特表 2024-502302 小分子ＲＮＡバイオマーカーの同定方法及びエキソソームを含む循環細胞外小胞の機能評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-18

(54)【発明の名称】小分子ＲＮＡバイオマーカーの同定方法及びエキソソームを含む循環細胞外小胞の機能評価方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20240111BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20240111BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20240111BHJP

   C12Q 1/6834 20180101ALI20240111BHJP

   C12Q 1/34 20060101ALI20240111BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240111BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240111BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240111BHJP

   A61K 9/72 20060101ALI20240111BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20240111BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20240111BHJP

   A61K 31/343 20060101ALI20240111BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240111BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240111BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20240111BHJP

   C12N 15/115 20100101ALN20240111BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240111BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240111BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240111BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240111BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20240111BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240111BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240111BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z ZNA

C12Q1/6851 Z

C12Q1/06

C12Q1/6834 Z

C12Q1/34

C12N15/113 Z

A61K45/00

A61P31/14

A61K9/72

A61K31/573

A61K38/21

A61K31/343

G01N33/53 D

G01N33/53 M

G01N33/543 511A

G01N33/569 Z

C12N15/115 Z

C12N5/10

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C07K14/725

C07K16/28

C07K19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539074

(86)(22)【出願日】2021-12-23

(85)【翻訳文提出日】2023-08-23

(86)【国際出願番号】 US2021065060

(87)【国際公開番号】W WO2022140662

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】63/130,545

(32)【優先日】2020-12-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523235127

【氏名又は名称】ハッケンサック メリディアン ヘルス センター フォー ディスカバリー アンド イノベーション

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100156982

【弁理士】

【氏名又は名称】秋澤 慈

(72)【発明者】

【氏名】ミッチェル メーガン イルヴェット

(72)【発明者】

【氏名】ラウディッグ オリヴィエ

(72)【発明者】

【氏名】カマリ－モガダム マスード

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C076

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ10

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QQ70

4B063QQ79

4B063QR08

4B063QR14

4B063QR15

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR41

4B063QR48

4B063QR55

4B063QR62

4B063QR72

4B063QR77

4B063QR79

4B063QR80

4B063QR82

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

4B063QS38

4B063QX01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA46

4C076AA93

4C076BB13

4C076BB21

4C076CC35

4C076FF70

4C084AA17

4C084DA21

4C084MA13

4C084MA56

4C084NA14

4C084ZB33

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA06

4C086CB07

4C086DA10

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA17

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZB33

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA75

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】小分子ＲＮＡバイオマーカーの同定方法及びエキソソームを含む循環細胞外小胞の機能評価方法を提供する。
【解決手段】次世代シーケンシングによる低存在量の小ＲＮＡカーゴのハイスループット解析用に設計された、ＡｎＴｉｂｏｄｙ ｏｆ ＣＨｏｉｃｅ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｌｅａｓｅ（ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ）による細胞外小胞の捕捉の精製方法、および、重症ウイルス感染症の発症リスクのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価および重症ウイルス感染症の治療を行うために、生物学的サンプルから生物学的粒子または細胞の精製集団を調製する際の当該方法の使用、ならびに、重症コロナウイルス感染症のリスクを有する患者における回復期血漿療法の治療効果を増強するため、および重症コロナウイルス感染症の患者を治療するために当該方法の使用が記載されている。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象からの生物学的サンプルから精製された生物学的粒子集団を調製する方法、および前記精製された生物学的粒子集団のカーゴを評価するための方法であって、
ａ）
（１）生物学的粒子を含む生物学的サンプルを得ることと、
（２）前記対象からの生物学的粒子を含む前記生物学的サンプルを、１つ以上の生物学的粒子表面抗原に向けられた結合剤と接触させ、ここで、前記結合剤は核酸に連結され、前記核酸は固体支持体上に固定化されることとによって、
精製された生物学的粒子集団を調製することと、
ｂ）前記結合剤によって結合された前記生物学的粒子を前記生物学的サンプルから分離することと、
ｃ）前記結合剤に結合した前記生物学的粒子を放出することと、
ｄ）前記結合した生物学的粒子を前記結合剤から溶出し、遊離精製された生物学的粒子の集団を形成することと、
ｅ）前記精製された生物学的粒子集団の、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または脂質を含むカーゴおよび表面分子を評価することとを含む、前記方法。

【請求項2】

カーゴおよび表面分子を評価する工程（ｅ）は、
（ｉ）質量分析によって前記生物学的粒子の表面に特異的なタンパク質及び／または脂質を同定すること、または
（ｉｉ）質量分析によってタンパク質及び／または脂質カーゴを同定すること、または
（ｉｉｉ）シークエンシングまたは定量ＰＣＲによりＤＮＡ分子を同定すること、または
（ｉｖ）前記精製された生物学的粒子集団からＲＮＡを抽出し、前記精製された生物学的粒子集団により封入されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子非コードＲＮＡの発現を同定および定量すること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

生物学的粒子のプールされた異種集団の開始を提供するために、初期の限外濾過または超遠心分離工程を含む、請求項１記載の方法。

【請求項4】

前記生物学的サンプルが、体液を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記体液が、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、便、汗、涙液、乳頭吸引液、もしくは精液または分泌された生物学的液体を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記体液が、循環体液または分泌される体液である、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記循環体液が、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）またはリンパ液である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

１つ以上の生物学的粒子表面抗原に結合する前記結合剤が、抗体、抗体結合断片、またはアプタマーである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記アプタマーが、核酸またはポリペプチドである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記生物学的粒子表面抗原が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、カベオリン－１、サイトケラチン、ＥＰＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、Ｐ６３、または異種細胞表面ポリペプチドのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記核酸が、ＤＮＡを含む、請求項11に記載の方法。

【請求項13】

前記ＤＮＡが、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドがウラシルである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ＤＮＡが制限酵素認識部位を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記核酸が、エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅ（ＲＮａｓｅ－Ｈ）によって分解され得るＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖である、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

前記核酸が、非天然ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記核酸が、前記核酸の第1末端上の結合部位および前記核酸の第２末端上の結合部位をさらに含み、前記核酸の第１末端上の結合部位および前記核酸の第２末端上の前記結合部位が異なる、請求項１１に記載の方法。

【請求項19】

前記核酸の前記第１末端上の前記結合部位が、アビジン、ストレプトアビジンまたはカルボキシル結合部分である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記結合部位が、ビオチンである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記核酸の前記第２末端上の前記結合部位が、アミン部位である、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記アミン部位が、アジドである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

１つ以上の生物学的粒子表面抗原に対する前記結合剤が、ジベンゾシクロオクチイン（ＤＢＣＯ）分子、２－ＩＴ（２－イミノチオラン）、ＭＢＳ（３－マレイミド安息香酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ、またはそれらの誘導体、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記固体支持体が、ウェルプレート、ポリマー、または表面である、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記単離された生物学的粒子を放出することは、
（ｉ）前記核酸を酵素的に切断すること、または
（ｉｉ）前記核酸の第１鎖または第２鎖に相補的な核酸、および前記抗体を前記支持体から遊離させる鎖置換活性を有する酵素を用いて、鎖置換によって、前記支持体に結合された前記核酸の前記第２鎖から前記抗体に結合された前記核酸の前記第１鎖を置換すること、または
（ｉｉｉ）前記抗体に結合した前記ＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、前記抗体に結合した前記ＤＮＡ鎖を損傷することなく、前記抗体を前記プラットフォームから放出できるように、アニールしたＤＮＡ鎖を分離することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記酵素的切断が、ウラシルグリコシラーゼによって行われる、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記酵素的切断が、制限酵素によって行われる、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記酵素的切断が、エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅによって行われる、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

鎖置換活性を有する前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼまたはヘリカーゼである、請求項２５に記載の方法。

【請求項30】

次世代シーケンシングによって、前記１つ以上の生物学的粒子に封入されたｍｉＲＮＡを含む前記１つ以上の低分子非コードＲＮＡを同定することを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項31】

前記単離された生物学的粒子が、健康な対象または疾病に罹患している対象に由来する、請求項１記載の方法。

【請求項32】

前記疾患が、ウイルス感染、がん、胎盤異常、運動誘発性筋肉損傷、心不全、アルツハイマー病、肝硬変、ウイルスおよび細菌感染、腎疾患、損傷後の骨リモデリング、創傷治癒またはＣＯＰＤおよび灰白質を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

前記ウイルス感染が重症コロナウイルス感染である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記重症コロナウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記重症コロナウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による重症コロナウイルス感染症に罹患した対象由来の単離かつ定量された前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－６２９のうちの１つ以上を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項37】

重症ＳＡＲＳＣｏＶ－２疾患のｍｉＲＮＡマーカーには、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ１２６－３ｐまたはその両方が含まれる、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

対象の重症コロナウイルス感染症の発症リスクをｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し、治療する方法であって、
ａ．
（１）前記対象からの生物学的粒子を含む生物学的サンプルを得ることと、
（２）前記対象からの生物学的粒子を含む前記生物学的サンプルを、１つ以上の生物学的粒子表面抗原に対する結合剤と接触させ、ここで、前記結合剤は核酸に連結され、前記核酸は固体支持体上に固定化されることとによって、
精製された生物学的粒子集団を調製することと、
ｂ．前記結合剤によって結合された前記生物学的粒子を前記生物学的サンプルから分離することと、
ｃ．前記結合剤に結合した前記生物学的粒子を放出することと、
ｄ．前記結合した生物学的粒子を前記結合剤から溶出し、遊離精製された生物学的粒子の集団を形成することと、
（ｉ）前記精製された生物学的粒子の集団からＲＮＡを抽出することと、
（ｉｉ）前記精製されたエキソソーム集団により封入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子非コードＲＮＡの発現を同定および定量することと、
（ｉｉｉ）前記精製された生物学的粒子のカーゴプロフィールを、（１）前記コロナウイルスに感染していない対照対象、（２）前記コロナウイルスに感染して軽症になった対照対象、および（３）コロナウイルスに感染して重症になった対照対象のカーゴプロファイルと比較することとによって、
ｅ．精製された生物学的粒子の集団のカーゴを評価することにより、前記精製された生物学的粒子のカーゴプロファイルを決定することと、
（ｆ）前記患者が重症ウイルス感染症にかかるリスクを判定することであって、前記精製された生物学的粒子についての前記低分子非コードＲＮＡまたはタンパク質のカーゴプロファイルは、重症疾患を発症したコロナウイルスに感染した前記対照対象からの前記カーゴプロファイルよりも約１.５倍低いか、または約１.５倍高くなることと、
（ｇ）前記重症ウイルス感染のリスクがある患者に適した治療を実施することとを含む、前記方法。

【請求項39】

生物学的粒子のプールされた異種集団を提供するために、初期の限外濾過または超遠心分離工程を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記生物学的サンプルが、体液を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

前記体液が、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、便、汗、涙液、乳頭吸引液、精液または分泌された生物学的液体を含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記体液が、循環体液または分泌される体液である、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

前記循環体液が、全血、血清、血漿、ＣＳＦまたはリンパ液である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記重症コロナウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである、請求項３８に記載の方法。

【請求項45】

前記重症コロナウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２に感染した前記対象のｍｉＲＮＡの集団は、対照と比較した場合、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０－５ｐ、またはｈｓａ－ｍｉＲ－６２９うち１つ以上を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされる重症疾患のｍｉＲＮＡマーカーは、対照と比較した場合、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ１２６－３ｐ、またはｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａおよびｈｓａ－ｍｉＲ１２６－３ｐの両方を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

１つ以上の生物学的粒子表面抗原に結合する前記結合剤が、抗体、抗体断片、またはアプタマーである、請求項３８に記載の方法。

【請求項49】

前記エクソソーム表面抗原が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、カベオリン－１、サイトケラチン、ＥＰＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、Ｐ６３、または異種細胞表面ポリペプチドのうちの１つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項50】

前記核酸は、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドを含むＤＮＡを含み、前記リボ核酸ヌクレオチドはウラシルである、請求項３８に記載の方法。

【請求項51】

前記単離された生物学的粒子を放出することは、
（ｉ）前記核酸を酵素的に切断すること、または
（ｉｉ）前記核酸の第１鎖または第２鎖に相補的な核酸、および前記抗体を前記支持体から遊離させる鎖置換活性を有する酵素を用いて、鎖置換によって、前記支持体に結合された前記核酸の前記第２鎖から前記抗体に結合された前記核酸の前記第１鎖を置換すること、または
（ｉｉｉ）前記抗体に結合した前記ＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、前記抗体に結合した前記ＤＮＡ鎖を損傷することなく、前記抗体を前記プラットフォームから放出できるように、前記アニールしたＤＮＡ鎖を分離することを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項52】

前記酵素的切断が、ウラシルグリコシラーゼによって行われる、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記酵素的切断が、制限酵素によって行われる、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

前記酵素的切断が、エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅによって行われる、請求項５１に記載の方法。

【請求項55】

鎖置換活性を有する前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼまたはヘリカーゼである、請求項５１に記載の方法。

【請求項56】

前記精製された生物学的粒子の集団によって封入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子非コードＲＮＡの同定および定量化は、次世代シーケンシングによって行われる、請求項３８に記載の方法。

【請求項57】

前記重症ウイルス感染症のリスクがある患者に適切な前記治療法は、支持療法、抗ウイルス剤、免疫調節剤の1つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項58】

（ａ）前記支持療法には、液体の静脈内投与、酸素補給、またはネブライザーによる蒸気の吸入が含まれ、または
（ｂ）前記抗ウイルス剤が、ウイルスの侵入を阻害するか、ウイルス量を減少させるか、またはその両方を行い、または
（ｃ）前記抗ウイルス剤は、アシクロビル、ガンシドビル、ホスカルネット；リバビリン；アマンタジン、アジドデオキシチミジン（ジドブジン）、ネビラピン、テトラヒドロイミダゾベンゾジアゼピノン（ＴＩＢＯ）化合物；エファビレンツ；レムデシビル、ロピナビル／リトナビル、ウミフェノビル、ファビピラビル、イベルメクチン、およびデラビルジンから選択され、または
（ｄ）前記免疫調節剤が、グルココルチコイド、または組み換えインターフェロンであり、または
（ｅ）前記免疫調節剤がグルココルチコイドであり、前記グルココルチコイドがコルチコステロイドである、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記グルココルチコイドは、プレドニゾン、デキサメタゾン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

重症コロナウイルス感染症のリスクのある患者を治療するための回復期血漿療法の治療効果を増強する方法であって、
ａ）回復期対象の回復期血清から、
（１）前記コロナウイルスに対する高いＩｇＧ力価を有する回復期血清を、前記回復期対象から得ることと、
（２）前記回復期血清を、１つ以上の生物学的粒子表面抗原に向けられた結合剤と接触させ、ここで、前記結合剤は核酸に連結され、前記核酸は固体支持体上に固定化されることにより、前記精製された生物学的粒子集団を調製することと、
ｂ）前記結合剤によって結合された前記生物学的粒子を前記生物学的サンプルから分離することと、
ｃ）前記結合剤に結合した前記生物学的粒子を放出することと、
ｄ）前記結合した生物学的粒子を前記結合剤から溶出し、遊離精製された生物学的粒子の集団を形成することと、
ｅ）前記コロナウイルスについての前記精製された生物学的粒子集団の中和力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
ｆ）高い中和力価の生物学的粒子および高い中和力価のＩｇＧを含む前記回復期血清を前記対象に投与することと、を含む、前記方法。

【請求項61】

生物学的粒子のプールされた異種集団を提供するために、初期の限外濾過または超遠心分離工程を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記生物学的サンプルが、体液を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項63】

前記体液が、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、便、汗、涙液、乳頭吸引液、精液または分泌された生物学的液体を含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記体液が、循環体液である、請求項６２に記載の方法。

【請求項65】

前記循環体液が、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）またはリンパ液である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

１つ以上の生物学的粒子表面抗原に結合する前記結合剤が、抗体、抗体断片、またはアプタマーである、請求項６０に記載の方法。

【請求項67】

前記生物学的粒子表面抗原が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、カベオリン－１、サイトケラチン、ＥＰＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、Ｐ６３、または異種細胞表面ポリペプチドのうちの１つ以上を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項68】

前記核酸は、リボ核酸ヌクレオチドを含むＤＮＡを含み、前記リボ核酸ヌクレオチドは、ウラシルであるか、または前記ＤＮＡは制限酵素認識部位を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項69】

前記単離された生物学的粒子を放出することは、
（ｉ）前記核酸を酵素的に切断すること、または
（ｉｉ）前記核酸の第１鎖または第２鎖に相補的な核酸、および前記抗体を前記支持体から遊離させる鎖置換活性を有する酵素を用いて、鎖置換によって、前記支持体に結合された前記核酸の前記第２鎖から前記抗体に結合された前記核酸の前記第１鎖を置換すること、または
（ｉｉｉ）前記抗体に結合した前記ＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、前記抗体に結合した前記ＤＮＡ鎖を損傷することなく、前記抗体を前記プラットフォームから放出できるように、前記アニールしたＤＮＡ鎖を分離することを含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項70】

前記酵素的切断が、ウラシルグリコシラーゼによって行われる、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記酵素的切断が、制限酵素によって行われる、請求項６９に記載の方法。

【請求項72】

前記酵素的切断が、エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅによって行われる、請求項６９に記載の方法。

【請求項73】

鎖置換活性を有する前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼまたはヘリカーゼである、請求項６９に記載の方法。

【請求項74】

前記重症コロナウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである、請求項６０に記載の方法。

【請求項75】

前記重症コロナウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記高ＩｇＧ力価を有する前記回復期血清に由来する前記中和精製された生物学的粒子集団が、ＡＣＥ２－レセプターを含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項77】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する前記精製された生物学的粒子集団の中和力価を測定することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでコロナウイルスに感染した哺乳動物細胞を、高いＩｇＧ力価を有する前記回復期血清由来の前記単離精製された生物学的粒子の希釈系列でインキュベートすることと、陰性対照（前記回復期血清由来の前記精製された生物学的粒子を含まない感染細胞）と比較してウイルス粒子産生を測定することとをさらに含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項78】

前記ウイルス粒子産生は、陰性対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少する、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

（ａ）前記中和精製された生物学的粒子を含む前記回復期血清は、回復期血漿療法のみを用いた治療と比較して、回復期血漿療法の有効性を少なくとも約２倍に向上させることができ、または
（ｂ）前記中和精製された生物学的粒子により、免疫系にウイルス抗原を提示できる、請求項６０に記載の方法。

【請求項80】

重症コロナウイルス感染を有する対象を治療する方法であって、
（１）生物学的粒子を含む前記生物学的サンプルを得ることと、
（２）前記対象からの生物学的粒子を含む前記生物学的サンプルを、１つ以上の生物学的粒子表面抗原に対する結合剤と接触させ、ここで、前記結合剤は核酸に連結され、前記核酸は固体支持体上に固定化されることと、
（３）前記結合剤によって結合された前記生物学的粒子を前記生物学的サンプルから分離することと、
（４）前記結合剤に結合した前記生物学的粒子を放出することと、
（５）前記結合した生物学的粒子を前記結合剤から溶出し、遊離精製された生物学的粒子の集団を形成することと、
（６）前記精製された生物学的粒子集団の中和力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することとによって、
（ａ）前記対象の生物学的サンプルから精製された生物学的粒子集団の中和力価を決定することと、
（ｂ）前記対象からの前記精製された生物学的粒子集団の中和力価が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルス粒子産生を減少させるには不十分である場合に、前記精製された生物学的粒子を中和することを含む回復期血漿療法を受ける前記対象を選択することと、
（ｉ）回復期対象から、高い抗コロナウイルスＩｇＧ力価を含む回復期血清を得ることと、
（ｉｉ）前記回復期血清を、１つ以上の生物学的粒子表面抗原に向けられた結合剤と接触させることと、
（ｉｉｉ）前記結合剤によって結合された前記生物学的粒子を前記生物学的サンプルから分離することと、
（ｉｖ）前記結合剤に結合した前記生物学的粒子を放出することと、
（ｖ）前記精製された生物学的粒子集団の中和力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することとによって、
（ｃ）回復期対象の回復期血漿から、精製された生物学的粒子集団を調製することと、
（ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスについて回復期血清から精製された生物学的粒子集団の中和力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、
（ｅ）前記対象に、前記中和精製された生物学的粒子を単独投与するか、または前記中和精製された生物学的粒子を含む高ＩｇＧ力価の回復期血清を投与することとを含む、方法。

【請求項81】

生物学的粒子のプールされた異種集団を提供するために、初期の限外濾過または超遠心分離工程を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記生物学的サンプルが、体液を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項83】

前記体液が、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、便、汗、涙液、乳頭吸引液、精液または分泌された生物学的液体を含む、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記体液が、循環体液を含む、請求項８２に記載の方法。

【請求項85】

前記循環体液が、全血、血清、血漿、ＣＳＦまたはリンパ液である、請求項８２に記載の方法。

【請求項86】

１つ以上の生物学的粒子表面抗原に結合する前記結合剤が、抗体、抗体断片、またはアプタマーである、請求項８０に記載の方法。

【請求項87】

前記生物学的粒子表面抗原が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、カベオリン－１、サイトケラチン、ＥＰＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、Ｐ６３、または異種細胞表面ポリペプチドのうちの１つ以上を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項88】

前記単離された生物学的粒子を放出することは、
（ｉ）前記核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを酵素的に切断すること、または
（ｉｉ）前記核酸の第１鎖または第２鎖に相補的な核酸、および前記抗体を前記支持体から遊離させる鎖置換活性を有する酵素を用いて、鎖置換によって、前記支持体に結合された前記核酸の前記第２鎖から前記抗体に結合された前記核酸の前記第１鎖を置換すること、または
（ｉｉｉ）前記抗体に結合した前記ＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、前記抗体に結合した前記ＤＮＡ鎖を損傷することなく、前記抗体を前記プラットフォームから放出できるように、アニールしたＤＮＡ鎖を分離することを含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項89】

前記核酸がリボ核酸ヌクレオチドを含むＤＮＡを含み、前記リボ核酸ヌクレオチドがウラシルであり、前記酵素的切断がウラシルグリコシラーゼによって行われる、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記酵素的切断が、制限酵素によって行われる、請求項８８に記載の方法。

【請求項91】

前記酵素的切断が、エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅによって行われる、請求項８８に記載の方法。

【請求項92】

鎖置換活性を有する前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼまたはヘリカーゼである、請求項８８に記載の方法。

【請求項93】

前記重症コロナウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである、請求項８０に記載の方法。

【請求項94】

前記重症コロナウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

（ｉ）前記対象から精製された生物学的粒子集団の中和力価と、（ｉｉ）コロナウイルスに対する高いＩｇＧ力価を有する回復期血清からの精製された生物学的粒子集団の中和力価とを測定する方法は、
前記コロナウイルスに感染した哺乳動物細胞を、（ｉ）前記対象由来の単離精製された生物学的粒子、および（ｉｉ）高ＩｇＧ力価を有する回復期血清由来の単離精製された生物学的粒子、の希釈系列でｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることと、
ウイルス粒子産生を陰性対照（感染細胞単独）と比較することと、を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項96】

精製された生物学的粒子の中和集団がＡＣＥ２－レセプターを含む、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

対象からの生物学的サンプルから精製された細胞集団を調製する方法であって、
（１）細胞を含む前記対象から生物学的サンプルを取得することと、
（２）細胞を含む前記対象からの前記生物学的サンプルを、１つ以上の細胞表面抗原に向けられた結合剤と接触させ、ここで、前記結合剤は核酸に連結され、前記核酸は固体支持体上に固定化されることとによって、
ａ）精製された細胞の集団を調製することと、
ｂ）前記結合剤によって結合された前記細胞を前記生物学的サンプルから分離することと、
ｃ）前記結合剤に結合した前記細胞を放出することと、
ｄ）結合した細胞を前記結合剤から溶離して、精製された細胞の集団を形成することと、を含む、前記方法。

【請求項98】

細胞のプールされた異種集団の開始を提供するために、初期の限外濾過または超遠心分離工程を含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記生物学的サンプルは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで調製される、請求項９７に記載の方法。

【請求項100】

前記生物学的サンプルが、体液を含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項101】

前記体液が、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、便、汗、涙液、乳頭吸引液、精液または分泌された生物学的液体を含む、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記体液が、循環体液または分泌される体液である、請求項１００に記載の方法。

【請求項103】

前記循環体液が、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）またはリンパ液である、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

前記1つ以上の細胞表面抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ４６、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１３８、ＣＤ１５１、ＡＬｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、カベオリン－１、サイトケラチン、ＥＰＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、Ｐ６３、または異種細胞表面ポリペプチドを含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項105】

前記異種細胞表面ポリペプチドは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）によって発現される、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

１つ以上の細胞表面抗原に結合する前記結合剤が、抗体、抗体結合断片、またはアプタマーである、請求項９７に記載の方法。

【請求項107】

前記アプタマーが、核酸またはポリペプチドである、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項109】

前記核酸が、ＤＮＡを含む、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記ＤＮＡが、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドを含む、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドがウラシルである、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記ＤＮＡが制限酵素認識部位を含む、請求項１０９に記載の方法。

【請求項113】

前記核酸が、エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅ（ＲＮａｓｅ－Ｈ）によって分解され得るＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖である、請求項１０８に記載の方法。

【請求項114】

前記核酸が、非天然ヌクレオチドを含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項115】

前記核酸が、前記核酸の第1末端上の結合部位および前記核酸の第２末端上の結合部位をさらに含み、前記核酸の第１末端上の結合部位および前記核酸の第２末端上の結合部位が異なる、請求項９７に記載の方法。

【請求項116】

前記核酸の前記第１末端上の前記結合部位が、アビジン、ストレプトアビジンまたはカルボキシル結合部分である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記結合部位が、ビオチンである、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記核酸の前記第２末端上の前記結合部位が、アミン部位である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項119】

前記アミン部位が、アジドである、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

１つ以上の細胞表面抗原に対する前記結合剤が、ジベンゾシクロオクチイン（ＤＢＣＯ）分子、２－ＩＴ（２－イミノチオラン）、ＭＢＳ（３－マレイミド安息香酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ、またはそれらの誘導体、請求項９７に記載の方法。

【請求項121】

前記固体支持体が、ウェルプレート、ポリマー、または表面である、請求項９７に記載の方法。

【請求項122】

前記単離された細胞を放出することは、
（ｉ）前記核酸を酵素的に切断すること、または
（ｉｉ）前記核酸の第１鎖または第２鎖に相補的な核酸、および前記抗体を前記支持体から遊離させる鎖置換活性を有する酵素を用いて、鎖置換によって、前記支持体に結合された前記核酸の前記第２鎖から前記抗体に結合された前記核酸の前記第１鎖を置換すること、または
（ｉｉｉ）前記抗体に結合した前記ＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、前記抗体に結合した前記ＤＮＡ鎖を損傷することなく、前記抗体を前記プラットフォームから放出できるように、アニールしたＤＮＡ鎖を分離することを含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項123】

前記酵素的切断が、ウラシルグリコシラーゼによって行われる、請求項１２２に記載の方法。

【請求項124】

前記酵素的切断が、制限酵素によって行われる、請求項１２２に記載の方法。

【請求項125】

前記酵素的切断が、エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅによって行われる、請求項１２２に記載の方法。

【請求項126】

鎖置換活性を有する前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼまたはヘリカーゼである、請求項１２２に記載の方法。

【請求項127】

精製された細胞の集団は、非真核細胞、真核細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項128】

前記真核細胞が、ヒト、マウス、ラット、イヌ、非ヒト霊長類またはネコ科動物である、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

前記精製された細胞の集団が、健康な対象または疾病に罹患している対象に由来する、請求項９７に記載の方法。

【請求項130】

前記疾患が、がん、ウイルス感染、胎盤異常、炎症および他の病理を含む、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記細胞が、内皮細胞、上皮細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、神経細胞、腫瘍細胞、血液細胞、または心臓細胞である、請求項９７に記載の方法。

【請求項132】

前記細胞の集団が、
（ａ）非真核種および真核種、または
（ｂ）健康な正常組織、または疾患組織、または
（ｃ）マウスのオルソトピック／異種移植片／ＰＤＸ臓器、または
（ｄ）血液、または
（ｅ）組織培養から誘導されている、請求項９７に記載の方法。

【請求項133】

前記ウイルス感染が重症コロナウイルス感染である、請求項１３０に記載の方法。

【請求項134】

前記重症コロナウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである、請求項１３２に記載の方法。

【請求項135】

前記重症コロナウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである、請求項１３３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２４日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｍａｌｌ－ＲＮＡ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ」と題された米国仮特許出願第６３／１３０，５４５号に基づく優先権を主張し、前記出願の全内容は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含んでおり、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。２０２１年１２月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーのファイル名は、１２９６４２－００４２０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、ファイルサイズは２１，２６１バイトである。

【0003】

本開示は、循環細胞外小胞の単離方法及び精製方法に関する。

【背景技術】

【0004】

感染症、炎症、がん、その他の生理学的及び病理学的過程において細胞から放出される核酸は、ヒトの血液中に循環しており、疾患の強力なバイオマーカーとなる可能性がある［１，２］。例えば、がんの治療効果及び残存病変の有無を評価するために、循環細胞フリーゲノム腫瘍ＤＮＡ変異を検出する技術が有望視されている［３－６］。大分子一本鎖ＲＮＡ転写産物は循環中に分解されるが、小分子ＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ；塩基長約２２ｎｔ）はそのまま残り、病的プロセスを反映するために検出し、測定することができる。ｍｉＲＮＡは、特定のｍＲＮＡ標的の活性を調節するマスター転写調節因子であり、正常過程及び病的過程の広い範囲において、重要な役割を果たしている［７－１２］。循環ｍｉＲＮＡの検出には大きな進歩があったが、多様な細胞や組織から得られる循環ｍｉＲＮＡの大きなプールの中で、これらの分子が占める割合が低いため、より高い検出感度と特異性が要求され、疾患に関連するｍｉＲＮＡバイオマーカーの発見は依然として難題であった。この問題に対処するため、現在では血液、血清、血漿から精製された全ＲＮＡではなく、細胞外小胞にカプセル化されたｍｉＲＮＡカーゴの分析に焦点が当てられている［１３－１５］。細胞外小胞は、ほとんどの種類の細胞から微小環境と循環系に活発に放出され、標的細胞の取り込みを介した細胞間コミュニケーションに関与することが知られており、小胞が輸送するｍｉＲＮＡは受容細胞の再プログラミングに関与している［１６－２０］。

【0005】

脂質二分子層を持つ細胞外小胞（ＥＶ）は、そのユニークなサイズ範囲（直径３０～１５０ｎｍ）及び生合成の両者によって区別される［２１］。ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２は活発に分泌され、膜結合型テトラスパニンに特異的に濃縮されており、抗体精製の標的とすることができる［２１、２２］。細胞外小胞は分泌の過程において、由来となる細胞から表面分子（タンパク質、脂質など）も獲得しており、抗体ベースの精製をより選択的に行うことができる［２３－２５］。細胞外小胞精製のためのマイクロ流体ベースのシステム開発において、ここ数年で大きな進歩が見られたが、商業的な市場にはほとんど到達していないため、生物流体からの細胞外小胞の精製と評価のための実験室ベースの技術が、依然としてゴールドスタンダードとなっている。これまで、循環細胞外小胞を精製する４つの主要なアプローチが開発されており、その多くは大量の細胞外小胞の選択による平均化されたバイオマーカーの評価を提供するものである［２６－２８］。細胞外小胞を精製する３つの古典的アプローチは、超遠心分離、沈殿、及びサイズ排除を利用したものである［２６－２９］。これらの方法では、純粋な細胞外小胞調製物が得られるが（沈殿ベースの方法には注意点がある）、いずれも様々な組織や細胞タイプから循環中に放出される細胞外小胞のサブ集団が混在するため、その後の解析を混乱させる。第４の方法は、モノクローナル抗体でコーティングした磁気ビーズを用いて、細胞外小胞の表面バイオマーカーを選択することにより、細胞外小胞を免疫精製する方法である［２５、３０、３１］。ストレプトアビジン磁気ビーズは、カスタマイズ可能なビオチン化抗体ベースの選択を可能にする可能性があるが、このカスタマイズの最適化は依然として困難であり、磁気ビーズの品質（表面ポリマー）及びデザイン（ストレプトアビジンコーティング）に大きく依存する。一般に、市販されている抗体ベースの精製アッセイのほとんどは、既知の細胞外小胞表面マーカー（ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９など）の認識にのみ依存する静的なシステムであり、細胞特異的な細胞外小胞の異なるサブ集団をカスタマイズして選択及び評価を行うことはできない。これらの確立されたアッセイ法は、細胞外小胞の強固な選択を可能にするが、細胞特異的な表面マーカーを生体流体から選択できる、カスタマイズ可能な抗体選択アッセイは、循環疾患バイオマーカーの同定に、より有望である［３２］。最後に、下流のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析のために、選択した細胞外小胞をそのまま放出できるような抗体ベースの方法が構築されることはほとんどない。最近のイムノアフィニティーに基づく細胞外小胞分離アッセイ（ｅｘｏ－ＰＬＡ）は、細胞外小胞結合抗体と磁性ビーズとの間に酵素分解可能なＤＮＡリンカーを使用し、無傷の細胞外小胞の放出を可能にすることで、これらの問題の多くを解決した［３１］。しかし本発明者らの初期評価では、このアプローチで使用される磁気ビーズは、低存在量のｍｉＲＮＡカーゴの検出を著しく制限する程度まで、低分子ＲＮＡを非特異的に結合させる可能性があることが示された。

【0006】

細胞外小胞は、バイオマーカーの貴重な供給源であるだけでなく、複数の生物学的プロセス、特に免疫系において重要な役割を果たしている［３３－３８］。最近の研究では、細胞外小胞が免疫系への抗原提示に関与し［３７、３８］、ウイルス感染時の免疫防御を仲介している可能性が示唆されている［３３、３４］。よく研究されているウイルス（ＨＩＶ、ＥＢＶ、エボラ出血熱）に対する免疫において、細胞外小胞が果たすメカニズム的役割は、以前に評価されている［３９－４１］。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する潜在的な影響を評価した研究はほとんどない。本発明者らの医療ネットワーク（Ｈａｃｋｅｎｓａｃｋ Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｈｅａｌｔｈ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックの米国内の震源地に位置しており、ニュージャージー州のＣｏｖｉｄ－１９患者の半数近くが本発明者らの病院に入院していた。これにより、Ｃｏｖｉｄ－１９患者の血清サンプルを入手することができ、臨床検体に本発明者らの新しい細胞外小胞精製アッセイ法を適用する原理実証試験にそれを使用することができた。

【発明の概要】

【0007】

記載された発明は、エキソソーム及び／または細胞外小胞を精製する方法、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｃａｐｔｕｒｅ ｂｙ ＡｎｉＴｂｏｄｙ ｏｆ ＣＨｏｉｃｅ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｌｅａｓｅ（ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ）アッセイを提供する。カスタマイズ可能な循環細胞外小胞の選択と放出のための、このアッセイの段階的デザインと評価について述べる。ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイと、高感度ｓｍａｌｌ－ＲＮＡ ｃＤＮＡライブラリー調製プロトコール［１４、４２］を組み合わせ、高スループットｓｍａｌｌ－ＲＮＡ配列決定のために、Ｃｏｖｉｄ－１９患者の血清から循環細胞外小胞を精製し、入院患者間で疾患の重症度に関連する発現量の異なるｍｉＲＮＡを同定することにより、その適用性を実証した。さらに、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲで精製され、放出された細胞外小胞の完全性を評価したところ、超遠心機で精製した細胞外小胞を用いて予想外に同定されたＣｏｖｉｄ－１９回復者の血清からの回復期細胞外小胞の中和活性が確認された。

【0008】

一態様によれば、本開示は、被験体からの生物学的サンプルから精製された生物学的粒子の集団を調製する方法、及び前記精製された生物学的粒子の集団のカーゴを評価するための方法であって、ａ）（１）生物学的粒子を含む生物学的サンプルを取得し、（２）１または複数の生物学的粒子表面剤に対する結合剤であって、核酸に結合し、前記核酸が固体担体の表面に固定された前記結合剤と、生物学的粒子を含む前記被験者からの前記生物学的サンプルを接触させることにより、前記精製された生物学的粒子の集団を調製し、ｂ）結合剤によって結合された前記生物学的粒子を前記生物学的サンプルから単離し、ｃ）前記結合剤に結合された前記生物学的粒子を放出し、ｄ）前記結合剤から前記生物学的粒子を溶出し、遊離の精製された生物学的粒子の集団を形成し、ｅ）前記精製された生物学的粒子の集団の、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を含むカーゴ及び表面分子を評価する、前記方法を提供する。

【0009】

いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｅ）カーゴ及び表面分子を評価することは、（ｉ）質量分析によって生物学的粒子の表面に特異的なタンパク質を同定すること、または（ｉｉ）質量分析によってタンパク質カーゴを同定すること、または（ｉｉｉ）配列決定または定量的ＰＣＲによってＤＮＡ分子を同定すること、または（ｉｖ）前記精製された生物学的粒子の集団からＲＮＡを抽出し、精製された生物学的粒子の集団によってカプセル化されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子ノンコーディングＲＮＡの発現を同定及び定量することのうち、１または複数をさらに含んでいる。

【0010】

いくつかの実施形態によれば、この方法は、生物学的粒子の開始時のプールされた不均一集団を提供するための最初の限外濾過または超遠心分離ステップを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、生物学的サンプルは体液を含む。いくつかの実施形態によれば、体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、便、汗、涙、乳頭吸引液、または精液、あるいは分泌された生物学的液体を含む。いくつかの実施形態によれば、体液は循環体液または分泌体液である。いくつかの実施形態によれば、循環体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）またはリンパである。

【0011】

いくつかの実施形態によれば、１または複数の生物学的粒子表面抗原に結合する結合剤は、抗体、抗体結合フラグメントまたはアプタマーである。いくつかの実施形態によれば、アプタマーは核酸またはポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子表面抗原は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、カベオリン－１、サイトケラチン、ＥＰＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、Ｐ６３、異種細胞表面ポリペプチド及び／または生物学的粒子によって受け継がれる他の細胞表面マーカーのうち１または複数を含んでいる。いくつかの実施形態によれば、核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態によれば、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡは、１または複数のリボ核酸ヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、１または複数のリボ核酸ヌクレオチドはウラシルである。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡは制限酵素認識部位を含んでいる。いくつかの実施形態によれば、核酸は非天然型ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、核酸は、核酸の第１末端上の結合部位及び核酸の第２末端上の結合部位をさらに含み、核酸の第１末端上の結合部位及び核酸の第２末端上の結合部位は異なる。いくつかの実施形態によれば、核酸の第１末端上の結合部位は、アビジン、ストレプトアビジンまたはカルボキシル結合部位である。いくつかの実施形態によれば、結合部位はビオチンである。いくつかの実施形態によれば、核酸の第２末端上の結合部位はアミン部分である。いくつかの実施形態によれば、アミン部分はアジドである。いくつかの実施形態によれば、１または複数の生物学的粒子表面抗原に対する結合剤は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）分子、２－ＩＴ（２－イミノチオラン）、ＭＢＳ（３－マレイミド安息香酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル Ｓ－アセチルチオアセテート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態によれば、固体担体はウェルプレート、ポリマー、または表面である。いくつかの実施形態によれば、単離された生物学的粒子を放出することは、（ｉ）核酸を酵素的に分解すること、または（ｉｉ）核酸の第１及び第２の鎖と相補的な核酸と、鎖置換活性を有し担体から抗体を放出する酵素とを用いた鎖置換により、抗体に連結した核酸の第１の鎖を、担体に連結した核酸の第２の鎖から置換すること、または（ｉｉｉ）抗体に結合したＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、抗体に結合したＤＮＡ鎖を損傷することなく、アニールしたＤＮＡ鎖を単離してプラットフォームから抗体を放出すること、を含む。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断はウラシルグリコシラーゼを用いるものである。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断は制限酵素を用いるものである。いくつかの実施形態によれば、鎖置換活性を有する酵素はＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、またはヘリカーゼである。いくつかの実施形態によれば、本方法は、次世代シーケンシングにより、１または複数の生物学的粒子にカプセル化されたｍｉＲＮＡを含む１以上の低分子ノンコーティングＲＮＡを同定することを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、単離された生物学的粒子は、健常な被験体または疾患に罹患している被験体に由来する。いくつかの実施形態によれば、疾患は、ウイルス感染、がん、胎盤形成異常、運動誘発性筋損傷、心不全、アルツハイマー病、肝硬変、ウイルス及び細菌感染、腎疾患、損傷後の骨リモデリング、創傷治癒またはＣＯＰＤ及び喘息を含む。いくつかの実施形態によれば、ウイルス感染は重症コロナウイルス感染である。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因するものである。いくつかの実施形態によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による重症コロナウイルス感染に罹患した被験体由来の、単離され定量されたｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０－５ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－６２９のうちの１以上を含んでいる。いくつかの実施形態によれば、重症ＳＡＲＳＣｏＶ－２疾患のｍｉＲＮＡマーカーは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ１２６－３ｐ、またはその両者を含んでいる。

【0012】

別の態様によれば、本開示は、被験体が重症コロナウイルス感染を発症するリスクをインビトロで評価するための方法、及び重症コロナウイルス感染を処置するための方法であって、ａ．（１）被験体から生物学的粒子を含む生物学的サンプルを取得し、（２）１または複数の生物学的粒子表面剤に対する結合剤であって、核酸に結合し、前記核酸が固体担体の表面に固定された前記結合剤と、生物学的粒子を含む前記被験者からの前記生物学的サンプルを接触させることにより、前記精製された生物学的粒子の集団を調製し、ｂ．結合剤によって結合された前記生物学的粒子を前記生物学的サンプルから単離し、ｃ．前記結合剤に結合された前記生物学的粒子を放出し、ｄ．前記結合剤から前記生物学的粒子を溶出し、遊離の精製された生物学的粒子の集団を形成し、ｅ．（ｉ）前記精製された生物学的粒子の集団からＲＮＡを抽出し、（ｉｉ）エキソソームの精製された集団によってカプセル化された、１または複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子ノンコーディングＲＮＡの発現を同定及び定量し、（ｉｉｉ）（１）コロナウイルス非感染の対照被験体、（２）コロナウイルスに感染し、軽度疾患を発症した対照被験体、及び（３）コロナウイルスに感染し、重度疾患を発症した対照被験体のカーゴプロファイルに前記精製された生物学的粒子のカーゴプロファイルを比較することにより、前記精製された生物学的粒子の集団のカーゴを評価することにより、前記精製された生物学的粒子のカーゴプロファイルを決定し、（ｆ）精製された生物学的粒子の低分子ノンコーディングＲＮＡまたはタンパク質のカーゴプロファイルが、重症疾患を発症したコロナウイルスに感染している対照被験体からのカーゴプロファイルよりも約１．５倍低く、または１．５倍高い場合について、重症ウイルス感染に対する患者のリスクを決定し、（ｇ）重篤なウイルス感染のリスクを有する患者に適切な療法を実施する前記方法が提供される。

【0013】

いくつかの実施形態によれば、この方法は、生物学的粒子の開始時のプールされた不均一な集団を提供するための最初の限外濾過または超遠心分離ステップを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、生物学的サンプルは体液を含む。いくつかの実施形態によれば、体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、便、汗、涙、乳頭吸引液、または精液、あるいは分泌された生物学的液体を含む。いくつかの実施形態によれば、体液は循環体液または分泌体液である。いくつかの実施形態によれば、循環体液は、全血、血清、血漿、ＣＳＦまたはリンパである。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因するものである。いくつかの実施形態によれば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２に感染した患者のｍｉＲＮＡは、対照と比較した場合、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０－５ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－６２９の１または複数を含んでいる。いくつかの実施形態によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による重症疾患のｍｉＲＮＡマーカーは、対照と比較した場合、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ１２６－３ｐ、またはその両者を含んでいる。いくつかの実施形態によれば、１または複数の生物学的粒子表面抗原に対する結合剤は、抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーである。いくつかの実施形態によれば、エキソソーム表面抗原は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、及び／または生物学的粒子によって受け継がれる他の細胞表面マーカーのうちの１または複数を含んでいる。いくつかの実施形態によれば、核酸は、１または複数のリボ核酸ヌクレオチドを含むＤＮＡからなり、リボ核酸ヌクレオチドはウラシルである。いくつかの実施形態によれば、単離された生物学的粒子を放出することは、（ｉ）核酸を酵素的に切断すること、または（ｉｉ）核酸の第１鎖または第２鎖に相補的な核酸と鎖置換活性を有する酵素を用いて鎖置換することにより、支持体に連結された核酸の第２鎖から抗体に連結された核酸の第１鎖を置換し、抗体を支持体から遊離させること、または、（ｉｉｉ）抗体に結合したＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、抗体に結合したＤＮＡ鎖を損傷することなく抗体を支持体から遊離させるために、アニールしたＤＮＡ鎖を分離することを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断はウラシルグリコシラーゼを用いるものである。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断は制限酵素を用いるものである。いくつかの実施形態によれば、鎖置換活性を有する酵素はＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、またはヘリカーゼである。いくつかの実施形態によれば、精製された生物学的粒子の集団によってカプセル化された１または複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子ノンコーディングＲＮＡの同定及び定量は、次世代シーケンシングによって行われる。いくつかの実施形態によれば、重症ウイルス感染のリスクがある患者に対する適切な療法は、支持療法、抗ウイルス剤、免疫調節剤のうち１または複数を含んでいる。いくつかの実施形態によれば、（ａ）支持療法は、輸液の静脈内投与、補助酸素投与、またはネブライザーによる蒸気の吸入からなり、または（ｂ）抗ウイルス剤は、ウイルス侵入を阻害し、ウイルス量を減少させ、またはその両方を阻害し、または（ｃ）抗ウイルス剤は、アシクロビル、ガンシドビル、ホスカルネット、リバビリン、アマンタジン、アジドデオキシチミジン（ジドブジン）、ネビラピン、テトラヒドロイミダゾベンゾジアゼピノン（ＴＩＢＯ）化合物、エファビレンツ、レムデシビル、ロピナビル／リトナビル、ウミフェノビル、ファビピラビル、イベルメクチン、及びデラビルジンから選択され、または（ｄ）免疫調節剤はグルココルチコイド、または組換えインターフェロンであり、または（ｅ）免疫調節剤は、グルココルチコイドであり、グルココルチコイドはコルチコステロイドである。いくつかの実施形態によれば、グルココルチコイドは、プレドニゾン、デキサメタゾン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、またはそれらの組み合わせを含む。

【0014】

別の態様によれば、本開示は、重篤なコロナウイルスまたは他のウイルス感染のリスクを有する患者を治療するための回復期血漿療法の治療効果を増強するための方法であって、ａ）（１）回復期の被験体から、コロナウイルスに対する高いＩｇＧ力価を含む回復期の血清を取得し、（２）１または複数の生物学的粒子表面剤に対する結合剤であって、核酸に結合し、前記核酸が固体担体の表面に固定された前記結合剤と、生物学的粒子を含む前記被験者からの前記生物学的サンプルを接触させることにより、前記精製された生物学的粒子の集団を調製し、ｂ）結合剤によって結合された生物学的粒子を生物学的サンプルから単離し、ｃ）前記結合剤に結合された前記生物学的粒子を放出し、ｄ）前記結合剤から生物学的粒子を溶出し、遊離の精製された生物学的粒子の集団を形成し、ｅ）コロナウイルスに対する精製生物学的粒子の集団の中和力価をインビトロで測定し、ｆ）高力価の中和生物学的粒子及び高力価の中和ＩｇＧを含む回復血清を被験体に投与することを含む前記方法を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態によれば、この方法は、生物学的粒子の開始時のプールされた不均一集団を提供するための最初の限外濾過または超遠心分離ステップを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、生物学的サンプルは体液を含む。いくつかの実施形態によれば、体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、便、汗、涙、乳頭吸引液、または精液、あるいは分泌された生物学的液体を含む。いくつかの実施形態によれば、体液は循環体液である。いくつかの実施形態によれば、循環体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）またはリンパである。

【0016】

いくつかの実施形態によれば、１または複数の生物学的粒子表面抗原に結合する結合剤は、抗体、抗体結合フラグメントまたはアプタマーである。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子表面抗原は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、カベオリン－１、サイトケラチン、ＥＰＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、Ｐ６３、異種細胞表面ポリペプチド及び／または生物学的粒子によって受け継がれる他の細胞表面マーカーのうち１または複数を含む。いくつかの実施形態によれば、核酸はリボ核酸ヌクレオチドを含むＤＮＡを含み、リボ核酸ヌクレオチドはウラシルであるか、または、ＤＮＡは制限酵素認識部位を含んでいる。いくつかの実施形態によれば、単離された生物学的粒子を放出することは、（ｉ）核酸を酵素的に切断すること、または（ｉｉ）核酸の第１鎖または第２鎖に相補的な核酸と鎖置換活性を有する酵素を用いて鎖置換することにより、支持体に連結された核酸の第２鎖から抗体に連結された核酸の第１鎖を置換し、抗体を支持体から遊離させること、または、（ｉｉｉ）抗体に結合したＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、抗体に結合したＤＮＡ鎖を損傷することなく抗体を支持体から遊離させるために、アニールしたＤＮＡ鎖を分離することを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断はウラシルグリコシラーゼを用いるものである。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断は制限酵素を用いるものである。いくつかの実施形態によれば、鎖置換活性を有する酵素はＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、またはヘリカーゼである。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因するものである。いくつかの実施形態によれば、高いＩｇＧ力価を有する回復期血清由来の中和精製生物学的粒子集団は、ＡＣＥ２－レセプターを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する精製された生物学的粒子集団の中和力価を測定することは、インビトロでコロナウイルスに感染した哺乳動物細胞を、高いＩｇＧ力価を有する回復期血清由来の単離された精製生物学的粒子の希釈系列でインキュベートすること、及び陰性対照（回復期血清由来の精製生物学的粒子を含まない感染細胞）と比較してウイルス粒子産生を測定することをさらに含んでいる。いくつかの実施形態によれば、ウイルス粒子産生は、陰性対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少している。いくつかの実施形態によれば、中和精製生物学的粒子を含む回復期血清は、回復期血漿療法単独による治療と比較して、回復期血漿療法の有効性を少なくとも約２倍高める可能性があり、または（ｂ）中和精製生物学的粒子は、免疫系へのウイルス抗原の提示を可能にする。

【0017】

別の態様によれば、本開示は、重篤なコロナウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、ａ）（１）生物学的粒子を含む生物学的サンプルを取得し、（２）１または複数の生物学的粒子表面剤に対する結合剤であって、核酸に結合し、前記核酸が固体担体の表面に固定された前記結合剤と、生物学的粒子を含む前記被験者からの前記生物学的サンプルを接触させ、（３）結合剤によって結合された前記生物学的粒子を前記生物学的サンプルから単離し、（４）前記結合剤（２）に結合された前記生物学的粒子を放出し、（５）前記結合剤から前記生物学的粒子を溶出し、遊離の精製された生物学的粒子の集団を形成し、（６）精製された生物学的粒子の集団の中和力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することにより、被験体の生物学的サンプルから精製された生物学的粒子の集団の中和力価を決定し、ｂ）被験体から精製された精製生物学的粒子の集団の中和力価が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルス粒子産生を減少させるには不十分である場合に、精製された生物学的粒子を中和することを含む回復期血漿療法を被験者に受けさせることを選択し、ｃ）（ｉ）回復期の被験体から、高い抗コロナウイルスＩｇＧ力価を含む回復期の血清を取得し、（ｉｉ）回復期の血清を、１つ以上の生物学的粒子表面抗原に指向性を有する結合剤と接触させ、（ｉｉｉ）結合剤により結合された生物学的粒子を生物学的試料から単離し、（ｉｖ）結合剤に結合された生物学的粒子を放出し、（ｖ）結合された生物学的粒子を結合剤から溶出し、遊離の精製生物学的粒子の集団を形成することにより、回復期の被験体の回復期血漿から精製された生物学的粒子の集団を調製し、ｄ）回復期血清から精製された生物学的粒子集団のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定し、（ｅ）中和精製生物学的粒子単独または中和精製生物学的粒子を含むＩｇＧ力価の高い回復期血清を被験体に投与することを含む前記方法を提供する。

【0018】

いくつかの実施形態によれば、この方法は、生物学的粒子の開始時のプールされた不均一集団を提供するための最初の限外濾過または超遠心分離ステップを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、生物学的サンプルは体液からなる。いくつかの実施形態によれば、体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、便、汗、涙、乳頭吸引液、または精液、あるいは分泌された生物学的液体からなる。いくつかの実施形態によれば、体液は循環体液または分泌体液である。いくつかの実施形態によれば、循環体液は、全血、血清、血漿、ＣＳＦまたはリンパである。

【0019】

いくつかの実施形態によれば、１または複数の生物学的粒子表面抗原に結合する結合剤は、抗体、抗体結合フラグメントまたはアプタマーである。いくつかの実施形態によれば、アプタマーは核酸またはポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子表面抗原は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、カベオリン－１、サイトケラチン、ＥＰＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、Ｐ６３、異種細胞表面ポリペプチド及び／または生物学的粒子によって受け継がれる他の細胞表面マーカーのうち１または複数を含んでいる。いくつかの実施形態によれば、単離された生物学的粒子を放出することは、（ｉ）核酸を酵素的に切断すること、または（ｉｉ）核酸の第１鎖または第２鎖に相補的な核酸と鎖置換活性を有する酵素を用いて鎖置換することにより、支持体に連結された核酸の第２鎖から抗体に連結された核酸の第１鎖を置換し、抗体を支持体から遊離させること、または、（ｉｉｉ）抗体に結合したＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、抗体に結合したＤＮＡ鎖を損傷することなく抗体を支持体から遊離させるために、アニールしたＤＮＡ鎖を分離することを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、核酸は、１または複数のリボ核酸ヌクレオチドを含むＤＮＡからなり、リボ核酸ヌクレオチドはウラシル、制限部位配列またはＲＮＡとＤＮＡ分子の二重鎖であり、酵素的切断はウラシル糖転移酵素、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅによって行われる。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断は制限酵素を用いるものである。いくつかの実施形態によれば、鎖置換活性を有する酵素はＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、またはヘリカーゼである。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因するものである。

【0020】

いくつかの実施形態によれば、コロナウイルスに対する、（ｉ）被験体から精製された生物学的粒子集団の中和力価、及び（ｉｉ）高いＩｇＧ力価を有する回復期血清由来の精製された生物学的粒子集団の中和力価を測定することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでコロナウイルスに感染した哺乳動物細胞を、（ｉ）被験体由来の単離精製された生物学的粒子、及び（ｉｉ）高ＩｇＧ力価を有する回復期血清由来の単離された精製生物学的粒子の希釈系列でインキュベートし、陰性対照（感染細胞単独）と比較したウイルス粒子産生を比較することを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、精製された生物学的粒子の中和集団は、ＡＣＥ２－レセプターを含んでいる。

【0021】

別の態様によれば、本開示は、被験体からの生物学的試料から精製細胞の集団を調製する方法であって、以下を含む前記方法を提供する。

【0022】

ａ）以下により、精製された細胞集団を調製し、

【0023】

（１）細胞を含む被験体から才物学的サンプルを取得し、

【0024】

（２）１または複数の細胞表面抗原に対する結合剤であって、核酸に結合し、前記核酸が固体担体の表面に固定された前記結合剤と、生物学的粒子を含む前記被験者からの前記生物学的サンプルを接触させる。

【0025】

ｂ）結合剤によって結合された前記細胞を前記生物学的サンプルから単離し、

【0026】

ｃ）前記結合剤に結合された前記細胞を放出し、

【0027】

ｄ）前記結合剤から結合された細胞を溶出し、精製された細胞集団を形成する。

【0028】

いくつかの実施形態によれば、この方法は、細胞の開始時のプールされた不均一な集団を提供するための最初の限外濾過または超遠心分離ステップを含んでいる。

【0029】

いくつかの実施形態によれば、生物学的サンプルはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで調製される。

【0030】

いくつかの実施形態によれば、生物学的サンプルは体液を含む。いくつかの実施形態によれば、体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、便、汗、涙、乳頭吸引液、または精液、あるいは分泌された生物学的液体を含む。いくつかの実施形態によれば、体液は循環体液または分泌体液である。いくつかの実施形態によれば、循環体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）またはリンパである。

【0031】

いくつかの実施形態によれば、１または複数の細胞表面抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ４６、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１３８、ＣＤ１５１、ＡＬｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、カベオリン－１、サイトケラチン、ＥＰＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、Ｐ６３、異種細胞表面ポリペプチドを含む。

【0032】

いくつかの実施形態によれば、異種細胞表面ポリペプチドはキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）によって発現されるものである。

【0033】

いくつかの実施形態によれば、１つ以上の細胞表面抗原に結合する結合剤は、抗体、抗体結合フラグメントまたはアプタマーである。いくつかの実施形態によれば、アプタマーは核酸またはポリペプチドである。

【0034】

いくつかの実施形態によれば、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態によれば、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡは、１または複数のリボ核酸ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、１または複数のリボ核酸ヌクレオチドは、ウラシルである。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡは、制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態によれば、核酸は、エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅ（ＲＮａｓｅ－Ｈ）によって分解可能なＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖である。いくつかの実施形態によれば、核酸は非天然ヌクレオチドを含む。

【0035】

いくつかの実施形態によれば、核酸は、核酸の第１末端上の結合部位及び核酸の第２末端上の結合部位をさらに含み、核酸の第1末端上の結合部位及び核酸の第２末端上の結合部位は異なる。

【0036】

いくつかの実施形態によれば、核酸の第１末端上の結合部位は、アビジン、ストレプトアビジンまたはカルボキシル結合部位である。いくつかの実施形態によれば、結合部位はビオチンである。いくつかの実施形態によれば、核酸の第２末端上の結合部位はアミン部分である。いくつかの実施形態によれば、アミン部分はアジドである。

【0037】

いくつかの実施形態によれば、１または複数の細胞表面抗原に対する結合剤は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）分子、２－ＩＴ（２－イミノチオラン）、ＭＢＳ（３－マレイミド安息香酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル Ｓ－アセチルチオアセテート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ、またはそれらの誘導体を含む。

【0038】

いくつかの実施形態によれば、固体担体はウェルプレート、ポリマー、または表面である。

【0039】

いくつかの実施形態によれば、単離された細胞を放出することは、

【0040】

（ｉ）核酸を酵素的に切断すること、または

【0041】

（ｉｉ）核酸の第１鎖または第２鎖に相補的な核酸と鎖置換活性を有する酵素を用いて鎖置換することにより、支持体に連結された核酸の第２鎖から抗体に連結された核酸の第１鎖を置換し、抗体を支持体から遊離させること、または、

【0042】

（ｉｉｉ）抗体に結合したＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、抗体に結合したＤＮＡ鎖を損傷することなく抗体を支持体から遊離させるために、アニールしたＤＮＡ鎖を分離することを含んでいる。

【0043】

いくつかの実施形態によれば、酵素的切断はウラシルグリコシラーゼを用いるものである。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断は制限酵素を用いるものである。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断はエンドヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅを用いるものである。いくつかの実施形態によれば、鎖置換活性を有する酵素はＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、またはヘリカーゼである。

【0044】

いくつかの実施形態によれば、細胞の集団は、非真核生物種及び真核生物種、または健康な正常組織又は疾患組織、またはマウス同所性／異種移植／ＰＤＸ臓器、または血液、または組織培養物に由来する。

【0045】

いくつかの実施形態によれば、真核細胞はヒト、マウス、ラット、イヌ、非ヒト霊長類、またはネコである。

【0046】

いくつかの実施形態によれば、精製された細胞の集団は、健常な被験体又は疾患に罹患している被験体に由来する。いくつかの実施形態によれば、疾患は、がん、ウイルス感染、胎盤異常、炎症及び他の病態からなる。

【0047】

いくつかの実施形態によれば、細胞は内皮細胞、上皮細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、神経細胞、腫瘍細胞、血液細胞、または心臓細胞である。

【0048】

いくつかの実施形態によれば、細胞集団は、（ａ）非真核生物種及び真核生物種、または（ｂ）健常正常組織または疾患組織、または（ｃ）マウス同所性／異種移植／ＰＤＸ臓器、または（ｄ）血液、または（ｅ）組織培養に由来する。

【0049】

いくつかの実施形態によれば、ウイルス感染は重症コロナウイルス感染である。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】ｓｍａｌｌ－ＲＮＡシークエンシングとｍｉＲＮＡバイオマーカーの同定に先立ち、循環細胞外小胞を特異的に免疫捕捉及び放出するための、カスタマイズ可能な低バックグラウンド、高親和性アッセイである、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｃａｐｔｕｒｅ ｂｙ ＡｎＴｉｂｏｄｙ ｏｆ ＣＨｏｉｃｅ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｌｅａｓｅ）の概略図である。

【図2】Ａは、生物流体から細胞外小胞を精製するために設計されたＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイの概略図であり、分解可能なｄｓＤＮＡ－リンカー（ウラシル化５’－アジドオリゴヌクレオチドと相補的なウラシル化３’－ビオチンオリゴヌクレオチドとのアニーリング）とＤＢＣＯ活性化抗体及びストレプトアビジンコートプラットフォームとの結合に依存している。Ｂは、一本鎖オリゴヌクレオチド及び二本鎖（ｄｓ）ハイブリダイズＤＮＡリンカーのアクリルアミドゲル移動を示す。一本鎖（ｓｓ）ビオチン標識ＤＮＡ（レーン２）、ｓｓＤＮＡアジド（レーン３）、ｄｓＤＮＡリンカー（レーン４）、ＵＮＧ消化ｄｓＤＮＡリンカー（レーン５）を１５％非変性ＰＡＧＥゲル上で分離した。Ｃは、モノクローナルヒト抗ＣＤ６３抗体（Ａｂ）の活性化とｄｓＤＮＡ－リンカー結合を示す。プロテインラダー（レーンａ）、１μｇネイティブ抗ＣＤ６３ Ａｂ（レーンｂ）、１μｇＤＢＣＯ活性化抗ＣＤ６３抗体に結合したｄｓＤＮＡ－リンカー（ｄｓＤＮＡ－リンカーの量を増加させて使用）（レーンｃ－ｅ）、ＵＮＧで消化したｄｓＤＮＡ－リンカー－Ａｂ（５００ｎｇ－１μｇ）（レーンｆ）の移動を伴うクマシー染色非変性ＰＡＧＥゲル（１２％）の代表画像。実験は繰り返し行い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰイメージャーで画像化した。配列番号１及び２をそれぞれ、出現順に開示する。

【図3A】ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズとウェルへの非特異的低分子ＲＮＡ結合を評価するアッセイ法を示す。サンプル収集の実験手順の概略図（上）。１ｎｇのａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａ ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む１ｘＰＢＳ溶液をウェルまたはビーズとインキュベートし、洗浄液＃１、洗浄液＃２、洗浄液＃３、最終溶出を含む４つの異なるサンプルを集めた。左の２つのグラフは、コントロールのａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａ ＲＮＡ（１ｎｇ；黒色のバー）、洗浄液＃１、＃２、＃３（灰色のバー）、及び最終溶出液（白色のバー）を用いて、ウェル（左上のグラフ）及びビーズ（左下のグラフ）、ＲＮａｓｅ－Ａ処理なしで得られたＲＴ－ｑＰＣＲ定量を示す。右の２つのグラフは、ウェルとビーズを最初にＲＮａｓｅ－Ａで処理し、同じ方法で採取したサンプルを用いて得られたＲＴ－ｑＰＣＲ定量値を示す。

【図3B】ＭＣＦ－７の細胞外小胞非特異的結合を評価するアッセイを示す図である。実験的収集手順を概略図（上）に示す。２つのグラフは、全細胞外小胞コントロール（１０μｇ、黒色バー）、細胞外小胞＋ＲＮａｓｅ－Ａ（濃い灰色のバー）から抽出した全ＲＮＡを用いたｈｓａ－ｍｉＲ－２１（左）及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ（右）のＲＴ－ｑＰＣＲ定量を表す、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（磁気ビーズ）インキュベーション及び除去後の細胞外小胞＋ＲＮａｓｅ－Ａ（薄い灰色のバー）、ウェルとのインキュベーション及び除去後の細胞外小胞＋ＲＮａｓｅ－Ａ（白色のバー）。すべてのｑＰＣＲ実験は各サンプルについて３回実行された。データはテクニカルレプリケート（ａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａと１０μｇＭＣＦ－７コントロールの減算処理）で、ΔΔＣｔとして表される。

【図4A】抗Ａｌｉｘ抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ９抗体、及び抗ＣＤ８１抗体を用いた、ウェスタンブロットによる細胞外小胞表面マーカーの評価を示す。精製前の総タンパク質インプットを減少させた、ＭＣＦ－７組織培養培地由来のＣＤ６３⁺細胞外小胞のＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ精製。左と中央のウェスタンブロットでは、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ精製前に３μｇ（レーン１）、２．７５μｇ（レーン２）、２．５μｇ（レーン３）、２．２５μｇ（レーン４）、２μｇ（レーン５）、１．７５μｇ（レーン６）、１．５μｇ（レーン７）の総タンパク質を使用した。

【図4B】抗Ａｌｉｘ抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ９抗体、及び抗ＣＤ８１抗体を用いた、ウェスタンブロットによる細胞外小胞表面マーカーの評価を示す。精製前の総タンパク質インプットを減少させた、ヒト血漿由来のＣＤ６３⁺細胞外小胞のＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ精製。左と中央のウェスタンブロットでは、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ精製前に３μｇ（レーン１）、２．７５μｇ（レーン２）、２．５μｇ（レーン３）、２．２５μｇ（レーン４）、２μｇ（レーン５）、１．７５μｇ（レーン６）、１．５μｇ（レーン７）の総タンパク質を使用した。

【図4C】抗Ａｌｉｘ抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ９抗体、及び抗ＣＤ８１抗体を用いた、ウェスタンブロットによる細胞外小胞表面マーカーの評価を示す。ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲは、血清サンプル由来のＣＤ６３⁺細胞外小胞精製にも使用され、４つの異なる表面タンパク質抗体によって検証された。

【図4D】ＭＣＦ－７細胞外小胞ストック（左、ＭＣＦ－７ストック）及びＭＣＦ－７細胞外小胞ストック（ＭＣＦ－７）、ヒト血漿（Ｐｌａｓｍａ）及びヒト血清（Ｓｅｒｕｍ）から精製したＣＤ６３細胞外小胞の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。ＴＥＭ像の直接倍率は２０，０００倍、スケールバーは２００ｎｍである。

【図4E】ＭＣＦ－７細胞培養培地（左のグラフ）、ヒト血漿（中央のグラフ）、ヒト血清（右のグラフ）から精製したＣＤ６３細胞外小胞について、ナノ粒子追跡（ＴＳ４００マイクロ流体カートリッジを装備したＳｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ ｎＣＳ１）によって特徴付けられた代表的な粒度分布を示す。直径＜６５ｎｍ及び通過時間＞８０μｓに対してピークフィルタリングを行った。６５～１５０ｎｍで検出された粒子の濃度を表す。

【図5A】ヒト血清中で上位に発現された循環ｍｉＲＮＡの次世代シーケンシング及びヒートマップ表示を示す。ヒートマップには、発現した上位４９個のｍｉＲＮＡと、ヒト血清から抽出した総ＲＮＡの量を減少させた場合（６ｎｇ、３ｎｇ、及び１．５ｎｇ、二度繰り返し）におけるそれらの検出可能性が含まれる。

【図5B】マウスＲＡＷＳ２６４．７細胞外小胞から抽出した全ＲＮＡ（最初の２列）、市販の全ヒト血漿（３列目と４列目）、及び市販の同一の全ヒト血漿から超遠心分離により取得した細胞外小胞（５列目と６列目）の間のｍｉＲＮＡ発現の違いを表示したヒートマップ表示である。新しい（Ｒｅｐｅａｔｓ＃１）３’バーコードアダプター及び古い（Ｒｅｐｅａｔｓ＃２）３’バーコードアダプターを用いて、重複ライブラリーを得た。

【図5C】ヒト血漿にスパイクされたマウス細胞外小胞のＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ特異的捕捉を示す。ヒートマップは、マウスＲＡＷＳ２６４．７細胞外小胞とヒト血漿の間のｍｉＲＮＡ発現の違いを表しており、ヒト血漿とマウスＲＡＷＳ２６４．７細胞外小胞の間で差次的に発現したｍｉＲＮＡのトップ５８（カラム１及び２）及びマウス特異的転写物のトップ５０（カラム５及び６）を含む。ヒト血漿（１００μｌ）中にスパイクしたマウスＲＡＷＳ細胞外小胞（１μｇ）を、マウス特異的抗ＣＤ６３抗体を保有するＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを用いて血漿から精製した（カラム２及び３）。新しい（Ｒｅｐｅａｔｓ＃１）３’バーコードアダプター及び古い（Ｒｅｐｅａｔｓ＃２）３’バーコードアダプターを用いて重複ライブラリーを得た。データはＲプラットフォームの専用Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使って解析し、ヒートマップは‘ＮＭＦ’パッケージ（ヒートマップ関数）を用いて作成した。

【図6A】ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲにより精製された細胞外小胞から同定された１０種類の発現差のあるｍｉＲＮＡ（緑色の四角、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５、および ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ）及び軽症および重症のＣｏｖｉｄ－１９入院患者の全血清から同定された２種類の発現量に差があるｍｉＲＮＡ（オレンジ色の四角、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２９＊）による、次世代低分子ＲＮＡシーケンスによる個々のボックスプロット解析を示す。血清から精製された細胞外小胞は、抗ＣＤ６３、抗ＣＤ９、抗ＣＤ８１抗体の組み合わせを使用するＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲにより取得された。

【図6B】軽症のＣｏｖｉｄ－１９入院患者（ｎ＝１３）及び重症のＣｏｖｉｄ－１９入院患者（ｎ＝１７）の血清エキソソーム及び／または細胞外小胞から同定された発現量の異なる上位１０個のｍｉＲＮＡを、全ｍｉＲＮＡリードと比較してボックスプロットしたｍｉＲＮＡリード表示を示す。

【図6C】軽症患者及び重症患者から精製したエキソソーム及び／または細胞外小胞から抽出したＲＮＡを用いて調製した２つの低分子ＲＮＡライブラリー間の、ｍｉＲＮＡ統合シグネチャー（血清エキソソーム及び／または細胞外小胞で同定された上位１０個のｍｉＲＮＡを含む）のボックスプロット表示を示す（ライブラリー＃３は軽症７例、重症８例を含み、ライブラリー＃４は軽症６例、重症９例を含む）。

【図6D】ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲで精製した細胞外小胞から抽出したＲＮＡと、軽症患者と重症患者の全血清から抽出したＲＮＡの間の統合的ｍｉＲＮＡシグネチャー（１０個のｍｉＲＮＡ）のボックスプロット表示を示す。

【図6E】ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲで精製した細胞外小胞から抽出したＲＮＡを用いて、小分子ＲＮＡ配列決定によって軽症と重症のＣｏｖｉｄ－１９入院患者間で同定された発現量の異なる上位４つのｍｉＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ検証結果をボックスプロットで示したものである。データはΔΔＣｔとして表され、各サンプルについてテクニカルトリプリケートが行われた。発現の差は、シーケンシングの結果についてはＤＥＳｅｑ２（Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ）を用いて、ｍｉＲＮＡスコアとｑＰＣＲの結果についてはｔ検定を用いて評価した。

【図7A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を抗原とする免疫グロブリン（ＩｇＧ）の存在について定量した６つの回復期血清サンプルを示す。３つの高ＩｇＧ力価血清サンプル（左）及び３つのＩｇＧ力価が定量レベル以下（ＢＬＱ）の血清サンプルをＥＬＩＳＡで定量した。高ＩｇＧ力価は１０，０００倍希釈で残存する活性で推定され、ＢＬＱ ＩｇＧ血清サンプルはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク蛋白に対する検出可能なＩｇＧを含まなかった。

【図7B】高ＩｇＧ（レーン１－３）及びＢＬＱ ＩｇＧ（レーン４－６）血清サンプルからＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを用いて、抗Ａｌｉｘ抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ８１抗体（Ａｂｃａｍ）を用いたＣＤ６３精製細胞外小胞のウェスタンブロット分析である。

【図7C】ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを用いて回復期血清から単離した高ＩｇＧ（ＣＤＩ－００１、図７Ｂ－レーン１）及びＢＬＱ ＩｇＧ（ＣＤＩ－００４、図７Ｂ－レーン６）の代表的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。直接倍率は２０，０００倍、スケールバーは２００ｎｍである。

【図7D】６名のドナーのＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲにより精製された細胞外小胞を用い、ＴＳ４００マイクロ流体カートリッジを備えたＳｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ ｎＣＳ１装置を用いて評価されたナノ粒子サイズ分布を示す。

【図7E】超遠心分離によって高純度の回復期血清細胞外小胞を得るために用いた実験手順の概略図である。

【図7F】全血清または精製細胞外小胞で処理したＶｅｒｏ Ｅ６細胞を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価を示す。健康なＶｅｒｏ Ｅ６細胞コントロール（バー１、ウイルスなし）に、ｍＮＧ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（バー２、ウイルス）、高ＩｇＧ（バー３）及びＢＬＱ ＩｇＧ（バー４）を用いた超遠心分離細胞外小胞（細胞外小胞コントロール）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と高ＩｇＧ全血清（バー５、７及び９）またはＢＬＱ ＩｇＧ全血清（バー１１、１３及び１５）、ｍＮＧ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と高ＩｇＧ血清のＣＤ６３⁺細胞外小胞（バー６、８及び１０）またはＢＬＱ ＩｇＧ血清のＣＤ６３＋細胞外小胞（バー１２、１４及び１６）、ＵＮＧ消化バッファー（バー１７）及びＵＮＧ消化バッファーとｍＮＧ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（バー１８）を７２時間反応させた。統計解析は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用い、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ ｈｏｃ補正を行った。すべての結果は平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示され、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１ ｖｓ ウイルスである。

【図7G】ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２レポーターウイルスを感染させたＶｅｒｏ Ｅ６細胞の蛍光イメージングを示す。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２とｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎは、蛍光Ｃｅｌｉｇｏ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇを用いて可視化した。代表的な蛍光画像は、健康なＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ウイルスなしのコントロール）、ｍＮＧ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と高ＩｇＧ全血清（高ＩｇＧ血清）、ｍＮＧ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と高ＩｇＧ血清から精製したＣＤ６３＋細胞外小胞（細胞外小胞（高ＩｇＧ血清）、患者番号ＣＤＩ－００１）、ｍＮＧ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ウイルスコントロール）、ＢＬＱ ＩｇＧ全血清を用いたｍＮＧ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢＬＱ ＩｇＧ血清、患者番号ＣＤＩ－００４）、ＢＬＱ血清から精製したＣＤ６３＋細胞外小胞を用いたｍＮＧ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（細胞外小胞（ＢＬＱ血清））。画像のスケールバーは５００μＭであった。

【図8】ｓｍａｌｌ－ＲＮＡ次世代シーケンシングによって同定された、ヒト血清中の発現循環ｓｍａｌｌ－ＲＮＡ上位１１７個のヒートマップ表現である（カラム１及び２）。低分子ＲＮＡシーケンシングは、全血清中でインキュベートしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）磁気ビーズ（カラム３及び４）、全血清中でインキュベートしＵＮＧで処理した磁気ビーズ（カラム５及び６）、全血清中でインキュベートしたＣＤ６３抗体と共有結合させた磁気ビーズ（カラム７及び８）、超遠心分離で得た細胞外小胞（カラム９及び１０）から抽出したＲＮＡに対して行った。実験はすべて二度繰り返した。

【図9】ＡとＢは、総タンパク質及びＡＣＥ－２を示すように染色した、ＣＯＶＩＤ－１９回復期血清（左、高ＩｇＧ力価回復期血清、ＲＢＤ ＩｇＧ＞１０，０００；右、ＢＬＱ回復期血清）からのエキソソーム抽出物のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。Ｂは、回復期血清（（左、高ＩｇＧ力価回復期血清、ＲＢＤ ＩｇＧ＞１０，０００；右、ＢＬＱ回復期血清）の総タンパク質に対して正規化されたＡＣＥ－２タンパク質発現量のグラフであり、高ＩｇＧ力価の個体からの回復期血漿におけるＡＣＥ－２の有意な増加を示している。

【発明を実施するための形態】

【0051】

定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、複数の参照を含む。従って、例えば、「ペプチド」への言及は、当業者に公知の１つ以上のペプチド及びその等価物などへの言及である。

【0052】

急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、非心原性肺水腫、肺炎、低酸素血症、肺コンプライアンスの低下を特徴とする。ＡＲＤＳの発症機序はいまだ解明されておらず、ゴールドスタンダードとなる診断テストは存在しない。ＡＲＤＳのＢｅｒｌｉｎ定義（Ｒａｎｉｅｒｉ，ＶＭ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．（２０１２）３０７（２３）：２５２６－３３）は、以下に示す基準と定義を提示している。

【0053】

【表1】

【0054】

本明細書で使用される「アンジオテンシン変換酵素２」または「ＡＣＥ２」という用語は、１型膜内在性糖タンパク質［Ｔｉｐｎｉｓ，ＳＲ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５（４３）：３３２３８－４３を引用するＴｉｋｅｌｌｉｌｓ，Ｃ． ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ ＭＣ．Ｉｎｔｌ Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２０１２）２５６２９４］であり、レニン－アンジオテンシン系（ＲＡＳ）の構成因子である殆どの組織において発現し、活性であり、体内の水分量を調節することにより血圧をコントロールする。ＡＣＥ２の発現が最も高いのは、腎臓、内皮、肺、心臓である［Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．（２０００）８７（５）：Ｅ１－Ｅ９、Ｔｉｐｎｉｓ，ＳＲ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５（４３）：３３２３８－４３を引用する上記文献］。

【0055】

本明細書で使用される「投与する」という用語は、治療薬と組み合わせて使用される場合、治療薬を標的器官、組織または細胞に直接投与または適用すること、または治療薬を被験体に投与することを意味し、それによって治療薬は、それが標的とされる器官、組織、細胞または被験体に正の影響を与える。したがって、本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、例えばエキソソーム及び／または細胞外小胞を含む組成物とともに使用される場合、組成物を標的臓器、組織または細胞内または細胞上に提供すること；または治療薬が標的臓器、組織または細胞に到達するように組成物を患者に提供することを含み得るが、これらに限定されない。「投与」は、非経口的に、例えば、静脈内投与もしくは注入技術、吸入もしくは気腹によって、または他の既知の技術と組み合わせたこのような方法によって達成され得る。

【0056】

本明細書で使用される「Ａｌｉｘ」という用語は、輸送に必要なエンドソームソーティング複合体（ＥＳＣＲＴ）の付属タンパク質を指す。Ａｌｉｘが細胞外小胞（ＥＶ）生合成中のｍｉＲＮＡのパッケージングに関与することを示す証拠がある［Ｉａｖｅｌｌｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２０１６）３７（４）：９５８－６６］。

【0057】

本明細書で使用される「アンジオテンシン変換酵素２レセプター」または「ＡＣＥ２レセプター」という用語は、ＳＡＲＳＣｏＶ－２が広範なヒト細胞に感染するための入口となるタンパク質を指す。

【0058】

本明細書で使用される「動物」、「患者」、及び「被験体」という用語には、ヒト、ならびに野生動物、家畜動物、及び農場動物などのヒト以外の脊椎動物が含まれるが、これらに限定されない。「動物」、「患者」、及び「被験体」という用語は、ヒトを含むがこれらに限定されない哺乳類を指す場合がある。

【0059】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原の抗原決定基の特徴と相補的な内部表面形状及び電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折り畳みから形成される、少なくとも１つの結合ドメインからなるポリペプチドまたはポリペプチド群を指す。

【0060】

全抗体分子の基本的な構造単位は、４本のポリペプチド鎖からなり、２本の同一の軽鎖（Ｌ鎖）（それぞれ約２２０個のアミノ酸を含む）と２本の同一の重鎖（Ｈ鎖）（それぞれ通常約４４０個のアミノ酸を含む）である。２本の重鎖と２本の軽鎖は、非共有結合と共有結合（ジスルフィド結合）の組み合わせによって結合している。分子は２つの同じ部分からなり、それぞれが軽鎖のＮ末端領域と重鎖のＮ末端領域からなる同一の抗原結合部位を持つ。通常、軽鎖と重鎖の両方が協力して抗原結合面を形成する。ヒト抗体はκとλの２種類の軽鎖を示すが、免疫グロブリンの個々の分子は通常どちらか一方のみである。

【0061】

抗体は、オリゴクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、触媒抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、可溶性または結合形態で標識可能な抗体、ならびにそれらのフラグメント、バリアント、誘導体であり、単独でまたは公知の技術によって提供される他のアミノ酸配列と組み合わせて使用することができる。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、免疫したドナーのマウス脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株と融合させ、選択培地で増殖する確立されたマウスハイブリドーマクローンを得ることにより作製することができる。ハイブリドーマ細胞は、抗体を分泌するＢ細胞と骨髄腫細胞とのｉｎ ｖｉｔｒｏ融合によって生じる不死化ハイブリッド細胞である。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫とは、培養中の抗原特異的Ｂ細胞を一次的に活性化することを指し、マウスモノクローナル抗体を産生するもう一つの確立された手段である。末梢血リンパ球からの免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（Ｖκ及びＶλ）可変遺伝子の多様なライブラリーも、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって増幅することができる。重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがポリペプチドスペーサーで連結された単一ポリペプチド鎖（単一鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ）をコードする遺伝子は、ＰＣＲを用いて重鎖Ｖ遺伝子と軽鎖Ｖ遺伝子をランダムに結合させることで作製できる。その後、コンビナトリアルライブラリーをクローニングし、ファージ先端のマイナーコートタンパク質と融合させることにより、糸状バクテリオファージの表面に発現させることができる。誘導選択法は、ヒト免疫グロブリンＶ遺伝子とネズミ免疫グロブリンＶ遺伝子のシャッフリングに基づいている。この方法は、（ｉ）ヒトλ軽鎖のレパートリーを、目的の抗原と反応するマウスモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインとシャッフルし、（ｉｉ）その抗原でハーフヒトＦａｂを選択し、（ｉｉｉ）選択されたλ軽鎖遺伝子を、ヒト重鎖のライブラリーの「ドッキングドメイン」として２回目のシャッフルで使用し、ヒト軽鎖遺伝子を持つクローンＦａｂ断片を単離する、（ｖ）遺伝子を含む哺乳動物細胞発現ベクターでマウス骨髄腫細胞をエレクトロポレーションによりトランスフェクトし；そして（ｖｉ）抗原と反応性のＦａｂのＶ遺伝子を完全なＩｇＧ１、λ抗体分子としてマウス骨髄腫で発現させる。抗体はいかなる生物種由来であってもよい。抗体という用語には、本発明の抗体の結合フラグメントも含まれる。フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）が挙げられる。構造的ドメイン及び機能的ドメインは、ヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列データを公開配列データベースまたは専有配列データベースと比較することにより同定することができる。例えば、構造及び／または機能が既知の他のタンパク質において生じる配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンフォメーションドメインを同定するために、コンピュータによる比較方法を使用することができる。既知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は知られている。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１）を参照。

【0062】

本明細書において使用される「抗原」という用語は、免疫反応を引き起こす任意の物質を指す。

【0063】

本明細書において使用される「抗原結合部位」という用語は、抗体の各アームの先端にあり、抗原と物理的に接触し、非共有結合的に結合する部位を指す。抗原結合部位の抗原特異性は、その形状と存在するアミノ酸によって決定される。

【0064】

本明細書において使用される「抗原決定基」または「エピトープ」という用語は、所与の抗体または抗原レセプターの抗原結合部位に接触する抗原分子の部分を指す。

【0065】

本明細書において使用される「アプタマー」という用語は、高い親和性と特異性で標的分子に非共有的に結合できる三次元形状に折り畳まれた一本鎖合成オリゴヌクレオチドを指す。一次配列よりもむしろ、アプタマーの結合はその三次構造によって決定される。ターゲットの認識と結合には、疎水性相互作用、塩基のスタッキング、インターカレーションと同様に、３次元的な形状依存的な相互作用が関与する。

【0066】

本明細書において使用される「結合」という用語及びその他の文法形式は、化学物質間の持続的な引力を意味する。結合特異性には、特定のパートナーに結合することと、他の分子に結合しないことの両方が含まれる。機能的に重要な結合は、低親和性から高親和性までの範囲で起こる可能性があり、設計要素は望ましくない相互作用を抑制する可能性がある。翻訳後修飾もまた、相互作用の化学的性質や構造を変化させることがある。「プロミスキャス結合」には、構造的可塑性の程度が関与している可能性があり、その結果、異なる残基のサブセットが異なるパートナーとの結合に重要になるのかもしれない。「相対的結合特異性」とは、生化学的システムにおいて、分子がその標的やパートナーと異なる相互作用をすることで、個々の標的やパートナーの同一性に応じて、それらに異なる影響を付与する特性である。

【0067】

本明細書において使用される「結合剤」という用語は、化学物質または抗原などの他の物質に結合できる物質を指す。

【0068】

本明細書において使用される「生分解性」及び「生物学的分解性」という用語は、可溶性種に浸食され、または生理学的条件下で、それ自体、被験体に対して非毒性（生体適合性）であり、被験体によって代謝、除去、または排泄されることが可能な、より小さい単位または化学種に分解される材料を指す。

【0069】

本明細書において使用される「生物学的粒子」という用語は、生物に由来する微細な部分、断片、または量（粒子）を指す。生物学的粒子には、限定されないが、エキソソーム、細胞外小胞、ウイルス粒子、細菌粒子、または表面膜からなる他の分泌粒子が含まれる。

【0070】

本明細書において使用される「バイオマーカー」（または「バイオシグネチャー」）という用語は、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、遺伝子、代謝産物、または生物学的状態の指標として使用されるその他の物質を指す。それは、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、または治療的介入に対する薬理学的反応の細胞または分子指標として客観的に測定され、評価される特性である。本明細書において使用される「指標」という用語は、時間の関数として相対的な変化を明らかにする可能性のある、一連の観察事実から導き出されるあらゆる物質、数、または比率、あるいは、目視可能な、またはその存在もしくは存在の証拠となるシグナル、徴候、印、メモ、または症状を指す。提案されたバイオマーカーが有効であることが確認されると、そのバイオマーカーは、疾病リスク、個体における疾病の存在の診断、または個体における疾病の治療法の調整（例えば、薬物治療または投与レジメンの選択）に使用することができる。

【0071】

本明細書において使用される「カーゴ」という用語は、積荷または運搬されるものを指す。エキソソーム及び／または細胞外小胞に関して、カーゴという用語は、エキソソーム及び／または細胞外小胞に封入された物質を指す。化合物または物質は、例えば、核酸（例えば、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ポリペプチド、脂質、タンパク質、または代謝産物、あるいはエキソソーム及び／または細胞外小胞に内包され得る他の物質であってもよい。エキソソーム及び／または細胞外小胞に関して、本明細書において使用される「カーゴプロファイル」という用語は、エキソソーム及び／または細胞外小胞の集団を特徴付けるカーゴ成分（例えば、核酸（例えば、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ポリペプチド、脂質、タンパク質、または代謝産物）の存在量の測定を指す。

【0072】

本明細書において使用される「ＣＤ９」という用語は、結晶構造が逆円錐状の分子形状を示すテトラスパニンタンパク質ファミリーのメンバーであり、結晶脂質層に膜湾曲を生じさせる。（Ｕｍｅｄａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃ．（２０２０）１１：ａｒｔｉｃｌｅ １６０６）。

【0073】

本明細書において使用される「ＣＤ３７」という用語は、免疫細胞にのみ発現するテトラスパニンタンパク質ファミリーのメンバーを指す。（Ｚｕｉｄｓｃｈｅｒｗｏｕｄｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１５）５：１２２０１）。

【0074】

本明細書において使用される「ＣＤ６３」という用語は、テトラスパニンタンパク質ファミリーのメンバーを指し、そのＣ末端ドメインはアダプタータンパク質（ＡＰ）複合体のいくつかのサブユニットと相互作用し、このテトラスパニンの輸送をクラスリン依存性経路に連結する（Ｒｏｕｓ，ＢＡ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（２００２）１３（３）：１０７１－８２を引用するＡｎｄｒｅｕ，Ｚ．＆ Ｙａｎｅｚ－Ｍｏ，Ｍ．）。細胞内相互作用タンパク質の中で、ＣＤ６３は二重ＰＤＺドメイン含有タンパク質であるシンテニン－１に直接結合することが示された（同上、Ｌａｔｙｓｈｅｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００６）２６（２０）：７７０７－１８を引用している）。シンテニン－１については、エキソソーム生合成における主要な役割が報告されている（同上、Ｂａｉｅｔｔｉ，ＭＦ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２０１２）１４（７）：６７７－８５）。

【0075】

本明細書で使用する「ＣＤ８１」という用語は、４つの膜貫通（ＴＭ）らせんが逆ティピー状に配置された結晶構造を示すテトラスパニンタンパク質ファミリーのメンバーを指し、このタンパク質は膜内領域に中央ポケットを形成し、中央空洞でコレステロールと結合すると思われる。（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１６）１６７：１０４１－５１）。発生過程において、ＣＤ８１は、リンパ球Ｂ細胞の必須共刺激分子であり、ＣＤ８１のパートナーとしてよく知られているＣＤ１９の分泌経路に沿った輸送を制御している。（Ｓｈｏｈａｍ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．（２００３）１７１：４０６２－７２）。ＣＤ９及びＣＤ８１は、いくつかの細胞間融合プロセスを制御することが示されている。（Ｃｈａｒｒｉｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）１２７：３６４１－４８）。

【0076】

本明細書において使用される「ＣＤ８２」という用語は、ＥＶへのタンパク質選別の制御及び抗原提示細胞による抗原提示に関与しているテトラスパニンタンパク質ファミリーのメンバーを指す。（Ａｎｄｒｅｕ，Ｚ．ａｎｄ Ｙａｎｅｚ－Ｍｏ，Ｍ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００４４２）。

【0077】

本明細書において使用される「クリックケミストリー」という用語は、効率的な試薬条件を用いて結合させることができ、良性溶媒または溶媒中で行うことができ、蒸発、抽出、蒸留などの簡便な方法で除去または抽出できる試薬を用いて化合物を製造する化学合成法を指す。エポキシド及びアジリジンの求核的開環反応、ヒドラゾン及び複素環形成などの非アルドール型カルボニル反応、エポキシドの酸化的形成及びマイケル付加などの炭素－炭素多重結合への付加反応、環化付加反応など、これらの基準を満たすいくつかのタイプの反応が同定されている。クリックケミストリーの代表的な例として、アジドとアルキンをカップリングさせてトリアゾールを形成させる下記式Ｉの反応がある。銅触媒を用いたアジド－アルキン環化付加反応（ＣｕＡＡＣ）は、無触媒の１，３－双極性環化付加反応に比べて１０⁷～１０⁸倍という圧倒的な反応速度の加速を特徴とする。広い温度範囲で成功し、水性条件やｐＨ４～１２の範囲に影響されず、幅広い官能基を許容する。純粋な生成物は、クロマトグラフィーまたは再結晶を必要とせず、簡単な濾過や抽出によって単離することができる。

【化1】

【0078】

銅を使わないクリックケミストリーの代表例は、式ＩＩに示すような、ジベンゾシクロ－オクチル（ＤＢＣＯ）タグを付けたＤＮＡ分子を、銅を使わない環化付加反応によってアジド官能基化表面に結合させる反応である。

【0079】

【化2】

［Ｅｅｆｔｅｎｓ，ＪＭ，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｐｈｙｓ．（２０１５）８：９］。

【0080】

本明細書において使用される「クリック可能な官能基」という用語は、生成物を形成するためにクリックケミストリーで使用することができる官能基を指す。いくつかの実施形態によれば、クリック可能な官能基は、アジドまたはアルキンである。

【0081】

本明細書において使用される「コンジュゲート」という用語は、２つ以上の化学化合物の結合または連結によって形成される化合物を指す。

【0082】

本明細書において使用される「接触」という用語及びその様々な文法形式は、接触している状態、または至近距離にあり、もしくは局所的に近接している状態を指す。

【0083】

本明細書において使用される「回復期血清」という用語は、感染症から回復した個体から得られ、その疾患の原因となった感染因子に対する抗体を含む血液血清を指す。「回復期血清」及び「回復期血漿」という用語は、互換的に使用することができる。

【0084】

本明細書において使用される「コロナウイルス」又は「ＣｏＶ」（ＣｏＶｓ、複数形）という用語は、呼吸器疾患、腸疾患、肝疾患及び神経疾患を引き起こす、多種多様な動物に感染し得る一本鎖ＲＮＡウイルスの大きなファミリーを指す［Ｗｅｉｓｓ，ＳＲ，Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ，ＩＬ，Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．（２０１１）８１：８５－１６４を引用するＹｉｎ，Ｙ．，Ｗｕｎｄｅｒｉｎｋ，ＲＧ，Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ（２０１８）２３（２）：１３０－３７］。ヒトコロナウイルスは、過去には比較的無害な呼吸器病原体と考えられていたが、現在では呼吸器感染症における重要な病原体として世界的に注目されている。既知の最大のＲＮＡウイルスであるＣｏＶは、さらにα－、β－、γ－、δ－グループの４つの属に分けられ、βグループはさらにＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄのサブグループから構成されている。［Ｘｉａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ａｄｖ．（２０１９）５：ｅａａｖ４５８０］。

【0085】

ＣｏＶは、２６，０００塩基から３７，０００塩基の非分節型ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡでエンベロープされており、これはＲＮＡウイルスの中で最も大きなゲノムである［Ｗｅｉｓｓ，ＳＲ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００５）６９（４）：６３５－６４を引用するＹａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０２０）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊａｕｔ．２０２０．１０２４３４］。ウイルスＲＮＡは、構造タンパク質、及び構造遺伝子の中に散在する遺伝子をコードしており、その一部はウイルスの病原性において重要な役割を果たす［Ｆｅｈｒ，ＡＲ，Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１５）１２８２：１－２３を引用するＹａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０２０）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊａｕｔ．２０２０．１０２４３４、Ｚｈａｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ（２０１２）１１（６）：６０７－１６］。スパイクタンパク質（Ｓ）は、受容体との結合とそれに続く宿主細胞へのウイルス侵入を担っており、Ｓ１とＳ２のサブユニットから構成されている。膜タンパク質（Ｍ）とエンベロープタンパク質（Ｅ）は、ウイルスの組み立てに重要な役割を果たす；Ｅタンパク質は病原性に必要である［ＤｅＤｉｅｇｏ，ＭＬ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００７）８１（４）：１７０１－１３を引用する上記文献、Ｎｉｅｔｏ－Ｔｏｒｒｅｓ，ＪＬ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．（２０１４）１０（５）：ｅ１００４０７７］。ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質には２つのドメインがあり、どちらも異なるメカニズムでウイルスＲＮＡゲノムと結合することができ、ＲＮＡ合成とカプセル化されたゲノムのビリオンへのパッケージングに必要である。［Ｆｅｈｒ，ＡＲ，Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１５）１２８２：１－２３を引用するＹａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０２０）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊａｕｔ．２０２０．１０２４３４．、Ｓｏｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｕｓｅｓ（２０１９）１１（１）：５９、Ｃｈａｎｇ，ＣＫ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．（２００６）１３（１）：５９－７２、Ｈｕｒｓｔ，ＫＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００９）８３（１４）：７２２１－３４］。Ｎタンパク質はまた、インターフェロンのアンタゴニストであり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のウイルスコード化抑制因子（ＶＳＲ）でもあり、ウイルスの複製に利益をもたらす［Ｃｕｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０１５）８９（１７）：９０２９－４３を引用する上記文献］。

【0086】

２０１９年１２月までに、６種のコロナウイルスがヒトに感染し、疾病を引き起こすことが確認されている。その中で、αグループのＨ－ＣｏＶ－２２９ＥとＨＣｏＶ－ＮＬ６３、βサブグループＡのＨＣｏＶ－ＯＣ４３とＨＣｏＶ－ＨＫＵ１による感染は軽症であることが多く、ほとんどが感冒症状を引き起こす［Ｓｕ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１６）２４：４９０－５０２を引用するＸｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＆ Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍａｇｉｎｇ（２０２０）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５９－０２０－０４７３５－９］。他の２種、βサブグループＢの重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）とβサブグループＣの中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）は病原性が異なり、致命的な病気を引き起こしている［同上、Ｃｕｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１９）１７：１８１－９２を引用］。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ヒトに感染するコロナウイルスの７番目のメンバーである［Ｚｈｕ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２０２０）３８２：７２７－３３］。ＣｏＶの宿主細胞への侵入は、ウイルススパイク（Ｓ）タンパク質と細胞レセプターとの結合、及び宿主細胞のプロテアーゼによるＳタンパク質のプライミングに依存し、このプライミングはＳ１／Ｓ２及びＳ２’部位でのＳタンパク質の切断を含み、Ｓ２サブユニットにより駆動されるプロセスであるウイルス膜及び細胞膜の融合を生じる。［Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０２０）１８１（２）：２７１－８０］。アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）とジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）は、それぞれＳＡＲＳ－ＣｏＶとＭＥＲＳ－ＣｏＶの宿主受容体として知られている［Ｋｕｈｎ，ＪＨ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（２００４）６１（２１）：２７３８－４３を引用するＹａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０２０）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊａｕｔ．２０２０．１０２４３４；Ｒａｊ，ＶＳ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１３）４９５（７４４０）：２５１－５４］。ＳＡＲＳＣｏＶ－２は宿主細胞への侵入にＳＡＲＳ－ＣｏＶレセプターＡＣＥ２を使用し、Ｓタンパク質のプライミングにセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２を使用する。［Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０２０）１８１（２）：２７１－８０］。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が侵入するメカニズムの一つは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面にあるスパイクタンパク質がＡＣＥ２レセプターに結合し、２つの切断部位で切断され（「プライミング」）、ウイルスと宿主の膜融合を可能にする構造変化を起こすことである。［Ｓｈｒｉｍｐ，ＪＨ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｓｃｉ．（２０２０）３（５）：９９７－１００７］。

【0087】

本明細書において使用される場合、「由来する」という用語は、起源から何かを受け取り、入手し、または改変するためのあらゆる方法を指す。

【0088】

本明細書において使用される「ＤＮＡライブラリー」という用語は、研究者がさらなる研究のために興味のあるＤＮＡ断片を同定し、単離することができるように、ベクターにクローン化されたＤＮＡ断片のコレクションを指す。

【0089】

本明細書において使用される「ドメイン」という用語は、特徴的な三次構造と機能を有するタンパク質の領域、及び直鎖ペプチド鎖を折り畳むことによって形成される三次構造を構成するタンパク質の三次元サブユニットのいずれかを指す。

【0090】

本明細書において使用される用語「カプセル化」という用語は、カプセル（一部分を包む膜状の包みを意味する）に封入されていることを指す。

【0091】

本明細書において使用される「輸送に必要なエンドソームソーティング複合体」（ＥＳＣＲＴ）という用語は、多胞体（ＭＶＢ）及び管腔内小胞（ＩＬＶ）の生合成に関与する成分を指す。ＥＳＣＲＴは、酵母から哺乳類まで保存されている４つの複合体（ＥＳＣＲＴ－０、－Ｉ、－ＩＩ、－ＩＩＩ）と関連タンパク質（ＶＰＳ４、ＶＴＡ１、ＡＬＩＸ）にアセンブルする約２０種類のタンパク質から構成される（Ｈｅｎｎｅ，Ｗ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ２１，７７－９１を引用するＣｏｌｏｍｂｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）１２６：５５５３－６５；Ｈｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｒｏｘｒｕｄ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）．ＥＳＣＲＴ ＆ Ｃｏ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １０２，２９３－３１８）。ＥＳＣＲＴ－０複合体はエンドソーム膜のユビキチン化タンパク質を認識し隔離する。一方、ＥＳＣＲＴ－Ｉ及び－ＩＩ複合体は、隔離されたカーゴを持つ芽への膜変形を担うようであり、ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ成分はその後、小胞の脱離を促進する（同上、Ｈｕｒｌｅｙ，Ｊ．Ｈ．ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ，Ｐ．Ｉ．（２０１０）．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１，５５６－５６６；Ｗｏｌｌｅｒｔ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００９）４５８：１７２－７７を引用）。ＥＳＣＲＴ－０は、肝細胞増殖因子制御チロシンキナーゼダブストレート（ＨＲＳ）タンパク質からなり、モノユビキチン化されたカーゴタンパク質を認識し、シグナル伝達アダプター分子（ＳＴＡＭ）、Ｅｐｓ１５、クラスリンと複合体を形成する。ＨＲＳはＥＳＣＲＴ－Ｉ複合体のＴＳＧ１０１をリクルートし、ＥＳＣＲＴ－ＩはＥＳＣＲＴ－ＩＩまたはＥＳＣＲＴアクセサリータンパク質であるＡＬＩＸを介して、ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩのリクルートに関与する。最後に、ＥＳＣＲＴ機構の解離と再利用には、様々な細胞活動に関連するＡＴＰアーゼ（ＡＡＡ－ＡＴＰアーゼ）Ｖｐｓ４との相互作用が必要であり、Ｖｐｓ４は、ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩをさらなる選択事象のためにＭＶＢ膜から放出する。ＥＳＣＲＴ－ＩＩがＩＬＶの生合成に直接的な役割を持つのか、あるいはその機能が特定のカーゴに限定されているのかは不明である（Ｂｏｗｅｒｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，５０９４－５１０５；Ｍａｌｅｒｏｄ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｆｆｉｃ ８，１６１７－１６２９を引用する上記文献）。

【0092】

４つのＥＳＣＲＴ複合体に属するＥＳＣＲＴサブユニットの同時枯渇は、ＭＶＢの形成を完全には損なわないことから、ＩＬＶの形成、ひいてはエキソソーム及び／または細胞外小胞の形成において、他の機序が作用する可能性があることが示されている（Ｓｔｕｆｆｅｒｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｔｒａｆｆｉｃ １０，９２５－９３７を引用する上記文献）。これらの経路の一つは、スフィンゴミエリンをセラミドに加水分解するＩＩ型スフィンゴミエリナーゼを必要とする（Ｔｒａｊｋｏｖｉｃ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９，１２４４－１２４７を引用する上記文献）。異なるＥＳＣＲＴ成分の枯渇は、ＭＶＢの形成や、エキソソーム及び／または細胞外小胞に関連するプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）の分泌の明確な減少にはつながらないが、ｓｉＲＮＡによる中性スフィンゴミエリナーゼ発現のサイレンシングや、ＧＷ４８６９という薬剤によるその活性の抑制は、エキソソーム及び／または細胞外小胞の形成と放出を減少させる。しかしながら、このようなセラミドへの依存性が、エキソソームや細胞外小胞を産生する他の細胞型や付加的な荷物に一般化できるかどうかは、まだ明らかにされていない。メラノーマ細胞におけるＩＩ型スフィンゴミエリナーゼの枯渇は、ＭＶＢの生合成を損なわない（ｖａｎ Ｎｉｅｌ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ２１，７０８－７２１を引用する上記文献）、エキソソーム及び／または細胞外小胞分泌を阻害しないが、これらの細胞では、メラノソームタンパク質ＰＭＥＬの内腔ドメインのＥＳＣＲＴ非依存的なソーティングにテトラスパニンＣＤ６３が必要である（ｖａｎ Ｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ２１，７０８－７２１）。さらに、テトラスパニンに富むドメインは、エキソソームや細胞外小胞の形成を可能にするソーティングマシーナリーとして機能することが提唱されている（Ｐｅｒｅｚ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１３）２８８，１１６４９－１１６６１）。

【0093】

エキソソーム及び／または細胞外小胞形成のＥＳＣＲＴ非依存的メカニズムに関する証拠があるにもかかわらず、様々な細胞型からの精製エキソソーム及び／または細胞外小胞のプロテオーム解析により、ＥＳＣＲＴ成分（ＴＳＧ１０１、ＡＬＩＸ）及びユビキチン化タンパク質が同定されている（同、Ｂｕｓｃｈｏｗ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．３５，３９８－４０３；Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｕｎｉｔ ３．２２）。また、ＥＳＣＲＴ－０成分であるＨＲＳは、樹状細胞（ＤＣ）によるエキソソーム及び／または細胞外小胞の形成及び／または分泌に必要であり、それによって抗原提示能力に影響を与える可能性があることも報告されている（同上、Ｔａｍａｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３９９，３８４－３９０を引用）。一般にエキソソーム及び／または細胞外小胞分泌の運命にある網状赤血球のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、ユビキチン化されてはいないが、ＭＶＢ選別のためにＡＬＩＸと相互作用する（同上、Ｇｅｍｉｎａｒｄ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）．Ｔｒａｆｆｉｃ ５，１８１－１９３を引用）。ＡＬＩＸがエキソソーム及び／または細胞外小胞の生合成と、コアタンパク質に共有結合したシンデカン（硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）またはＨＳとコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の両方からなる細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）の主要ファミリー）のエキソソームソーティングに関与することも示された－Ｐａｒｋ，ＰＷ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２０１８）１４３：３１７－３３）、シンテニンとの相互作用を介している（Ｂａｉｅｔｔｉ，ＭＦ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４，６７７－６８５を引用するＣｏｌｏｍｂｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）１２６：５５５３－６５）。ＥＳＣＲＴ－０の２つの構成要素（ＨＲＳ、ＳＴＡＭ１）、ＥＳＣＲＴ－Ｉの１つ（ＴＳＧ１０１）、及び遅効性構成要素（ＶＰＳ４Ｂ）の遺伝子をサイレンシングすると、エキソソーム及び／または細胞外小胞分泌に一貫した変化が誘導された。［Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．（２０１３）１２６：５５５３－６５］。

【0094】

本明細書で使用される「エキソソーム及び／または細胞外小胞」という用語は、すべての細胞によって生成される、直径約４０～１６０ｎｍ（平均～１００ｎｍ）のサイズ範囲のエンドソーム起源の細胞外二分子膜結合小胞であって、活発に分泌されるものを指す。

【0095】

生合成：エキソソーム及び／または細胞外小胞は、細胞膜の二重の侵入と、細胞内小胞（ＩＬＶ）を含む細胞内多胞体（ＭＶＢ）の形成を伴うプロセスで生成される。ＩＬＶは、ＭＶＢの細胞膜への融合とエキソサイトーシスにより、最終的に直径４０～１６０ｎｍのエキソソーム及び／または細胞外小胞として分泌される。細胞膜の最初の侵入は、細胞表面タンパク質と細胞外環境に関連する可溶性タンパク質を含むカップ状の構造を形成する。これにより、初期選別エンドソーム（ＥＳＥ）が新たに形成され、場合によっては既存のＥＳＥと直接結合することもある。トランスゴルジ網と小胞体も、ＥＳＥの形成とその内容に寄与することがある（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２０１６）１２６：１２０８－１５を引用するＫａｌｌｕｒｉ，Ｒ．，ＬｅＢｌｅｕ，ＶＳ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２０）３６７（６４７８）：ｅａａｕ６９７７、ｖａｎ Ｎｅｉｌ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２０１８）１９：２１３－２８、ＭｃＡｎｄｒｅｗｓ，ＫＭ，Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ（２０１９）１８：５２、Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２０１９）２１：９－１７、Ｗｉｌｌｍｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８）９：７３８、Ｈｅｓｓｖｉｋ，ＮＰ，Ｌｌｏｒｅｎｔｅ，Ａ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（２０１８）７５：１９３－２０８）。ＥＳＥは後期選別エンドソーム（ＬＳＥ）に成熟し、最終的には多胞エンドソームとも呼ばれるＭＶＢを生成する。ＭＶＢは、エンドソーム限界膜の内側への侵入（すなわち、細胞膜の二重侵入）によって形成される。この過程で、複数のＩＬＶ（将来のエキソソーム及び／または細胞外小胞）を含むＭＶＢが形成される。ＭＶＢは、リソソームまたはオートファゴソームと融合して分解され、または細胞膜と融合して、含まれるＩＬＶをエキソソーム及び／または細胞外小胞として放出することができる［Ｋａｈｌｅｒ，Ｃ．，Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２０１３）９１：４３１０３７を引用する上記文献］。

【0096】

異質性：細胞外小胞の異質性は、その粒径、内容物、レシピエント細胞への機能的影響、及び細胞起源を反映していると考えられている。それは、分泌される間に、その起源細胞から表面タンパク質を獲得する。それは天然に、細胞間でｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びタンパク質を輸送する。

【0097】

バイオマーカー：その膜にはテトラスパニンであるＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ８２が特異的に濃縮されている、ということで全体的に意見が一致している。

【0098】

役割：細胞外小胞は、健康状態及び疾患における近距離及び長距離の細胞間伝達の媒介物質であり、細胞生物学の様々な側面に影響を与える。

【0099】

本明細書で使用される「細胞外小胞（ＥＶ）」という用語は、細胞間伝達の一形態としてＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を含めた積荷を細胞間で輸送し得る、細胞から放出されたナノサイズの膜結合型小胞を指す。微小小胞（ＭＶ）、エキソソーム、オンコソーム及びアポトーシス小体を含めた種々のＥＶタイプは、それらの生合成または放出経路に基づいて特徴付けられている。微小小胞は、形質膜から直接発生し、粒径が１００ナノメートル（ｎｍ）～１マイクロメートル（μｍ）であり、細胞質積荷を含有する（Ｈｅｉｊｎｅｎ，ＨＦ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（１９９９）９４：３７９１－９９を引用しているＺａｂｏｒｏｗｓｋｉ，ＭＰ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（２０１５）６５（８）：７８３－９７）。別のＥＶサブタイプであるエキソソームは、多胞体と形質膜との間での融合によって形成されるが、この融合によって多胞体は、４０～１６０ｎｍの範囲の直径を有したより小さな小胞（エキソソーム）を放出する（Ｅｌ Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１３）１２：３４７－５７、Ｃｏｃｕｃｃｉ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｌｄｏｌｅｓｉ Ｊ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）２５：３６４－７２を引用する上記文献）。死滅しつつある細胞は、特定条件下でエキソソームまたはＭＶよりも豊富に存在し得る、かつ生体液間で内容物が異なり得る、小胞状のアポトーシス小体（５０ｎｍ～２μｍ）を放出する（Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）１６６６：７３０９－１８、Ｅｌ Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１３）１２：３４７－５７を引用する上記文献）。膜突出は、オンコソーム（１～１０μｍ）と称される大きなＥＶも発生させ得るが、これは主に、形質転換されていない対応物とは異なる悪性細胞によって産生される（Ｄｉ Ｖｉｚｉｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０１２）１８１：１５７３－８４、Ｍｏｒｅｌｌｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ（２０１３）１２：３５２６－３６を引用する上記文献）。

【0100】

本明細書で使用される「阻害剤」という用語は、量もしくはプロセスの速度を減少させる、プロセスを完全に停止させる、またはその作用もしくは機能を減少させる、制限するもしくは阻止する分子を指す。酵素阻害剤は、酵素に結合してそれによって酵素活性を低下させる分子である。阻害剤は、その特異性及び力価によって評価され得る。阻害には、物質の量、速度、作用機能またはプロセスの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の減少または低下が含まれ得る。

【0101】

「単離された」という用語は、本明細書において、（１）天然の存在環境で通常みられるように付随または相互作用する成分を実質的または本質的に含まない、材料、例えば、限定はされないが、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指して使用される。「実質的に含まない」または「本質的に含まない」という用語は、本明細書において、約９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超または１００％超が含んでいないことを指して使用される。単離された材料は、天然環境にある当該材料と一緒にはみられない材料を、任意選択的に含む；あるいは（２）材料がその天然の環境にある場合、当該材料は合成的に（非天然に）、意図的な人間の介入によって組成物に変えられている、及び／またはその環境でみられる材料に元来存在していない細胞の中のある場所（例えば、ゲノム、または細胞内の細胞小器官）に置かれている。合成材料を得るための改変は、天然の状態にあるかまたはそこから取り出された材料に対して実施され得る。

【0102】

本明細書で使用される「Ｆａｂ断片」という用語は、酵素パパインによるＩｇＧの切断によって生産された、Ｆｃ領域を有さず抗体の単一の抗原結合アームで構成された抗体断片を指す。それは、完全軽鎖と、重鎖のアミノ末端側可変領域及び第１定常領域とが鎖間ジスルフィド結合によって結び付けられたものを含有する。

【0103】

本明細書で使用される「Ｆ（ａｂ’）₂断片という用語は、ペプシンによるＩｇＧの切断によって生産された、Ｆｃ領域を有さず２つの繋げられた抗原結合アーム（Ｆａｂ断片）で構成された抗体断片を指す。

【0104】

本明細書で使用される「断片」または「ペプチド断片」という用語は、より大きなペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に由来する、そこから切り離された、または切断された、小さな部分であって、より大きなペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の所望の生物学的活性を保持している、当該部分を指す。抗体結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、及び一本鎖（ｓｃ）抗体）は、組換えＤＮＡ技術によって、または完全抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生産され得る。

【0105】

本明細書で使用される「異種」という用語は、無関係な、または類似していない要素または部分で構成されていること；変化していること；種々雑多なものからなること；異なる種類のものである；構造、質などが異なるまたは全く異なることを指す。

【0106】

本明細書で使用される「高処理量スクリーニング」または「ＨＴＳ」という用語は、自動装置を使用して数千～数百万個の試料をモデル生物、細胞、経路または分子のレベルでの生物学的活性について高速検査することを指す。

【0107】

本明細書で使用される「同種」という用語は、同じ特徴、構造、質などを有すること；本質的に類似していること；同じ性質を有すること；類似するまたは同一の要素または部分で構成されていること；一様であることを指す。

【0108】

本明細書において、「免疫応答」及び「免疫介在性の」という用語は、これらの反応の結末が対象にとって有益なものであるか有害なものであるかにかかわらず、外来または自己抗原のいずれかに対する対象の免疫系の任意の機能発現を指して互換的に使用される。

【0109】

本明細書で使用される「免疫調節性」という用語は、例えばケモカイン、サイトカイン、及び免疫応答の他の介在物質を発現することによって、免疫応答を直接的または間接的に増大または減少させることができる、物質または薬剤を指す。

【0110】

本明細書で使用される「吸入」という用語は、投薬された蒸気を呼吸によって吸い込む行為を指す。

【0111】

本明細書で使用される「吸入送達装置」という用語は、液体または乾燥粉末エアゾール製剤から小さな液滴またはエアゾールを生成し、例えば液体、懸濁液、粉末などの中に含まれている薬物の肺内投与を成し遂げるべく口からの投与のために使用される、装置／機械または部品を指す。

【0112】

本明細書で使用される「結び合わせる」という用語は、あるものを別のものと繋げる、結合させる、または連結することを意味する。これらの用語の各々は互換的に使用される。

【0113】

本明細書で使用される「長鎖ノンコーディングＲＮＡ」（「ｌｎｃＲＮＡ」）という用語は、２００ヌクレオチドよりも長いがタンパク質をコードしない、転写されるＲＮＡ分子のクラスを指す。ＬｎｃＲＮＡは、複雑な構造に折りたたまれ得、タンパク質、ＤＮＡ及び他のＲＮＡと相互作用して活性、多タンパク質複合体のＤＮＡ標的またはパートナーを調節し得る。ｌｎｃＲＮＡとｍｉＲＮＡとのクロストークは、遺伝子発現の転写後調節を働かせる複雑なネットワークを作り出す。例えば、ｌｎｃＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ結合部位を内包し得、ｍｉＲＮＡを他の転写産物から隔離する分子デコイまたはスポンジとして働き得る。標的ｍＲＮＡとの結合をめぐるｌｎｃＲＮＡとｍｉＲＮＡとの間での競合が報告されており、これは、遺伝子発現の抑制解除をもたらす（Ｙｏｏｎ，ＪＨ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏ．（２０１４）３４：９－１４を引用しているＺａｍｐｅｔａｋｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２０１８）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｐｈｙｓ．２０１８．０１２０１、Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅ，ＭＤ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１６）９９：４９４－５０１）。最終的にｌｎｃＲＮＡは、埋め込まれたｍｉＲＮＡ配列を含有し、ｍｉＲＮＡの供給源としての役割を果たす（Ｐｉｃｃｏｌｉ，ＭＴ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．（２０１７）１２１：５７５－８３を引用する上記文献）。

【0114】

本明細書で使用される「メッセンジャーＲＮＡ」（「ｍＲＮＡ」）という用語は、タンパク質翻訳において機能するものであるコーディングＲＮＡを指す。

【0115】

本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ」（または「ｍｉＲＮＡ」）という用語は、小さな１８～２８ヌクレオチドの長さのノンコーディングＲＮＡ分子のクラスを指す。それらの主な役割はタンパク質発現の転写後調節にある。

【0116】

本明細書で使用される場合、「中和」という用語、及び他のその文法形式は、例えば宿主細胞にウイルス粒子が結合及び進入するのを阻害することであってこれによってウイルス複製サイクルが効果的に阻害されることによる、ウイルスの感染性の阻害を指して、使用される。本明細書で使用される「中和力価」という用語は、中和を生じさせるのに必要な、生体試料に由来する物質の最小量または濃度を指す。

【0117】

本明細書で使用される「次世代シーケンシング」、「ＮＧＳ」、「超並列シーケンシング」または「ディープシーケンシング」という用語は、個体の全ゲノムのヌクレオチド配列を自動プロセスで一度に決定するために用いられる高処理量の方法を表す。まず、患者の試料から、断片化、精製、及びＤＮＡ試料の増幅によって、ＤＮＡライブラリーを調製する。その後、個々の断片を、固体表面または小ビーズへの結合によって物理的に単離する。これらの断片の各々の配列は、合成による配列決定などの技術によって同時に解明される。結果として得られた配列データは、コンピュータによって「標準参照」ゲノムに対してアライメントされる。

【0118】

本明細書で使用される「ノンコーディングＲＮＡ」（「ｎｃＲＮＡ」）という用語は、ＤＮＡから転写されるがタンパク質には翻訳されない機能性ＲＮＡ分子を指す。それらは、ハウスキーピング及び調節性ノンコーディングＲＮＡに分類される。ハウスキーピングｎｃＲＮＡとしては、リボソームＲＮＡ（リボソームのＲＮＡ成分であるｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（アミノ酸をｍＲＮＡに整合させるためのアダプターとして機能するものであるｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｍＲＮＡスプライシングなどのＲＮＡプロセシングにおいて機能するものであるｓｎＲＮＡ）、及び核小体低分子ＲＮＡ（他のＲＮＡの化学修飾を誘導することにおいて機能するものであるｓｎｏＲＮＡ）が挙げられる。調節性ノンコーディングＲＮＡは、短鎖ｎｃＲＮＡ（２００ｎｔ未満）及び長鎖ｎｃＲＮＡ（２００ｎｔを上回る）に分割される。２００ｎｔ未満の短鎖ノンコーディングＲＮＡはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ならびに長鎖ノンコーディングＲＮＡ（２００ｎｔを上回る）を含む。［Ｌｏｓｋｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（２０１６）１－１２．１０．１１５５／２０１６／５３６５２０９］。

【0119】

本明細書で使用される「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、特に限定されない限り、天然に存在しているヌクレオチド（例えばペプチド核酸）と同様の様式で一本鎖核酸にハイブリダイズするという点において天然ヌクレオチドの必須の性質を有している既知の類縁体を包含する。

【0120】

本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、窒素含有塩基（ＤＮＡではアデニン、グアニン、チミンまたはシトシン；ＲＮＡではアデニン、グアニン、ウラシルまたはシトシン）、リン酸基及び糖（ＤＮＡではデオキシリボース；ＲＮＡではリボース）からなる分子を指す。

【0121】

本明細書で使用される「粒子」という用語は、極めて小さな構成物質、例えばナノ粒子を指す。

【0122】

本明細書で使用される「ＰＤＺドメイン」という用語は、標的タンパク質のＣ末端側にある短いアミノ酸モチーフをしばしば認識する、豊富なタンパク質相互作用モチーフを指す。それらは、複数の生物学的プロセス、例えば、輸送、イオンチャネルシグナル伝達及び他のシグナル伝達系を調節することに関係があるとされている。（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｊ ＆ Ｚｈｅｎｇ，ＪＪ．Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ＆ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（２０１０）８：ａｒｔｉｃｌｅ ８参照）。

【0123】

本明細書で使用される「ペプチド模倣体」という用語は、天然の親ペプチドの生物学的作用（複数可）を模倣する（模擬するという意味）またはそれに拮抗する（中和または相殺するという意味）ことができる小さなタンパク質様鎖または非ペプチド性構造要素を指す。

【0124】

「胎盤性アルカリホスファターゼ」または「ＰＬＡＰ」という用語は、正常では始原生殖細胞及び合胞体栄養細胞によって産生される酵素を指し、その発現の検出は、生殖細胞腫瘍の診断に役立つ。正常なヒト成人及び胎児筋肉組織ではＰＬＡＰ免疫反応性が認められる。この免疫反応性は、軟部組織腫瘍における筋原性分化の度合いに関係しているようであり、骨格筋分化を有する細胞においてより頻繁に発現し、筋線維芽細胞の特徴を有する細胞において最も発現が少ない。（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，ＪＤ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌ（２００２）２６（１２）：１６２７－３３）。

【0125】

本明細書で使用される「血漿」という用語は、循環血の流体（非細胞性）部分、及びリンパの流体部分を指す。

【0126】

「ポリマー」という用語は、多くの小単位の繰り返しで構成される大分子または巨大分子を指す。「モノマー」という用語は、他の分子に化学的に結合してポリマーを形成し得る分子を指す。本明細書で使用される「コポリマー」という用語は、１種類よりも多いモノマーから得られるポリマーを指す。

【0127】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において、その最も広い意味で、小単位アミノ酸、アミノ酸類縁体またはペプチド模倣体の配列を指して使用される。小単位は、特に記されている場合を除き、ペプチド結合によって繋げられる。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーに対してだけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が、天然に存在する対応するアミノ酸の人工化学類縁体になっているアミノ酸ポリマーに対しても、適用される。当該用語は、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰリボシル化を含むがこれらに限定されない修飾も包含する。よく知られているように、そして上記にあるように、ポリペプチドが完全に線状でない場合があることは理解されよう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐状になり得、またはそれは、天然のプロセシングによるものであろうと、天然に起こらない人為的操作によってもたらされる事象によるものであろうと、一般的に翻訳後事象の結果として、分岐を有するもしくは有さない環状になり得る。環状、分岐状、及び分岐環状ポリペプチドは、完全に合成方法によって合成され得る。

【0128】

本明細書で使用される「精製」という用語、及びその様々な文法形式は、外来の、外生の、または厭わしい要素から分離するまたは遊離させるプロセスを指す。組成物は、それにもかかわらず、生体系または合成中にそれに会合していることがある物質から実質的に分離されているという点では実質的に純粋である。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」という用語は、分析的プロトコールによって決定される少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の純度を指す。そのようなプロトコールには、例えば、フローサイトメトリー、電気泳動、低分子ＲＮＡシーケンシング、定量的ＰＣＲ、ナノ粒子追跡、電子顕微鏡、質量分析、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、及び様々な代謝アッセイが含まれるが、これらに限定されない。

【0129】

「定量的ＰＣＲ」（または「ｑＰＣＲ」）という用語は、「リアルタイムＰＣＲ」または「定量的リアルタイムＰＣＲ」とも呼称されるが、標的ＤＮＡ配列の増幅を反応物中のそのＤＮＡ種の濃度の定量と結合させる、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術を指す。

【0130】

本明細書で使用される「受容体結合ドメイン」または「ＲＢＤ」という用語は、ウイルスタンパク質を宿主細胞受容体に結合させてそれによって宿主細胞への進入及び感染を獲得するウイルスタンパク質上のドメインを指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤは、Ｓタンパク質の残基３３１～５２４に対応する。［Ｔａｉ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０２０）１７：６１３－２０］。

【0131】

レニンアンジオテンシン系（ＲＡＳ）は、腎及び心血管機能の中心的調節因子である。古典的には、それは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、その産物、アンジオテンシン（Ａｎｇ）ＩＩ、及びＡｎｇ ＩＩの受容体、アンジオテンシン１型（ＡＴ１）及びアンジオテンシン２型（ＡＴ２）受容体からなる。ＲＡＳはさらに、Ａｎｇ ＩＩからＡｎｇ－（１～７）を生成するモノカルボキシペプチダーゼ、ＡＣＥ２を含む。アンジオテンシン－（１～７）はＧタンパク質結合受容体Ｍａｓの内因性リガンドであり、したがって、ＭａｓはＡｎｇ－（１～７）の生物学的作用を媒介する［Ｓａｎｔｏｓ，ＲＡ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３）１００：８２５８－６３を引用しているＳｉｎｇｈ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｈｙｓｉｏｌ．（２０１５）３０９（１０）：Ｈ１６９７－Ｈ１７０７］。Ａｎｇ ＩＩは、心血管系において高血圧性、酸化促進性、肥大性及び線維化促進性の作用を生じさせる。Ａｎｇ－（１～７）は、血管拡張性、降圧性、肥大抑制性、抗線維化性及び抗血栓性の作用を減少させることによってＡＣＥ／ＡｎｇＩＩ経路に逆調節作用を誘発する［Ｆｅｒｒｅｉｒａ，ＡＪ，ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ（２０１０）５５：２０７－１３、Ｊｕｓｕｆ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００８）５８５：３０３－１２を引用する上記文献］。

【0132】

本明細書で使用される「制限酵素」という用語は、核酸分子中の短い配列を認識してその配列またはその近傍において核酸分子を切断し、その結果として二本鎖または一本鎖切断部をもたらす、細菌によって産生された酵素を指す。本明細書で使用される「制限酵素認識部位」または「制限部位」という用語は、各制限酵素によって認識される、ＤＮＡの塩基対の短い特定の配列である。

【0133】

本明細書で使用される「血清」という用語は、フィブリン血餅及び血球を除去した後に得られる血液の流体部分を指す。

【0134】

本明細書で使用される「静止系」という用語は、ある時点での出力がその時点における入力にのみ依存している、フィードバック系がない系を指す。それは、任意の時点において出力がデータの過去及び未来の値に依存している「動的系」とは区別される。

【0135】

本明細書で使用される「鎖置換」という用語は、ＤＮＡ相同組換え及びＤＮＡミスマッチ修復における反応を指す。それは、二本鎖ＤＮＡ中の鎖の１つが別のほぼ同一な鎖に置き換えられる反応である。ＤＮＡ鎖置換には、「侵入」、「既存」及び「基質」鎖と命名される３本の一本鎖が関与する。基本的にはそれは、基質鎖上での侵入鎖と既存鎖との間での交換反応である。二本鎖核酸分子は、鎖置換活性（例えば弛緩活性）を有する酵素、例えばトポイソメラーゼまたはヘリカーゼ、及び二本鎖核酸中の既存鎖に対して相補的である侵入鎖によって、２つの別個な一本鎖核酸鎖に部分的または完全に分離される。酵素は二本鎖核酸を弛緩させて、二本鎖核酸の分離された鎖の１つに相補侵入鎖がハイブリダイズすることを可能にし、それによって、既存二本鎖核酸鎖とそれに整合する基質鎖とが再アニーリングして元の二本鎖ＤＮＡ分子になるのを阻止する。置き換えられ既存一本鎖ＤＮＡは、その後、既存鎖が完全に侵入鎖に置き換わるまで分岐点移動を受ける。（Ｂｒｏａｄｗａｔｅｒ，Ｊｒ．，ＤＷＢ，Ｋｉｍ，ＨＤ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（２０１６）１１０（７）：１４７６－８４）。記載され、及び特許請求されているアッセイは、ＤＮＡ置換を含むが、このＤＮＡ置換では、抗体に結合しているＤＮＡ鎖において、二本鎖ＤＮＡの二重鎖の末端に小さなオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ及びオーバーハングし、ＤＮＡポリメラーゼ反応が初期ＤＮＡ鎖（抗体に連結された鎖と、ビオチンを介して足場に連結された鎖）を分離させ、そのようにして、独特なＤＮＡ鎖を有する独特な抗体が、エキソソームの様々な表面マーカーを標的とする様々な抗体の群から特異的に引き離され得る。

【0136】

本明細書で使用される「テトラスパニン」という用語は、主に膜タンパク質組織化物質として機能する保存された構造を有する、膜をまたいで存在するタンパク質を指す。タンパク質のテトラスパニンファミリーのメンバーは、４つの膜貫通ドメインを有するが、これらは、小さな（ＥＣ１）及び大きな（ＥＣ２）細胞外ループを作り出すのに寄与している［Ａｂｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．（２００８）２６６：１６３－７０を引用しているＴｅｒｍｉｎｉ，ＣＭ，Ｇｉｌｌｅｔｔｅ，ＪＭ，Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（２０１７）５：３４）。大きな細胞外ループは、保存されたＣｙｓ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙアミノ酸モチーフ（ＣＣＧモチーフ）、及び他の２つの保存されたシステイン残基を含有する。テトラスパニンファミリーの多くのメンバーは、翻訳後修飾も含有する。

【0137】

本明細書で使用される「治療剤」という用語は、治療効果をもたらす薬物、分子、核酸、タンパク質、代謝産物、細胞、組成物または他の物質を指す。本明細書で使用される「活性」という用語は、意図した治療効果を担っている、記載される本発明の組成物の原料、成分または構成物質を指す。「治療剤」及び「活性薬剤」という用語は本明細書において互換的に使用される。

【0138】

本明細書で使用される「治療構成要素」という用語は、集団のある百分率において特定の疾患徴候の進行を排除、軽減または防止する治療的に有効な投薬量（すなわち、投与の用量及び頻度）を指す。一般的に用いられている治療構成要素の一例は、集団の５０％において特定の疾患徴候に対して治療的に有効である特定の投薬量での用量を表すＥＤ５０である。

【0139】

活性薬剤の「治療量」、「有効な量」または「治療的有効量」という用語は、意図した治療利益をもたらすのに十分な量を指して互換的に使用される。但し、投薬量レベルは、患者の年齢、体重、性別、病状、病態の重症度、投与経路、及び採用される特定の活性薬剤を含めた様々な因子に基づく。それゆえに投薬計画は実に様々であり得るが、標準的な方法を用いて医師によって慣例的に判断され得る。加えて、「治療量」及び「治療的有効量」という用語は、記載される本発明の組成物の予防的または防止的な量を含む。記載される本発明の予防的または防止的な用途において、医薬組成物または医薬は、疾患、障害または病態の生化学的、組織学的及び／または行動的症候、その合併症、ならびに疾患、障害または病態の進展の間に呈する中間的な病理学的表現型を含めた疾患、障害または病態のリスクを排除もしくは低減する、その重症度を低減する、またはその発症を遅らせるのに十分な量で、疾患、障害または病態に罹患しやすいかあるいはそのリスクを有する患者に投与される。一般的には、最大用量、すなわち、いくつかの医学的判断に従って最も高い安全用量を用いることが好ましい。「用量」及び「投薬量」という用語は本明細書において互換的に使用される。

【0140】

本明細書で使用される「治療効果」という用語は、結果が望ましく有益であると判断される、治療の結果を指す。治療効果には、直接的または間接的に、疾患徴候の阻止、軽減または排除が含まれ得る。治療効果にはまた、直接的または間接的に、疾患徴候の進行の阻止軽減または排除も含まれ得る。

【0141】

本明細書に記載される任意の治療薬剤に関して、治療的有効量は、最初は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験及び／または動物モデルにおいて予め決定され得る。治療的有効用量はまた、ヒトデータからも決定され得る。適用される用量は、投与される化合物の相対的な生物学的利用率及び力価に基づいて調整され得る。上記方法及び他のよく知られた方法に基づいて最大限の有効性をもたらすように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。

【0142】

治療有効性を決定するための一般的原理は、参照により本明細書に援用されるＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ ＧｉｌｍａｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章の中に見つかり得るが、以下に要約される。

【0143】

薬物動態原理は、許容されない有害作用を最小限に抑えながら所望の度合いの治療有効性を得るべく投薬計画を改変するための基準を提供する。薬物の血漿中濃度が測定され得、治療適用枠に関係付けられ得る状況では、投薬量改変のためのさらなる指針が得られ得る。

【0144】

大抵の臨床現場では、薬物は、治療適用枠に関連付けて薬物の定常状態濃度を維持するために、一連の反復用量で、または連続輸注として投与される。選定された定常状態または目標濃度（「維持用量」）を維持するためには、薬物投与の速度を、投入速度が損失速度と等しくなるように調整する。臨床医が血漿における薬物の所望の濃度を選択し、特定患者におけるその薬物のクリアランス及び生物学的利用率を知っている場合、適切な用量及び投薬間隔が算出され得る。但し、生細胞療法はこの概念を破る。なぜなら、それは分裂するものであり、自家細胞療法の場合には身体における永久的存在さえ獲得し得るからである。したがって、最初に投与されたものは、レシピエントの中に存在しているものとの相関性が時の経過とともにほとんどなくなり得る。

【0145】

本明細書で使用される「ＴＣＩＤ５０」または「５０％組織培養感染量」という用語は、細胞が培養された表面にウイルス流体の希釈溶液を播種した場合に細胞の５０％が感染する濃度を指す。

【0146】

本明細書で使用される「Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有４」または「Ｔｉｍ－４」という用語は、抗原提示細胞上に選択的に発現するがＴ細胞上には発現せず、Ｔ細胞増殖を調節し得る、ホスファチジルセリン受容体を指す。（Ｌｉｕ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０２０）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２０．００５３７）。

【0147】

本明細書で使用される「力価」という用語は、血中の抗体の濃度などの生体試料中の物質の濃度及び強さの尺度である。力価は、検出可能な効果をなおも可能とする最高希釈倍率によって推定される。例えば、１：１００が陽性検査結果を与え、より高い希釈倍率が陰性である場合、力価は１００である。

【0148】

本明細書で使用される「治療する」、「治療された」または「治療すること」という用語は、望ましくない生理学的状態、障害または疾患を防止もしくは減速させること、または有益な、もしくは望ましい臨床結果を得ることを目的とする、治療処置及び／または予防的もしくは防止的手段の両方を指す。本開示の目的に関して、有益な、または望ましい臨床結果としては、症候の緩和；病態、障害または疾患の程度の軽減；病態、障害または疾患の状態の安定化（つまり、悪化させないこと）；病態、障害または疾患の発症の遅延、または進行の減速；病態、障害または疾患状態の改善；及び検出可能あるいは検出不可能な（部分的あるいは完全な）寛解、または病態、障害もしくは疾患の向上もしくは改善が挙げられるが、これらに限定されない。治療には、許容されない副作用を伴うことなく臨床的に重要な応答を誘発することが含まれる。治療にはまた、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延ばすことが含まれる。

【0149】

本明細書で使用される「ウイルス負荷」という用語は、生物中、典型的には血流中の、通常はミリリットルあたりのウイルス粒子で示されるウイルスの量の測定結果を指す。

【0150】

方法
一態様によれば、本開示は、被験者の重症ウイルス感染症の発症リスクをｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し、治療するための方法を提供し、該方法は、

【0151】

ａ）カーゴを含む精製生物学的粒子の集団を調製することであって、該調製することは、

【0152】

（１）被験者から生物学的粒子を含む生体サンプルを取得すること、

【0153】

（２）被験者からの生物学的粒子を含む生体サンプルを、１つ以上の生物学的粒子の表面抗原に対する結合剤と接触させることであって、結合剤が核酸に結合され、核酸が固体支持体に固定化される、該接触させること、による上記調製することと、

【0154】

ｂ）結合剤によって結合された生物学的粒子を生体サンプルから単離することと、

【0155】

ｃ）結合剤に結合した生物学的粒子を放出することと、

【0156】

（ｄ）結合した生物学的粒子を結合剤から溶離し、遊離の精製生物学的粒子の集団を形成することと、

【0157】

（ｅ）精製生物学的粒子の集団のカーゴを評価することと、

【0158】

（ｆ）精製生物学的粒子の集団のカーゴプロファイルに基づいて、患者の重症ウイルス感染症のリスクを決定することと、

【0159】

（ｇ）重症ウイルス感染症のリスクがある患者に適切な治療を実施することとを含む。

【0160】

いくつかの実施形態によれば、カーゴは、カプセル化されたｍｉＲＮＡ及び／もしくは低分子非コードＲＮＡ、カプセル化されたポリペプチド、カプセル化されたＤＮＡ、表面ポリペプチド、または表面脂質のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、カーゴの評価は、例えば、（ｉ）精製生物学的粒子によってカプセル化された１つ以上のｍｉＲＮＡまたは低分子非コードＲＮＡ、精製生物学的粒子によってカプセル化されたポリペプチド、精製生物学的粒子の表面におけるポリペプチド、精製生物学的粒子によってカプセル化されたＤＮＡ、及び精製生物学的粒子の脂質の発現を測定することにより、カーゴを同定及び定量することを含む。いくつかの実施形態によれば、カーゴの評価は、精製生物学的粒子のカーゴプロファイルを決定することと、被験者からの精製生物学的粒子のカーゴプロファイルを対照被験者である、（１）コロナウイルスに感染しない人、（２）コロナウイルスに感染して軽症化した人、及び（３）コロナウイルスに感染して重症化した人からのカーゴプロファイルと比較することとを含む。いくつかの実施形態によれば、カーゴの評価は、

【0161】

（ｉ）精製生物学的粒子の集団からＲＮＡを抽出することと、

【0162】

（ｉｉ）精製生物学的粒子の集団によってカプセル化されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む１つ以上の低分子非コードＲＮＡの発現を同定及び定量することと、

【0163】

（ｉｉｉ）同定及び定量されたｍｉＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡの発現を、対照被験者である、ｉ）ウイルスに感染しない人、ｉｉ）ウイルスに感染して（ＰＣＲによって確認）、軽症化した人（入院したが、人工呼吸器を必要としないことを意味する）、及びｉｉｉ）ウイルスに感染して（ＰＣＲによって確認）、重症した人（急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ、ベルリンの分類基準に従う）を示し、人工呼吸器を必要とすることを意味する）からの同定及び定量されたｍｉＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡと比較することとを含む。

【0164】

いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子のカーゴプロファイルは、精製生物学的粒子からのｍｉＲＮＡを含む、同定及び定量された、低分子非コードＲＮＡを含む。いくつかの実施形態によれば、被験者からの精製生物学的粒子からのカーゴプロファイルを対照被験者である、ｉ）ウイルスに感染しない人、ｉｉ）ウイルスに感染して（ＰＣＲによって確認）、軽症化した人（入院したが、人工呼吸器を必要としないことを意味する）、及びｉｉｉ）ウイルスに感染して（ＰＣＲによって確認）、重症した人（急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ、ベルリンの分類基準に従う）を示し、人工呼吸器を必要とすることを意味する）からのカーゴプロファイルと比較する。

【0165】

いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団のカーゴを評価することにより、精製生物学的粒子のカーゴプロファイルを決定することは、（ｉ）精製生物学的粒子の集団からＲＮＡを抽出すること、（ｉｉ）精製エキソソームの集団によってカプセル化された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子非コードＲＮＡの発現を同定及び定量すること、及び（ｉｉｉ）精製生物学的粒子のカーゴプロファイルを対照被験者である、（１）コロナウイルスに感染しない人、（２）コロナウイルスに感染して軽症化した人、及び（３）コロナウイルスに感染して重症化した人からのカーゴプロファイルと比較することによって実現される。

【0166】

いくつかの実施形態によれば、該方法は、プールされた異種の生物学的粒子の集団を提供するための、最初の限外濾過ステップ、超遠心分離ステップ、またはその両方を含む。

【0167】

いくつかの実施形態によれば、重症ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症である。いくつかの実施形態によれば、コロナウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染症である。いくつかの実施形態によれば、コロナウイルス感染症は、ＭＥＲＳＣｏＶ感染症である。いくつかの実施形態によれば、コロナウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症である。

【0168】

いくつかの実施形態によれば、生体サンプルは、体液を含む。体液は、例えば、血液、尿、精子（精液）、膣分泌物、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、胸膜液（胸腔洗浄）、心嚢液、腹水、羊水、唾液、鼻水、耳漏、胃液、母乳、ふん便、汗、涙、乳頭吸引液、または他の分泌された体液を含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、体液は、血液（全血、血清、もしくは血漿）、ＣＳＦ、またはリンパ液などの循環／分泌体液である。いくつかの実施形態によれば、生体サンプルは、生体組織（例えば、病変組織）を含む。

【0169】

いくつかの実施形態によれば、該方法は、ハイスループットアッセイであり、それは、一度に複数のサンプルの精製を可能にし、即ち、２４、９６、３８４ウェルプレート形式または他のマルチウォール形式と互換性がある。いくつかの実施形態によれば、特定のバイオマーカー（複数可）を含む生物学的粒子が選択される生体液は、再利用可能であり、例えば、それ以降のラウンドでは、生体液に悪影響を与えることなく、他のバイオマーカーの選択、ｍｉＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡの選択、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、脂質、またはそれらの組み合わせの単離などを行う。

【0170】

いくつかの実施形態によれば、結合剤は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはそれらの組み合わせ）、ポリペプチド（例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマーポリペプチド、もしくはそれらの組み合わせ）、または生分解性ポリマーを含む。

【0171】

いくつかの実施形態によれば、結合剤は、固体支持体に直接固定化される。いくつかの実施形態によれば、結合剤は、固体支持体に間接的に固定化される。いくつかのかかる実施形態では、結合剤は、核酸に結合され、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態によれば、核酸は、クリック化学によって固体支持体に固定化される。

【0172】

いくつかの実施形態によれば、結合剤は、生物学的粒子抗原に特異的な抗体である。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子抗原は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、及び／または生物学的粒子によって受け継がれる他の細胞表面マーカーのうちの１つ以上を含む。このように、精製プロセスは、ウイルスに感染したもの、癌細胞由来のもの、器官由来のものなど、必要に応じて生物学的粒子の特定の集団を選択し、それらの内容物を走査するように調整することができる。いくつかの実施形態によれば、該方法は、少量のバイオマーカーを検出するために生物学的粒子の亜集団を濃縮するための追加の細胞特異的抗体を含む。いくつかの実施形態によれば、該方法は、本明細書でテストしたものよりも大量の生体液物質の入力を含む。いくつかの実施形態によれば、該方法は、ｑＰＣＲ検知閾値を向上させるための準備ステップを含む。いくつかの実施形態によれば、該方法は、少量のバイオマーカーを検出するために生物学的粒子の亜集団を濃縮するための追加の細胞特異的抗体、より大量の生体液物質の入力、及びｑＰＣＲ検知閾値を向上させるための準備ステップを含む。

【0173】

いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子抗原に特異的な抗体は、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）エステル、２－ＩＴ（２－イミノチオラン）、ＭＢＳ（３－マレイミド安息香酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、スルホ－ＳＭＣＣ、またはそれらの誘導体で活性化される。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子抗原に特異的な抗体は、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）エステルで活性化される。いくつかの実施形態によれば、ＤＢＣＯ修飾抗体は、クリック化学によってＤＮＡリンカーに結合される。いくつかの実施形態によれば、抗体－ＤＮＡリンカーコンジュゲートは、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルプレートに結合される。いくつかの実施形態によれば、ウェルプレートは、ＲＮＡｓｅ Ａで前処理される。

【0174】

いくつかの実施形態によれば、単離／分離ステップは、洗浄を含み、そのため、結合剤に結合した生物学的粒子から生体サンプル内の未結合物質を分離する。いくつかの実施形態によれば、結合剤に結合した生物学的粒子は、固体支持体から酵素的に放出される。いくつかの実施形態によれば、その放出は、１つ以上の結合剤と固体支持体との間の結合を酵素的に切断することを含む。いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、結合剤に結合した核酸の酵素的切断によって放出される。いくつかの実施形態によれば、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡは、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドは、ウラシル、制限部位配列、またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖である。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖が二本鎖になる場合、該酵素は、リボ核酸ヌクレオチドもしくは特定の制限部位配列、または特定のＲＮＡ鎖もしくはＤＮＡ鎖で核酸を特異的に切断する。いくつかの実施形態によれば、リボ核酸ヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドである。いくつかの実施形態によれば、核酸をウラシルヌクレオチドで切断する酵素は、ウラシルグリコシラーゼである。いくつかの実施形態によれば、特定の核酸配列で切断する酵素は、制限酵素である。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を特異的に切断する酵素は、制限エンドヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅ－Ｈである。

【0175】

いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、鎖置換によって放出される。いくつかの実施形態によれば、核酸の第１既存鎖は、核酸の第１鎖または第２鎖に対する相補的な侵入鎖、及び鎖置換活性を含む酵素により、核酸の第２基質鎖から分離される。いくつかの実施形態によれば、鎖置換活性を含む酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、またはヘリカーゼである。いくつかの実施形態によれば、抗体に結合したＤＮＡ鎖を損傷することなくプラットフォームから抗体を放出できるように、抗体に結合したＤＮＡ領域に相補的なオリゴヌクレオチドを使用したポリメラーゼ連鎖反応を使用して、アニーリングされたＤＮＡ鎖を分離する。

【0176】

いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子は、結合剤から溶離される。例えば、生物学的粒子は、精製生物学的粒子の集団を放出できるように、結合した結合剤－生物学的粒子複合体を結合剤に特異的な遊離リガンドと接触させることによって溶離することができる。

【0177】

いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、生物学的粒子の表面タンパク質バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子の表面タンパク質バイオマーカーは、１つ以上のテトラスパニン（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２）、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、及び／または生物学的粒子によって受け継がれる他の細胞表面マーカーを含む。いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子集団の純度は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、同種である。

【0178】

いくつかの実施形態によれば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を低分子非コードＲＮＡまたは精製生物学的粒子にカプセル化されたＤＮＡを含むＲＮＡ種を単離、同定、及び定量することができる。いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡ、またはＤＮＡは、次世代シーケンシングによって単離、同定、定量し、ヒートマップで表示することができる。簡潔に、次世代シークエンシングは、自動プロセスで一度に個人の全ゲノムのヌクレオチド配列を決定するために使用されるハイスループットな方法である。シーケンシングによって同定されたｍｉＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡ、またはＤＮＡは、統計分析後に生成されたデータ値が色（「ヒートマップ」）として表されるマップまたは図の形式でデータの表現を使用して表示される。

【0179】

いくつかの実施形態によれば、単離された生物学的粒子のｍｉＲＮＡ内容物を含む低分子非コードＲＮＡを、次世代シークエンシング及びヒートマップ生成によって対照被験者（即ち、ウイルスに感染しない正常な健康な被験者、ウイルスに感染して軽症化した対照被験者、ウイルスに感染して重症化した対照被験者である）と比較する。いくつかの実施形態によれば、血清生物学的粒子からの全ＲＮＡを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２患者の軽症サンプル群と重症サンプル群の間で１０個のｍｉＲＮＡが差次的に発現され、それらは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５、及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃである。いくつかの実施形態によれば、全血清からの全ＲＮＡを使用する重症ＣＯＶＩＤ感染症のｍｉＲＮＡマーカーは、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０－５ｐ、もしくはｈｓａ－ｍｉＲ－６２９、またはその両方を含む。

【0180】

いくつかの実施形態によれば、患者の重症ウイルス感染症のリスクを決定できるように、カーゴプロファイルの変化倍数の差（約０．７５（減少）から約１．５（増加）までの範囲）は、統計的に評価され、ｐ値＜０．０５に基づいて同定される。いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の低分子非コードＲＮＡまたはタンパク質のカーゴプロファイルは、コロナウイルスに感染して重症化した対照被験者からのカーゴプロファイルよりも約１．５倍低いまたは１．５倍高い。

【0181】

いくつかの実施形態によれば、その療法は、液体の静脈内投与、酸素補給、ネブライザーによる蒸気投与などの支持療法を含む。いくつかの実施形態によれば、その療法は、抗ウイルス剤、免疫調節剤、またはその両方を含む医薬組成物を含む。

【0182】

いくつかの実施形態によれば、抗ウイルス剤は、ウイルスの侵入を阻害するか、ウイルス量を減少させるか、その両方を行う。いくつかの実施形態によれば、抗ウイルス剤は、アシクロビル、ガンシクロビル、ホスカネット、リバビリン、アマンタジン、アジドデオキシチミジン／ジドブジン）、ネビラピン、テトラヒドロイミダゾベンゾジアゼピノン（ＴＩＢＯ）化合物、エファビレンツ、レムデシビル、ロピナビル／リトナビル、ウミフェノビル、ファビピラビル、イベルメクチン、及びデラビルジンから選択される。

【0183】

いくつかの実施形態によれば、免疫調節剤は、グルココルチコイドまたは遺伝子組み換えインターフェロンである。いくつかの実施形態によれば、グルココルチコイドは、プレドニゾン、デキサメタゾン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、またはそれらの組み合わせなどのコルチコステロイドである。

【0184】

別の態様によれば、本開示は、重症ＳＡＲＳＣｏＶ－２感染症（ＣＯＶＩＤ）のリスクがある患者における回復期血漿療法の治療効果を高めるための方法を提供し、該方法は、

【0185】

ａ）回復期の被験者の回復期血漿から精製生物学的粒子集団を調製することであって、該調製することは、

【0186】

（１）回復期の被験者から高い抗ＳＡＲＳＣｏＶ－２ ＩｇＧ力価を含む回復期血清を取得すること、

【0187】

（２）回復期血清を１つ以上の生物学的粒子の表面抗原に対する結合剤と接触させることであって、結合剤が核酸に結合され、核酸が固体支持体に固定化される、該接触させること、による上記調製することと、

【0188】

ｂ）結合剤によって結合された生物学的粒子を生体サンプルから単離することと、

【0189】

ｃ）（ｂ）における結合剤に結合した生物学的粒子を放出することと、

【0190】

（ｄ）結合した生物学的粒子を結合剤から溶離し、遊離の精製生物学的粒子の集団を形成することと、

【0191】

（ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する精製エキソソーム集団の中和力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと

【0192】

（ｆ）高力価中和生物学的粒子を含む回復期血清を患者に投与することとを含む。

【0193】

いくつかの実施形態によれば、該方法は、プールされた異種の生物学的粒子の集団を提供するための、最初の限外濾過ステップ、最初の超遠心分離ステップ、またはその両方を含む。

【0194】

いくつかの実施形態によれば、回復期血清サンプルは、正常な健康な対照被験者（重症ウイルス感染の症状または他の証拠がない被験者、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しない対照被験者を意味する）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染して（ＰＣＲなどによって確認）、軽症化して回復した被験者、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染して（ＰＣＲなどによって確認）、重症化して回復した被験者に由来する。いくつかの実施形態によれば、回復期血清サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合タンパク質（ＲＢＤ）に対する抗体の高力価を有する。いくつかの実施形態によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合タンパク質（ＲＢＤ）に対する抗体の力価は、少なくとも回復期血清の１：１０，０００希釈で検出可能である。いくつかの実施形態によれば、回復期血清サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合タンパク質（ＲＢＤ）に対する抗体の低力価を有する。いくつかの実施形態によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合タンパク質（ＲＢＤ）に対する抗体の低力価を含む血清は、回復期血清の１：１０，０００希釈未満から定量限界未満までの範囲に及ぶ。

【0195】

いくつかの実施形態によれば、生体サンプルは、体液を含む。体液は、例えば、血液、尿、精子（精液）、膣分泌物、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、胸膜液（胸腔洗浄）、心嚢液、腹水、羊水、唾液、鼻水、耳漏、胃液、母乳、ふん便、汗、涙、乳頭吸引液、または他の分泌された体液を含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、体液は、血液（全血、血清、もしくは血漿）、ＣＳＦ、またはリンパ液などの循環／分泌体液である。いくつかの実施形態によれば、生体サンプルは、生体組織（例えば、病変組織）を含む。

【0196】

いくつかの実施形態によれば、特定のバイオマーカー（複数可）を含む生物学的粒子が選択される生体液は、再利用可能であり、例えば、それ以降のラウンドでは、生体液に悪影響を与えることなく、他のバイオマーカーの選択、ｍｉＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡの選択、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、脂質、またはそれらの組み合わせの単離などを行う。

【0197】

いくつかの実施形態によれば、結合剤は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはそれらの組み合わせ）、ポリペプチド（例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマーポリペプチド、もしくはそれらの組み合わせ）、または生分解性ポリマーを含む。

【0198】

いくつかの実施形態によれば、結合剤は、固体支持体に直接固定化される。いくつかの実施形態によれば、結合剤は、固体支持体に間接的に固定化される。いくつかのかかる実施形態では、結合剤は、核酸に結合され、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態によれば、核酸は、クリック化学によって固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態によれば、結合剤は、生物学的粒子抗原に特異的な抗体である。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子抗原は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、及び／または生物学的粒子によって受け継がれる他の細胞表面マーカーのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、該方法は、少量のバイオマーカーを検出するために生物学的粒子の亜集団を濃縮するための追加の細胞特異的抗体を含む。いくつかの実施形態によれば、該方法は、本明細書でテストしたものよりも大量の生体液物質の入力を含む。いくつかの実施形態によれば、該方法は、ｑＰＣＲ検知閾値を向上させるための準備ステップを含む。いくつかの実施形態によれば、該方法は、少量のバイオマーカーを検出するために生物学的粒子の亜集団を濃縮するための追加の細胞特異的抗体、より大量の生体液物質の入力、及びｑＰＣＲ検知閾値を向上させるための準備ステップを含む。

【0199】

いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子抗原に特異的な抗体は、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）エステル、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）分子、２－ＩＴ（２－イミノチオラン）、ＭＢＳ（３－マレイミド安息香酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、スルホ－ＳＭＣＣ、またはそれらの誘導体で活性化される。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子抗原に特異的な抗体は、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）エステルで活性化される。いくつかの実施形態によれば、ＤＢＣＯ修飾抗体は、クリック化学によってＤＮＡリンカーに結合される。いくつかの実施形態によれば、抗体－ＤＮＡリンカーコンジュゲートは、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルプレートに結合される。いくつかの実施形態によれば、ウェルプレートは、ＲＮＡｓｅ Ａで前処理される。

【0200】

いくつかの実施形態によれば、単離／分離ステップは、洗浄を含み、そのため、結合剤に結合した生物学的粒子から未結合物質を分離する。

【0201】

いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、固体支持体から酵素的に放出される。いくつかの実施形態によれば、その放出は、１つ以上の結合剤と固体支持体との間の結合を酵素的に切断することを含む。いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、結合剤に結合した核酸の酵素的切断によって放出される。いくつかの実施形態によれば、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡは、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドは、ウラシル、制限部位配列、またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖である。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖が二本鎖になる場合、該酵素は、リボ核酸ヌクレオチドもしくは特定の制限部位配列、または特定のＲＮＡ鎖もしくはＤＮＡ鎖で核酸を特異的に切断する。いくつかの実施形態によれば、リボ核酸ヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドである。いくつかの実施形態によれば、核酸をウラシルヌクレオチドで切断する酵素は、ウラシルグリコシラーゼである。いくつかの実施形態によれば、特定の核酸配列で切断する酵素は、制限酵素である。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を特異的に切断する酵素は、制限エンドヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅ－Ｈである。

【0202】

いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、鎖置換によって放出される。いくつかの実施形態によれば、核酸の第１既存鎖は、核酸の第１鎖または第２鎖に対する相補的な侵入鎖、及び鎖置換活性を含む酵素により、核酸の第２基質鎖から分離される。いくつかの実施形態によれば、鎖置換活性を含む酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、またはヘリカーゼである。いくつかの実施形態によれば、抗体に結合したＤＮＡ鎖を損傷することなくプラットフォームから抗体を放出できるように、抗体に結合したＤＮＡ領域に相補的なオリゴヌクレオチドを使用したポリメラーゼ連鎖反応を使用して、アニーリングされたＤＮＡ鎖を分離する。

【0203】

いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子は、結合剤から溶離される。例えば、生物学的粒子は、精製生物学的粒子の集団を形成するできるように、結合した結合剤－生物学的粒子複合体を結合剤に特異的な遊離リガンドと接触させることによって溶離される。

【0204】

いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、エキソソーム表面タンパク質バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子の表面タンパク質バイオマーカーは、テトラスパニン（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２）、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、及び／または生物学的粒子によって受け継がれる他の細胞表面マーカーのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、精製エキソソームの集団の純度は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、同種である。

【0205】

いくつかの実施形態によれば、その中和は、回復期血清由来の単離された精製生物学的粒子をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞株とｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで決定される。ウイルスの感染性を妨げる物質の存在及び大きさは、適切な期間、例えば、１２時間、２４時間、３６時間及び／または７２時間後のウイルス粒子の生成を測定することによって決定される。いくつかの実施形態によれば、ネオングリーンのＳＡＲＳＣｏＶ－２レポーターウイルスに感染した細胞を計数し、陰性対照（回復期の精製生物学的粒子を含まない感染細胞）と比較することができる。いくつかの実施形態によれば、蛍光によって定量できるウイルス粒子の生成は、陰性対照と比較した場合、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少する。いくつかの実施形態によれば、ＡＣＥ２レセプターを含む回復期ＥＶの中和活性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和に役割を果たす。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子は、ウイルスタンパク質を表面に保持しながら感染細胞からウイルスタンパク質を除去することに効果的であり得、従って、免疫系への抗原の提示を可能にする。

【0206】

いくつかの実施形態によれば、中和精製生物学的粒子を含む回復期血清は、回復期血漿療法単独による治療と比較した場合、回復期血漿療法の有効性を約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、及び約１０倍高めることができる。

【0207】

いくつかの実施形態によれば、重度ＳＡＲＳＣｏＶ－２感染症に苦しむ患者は、付加療法で治療され得る。いくつかの実施形態によれば、付加療法は、液体の静脈内投与、酸素補給、ネブライザーによる蒸気投与などの支持療法を含む。

【0208】

いくつかの実施形態によれば、付加療法は、抗ウイルス剤、免疫調節剤、またはその両方を含む医薬組成物を含む。いくつかの実施形態によれば、抗ウイルス剤は、ウイルスの侵入を阻害するか、ウイルス量を減少させるか、その両方を行う。いくつかの実施形態によれば、抗ウイルス剤は、アシクロビル、ガンシクロビル、ホスカネット、リバビリン、アマンタジン、アジドデオキシチミジン（ジドブジン）、ネビラピン、テトラヒドロイミダゾベンゾジアゼピノン（ＴＩＢＯ）化合物、エファビレンツ、レムデシビル、ロピナビル／リトナビル、ウミフェノビル、ファビピラビル、イベルメクチン、及びデラビルジンから選択される。

【0209】

いくつかの実施形態によれば、免疫調節剤は、グルココルチコイドまたは遺伝子組み換えインターフェロンである。いくつかの実施形態によれば、グルココルチコイドは、コルチコステロイドであり、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、またはそれらの組み合わせである。

【0210】

別の態様によれば、本開示は、重症コロナウイルス感染症の患者を治療する方法を更に提供し、該方法は、

【0211】

（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで被験者からの精製生物学的粒子の集団の中和力価を決定することであって、該決定することは、

【0212】

（１）生物学的粒子を含む生体サンプルを被験者から取得すること、

【0213】

（２）被験者からの細胞外小胞を含む生体サンプルを、１つ以上の生物学的粒子の表面抗原に対する結合剤と接触させることであって、結合剤が核酸に結合され、核酸が固体支持体に固定化される、該接触させること、

【0214】

（３）結合剤によって結合された生物学的粒子を洗浄によって生体サンプルから単離すること、

【0215】

（４）上記（３）における結合剤に結合した生物学的粒子を放出すること、

【0216】

（５）結合した生物学的粒子を結合剤から溶離し、遊離の精製生物学的粒子の集団を形成すること、

【0217】

（６）精製生物学的粒子の集団の中和力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定すること、による上記中和力価を決定することと、

【0218】

（ｂ）被験者からの精製生物学的粒子の集団の中和力価がｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルス感染を中和するには不十分である場合、ＡＣＥ２レセプターを含む精製生物学的粒子を中和することを含む回復期血漿療法を受ける被験者を選択することと、

【0219】

（ｃ）回復期の被験者の回復期血漿から精製生物学的粒子の集団を調製することであって、該調製することは、

【0220】

（ｉ）回復期の被験者から高い抗ＳＡＲＳＣｏＶ－２ ＩｇＧ力価を含む回復期血清を取得すること、

【0221】

（ｉｉ）回復期血清を、１つ以上の生物学的粒子の表面抗原に対する結合剤と接触させること、

【0222】

（ｉｉｉ）結合剤によって結合された生物学的粒子を洗浄によって生体サンプルから単離すること、

【0223】

（ｉｖ）上記（ｂ）における結合剤に結合した生物学的粒子を放出すること、

【0224】

（ｖ）結合した生物学的粒子を結合剤から溶離し、遊離の精製生物学的粒子の集団を形成すること、による上記調製することと、

【0225】

（ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するステップ（ｖ）における精製生物学的粒子の集団の中和力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することと、

【0226】

（ｅ）ステップ（ｄ）における中和精製生物学的粒子または中和生物学的粒子を含む回復期血清を被験者に投与することとを含む。

【0227】

いくつかの実施形態によれば、該方法は、プールされた異種の生物学的粒子の集団を提供するための、最初の限外濾過ステップ、最初の超遠心分離ステップ、またはその両方を含む。

【0228】

いくつかの実施形態によれば、生体サンプルは、体液を含む。体液は、例えば、血液、尿、精子（精液）、膣分泌物、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、胸膜液（胸腔洗浄）、心嚢液、腹水、羊水、唾液、鼻水、耳漏、胃液、母乳、ふん便、汗、涙、乳頭吸引液、または他の分泌された体液を含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、体液は、血液（全血、血清、もしくは血漿）、ＣＳＦ、またはリンパ液などの循環／分泌体液である。いくつかの実施形態によれば、生体サンプルは、生体組織（例えば、病変組織）を含む。

【0229】

いくつかの実施形態によれば、特定のバイオマーカー（複数可）を含む生物学的粒子が選択される生体液は、再利用可能であり、例えば、それ以降のラウンドでは、生体液に悪影響を与えることなく、他のバイオマーカーの選択、ｍｉＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡの選択、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、脂質、またはそれらの組み合わせの単離などを行う。

【0230】

いくつかの実施形態によれば、結合剤は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはそれらの組み合わせ）、ポリペプチド（例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマーポリペプチド、もしくはそれらの組み合わせ）、または生分解性ポリマーを含む。

【0231】

いくつかの実施形態によれば、結合剤は、固体支持体に直接固定化される。いくつかの実施形態によれば、結合剤は、固体支持体に間接的に固定化される。いくつかのかかる実施形態では、結合剤は、核酸に結合され、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態によれば、核酸は、クリック化学によって固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態によれば、結合剤は、生物学的粒子抗原に特異的な抗体である。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子抗原は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、及び／または生物学的粒子によって受け継がれる他の細胞表面マーカーのうちの１つ以上である。

【0232】

いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子抗原に特異的な抗体は、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）エステル、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）分子、２－ＩＴ（２－イミノチオラン）、ＭＢＳ（３－マレイミド安息香酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、スルホ－ＳＭＣＣ、またはそれらの誘導体で活性化される。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子抗原に特異的な抗体は、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）エステルで活性化される。いくつかの実施形態によれば、ＤＢＣＯ修飾抗体は、クリック化学によってＤＮＡリンカーに結合される。いくつかの実施形態によれば、抗体－ＤＮＡリンカーコンジュゲートは、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルプレートに結合される。いくつかの実施形態によれば、ウェルプレートは、ＲＮＡｓｅ Ａで前処理される。

【0233】

いくつかの実施形態によれば、単離／分離ステップは、洗浄を含み、そのため、結合剤に結合した生物学的粒子から生体サンプル内の未結合物質を分離する。

【0234】

いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、固体支持体から酵素的に放出される。いくつかの実施形態によれば、その放出は、１つ以上の結合剤と固体支持体との間の結合を酵素的に切断することを含む。いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、結合剤に結合した核酸の酵素的切断によって放出される。いくつかの実施形態によれば、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡは、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドは、ウラシル、制限部位配列、またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖である。いくつかの実施形態によれば、該酵素は、リボ核酸ヌクレオチドで核酸を特異的に切断する。いくつかの実施形態によれば、リボ核酸ヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドである。いくつかの実施形態によれば、核酸をウラシルヌクレオチドで切断する酵素は、ウラシルグリコシラーゼである。いくつかの実施形態によれば、特定の核酸配列で切断する酵素は、制限酵素である。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を特異的に切断する酵素は、制限エンドヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅ－Ｈである。

【0235】

いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、鎖置換によって放出される。いくつかの実施形態によれば、核酸の第１既存鎖は、核酸の第１鎖または第２鎖に対する相補的な侵入鎖、及び鎖置換活性を含む酵素により、核酸の第２基質鎖から分離される。いくつかの実施形態によれば、鎖置換活性を含む酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、またはヘリカーゼである。いくつかの実施形態によれば、抗体に結合したＤＮＡ鎖を損傷することなくプラットフォームから抗体を放出できるように、抗体に結合したＤＮＡ領域に相補的なオリゴヌクレオチドを使用したポリメラーゼ連鎖反応を使用して、アニーリングされたＤＮＡ鎖を分離する。

【0236】

いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子は、結合剤から溶離される。例えば、生物学的粒子は、精製生物学的粒子の集団を形成するできるように、結合した結合剤－生物学的粒子複合体を結合剤に特異的な遊離リガンドと接触させることによって溶離することができる。

【0237】

いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、生物学的粒子の表面タンパク質バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子の表面タンパク質バイオマーカーは、テトラスパニン（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２）、Ａｌｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、及び／または生物学的粒子によって受け継がれる他の細胞表面マーカーのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子集団の純度は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。いくつかの実施形態によれば、精製生物学的粒子の集団は、同種である。

【0238】

いくつかの実施形態によれば、その中和は、回復期血清由来の単離された精製生物学的粒子をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで決定される。ウイルスの感染性を妨げる物質の存在及び大きさは、適切な期間、例えば、１２時間、２４時間、３６時間及び７２時間後のウイルス粒子の生成を測定することによって決定される。いくつかの実施形態によれば、ネオングリーンのＳＡＲＳＣｏＶ－２レポーターウイルスに感染した細胞を計数し、陰性対照（回復期の精製生物学的粒子を含まない感染細胞）と比較することができる。いくつかの実施形態によれば、中和と見なされるには、蛍光によって定量できるウイルス粒子の生成は、陰性対照と比較した場合、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少する。いくつかの実施形態によれば、ＡＣＥ２レセプターを含む回復期ＥＶの中和活性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和に役割を果たす。いくつかの実施形態によれば、生物学的粒子は、ウイルスタンパク質を表面に保持しながら感染細胞からウイルスタンパク質を除去することに効果的であり得、従って、免疫系への抗原の提示を可能にする。

【0239】

いくつかの実施形態によれば、回復期血清サンプルは、正常な健康な対照被験者（重症ウイルス感染の症状または他の証拠がない被験者、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しない対照被験者を意味する）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染して軽症化して回復した被験者、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染して重症化して回復した被験者に由来する。

【0240】

いくつかの実施形態によれば、回復期血清サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合タンパク質（ＲＢＤ）に対する抗体の高力価を有する。いくつかの実施形態によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合タンパク質（ＲＢＤ）に対する抗体の力価は、少なくとも回復期血清の１：１０，０００希釈で検出可能である。いくつかの実施形態によれば、回復期血清サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合タンパク質（ＲＢＤ）に対する抗体の低力価を有する。いくつかの実施形態によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合タンパク質（ＲＢＤ）に対する抗体の低力価を含む血清の力価は、１：１０，０００希釈未満から定量限界未満までの範囲に及ぶ。

【0241】

いくつかの実施形態によれば、本開示は、被験者からの生体サンプルから精製細胞の集団を調製する方法を提供し、該方法は、

【0242】

ａ）精製細胞の集団を調製することであって、該調製することは、

【0243】

（１）細胞を含む生体サンプルを被験者から取得すること、

【0244】

（２）細胞を含む被験者からの生体サンプルを、１つ以上の細胞表面抗原に対する結合剤と接触させることであって、結合剤がリンカーによって核酸に結合され、核酸が固体支持体に固定化される、該接触させること、による上記調製することと、

【0245】

ｂ）結合剤によって結合された細胞を生体サンプルから単離することと、

【0246】

ｃ）結合剤に結合した細胞を放出することと、

【0247】

ｄ）結合した細胞を結合剤から溶離し、精製細胞の集団を形成することとを含む。

【0248】

いくつかの実施形態によれば、細胞の集団は、非真核生物種及び真核生物種（例えば、ヒト、マウス、ラット、サルなど）、健康な正常組織（例えば、血液、組織など）の細胞（内皮細胞、上皮細胞、Ｔ細胞・線維芽細胞、脂肪細胞、神経細胞、及び特定の腫瘍細胞の亜集団を含むが、それらに限定されない）に由来する。いくつかの実施形態によれば、細胞は、ヒト患者の正常組織及び病変組織、マウスの同所性／異種移植片／ＰＤＸ臓器、血液、または組織培養に由来することができ、例えば、新しいクローンを同定する場合、フローサイトメトリーにかけるには感度が高すぎる固有の細胞、または濃縮する必要がある細胞を精製する場合などで、固有の表面マーカーをターゲットとするＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲを使用して精製することができる。

【0249】

いくつかの実施形態によれば、該方法は、最初のプールされた異種の細胞の集団を提供するための、最初の限外濾過ステップまたは超遠心分離ステップを含む。いくつかの実施形態によれば、生体サンプルは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで調製される。

【0250】

いくつかの実施形態によれば、生体サンプルは、体液を含む。いくつかの実施形態によれば、体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、尿、ふん便、汗、涙、乳頭吸引液、もしくは精液、または分泌された生体液を含む。いくつかの実施形態によれば、体液は、循環／分泌体液である。いくつかの実施形態によれば、循環体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、またはリンパ液である。

【0251】

いくつかの実施形態によれば、該方法は、ハイスループットアッセイであり、それは、一度に複数のサンプルの精製を可能にし、即ち、２４、９６、３８４ウェルプレート形式または他のマルチウォール形式と互換性がある。いくつかの実施形態によれば、特定のバイオマーカー（複数可）を含む細胞が選択される生体液は、再利用可能であり、例えば、それ以降のラウンドでは、生体液に悪影響を与えることなく、他のバイオマーカーの選択、ｍｉＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡの選択、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、脂質、またはそれらの組み合わせの単離などを行う。

【0252】

いくつかの実施形態によれば、結合剤は、細胞の表面抗原に特異的な抗体である。いくつかの実施形態によれば、細胞の表面抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ４６、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１３８、ＣＤ１５１、ＡＬｉｘ、ＡＣＥ－２、Ｔｉｍ４、ＰＬＡＰ、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、カベオリン－１、サイトケラチン、ＥＰＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、Ｐ６３、異種細胞表面ポリペプチド及び／または他の細胞の表面マーカーのうちの１つ以上を含む。このような抗体の市販供給源の例としては、ＣＤ４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃２７５２０）、ＣＤ８（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃８１５７５）、ＣＤ４６（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ２７１８７１）、ＣＤ１３８（Ａｂｃａｍ＃ａｂ２４２３９４）、ＣＤ１５１（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ２７４０６）、アディポネクチン（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ２２７０５１）、及びＥＰＣＡＭ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃４６４０３）が挙げられるが、それらに限定されない。このように、精製プロセスは、ウイルスに感染したもの、癌細胞由来のもの、器官由来のものなど、必要に応じて細胞の特定の集団を選択し、それらの内容物を走査するように調整することができる。いくつかの実施形態によれば、該方法は、少量のバイオマーカーを検出するために細胞の亜集団を濃縮するための追加の細胞特異的抗体を含む。いくつかの実施形態によれば、該方法は、本明細書でテストしたものよりも大量の生体液物質の入力を含む。いくつかの実施形態によれば、該方法は、ｑＰＣＲ検知閾値を向上させるための準備ステップを含む。いくつかの実施形態によれば、該方法は、少量のバイオマーカーを検出するために細胞の亜集団を濃縮するための追加の細胞特異的抗体、より大量の生体液物質の入力、及びｑＰＣＲ検知閾値を向上させるための準備ステップを含む。

【0253】

いくつかの実施形態によれば、精製細胞の集団の純度は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。いくつかの実施形態によれば、精製細胞の集団は、同種である。

【0254】

いくつかの実施形態によれば、異種の細胞の表面ポリペプチドは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）によって発現される。

【0255】

いくつかの実施形態によれば、１つ以上の細胞表面抗原に結合する結合剤は、抗体、抗体結合フラグメント、またはアプタマーである。いくつかの実施形態によれば、アプタマーは、核酸またはポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態によれば、核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡは、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドは、ウラシルである。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡは、制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態によれば、核酸は、エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅ（ＲＮａｓｅ－Ｈ）によって分解され得るＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖である。いくつかの実施形態によれば、核酸は、非天然ヌクレオチドを含む。

【0256】

いくつかの実施形態によれば、核酸は、核酸の第１末端に結合部分を含み、核酸の第２末端に結合部分を含み、ここで、核酸の第１末端の結合部分と核酸の第２末端の結合部分は異なる。いくつかの実施形態によれば、核酸の第１末端における結合部分は、アビジン、ストレプトアビジン、またはカルボキシル結合部分である。いくつかの実施形態によれば、結合部分は、ビオチンである。いくつかの実施形態によれば、核酸の第２末端における結合部分は、アミン部分である。いくつかの実施形態によれば、アミン部分は、アジドである。

【0257】

いくつかの実施形態によれば、１つ以上の細胞の表面抗原に対する結合剤は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）分子、２－ＩＴ（２－イミノチオラン）、ＭＢＳ（３－マレイミド安息香酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、スルホ－ＳＭＣＣ、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態によれば、ＤＢＣＯ修飾抗体は、クリック化学によってＤＮＡリンカーに結合される。いくつかの実施形態によれば、抗体－ＤＮＡリンカーコンジュゲートは、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルプレートに結合される。いくつかの実施形態によれば、ウェルプレートは、ＲＮＡｓｅ Ａで前処理される。

【0258】

いくつかの実施形態によれば、単離／分離ステップは、洗浄を含み、そのため、結合剤に結合した細胞から生体サンプル内の未結合物質を分離する。いくつかの実施形態によれば、結合剤に結合した細胞は、固体支持体から酵素的に放出される。いくつかの実施形態によれば、その放出は、１つ以上の結合剤と固体支持体との間の結合を酵素的に切断することを含む。いくつかの実施形態によれば、精製細胞の集団は、結合剤に結合した核酸の酵素的切断によって放出される。いくつかの実施形態によれば、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡは、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のリボ核酸ヌクレオチドは、ウラシル、制限部位配列、またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖である。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖が二本鎖になる場合、該酵素は、リボ核酸ヌクレオチドもしくは特定の制限部位配列、または特定のＲＮＡ鎖もしくはＤＮＡ鎖で核酸を特異的に切断する。いくつかの実施形態によれば、リボ核酸ヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドである。いくつかの実施形態によれば、核酸をウラシルヌクレオチドで切断する酵素は、ウラシルグリコシラーゼである。いくつかの実施形態によれば、特定の核酸配列を切断する酵素は、制限酵素である。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を特異的に切断する酵素は、制限エンドヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅ－Ｈである。

【0259】

いくつかの実施形態によれば、精製細胞の集団は、鎖置換によって放出される。いくつかの実施形態によれば、核酸の第１既存鎖は、核酸の第１鎖または第２鎖に対する相補的な侵入鎖、及び鎖置換活性を含む酵素により、核酸の第２基質鎖から分離される。いくつかの実施形態によれば、鎖置換活性を含む酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、またはヘリカーゼである。いくつかの実施形態によれば、抗体に結合したＤＮＡ鎖を損傷することなくプラットフォームから抗体を放出できるように、抗体に結合したＤＮＡ領域に相補的なオリゴヌクレオチドを使用したポリメラーゼ連鎖反応を使用して、アニーリングされたＤＮＡ鎖を分離する。

【0260】

いくつかの実施形態によれば、結合剤は、固体支持体に直接固定化される。いくつかの実施形態によれば、結合剤は、固体支持体に間接的に固定化される。いくつかのかかる実施形態では、結合剤は、核酸に結合され、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態によれば、核酸は、クリック化学によって固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態によれば、固体支持体は、ウェルプレート、ポリマー、または表面である。

【0261】

いくつかの実施形態によれば、単離された細胞の放出は、

【0262】

（ｉ）核酸を酵素的に切断すること、または

【0263】

（ｉｉ）核酸の第１鎖または第２鎖に相補的な核酸、及び支持体から抗体を放出するための鎖置換活性を有する酵素による鎖置換により、抗体に結合した核酸の第１鎖を、支持体に結合した核酸の第２鎖から置換すること、または

【0264】

（ｉｉｉ）抗体に結合したＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応により、抗体に結合したＤＮＡ鎖を損傷することなく、アニーリングされたＤＮＡ鎖を分離して、プラットフォームから抗体を放出することを含む。

【0265】

いくつかの実施形態によれば、酵素的切断は、ウラシルグリコシラーゼによって行われる。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断は、制限酵素を使用して行われる。いくつかの実施形態によれば、酵素的切断は、エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅを使用して行われる。

【0266】

いくつかの実施形態によれば、鎖置換活性を有する酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、またはヘリカーゼである。

【0267】

いくつかの実施形態によれば、精製細胞の集団は、非真核細胞、真核細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態によれば、真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ヒト以外の霊長類、ネコ科の細胞である。いくつかの実施形態によれば、精製細胞の集団は、健康な被験者または疾患に罹患する被験者に由来する。いくつかの実施形態によれば、その疾患は、癌、ウイルス感染、胎盤異常、炎症、及び他の病状を含む。いくつかの実施形態によれば、細胞は、内皮細胞、上皮細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、神経細胞、腫瘍細胞、血液細胞、または心臓細胞である。

【0268】

いくつかの実施形態によれば、ウイルス感染は、重症コロナウイルス感染症である。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである。いくつかの実施形態によれば、重症コロナウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるものである。

【0269】

いくつかの実施形態によれば、細胞の集団は、（ａ）非真核生物種及び真核生物種、（ｂ）健康な正常組織もしくは病変組織、（ｃ）マウスの同所性／異種移植片／ＰＤＸ臓器、（ｄ）血液、または、（ｅ）組織培養に由来する。

【0270】

医薬製剤
本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、標的の病気もしくは疾患を予防し、強度を低下させ、治癒し、または他の方法で治療するために使用される組成物を指す。一般に、医薬組成物は、活性薬剤と、薬学的に許容される担体とを含む。

【0271】

本明細書で使用される「担体」という用語は、生物に重大な刺激を引き起こさず、記載された発明の組成物の活性化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない材料を指す。担体は、治療を受ける哺乳動物への投与に適したものにするために、十分に高い純度であり、十分に低い毒性を持つ必要がある。担体は、不活性であり得るし、薬学的利点、美容上の利点、またはその両方を有し得る。「賦形剤」、「担体」、または「ビヒクル」という用語は、本明細書に記載の薬学的に許容される組成物の製剤化及び投与に適した担体物質を指し、それらは、互換的に使用することができる。本明細書で有用な担体及びビヒクルは、非毒性であり、他の成分と相互作用しない、該技術分野で知られている任意のそのような物質を含む。担体は、液体でも固体でもよく、活性薬剤及び所与の組成物の他の成分と組み合わせた場合に所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画された投与方法を念頭に置いて選択される。

【0272】

「薬学的に許容される担体」というフレーズは、該技術分野で認識される。それは、本発明の単離されたＥＶが安定して生物学的に利用可能な状態を保つ、医薬品の投与に従来使用可能な任意の実質的に非毒性の担体を意味するために使用される。薬学的に許容される担体は、治療される哺乳動物への投与に適できるように、十分に高純度であり、十分に毒性が低い必要がある。更に、活性薬剤の安定性と生物学的利用能を維持する必要がある。薬学的に許容される担体は、液体でも固体でもよく、活性薬剤及び所与の組成物の他の成分と組み合わせた場合に所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画された投与方法を念頭に置いて選択される。担体の例としては、対象薬剤を１つの器官または体の一部から別の器官または体の一部に運ぶまたは輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化物質が挙げられる。各担体は、配合物の他の成分と適合し、患者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として機能できる物質の例としては、糖（例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース）、澱粉（例えば、トウモロコシ澱粉及びジャガイモ澱粉）、セルロース及びその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース）、粉末トラガカント、モルト、ゼラチン、タルク、賦形剤（例えば、ココアバター及び坐薬ワックス）、油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油）、グリコール（例えば、プロピレングリコール）、ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール）、エステル（例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル）、寒天、緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム）、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンガー溶液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、及び医薬配合物に使用される他の非毒性適合物質が挙げられる。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、発熱物質を含まない滅菌水である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、乳酸リンゲル液であり、乳酸加リンゲル液としても知られている。

【0273】

湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、保存剤及び酸化防止剤も組成物中に存在することができる

【0274】

薬学的に許容される酸化防止剤の例としては、水溶性酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸ナトリウムなど）、油溶性酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル及びアルファ－トコフェロールなど）、金属キレート剤、（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）が挙げられる。

【0275】

具体的な投与方法は、適応症によって異なる。特定の投与経路及び用法の選択は、最適な臨床反応を得るために、臨床医に知られている方法に従って臨床医によって調整または滴定されるべきである。投与される活性薬剤の量は、意図された治療の利益を提供するのに十分な量である。投与される用量は、治療対象の特徴、例えば、治療される特定の哺乳動物またはヒト、年齢、体重、健康状態、併用療法の種類（もしあれば）、及び治療の頻度に依存し、当業者（例えば、臨床医）によって容易に決定することができる。

【0276】

本明細書で使用される「非経口」という用語及び他の文法的形式は、口または消化管以外の体内で生じる物質の投与を指す。例えば、本明細書で使用される「非経口」という用語は、例えば、皮下（即ち、皮膚の下への注射）、筋肉内（即ち、筋肉への注射）、静脈内（即ち、静脈への注射）、くも膜下腔内（即ち、脊髄周囲もしくは脳のクモ膜下腔への注射）を含む、注射（即ち、注射による投与）、または点滴技術による体内への導入を指す。

【0277】

いくつかの実施形態では、本開示による組成物は、数回投与され、または担当医師の判断で必要に応じて投与される。そのような一実施形態では、組成物は、１回目の点滴日に投与され、必要に応じて、２回目の点滴日、３回目の点滴日、４回目の点滴日、５回目の点滴日、６回目の点滴日、７回目の点滴日、８回目の点滴日、９回目の点滴日、及び１０回目の点滴日などに投与される。

【0278】

カテーテルを通じて注入される場合、本開示の生物学的粒子の治療効果は、カテーテルを通過する際にその効力を維持する医薬組成物に依存する。

【0279】

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、乾燥粉末、懸濁液、または溶液から選択される形態で医薬組成物をエアロゾル化することを含む。いくつかの実施形態によれば、組成物は、溶液である。いくつかの実施形態によれば、組成物は、懸濁液である。いくつかの実施形態によれば、組成物は、乾燥粉末である。吸入による投与の場合、本開示によって使用するための組成物は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスなどの適切な噴射剤を使用して、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するための弁を提供することによって用量単位を決定することができる。吸入具または吸入器で使用するための、例えば、ゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物と乳糖または澱粉などの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有して製剤化することができる。いくつかの実施形態によれば、吸入送達装置は、ネブライザー、定量吸入器、または乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）である。いくつかの実施形態によれば、呼吸に適した粒子のサイズは、包括的で約１～１０ミクロンの範囲である。いくつかの実施形態によれば、経鼻投与（吸入）用の粒子のサイズは、包括的で１０～５００μＭの範囲である。

【0280】

いくつかの実施形態によれば、本開示の医薬組成物は、記載された中和精製生物学的粒子以外の１つ以上の治療薬を含む。例えば、いくつかの実施形態によれば、付加療法は、抗ウイルス剤、免疫調節剤、またはその両方を含む医薬組成物を含み得る。いくつかの実施形態によれば、抗ウイルス剤は、ウイルスの侵入を阻害するか、ウイルス量を減少させるか、その両方を行う。いくつかの実施形態によれば、抗ウイルス剤は、アシクロビル、ガンシクロビル、ホスカネット、リバビリン、アマンタジン、アジドデオキシチミジン／ジドブジン）、ネビラピン、テトラヒドロイミダゾベンゾジアゼピノン（ＴＩＢＯ）化合物、エファビレンツ、レムデシビル、ロピナビル／リトナビル、ウミフェノビル、ファビピラビル、イベルメクチン、及びデラビルジンから選択される。いくつかの実施形態によれば、免疫調節剤は、グルココルチコイドまたは遺伝子組み換えインターフェロンである。いくつかの実施形態によれば、グルココルチコイドは、プレドニゾン、デキサメタゾン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、及びそれらの組み合わせから選択されるコルチコステロイドである。

【0281】

前述の実施形態によれば、医薬組成物は、限られた期間、または、例えば、状態が改善もしくは治癒するまでの長期間にわたる維持療法として、一度投与され得る。限定された期間は、１週間、２週間、３週間、４週間、及びエンドポイントを含むそのような値の間の任意の期間を含む最大１年間である。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、約１日間、約３日間、約１週間、約１０日間、約２週間、約１８日間、約３週間、またはエンドポイントを含むそれらの値のいずれかの任意の範囲で投与され得る。

【0282】

前述の実施形態によれば、組成物または医薬組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、またはそれ以上投与され得る。

【0283】

値の範囲が提供される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各中間値、及びその記載の範囲内の他の記載される値または中間値が本発明の範囲内に含まれることを理解されたい。それらの小さい範囲の上限及び下限は、記載される範囲に具体的に排除される限界がない限り、その小さい範囲に独立に含めることができ、また本発明の範囲に含まれる。記載される範囲が、一方または両方の限界を含む場合は、それらの含まれる限界の一方または両方を排除する範囲も、本発明に含まれる。

【0284】

特段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の一般的な技術者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本明細書で説明される方法及び材料と同様または等価のあらゆる方法及び材料も、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料がこれから説明される。本明細書で言及される全ての出版物は、その出版物が引用される方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。

【0285】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「及び」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。本明細書に記載の出版物は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提供され、それぞれはその全体が参照により組み込まれる。本明細書のいかなる引用も、本発明が先行発明のおかげでそのような出版物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。更に、提示する出版物の日付は、実際の出版日と異なることがあり、それは個別に確認する必要がある。

【実施例】

【0286】

以下の実施例は、本発明をどのように製造し、使用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が実施されたすべてまたは唯一の実験であることを示すことを意図したものでもない。使用された数値（例えば、量、温度など）の正確性を確保するために努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差及び偏差を考慮すべきである。

【0287】

材料及び方法
実験検体及び臨床検体
ヒトＭＣＦ－７及びマウスＲＡＷＳ２６４．７エキソソームは、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した（カタログ番号：それぞれＥＸＯＰ－１００Ａ－１及びＥＸＯＰ－１６５Ａ－１）。タンパク質滴定実験用のＭＣＦ－７エキソソームは超遠心分離によって得られた。簡単に説明すると、約８０％コンフルエントなＭＣＦ－７細胞から得られた６０ｍｌの組織培養培地（１０％エキソソーム枯渇ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ２７２０８０１）及び１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５１４０１２２）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、＃１０５６６０１６）を含む）を、収集前に４８時間リフレッシュした。細胞、死細胞及び細胞破片を、それぞれ５００ｘｇで５分間、２，０００ｘｇで１０分間、続いて１０，０００ｘｇで３０分間遠心分離することによって除去した。Ｏｐｔｉｍａ ＸＥ－９０超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）中の１０ｍｌのＵｌｔｒａｃｌｅａｒチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃３４４０５９）中で、超遠心分離を４℃、１００，０００ｘｇで２時間実施した。ペレットを１ｘＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１００１００２３）で洗浄し、次に、２回目の超遠心分離を４℃、１００，０００ｘｇで２時間行い、最終的なエキソソームペレットを５０μｌの１ｘＰＢＳ中に再懸濁した。ＨＭＨネットワークによって、ＩＲＢ＃Ｐｒｏ２０１８－１０２２に基づいて、ハッケンサック大学医療センター（Ｈａｃｋｅｎｓａｃｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、ＨＵＭＣ）においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者（最初のサンプルセット）の血清検体を採取した。血清サンプルをバイオリポジトリ（ＢｉｏＲ）で処理し、５００μｌのアリコートとして－８０℃で保存した。内部提案書（提案番号ＢｉｏＲＣＯＶ４）を提出し、承認を得た上で、人工呼吸器を必要としない患者から１３個の血清サンプルと、人工呼吸器を使用している中等度から重度のＡＲＤＳ患者から１７個のサンプルとを採取し、全血清とＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲエキソソーム精製の両方にＲＮＡ抽出を行った。Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｄｏｎａｔｏ博士（ＩＲＢ＃Ｐｒｏ２０２０－０３７５／０３７８）が率いる回復期血漿研究に登録された、最近回復したＣｏｖｉｄ－１９患者から、元の回復期血清検体（２番目のサンプルセット）を採取した。残存サンプルを匿名化した後、ＨＭＨ ＢｉｏＲに移送し、Ｃｏｖｉｄ－１９研究審査委員会による審査と承認を経て、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ（ＣＤＩ）に提供した（提案書ＣＯＶＩＤ－１９＃１０２）。提供したサンプルを、１，０００μｌのアリコートとして－８０℃で保存した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ、ＲＢＤ）を抗原として使用し、高ＩｇＧ血清力価と低ＩｇＧ血清力価を同定するために開発及び最適化した酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）を最初に実施した。次に、血清サンプルを高ＩｇＧ（力価＞１０，０００）または低ＩｇＧ（力価が定量下限（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＢＬＱ）未満）のいずれかに層別した。ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを使用して、高ＩｇＧ回復期個体からの３つの血清サンプルとＢＬＱ ＩｇＧ回復期個体からの３つの血清サンプルにＣＤ６３精製を行い、それらのエキソソーム含有量の中和能について評価した。エキソソーム全体を評価するために、２つのサンプル（１つの高及び１つのＢＬＱ）を超遠心分離した。

【0288】

選択した抗体による細胞外小胞捕捉及び酵素放出（ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ）アッセイ
Ｌｏｆ ｅｔ ａｌ．（２０１７）によって記載された放出プロトコールを以下のように更に最適化及び修正した。Ｌｏｆ ｅｔ ａｌ．（２０１７）から改変された、５’－アジド（５’Ａｚ－ＡＡＡＡＡＣＧＡＵＵＣＧＡＧＡＡＣＧＵＧＡＣＵＧＣＣＡＵＧＣＣＡＧＣＵＣＧＵＡＣＵＡＵ ＣＧＡＡ（配列番号１））及び３’－ビオチン（５’Ｂｉｏ－ＣＧＡＵＡＧＵＡＣＧＡＧＣＵＧＧＣＡＵＧＧＣＡＧＵＣＡＣＧＵＵＣＵＣＧＡＡ ＵＣＧＵＵＵＵ（配列番号２））のＨＰＬＣ精製ウラシル化オリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を２５０ｎｇ／μｌの濃度でＲＮａｓｅフリー水中に再懸濁した。等モル量（１：１比）の各オリゴを１ｘＲＮＡアニーリング緩衝液（６０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ₂）でアニーリング（９０℃で２分間、９０～４２℃で４０分間、４２℃で１２０分間）した後、１５％非変性ポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ）ゲル（０．５ｘＴＢＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１５５８１０４４）、４５０ボルトで９０分間）上で分離した。二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ、ｄｓ）ＤＮＡリンカーをＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（商標）色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ｓ１１４９４）を使用して青色ライトボックス上で可視化し、切り出し、ゲルブレーカーチューブ（ＩＳＴ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，＃３３８８－１００）中で遠心力を利用して破砕し、４００ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁し、４℃及び１，１００ＲＰＭに設定したサーモミキサー上で一晩（Ｏ／Ｎ）振盪した。溶液を濾過し、ＱＩＡＥＸ（登録商標）ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、＃２００２１）を製造業者の指示に従って使用して、ｄｓＤＮＡリンカーを精製した。精製したｄｓＤＮＡリンカーをＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００で評価し、２５０ｎｇ／μｌに希釈した。エキソソームプルに使用した抗体（１ｍｇ／ｍｌ）（抗ＣＤ６３（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ５９４７９；ＲＲＩＤ：ＡＢ＿９４０９１５）、抗ＣＤ８１（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ２３３６９２）、及び抗ＣＤ９（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ２６３０２３））を、新しく調製した４ｍＭ ＤＢＣＯ－Ｓ－Ｓ－ＮＨＳエステル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、＃７６１５３２）５μｌを使用して活性化し、暗所で室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートし、２．５μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）を暗所で室温で５分間添加することによって反応を停止させた。ＤＢＣＯ活性化抗体を、予め平衡化したＺｅｂａ脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃８９８８２）上で１分間インキュベートし、１，５００ｘｇで２分間遠心分離することにより脱塩した。タンパク質Ａ２８０を使用してＮａｎｏｄｒｏｐ ２０００機器で抗体を定量し、５０μｇの活性化抗体と２５μｇの精製ＤＮＡリンカーをローテーター上で４℃でＯ／Ｎ結合させることによって抗体－ｄｓＤＮＡ（Ａｂ－ｄｓＤＮＡ）ストック溶液を調製した。Ａｂ－ｄｓＤＮＡ結合の検証をＰＡＧＥによって実施し、そこで、Ａｂ－ｄｓＤＮＡ（１μｇ）産物を非変性及び非還元条件下で泳動し、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃１６１０７８６）染色を行ってＡｂ－ｄｓＤＮＡ移動の変化を視覚化した。翌日、Ａｂ－ｄｓＤＮＡコンジュゲートをストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、＃１５１２０）に結合させた。単一の抗ＣＤ６３抗体（１μｇ）または抗ＣＤ６３、抗ＣＤ８１、及び抗ＣＤ９の組み合わせ（各抗体１μｇ）（リンカー結合）のいずれかを１００μｌの１×ＰＢＳ中の単一ウェルに添加した。Ａｂ－ｄｓＤＮＡコンジュゲートを有するストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートをプレートシェーカー上に４℃、３００ＲＰＭで８時間置いて、プレートへの結合を可能にした。溶液を注意深く除去し、冷１ｘＰＢＳ溶液でウェルを３回洗浄した後、ＲＮａｓｅ－Ａ（１２．５μｇ／ｍｌ）で処理したサンプル（１００μｌ）を添加した。ｍｉｃｒｏＡＭＰ光学接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３１１９７１）を使用してプレートを密封し、シェーカー上に３００ＲＰＭ、４℃で一晩置いた。サンプルを注意深く取り出し、ウェルを冷１ｘＰＢＳで３回洗浄し、１ｘＰＢＳ（１ｘＵＮＧ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ ＮａＣｌ、１単位の酵素を含む）中の新たに調製したウラシルグリコシラーゼ（ＵＮＧ）酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，＃ＥＮ０３６２）１００μｌを各ウェルに添加した。ｄｓＤＮＡリンカーのＵＮＧ消化のために、プレートをシェーカー上で３００ＲＰＭ、３７℃で２時間インキュベートし、更なる特性評価と下流分析のためにこの溶液中でエキソソームを回収した。

【0289】

ＲＮＡ抽出
ｍｉＲＮｅａｓｙ血清／血漿キット（Ｑｉａｇｅｎ、＃ ２１７１８４）を製造業者の指示に従って使用して、全血清、全血漿、及び単離したエキソソームに対して全ＲＮＡ抽出を行い、全ＲＮＡ収量を向上させるためにいくつかの変更を加えた。簡単に説明すると、ＱＩＡｚｏｌを１００μｌの全血漿、血清、またはエキソソーム溶液に添加し、ボルテックスして室温で５分間インキュベートし、その後クロロホルムを各サンプルに添加した。サンプルを再度ボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。サンプルを１２，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離し、各サンプルの上層水相を注意深く除去し、新しいシリコン処理チューブに移し、そこに１００％エタノールを添加した。カラム精製の前に、サンプルを氷上で４０分間インキュベートした。次に、透明な上相を供給されたＲＮｅａｓｙ ｍｉｎＥｌｕｔｅカラムに２回通し、ＲＰＥ（膜結合ＲＮＡを洗浄し、エタノールを含む微量塩を除去するための洗浄緩衝液；Ｑｉａｇｅｎ）及び氷冷した８０％エタノールで洗浄した。カラムを回転させて残留エタノールを除去し、全ＲＮＡを５０μｌのＲＮａｓｅフリー水で溶出した。次にサンプルを、小分子ＲＮＡ配列決定の場合は１０μｌまで、定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）の場合は２０μｌまでスピードバキュームした。ｃＤＮＡ小分子ＲＮＡライブラリーの調製及び次世代シークエンシングのために、３ｎｇのサイズプライマー（１．５ｎｇ～１９ｎｔ及び１．５ｎｇ～２４ｎｔ；［４２］）を各ＲＮＡ抽出物にスパイクした。ＲＴ－ｑＰＣＲ実験では、１ｐｇのａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａ（ＩＤＴ、ｒＵｒＵｒＵＧＧＡｒＵｒＵＧＡＡＧＧＧＡＧＣｒＵＣｒＵＡ（配列番号３））をＱＩＡｚｏｌに添加し、ＭＣＦ－７及び臨床検体（軽度対重度のＣｏｖｉｄ－１９サンプル）からＲＮＡを抽出し、その後ＲＮＡ分離及びカラム精製を行い、外因性の技術的正規化対照として使用した。

【0290】

ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析を実施して、精製したエキソソーム画分からのエキソソーム表面タンパク質バイオマーカーの存在を評価した。精製したエキソソームを３５５ｍＭ β－メルカプトエタノールを含有する１ｘＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１６１－０７４７）で溶解及び変性させ、９５℃で５分間加熱した。変性した溶解物をパルス遠心分離し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって４～１２％ポリアクリルアミドプレキャストｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃４５６１０８６）上で分離した。５μｌのＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｘｔｒａ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１６１０３７７）をロードし、ゲル配向及び分離したタンパク質の分子量の測定に使用した。サンプルをロードし、ゲルを１ｘＴｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１６１０７３２）中で１００Ｖ及び４００ｍＡで９０分間泳動した（Ｐｏｗｅｒ Ｐａｃ ３００、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、セミドライ電気転写システム（ＴｒａｎｓＢｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ（商標）ｖ１．０２、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、２５Ｖで３０分間、タンパク質を０．２μｍのポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１７０４１５６）に転写した。Ｃｈｅｍｉ－Ｄｏｃ（商標）ＭＰ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）システムで提供された無染色ブロットプロトコールを使用して膜を視覚化し、タンパク質転移を評価し、ＥｖｅｒｙＢｌｏｔ（商標）ブロッキング緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１２０１００２０）中で膜を３０分間ブロックすることによって非特異的結合を防止した。膜を、Ａｌｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＭＡ１８３９７７）及びＣＤ６３（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ５９４７９）を標的とするＴＢＳ－Ｔ（１ｘＴＢＳ、ｐＨ６．８、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）希釈抗マウス一次抗体（１：１０００）、またはＣＤ８１（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ２３３６９２）及びＣＤ９（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ２６３０２３）を標的とするＴＢＳ－Ｔ希釈抗ウサギ一次抗体（１：１０００）とともに４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳ－Ｔで洗浄し（３×５分）、その後、抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（１：１００００）のいずれかで、室温で穏やかに撹拌しながら１時間インキュベートした。膜をＴＢＳ－Ｔ（３×５分）で洗浄し、その後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３４０９５）を使用してタンパク質を検出し、Ｃｈｅｍｉ－Ｄｏｃ ＭＰ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）イメージングシステムでＩｍａｇｅＬａｂ ４．０ソフトウェアを使用してタンパク質バンドを視覚化した。

【0291】

透過電子顕微鏡法
精製したエキソソームの透過電子顕微鏡法（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＴＥＭ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＰＡＩ）、Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ）によって実施した。簡単に説明すると、精製したエキソソームを、リン酸緩衝液中の２％グルタルアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、＃６５３６－０５）を使用して固定し、４℃で保存した。３００メッシュのホルムバールでコーティングされたグリッドを、２０μｌの固定したエキソソーム懸濁液上で約２分間反転させ、乾燥させた。次に、グリッドを４０μｌの２％酢酸ウラニル水溶液上で約１分間反転させ、乾燥させた。サンプルを、加速電圧８０ｋＶで動作するＪＥＯＬ ＪＥＭ－１４００＋透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で画像化した。ＡＭＴ １６ ＭＰデジタルカメラシステム（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用いて高解像度のＴＩＦＦ画像を取得して保存した。

【0292】

ナノ粒子追跡
Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ ｎＣＳ１機器を使用して精製したエキソソームのサイズ及び粒子濃度を評価した。簡単に説明すると、２μｌの精製したエキソソームをＴＳ４００マイクロ流体カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ、＃ＴＳ４００）にロードし、これにより、６５～４００ｎｍの粒子の分析が可能となった。装填されたカートリッジを、０．２μｍの濾過済み緩衝液（１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む１ｘＰＢＳ）を使用して機器中でプライミングし、粒子取得を実施した。取得した統計ファイルを、Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを使用して粒子濃度及びサイズ分布について分析し、ピークフィルタリングされたＣＳＤグラフを作成した。

【0293】

エキソソーム小分子ＲＮＡ ｃＤＮＡライブラリーの調製
Ｌｏｕｄｉｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）によって記載されたｃＤＮＡライブラリー調製プロトコールを使用してエキソソームからの小分子ＲＮＡ配列決定を実施し、ＲＮＡ量が定量化できない場合はエキソソーム精製のための修正を加えた。本発明者らの研究室で行われた滴定実験は、わずか５ｎｇのエキソソームでロバストな小分子ＲＮＡプロファイルが得られることを示した（図５Ａ）。Ｃｏｖｉｄ－１９血清から個別に精製したエキソソームについては、２００μｌの血清から精製したエキソソームから回収した全ＲＮＡを使用して、小分子ＲＮＡ ｃＤＮＡライブラリーの調製を実施した（各血清サンプル用に２つのウェルを用意し（ウェルあたり１００μｌ）、ＲＮＡ抽出のためにプルをプールした）。簡単に説明すると、９．５μｌの全ＲＮＡ、８．５μｌのマスターミックス、及び１μｌの５０μＭアデニル化バーコード付き３’アダプター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、特注）を組み合わせることにより、１５（Ｃｏｖｉｄ－１９ライブラリー）～１８（最適化実験）のライゲーションを個別にセットアップした。０．００５２ｎＭ キャリブレーターカクテル（４０μｌの１０ｘＲＮＡリガーゼ－２緩衝液、１２０μｌの５０％ＤＭＳＯ、及び［４２］からの１０μｌのキャリブレーターカクテル）を使用してマスターミックスを調製した。反応物を９０℃で１分間加熱し、氷上で２分間インキュベートし、１μｌ（１／１０希釈）の切断型Ｋ２２７Ｑ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｍ０３５１Ｌ）を各反応物に添加し、次に冷蔵室で氷上で一晩インキュベートした。翌日、ライゲーションを９０℃で１分間加熱不活性化し、１．２μｌのＧｌｙｃｏｂｌｕｅ（商標）ミックス（２６μｌの５Ｍ ＮａＣｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＡＭ９５７９）中の１μｌのＧｌｙｃｏｂｌｕｅ（商標）共沈剤（１５ｍｇ／ｍｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＡＭ９５１６））を添加することによって個別に沈殿させ、６３μｌの１００％エタノールを各チューブに添加した。反応物を合わせ、氷上で１時間沈殿させ、１４，０００ＲＰＭ、４℃で１時間遠心分離した。ペレットを乾燥させ、２０μｌのヌクレアーゼフリー水及び２０μｌの変性ＰＡＡゲルローディング溶液に再懸濁し、１５％尿素－ＰＡＧＥゲル上で分離した。サイズマーカーＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）をゲル切除のガイドとして使用した。ゲル片をゲルブレーカーチューブ（ＩＳＴ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、＃３３８８－１００）を使用して粉砕し、サーモミキサー上で４００ｍＭ ＮａＣｌ中で４℃、１，１００ＲＰＭで一晩インキュベートした。翌日、溶液を濾過し、氷上で１００％エタノール中で１時間沈殿させた。４℃、１４，０００ＲＰＭで１時間遠心分離することによってＲＮＡペレットを得た。５’アダプターを再懸濁したペレットに添加し、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｍ０２０４Ｌ）を３７℃で１時間添加した。サイズ選択のガイドとして、連結した生成物を、５’連結サイズマーカーの存在下で１２％尿素－ＰＡＧＥゲル上で分離した。ゲルをゲルブレーカーチューブ中で回転させ、その後、破砕したゲルを１μｌの１００μＭ ３’ＰＣＲプライマーを含む３００ｍＭ ＮａＣｌ溶液中に再懸濁し、サーモミキサー上で１，１００ＲＰＭ、４℃で一晩インキュベートした。続いて、溶液を濾過し、１００％エタノールで沈殿させ、氷上で１時間インキュベートし、４℃、１４，０００ＲＰＭで１時間遠心分離することによってペレット化した。ＲＮＡペレットを、０．７５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１８０８０－０９３）による逆転写のためにヌクレアーゼフリー水（３μｌの５ｘ第一鎖緩衝液、１．５μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、及び４．２μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（それぞれ２ｍＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ｒ０２４１））に再懸濁し、５０℃で３０分間インキュベートした。逆転写を９５℃で１分間不活性化した後、９５μｌのヌクレアーゼフリー水を添加した。パイロットＰＣＲ反応をセットアップした（１０μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液、１０μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（それぞれ２ｍＭ）、１０μｌのｃＤＮＡ、６７μｌのヌクレアーゼフリー水、０．５μｌの３’ＰＣＲプライマー、０．５μｌの５’ＰＣＲプライマー、及び２μｌのＴｉｔａｎｉｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃６３９２０８））。２．５％アガロースゲルでの分析及び最適なＰＣＲ増幅サイクルの同定のために、サイクル１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２で１２μｌのアリコートを回収した。次に６つのＰＣＲ反応をセットアップし、最適な増幅サイクル数で実行し、一部（１０μｌ）を２．５％アガロースゲルで評価した。残りの溶液を合わせ、沈殿させ、サイズマーカーを除去するためにＰｍｅＩで消化し、２．５％ゲル上で分離した。１００ｎｔのＰＣＲライブラリー産物を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、＃２８７０４）で精製し、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ｑ３２８５４）を使用して定量した。次に、ｃＤＮＡライブラリーをＨｉＳｅｑ２５００シーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、＃ＳＹ－４０１－２５０１）で配列決定し（シングルリード５０サイクル）し、その後、生の配列決定データを含むＦＡＳＴＱファイルを、アダプタートリミング及びｈｇ－１９ゲノムへの小分子ＲＮＡアラインメントのために処理した。リードカウントを総カウントに対して正規化し、統計分析を行った（以下を参照）。

【0294】

定量ＰＣＲ実験
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡマスターミックスＰＣＲキット、及び個々のＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイを製造業者の指示（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って使用して、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）実験を実施した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）及びストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートへの非特異的エキソソーム結合の評価には、ａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａ ＲＮＡオリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。Ｃｏｖｉｄ－１９感染血清検体から精製したエキソソームのＲＮＡ抽出中に１ピコグラムのａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａも添加し、技術的正規化対照として使用した。最適化実験では、ＭＣＦ－７エキソソームから抽出したＲＮＡを使用してｈｓａ－ｍｉＲ－２１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃０００３９７）及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃０００５０５）を定量した。Ｃｏｖｉｄ－１９血清検体からのエキソソームＲＮＡの配列決定によって同定された差次的発現ｍｉＲＮＡの検証には、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ（＃００２２２８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ（＃００２１６３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ（＃０００４５１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５（＃０００５０９）に対するＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡプライマーアッセイを使用した。これらのｑＰＣＲ反応では、１００μｌの血清からのＣＤ６３／ＣＤ８１／ＣＤ９エキソソーム精製を組み合わせたものから抽出したＲＮＡの１０％（２０μｌ中２μｌ）を使用して逆転写をセットアップした。個々の転写物の定量化では、ＲＴ反応の１／３（５μｌ）を使用して３つの個々のｑＰＣＲ実験をセットアップした。Ｓｔｅｐ－Ｏｎｅ－Ｐｌｕｓ機器で、製造者の推奨するストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート及びカバーを用いて定量ＰＣＲ測定を実施した。以下に説明するように、定量データを統計分析のためにＥｘｃｅｌシートに転送した。例示的なｍｉＲＮＡ配列を以下の表２に列挙する。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【0295】

ＢＳＬ－３組織培養及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和
データ分析
配列決定データ分析では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００シーケンサーから取得した生のＦＡＳＴＱデータファイルを、アダプタートリミング、リードアラインメント、及びアノテーションを含めて、ＲＮＡｗｏｒｌｄサーバを使用して処理した。ｍｉＲＮＡカウントを、データ分析のためにスプレッドシートにエクスポートした。以下に詳述するように、Ｒプラットフォームの専用Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用してｍｉＲＮＡカウントの統計分析を実施した。「ＮＭＦ」パッケージ（ヒートマップ関数）を使用して、ヒートマップを変換されたカウントから生成した。「ＤＥＳｅｑ２」と「ｅｄｇｅＲ」を使用して差次的発現を評価した。差次的発現モデルには、バッチバイアスを低減するためのバッチ変数（ライブラリー）が含まれていた。性別と年齢との相互作用を試験した［４３］。ｍｉＲＮＡの識別能力を最大化するために、各サンプルのスコア（「ｍｉＲＮＡスコア」、［４４］）を計算し、これは、すべての有意にアップレギュレートされたｍｉＲＮＡの標準化レベル（ｚ値）と、すべての有意にダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡのｚ値の負の値を合計することによって集められた。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）では、個々のｍｉＲＮＡのＣｔ値からａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａ（外因性正規化対照）の閾値サイクル（Ｃｔ）値を差し引き、ΔΔＣｔ比較法の値を計算した。ΔΔＣｔ値のｔ検定またはマンホイットニーのＵ検定によってｑＰＣＲの差次的発現を評価した。回復期エキソソーム中和については、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０ソフトウェアを使用して統計分析を実施し、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を使用してデータを評価した。すべてのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、技術的反復（３つの別々のウェル）及び生物学的反復（３つの別々の実験）の両方で構成された。ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ、ＡＮＯＶＡ）を実施した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。

【0296】

結果
ヒト生体液からエキソソームを精製するためのＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイの開発
本発明者らは、生体液からエキソソームを特異的に精製するために、結合プラットフォームへの選択的抗体のカスタマイズ可能な結合を最適化するよう努めた。したがって、Ｌｏｆ ｅｔ ａｌ．，２０１７（図２Ａ）によって記載された設計を使用して、本発明者らは、最初に、その後のアッセイのために最高量の二本鎖ＤＮＡリンカーを生成するための最適なハイブリダイゼーション条件を確立した（図２Ｂ、レーン４）。ｄｓＤＮＡの純度を高め、ＤＢＣＯ活性化抗体に結合してプラットフォームへの結合を防止することができる一本鎖５’アジドオリゴヌクレオチドの発現を防ぐために、アニーリングしたｄｓＤＮＡ産物を非変性アクリルアミドゲル上で精製した。ウラシル－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を使用して、酵素消化を通じてｄｓＤＮＡリンカーの分解性の性質を検証した（図２Ｂ、レーン５）。次に、ｄｓＤＮＡリンカーとＤＢＣＯ活性化抗体との間の最適な比率を決定し、これを１２％ＰＡＧＥで評価した（図２Ｃ、レーンｃ、ｄ、及びｅを比較）。ｄｓ－ＤＮＡリンカーの結合は抗体の移動パターンを変更し、これはＵＮＧグリコシラーゼ処理及びｄｓＤＮＡリンカーの消化により回復することができた（図２Ｃ、レーンｆ）。これらの実験を異なる抗体で繰り返し、ｄｓ－ＤＮＡリンカーと抗体二本鎖の調製のための最適化条件を検証した。

【0297】

低非特異的核酸結合プラットフォームの同定
磁気ビーズは、カーゴの評価に先立ってエキソソームを単離するために広く使用されているが、本発明者らの研究室で行われた反復実験は、捕捉抗体の非存在下での高レベルの非特異的小分子ＲＮＡ結合を示唆した（図８）。したがって、本発明者らは、非磁性ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（ウェル、主にＥＬＩＳＡアッセイに使用される）とＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（磁性ビーズ）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＴ１ビーズ（ビーズ）を比較することにより、磁性ビーズの非特異的結合能力を調査しようとした。本発明者らは、２つのプラットフォーム（ビーズ対ウェル）の評価のための小分子ＲＮＡの供給源として、実験室（対照ＰＣＲ実験）で汚染物質として検出されなかったシロイヌナズナ特異的ｍｉＲＮＡであるａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａ ＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用することを選択した。高感度測定ツールとしてｑＰＣＲを使用することで、本発明者らは、１ｎｇのａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａ（１４サイクルのＣｔ、図３Ａ及び図３Ｂ－すべてのグラフ中の黒いバーを参照）がウェル及びビーズへの非特異的結合の定量化に最適であると判断した。非特異的ａｔｈ－１５９ａ ＲＮＡ結合の評価では、ウェル（図３Ａ、左上）またはビーズ（図３Ａ、左下）から、その後の３回のＰＢＳ洗浄及びＵＮＧ消化後の１回の最終溶出を含む４つの画分を収集した。本発明者らのデータは、特に最終溶出（図３Ａの左上と左下、薄い灰色のバー）において、ウェルが最小量のａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａ ＲＮＡを保持し、大量のａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａ ＲＮＡが非特異的に結合してすべてのステップで放出されたが、特にビーズによる最終溶出中に放出されたことを示す。本発明者らは、ａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａとのインキュベーション前にウェル及びビーズをＲＮａｓｅ－Ａで処理すると（図３Ａ、右上と右下）、ａｔｈ－１５９ａ ＲＮＡの非特異的結合及びビーズによる最終溶出におけるその高い発現がほとんど除去されることを見出した。この前処理は、溶出におけるＲＮａｓｅ－Ａ活性のキャリーオーバーを示唆しており、その後のすべての実験には適していない可能性があるが、磁気ビーズを使用する場合には必要と思われる。次に、本発明者らは、ウェル又はビーズのいずれかがエキソソームに非特異的に結合することもできるか否かを判定しようとした（図３Ｂ）。ＭＣＦ－７細胞からのエキソソームＲＮＡ抽出物中で以前に検出したｈｓａ－ｍｉＲ－２１（Ｃｔ＝２４）及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ（Ｃｔ＝２７）のｑＰＣＲ評価を実施した。商業的に精製されたＭＣＦ－７エキソソームが超遠心分離によって得られることを考慮すると、エキソソームフリーｈｓａ－ｍｉＲ－２１及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃを予想したため、すべての反応をＲＮａｓｅ－Ａで前処理した。本発明者らのデータは、ｍｉＲＮＡシグナルの約半分が残っていることを示しており、おそらくエキソソーム二重脂質層によるＲＮａｓｅ－Ａ活性からの保護を示唆している（図３Ｂ、濃い灰色のバー）。ＲＮａｓｅ－Ａで処理したエキソソーム溶液をウェル中で又はビーズとともにインキュベートした後に取り出し、その後、溶液中に残っているｈｓａ－ｍｉＲ－２１及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ ＲＮＡレベルを評価した。本発明者らのデータにより、ウェル上でエキソソーム溶液をインキュベートした後、両方のｍｉＲＮＡが同じ検出可能なレベルを維持する一方、ｍｉＲＮＡシグナルの大部分がインキュベーション及びビーズの除去後に失われたことが体系的に確認された（図３Ｂ、薄い灰色のバー）。これらのデータは、磁気ビーズが小分子ＲＮＡとエキソソームの両方に非特異的に結合する能力を有することを示唆しており、これは、血清中でインキュベートしたビーズの小分子ＲＮＡ配列決定を行うときに観察した非特異的ＲＮＡバックグラウンドに寄与する可能性がある（図８）。したがって、その後のすべての実験では、評価したすべての生体液からのエキソソームの免疫精製のために、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートを選択した。

【0298】

生体液からのエキソソーム精製のためのＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイの再現性及び感度
これらの原理証明実験では、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイで抗ＣＤ６３抗体を使用して、３つの異なる生物学的供給源（ヒト細胞株（ＭＣＦ－７）の組織培養培地、ヒト血漿、及びヒト血清）からのエキソソームの精製を評価した（図４Ａ～図４Ｅ）。これらのエキソソーム精製を、総タンパク質インプット（ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計で定量化）が減少している状態で実施し、エキソソーム溶出におけるタンパク質発現のための抗Ａｌｉｘ、－ＣＤ６３、－ＣＤ９、及び－ＣＤ８１抗体を使用して、ウェスタンブロッティングによってＣＤ６３プルダウンの再現性を評価した（図４Ａ～図４Ｃ）。入手可能性が限られていたため、エキソソーム精製を単一容量の血清（１００μｌ）を用いて実施した。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ、図４Ｄ）を使用して、以前のエキソソーム評価（３６）と一致するサイズ及び形態を有する無傷のＥＶの存在を明らかにした。最後に、Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ ｎＣＳ１ナノ粒子トラッカーを使用して、ＣＤ６３⁺精製及び放出されたエキソソームのサイズ分布を評価したところ、ＰＢＳでインキュベートしたウェルからのＵＮＧ消化Ａｂリンカーと比較して、ＭＣＦ－７細胞培地（３．３０×１０¹⁰粒子／ｍｌ（ｎ＝２０，０５８））、血漿（６．９３×１０⁹粒子／ｍｌ（ｎ＝３４０，９５６））、及び血清（２．２７×１０¹⁰粒子／ｍｌ（ｎ＝１２，５１６））からのエキソソームについて６５～１５０ｎｍの範囲のサイズを有するナノ粒子が存在することが明らかになった（図４Ｅ）。まとめると、これらの分析は、様々な生体液からエキソソームを精製するためのＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイの均一な再現性を明らかにした。

【0299】

ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲで精製したＣＤ６３⁺エキソソームを使用した小分子ＲＮＡ配列決定
磁気ビーズで精製したエキソソームから抽出した全ＲＮＡを使用した以前の小分子ＲＮＡ配列決定実験（図８）が高い小分子ＲＮＡバックグラウンドの存在を示したことを考慮して、本発明者らは同じ小分子ＲＮＡ ｃＤＮＡライブラリー調製プロトコルを用いてＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイの特異性を評価しようとした［４２］。最初の試験として、全血清から抽出した全ＲＮＡの量を減少させて、循環小分子ＲＮＡの検出に対するｃＤＮＡライブラリー調製プロトコールの適用性を検証した（図５Ａ）。反復実験により、少量の循環小分子ＲＮＡを使用した配列決定パイプラインの再現性が実証された。次に、超遠心分離したヒト血漿（全エキソソームの古典的な精製）及び全血漿から抽出したＲＮＡからの小分子ＲＮＡ配列決定データを比較し、特定のｍｉＲＮＡ発現の差異を特定し（図５Ｂ）、これは、ＲＮＡ抽出方法が発現量に影響を与えることを更に裏付けた［４５］。対照の尺度として、マウスエキソソームとヒトエキソソームとの間に特定の小分子ＲＮＡ発現差異が存在することを確認した（図５Ｂ）。最後に、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲを使用して生体液からエキソソームの亜集団を特異的に選択できるか否かを明らかにしようとした。これらの実験では、ヒト血漿にマウスＲＡＷＳ２６４．７エキソソームをスパイクすることを選択した。ヒトＣＤ６３との交差反応性を持たない抗マウスＣＤ６３抗体を使用してＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイをカスタマイズし、ヒト血漿からマウスエキソソームの精製を実施した。精製したｍｉＲＮＡカーゴの高感度評価では、ｃＤＮＡライブラリー調製プロトコールを使用し、選択したエキソソームの小分子ＲＮＡ含有量を配列決定した（図５Ｃ）。これらの実験では、ｃＤＮＡライブラリー調製プロトコールの固有変動性を強調するために、すべてのライブラリーを新しい（リピート＃１、３年）と古い（リピート＃２、６年）の３’バーコード付きアダプターを使用して複製した。図５Ｃに見られるように、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを使用してヒト血漿から捕捉したマウスＣＤ６３⁺エキソソームからの小分子ＲＮＡ発現データは、マウスＲＡＷＳ２６４．７全エキソソームでのみ同定されたマウス特異的な小分子ＲＮＡ配列（タグ）を含んでいた（図５Ｃ、カラム２及び３）。また、ヒト全血漿中で差次的に検出されたｍｉＲＮＡ（マウスＲＡＷＳ２６４．７エキソソームでは検出できない）が、マウスＣＤ６３⁺精製エキソソーム内では検出できないことにも注目した。興味深いことに、ＲＡＷＳ２６４．７エキソソーム全体（エキソソームのプールを表す）とＣＤ６３⁺精製エキソソームの間でｍｉＲＮＡ発現の差異が認められ、特定のｍｉＲＮＡはマウスＲＡＷＳ２６４．７細胞からのプールされたエキソソームでのみ検出可能であった。これらの次世代シーケンシング実験は、循環小分子ＲＮＡの再現性のある検出と、生体液からのエキソソーム亜集団の選択的捕捉に対するＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイの特異性を実証している。

【0300】

軽症および重症のＣｏｖｉｄ－１９患者の血清エキソソームのｍｉＲＮＡ分析
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックの米国初期の渦中に当研究所とその親病院ネットワークが位置することにより、差し迫った生物学的疑問を調査し、当ネットワーク内で治療を受けたＣｏｖｉｄ－１９患者の血清サンプルにおけるｍｉＲＮＡバイオマーカーを同定するためのＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイの臨床的有用性をさらに調査するユニークな機会を与えてくれた。Ｃｏｖｉｄ－１９感染症（患者の幅広い転帰と関連している）に関する重要な問題は、循環しているｍｉＲＮＡ発現の変化が重症化のリスクがある患者を早期に特定するのに役立つかどうかを評価することであった。そこで、軽症および重症のＣｏｖｉｄ－１９患者の血清（我々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染血清サンプルセット）から循環エキソソームを精製し、次世代シーケンシングによりそのｍｉＲＮＡ発現量を評価する最初のパイロット試験を確立した。原理実証として、血清から循環エキソソームを偏りなく捕捉するために抗ＣＤ６３、－ＣＤ８１、－ＣＤ９抗体の組み合わせを使用することを選択した。ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイの感度を測定するために、低値ＥＶ（ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ）および全血清から抽出した総ＲＮＡを用いて、軽症患者および重症患者のｍｉＲＮＡ発現の違いを測定した。軽症患者は入院したが人工呼吸器は必要なかった（ｎ＝１３）一方、重症患者は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ；ベルリン分類基準［４６］に従って）を示し人工呼吸器を必要とした（ｎ＝１７）、かつ両群ともＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの感染がＰＣＲ法で確認された。これらの患者から臨床データが得られた(表１)。バッチ効果を最小限に抑えるために、血清全体から抽出したＲＮＡ（３０個のサンプル；２個のライブラリー）または血清エキソソーム（３０個のサンプル；２個のライブラリー）から抽出したＲＮＡから、各ライブラリーに軽度および重度のＲＮＡサンプルを均等に配置した１５個の独立したサンプルを用いて小ＲＮＡ ｃＤＮＡライブラリーを調製した。我々の発現分析では、血清エキソソーム由来の総ＲＮＡを用いて、軽症と重症のサンプル群の間で１０個の差次的に発現されたｍｉＲＮＡが同定され（図６Ａ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ（ｐ－ｖａｌ＝０．０００４１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ（ｐ－ｖａｌ＝０．０２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４、（ｐ－ｖａｌ＝０．００４５４））、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－３ｐ（ｐ－ｖａｌ＝０．０１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ（ｐ－ｖａｌ＝０．０００１７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７－５ｐ（ｐ－ｖａｌ＝０．０１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５（ｐ－ｖａｌ＝０．０１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５（０．０００４９）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ（ｐ－ｖａｌ＝０．０１）、また、全血清由来の総ＲＮＡを用いて、軽症と重症のサンプル群の間で差次的に発現されたｍｉＲＮＡｓが２つだけ同定された（図６Ａ；ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０－５ｐ（ｐ－ｖａｌ＝０．０２６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２９＊（ｐ－ｖａｌ＝０．００８８））。図６Ｂに示すように、２つの群間で差次的に発現された１０個のエキソソームｍｉＲＮＡは、存在量は少なかったが、再現性よく検出され得る。我々は、軽度および重度の患者の血清エキソソームにおいて差次的に発現された１０個のｍｉＲＮＡを使用して、統合的ｍｉＲＮＡシグネチャを確立した（図６Ｃ）。両方のエキソソーム小ＲＮＡライブラリー間のこのシグネチャの評価により、軽症と重症のサンプル群の間で観察される発現の違いが確認された（図６Ｃ）。興味深いことに、血清エキソソームおよび全血清の両方についてこのｍｉＲＮＡ統合シグネチャを評価した場合（図６Ｄ）、血清精製エキソソームにおいて、軽症と重症のサンプル群の間で有意な差があることが確認された（図６Ｄ、ｐ－ｖａｌ＝２ｅ－０７）。驚くべきことに、全血清型（ｐ－ｖａｌ＝０.０１１）から、これらの１０個のｍｉＲＮＡは、２つの患者群間で個々に発現の差は見られなかった。最後に、血清エキソソーム中で同定された差次的に発現している上位４つのｍｉＲＮＡを評価するために、金標準定量ＰＣＲアプローチを利用した（図６Ｅ）。得られた発見の完全な技術的検証を可能にするために、血清エキソソームの精製に最初に使用した新規な抗ＣＤ６３、－ＣＤ８１及び－ＣＤ９抗体を活性化し、同じ３０の全血清サンプル（軽症ｎ＝１３、重症ｎ＝１７）からＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲを使用して新規なエキソソソソームを精製し、かつ総ＲＮＡを抽出した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを用いて、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５の発現差を評価し、差次的に発現している上位２つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ（ｐｖａｌ＝０.００２３）及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２２６－３ｐ（０.０３６）の検証に成功した（図６Ｅ、上の２つのボックスプロット）他の２つのｍｉＲＮＡの検証の欠如について考えられる理由を評価するために、４つのｍｉＲＮＡ全てについて３０個の検体のｑＰＣＲのＣｔ値の平均を示した。Ｃｔ値が最も低い（最も発現している）ｍｉＲＮＡのみが検証され得ることが観察され（図６Ｅの上側のボックスプロット、Ｃｔ値を参照）、このことは、これらのｍｉＲＮＡ転写物がｑＰＣＲ検出閾値を下回ったことを示唆し得る。全体として、我々のシークエンシング分析では、血清エキソソームには、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを用いて捕捉され、ｑＰＣＲで検証可能な低存在量の特異的ｍｉＲＮＡが含まれていることを証明している。我々の分析では、軽症および重症のＣｏｖｉｄ－１９患者からの血清エキソソーム間でｍｉＲＮＡ発現に差があることも示唆している。

【表3】

【0301】

ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲで精製したエキソソームはｉｎ ｖｉｔｒｏ分析のための機能的特性を維持する
以前のＴＥＭ分析では、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ精製後に放出されたエキソソームの大部分が無傷であることが示唆されたことを考慮し、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲを使用して生体流体から精製されたエキソソームがｉｎ ｖｉｔｒｏ分析においてその生物学的特性を維持したかどうかを検討した。これらの概念実証実験のために、我々は第２のパイロット試験（回復期血清サンプルセット）を確立し、そこで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から最近回復した６人の血清からＣＤ６３＋循環エキソソームを精製した（ＨＵＭＣの回復期血漿試験に登録し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を抗原（ＩｇＧ）とし、ＥＬＩＳＡにより抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を評価した）。図７Ａに示すように、血清サンプルのうち３つは、ＩｇＧ力価の高い個体（Ｈｉｇｈ；血清の１０，０００倍希釈を超えると定義）から得られ、３つはＩｇＧレベルが定量限界（ＢＬＱ；検出不能）を下回る個体の血清から得られた。ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを使用して、異なる血清サンプルからエキソソームを精製し、抗Ａｌｉｘ、－ＣＤ９、－ＣＤ６３、および－ＣＤ８１抗体を使用するウェスタンブロット分析によってそれらの同一性を確認した（図７Ｂ）。これらの実験により、高血清（図７Ｂ、レーン１～３）とＢＬＱ血清（図７Ｂ、レーン４～６）との間のエキソソームの均一な精製が明らかになった。ＴＥＭを使用して、本発明者らは、高血清サンプルおよびＢＬＱ血清サンプルの両方から精製したエキソソーム（図７Ｃ）のサイズ、形態、および完全性を評価した。エキソソームのサイズ分布もナノ粒子追跡によって評価し（図７Ｄ）、高濃度（平均濃度：１.９９×１０¹⁰個／ｍｌ（ｎ＝２０.４８１）とＢＬＱ（１.５５×１０¹⁰個／ｍｌ（ｎ＝２０.４４９）の血清エキソソーム間で、同様のナノ粒子分布（６５～１５０ｎｍ）を示した。我々は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２レポーターウイルス（ウイルス複製により、測定可能な緑色蛍光タンパク質シグナルが産生される）の感染および増殖を、ＡＣＥ－２レセプターを高レベルに保有するゴールドスタンダードＶｅｒｏ Ｅ６（アフリカミドリザル腎臓）細胞を用いて行い［４７］、それにより、異なる血清および精製された循環血清エキソソームの中和特性を評価する（図７Ｅ）［４８～５０］。高いＩｇＧ力価を有する個体からの全回復期血清を用いてＶｅｒｏＥ６細胞を処理すると、予想通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和が生じたが（図７Ｅ、高ＩｇＧ）、ＢＬＱのＩｇＧ力価を有する個体からの全血清を使用した場合には観察されなかった（図７Ｅ、ＢＬＱ ＩｇＧ）。循環エキソソームの潜在的な中和特性を評価するために、本発明者らはまず、金標準の超遠心分離法（ＵＣ）によって高度に精製されたエキソソームを得た［３５］。血清ＩｇＧのキャリーオーバーを防ぐために、連続した超遠心分離工程および洗浄を行い、これにより、初期の血清の約１～２×１０⁷倍の希釈につながると推定した（図７Ｅ；１高い、１ＢＬＱ）。我々の実験により、高ＩｇＧ力価血清サンプルに由来するＵＣエキソソームで前処理されたＶｅｒｏ Ｅ６細胞は、全血清の処理で見られるのと同様のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和効果（図７Ｅ、第３列）をもたらすが、ＢＬＱ ＩｇＧ力価血清サンプルに由来するＵＣエキソソソームで処理された細胞は、ウイルスに対する中和効果を示さないことが明らかになった（（図７Ｅ、第４列）。血清のＵＣから得られた非常に高い希釈度に基づき、我々のデータは、高ＩｇＧ力価の血清からのＵＣエキソソームで観察された中和効果がエキソソーム媒介であり得ることを示唆している。したがって、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイによって精製および放出された血清エキソソームを用いて、これらの予想外の結果を確認しようと努めた。我々のデータは、高ＩｇＧ力価血清から精製したエキソソーム（図７Ｅ．サンプル１－３）が、高ＩｇＧ力価血清からのＵＣエキソソームと同様の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を示すことを示したが、これはＢＬＱ ＩｇＧ血清では観察されなかった（図７Ｅ．サンプル４－６）。これらの観察は、イメージングによる蛍光ウイルス粒子の検出によって検証された（図７Ｆ）。これらの予想外のデータは、高ＩｇＧ価を有する回復期血清から精製されたエキソソームの中和特性を示唆するが、作用機序の同定と確認はまだなされていないが、我々の分析は、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを使用して精製されたエキソソームが同じ血清サンプルの１つから高度に精製されたＵＣエキソソームで観察されたものと同等であることを証明する。

【0302】

図９Ａ、総タンパク質およびＡＣＥ－２を示すために染色された、ＣＯＶＩＤ１９回復期血清（左、高ＩｇＧ力価回復血清、ＲＢＤ ＩｇＧ＞１０，０００；右、ＢＬＱ回復血清）由来のエキソソソーム抽出物のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。図９Ｂに、回復期血清（左、高ＩｇＧ力価回復期血清、ＲＢＤ ＩｇＧ＞１０，０００；右、ＢＬＱ回復期血清）についての総タンパク質に対して正規化されたＡＣＥ－２タンパク質発現のグラフを示し、高ＩｇＧ力価を有する個体からの回復期血漿におけるＡＣＥ－２の有意な増加を示す。

【0303】

考察
本研究では、高感度でカスタマイズ可能な抗体ベースのエキソソーム精製手順であるＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲを開発し、エキソソーム小ＲＮＡのカーゴをハイスループットで同定し、精製エキソソームを無傷で放出してその生物学的特性を評価した。

【0304】

循環ｍｉＲＮＡバイオマーカーの同定における重要な問題は、周囲のｍｉＲＮＡノイズが本質的に高いレベルであり、その結果、特に大型生物内の細胞集団からのｍｉＲＮＡ発現変化の検出において、生体流体中のそれらのシグナルが「減衰」してしまう［３２］。循環エキソソームの評価は、特定の細胞からの区画化されたｍｉＲＮＡカーゴを評価するための独特な機会を提供するが、現在の実験室ベースの技術には大きな注意点がある［２５～３１］。したがって、エキソソーム精製中のＲＮＡバックグラウンド／ノイズを最小化する意図でＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを最適化し、磁気ビーズが本質的にＲＮＡとエキソソームを非特異的に捕捉し、分析の妨げになると判断したため、ストレプトアビジンコーティングされた９６ウェルプレートを結合プラットフォームとして使用するように選択した。最適化された小ＲＮＡ ｃＤＮＡライブラリー作製プロトコールを使用して、ヒト血漿にスパイクされた、選択的に精製されたＣＤ６３＋マウスＲＡＷＳ２６４.７エキソソームから抽出されたＲＮＡをシーケンシングすることにより、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲの特異性を証明した。さらに、同じ生体流体（全血漿、血漿由来の超遠心分離エキソソーム、および抗体引き出しエキソソーム）からの異なる循環ＲＮＡ画分の次世代シーケンシング分析により、ｍｉＲＮＡ発現の違いはＲＮＡ供給源および精製方法に基づいて体系的に同定できるという原理がさらに正当化された。これらのデータは、循環エキソソーム上に存在する細胞特異的表面タンパク質の捕捉に抗体選択を適合させることにより、ヒト疾患の病原性の評価にＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを使用する大きな可能性を実証する。

【0305】

本発明者らは、封入されたバイオマーカーを重点的に選択することにより、微調整された低存在度の小ＲＮＡが検出できることを提案した。我々の分析がこの原則を支持している理由は以下のとおり、ＣＤ６３⁺／ＣＤ８１⁺／ＣＤ９⁺精製エキソソームの小ＲＮＡシークエンシングにより、軽症および重症のＣｏｖｉｄ－１９入院患者間で差次的に発現された１０個のｍｉＲＮＡを同定できるのに対し、全血清（第１の血清サンプルセット）を評価した場合には、これらのｍｉＲＮＡのいずれもが個別に差次的発現として検出できなかった。興味深いことに、全血清のｍｉＲＮＡ発現シーケンシングデータを使用して、これらの１０個のｍｉＲＮＡを統合的なｍｉＲＮＡシグネチャとして評価した場合、２つの患者群を区別できることがわかった（個々のｐｖａｌ＞０.００５）。これらの観察結果から、封入されたエキソソームからの固有のｍｉＲＮＡ発現の差は、全生体流体内で評価されると減衰することが示唆され、さらに、低発現で潜在的にロバストかつ臨床的に関連するｍｉＲＮＡバイオマーカーを発見するために、特異的に精製されたエキソソームを重点的に評価する必要があることを実証している。ｑＰＣＲが臨床アッセイにおけるＲＮＡ転写物の検出のゴールドスタンダードの１つであることを考慮すると、少量の血清サンプル（１００μｌ）から精製された循環エキソソームから抽出された総ＲＮＡを扱う場合に、ｑＰＣＲには大きな制限があることに注意することが重要である。例えば、ｑＰＣＲの検証中、差次的に発現された上位２つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａおよびｈｓａ－ｍｉＲ１２６－３ｐ）は、２つの患者群（軽症対重症）の間で統計的有意性を保持する一方で、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５は、比較検出閾値～３８ー３９の増幅サイクルで有意性を失った。これらの評価では、低存在量のバイオマーカーの検出には、１、エキソソームサブ集団富化のためにより多くの細胞特異的抗体の使用、２、より大量の生体流体材料のインプット、および３、ｑＰＣＲ検出閾値を改善するための前増幅工程が必要であることが示唆される。

【0306】

疾患に関連する小ＲＮＡ バイオマーカーを発見するために ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを開発したので、正確な分子分析のために無傷のエキソソームを確実に放出できるようにした。そのため、捕捉抗体と低非特異的小ＲＮＡ結合プラットフォームとの間に、酵素分解性ＤＮＡリンカーを含めることにした。エキソソームの無傷放出を評価するために、ＴＥＭおよびナノ粒子追跡実験を用いて、サイズ特異的な無傷エキソソームサブ集団の富化を評価した。我々の実験が示唆するように、この無傷のエキソソームの酵素的放出は、ｉｎ ｖｉｖｏでの分析を妨げることなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイを用いてＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲ精製エキソソームの機能的特性を探索する機会にもなり得る。本アッセイの検証のための原理証明として、エキソソームの精製によく認められた選択抗体（抗ＣＤ６３／ＣＤ８１／ＣＤ９）のプールを使用したが、我々のデータでは、特異的モノクローナル抗体を用いてカスタマイズすることにより、生体流体中を循環する細胞特異的エキソソームの選択と分析に大きな可能性があることが示唆される。実際に、最近の研究では、臓器／組織特異的エキソソームは、モノクローナル抗体を使用して循環から精製することができ、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏ分析に使用できることが既に示されている［５１～５４］。エキソソーム捕捉の特異性を高めるために、最初の限外濾過または超遠心分離工程で、無傷のプールされたエキソソームを提供することができ、次いで、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを使用して単一抗体を選択し、ｍｉＲＮＡバイオマーカーおよび機能的特性を評価することができることを提案した。

【0307】

当研究機関とその親機関は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックの米国初期の渦中に位置していたため、当機関の分子アッセイをＣｏｖｉｄ－１９感染患者の血清の評価に利用できるかどうかを調べようとした。Ｃｏｖｉｄ－１９血清検体の重症疾患層化のリスク予測バイオマーカーを評価する分子研究の欠如を考慮して、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを原理実証として使用し、感染の重症度に関連する循環エキソソームｍｉＲＮＡ発現変化を検出できるかどうかを判断した（第１の血清サンプルセット）。小規模ではあるが、軽症に罹患したＣｏｖｉｄ－１９（ｎ＝１３）と、機械的人工呼吸を必要とする重症の入院患者（ｎ＝１７）とのエキソソームｍｉＲＮＡ発現比較分析により、全血清では検出できなかった少なくとも２つのダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１４６ａおよびｍｉＲ－１２６－３ｐ）を検出し、ｑＰＣＲで検証することができた。これらの分析により、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイの感度が検証されただけでなく、疾患の重症度に関連した推定予後バイオマーカーがＣｏｖｉｄ－１９患者の血清エキソソームで検出できることも示唆された。興味深いことに、以前の研究では、これらのｍｉＲＮＡはどちらも免疫および血管調節ｍｉＲＮＡであり、炎症および血管傷害性事象に関連していることが示唆された［５５～６０］。例えば、Ｔａｇａｎｏｖらによる研究では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａが炎症に対する分子ブレーキであることが示唆されている［５６］。ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６の研究では、部分的にＶＥＧＦシグナル伝達［６２］の活性化を介して血管新生［６１］を調節する血管性ｍｉＲＮＡであることが明らかになった。より正確には、ヒト内皮前駆細胞から分泌されたエキソソームは、ｈｓａ－ｍｉＲＮＡ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐおよびｍｉＲ－１２６－５ｐの両方）を損傷された肺胞に送達することによって、マウスのリポ多糖類誘発急性肺障害に有益であることが、研究によって証明された［６３］。小規模ではあるが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａとｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐの両方が、人工呼吸器を使用している重症のＣＯＶＩＤ－１９入院患者において、軽症の入院患者と比較してダウンレギュレーションされている可能性があるという我々の観察は、報告されている抗炎症性および血管健康促進特性と一致している。これらの観察では、Ｃｏｖｉｄ－１９の入院患者から採取した血清エキソソームをより大規模に評価することで、ロバストな予後循環型ｍｉＲＮＡを同定できることが示唆され、これにより、回復期血漿療法が最も有効な患者を同定することで、臨床転帰を戦略的に改善するのに役立つ可能性がある。

【0308】

循環エキソソームは、ウイルス感染時の免疫応答に関与しており［６４～６８］、研究では、エキソソームは、ウイルス複製を阻害するタンパク質（例えば、ＨＩＶに対して［６９］）、またはＢリンパ球増殖を誘導し得るタンパク質（例えば、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）感染細胞から放出されるエキソソーム［３４］）を保有し得ることを実証している。しかしながら、これまでＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のウイルス中和における循環エキソソームの潜在的な役割は評価されていない。最初の実験では、高ＩｇＧ力価血清から連続的超遠心分離して得られた高純度のエキソソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する中和活性を示したが、ＩｇＧ力価が定量レベル未満の血清から精製されたエキソソームは中和活性を示さなかった。本発明者らは、Ｃｏｖｉｄ－１９の回復性エキソソームの中和特性（第２の血清サンプルセット）をｉｎ ｖｉｔｒｏで複製するために、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイを使用することにした。高ＩｇＧ力価の血清からＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲアッセイで捕捉・放出されたエキソソームを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこの中和活性を確認し、これは、ＩｇＧ力価が定量レベル未満の血清からのエキソソームでは観察できなかった。本発明者らは、高度に特異的な精製アッセイを用いて（全ての回復期の血清からの）最小ＩｇＧキャリーオーバーの可能性を完全に除外できないかもしれないが、超遠心分離によって高度に精製された回復期のエキソソーム（希釈倍率が約１～２×１０⁷と推定される）は、全血清で観察されたものと類似したウイルス中和特性が示された。興味深いことに、最近の研究では、エキソソームは、１０～１２ｎｍと推定されるサイズが循環エキソソーム内の区画化と適合するため、免疫グロブリンを輸送し得ることが実証された［３５.３６］。このようなエキソソームの特性は、エキソソームの中和と高い中和ＩｇＧ力価の存在との間の強い関連性を説明できるかもしれないが、さらなる評価が必要である。しかしながら、ウイルス中和のさらなるメカニズムも提案されており、これは、回復期のエキソソームがウイルスの標的となる細胞に結合し、ウイルスの侵入を防ぐという間接的なクローキング戦略［６５］、あるいはエキソソーム自体がウイルス受容体（すなわち、ＡＣＥ２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体）を保有し、ウイルス粒子をクローキングするという直接的なクローキング戦略［７０］を含み得る。Ｃｏｖｉｄ－１９の回復期エキソソームの正確な中和メカニズムについてさらなる評価が必要であるが、高ＩｇＧ力価血清から単離されたエキソソームが抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和活性を有するという観察結果は、回復期血漿療法への増強としての精製エキソソームの可能性に重要な影響を及ぼす。

【0309】

要約すると、本発明者らの研究では、高感度の小ＲＮＡ ｃＤＮＡライブラリーの調製、低小ＲＮＡの背景、再現可能でカスタマイズ可能なエキソソーム選択アッセイ、ＥＶ－ＣＡＴＣＨＥＲを組み合わせることで、疾患に関連する低発現エキソソーム特異的循環バイオマーカーの同定に役立ち得ることが示された。また、このアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび場合によってはｉｎ ｖｉｖｏの両方で、異なるエキソソームサブ集団の生物学的特性を評価するための有用なツールを提供し得ることを提案する。このアッセイの９６プレックス形式を考慮すると、循環エキソソームの精製および評価を容易に自動化することができ、単一の生体流体サンプルからエキソームサブ集団を連続的に分析できる大きな見通しが得られることが提案される。

【0310】

本開示では、その具体的な実施態様を参照して本発明を説明したが、本発明の真の趣旨と範囲を逸脱することなく様々な変更がなされたり、均等物と置き換えたりすることができることは当業者によって理解されるであろう。さらに、特定の状況、物質、物質の組成、プロセス、プロセスステップ、またはステップを本発明の目的である、趣旨及び範囲に適合させるために多くの改変がなされ得る。そのような修正はいずれも、本明細書に添付の請求の範囲内であることが意図される。
参考文献
１－ Ｍａｎｄｅｌ Ｐ， Ｍｅｔａｉｓ Ｐ． Ｌｅｓ ａｃｉｄｅｓ ｎｕｃｌｅｉｑｕｅｓ ｄｕ ｐｌａｓｍａ ｓａｎｇｕｉｎｅ ｃｈｅｚ ｌ’ｈｏｍｍｅ．ＣＲ Ｓｅａｎｃｅｓ Ｓｏｃ． Ｂｉｏｌ． Ｆｉｌ．１９４８； １４２：２４１－２４３．
２－ Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈ Ｈ， Ｈｏｏｎ Ｄ．Ｓ．Ｂ．， Ａｎｄ Ｐａｎｔｅｌ Ｋ．Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｓ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１１．１１（６）：４２６－３７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃ３０６６． ＰＭＩＤ：２１５６２５８０Ｒｅｖｉｅｗ．
３－ Ｃｅｓｃｏｎ， Ｄ．Ｗ．， Ｂｒａｔｍａｎ， Ｓ．， Ｃｈａｎ， Ｓ．Ｍ．， Ｓｉｕ Ｌ．Ｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ Ｃａｎｃｅｒ １，２０２０； ２７６－２９０． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４３０１８－０２０－００４３－５．
４－ Ｃａｂｅｌ Ｌ， Ｐｒｏｕｄｈｏｎ Ｃ， Ｒｏｍａｎｏ Ｅ， Ｇｉｒａｒｄ Ｎ， Ｌａｎｔｚ Ｏ， Ｓｔｅｒｎ ＭＨ， Ｐｉｅｒｇａ ＪＹ， Ｂｉｄａｒｄ ＦＣ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ＤＮＡ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１８； １５（１０）：６３９－６５０． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５７１－０１８－００７４－３．ＰＭＩＤ：３００５００９４．
５－ Ｏ’Ｌｅａｒｙ Ｂ， Ｈｒｅｂｉｅｎ Ｓ， Ｍｏｒｄｅｎ ＪＰ， Ｂｅａｎｅｙ Ｍ， Ｆｒｉｂｂｅｎｓ Ｃ， Ｈｕａｎｇ Ｘ， Ｌｉｕ Ｙ， Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＣＨ， Ｋｏｅｈｌｅｒ Ｍ， Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ Ｍ， Ｇａｒｃｉａ－Ｍｕｒｉｌｌａｓ Ｉ， Ｂｌｉｓｓ ＪＭ， Ｔｕｒｎｅｒ ＮＣ． Ｅａｒｌｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｃｌｏｎａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ ａｎｄ ｆｕｌｖｅｓｔｒａｎｔ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１８； ９（１）：８９６． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０３２１５－ｘ．ＰＭＩＤ：２９４９７０９．
６－ Ｒｅｅｃｅ Ｍ， Ｓａｌｕｊａ Ｈ， Ｈｏｌｌｉｎｇｔｏｎ Ｐ， Ｋａｒａｐｅｔｉｓ ＣＳ， Ｖａｔａｎｄｏｕｓｔ Ｓ， Ｙｏｕｎｇ ＧＰ， Ｓｙｍｏｎｄｓ ＥＬ． Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｔｏ Ｍｏｎｉｔｏｒ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ． Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ． ２０１９； １０：１１１８． ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｇｅｎｅ．２０１９．０１１１８． ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１９． ＰＭＩＤ：３１８２４５５８．
７－ Ｌａｒｒｅａ Ｅ， Ｓｏｌｅ Ｃ， Ｍａｎｔｅｒｏｌａ Ｌ， Ｇｏｉｃｏｅｃｈｅａ Ｉ， Ａｒｍｅｓｔｏ Ｍ， Ａｒｅｓｔｉｎ Ｍ， Ｃａｆｆａｒｅｌ ＭＭ， Ａｒａｕｊｏ ＡＭ， Ａｒａｉｚ Ｍ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｍｅｒｃａｄｏ Ｍ， Ｌａｗｒｉｅ ＣＨ． Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ： Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉＲＮＡｓ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｉｅｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１６ Ａｐｒ ２７；１７（５）：６２７． ｄｏｉ： １０．３３９０／ｉｊｍｓ１７０５０６２７．ＰＭＩＤ：２７１２８９０８．
８－ Ｃｏｒｔｅｚ ＭＡ， Ｂｕｅｓｏ－Ｒａｍｏｓ Ｃ， Ｆｅｒｄｉｎ Ｊ， Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ Ｇ， Ｓｏｏｄ ＡＫ， Ｃａｌｉｎ ＧＡ． ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄｓ－－ｔｈｅ ｍｉｘ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１１； ８（８）：４６７－７７． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２０１１．７６．ＰＭＩＤ：２１６４７１９５．
９－ Ｚｌｏｔｏｒｙｎｓｋｉ Ｅ． Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｕｒｎｏｖｅｒ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１９； ２０（９）：５１１． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５８０－０１９－０１６４－９．ＰＭＩＤ：３１３６６９８６．
１０－ Ｓｈａｈ Ｒ， Ｐａｔｅｌ Ｔ， Ｆｒｅｅｄｍａｎ ＪＥ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１８； ３７９（１０）： ９５８－９６６． ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｒａ１７０４２８６． ＰＭＩＤ：３０１８４４５７．
１１－ ＬｅＢｌｅｕ ＶＳ， Ｋａｌｌｕｒｉ Ｒ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｓ ａ Ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ． ２０２０； Ｓ２４０５－８０３３（２０）３０１１６－３． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｔｒｅｃａｎ．２０２０．０３．００７． ＰＭＩＤ：３２３０７２６７．
１２－ Ａｒｒｏｙｏ Ｊ．Ｄ．， Ｃｈｅｖｉｌｌｅｔ Ｊ．Ｒ．， Ｋｒｏｈ Ｅ．Ｍ．， Ｒｕｆ Ｉ．Ｋ．， Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ Ｃ．Ｃ．， Ｇｉｂｓｏｎ Ｄ．Ｆ．， Ｍｉｔｃｈｅｌ Ｐ．Ｓ．， Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｃ．Ｆ．， Ｐｏｇｏｓｏｖａ－Ａｇａｄｊａｎｙａｎ Ｅ．Ｌ．， Ｓｔｉｒｅｗａｌｔ Ｄ．Ｌ．， Ｔａｉｔ ＪＦ， Ｔｅｗａｒｉ Ｍ． Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｃａｒｒｙ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．２０１１； １０８：５００３－５００８． ｄｏｉ： １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１９０５５１０８．
１３－ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＰＳ， Ｐａｒｋｉｎ ＲＫ， Ｋｒｏｈ ＥＭ， Ｆｒｉｔｚ ＢＲ， Ｗｙｍａｎ ＳＫ， Ｐｏｇｏｓｏｖａ－Ａｇａｄｊａｎｙａｎ ＥＬ， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ａ， Ｎｏｔｅｂｏｏｍ Ｊ， Ｏ’Ｂｒｉａｎｔ ＫＣ， Ａｌｌｅｎ Ａ， Ｌｉｎ ＤＷ， Ｕｒｂａｎ Ｎ， Ｄｒｅｓｃｈｅｒ ＣＷ， Ｋｎｕｄｓｅｎ ＢＳ， Ｓｔｉｒｅｗａｌｔ ＤＬ， Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ Ｒ， Ｖｅｓｓｅｌｌａ ＲＬ， Ｎｅｌｓｏｎ ＰＳ， Ｍａｒｔｉｎ ＤＢ， Ｔｅｗａｒｉ Ｍ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ ｓｔａｂｌｅ ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００８； １０５（３０）：１０５１３－８． ｄｏｉ： １０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０４５４９１０５． ＰＭＩＤ：１８６６３２１９．
１４－ Ｌｏｕｄｉｇ Ｏ， Ｗａｎｇ Ｔ， Ｙｅ Ｋ， Ｌｉｎ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｒａｍｎａｕｔｈ Ａ， Ｌｉｕ Ｃ， Ｓｔａｒｋ Ａ， Ｃｈｉｔａｌｅ Ｄ， Ｇｒｅｅｎｌｅｅ Ｒ， Ｍｕｌｔｅｒｅｒ Ｄ， Ｈｏｎｄａ Ｓ， Ｄａｉｄａ Ｙ， Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｆｅｉｇｅｌｓｏｎ Ｈ， Ｇｌａｓｓ Ａ， Ｃｏｕｃｈ ＦＪ， Ｒｏｈａｎ Ｔ， Ｂｅｎ－Ｄｏｖ ＩＺ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ－Ｂａｓｅｄ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ａｒｃｈｉｖｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｆｒｏｍ ｕｐ ｔｏ ３５－Ｙｅａｒ－Ｏｌｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＦＦＰＥ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１７；１８（３）：６２７． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ １８０３０６２７． ＰＭＩＤ：２８３３５４３３．
１５－ Ｒｏｈａｎ ＴＥ， Ｗａｎｇ Ｔ， Ｗｅｉｎｍａｎｎ Ｓ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｌｉｎ Ｊ， Ｇｉｎｓｂｅｒｇ Ｍ， Ｌｏｕｄｉｇ Ｏ． Ａ ｍｉＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｄｉｓｔａｎｔ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１９； ７９（７）：１７０５－１７１３． ｄｏｉ： １０．１１５８／０００８－５４７２．ＰＭＩＤ：３０７６０５１７
１６－Ｍ．Ｓｉｍｏｎｓ，Ｇ．Ｒａｐｏｓｏ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ－ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００９， ２１：５７５－５８１． ＰＭＩＤ：１９４４２５０４．
１７－Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｌｉ Ｓ， Ｌｉ Ｌ， Ｌｉ Ｍ， Ｇｕｏ Ｃ， Ｙａｏ Ｊ， Ｍｉ Ｓ． Ｅｘｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＭｉｃｒｏＲＮＡ： Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ， Ｓｏｒｔｉｎｇ， ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１５ Ｆｅｂ；１３（１）：１７－２４． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｇｐｂ．２０１５．０２．００１．ＰＭＩＤ：２５７２４３２６．
１８－ Ｆａｎ Ｑ， Ｙａｎｇ Ｌ， Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ｐｅｎｇ Ｘ， Ｗｅｉ Ｓ， Ｓｕ Ｄ， Ｚｈａｉ Ｚ， Ｈｕａ Ｘ， Ｌｉ Ｈ． Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ２０１８； ４１４：１０７－１１５． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃａｎｌｅｔ．２０１７．１０．０４０．ＰＭＩＤ：２９１０７１１２
１９－ Ｗａｎｇ Ｍ， Ｙｕ Ｆ， Ｄｉｎｇ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｌｉ Ｐ， Ｗａｎｇ Ｋ． Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖａｌｕｅｓ ｏｆ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． ２０１９； １６：７９１－８０４． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｎ．２０１９．０４．０２７． ＰＭＩＤ：３１１６３３２１．
２０－ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｋ， Ｂｒｅｙｎｅ Ｋ， Ｕｇｈｅｔｔｏ Ｓ， Ｌａｕｒｅｎｔ ＬＣ， Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ ＸＯ． ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０２０； ２６：１－２２． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５８０－０２０－０２５１－ｙ．ＰＭＩＤ：３２４５７５０７．
２１－ Ｃｏｌｏｍｂｏ Ｍ， Ｒａｐｏｓｏ Ｇ， Ｔｈｅｒｙ Ｃ． Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． ２０１４； ３０：２５５－８９． ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｃｅｌｌｂｉｏ－１０１５１２－１２２３２６． ＰＭＩＤ：２５２８８１１４．
２２－ Ａｎｄｒｅｕ Ｚ， Ｙａｎｅｚ－Ｍｏ Ｍ． Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１４； ５：４４２． ＰＭＩＤ：２５２７８９３７．
２３－ Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ Ｓ， Ｓｉｍｐｓｏｎ ＲＪ． ＥｘｏＣａｒｔａ： Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ＲＮＡ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２００９； ９（２１）：４９９７－５０００． ｄｏｉ： １０．１００２／ｐｍｉｃ．２００９００３５１． ＰＭＩＤ：１９８１００３３
２４－ Ｗｕ Ｄ， Ｙａｎ Ｊ， Ｓｈｅｎ Ｘ， Ｓｕｎ Ｙ， Ｔｈｕｌｉｎ Ｍ， Ｃａｉ Ｙ， Ｗｉｋ Ｌ， Ｓｈｅｎ Ｑ， Ｏｅｌｒｉｃｈ Ｊ， Ｑｉａｎ Ｘ， Ｄｕｂｏｉｓ ＫＬ， Ｒｏｎｑｕｉｓｔ ＫＧ， Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｍ， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ Ｕ， Ｋａｍａｌｉ－Ｍｏｇｈａｄｄａｍ Ｍ． Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ａｓｓａｙ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１９；１０（１）：３８５４． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１４６７－０１９－１１４８６－１． ＰＭＩＤ：３１４５１６９２．
２５－ Ｌａｒｓｓｅｎ Ｐ， Ｗｉｋ Ｌ， Ｃｚａｒｎｅｗｓｋｉ Ｐ， Ｅｌｄｈ Ｍ， Ｌｏｆ Ｌ， Ｒｏｎｑｕｉｓｔ ＫＧ， Ｄｕｂｏｉｓ Ｌ， Ｆｒｅｙｈｕｌｔ Ｅ， Ｇａｌｌａｎｔ ＣＪ， Ｏｅｌｒｉｃｈ Ｊ， Ｌａｒｓｓｏｎ Ａ， Ｒｏｎｑｕｉｓｔ Ｇ， Ｖｉｌｌａｂｌａｎｃａ ＥＪ， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ Ｕ， Ｇａｂｒｉｅｌｓｓｏｎ Ｓ， Ｋａｍａｌｉ－Ｍｏｇｈａｄｄａｍ Ｍ． Ｔｒａｃｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２０１７； １６（３）：５０２－５１１． ｄｏｉ： １０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１６．０６４７２５． ＰＭＩＤ：２８１１１３６１．
２６－ Ｙｕ ＬＬ， Ｚｈｕ Ｊ， Ｌｉｕ ＪＸ， Ｊｉａｎｇ Ｆ， Ｎｉ ＷＫ， Ｑｕ ＬＳ， Ｎｉ ＲＺ， Ｌｕ ＣＨ， Ｘｉａｏ ＭＢ． Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓａｍｐｌｅｓ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ． ２０１８； ２０１８：３６３４５６３． ｄｏｉ： １０．１１５５／２０１８／３６３４５６３． ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１８． ＰＭＩＤ：３０１４８１６５．
２７－ Ｐａｔｅｌ ＧＫ， Ｋｈａｎ ＭＡ， Ｚｕｂａｉｒ Ｈ， Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＳＫ， Ｋｈｕｓｈｍａｎ Ｍ， Ｓｉｎｇｈ Ｓ， Ｓｉｎｇｈ ＡＰ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｕｓｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｕｍ ｙｉｅｌｄ， ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１９； ９（１）：５３３５． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－４１８００－２． ＰＭＩＤ：３０９２６８６４．
２８－ Ｌｕｄｗｉｇ ＡＫ， Ｄｅ Ｍｉｒｏｓｃｈｅｄｊｉ Ｋ， Ｄｏｅｐｐｎｅｒ ＴＲ， Ｂｏｒｇｅｒ Ｖ， Ｒｕｅｓｉｎｇ Ｊ， Ｒｅｂｍａｎｎ Ｖ， Ｄｕｒｓｔ Ｓ， Ｊａｎｓｅｎ Ｓ， Ｂｒｅｍｅｒ Ｍ， Ｂｅｈｒｍａｎｎ Ｅ， Ｓｉｎｇｅｒ ＢＢ， Ｊａｓｔｒｏｗ Ｈ， Ｋｕｈｌｍａｎｎ ＪＤ， Ｅｌ Ｍａｇｒａｏｕｉ Ｆ， Ｍｅｙｅｒ ＨＥ， Ｈｅｒｍａｎｎ ＤＭ， Ｏｐａｌｋａ Ｂ， Ｒａｕｎｓｅｒ Ｓ， Ｅｐｐｌｅ Ｍ， Ｈｏｒｎ ＰＡ， Ｇｉｅｂｅｌ Ｂ． Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｗａｓｈｉｎｇ ａｎｄ ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ ｂｙ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｅｎｒｉｃｈｅｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ ａｎｄ ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅｓ． Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ． ２０１８； ７（１）：１５２８１０９． ｄｏｉ： １０．１０８０／２００１３０７８．２０１８．１５２８１０９． ＰＭＩＤ：３０３５７００８．
２９－ Ｍａｃｉａｓ Ｍ， Ｒｅｂｍａｎｎ Ｖ， Ｍａｔｅｏｓ Ｂ， Ｖａｒｏ Ｎ， Ｐｅｒｅｚ－Ｇｒａｃｉａ ＪＬ， Ａｌｅｇｒｅ Ｅ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ａ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｉｘ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｅｒｕｍ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ． Ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ． ２０１９； ５７（１０）：１５３９－１５４５． ｄｏｉ： １０．１５１５／ｃｃｌｍ－２０１８－１２９７． ＰＭＩＤ：３０９９０７８１．
３０－ Ｐｕｇｈｏｌｍ ＬＨ， Ｒｅｖｅｎｆｅｌｄ ＡＬ， Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ＥＫ， Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ＭＭ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ． ２０１５； ５２４８１７． ｄｏｉ： １０．１１５５／２０１５／５２４８１７． ＰＭＩＤ：２６７７０９７４．
３１－ Ｌｏｆ Ｌ， Ａｒｎｇａｒｄｅｎ Ｌ， Ｅｂａｉ Ｔ， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ Ｕ， Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ Ｏ， Ｋａｍａｌｉ－Ｍｏｇｈａｄｄａｍ Ｍ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｒｅａｄｏｕｔ－ＥｘｏＰＬＡ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｙｔｏｍ． ２０１７； ８１：４．８．１－４．８．１０． ｄｏｉ： １０．１００２／ｃｐｃｙ．２２． ＰＭＩＤ：２８６７８４１８．
３２－Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｚ， Ｂｅｎ－Ｄｏｖ ＩＺ， Ｅｌｉａｓ Ｒ， Ｍｉｈａｉｌｏｖｉｃ Ａ， Ｂｒｏｗｎ Ｍ， Ｒｏｓｅｎｗａｋｓ Ｚ， Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｖｉａ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１３； １１０（１１）：４２５５－６０． ｄｏｉ： １０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１４０４６１１０． ＰＭＩＤ：２３４４０２０３．
３３－Ｂａｒｒｏｓ ＦＭ， Ｃａｒｎｅｉｒｏ Ｆ， Ｍａｃｈａｄｏ ＪＣ， Ｍｅｌｏ ＳＡ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ： Ｆｒｉｅｎｄｓ ｏｒ Ｆｏｅｓ？ Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１８； ９（７３０）． ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．００７３０
３４－Ｇｕｔｚｅｉｔ Ｃ， Ｎａｇｙ Ｎ， Ｇｅｎｔｉｌｅ Ｍ， Ｌｙｂｅｒｇ Ｋ， Ｇｕｍｚ Ｊ， Ｖａｌｌｈｏｖ Ｈ， Ｐｕｇａ Ｉ， Ｋｌｅｉｎ Ｅ， Ｇａｂｒｉｅｌｓｓｏｎ Ｓ， Ｃｅｒｕｔｔｉ Ａ， Ｓｃｈｅｙｎｉｕｓ Ａ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｌａｓｓ－ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１４； １９２（１２）， ５８５２－５８６２． ｄｏｉ： １０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１３０２０６８
３５－Ｂｕｒｋｏｖａ ＥＥ， Ｇｒｉｇｏｒ’ｅｖａ ＡＥ， Ｂｕｌｇａｋｏｖ ＤＶ， Ｄｍｉｔｒｅｎｏｋ ＰＳ， Ｖｌａｓｓｏｖ ＶＶ， Ｒｙａｂｃｈｉｋｏｖａ ＥＩ， Ｓｅｄｙｋｈ ＳＥ， Ｎｅｖｉｎｓｋｙ ＧＡ． Ｅｘｔｒａ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｃｏｎｔａｉｎ ａｎ Ｕｎｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅ Ｓｍａｌｌ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１９； ２０（１０）： ２４３４． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ２０１０２４３４．
３６－Ｈｕａｎｇ Ｃ， Ｆｉｓｈｅｒ ＫＰ， Ｈａｍｍｅｒ ＳＳ， Ｎａｖｉｔｓｋａｙａ Ｓ， Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ＧＪ， Ｂｕｓｉｋ ＪＶ． Ｐｌａｓｍａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄａｍａｇｅ ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｂｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ２０１８； ６７（８）： １６３９－１６４９． ｄｏｉ：１０．２３３７／ｄｂ１７－１５８７．
３７－ Ｍａｌｌｅｇｏｌ Ｊ， Ｖａｎ Ｎｉｅｌ Ｇ， Ｌｅｂｒｅｔｏｎ Ｃ， Ｌｅｐｅｌｌｅｔｉｅｒ Ｙ， Ｃａｎｄａｌｈ Ｃ， Ｄｕｇａｖｅ Ｃ， Ｈｅａｔｈ ＪＫ， Ｒａｐｏｓｏ Ｇ， Ｃｅｒｆ－Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ Ｎ， Ｈｅｙｍａｎ Ｍ． Ｔ８４－ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｂｅａｒ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ／ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ２００７； １３２（５）：１８６６－１８７６． ｄｏｉ： １０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２００７．０２．０４３．＋
３８－Ｓｍｉｔｈ ＶＬ， Ｃｈｅｎｇ Ｙ， Ｂｒｙａｎｔ ＢＲ， Ｓｃｈｏｒｅｙ ＪＳ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１７； ７：４３５７８． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４３５７８．
３９－Ｐｌｅｅｔ ＭＬ， Ｍａｔｈｉｅｓｅｎ Ａ， ＤｅＭａｒｉｎｏ Ｃ， Ａｋｐａｍａｇｂｏ ＹＡ， Ｂａｒｃｌａｙ ＲＡ， Ｓｃｈｗａｂ Ａ， Ｉｏｒｄａｎｓｋｉｙ Ｓ， Ｓａｍｐｅｙ ＧＣ， Ｌｅｐｅｎｅ Ｂ， Ｎｅｋｈａｉ Ｓ， Ａｍａｎ ＭＪ， Ｋａｓｈａｎｃｈｉ Ｆ． Ｅｂｏｌａ ＶＰ４０ ｉｎ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎ Ｃａｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ａｐｐｅａｒｓ ｉｎ Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１８ Ａｐｒ １７；９：６９２］．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１６； ７：１７６５． ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１６．０１７６５．
４０－Ｍｕｋｈａｍｅｄｏｖａ Ｎ， Ｈｏａｎｇ Ａ， Ｄｒａｇｏｌｊｅｖｉｃ Ｄ， Ｄｕｂｒｏｖｓｋｙ Ｌ， ＰｕｓｈｋａｒｓｋｙＴ， Ｌｏｗ Ｈ， Ｄｉｔｉａｔｋｏｖｓｋｉ Ｍ， Ｆｕ Ｙ， Ｏｈｋａｗａ Ｒ， Ｍｅｉｋｌｅ ＰＪ， Ｈｏｒｖａｔｈ Ａ， Ｂｒｉｃｈａｃｈｅｋ Ｂ， Ｍｉｌｌｅｒ ＹＩ， Ｍｕｒｐｈｙ Ａ， Ｂｕｋｒｉｎｓｋｙ Ｍ， Ｓｖｉｒｉｄｏｖ Ｄ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＨＩＶ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｅｆ ｒｅｏｒｇａｎｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ． ２０１９； １５（７）：ｅ１００７９０７． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００７９０７．
４１－ Ｖａｌｌｈｏｖ Ｈ， Ｇｕｔｚｅｉｔ Ｃ， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ＳＭ， Ｎａｇｙ Ｎ， Ｐａｕｌ Ｍ， Ｌｉ Ｑ， Ｆｒｉｅｎｄ Ｓ， Ｇｅｏｒｇｅ ＴＣ， Ｋｌｅｉｎ Ｅ， Ｓｃｈｅｙｎｉｕｓ Ａ， Ｇａｂｒｉｅｌｓｓｏｎ Ｓ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ３５０ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｂｙ ＥＢＶ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔａｒｇｅｔ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＤ２１ ａｎｄ ｂｌｏｃｋ ＥＢＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１１； １８６（１）：７３－８２． ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１００１１４５．
４２－Ｌｏｕｄｉｇ Ｏ， Ｌｉｕ Ｃ， Ｒｏｈａｎ Ｔ， Ｂｅｎ－Ｄｏｖ ＩＺ． Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｕｓｉｎｇ Ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ Ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ＲＮＡ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ． Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ． ２０１８； （１３５）：５７４７１． ｄｏｉ： １０．３７９１／５７４７１． ＰＭＩＤ：２９７８１９８７．
４３－Ｍｅｎｓａ Ｅ， Ｇｉｕｌｉａｎｉ Ａ， Ｍａｔａｃｃｈｉｏｎｅ Ｇ， Ｇｕｒａｕ Ｆ， Ｂｏｎｆｉｇｌｉ ＡＲ， Ｒｏｍａｇｎｏｌｉ Ｆ， Ｄｅ Ｌｕｃａ Ｍ， Ｓａｂｂａｔｉｎｅｌｌｉ Ｊ， Ｏｌｉｖｉｅｒｉ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉＲ－１４６ａ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ： Ａｇｅ－ ａｎｄ ｇｅｎｄｅｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｊｅｃｔｏｒｉｅｓ． Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ． ２０１９； １８０：１－１０． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｍａｄ．２０１９．０３．００１．
４４－Ｍａｚｅｈ Ｈ， Ｄｅｕｔｃｈ Ｔ， Ｋａｒａｓ Ａ， Ｂｏｇａｒｄｕｓ ＫＡ， Ｍｉｚｒａｈｉ Ｉ， Ｇｕｒ－Ｗａｈｎｏｎ Ｄ， Ｂｅｎ－Ｄｏｖ ＩＺ． Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｉＲＮＡ Ｐａｎｅｌ Ｔｈａｔ Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ Ｗｅｌｌ－Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｃａｎｃｅｒ ｆｒｏｍ Ｂｅｎｉｇｎ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｎｏｄｕｌｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ． ２０１８； ２７（８）：８５８－８６３． ｄｏｉ： １０．１１５８／１０５５－９９６５．ＥＰＩ－１８－００５５
４５－Ｅｌ－Ｋｈｏｕｒｙ Ｖ， Ｐｉｅｒｓｏｎ Ｓ， Ｋａｏｍａ Ｔ， Ｂｅｒｎａｒｄｉｎ Ｆ， Ｂｅｒｃｈｅｍ Ｇ． Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉＲＮＡ ｒｅｃｏｖｅｒｙ： ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｉｎｐｕｔ ｍａｔｅｒｉａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６， ２０１６； １９５２９． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓｒｅｐ１９５２９
４６－ Ｒａｎｉｅｒｉ ＶＭ， Ｒｕｂｅｎｆｅｌｄ ＧＤ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＢＴ， Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ＮＤ， Ｃａｌｄｗｅｌｌ Ｅ， Ｆａｎ Ｅ， Ｃａｍｐｏｒｏｔａ Ｌ， Ｓｌｕｔｓｋｙ ＡＳ． Ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ｔｈｅ Ｂｅｒｌｉｎ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ． ＡＲＤＳ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ， ＪＡＭＡ． ２０１２； ３０７（２３）：２５２６－３３． ｄｏｉ： １０．１００１／ｊａｍａ．２０１２．５６６９． ＰＭＩＤ：２２７９７４５２．
４７－Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｍ， Ｋｌｅｉｎｅ－Ｗｅｂｅｒ Ｈ， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｓ， Ｋｒｕｇｅｒ Ｎ， Ｈｅｒｒｌｅｒ Ｔ， Ｅｒｉｃｈｓｅｎ Ｓ， Ｓｃｈｉｅｒｇｅｎｓ ＴＳ， Ｈｅｒｒｌｅｒ Ｇ， Ｗｕ Ｎ－Ｈ， Ｎｉｔｓｃｈｅ Ａ， Ｍｕｌｌｅｒ ＭＡ， Ｄｒｏｓｔｅｎ Ｃ， Ｐｏｈｌｍａｎｎ Ｓ． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ＡＣＥ２ ａｎｄ ＴＭＰＲＳＳ２ ａｎｄ Ｉｓ Ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｖｅｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｃｅｌｌ． ２０２０； １８１（２）：２７１－２８０． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０２．０５２．
４８－Ｎｇ Ｍ－Ｌ， Ｔａｎ Ｓ－Ｈ， Ｓｅｅ Ｅ－Ｅ， Ｏｏｉ Ｅ－Ｅ， Ｌｉｎｇ， Ａ－Ｅ． Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｖｅｒｏ Ｅ６ ｃｅｌｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２００３； ８４， ３２９１－３３０３． ｄｏｉ； １０．１０９９／ｖｉｒ．０．１９５０５－０．
４９－Ｙａｍａｔｅ Ｍ， Ｙａｍａｈｉｔａ Ｍ， Ｇｏｔｏ Ｔ， Ｔｓｕｊｉ Ｓ， Ｌｉ Ｙ－Ｇ， Ｗａｒａｃｈｉｔ Ｊ， Ｙｕｎｏｋｉ Ｍ， Ｉｋｕｔａ Ｋ． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｒｏ Ｅ６ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ． Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ７． ２００５； １５３０－１５４０． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｍｉｃｉｎｆ．２００５．０５．０１３．
５０－Ｘｉｅ Ｘ， Ｍｕｒｕａｔｏ Ａ， Ｌｏｋｕｇａｍａｇｅ ＫＧ， Ｎａｒａｙａｎａｎ Ｋ， Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ｚｏｕ Ｊ， Ｌｉｕ Ｊ， Ｓｃｈｉｎｄｅｗｏｌｆ Ｃ， Ｂｏｐｐ ＮＥ， Ａｇｕｉｌａｒ ＰＶ， Ｐｌａｎｔｅ ＫＳ， Ｗｅａｖｅｒ ＳＣ， Ｍａｋｉｎｏ Ｓ， ＬｅＤｕｃ ＪＷ， Ｍｅｎ． Ａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２． Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ． ２０２０；２７（５）：８４１－８４８．ｅ３． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０２０．０４．００４
５１－Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｃｈｅｎ Ｒ， Ｋｅｍｐｅｒ Ｓ， Ｂｒｉｇｓｔｏｃｋ Ｄ．Ｒ． Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｓｉｇｎａｌ． ２０１８； １２：３４３－３５７． ｄｏｉ： １０．１００７／ｓ１２０７９－０１７－０４２１－７．
５２－Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｙｕｌａ Ｐ， Ｋｏｒｕｔｌａ Ｌ， Ｈａｂｅｒｔｈｅｕｅｒ Ａ， Ｙｕ Ｍ， Ｒｏｓｔａｍｉ Ｓ， Ｙｕａｎ ＣＸ， Ｒｅｄｄｙ Ｓ， Ｌｉｕ Ｃ， Ｋｏｒｕｔｌａ Ｖ， Ｋｏｅｂｅｒｌｅｉｎ Ｂ， Ｔｒｏｆｅ－Ｃｌａｒｋ Ｊ， Ｒｉｃｋｅｌｓ ＭＲ， Ｎａｊｉ Ａ． Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｏｓｏｍｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｌｙ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１７ Ａｐｒ ３；１２７（４）：１３７５－１３９１． ｄｏｉ： １０．１１７２／ＪＣＩ８７９９３． ＰＭＩＤ： ２８３１９０５１．
５３－Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ Ｓ， Ｌｉｍ ＪＷＥ， Ｔａｕｒｏ ＢＪ， Ｊｉ Ｈ， Ｍｏｒｉｔｚ ＲＬ， Ｓｉｍｐｓｏｎ ＲＪ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａ３３ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ Ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＬＩＭ１２１５ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２０１０； ９（２）：１９７－２０８． ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ９００１５２－ＭＣＰ２００．
５４－Ｌａｉ Ａ， Ｅｌｆｅｋｙ Ｏ， Ｒｉｃｅ ＧＥ， Ｓａｌｏｍｏｎ Ｃ． Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｃｅｎｔａ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． Ｉｎ： Ｍｕｒｔｈｉ Ｐ．， Ｖａｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ Ｃ． （ｅｄｓ） Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１８； １７１０：１３１－１３８． ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－４９３９－７４９８－６＿１０．
５５－Ｔａｇａｎｏｖ ＫＤ， Ｂｏｌｄｉｎ ＭＰ， Ｃｈａｎｇ ＫＪ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｄ． ＮＦ－ｋａｐｐａＢ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ－１４６， ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００６； １０３（３３）：１２４８１－１２４８６． ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６０５２９８１０３．
５６－Ｂｏｌｄｉｎ ＭＰ， Ｔａｇａｎｏｖ ＫＤ， Ｒａｏ ＤＳ， Ｙａｎｇ Ｌ， Ｚｈａｏ ＪＬ， Ｋａｌｗａｎｉ Ｍ， Ｇａｒｃｉａ－Ｆｌｏｒｅｓ Ｙ， Ｌｕｏｎｇ Ｍ， Ｄｅｖｒｅｋａｎｌｉ Ａ， Ｘｕ Ｊ， Ｓｕｎ Ｇ， Ｔａｙ Ｊ， Ｌｉｎｓｌｅｙ ＰＳ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｄ． ｍｉＲ－１４６ａ ｉｓ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｂｒａｋｅ ｏｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ， ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２０１１； ２０８（６）：１１８９－１２０１． ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１０１８２３．
５７－ Ｇａｏ Ｍ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ｈａ Ｔ， Ｍａ Ｈ， Ｌｉｕ Ｌ， Ｋａｌｂｆｌｅｉｓｃｈ ＪＨ， Ｇａｏ Ｘ， Ｋａｏ ＲＬ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＤＬ， Ｌｉ Ｃ． Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｄｉａｃ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｅｐｓｉｓ ｂｙ ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４６ａ Ｉｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＩＲＡＫ１ ａｎｄ ＴＲＡＦ６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１５； １９５（２）：６７２－６８２． ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１４０３１５５．
５８－ Ａｌｅｘａｎｄｒｕ Ｎ， Ａｎｄｒｅｉ Ｅ， Ｓａｆｃｉｕｃ Ｆ， Ｄｒａｇａｎ Ｅ， Ｂａｌａｈｕｒａ， ＡＭ， Ｂａｄｉｌａ Ｅ， Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕ Ａ． Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｏｒｉｇｉｎｓ Ｄｅｆｅｎｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ａ Ｄｉｒｅｃｔ Ａｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌｓ． ２０２０； ９（２）：４２３． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｃｅｌｌｓ９０２０４２３．
５９－ Ａｒｒｏｙｏ ＡＢ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｐｅｒｅｚ ＭＰ， Ｄｅｌ Ｍｏｎｔｅ Ａ， Ａｇｕｉｌａ Ｓ， Ｍｅｎｄｅｚ Ｒ， Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ａｎｔｏｌｉｎ Ｒ， Ｇａｒｃｉａ－Ｂａｒｂｅｒ Ｎ， ｄｅ Ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ－Ｇａｒｃｉａ Ａ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｊｉｍｅｎｅｚ Ｐ， Ａｒｃａｓ ＭＩ， Ｖｉｃｅｎｔｅ Ｖ， Ｍｅｎｅｎｄｅｚ Ｒ， Ａｎｄｒｅｓ Ｖ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃｏｎｅｊｅｒｏ Ｒ， Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｃ． ｍｉＲ－１４６ａ ｉｓ ａ ｐｉｖｏｔａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ， ２０２０ Ｊｕｎ ２５］． Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ． ２０２０； ｈａｅｍａｔｏｌ．２０１９．２４０２２６． ｄｏｉ：１０．３３２４／ｈａｅｍａｔｏｌ．２０１９．２４０２２６．
６０－Ｂｅｎｂａｉｂｅｃｈｅ Ｈ， Ｈｉｃｈａｍｉ Ａ， Ｏｕｄｊｉｔ Ｂ， Ｈａｆｆａｆ ＥＭ， Ｋａｃｉｍｉ Ｇ， Ｋｏｃｅｉｒ ＥＡ， Ｋｈａｎ ＮＡ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｒ－２１ ａｎｄ ｍｉｒ－１４６ａ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ＣＤ３６ ｉｎ Ａｌｇｅｒｉａｎ ｏｂｅｓｅ ｍａｌｅ ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ， ２０２０ Ｊｕｎ １３］． Ａｒｃｈ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０２０； １－６． ｄｏｉ：１０．１０８０／１３８１３４５５．２０２０．１７７５６５５．
６１－ Ｋｕｈｎｅｒｔ Ｆ， Ｍａｎｃｕｓｏ ＭＲ， Ｈａｍｐｔｏｎ Ｊ， Ｓｔａｎｋｕｎａｓ Ｋ， Ａｓａｎｏ Ｔ， Ｃｈｅｎ Ｃ－Ｚ， Ｋｕｏ ＣＪ． Ａｔｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ Ｅｇｆｌ７ ｌｏｃｕｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ－１２６． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ２００８； １３５（２４）：３９８９－３９９３． ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．０２９７３６．
６２－ Ｎｉｃｏｌｉ Ｓ， Ｓｔａｎｄｌｅｙ Ｃ， Ｗａｌｋｅｒ Ｐ， Ｈｕｒｌｓｔｏｎｅ Ａ， Ｆｏｇａｒｔｙ ＫＥ， Ｌａｗｓｏｎ ＮＤ． ＭｉｃｒｏＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈａｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ Ｖｅｇｆ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ａｐｐｅａｒｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ． ２０１０ Ｓｅｐ １６；４６７（７３１３）：３５６］． Ｎａｔｕｒｅ． ２０１０； ４６４（７２９２）：１１９６－１２００． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８８８９．
６３－ Ｚｈｏｕ Ｙ， Ｌｉ Ｐ， Ｇｏｏｄｗｉｎ ＡＪ， Ｃｏｏｋ ＪＡ， Ｈａｌｕｓｈｋａ ＰＶ， Ｃｈａｎｇ Ｅ， Ｚｉｎｇａｒｅｌｌｉ Ｂ， Ｆａｎ Ｈ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ． Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ． ２０１９； ２３（１）：４４． ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０５４－０１９－２３３９－３．
６４－ Ｙａｏ Ｚ， Ｑｉａｏ Ｙ， Ｌｉ Ｘ， Ｃｈｅｎ Ｊ， Ｄｉｎｇ Ｊ， Ｂａｉ Ｊ， Ｓｈｅｎ Ｆ， Ｓｈｉ Ｂ， Ｌｉｕ Ｊ， Ｌｉ Ｊ， Ｙｕａｎ Ｚ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ Ｅｘｐｌｏｉｔ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ Ｔｒａｎｓｍｉｔ Ａｌｐｈａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２０１８； ９２（２４）：ｅ０１５７８－１８． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１５７８－１８
６５－Ｇｕ Ｊ， Ｗｕ Ｊ， Ｆａｎｇ Ｄ， Ｑｉｕ Ｙ， Ｚｏｕ Ｘ， Ｊｉａ Ｘ， Ｙｉｎ Ｙ， Ｓｈｅｎ Ｌ， Ｍａｏ Ｌ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｃｌｏａｋ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ｔｏ ｔｒａｎｓｍｉｔ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｎｏｎ－ｌｙｔｉｃａｌｌｙ． Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ． ２０２０； １１（１）：３２－３８． ｄｏｉ：１０．１０８０／２１５０５５９４．２０１９．１７０５０２２．
６６－ Ｂｅｄｆｏｒｄ ＪＧ， Ｉｎｆｕｓｉｎｉ Ｇ， Ｄａｇｌｅｙ ＬＦ， Ｖｉｌｌａｌｏｎ－Ｌｅｔｅｌｉｅｒ Ｆ， Ｚｈｅｎｇ ＭＺＭ， Ｂｅｎｎｅｔｔ－Ｗｏｏｄ Ｖ， Ｒｅａｄｉｎｇ ＰＣ， Ｗａｋｉｍ ＬＭ． Ａｉｒｗａｙ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ Ｒｅｌｅａｓｅｄ Ｄｕｒｉｎｇ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｅ ａｓ ａ Ｋｅｙ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０２０； １１：８８７． ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２０．００８８７
６７－Ｕｒｂａｎｅｌｌｉ Ｌ， Ｂｕｒａｔｔａ Ｔ， Ｔａｎｃｉｎｉ Ｂ， Ｓａｇｉｎｉ Ｋ， Ｄｅｌｏ Ｆ， Ｐｏｒｃｅｌｌａｔｉ Ｓ， Ｅｍｉｌｉａｎｉ Ｃ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ． ２０１９； ７（１０２）． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖａｃｃｉｎｅｓ７０３０１０２．
６８－Ｊｅｏｎ Ｈ， Ｙｏｏ Ｓ－Ｍ， Ｃｈｏｉ ＨＳ， Ｍｕｎ ＪＹ， Ｋａｎｇ Ｈ－Ｇ， Ｌｅｅ Ｊ， Ｐａｒｋ Ｊ， Ｇａｏ Ｓ－Ｊ， Ｌｅｅ Ｍ－Ｓ． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ＫＳＨＶ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ． ２０１７； ８（５９）：９９８４１－９９８６０． ｄｏｉ： １０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２１６６８．
６９－Ｋｈａｔｕａ Ａ， Ｔａｙｌｏｒ ＨＥ， Ｈｉｌｄｒｅｔｈ ＪＥＫ， Ｐｏｐｉｋ Ｗ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ ｃｏｎｆｅｒ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ８３（２）， ５１２－２１ （２００９）． ｄｏｉ： １０．１１２８／ＪＶＩ．０１６５８－０８．
７０－Ｗａｎｇ Ｊ， Ｃｈｅｎ Ｓ， Ｂｉｈｌ Ｊ． Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＡＣＥ－２ （Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ２） ｆｒｏｍ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ． Ｏｘｉｄ Ｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｖ． ２０２０； ４２１３５４１． ｄｏｉ：１０．１１５５／２０２０／４２１３５４１．

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図8】

【図9】

【配列表】

2024502302000001.app

【国際調査報告】