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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-18
(54)【発明の名称】抗ＣＤ３含有分子の拡散勾配アッセイ
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240111BHJP
C07K 7/00 20060101ALI20240111BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240111BHJP
C07K 16/46 20060101ALN20240111BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20240111BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240111BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C07K7/00
C07K16/28
C07K16/46
C07K14/705
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537296
(86)(22)【出願日】2021-12-21
(85)【翻訳文提出日】2023-08-15
(86)【国際出願番号】 US2021064546
(87)【国際公開番号】W WO2022140344
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】63/128,959
(32)【優先日】2020-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500049716
【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド
(71)【出願人】
【識別番号】513105328
【氏名又は名称】アムジェン リサーチ （ミュニック） ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】タン，グレン・クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ザサジンスカ，イベリーナ
(72)【発明者】
【氏名】ホフマン，パトリック
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ビン
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB19
4B065CA25
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA70
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA54
4H045FA10
4H045FA74
4H045GA22
(57)【要約】
本開示は、Ｆｃ非含有生体分子を発現及び分泌する細胞を識別し、選択し、且つ特徴付ける材料及び方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する細胞集団から少なくとも１つの細胞を単離するための方法であって、（ａ）ナノ流体チップのナノ流体チャンバー内の細胞集団から単一細胞を収集する工程であって、前記細胞は前記生体分子を発現することができる発現コンストラクトを含む、工程と；
（ｂ）クローン増殖並びに前記生体分子の発現及び分泌を可能にする条件下で前記単一細胞を培養し、それによって単一細胞クローンから複数の細胞を生成する工程と；
（ｃ）前記ＣＤ３ペプチドを含む組成物を、前記ＣＤ３ペプチドが前記単一細胞クローンの前記複数の細胞によって分泌された前記生体分子と接触することを可能にする条件下で前記ナノ流体チップに投与する工程と；
（ｄ）ＣＤ３ペプチドと前記生体分子との結合を検出する工程と；
（ｅ）ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する工程（ｂ）の複数の細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程と
を含む方法。
【請求項2】
前記細胞集団は細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細胞集団は２つ以上の細胞株の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
単一細胞株の前記複数の細胞によって分泌された前記生体分子の量を定量する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、酵母細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０、Ｓｐ２／０）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胚性腎臓（２９３）細胞、線維肉腫（ＨＴ－１０８０）細胞、ヒト胚性網膜（ＰＥＲ．Ｃ６）細胞、ハイブリッド腎臓及びＢ細胞（ＨＫＢ－１１）、ＣＥＶＥＣ羊膜細胞産生（ＣＡＰ）細胞、並びにヒト肝臓（ＨｕＨ－７）細胞からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記生体分子はポリペプチドを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ポリペプチドは組換え体である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ポリペプチドは、抗体、ペプチボディ、多重特異性タンパク質、二重特異性タンパク質、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、半減期延長二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、並びにそれらの生物学的に活性な断片、アナログ及び誘導体からなる群から選択される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
前記生体分子はＢｉＴＥであり、またＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＤＬＬ３、ＣＤ１９、ＦＬＴ３、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１７、ＣＬＤＮ１８．２、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０及びＣＤ７０からなる群から選択される標的分子に結合することができる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＣＤ３ペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＣＤ３ペプチドは１０個のアミノ酸を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ＣＤ３ペプチドは、ピログルタミン酸－ＤＧＮＥＥＭＧＧＣ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＣＤ３ペプチドは、少なくとも１つの修飾を含むＣＤ３ペプチドコンジュゲートである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記修飾は、選択された検出部分の結合を含み、前記検出部分はフルオロフォアである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記フルオロフォアは、ＡＦ５９４及びＡＦ４８８からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＡＦ５９４は、マレイミドリンカーを使用して、配列ピログルタミン酸－ＤＧＮＥＥＭＧＧＣ（配列番号１）のＣ末端システインに結合している、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記発現コンストラクトは、ベクター、プラスミド、及び線状化ＤＮＡ発現配列からなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
１４日以内に完了する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ナノ流体チップは、１，０００～２，０００のナノ流体チャンバーを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記ナノ流体チップは、１７５８個のナノ流体チャンバーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
ＣＤ３ペプチドに結合することができる二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを分泌する細胞集団から少なくとも１つの細胞を単離するための方法であって、（ａ）ナノ流体チップのナノ流体チャンバー内の単一細胞を収集する工程であって、前記細胞は前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを発現することができる発現コンストラクトを含む、工程と；
（ｂ）クローン増殖並びに前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの発現及び分泌を可能にする条件下で前記単一細胞を培養し、それによって単一細胞クローンから複数の細胞を生成する工程と；
（ｃ）前記ＣＤ３ペプチドを含む組成物を、前記ＣＤ３ペプチドが前記単一細胞株の前記複数の細胞によって分泌された前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーと接触することを可能にする条件下で前記ナノ流体チップに投与する工程と；
（ｄ）ＣＤ３ペプチドと前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーとの結合を検出する工程と；
（ｅ）ＣＤ３ペプチドに結合することができる二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを分泌する工程（ｂ）の複数の細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程と、
を含み、
前記ＣＤ３ペプチドはＣＤ３ペプチドコンジュゲートであり、且つアミノ酸配列ピログルタミン酸－ＤＧＮＥＥＭＧＧＣ（配列番号１）を含み、ＡＦ５９４が前記配列のＣ末端システインに結合している、方法。
【請求項23】
ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を生成する方法であって、（ａ）ナノ流体チップのナノ流体チャンバー内の細胞集団から単一細胞を収集する工程であって、前記細胞は前記生体分子を発現することができる発現コンストラクトを含む、工程と；
（ｂ）クローン増殖並びに前記生体分子の発現及び分泌を可能にする条件下で前記単一細胞を培養し、それによって単一細胞クローンから複数の細胞を生成する工程と；
（ｃ）前記ＣＤ３ペプチドを含む組成物を、前記ＣＤ３ペプチドが前記単一細胞株の前記複数の細胞によって分泌された前記生体分子と接触することを可能にする条件下で前記ナノ流体チップに投与する工程と；
（ｄ）ＣＤ３ペプチドと前記生体分子との結合を検出する工程と；
（ｅ）ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する工程（ｂ）の複数の細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程と；
（ｆ）前記少なくとも１つの細胞を前記細胞株から容器に移し、前記生体分子の産生を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程と
を含む方法。
【請求項24】
ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する細胞集団から少なくとも１つの細胞を単離するための方法であって、（ａ）ナノ流体チップのナノ流体チャンバー内の細胞集団から単一細胞を収集する工程であって、前記細胞は前記生体分子を発現することができる発現コンストラクトを含む、工程と；
（ｂ）クローン増殖並びに前記生体分子の発現及び分泌を可能にする条件下で前記単一細胞を培養し、それによって単一細胞クローンから複数の細胞を生成する工程と；
（ｃ）前記ＣＤ３ペプチドを含む第１の組成物及び生体分子結合試薬を含む第２の組成物を、前記ＣＤ３ペプチドが前記単一細胞株の前記複数の細胞によって分泌された前記生体分子と接触することを可能にする条件下で前記ナノ流体チップに投与する工程と；
（ｄ）ＣＤ３ペプチド及び生体分子結合試薬と前記生体分子との結合を検出する工程と；
（ｅ）ＣＤ３ペプチド、及び任意選択により生体分子結合試薬に結合することができる生体分子を分泌する工程（ｂ）の複数の細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
配列表は、本開示の一部であり、テキストファイルとして本明細書と同時に提出している。配列表を含むテキストファイルの名称は、「５５３３３＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、これは、２０２１年１２月７日に作成され、８３５バイトのサイズである。配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表は、本開示の一部であり、テキストファイルとして本明細書と同時に提出している。配列表を含むテキストファイルの名称は、「５５３３３＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、これは、２０２１年１２月７日に作成され、８３５バイトのサイズである。配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
現在開発中の治療用生物製剤候補の数の増加に伴い、これらの医薬品を送達するためのプロセス開発業務からの革新的なソリューションに対する要求が高まっている。かなりの数の生物製剤が、生細胞系を用いて製造され、哺乳動物のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は主に、モノクローナル抗体又は他の抗体フォーマットなどの組換えタンパク質治療薬の製造に使用されている（Ｗｕｒｍ，ＦＭ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００４，２２（１１）．１３９３－８）。典型的な哺乳動物細胞株開発（ＣＬＤ）プロセスは、目的の導入遺伝子をコードするＤＮＡコンストラクトを用いた宿主細胞トランスフェクションから始まり、その後、所望の治療用タンパク質を発現する細胞の安定なプールを送達するために（必要であれば）選択及び増幅が続く。治療用タンパク質の生産における規制要件を満たすとともに安全で頑健なプロセスを保証するためには、プロセス細胞株は、単一細胞に由来しなければならない（Ｆｒｙｅ，Ｃ．；ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２０１６，４４（２），１１７－２２；及びＬｅ Ｋ，Ｔａｎ Ｃ，Ｌｅ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａｓｓｕｒｉｎｇ Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｅａｃｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０２０；１５（１）：ｅ１９００２４７）。単一細胞のクローニングに使用される細胞のプール集団は、非常に不均一であり、そこでは、満足する製品品質プロファイルを有するタンパク質を大量に産生する細胞はあまり示されない。したがって、経験的スクリーニング努力によって、所望の産物品質特性を有する高品質クローン細胞株を特定し単離する必要がある。一般的には、臨床的及び商業的製造に適した高品質の細胞株候補を特定するためには、数百から数千のクローンを評価する必要があるので、クローンスクリーニング試験はかなり困難であり、資源集約的である（Ｗｕｒｍ，Ｆ．Ｍ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）。
【0003】
最近開発されたＢｅｒｋｅｌｅｙ ＬｉｇｈｔのＢｅａｃｏｎ（登録商標）技術プラットフォームは、細胞株の開発操作に適しており、単一細胞レベルでの増殖及び所望の分泌プロファイルの評価が可能である。Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）機器は、単一のナノ流体チップ上で最大１７５８個のクローン細胞株を単離することができる完全統合型ナノ流体細胞培養システムである。ＢＬＩプラットフォームは、内蔵の蛍光顕微鏡機能を備えており、チップ上で増殖した細胞集団を特徴付けるナノスケールの蛍光アッセイを開発することができる。ナノ流体チップにロードされた細胞を個々のペンで単離し、同時に培養し、組換えタンパク質分泌をアッセイすることができる。クローン候補を所望の増殖及び分泌プロファイルに基づいて選択し、チップから取り出し、スケールアップに供する。最近、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォームを使用して、クローン性が高度に保証された、臨床的及び商業的製造に適した高品質クローンの濃縮が行われた（Ｌｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１８；３４（６）：１４３８－１４４６；及びＬｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０２０；１５（１）：ｅ１９００２４７）。
【0004】
ＢＬＩプラットフォームを利用する標準的なＣＬＤワークフローにより、ヒトＦｃドメイン又はヒトカッパ軽鎖ドメインをタンパク質配列中に有する治療用生物製剤を発現する産生性の高い細胞株を選択することができる。ナノ流体チップ上のタンパク質検出を可能にし、個々のクローンの分泌能力を評価する、ＢＬＩの拡散に基づくＳｐｏｔｌｉｇｈｔＴＭＨｕ３又はＳｐｏｔＬｉｇｈｔヒトカッパアッセイによって、所望の分泌表現型を示す細胞株のスクリーニングを促進することができる。Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔの拡散アッセイ試薬には、モノクローナル抗体などの治療法のサブセットに存在するヒトＦｃドメイン又はヒトカッパ軽鎖ドメインに結合する蛍光標識プローブが含まれる。このアッセイはペン内の蛍光試薬の差次的保持に依存しており、これは、蛍光顕微鏡法によって検出することができ、組換えタンパク質分泌の定量的尺度を提供する。蛍光プローブの低分子量は、その迅速な拡散及び効率的なオンチップ平衡化を可能にする。アッセイ試薬は培地で希釈され、チップ上に潅流され、そこで各ペン中に拡散し、分泌タンパク質産物中に存在する標的ドメインに結合する。その結果、標的タンパク質及び拡散アッセイ試薬からなる高分子量複合体が形成される。平衡に達すると、チップは培地でフラッシュされ、このプロセスの間、未結合のアッセイ試薬は、急速にペンから拡散する。対照的に、分泌タンパク質と複合体化した拡散試薬は、そのより大きい分子量によって引き起こされるそのより遅い拡散速度のために、ペン内に保持される。ＳｐｏｔｌｉｇｈｔＴＭＨｕ３－Ｆｃドメイン又はＳｐｏｔＬｉｇｈｔヒトカッパ－カッパ軽鎖複合体に対応する蛍光強度が、ペンにおいて検出され、組換えタンパク質分泌レベルを測定することが可能になる。
【0005】
細胞株スクリーニングのためにＢｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ拡散アッセイを利用することに対する大きな制約は、それらが、抗体又は他のヒトＦｃ若しくはヒトカッパ軽鎖含有抗体フォーマットなどの組換えタンパク質のサブセットを発現する細胞にのみ適用可能であることである。しかしながら、分子フォーマット又はタンパク質配列工学のために、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓによって提供される市販の試薬に適合しない、相当量の組換えタンパク質治療薬が存在する。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、２つの抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）からなる組換え融合タンパク質であり、以下の２つの抗原を特異的に認識するように設計されている：ＣＤ３受容体に対する親和性によってＴ細胞表面上に存在するもの、及び標的腫瘍細胞上に存在する第２の抗原（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９；１１（１）：２２－３０；Ｆｒａｎｋｅｌ ＳＲ，ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１３；１７（３）：３８５－３９２；及びＹｕｒａｓｚｅｃｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７；１０１（５）：６３４－６４５）。ＢｉＴＥ（（登録商標）療法は、患者自身の免疫システムを働かせて疾患と闘うように設計された抗癌治療である。ＢｉＴＥ（登録商標）が投与されると、患者自身のＴ細胞は、選択された腫瘍関連抗原を発現する癌細胞に繋がれ、その結果、腫瘍に対する免疫応答を誘導する。ＢｉＴＥ（登録商標）技術は、固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍の両方に対する治療の開発に有望な解決策を提供する（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９；１１（１）：２２－３０）。
【0006】
したがって、当該技術分野においては、カノニカルＢｉＴＥ（登録商標）分子などの非Ｆｃ含有生体分子を発現し分泌する細胞を特徴付ける方法を開発することが要望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｗｕｒｍ，Ｆ．Ｍ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００４，２２（１１），１３９３－８
【非特許文献2】Ｆｒｙｅ，Ｃ．；ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２０１６，４４（２），１１７－２２
【非特許文献3】Ｌｅ Ｋ，Ｔａｎ Ｃ，Ｌｅ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａｓｓｕｒｉｎｇ Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｅａｃｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０２０；１５（１）：ｅ１９００２４７
【非特許文献4】Ｌｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１８；３４（６）：１４３８－１４４６
【非特許文献5】Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９；１１（１）：２２－３０
【非特許文献6】Ｆｒａｎｋｅｌ ＳＲ，ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１３；１７（３）：３８５－３９２
【非特許文献7】Ｙｕｒａｓｚｅｃｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７；１０１（５）：６３４－６４５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本明細書に記載されるように、本開示は、様々な実施形態において、ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する細胞の集団から少なくとも１つの細胞を単離するための方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する細胞集団から少なくとも１つの細胞を単離するための方法であって、（ａ）ナノ流体チップのナノ流体チャンバー内の細胞集団から単一細胞を収集する工程であって、前記細胞は前記生体分子を発現することができる発現コンストラクトを含む、工程と；（ｂ）クローン増殖並びに前記生体分子の発現及び分泌を可能にする条件下で単一細胞を培養し、それによって単一細胞クローンから複数の細胞を生成する工程と；（ｃ）前記ＣＤ３ペプチドを含む組成物を、ＣＤ３ペプチドが単一細胞クローンの前記複数の細胞によって分泌された前記生体分子と接触することを可能にする条件下で前記ナノ流体チップに投与する工程と；（ｄ）ＣＤ３ペプチドと前記生体分子との結合を検出する工程と；（ｅ）ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する工程（ｂ）の複数の細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程と、を含む方法を提供する。
【0009】
一実施形態では、細胞集団は細胞株である。別の実施形態では、細胞集団は２つ以上の細胞株の混合物である。さらに別の実施形態では、単一細胞株の前記複数の細胞によって分泌された前記生体分子の量を定量する工程をさらに含む、前述の方法が提供される。
【0010】
さらに別の実施形態では、本開示は、細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、酵母細胞及び真菌細胞からなる群から選択される前述の方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０、Ｓｐ２／０）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胚性腎臓（２９３）細胞、線維肉腫（ＨＴ－１０８０）細胞、ヒト胚性網膜（ＰＥＲ．Ｃ６）細胞、ハイブリッド腎臓及びＢ細胞（ＨＫＢ－１１）、ＣＥＶＥＣ羊膜細胞産生（ＣＡＰ）細胞、並びにヒト肝臓（ＨｕＨ－７）細胞からなる群より選択される。
【0011】
別の実施形態では、本開示は、前記生体分子がポリペプチドを含む前述の方法を提供する。一実施形態では、このポリペプチドは、組換え体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体、ペプチボディ、多重特異性タンパク質、二重特異性タンパク質、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、半減期延長二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、並びにそれらの生物学的に活性な断片、アナログ及び誘導体からなる群から選択される。
【0012】
さらに別の実施形態では、本開示は、生体分子がＢｉＴＥであり、またＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＤＬＬ３、ＣＤ１９、ＦＬＴ３、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１７、ＣＬＤＮ１８．２、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０及びＣＤ７０からなる群から選択される標的分子に結合することもできる、前述の方法を提供する。
【0013】
さらに別の実施形態では、本開示は、前記ＣＤ３ペプチドが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸を含む、前述の方法を提供する。一実施形態では、ＣＤ３ペプチドは１０個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＣＤ３ペプチドは、ピログルタミン酸－ＤＧＮＥＥＭＧＧＣ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む。
【0014】
さらに別の実施形態では、本開示は、前記ＣＤ３ペプチドが少なくとも１つの修飾を含むＣＤ３ペプチドコンジュゲートである、前述の方法を提供する。一実施形態では、修飾は、選択された検出部分の結合を含み、前記検出部分はフルオロフォアである。一実施形態では、フルオロフォアは、ＡＦ５９４及びＡＦ４８８からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、ＡＦ５９４が、マレイミドリンカーを使用して、配列ピログルタミン酸－ＤＧＮＥＥＭＧＧＣ（配列番号１）のＣ末端システインに結合している。
【0015】
さらに別の実施形態では、本開示は、前記発現コンストラクトがベクター、プラスミド、及び線状化ＤＮＡ発現配列からなる群から選択される、前述の方法を提供する。さらに他の実施形態では、前述の方法は、１４日以内に完了する。
【0016】
別の実施形態では、本開示は、ナノ流体チップが１，０００～２，０００のナノ流体チャンバーを含む、前述の方法を提供する。一実施形態では、ナノ流体チップは、１７５８個のナノ流体チャンバーを含む。
【0017】
さらに別の実施形態では、本開示は、ＣＤ３ペプチドに結合することができる二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを分泌する細胞集団から少なくとも１つの細胞を単離するための方法であって、（ａ）ナノ流体チップのナノ流体チャンバー内の単一細胞を収集する工程であって、前記細胞は前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを発現することができる発現コンストラクトを含む、工程と；（ｂ）クローン増殖並びに前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの発現及び分泌を可能にする条件下で単一細胞を培養し、それによって単一細胞クローンから複数の細胞を生成する工程と；（ｃ）前記ＣＤ３ペプチドを含む組成物を、前記ＣＤ３ペプチドが前記単一細胞株の前記複数の細胞によって分泌された前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーと接触することが可能にする条件下で前記ナノ流体チップに投与する工程と；（ｄ）ＣＤ３ペプチドと前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーとの結合を検出する工程と；（ｅ）ＣＤ３ペプチドに結合することができる二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを分泌する工程（ｂ）の複数の細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程と、を含み、前記ＣＤ３ペプチドはＣＤ３ペプチドコンジュゲートであり、且つアミノ酸配列ピログルタミン酸－ＤＧＮＥＥＭＧＧＣ（配列番号１）を含み、ＡＦ５９４が前記配列のＣ末端システインに結合している、方法を提供する。
【0018】
さらに別の実施形態では、本開示は、ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を生成する方法であって、（ａ）ナノ流体チップのナノ流体チャンバー内の細胞集団から単一細胞を収集する工程であって、前記細胞は前記生体分子を発現することができる発現コンストラクトを含む、工程と；（ｂ）クローン増殖並びに前記生体分子の発現及び分泌を可能にする条件下で単一細胞を培養し、それによって単一細胞クローンから複数の細胞を生成する工程と；（ｃ）前記ＣＤ３ペプチドを含む組成物を、前記ＣＤ３ペプチドが単一細胞株の前記複数の細胞によって分泌された前記生体分子と接触することを可能にする条件下で前記ナノ流体チップに投与する工程と；（ｄ）ＣＤ３ペプチドと前記生体分子との結合を検出する工程と；（ｅ）ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する工程（ｂ）の複数の細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程と、（ｆ）前記少なくとも１つの細胞を前記細胞クローンから容器に移し、前記生体分子の産生を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程と、を含む、方法を提供する。
【0019】
さらに別の実施形態では、本開示は、ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する細胞集団から少なくとも１つの細胞を単離するための方法であって、（ａ）ナノ流体チップのナノ流体チャンバー内の細胞集団から単一細胞を収集する工程であって、前記細胞は前記生体分子を発現することができる発現コンストラクトを含む、工程と；（ｂ）クローン増殖並びに前記生体分子の発現及び分泌を可能にする条件下で単一細胞を培養し、それによって単一細胞クローンから複数の細胞を生成する工程と；（ｃ）前記ＣＤ３ペプチドを含む第１の組成物及び生体分子結合試薬を含む第２の組成物を、前記ＣＤ３ペプチドが単一細胞株の前記複数の細胞によって分泌された前記生体分子と接触することを可能にする条件下で前記ナノ流体チップに投与する工程と；（ｄ）ＣＤ３ペプチド及び生体分子結合試薬と前記生体分子との結合を検出する工程と；（ｅ）ＣＤ３ペプチド、及び任意選択により生体分子結合試薬に結合することができる生体分子を分泌する工程（ｂ）の複数の細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程と、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、前述の方法は、細胞若しくは細胞株の混合物又は細胞若しくは細胞株の混合集団から少なくとも１つの細胞を単離することを可能にする。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、１つの細胞株に由来する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1A】図１は、ＣＤ３結合を模倣するアッセイ試薬の設計及び開発を示す。図１Ａ．拡散勾配アッセイのためのＢｉＴＥ（登録商標）特異的試薬設計の概略図。図１Ｂ．ＣＤ３－ＡＦ４８８ペプチドコンジュゲートを補充した培地から精製した組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質に対応するＳＥＣプロファイル。検出された組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質の種を矢印で示す。図１Ｃ．ＣＤ３－ＡＦ４８８ペプチドコンジュゲートを補充した分泌培地に由来する試料に対応するＳＥＣプロファイル。検出された組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質の種及び非結合ＣＤ３－ＡＦ４８８試薬を矢印で示す。図１Ｄ．示された濃度のＣＤ３拡散アッセイ試薬との２４時間のインキュベーション後に測定されたＣＨＯ細胞の生存率を示すグラフ。
【図1B】図１は、ＣＤ３結合を模倣するアッセイ試薬の設計及び開発を示す。図１Ａ．拡散勾配アッセイのためのＢｉＴＥ（登録商標）特異的試薬設計の概略図。図１Ｂ．ＣＤ３－ＡＦ４８８ペプチドコンジュゲートを補充した培地から精製した組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質に対応するＳＥＣプロファイル。検出された組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質の種を矢印で示す。図１Ｃ．ＣＤ３－ＡＦ４８８ペプチドコンジュゲートを補充した分泌培地に由来する試料に対応するＳＥＣプロファイル。検出された組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質の種及び非結合ＣＤ３－ＡＦ４８８試薬を矢印で示す。図１Ｄ．示された濃度のＣＤ３拡散アッセイ試薬との２４時間のインキュベーション後に測定されたＣＨＯ細胞の生存率を示すグラフ。
【図1C】図１は、ＣＤ３結合を模倣するアッセイ試薬の設計及び開発を示す。図１Ａ．拡散勾配アッセイのためのＢｉＴＥ（登録商標）特異的試薬設計の概略図。図１Ｂ．ＣＤ３－ＡＦ４８８ペプチドコンジュゲートを補充した培地から精製した組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質に対応するＳＥＣプロファイル。検出された組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質の種を矢印で示す。図１Ｃ．ＣＤ３－ＡＦ４８８ペプチドコンジュゲートを補充した分泌培地に由来する試料に対応するＳＥＣプロファイル。検出された組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質の種及び非結合ＣＤ３－ＡＦ４８８試薬を矢印で示す。図１Ｄ．示された濃度のＣＤ３拡散アッセイ試薬との２４時間のインキュベーション後に測定されたＣＨＯ細胞の生存率を示すグラフ。
【図1D】図１は、ＣＤ３結合を模倣するアッセイ試薬の設計及び開発を示す。図１Ａ．拡散勾配アッセイのためのＢｉＴＥ（登録商標）特異的試薬設計の概略図。図１Ｂ．ＣＤ３－ＡＦ４８８ペプチドコンジュゲートを補充した培地から精製した組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質に対応するＳＥＣプロファイル。検出された組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質の種を矢印で示す。図１Ｃ．ＣＤ３－ＡＦ４８８ペプチドコンジュゲートを補充した分泌培地に由来する試料に対応するＳＥＣプロファイル。検出された組換えＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質の種及び非結合ＣＤ３－ＡＦ４８８試薬を矢印で示す。図１Ｄ．示された濃度のＣＤ３拡散アッセイ試薬との２４時間のインキュベーション後に測定されたＣＨＯ細胞の生存率を示すグラフ。
【図2A】図２は、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓナノ流体チップ上でのＣＤ３バインダー分泌のための拡散勾配アッセイの最適化を示す。図２Ａ．ＣＤ３結合タンパク質のカノニカルＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質産物の分泌を検出するためのオンチップＣＤ３拡散勾配アッセイの概略図。図２Ｂ．ＣＤ３拡散アッセイを示すＢＬＩプラットフォームで取得された画像により、ペンにおける蛍光プローブの差次的保持に基づいて、カノニカルＢｉＴＥ（登録商標）モダリティを分泌するクローンの識別することができる。
【図2B】図２は、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓナノ流体チップ上でのＣＤ３バインダー分泌のための拡散勾配アッセイの最適化を示す。図２Ａ．ＣＤ３結合タンパク質のカノニカルＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質産物の分泌を検出するためのオンチップＣＤ３拡散勾配アッセイの概略図。図２Ｂ．ＣＤ３拡散アッセイを示すＢＬＩプラットフォームで取得された画像により、ペンにおける蛍光プローブの差次的保持に基づいて、カノニカルＢｉＴＥ（登録商標）モダリティを分泌するクローンの識別することができる。
【図3A】図３は、ＣＤ３拡散アッセイが、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓナノ流体チップ上の２つのＢｉＴＥ（登録商標）フォーマットに対する高い特異性を実証することを示す。図３Ａ．ＣＤ３バインダー拡散アッセイの特異性及び効率を示すＢＬＩプラットフォームで得られた代表的画像。画像は、ＢＬＩプラットフォームに構築されたアッセイ分析ツールから抽出した。ＣＤ３バインダー及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ画像取得に使用される曝露時間は、アッセイパラメーターの違いのため同じではない。カノニカルＢｉＴＥ（登録商標）、ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合体又はＩｇＧ融合タンパク質を発現する３つの独立して生成された細胞株を、１つのチップ上の交互の切片にロードし、５日間培養した。ＣＤ３バインダーアッセイ及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイを５日目に実施した。図３Ｂ．分泌スコアの定量とＡに示すアッセイ結果を示すグラフ。図３Ｃ．Ａ及びＢに示す細胞株によって発現した３つのモダリティについてのＣＤ３拡散アッセイスコア対Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイスコアの相関。表示したＲ２値は、ＣＤ３拡散アッセイの結果とＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイの結果との間の相関の程度を示す。
【図3B】図３は、ＣＤ３拡散アッセイが、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓナノ流体チップ上の２つのＢｉＴＥ（登録商標）フォーマットに対する高い特異性を実証することを示す。図３Ａ．ＣＤ３バインダー拡散アッセイの特異性及び効率を示すＢＬＩプラットフォームで得られた代表的画像。画像は、ＢＬＩプラットフォームに構築されたアッセイ分析ツールから抽出した。ＣＤ３バインダー及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ画像取得に使用される曝露時間は、アッセイパラメーターの違いのため同じではない。カノニカルＢｉＴＥ（登録商標）、ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合体又はＩｇＧ融合タンパク質を発現する３つの独立して生成された細胞株を、１つのチップ上の交互の切片にロードし、５日間培養した。ＣＤ３バインダーアッセイ及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイを５日目に実施した。図３Ｂ．分泌スコアの定量とＡに示すアッセイ結果を示すグラフ。図３Ｃ．Ａ及びＢに示す細胞株によって発現した３つのモダリティについてのＣＤ３拡散アッセイスコア対Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイスコアの相関。表示したＲ２値は、ＣＤ３拡散アッセイの結果とＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイの結果との間の相関の程度を示す。
【図3C】図３は、ＣＤ３拡散アッセイが、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓナノ流体チップ上の２つのＢｉＴＥ（登録商標）フォーマットに対する高い特異性を実証することを示す。図３Ａ．ＣＤ３バインダー拡散アッセイの特異性及び効率を示すＢＬＩプラットフォームで得られた代表的画像。画像は、ＢＬＩプラットフォームに構築されたアッセイ分析ツールから抽出した。ＣＤ３バインダー及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ画像取得に使用される曝露時間は、アッセイパラメーターの違いのため同じではない。カノニカルＢｉＴＥ（登録商標）、ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合体又はＩｇＧ融合タンパク質を発現する３つの独立して生成された細胞株を、１つのチップ上の交互の切片にロードし、５日間培養した。ＣＤ３バインダーアッセイ及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイを５日目に実施した。図３Ｂ．分泌スコアの定量とＡに示すアッセイ結果を示すグラフ。図３Ｃ．Ａ及びＢに示す細胞株によって発現した３つのモダリティについてのＣＤ３拡散アッセイスコア対Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイスコアの相関。表示したＲ２値は、ＣＤ３拡散アッセイの結果とＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイの結果との間の相関の程度を示す。
【図4A】図４は、ＣＤ３拡散アッセイに基づいて選択されたクローンがサブクローニングに使用された親細胞株と比較して同様の性能を示すことを示す。図４Ａ、図４Ｂ．ＣＤ３拡散アッセイに基づいて選択され、図３に示されるチップからエクスポートされたＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合発現クローンについての１０日間のフェドバッチ実験によって評価された正規化力価測定値（Ａ）及び比生産性（Ｂ）を示すグラフ。本研究で作製したＢＬＩエクスポートクローンを丸で示し、サブクローニングに使用した親細胞株を三角で示す。Ａ及びＢに示す細胞株によって得られた力価及びＱｐは、親細胞株で測定された値に対して正規化した。図４Ｂ．Ａ及びＢに示す１０日間のフェドバッチ実験中の生存細胞密度及び生存率を示すグラフ。
【図4B】図４は、ＣＤ３拡散アッセイに基づいて選択されたクローンがサブクローニングに使用された親細胞株と比較して同様の性能を示すことを示す。図４Ａ、図４Ｂ．ＣＤ３拡散アッセイに基づいて選択され、図３に示されるチップからエクスポートされたＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合発現クローンについての１０日間のフェドバッチ実験によって評価された正規化力価測定値（Ａ）及び比生産性（Ｂ）を示すグラフ。本研究で作製したＢＬＩエクスポートクローンを丸で示し、サブクローニングに使用した親細胞株を三角で示す。Ａ及びＢに示す細胞株によって得られた力価及びＱｐは、親細胞株で測定された値に対して正規化した。図４Ｂ．Ａ及びＢに示す１０日間のフェドバッチ実験中の生存細胞密度及び生存率を示すグラフ。
【図5A】図５は、低レベルで分泌されるＢｉＴＥ（登録商標）モダリティのためのデュアルターゲティング拡散勾配アッセイの開発を示す。図５Ａ．Ｂ及びＣに示す実験計画の概略図。図５Ｂ．ＣＤ３拡散アッセイ、Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３及びデュアルターゲティングアッセイ結果の定量化を示すグラフ。ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ発現細胞株は濃い灰色の円で示され、空のペンは薄い灰色の円で示される。分泌スコア（Ａｕスコア）を、各データセット内の空のペンについて計算された平均Ａｕスコアに対して正規化した。図５Ｃ．デュアルターゲティング拡散勾配アッセイの効率を示す、ＢＬＩプラットフォームで取得された代表的な画像。ＣＤ３拡散アッセイ／デュアルターゲティングアッセイ及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ画像取得に使用した曝露時間は、アッセイパラメーターの違いのために同じではない。
【図5B】図５は、低レベルで分泌されるＢｉＴＥ（登録商標）モダリティのためのデュアルターゲティング拡散勾配アッセイの開発を示す。図５Ａ．Ｂ及びＣに示す実験計画の概略図。図５Ｂ．ＣＤ３拡散アッセイ、Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３及びデュアルターゲティングアッセイ結果の定量化を示すグラフ。ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ発現細胞株は濃い灰色の円で示され、空のペンは薄い灰色の円で示される。分泌スコア（Ａｕスコア）を、各データセット内の空のペンについて計算された平均Ａｕスコアに対して正規化した。図５Ｃ．デュアルターゲティング拡散勾配アッセイの効率を示す、ＢＬＩプラットフォームで取得された代表的な画像。ＣＤ３拡散アッセイ／デュアルターゲティングアッセイ及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ画像取得に使用した曝露時間は、アッセイパラメーターの違いのために同じではない。
【図5C】図５は、低レベルで分泌されるＢｉＴＥ（登録商標）モダリティのためのデュアルターゲティング拡散勾配アッセイの開発を示す。図５Ａ．Ｂ及びＣに示す実験計画の概略図。図５Ｂ．ＣＤ３拡散アッセイ、Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３及びデュアルターゲティングアッセイ結果の定量化を示すグラフ。ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ発現細胞株は濃い灰色の円で示され、空のペンは薄い灰色の円で示される。分泌スコア（Ａｕスコア）を、各データセット内の空のペンについて計算された平均Ａｕスコアに対して正規化した。図５Ｃ．デュアルターゲティング拡散勾配アッセイの効率を示す、ＢＬＩプラットフォームで取得された代表的な画像。ＣＤ３拡散アッセイ／デュアルターゲティングアッセイ及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ画像取得に使用した曝露時間は、アッセイパラメーターの違いのために同じではない。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本開示は、Ｆｃ非含有生体分子を発現し分泌する細胞の特徴付けに有用な方法及び材料を提供することによって、当該技術分野における前述の必要性に対処する。この必要性をさらに増強すると、カノニカル及び半減期が延長されたＦｃコンジュゲートＢｉＴＥ（登録商標）分子はいずれも、ＣＨＯ細胞においてモノクローナル抗体よりも低いレベルで発現する。ＢｉＴＥ（登録商標）分子を高レベルで発現するクローンを識別するためのスクリーニング方法は、低発現プールのハードルを潜在的に回避する。
【0022】
一実施形態では、本開示は、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォームを使用する細胞株開発ワークフローに適合する、ＣＤ３結合モダリティに特異的なアッセイを提供する。この実施形態では、ＣＤ３－ペプチドコンジュゲートを調製し、ナノ流体チップ上のＣＤ３結合治療用生物製剤を分泌するクローンを識別するために、最適化オンチップ拡散勾配アッセイを実施した。この戦略は、高レベルのＣＤ３バインダーを分泌するクローンを、低産生クローンから、またナノ流体チップ上の他のモダリティを分泌する細胞株から区別することを可能にする。さらに、このアッセイを用いて選択された細胞株は、標準的なワークフローにより誘導されるクローンと比較した場合、同様の増殖及び分泌プロファイルを示す。したがって、本明細書で提供されるＣＤ３拡散アッセイは、ナノ流体チップ上の高分泌細胞株の識別を可能にし、一実施形態では、ＢＬＩプラットフォームを使用する早期のクローン選択を支持する。他の実施形態では、本開示は、他のマイクロ流体デバイス、細胞ベースのマイクロアレイ、マイクロタイタープレートベースのスクリーニングアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、並びにリソグラフィベースのマイクロアレイ及びナノウェル支援細胞パターニングプラットフォームを含むビーズカプセル化技術を使用する液滴ベースのスクリーニング（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４（６）７０３（２００６）；及びＯｚｋｕｍｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｖｉｅｗｓ，１１（３６），４６４３－４６５０（２０１５））に使用することができる方法及び試薬を提供する。
【0023】
細胞株開発キャンペーンには、増殖され、所望の治療用生物製剤の分泌を評価される何千もの単一前駆細胞株が含まれる。Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔ Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォームは、ユーザが単一のナノ流体チップ上で最大１７５８個のクローン細胞株を同時に培養し、アッセイし、増殖させることを可能にする完全に統合されたナノ流体細胞培養システムである。本明細書に記載されるように、一実施形態では、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォームは、細胞株開発（ＣＬＤ）操作を進め、単一細胞レベルでの増殖及び所望の分泌プロファイルの評価を可能にする。これにより、標準的なアッセイを使用して生産スケール及びスクリーニングに何千もの候補をスケールアップする必要なしに、高品質クローンを選択することができる。オンチップ分泌評価のために、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ＬｉｇｈｔｓはヒトＦｃドメイン又はヒトカッパ軽鎖ドメインにそれぞれ結合するＳｐｏｔｌｉｇｈｔＴＭＨｕ３及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔヒトカッパアッセイ試薬を開発したが、このアプローチは組換えタンパク質治療薬のサブセットにのみ適用される。したがって、本開示は、一実施形態において、カノニカル二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどのＣＤ３バインダーによって特異的に認識されるフルオロフォアコンジュゲートペプチドを利用するオンチップ拡散ベースのアッセイを提供し、ナノ流体チップ上の高分泌クローンの識別を可能にする。本明細書に開示されるように、アッセイは、様々なＣＤ３結合剤を検出するための特異性を提供する。さらに、別の実施形態では、本開示は、２つの蛍光プローブを使用して組換えタンパク質分泌を検出し、標準的な拡散勾配アッセイの感度を高めることを可能にするデュアルターゲティングアッセイ戦略を提供する。
【0024】
一実施形態では、本開示は、ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する細胞集団から少なくとも１つの細胞を単離するための方法を提供する。「少なくとも１つ」という語句は、本明細書で使用される場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、数千個もの個々の細胞が単離され、アッセイされる。例えば、いくつかの実施形態では、約１０個、１００個、１，０００個、５，０００個、６，０００個、７，０００個、８，０００個、９，０００個、１０，０００個又は１１，０００個若しくはそれ以上の細胞が単離される。いくつかの実施形態では、ナノ流体チップは、単離すべきこれまで以上の数の個々の細胞、例えば、最大８５，０００個又は２５０，０００個の個々の細胞を収容することができる。一実施形態では、１７５８個の細胞がナノ流体チップ上で単離される。一実施形態では、「細胞の集団」は、単一細胞株の細胞の集団である。本開示の一実施形態では、単一細胞株をクローニングすることができる。他の実施形態では、細胞の集団は、細胞株の混合物（例えば、２つ以上）（例えば、細胞の混合集団）由来である。
【0025】
本明細書で提供される生体分子は、ＣＤ３タンパク質又はＣＤ３ペプチドに結合することができる。一実施形態では、本明細書に記載のＣＤ３タンパク質及びＣＤ３ペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６に対応する。（本明細書で企図されるＣＤ３のさらなる情報及び配列については、Ｃｌｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５，８１５６－８１６０（１９８８）及びＢｏｒｒｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３，（１），２５－３１（１９９９）も参照されたい）。ＣＤ３ペプチドには、本明細書に記載の方法における結合を促進するのに十分な内因性ヒトＣＤ３イプシロンタンパク質の一部が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ペプチドは、完全長ＣＤ３アミノ酸配列の５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個若しくはそれ以上の連続するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ペプチドは、完全長ＣＤ３アミノ酸配列の９個、１０個、１１個、１２個、１３個又は１４個の連続するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ペプチドアミノ酸配列は、修飾されていてもよい（例えば、置換、欠失及び／若しくは挿入変異を含んでもよく、且つ／又は化学修飾を含んでもよい）。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ペプチドアミノ酸配列は、一方又は両方の末端に担体タンパク質を含むように修飾されていてもよい。本明細書に記載されるように、ペプチドは、任意選択により、ピログルタミン酸に合成的にコンジュゲートさせることができる。別の実施形態では、化学修飾を容易にするために、１つ又は複数のシステイン（Ｃ）残基を、内部又は１つ若しくは複数のペプチド末端に付加してもよい。例として、ＣＤ３ペプチドは、配列ＤＧＮＥＥＭＧＧＣ（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端システイン及び／又はフルオロフォア部分の付加は、ペプチドの溶解度を改善する。例えば、未修飾のペプチド単独は不溶性であり得るが、システインの付加は、フルオロフォアコンジュゲーションを可能にし、溶解度を増加させ得る。
【0026】
したがって、本明細書に記載されるように、ＣＤ３ペプチドは、以下の配列又は以下の配列の部分（ＣＤ３εの最初の２７個のＮ末端アミノ酸）に対する修飾（例えば、以下に限定されないが、１つ又は複数の置換、欠失及び／若しくは挿入変異、並びに／又はタグ若しくは化学修飾）を含んでもよい：ＱＤＧＮＥ ＥＭＧＧＩ ＴＱＴＰＹ ＫＶＳＩＳ ＧＴＴＶＩ ＬＴ（配列番号２）。
【0027】
ＣＤ３ペプチドへのフルオロフォアなどのレポーター分子のコンジュゲーションもまた、本開示によって企図される。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、コンジュゲートペプチドを溶解性にするために、荷電又は高度に荷電される。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、硫酸基と交換されたカルボキシ基を有し、したがって、低いｐＨでも高い溶解度を有する。いくつかの実施形態では、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素又はＡｍｅｒｓｈａｍＴＭＣｙＤｙｅＴＭフルオール又はＶｉｖｏＴａｇ（登録商標）蛍光色素（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）又はＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）蛍光色素が、本明細書に記載の方法において使用される。例として、ペプチドは、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、例えばＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７にコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態では、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、クマリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ、ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙａｎｉｎｅ５．５、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、及び／又はテキサスレッド（それぞれＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）が本明細書において企図される。
【0028】
いくつかの実施形態では、ＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８又はＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４は、マレイミド媒介化学によってペプチドにコンジュゲートされる。
【0029】
他の実施形態では、本開示によるペプチドは、以下の例示的な技術の１つ以上を使用して修飾され得る：クリックケミストリー、ペプチド合成中の化学的に活性化されたフルオロフォアの包含による直接的なコンジュゲーション、ペプチド合成中に使用される人工アミノ酸へのフルオロフォアの共有結合、及び／又はＮ末端リシンの付加。
【0030】
本明細書に記載されるように、一実施形態では、本開示によって提供される組成物及び方法は、ＣＤ３タンパク質又はＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子の識別を可能にする。関連する実施形態では、生体分子は、ＣＤ３タンパク質又はＣＤ３ペプチドと本明細書に記載の抗原標的とを結合することができる二重特異性生体分子である。
【0031】
本明細書で使用される場合、「生体分子」という用語は、本明細書に記載されるＣＤ３ペプチドなどの結合試薬に結合することができる細胞によって産生される分子を指す。本開示の様々な実施形態による生体分子としては、抗体、ペプチボディ、融合タンパク質、ムテイン、多重特異性タンパク質、二重特異性タンパク質、並びにその生物学的に活性な断片、類似体、誘導体及びバリアント、並びにそれらのバイオシミラーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0032】
「多重特異性タンパク質」及び「多重特異性抗体」は、本明細書では、少なくとも２つの異なる抗原又は同じ抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに特異的に同時に結合し、中和し、且つ／又は相互作用するように組換え改変されているタンパク質を指すために使用される。例えば、多重特異性タンパク質は、標的化細胞傷害性薬剤と組み合わせて免疫エフェクターを腫瘍又は感染性因子に標的化するように改変され得る。本明細書において「二重特異性タンパク質」及び「二重特異性抗体」と称される、２つの抗原に結合する多重特異性タンパク質は、多重特異性タンパク質の最も一般的で且つ多様な群である。二重特異性抗体を含む二重特異性タンパク質のフォーマットとしては、クアドローマ、ノブ・イン・ホール、交差－Ｍａｂ、二重可変ドメインＩｇＧ（ＤＶＤ－ＩｇＧ）、ＩｇＧ－一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、半分子交換、κλ－ボディ、タンデム型ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃダイアボディ）、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、タンデム型ダイアボディ、ｓｃダイアボディ－ＨＡＳ、タンデム型ｓｃＦｖ－毒素、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ナノボディ、ナノボディ－ＨＳＡ、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）、鎖交換改変ドメインＳＥＥＤボディ、Ｔｒｉｏｍａｂ、ロイシンジッパー（ＬＵＺ－Ｙ）、Ｆａｂ－アーム交換、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、荷電対、Ｆｃａｂ、直交性Ｆａｂ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦＶ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦＶ、ＩｇＧ（Ｌ１Ｈ１）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦＶ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ、ＤＶＩ－Ｉｇ４（４－ｉｎ－１）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦＶ、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、イントラボディ、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳＡＢｏｄｙ、ＩｇＧ－ＩｇＧ、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２、ＸｍＡｂ（登録商標）技術を用いて作られた分子、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））及び半減期が延長された二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標））（Ｆａｎ 上記；Ｓｐｉｅｓｓ 上記；Ｓｅｄｙｋｈ 上記；Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６（６）４５８－６７，２０１０；Ｓｈｕｌｋａ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２６ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，ｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｃａｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｗｅ Ｇｏｔｔｓｗｃｈａｌｋ ｅｄｉｔｏｒ，ｐ５５９－５９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２０１７；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ３：６，５４６－５５７，２０１１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
多重特異性タンパク質にはまた、複数の標的に結合できる三重特異性抗体、四価二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディなどの抗体成分を伴わない多重特異性タンパク質、ミニボディ、及び一本鎖タンパク質などが含まれる。Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（１９９７）１５９－１６３。
【0034】
いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質には、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、ソリトマブ、ｔａｒｇｏｍｉＲ、ルチキズマブ（ＡＢＴ９８１）、バヌシズマブ（ＲＧ７２２１）、メムトルマブ（ＡＢＴ１２２）、オゾラリズマブ（ＡＴＮ１０３）、フロテツズマブ（ＭＧＤ００６）、パソツキシズマブ（ＡＭＧ１１２、ＭＴ１１２）、ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ（ＦＢＴＡ０５）、（ＡＴＮ－１０３）、ＡＭＧ２１１（ＭＴ１１１、Ｍｅｄｉ－１５６５）、ＡＭＧ３３０、ＡＭＧ４２０（Ｂ１８３６９０９）、ＡＭＧ－１１０（ＭＴ１１０）、ＭＤＸ－４４７、ＴＦ２、ｒＭ２８、ＨＥＲ２Ｂｉ－ａＡＴＣ、ＧＤ２Ｂｉ－ａＡＴＣ、ＭＧＤ００６、ＭＧＤ００７、ＭＧＤ００９、ＭＧＤ０１０、ＭＧＤ０１１（ＪＮＪ６４０５２７８１）、ＩＭＣｇｐ１００、インジウム標識ＩＭＰ－２０５、ｘｍ７３４、ＬＹ３１６４５３０、ＯＭＰ－３０５ＢＢ３、ＲＥＧＮ１９７９、ＣＯＶ３２２、ＡＢＴ１１２、ＡＢＴ１６５、ＲＧ－６０１３（ＡＣＥ９１０）、ＲＧ７５９７（ＭＥＤＨ７９４５Ａ）、ＲＧ７８０２、ＲＧ７８１３（ＲＯ６８９５８８２）、ＲＧ７３８６、ＢＩＴＳ７２０１Ａ（ＲＧ７９９０）、ＲＧ７７１６、ＢＦＫＦ８４８８Ａ（ＲＧ７９９２）、ＭＣＬＡ－１２８、ＭＭ－１１１、ＭＭ１４１、ＭＯＲ２０９／ＥＳ４１４、ＭＳＢ００１０８４１、ＡＬＸ－００６１、ＡＬＸ０７６１、ＡＬＸ０１４１；ＢＩＩ０３４０２０、ＡＦＭ１３、ＡＦＭ１１、ＳＡＲ１５６５９７、ＦＢＴＡ０５、ＰＦ０６６７１００８、ＧＳＫ２４３４７３５、ＭＥＤＩ３９０２、ＭＥＤＩ０７００、ＭＥＤＩ７３５２、並びにそれらの分子又はバリアント若しくはアナログ及び上記のいずれかのバイオシミラーが含まれ得る。
【0035】
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な誘導体」又は「生物学的に活性なバリアント」には、結合特性などの前記分子の実質的に同じ機能的及び／若しくは生物学的特性、並びに／又はペプチド骨格若しくは塩基性ポリマー単位などの同じ構造基盤を有する分子の任意の誘導体又はバリアントが含まれる。
【0036】
「バリアント」又は「誘導体」などの「アナログ」は、構造が実質的に類似し、場合によって程度は相違するが、天然に存在する分子と同じ生物学的活性を有する化合物である。例えば、ポリペプチドバリアントは実質的に類似の構造を共有し、参照ポリペプチドと同じ生物学的活性を有するポリペプチドを指す。バリアント又はアナログは、それらのアミノ酸配列の組成が、（ｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端における１つ以上のアミノ酸残基及び／又は天然に存在するポリペプチド配列の１つ以上の内部領域の欠失（例えば、断片）、（ｉｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端における１つ以上のアミノ酸の挿入若しくは付加（典型的には「付加」若しくは「融合」）、及び／又は天然に存在するポリペプチド配列の１つ以上の内部領域の挿入又は付加（典型的には「挿入」）、或いは（ｉｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列における１つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含む１つ以上の変異に基づいて、アナログが由来する天然に存在するポリペプチドと比較して異なっている。例として、「誘導体」は、アナログの１つのタイプであり、例えば化学的に修飾された参照ポリペプチドと同じか又は実質的に類似した構造を共有するポリペプチドを指す。
【0037】
バリアントポリペプチドは、アナログポリペプチドの１つのタイプであり、１つ以上のアミノ酸残基が本発明の生体分子アミノ酸配列に付加される挿入バリアントが含まれる。挿入は、タンパク質の一方若しくは両方の末端に位置してもよく、且つ／又は治療用タンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置してもよい。一方又は両方の末端にさらなる残基を有する挿入バリアントとしては、例えば、融合タンパク質及びアミノ酸タグ又は他のアミノ酸標識を含むタンパク質が挙げられる。一態様では、生体分子は、任意選択により、特に分子がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞において組換えにより発現される場合、Ｎ末端Ｍｅｔを含有する。別の態様では、生体分子に、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）が含まれる。
【0038】
欠失バリアントでは、本明細書に記載の生体分子ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基が除去される。欠失は、治療用タンパク質ポリペプチドの一方又は両方の末端で、且つ／又は治療用タンパク質アミノ酸配列内の１つ以上の残基の除去によって行うことができる。したがって、欠失バリアントには、治療用タンパク質ポリペプチド配列の断片が含まれる。
【0039】
置換バリアントにおいては、生体分子の１つ以上のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置換される。一態様では、置換は本質的に保存的であり、このタイプの保存的置換は当該技術分野でよく知られている。或いは、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。例示的な保存的置換は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒの［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１－７７］に記載されており、すぐ下に記載する。
【0040】
本明細書で使用される際、「特異的に結合する」は、「抗原特異的」であるか、抗原標的「に対して特異的」であるか、又は抗原と「免疫反応性」である生体分子は、同様の配列の他の抗原より高い親和性で抗原に結合する生体分子を指す。一態様では、生体分子、又はその断片、バリアント若しくは誘導体は、ヒト抗原に対し、他の、すなわち非ヒト種の同様の抗原に対する結合親和性と比較してより高い親和性で結合するが、標的のオルソログを認識し、結合するポリペプチド結合剤は、本発明の範囲内にある。
【0041】
「エピトープ」という用語は、生体分子によって認識され、結合することができる任意の分子の部分を指す。エピトープは、通常、アミノ酸又は炭水化物側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。本明細書において使用されるエピトープは、連続的又は非連続的であり得る。
【0042】
本明細書において企図される生体分子には、完全長タンパク質、完全長タンパク質の前駆体、完全長タンパク質の生物学的に活性なサブユニット又は断片、並びにこれらの形態の治療用タンパク質のいずれかの生物学的に活性な誘導体及びバリアントが含まれる。したがって、生体分子には、（１）参照核酸によってコードされるポリペプチド又は本明細書に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約２５、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００又はそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％若しくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するものが含まれる。本開示によれば、用語「組換え生体分子」には、組換えＤＮＡ技術により得られた任意の生体分子が含まれる。特定の実施形態では、この用語は本明細書に記載のタンパク質を包含する。
【0043】
いくつかの実施形態では、目的の生体分子は、ＣＤ３タンパク質若しくはペプチド、並びに１つ以上の他のタンパク質、例えばＨＥＲ受容体ファミリータンパク質、ＣＤタンパク質、細胞接着分子、成長因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーム成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子、骨誘導性因子、インスリン及びインスリン関連タンパク質、凝固及び凝固関連タンパク質、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、他の血液及び血清タンパク質血液型抗原；受容体、受容体関連タンパク質、成長ホルモン、成長ホルモン受容体、Ｔ細胞受容体；神経栄養因子、ニューロトロフィン、リラキシン、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス抗原、リポタンパク質、インテグリン、リウマチ因子、免疫毒素、表面膜タンパク質、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質及びイムノアドヘシンに特異的に結合し、中和し、且つ／又は相互作用する。
【0044】
いくつかの実施形態では、目的の生体分子は、単独で又は任意の組み合わせで、ＣＤ３タンパク質及び以下の１つ以上に結合し、中和し、且つ／又は相互作用する：ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１及びＣＤ１７４を含むがこれらに限定されないＣＤタンパク質、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４を含むＨＥＲ受容体ファミリータンパク質、ＥＧＦ受容体であるＥＧＦＲｖＩＩＩ、細胞接着分子、例えばＬＦＡ－１、Ｍｏｌ、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、アルファｖ／ベータ３インテグリン、例えば血管内皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）を含むがこれらに限定されない成長因子；ＶＥＧＦＲ２、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ミュラー抑制物質、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＮＧＦ－ベータなどの神経成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦを含む線維芽細胞成長因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、クリプト、数ある中でも、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、又はＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－α及びＴＧＦ－βを含むトランスフォーム成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳内ＩＧＦ－Ｉ）及び骨形成促進因子、インスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン及びインスリン様成長因子結合タンパク質を含むがこれらに限定されないインスリン及びインスリン関連タンパク質、数ある中でも、第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォンウィルブランド因子などの凝固及び凝固関連タンパク質、プロテインＣ、アルファ－１－アンチトリプシン、ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲンアクチベーター（「ｔ－ＰＡ」）などのプラスミノーゲンアクチベーター、ボンバジン、トロンビン、トロンボポエチン及びトロンボポエチン受容体、数ある中でも、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ及びＧ－ＣＳＦを含むコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アルブミン、ＩｇＥ、及び血液型抗原を含むがこれらに限定されない他の血液及び血清タンパク質、例えば、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、成長ホルモン受容体及びＴ細胞受容体を含む受容体及び受容体関連タンパク質、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びニューロトロフィン－３、－４、－５又は－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５又はＮＴ－６）を含むがこれらに限定されない神経栄養因子；リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、及びプロレラキシン、例えばインターフェロン－アルファ、－ベータ及び－ガンマを含むインターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ－１～ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ１－Ｒ１、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－４受容体及び／又はＩＬ－１３から受容体であるＩＬ－１３ＲＡ２、又はＩＬ－１７受容体であるＩＬ－１ＲＡＰ；ＡＩＤＳエンベロープウイルス抗原、リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータを含むがこれらに限定されないウイルス抗原、エンケファリナーゼ、ＢＣＭＡ、ＳＴＥＡＰ１、ＩｇＫａｐｐａ、ＲＯＲ－１、ＥＲＢＢ２、メソセリン、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、Ｄｎａｓｅ、ＦＲ－アルファ、インヒビン及びアクチビン、インテグリン、プロテインＡ又はＤ、リウマチ因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシドディスムターゼ、表面膜タンパク質、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送タンパク質、ホーミング受容体、ＭＩＣ（ＭＩＣ－ａ、ＭＩＣ－Ｂ）、ＵＬＢＰ １－６、ＥＰＣＡＭ、アドレシン、制御タンパク質、イムノアドヘシン、抗原結合タンパク質、ソマトロピン、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ４、エオタキシン－１、ＭＵＣ１、ＣＥＡ、ｃ－ＭＥＴ、クローディン－１８、ＧＰＣ－３、ＥＰＨＡ２、ＦＰＡ、ＬＭＰ１、ＭＧ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣＡ、ガングリオシドＧＤ２、グラングリオシドＧＭ２、ＢＡＦＦ、ＯＰＧＬ（ＲＡＮＫＬ）、ミオスタチン、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１（ＤＫＫ－１）、Ａｎｇ２、ＮＧＦ、ＩＧＦ－１受容体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ｃ－Ｋｉｔ、Ｂ７ＲＰ－１、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄ－１、プログラムされた細胞死タンパク質１及びリガンド、ＰＤ１及びＰＤＬ１、マンノース受容体／ｈＣＧβ、ＴＮＦ、ＴＬ１Ａ、Ｃ型肝炎ウイルス、メソセリンｄｓＦｖ［ＰＥ３８コンジュゲート、レジオネラニューモフィラ（ｌｌｙ）、ＩＦＮガンマ、インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＩＦＮＡＲ、ＴＡＬＬ－１、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、幹細胞因子、Ｆｌｔ－３、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、ＯＸ４０Ｌ、α４β７、血小板特異的（血小板糖タンパクＩｉｂ／ＩＩＩｂ（ＰＡＣ－１）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＦＧβ）、透明帯精子結合タンパク質３（ＺＰ－３）、ＴＷＥＡＫ、血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲα）、スクレロスチン、並びに前記のいずれかの生物活性断片又はバリアント。
【0045】
いくつかの実施形態では、生体分子には、二重特異性タンパク質、特にＣＤ１９、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＣＤＨ３、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤ７０、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＢＣＭＡ、Ｈｅｒ２、及びＣＤ２０と組み合わせてＣＤ３に特異的に結合するＢｉＴＥ（登録商標）分子、及びＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）分子が含まれる。
【0046】
本開示はまた、それぞれが本明細書に記載される異なる結合試薬を含む２つ以上の組成物を使用する組成物及び方法を企図する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ペプチドを含む第１の組成物が、目的の生体分子の異なる部分又はエピトープに結合する結合剤を含む１つ又は複数の組成物と組み合わせて使用される。ここで、結合剤は、（異なる）フルオロフォアにコンジュゲートされるか、又は本明細書に記載されるように他の方法で修飾され得る。様々な実施形態において、ＣＤ３ペプチドに加えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０若しくはそれ以上の結合剤が、本明細書に記載の方法において使用される。
【0047】
本明細書で使用される場合、「細胞」は、様々な実施形態において、真核細胞、原核細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、単核細胞、末梢血単核細胞、骨髄由来単核細胞、臍帯血由来単核細胞、リンパ球、単球、樹状細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、多能性胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、又は植物細胞であり得る。さらなる例示的な細胞株としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶｌ株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞、又は懸濁培養での増殖用にサブクローン化された２９３細胞、（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶｌ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞、ヒト肝臓（ＨｕＨ－７）細胞、ＣＥＶＥＣの羊膜細胞産生（ＣＡＰ）細胞、ハイブリッド腎臓及びＢ細胞（ＨＫＢ－１１）、線維肉腫（ＨＴ－１０８０）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒト胚性網膜（ＰＥＲ．Ｃ６）細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びに臨床的及び／又は商業的製造に使用される任意の他の細胞が挙げられる。一実施形態では、細胞又は細胞株は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり得る。
【0048】
本明細書で使用される場合、「ナノ流体チップのナノ流体チャンバー」は、単一の細胞を単離することができるナノ流体デバイスの一部又は一セクションを指す。例として、ナノ流体チャンバーは、本明細書に記載されるＢｅｒｋｅｌｅｙ ＬｉｇｈｔのＢｅａｃｏｎ（登録商標）技術プラットフォームに関連であり得る。いくつかの実施形態では、ナノ流体チップ又はデバイスは、各々が単一の細胞を単離することができる数百又は数千の個々のペン又はチャンバーを含む。いくつかの実施形態では、ナノ流体デバイス又はチップは、１７５８個のチャンバー（又はペン又はウェル）、３，５００個のチャンバー又は１１，０００個のチャンバーを含む。
【0049】
さらなる単一細胞選別及び分析プラットフォームもまた、本開示の試薬及び材料とともに使用するために企図される。一実施形態では、リソグラフィベースのマイクロアレイ又はナノウェル支援細胞パターニングプラットフォーム（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４（６）７０３（２００６）；及びＯｚｋｕｍｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｖｉｅｗｓ，１１（３６），４６４３－４６５０（２０１５））が企図される。したがって、いくつかの実施形態では、ナノ流体デバイス又はチップは、１７５８個のチャンバー、８５，０００個又は２５０，０００個のチャンバーを含むことが、本明細書で企図される。
【0050】
本明細書で使用される場合、「発現コンストラクト」という用語は、タンパク質の組換え発現のために当該技術分野で日常的に使用されるベクター、プラスミド、又は線状化ＤＮＡ発現配列を指す。
【0051】
生体分子を産生するための方法もまた、本開示によって企図される。例えば、一実施形態では、ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子は、ナノ流体チップのナノ流体チャンバー内の細胞の集団から単一の細胞を収集することによって生成され、細胞は生体分子を発現することができる発現コンストラクトを含む。単一細胞を、クローン増殖並びに生体分子の発現及び分泌を可能にする条件下で培養した後、本明細書に記載のＣＤ３ペプチドを含む組成物を、ＣＤ３ペプチドが分泌された生体分子と接触することを可能にする条件下でナノ流体チップに投与する。次に、ＣＤ３ペプチドに結合することができる生体分子を分泌する少なくとも１つの細胞を単離し、生体分子の産生を可能にする条件下で培養するための容器に移す。様々な実施形態において、「容器」には、マルチウェルプレート、振盪フラスコ、スピンチューブ、ローラーボトル、ガス透過性培養バッグ、ガス透過性バイオリアクター、ガス不透過性バイオリアクター、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、及び所望の生産レベルに適した大きさの撹拌タンクバイオリアクターを含む、細胞培養に適した容器が含まれ得る。
【0052】
本発明をさらに説明する前に、本発明は、説明されている特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら多様であり得ることを理解しなればならない。また、本明細書で使用されている用語法は、特定の実施形態を説明することだけを目的とするものであって、限定することを意図していないことも理解しなければならず、なぜならば、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
【0053】
値の範囲が記載されている場合には、この範囲の上限と下限との間の介在値（別途文脈が明確に示す場合を除き、下限の単位の１０分の１まで）、及びこの指定された範囲のあらゆる他の指定の又は介在する値は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、この小さい範囲に含まれ得、またこの指定された範囲で具体的に排除された任意の制限を条件として、本発明に包含される。指定された範囲が、限界の一方又は両方を含む場合には、含まれているこれらの限界の一方又は両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
【0054】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されているものと類似の又は同等のあらゆる方法及び材料もまた、本発明の実施又は試験で使用し得るが、好ましい方法及び材料を本明細書で説明する。本明細書で言及されている全ての刊行物は、この刊行物の引用に関連する方法及び／又は材料を開示して説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【0055】
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、別途文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。そのため、例えば、「コンフォメーションスイッチングプローブ」への言及は、複数のそのようなコンフォメーションスイッチングプローブを含み、「マイクロ流体デバイス」への言及は、１つ又は複数のマイクロ流体デバイス及び当業者に既知のその等価物への言及を含み、以下同様である。さらに、特許請求の範囲が、任意の要素、例えば任意の任意選択的要素を除くように書かれている可能性があることにも留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙又は「消極的」限定の使用に関連して、「だけ」、「のみ」などのそのような排他的用語法を使用するための先行詞として役立つことが意図されている。
【0056】
本開示を読む際に当業者には明らかであるように、本明細書で説明され、例示されている個別の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか又は特徴と容易に組み合わされ得る別個の成分及び特徴を有している。任意の列挙された方法を、列挙された事象の順に、又は論理的に可能である任意の他の順に実行し得る。これには、そのような組み合わせの全てを支持することが意図されている。
【実施例】
【0057】
以下の実施例１に関連して、以下の材料及び方法を使用した。
【0058】
ＣＤ３ペプチド蛍光色素コンジュゲートの設計及び合成
天然のヒトＣＤ３ｅペプチドアミノ酸配列のｎ末端の最初の９個のアミノ酸を使用した（使用したＣＤ３ペプチド配列：ＱＤＧＮＥＥＭＧＧ（配列番号１））。ペプチドをＭｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ、Ｐｌａｎｅｇｇ、Ｇｅｒｍａｎｙで合成し、以下の修飾を含めた：Ｎ末端グルタミン（Ｑ）をピログルタミン酸に変換し、ペプチドのＣ末端にシステインを付加し、Ｃ末端をアミド化した。合成したペプチドを、８５％の水、１０％のジメチルホルムアミドＤＭＦ、５％のアセトニトリルの混合物に溶解した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｃ５ ４８８マレイミドをＤＭＦに溶解した。溶解したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｃ５ ４８８ マレイミド蛍光色素を、蛍光色素２対ペプチド１のモル比で添加した。反応容器を暗所において室温で１時間混合することによってインキュベーションを行った。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ１０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＡｅｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続し、５％のＤＭＳＯを含むリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳからなる緩衝液で０．５ｍｌ／分の流速で平衡化した。検出は、２８０ｎｍ及び４９０ｎｍの波長でのオンライン光吸収に設定した。１ｍｌの反応混合物を、接続された試料ループに注入し、カラムに適用し、その後、０．５ｍｌ／分のフローを使用して定組成溶出を行った。接続されたフラクションコレクターを用いて、溶出量を０．５ｍｌサイズのフラクションに集めた。コンジュゲートしたペプチド－蛍光色素を含有する最初の溶出ピークをプールし、アリコートした。
天然のヒトＣＤ３ｅペプチドアミノ酸配列のｎ末端の最初の９個のアミノ酸を使用した（使用したＣＤ３ペプチド配列：ＱＤＧＮＥＥＭＧＧ（配列番号１））。ペプチドをＭｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ、Ｐｌａｎｅｇｇ、Ｇｅｒｍａｎｙで合成し、以下の修飾を含めた：Ｎ末端グルタミン（Ｑ）をピログルタミン酸に変換し、ペプチドのＣ末端にシステインを付加し、Ｃ末端をアミド化した。合成したペプチドを、８５％の水、１０％のジメチルホルムアミドＤＭＦ、５％のアセトニトリルの混合物に溶解した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｃ５ ４８８マレイミドをＤＭＦに溶解した。溶解したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｃ５ ４８８ マレイミド蛍光色素を、蛍光色素２対ペプチド１のモル比で添加した。反応容器を暗所において室温で１時間混合することによってインキュベーションを行った。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ１０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＡｅｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続し、５％のＤＭＳＯを含むリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳからなる緩衝液で０．５ｍｌ／分の流速で平衡化した。検出は、２８０ｎｍ及び４９０ｎｍの波長でのオンライン光吸収に設定した。１ｍｌの反応混合物を、接続された試料ループに注入し、カラムに適用し、その後、０．５ｍｌ／分のフローを使用して定組成溶出を行った。接続されたフラクションコレクターを用いて、溶出量を０．５ｍｌサイズのフラクションに集めた。コンジュゲートしたペプチド－蛍光色素を含有する最初の溶出ピークをプールし、アリコートした。
【0059】
細胞培養上清中のカノニカルＢｉＴＥ（登録商標）の検出
ヒトＣＤ３ｅ結合バインダーを特徴とする発現ＢｉＴＥ（登録商標）コンストラクトを含有する０．２μｍ濾過哺乳動物細胞培養試料１００μｌを、２．５μｌのペプチド－蛍光色素コンジュゲートと混合し、オートサンプラーバイアルに移した。バイアルを、蛍光検出器を特徴とする超高速液体クロマトグラフィーＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ装置（Ｗａｔｅｒｓ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続されたオートサンプラー上に置いた。分析用サイズ排除クロマトグラフィーＢＥＨ２００ ＳＥＣの１．７μｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＵＨＰＬＣに接続し、ｐＨ７．０に調整した１０ｍＭクエン酸、７５ｍＭリシンＨＣｌを含有する水性緩衝系で平衡化した。調製した各試料１０μｌをカラムに適用し、定組成溶出により溶出させた。励起波長４９０ｎｍ及び発光波長５２０ｎｍでの蛍光検出を用いて検出を行った。評価は、精製された単量体及び二量体のカノニカルＢｉＴＥ（登録商標）コンストラクトの注入から得られたクロマトグラムにおける溶出時間を、異なるカノニカルＢｉＴＥ（登録商標）種の溶出時間を基準として比較することによって行った。
ヒトＣＤ３ｅ結合バインダーを特徴とする発現ＢｉＴＥ（登録商標）コンストラクトを含有する０．２μｍ濾過哺乳動物細胞培養試料１００μｌを、２．５μｌのペプチド－蛍光色素コンジュゲートと混合し、オートサンプラーバイアルに移した。バイアルを、蛍光検出器を特徴とする超高速液体クロマトグラフィーＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ装置（Ｗａｔｅｒｓ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続されたオートサンプラー上に置いた。分析用サイズ排除クロマトグラフィーＢＥＨ２００ ＳＥＣの１．７μｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＵＨＰＬＣに接続し、ｐＨ７．０に調整した１０ｍＭクエン酸、７５ｍＭリシンＨＣｌを含有する水性緩衝系で平衡化した。調製した各試料１０μｌをカラムに適用し、定組成溶出により溶出させた。励起波長４９０ｎｍ及び発光波長５２０ｎｍでの蛍光検出を用いて検出を行った。評価は、精製された単量体及び二量体のカノニカルＢｉＴＥ（登録商標）コンストラクトの注入から得られたクロマトグラムにおける溶出時間を、異なるカノニカルＢｉＴＥ（登録商標）種の溶出時間を基準として比較することによって行った。
【0060】
Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）機器を使用した細胞クローニング
単一細胞クローニング法を、以前に記載された手順に従って実施した。（Ｌｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１８；３４（６）：１４３８－１４４６；及びＬｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０２０；１５（１）：ｅ１９００２４７）。簡潔に記載すると、安定な細胞株を、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）機器を使用し、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡによって提供されている標準的な細胞株開発ワークフローを利用して、ＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔチップ（Ｄｅｓｉｇｎ １７５８、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）上に単一細胞でロードした。細胞を、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォームに組み込まれた一体型４×対物レンズ及びカメラを使用して、細胞増殖をモニターする画像化に供した。独自の増殖培地及び製造業者が推奨する設定を用いて、細胞を潅流培養に供した。
単一細胞クローニング法を、以前に記載された手順に従って実施した。（Ｌｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１８；３４（６）：１４３８－１４４６；及びＬｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０２０；１５（１）：ｅ１９００２４７）。簡潔に記載すると、安定な細胞株を、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）機器を使用し、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡによって提供されている標準的な細胞株開発ワークフローを利用して、ＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔチップ（Ｄｅｓｉｇｎ １７５８、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）上に単一細胞でロードした。細胞を、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォームに組み込まれた一体型４×対物レンズ及びカメラを使用して、細胞増殖をモニターする画像化に供した。独自の増殖培地及び製造業者が推奨する設定を用いて、細胞を潅流培養に供した。
【0061】
Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ
Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３分泌アッセイは、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓによって提供されたＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ用試薬を使用して実施し、試薬は製造業者によって推奨される濃度で使用した。アッセイワークフローは、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ Ｉｎｃによって確立された推奨に従って実行した。図４Ｂにおいて、アッセイデータは、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォームに統合されたＢｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ ＣＡＳソフトウェアによって空のペンについて計算された平均Ａｕスコアに対して手作業で正規化した。
Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３分泌アッセイは、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓによって提供されたＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ用試薬を使用して実施し、試薬は製造業者によって推奨される濃度で使用した。アッセイワークフローは、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ Ｉｎｃによって確立された推奨に従って実行した。図４Ｂにおいて、アッセイデータは、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォームに統合されたＢｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ ＣＡＳソフトウェアによって空のペンについて計算された平均Ａｕスコアに対して手作業で正規化した。
【0062】
ＣＤ３拡散アッセイ
ＣＤ３拡散アッセイペプチド試薬をＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、長期保存のために－２０℃で光から保護して保存した。短期保存のために、アッセイ試薬をＰＢＳ中、４μｇ／ｍｌにさらに希釈し、４℃で保存した。ナノ流体チップ上のＢｉＴＥ（登録商標）分泌を検出するために拡散勾配アッセイを実施する前に、ＣＤ３拡散アッセイ試薬を細胞培養培地中、０．２μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、２２μｍフィルターを通して濾過し、９６ウェルプレートに移し、チップに入れた。アッセイ試薬を、４５分間、０．０１４μｌ／秒の流量でチップ上に潅流した。図４において、平衡化工程が完了したところで、アッセイ試薬を２５０μｌの細胞培養培地で２μｌ／秒の流量で洗い流し、続いて細胞培養培地で０．１６６７μｌ／秒の流量で２０分間さらに洗い流した。次いで、９００ｍｓの露光時間及び１００％の照明設定を使用して、ＴＲＥＤフィルタキューブを通してチップを撮像した。
ＣＤ３拡散アッセイペプチド試薬をＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、長期保存のために－２０℃で光から保護して保存した。短期保存のために、アッセイ試薬をＰＢＳ中、４μｇ／ｍｌにさらに希釈し、４℃で保存した。ナノ流体チップ上のＢｉＴＥ（登録商標）分泌を検出するために拡散勾配アッセイを実施する前に、ＣＤ３拡散アッセイ試薬を細胞培養培地中、０．２μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、２２μｍフィルターを通して濾過し、９６ウェルプレートに移し、チップに入れた。アッセイ試薬を、４５分間、０．０１４μｌ／秒の流量でチップ上に潅流した。図４において、平衡化工程が完了したところで、アッセイ試薬を２５０μｌの細胞培養培地で２μｌ／秒の流量で洗い流し、続いて細胞培養培地で０．１６６７μｌ／秒の流量で２０分間さらに洗い流した。次いで、９００ｍｓの露光時間及び１００％の照明設定を使用して、ＴＲＥＤフィルタキューブを通してチップを撮像した。
【0063】
図２において、ＣＤ３拡散アッセイ試薬を０．１２５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。図２及び３において、平衡化工程が完了したところで、アッセイ試薬を５００μｌの細胞培養培地で２μｌ／秒の流量で洗い流し、続いて細胞培養培地で０．１６６７μｌ／秒の流量で２４分間さらに洗い流した。次いで、１０００ｍｓ（図２）又は７５０ｍｓ（図３）の露光時間、及び１００％の照明設定を使用して、ＴＲＥＤフィルタキューブを通してチップを撮像した。
【0064】
拡散勾配分析及びＡｕスコア正規化
図３及び４に示すＣＤ３拡散アッセイでは、チップ位置効果及びバックグラウンド蛍光シグナルに対してＣＤ３拡散アッセイスコアを正規化するために使用する参照画像を生成するために、参照アッセイを空のチップで実行した。参照データセット生成した後、ナノ流体チップに細胞をロードし、ＴＲＥＤフィルタキューブを９００ｍｓの露光時間及び１００％照明設定（図４）又は７５０ｍｓの露光時間及び１００％照明設定（図３）で使用した。ナノ流体チップにＣＤ３拡散アッセイ試薬を入れることによって、「バックグラウンド」画像シーケンスを事前に生成した。試薬をチップに入れ、拡散勾配アッセイの平衡化工程が完了した後に、「Ｆｌｕｏｒｅｆ」画像シーケンスを生成した。図４のデータでは、「ＤｉｆｆｕｓｉｏｎＲｅｆ」画像シーケンスは、拡散勾配アッセイのフラッシュ工程が完了した後に生成した。参照画像をＣＡＳソフトウェアによって使用して、バックグラウンド及びチップ位置効果に対して個々のペンごとにＣＤ３拡散アッセイスコアを正規化した。
図３及び４に示すＣＤ３拡散アッセイでは、チップ位置効果及びバックグラウンド蛍光シグナルに対してＣＤ３拡散アッセイスコアを正規化するために使用する参照画像を生成するために、参照アッセイを空のチップで実行した。参照データセット生成した後、ナノ流体チップに細胞をロードし、ＴＲＥＤフィルタキューブを９００ｍｓの露光時間及び１００％照明設定（図４）又は７５０ｍｓの露光時間及び１００％照明設定（図３）で使用した。ナノ流体チップにＣＤ３拡散アッセイ試薬を入れることによって、「バックグラウンド」画像シーケンスを事前に生成した。試薬をチップに入れ、拡散勾配アッセイの平衡化工程が完了した後に、「Ｆｌｕｏｒｅｆ」画像シーケンスを生成した。図４のデータでは、「ＤｉｆｆｕｓｉｏｎＲｅｆ」画像シーケンスは、拡散勾配アッセイのフラッシュ工程が完了した後に生成した。参照画像をＣＡＳソフトウェアによって使用して、バックグラウンド及びチップ位置効果に対して個々のペンごとにＣＤ３拡散アッセイスコアを正規化した。
【0065】
デュアルターゲティングアッセイ
ＣＤ３拡散アッセイ試薬をＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、長期保存のために－２０℃で光から保護して保存した。短期保存のために、アッセイ試薬をＰＢＳ中、４μｇ／ｍｌにさらに希釈し、４℃で保存した。拡散勾配アッセイを実施する前に、ＣＤ３拡散アッセイ試薬及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ試薬をそれぞれ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓによって推奨される細胞培養培地中０．２μｇ／ｍｌ濃度及び１×濃度に希釈した。次いで、アッセイ試薬を２２μｍフィルターを通して濾過し、９６ウェルプレートに移し、チップに入れた。アッセイ試薬を、４５分間、０．０１４μｌ／秒の流量でチップ上に潅流した。平衡化工程が完了したなら、アッセイ試薬を２５０μｌの細胞培養培地で２μｌ／秒の流量で洗い流し、続いて細胞培養培地で０．１６６７μｌ／秒の流量で２０分間さらに洗い流した。次いで、９００ｍｓの露光時間及び１００％の照明設定を使用して、ＴＲＥＤフィルタキューブを通してチップを撮像した。
ＣＤ３拡散アッセイ試薬をＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、長期保存のために－２０℃で光から保護して保存した。短期保存のために、アッセイ試薬をＰＢＳ中、４μｇ／ｍｌにさらに希釈し、４℃で保存した。拡散勾配アッセイを実施する前に、ＣＤ３拡散アッセイ試薬及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイ試薬をそれぞれ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓによって推奨される細胞培養培地中０．２μｇ／ｍｌ濃度及び１×濃度に希釈した。次いで、アッセイ試薬を２２μｍフィルターを通して濾過し、９６ウェルプレートに移し、チップに入れた。アッセイ試薬を、４５分間、０．０１４μｌ／秒の流量でチップ上に潅流した。平衡化工程が完了したなら、アッセイ試薬を２５０μｌの細胞培養培地で２μｌ／秒の流量で洗い流し、続いて細胞培養培地で０．１６６７μｌ／秒の流量で２０分間さらに洗い流した。次いで、９００ｍｓの露光時間及び１００％の照明設定を使用して、ＴＲＥＤフィルタキューブを通してチップを撮像した。
【0066】
拡散勾配分析及びＡｕスコア正規化
チップ位置効果及びバックグラウンド蛍光シグナルに対してデュアルターゲティングアッセイスコアを正規化するために使用する参照画像を生成するために、参照アッセイを空のチップで実行した。「バックグラウンド」、「Ｆｌｕｏｒｅｆ」及び「ＤｉｆｆｕｓｉｏｎＲｅｆ」を含む参照データセットを生成した後、ナノ流体チップに細胞をロードし、ＴＲＥＤフィルタキューブを９００ｍｓの露光時間及び１００％照明設定で使用した。測定領域に明るい蛍光物体が位置するペンは、アッセイ画像の目視検査時にアーチファクトとして識別された。
チップ位置効果及びバックグラウンド蛍光シグナルに対してデュアルターゲティングアッセイスコアを正規化するために使用する参照画像を生成するために、参照アッセイを空のチップで実行した。「バックグラウンド」、「Ｆｌｕｏｒｅｆ」及び「ＤｉｆｆｕｓｉｏｎＲｅｆ」を含む参照データセットを生成した後、ナノ流体チップに細胞をロードし、ＴＲＥＤフィルタキューブを９００ｍｓの露光時間及び１００％照明設定で使用した。測定領域に明るい蛍光物体が位置するペンは、アッセイ画像の目視検査時にアーチファクトとして識別された。
【0067】
１０日間のフェドバッチ生産
２４ディープウェルプレートを用い、１ウェル当たり３．５ｍＬの作業量でフェドバッチ実験を行い、細胞懸濁培養物を３６℃、５％ＣＯ２、８５％相対湿度でインキュベートした。生産培養物を、８×１０５細胞／ｍＬの標的細胞密度で接種し、１０日間培養し、その間、３、６、及び８日目にボーラス供給した。分析のため、０、３、６～１０日目にプロセス内試料を採取した。細胞数及び生存率を、Ｖｉ－ＣｅｌｌＢｌｕ細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて決定した。タンパク質力価は、プロテインＡアフィニティ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（プロテインＡ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）によって測定した。積算生存細胞密度（ＩＶＣＤ）を、培養時間に対するＶＣＤの台形公式によって計算した。比生産性（Ｑｐ）を、力価をＩＶＣＤ計算値で除すことによって決定した。
２４ディープウェルプレートを用い、１ウェル当たり３．５ｍＬの作業量でフェドバッチ実験を行い、細胞懸濁培養物を３６℃、５％ＣＯ２、８５％相対湿度でインキュベートした。生産培養物を、８×１０５細胞／ｍＬの標的細胞密度で接種し、１０日間培養し、その間、３、６、及び８日目にボーラス供給した。分析のため、０、３、６～１０日目にプロセス内試料を採取した。細胞数及び生存率を、Ｖｉ－ＣｅｌｌＢｌｕ細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて決定した。タンパク質力価は、プロテインＡアフィニティ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（プロテインＡ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）によって測定した。積算生存細胞密度（ＩＶＣＤ）を、培養時間に対するＶＣＤの台形公式によって計算した。比生産性（Ｑｐ）を、力価をＩＶＣＤ計算値で除すことによって決定した。
【0068】
実施例１
ＣＤ３拡散モダリティに特異的な拡散勾配アッセイ
Ａ．ＣＤ３結合を模倣するＣＤ３バインダー分泌アッセイ試薬の設計及び開発
本実施例は、いくつかの実施形態ではＢｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ機器を含む既存の技術を使用することができるＣＤ３バインダーの検出を容易にするように設計されたアッセイを提供する。ＣＤ３結合組換えタンパク質によって特異的に認識されるフルオロフォアにコンジュゲートしたＣＤ３ペプチドからなる試薬を設計した（図１Ａ）。試薬の特異的結合は、内因性ヒトＣＤ３イプシロンタンパク質の最初の９個のアミノ酸の配列の存在によって付与される。この短いペプチドは、その不溶性のために、合成が困難であることがわかった。ペプチドの溶解性を改善するために、Ｃ末端にシステイン残基を加え、これにより、マレイミド媒介化学を介したＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８又はＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４フルオロフォアへのＣＤ３ペプチドの共有結合性コンジュゲーションが可能になった（図１Ａ）。ペプチドをこのアミノ酸誘導体に合成的にコンジュゲートさせた。これらの修飾により、以下の配列（配列番号１）：ピログルタミン酸－ＤＧＮＥＥＭＧＧＣ－ＡＦ５９４（又はＡＦ４８８）を有する約２ｋＤａのサイズのペプチドコンジュゲートが最終的に得られた（図１Ａ）。
ＣＤ３拡散モダリティに特異的な拡散勾配アッセイ
Ａ．ＣＤ３結合を模倣するＣＤ３バインダー分泌アッセイ試薬の設計及び開発
本実施例は、いくつかの実施形態ではＢｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ機器を含む既存の技術を使用することができるＣＤ３バインダーの検出を容易にするように設計されたアッセイを提供する。ＣＤ３結合組換えタンパク質によって特異的に認識されるフルオロフォアにコンジュゲートしたＣＤ３ペプチドからなる試薬を設計した（図１Ａ）。試薬の特異的結合は、内因性ヒトＣＤ３イプシロンタンパク質の最初の９個のアミノ酸の配列の存在によって付与される。この短いペプチドは、その不溶性のために、合成が困難であることがわかった。ペプチドの溶解性を改善するために、Ｃ末端にシステイン残基を加え、これにより、マレイミド媒介化学を介したＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８又はＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４フルオロフォアへのＣＤ３ペプチドの共有結合性コンジュゲーションが可能になった（図１Ａ）。ペプチドをこのアミノ酸誘導体に合成的にコンジュゲートさせた。これらの修飾により、以下の配列（配列番号１）：ピログルタミン酸－ＤＧＮＥＥＭＧＧＣ－ＡＦ５９４（又はＡＦ４８８）を有する約２ｋＤａのサイズのペプチドコンジュゲートが最終的に得られた（図１Ａ）。
【0069】
このＣＤ３ペプチドを、ＣＤ３バインダーである細胞培養培地中に分泌される組換えカノニカルＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質への結合について試験した。ｓｃＦｖベースのＢｉＴＥ（登録商標）組換えタンパク質を発現する細胞株から収集した分泌培地を集め、ＣＤ３－ＡＦ４８８試薬と混合し、捕捉クロマトグラフィーに供した。その後、未精製分泌培地及び精製材料の両方を、蛍光検出器を備えたサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した（図１Ｂ、Ｃ）。この設定により、分析された試料中に存在する全タンパク質含量との関連で、ＣＤ３－ＡＦ４８８ペプチドとその結合タンパク質複合体の溶出プロファイルをモニターすることが可能になった。精製材料のＵＶ吸光度（Ａ２８０ｎｍ）溶出プロファイルにより、ＢｉＴＥ（登録商標）モノマー、ダイマー及びＨＭＷ種の識別が可能になった（図１Ｂ）。蛍光ＣＤ３－ＡＦ４８８ペプチドの溶出プロファイル（２５４ｎｍ）は、ＢｉＴＥ（登録商標）溶出プロファイルと重なり、ＣＤ３－ペプチドがＢｉＴＥ（登録商標）組換えタンパク質と複合体を形成し、ＢｉＴＥ（登録商標）モノマー、ダイマー及び凝集種の検出が可能であることを示している（図１Ｂ）。未精製試料で検出された蛍光溶出プロファイルは、精製材料で検出されたＳＥＣプロフィールに類似しており、ＣＤ３ペプチドコンジュゲート試薬が、細胞培養培地中のＣＤ３バインダー分泌の検出に使用することができることを示している（図１Ｃ）。
【0070】
アッセイ試薬が細胞毒性を導入するかどうかを決定するために、ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合分子を発現するＣＨＯ細胞を、０μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬの範囲の濃度でＣＤ３－ＡＦ５９４コンジュゲートを補充した培地に曝露した。細胞を試薬とともに２４時間インキュベートし、培地で洗浄し、細胞生存率を分析した。ＣＤ３アッセイ試薬による処理に応じた細胞生存率の欠陥は観察されなかった。これらのデータに基づいて、ＣＤ３ペプチドコンジュゲートは細胞培養培地中のＣＤ３バインダー分泌の検出に適しており、細胞毒性を誘導しないと結論付けられた（図１Ａ～Ｄ）。
【0071】
Ｂ．ナノ流体チップ上のＣＤ３バインダー分泌のための拡散勾配アッセイの最適化
次に、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔのナノ流体チップ（図２Ａ）上の組換えＣＤ３バインダーの分泌を検出する拡散勾配アッセイに使用されるＣＤ３－ＡＦ５９４ペプチドコンジュゲート能力を評価した。ＢｉＴＥ（登録商標）モダリティを発現する細胞を、標準的な細胞株開発ワークフローを用いてＢＬＩプラットフォームにロードした。単一細胞をＮａｎｏｐｅｎｓＴＭにデポジットし、続いて潅流下で６日間培養した。本明細書に記載のような最適化された設定を使用して、ＣＤ３試薬を拡散勾配アッセイにおいて使用した。このアッセイにより、収集された蛍光画像の目視検査に基づいて、高レベルのＢｉＴＥ（登録商標）組換えタンパク質を分泌する細胞株の識別が可能になった（図２Ｂ）。ＢｉＴＥ（登録商標）組換えタンパク質を発現する細胞を集めたペンにおいて高い蛍光シグナルが検出され、これは、陰性対照として使用した空のペンとは対照的であった（図２Ｂ）。これらのデータは、ＣＤ３アッセイ試薬がＢＬＩプラットフォームを利用するＢｉＴＥ（登録商標）分泌の検出に適していることを示している。
次に、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔのナノ流体チップ（図２Ａ）上の組換えＣＤ３バインダーの分泌を検出する拡散勾配アッセイに使用されるＣＤ３－ＡＦ５９４ペプチドコンジュゲート能力を評価した。ＢｉＴＥ（登録商標）モダリティを発現する細胞を、標準的な細胞株開発ワークフローを用いてＢＬＩプラットフォームにロードした。単一細胞をＮａｎｏｐｅｎｓＴＭにデポジットし、続いて潅流下で６日間培養した。本明細書に記載のような最適化された設定を使用して、ＣＤ３試薬を拡散勾配アッセイにおいて使用した。このアッセイにより、収集された蛍光画像の目視検査に基づいて、高レベルのＢｉＴＥ（登録商標）組換えタンパク質を分泌する細胞株の識別が可能になった（図２Ｂ）。ＢｉＴＥ（登録商標）組換えタンパク質を発現する細胞を集めたペンにおいて高い蛍光シグナルが検出され、これは、陰性対照として使用した空のペンとは対照的であった（図２Ｂ）。これらのデータは、ＣＤ３アッセイ試薬がＢＬＩプラットフォームを利用するＢｉＴＥ（登録商標）分泌の検出に適していることを示している。
【0072】
次に、ＢｉＴＥ（登録商標）拡散勾配アッセイの特異性を評価した。ＢｉＴＥ（登録商標）、ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合又はＩｇＧ融合タンパク質を発現する３つの異なる細胞株を、ＢＬＩプラットフォームにおいて単一細胞ロードワークフローで使用した（図３Ａ）。細胞を５日間増殖させ、ＳｐｏｔｌｉｇｈｔＴＭＨｕ３アッセイ及びＣＤ３拡散アッセイを用いて組換えタンパク質分泌についてアッセイした。ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合体は、ＣＤ３及びＦｃドメインの両方が存在するため、ＣＤ３タンパク質に結合する能力並びにＳｐｏｔｌｉｇｈｔＴＭＨｕ３試薬に対する親和性を有するので、本試験において陽性対照として機能した。予想通り、ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃタンパク質産物の分泌は、ＳｐｏｔｌｉｇｈｔＴＭＨｕ３及びＣＤ３拡散アッセイの両方で検出された（図３Ａ、Ｂ）。両方のアッセイで測定された分泌スコア（Ａｕスコア）は相関し、０．９６のＲ２値が得られ、ＣＤ３拡散アッセイは市販のＳｐｏｔｌｉｇｈｔＴＭＨｕ３アッセイと同程度効率的にＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ分子を検出し得ることが示された（図３Ｃ）。ＣＤ３拡散アッセイは、ＩｇＧ融合タンパク質の分泌を検出することができず、これはＳｐｏｔｌｉｇｈｔＴＭＨｕ３アッセイとは対照的であり、ＣＤ３ペプチド試薬の高い特異性が実証された（図３Ａ～Ｃ）。ＣＤ３拡散アッセイ及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔＴＭＨｕ３アッセイの両方で測定された分泌スコア（Ａｕスコア）は、ＩｇＧ発現細胞株の場合、相関性は低かった（図３Ｃ）。ＣＤ３拡散試薬は、ＢｉＴＥ（登録商標）発現細胞株の分泌を効率的に検出した（図３Ａ～Ｃ）。これらのデータは、本明細書で開発されたＣＤ３拡散アッセイが様々なＢｉＴＥ（登録商標）フォーマットの検出に適用することができ、ＣＤ３バインダーに対して高い特異性を有することを示している。
【0073】
Ｃ．ＣＤ３バインダーアッセイに基づいて選択されたクローンは、標準的な方法に由来するクローンと比較して同様の性能を示す。
次に、エクスポート手順（すなわち、選択されたクローン候補を、その後の増殖及びスケールアップのために、ナノ流体チップから９６ウェルプレートに移す）の後、ＣＤ３バインダーアッセイに曝露したクローンの性能を評価した。ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合分子（図３）を発現するクローン親細胞株に由来するクローンを選択し、エクスポートに供した。１９個のクローンをスケールアップし、ディープウェルプレートで実施した１０日間の小規模フェドバッチ実験により評価した。培養物を、増殖、生存率及び最終力価、並びに比生産性（ｑｐ）についてモニターし、ＢＬＩチップ上の細胞をサブクローニングするために使用した親細胞株と比較した（図３）。１つの例外を除いたクローンは全て、同様の増殖及び生存プロファイルを示した（図４Ｂ）。エクスポートされたクローンによって得られた力価及び比生産性は、サブクローニングに使用された親細胞株によって得られた値と比較した場合、それぞれ１１０～４７％及び１５５～５０％の範囲内であった。これらのデータを総合すると、クローニング中にＣＤ３拡散アッセイ試薬に曝露された細胞株は、標準的な方法により誘導された細胞株と比較した場合、同等の性能を有することが示された。さらに、ＣＤ３拡散アッセイを用いて、標準的なＣＬＤワークフローにより選択された細胞株と同等の性能を示すクローンを識別し、濃縮することができる。
次に、エクスポート手順（すなわち、選択されたクローン候補を、その後の増殖及びスケールアップのために、ナノ流体チップから９６ウェルプレートに移す）の後、ＣＤ３バインダーアッセイに曝露したクローンの性能を評価した。ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合分子（図３）を発現するクローン親細胞株に由来するクローンを選択し、エクスポートに供した。１９個のクローンをスケールアップし、ディープウェルプレートで実施した１０日間の小規模フェドバッチ実験により評価した。培養物を、増殖、生存率及び最終力価、並びに比生産性（ｑｐ）についてモニターし、ＢＬＩチップ上の細胞をサブクローニングするために使用した親細胞株と比較した（図３）。１つの例外を除いたクローンは全て、同様の増殖及び生存プロファイルを示した（図４Ｂ）。エクスポートされたクローンによって得られた力価及び比生産性は、サブクローニングに使用された親細胞株によって得られた値と比較した場合、それぞれ１１０～４７％及び１５５～５０％の範囲内であった。これらのデータを総合すると、クローニング中にＣＤ３拡散アッセイ試薬に曝露された細胞株は、標準的な方法により誘導された細胞株と比較した場合、同等の性能を有することが示された。さらに、ＣＤ３拡散アッセイを用いて、標準的なＣＬＤワークフローにより選択された細胞株と同等の性能を示すクローンを識別し、濃縮することができる。
【0074】
Ｄ．低レベルで発現されるＣＤ３結合モダリティのためのデュアルターゲティング拡散勾配アッセイの開発
オンチップ拡散勾配アッセイは、ナノスケールでのタンパク質分泌を検出するための有望なツールであるが、そのようなアッセイの検出限界は、低レベルで治療用生物製剤を発現する細胞株にとって課題を提示する。２つの蛍光プローブが重ならないタンパク質ドメインを同時に標的とするアッセイを利用して、ペン内に保持される蛍光シグナルの増加を観察することができた。
オンチップ拡散勾配アッセイは、ナノスケールでのタンパク質分泌を検出するための有望なツールであるが、そのようなアッセイの検出限界は、低レベルで治療用生物製剤を発現する細胞株にとって課題を提示する。２つの蛍光プローブが重ならないタンパク質ドメインを同時に標的とするアッセイを利用して、ペン内に保持される蛍光シグナルの増加を観察することができた。
【0075】
これを試験するために、拡散勾配アッセイを、低レベルで発現されるＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合タンパク質の検出のために最適化した。ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合タンパク質は、ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合タンパク質のＣＤ３結合能力及びＦｃドメインの存在にそれぞれ起因して、ＣＤ３拡散アッセイ及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔＴＭＨｕ３の両方で認識することができる。この実施形態では、両方のアッセイ試薬を使用した。ＣＤ３ペプチド試薬及びＦｃアッセイ試薬は、スペクトルが重なるＡＦ５９４又はＴＲＥＤ（テキサスレッド）フルオロフォアにコンジュゲートされ、したがって、同じ蛍光キューブを使用して同時に励起され、検出され得る。
【0076】
ＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃタンパク質を発現する細胞をＢＬＩプラットフォームにロードした。単一細胞をＮａｎｏｐｅｎｓＴＭにデポジットし、続いて潅流下で４日間培養した。次いで、両方の蛍光プローブの組み合わせを使用するデュアルターゲティングアッセイ、又はＣＤ３拡散アッセイ及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイを、個々に実施した（図５Ａ、Ｂ）。ペンに存在するあらゆる残留蛍光シグナルを除去するために、各アッセイの間に、チップを５ｍｌの細胞培養培地でフラッシュした（これは、約１０００×チップ容量に相当する）。Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３、ＣＤ３拡散アッセイ及びデュアルターゲティングアッセイ間の画像捕捉に使用される露光時間の差異により、アッセイの各々についてＢＬＩソフトウェアによって計算された分泌スコア（Ａｕスコア）を、各データセット内の空のペンで検出された平均Ａｕスコアに対して正規化した（図５Ａ）。この正規化工程により、チップ上で実行される各アッセイの分泌スコアとの直接比較が可能になった。各蛍光プローブが１：１の比で標的分子に結合するＣＤ３拡散アッセイ及びＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイの場合、ペンにおいて検出される蛍光シグナルは低い。これは、両方の蛍光プローブが同時に標的タンパク質産物に結合し、フルオロフォア：標的タンパク質の比が２：１となるデュアルターゲティングアッセイとは対照的であった。チップ上に分泌された組換えタンパク質のこの二重認識は、個々のペンで検出される蛍光強度の増加をもたらした（図５Ａ、Ｂ）。
【0077】
アッセイを実施する順序及びその間に実施された広範なフラッシングがペンで検出されるタンパク質レベルに影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、図４で使用された同じＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合タンパク質を発現する細胞株をナノ流体チップにロードし、培養の４日目にＳｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３アッセイを実施し、その後、培地で５ｍｌフラッシュした。デュアルターゲティングアッセイを実施し、チップ上で検出された分泌プロファイルを分析した。デュアルターゲティングアッセイを実施している間に検出された蛍光シグナルは、Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３試薬単独の場合と比較して増加しており、高度に分泌するクローンが容易に識別された。
【0078】
これらの観察に基づいて、２つのアッセイ試薬を組み合わせることにより、より高い感度及び蛍光シグナル増幅がもたらされ、低レベルで分泌されるＢｉＴＥ（登録商標）－Ｆｃ融合タンパク質をより効果的に検出することができると結論付けられた。さらに、Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｈｕ３及びＣＤ３拡散アッセイ試薬の両方を利用することによって検出される分泌表現型はより多様性を示し、所望の生産性プロファイルを有するクローンの選択を可能にした。
【0079】
Ｅ．考察
組換えタンパク質治療薬を発現する細胞株の開発は、多くの資源及び時間を必要とするプロセスである。Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ｌｉｇｈｔｓ技術プラットフォームは、細胞株開発活動を小型化するための有望な解決策を提供し、商業的製造に適したクローン由来の細胞株候補を識別するためにスクリーニングする必要があるクローンの数を著しく減少させる。Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォームはまた、詳細なクローン性データパッケージを用いて高品質クローン細胞株を送達するために必要とされる資源を大きく減少させる（Ｌｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１８；３４（６）：１４３８－１４４６；及びＬｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０２０；１５（１）：ｅ１９００２４７）。Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォーム上の細胞株開発ワークフローは、所望の生産性プロファイルを有するクローンの選択を補助する蛍光アッセイの実施を可能にする。市販の試薬はＦｃ含有分子の検出が可能であるか、オンチップ分泌アッセイを非Ｆｃモダリティに実施する能力は制限される。
組換えタンパク質治療薬を発現する細胞株の開発は、多くの資源及び時間を必要とするプロセスである。Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ｌｉｇｈｔｓ技術プラットフォームは、細胞株開発活動を小型化するための有望な解決策を提供し、商業的製造に適したクローン由来の細胞株候補を識別するためにスクリーニングする必要があるクローンの数を著しく減少させる。Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォームはまた、詳細なクローン性データパッケージを用いて高品質クローン細胞株を送達するために必要とされる資源を大きく減少させる（Ｌｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１８；３４（６）：１４３８－１４４６；及びＬｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０２０；１５（１）：ｅ１９００２４７）。Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォーム上の細胞株開発ワークフローは、所望の生産性プロファイルを有するクローンの選択を補助する蛍光アッセイの実施を可能にする。市販の試薬はＦｃ含有分子の検出が可能であるか、オンチップ分泌アッセイを非Ｆｃモダリティに実施する能力は制限される。
【0080】
本明細書で提供されるＣＤ３拡散勾配アッセイは、蛍光標識されたＣＤ３ペプチドを介してＣＤ３結合モダリティの分泌を検出することができる。ＣＤ３拡散アッセイで評価された分泌プロファイルに基づいてサブクローニングされた細胞株は、単一前駆体に由来する親細胞と比較した場合、同様の性能を示す。さらに、本開示の本実施形態において提供されるアッセイ試薬は、完全に合成的に誘導され、細胞毒性を誘導せず、ＣＤ３結合モダリティフォーマットに対して高い特異性を示し、臨床的及び商業的製造に適合する細胞株を開発するのに適している。
【0081】
組換えタンパク質フォーマットのサブセットは発現が困難であることが証明されており、それらの分泌は低レベルで起こる。そのような場合、分泌された組換えタンパク質産物の検出は、単一細胞又は少数の細胞レベルで課題を提示する。本明細書に示されるように、複数のアッセイ試薬を組み合わせることにより、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）プラットフォーム上のＣＬＤワークフローに関連して使用される拡散勾配アッセイの感度を改善することができ、シグナル増幅をもたらす。
【0082】
上記で説明されている様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供し得る。本明細書で言及されている及び／又は本出願データシートで列挙されている全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本実施形態の態様は、様々な特許、出願、及び刊行物の概念を採用するために、必要に応じて改変されて、さらなる実施形態を提供し得る。
【0083】
これらの及び他の変更を、上記の詳細な説明を考慮して実施形態に行ない得る。一般的に、下記の特許請求の範囲において、使用される用語は、この特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲で開示されている具体的な実施形態に限定するように解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全ての範囲とともに全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、本特許請求の範囲は、本開示により限定されるものではない。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【配列表】
【国際調査報告】