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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-18
(54)【発明の名称】無細胞ＤＮＡ断片化を用いた肺癌の検出
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240111BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240111BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240111BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240111BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12N15/09 Z
G01N33/50 P
G01N33/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537339
(86)(22)【出願日】2021-12-21
(85)【翻訳文提出日】2023-08-17
(86)【国際出願番号】 US2021064613
(87)【国際公開番号】W WO2022140386
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】63/128,776
(32)【優先日】2020-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/197,301
(32)【優先日】2021-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518056003
【氏名又は名称】ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100189131
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 拓郎
(74)【代理人】
【識別番号】100182486
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 正展
(74)【代理人】
【識別番号】100147289
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 裕子
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルクレスク， ビクター
(72)【発明者】
【氏名】シャルプ， ロバート ビー．
(72)【発明者】
【氏名】マティオス， ディミトリオス
(72)【発明者】
【氏名】ファレン， ジリアン エー
(72)【発明者】
【氏名】ブルーム， ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアーノ， スティーブン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CA26
2G045DA13
2G045DA36
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS39
4B063QX02
(57)【要約】
肺癌検出のための無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片化が、現在の画像化に基づくスクリーニング方法およびバイオマーカーと併用される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における癌を診断する方法であり、前記対象の生体試料から無細胞（ｃｆＤＮＡ）を抽出すること、
前記抽出されたｃｆＤＮＡおよびｃｆＤＮＡ断片の全ゲノム配列決定からゲノムライブラリーを生成すること、
前記ｃｆＤＮＡ断片をゲノム起源にマッピングし、断片長を評価し、各試料についてゲノム規模の断片化プロファイルを得ること、
前記対象のタンパク質バイオマーカーを同定すること、
前記対象のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよびタンパク質バイオマーカーを正常参照非癌対象と比較すること、および
対象における癌を診断すること、
を含む、方法。
【請求項2】
前記癌が肺癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記対象を低線量らせんコンピュータ断層撮影（ＬＤＣＴ）に供することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
肺癌を有すると診断された対象と正常な非癌対象とで臨床データを比較することをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ｃｆＤＮＡ断片の平均長およびプロファイルが、非癌個体間で類似している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
癌対象のｃｆＤＮＡ断片プロファイルが変化する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
１つまたは複数の腫瘍抗原、サイトカインまたはタンパク質の血清レベルが測定される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
１つまたは複数の腫瘍抗原が測定され、前記１つまたは複数の腫瘍抗原が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９－９、ＣＡ １２５、組織ポリペプチド抗原（ＴＳＡ）、ＣＹＦＲＡ－２１－１、ニューロン特異的エノラーゼ、プロガストリン放出ペプチド（ＰｒｏＧＲＰ）、血漿中カリクレインＢ１（ＫＬＫＢ１）、血清中アミロイドＡ、ハプトグロビン－アルファ－２、ＡＤＡＭ－１７、オステオプロテゲリン、ペントラキシン３、フォリスタチン、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ａまたはそれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記１つまたは複数のタンパク質が測定され、前記１つまたは複数のタンパク質がＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、キチナーゼ－３－様タンパク質１（ＹＫＬ－４０／ＣＨＩ３Ｌ１）またはその断片を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
早期遮断のための断片のＤＮＡ評価（ＤＥＬＦＩ）が、ＤＥＬＦＩスコアを生成するために行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
非癌個体のＤＥＬＦＩスコアが約０．３未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
病期Ｉの癌のＤＥＬＦＩスコアが約０．３から０．５未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
病期ＩＩの癌のＤＥＬＦＩスコアが約０．５から０．８未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
病期ＩＩＩの癌のＤＥＬＦＩスコアが約０．８から０．９５未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
病期ＩＶの癌のＤＥＬＦＩスコアが約０．９５以上である、請求項１０に記載の方法。
【請求項16】
病期Ｉの癌のＤＥＬＦＩスコアが約０．３５である、請求項１０に記載の方法。
【請求項17】
病期ＩＩの癌のＤＥＬＦＩスコアが約０．７５である、請求項１０に記載の方法。
【請求項18】
病期ＩＩＩの癌のＤＥＬＦＩスコアが約０．９である、請求項１０に記載の方法。
【請求項19】
病期ＩＶの癌のＤＥＬＦＩスコアが約０．９９である、請求項１０に記載の方法。
【請求項20】
前記対象が癌治療を受ける、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する対象と、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する対象または癌を有さない対象とを診断的に区別する方法であり、ＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣまたは白血球の生体試料での転写因子の発現変動を比較すること、
前記生体試料にて同定された転写因子の発現と比較して、より高い発現変動を有する少なくとも１つまたは複数の転写因子を選択すること、
前記対象の生体試料から無細胞（ｃｆＤＮＡ）を抽出すること、
前記対象から得られた前記ｃｆＤＮＡのゲノムワイド断片化プロファイルを取得して、前記少なくとも１つまたは複数の転写因子結合部位を同定すること、
前記少なくとも１つまたは複数の転写因子結合部位のｃｆＤＮＡカバレッジを評価して、非癌対象またはＮＳＣＬＣ対象と比較した断片のカバレッジおよびサイズを決定すること；を含み、それによって
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する対象と、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する対象または癌を有さない対象とを診断的に区別する、方法。
【請求項22】
前記少なくとも１つの転写因子が、Ａｃｈａｅｔｅ－Ｓｃｕｔｅファミリー塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス転写因子１（ＡＳＣＬ１）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
ＡＳＣＬ１結合部位を含む核酸配列中のｃｆＤＮＡ断片サイズが、ＮＳＣＬＣを有する患者または非癌対象と比較してＳＣＬＣ患者において大きい、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
ＡＳＣＬ１結合部位を含む核酸配列における集約断片カバレッジが、ＮＳＣＬＣを有する患者または非癌対象と比較してＳＣＬＣ患者において減少している、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する対象と、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する対象または癌を有さない対象とを診断的に区別する方法であり、前記対象の生体試料から無細胞（ｃｆＤＮＡ）を抽出すること、
Ａｃｈａｅｔｅ－Ｓｃｕｔｅファミリー塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス転写因子１（ＡＳＣＬ１）結合部位のｃｆＤＮＡカバレッジを評価して、非癌対象またはＮＳＣＬＣ対象と比較した断片カバレッジおよびサイズを決定すること、を含み、それによって
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する対象と、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する対象または癌を有さない対象とを診断的に区別する、方法。
【請求項26】
ＡＳＣＬ１結合部位を含む核酸配列中の前記ｃｆＤＮＡ断片サイズが、ＮＳＣＬＣを有する患者または非癌対象と比較してＳＣＬＣ患者において大きい、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
ＡＳＣＬ１結合部位を含む核酸配列中の集約断片カバレッジが、ＮＳＣＬＣを有する患者または非癌対象と比較してＳＣＬＣを有する患者において減少している、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
対象の断片化プロファイルが、細胞型特異的ゲノムワイド転写因子結合をもたらし、肺癌のタイプおよび組織学的サブタイプの診断に有効である、請求項２１または２５に記載の方法。
【請求項29】
対象が癌治療を受ける、請求項２１または２５に記載の方法。
【請求項30】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法を含む、対象における癌の再発を決定する方法。
【請求項31】
ゲノムワイド断片化分析のＧＣ含量を補正する方法であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供されていない試料および可変回数のＰＣＲサイクルに供された試料からの癌対象および癌を有さない対象の全ゲノムライブラリーを配列決定すること、
アダプター配列をフィルタリングし、配列リードをヒト参照ゲノムに対してアライメントし、重複リードを除去し、アライメントされた各対をゲノム区間に変換すること、ここで前記ゲノム区間は配列決定されたＤＮＡ断片を表す、および
３０以上のｍａｐｑスコアを有するリードを選択すること、
を含む、方法。
【請求項32】
前記参照ゲノムを、前記ゲノムの約１～３ＧＢにわたる約１００～６００個の非重複１～１０Ｍｂビンにテーリングし、それによって、低カバレッジ全ゲノム配列決定からの前記ゲノムにわたる断片化における大規模なエピジェネティックな差異を捕捉することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
前記１００～６００個の非重複１～１０Ｍｂビンにわたる短い断片対長い断片（１５１ｂｐ対２２０ｂｐ）の数の比が、ＧＣ含量およびライブラリーサイズについて正規化された、請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
各ＧＣ層内の断片の総数を取得することが、０と１との間の約１００個の可能なＧＣ層のうちの１つへの断片の割り当てを含む、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
ｌが全てのＧおよびＣのヌクレオチドを有する断片を示す、請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
非癌試料についてのＧＣ層による断片数の分布、およびターゲット分布の中央値を得ることをさらに含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項37】
対象での試料間ＰＣＲバイアスの正規化が、【数1】
【請求項38】
ＧＣバイアスにおける試料間変動およびライブラリーサイズにおける差異の正規化が、各ビンについての短い断片および長い断片のＧＣ調整された数を、そのビンに整列された断片についての重みの合計として計算することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
断片化プロファイルが、非癌対象および非悪性肺癌を有する対象の間で一貫している、請求項３０～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
癌対象が、広範なゲノムワイド変動を表す、請求項３０～３９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、１）の優先権の利益を主張する。２０２１年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／１２８，７７６号および２０２０年６月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１９７，３０１号（これらの出願の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本出願は、１）の優先権の利益を主張する。２０２１年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／１２８，７７６号および２０２０年６月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１９７，３０１号（これらの出願の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0002】
連邦政府支援の研究に関する記述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金ＣＡ１２１１１３およびＣＡ２３３２５９の下で政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金ＣＡ１２１１１３およびＣＡ２３３２５９の下で政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【0003】
技術分野
本開示は、概して、癌、特に肺癌を疾患の初期段階で検出および診断するための方法に関する。
本開示は、概して、癌、特に肺癌を疾患の初期段階で検出および診断するための方法に関する。
【背景技術】
【0004】
肺癌は世界で最も致死的な癌である１（非特許文献１）。５年生存率は２０％未満であり２（非特許文献２）、これは主に、治療が初期段階よりも有効性が低い診断後期段階によるものであり、肺癌の発生率は世界中で増加し続けている３（非特許文献３）。大規模な無作為化試験は、胸部低線量コンピュータ断層撮影（ＬＤＣＴ）を使用する肺癌検診が高リスク個体の死亡率を減少させることを実証している４、５（非特許文献４，５）が、偽陽性撮像結果からの潜在的な害、放射線被曝、および侵襲的診断手順からの罹患率の懸念により、ＬＤＣＴは十分に活用されていないままであり、スクリーニングされたリスク個体の６％未満であるしかスクリーニングを受けていない６～８（非特許文献６－８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｆｅｒｌａｙ Ｊ， Ｃｏｌｏｍｂｅｔ Ｍ， Ｓｏｅｒｊｏｍａｔａｒａｍ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ２０１８： ＧＬＯＢＯＣＡＮ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ２０１９；１４４：１９４１－５３．
【非特許文献2】Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ Ｒ， Ｓａｎｔ Ｍ， Ｃｏｌｅｍａｎ ＭＰ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅ １９９９－２００７ ｂｙ ｃｏｕｎｔｒｙ ａｎｄ ａｇｅ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＥＵＲＯＣＡＲＥ－－５－ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１４；１５：２３－３４．
【非特許文献3】ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ＰＭ， Ｗｕ ＣＣ， Ｃａｒｔｅｒ ＢＷ， Ｍｕｎｄｅｎ ＲＦ． Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１８；７：２２０－３３．
【非特許文献4】ｄｅ Ｋｏｎｉｎｇ ＨＪ， ｖａｎ ｄｅｒ Ａａｌｓｔ ＣＭ， ｄｅ Ｊｏｎｇ ＰＡ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｌｕｎｇ－Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｖｏｌｕｍｅ ＣＴ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ａ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｔｒｉａｌ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０；３８２：５０３－１３．
【非特許文献5】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｕｎｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔ， Ａｂｅｒｌｅ ＤＲ， Ａｄａｍｓ ＡＭ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｄｕｃｅｄ ｌｕｎｇ－ｃａｎｃｅｒ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：３９５－４０９．
【非特許文献6】Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＴＢ， Ｓｏｍａｎ Ａ， Ｔｈｏｍａｓ ＣＣ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ － １０ Ｓｔａｔｅｓ， ２０１７． ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｅｅｋｌｙ ｒｅｐｏｒｔ ２０２０；６９：２０１－６．
【非特許文献7】Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． ２０２０． ａｔ ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｇｒｅｓｓｒｅｐｏｒｔ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｌｕｎｇ＿ｃａｎｃｅｒ．）
【非特許文献8】Ｐｉｎｓｋｙ ＰＦ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｉｃａｌ ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１５；９５：９５３－６６．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、癌、特に肺癌を疾患の初期段階で検出および診断するための新規な非侵襲的方法を提供する。したがって、ある実施形態では、対象における癌を診断する方法は、対象の生体試料から無細胞（ｃｆＤＮＡ）を抽出すること、抽出されたｃｆＤＮＡからゲノムライブラリーを生成し、ｃｆＤＮＡ断片の全ゲノム配列決定すること、ゲノム起源にｃｆＤＮＡ断片をマッピングし、断片長を評価し、各試料についてゲノムワイド断片化プロファイルを得ること、対象のタンパク質バイオマーカーを同定すること、対象のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよびタンパク質バイオマーカーを正常参照非癌対象と比較することを含む。特定の実施形態において、癌は肺癌である。
【0007】
特定の実施形態において、本方法は、対象を低線量らせんコンピュータ断層撮影（ＬＤＣＴ）に供することをさらに含む。ある実施形態では、本方法は、肺癌を有すると診断された対象と非癌対象との間で臨床データを比較することをさらに含む。ある実施形態では、ｃｆＤＮＡ断片の平均長およびプロファイルは、非癌個体間で類似している。ある実施形態では、癌対象のｃｆＤＮＡ断片プロファイルは変化する。ある実施形態では、血清中の１つまたは複数の、腫瘍抗原、サイトカインまたはタンパク質の血清レベルが測定される。
【0008】
ある実施形態では、１つまたは複数の腫瘍抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９－９、ＣＡ１２５、組織ポリペプチド抗原（ＴＳＡ）、ＣＹＦＲＡ－２１－１、ニューロン特異的エノラーゼ、プロガストリン放出ペプチド（ＰｒｏＧＲＰ）、血漿カリクレインＢ１（ＫＬＫＢ１）、血清中アミロイドＡ、ハプトグロビン－α－２、ＡＤＡＭ－１７、オステオプロテゲリン、ペントラキシン３、フォリスタチン、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ａまたはそれらの組合せを含む。
【0009】
特定の実施形態において、１つまたは複数のタンパク質は、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、キチナーゼ－３－様タンパク質１（ＹＫＬ－４０／ＣＨＩ３Ｌ１）またはそれらの断片を含む。
【0010】
ある実施形態では、ＤＥＬＦＩ（早期遮断のための断片のＤＮＡ評価）スコアが生成され、この際、交差検証反復（ＤＥＬＦＩスコア）にわたる平均として各対象についてのスコアを生成するために、主成分分析が機械学習予測モデルに組み込まれる。例として、トレーニングのために利用可能な試料数に対する断片化特徴が高い次元性を有するため、特徴空間の次元性を低減するために主成分分析を各トレーニングセット内で実施し、試料間の断片化プロファイルの分散の９０％を説明するために必要とされる最小数の主成分を保持した。主成分特徴に加えて、全ての３９のｚスコアを、ＬＡＳＳＯペナルティを用いてロジスティック回帰モデルにおいて評価した。本発明者らの分析における最適化されたＬＡＳＳＯペナルティは、カレットＲパッケージを使用してリサンプリングすることによって得られた。各試料について導出されたＤＥＬＦＩスコアは、１０回の交差検証反復にわたる平均スコアに対応する。本明細書における「ＤＥＬＦＩスコア」への言及は、この上記で特定された手順によって決定される値である。
【0011】
ある実施形態において、非癌個体のＤＥＬＦＩスコアは、約０．３未満である。ある実施形態では、病期Ｉの癌のＤＥＬＦＩスコアは、約０．３から０．５未満である。ある実施形態において、病期ＩＩの癌についてのＤＥＬＦＩスコアは、約０．５から０．８未満である。ある実施形態において、病期ＩＩＩの癌についてのＤＥＬＦＩスコアは、約０．８から０．９９未満である。ある実施形態では、病期ＩＶのＤＥＬＦＩスコアは、約０．９９以上である。ある実施形態において、病期Ｉの癌のＤＥＬＦＩスコアは約０．３５である。ある実施形態において、病期ＩＩの癌のＤＥＬＦＩスコアは、約０．７５である。ある実施形態において、病期ＩＩＩの癌のＤＥＬＦＩスコアは、約０．９である。ある実施形態において、病期ＩＶの癌のＤＥＬＦＩスコアは、約０．９９である。
【0012】
ある実施形態では、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する対象と、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する対象または癌を有さない対象とを診断的に区別する方法は、ＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣまたは白血球の生体試料中の転写因子の発現変動（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を比較すること；生体試料中で同定された転写因子の発現と比較してより高い発現変動を有する少なくとも１つまたは複数の転写因子を選択すること；対象の生体試料から無細胞（ｃｆＤＮＡ）を抽出すること；対象から得られたｃｆＤＮＡのゲノムワイド断片化プロファイルを得て、少なくとも１つまたは複数の転写因子結合部位を同定すること；少なくとも１つまたは複数の転写因子結合部位のｃｆＤＮＡカバレッジを評価して、非癌対象またはＮＳＣＬＣ対象と比較して断片カバレッジおよびサイズを決定すること；それによって、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する対象と、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する対象または癌を有さない対象とを診断的に区別することを含む。
【0013】
ある実施形態では、少なくとも１つの転写因子は、Ａｃｈａｅｔｅ－Ｓｃｕｔｅファミリー塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス転写因子１（ＡＳＣＬ１）である。
【0014】
ある実施形態では、ＡＳＣＬ１結合部位を含む核酸配列中のｃｆＤＮＡ断片サイズは、ＮＳＣＬＣを有する患者または非癌対象と比較して、ＳＣＬＣ患者においてより大きい。
【0015】
ある実施形態では、ＡＳＣＬ１結合部位を含む核酸配列における集約（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）断片カバレッジは、ＮＳＣＬＣを有する患者又は非癌対象と比較して、ＳＣＬＣ患者において減少している。
【0016】
ある実施形態では、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する対象と、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する対象または癌を有さない対象とを診断的に区別する方法であって、その方法は、対象の生体試料から無細胞（ｃｆＤＮＡ）を抽出すること、Ａｃｈａｅｔｅ－Ｓｃｕｔｅファミリー塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス転写因子１（ＡＳＣＬ１）結合部位のｃｆＤＮＡカバレッジを評価して、非癌対象またはＮＳＣＬＣ対象と比較して断片カバレッジおよびサイズを決定すること、それによって、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する対象と、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する対象または癌を有さない対象とを診断的に区別することを含む。
【0017】
ある実施形態では、ＡＳＣＬ１結合部位を含む核酸配列中のｃｆＤＮＡ断片サイズは、ＮＳＣＬＣを有する患者または非癌対象と比較して、ＳＣＬＣ患者においてより大きい。
【0018】
ある実施形態では、ＡＳＣＬ１結合部位を含む核酸配列における集約断片カバレッジは、ＮＳＣＬＣを有する患者又は非癌対象と比較して、ＳＣＬＣ患者において減少している。
【0019】
ある実施形態では、対象の断片化プロファイルは、細胞型特異的ゲノムワイド転写因子結合をもたらし、肺癌のタイプおよび組織学的サブタイプの診断を有効にする。
【0020】
ある実施形態において、対象は、癌治療を受ける。
【0021】
特定の実施形態では、対象における癌の再発を決定する方法は、本明細書で具体化される方法を含む。
【0022】
ある実施形態では、ゲノムワイド断片化分析のＧＣ含量を補正する方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供されていない試料および可変回数のＰＣＲサイクルに供された試料からの癌対象および癌を有さない対象の全ゲノムライブラリーを配列決定すること、アダプター配列をフィルタリングすること、配列リードをヒト参照ゲノムに対してアライメントし、重複リードを除去すること、アライメントされた各対を、配列決定されたＤＮＡ断片を表すゲノム間隔に変換すること、および、３０以上のｍａｐｑスコアを有するリードを選択することを含む。
【0023】
ある実施形態では、本方法は、参照ゲノムを、ゲノムの約１～３ＧＢにわたる約１００～６００個の非重複１～１０Ｍｂビンにテーリングし、それによって、低カバレッジ全ゲノム配列決定からのゲノムにわたる断片化における大規模なエピジェネティック差異を捕捉することをさらに含む。
【0024】
ある実施形態では、１００～６００個の非重複１～１０Ｍｂビンにわたる短い断片対長い断片（１５１～２２０ｂｐ）の数の比を、ＧＣ含量およびライブラリーサイズについて正規化した。
【0025】
ある実施形態では、本方法は、０と１との間の約１００個の可能なＧＣ層のうちの１つに断片を割り当てることを含む、各ＧＣ層内の断片の総数を得ることをさらに含む。
【0026】
ある実施形態において、１は、全てのＧおよびＣのヌクレオチドを有する断片を示す。
【0027】
ある実施形態では、本方法は、非癌試料についてのＧＣ層による断片数の分布、およびターゲット分布の中央値を得ることをさらに含む。
【0028】
ある実施形態では、対象における試料間ＰＣＲバイアスの正規化は
となるように、ＧＣ層ｉにおける断片に重みｗｉを割り当てることを含み、ここで、ｔｉはターゲット分布における断片の数を示し、Ｎｉは階層ｉにおける断片の総数を示し、ｉ＝１，．１００である。ある実施形態では、ＧＣバイアスにおける試料間変動およびライブラリーサイズにおける差異の正規化は、各ビンについての短い断片および長い断片のＧＣ調整された数を、そのビンにアラインされた断片についての重みの合計として計算することを含む。
【数1】
【0029】
ある実施形態では、断片化プロファイルは、非癌対象および非悪性肺癌を有する対象の間で一貫している。
【0030】
ある実施形態では、癌対象は、広範なゲノムワイドな変動を示す。
【0031】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書に定義されているような用語は、関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであり、本明細書において明示的にそのように定義されていない限り、理想化された意味または過度に形式的な意味に解釈されないことがさらに理解されよう。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書に定義されているような用語は、関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであり、本明細書において明示的にそのように定義されていない限り、理想化された意味または過度に形式的な意味に解釈されないことがさらに理解されよう。
【0032】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「伴う（ｗｉｔｈ）」、またはそれらの変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される限りにおいて、そのような用語は、用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的であることが意図される。
【0033】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における慣行に従って、１または１を超える標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値または範囲の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、値の５倍以内、また２倍以内の大きさのオーダー内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語が想定されるべきである。
【0034】
「アライメントされた（ａｌｉｇｎｅｄ）」、「アライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）」、「マッピングされた（ｍａｐｐｅｄ）」または「アライメントする（ａｌｉｇｎｉｎｇ）」、「マッピングする（ｍａｐｐｉｎｇ）」という用語は、参照ゲノム由来の既知の配列に対する核酸分子の順序に関して一致として同定される１つまたは複数の配列を指す。そのようなアラインメントは、手動で、または、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｅｓパイプラインの一部として配布される効率的局所的アラインメント（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａ）（ＥＬＡＮＤ）コンピュータプログラムをｏｔｉｄｅ Ｄａｔａ（ＥＬＡＮＤ）コンピュータプログラム等のコンピューターアルゴリズムによって実施することができる。。整列における配列リードの一致は、１００％配列一致または１００％未満（不完全一致）であり得る。
【0035】
「代替対立遺伝子」または「ＡＬＴ」という用語は、例えば既知の遺伝子に対応する参照対立遺伝子と比較して１つまたは複数の突然変異を有する対立遺伝子を指す。
【0036】
「バイオマーカー」という用語は、プロセス、事象または状態の特徴的な生物学的指標または生物学的に誘導される指標を意味する。バイオマーカーは、診断方法、例えば臨床スクリーニングおよび予後評価において；および特定の治療的処置に応答する可能性が最も高い患者を同定するための治療結果のモニタリングにおいて、ならびに薬物スクリーニングおよび開発において使用することができる。バイオマーカーおよびその使用は、新たな薬物治療の同定および薬物治療のための新たな標的の発見に有用である。本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、生物学的変化と定量的または定性的のいずれかで関連する分子を指す。バイオマーカーの例としては、ポリペプチド、タンパク質またはポリペプチドもしくはタンパク質の断片；およびポリヌクレオチド、例えば遺伝子産物、ＲＮＡまたはＲＮＡ断片；および他の身体代謝産物が挙げられる。ある実施形態では、「バイオマーカー」は、第２の表現型を有する（例えば、疾患もしくは状態を有さないか、または疾患もしくは状態の重症度の低いバージョンを有する）対象または対象群からの生体試料と比較して、第１の表現型を有する（例えば、疾患もしくは状態を有する）対象または対象群からの生体試料中に差次的に存在する（すなわち、増加または減少する）化合物を意味する。バイオマーカーは、任意のレベルで差次的に存在し得るが、一般に、５％以上、１０％、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、１００％以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、もしくはそれ以上増加したレベルで存在するか、または一般に、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、もしくは１００％以上（すなわち、存在しない）減少したレベルで存在する。バイオマーカーは、好ましくは、統計的に有意なレベル（例えば、ウェルチのＴ検定またはウィルコクソンの順位和検定のいずれかを使用して決定される場合、例えば、０．０５未満のｐ値および／または０．１０未満のｑ値）で差次的に存在する。
【0037】
加えて、「バイオマーカー」という用語は、前述のいずれかのアイソフォームおよび／または翻訳後修飾形態も含む。本発明は、非修飾および修飾（例えば、グリコシル化、シトルリン化、リン酸化、酸化または他の翻訳後修飾）タンパク質／ポリペプチド／ペプチドの両方の検出、測定、定量化、決定などを企図する。ある実施形態では、バイオマーカーの検出、測定、決定などへの言及は、タンパク質／ポリペプチド／ペプチド（修飾および／または非修飾）の検出を指すことが理解される。
【0038】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」は、当該分野で公知であるような、調節されない細胞の増殖または複製によって特徴付けられる病気、状態、形質、遺伝子型または表現型を意味し；肺の癌（非小細胞肺癌を含む）、胃の癌、結腸直腸の癌、ならびに例えば、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、および慢性リンパ性白血病）、ＡＩＤＳ関連の癌（例えば、カポージ肉腫）；乳癌；骨肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、巨細胞腫瘍、アダマンチノーマ、および脊索腫）；脳の癌（例えば、髄膜腫、膠芽細胞腫、低悪性度星状細胞腫、乏突起細胞腫、下垂体腫瘍、神経鞘腫、および転移性脳腫瘍）；頭部および頚部の癌（例えば、種々のリンパ腫、例えば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、腺腫、扁平上皮癌、喉頭癌、胆嚢癌、および胆管癌）、網膜の癌（例えば、網膜芽腫）、食道癌、胃癌、多発性ミエローマ、卵巣の癌、子宮の癌、甲状腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、メラノーマ、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、頭部および頚部の癌、皮膚癌、鼻咽頭癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、子宮内膜癌、多剤耐性癌）；ならびに増殖性の疾患および状態（例えば、腫瘍血管形成に関連する新生血管形成）を含む。
【0039】
「候補変異体」、「コールされた変異体（ｃａｌｌｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）」、または「推定上の変異体」という用語は、例えば、変異していると決定されたゲノム中の位置における、ヌクレオチド配列の１つまたは複数の検出されたヌクレオチド変異体を指す。一般に、ヌクレオチド塩基は、試料から得られた配列リード上の代替対立遺伝子の存在に基づいてコールされた変異体とみなされ、この際、配列リードはそれぞれ、ゲノム中の位置にわたって交差する。候補変異体の供給源は、最初は未知または不確かであり得る。処理中、候補変異体は、ゲノムＤＮＡ（例えば、血液由来）または癌によって影響を受けた細胞（例えば、腫瘍由来）などの予想される供給源と関連付けられ得る。さらに、候補変異体は、真陽性（ｔｒｕｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）と呼ばれ得る。目的の変異体は、測定、定性、定量、または検出される遺伝子配列の特定の変異体である。いくつかの実施態様では、目的の変異体は、癌、腫瘍、または遺伝的障害などの状態に関連することが知られているか、またはその疑いがある変異体である。
【0040】
「無細胞核酸」、「無細胞ＤＮＡ」、または「ｃｆＤＮＡ」という用語は、個体の体内（例えば、血流）を循環し、１つもしくは複数の健常細胞および／または１つもしくは複数の癌細胞に由来する核酸断片を指す。さらに、ｃｆＤＮＡは、ウイルス、胎児などの他の供給源に由来し得る。
【0041】
「循環腫瘍ＤＮＡ」または「ｃｔＤＮＡ」という用語は、腫瘍細胞または他のタイプの癌細胞に由来する核酸断片を指し、死滅細胞のアポトーシスまたは壊死などの生物学的プロセスの結果として個体の血流中に放出され得るか、または生存腫瘍細胞によって能動的に放出され得る。
【0042】
本明細書で使用される場合、項目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの定義または記載された要素に関して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含まれた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、およびそれらの変形は、包含的またはオープンエンドであることを意味し、追加の要素を許容し、それによって、定義または記載された項目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどが、それらの特定の要素、または必要に応じてそれらの等価物を含み、他の要素が含まれ得、定義された項目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの範囲／定義内に依然として含まれ得ることを示す。
【0043】
「診断の（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）」または「診断された（ｄｉａｇｎｏｓｅｄ）」とは、病的状態の存在または性質を同定することを意味する。診断方法は、それらの感度および特異度が異なる。診断アッセイの「感度」は、陽性と判定された罹患個体の割合（「真陽性」の割合）である。そのアッセイにより検出されなかった罹患個体は「偽陰性」である。罹患しておらず、そのアッセイにより陰性と判定された対象は「真陰性」とよばれる。診断アッセイの「特異度」は、１から偽陽性率を引いたものであり、ここで、「偽陽性」率は、疾患を有さない、試験で陽性と判定された対象の割合として定義される。特定の診断方法が状態の決定的な診断を提供しない場合があるが、その方法が診断を補助する明確な指標を提供する場合、それは十分である。
【0044】
本明細書で使用される「有効量」は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。
【0045】
本明細書中で使用される場合、用語「断片化プロファイル」、「断片化パターンの位置依存的差異」、および「ゲノムにわたる位置依存的様式での断片サイズおよびカバレッジの差異」は同義であり、互換的に用いられ得る。本明細書中で使用される場合、用語「断片化プロファイル」、「断片化パターンの位置依存的差異」、および「ゲノムにわたる位置依存的様式での断片サイズおよびカバレッジの差異」は、等価であり、交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物でのｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの決定は、癌を有する哺乳動物を同定するために使用することができる。例えば、哺乳動物から（例えば、哺乳動物から得られた試料から）得られたｃｆＤＮＡ断片は低カバレッジ全ゲノム配列決定に供することができ、配列決定された断片はゲノムに（例えば、重複しないウィンドウで）マッピングされ、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するために評価され得る。本明細書に記載されるように、癌を有する哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、健常哺乳動物（例えば、癌を有さない哺乳動物）のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルよりも（例えば、断片長において）不均一である。したがって、本開示はまた、癌を有するかまたは有することが疑われる哺乳動物（例えば、ヒト）を評価、モニタリング、および／または処置するための方法および材料を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳動物が癌を有すると同定するための方法および材料を提供する。例えば、哺乳動物から得られた試料（例えば、血液試料）は、哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに少なくとも部分的に基づいて、哺乳動物における癌の存在および任意選択で癌の起源の組織を決定するために、評価され得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物を、癌を有するとしてモニタリングするための方法および材料が提供される。例えば、哺乳動物から得られた試料（例えば、血液試料）は、哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに少なくとも部分的に基づいて、哺乳動物における癌の存在を決定するために評価され得る。いくつかの実施形態において、哺乳動物を、癌を有するとして同定し、哺乳動物を治療するために哺乳動物に１つまたは複数の癌治療を施すための方法および材料が提供される。例えば、哺乳動物から得られた試料（例えば、血液試料）は、その哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに少なくとも部分的に基づいて哺乳動物が癌を有するかどうかを決定するために評価され得、１つまたは複数の癌治療をその哺乳動物に施すことができる。
【0046】
「ゲノム核酸」または「ゲノムＤＮＡ」という用語は、１つまたは複数の健常（例えば、非腫瘍）細胞に由来する染色体ＤＮＡを含む核酸を指す。様々な実施形態において、ゲノムＤＮＡは、白血球（ＷＢＣ）などの血液細胞系列に由来する細胞から抽出することができる。
【0047】
「任意選択の」または「任意選択で」は、その後に記載される事象または状況が起こり得るまたは起こり得ないこと、ならびにその記載が、その事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。
【0048】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、「または」という用語は、内容が明らかに別のことを指示しない限り、「および／または」を含む意味で一般に使用される。
【0049】
免疫原性組成物の「非経口」投与は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内注射、または注入技術を含む。
【0050】
「患者」または「個体」または「対象」という用語は、本明細書において互換的に使用され、治療される哺乳動物の対象を指し、ヒト患者が好ましい。いくつかの実施形態、本発明の方法は、実験動物において、獣医学的適用において、ならびにマウス、ラット、およびハムスターを含む齧歯類、ならびに霊長類を含むがこれらに限定されない疾患のための動物モデルの開発において用途を見出す。
【0051】
用語「参照ゲノム」は、本明細書で使用される場合、種または対象の代表例として組み立てられた、デジタルのまたは以前に同定された核酸配列データベースを指し得る。参照ゲノムは、複数の対象、試料または生物由来の核酸配列からアセンブルされてもよく、必ずしも単一の人の核酸構成を表すわけではない。参照ゲノムは、試料からの配列決定リードを染色体位置にマッピングするために使用され得る。例えば、ヒト対象ならびに多くの他の生物に使用されるための参照ゲノムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで見出される。
【0052】
「リードセグメント」または「リード」という用語は、個体から得られた配列リードを含む任意のヌクレオチド配列、および／または個体から得られた試料からの最初の配列リードに由来するヌクレオチド配列を指す。
【0053】
「試料」、「患者試料」、「生体試料」などの用語は、患者、個体、または対象から得られる様々な試料タイプを包含し、診断、予後および／またはモニタリングアッセイにおいて使用され得る。患者試料は、健常対象、罹患した患者、または肺癌を有する患者から得ることができる。ある実施形態では、「提供される」試料は、アッセイを行う人（または機械）によって得ることができるか、または別の人によって得て、アッセイを行う人（または機械）に移すことができる。また、患者から採取した試料を分割して、一部のみを診断に用いてもよい。さらに、試料またはその一部は、後の分析のために試料を維持する条件下で保存することができる。この定義は、特に、血液および生物学的起源の他の液体試料（末梢血、血清、血漿、臍帯血、羊水、脳脊髄液、尿、唾液、糞便および滑液を含むが、これらに限定されない）、生検標本または組織培養物等の固形組織試料またはそれらに由来する細胞およびそれらの子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）を包含する。ある実施形態では、試料は、脳脊髄液を含む。ある実施形態では、試料は血液試料を含む。別の実施形態では、試料は血漿試料を含む。さらに別の実施形態では、血清試料が使用される。「試料」の定義はまた、それらの調達後に、遠心分離、濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィー、試薬による処理、洗浄、または特定の細胞集団についての濃縮などの任意の方法で操作された試料を含む。これらの用語は臨床試料をさらに包含し、培養中の細胞、細胞上清、組織試料、臓器なども含む。試料はまた、新鮮凍結および／またはホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロック、例えば臨床または病理生検から調製されたブロック、免疫組織化学による病理分析または研究のために調製されたブロックを含んでもよい。
【0054】
「配列リード」という用語は、個体から得られた試料から読み取られたヌクレオチド配列を指す。配列リードは、当技術分野で公知の様々な方法によって得ることができる。
【0055】
本明細書で定義される場合、化合物または薬剤の「治療有効」量（すなわち、有効投与量）は、治療的に（例えば、臨床的に）望ましい結果をもたらすのに十分な量を意味する。組成物は、１日に１回または複数回から週に１回または複数回投与することができ、１日おきに１回を含む。当業者であれば、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の要因が、対象を効果的に治療するのに必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本発明の化合物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含むことができる。
【0056】
本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、障害および／またはそれに関連する症状を低減または改善することを指す。障害または状態を処置することは、排除されないが、障害、状態またはそれに関連する症状が完全に排除されることを必要としないことが理解される。
【0057】
遺伝子：本明細書中に開示される全ての遺伝子、遺伝子名、および遺伝子産物は、本明細書中に開示される組成物および方法が適用可能である任意の種由来のホモログに対応することが意図される。特定の種由来の遺伝子または遺伝子産物が開示される場合、この開示は、例示のみを意図しており、それが現れる文脈が明確に示さない限り、限定として解釈されるべきではないことが理解される。したがって、例えば、本明細書に開示される遺伝子または遺伝子産物については、他の種由来の相同および／またはオーソロガス遺伝子ならびに遺伝子産物を包含することが意図される。
【0058】
範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された全ての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【0059】
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な手数料の支払いに応じて特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【0060】
【図1】図１Ａは、アポトーシス肺癌細胞および白血球（ＷＢＣ）からのＤＮＡ断片化および放出の概略図である。様々な長さのリンカーＤＮＡを有するヌクレオソームＤＮＡは、ＷＢＣから生じるｃｆＤＮＡ断片と比較してより異常なプロファイルを有する癌細胞ｃｆＤＮＡ断片と共に循環中に保存される。ゲノムに沿ったｃｆＤＮＡ断片をマッピングし、短い断片対長い断片の比を計算することにより、非癌の個体とは異なる癌患者でのパターンが明らかになる。図１Ｂは、全体的なアプローチの概略図である。肺癌の早期検出のためのＤＥＬＦＩアプローチの概要。ＬＵＣＡＳ診断コホートからの合計３６５人の患者がゲノムワイド断片化プロファイルを導き出すために利用され、このゲノムワイド断片化プロファイルは、交差検証された機械学習モデルを使用してこのコホートにおける診断性能を訓練および評価するために使用された。固定モデルを使用して、４６人の肺癌患者および３８５人の非癌個体の独立コホートにおける性能を検証した。
【図2】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、肺癌患者および非癌個体の無細胞ＤＮＡ断片化プロファイルを示すグラフの読み出しおよびヒートマップである。図２Ａ：５Ｍｂビンにおけるゲノム全体にわたる長いｃｆＤＮＡ断片に対する短いｃｆＤＮＡ断片の比を、ＬＣＡＳコホートからの肺癌および非癌個体の血漿試料において評価した。非癌患者は、有意な変動を示した肺癌患者と比較して類似した断片化プロファイルを有していた。図２Ｂ：非癌個体の平均と比較した、肺癌を有する患者または非癌個体についてのゲノムにわたるｃｆＤＮＡ断片化特徴の偏差を表現したヒートマップ。全体的なＤＥＬＦＩスコアおよび臨床特性を、断片化偏差ヒートマップの左側に示す。図２Ｃ：断片化プロファイル特徴の主成分の固有値を表現したヒートマップ。特徴の相対的重要性は、ヒートマップの上部（断片化変化）および右（染色体腕変化）に示され、色は、癌リスクの係数の増加（ｇａｉｎ）（赤色）または減少（ｌｏｓｓ）（青色）を示す。肺腺癌（ｎ＝５１８）および扁平上皮細胞癌（ｎ＝５０１）における染色体腕の増加（赤色）および減少（青色）のＴＣＧＡ由来の観察を、右余白に示す。ＬＵＣＡＳにおける可変重要度バーの色とＴＣＧＡコピー数データとの間の一致は、それぞれ、ＬＵＣＡＳにおける染色体腕レベル表示の減少（青色）または増加（赤色）によるより高い癌リスクと、ＴＣＧＡにおけるコピー数増幅（赤色）およびコピー数欠失（青色）との間の対応を示す。
【図3】図３Ａ～３Ｃは、肺癌患者および非癌個体についてのＤＥＬＦＩ分析の性能を示す一連のプロットである。図３Ａ：ＬＵＣＡＳコホートにおける病期および組織型群によって層別化された、非癌個体および癌患者にわたるＤＥＬＦＩスコア分布。ボックスプロットは、中央値ＤＥＬＦＩスコアおよび四分位数間範囲を示し、個々の試料値はドットとしてオーバーレイされている。良性病変を有するかまたは有さない非癌症例は、癌症例と比較してより低いＤＥＬＦＩスコアを有し、段階的にＤＥＬＦＩスコアが徐々に増加する。最も高い中央値ＤＥＬＦＩスコアは、ＳＣＬＣ症例において観察される。ＲＯＣ図中の点線の垂直線は、決定境界として８０％の特異度を表す。図３Ｂ：全ＬＣＡＳコホートならびに病期および組織学によるＲＯＣ分析。図３Ｃ：ＤＥＬＦＩ固定モデルの分析およびＬＵＣＡＳコホートから決定された０．３４４のスコアカットオフを検証コホートに適用した。独立コホートにおけるこの分類子の性能は、すべての腫瘍病期にわたって特異度（左）および感度（右）の両方においてＬＵＣＡＳと同様であった。トレーニングセットおよび検証セットにおける試料数は、横軸のラベルに示されている。提示された間隔は、９０％信頼区間を反映する。
【図4】図４Ａ～４Ｃは、肺癌の大きさおよび侵襲性とＤＥＬＦＩスコアとの関係を示す一連のグラフである。図４Ａ：ＬＣＡＳコホートにおけるＴ病期またはＮ病期によって分類された肺癌を有する非転移性患者のＤＥＬＦＩスコアの箱ひげ図。Ｔ１～Ｔ４のＴ病期によるＤＥＬＦＩスコアの漸増が観察された（ｐ＜０．０１、Ｋｒｕｓｋａｌｌ－Ｗａｌｌｉｓ、ｄｆ＝３）。リンパ節の関与のない肺癌患者は、リンパ節転移を有する患者と比較して有意に低いＤＥＬＦＩスコアを有した（ウィルコクソン順位和検定、ｐ＜０．００１）。図４Ｂ：ＴおよびＮ病期によるＤＥＬＦＩスコアの段階的増加は、各患者においてＴおよびＮ病期の両方を考慮した場合に維持された（Ｋｒｕｓｋａｌｌ－Ｗａｌｌｉｓ、ｄｆ＝６、ｐ＜０．０１）。図４Ｃ：原発性肺癌を有する患者を、０．５のＤＥＬＦＩカットオフに基づいて２つの群に層別化した（ｎ＝９３）。ＤＥＬＦＩスコアが０．５超の患者は、ＤＥＬＦＩスコアが０．５未満の患者と比較して、癌特異的生存率が有意に悪かった。
【図5】図５Ａ～５Ｆは、ゲノムワイド断片化プロファイルがＳＣＬＣをＮＳＣＬＣから区別することができることを実証する、一連のプロット、ボックスグラフおよび教師なしクラスタリング分析である。図５Ａ：ＳＣＬＣ（ｎ＝７９）のＴＣＧＡ ＲＮＡ－ｓｅｑ分析におけるＡＳＣＬ１転写因子の発現は、ＮＳＣＬＣ（ｎ＝１０４６）またはＷＢＣ（７５５）試料と比較して高い。図５Ｂ：ＴＣＧＡ肺癌コホートにおける遺伝子発現の教師なしクラスタリング分析は、ＡＳＣＬ１結合部位を有する遺伝子がＳＣＬＣとＮＳＣＬＣとの間で差次的に発現されることを示す。ＬＵＣＡＳコホート患者におけるＡＳＣＬ１結合部位でのゲノムワイドｃｆＤＮＡ断片化分析は、非癌個体と比較したＳＣＬＣ患者（図５Ｃ）または他の個体と比較したＳＣＬＣを有するＤＥＬＦＩ陽性患者（図５Ｅ）の転写因子結合部位付近のカバレッジの減少を明らかにする。これらの分子特徴は、高い精度で、ＳＣＬＣ患者（ｎ＝１１）を非癌個体（ｎ＝１５８）（図５Ｄ、ＡＵＣ＝０．９２）から、ならびにＤＥＬＦＩ陽性ＳＣＬＣ患者（ｎ＝１０）をＮＳＣＬＣ患者およびその他（ｎ＝１１５）（図５Ｆ、ＡＵＣ＝０．９８）から区別することができる。
【図6】図６Ａ～６Ｇは、肺癌検診におけるＤＥＬＦＩの実装のモデル化を示す一連のグラフおよび概略図である。図６Ａ：肺癌検診の現在の臨床診療（上）およびＤＥＬＦＩ検査と組み合わせた提案されたアプローチ（下）の概略図。組み合わされたアプローチにおいて、肺癌に対し高リスクの個体は、ＤＥＬＦＩ試験によってスコア付けされる毎年の採血を受け、陽性結果を有する個体は、その後、ＬＤＣＴスキャンおよび肺癌の検出のためのその後の診断評価を受け、一方、ＤＥＬＦＩ陰性結果を有する個体は、毎年検診を繰り返す。図６Ｂ：肺癌検出のためのＤＥＬＦＩ単独、またはＤＥＬＦＩとそれに続くＬＤＣＴの感度を、単一または組合せ分析について８０％の特異度を仮定して決定した。これらの分析のために、本発明者らは、肺癌を有する個体を、ベースラインでＬＤＣＴにより検出されたものとみなしたが、３人の個体が、１年以内の反復ＬＤＣＴにおいて肺癌を有すると同定された。ＬＵＣＡＳコホートの個体数は以下の通りである。病期Ｉ ｎ＝１５、ＩＩ ｎ＝７、病期ＩＩＩ ｎ＝３５、病期ＩＶ ｎ＝７２；肺腺癌を有するコホート中の個体は、病期Ｉ ｎ＝８、病期ＩＩ ｎ＝３、病期ＩＩＩ ｎ＝１４、病期ＩＶ ｎ＝３７を含んでいた。個体数をドットの大きさで模式的に示し、表１に示す。図６Ｃ：ＬＤＣＴ単独ならびにＤＥＬＦＩの感度および特異度の不確実性をモデル化し、続いて、１００，０００人の高リスク個体の理論的集団におけるスクリーニングのためにＬＤＣＴを行った。これらの個体間の、検出された肺癌の数（図６Ｄ）、精度（図６Ｅ）、不必要な手順の割合（図６Ｆ）、および陽性予測値（図６Ｇ）についての予測分布は、肺癌の有病率ならびに画像によるおよび血液によるスクリーニングへのアドヒアランスの両方において変動を取り込んでいた。
【図7】図７は、ＬＵＣＡＳ診断コホートから分析された試料についての診断アルゴリズムの概略図である。ＬＵＣＡＳコホートの患者は、胸部Ｘ線または胸部ＣＴでの陽性所見の後に診断精密検査を受けた。全ての患者は、最初のイメージング所見を確認するために、来院時に血漿及び血清の採血、並びに胸部ＣＴを受けた。患者を、肺癌群について低い疑いおよび高い疑いに階層化した。低い疑いを有する患者（ｎ＝１５０）は、最長７年間臨床的およびＸ線撮影で追跡された。これらの患者のうち１４５人は、最後の追跡調査の時点で肺癌を発症していなかったが、これらの患者のうち５人は、病歴および画像化特性に基づいて診断された肺癌を有し、剖検で肺癌を有することが確認された。疑いの高い患者（ｎ＝２０８）は、ＰＥＴ－ＣＴスキャンおよび肺生検を含む追加の精密検査を受けた。これらの患者のうち８７人は非悪性結節と診断されたが、１２４人の患者は生検により組織学的に確認された肺癌を有していた。
【図8】図８Ａ～８Ｃは、様々なサイクルのＰＣＲ増幅を用いた、マッチしたＤＮａｓｅ消化リンパ球ＤＮＡにおける断片化プロファイルを示す一連のプロットである。図８Ａ：４サイクルのＰＣＲ（ｎ＝４）および１２サイクルのＰＣＲ（ｎ＝３）の技術的反復と比較した、増幅なしの同じ試料（０サイクルのＰＣＲ、ｎ＝１）の標準化された断片カバレッジ。増幅なしと比較して４サイクルのＰＣＲの影響は最小限であったが、１２サイクルは明らかに異なっていた。図８Ｂ：ＧＣ補正なしの断片化プロファイルの主成分分析は、０サイクルおよび４サイクルのＰＣＲ断片化プロファイルの類似性を強調する。図８Ｃ：４または１２サイクルＰＣＲライブラリーからの配列の断片レベルＧＣ補正は、増幅を伴わない天然に存在する断片化プロファイルに類似していたが、ビンレベルＧＣ補正は、４または１２サイクルＰＣＲライブラリーにおけるＧＣバイアスを部分的に軽減しただけであった。
【図9】図９は、５０回のトレーニング反復にわたる最終ＤＥＬＦＩモデルへの特徴寄与の変動のヒートマップ表現である。ヒートマップは、５０個のトレーニングセット（５フォールド×１０反復、横軸）にわたる各モデル特徴（縦軸）のスケーリングされた回帰係数を示す。灰色のボックスは、示された主成分（ＰＣ）を利用しないモデルを示す。右余白は、ＬＵＣＡＳ分析からの利用可能なデータを使用する外部検証に使用される最終モデルを表す。
【図10】図１０Ａ～１０Ｄは、非癌個体におけるＤＥＬＦＩスコアに対する喫煙状態、年齢、および共存症の影響を示す一連のグラフである。図１０Ａ：癌を有さない個体におけるＤＥＬＦＩスコアは、現在喫煙者対喫煙未経験者または喫煙経験者について（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、ｄｆ＝１５４、ｐ＝０．４７）、ならびにパックイヤー群にわたって（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、ｄｆ＝１５４、ｐ＝０．４７）類似していた。図１０Ｂ、１０Ｃ：癌を有さず、自己免疫疾患またはＣＯＰＤと診断された個体は、これらの状態を有さない個体と同様のＤＥＬＦＩスコアを有した（それぞれｐ＝０．２６、ｐ＝０．３７）。図１０Ｄ：ＤＥＬＦＩスコアは、臨床的に関連する年齢群間で相違がなかった（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ、ｄｆ＝２、ｐ＝０．１８）。
【図11】図１１は、非癌個体におけるＤＥＬＦＩスコアおよび血清タンパク質マーカーを示す一連のプロットである。健常個体におけるＤＥＬＦＩスコア（縦軸）と血清タンパク質レベル（横軸）との相関分析。ＣＲＰおよびＹＫＬ－４０レベルは、ＤＥＬＦＩスコアと弱い相関を有していた（スピアマン相関係数：それぞれ０．１７、ｐ＝０．０４；０．１２、ｐ＝０．０２）。ＩＬ－６（ｐ＝０．０８）またはＣＥＡ（ｐ＝０．５）とＤＥＬＦＩスコアとの間に相関はなかった。
【図12】図１２Ａ～１２Ｃは、ＤＥＬＦＩアプローチの性能と他のゲノムアプローチとの比較を示す一連のグラフである。図１２Ａ：ＬｕｃＡＳコホートにおけるＣｒｉｓｔｉａｎｏらの文献２３に記載されているモデル特徴およびＧＣバイアス補正の実装は、本明細書で実装されるモデルと比較して同様の性能を示すが、本ＤＥＬＦＩモデルは、高い特異度範囲でより高い感度を有する。図１２Ｂ：本ＤＥＬＦＩモデルは、ｉｃｈｏｒ分析または断片長中央値の評価よりも性能が優れている。ＲＯＣ図における点線の垂直線は、９５％、９０％および８０％の特異度を表す。図１２Ｃ：コホートによる断片サイズ中央値の比較は、非癌個体ならびに病期によって分けられた癌を有する患者について、ＬＵＣＡＳおよび検証コホートの両方について同様の断片長中央値を示す。
【図13】図１３は、肺癌検証コホートにおけるＤＥＬＦＩの性能を実証する一連のグラフである。３８５人の非癌個体および４６人の肺癌患者を含む検証コホートの分析は、異なる病期および組織学的サブタイプにわたってＬＣＡＳコホートと同様の性能測定基準を明らかにした。グラフは、固定カットオフがＬＣＡＳおよび検証コホートの両方に使用される場合のＤＥＬＦＩの特異度および感度を示す。各行は、上から下に示されるように、それぞれ７０％、７５％、８０％または８５％の特異度に対応する異なるＤＥＬＦＩスコアカットオフ（０．２５２、０．３０３、０．３４４または０．３７７）を表す。図中に示される間隔は、９０％信頼区間を反映する。
【図15】図１５Ａおよび１５Ｂは、肺癌患者および非癌個体についてのＤＥＬＦＩｍｕｌｔｉ分析の性能を示す一連のグラフである。図１５Ａ：病期および組織学的サブタイプにわたるＤＥＬＦＩｍｕｌｔｉスコア分布。図１５Ｂ：病期および組織学によるＤＥＬＦＩ ＲＯＣ曲線。ＲＯＣ図における点線の垂直線は、９５％、９０％および８０％の特異度を表す。
【図16】図１６Ａ～１６Ｄは、ＡＳＣＬ１結合部位におけるｃｆＤＮＡ断片サイズが、非癌個体およびＮＳＣＬＣ患者からＳＣＬＣを区別することができることを実証する一連のグラフである。ＬＵＣＡＳコホート患者におけるＡＳＣＬ１結合部位でのゲノムワイドｃｆＤＮＡ断片化分析は、非癌個体（図１６Ａ）または他の癌を有する個体（図１６Ｃ）と比較して、ＳＣＬＣ患者の転写因子結合部位付近の断片サイズが増加していることを明らかにしている。この分子的特徴は、高い精度で、ＳＣＬＣ患者を非癌個体から（図１６Ｂ、ＡＵＣ＝０．９１）、およびＳＣＬＣをＮＳＣＬＣ患者から（図１６Ｄ、ＡＵＣ＝０．９４）区別することができる。
【図17】図１７Ａおよび１７Ｂは、肺癌患者におけるＤＥＬＦＩスコアおよび臨床転帰を示すグラフである。図１７Ａ：ＤＥＬＦＩスコア０．５未満の病期ＩＶの原発性肺癌を有する患者は、ＤＥＬＦＩスコア０．５超の患者と比較して、有意に長い癌特異的生存率を示した。図１７Ｂ：ＤＥＬＦＩスコアが癌特異的全生存の独立予後因子であるかどうかを評価するために、本発明者らは、高いまたは低いＤＥＬＦＩスコア、組織型群、および病期を共変量として用いてコックス比例ハザード比を計算した。ＤＥＬＦＩスコア＞０．５を有する患者は、組織型群および病期について調整した後、ＤＥＬＦＩスコア＜０．５（ｐ＜０．００１）を有する患者と比較して、２．５３のＨＲを有した。間隔は、ハザード比の９５％信頼区間を示す。
【発明を実施するための形態】
【0061】
高リスク個体および究極的には一般集団の間で利用可能性を増すことができる標準治療の癌検診を改善するための非侵襲的アプローチの開発について、緊急の臨床ニーズが満たされていない。肺癌の早期検出のためのバイオマーカー開発は、スクリーニングの際、ならびに胸部画像化研究で小結節として同定された円形混濁における悪性腫瘍を識別するために、臨床な適用の可能性を有する８。血液または気道上皮におけるタンパク質９～１１、自己抗体１２、遺伝子発現プロファイル１３およびマイクロＲＮＡ１４の調査により、肺癌の早期検出のための有望なバイオマーカー候補が得られているが、年齢ならびに喫煙および他の状態への長期曝露によって誘導される全身性炎症によって影響を受ける可能性があるものもあり、臨床使用がまだ承認されていないものもある１４。
【0062】
液体生検分析における急速な技術および分析の進歩により、血液のｃｆＤＮＡコンパートメントにおける癌関連の特徴が同定され、癌の早期検出のための新しい道が提供された。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における突然変異は、腫瘍におけるこれらの改変の予備知識なしに初期段階の肺癌患者において直接検出することができる１５～１８。しかしながら、標的化された高カバレッジ配列決定によって評価され得る比較的少数の配列改変を考慮すると、癌を有する多くの個体は、そのようなアプローチによって見落とされる場合があり、クローン造血から生じる変化を排除するために白血球（ＷＢＣ）の配列決定を必要とする場合もある１６，１７，１９。初期段階の癌の検出感度を増加させるために、ＤＥＬＦＩ（初期遮断のための断片のＤＮＡ評価）２０と呼ばれるｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの分析のための機械学習を使用して、ゲノムワイドアプローチが開発された。この多特徴分析は、何百万ものｃｆＤＮＡ断片の同時評価を可能にし、検出することができる腫瘍由来エピゲノムおよびゲノム変化の数を増加させる。この研究では、方法が改善され、肺癌患者ならびに非癌個体を含む前向きに収集された診断コホートにおける肺癌検出に適用された。この方法を血漿タンパクバイオマーカーおよび血液細胞数と組み合わせ、それによって早期癌検出のためにゲノム、エピゲノム、タンパク、および細胞の特徴を調べる評価もまた、本明細書に開示される。この努力を通じて、早期肺癌検出のためにＤＥＬＦＩを他のマーカーおよび低線量らせんコンピュータ断層撮影（ＬＤＣＴ）と組み合わせて、非侵襲的液体生体検査アプローチを臨床に組み込むことができる臨床フレームワークが提供される。
【0063】
早期遮断のための断片のＤＮＡ評価（ＤＥＬＦＩ）
早期遮断のための断片のＤＮＡ評価（ＤＮＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｉｏｎ、ＤＥＬＦＩ）は以前に開発されたＣｒｉｓｔｉａｎｏ Ｓ，Ｌｅａｌ Ａ，Ｐｈａｌｌｅｎ ＪらのＧｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１９；５７０：３８５－９に記載されており、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、または胆管癌を有する２３６人の患者ならびに２４５人の健常個体のｃｆＤＮＡのゲノムワイドな断片化パターンを評価するために使用されている。これらの分析は、健常個体のｃｆＤＮＡプロファイルが白血球のヌクレオソーム断片化パターンを反映しているが、癌を有する患者では断片化プロファイルが変化したことを明らかにした。ＤＥＬＦＩは、９８％の特異度で７つの癌タイプの間で５７％から９９％超の範囲の検出感度を有し、７５％の症例で限られた数の部位に対して癌発生組織を同定した。ｃｆＤＮＡを（例えば、ＤＥＬＦＩを使用して）評価することは、癌の早期検出のためのスクリーニングアプローチを提供し、これは、癌を有する患者の治療成功の機会を増加させることができる。ｃｆＤＮＡを（例えば、ＤＥＬＦＩを使用して）評価することはまた、癌をモニタリングするためのアプローチを提供することができ、これは、癌を有する患者の治療の成功および転帰の改善の機会を増加させることができる。加えて、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、限られた量のｃｆＤＮＡから、安価な試薬および／または機器を使用して得ることができる。
早期遮断のための断片のＤＮＡ評価（ＤＮＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｉｏｎ、ＤＥＬＦＩ）は以前に開発されたＣｒｉｓｔｉａｎｏ Ｓ，Ｌｅａｌ Ａ，Ｐｈａｌｌｅｎ ＪらのＧｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１９；５７０：３８５－９に記載されており、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、または胆管癌を有する２３６人の患者ならびに２４５人の健常個体のｃｆＤＮＡのゲノムワイドな断片化パターンを評価するために使用されている。これらの分析は、健常個体のｃｆＤＮＡプロファイルが白血球のヌクレオソーム断片化パターンを反映しているが、癌を有する患者では断片化プロファイルが変化したことを明らかにした。ＤＥＬＦＩは、９８％の特異度で７つの癌タイプの間で５７％から９９％超の範囲の検出感度を有し、７５％の症例で限られた数の部位に対して癌発生組織を同定した。ｃｆＤＮＡを（例えば、ＤＥＬＦＩを使用して）評価することは、癌の早期検出のためのスクリーニングアプローチを提供し、これは、癌を有する患者の治療成功の機会を増加させることができる。ｃｆＤＮＡを（例えば、ＤＥＬＦＩを使用して）評価することはまた、癌をモニタリングするためのアプローチを提供することができ、これは、癌を有する患者の治療の成功および転帰の改善の機会を増加させることができる。加えて、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、限られた量のｃｆＤＮＡから、安価な試薬および／または機器を使用して得ることができる。
【0064】
したがって、ある実施形態では、対象における癌を診断する方法は、対象の生体試料から無細胞（ｃｆＤＮＡ）を抽出すること、抽出されたｃｆＤＮＡからゲノムライブラリーを生成し、ｃｆＤＮＡ断片の全ゲノム配列決定すること、ゲノム起源にｃｆＤＮＡ断片をマッピングし、断片長を評価し、各試料についてゲノムワイド断片化プロファイルを得ること、対象のタンパク質バイオマーカーを同定すること、対象のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよびタンパク質バイオマーカーを正常参照非癌対象と比較することを含む。ある実施形態において、癌は肺癌である。
【0065】
ある実施形態において、本方法は、対象を低線量らせんコンピュータ断層撮影（ＬＤＣＴ）に供することをさらに含む。ある実施形態において、本方法は、肺癌を有すると診断された対象と正常な非癌対象との間で臨床データを比較することをさらに含む。ある実施形態では、ｃｆＤＮＡ断片平均長およびプロファイルは、非癌個体間で類似している。ある実施形態では、癌対象のｃｆＤＮＡ断片プロファイルは変動する。ある実施形態では、１つまたは複数の腫瘍抗原、サイトカインまたはタンパク質の血清レベルが測定される。
【0066】
ある実施形態では、ＤＥＬＦＩスコアが生成され、主成分分析が機械学習予測モデルに組み込まれて、各対象についてのスコアが交差検証反復（ＤＥＬＦＩスコア）にわたる平均として生成される。ある実施形態において、非癌個体のＤＥＬＦＩスコアは、約０．３未満である。ある実施形態では、病期Ｉの癌のＤＥＬＦＩスコアは、約０．３～０．５未満である。ある実施形態において、病期ＩＩの癌についてのＤＥＬＦＩスコアは、約０．５～０．８未満である。ある実施形態において、病期ＩＩＩの癌についてのＤＥＬＦＩスコアは、約０．８～０．９９未満である。ある実施形態では、病期ＩＶのＤＥＬＦＩスコアは、約０．９９以上である。ある実施形態において、病期Ｉの癌のＤＥＬＦＩスコアは約０．３５である。ある実施形態において、病期ＩＩの癌のＤＥＬＦＩスコアは、約０．７５である。ある実施形態において、病期ＩＩＩの癌のＤＥＬＦＩスコアは、約０．９である。ある実施形態において、病期ＩＶの癌のＤＥＬＦＩスコアは、約０．９９である。
【0067】
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイル：ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、１つまたは複数のｃｆＤＮＡ断片化パターンを含み得る。ｃｆＤＮＡ断片化パターンは、任意の適切なｃｆＤＮＡ断片化パターンを含み得る。ｃｆＤＮＡ断片化パターンの例としては、断片サイズ中央値、断片サイズ分布、大きなｃｆＤＮＡ断片に対する小さなｃｆＤＮＡ断片の比、およびｃｆＤＮＡ断片のカバレッジが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡ断片化パターンは、中央値断片サイズ、断片サイズ分布、大きいｃｆＤＮＡ断片に対する小さいｃｆＤＮＡ断片の比、およびｃｆＤＮＡ断片のカバレッジのうちの２つ以上（例えば、２つ、３つ、または４つ）を含む。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ゲノムワイドｃｆＤＮＡプロファイル（例えば、ゲノムにわたるウィンドウ内のゲノムワイドｃｆＤＮＡプロファイル）であり得る。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、標的化領域プロファイルであり得る。標的化領域は、ゲノムの任意の適切な部分（例えば、染色体領域）であり得る。本明細書に記載されるようにｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定することができる染色体領域の例としては、染色体の一部（例えば、２ｑ、４ｐ、５ｐ、６ｑ、７ｐ、８ｑ、９ｑ、１０ｑ、１１ｑ、１２ｑ、および／または１４ｑの一部）および染色体腕（例えば、８ｑ、１３ｑ、１１ｑ、および／または３ｐの染色体腕）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、２つ以上の標的領域プロファイルを含み得る。
【0068】
いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡ断片長の変化（例えば、改変（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ））を同定するために、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを使用することができる。改変は、ゲノムワイドな改変または１つまたは複数の標的領域／遺伝子座における改変であり得る。標的領域は、１つまたは複数の癌特異的改変を含有する任意の領域であり得る。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを使用して、約１０個の改変～約５００個の改変（例えば、約２５～約５００、約５０～約５００、約１００～約５００、約２００～約５００、約３００～約５００、約１０～約４００、約１０～約３００、約１０～約２００、約１０～約１００、約１０～約５０、約２０～約４００、約３０～約３００、約４０～約２００、約５０～約１００、約２０～約１００、約２５～約７５、約５０～約２５０、または約１００～約２００個の改変）を同定（例えば、同時に同定）することができる。
【0069】
いくつかの実施形態では、腫瘍由来ＤＮＡを検出するために、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを使用することができる。例えば、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌を有するかまたは有することが疑われる哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを、参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイル（例えば、健常哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよび／または癌を有するかまたは有することが疑われる哺乳動物由来の健常細胞のヌクレオソームＤＮＡ断片化プロファイル）と比較することによって、腫瘍由来ＤＮＡを検出するために、使用することができる。いくつかの実施形態において、参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、健常哺乳動物から以前に生成されたプロファイルである。例えば、本明細書で提供される方法は、健常哺乳動物における参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するために使用することができ、その参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌を有するかまたは有することが疑われる哺乳動物における試験ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルとの将来の比較のために（例えば、コンピュータまたは他の電子記憶媒体に）記憶することができる。いくつかの実施形態において、健常哺乳動物の参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイル（例えば、保存されたｃｆＤＮＡ断片化プロファイル）は、全ゲノムにわたって決定される。いくつかの実施形態において、健常哺乳動物の参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイル（例えば、保存されたｃｆＤＮＡ断片化プロファイル）は、サブゲノム区間にわたって決定される。
【0070】
いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、哺乳動物（例えば、ヒト）を癌（例えば、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、胆管癌、および／または卵巣癌）を有すると同定するために使用することができる。
【0071】
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ｃｆＤＮＡ断片サイズパターンを含み得る。ｃｆＤＮＡ断片は、任意の適切なサイズであり得る。例えば、ｃｆＤＮＡ断片は、約５０塩基対（ｂｐ）～約４００ｂｐの長さであり得る。本明細書に記載されるように、癌を有する哺乳動物は、健常哺乳動物におけるｃｆＤＮＡ断片サイズ中央値よりも短いｃｆＤＮＡ断片サイズ中央値を含有するｃｆＤＮＡ断片サイズパターンを有し得る。健常哺乳動物（例えば、癌を有さない哺乳動物）は、約１６６．６ｂｐ～約１６７．２ｂｐ（例えば、約１６６．９ｂｐ）のｃｆＤＮＡ断片サイズ中央値を有するｃｆＤＮＡ断片サイズを有し得る。いくつかの実施形態において、癌を有する哺乳動物は、健常哺乳動物におけるｃｆＤＮＡ断片サイズよりも平均して約１．２８ｂｐ～約２．４９ｂｐ（例えば、約１．８８ｂｐ）短いｃｆＤＮＡ断片サイズを有し得る。例えば、癌を有する哺乳動物は、約１６４．１１ｂｐ～約１６５．９２ｂｐ（例えば、約１６５．０２ｂｐ）のｃｆＤＮＡ断片サイズ中央値を有するｃｆＤＮＡ断片サイズを有し得る。
【0072】
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を含み得る。本明細書に記載されるように、癌を有する哺乳動物は、健常哺乳動物におけるｃｆＤＮＡ断片サイズ分布よりも変動性であるｃｆＤＮＡサイズ分布を有し得る。いくつかの実施形態において、サイズ分布は、標的領域内であり得る。健常哺乳動物（例えば、癌を有さない哺乳動物）は、約１または約１未満の標的領域ｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有し得る。いくつかの実施形態では、癌を有する哺乳動物は、健常哺乳動物における標的領域ｃｆＤＮＡ断片サイズ分布よりも長い（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれ以上のｂｐで長い、またはこれらの数の間の任意の数の塩基対）標的領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有し得る。いくつかの実施形態では、癌を有する哺乳動物は、健常哺乳動物における標的領域ｃｆＤＮＡ断片サイズ分布よりも短い（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれ以上のｂｐで短い、またはこれらの数の間の任意の数の塩基対短い）標的領域ｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有し得る。いくつかの実施形態では、癌を有する哺乳動物は、健常哺乳動物における標的領域ｃｆＤＮＡ断片サイズ分布よりも約４７ｂｐ小さい～約３０ｂｐ長い標的領域ｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有することができる。いくつかの実施形態では、癌を有する哺乳動物は、平均してｃｆＤＮＡ断片の長さにおいて１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５、１７、１８、１９、２０ｂｐまたはそれ以上の差の標的領域ｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有することができる。例えば、癌を有する哺乳動物は、ｃｆＤＮＡ断片の長さが平均して約１３ｂｐ異なる標的領域ｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有し得る。いくつかの実施形態において、サイズ分布は、ゲノムワイドサイズ分布であり得る。健常哺乳動物（例えば、癌を有さない哺乳動物）は、ゲノムワイドで短いｃｆＤＮＡ断片および長いｃｆＤＮＡ断片の非常に類似した分布を有し得る。いくつかの実施形態では、癌を有する哺乳動物は、ゲノムワイドで、ｃｆＤＮＡ断片サイズの１つまたは複数の変化（例えば、増加および減少）を有し得る。１つまたは複数の改変は、ゲノムの任意の適切な染色体領域であり得る。例えば、変化は染色体の一部であり得る。ｃｆＤＮＡ断片サイズの１つまたは複数の変化を含有し得る染色体の部分の例としては、２ｑ、４ｐ、５ｐ、６ｑ、７ｐ、８ｑ、９ｑ、１０ｑ、１１ｑ、１２ｑ、および１４ｑの部分が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、改変は、染色体腕（例えば、染色体腕全体）にわたるものであり得る。
【0073】
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、大きいｃｆＤＮＡ断片に対する小さいｃｆＤＮＡ断片の比、および参照断片比に対する断片比の相関を含むことができる。本明細書で使用される場合、大きいｃｆＤＮＡ断片に対する小さいｃｆＤＮＡ断片の比に関して、小さいｃｆＤＮＡ断片は、約１００ｂｐ長～約１５０ｂｐ長であり得る。本明細書で使用される場合、大きいｃｆＤＮＡ断片に対する小さいｃｆＤＮＡ断片の比に関して、大きいｃｆＤＮＡ断片は、約１５１ｂｐ長～２２０ｂｐ長であり得る。本明細書に記載されるように、癌を有する哺乳動物は、健常哺乳動物よりも低い（例えば、２倍低い、３倍低い、４倍低い、５倍低い、６倍低い、７倍低い、８倍低い、９倍低い、１０倍低い、またはそれ以上低い）断片比の相関（例えば、１つまたは複数の健常哺乳動物由来のＤＮＡ断片比などの参照ＤＮＡ断片比に対するｃｆＤＮＡ断片比の相関）を有し得る。健常哺乳動物（例えば、癌を有さない哺乳動物）は、約１（例えば、約０．９６）の断片比の相関（例えば、１つまたは複数の健常哺乳動物由来のＤＮＡ断片比などの参照ＤＮＡ断片比に対するｃｆＤＮＡ断片比の相関）を有し得る。いくつかの実施形態では、癌を有する哺乳動物は、健常哺乳動物における断片比の相関（例えば、１つまたは複数の健常哺乳動物由来のＤＮＡ断片比などの参照ＤＮＡ断片比に対するｃｆＤＮＡ断片比の相関）よりも平均して約０．１９～約０．３０（例えば、約０．２５）低い断片比の相関（例えば、１つまたは複数の健常哺乳動物由来のＤＮＡ断片比などの参照ＤＮＡ断片比に対するｃｆＤＮＡ断片比の相関）を有し得る。
【0074】
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、全ての断片のカバレッジを含み得る。全ての断片のカバレッジは、カバレッジのウィンドウ（例えば、重複しないウィンドウ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、全ての断片のカバレッジは、小さな断片（例えば、約１００ｂｐ～約１５０ｂｐの長さの断片）のウィンドウを含み得る。いくつかの実施形態において、全ての断片のカバレッジは、大きな断片（例えば、約１５１ｂｐ～約２２０ｂｐの長さの断片）のウィンドウを含み得る。
【0075】
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、任意の適切な方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、癌を有するか、または癌を有することが疑われる哺乳動物）由来のｃｆＤＮＡを、全ゲノム配列決定（例えば、低カバレッジ全ゲノム配列決定）に供することができる配列決定ライブラリーに処理し、ゲノムにマッピングし、分析してｃｆＤＮＡ断片長を決定することができる。マッピングされた配列は、ゲノムをカバーする非重複ウィンドウにおいて分析することができる。ウィンドウは任意の適切なサイズとすることができる。例えば、ウィンドウは、数千から数百万の塩基長であり得る。１つの非限定的な例として、ウィンドウは、約５メガ塩基（Ｍｂ）長であり得る。任意の適切な数のウィンドウをマッピングすることができる。例えば、数十から数千のウィンドウをゲノムにマッピングすることができる。例えば、数百から数千のウィンドウをゲノム中にマッピングすることができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、各ウィンドウ内で決定することができる。
【0076】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および材料はまた、機械学習を含み得る。例えば、機械学習は、改変した断片化プロファイルを同定するために使用することができる（例えば、ｃｆＤＮＡ断片のカバレッジ、ｃｆＤＮＡ断片の断片サイズ、染色体およびｍｔＤＮＡのカバレッジを使用して）。
【0077】
バイオマーカー
ある実施形態において、患者からの１つまたは複数のバイオマーカーの検出は、以下の実施例の節において詳細に記載されるように、ＤＥＬＦＩと組み合わされる。ある実施形態では、１つまたは複数の腫瘍抗原、サイトカインまたはタンパク質の血清レベルが測定、比較等される。
ある実施形態において、患者からの１つまたは複数のバイオマーカーの検出は、以下の実施例の節において詳細に記載されるように、ＤＥＬＦＩと組み合わされる。ある実施形態では、１つまたは複数の腫瘍抗原、サイトカインまたはタンパク質の血清レベルが測定、比較等される。
【0078】
本明細書で使用される場合、「比較すること」または「比較」という用語は、患者由来の試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞局在が、標準または対照試料中の対応する１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞局在とどのように関連するかの評価を行うことを指す。例えば、「比較すること」は、患者由来の試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベル、または細胞局在が、標準または対照試料中の対応する１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベル、または細胞局在と同じであるか、より多いかもしくはより少ないか、または異なるかどうかを評価することを指し得る。より具体的には、この用語は、患者由来の試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベル、または細胞局在が、例えば、肺癌を有する患者、肺癌を有さない患者、心筋傷害の治療に応答している患者、心筋傷害の治療に応答していない患者、特定の心筋傷害治療に応答する可能性がない患者、または別の疾患もしくは状態を有する／有していない患者に対応する所定のバイオマーカーレベル／比の割合、レベル、または細胞局在と同じであるか、より多いかもしくはより少ないか、異なるか、またはそうでなければ対応する（もしくはしない）かどうかを評価することを指し得る。ある実施形態では、「比較すること」という用語は、患者由来の試料中の本発明の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルが、対照試料中の同じバイオマーカーのレベル／比（例えば、健常個体と相関する所定のレベル／比、肺癌レベル／比など）と同じであるか、より多いかまたはより少ないか、他とは異なるか、そうでなければ、対照試料中の同じバイオマーカーのレベル／比に対応する（または対応しない）かどうかを評価することを指す。別の実施形態では、「比較すること」または「比較」という用語は、患者由来の試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞局在が、同じ試料中の別のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞局在とどのように関連するかの評価を行うことを指す。例えば、同じ患者試料からのあるバイオマーカーと別のバイオマーカーとの比が比較され得る。別の実施形態では、試料中の１つのバイオマーカー（例えば、翻訳後改変されたバイオマーカータンパク質）のレベルを、試料中の同じバイオマーカー（例えば、改変されていないバイオマーカータンパク質）のレベルと比較することができる。改変：非改変バイオマーカータンパク質の比は、同じ試料中の他のタンパク質比または所定の参照もしくは対照比と比較され得る。
【0079】
バイオマーカーの関係が比率に関して記載されるある実施形態において、比率は、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、３６倍、３７倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、５１倍、５２倍、５３倍、５４倍、５５倍、５６倍、６３倍、６４倍、６５倍、６６倍、６７倍、６８倍、６９倍、７０倍、７１倍、７２倍、７３倍、７４倍、７５倍、７６倍、７７倍、７８倍、７９倍、８０倍、８１倍、８２倍、８３倍、８４倍、８５倍、８６倍、８７倍、８８倍、８９倍、９０倍、９１倍、９２倍、９３倍、９４倍、９５倍、９６倍、９７倍、９８倍、９９倍、１００倍またはそれ以上の差（より高いまたは低い）を含み得る。あるいは、その相違として、文脈に応じて、０．９倍、０．８倍、０．７倍、０．７倍、０．６倍、０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２倍、および０．１倍（より高いまたはより低い）を含み得る。前述のことはまた、範囲（例えば、１～５倍高いまたは低い）または閾値（例えば、少なくとも２倍高いまたは低い）に関して表現され得る。
【0080】
他の実施形態において、１つまたは複数のバイオマーカーの量の特定のセットまたはパターンは、罹患していない患者と相関され得る（すなわち、患者が癌、例えば肺癌を有さないことを示す）。ある実施形態では、本開示に従って使用される「示す」または「相関させる」は、診断の評価、癌または癌進行の予測、臨床治療の有効性の評価、特定の治療計画または医薬品に応答し得る患者の同定、治療の進行のモニタリングのための、およびスクリーニングアッセイの文脈において、抗癌治療薬の同定のための、バイオマーカーのレベル／比と標準値、対照値または比較値との間の関係を定量化する任意の線形または非線形方法によるものであり得る。
【0081】
ある実施形態において、検出されるバイオマーカーは腫瘍抗原である。ある実施形態では、１つまたは複数の腫瘍抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９－９、ＣＡ１２５、組織ポリペプチド抗原（ＴＳＡ）、ＣＹＦＲＡ－２１－１、ニューロン特異的エノラーゼ、プロガストリン放出ペプチド（ＰｒｏＧＲＰ）、血漿カリクレインＢ１（ＫＬＫＢ１）、血清中アミロイドＡ、ハプトグロビン－α－２、ＡＤＡＭ－１７、オステオプロテゲリン、ペントラキシン３、フォリスタチン、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ａまたはそれらの組合せを含む。
【0082】
ある実施形態において、１つまたは複数のタンパク質は、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、キチナーゼ－３－様タンパク質１（ＹＫＬ－４０／ＣＨＩ３Ｌ１）またはそれらの断片を含む。
【0083】
他の腫瘍抗原は、以下が挙げられる（ただし、示される癌指標は非限定的な例を示す）：アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、アネキシンＡ１、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６、様々な癌）、ＣＡ１２５（卵巣癌）、ＣＡ１５－３（癌腫）、ＣＡ１９－９（癌腫）、Ｌ６（癌腫）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ（癌腫）、Ｌｅｗｉｓ Ｘ（癌腫）、アルファ・フェトプロテイン（癌腫）、ＣＡ２４２（結腸直腸癌）、胎盤アルカリホスファターゼ（癌腫）、前立腺特異的抗原（前立腺癌）、前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺癌）、上皮増殖因子（癌腫）、ＣＤ２（Ｈｏｄｇｋｉｎ病、ＮＨＬリンパ腫、多発性骨髄腫）、ＣＤ３イプシロン（Ｔ細胞リンパ腫、肺癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、自己免疫疾患、悪性腹水）、ＣＤ１９（Ｂ細胞悪性腫瘍）、ＣＤ２０（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞腫瘍、自己免疫疾患）、ＣＤ２１（Ｂ細胞リンパ腫）、ＣＤ２２（白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ＳＬＥ）、ＣＤ３０（ホジキンリンパ腫）、ＣＤ３３（白血病、自己免疫疾患）、ＣＤ３８（多発性骨髄腫）、ＣＤ４０（リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５１（転移性黒色腫、肉腫）、ＣＤ５２（白血病）、ＣＤ５６（小細胞肺癌、卵巣癌、メルケル細胞癌、および液状腫瘍、多発性骨髄腫）、ＣＤ６６ｅ（癌腫）、ＣＤ７０（転移性腎細胞癌および非ホジキンリンパ腫）、ＣＤ７４（多発性骨髄腫）、ＣＤ８０（リンパ腫）、ＣＤ９８（癌腫）、ＣＤ１２３（白血病）、ムチン（癌腫）、ＣＤ２２１（固形腫瘍）、ＣＤ２２７（乳癌、卵巣癌）、ＣＤ２６２（ＮＳＣＬＣおよびその他の癌）、ＣＤ３０９（卵巣癌）、ＣＤ３２６（固形腫瘍）、ＣＥＡＣＡＭ３（結腸直腸癌、胃癌）、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅ）（乳癌、結腸直腸癌、肺癌）、ＤＬＬ４（Ａ－様－４（Ａ－ｌｉｋｅ－４））、ＥＧＦＲ（様々な癌）、ＣＴＬＡ４（悪性黒色腫）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ １８４，血液腫瘍、固形腫瘍）、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ（ＣＤ１０５、固形腫瘍）、ＥＰＣＡＭ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ、膀胱癌、頭頸部癌、結腸癌、ＮＨＬ前立腺癌、卵巣癌）、ＥＲＢＢ２（肺癌、乳癌、前立腺癌）、ＦＣＧＲ１（自己免疫疾患）、ＦＯＬＲ（葉酸受容体、卵巣癌）、ＦＧＦＲ（癌腫）、ＧＤ２ガングリオシド（癌腫）、Ｇ－２８（細胞表面抗原糖脂質、悪性黒色腫）、ＧＤ３イディオタイプ（癌腫）、熱ショックタンパク質（癌腫）、ＨＥＲ１（肺癌、胃癌）、ＨＥＲ２（乳癌、肺癌、および卵巣癌）、ＨＬＡ－ＤＲ１０（ＮＨＬ）、ＨＬＡ－ＤＲＢ（ＮＨＬ、Ｂ細胞白血病）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（癌腫）、ＩＧＦ１Ｒ（固形腫瘍、血液癌）、ＩＬ－２受容体（Ｔ細胞白血病およびリンパ腫）、ＩＬ－６Ｒ（多発性骨髄腫、ＲＡ、キャッスルマン病、ＩＬ６依存性腫瘍）、インテグリン（ανβ３、α５β１、α６β４、α１１β３、α５β５、ανβ５、様々な癌に対する）、ＭＡＧＥ－１（癌腫）、ＭＡＧＥ－２（癌腫）、ＭＡＧＥ－３（癌腫）、ＭＡＧＥ－４（癌腫）、抗トランスフェリン受容体（癌腫）、ｐ９７（悪性黒色腫）、ＭＳ４Ａ１（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｓｐａｎｎｉｎｇ ４－ｄｏｍａｉｎｓ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｍｅｍｂｅｒ １、非ホジキンＢ細胞リンパ腫、白血病）、ＭＵＣ１（乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、気管支癌、消化器癌）、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）（卵巣癌）、ＣＥＡ（結腸直腸癌）、ｇｐ１００（悪性黒色腫）、ＭＡＲＴＩ（悪性黒色腫）ＭＰＧ（悪性黒色腫）、ＭＳ４Ａ１（膜貫通４領域サブファミリーＡ、小細胞肺癌、ＮＨＬ）、ヌクレオリン、Ｎｅｕ癌遺伝子産物（癌腫）、Ｐ２１（癌腫）、ｎｅｃｔｉｎ－４（癌腫）、抗－（Ｎ－グリコリルノイラミン酸、乳癌、悪性黒色腫癌）のパラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）、ＰＬＡＰ様精巣アルカリホスファターゼ（卵巣癌、精巣癌）、ＰＳＭＡ（前立腺腫瘍）、ＰＳＡ（前立腺癌）、ＲＯＢ０４、ＴＡＧ７２（ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２、ＡＭＬ、胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌）、Ｔ細胞膜貫通タンパク質（癌）、Ｔｉｅ（ＣＤ２０２ｂ）、組織因子、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １０Ｂ、癌腫）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １３Ｂ、多発性骨髄腫、ＮＨＬ、その他の癌、ＲＡおよびＳＬＥ）、ＴＰＢＧ（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、腎細胞癌）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、リンパ種、ＮＨＬ、結腸直腸癌、肺癌）、ＶＣＡＭ－１（ＣＤ１０６、悪性黒色腫）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－２（ＣＤ３０９）（様々な癌）。いくつかの他の腫瘍関連抗原が概説されている（Ｇｅｒｂｅｒ，ｅｔ ａｌ，ｍＡｂｓ ２００９ １：２４７－２５３；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２００５ ５４：１８７－２０７、Ｆｒａｎｋｅ， ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ． ２０００，１５：４５９－７６、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３；１１９：４２１－４７５、Ｐａｒｍｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００７ １７８：１９７５－９）。これらの抗原の例としては、分化抗原群（ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤｌｌａ、ＣＤｌｌｂ、ＣＤｌｌｃ、ＣＤ１２ｗ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤｗｌ７、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１５６、ＣＤ１５８、ＣＤ１６３、ＣＤ１６６、．ＣＤ１６８、ＣＤ１８４、ＣＤｗｌ８６、ＣＤ１９５、ＣＤ２０２（ａ、ｂ）、ＣＤ２０９、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４）、アネキシンＡｌ、ヌクレオリン、エンドグリン（ＣＤ１０５）、ＲＯＢ０４、アミノペプチダーゼＮ、－ｌｉｋｅ－４（ＤＬＬ４）、ＶＥＧＦＲ－２（ＣＤ３０９）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）、Ｔｉｅ２、Ｂ７－Ｈ３、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６ Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、イディオタイプ（ｉｄｉｏｔｙｐｅ）、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非変異体、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＧＤ３、フコシルＧＭｌ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ Ａｌ、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰＩＢ Ｉ、ＰＬＡＣｌ、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ ２、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ－β、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｎｏｔｃｈ１、ＩＣＡＭ１およびＦｏｓ関連抗原１。
【0084】
治療方法
ある実施形態では、本明細書で具体化される方法は、哺乳動物を癌を有するものとして同定する。本方法は、ｃｆＤＮＡ断片の全ゲノム配列決定；ゲノム起源へのｃｆＤＮＡ断片のマッピングならびに断片長の評価および各試料についてのゲノムワイド断片化プロファイルの取得；対象のタンパク質バイオマーカーの同定；対象のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよびタンパク質バイオマーカーと正常参照非癌対象との比較を含む。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと比較し、哺乳動物から得られた試料中のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと異なる場合に、哺乳動物を癌を有すると同定する。
ある実施形態では、本明細書で具体化される方法は、哺乳動物を癌を有するものとして同定する。本方法は、ｃｆＤＮＡ断片の全ゲノム配列決定；ゲノム起源へのｃｆＤＮＡ断片のマッピングならびに断片長の評価および各試料についてのゲノムワイド断片化プロファイルの取得；対象のタンパク質バイオマーカーの同定；対象のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよびタンパク質バイオマーカーと正常参照非癌対象との比較を含む。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと比較し、哺乳動物から得られた試料中のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと異なる場合に、哺乳動物を癌を有すると同定する。
【0085】
ある実施形態において、対象は、癌、例えば、初期段階の癌を有すると診断される。ある実施形態では、癌のタイプが同定され、癌は、癌のタイプに特異的な治療法を含む様々な治療方法によって治療される。癌治療は、手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞毒性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法、標的療法、またはそれらの任意の組合せであり得る。本方法はまた、哺乳動物に癌治療（例えば、手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞毒性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法、標的療法、またはそれらの任意の組み合わせ）を施すことを含み得る。哺乳動物は、癌治療を受けた後に癌の存在についてモニターされ得る。
【0086】
癌療法は、一般に、化学治療および放射線治療の両方との様々な併用療法も含む。併用化学療法としては、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナム、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、Ｔｅｍoｚｏｌｏｍｉｄｅ（ＤＴＩＣの水性形態）、または前述の任意の類似体もしくは誘導体変異体が挙げられる。化学療法と生物学的療法との組み合わせは、生物化学療法として知られている。化学療法は、メトロノミック（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃ）化学療法として知られている低連続用量で投与することもできる。
【0087】
さらに別の併用化学療法としては、例えば、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メトウレドーパおよびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（特に、合成類似体トポテカンを含む）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；エネジイン系抗生物質などの抗生物質（例えば、カリキアミシン、特にカリキアミシンガモールおよびカリキアミシンオメガール；ダイネミシンＡなどのダイネミシン；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連するクロモプロテイン・エネディイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラルニシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラルニシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどのマイトマイシン類；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似物質；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナリン剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にＴ－２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガセトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなどの白金錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えばＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル－タンパク質転移酵素阻害剤、トランス白金；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体。
【0088】
免疫療法は、一般に、癌細胞を標的とし破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は単独で治療のエフェクターとして機能し得るか、または他の細胞を動員して実際に細胞死滅をもたらし得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合体化され得、そして単に標的化剤として作用し得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞、ならびにキメラ抗原受容体を発現するように改変されたこれらの細胞型の遺伝子操作された改変体が挙げられる。
【0089】
免疫療法は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の抑制を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫療法は、腫瘍ワクチン（例えば、全腫瘍細胞ワクチン、ペプチド、および組換え腫瘍関連抗原ワクチン）、または養子細胞療法（ＡＣＴ）（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ＴＩＬ、およびＬＡＫ細胞）である。Ｔ細胞は、特定の腫瘍抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて操作され得る。本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体（またはＣＡＲ）は、Ｔ細胞において発現された場合に、ＣＡＲの特異性をＴ細胞に付与する、目的の抗原に特異的な任意の操作された受容体を指し得る。標準的な分子技術を使用して作製されると、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞は、養子細胞移入などの技術を用いて患者に導入され得る。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、γ－ＩＦＮ産生 ＣＤ４および／もしくはＣＤ８ Ｔ細胞によって、ならびに／またはその組合せの投与前と比較して増強された細胞溶解活性によって特徴付けられる、個体において活性化されたＣＤ４および／またはＣＤ８ Ｔ細胞である。ＣＤ４および／またはＣＤ８ Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびインターロイキンからなる群から選択されるサイトカインの放出の増加を示し得る。ＣＤ４および／またはＣＤ８ Ｔ細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞であり得る。ある実施形態では、ＣＤ４および／またはＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｌｏｗの発現を有することを特徴とする。
【0090】
免疫療法は、１つまたは複数の癌抗原、特にタンパク質もしくはその免疫原性断片、前記癌抗原、特にタンパク質もしくはその免疫原性断片をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ、癌細胞溶解物、および／または腫瘍細胞からのタンパク質調製物を含む癌ワクチンであってもよい。本明細書中で使用される場合、癌抗原は、癌細胞中に存在する抗原性物質である。変異に起因する異常な構造を有する癌細胞において産生される任意のタンパク質は、基本的には、癌抗原として作用し得る。癌抗原は、基本的には、突然変異癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の産物、他の突然変異遺伝子の産物、過剰発現または異常発現細胞タンパク質、発癌性ウイルスによって産生される癌抗原、癌胎児性抗原、変化した細胞表面糖脂質および糖タンパク質、または細胞型特異的分化抗原であり得る。癌抗原の例には、ｒａｓおよびｐ５３遺伝子の異常産物が含まれる。他の例としては、組織分化抗原、突然変異タンパク質抗原、発癌性ウイルス抗原、癌－精巣抗原および血管または間質特異的抗原が含まれる。組織分化抗原は、ある種の組織に特異的なものである。変異タンパク質抗原は、正常細胞がこれらのタンパク質を含むはずがないので、癌細胞に対してはるかに特異的である可能性が高い。正常細胞は、それらのＭＨＣ分子上に正常タンパク質抗原を提示するが、癌細胞は、突然変異体バージョンを提示する。いくつかのウイルスタンパク質は癌の形成に関与しており、いくつかのウイルス抗原も癌抗原である。癌－精巣抗原は、主に精巣の生殖細胞において発現されるが、胎児の卵巣および栄養膜においても発現される抗原である。いくつかの癌細胞は、これらのタンパク質を異常に発現し、したがってこれらの抗原を提示し、これらの抗原に特異的なＴ細胞による攻撃を可能にする。このタイプの例示的な抗原は、ＣＴＡＧ１ ＢおよびＭＡＧＥＡ１、ならびに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ｖｌＩＩ変異体を標的とする１４マー皮内注射可能ペプチドワクチンであるＲｉｎｄｏｐｅｐｉｍｕｔである。Ｒｉｎｄｏｐｅｐｉｍｕｔは、本明細書に記載されるＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌシグナル伝達系の阻害剤と組み合わせて使用される場合、神経膠芽腫を治療するのに特に適している。また、通常は非常に少量しか産生されないが、その産生が癌細胞において劇的に増加するタンパク質は、免疫応答を誘発し得る。このようなタンパク質の例は、メラニン産生に必要な酵素チロシナーゼである。通常、チロシナーゼは微量で産生されるが、そのレベルは黒色腫細胞において非常に上昇する。癌胎児性の抗原は、癌抗原の別の重要なクラスである。例は、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。これらのタンパク質は、通常、胚発生の初期段階で産生され、免疫系が完全に発達するまでに消失する。従って、自己寛容はこれらの抗原に対して発達しない。異常タンパク質はまた、オンコウイルス（例えば、ＥＢＶおよびＨＰＶ）に感染した細胞によって産生される。これらのウイルスに感染した細胞は潜在ウイルスＤＮＡを含み、これが転写され、得られたタンパク質が免疫応答を生じる。癌ワクチンは、ペプチド癌ワクチンを含み得、これは、いくつかの実施形態では、個別化ペプチドワクチンである。いくつかの実施形態において、ペプチド癌ワクチンは、多価長ペプチドワクチン、マルチペプチドワクチン、ペプチドカクテルワクチン、ハイブリッドペプチドワクチン、またはペプチドパルス樹状細胞ワクチンである。
【0091】
免疫療法は、ポリクローナル抗体調製物の一部などの抗体であってもよく、またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体断片、二重特異性抗体または単鎖抗体であってもよい。本明細書に開示される抗体は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄｆｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片などの抗体断片を含む。いくつかの態様では、抗体またはその断片は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ１、Ｅｒｂ－Ｂ１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｅｒｂ－Ｂ２）、ＣＤ２０、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、ＴＲＡＩＬ受容体、上皮細胞接着分子、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、ムチン－１、ＣＤ３０、ＣＤ３３、またはＣＤ４０に特異的に結合する。
【0092】
モノクローナル抗体の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体）；ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２ｍＡｂ）；セツキシマブ（上皮成長因子受容体ＥＧＦＲに対するキメラモノクローナル抗体）；パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）；ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）；ザルツムマブ（抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ）；ネシツムマブ（抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ）；ＭＤＸ－２１０（ヒト化抗ＨＥＲ－２ 二重特異性抗体）；ＭＤＸ－２１０（ヒト化抗ＨＥＲ－２ 二重特異性抗体）；ＭＤＸ－４４７（ヒト化抗ＥＧＦ受容体 二重特異性抗体）；リツキシマブ（マウス／ヒトキメラ抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）;オビヌツズマブ（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）；オファツムマブ（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）；トシツムマブ－Ｉ １３１（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）；イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）；ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ）；ラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２ ｍＡｂ）；ラニビズマブ（抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ）；アフリベルセプト（ＩｇＧ１ Ｆｃに融合したＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメイン）；ＡＭＧ３８６（ＩｇＧ１ Ｆｃに融合したアンジオポエチン－１および－２結合ペプチド）；ダロツズマブ（抗ＩＧＦ－１Ｒ ｍＡｂ）；ゲムツズマブオゾガマイシン（抗ＣＤ３３ ｍＡｂ）；アレムツズマブ（抗Ｃａｍｐａｔｈ－１／ＣＤ５２ ｍＡｂ）；ブレンツキシマブベドチン（抗ＣＤ３０ ｍＡｂ）；カツマキソマブ（上皮細胞接着分子およびＣＤ３を標的とする二重特異性ｍＡｂ）；ナプツモマブ（抗５Ｔ４ ｍＡｂ）；ギレンツキシマブ（抗炭酸脱水酵素ｉｘ）；またはファルレツズマブ（抗葉酸受容体）。他の例には、ＰａｎｏｒｅｘＴＭなどの抗体が含まれる。（１７－１Ａ）（マウスモノクローナル抗体）；Ｐａｎｏｒｅｘ（ＭＡｂ１７－１Ａ）（マウスキメラモノクローナル抗体）；ＢＥＣ２（抗イディオタイプｍＡｂ、ＧＤエピトープを模倣する）（ＢＣＧを伴う）；Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ－１モノクローナル抗体）；ＳＭＡＲＴ Ｍ１９５ Ａｂ、ヒト化１３’１ ＬＹＭ－１（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、Ｏｖａｒｅｘ（Ｂ４３．１３、抗イディオタイプマウスｍＡｂ）；腺癌上のＥＧＰ４０（１７－１Ａ）汎癌抗原に結合する３６２２Ｗ９４ ｍＡｂ；Ｚｅｎａｐａｘ（ＳＭＡＲＴ抗Ｔａｃ（ＩＬ－２受容体）；ＳＭＡＲＴ Ｍ１９５ Ａｂ、ヒト化Ａｂ、ヒト化）；ＮｏｖｏＭＡｂ－Ｇ２（汎癌特異的Ａｂ）；ＴＮＴ（ヒストン抗原に対するキメラｍＡｂ）；ＴＮＴ（ヒストン抗原に対するキメラｍＡｂ）；Ｇｌｉｏｍａｂ－Ｈ（モノクローナル－ヒト化Ａｂ）；ＧＮＩ－２５０ Ｍａｂ；ＥＭＤ－７２０００（キメラ－ＥＧＦアンタゴニスト）；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（ヒト化ＩＬ．Ｌ．２抗体）；およびＭＤＸ－２６０二重特異性は、ＧＤ－２、ＡＮＡ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ ＩＤＩＯ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ ＡＢＬ ３６４ ＡｂまたはＩｍｍｕＲＡＩＴ－ＣＥＡを標的とする。抗体のさらなる例としては、以下が挙げられる：Ｚａｎｕｌｉｍｕｍａｂ（抗ＣＤ４ ｍＡｂ）、ケリキシマブ（抗ＣＤ４ ｍＡｂ）；イピリムマブ（ＭＤＸ－１０１；抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ）；トレミリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ）；ダクリズマブ（抗ＩＬ－２５／ＩＬ－２Ｒ ｍＡｂ）；バシリキシマブ（抗ＩＬ－２５／ＩＬ－２Ｒ ｍＡｂ）；ＭＤＸ－１１０６（抗ＰＤ１ ｍＡｂ）；ＧＩＴＲに対する抗体；ＧＣ１００８（抗ＴＧＦ－β抗体）；メテリムマブ／ＣＡＴ－１９２（抗ＴＧＦ－β抗体）；レルデリムマブ／ＣＡＴ－１５２（抗ＴＧＦ－β抗体）；ＩＤ１１（抗ＴＧＦ－β抗体）；デノスマブ（抗ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ）；ＢＭＳ－６６３５１３（ヒト化抗４－１ＢＢ ｍＡｂ）；ＳＧＮ－４０（ヒト化抗ＣＤ４０ ｍＡｂ）；ＣＰ８７０，８９３（ヒト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ）；インフリキシマブ（キメラ抗ＴＮＦ ｍＡｂ）；アダリムマブ（ヒト抗ＴＮＦ ｍＡｂ）；セルトリズマブ（ヒト化Ｆａｂ抗ＴＮＦ）；ゴリムマブ（抗ＴＮＦ）；エタネルセプト（ＩｇＧ１ Ｆｃに融合したＴＮＦＲの細胞外ドメイン）；ベラタセプト（Ｆｃに融合したＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン）；アバタセプト（Ｆｃに融合したＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン）；ベリムマブ（抗Ｂリンパ球刺激因子）；ムロモナブ－ＣＤ３（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）；オテリキシズマブ（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）；テプリズマブ（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）；トシリズマブ（抗ＩＬ６Ｒ ｍＡｂ）；ＲＥＧＮ８８（抗ＩＬ６Ｒ ｍＡｂ）；ウステキヌマブ（抗ＩＬ－１２／２３ ｍＡｂ）；ブリアキヌマブ（抗ＩＬ－１２／２３ ｍＡｂ）；ナタリズマブ（抗α４インテグリン）；ベドリズマブ（抗α４β７インテグリンｍＡｂ）；Ｔ１ｈ（抗ＣＤ６ ｍＡｂ）；エプラツズマブ（抗ＣＤ２２ ｍＡｂ）；エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ ｍＡｂ）；およびアタシセプト（Ｆｃと融合した膜貫通活性化因子およびカルシウム調節リガンド相互作用因子の細胞外ドメイン）。
【実施例】
【0093】
実施例１：無細胞ＤＮＡ断片化を用いた肺癌の早期検出
液体生検分析における急速な技術および分析の進歩により、末梢血中のｃｆＤＮＡ断片における癌関連の特徴が同定され、癌の非侵襲的検出のための新たな手段が提供された。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における突然変異またはメチル化は、腫瘍におけるこれらの変化の予備知識なしに、初期段階の肺癌患者において直接検出することができる１６～２１。標的化された高カバレッジ配列決定によって評価され得る比較的少数の配列またはエピジェネティックな変化を考慮すると、癌を有する多くの個体は、そのようなアプローチによって見落とされる可能性があり、クローン造血から生じる変化を排除するために白血球（ＷＢＣ）の配列決定も必要とし得る１７，１８，２２。初期段階の癌の検出感度を高めるために、ＤＥＬＦＩ（ＤＮＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｉｏｎ）２３と呼ばれるｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの分析のためのゲノムワイドアプローチが開発された。このアプローチは、ｃｆＤＮＡ「ｆｒａｇｍｅｎｔｏｍｅ」の見解を提供し、ゲノムにわたる数百万の天然に発生するｃｆＤＮＡ断片のサイズ分布および頻度の評価を可能にする。ｃｆＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｏｍｅは、ゲノム特性およびクロマチン特性の両方を包括的に表すことができるので、循環における多数の腫瘍由来変化を同定する可能性を有する。この研究において、この方法は、悪性および良性肺結節を有する患者ならびに他の臨床状態を有するものを含む非癌個体を含む前向きに収集された実世界コホートにおける肺癌検出および特徴付けのために利用された（図１Ａ、１Ｂ）。この努力を通じて、臨床において非侵襲性液体生検を組み込むためのフレームワークが提供され、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを肺癌検出のための他のマーカーおよびＬＤＣＴと組み合わせる。
液体生検分析における急速な技術および分析の進歩により、末梢血中のｃｆＤＮＡ断片における癌関連の特徴が同定され、癌の非侵襲的検出のための新たな手段が提供された。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における突然変異またはメチル化は、腫瘍におけるこれらの変化の予備知識なしに、初期段階の肺癌患者において直接検出することができる１６～２１。標的化された高カバレッジ配列決定によって評価され得る比較的少数の配列またはエピジェネティックな変化を考慮すると、癌を有する多くの個体は、そのようなアプローチによって見落とされる可能性があり、クローン造血から生じる変化を排除するために白血球（ＷＢＣ）の配列決定も必要とし得る１７，１８，２２。初期段階の癌の検出感度を高めるために、ＤＥＬＦＩ（ＤＮＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｉｏｎ）２３と呼ばれるｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの分析のためのゲノムワイドアプローチが開発された。このアプローチは、ｃｆＤＮＡ「ｆｒａｇｍｅｎｔｏｍｅ」の見解を提供し、ゲノムにわたる数百万の天然に発生するｃｆＤＮＡ断片のサイズ分布および頻度の評価を可能にする。ｃｆＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｏｍｅは、ゲノム特性およびクロマチン特性の両方を包括的に表すことができるので、循環における多数の腫瘍由来変化を同定する可能性を有する。この研究において、この方法は、悪性および良性肺結節を有する患者ならびに他の臨床状態を有するものを含む非癌個体を含む前向きに収集された実世界コホートにおける肺癌検出および特徴付けのために利用された（図１Ａ、１Ｂ）。この努力を通じて、臨床において非侵襲性液体生検を組み込むためのフレームワークが提供され、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを肺癌検出のための他のマーカーおよびＬＤＣＴと組み合わせる。
【0094】
方法
分析された研究集団
ＬＵＣＡＳ診断コホートは、Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ Ｕｎｉｔｅ、Ｂｉｓｐｅｂｊｅｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）の呼吸器内科において胸部Ｘ線または胸部ＣＴで陽性イメージング所見を示した３６８人の主に症状のある患者の前向きに収集されたコホートである。研究は、２０１２年９月から２０１３年３月までの７ヶ月にわたって行われ、全ての患者は、死亡または２０２０年４月まで臨床的追跡調査を受けた。全ての患者は、肺癌の可能性のある診断がなされる前に、彼らの最初の来診時に血液試料を採取された。ゲノム配列決定から品質管理に合格した３６５人の患者からの試料を、その後の分析に含めた。分析されたコホートは、以前、ベースライン、または将来の癌を有さない１５８人の患者、ベースラインの肺癌を有する１２９人の患者、および採血時に癌を有さないが、初期または後期癌のいずれかを有する７８人の患者を含んだ（図６、表１）。検証コホートは、デンマークおよびオランダにおける結腸直腸癌についての２つのスクリーニングコホートからの３８５人の非癌個体、ならびにＢｉｏＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を通じた独立した前向き収集から病理学的に確認された主に初期段階の肺癌を有する４６人の患者からなっていた。肺癌患者の検証コホートは、収集時に肺癌の新たな診断を受けた。
分析された研究集団
ＬＵＣＡＳ診断コホートは、Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ Ｕｎｉｔｅ、Ｂｉｓｐｅｂｊｅｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）の呼吸器内科において胸部Ｘ線または胸部ＣＴで陽性イメージング所見を示した３６８人の主に症状のある患者の前向きに収集されたコホートである。研究は、２０１２年９月から２０１３年３月までの７ヶ月にわたって行われ、全ての患者は、死亡または２０２０年４月まで臨床的追跡調査を受けた。全ての患者は、肺癌の可能性のある診断がなされる前に、彼らの最初の来診時に血液試料を採取された。ゲノム配列決定から品質管理に合格した３６５人の患者からの試料を、その後の分析に含めた。分析されたコホートは、以前、ベースライン、または将来の癌を有さない１５８人の患者、ベースラインの肺癌を有する１２９人の患者、および採血時に癌を有さないが、初期または後期癌のいずれかを有する７８人の患者を含んだ（図６、表１）。検証コホートは、デンマークおよびオランダにおける結腸直腸癌についての２つのスクリーニングコホートからの３８５人の非癌個体、ならびにＢｉｏＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を通じた独立した前向き収集から病理学的に確認された主に初期段階の肺癌を有する４６人の患者からなっていた。肺癌患者の検証コホートは、収集時に肺癌の新たな診断を受けた。
【0095】
試料収集および保存
ＬＵＣＡＳコホートの試料収集は、スクリーニング来診時に採取され、以下のように実施された。静脈末梢血を１本のＫ２－ＥＤＴＡチューブおよび２本の血清ゲルチューブに採取した。２時間以内に、採血管を２３３０ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。遠心分離後、ＥＤＴＡ血漿および血清を等分し、それぞれｃｆＤＮＡおよびタンパク質分析のために－８０℃で保存した。
ＬＵＣＡＳコホートの試料収集は、スクリーニング来診時に採取され、以下のように実施された。静脈末梢血を１本のＫ２－ＥＤＴＡチューブおよび２本の血清ゲルチューブに採取した。２時間以内に、採血管を２３３０ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。遠心分離後、ＥＤＴＡ血漿および血清を等分し、それぞれｃｆＤＮＡおよびタンパク質分析のために－８０℃で保存した。
【0096】
検証コホートでは、各個体の静脈末梢血を１本のＥＤＴＡチューブに採取した。採血から２時間以内に、チューブを低速（１５００～３０００ｇ）で１０～１５分間遠心分離した。遠心分離後、ＥＤＴＡ血漿を等分し、ｃｆＤＮＡ分析のために－８０℃で保存した。
【0097】
配列決定ライブラリー調製
循環無細胞ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を使用して２～４ｍｌの血漿から単離し、０．０４％アジ化ナトリウム（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を含む５２μｌのＲＮａｓｅフリー水で溶出し、ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ）にて－２０℃で保存した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｃｆＤＮＡの濃度および品質を評価した。
循環無細胞ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を使用して２～４ｍｌの血漿から単離し、０．０４％アジ化ナトリウム（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を含む５２μｌのＲＮａｓｅフリー水で溶出し、ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ）にて－２０℃で保存した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｃｆＤＮＡの濃度および品質を評価した。
【0098】
次世代配列決定（ＮＧＳ）ｃｆＤＮＡライブラリーを、利用可能な場合は１５ｎｇのｃｆＤＮＡ、または１５ｎｇ未満の場合は全精製量を使用して、ＷＧＳのために調製した。検証コホートのために、最大１２５ｎｇの利用可能なｃｆＤＮＡを、ライブラリー調製のための投入材料として使用した。簡潔に述べると、ゲノムライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））を使用して、製造業者のガイドラインに４つの主要な修正を加えて調製した：（ｉ）ライブラリー精製工程は、ビーズ上ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）アプローチを使用して、溶出およびチューブ移動工程中の試料損失を最小限にする；（ｉｉ）ＮＥＢＮｅｘｔ末端修復、Ａ－テーリングおよびアダプターライゲーション酵素およびバッファー容量を、ビーズ上ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ精製戦略に適合するように適切に調整した；（ｉｉｉ）Ｉｌｌｕｍｉｎａデュアルインデックスアダプターをライゲーション反応に使用した；および（ｉｖ）ｃｆＤＮＡライブラリーをＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで増幅した。全ての試料は、ＤＮＡライゲーション工程後に４サイクルのＰＣＲ増幅を受けた。
【0099】
合計で、ＬＵＣＡＳコホートについてｃｆＤＮＡライブラリー調製の２３バッチを実施した。各バッチは、癌患者および非癌対照の組み合わせを含んでいた。全てのバッチは、異なる日に実施されたバッチにわたる配列決定の一貫性を評価するために、ヌクレアーゼ消化ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）から得られたヌクレオソームＤＮＡの技術的複製物を含んだ。ライブラリー調製中にＤＮＡ汚染がないことを確実にするために、ＤＮＡ試料の代わりに緩衝液ＴＥ ｐＨ８．０を使用した陰性ライブラリー対照を定期的に含めた。検証コホートを上記と同じ様式で調製し、実施形態および対照を含む４８５個の試料を３３個のバッチに展開した。
【0100】
低カバレッジ全ゲノム配列決定およびアラインメント
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００プラットフォーム上でゲノム当たり１～２倍のカバレッジで１００ｂｐペアエンドラン（２００サイクル）を使用して、癌患者および癌のない個体の全ゲノムライブラリーを配列決定した。アラインメントの前に、アダプター配列を、ｆａｓｔｐソフトウェア３４を使用してリードからフィルタリングした。配列リードを、Ｂｏｗｔｉｅ２を用いてｈｇ１９ヒト参照ゲノムに対してアライメントさせ３５、Ｓａｍｂａｍｂａを使用して重複リードを除去した３６。アラインメント後、各アラインメントされた対を、配列決定されたＤＮＡ断片を表すゲノム区間に、ベッドツール（Ｂｅｄｔｏｏｌｓ）を使用して変換した３７。３０以上のｍａｐｑスコアを有するリードのみを保持した。リード対は、Ｄｕｋｅ Ｅｘｃｌｕｄｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｌａｃｋｌｉｓｔ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＴｒａｃｋＵｉ？ｄｂ＝ｈｇ１９＆ｇ＝ｗｇＥｎｃｏｄｅＭａｐａｂｉｌｉｔｙ；Ａｍｅｍｉｙａ，Ｈ．Ｍ．，Ｋｕｎｄａｊｅ，Ａ．＆Ｂｏｙｌｅ，Ａ．Ｐ．Ｔｈｅ ＥＮＣＯＤＥ Ｂｌａｃｋｌｉｓｔ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｂｌｅｍａｔｉｃ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，９３５４（２０１９）。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－４５８３９－ｚ）により提供された問題のある領域に重なる場合はさらにフィルタリングされた。低カバレッジ全ゲノム配列決定から推定可能なゲノムにわたる断片化における大規模なエピジェネティックな差異（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）を捕捉するために、ｈｇ１９参照ゲノムを、ゲノムの約２．４ＧＢに及ぶ４７３個の非重複５Ｍｂビンにタイル分割した。全てのビンは、平均ＧＣ含量０．３以上および平均マッピング可能性０．９以上を有した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００プラットフォーム上でゲノム当たり１～２倍のカバレッジで１００ｂｐペアエンドラン（２００サイクル）を使用して、癌患者および癌のない個体の全ゲノムライブラリーを配列決定した。アラインメントの前に、アダプター配列を、ｆａｓｔｐソフトウェア３４を使用してリードからフィルタリングした。配列リードを、Ｂｏｗｔｉｅ２を用いてｈｇ１９ヒト参照ゲノムに対してアライメントさせ３５、Ｓａｍｂａｍｂａを使用して重複リードを除去した３６。アラインメント後、各アラインメントされた対を、配列決定されたＤＮＡ断片を表すゲノム区間に、ベッドツール（Ｂｅｄｔｏｏｌｓ）を使用して変換した３７。３０以上のｍａｐｑスコアを有するリードのみを保持した。リード対は、Ｄｕｋｅ Ｅｘｃｌｕｄｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｌａｃｋｌｉｓｔ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＴｒａｃｋＵｉ？ｄｂ＝ｈｇ１９＆ｇ＝ｗｇＥｎｃｏｄｅＭａｐａｂｉｌｉｔｙ；Ａｍｅｍｉｙａ，Ｈ．Ｍ．，Ｋｕｎｄａｊｅ，Ａ．＆Ｂｏｙｌｅ，Ａ．Ｐ．Ｔｈｅ ＥＮＣＯＤＥ Ｂｌａｃｋｌｉｓｔ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｂｌｅｍａｔｉｃ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，９３５４（２０１９）。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－４５８３９－ｚ）により提供された問題のある領域に重なる場合はさらにフィルタリングされた。低カバレッジ全ゲノム配列決定から推定可能なゲノムにわたる断片化における大規模なエピジェネティックな差異（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）を捕捉するために、ｈｇ１９参照ゲノムを、ゲノムの約２．４ＧＢに及ぶ４７３個の非重複５Ｍｂビンにタイル分割した。全てのビンは、平均ＧＣ含量０．３以上および平均マッピング可能性０．９以上を有した。
【0101】
全ゲノム断片特徴
４７３ビンにわたる、長い（１５１～２２０ｂｐ）断片に対する短い（１００～１５０ｂｐ）断片の数の比を、ＧＣ含量およびライブラリーサイズについて正規化した。ＧＣ関連バイアスは主にＰＣＲ中の優先的な断片の増幅に起因しているので４０、断片レベルＧＣ調整のためにノンパラメトリック法を開発した。ＬＵＣＡＳコホートにおける各個体について、断片を、０と１の間（１は、全てのＧおよびＣヌクレオチドを有する断片を示す）の１００個の可能なＧＣ層のうちの１つに割り当て、各ＧＣ層内の断片の総数を得た。同様に、５４個の非癌試料のホールドアウトセットについてＧＣ層ごとの断片数の分布と、その５４個の分布の中央値を求め、ターゲット分布とした。ＬＵＣＡＳにおける試料間ＰＣＲバイアスを正規化するために、ＧＣ層ｉにおける断片のコレクションに、以下のような重みｗｉを割り当てた。
ここで、ｔｉはターゲット分布における断片の数を示し、Ｎｉは階層ｉにおける断片の総数を示し、ｉ＝１，．１００である。短い断片および長い断片のＧＣ調整された数を、各５Ｍｂビンについて、そのビンに整列された断片についての重みの合計として計算し、それによって、ＧＣバイアスにおける試料間の変動ならびにライブラリーサイズにおける差異の両方を正規化した。ＧＣ調整短対長比の断片化プロファイルを、ゲノム全体にわたって平均０および単位標準偏差を有するように標準化した。
４７３ビンにわたる、長い（１５１～２２０ｂｐ）断片に対する短い（１００～１５０ｂｐ）断片の数の比を、ＧＣ含量およびライブラリーサイズについて正規化した。ＧＣ関連バイアスは主にＰＣＲ中の優先的な断片の増幅に起因しているので４０、断片レベルＧＣ調整のためにノンパラメトリック法を開発した。ＬＵＣＡＳコホートにおける各個体について、断片を、０と１の間（１は、全てのＧおよびＣヌクレオチドを有する断片を示す）の１００個の可能なＧＣ層のうちの１つに割り当て、各ＧＣ層内の断片の総数を得た。同様に、５４個の非癌試料のホールドアウトセットについてＧＣ層ごとの断片数の分布と、その５４個の分布の中央値を求め、ターゲット分布とした。ＬＵＣＡＳにおける試料間ＰＣＲバイアスを正規化するために、ＧＣ層ｉにおける断片のコレクションに、以下のような重みｗｉを割り当てた。
【数2】
【0102】
断片化プロファイルに加えて、染色体腕および全ｃｆＤＮＡ断片化のゲノムワイド概要についてもｚスコアを計算した。３９の常染色体腕の各々についてのＺスコアは、参照セット２３，４１として使用される５４の非癌試料における対応する腕特異的カウントの平均および標準偏差によって、各腕についての総ＧＣ調整断片カウントをセンタリングおよびスケーリングすることによって得られた。各試料についての全体的なｃｆＤＮＡ断片化サイズを要約するために、本発明者らは、マルチヌクレオソーム（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ）（２５０ｂｐ以上）対モノヌクレオソーム（２５０ｂｐ未満）断片の比を計算した。
【0103】
ＴＣＧＡからの公開データベースに基づく分析
パッケージＲＴＣＧＡ ｖ１．１６．０５１を使用して、ＴＣＧＡにおける２つの肺癌コホート（ＬＵＡＤ ｎ＝５１８およびＬＵＳＣ ｎ＝５０１）からのコピー数データを検索した。腫瘍対正常対数コピー比値を腫瘍型特異的閾値５２と比較して、コピーの増加および喪失を有するゲノム領域を同定した。ゲノムにわたる５Ｍｂビンの各々におけるコピー数状態を、増加（ｇａｉｎ）または喪失（ｌｏｓｓ）を保有するセグメントによるビン間隔の９０％の最小カバレッジを必要とすることによって決定した。ゲノムビンにおけるコピー増加および喪失の頻度を、ＴＣＧＡにおける肺癌コホートの各々について計算した。
パッケージＲＴＣＧＡ ｖ１．１６．０５１を使用して、ＴＣＧＡにおける２つの肺癌コホート（ＬＵＡＤ ｎ＝５１８およびＬＵＳＣ ｎ＝５０１）からのコピー数データを検索した。腫瘍対正常対数コピー比値を腫瘍型特異的閾値５２と比較して、コピーの増加および喪失を有するゲノム領域を同定した。ゲノムにわたる５Ｍｂビンの各々におけるコピー数状態を、増加（ｇａｉｎ）または喪失（ｌｏｓｓ）を保有するセグメントによるビン間隔の９０％の最小カバレッジを必要とすることによって決定した。ゲノムビンにおけるコピー増加および喪失の頻度を、ＴＣＧＡにおける肺癌コホートの各々について計算した。
【0104】
機械学習および交差検証分析
初期および後期癌検出のための予測モデルを開発するために５分割交差検証を使用し、特徴選択およびモデル開発を５分割のうちの４分割（トレーニングセット）で評価し、５番目のホールドアウト分割はモデル性能を評価するためだけに使用した（試験セット）。トレーニングおよび試験に利用可能な試料の総数は、以前、ベースライン、または将来の癌を有さない１５８人の参加者、および採血時に癌を有する１２９人の患者を含む。以前または将来の癌を有する患者（ｎ＝７８）は、訓練または試験に使用されなかった。トレーニングのために利用可能な試料の数に対する断片化特徴は高次元であるため、主成分分析を各トレーニングセット内で実施して、特徴空間の次元を低減し、試料間の断片化プロファイルの分散の９０％を説明するのに必要な主成分を最小数に保持した。主成分特徴に加えて、全ての３９のｚスコアを、ＬＡＳＳＯのペナルティを用いてロジスティック回帰モデルにおいて評価した。解析における０．００１７の最適化されたＬＡＳＳＯペナルティは、Ｒのｃａｒｅｔパッケージを使用してリサンプリングすることによって得られた。各試料について導出されたＤＥＬＦＩスコアは、１０回の交差検証反復にわたる平均スコアに対応する。特徴選択（主成分分析）およびＬＡＳＳＯモデルの両方が、トレーニングセット中の試料に対してのみ評価されたので、このアプローチは、モデル性能の偏りのない推定値を提供する。
初期および後期癌検出のための予測モデルを開発するために５分割交差検証を使用し、特徴選択およびモデル開発を５分割のうちの４分割（トレーニングセット）で評価し、５番目のホールドアウト分割はモデル性能を評価するためだけに使用した（試験セット）。トレーニングおよび試験に利用可能な試料の総数は、以前、ベースライン、または将来の癌を有さない１５８人の参加者、および採血時に癌を有する１２９人の患者を含む。以前または将来の癌を有する患者（ｎ＝７８）は、訓練または試験に使用されなかった。トレーニングのために利用可能な試料の数に対する断片化特徴は高次元であるため、主成分分析を各トレーニングセット内で実施して、特徴空間の次元を低減し、試料間の断片化プロファイルの分散の９０％を説明するのに必要な主成分を最小数に保持した。主成分特徴に加えて、全ての３９のｚスコアを、ＬＡＳＳＯのペナルティを用いてロジスティック回帰モデルにおいて評価した。解析における０．００１７の最適化されたＬＡＳＳＯペナルティは、Ｒのｃａｒｅｔパッケージを使用してリサンプリングすることによって得られた。各試料について導出されたＤＥＬＦＩスコアは、１０回の交差検証反復にわたる平均スコアに対応する。特徴選択（主成分分析）およびＬＡＳＳＯモデルの両方が、トレーニングセット中の試料に対してのみ評価されたので、このアプローチは、モデル性能の偏りのない推定値を提供する。
【0105】
モデル性能のさらなる尺度として、ＬＣＡＳ研究において１５８人の非癌個体およびベースライン肺癌を有する１２９人の患者すべてを使用して最終モデルを得て、非癌個体（ｎ＝３８５）および主に初期段階の癌（ｎ＝４６）の独立コホート（検証セット）においてこの固定モデルを評価した。固定モデルを使用して、予測スコアを検証セットにおける各個体について得て、８０％の所望の特異度を提供するＬUＣＡＳからの固定カットオフを使用して各個体を非癌または癌として分類した。注目すべきことに、検証コホートからの試料は、試料収集、ライブラリー調製、および配列決定に関して、ＬＵＣＡＳコホートから完全にバッチ非依存的であった。
【0106】
断片化特徴に加えて、臨床および血清タンパク質マーカーが予測をさらに改善することができるかどうかを評価するために、反復５分割交差検証アプローチを使用してマルチモーダル予測モデルを評価した。主成分分析およびｚスコアによって要約された断片化特徴を、特徴選択およびモデルパラメータの推定の両方が試験セットから独立しているように、上記のように評価した。臨床および血清タンパク質マーカーについては、年齢、喫煙歴、ＣＯＰＤ状態、およびＣＥＡを含めた。ＬＡＳＳＯペナルティを伴うロジスティック回帰モデルを使用して、各トレーニングフォールドにおける断片化、臨床、およびタンパク質バイオマーカー特徴を評価した。
【0107】
ＬＵＣＡＳコホートにおける処置
全ての患者は、１）一次手術、２）治癒目的の併用化学療法および放射線療法、３）標準的な対症的全身腫瘍学的処置（化学療法または標的療法のいずれかを伴う）、または４）最良の支持療法（全て、ＥＳＭＯガイドライン４２～４４と一致した２０１２～１３年の肺癌に対するデンマーク国の治療ガイドラインに従う）のいずれかに対する適格性について診断後に評価された。
全ての患者は、１）一次手術、２）治癒目的の併用化学療法および放射線療法、３）標準的な対症的全身腫瘍学的処置（化学療法または標的療法のいずれかを伴う）、または４）最良の支持療法（全て、ＥＳＭＯガイドライン４２～４４と一致した２０１２～１３年の肺癌に対するデンマーク国の治療ガイドラインに従う）のいずれかに対する適格性について診断後に評価された。
【0108】
全ての患者を、ＴＮＭ病期ならびに麻酔の可能性を妨げ得る可能な共存症に基づいて、可能な一次手術について評価した。患者は、孤立性肺転移（２人の結腸－直腸、１人の精巣癌、および１人の乳癌）のために一次肺手術を受け、サブセットは、２０１２～２０１３年のＥＳＭＯガイドラインに従って手術後アジュバント化学療法を受けた。患者が一次手術に適格でなかった場合、治療目的で、併用療法（ビノレルビン（ＮＳＣＬＣに対して）またはエトポシド（ＳＣＬＣに対して）のいずれかと組み合わせたプラチナダブレット療法）および放射線療法（３３分割で２グレイ、５Ｆ／Ｗまたは定位放射線療法、３分割で１５グレイ（ＮＳＣＬＣに対して）または４５分割で２，０５グレイまたは１０分割で３グレイ（ＳＣＬＣに対して）のいずれか）について、複数回チームカンファレンスで評価した。不良なＥＣＯＧパフォーマンスステータスおよび／または有意な共存症を有する患者は、任意のタイプの腫瘍学的処置を受けることから除外され、支持療法を受けた。診断時に進行した疾患を有する患者は、姑息的化学療法および／または放射線療法に適格であった。ＥＧＦＲ突然変異を有する患者は、ゲフィチニブまたは化学療法のいずれかの後に、１番目のラインにおけるゲフィチニブおよびエルロチニブで主に処置され、ＡＬＫ転座を有する患者は、クリゾチニブで処置された。最初の姑息的治療コホートからの患者は、疾患の進行後に第２選択腫瘍学的治療（典型的にはペメトレキセド単独療法）を受け続けた。１６人の患者のみが、２回目の処置の後にさらなる治療を受け、１人の患者は、合計７回の処置を受けた。コホートは２０１２～２０１３年であるため、２人の患者のみが、ＣｈｅｃｋＭａｔｅプロトコールにおいてそれぞれ３番目および７番目のラインで免疫療法（ニボルマブ）を受けた。
【0109】
臨床的共変量および生存とＤＥＬＦＩスコアとの関連
ＤＥＬＦＩスコアの分布をベースラインの臨床的共変量および実験室共変量の、年齢、喫煙、および血清炎症マーカーと比較する単変量解析を、ウィルコクソン順位和検定を用いて行った。さらに、ＤＥＬＦＩスコアと、ベースライン共変量の、年齢、喫煙、および性別を伴うおよび伴わない癌リスクとの関係を、ロジスティック回帰を使用して評価した。
ＤＥＬＦＩスコアの分布をベースラインの臨床的共変量および実験室共変量の、年齢、喫煙、および血清炎症マーカーと比較する単変量解析を、ウィルコクソン順位和検定を用いて行った。さらに、ＤＥＬＦＩスコアと、ベースライン共変量の、年齢、喫煙、および性別を伴うおよび伴わない癌リスクとの関係を、ロジスティック回帰を使用して評価した。
【0110】
ＤＥＬＦＩスコアが予後と関連するかどうかを評価するために、高リスクの肺癌患者を、癌を有する可能性が高いかどうか（ＤＥＬＦＩスコアが０．５超）に従って分類した。単変量解析において、この分類が肺癌患者間の生存に関連するかどうかを評価するために、ログランク検定を使用して生存曲線を比較した。単変量解析に加えて、ＤＥＬＦＩスコアが、さらなる説明変数として原発性肺癌の組織学的サブタイプおよび臨床病期分類を含む多変量のＣｏｘ比例ハザードモデルにおいて、肺癌特異的生存と独立して関連するかどうかを評価した。
【0111】
組織サブタイプの予測のためのゲノムワイド転写因子分析
Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）によって生成された、ＳＣＬＣ（ｎ＝７９）５７、肺腺癌（ｎ＝５４２）および肺扁平上皮癌（ｎ＝５０４）、ならびにＧｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）プロジェクトによって生成された全血（ｎ＝７５５）について、遺伝子発現値を、ｒｅｃｏｕｎｔ３ １．０．２５６を使用して生カウントとして取得し、ｒｅｃｏｕｎｔ１．１６．１を使用して１００万当たりの転写産物（ＴＰＭ）に変換した。ＴＰＭ中央値を、各癌／組織型における１，６３９個の転写因子（ＴＦ）５８について計算した。発現されなかったＴＦ（中央値ＴＰＭ＜１）を、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、および全血において同定し、次いでそれらをＳＣＬＣにおける最も高い発現から最も低い発現へと順序付けた。上位の遺伝子はＡＳＣＬ１であった（中央値ＴＰＭ＝１０１）。次いで、クロマチン免疫沈降を得た後、ＡＳＣＬ１（ｎ＝１３，９２０ピーク）（ＧＥＯ試料受託番号：ＧＳＭ３７０４４２１）５９についてのピークを配列決定（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）した。常染色体（ｎ＝１３，６９３ピーク）における各ピークについて、ピークの中心を位置０として定義し、次いで、少なくとも０．３７のＤＥＬＦＩスコア（８５％の特異度に対応する）を有する１２５個の試料について、各ピークの周りの＋／－３，０００ｂｐウィンドウにおいて別々にカバレッジを計算した。試料全体にわたって平均３超のカバレッジで少数のピークを除外した。全てのピークにわたる各位置（－３，０００～＋３，０００）でのカバレッジの平均を、各試料について計算した。図５Ｃ、５Ｅでは、ＡＳＣＬ１結合部位を取り囲む＋／－３，０００ｂｐウィンドウ内の各位置でカバレッジをとり、その試料内の最大値で割ることによって、所与の試料の相対的なカバレッジを計算した。ＳＣＬＣ試料は別々にプロットされ、「その他」群の試料は、ＡＳＣＬ１結合部位に対する各位置での相対的なカバレッジまたは断片長の中央値（黒線）ならびに相対カバレッジまたは断片長の０．０５および０．９５四分位数（影付き領域）としてプロットされる。ＲＯＣ曲線（図５Ｄ、５Ｆ）について、相対カバレッジを各試料について計算し、この際、ＡＳＣＬ１結合部位の中心を囲む＋／－１００ｂｐウィンドウ内の平均カバレッジを、結合部位の２，７５０ｂｐ上流および下流を囲む＋／－２５０ｂｐウィンドウ内の平均カバレッジで割ったものとして計算した。ＲＯＣ曲線は、ｐＲＯＣ１．１６．２６０を用いて作成した。図５Ｂについては、６２０個のＡＳＣＬ１標的遺伝子の名称が得られ６１、そのうちの６００個が遺伝子発現データセットにおいて一致する遺伝子名を有していた。これらの６００個の遺伝子について、遺伝子は、ＴＰＭ値が、全ての試料にわたるその遺伝子についての平均を、標準偏差が３超を上回る場合、所与の試料において「過剰発現されている」と定義された。
Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）によって生成された、ＳＣＬＣ（ｎ＝７９）５７、肺腺癌（ｎ＝５４２）および肺扁平上皮癌（ｎ＝５０４）、ならびにＧｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）プロジェクトによって生成された全血（ｎ＝７５５）について、遺伝子発現値を、ｒｅｃｏｕｎｔ３ １．０．２５６を使用して生カウントとして取得し、ｒｅｃｏｕｎｔ１．１６．１を使用して１００万当たりの転写産物（ＴＰＭ）に変換した。ＴＰＭ中央値を、各癌／組織型における１，６３９個の転写因子（ＴＦ）５８について計算した。発現されなかったＴＦ（中央値ＴＰＭ＜１）を、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、および全血において同定し、次いでそれらをＳＣＬＣにおける最も高い発現から最も低い発現へと順序付けた。上位の遺伝子はＡＳＣＬ１であった（中央値ＴＰＭ＝１０１）。次いで、クロマチン免疫沈降を得た後、ＡＳＣＬ１（ｎ＝１３，９２０ピーク）（ＧＥＯ試料受託番号：ＧＳＭ３７０４４２１）５９についてのピークを配列決定（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）した。常染色体（ｎ＝１３，６９３ピーク）における各ピークについて、ピークの中心を位置０として定義し、次いで、少なくとも０．３７のＤＥＬＦＩスコア（８５％の特異度に対応する）を有する１２５個の試料について、各ピークの周りの＋／－３，０００ｂｐウィンドウにおいて別々にカバレッジを計算した。試料全体にわたって平均３超のカバレッジで少数のピークを除外した。全てのピークにわたる各位置（－３，０００～＋３，０００）でのカバレッジの平均を、各試料について計算した。図５Ｃ、５Ｅでは、ＡＳＣＬ１結合部位を取り囲む＋／－３，０００ｂｐウィンドウ内の各位置でカバレッジをとり、その試料内の最大値で割ることによって、所与の試料の相対的なカバレッジを計算した。ＳＣＬＣ試料は別々にプロットされ、「その他」群の試料は、ＡＳＣＬ１結合部位に対する各位置での相対的なカバレッジまたは断片長の中央値（黒線）ならびに相対カバレッジまたは断片長の０．０５および０．９５四分位数（影付き領域）としてプロットされる。ＲＯＣ曲線（図５Ｄ、５Ｆ）について、相対カバレッジを各試料について計算し、この際、ＡＳＣＬ１結合部位の中心を囲む＋／－１００ｂｐウィンドウ内の平均カバレッジを、結合部位の２，７５０ｂｐ上流および下流を囲む＋／－２５０ｂｐウィンドウ内の平均カバレッジで割ったものとして計算した。ＲＯＣ曲線は、ｐＲＯＣ１．１６．２６０を用いて作成した。図５Ｂについては、６２０個のＡＳＣＬ１標的遺伝子の名称が得られ６１、そのうちの６００個が遺伝子発現データセットにおいて一致する遺伝子名を有していた。これらの６００個の遺伝子について、遺伝子は、ＴＰＭ値が、全ての試料にわたるその遺伝子についての平均を、標準偏差が３超を上回る場合、所与の試料において「過剰発現されている」と定義された。
【0112】
２００ｂｐ未満の断片を使用して、平均断片サイズを、ＡＳＣＬ１結合部位を囲む＋／－３，０００ｂｐウィンドウ内の各位置で計算した。図１６Ａでは、ＳＣＬＣ試料および１０個の無作為なベースライン癌なし試料を別々にプロットし、ＬＯＥＳＳ法を使用して平滑化する。図１６Ｃでは、ＡＳＣＬ１結合部位を取り囲む＋／－３，０００ｂｐウィンドウ内の各位置で平均断片サイズをとり、それをその試料内の最小値で割ることによって、所与の試料の相対断片サイズを計算する。図１６Ｄでは、ＳＣＬＣ試料を別々にプロットし、ＬＯＥＳＳ法を使用して平滑化し、「その他」群の試料を、相対断片サイズ中央値（黒線）ならびにＡＳＣＬ１結合部位に対する各位置での相対断片サイズの０．０５および０．９５分位数（陰影領域）としてプロットする。ＲＯＣ曲線については、各試料について、ＡＳＣＬ１結合部位の中心を囲む＋／－１００ｂｐウィンドウ内の平均断片サイズを、結合部位の１，２５０ｂｐ上流および下流を囲む＋／－２５０ｂｐウィンドウ内の平均断片サイズで割ったものとして、相対断片長さを計算した。
【0113】
スクリーニング集団におけるＤＥＬＦＩ性能のモデリング
ＬＵＣＡＳにおける試料間ＰＣＲバイアスを正規化するために、ＧＣ層ｉにおける断片のコレクションを、
となるような重みＷiに割り当て、ここで、ｔｉは、ターゲット分布での断片の数を表し、ＮｉはＧＣ層ｉでの断片の総数である。
ＬＵＣＡＳにおける試料間ＰＣＲバイアスを正規化するために、ＧＣ層ｉにおける断片のコレクションを、
【数3】
【0114】
１００，０００人の仮説的スクリーニング集団において、ＬＤＣＴ単独およびＤＥＬＦＩとそれに続くＬＤＣＴの性能を評価するために、本発明者らは、モンテカルロシミュレーションを使用して、未知のパラメータ感度、特異度、アドヒアランス、および肺癌有病率の不確実性を捕捉した。ＬＵＣＡＳ単独に対する感度の先行モデルは、ＬＵＣＡＳおよびＮＬＳＴコホートからの経験的推定値に大まかに集中していた：
発明者らは、π～「ベルヌーイ」（０．５）をサンプリングした。
特異度については、先行モデルは以下の通りであった：
本発明者らのシミュレートしたスクリーニング研究でのスクリーニングされる個体の数は、スクリーニングガイドラインの順守に依存する。ｎは本発明者らのスクリーニング研究の規模を示すものとし、ｎに関する本発明者らのサンプリングモデルは以下で表される。
ＬＤＣＴ単独の場合、形状パラメータαｎおよびβｎがＤＥＬＦＩｍｕｌｔｉは１２および１８８７であったが、ＬＤＣＴ形状パラメータが後に続くものは８０および２０３２であった。本発明者らのスクリーニング研究の規模とθ１，Ｍおよびθ２，Ｍのそれぞれの事前分布からの抽出を条件とし、本発明者らは疾患状態ｙおよびスクリーニング結果ｘを、ｙを条件としてサンプリングした。
本発明者らの仮説集団における有病率についての有益な事前情報ψは、本発明者らのスクリーニング研究が癌を有さない個体から主に構成されることを確実にするが、真の有病率は、ＮＬＳＴ研究からの０．９１％の推定よりも小さくまたは大きくなり得る５。検出された肺癌を有する患者の数、精度、偽陽性率、および陽性予測値をｘおよびｙの同時分布から計算した。本発明者らは、上記のサンプリング手順を１０，０００回繰り返し、それによって、感度、特異度、アドヒアランス、および有病率の不確実性を反映するこれらの統計値の予測分布を得た。
【数4】
特異度については、先行モデルは以下の通りであった：
【数5】
【数6】
【数7】
【0115】
生物情報学および統計ソフトウェア
全ての統計分析は、Ｒバージョン３．６．１を用いて行った。ｆａｓｔｐ（０．２０．０）を使用したアダプター配列のトリミング後、本発明者らは、Ｂｏｗｔｉｅ２（２．３．０）を使用して、ペアエンドリードをｈｇ１９参照ゲノムに整列させた。Ｓａｍｂａｍｂａ（０．６．８）を用いてＰＣＲ複製物を除去し、Ｂｅｄｔｏｏｌｓ（２．２９．０）を用いて残りのアラインメントされたリード対をベッドフォーマットに変換した。Ｒパッケージデータ表（１．１２．８）を、ゲノムに沿った５Ｍｂウィンドウにおける表形式データおよびビニング断片の操作のために使用した。Ｒパッケージｃａｒｅｔ（６．０．８４）およびｇｂｍ（２．１．５）を使用して、勾配ブーストツリーおよびリサンプリングによる分類を実施した。
全ての統計分析は、Ｒバージョン３．６．１を用いて行った。ｆａｓｔｐ（０．２０．０）を使用したアダプター配列のトリミング後、本発明者らは、Ｂｏｗｔｉｅ２（２．３．０）を使用して、ペアエンドリードをｈｇ１９参照ゲノムに整列させた。Ｓａｍｂａｍｂａ（０．６．８）を用いてＰＣＲ複製物を除去し、Ｂｅｄｔｏｏｌｓ（２．２９．０）を用いて残りのアラインメントされたリード対をベッドフォーマットに変換した。Ｒパッケージデータ表（１．１２．８）を、ゲノムに沿った５Ｍｂウィンドウにおける表形式データおよびビニング断片の操作のために使用した。Ｒパッケージｃａｒｅｔ（６．０．８４）およびｇｂｍ（２．１．５）を使用して、勾配ブーストツリーおよびリサンプリングによる分類を実施した。
【0116】
結果
Ｂｉｓｐｅｂｊｅｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｉｎ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ（ＬＣＡＳコホート）で行われた３６５人の前向き診断研究からの患者血液試料を検査した。７ヶ月間。このコホートでの対象の大部分は、肺癌のリスクが高い症状のある個体（５０～８０歳および喫煙歴２０パックイヤー超）であった（表１）。このコホートは、肺、非肺または全身症状を有する３２３人の対象（９０％）を含み、大多数は、咳または呼吸困難などの一般的な喫煙関連症状を有していた。残りは登録時に無症候性であり、肺悪性腫瘍が疑われるＸ線またはＣＴによる偶発的な胸部画像所見があった。患者の来院時に、さらなる胸部ＣＴまたは１８Ｆ－ＰＥＴ／ＣＴを行って、同定された結節または浸潤物を評価した（図７）。研究された３６５人の個体のうち、１２９人は、血液採取の時点から数日後に肺癌を有すると決定されたが（中央値９．５日、範囲０～４４）、残りは、組織学的に良性結節であると証明されたか（ｎ＝８７）、または癌についての低い臨床的疑いおよび放射線写真的疑いのために生検されなかった（ｎ＝１４９）（図７）。Ｆｌｅｉｓｃｈｎｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ肺結節推奨２４～２６を含む肺結節の管理のための標準的なアルゴリズムを使用して、臨床管理を決定した。
Ｂｉｓｐｅｂｊｅｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｉｎ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ（ＬＣＡＳコホート）で行われた３６５人の前向き診断研究からの患者血液試料を検査した。７ヶ月間。このコホートでの対象の大部分は、肺癌のリスクが高い症状のある個体（５０～８０歳および喫煙歴２０パックイヤー超）であった（表１）。このコホートは、肺、非肺または全身症状を有する３２３人の対象（９０％）を含み、大多数は、咳または呼吸困難などの一般的な喫煙関連症状を有していた。残りは登録時に無症候性であり、肺悪性腫瘍が疑われるＸ線またはＣＴによる偶発的な胸部画像所見があった。患者の来院時に、さらなる胸部ＣＴまたは１８Ｆ－ＰＥＴ／ＣＴを行って、同定された結節または浸潤物を評価した（図７）。研究された３６５人の個体のうち、１２９人は、血液採取の時点から数日後に肺癌を有すると決定されたが（中央値９．５日、範囲０～４４）、残りは、組織学的に良性結節であると証明されたか（ｎ＝８７）、または癌についての低い臨床的疑いおよび放射線写真的疑いのために生検されなかった（ｎ＝１４９）（図７）。Ｆｌｅｉｓｃｈｎｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ肺結節推奨２４～２６を含む肺結節の管理のための標準的なアルゴリズムを使用して、臨床管理を決定した。
【0117】
肺癌検出のためのＤＥＬＦＩ性能
２～４ｍｌの血漿をＬＣＡＳコホートの各患者から単離し、抽出されたｃｆＤＮＡを、実験的およびバイオインフォマティクス的改善を伴うＤＥＬＦＩアプローチを使用して調べた。ＰＣＲは、ＧＣ含量および断片長に依存して増幅されたゲノム断片の提示に影響を及ぼすことが公知であるので、ＤＥＬＦＩゲノムワイド断片化プロファイルを、増幅なしで、または４もしくは１２サイクルのＰＣＲを用いて作製されたゲノムライブラリーを使用して評価した。４サイクルのＰＣＲで作製されたライブラリーは、増幅なしのものと類似したプロファイルを有していたが、１２サイクルは実質的なバイアスをもたらしたことが見出された（図８Ａ、８Ｂ）。断片長および／またはＧＣ含量による優先的増幅を同時に説明する新規な断片ベースのＧＣ補正方法を開発した（方法を参照のこと）。４サイクルライブラリー間のこのアプローチが、一般的に使用されるビンベースのアプローチ２７と比較してＧＣバイアスをさらに最小化するかどうかを調べ、断片ベースのアプローチが増幅なしのライブラリーに最も近いことを見出した（図８Ｃ）。したがって、４サイクル増幅を使用してゲノムライブラリーを生成し、浅い全ゲノム配列決定（約２×カバレッジ）を使用してｃｆＤＮＡ断片を配列決定し、試料当たり平均４０００万対のリードを得た（図１）。ゲノムワイドなｃｆＤＮＡ断片化パターンを調べるために、断片ベースのＧＣ補正された配列データを使用して、高いマッピング可能性を有する４７３個の非重複５ＭＢ領域におけるゲノムにわたる断片化プロファイルを評価した。各領域は、約８０，０００個の断片を含み、ゲノムの約２．４ＧＢに及ぶ。
２～４ｍｌの血漿をＬＣＡＳコホートの各患者から単離し、抽出されたｃｆＤＮＡを、実験的およびバイオインフォマティクス的改善を伴うＤＥＬＦＩアプローチを使用して調べた。ＰＣＲは、ＧＣ含量および断片長に依存して増幅されたゲノム断片の提示に影響を及ぼすことが公知であるので、ＤＥＬＦＩゲノムワイド断片化プロファイルを、増幅なしで、または４もしくは１２サイクルのＰＣＲを用いて作製されたゲノムライブラリーを使用して評価した。４サイクルのＰＣＲで作製されたライブラリーは、増幅なしのものと類似したプロファイルを有していたが、１２サイクルは実質的なバイアスをもたらしたことが見出された（図８Ａ、８Ｂ）。断片長および／またはＧＣ含量による優先的増幅を同時に説明する新規な断片ベースのＧＣ補正方法を開発した（方法を参照のこと）。４サイクルライブラリー間のこのアプローチが、一般的に使用されるビンベースのアプローチ２７と比較してＧＣバイアスをさらに最小化するかどうかを調べ、断片ベースのアプローチが増幅なしのライブラリーに最も近いことを見出した（図８Ｃ）。したがって、４サイクル増幅を使用してゲノムライブラリーを生成し、浅い全ゲノム配列決定（約２×カバレッジ）を使用してｃｆＤＮＡ断片を配列決定し、試料当たり平均４０００万対のリードを得た（図１）。ゲノムワイドなｃｆＤＮＡ断片化パターンを調べるために、断片ベースのＧＣ補正された配列データを使用して、高いマッピング可能性を有する４７３個の非重複５ＭＢ領域におけるゲノムにわたる断片化プロファイルを評価した。各領域は、約８０，０００個の断片を含み、ゲノムの約２．４ＧＢに及ぶ。
【0118】
得られた断片化プロファイルは、非悪性肺結節を有する個体を含む非癌個体間で著しく 一貫していた（図２Ａ、２Ｂ）。対照的に、癌患者は、広範なゲノム規模の変動を示した（図２Ａ、２Ｂ）。注目すべきことに、断片化プロファイルの差異は、病期および組織学にわたるものを含む、大多数の癌患者のゲノム全体にわたる複数の領域において観察することができた。機械学習モデルを用いて、ｃｆＤＮＡプロファイルが肺癌を有する個体または肺癌を有さない個体の特徴を有するかどうかを調べた。分析された患者の数に対する本発明者らのゲノムワイド断片化プロファイルが高次元であるため、主成分分析（ＰＣＡ）を実施して、分散の少なくとも９０％を説明する本発明者らの断片化特徴の線形組み合わせを同定した。この次元削減ステップを機械学習モデルに組み込み、反復５重交差検証によって性能特性を推定し、交差検証反復にわたる平均として各個体のスコア（ＤＥＬＦＩスコア）を生成した。機械学習モデルに組み込まれた特徴の分析および可変重要性の対応する尺度は、癌患者において変化し、癌リスクを予測する断片化および染色体変化を明らかにした（図２Ｃ）。これらの特徴の重要性は、トレーニングフォールドにわたって一貫していた（図９）。モデルに組み込まれたゲノム変化のうち、ｃｆＤＮＡ提示において増加または減少した染色体腕は、肺腺癌（ｎ＝５１８）および扁平上皮癌（ｎ＝５０１）についての以前のＴＣＧＡ大規模ゲノム研究において見られたように、肺癌において一般的に増加した（ｇａｉｎｅｄ）または喪失した（ｌｏｓｔ）ものに対応した（図２Ｃ）。これらには、７ｑ、１２ｐ、および２０ｑのｃｆＤＮＡレベルの増加、または１ｐ、３ｐ、８ｐ、および１７ｐのレベルの喪失が含まれ、これらはすべて、様々な肺癌においてそれぞれ増加または喪失されることが知られている２８～３０。
【0119】
ＤＥＬＦＩプロファイルとマルチモーダル解析との組み合わせ
臨床特性は腫瘍バイオマーカーに影響を及ぼし得るので、非悪性結節、年齢もしくは喫煙歴などの人口統計パラメータ、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）もしくは自己免疫疾患の存在がＤＥＬＦＩスコアと関連するかどうかを調査することが最初に求められた。ＬＵＣＡＳコホートの前向き観察試験収集のために、これらの特徴の偏りのない分析が可能であった。良性肺病変を有するまたは有さない非癌個体を比較した場合、ＤＥＬＦＩスコアの差は観察されなかった（中央値ＤＥＬＦＩスコア０．１６対０．２１、ｐ＝０．９９、ウィルコクソン順位和検定、図３Ａ）。ＤＥＬＦＩスコアの変化はまた、年齢群の間（Ｆ統計量＝１．６５、ｐ＝０．２０）、現在喫煙者、喫煙経験者および喫煙未経験者の間（Ｆ統計量＝１．３、ｐ＝０．２７）、および非癌個体におけるパックイヤーにわたって（Ｆ統計量＝０．６７、ｐ＝０．５７）観察されなかった（図１０Ａ～１０Ｄ）。同様に、ＣＯＰＤを有する患者もしくは有しない患者（ｐ＝０．２６）または自己免疫疾患を有する患者もしくは有しない患者（ｐ＝０．３８）の間で差は観察されなかった。最後に、炎症マーカーＣＲＰまたはＩＬ－６のレベルとＩＬ－６のレベルとＤＥＬＦＩスコアとの間に相関は観察されず、これは、ｃｆＤＮＡ断片化の変化が癌に特有であり、ＤＥＬＦＩスコアが急性または慢性炎症状態の存在によって影響を受けないという考えと一致する（図１１）。
臨床特性は腫瘍バイオマーカーに影響を及ぼし得るので、非悪性結節、年齢もしくは喫煙歴などの人口統計パラメータ、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）もしくは自己免疫疾患の存在がＤＥＬＦＩスコアと関連するかどうかを調査することが最初に求められた。ＬＵＣＡＳコホートの前向き観察試験収集のために、これらの特徴の偏りのない分析が可能であった。良性肺病変を有するまたは有さない非癌個体を比較した場合、ＤＥＬＦＩスコアの差は観察されなかった（中央値ＤＥＬＦＩスコア０．１６対０．２１、ｐ＝０．９９、ウィルコクソン順位和検定、図３Ａ）。ＤＥＬＦＩスコアの変化はまた、年齢群の間（Ｆ統計量＝１．６５、ｐ＝０．２０）、現在喫煙者、喫煙経験者および喫煙未経験者の間（Ｆ統計量＝１．３、ｐ＝０．２７）、および非癌個体におけるパックイヤーにわたって（Ｆ統計量＝０．６７、ｐ＝０．５７）観察されなかった（図１０Ａ～１０Ｄ）。同様に、ＣＯＰＤを有する患者もしくは有しない患者（ｐ＝０．２６）または自己免疫疾患を有する患者もしくは有しない患者（ｐ＝０．３８）の間で差は観察されなかった。最後に、炎症マーカーＣＲＰまたはＩＬ－６のレベルとＩＬ－６のレベルとＤＥＬＦＩスコアとの間に相関は観察されず、これは、ｃｆＤＮＡ断片化の変化が癌に特有であり、ＤＥＬＦＩスコアが急性または慢性炎症状態の存在によって影響を受けないという考えと一致する（図１１）。
【0120】
肺癌の進行および転帰のＤＥＬＦＩ分析
次に、ＤＥＬＦＩスコアと癌病期および組織型との間の関係を調べた。非癌個体についてのＤＥＬＦＩスコアは低かったが（生検なしまたは良性病変を有する個体についてそれぞれ０．１６または０．２１のＤＥＬＦＩスコア中央値）、癌患者は有意に高いＤＥＬＦＩスコア中央値を有した（病期Ｉ＝０．３５、病期ＩＩ＝０．７５、病期ＩＩＩ＝０．９０、および病期ＩＶ＝０．９９についてのＤＥＬＦＩスコア）（病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶについてｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）（図３Ａ）。ＬＵＣＡＳコホートにおける癌を有する患者を同定するためのＤＥＬＦＩアプローチの感度および特異度を表す受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、０．９０（９５％ＣＩ＝０．８６～０．９４）の曲線下面積（ＡＵＣ）を明らかにした（図３Ｂ）。病期Ｉの病気は同定するのがより困難であった（ＡＵＣ＝０．７６）が、病期ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの病気は同様に高いパフォーマンスを有した（それぞれＡＵＣＩＩ＝０．８９、ＡＵＣＩＩＩ＝０．９２、ＡＵＣＩＶ＝０．９２）。癌の既往歴のない個体の検出を考慮すると、他の癌検診研究４、５の組み入れ基準と一致して、全体的により高いパフォーマンス（ＡＵＣ＝０．９３、９５％ＣＩ＝０．９０～０．９７）ならびに個々の病期（ＡＵＣＩ＝０．８９、ＡＵＣＩＩ＝０．８９、ＡＵＣＩＩＩ＝０．９３、ＡＵＣＩＶ＝０．９５）が観察された（図３Ｂ）。同様に、肺癌のリスクが高いと考えられたこの群（５０～８０歳、喫煙歴２０パックイヤー以上）の個体のサブセットの分析は、０．９４の全体的なＡＵＣを明らかにした（図３Ｂ）。肺癌の異なる組織学的サブタイプの分析は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および扁平上皮癌（ＳＣＣ）が肺腺癌よりも容易に検出されることを示した（図３Ｂ）。以前の複数癌ＤＥＬＦＩアプローチのロバスト性を評価するために、本研究におけるＣｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．２３の特徴および機械学習アプローチは、同様の性能を同定した（全ての患者についてＡＵＣ＝０．８７、９５％ＣＩ＝０．８２～０．９１、癌の既往歴のない患者についてＡＵＣ＝０．９０、９５％ＣＩ＝０．８６～０．９４）（図１２Ａ）。コピー数変化のみを含むｉｃｈｏｒＣＮＡ３１などの他の全ゲノム分析、およびｃｆＤＮＡ断片長の全体中央値の分析は、それぞれ、０．７６（９５％ＣＩ＝０．７０～０．８２）および０．６１（９５％ＣＩ＝０．５４～０．６７）の全体ＡＵＣを有する実質的により弱いパフォーマンスを提供した（図１２Ｂ）。バルク断片長のより低い性能は、この測定基準がゲノムにわたる断片化変化を捕捉できないことを反映し得る（スピアマン相関＝０．２９）。
次に、ＤＥＬＦＩスコアと癌病期および組織型との間の関係を調べた。非癌個体についてのＤＥＬＦＩスコアは低かったが（生検なしまたは良性病変を有する個体についてそれぞれ０．１６または０．２１のＤＥＬＦＩスコア中央値）、癌患者は有意に高いＤＥＬＦＩスコア中央値を有した（病期Ｉ＝０．３５、病期ＩＩ＝０．７５、病期ＩＩＩ＝０．９０、および病期ＩＶ＝０．９９についてのＤＥＬＦＩスコア）（病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶについてｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）（図３Ａ）。ＬＵＣＡＳコホートにおける癌を有する患者を同定するためのＤＥＬＦＩアプローチの感度および特異度を表す受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、０．９０（９５％ＣＩ＝０．８６～０．９４）の曲線下面積（ＡＵＣ）を明らかにした（図３Ｂ）。病期Ｉの病気は同定するのがより困難であった（ＡＵＣ＝０．７６）が、病期ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの病気は同様に高いパフォーマンスを有した（それぞれＡＵＣＩＩ＝０．８９、ＡＵＣＩＩＩ＝０．９２、ＡＵＣＩＶ＝０．９２）。癌の既往歴のない個体の検出を考慮すると、他の癌検診研究４、５の組み入れ基準と一致して、全体的により高いパフォーマンス（ＡＵＣ＝０．９３、９５％ＣＩ＝０．９０～０．９７）ならびに個々の病期（ＡＵＣＩ＝０．８９、ＡＵＣＩＩ＝０．８９、ＡＵＣＩＩＩ＝０．９３、ＡＵＣＩＶ＝０．９５）が観察された（図３Ｂ）。同様に、肺癌のリスクが高いと考えられたこの群（５０～８０歳、喫煙歴２０パックイヤー以上）の個体のサブセットの分析は、０．９４の全体的なＡＵＣを明らかにした（図３Ｂ）。肺癌の異なる組織学的サブタイプの分析は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および扁平上皮癌（ＳＣＣ）が肺腺癌よりも容易に検出されることを示した（図３Ｂ）。以前の複数癌ＤＥＬＦＩアプローチのロバスト性を評価するために、本研究におけるＣｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．２３の特徴および機械学習アプローチは、同様の性能を同定した（全ての患者についてＡＵＣ＝０．８７、９５％ＣＩ＝０．８２～０．９１、癌の既往歴のない患者についてＡＵＣ＝０．９０、９５％ＣＩ＝０．８６～０．９４）（図１２Ａ）。コピー数変化のみを含むｉｃｈｏｒＣＮＡ３１などの他の全ゲノム分析、およびｃｆＤＮＡ断片長の全体中央値の分析は、それぞれ、０．７６（９５％ＣＩ＝０．７０～０．８２）および０．６１（９５％ＣＩ＝０．５４～０．６７）の全体ＡＵＣを有する実質的により弱いパフォーマンスを提供した（図１２Ｂ）。バルク断片長のより低い性能は、この測定基準がゲノムにわたる断片化変化を捕捉できないことを反映し得る（スピアマン相関＝０．２９）。
【0121】
肺癌を有する個体または肺癌を有さない個体の独立した群におけるＤＥＬＦＩの予測性能を外部から検証するために、単一の断片化に基づくモデルを、ＬＣＡＳ研究において非癌個体およびベースライン肺癌を有する患者を使用して最初に取得し、７０％～８５％の範囲の特異度を達成するのに必要なＤＥＬＦＩスコアカットオフを決定した。次に、癌を有さない個体（ｎ＝３８５）または主に初期段階の癌（ｎ＝４６）からなる独立した検証コホートにおいて、ＬＵＣＡＳにおける固定モデルを使用して、検証セットにおけるＤＥＬＦＩスコアを計算した。以前に確立されたカットオフを使用して、検証セットにおける個体についての癌状態を、それらのＤＥＬＦＩスコアがカットオフを上回るかまたは下回るかに従って予測した。検証コホートにおけるこのモデルの感度および特異度は、疾患の異なる段階および異なる組織学的サブタイプの間でＬＣＡＳコホートにおいて観察されたものと同様であった（図３Ｃ、図１３）。全体として、これらの分析は、ＤＥＬＦＩアプローチが、異なる病期および組織学的サブタイプにわたるものを含む、異なる肺癌コホートにわたって一般化可能であることを提供する。
【0122】
ＤＥＬＦＩプロファイルとマルチモーダル解析との組み合わせ
マルチフィーチャーｃｆＤＮＡ分析と組み合わせた癌検出のためのマルチモーダルアプローチを評価するために、肺バイオマーカー１２，１５，３２，３３として提案されている分泌タンパク質である癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の血清レベルを最初に評価した。肺癌患者は、癌を有さない患者と比較してより高いＣＥＡレベルを有し、病期Ｉ～ＩＩＩの癌患者の２０％超および病期ＩＶの癌患者の大部分が７．５ｎｇ／ｍｌ超のレベルで検出されたが、非癌患者の約４％のみがこの閾値１２，１５，３４を超えた（ｐ＜０．００１）（図１４）。ＣＥＡレベルは病期とともに増加し、腺癌およびＳＣＬＣサブタイプを有する患者は、ＳＣＣまたは肺への転移を有する患者と比較してより高いレベルを示した（図１４）。臨床特性が肺癌および他の癌のリスク因子として提案されているので３５、ゲノムワイドｃｆＤＮＡ断片化特徴を、マルチモーダルモデル（ＤＥＬＦＩｍｕｌｔｉ）におけるＣＥＡレベル、年齢、喫煙歴、およびＣＯＰＤの存在と組み合わせた（方法を参照されたい）。反復交差検証を使用して、これらのマルチモーダル特徴が非癌個体または癌患者の特徴を表すかどうかを予測した。ＤＥＬＦＩｍｕｌｔｉのパフォーマンスの評価は、個々の病期について（ＡＵＣＩ＝０．７８、ＡＵＣＩＩ＝０．９５、ＡＵＣＩＩＩ＝０．９４、ＡＵＣＩＶ＝０．９５）、および組織サブタイプにわたって（ＡＵＣａｄｅｎｏ＝０．９１、ＡＵＣｓｑｕａｍｏｕｓ＝０．９５；ＡＵＣＳＣＬＣ＝０．９６）、０．９３の全体的なＡＵＣを明らかにした（図１５Ａ、１５Ｂ）。このアプローチは検証コホートにおいて評価することができなかったが、これらの分析は、ＤＥＬＦＩと血清タンパク質および臨床リスク因子との組合せが、断片化プロファイル単独によって得られるものと比較してＤＥＬＦＩ性能を改善するという証拠を提供する。
マルチフィーチャーｃｆＤＮＡ分析と組み合わせた癌検出のためのマルチモーダルアプローチを評価するために、肺バイオマーカー１２，１５，３２，３３として提案されている分泌タンパク質である癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の血清レベルを最初に評価した。肺癌患者は、癌を有さない患者と比較してより高いＣＥＡレベルを有し、病期Ｉ～ＩＩＩの癌患者の２０％超および病期ＩＶの癌患者の大部分が７．５ｎｇ／ｍｌ超のレベルで検出されたが、非癌患者の約４％のみがこの閾値１２，１５，３４を超えた（ｐ＜０．００１）（図１４）。ＣＥＡレベルは病期とともに増加し、腺癌およびＳＣＬＣサブタイプを有する患者は、ＳＣＣまたは肺への転移を有する患者と比較してより高いレベルを示した（図１４）。臨床特性が肺癌および他の癌のリスク因子として提案されているので３５、ゲノムワイドｃｆＤＮＡ断片化特徴を、マルチモーダルモデル（ＤＥＬＦＩｍｕｌｔｉ）におけるＣＥＡレベル、年齢、喫煙歴、およびＣＯＰＤの存在と組み合わせた（方法を参照されたい）。反復交差検証を使用して、これらのマルチモーダル特徴が非癌個体または癌患者の特徴を表すかどうかを予測した。ＤＥＬＦＩｍｕｌｔｉのパフォーマンスの評価は、個々の病期について（ＡＵＣＩ＝０．７８、ＡＵＣＩＩ＝０．９５、ＡＵＣＩＩＩ＝０．９４、ＡＵＣＩＶ＝０．９５）、および組織サブタイプにわたって（ＡＵＣａｄｅｎｏ＝０．９１、ＡＵＣｓｑｕａｍｏｕｓ＝０．９５；ＡＵＣＳＣＬＣ＝０．９６）、０．９３の全体的なＡＵＣを明らかにした（図１５Ａ、１５Ｂ）。このアプローチは検証コホートにおいて評価することができなかったが、これらの分析は、ＤＥＬＦＩと血清タンパク質および臨床リスク因子との組合せが、断片化プロファイル単独によって得られるものと比較してＤＥＬＦＩ性能を改善するという証拠を提供する。
【0123】
肺癌の進行および転帰のＤＥＬＦＩ分析
断片化プロファイルと肺腫瘍進行との間の関係を調べるために、肺癌病変のサイズまたは他の臨床的もしくは放射線学的所見が異常な断片化プロファイルに関連するかどうかを評価した。以前の研究は、特定の位置におけるｃｔＤＮＡ分子の数が限られており、これらの方法による検出限界が約０．１％であることを考慮すると、突然変異に基づくアプローチによって小さな腫瘍（例えば、約１ｃｍ３）が見逃され得ることを示唆しているが２０、ゲノムワイドなアプローチは、そのような変化のより高感度な検出を可能にし得る。ＤＥＬＦＩアプローチは約４０００万個の断片を調べるので、ゲノム全体にわたる約４０，０００個の断片が、０．１％ｃｔＤＮＡ寄与を有する小さな腫瘍を有する患者において腫瘍由来であり、それによって検出の機会を増加させることが予想された。興味深いことに、ＬＵＣＡＳコホートにおいて、サイズが２ｃｍ未満の９つの腫瘍のうち８つ（Ｔ１ａ）は、非癌集団の中央値よりも高いＤＥＬＦＩスコアを有していた（０．４０対０．１６のＤＥＬＦＩスコアの中央値）（図４Ａ）。限局性疾患を有する患者におけるＤＥＬＦＩスコアおよびＴ病期の分析は、Ｔ１からＴ４病期へのＤＥＬＦＩスコアの段階的増加を示した（Ｔ１＝０．３２、Ｔ２＝０．５６、Ｔ３＝０．７７、Ｔ４＝０．９４についてのＤＥＬＦＩスコア中央値；Ｔ１対Ｔ４、ｐ＜０．００１、ウィルコクソン順位和検定）。さらに、リンパ節転移のない肺癌患者（Ｎ０）は、リンパ節転移を有する患者と比較して有意に低いＤＥＬＦＩスコアを有した（図４Ａ、ｐ＜０．００１、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。ＤＥＬＦＩスコアの段階的増加はまた、罹患患者におけるＴおよびＮ段階を評価する場合にも観察された（図４Ｂ、ｐ＝０．００５）。これらの観察は、肺腫瘍サイズと循環中の異常な断片化プロファイルとの間の直接的関係を示し、深部標的配列決定（約３０，０００×）を使用して検出不能であった症例において以前に観察されたものを含めて、比較的小さい腫瘍でさえ検出可能であり得るという証拠を提供する２３。
断片化プロファイルと肺腫瘍進行との間の関係を調べるために、肺癌病変のサイズまたは他の臨床的もしくは放射線学的所見が異常な断片化プロファイルに関連するかどうかを評価した。以前の研究は、特定の位置におけるｃｔＤＮＡ分子の数が限られており、これらの方法による検出限界が約０．１％であることを考慮すると、突然変異に基づくアプローチによって小さな腫瘍（例えば、約１ｃｍ３）が見逃され得ることを示唆しているが２０、ゲノムワイドなアプローチは、そのような変化のより高感度な検出を可能にし得る。ＤＥＬＦＩアプローチは約４０００万個の断片を調べるので、ゲノム全体にわたる約４０，０００個の断片が、０．１％ｃｔＤＮＡ寄与を有する小さな腫瘍を有する患者において腫瘍由来であり、それによって検出の機会を増加させることが予想された。興味深いことに、ＬＵＣＡＳコホートにおいて、サイズが２ｃｍ未満の９つの腫瘍のうち８つ（Ｔ１ａ）は、非癌集団の中央値よりも高いＤＥＬＦＩスコアを有していた（０．４０対０．１６のＤＥＬＦＩスコアの中央値）（図４Ａ）。限局性疾患を有する患者におけるＤＥＬＦＩスコアおよびＴ病期の分析は、Ｔ１からＴ４病期へのＤＥＬＦＩスコアの段階的増加を示した（Ｔ１＝０．３２、Ｔ２＝０．５６、Ｔ３＝０．７７、Ｔ４＝０．９４についてのＤＥＬＦＩスコア中央値；Ｔ１対Ｔ４、ｐ＜０．００１、ウィルコクソン順位和検定）。さらに、リンパ節転移のない肺癌患者（Ｎ０）は、リンパ節転移を有する患者と比較して有意に低いＤＥＬＦＩスコアを有した（図４Ａ、ｐ＜０．００１、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。ＤＥＬＦＩスコアの段階的増加はまた、罹患患者におけるＴおよびＮ段階を評価する場合にも観察された（図４Ｂ、ｐ＝０．００５）。これらの観察は、肺腫瘍サイズと循環中の異常な断片化プロファイルとの間の直接的関係を示し、深部標的配列決定（約３０，０００×）を使用して検出不能であった症例において以前に観察されたものを含めて、比較的小さい腫瘍でさえ検出可能であり得るという証拠を提供する２３。
【0124】
ＬＵＣＡＳコホートの長期の臨床経過観察（７～８年）により、ＤＥＬＦＩスコアと生存率との間の関連性の分析が可能になった。これらの分析により、０．５を超えるＤＥＬＦＩスコアは、０．５未満のＤＥＬＦＩスコアと比較して全生存期間の減少に関連することが明らかになった（Ｐ＜０．００１、図４Ｃ）。Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた多変量解析において、ＤＥＬＦＩスコアと生存率との関連は、癌組織学および病期とは独立しており、ハザード比（ＨＲ）は２．５３であった（ｐ＝０．００１、図１７Ｂ）。病期ＩＶの腺癌を有する患者の均一な集団を分析した場合（ｐ＝０．００４、図１７Ａ）、または０．３～０．９の範囲の他のＤＥＬＦＩスコア閾値を使用した場合、同様の結果が得られた。ＤＥＬＦＩスコアは、これらの個体（Ｐ＝０．０４、ＨＲ＝２．３）、または生存期間が短い患者を除外した場合であっても、独立した予後因子のままであった。これらの結果は、断片化パターンと腫瘍負荷または攻撃性との間の関係を実証し、長期肺癌転帰への臨床的洞察を提供し得る。
【0125】
ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣの生物学的特徴および臨床管理における重要な差異を考慮して、ゲノム規模の断片化プロファイルを使用してこれらの癌タイプを非侵襲的に区別することができるかどうかを評価した。肺癌サブタイプからの公的に入手可能なＴＣＧＡ ＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して、ＳＣＬＣ（ｎ＝７９）とＮＳＣＬＣ（ｎ＝１０４６）または白血球（ｎ＝７５５）試料との間で最も高い発現変動を有する転写因子を同定し、ＡＳＣＬ１（Ａｃｈａｅｔｅ－Ｓｃｕｔｅファミリー塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス転写因子１）を最も高度に差次的に発現される遺伝子（ＮＳＣＬＣおよびＷＢＣと比較して９６０倍超）として同定した（図５Ａ）。ＡＳＣＬ１は、ＳＣＬＣの前駆細胞型である神経内分泌細胞におけるパイオニア転写因子であり、ＳＣＬＣの大部分において過剰発現されることが同定されている３０。予想通り、ＡＳＣＬ１結合部位を有する遺伝子のサブセットは、ＳＣＬＣとＮＳＣＬＣとの間で差次的に発現された（図５Ｂ）。転写因子結合３６の領域におけるｃｆＤＮＡカバレッジの報告された差異を考慮して、ＡＳＣＬ１の観察された１３，０００ゲノムワイド結合部位にわたる断片カバレッジおよびサイズが、ＳＣＬＣ患者のｃｆＤＮＡにおいて変化したかどうかを評価した。非癌個体または他の癌タイプを有する個体と比較して、ＳＣＬＣを有する患者のＡＳＣＬ１結合部位（＋／－２００ｂｐ）を含有する領域において、集約断片カバレッジの顕著かつ一貫した減少が観察された（図５Ｃ）。対照的に、ＡＳＣＬ１結合部位からさらに離れた距離（２０００ｂｐ超）では、ＳＣＬＣと他の患者との間の断片範囲は類似していた。ＡＳＣＬ１結合の領域におけるｃｆＤＮＡ断片サイズはより大きく、これはおそらく、非癌ｃｆＤＮＡ２３よりも典型的に小さい腫瘍由来ｃｆＤＮＡの寄与の減少を反映している（図１６Ａ、１６Ｃ）。ＡＳＣＬ１結合領域における断片情報を使用して、９９％超の特異度（９５％ＣＩ＝９８％～１００％）（ＡＵＣ＝０．９２）で１５８人の非癌個体と比較して１１人のＳＣＬＣのうち１０人（９１％感度、９５％ＣＩ＝６５％～９９％）を正確に検出するために使用され得る分類子を作製した（図５Ｄ）。さらに、ＤＥＬＦＩ陽性症例（８０％特異度に対応するＤＥＬＦＩスコアが０．３４超）を考慮した場合、ＳＣＬＣ患者は、ＳＣＬＣを有さない他のＤＥＬＦＩ陽性症例と比較して高い精度で分類された（１００％感度、９５％特異度で９５％ＣＩ＝７８％～１００％、９５％ＣＩ＝９０％～９８％、ＡＵＣ＝０．９８）（図５Ｅ）。限られた数のＳＣＬＣ症例にもかかわらず、これらの知見は、断片化プロファイルが細胞型特異的ゲノムワイド転写因子結合を反映し得るという証拠を提供し、異なる組織学的サブタイプを有する肺癌を区別するための非侵襲的アプローチを提供する。
【0126】
ＤＥＬＦＩベースライン評価時に臨床的寛解にあった癌の既往歴を有する患者の分析により、２５人の患者が同定され、５人は再発し、４人は最終的にこの疾患で死亡した。これらには、頭頸部癌を有する３人の患者、結腸癌を有する１人の患者、および悪性黒色腫を有する１人の患者が含まれた。その後再発した患者は、再発していない個体よりも有意に高いＤＥＬＦＩスコアを有していた（中央値ＤＥＬＦＩスコア０．６５対０．１９、ｐ＝０．００５）（図１８Ａ）。さらに、ＤＥＬＦＩ試験で陽性と記録された患者（ＤＥＬＦＩスコアが０．３４超）は、ＤＥＬＦＩ試験スコアが陰性の患者と比較して、無再発生存期間（採血から再発までの時間）が有意に短かった（ｐ＜０．０１、図１８Ｂ）。これらの結果は、ＤＥＬＦＩアプローチが処置後の疾患再発の検出のために使用され得るという概念を支持する。
【0127】
加えて、ＬＵＣＡＳコホートにおいて利用可能な長期的な臨床経過観察は、ベースライン時に癌がないと見なされたが、ベースライン評価後に新たな癌を発症した個体における断片化プロファイルの分析を可能にした。２年以内にその後の癌診断を受けた１７人の研究対象（限局性皮膚腫瘍を除く）のうち、４人の患者は、登録時に０．５を超えるＤＥＬＦＩスコアを有し、登録後３３～４８１日以内に０．５～１．０の範囲であった。同定された悪性腫瘍は、ＮＳＣＬＣの１つの症例、ならびに慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および２つのＢ細胞リンパ腫を含む３つの非肺悪性腫瘍を含んだ。これらのデータは、上昇したＤＥＬＦＩスコアが、臨床的に検出されなかった癌の出現を同定し得るという証拠を提供する。
【0128】
肺癌検出に対する非侵襲的分子血液検査の理論的影響を評価するために、ＤＥＬＦＩスコアまたはマルチモーダルＤＥＬＦＩｍｕｌｔｉスコアのパフォーマンスを調べた後、ＬＵＣＡＳコホートにおける標準的な診断用ＣＴイメージングを行った。これは、高リスク個体が最初に採血され、ｃｆＤＮＡ分析の結果に応じて、個体が、ＤＥＬＦＩスコアが陽性である場合にＬＤＣＴを有するか、またはスコアが陰性である場合にＬＤＣＴを有さないかのいずれかの経路に従うシナリオを調べることを可能にする（図６Ａ）。ＬＵＣＡＳコホートにおけるＬＤＣＴ単独の性能の分析は、高い感度（９５％超）および低い特異度（５８％）を示した。ＤＥＬＦＩスコアを使用して患者をプレスクリーニングし、陽性であった患者のみをＬＤＣＴによってさらに評価したモデルでは、ＤＥＬＦＩ／ＬＤＣＴ併用アプローチの観察された感度は９０％（病期Ｉ＝８０％、病期ＩＩ＝８６％、病期ＩＩＩ＝９４、および病期ＩＶ＝９０％）であり、特異度は８０％まで増加する（図６Ｂ）。ＤＥＬＦＩｍｕｌｔｉアプローチとそれに続くＬＤＣＴは、同じ特異度で感度を全体で９４％（病期Ｉ＝８７％、病期ＩＩ＝１００％、病期ＩＩＩ＝９７％、および病期ＩＶ＝９６％）に改善し、組み合わせたアプローチを使用した場合、不必要な手順の数をＬＤＣＴ単独での６７から３２に減少させた（５２％減少）（図６Ｂ）。
【0129】
集団規模で肺癌を有する個体の全体的な検出について本明細書のアプローチがどのように実行されるかを調べるために、モンテカルロシミュレーションを使用して、１００，０００人の高リスク個体の理論的集団においてＤＥＬＦＩモデルを評価した。この仮説集団におけるプレスクリーニングとして、ＬＤＣＴ単独またはＤＥＬＦＩとの推定感度および特異度を用いて（図６Ｂ）、これらのパラメータの不確実性を、ＮＬＳＴおよび／またはＬＵＣＡＳコホートから得られた経験的推定値を中心とする確率分布を用いてモデル化した（図６Ｃ）。０．９１％のＮＬＳＴ研究５推定値を使用するこの集団における肺癌の可能性のある有病率は、９１０人（９５％ＣＩ、４２８～１，５８４）であろう。ＬＤＣＴスクリーニングについての推奨にもかかわらず、米国におけるアドヒアランスは、わずか５．９％７であって、試験された平均５９７９人の個体となる（９５％ＣＩ、３，１７６～９，６５８）。血液検査は、高いアクセス可能性およびコンプライアンスを提供し、８０～９０％のアドヒアランス率が血液由来バイオマーカーについて報告されている３７，３８ため、肺癌検診集団の平均６０％（９５％信頼区間、３９％～７６％）が、組み合わせアプローチを使用して検査されると仮定した。これらの確率分布からのモンテカルロシミュレーションは、ＬＤＣＴ単独が肺癌を有する平均５１個体（９５％ＣＩ、１７～１０８）を検出したことを明らかにした（図６Ｄ）。ＤＥＬＦＩをＬＤＣＴのプレスクリーニングとして使用して、平均して３９４の追加の肺癌症例が検出されたか、またはＬＤＣＴ単独と比較して約８倍の増加（９５％ＣＩ、４．４～１９．６倍の増加）であった（図６Ｄ）。組み合わされたアプローチは、肺癌の検出を実質的に改善するだけでなく、検査の精度を増加させ、不必要な手順の数を減少させ、陽性的中率（ＰＰＶ）をＬＤＣＴＬＵＣＡＳについての１．９％およびＬＤＣＴＮＬＳＴについての２．６％（９５％Ｃｌ、０．８～３．８％）からＤＥＬＦＩおよびＬＤＣＴについての３．９％（９５％Ｃｌ、１．８～７．９％、図６Ｅ～６Ｇ）に増加させることが期待される。これらの分析は、高感度の血液ベースの早期検出試験を、肺癌の検出のためのその後の診断ＬＤＣＴと組み合わせることについての有意な集団全体の利益を示唆する。
【0130】
考察
全体として、改善されたＤＥＬＦＩアプローチが、肺癌の検出のためのゲノムワイド断片化分析について記載される。ｃｆＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｏｍｅの容易でスケーラブルな分析を使用して、高リスク集団を肺癌についてプレスクリーニングして、肺癌検出の利用可能性を増加させ、不必要なフォローアップイメージング手順および侵襲的生検を減少させることができることが提案される。ＬＵＣＡＳコホートの分析を通して、ＤＥＬＦＩアプローチが、良性肺結節を有するまたは有さない非癌個体と比較して、全ての病期および組織学的サブタイプにわたって肺癌を検出することができることが実証された。独立した検証コホートにおけるＬＵＣＡＳコホートからの固定ＤＥＬＦＩモデルの検証は、アプローチの一般化可能性を支持する。標的化配列決定アプローチ１６，２２，３９～４３による観察と同様に、ＤＥＬＦＩスコアと腫瘍進行および長期死亡率との間の関係は、血液ベースの断片化分析が、画像化によって観察されない潜在性疾患を同定し得るか、または疾患の攻撃性をより正確に同定し得るという証拠を提供する。ＮＳＣＬＣとＳＣＬＣとの区別は、組織が利用可能でない場合、肺癌患者の非侵襲的特徴付けおよび治療を可能にし得る。標準的な診断方法を通して癌を有することが数ヶ月後に同定されただけのＤＥＬＦＩによる患者の同定は、癌検出のためのアプローチの有用性、再発病の検出、および肺癌検診を通し初期段階（「病期シフト」）での癌の検出の可能性を示す。ゲノムワイド多特徴断片化プロファイル分析を標準タンパク質マーカーおよび臨床特性と組み合わせる可能性は、アプローチの感度をさらに増加させることができる高度に複雑なマルチモーダル分析のための道を提供する。
全体として、改善されたＤＥＬＦＩアプローチが、肺癌の検出のためのゲノムワイド断片化分析について記載される。ｃｆＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｏｍｅの容易でスケーラブルな分析を使用して、高リスク集団を肺癌についてプレスクリーニングして、肺癌検出の利用可能性を増加させ、不必要なフォローアップイメージング手順および侵襲的生検を減少させることができることが提案される。ＬＵＣＡＳコホートの分析を通して、ＤＥＬＦＩアプローチが、良性肺結節を有するまたは有さない非癌個体と比較して、全ての病期および組織学的サブタイプにわたって肺癌を検出することができることが実証された。独立した検証コホートにおけるＬＵＣＡＳコホートからの固定ＤＥＬＦＩモデルの検証は、アプローチの一般化可能性を支持する。標的化配列決定アプローチ１６，２２，３９～４３による観察と同様に、ＤＥＬＦＩスコアと腫瘍進行および長期死亡率との間の関係は、血液ベースの断片化分析が、画像化によって観察されない潜在性疾患を同定し得るか、または疾患の攻撃性をより正確に同定し得るという証拠を提供する。ＮＳＣＬＣとＳＣＬＣとの区別は、組織が利用可能でない場合、肺癌患者の非侵襲的特徴付けおよび治療を可能にし得る。標準的な診断方法を通して癌を有することが数ヶ月後に同定されただけのＤＥＬＦＩによる患者の同定は、癌検出のためのアプローチの有用性、再発病の検出、および肺癌検診を通し初期段階（「病期シフト」）での癌の検出の可能性を示す。ゲノムワイド多特徴断片化プロファイル分析を標準タンパク質マーカーおよび臨床特性と組み合わせる可能性は、アプローチの感度をさらに増加させることができる高度に複雑なマルチモーダル分析のための道を提供する。
【0131】
ほぼ１０年前のＮＬＳＴ試験の発表にもかかわらず５、肺癌罹患率および死亡率の低減におけるＬＤＣＴの影響は限定されている。このアプローチの課題には、多数の患者をスクリーニングすることができる不十分な撮像施設およびインフラストラクチャ、頻繁な訪問および共有される意思決定を必要とする医療精密検査の複雑さ、ならびに毎年のスクリーニングからの反復的な放射線被曝が含まれている４４。加えて、画像化研究は、癌ではなく放射線異常を検出し、陽性スキャン所見のごく少数においてのみ生検同定癌診断をもたらすが、偽陽性所見の大部分は、侵襲的診断手順に至らせならびに追跡調査の数ヶ月または数年の間の進行中の患者に不安を促し得る。最後に、スクリーニングは、高リスクの個体における肺癌の早期検出のための重要なステップとして認識されているが、肺癌のかなりの割合が、より低いリスクの個体において生じ４５、現在のＵＳＰＳＴＦ推奨は、害および利益の不均衡に起因して、これらの患者のためのＬＤＣＴスクリーニングを推奨しない。
【0132】
分析されたコホートは、実世界の予想される集団を表し、全ての試料の収集および処理は、系統的な様式で行われ、分析前の特徴の均一性ならびに実験変数および分析変数の注意深い制御を確実にした。組み合わされたＬＤＣＴ／ＤＥＬＦＩアプローチにおける陽性予測値の潜在的な改善は、多くのより少ない不必要な手順が、陽性結果を有する個体において行われることを示唆する。さらに、ＤＥＬＦＩスコアは、肺癌検出のための他の潜在的バイオマーカーを混乱させた非癌状態によって影響されないようである。スケーラブルで費用効果の高い非侵襲性ｃｆＤＮＡ断片化分析が、肺癌患者を非癌個体から区別することができるという観察は、最終的に、肺癌について高リスク個体だけでなく一般集団も評価する機会を提供し得る。
【0133】
表１．ＬＵＣＡＳコホートにおける患者のデモグラフィックと臨床情報
*Ｐ－値は、以下の項目について、肺癌を有する／有しない個人のデータを比較するために計算された：平均年齢および喫煙パックイヤーはＳｔｕｄｅｎｔの対応のない両側ｔ検定を使用し、性別分布はカイ二乗検定を使用し、喫煙状態および癌既往歴は一元配置分散分析を用いた。
表２．検証コホートにおける患者のデモグラフィックと臨床情報
*Ｐ－値は、以下の項目について、肺癌を有する／有しない個人のデータを比較するために計算された：平均年齢はＳｔｕｄｅｎｔの対応のない両側ｔ検定を使用し、性別分布はカイ二乗検定を使用した。
【表1】
表２．検証コホートにおける患者のデモグラフィックと臨床情報
【表2】
【0134】
参考文献
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２０． Ａｂｂｏｓｈ Ｃ， Ｂｉｒｋｂａｋ ＮＪ， Ｗｉｌｓｏｎ ＧＡ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｔＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｐｉｃｔｓ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１７；５４５：４４６－５１．
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２２． Ｌｅａｌ Ａ， ｖａｎ Ｇｒｉｅｋｅｎ ＮＣＴ， Ｐａｌｓｇｒｏｖｅ ＤＮ， ｅｔ ａｌ． Ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０２０；１１：５２５．
２３． Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ Ｓ， Ｌｅａｌ Ａ， Ｐｈａｌｌｅｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１９；５７０：３８５－９．
２４． ＭａｃＭａｈｏｎ Ｈ， Ｎａｉｄｉｃｈ ＤＰ， Ｇｏｏ ＪＭ， ｅｔ ａｌ． Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｃｉｄｅｎｔａｌ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｎｏｄｕｌｅｓ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｏｎ ＣＴ Ｉｍａｇｅｓ： Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆｌｅｉｓｃｈｎｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１７． Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ２０１７；２８４：２２８－４３．
２５． Ｐａｔｅｌ ＶＫ， Ｎａｉｋ ＳＫ， Ｎａｉｄｉｃｈ ＤＰ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｔａｒｙ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｎｏｄｕｌｅｓ： ｐａｒｔ １： ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ． Ｃｈｅｓｔ ２０１３；１４３：８２５－３９．
２６． Ｐａｔｅｌ ＶＫ， Ｎａｉｋ ＳＫ， Ｎａｉｄｉｃｈ ＤＰ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｔａｒｙ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｎｏｄｕｌｅｓ： ｐａｒｔ ２： ｐｒｅｔｅｓｔ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ． Ｃｈｅｓｔ ２０１３；１４３：８４０－６．
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３５． Ｔａｍｍｅｍａｇｉ ＭＣ， Ｋａｔｋｉ ＨＡ， Ｈｏｃｋｉｎｇ ＷＧ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｌｕｎｇ－ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１３；３６８：７２８－３６．
３６． Ｕｌｚ Ｐ， Ｐｅｒａｋｉｓ Ｓ， Ｚｈｏｕ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｕｍｏｒ ｓｕｂｔｙｐｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１９；１０：４６６６．
３７． Ｂｏｋｈｏｒｓｔ ＬＰ， Ａｌｂｅｒｔｓ ＡＲ， Ｒａｎｎｉｋｋｏ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ Ｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ （ＰＲＩＡＳ） Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｎｃｏｍｐｌｉｅｒｓ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｕｒｏｌｏｇｙ ２０１５；６８：８１４－２１．
３８． Ｄｕｆｆｙ ＭＪ， ｖａｎ Ｒｏｓｓｕｍ ＬＧ， ｖａｎ Ｔｕｒｅｎｈｏｕｔ ＳＴ， ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ ｆａｅｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ： ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｇｒｏｕｐ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｐａｐｅｒ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ２０１１；１２８：３－１１．
３９． Ｐｈａｌｌｅｎ Ｊ， Ｌｅａｌ Ａ， Ｗｏｏｄｗａｒｄ ＢＤ， ｅｔ ａｌ． Ｅａｒｌｙ Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９；７９：１２０４－１３．
４０． Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ Ｖ， Ｆｏｒｄｅ ＰＭ， Ｗｈｉｔｅ ＪＲ， ｅｔ ａｌ． Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９；７９：１２１４－２５．
４１． Ｎａｂｅｔ ＢＹ， Ｅｓｆａｈａｎｉ ＭＳ， Ｍｏｄｉｎｇ ＥＪ， ｅｔ ａｌ． Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅａｒｌｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｆｒｏｍ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ ２０２０；１８３：３６３－７６ ｅ１３．
４２． Ｂｒａｔｍａｎ ＳＶ， Ｙａｎｇ ＣＳＹ， Ｉａｆｏｌｌａ ＭＡＪ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ． Ｎａｔ Ｃａｎｃｅｒ ２０２０；１： ８７３-８８１．
４３． Ｚｈａｎｇ Ｑ， Ｌｕｏ Ｊ， Ｗｕ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ． Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０２０；１０：１８４２－５３．
４４． Ｊｅｍａｌ Ａ， Ｆｅｄｅｗａ ＳＡ． Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｗｉｔｈ Ｌｏｗ－Ｄｏｓｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ－２０１０ ｔｏ ２０１５． ＪＡＭＡ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１７；３：１２７８－８１．
４５． Ｋａｎｇ ＨＲ， Ｃｈｏ ＪＹ， Ｌｅｅ ＳＨ， ｅｔ ａｌ． Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｌｏｗ－Ｄｏｓｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｍｏｎｇ Ｎｅｖｅｒ－Ｓｍｏｋｅｒｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｏｒａｃｉｃ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２０１９；１４：４３６－４４．
４６． Ｃｈｅｎ Ｓ， Ｚｈｏｕ Ｙ， Ｃｈｅｎ Ｙ， Ｇｕ Ｊ． ｆａｓｔｐ： ａｎ ｕｌｔｒａ－ｆａｓｔ ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ ＦＡＳＴＱ ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｏｒ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１８；３４：ｉ８８４－ｉ９０．
４７． Ｌａｎｇｍｅａｄ Ｂ， Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ． Ｆａｓｔ ｇａｐｐｅｄ－ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｏｗｔｉｅ ２． Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２；９：３５７－９．
４８． Ｔａｒａｓｏｖ Ａ， Ｖｉｌｅｌｌａ ＡＪ， Ｃｕｐｐｅｎ Ｅ， Ｎｉｊｍａｎ ＩＪ， Ｐｒｉｎｓ Ｐ． Ｓａｍｂａｍｂａ： ｆａｓｔ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ＮＧＳ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１５；３１：２０３２－４．
４９． Ｑｕｉｎｌａｎ ＡＲ， Ｈａｌｌ ＩＭ． ＢＥＤＴｏｏｌｓ： ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１０；２６：８４１－２．
５０． Ｌｅａｒｙ ＲＪ， Ｓａｕｓｅｎ Ｍ， Ｋｉｎｄｅ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２；４：１６２ｒａ５４．
５１． Ｐ． ＫＭａＢ． ＲＴＣＧＡ： Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｄａｔａ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ． Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．１６．０． ２０１９．
５２． Ｄａｖｏｌｉ Ｔ， Ｕｎｏ Ｈ， Ｗｏｏｔｅｎ ＥＣ， Ｅｌｌｅｄｇｅ ＳＪ． Ｔｕｍｏｒ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１７；３５５．
５３． Ｖａｎｓｔｅｅｎｋｉｓｔｅ Ｊ， Ｄｅ Ｒｕｙｓｓｃｈｅｒ Ｄ， Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ ＷＥ， ｅｔ ａｌ． Ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌｏｃａｌｌｙ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ （ＮＳＣＬＣ）： ＥＳＭＯ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１３；２４ Ｓｕｐｐｌ ６：ｖｉ８９－９８．
５４． Ｓｏｒｅｎｓｅｎ Ｍ， Ｐｉｊｌｓ－Ｊｏｈａｎｎｅｓｍａ Ｍ， Ｆｅｌｉｐ Ｅ， Ｇｒｏｕｐ ＥＧＷ． Ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ： ＥＳＭＯ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１０；２１ Ｓｕｐｐｌ ５：ｖ１２０－５．
５５． Ｄ’Ａｄｄａｒｉｏ Ｇ， Ｆｒｕｈ Ｍ， Ｒｅｃｋ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ： ＥＳＭＯ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１０；２１ Ｓｕｐｐｌ ５：ｖ１１６－９．
５６． Ｌ Ｃ－Ｔ． Ｅｘｐｌｏｒｅ ａｎｄ ｄｏｗｎｌｏａｄ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｃｏｕｎｔ３ ｐｒｏｊｅｃｔ． ． ２０２１．
５７． Ｊｉａｎｇ Ｌ， Ｈｕａｎｇ Ｊ， Ｈｉｇｇｓ ＢＷ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ｓｕｒｖｅｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ＳＲＳＦ１ ａｓ ａ Ｋｅｙ Ｏｎｃｏｄｒｉｖｅｒ ｉｎ Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． ＰＬｏＳ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１６；１２：ｅ１００５８９５．
５８． Ｌａｍｂｅｒｔ ＳＡ， Ｊｏｌｍａ Ａ， Ｃａｍｐｉｔｅｌｌｉ ＬＦ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ ２０１８；１７２：６５０－６５．
５９． Ｈｏｋａｒｉ Ｓ， Ｔａｍｕｒａ Ｙ， Ｋａｎｅｄａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴＴＦ－１ ｂｉｎｄｉｎｇ ＤＮＡ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０２０；１４：２７７－９３．
６０． Ｒｏｂｉｎ Ｘ， Ｔｕｒｃｋ Ｎ， Ｈａｉｎａｒｄ Ａ， ｅｔ ａｌ． ｐＲＯＣ： ａｎ ｏｐｅｎ－ｓｏｕｒｃｅ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ Ｒ ａｎｄ Ｓ＋ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅ ＲＯＣ ｃｕｒｖｅｓ． ＢＭＣ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１１；１２：７７．
６１． Ｂｏｒｒｏｍｅｏ ＭＤ， Ｓａｖａｇｅ ＴＫ， Ｋｏｌｌｉｐａｒａ ＲＫ， ｅｔ ａｌ． ＡＳＣＬ１ ａｎｄ ＮＥＵＲＯＤ１ Ｒｅｖｅａｌ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｒａｍｓ． Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１６；１６：１２５９－７２．
１． Ｆｅｒｌａｙ Ｊ， Ｃｏｌｏｍｂｅｔ Ｍ， Ｓｏｅｒｊｏｍａｔａｒａｍ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ２０１８： ＧＬＯＢＯＣＡＮ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ２０１９；１４４：１９４１－５３．
２． Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ Ｒ， Ｓａｎｔ Ｍ， Ｃｏｌｅｍａｎ ＭＰ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅ １９９９－２００７ ｂｙ ｃｏｕｎｔｒｙ ａｎｄ ａｇｅ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＥＵＲＯＣＡＲＥ－－５－ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１４；１５：２３－３４．
３． ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ＰＭ， Ｗｕ ＣＣ， Ｃａｒｔｅｒ ＢＷ， Ｍｕｎｄｅｎ ＲＦ． Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１８；７：２２０－３３．
４． ｄｅ Ｋｏｎｉｎｇ ＨＪ， ｖａｎ ｄｅｒ Ａａｌｓｔ ＣＭ， ｄｅ Ｊｏｎｇ ＰＡ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｌｕｎｇ－Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｖｏｌｕｍｅ ＣＴ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ａ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｔｒｉａｌ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０；３８２：５０３－１３．
５． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｕｎｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔ， Ａｂｅｒｌｅ ＤＲ， Ａｄａｍｓ ＡＭ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｄｕｃｅｄ ｌｕｎｇ－ｃａｎｃｅｒ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：３９５－４０９．
６． Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＴＢ， Ｓｏｍａｎ Ａ， Ｔｈｏｍａｓ ＣＣ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ － １０ Ｓｔａｔｅｓ， ２０１７． ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｅｅｋｌｙ ｒｅｐｏｒｔ ２０２０；６９：２０１－６．
７． Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． ２０２０． ａｔ ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｇｒｅｓｓｒｅｐｏｒｔ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｌｕｎｇ＿ｃａｎｃｅｒ．）
８． Ｐｉｎｓｋｙ ＰＦ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｉｃａｌ ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１５；９５：９５３－６６．
９． Ｍａｚｚｏｎｅ ＰＪ， Ｓｅａｒｓ ＣＲ， Ａｒｅｎｂｅｒｇ ＤＡ， ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ： Ｗｈｅｎ Ｉｓ ａ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅａｄｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅ？ Ａｎ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｏｌｉｃｙ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ． Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃａｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７；１９６：ｅ１５－ｅ２９．
１０． Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ ＡＫ， Ｃａｐｏｒａｓｏ ＮＥ， Ｋａｔｋｉ ＨＡ， ｅｔ ａｌ． Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１０；２８：２７１９－２６．
１１． Ｔａｎｇ Ｈ， Ｂａｉ Ｙ， Ｓｈｅｎ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１８；５１：１９１－８．
１２． Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｅ， Ｒｉｓｋ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃ， Ｇｕｉｄａ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｉｓｋ ｏｎ ｔｈｅ Ｂａｓｉｓ ｏｆ ａ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｎｅｌ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ＪＡＭＡ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１８；４：ｅ１８２０７８．
１３． Ｔａｎｇ ＺＭ， Ｌｉｎｇ ＺＧ， Ｗａｎｇ ＣＭ， Ｗｕ ＹＢ， Ｋｏｎｇ ＪＬ． Ｓｅｒｕｍ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ： Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１７；１２：ｅ０１８２１１７．
１４． Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ ＧＡ， Ｖａｃｈａｎｉ Ａ， Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ａ Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１５；３７３：２４３－５１．
１５． Ｓｅｉｊｏ ＬＭ， Ｐｅｌｅｄ Ｎ， Ａｊｏｎａ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ： Ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ， Ｐｒｏｍｉｓｅｓ， ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｏｒａｃｉｃ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２０１９；１４：３４３－５７．
１６． Ｐｈａｌｌｅｎ Ｊ， Ｓａｕｓｅｎ Ｍ， Ａｄｌｅｆｆ Ｖ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｃａｎｃｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７；９．
１７． Ｌｉｕ ＭＣ， Ｏｘｎａｒｄ ＧＲ， Ｋｌｅｉｎ ＥＡ， Ｓｗａｎｔｏｎ Ｃ， Ｓｅｉｄｅｎ Ｍ． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｗ．Ｃ． Ｔａｙｌｏｒ， ａｎｄ Ｃ． Ｆｉａｌａ ａｎｄ Ｅ．Ｐ． Ｄｉａｍａｎｄｉｓ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０２０；３１：１２６８－７０．
１８． Ｌｅｎｎｏｎ ＡＭ， Ｂｕｃｈａｎａｎ ＡＨ， Ｋｉｎｄｅ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＰＥＴ－ＣＴ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２０；３６９．
１９． Ｃｈａｂｏｎ ＪＪ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＥＧ， Ｋｕｒｔｚ ＤＭ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｅａｒｌｙ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ２０２０；５８０：２４５－５１．
２０． Ａｂｂｏｓｈ Ｃ， Ｂｉｒｋｂａｋ ＮＪ， Ｗｉｌｓｏｎ ＧＡ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｔＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｐｉｃｔｓ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１７；５４５：４４６－５１．
２１． Ｓｈｅｎ ＳＹ， Ｓｉｎｇｈａｎｉａ Ｒ， Ｆｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｕｍｏｕｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｏｍｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１８；５６３：５７９－８３．
２２． Ｌｅａｌ Ａ， ｖａｎ Ｇｒｉｅｋｅｎ ＮＣＴ， Ｐａｌｓｇｒｏｖｅ ＤＮ， ｅｔ ａｌ． Ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０２０；１１：５２５．
２３． Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ Ｓ， Ｌｅａｌ Ａ， Ｐｈａｌｌｅｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１９；５７０：３８５－９．
２４． ＭａｃＭａｈｏｎ Ｈ， Ｎａｉｄｉｃｈ ＤＰ， Ｇｏｏ ＪＭ， ｅｔ ａｌ． Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｃｉｄｅｎｔａｌ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｎｏｄｕｌｅｓ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｏｎ ＣＴ Ｉｍａｇｅｓ： Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆｌｅｉｓｃｈｎｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１７． Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ２０１７；２８４：２２８－４３．
２５． Ｐａｔｅｌ ＶＫ， Ｎａｉｋ ＳＫ， Ｎａｉｄｉｃｈ ＤＰ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｔａｒｙ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｎｏｄｕｌｅｓ： ｐａｒｔ １： ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ． Ｃｈｅｓｔ ２０１３；１４３：８２５－３９．
２６． Ｐａｔｅｌ ＶＫ， Ｎａｉｋ ＳＫ， Ｎａｉｄｉｃｈ ＤＰ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｔａｒｙ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｎｏｄｕｌｅｓ： ｐａｒｔ ２： ｐｒｅｔｅｓｔ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ． Ｃｈｅｓｔ ２０１３；１４３：８４０－６．
２７． Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ Ｙ， Ｓｐｅｅｄ ＴＰ． Ｓｕｍｍａｒｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔ ｂｉａｓ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１２；４０：ｅ７２．
２８． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎ． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１４；５１１：５４３－５０．
２９． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎ． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｓ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１２；４８９：５１９－２５．
３０． Ｇｅｏｒｇｅ Ｊ， Ｌｉｍ ＪＳ， Ｊａｎｇ ＳＪ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１５；５２４：４７－５３．
３１． Ａｄａｌｓｔｅｉｎｓｓｏｎ ＶＡ， Ｈａ Ｇ， Ｆｒｅｅｍａｎ ＳＳ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃａｌａｂｌｅ ｗｈｏｌｅ－ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｒｅｖｅａｌｓ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１７；８：１３２４．
３２． Ｇｒｏｐｐ Ｃ， Ｌｅｈｍａｎｎ ＦＧ， Ｈａｖｅｍａｎｎ Ｋ． ［Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ （ＣＥＡ） ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｕｒ ｅｘｔｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ （ａｕｔｈｏｒ’ｓ ｔｒａｎｓｌ）］． Ｄｅｕｔｓｃｈｅ ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ １９７７；１０２：１０７９－８２．
３３． Ｇｒｕｎｎｅｔ Ｍ， Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ＪＢ． Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ （ＣＥＡ） ａｓ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ２０１２；７６：１３８－４３．
３４． Ｈａｎａｓｈ ＳＭ， Ｏｓｔｒｉｎ ＥＪ， Ｆａｈｒｍａｎｎ ＪＦ． Ｂｌｏｏｄ ｂａｓｅｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｂｅｙｏｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｆｏｒ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１８；７：３２７－３５．
３５． Ｔａｍｍｅｍａｇｉ ＭＣ， Ｋａｔｋｉ ＨＡ， Ｈｏｃｋｉｎｇ ＷＧ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｌｕｎｇ－ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１３；３６８：７２８－３６．
３６． Ｕｌｚ Ｐ， Ｐｅｒａｋｉｓ Ｓ， Ｚｈｏｕ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｕｍｏｒ ｓｕｂｔｙｐｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１９；１０：４６６６．
３７． Ｂｏｋｈｏｒｓｔ ＬＰ， Ａｌｂｅｒｔｓ ＡＲ， Ｒａｎｎｉｋｋｏ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ Ｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ （ＰＲＩＡＳ） Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｎｃｏｍｐｌｉｅｒｓ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｕｒｏｌｏｇｙ ２０１５；６８：８１４－２１．
３８． Ｄｕｆｆｙ ＭＪ， ｖａｎ Ｒｏｓｓｕｍ ＬＧ， ｖａｎ Ｔｕｒｅｎｈｏｕｔ ＳＴ， ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ ｆａｅｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ： ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｇｒｏｕｐ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｐａｐｅｒ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ２０１１；１２８：３－１１．
３９． Ｐｈａｌｌｅｎ Ｊ， Ｌｅａｌ Ａ， Ｗｏｏｄｗａｒｄ ＢＤ， ｅｔ ａｌ． Ｅａｒｌｙ Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９；７９：１２０４－１３．
４０． Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ Ｖ， Ｆｏｒｄｅ ＰＭ， Ｗｈｉｔｅ ＪＲ， ｅｔ ａｌ． Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９；７９：１２１４－２５．
４１． Ｎａｂｅｔ ＢＹ， Ｅｓｆａｈａｎｉ ＭＳ， Ｍｏｄｉｎｇ ＥＪ， ｅｔ ａｌ． Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅａｒｌｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｆｒｏｍ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ ２０２０；１８３：３６３－７６ ｅ１３．
４２． Ｂｒａｔｍａｎ ＳＶ， Ｙａｎｇ ＣＳＹ， Ｉａｆｏｌｌａ ＭＡＪ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ． Ｎａｔ Ｃａｎｃｅｒ ２０２０；１： ８７３-８８１．
４３． Ｚｈａｎｇ Ｑ， Ｌｕｏ Ｊ， Ｗｕ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ． Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０２０；１０：１８４２－５３．
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【0135】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、例示を意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、例示を意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【0136】
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用される全ての米国特許および公開または未公開米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書で引用される全ての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中で引用される全ての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、本明細書中で参考として援用される。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【国際調査報告】