルテックス(5回5秒)で混合した。次に、この混合物の半分(420 μl)をキットのカラムにロードし、8000 x gで30秒間遠心分離した。以前に遠心分離した部分を除去した後、残りの半分(420 μl)を同じカラムにロードし、8000 x gで30秒間遠心分離した。

【0135】

Qiagenカラム中に捕捉されたシリカビーズに固定されたDNAを、750 μlのAW1バッファー(グアニジンおよびエタノールを含むバッファー)で1回洗浄した後、8000 x gで30秒間遠心分離した。750 μlのAW2バッファー(Tris、NaCl、およびエタノールを含むバッファー)で2回目の洗浄を行い、8000 x gで30秒間遠心分離した。

【0136】

DNAを捕捉した膜を14,000 x gで1分間遠心分離して乾燥させた。DNAの溶出は、毎回２分間インキュベートおよび毎回8000 x gで１分間遠心分離した後に、25 μlのAEバッファー(TEバッファーに相当：Tris／EDTA 1mM／0.1mM)で、２段階で実施した。

【0137】

DNAは０ ℃及び８ ℃の間の低温で保存されるか、-16 ℃及び-85 ℃の間の温度で凍結された。

【0138】

遊離DNA濃度の測定方法

【0139】

装置

【0140】

― RPP30 (NM_006413, ENST00000371703.7)と略記される遺伝子Homo sapiensリボヌクレアーゼP/MRPサブユニットp30のエクソン1とイントロン2にまたがる86塩基対の領域の増幅に使用したプライマーの塩基配列： RNP30_F: AGATTTGGACCTGCGAGCG (SEQ ID NO: 1)およびRNP30_R: GAAGCCGGGGCAACTCAC (SEQ ID NO: 2)。

【0141】

― リアルタイムサーモサイクラータイプ LightCycler 480II。

【0142】

― SYBRgreen Type LightCycler（登録商標） 480 SYBR Green I Master (カタログ番号：04707516001) を含むマスターミックス。

【0143】

方法

【0144】

５ μlのDNA抽出物のトリプリケートを、0.5 μMの各プライマーを含む1 x マスターミックス20 μlに添加した。増幅は、95 ℃で5分間の活性化、95 ℃で10秒間、59 ℃で20秒間のハイブリダイゼーション、72 ℃で15秒間の伸長の35回の変性サイクル、それに続く72 ℃で5分間の最終伸長で構成される。

【0145】

濃度の算出は、既知の濃度のヒトDNA（50万コピー/反応から1000コピー/反応まで）を10倍に希釈し、3連で行い、定量的PCR（qPCR）に記載されている既知の方法に従ってCt（Cycle threshold）を比較することにより線形回帰で行う。ハプロイドヒト遺伝子の長さは3.2×109塩基対、モル質量は650g/モル/bpであり、290コピー/ngのハプロイドDNAが得られる。

【0146】

実施例の結果は、以下の表に示される。

【0147】

【表1】

【0148】

抽出したDNAの重亜硫酸塩処理

【0149】

Zymo Research社のEZ DNA Methylation Kitを用い、各サンプル45μlの全量を、供給元のプロトコルに従って重亜硫酸塩で処理する。メチル化シトシンは保護され変換されないが、非メチル化シトシンはウラシル（U）に変換される。変換手順終了時の溶出量は25 μlである。

【0150】

処理されたDNA濃度のモニタリング
重亜硫酸塩で処理したサンプルの濃度は、Thermo Scientific社の分光光度計Nano-Drop ND-1000を用いて測定する。測定には 1 μl を使用する。

【0151】

実施例の結果は、以下の表に示される。

【0152】

【表2】

【0153】

PCR反応

【0154】

PCRプライマーの設計

【0155】

１５の標的遺伝子は、以前の実験の間に同定された（以下の表を参照）。

【0156】

【表3】

【0157】

１５の各遺伝子について、PCRプライマーの特定のペアが定められた。改変された塩基は太字のY（塩基T又はC）およびR（塩基A又はG）で示される。

【0158】

【表4-1】

【0159】

【表4-2】

【0160】

PCR反応混合物

【0161】

PCR反応物は、以下を含む最終体積２５μlで増幅される

【0162】

【表5】

【0163】

PCRプログラム

【0164】

【表6】

【0165】

生成されたPCR産物は、1％アガロース(3 μl)中で電気泳動によって確認され、その後配列決定される。最初にメチル化されたシトシンは「保護」され、重亜硫酸塩処理中に変換されなかったが、非メチル化シトシンはウラシル(U)に変換される。したがって、シーケンシングでは、メチル化シトシンはシトシン(C)として表示され、非メチル化シトシンはチミン(T)として表示される。

【0166】

生物学的結果

【0167】

遊離DNAレベルに対する治療の影響

【0168】

血清中の遊離DNAを抽出したところ、治療前と比較して治療終了時には40％減少した。

【0169】

治療前の対象患者7人の遊離DNA濃度は非常に高かったが、2500UIのドルナーゼIを2日ごとに投与したところ、ほぼ半減した。このことは用量効果を示唆しており、より優れた効果のために1日2500UIを投与することで、循環DNAレベルをさらに低下させる可能性がある。

【0170】

遺伝子とメチル化プロファイル

【0171】

治療前の7つの血清DNAと治療後の7つの血清DNAをWGS（全ゲノム塩基配列決定）に供し、特にこの実験部の冒頭で引用した候補遺伝子（10個の高メチル化遺伝子と5個の低メチル化遺伝子）のメチル化状態を決定する。

【0172】

この解析結果の入手は、COVID-19パンデミックのために遅れている。しかしながら、これらの遺伝子のメチル化プロファイルはドルナーゼアルファによる治療後に大きく変化し、遺伝子分布は比較的変化しないが、その分布に新たなデータが明らかになると予想される。

【0173】

ネットワーク研究は、治療の有益な効果を証明する代謝チャネルの新しい分布を反映するはずである。

【0174】

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【0175】

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【国際調査報告】